CN110747256B - 一种白菜紫色叶片相关分子标记的获得及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种白菜紫色叶片相关分子标记的获得及应用。包括鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的方法，包括：检测待测白菜基因组是否含有分子标记A3，如果待测白菜基因组含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为紫色，如果待测白菜基因组不含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为绿色，其中，所述分子标记A3为核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子。

Description

一种白菜紫色叶片相关分子标记的获得及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，白菜紫色叶片分子标记及其在鉴定白菜植株颜色中的应用。

背景技术

大白菜原产我国，是我国栽培面积最大的蔬菜作物。近年来，随着生活水平的提高，人们对大白菜的品质要求也随之提高。蔬菜品种供应也随之逐渐呈现多样化趋势，如北京桔红心和黄心大白菜等彩色大白菜的育成和推广等。紫色白菜因色泽艳丽、风味独特、营养丰富、栽培效益高日益受到人们的喜爱。紫色白菜富含花青素。花青素是一类重要的水溶性色素，具有吸引昆虫传粉、抵御低温和紫外线伤害以及防治病虫害等多种生理功能。此外，花青素还具医疗保健功能，如延缓皮肤衰老，防止老年痴呆以及增强机体免疫力等。花青素是目前已知最强的自由基清除剂，清除自由基的能力是维生素C的20倍，维生素E的50倍。另外，花青素也可作为天然食用色素。因此，培育和推广紫色白菜具有十分重要的实用意义。

2006年，国内出现了紫色小白菜杂交种“紫罗兰”，但在大白菜种质资源中，尚未发现紫色品种。目前紫色大白菜的紫色性状的主要来源可分为5种：紫红色芥菜、紫色小白菜、紫菜薹、紫红色芜菁和深紫色芥菜。孙日飞等(2006)采用大白菜和紫红色芥菜种间杂交，获得了紫色白菜新种质，但是研究表明，大白菜紫红色性状遗传不符合孟德尔遗传规律。张德双等(2007)采用大白菜与紫色小白菜杂交，获得两份紫色白菜材料，研究发现大白菜叶片紫色对绿色为显性，由一对遗传基因控制，叶片紫色的基因具有累加效应。张明科等(2008)研究表明，来源于紫菜薹的紫色为数量性状，是受一对主基因控制的不完全显性遗传，并呈现出剂量效应，可能还受到微效基因和环境条件的共同影响。Hayashi等在A7连锁群上定位到控制芜菁紫红色的基因，与SSR标记BRMS-036和CAPS标记OPU10C表现连锁，遗传距离分别为2.4cM。近年来，韩国KWONNONGSEED公司权五河利用细胞质雄性不育系CMS成功育成紫色大白菜“紫宝”、“紫裔”品种，叶片紫色性状表现美观、匀称。张德双等(2017)获得了子叶腹面、真叶的腹面和背面、叶柄以及叶脉全部为深紫色大白菜15NG28。15NG28与绿色大白菜的杂交F1代、回交BC1F1代的紫色单株子叶的腹面和背面、真叶的腹面和背面、叶柄以及叶脉均为紫色。目前关于大白菜紫色性状控制基因及遗传规律尚没有清晰的认识。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：找到一种与白菜叶片为紫色密切相关的分子标记，并将其应用在白菜叶片的颜色鉴定和白菜育种中。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的方法，包括：检测待测白菜基因组是否含有分子标记A3，如果待测白菜基因组含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为紫色，如果待测白菜基因组不含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为绿色，其中，所述分子标记A3为核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子。

其中，所述检测所述待测白菜中是否含有分子标记A3包括如下步骤：针对所述分子标记A3设计特异性引物对，将所述特异性引物对命名为B1引物对。

进一步，所述B1引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的两条单链DNA组成。

进一步，包括如下步骤：

1)提取待测白菜的基因组DNA；

2)以待测白菜的基因组DNA为模板，以引物对B1为引物，进行PCR扩增；

3)若扩增产物中含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为紫色，若扩增产物中不含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为绿色。

