CN113788789B - 一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法与应用 - Google Patents

一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法与应用，涉及铜离子和草甘膦检测领域，尤其涉及一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法与应用。是解决现有荧光探针检测法同一测试条件下不利于实现铜离子和草甘膦两种物质连续识别的问题。本发明中探针的制备包括：水合肼与4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐的反应产物，与N,N‑二甲基乙二胺反应后，再与水杨醛缩合即得荧光探针L。本发明制备的荧光探针，可高选择性快速识别铜离子，同时探针与铜离子的络合物对草甘膦具有良好的识别选择性，不受其它有机磷农药的干扰，检测灵敏高效，不需要昂贵的大型仪器和复杂的样品前处理，能够实现草甘膦的大规模、常规化检测。本发明用于铜离子和草甘膦的检测领域。

Description

一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及铜离子和草甘膦检测领域，尤其涉及一种荧光探针的制备方法及其在铜离子和草甘膦连续检测中的应用。
背景技术
作为生物体所必需的第三大微量元素，铜离子可参与多种酶如酪氨酸酶、超氧化物歧化酶的代谢，在动植物体内起至关重要的作用。但铜离子摄入过多，不仅会导致植物体生长迟缓甚至死亡，还会引起生物体内铜的代谢紊乱，导致阿尔茨海默病、帕金森病和威尔逊氏病等多种疾病的发生。因此，对环境中铜离子检测具有重要意义。
草甘膦是一种非选择性、灭生性有机磷除草剂，与其它除草剂相比，具有高效、广谱等优点，被广泛应用于农业、林业等领域。近期研究表明，草甘膦能够引起多种健康危害，可能会引发淋巴腺癌、血管瘤、胰腺癌、肺癌等，并被世界卫生组织(WHO)列为2A类致癌物。目前，全世界范围内已有超过30个国家或地区开始禁止或限制使用草甘膦，并加强了对环境中草甘膦残留的监测。因此，开发可以快速、高效、低成本检测环境中草甘膦的方法具有重要意义。
近年来，单独识别铜离子或草甘膦的荧光探针已经被报道，但是利用同一个荧光探针分子连续识别铜离子和草甘膦的文献却少有报道。本发明设计合成一种结构新颖的1,8- 萘酐类荧光探针，在缓冲溶液中可高效快速识别铜离子，同时形成的络合物又可实现对草甘膦的特异性识别，具有选择性好、抗干扰性强及灵敏度高等优点。本发明制备的荧光探针，可在同一测试条件下连续识别铜离子和草甘膦两种物质，操作简便，同时降低了探针的合成工作，使荧光探针检测方法更加节能绿色。
发明内容
本发明是要解决铜离子和草甘膦难于在同一测试条件下实现连续检测的问题，提供一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法与应用。
本发明用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法，所述荧光探针L的分子结构为：
Figure BDA0003301046380000021
上述荧光探针的合成路线如下：
Figure BDA0003301046380000022
本发明用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针制备方法，包括以下步骤：
一、将80％的水合肼滴加到4-溴-1,8-萘二甲酸酐的乙醇溶液中，回流反应4～6h后脱除溶剂再重结晶，得黄色固体中间体1；
二、将中间体1、N,N-二甲基乙二胺在乙二醇单甲醚中回流反应3～5h；倒入水中后过滤真空干燥，即得黄色固体中间体2；
三、在催化剂存在下，将中间体2、水杨醛在乙醇中回流反应8～10h；反应产物过滤、洗涤、干燥即得荧光探针L。
优选的，步骤一中所述重结晶溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇，其中优选乙醇。
优选的，步骤三中催化剂为盐酸、乙酸或三氟乙酸，其中优选乙酸。
本发明利用荧光探针连续检测铜离子和草甘膦的具体方法为：
一、将荧光探针L溶于HEPES缓冲溶剂中，配制成3.0×10-4～3.0×10-6mol/L溶液，在445nm激发光作用下，测量荧光探针在532nm荧光发射峰强度；在探针溶液中加入硝酸铜水溶液，测量荧光探针在532处荧光发射峰强度；
二、探针L与硝酸铜孵育时间为2～5min，向体系中加入草甘膦样品，在445nm激发光作用下，测量荧光传感器在532nm处荧光发射峰强度值。
优选的，HEPES缓冲溶剂中CH3CN与水体积比为75:25。
优选的，HEPES缓冲溶液中HEPES浓度为20mM；pH为7.4。
