CN109358198A - 一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法 - Google Patents

一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法，该方法包括：以待定试剂浸种，得到植物幼苗；测定主根长，判断待定试剂能否促进植物根系生长，且进一步确定试剂的有效浓度区间；选择某一浓度处理下的幼苗，进行低温逆境处理，测定幼苗的主根褐化率和/或根系活力，判定待定试剂在表观上对植物根系是否有耐低温诱抗作用；提取幼苗根部总蛋白，获取蛋白质的鉴定和定量结果，筛选差异表达蛋白质，寻找差异表达蛋白质中是否存在与低温逆境相关的功能性蛋白；判定待定试剂是否为具有耐低温诱抗作用的植物免疫诱抗剂。本方法通过测定根系农艺指标、主根褐化率、根系活力和分析差异蛋白质，鉴定具促进水稻根系生长和提高水稻根系耐低温能力的植物免疫诱抗剂。

Description

一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法。
背景技术
植物免疫诱抗剂又称植物疫苗，能够激活植物体内分子免疫系统，使植物自身产生抗菌物质，提高植物抗病性，同时还能激发植物体内的一系列代谢调控系统，具有促进植物生长和增加作物产量的作用。植物天然免疫具有预防性、系统性、稳定性、相对性、安全性等一系列优点，可以解决化学防治存在的病原菌抗药性、环境污染和对人畜副作用的问题，实现农产品无害化生产和农业可持续发展。
目前，诱抗剂可分为非生物来源和生物来源两大类。非生物来源的诱抗剂包括无机盐、有机酸、寡糖类、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等。生物来源的诱抗剂除源自植物的寡聚半乳糖和源自细菌的过敏素(harpin)外，还包括病毒衣壳蛋白、糖蛋白类等诱抗剂。
有些生物源激发子是无毒基因的产物，是专化性的，但大部分激发子是非专化性的。病原微生物作为激发子可以是活体菌、菌体培养滤液、菌体匀浆或菌体细胞提取液等，主要是非致病性或弱致病性病菌。研究发现可可丛枝病原菌Crinipellis perniciosa菌丝体的水溶液可激活番茄对疮痂病的抗性，诱导体内过氧化物酶、多酚氧化酶、几丁质酶的积累和木质素的沉积。黄青霉Penicillium chrysogenum的提取物可以作为诱导因子，诱导拟南芥对霜霉病、灰霉病、黑斑病和细菌性斑点病的抗性。木霉菌可直接与植物相互作用，能够诱导植物产生对病原菌的抗性。大蒜、洋葱、花椒、大黄等植物源提取物作为激发子可以诱导马铃薯抗晚疫病。前胡、白芷的水提取液可诱导水稻对稻瘟病的抗性及小麦对赤霉病的抗性。青蒿、独活可诱导西瓜抗花叶病。
果寡糖又名低聚果糖，是在蔗糖分子基础上以糖苷键的形式结合数个D-果糖所形成的一类低聚糖的总称，具有低热、稳定、安全无毒的良理化性能，大部分不能被动物本身的消化酶所消化，但到达肠道后可作为有益微生物的底物，而不能被病原微生物利用，从而促进有益微生物的繁殖和抑制有害微生物。果寡糖还能促进人体内B族维生素合成，提高机体新陈代谢水平，增强免疫力和抗病力，同时促进钙、镁、铁等矿物质的吸收。研究表明果糖对拟南芥根的生长发育具有促进作用，而果寡糖作为一种以果糖为基础分子聚合而成的糖类物质，推测可能对植物根的生长具有促进作用。天然植物中存在的果寡糖主要是由植物中的果糖转移酶通过催化反应生成，其中富含果寡糖的植物主要有菊薯、菊芋、冬小麦和洋葱等。研究发现菊薯粗糖主要是由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖组成，其中果寡糖占其干物质的45％-65％。
目前，植物免疫诱抗评价大多涉及到组织形态学和生理生化等指标，如叶片表面蜡质层厚度、细胞壁厚度、叶绿素含量、光合作用参数、抗性酶活性等。而分子生物学评价指标除病程相关的PR蛋白的表达量外，很少涉及相关功能基因表达和组学指标，例如GO分类和关键途径富集分析。
因此，本发明旨在通过基于水稻根系生长系统来评价植物免疫诱抗剂对水稻根系耐低温的诱抗效果，并利用蛋白质组学分析揭示果寡糖促进水稻耐低温的机制。
发明内容