所述B1引物对也应在本发明的保护范围之内。

含有所述B1引物对的鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的试剂或者试剂盒也应在本发明的保护范围之内。

所述分子标记A3也应在本发明的保护范围之内。

上述任一所述的方法、所述分子标记A3、所述引物对或者所述的试剂或试剂盒在白菜育种中的应用也应在本发明的保护范围之内。

上述任一所述的方法、所述分子标记A3、所述引物对或者所述的试剂或试剂盒在筛选紫色叶片的白菜中的应用也应在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1为白菜紫色叶片的三种带型。

图2为幼苗期紫色白菜和绿色白菜白菜的表型。

图3为成苗期紫色白菜的表型。

图4为F2代植株鉴定，1-84泳道为紫色后代，85-97泳道为绿色后代，98、99泳道为亲本绿色大白菜，M为DNA分子量标准。

图5为F3代植株鉴定，1-132泳道均为F3代紫色植株，M为DNA分子量标准。

图6为F3代植株鉴定，其中，133-228泳道为F3代植株，229泳道为F2代绿色植株，230、231位绿色大白菜亲本，M为DNA分子量标准。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本实施例利用白菜紫色叶片分子标记对白菜的植株颜色进行鉴定，所检测白菜为紫色大白菜15NG28(张德双，赵泓，张凤兰，余阳俊，赵岫云，于拴仓，汪维红，苏同兵，卢桂香.新型紫色大白菜15NG28后代的鉴别及其转录组分析.华北农学报，32(6)：14-24。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。15NG28真叶的腹面和背面、叶柄以及叶脉全部表现深紫色。)与绿色大白菜84427(张凤兰，张德双，余阳俊，徐家炳，赵岫云，于拴仓，汪维红，卢桂香.晚熟大白菜新品种京秋4号的选育.中国蔬菜，2013(12)：94-96。84427的叶片和叶柄均为绿色，选育过程：于1984年从山东地方品种胶县二叶中经8代自交选育而成的自交不亲和系，亲和指数为2.0，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。绿色大白菜84427的表型为，植株半直立，生长势中等，叶色较深，叶面稍皱，叶柄绿色，多茸毛，叶球合叠形，耐病毒病、霜霉病。)

实施例1

白菜紫色叶片性状特异分子标记的获得方法，步骤包括：

(1)提取白菜的基因组DNA；以白菜的基因组DNA为模板，引物对B1(B1-F：tttttgtataacataactctgtttttcccc(如SEQ ID NO:1所示)B1-R：gacacaatccatagaaatgtcttcac(如SEQ ID NO:2所示))为引物进行PCR。

(2)配制如下PCR体系：

(3)PCR程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸2min，扩增35个循环，最后68℃延伸5min。

(4)利用1.0％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

按照上述步骤得到的电泳结果如图1所示，A1、A2和A3三种条带，经测序表明A3为长度为1360bp的DNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)。

当电泳结果包含对应A3序列的电泳条带时，其对应的大白菜的叶片颜色即为紫色；当电泳结果不包含对应A3序列的电泳条带时，其对应的大白菜的叶片颜色即为绿色。植株幼苗期及成苗期的叶片颜色如图2和图3所示，其中图2中的紫色幼苗为幼苗期紫色白菜的表型；图3为成苗期紫色白菜的表型。

实施例2：白菜杂交F2代植株的颜色鉴定

通过本发明的鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的方法对紫色大白菜(15NG28)与绿色大白菜(84427)杂交产生的F2代植株进行鉴定，方法如下：

1)分别提取待测白菜基因组DNA；

2)分别以上述基因组DNA为模板，利用引物对B1进行PCR扩增，配制反应体系如下：

设置PCR程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸2min，扩增35个循环，最后68℃延伸5min。