优选的，荧光探针L、铜离子及草甘膦的摩尔浓度比为1:1:1。
本发明在实际进行含草甘膦样品检测时，样品通过离心、过滤，除去固体颗粒杂质的前处理即可。
本发明的原理：
本发明所制备的荧光探针L结构中具有较大的共轭体系和刚性共平面，能够产生稳定的荧光；荧光探针L含有的羰基、羟基等基团能与铜离子发生络合作用形成络合物，基团中氧原子的给电子能力消失，导致荧光淬灭现象发生，因此，可实现对铜离子的检测。草甘膦分子中含有氨基、磷酸基、羧基等官能团，这些官能团与铜离子发生强烈的配位作用，草甘膦可以将探针与铜离子络合物中的铜离子置换出来，使探针恢复单体状态，从而导致荧光效应的恢复，实现对草甘膦的荧光检测。荧光探针连续检测铜离子和草甘膦的原理见图1。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明制备的荧光探针可在同一测试条件下实现对铜离子和草甘膦两种物质的连续检测，操作简便，检测效果良好，降低了探针的合成工作，使荧光探针检测方法更加节能绿色。
2)本发明制备的荧光探针对铜离子具有良好的选择性，不受其它金属离子的干扰，在0～15μM(即0～3.6μg/mL)内，荧光强度与铜离子浓度具有良好的线性关系，检测极限低至3.7×10-7mol/L(即89.3ng/mL)，实现了铜离子的痕量定性、定量检测。
3)本发明制备的荧光探针在与铜离子形成络合物后对草甘膦具有特异性识别作用，可不受其它有机磷农药的干扰，在0～15μM(即0～2.5μg/mL)内，荧光强度与草甘膦浓度具有良好的线性关系，检测极限低至5.6×10-7mol/L(即94.7ng/mL)，实现了草甘膦的痕量定性、定量检测。
4)本发明制备的荧光探针，使用成本低，不需要昂贵的大型仪器和复杂的样品前处理，而且在可见光/紫外光下荧光探针对草甘膦具有明显的颜色/荧光变化，便于肉眼观测，在不借助仪器设备的条件下，可实现铜离子和草甘膦的简单定性检测。
5)本发明方法在实际进行含草甘膦样品检测时，样品通过离心、过滤，除去固体颗粒杂质的前处理即可，样品前处理方法简单。
附图说明
图1本发明荧光探针连续检测铜离子和草甘膦的原理；
图2本发明制备荧光探针L的1H NMR谱图；
图3本发明制备荧光探针L的13C NMR谱图；
图4本发明制备荧光探针L的IR谱图；
图5荧光探针L识别金属离子的选择性；
图6共存金属离子对荧光探针检测铜离子的影响；
图7荧光探针对不同浓度铜离子的荧光响应线性关系图；
图8荧光探针L对Cu2+的Job’s plot曲线；
图9荧光探针L-Cu2+对有机磷农药选择性识别关系图；
图10共存有机磷农药对荧光探针L-Cu2+识别草甘膦关系图；
图11荧光探针L-Cu2+对不同浓度草甘膦的荧光响应关系图；
图12荧光探针L-Cu2+对草甘膦的Job’s plot曲线；
图13在可见光(a)、紫外光365nm(b)下，荧光探针L(1#)、荧光探针L-Cu2+(2#)、荧光探针L-Cu2+分别与草甘膦(3#)、敌百虫(4#)、亚胺硫磷(5#)、敌敌畏(6#)、马拉硫磷(7#)、氧化乐果(8#)、乐果(9#)、灭线磷(10#)、杀螟硫磷(11#)、甲基对硫磷(12#)、对硫磷(13#)、草铵膦(14#)作用后的颜色、荧光变化图；
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针L的分子结构为：
Figure BDA0003301046380000041
具体实施方式二：所述荧光探针L的制备方法，包括以下步骤：
一、将80％的水合肼滴加到4-溴-1,8-萘二甲酸酐的乙醇溶液中，回流反应4～6h后脱除溶剂再重结晶，得黄色固体中间体1；
二、将中间体1、N,N-二甲基乙二胺在乙二醇单甲醚中回流反应3～5h；倒入水中后过滤真空干燥，即得黄色固体中间体2；
三、在催化剂存在下，将中间体2、水杨醛在乙醇中回流反应8～10h；反应产物过滤、洗涤、干燥即得荧光探针L。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中重结晶溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤三中催化剂为盐酸、乙酸或三氟乙酸。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式荧光探针在连续检测铜离子和草甘膦中的应用。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：荧光探针连续检测铜离子和草甘膦中的具体方法为：
一、将荧光探针L溶于HEPES缓冲溶剂中，配制成3.0×10-4～3.0×10-6mol/L溶液，在445nm激发光作用下，测量荧光探针在532nm荧光发射峰强度；在探针溶液中加入硝酸铜水溶液，测量荧光探针在532nm处荧光发射峰强度；