本发明提供了一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法，该方法以植物根系生长系统为研究对象，通过根系、主根褐化率、根系活力和差异蛋白质分析等指标的整合，评价和鉴定能够促进水稻根系生长和提高水稻根系耐低温能力的植物免疫诱抗剂。
具体技术方案如下：
一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法，包括：
(1)配制不同浓度梯度的待定试剂，以采用不同浓度待定试剂浸种的处理为处理组I，清水浸种的处理为对照组I，对植物种子进行浸种、清洗和催芽，得到不同处理下的植物幼苗；
(2)测定植物幼苗的根系农艺指标，以是否存在处理组I幼苗根系农艺指标显著大于对照组I的情况作为依据，判断待定试剂能否促进植物根系生长；
若处理组I中所有浓度梯度处理下的幼苗根系农艺指标均不显著大于对照组I，则判定待定试剂对植物根系生长无促进作用，不再进行后续鉴定步骤；反之，则判定待定试剂对植物根系生长有促进作用，并进一步确定待定试剂促进植物根系生长的有效浓度区间；
(3)从所述有效浓度区间内选择某一浓度，取出步骤(1)中该浓度处理下的植物幼苗，与对照组I幼苗一同置于1～10℃条件下进行低温逆境处理，得到处理组II和对照组II的幼苗，处理结束后，测定幼苗的主根褐化率和/或根系活力，统计分析两组数据是否具有显著性差异；
若处理组II幼苗的主根褐化率显著低于对照组II，和/或根系活力显著高于对照组II，则进行步骤(4)，反之，则判定待定试剂在表观上对植物根系无耐低温诱抗作用，不再进行后续鉴定步骤；
(4)取步骤(3)中处理组II和对照组II的幼苗，提取和分离幼苗根部的总蛋白，利用质谱技术获取蛋白质的鉴定和定量结果，并进一步筛选处理组II和对照组II之间的差异表达蛋白质，再利用基因功能和信号通路分析技术，寻找差异表达蛋白质中是否存在与低温逆境相关的功能性蛋白；
若存在与低温逆境相关的功能性蛋白，则判定待定试剂为具有耐低温诱抗作用的植物免疫诱抗剂，反之则无。
本发明上述方法可用于鉴定单子叶植物的根系生长系统，例如：水稻、小麦、玉米、高粱等；其中，本发明以水稻品种“浙优一号”为例进行试验，发现上述方法较为适宜，故作为优选，所述植物为水稻。
对于水稻而言，进一步地，步骤(1)中，所述催芽的温度为25～30℃，时间为30～50h。适宜的催芽温度和时间可有效获得适宜根、苗长度的水稻幼苗，进而有利于幼苗主根长度的测定。根据不同植物种子，可适当调整催芽的温度和时间。
进一步地，步骤(2)中，选择根长0.8～1.2cm、芽长0.4～0.6cm的水稻幼苗进行低温逆境处理；低温逆境处理的时间为40～50h。
进一步地，所述待定试剂为果寡糖；更进一步地，所述果寡糖为蔗果四糖。
本发明实施例中以蔗果四糖为例，以蔗果四糖作为待定试剂处理水稻根系，进而鉴定蔗果四糖在促进水稻根系生长以及提高水稻根系耐低温能力方面的诱抗效果。蔗果四糖可以是购买的市售产品，也可以是从菊薯粗糖中分离获得。经试验发现，蔗果四糖为具有耐低温诱抗作用的植物免疫诱抗剂。
本发明提供的鉴定方法也可以专门用于果寡糖或蔗果四糖对不同单子叶植物根系系统或者水稻不同品种根系系统的耐低温诱抗作用的鉴定。
进一步地，对于菊薯粗糖和蔗果四糖而言，步骤(1)中，所述待定试剂的浓度梯度范围可设置为30～100ppm；所述浸种的温度为25～30℃，时间为20～30h。
其中，本发明针对水稻种子设置的浓度梯度为50ppm、75ppm和100ppm；试验发现，在100ppm时蔗果四糖对水稻幼苗的生长并无促进作用，说明在进行免疫诱抗剂功能鉴定时应当先找到免疫诱抗剂对特定植物的有效浓度区间，再进行后续鉴定工作。
进一步地，步骤(2)中，所述的根系农艺指标为主根长、侧根长、侧根数、侧根根毛数和根生物量中的至少一种。其中，根生物量是指根干重或者根鲜重。
进一步地，步骤(2)和(3)中，差异显著性的判断标准为P>0.05。
步骤(3)中，总蛋白的提取方法为用液氮将幼苗根部磨成粉末后，依次加入至蛋白提取液I和蛋白提取液II中进行两次提取，再经离心、真空抽干，得到粗蛋白干粉。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本方法以植物根系生长系统为研究对象，通过测定主根长、主根褐化率、根系活力和分析差异蛋白质，评价和鉴定能够促进水稻根系生长和提高水稻根系耐低温能力的植物免疫诱抗剂。
