CN105177177B

CN105177177B - 一种苹果花叶病毒检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN105177177B
Application number: CN201510171742.5A
Authority: CN
Inventors: 兰伟; 纪秀翠; 徐慧
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2015-04-13
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2035-04-13
Also published as: CN105177177A

Abstract

本发明一种苹果病毒检测试纸条及其制备方法，其特点是运用靶向引发的、ExonucleaseⅢ辅助的放大策略进行检测，经靶向苹果病毒引发、ExonucleaseⅢ切割循环后产生的大量单链DNA作为样品垫上的待测试液，其一部分序列与玻璃纤维结合垫上的DNA探针1互补配对、另一部分序列与硝酸纤维素膜上的DNA探针2互补配对；且DNA探针1‑纳米金复合物上的DNA与DNA探针3互补配对。制备方法包括依次将制备的样品垫、特定涂覆的玻璃纤维结合垫、特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫搭接成型，并粘贴于底板上，裁成3~5mm宽的细条，即得成品，优点是该试纸条可高灵敏、高选择性地检测苹果病毒。

Description

一种苹果花叶病毒检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，特别是涉及一种苹果病毒的检测方法。

背景技术

苹果原产于中国，是我国第一大水果品种，在我国已有3000多年的栽培历史。目前，我国25个省都有苹果的生产栽培，有世界上最大的连片苹果园，其种植面积及产量均居世界第一位。我国苹果鲜果的出口量在2000-2010年增长超过3倍，已成为全球最大的浓缩苹果汁生产和出口国，年产量和出口量均占全球总量的60％左右，每年出口额超过10亿美元。近年来，随着苹果产业的蓬勃发展，苹果病毒病已成为严重制约苹果经济发展的重要因素。研究表明，苹果带毒株较无毒株树体生长量减少10-30％，减产16％-60％，需氮肥量增加 30％-40％，而苹果树一旦感染病毒将终生带病，其造成的经济损失难以估计。因而建立苹果病毒准确快速的检测方法，加强田间病毒病的监测，是有效控制和预防苹果病毒病大发生，从而减少经济损失的最有效手段。

苹果病毒的检测检测技术目前主要有指示植物法、电子显微镜技术、血清学技术和分子生物学技术等。目前运用最普遍的是血清学技术和分子生物学技术，其中，核酸鉴定法如RT-PCR，比生产上常用的酶联免疫吸附反应法(enzyme linked immunosorbentassay， ELISA)检测技术更准确、灵敏、快速。但是该方法容易产生非特异性扩增和假阳性结果，而且电泳中所使用的嗅化乙锭对操作人员有毒害作用。因而，建立一种快速、灵敏、准确的苹果病毒检测体系，不但可有效检测田间苹果树病毒的带毒情况，还能为无病毒苗木的繁殖以及苹果病毒检疫提供保障。

本发明运用靶向基因引发的、ExonucleaseⅢ(ExoⅢ)辅助的放大策略，结合试纸条的快速检测能力发展了一种简便的检测苹果病毒的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于纳米金和特异性基因的苹果病毒检测试纸条及其制备方法，该试纸条可以高灵敏度、高选择性地检测样品中的苹果病毒。

本发明所采用的技术方案为：一种苹果病毒检测试纸条，所述的试纸条由条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、涂覆特异性DNA探针1-纳米金的金标结合物垫、特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，硝酸纤维素膜上有DNA探针2直线式检测线T线和 DNA探针3包被的直线式质控线C线，运用靶向基因引发的、ExonucleaseⅢ(ExoⅢ)辅助的放大策略进行检测，经靶向苹果病毒引发、ExoⅢ切割循环后产生的大量单链DNA，其一部分序列与DNA探针1-纳米金复合物上的DNA互补配对、另一部分序列与DNA探针2互补配对；且DNA探针1-纳米金复合物上的DNA与DNA探针3互补配对。

所述的样品垫为经0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡处理的玻璃纤维纸，其中 Tris-HCl缓冲液含Triton x-100的质量百分比为0.2％～0.3％，含NaCl的浓度为120-150mM， pH值为7.5～8.0。