3)利用1.0％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

本实验共对97株F2代植株和两株亲本绿色大白菜进行了鉴定，如图4所示，其中，1-84泳道为紫色后代，85-97泳道为绿色后代，98、99泳道为亲本绿色大白菜，M为DNA分子量标准。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后均获得清晰的条带。根据本发明所述分子标记的特征，1-84泳道均具有A3型分子标记；85-99泳道均不含A3型分子标记。所述编号为1-97的F2代植株以及编号为98和99的两株绿色大白菜亲本与分子标记A3的关系及其叶片颜色性状如表1所示。

结合表1和图4可以发现，除了没有显示电泳结果的编号为8、79和83的植株，编号1-84的植株的电泳结果中均含有与分子标记A3，观察植株表型发现编号为1-84的植株的叶片颜色均为紫色；编号为85-99的植株的电泳结果均为不含分子标记A3，观察植株表型发现编号为85-99的植株对应的叶片颜色均为绿色。

上述结果说明本发明的分子标记A3与白菜叶片的颜色性状相关，可用于鉴定白菜植株的叶片颜色。当大白菜植株中含有分子标记A3，即电泳结果中具有与分子标记A3对应的A3条带时，大白菜植株的叶片颜色为紫色；当大白菜植株中不含有分子标记A3，即电泳结果中没有与分子标记A3对应的A3条带时，大白菜植株的叶片颜色为绿色。另外，编号为8、79和83的植株的电泳结果没有条带显示可能是由于电泳实验的中的误差造成，在此处不考虑此三个植株的影响。

表1 F2代植株的基因型与叶片颜色表型

(其中，+A3表示电泳结果中含有A3条带，-A3表示电泳结果中不含有A3条带)

实施例3：白菜植株颜色的鉴定

本实施例选取实施例2中含有A3条带的F2代植株进行自交，获得228株F3代植株，利用本发明的鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的方法对228株F3代植株、1株F2代绿色植株和两株绿色大白菜亲进行检测，方法步骤如下：

1)提取待测白菜基因组DNA；

2)以上述基因组DNA为模板，利用引物对B1进行PCR扩增，配制反应体系如下：

3)设置PCR程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸2min，扩增35个循环，最后68℃延伸5min。

4)利用1.0％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

电泳检测结果如图5和图6所示，其中1-228泳道为紫色F3代植株，229泳道为F2代绿色植株，230、231泳道为两株绿色大白菜。从图5和图6中可以看出，大部分PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后均获得清晰的条带。所述编号为1-228的F3代植株以及1株F2代绿色植株和两株绿色大白菜亲本的基因型及其叶片颜色性状如表2所示，表2中的空白，表示没有电泳条带结果。根据本发明所述分子标记的特征，具有电泳条带结果的1-228泳道均含有A3条带，编号为1-228的植株均表现为整株紫色，即其叶片颜色为紫色；具有电泳条带结果的229-231泳道均不含A3条带，编号为229-231的植株均表现为整株绿色，即其叶片颜色为绿色。

以上结果表明，上述结果说明本发明的分子标记A3与白菜叶片的颜色性状相关，可用于鉴定白菜植株的叶片颜色。另外，图5和图6中的部分植株的电泳结果没有条带显示可能是由于电泳实验的中的误差造成，在此处不考虑此部分植株的影响。

表2 F3代植株的基因型与叶片颜色表型

(其中，+A3表示电泳结果中含有A3条带，-A3表示电泳结果中不含有A3条带)

以上结果表明，本发明所述的分子标记与白菜紫色叶片的性状密切相关，本发明所描述的方法能够在苗期迅速鉴定植株颜色和基因类型，与传统依靠观察后代分离情况的鉴定方法相比，具有用时短、操作简便、结果准确等优点，适用于大规模筛选育种材料，大大加速紫色白菜的选育进程。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种白菜紫色叶片相关分子标记的获得及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttttgtata acataactct gtttttcccc 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacacaatcc atagaaatgt cttcac 26

