CN113666896B - α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑萘酚酞衍生物类多功能荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针的结构式如式(I)所示。由式(III)的化合物合成式(II)的化合物进而合成所述荧光探针。所述荧光探针在二甲基亚砜和水的混合溶液中，利用荧光光谱和/或紫外‑可见吸收光谱可识别检测Hg²⁺和Al³⁺。该荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺的识别具有高选择性和灵敏度，抗干扰能力强，而且具有非常低的检测限；所述荧光探针可用于Hg²⁺和Al³⁺的定性及定量检测和活细胞中Hg²⁺和Al³⁺的示踪成像检测。

Description

α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及重金属离子检测识别技术领域，特别涉及一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

随着经济的发展和人类健康环保意识的提高，重金属污染问题受到越来越多的关注。重金属离子主要通过土壤、水源等介质在动植物体内富集，逐渐侵入人体。由于其难以被生物降解，严重威胁人们的生命健康。汞进入人体可引起消化道、肾脏、大脑，尤其神经系统的疾病，导致肢端疼痛症、阿尔茨海默病、水俣病等。铝具有密度小、延展性好、抗腐蚀性强等优点，广泛应用于食品、药物、存储等领域。而人体摄入过量铝离子会导致许多器官出现功能障碍，如痴呆、贫血、阿尔茨海默病、骨关节病等。因此建立准确、快速的汞离子及铝离子检测方法有重要的现实意义。

目前，汞离子及铝离子的测定方法主要有原子吸收光谱法、离子色谱法、电感耦合等离子体法、荧光分析法等。其中，荧光分析法由于灵敏度高、简便易行而被广泛使用。荧光分析法需要使用荧光分子探针，荧光分子探针在环境化学、分析化学和生命科学领域具有重要应用，能够进行快速、实时、原位定性和定量分析，引起了分析领域研究者的广泛关注，而席夫碱类分子探针更是研究的重点。然而目前所报道的小分子荧光探针仍然存在合成步骤复杂、分子量较大、灵敏度低等问题，因此开发出制备方法简单高效、高灵敏度、高选择性、超低检测限的小分子荧光探针仍充满挑战。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针的结构式如式(I)所示。由式(III)的化合物合成式(II)的化合物进而合成所述荧光探针。所述荧光探针在二甲基亚砜和水的混合溶液中，利用荧光光谱和/或紫外-可见吸收光谱可识别检测Hg²⁺和Al³⁺。

本发明提供一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：

本发明还提供所述的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

S1：合成第一化合物；第一化合物的结构式如式(II)所示；

S2：由所述第一化合物合成所述α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针。

进一步的，所述步骤S1中的所述第一化合物由第二化合物、三氟乙酸、六亚甲基四胺在氮气气氛下生成，所述第二化合物的结构式如式(III)所示：

进一步的，所述氮气气氛的反应温度为70～110℃。所述反应温度能够保证式(II)的第一化合物产率达到50％～80％。

进一步的，所述步骤S2中将所述第一化合物溶解在混合溶剂中，随后加入溶解于混合溶剂的二氨基马来睛，同时滴入冰醋酸，混合后的混合液加热搅拌反应；反应结束后分离纯化，得到所述α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针。

进一步的，所述混合溶剂为二氯甲烷和乙醇的混合溶剂，所述加热搅拌反应的时间为2～8小时。反应时间过短不能够实现所述荧光探针65％～85％的产率，时间过长会生成副产物。

本发明还提供一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针检测Hg²⁺和Al³⁺的检测方法，所述荧光探针为式(I)的荧光探针，所述荧光探针在二甲基亚砜和水的混合溶液中，利用检测光谱识别Hg²⁺和Al³⁺。

进一步的，所述二甲基亚砜和水的体积比为9:1～1:9。二甲基亚砜与水混合之后作为溶剂，用来溶解二氨基马来睛，在上述测试条件的参数范围内，所述探针对Hg²⁺和Al³⁺有明显的检测识别效果，而在所述参数范围之外的测试条件下，所述探针对Hg²⁺和Al³⁺则无明显检测识别效果。