所述的特异性DNA探针1-纳米金复合物溶液在所述的金标纤维结合垫上的喷涂量为 0.6～0.75μL/mm²，所述的特异性纳米金(AuNPs)-DNA探针1溶液的制备过程为16-18μL的50-70μmol/L巯基标记的序列4*与200μL、浓度为15nM的纳米金(粒径13nm±2nm) 结合，于4℃中过夜处理后，相隔25-30min分5-6次共加入24μL的0.1mol/LPBS(0.1 mol/L PB，含有1mol/L NaCl，pH＝7.0-7.4)溶液老化并过夜，然后用0.01mol/L PBS(0.01 mol/L PB，含有0.1mol/L NaCl，pH＝7.0-7.4)洗涤三次，沉淀重新溶于160μL含0.25％的 Tween-20，5％BSA和10％蔗糖的20mM的磷酸盐溶液中所得，pH为7.4～7.6。

所述的经靶向DNA引发、ExoⅢ切割循环后产生的单链DNA的制备过程如下：将 10-15μmol/L发卡DNA 90-95℃加热10min，自然冷却，待检人工合成苹果病毒寡核苷酸或待测苹果样本的RNA提取液90-95℃加热10min，立即冰浴。2.5μL 500nM的发卡DNA 与2.5μL的待检苹果病毒液杂交于45μL的1×ExoⅢbuffer中，37℃水浴中反应50-60min，加入1μL 45-50u ExoⅢ，37℃反应1-1.5小时，此1×ExoⅢbuffer含50mM Tris-HCl、5 mM MgCl₂、1mMDTT，pH值为8.0，所述的特定序列发卡DNA茎的3’端有一段突出的单链DNA(序列1)，这段突出的单链DNA与待检植物病毒的一段(序列1*)互补；且发夹DNA中茎(序列2)与苹果病毒的另一段(序列2*)互补。

所述的DNA探针2包被用量为0.0002～0.0004μmol/mm，所述的DNA探针3包被用量为0.0002～0.0004μmol/mm。

一种苹果病毒检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品垫的制备

将玻璃纤维用0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡湿润后，在20℃～37℃干燥1～4小时即得到样品垫，其中Tris-HCl缓冲液含Triton x-100的质量百分比为0.2％～0.3％，pH值为 7.5～8.0。

(2)涂覆特异性DNA探针1的金标结合物垫的制备

将玻璃纤维纸用0.01mol/L PBS(0.01mol/L PB，含有0.1mol/L NaCl，pH＝7.0-7.4)缓冲液浸泡湿润后，在20℃～37℃下干燥1～4小时后，在每平方毫米的玻璃纤维纸上均匀喷涂 0.6～0.75μL的特异性DNA探针1-纳米金复合物溶液，在25℃～37℃下干燥1～4小时后，即得到涂覆特异性DNA探针1的金标结合物垫，所述的特异性DNA探针1一端结合有纳米金，所述的特异性DNA探针的序列一端为巯基标记，其序列与茎环结构的环序列互补。

(3)特定包被的硝酸纤维膜的制备

先将硝酸纤维素膜在水中浸润，然后在20×SSC中泡一个小时，然后夹在两层滤纸中，37℃干燥20～30min，再用喷样仪将浓度为50-100μmol/L的DNA探针2溶液均匀喷涂于硝酸纤维膜上，形成直线式检测线T线，用喷样仪将浓度为50-100μmol/L的DNA探针3溶液沿与检测线T线平行的方向均匀喷涂于硝酸纤维膜上，形成直线式质控线C线，室温下干燥 1～2小时后，在80℃下烘烤1～2小时，即得到特定包被的硝酸纤维膜，其中所述的DNA探针2的碱基与所述的经靶向DNA引发、ExoⅢ切割循环后产生的单链DNA部分互补配对，所述的DNA探针3的碱基与所述的DNA探针1的碱基互补配对。

(4)将步骤(1)得到的样品垫，步骤(2)得到的涂覆特异性DNA探针的金标结合物垫，步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成 3～5mm宽的细条，即得苹果病毒检测试纸条。

所述的特异性DNA探针1溶液的制备方法如下：16-18μL的50-70μmol/L巯基标记的序列4*与200μL、浓度为15nM的纳米金(粒径13nm±2nm)结合，于4℃中过夜处理后，相隔25-30min分5-6次共加入24μL的0.1mol/LPBS(0.1mol/L PB，含有1mol/L NaCl，pH＝7.0-7.4)溶液老化并过夜，然后用0.01mol/L PBS(0.01mol/L PB，含有0.1 mol/L NaCl，pH＝7.0-7.4)洗涤三次，沉淀重新溶于160μL含0.25％的Tween-20，5％BSA 和10％蔗糖的20mM的磷酸盐溶液中，混合均匀后，即得特异性DNA探针1溶液，所述的磷酸盐缓冲液pH值为7.4～7.6。