附图说明
图1为不同处理下水稻主根褐化率的比较。
图2为不同处理下水稻根系活力的比较。
图3为蔗果四糖浸种处理对免疫相关蛋白PR10表达的影响；
其中，CK：对照；LT：低温处理“+”：蔗果四糖处理；“-”：清水处理；HSP：热激蛋白作为调量对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1
一、试验材料
杂交水稻品种“中浙优一号”，由浙江勿忘农种业有限公司提供。
蔗果四糖标准品：购于西宝生物有限公司(纯度99％)。
二、植物免疫诱抗剂的鉴定方法
1、配制不同浓度梯度的待定试剂，以采用不同浓度待定试剂浸种的处理为处理组I，清水浸种的处理为对照组I，对水稻种子进行浸种、清洗和催芽，得到不同处理下的水稻幼苗。
具体步骤如下：
(1)配制100mL 50mg/L、100mL 75mg/L和100mL 100mg/L三个浓度梯度的蔗果四糖水溶液(即待定试剂)，以采用蔗果四糖水溶液浸种的处理为处理组I，清水浸种的处理为对照组I，在30℃下浸种24h，每个处理重复两次；
(2)浸种结束后，弃去蔗果四糖水溶液，然后用纯水清洗三遍，以洗去多余的蔗果四糖水溶液。
(3)将水稻种子置于用水润湿滤纸的发芽盒中，上面盖一层用纯水浸润的滤纸，然后放入30℃培养箱中催芽45h，得到水稻幼苗。
2、测定水稻幼苗的主根长，以是否存在处理组I幼苗主根长显著大于对照组I的情况作为依据，判断待定试剂能否促进水稻根系生长；
若处理组I中所有浓度梯度处理下的幼苗主根长均不显著大于对照组I，则判定待定试剂对水稻根系生长无促进作用，不再进行后续鉴定步骤；反之，则进一步确定待定试剂促进植物根系生长的有效浓度区间；
其中，水稻幼苗主根长的测定和统计方法为：用尺子量取主根长；结果如图1所示，从图1中可以看出，50ppm和75ppm蔗果四糖处理的水稻主根长均极显著高于对照，而100ppm蔗果四糖处理的水稻主根长与对照相比无显著差异；所以，判定蔗果四糖对水稻根系生长有促进作用，并进一步确定蔗果四糖促进植物根系生长的有效浓度区间为50～75ppm。结果如下：
3、从所述有效浓度区间内选择75ppm浓度值，取出步骤(1)中该浓度处理下的水稻幼苗，与对照组I幼苗一同置于4℃条件下进行低温逆境处理，得到处理组II和对照组II的幼苗，处理结束后，测定幼苗的主根褐化率和根系活力，统计分析两组数据是否具有显著性差异；
若处理组II幼苗的主根褐化率显著低于对照组II，和/或根系活力显著高于对照组II，则进行步骤(4)，反之，则判定待定试剂在表观上对植物根系无耐低温诱抗作用，不再进行后续鉴定步骤；
其中，挑选根长约1cm和芽长0.5cm左右长势正常的水稻幼苗平铺在湿润滤纸的发芽盒中，每行可以摆放8粒幼苗，共6排一共为48粒；共摆放3盒处理组I的幼苗和3盒对照组I的幼苗，然后，放入至4℃冰箱处理48h，得到处理组II和对照组II的幼苗；
主根褐化率的测定方法为：实时观察幼苗表型，统计水稻幼苗根部褐化数目，结果表明处理组II水稻幼苗根部褐化率明显低于对照组II，说明菊薯粗糖提高水稻根系的抗低温损伤能力(图1)。
处理 主根褐化率(％)
对照组II 38.67±1.53 A
处理组II 8.33±0.58 B
根系活力的测定方法为：
(1)将表型明显的处理组II和对照组II的水稻幼苗(一般在冷处理完恢复3天后)主根剪下，每份称取0.5g，每个实验组三个重复，再剪成约0.5cm的小段。将剪碎的水稻根放入10mL离心管中，同时加入5mL新鲜配制的0.4％TTC溶液和5mL磷酸缓冲液等量混合成10mL保证所有根都浸没在混合溶液中。在37℃的恒温培养箱中暗处理2小时，以保证所有根充分染色(显红色)；
(2)与此同时，制作TTC标准曲线，取0.4％TTC溶液0.4mL再加入19.6mL乙酸乙酯和适量的保险粉，它们所反应生成的红色溶液为TTF溶液作为制作标准曲线的母液。分别配制20、40、80、120、160、200微克的TTF溶液，其中配置20微克TTF反应液所需的母液与甲醇的体积分别0.5mL和19.5mL，用紫外分光光度计485nm波长测定6个梯度的OD值，绘制标准曲线；