进一步的，所述检测光谱是荧光光谱和/或紫外-可见吸收光谱。

本发明还提供所述的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的应用，所述应用选自以下任意一种或多种：

(1)Hg²⁺和Al³⁺的定性检测；

(2)Hg²⁺和Al³⁺的定量检测；

(3)活细胞中Hg²⁺和Al³⁺的示踪成像检测。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

(1)本发明的荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺的识别有优良的选择性，与其它常见金属离子作用时荧光信号或吸收信号基本没有变化，抗干扰能力强。

(2)本发明的荧光探针具有较好的传感性质和高灵敏度。

(3)本发明的荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺分别具有18.3nM和20nM的超低检测限。

(4)本发明的荧光探针可实现对Hg²⁺和Al³⁺可视化区分检测。

(5)本发明的荧光探针可用于活细胞中Hg²⁺和Al³⁺的示踪成像检测。

(6)本发明的制备方法简单高效，荧光探针的产率可达到65％～85％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针识别检测Hg²⁺和Al³⁺的原理图。

图2是第一化合物(式(II))高分辨质谱表征图。

图3是本发明的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针(式(I))高分辨质谱表征图。

图4是不同分析物的紫外-可见光吸收光谱图。

图5是不同分析物的荧光发射光谱图。

图6是不同浓度Al³⁺的荧光发射光谱图。

图7是不同浓度Hg²⁺的荧光发射光谱图。

图8是Al³⁺的竞争性关系图。

图9是Hg²⁺的竞争性关系图。

图10是计算Al³⁺的检测限的线性相关图。

图11是计算Hg²⁺的检测限的线性相关图。

图12是本发明的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针在Hela细胞中，加入不同浓度Hg²⁺和Al³⁺之后的细胞共聚焦荧光图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明提供一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：

上述α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的制备方法的步骤如下：

(1)将式(III)化合物溶解在三氟乙酸中，随后加入六亚甲基四胺，在70～110℃氮气气氛下，生成式(II)，产率为50％～80％。

(2)将式(II)化合物溶解在二氯甲烷和乙醇的混合溶剂中，随后加入溶解于二氯甲烷和乙醇混合溶剂的二氨基马来睛(二氨基顺丁烯二腈)，同时滴入冰醋酸，反应2～8小时结束后，萃取、柱层析分离纯化后得到α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针，产率为65％～85％。

本发明还提供了一种使用α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针检测Hg²⁺和Al³⁺的检测方法：

将所述探针溶解于在二甲基亚砜和水的混合溶液中，可利用荧光光谱和/或紫外-可见吸收光谱识别Hg²⁺和Al³⁺，其原理见图1，所述二甲基亚砜和水的体积比为9:1～1:9。在上述测试条件的参数范围内，所述探针对Hg²⁺和Al³⁺有明显的检测识别效果，而在所述参数范围之外的测试条件下，所述探针对Hg²⁺和Al³⁺则无明显检测识别效果。

所述探针本身溶液呈深黄色，在加入Al³⁺后与探针发生配位反应，使光诱导电子转移(PET)过程发生抑制，荧光显著增强同时溶液颜色由深黄色变为浅黄色；在加入Hg²⁺后，Hg²⁺与探针发生配位诱导水解反应，释放出荧光中间体(II)，荧光显著增强同时溶液颜色由深黄色变为无色。因此探针可对Hg²⁺和Al³⁺进行识别检测。

实施例1合成α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针(I)

合成α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针(I)的反应式如下式：

合成α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针(I)的具体步骤如下：

(1)将式(III)溶解于三氟乙酸中，随后再逐步加入乌洛托品(六亚甲基四胺)。在氮气保护下，70～110℃加热回流反应2～8小时后，将反应体系冷却至室温。分离、洗涤、干燥，静置后过滤。将所得滤液用旋转蒸发仪旋干，得到粗产物；最后通过柱色谱分离提纯粗产物后用旋转蒸发仪旋干得到纯品式(II)，产率约为50％～80％。式(II)的质谱(负电模式)结果如图2所示，离子峰为472.419[M-2H]^-，与理论计算值474.44相符，说明此步成功合成了式(II)化合物。