二、探针L与硝酸铜孵育时间为2～5min，向体系中加入草甘膦样品，在445nm激发光作用下，测量荧光传感器在532nm处荧光发射峰强度值。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述HEPES缓冲溶剂中CH3CN与水的体积比为75:25。其它与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七不同的是：所述HEPES缓冲溶液中HEPES浓度为20mM。其它与具体实施方式六或七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六或七或八不同的是：所述HEPES缓冲pH为7.4。其它与具体实施方式六或七或八相同。
本实施方式采用HEPES缓冲溶液是为了防止探针溶液的pH变化，同时可以验证探针是否可以用于细胞实验。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述荧光探针L、铜离子及草甘膦的摩尔浓度比为1:1:1。其它与具体实施方式六相同。
在实际进行含草甘膦样品检测时，样品通过离心、过滤，除去固体颗粒杂质的前处理即可。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：本实施例荧光探针L的制备方法，按以下步骤进行：
一、在250mL三口瓶中加入4-溴-1,8-萘二甲酸酐4.0g、80％水合肼4.3g和乙醇100mL，回流反应4h。减压脱除溶剂，乙醇重结晶得黄色固体中间体1 3.8g，收率89％。
二、在250mL三口瓶中加入中间体1 3.0g、N,N-二甲基乙二胺5mL和乙二醇单甲醚100mL，回流反应6h；冷却至室温后，倒入100mL水中，过滤沉淀固体，水洗真空干燥，得黄色中间体2 2.83g，收率92％。
三、在250mL三口瓶中加入中间体2 2.0g、水杨醛1.0g、冰乙酸0.5mL和无水乙醇100mL，回流反应8h；冷却至室温后，过滤干燥，乙醚洗涤，得荧光探针L2.2g，收率 83％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.13(s,1H),9.53(s,1H),8.99(s,1H),8.76(d,J＝8.4 Hz,1H),8.52(d,J＝7.3Hz,1H),8.35(d,J＝8.5Hz,1H),7.92(s,1H),7.79(dd,J＝8.3,5.9Hz, 2H),7.54–7.42(m,1H),7.08–6.98(m,2H),3.81(d,J＝6.0Hz,2H),3.45(d,J＝6.3Hz,2H), 3.34(s,6H).13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ169.96,161.08,160.56,159.24,150.73, 134.96,134.45,131.74,130.84,129.69，129.23,125.18,122.52,121.02,120.04,118.22,117.22,109.02,105.04,54.89,43.10,39.82,38.28.FT-IR(KBr):3430.65,2923.84,2853.27,1691.56, 1655.42,1586.08,1458.73,1351.24,1241.96,1167.88,770.99。
荧光探针L的1H NMR谱图、13C NMR谱图、红外光谱图分别如图2、3、4所示。
实施例2：本实施例荧光探针L对铜离子选择性识别，按以下步骤进行：
分别配制浓度为0.1M的Cu2+、Ni2+、Co2+、Cd2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Ce3+、Hg2+、 Zn2+、Na+、K+、Fe3+、Ag+、Ba2+、Cs+、Al3+、Cr3+水溶液备用。
准确称量12.1mg荧光探针L溶解于100mL HEPES缓冲溶液(V乙腈:V水＝75:25,HEPES40mM,pH＝7.4)，配制成3.0×10-4mol/L溶液A；取10mL溶液A用缓冲溶液体系(V乙腈:V 水＝75:25,HEPES 20mM,pH＝7.4)定容至100mL容量瓶，配制成3.0×10-5mol/L溶液B待用。
每次取3mL溶液B于比色皿中，依次加入2eq.的Cu2+、Ni2+、Co2+、Cd2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Ce3+、Hg2+、Zn2+、Na+、K+、Fe3+、Ag+、Ba2+、Cs+、Al3+、Cr3+水溶液。在 445nm激发光作用下，测量荧光探针L在532nm处荧光发射峰强度值，荧光探针L中加入Cu2+后，具有明显的荧光猝灭效应，而加入其它金属离子未能引起明显的荧光变化，荧光探针L对Cu2+表现出专一性识别，结果如图5所示。