(3)暗处理反应完成后向每个管子中加入2mL的1mol/L的硫酸以中止反应。将根取出倒入包有滤纸的漏斗中，将溶液尽量滤干。向50mL离心管中加入10mL甲醇，将根加入甲醇中，37℃恒温培养箱中避光过夜脱色至根部变白为止；
(4)用分光光度计测定485nm下OD值，利用标准曲线获得相应OD值下TTF的质量，根据公式A＝cm/nt其中A为根系活力，c为标准曲线上获得的TTF值，m为测定吸光值时的稀释倍数，n为质量，t为用TTC溶液染液的反应时间；作图并分析数据。
结果如图2所示，在正常温度条件下蔗果四糖处理组II水稻幼苗根系活力与对照组II无明显差异，但是在低温处理条件下处理组II水稻幼苗根系活力显著高于对照组II；所以，说明蔗果四糖对在表观上对植物根系有耐低温诱抗作用，继续步骤(4)。
4、取步骤(3)中处理组II和对照组II的幼苗，提取和分离幼苗根部的总蛋白，利用质谱技术获取蛋白质的鉴定和定量结果，并进一步筛选处理组II和对照组II之间的差异表达蛋白质，再利用基因功能和信号通路分析技术，寻找差异表达蛋白质中是否存在与低温逆境相关的功能性蛋白；
若存在与低温逆境相关的功能性蛋白，则判定待定试剂为具有耐低温诱抗作用的植物免疫诱抗剂，反之则无。
具体方法如下：
(1)在4℃的低温逆境(即冷处理)条件下处理48小时后，恢复正常培养5天，再剪下处理组II和对照组II的幼苗的根，用液氮冻存，作为蛋白质组学实验材料。
(2)水稻根蛋白质提取、酶解及质谱分析
2.1配制蛋白提取液II：500ml丙酮+350μlβ-巯基乙醇；以及蛋白提取液I：40g三氯乙酸(TCA)溶于400ml的蛋白提取液II。
2.2用液氮将水稻根研成粉，装入2ml离心管中(将勺匙放入液氮中预冷)。加入1.5ml蛋白提取液I(-20℃，1h)期间晃匀5～6次，4℃13000rpm离心20min。
2.3弃上清，加入1.5ml蛋白提取液II(-20℃，1h)期间晃匀5～6次，4℃13000rpm离心20min。重复步骤3的操作2次。取沉淀，真空抽干得到粗蛋白干粉(抽干时间约为半小时左右)。
2.4配制裂解液UTC：8M尿素，100mM Tris-HCl(PH 8.5)，1mM PMSF(PMSF储液浓度100mM，乙醇配制)。用裂解液溶解粗蛋白干粉(5～10μl/mg)，室温放置1h(旋涡5～6次)。
2.5 4℃12000rpm离心20min取上清得蛋白样品进行浓度测定。用Bradford法测定蛋白浓度，一般将蛋白浓度控制在1mg/mL左右。
2.6根据已经测定的蛋白浓度，计算酶解150微克蛋白所需要的蛋白的量，反应总体积设定为200微升，不足的液体用碳酸氢铵补足。
2.7加入11μl 100mM的DTT使其终浓度为10mM，适度旋涡，放于37℃的金属浴上反应1h。
2.8加入12μl 500mM的IAA使其终浓度为50Mm左右，避光室温反应30min。
2.9将上述反应液转移至超滤管中，4℃12000rpm离心15min.。弃收集管中废液，再向超滤管中加入150μl 100mM NH4HCO3 4℃12000rpm离心15min.。重复步骤4的操作1次。
2.10更换新的收集管，超滤管中加入100mM NH4HCO3至总体积为100μl，按照蛋白质量：Trypsin＝25:1的比例加入Trypsin(1μg/μl)，于37℃金属浴上过夜(12h至16h)。酶解完成4℃12000rpm离心15min，再向超滤管中加入100μl 100mM NH4HCO3重复离心一次即得肽段溶液。在肽段溶液中加入5％TFA至TFA终浓度为0.1-1％，使肽段酸化。
2.11将C18tip紧密固定在100μl移液器上，吸取100μl 50％ACN后打出，重复一次以润湿C18填料。2.12吸取吹打0.1％TFA 2次以平衡C18tip。吸取吹打肽段样品50次以达到最佳吸附效果。
2.12吸取吹打0.1％TFA/5％ACN 10次以清洗肽段样品。依次缓慢吸取50μl含0.1％TFA的50％、60％、70％、80％已腈以洗脱肽段，并将洗脱液收集到新的1.5mlEP管中。
2.13得到终体积200μl的样本，真空旋转抽干。加入80μL 0.1％FA适当涡旋溶解，转移至样品瓶中上机检测。