所述的ExoⅢ切割得到的单链DNA的制备过程如下：10-15μmol/L特定序列发卡DNA 90-95℃加热10min，自然冷却，待检苹果病毒液90-95℃加热10min，立即冰浴，然后2.5μL 500nM的发卡DNA与2.5μL的待检苹果病毒液杂交于45μL的1×ExoIII buffer 中，37℃水浴中反应50-60min，加入1μL 45u ExoⅢ，37℃反应1-1.5小时，所述的发卡 DNA溶液的溶剂为1×ExoIII buffer，此1×ExoⅢbuffer含50mM Tris-HCl、5mM MgCl₂、 1mM DTT，pH值为8.0。

本发明提出的苹果病毒检测试纸条：检测线上涂覆DNA探针2，质控线上涂覆 DNA探针3，金标结合物垫上涂覆一端结合有纳米金的特异性DNA探针1；在苹果病毒存在时，此病毒序列与特定序列发卡DNA结合，经ExoⅢ切割循环反应，产生大量单链DNA，该单链DNA可与特异性DNA探针1结合，结合有特异性DNA探针1的该单链DNA又与 DNA探针2结合而被捕获，其链端结合的纳米金聚集显色，达到检测苹果病毒的目的；特异性DNA探针1碱基又与DNA探针3碱基互补配对，故过量的特异性DNA探针1被捕获在质控线上，其链端结合的纳米金聚集显色，达到检测的质控目的。用该试纸条对样品液进行检测：如果样品液中的苹果病毒浓度高于检测限时，检测线和质控线同时显示红色；如果样品液中不含苹果病毒或苹果病毒浓度低于检测限时，检测线不显色，质控线显示红色；如果质控线不显色，则检测无效。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)高灵敏度，检出限很低。原因在于：首先，这种靶向DNA引发的、ExoⅢ辅助的放大策略能够使得靶向序列循环再生，产生大量的单链DNA到样品垫中；其次，纳米金的摩尔吸光系数非常高，显色鲜明，人肉眼容易识别；最后，试纸条通过过滤和展开作用，能有效消除有色干扰物质对显色的影响；

(2)高选择性，高准确度，原因在于：DNA碱基严格按照碱基互补配对原则进行，快速识别苹果病毒，降低了其他非特异性结合的概率；ExoⅢ只能作用于双链DNA的3’端的平末端和凹末端。

(3)检测成本低，原因在于：硝酸纤维素上包被的DNA不需要生物素和链霉亲和素结合即可固定。

综上所述，基于纳米金和特异性DNA的苹果病毒检测试纸条，该试纸条可以高灵敏度度、高选择性地检测样品中的苹果病毒，且试纸条的制备方法简单、易操作。

附图说明

图1为本发明试纸条的反应原理及结构示意图；

图2为本发明检测效果示意图；

图3为本发明检测实际样品的结果图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明所采用的15nM纳米金(粒径13±2nm)，首先根据参考文献(K.C.Grabar,R.G.Freeman,M.B.Hommer,M.J.Natan,Anal.Chem.1995,67,735-743.)人工合成，其粒径为13±2nm,浓度为3nmol/L。然后取1mL的3nM的纳米金，12000转4℃离心20min，之后移除800μL的上清液，即得15nM的纳米金溶液；

本发明中用到的缓冲溶液的配制方法如下：

①0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液配制

0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液的制备方法：称量0.1211～0.3633g Tris置于100mL的烧杯中，加入80mL的去离子水，再加入0.8766g NaCl，使NaCl的终浓度为0.15mol/L，再加入0.2～0.3g的Triton x-100，使Triton x-100的最终质量百分比为0.2％～0.3％，然后用稀盐酸调pH值为7.5～8.0，最后移到100mL的容量瓶中，即得0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液。

②0.1MPBS(0.1M PB，含有1M NaCl，pH＝7.0-7.4)的配制

分别配置0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄，将这两种溶液以一定比例混合，用pH计调pH 值为7.0～7.4，得0.1M PB；将5.844g NaCl溶解于终体积为100mL的上述调节好的缓冲溶液中。