实施例3：本实施例荧光探针L识别铜离子抗干扰性，按以下步骤进行：
分别取3mL浓度为3.0×10-5mol/L溶液B，依次加入2eq.的Cu2+、Ni2+、Co2+、Cd2+、 Mg2 +、Pb2+、Ca2+、Ce3+、Hg2+、Zn2+、Na+、K+、Fe3+、Ag+、Ba2+、Cs+、Al3+、Cr3+水溶液，测量荧光强度。再依次加入2eq.Cu2+水溶液，观测并记录荧光强度。结果如图6所示。
由数据分析得，探针识别响应铜离子的过程中，即使在其它离子存在下，仍然对铜离子有明显的荧光猝灭效应，探针在识别铜离子时具有明显的抗干扰能力。
实施例4：本实施例荧光探针L对铜离子检测限，按以下步骤进行：
取3mL浓度为3.0×10-5mol/L溶液B，每次加入1μL浓度为3×10-3mol/L铜离子水溶液，测量荧光强度。以铜离子浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，结果如图7所示。
由数据分析可得，当铜离子浓度在0μM-15μM(即0-3.6μg/mL)内，荧光强度随着铜离子浓度的增加而不断降低，荧光强度与铜离子浓度呈现良好的线性关系，拟合方程为 y＝-20.08x+345.26，R2＝0.998。根据检测限的计算公式3σ/k，计算出探针分子对铜离子检出限量为3.7×10-7mol/L(即89.3ng/mL)。该探针可以实现对铜离子的痕量检测。
实施例5：本实施例荧光探针L与铜离子络合比，按以下步骤进行：
取浓度为3.0×10-5mol/L溶液B和3×10-3mol/L铜离子水溶液，保持体系中探针和铜离子总共度为9×10-8mol不变，通过改变探针和铜离子的当量比，测定其荧光强度，绘制Job’s Plot曲线图。结果如图8所示。
由Job’s Plot曲线图分析可得，当铜离子的摩尔分数在0.47时，荧光强度出现拐点，由此说明探针L与Cu2+络合比为1:1。
实施例6：荧光探针L-Cu2+对草甘膦选择性识别，按以下步骤进行：
取3mL浓度为3.0×10-5mol/L的溶液B加入1eq.的铜离子溶液，孵育3min后得配合物L-铜离子体系，依次加入1eq.的草甘膦、敌百虫、亚胺硫磷、敌敌畏、马拉硫磷、氧化乐果、乐果、灭线磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、对硫磷和草铵膦，在445nm激发光作用下，测量其荧光强度。结果如图9所示。
由数据分析得，当加入草甘膦之后，体系荧光明显增强，而加入其它农药时，荧光强度未发生明显变化，荧光探针L-Cu2+体系实现了对草甘膦的特异性识别。
实施例7：荧光探针L-Cu2+对草甘膦识别抗干扰性，按以下步骤进行：
取3mL浓度为3.0×10-5mol/L的溶液B加入1eq.的铜离子溶液，孵育3min后得荧光探针L-Cu2+体系，依次加入1eq.的草甘膦、敌百虫、亚胺硫磷、敌敌畏、马拉硫磷、氧化乐果、乐果、灭线磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、对硫磷和草铵膦，在445nm激发光作用下，记录其荧光强度，然后依次加入1eq.的草甘膦，观测并记录荧光强度变化。结果如图10所示。
由数据分析可得，在加入草甘膦之后，在其它共存农药存在下，加入草甘膦后仍可以实现荧光增强，其它农药对荧光探针L-Cu2+体系识别草甘膦无干扰。
实施例8：荧光探针L-Cu2+对草甘膦检测限，按以下步骤进行：
取浓度为3.0×10-5mol/L的溶液B加入1eq.的铜离子溶液，孵育3min后得荧光探针 L-Cu2+体系C待用，取3mL荧光探针L-Cu2+体系C，每次加入1μL浓度为3×10-3mol/L 草甘膦水溶液，测量荧光强度。结果如图11所示。
由数据分析可得，当草甘膦浓度在0μM-15μM(即0-2.5μg/mL)内，荧光强度随着草甘膦浓度的增加而不断增强，荧光强度与草甘膦浓度呈现良好的线性关系，拟合方程为 y＝19.31x+29.79，R2＝0.993。根据检测限的计算公式3σ/k，计算出荧光探针L-Cu2+对铜离子检出限量为5.6×10-7mol/L(即94.7ng/mL)。荧光探针L-Cu2+体系可以实现对草甘膦的痕量检测。
实施例9：荧光探针L-Cu2+对草甘膦作用比，按以下步骤进行：
荧光探针L-Cu2+体系C和3×10-3mol/L草甘膦水溶液，保持体系中荧光探针L-Cu2+体系和草甘膦总共度为9×10-8mol不变，通过改变荧光探针L-Cu2+体系和草甘膦的当量比，测定其荧光强度，绘制Job’s Plot曲线图。结果如图12所示。
由数据分析可得，当草甘膦的摩尔分数在0.52时，荧光强度出现拐点，由此说明荧光探针L-Cu2+体系与草甘膦络合比为1:1。