质谱数据采集：利用Easy-nano LC 1000液相仪和Q Exactive质谱仪(ThermoScientific)进行质谱分析。
保护柱：Acclaim PepMap 100(75μm内径*2cm长，3μm颗粒C18)，分析柱：Ac claimPepMap RSLC(50μm内径*15cm长，3μm颗粒C18)，液相梯度：0-4min,4-7％B；4-66min,7-14％B；66-88min,14-19％B；88-104min,19-34％B；104-120min,34-84％B(A:0.1％FA in H2O，B:0.1％FA in ACN)；喷针电压2.0kV。
毛细管温度：320℃；S-lens：55％；碰撞能量：27％HCD；分辨率设置：一级70 000@m/z 200，二级17 500@m/z 200；母离子扫描范围：m/z 300-2000；子离子扫描范围：startfrom m/z 100。以DDA模式(Data-dependent)采集前20(T OP20)的肽段。
(3)蛋白质组学数据生物信息学分析方法
3.1采集质谱所获得的数据，导入maxquant软件中分析，查看结果，获得可信度较高的蛋白总数。
3.2将maxquant软件分析的结果文件“proteingroup”导入perseus软件，通过相关系数分析三个重复之间的重复性如何。
3.3制作火山图根据p值小于等于0.5(即-logp大于等于1.3)和difference大于等于0.585(即fold change大于等于1.5)来筛选出显著上调的但蛋白，同样的根据difference小于等于-0.585来筛选出显著下调的蛋白。
3.4按照以下表格(表1和表2)中蔗果四糖处理(简称糖处理)和对照进行分析，以下分析组用字母编号代替。
表1不同处理编号
表2不同处理相互比较
3.5分析上调和下调差异蛋白，韦恩图分析的共同差异上调和下调蛋白，并做GO和KEGG分析。
表3 CK1vs T1上调差异蛋白
表4 CK1vs T1下调差异蛋白
表5 LCK1vs LT1上调差异蛋白
表6 LCK1vs LT1下调差异蛋白
表7 CK2vs T2上调差异蛋白
表8 CK2vs T2下调差异蛋白
表9 LCK2vs LT2上调差异蛋白
表10 LCK2vs LT2下调差异蛋白
表11 CK7vs T7显著上调蛋白
表12 CK7vs T7显著下调蛋白
表13 RCK7vs RT7显著上调蛋白
表14 RCK7vs RT7显著下调蛋白
表15蔗果四糖处理诱导生物与非生物逆境相关蛋白质的表达
将数据导入Maxquant软件分析后获得初步蛋白质组学数据，随后按照表2的比较组进行相互比较，根据p值大于等于0.05为显著，即-log10大于等于1.3，同时筛选显著上调的差异蛋白，以difference大于等于0.585为标准即fold change大于等于1.5，同理筛选出显著下调的蛋白，以difference小于等于-0.585为标准即fold change小于等于-1.5。筛选获得的显著上调和下调蛋白数，同时，分别列出了CK1vs T1(附表1和附表2)、LCK1vs LT1(附表3和附表4)、CK2vs T2(附表5和附表6)和LCK2vs LT2(附表7和附表8)的显著上调和下调蛋白的差异倍数。
与对照相比，正常条件培养24h下，蔗果四糖处理的差异蛋白数64个，其中上调蛋白41个和下调蛋白23个，而在低温条件下，蔗果四糖处理的差异蛋白数36个，其中上调蛋白23个和下调蛋白13个。正常条件培养48h下，蔗果四糖处理的差异蛋白数95个，其中上调蛋白51个和下调蛋白44个，而在低温条件下，蔗果四糖处理的差异蛋白数97个，其中上调蛋白53个和下调蛋白44个。正常条件培养7d下，蔗果四糖处理的差异蛋白数81个，其中上调蛋白31个和下调蛋白50个，而在低温2d后正常培养5d条件下，蔗果四糖处理的差异蛋白数124个，其中上调蛋白49个和下调蛋白75个。
另外，从上述差异蛋白中，具体列出了23个与生物逆境和非生物逆境相关蛋白(附表13)，它们主要参与激素茉莉酸、水杨酸、脱落酸等信号途径。