(2)将式(II)和二氨基马来腈分别溶于二氯甲烷和乙醇混合溶剂中。打开磁力搅拌器，将溶于二氯甲烷和乙醇混合溶剂的二胺基马来睛用胶头滴管逐滴加入三口烧瓶中，同时滴加一滴冰醋酸。将所得反应物在搅拌条件下反应2～8小时，体系中析出黄色产物。用无水乙醇洗涤产物，然后放入真空烘箱中干燥2～8小时，得到荧光探针式(I)，产率约为65％～85％。式(I)的高分辨质谱(负电模式)结果如图3所示，离子峰为653.16980[M-H]^-，与理论计算值654.636相符，说明此步成功合成了式(I)化合物，即本发明的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针。

实施例2本发明的荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺的选择性检测

10μmol/Lα-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针(实施例1制备的荧光探针(I))的二甲基亚砜和水的体积比为9:1的混合溶液，分别加入100μmol/L的金属离子(Zn²⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Fe³⁺,Ni²⁺,Sn²⁺,Cd²⁺,Li⁺,Na⁺,Pb²⁺,Mn²⁺,Fe²⁺,VO²⁺,Cu²⁺)。15min后检测溶液的荧光发射光谱变化及紫外-可见吸收光谱变化，检测结果如图4和图5所示。α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针自身在520nm和480nm处几乎没有发射峰，在436nm处几乎没有吸收峰，当加入Al³⁺后，α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针在550nm处出现强发射峰；当加入Hg²⁺之后，α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针在480nm处出现强发射峰，而其他金属离子，如Zn²⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Co^{2 +},Fe³⁺,Ni²⁺,Sn²⁺,Cd²⁺,Li⁺,Na⁺，Pb²⁺,Mn²⁺,Fe²⁺,VO²⁺,Cu²⁺加入后，α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针在520nm和480nm处峰图无明显变化。此外，探针在分别加入Hg²⁺和Al³⁺之后，颜色变化分别为深黄色变为浅黄色和深黄色变为无色，而探针加入其他离子后无明显颜色变化。实验结果表明，只有加入Hg²⁺和Al³⁺，才能引起α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的显著荧光增强；该α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针在二甲基亚砜和水的体积比为9:1的混合溶液中对Hg²⁺和Al³⁺具有良好的选择性。

实施例3α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺的荧光滴定实验

将10μmol/Lα-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针溶解于二甲基亚砜和水的体积比为1:1的混合溶液，分别逐步增加加入的Hg²⁺和Al³⁺的浓度，15min后测试各试样的荧光光谱及吸收光谱变化，检测结果如图6和图7所示，随着Al³⁺浓度的增加，荧光探针在520nm和560nm的发射峰增强并在100μM左右饱和；随着Hg²⁺浓度的增加，荧光探针在480nm处的发射峰也增强并在100μM左右饱和。这也说明该α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺具有较好的传感性质。

实施例4α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺识别的竞争实验

10μmol/Lα-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的二甲基亚砜和水的混合溶液中，分别加入100μmol/L的其他金属盐溶液(Zn²⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Co²⁺,Fe³⁺,Ni²⁺,Sn²⁺,Cd²⁺,Li⁺,Na⁺,Pb^{2 +},Mn²⁺,Fe²⁺,VO²⁺,Cu²⁺)，15min后测试各溶液的荧光光谱；然后向以上各个金属盐溶液中分别加入100μmol/L的Hg²⁺和Al³⁺，放置15min后再分别测试各个溶液的荧光光谱和紫外-可见吸收光谱。结果如图8和图9所示，可见共存的其它金属离子对Hg²⁺和Al³⁺的荧光识别、对Hg²⁺和Al³⁺的紫外可见吸收识别没有显著干扰。说明本发明的荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺的识别有优良的选择性，与其它常见金属离子作用时荧光信号或吸收信号基本没有变化，抗干扰能力强。