③0.01MPBS(0.01M PB，含有0.1M NaCl，pH＝7.0-7.4)的配制

将0.1MPBS(pH 7.0-7.4)稀释十倍得到0.01M PBS。

④20mM磷酸盐缓冲溶液制备(20mM磷酸盐，pH 7.4～7.6，含0.25％Tween-20，10％蔗糖、5％BSA)

20mM磷酸盐缓冲溶液制备方法：先制备20mM的NaH₂PO₄，即称量0.3120g NaH₂PO₄·2H₂O、0.25g Tween-20加入适量的超纯水，然后定量转移到100mL的容量瓶中；再制备20 mM的Na₂HPO₄，即称量0.7163g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.25gTween-20，加入适量的超纯水，然后定量转移到100mL的容量瓶中；用这两种溶液互相调pH值为7.4～7.6；然后取500μL 的上述混合液，加入0.05g蔗糖、0.025g BSA，使蔗糖的质量百分比为10％、BSA的质量百分比为5％，即得20mM磷酸盐缓冲溶液。

⑤20×SSC的制备

20×SSC的制备方法：称量8.76gNaCl和4.41g柠檬酸三钠，加入45mL的去离子水，然后用稀盐酸调pH值为7.0。

⑥1×Exo III buffer的制备

1×Exo III buffer的制备方法：将10×Exo III buffer(购于宝生物工程(大连)有限公司， 500mM Tris-HCl，pH 8.0，50mM MgCl₂，10mM DTT)稀释10倍，即取5μL的10×ExoIII buffer，加入到45μL水中，即得1×Exo III buffer，组成为50mM Tris-HCl，pH 8.0，5mM MgCl₂，1mM DTT。

本发明实施例中试验用DNA序列如下，由Takara公司合成并经HPLC纯化。所有溶液均用超纯水配制(电阻为18.2MΩ.cm)。

①特异性DNA探针1

AuNPs-SH-5’-AAA AAAACGAAGTCATCAAAAAAA-3’

②DNA探针2

5’-AGAGTTGTGTTTGGAGGA-3’

③DNA探针3

5’-TGATGACTTCGTAAAAAA-3’；

④发卡DNA

5’-TCCTCCAAACACAACTCTTGATGACTTCGTAGAGTT

GTGTTTGGAGGAGCTTCCCACTGCCAACCT-3’

⑤人工合成靶向苹果花叶病毒寡核苷酸(在NCBI数据库中查找已公布的苹果花叶病毒的基因序列，针对苹果病毒基因的高度保守区设计的一段待检寡核苷酸)

5’-AGGTTGGCAGTGGGAAGCTCCTCCAAACACAACTCTTGATGA-3’

实施例1

本发明一种苹果病毒检测试纸条，如图1所示，包括条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、涂覆特异性DNA探针1的金标结合物垫、特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，该特异性DNA探针1一端结合有纳米金，该硝酸纤维素膜上有用DNA探针2包被的直线式检测线T线和用DNA探针3包被的直线式质控线C线，如图1所示，待检苹果病毒液经靶向引发、ExoIII切割的循环放大原理得到大量单链DNA(序列4和2*)，该单链DNA与 AuNPs-DNA探针1上的序列4*和DNA探针2互补。

1、样品垫的制备

配制0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl缓冲液含Triton x-100的质量百分比为0.2％，含NaCl的浓度为150mM，pH值为7.5。将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液润湿后，在 20℃干燥4小时即得到样品垫。

2、涂覆特异性DNA探针的金标结合物垫的制备

a、将玻璃纤维纸用上述0.01mol/L PBS缓冲液润湿后，在20℃～37℃下干燥1～4小时；将 16μL的50μM序列为5’-(SH)AAAAAAACGAAGTCATCAAAAAAA-3’的DNA与200 μL上述配制的纳米金结合，过夜处理后，分6次分别相隔30min共加入24μL的上述配置的0.1mol/LPBS老化并过夜，然后离心，用上述配制的0.01mol/L PBS洗涤三次，沉淀重新溶于160μL含0.25％的Tween-20，5％BSA和10％蔗糖的20mM的磷酸盐缓冲液中，此磷酸盐溶液pH为7.4。即得特异性DNA探针1溶液，该特异性DNA探针一端结合有纳米金，该特异性DNA探针的结构为AuNPs-AuNPs-5’- (SH)AAAAAAACGAAGTCATCAAAAAAA-3’；

b、用移液枪取上述所得特异性DNA探针溶液，在每平方毫米的上述处理过的玻璃纤维纸上均匀涂覆0.6～0.75μL，在37℃下干燥1小时后，即得到涂覆特异性DNA探针1的金标结合物垫。