为了验证蛋白表达的真实性，选取3个免疫相关蛋白PR10即RSOsPR10、PR10a和OsPR10c，利用免疫印迹法(Western blot)检测24h(正常/低温处理)和48h(正常/低温处理)的3个蛋白表达情况(图3)，结果发现在正常培养24h条件下仅RSOsPR10受蔗果四糖诱导表达，而在正常培养48h条件下，RSOsPR10、PR10a和OsPR10c均受受蔗果四糖诱导表达。在低温处理下，3个蛋白均受低温诱导表达。

Claims (8)

1.一种植物免疫诱抗剂的鉴定方法，其特征在于，包括：
(1)配制不同浓度梯度的待定试剂，以采用不同浓度待定试剂浸种的处理为处理组I，清水浸种的处理为对照组I，对植物种子进行浸种、清洗和催芽，得到不同处理下的植物幼苗；
(2)测定植物幼苗的根系农艺指标，以是否存在处理组I幼苗根系农艺指标显著大于对照组I的情况作为依据，判断待定试剂能否促进植物根系生长；
若处理组I中所有浓度梯度处理下的幼苗根系农艺指标均不显著大于对照组I，则判定待定试剂对植物根系生长无促进作用，不再进行后续鉴定步骤；反之，则判定待定试剂对植物根系生长有促进作用，并进一步确定待定试剂促进植物根系生长的有效浓度区间；
(3)从所述有效浓度区间内选择某一浓度，取出步骤(1)中该浓度处理下的植物幼苗，与对照组I幼苗一同置于1～10℃条件下进行低温逆境处理，得到处理组II和对照组II的幼苗，处理结束后，测定幼苗的主根褐化率和/或根系活力，统计分析两组数据是否具有显著性差异；
若处理组II幼苗的主根褐化率显著低于对照组II，和/或根系活力显著高于对照组II，则进行步骤(4)，反之，则判定待定试剂在表观上对植物根系无耐低温诱抗作用，不再进行后续鉴定步骤；
(4)取步骤(3)中处理组II和对照组II的幼苗，提取和分离幼苗根部的总蛋白，利用质谱技术获取蛋白质的鉴定和定量结果，并进一步筛选处理组II和对照组II之间的差异表达蛋白质，再利用基因功能和信号通路分析技术，寻找差异表达蛋白质中是否存在与低温逆境相关的功能性蛋白；
若存在与低温逆境相关的功能性蛋白，则判定待定试剂为具有耐低温诱抗作用的植物免疫诱抗剂，反之则无。
2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物为水稻。
3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述催芽的温度为25～30℃，时间为30～50h。
4.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，选择根长0.8～1.2cm、芽长0.4～0.6cm的水稻幼苗进行低温逆境处理；低温逆境处理的时间为40～50h。
5.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待定试剂为果寡糖。
6.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述果寡糖为蔗果四糖。
7.如权利要求2或5任一项所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待定试剂的浓度梯度设置范围为30～100ppm；所述浸种的温度为25～30℃，时间为20～30h。
8.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的根系农艺指标为主根长、侧根长、侧根数、侧根根毛数和根生物量中的至少一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张子杰: "外源蔗果四糖调节水稻根响应低温的蛋白质组学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（农业科技辑）》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114303685A (zh) * 2020-09-29 2022-04-12 中国科学院微生物研究所 检测单子叶植物中产生pti反应的方法

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