<210> 3

<211> 1360

<212> DNA

<213> Brassica pekinensis

<400> 3

tttttgtata acataactct gtttttcccc tgttttaagc ttctttactt actctgtttt 60

agctttaagg aagacaagaa gatggttgca gttgaaagag ttgagagctt agcaaagagc 120

ggaatcgaat caatcccaaa agaatacatt cgtccaaaag aagagctaga gcacatcaac 180

gacgtgttcc aagaagagaa gaaagaagac ggtcctcaag tccccaccat caatctccaa 240

gacatcgagt ccgaagacgt aactgtccgt gagagatgca tagaggaact caaaaaggcg 300

gctatggatt ggggagtgat gcacctgatc aaccatggta tacccgttga tctaatggag 360

cgtgtgaaga gaacaggaga agagttcttc ggtttgcccg ttgaagagaa ggagaagtat 420

gcaaacgatc aagccaacgg gaagattcaa ggttatggaa gtaagttagc taacaacgcg 480

agtggacaac ttgagtggga agattacttc ttccatcttg tgtatcctga agacaagaga 540

gatctctcac tttggcctaa gacaccaagt gattacatgt aagctttggt tgtttcactt 600

aaaacacaca cacgaatctt gttttaagtt tttttttttt tttgttgagt gtagtgaagc 660

gacgagtaag tatgccaagt gtcttcgttt gctagcaaca aaagtcttca aggctctctc 720

tatcggtcta ggcttagagc ctgaccgtct agagaaagaa gttggcggca tagaagagct 780

tctcctccaa atgaagataa actattaccc gaaatgccct cagcctgagc tagcacttgg 840

cgtggaagct cacaccgatg taagcgcatt gaccttcatt ctacacaaca tggttccggg 900

tttgcagctg ttctacgagg gtaaatggat cattgcaaaa tgtgttcctg attcgattgt 960

gatgcatatt ggagatacgt tagagattct tagtaacggg aggtttaaga gtatacttca 1020

ccgtggattg gtgaataagg agaaggttag gatttcttgg gctgtgttct gtgagccacc 1080

aaaggataag attgtgctta agccgttgcc ggagatggtg agtgttgagt ctccggctaa 1140

gtttcctcca aggacgtttg ctcagcatat tgcgcataag ttgtttaaga acgagcaaga 1200

ggagttggta tctgagaaaa aggattaagt ttgagtcgtc attatacagt atgtgaaact 1260

ctatgttcga gtttctctgt tatcttatgt ttgtgtatgt atcctgtctt tgatgtatgt 1320

cttattaacg agatgtgaag acatttctat ggattgtgtc 1360

Claims (8)

1.鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的方法，其特征在于，检测待测白菜基因组是否含有分子标记A3，如果待测白菜基因组含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为紫色，如果待测白菜基因组不含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为绿色，其中，所述分子标记A3为核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测所述待测白菜中是否含有分子标记A3包括如下步骤：针对所述分子标记A3设计特异性引物对，将所述特异性引物对命名为B1引物对；所述B1引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的两条单链DNA组成。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取待测白菜的基因组DNA;

2）以待测白菜的基因组DNA为模板，以引物对B1为引物，进行PCR扩增；

3）若扩增产物中含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为紫色，若扩增产物中不含有分子标记A3，则待测白菜的叶片颜色为或者候选为绿色。

4.一种用于鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的B1引物对；所述B1引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的两条单链DNA组成。

5.含有权利要求4所述B1引物对的鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的试剂或者试剂盒。

6.一种用于鉴定或辅助鉴定白菜叶片颜色的分子标记A3，所述分子标记A3为核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子。

7.权利要求1-3任一所述的方法、权利要求4所述引物对、权利要求5所述的试剂或试剂盒或者权利要求6所述分子标记A3在白菜育种中的应用。

8.权利要求1-3任一所述的方法、权利要求4所述引物对、权利要求5所述的试剂或试剂盒或者权利要求6所述分子标记A3在筛选紫色叶片的白菜中的应用。

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