3、特定包被的硝酸纤维素膜的制备

先将硝酸纤维素膜在水中浸润，然后在20×SSC中泡一个小时，然后夹在两层滤纸中，37℃干燥20～30min，再用喷样仪将浓度为50μmol/L的DNA探针2溶液均匀喷涂于硝酸纤维膜上，形成直线式检测线T线，用喷样仪将浓度为50μmol/L的DNA探针3溶液沿与检测线 T线平行的方向均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，形成直线式质控线C线，室温下干燥1小时后，在80℃下烘烤1小时，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，其中DNA探针2的碱基与经 ExoIII循环反应切割得到的单链DNA部分互补配对，该DNA探针2的结构为5’- AGAGTTGTGTTTGGAGGA-3’，DNA探针3的碱基与DNA探针1的碱基互补配对，该 DNA探针3的结构为5’-TGATGACTTCGTAAAAAA-3’。

4、被检单链DNA的制备

10μmol/L结构为5’-TCCTCCAAACACAACTCTTGATGACTTCGTAGAGTT

GTGTTTGGAGGAGCTTCCCACTGCCAACCT-3’的发卡DNA 90℃加热10min，自然冷却，将待检苹果病毒液90℃加热10min，立即冰浴，然后将2.5μL 500nM的发卡DNA与2.5 μL的不同浓度的待检苹果病毒寡核苷酸液杂交于45μL的1×ExoⅢ buffer，37℃水浴中反应50min，加入1μL45u ExoⅢ，37℃反应1小时，即得单链DNA。

5、苹果病毒检测试纸条的制备

在条形底板上依次搭接样品垫、涂覆特异性DNA探针1的金标结合物垫、特定包被的硝酸纤维素膜、吸水垫(吸水垫为一种吸水纸，型号为SX27或CH27，吸水纸贴在条形底板的末端)，最后将试纸裁剪成3mm宽的细条，即得苹果病毒检测试纸条，检测时，将试纸条样品垫端插入经过处理的单链DNA中，靠毛细作用，样品依次通过涂覆特异性DNA探针1 的金标结合物垫，特定包被的硝酸纤维素膜，达到检测的目的。结果分别如图2所示，从左到右依次为不含苹果病毒寡核苷酸检测结果示意图(a)、含100nM的非特异性DNA的检测结果示意图(b)、10pM苹果病毒寡核苷酸(c)、100nM苹果病毒寡核苷酸检测示意图(d)，说明本发明苹果病毒检测试纸条具有高灵敏度和好的选择性。

实施例2

1、样品垫的制备、涂覆特异性DNA探针的金标结合物垫的制备、特定包被的硝酸纤维素膜的制备同实施例2

2、采集烟台农科院保存的苹果带花叶病毒阳性植株和脱毒植株样本，利用液氮速冻研磨和植物RNA提取试剂盒分别提取供试苹果叶片的总RNA。

3、被检单链DNA的制备

将10μmol/L结构为5’-TCCTCCAAACACAACTCTTGATGACTTCGTAGAGTT

GTGTTTGGAGGAGCTTCCCACTGCCAACCT-3’的发卡DNA95℃加热10min，自然冷却，将实际苹果病毒液95℃加热10min，立即冰浴，然后将2.5μL 500nM的发卡DNA与2.5 μL的上述提取的待检苹果病毒液杂交于45μL的1×ExoⅢbuffer，37℃水浴中反应60min，加入1μL50uExoⅢ，37℃反应1.5小时，即得大量单链DNA。

4、苹果病毒检测试纸条的制备

在条形底板上依次搭接样品垫、涂覆特异性DNA探针1的金标结合物垫、特定包被的硝酸纤维膜、吸水垫(吸水垫为一种吸水纸，型号为SX27或CH27，吸水纸贴在条形底板的末端)，最后将试纸裁剪成4mm宽的细条，即得苹果病毒检测试纸条。然后分别检测不含苹果病毒的溶液、含苹果病毒的溶液，结果分别如图3所示，从左到右依次为脱毒植物样本结果示意图、带花叶病毒检测示意图，说明本发明苹果病毒检测试纸条具有高选择性，且可以检测实际样品。