实施例5α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺检测限的计算

检测限根据荧光光谱滴定数据计算。以I/I₀为纵坐标，分别以Hg²⁺和Al³⁺浓度为横坐标作两组图，I为各试样的荧光强度，I₀为不加Hg²⁺和Al³⁺时探针溶液的荧光强度。结果如图10和图11所示，α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针与Al³⁺的线性关系为在0～50μM内，y＝0.4926x+1.8157，R²＝0.9915；α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针与Hg²⁺的线性关系为在0～40μM内，y＝1.1289x+4.9084，R²＝0.986；计算得到Al³⁺的检测限为0-50μM范围内18.3nM，Hg²⁺的检测限为0～40μM范围内20nM。α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针在检测限范围内呈现出较好的线性关系，因此α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针能对Hg²⁺和Al³⁺进行定量检测，可以根据检测到的荧光强度利用上述线性关系曲线计算得到Hg²⁺和Al³⁺的浓度。

实施例6α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的活细胞荧光示踪成像

将该探针和不同浓度的Al³⁺(10μM、30μM)在宫颈癌细胞(Hela细胞)共同孵育之后进行荧光共聚焦显微镜成像，与空白对照组比，随着Al³⁺浓度的增加荧光信号逐渐增强；将该探针和不同浓度的Hg²⁺(10μM、30μM)在宫颈癌细胞(Hela细胞)共同孵育之后进行荧光共聚焦显微镜成像，与空白对照组比，随着Hg²⁺浓度的增加荧光信号逐渐增强。结果如图12所示。其中a1、b1、c1、d1、e1为荧光探针在宫颈癌细胞(Hela细胞)的共聚焦荧光图，a3、b3、c3、d3、e3为明场图，a2、b2、c2、d2、e2为叠加图；a、b、c、d、e分别为荧光和30μM Hg²⁺共染图、荧光和10μM Hg²⁺共染图、对照组、荧光和10μM AI³⁺共染图、荧光和30μM AI³⁺共染图。实验结果可见，图a1的荧光强度明显高于图b1，图e1的荧光强度明显高于图d1，说明在一定浓度范围内，随着Hg²⁺和Al³⁺浓度的增加，细胞荧光强度增强，由此该探针可以运用于活细胞Hg²⁺和Al³⁺的示踪成像检测中。

综合以上实施例，本发明提供了一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针的结构式如式(I)所示。由式(III)的化合物合成式(II)的化合物进而合成所述荧光探针。所述荧光探针在二甲基亚砜和水的混合溶液中，利用荧光光谱和/或紫外-可见吸收光谱可识别检测Hg²⁺和Al³⁺。该荧光探针对Hg²⁺和Al³⁺的识别具有高选择性和灵敏度，抗干扰能力强，而且具有非常低的检测限；所述荧光探针可用于Hg²⁺和Al³⁺的定性及定量检测和活细胞中Hg²⁺和Al³⁺的示踪成像检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：

。

2.权利要求1所述的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：合成第一化合物；第一化合物的结构式如式(II)所示；

S2：由所述第一化合物合成所述α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的所述第一化合物由第二化合物、三氟乙酸、六亚甲基四胺在氮气气氛下生成，所述第二化合物的结构式如式(III)所示：

。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氮气气氛的反应温度为70～110℃。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中将所述第一化合物溶解在混合溶剂中，随后加入溶解于混合溶剂的二氨基马来腈，同时滴入冰醋酸，混合后的混合液加热搅拌反应；反应结束后分离纯化，得到所述α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂为二氯甲烷和乙醇的混合溶剂，所述加热搅拌反应的时间为2～8小时。

7.一种α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针检测Hg²⁺和Al³⁺的检测方法，所述荧光探针为权利要求1的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针在二甲基亚砜和水的混合溶液中，利用检测光谱识别Hg²⁺和Al³⁺。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述二甲基亚砜和水的体积比为9:1～1:9。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测光谱是荧光光谱和/或紫外-可见吸收光谱。

10.权利要求1所述的α-萘酚酞衍生物类多功能荧光探针的应用，所述应用选自以下任意一种或多种：

(1)Hg²⁺和Al³⁺的定性检测；

(2)Hg²⁺和Al³⁺的定量检测；

(3)活细胞中Hg²⁺和Al³⁺的示踪成像检测。

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