实施例10：可见光及紫外光(365nm)下荧光探针L-Cu2+体系定性检测草甘膦
准确量取1.5mL荧光探针L-Cu2+体系C，分别加入4eq.的草甘膦、敌百虫、亚胺硫磷、敌敌畏、马拉硫磷、氧化乐果、乐果、灭线磷、杀螟硫磷、甲基对硫磷、对硫磷和草铵膦，在可见光下得到图13中 (a)所示的结果；在紫外光365nm下得到图13中 (b)所示的结果。从图13中 (a)、13中 (b)中可以看出，荧光探针L-Cu2+体系与有机磷农药作用后，仅有草甘膦具有明显的颜色荧光变化，对草甘膦显现出优异的选择性，可用于草甘膦的定性检测，操作简便、检测速度快。
实施例11：荧光传感器在实际水样中检测草甘膦
为了考察荧光探针在实际环境中的潜在应用，选取实验室自来水和松花江水(中国哈尔滨)两种水样，并对水样进行预处理：所取水样在转速12000rpm条件下离心10min，用0.45μm过滤器处理过滤，配制浓度分别为：0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、 2.5μg/mL的草甘膦溶液。
采用实施例6制备的荧光探针L-Cu2+体系，向荧光探针L-Cu2+体系中加入上述不同浓度的草甘膦溶液，在445nm激发光作用下，测量荧光探针L-Cu2+体系在532nm处荧光发射峰强度值，并将其带入如下方程式，计算得到待测草甘膦溶液的浓度。检测结果如表 1所示。
Y＝19.31×X+29.79
其中，X为草甘膦浓度，Y为荧光发射峰强度值。
表1荧光探针L-Cu2+体系在实际水样中检测草甘膦
Figure BDA0003301046380000091
通过表1可以看出，实际水样中草甘膦的回收率为95.5％～100.8％，相对标准偏差分为2.24％、1.8％，测得的草甘膦浓度与相应的加标浓度误差很小，这些结果表明本发明制备的荧光探针L-Cu2+体系检测实际水样中的草甘膦具有较好的准确性，能够在 0～2.5μg/mL范围内定量检测草甘膦，具有良好的实用性能。

Claims (9)

1.一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针，其特征在于荧光探针分子结构为：
Figure FDA0003560129960000011
2.根据权利要求1所述的一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针的制备方法，其特征在于所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
一、将80％的水合肼滴加到4-溴-1,8-萘二甲酸酐的乙醇溶液中，回流反应4～6h后脱除溶剂再重结晶，得黄色固体中间体1；
二、将中间体1、N,N-二甲基乙二胺在乙二醇单甲醚中回流反应3～5h；倒入水中后过滤真空干燥，即得黄色固体中间体2；
三、在催化剂存在下，将中间体2、水杨醛在乙醇中回流反应8～10h；反应产物过滤、洗涤、干燥即得荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针的制备方法，其特征在于步骤一中重结晶溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇。
4.根据权利要求2所述的一种用于连续检测铜离子和草甘膦的荧光探针的制备方法，其特征在于步骤三中催化剂为盐酸、乙酸或三氟乙酸。
5.如权利要求1所述的荧光探针在连续检测铜离子和草甘膦中的应用，所述应用不包括疾病的诊断或治疗。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于利用荧光探针连续检测铜离子和草甘膦的具体方法为：
一、将荧光探针溶于HEPES缓冲溶剂中，配制成3.0×10-4～3.0×10-6mol/L溶液，在445nm激发光作用下，测量荧光探针在532nm荧光发射峰强度；在荧光探针溶液中加入硝酸铜水溶液，测量荧光探针在532nm处荧光发射峰强度；
二、荧光探针与硝酸铜孵育时间为2～5min，向体系中加入草甘膦样品，在445nm激发光作用下，测量荧光传感器在532nm处荧光发射峰强度值。
7.根据权利要求6所述的荧光探针在连续检测铜离子和草甘膦中的应用，其特征在于所述的HEPES缓冲溶剂中CH3CN与水的体积比为75:25。
8.根据权利要求6所述的荧光探针在连续检测铜离子和草甘膦中的应用，其特征在于所述的HEPES缓冲溶剂中HEPES浓度为20mM；pH为7.4。
9.根据权利要求6所述的荧光探针在连续检测铜离子和草甘膦中的应用，其特征在于荧光探针、铜离子及草甘膦的摩尔浓度比为1:1:1。
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