以上实施例不是穷举，其保护范围不限于所给出的实施例，比如此试纸条可以扩展到其他苹果病毒如苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒，也可以拓展到其他植物病毒的检测。凡是根据本发明的思路所能实现的所有的技术方案，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 一种苹果病毒检测试纸条及其制备方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性DNA探针1

<400> 1

AuNPs-SH-5’-aaaaaaacga agtcatcaaa aaaa-3’ 24

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA探针2

<400> 2

agagttgtgt ttggagga-3’ 18

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DNA探针3

<400> 3

tgatgacttc gtaaaaaa-3’ 18

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 发夹DNA

<400> 4

tcctccaaac acaactcttg atgacttcgt agagttgtgt ttggaggagc ttcccactgc 60

caacct 66

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成靶向苹果花叶病毒寡核苷酸

<400> 5

aggttggcag tgggaagctc ctccaaacac aactcttgat ga 42

Claims

1.一种苹果花叶病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括苹果花叶病毒检测试纸条、发卡DNA和ExonucleaseIII(ExoIII)，所述的试纸条由条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、涂覆特异性DNA探针1的玻璃纤维结合垫、特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫组成，所述的特异性DNA探针1一端结合有纳米金，硝酸纤维素膜上有DNA探针2包被的直线式检测线T线和DNA探针3包被的直线式质控线C线；所述的试纸条运用靶向基因引发的、ExoIII辅助的放大策略进行检测，经靶向苹果花叶病毒引发、ExoIII切割循环后产生的大量单链DNA作为样品垫上的待测试液，其一部分序列与DNA探针1-纳米金复合物上的DNA互补配对、另一部分序列与DNA探针2互补配对；且DNA探针1-纳米金复合物上的DNA与DNA探针3互补配对；

其中，特异性DNA探针1的序列为：

AuNPs-SH-5’-AAAAAAACGAAGTCATCAAAAAAA-3’

DNA探针2的序列为：

5’-AGAGTTGTGTTTGGAGGA-3’

DNA探针3的序列为：

5’-TGATGACTTCGTAAAAAA-3’

发卡DNA的序列为：

5’-TCCTCCAAACACAACTCTTGATGACTTCGTAGAGTTGTGTTTGGAGGAGCTTCCCACTGCCAACCT-3’。

2.根据权利要求1所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的样品垫为经0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡处理的玻璃纤维纸，其中Tris-HCl缓冲液含Tritonx-100的质量百分比为0.2％～0.3％，含120-150mM的NaCl，pH值为7.5～8.0。

3.根据权利要求1所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的特异性DNA探针1溶液在所述的玻璃纤维结合垫上的喷涂量为0.6～0.75μL/mm²，所述的特异性DNA探针1溶液为16-18μL的50-70μmol/L巯基标记的DNA与200μL粒径为13nm±2nm、浓度为15nM的纳米金结合，于4℃中过夜处理后，相隔25-30min分5-6次共加入24μL的0.1mol/L PBS老化并过夜，然后用0.01mol/L PBS洗涤三次，沉淀重新溶于160μL含0.25％的Tween-20，5％BSA和10％蔗糖的20mM的磷酸盐溶液中所得，pH为7.4～7.6；

所述0.1mol/L PBS由以下方法制得：分别配置0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄，将这两种溶液以一定比例混合，用pH计调pH值为7.0～7.4，将5.844g NaCl溶解于终体积为100mL的上述调节好的缓冲溶液中；

所述0.01mol/L PBS由以下方法制得：将0.1mol/L PBS稀释十倍得到0.01mol/L PBS。

4.根据权利要求1所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒，其特征在于：得到的大量单链DNA的制备过程如下：将10-15μmol/L发卡DNA 90-95℃加热10min，自然冷却后，待检苹果花叶病毒液90-95℃加热10min，立即冰浴，然后2.5μL 500nM的发卡DNA与2.5μL的待检苹果花叶病毒液杂交于45μL的1×ExoIII buffer中，37℃水浴中反应50-60min，加入1μL 45uExoIII，37℃反应1-1.5小时；其中1×ExoIII buffer含50mM Tris-HCl、5mM MgCl₂、1mMDTT，pH值为8.0。

5.根据权利要求1所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒，其特征在于：所述的DNA探针2包被用量为0.0002～0.0004μmol/mm，所述的DNA探针3包被用量为0.0002～0.0004μmol/mm。

6.一种苹果花叶病毒检测试剂盒的制备方法，所述试剂盒包括苹果花叶病毒检测试纸条、发卡DNA和ExoIII，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品垫的制备

将玻璃纤维用0.01～0.03mol/LTris-HCl缓冲液浸泡湿润后，在20℃～37℃干燥1～4小时即得到样品垫，其中Tris-HCl缓冲液含Tritonx-100的质量百分比为0.2％～0.3％，pH值为7.5～8.0；

(2)涂覆特异性DNA探针1的玻璃纤维结合垫的制备

将玻璃纤维纸用0.01mol/L PBS缓冲液浸泡湿润后，在20℃～37℃下干燥1～2小时后，在每平方毫米的玻璃纤维纸上均匀喷涂0.6～0.75μL的特异性DNA探针1-纳米金复合物溶液，在25℃～37℃下干燥1～4小时后，即得到涂覆特异性DNA探针1的玻璃纤维结合垫，所述的特异性DNA探针1一端结合有纳米金，所述的特异性DNA探针1的序列的另一端为巯基标记，其序列与发卡DNA的环序列互补；

所述 0.01mol/L PBS由以下方法制得：分别配置0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄，将这两种溶液以一定比例混合，用pH计调pH值为7.0～7.4，将5.844g NaCl溶解于终体积为100mL的上述调节好的缓冲溶液中得到0.1mol/L PBS，再将0.1mol/L PBS稀释十倍得到0.01mol/L PBS；

(3)特定包被的硝酸纤维膜的制备

先将硝酸纤维素膜在水中浸润，然后在20×SSC中泡一个小时，然后夹在两层滤纸中，37℃干燥20～30min，再用喷样仪将浓度为50-100μmol/L的DNA探针2溶液均匀喷涂于硝酸纤维膜上，形成直线式检测线T线，用喷样仪将浓度为50-100μmol/L的DNA探针3溶液沿与检测线T线平行的方向均匀喷涂于硝酸纤维膜上，形成直线式质控线C线，室温下干燥1～2小时后，在80℃下烘烤1～2小时，即得到特定包被的硝酸纤维膜，其中所述的DNA探针2的碱基与所述的经靶向DNA引发、ExoIII切割循环后产生的单链DNA部分互补配对，所述的DNA探针3的碱基与所述的DNA探针1的碱基互补配对；

(4)将步骤(1)得到的样品垫，步骤(2)得到的涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫，步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成3～5mm宽的细条，即得苹果花叶病毒检测试纸条；

其中，特异性DNA探针1的序列为：

AuNPs-SH-5’-AAAAAAACGAAGTCATCAAAAAAA-3’

DNA探针2的序列为：

5’-AGAGTTGTGTTTGGAGGA-3’

DNA探针3的序列为：

5’-TGATGACTTCGTAAAAAA-3’

发卡DNA的序列为：

5’-TCCTCCAAACACAACTCTTGATGACTTCGTAGAGTTGTGTTTGGAGGAGCTTCCCACTGCCAACCT-3’。

7.根据权利要求6所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的特异性DNA探针1溶液的制备方法如下：16-18μL的50-70μmol/L巯基标记的序列4*与200μL粒径为13nm±2nm、浓度为15nM的纳米金结合，于4℃中过夜处理后，相隔25-30min分5-6次共加入24μL的0.1mol/L PBS溶液老化并过夜，然后用0.01mol/L PBS洗涤三次，沉淀重新溶于160μL含0.25％的Tween-20，5％BSA和10％蔗糖的20mM的磷酸盐溶液中，混合均匀后，即得特异性DNA探针1溶液，所述的磷酸盐缓冲液pH值为7.4～7.6；

8.根据权利要求6所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的ExoIII切割得到的大量单链DNA的制备过程如下：10-15μmol/L特定序列发卡DNA90-95℃加热10min，自然冷却，待检苹果花叶病毒液90-95℃加热10min，立即冰浴，然后2.5μL500nM的发卡DNA与2.5μL的待检苹果花叶病毒液杂交于45μL的1×ExoIII buffer中，37℃水浴中反应50-60min，加入1μL 45u ExoⅢ，37℃反应1-1.5小时，所述的发卡DNA溶液的溶剂为1×ExoIII buffer，此1×ExoIII buffer含50mM Tris-HCl、5mM MgCl₂、1mM DTT，pH值为8.0。

9.根据权利要求6所述的一种苹果花叶病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述的DNA探针2溶液包被用量为0.0002～0.0004μmol/mm，所述的DNA探针3溶液包被量为0.0002～0.0004μmol/mm。