CN111693518A - 一种汞离子的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将胸腺嘧啶‑Hg2+‑胸腺嘧啶(T‑Hg2+‑T)配位化学和熵驱动催化显色反应联用的汞离子检测方法。熵驱动的催化反应由T‑Hg2+‑T配位化学诱导，导致释放出富G序列。可以在氯化血红素的帮助下形成氯化血红素/G‑四联体结构，形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，氧化底物3,3',5,5'‑四甲基联苯胺，颜色从无色变为蓝色，在0.05nM至2nM之间存在良好的线性关系。该方法可用于水中Hg2+浓度的现场分析。
Description
技术领域
本发明涉及汞离子的检测领域，特别是将胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配位化学和熵驱动催化显色反应联用的汞离子检测方法领域。
背景技术
汞污染已成为人类健康和环境保护的全球性问题。尽管汞在环境中天然存在，但人类活动导致汞进入环境，如采矿，化石燃料燃烧和固体废物焚烧等。痕量的Hg2+可能通过与含巯基的分子结合而通过生物累积积聚在人体内。人体内的Hg2+即使在极低浓度下也会引起神经系统疾病，肾脏疾病和其他疾病，因为它的毒性很高。因此，有必要开发一种检测食品安全和环境保护领域Hg2+的灵敏度方法。由于肉眼可以简单，快速和可观察到结果，比色法引起了很多关注。不同种类的比色法已被用于基于金纳米粒子、石墨烯、SiO2纳米粒子、银纳米粒子和G-四联体等的Hg2+检测。然而，上述方法的灵敏度不足或选择性较差。
现有技术已经证明了胸腺嘧啶-胸腺嘧啶错配碱基对与Hg2+之间的高亲和力。胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配位化学已经与比色法，荧光，电化学，电化学发光和增强拉曼散射法结合。但是，现有技术的检测限高于30nM(由世界卫生组织设定的饮用水中汞的最大污染物水平)，无法满足实际应用的要求。为了显著提高灵敏度，现有技术中使用了杂交链式反应、发夹催化自组装、催化自组装等无酶的信号增强方法用于胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配位的Hg2+检测。这些方法中的大多数是由碱基对形成的自由能驱动的，这可能导致相对高的背景和假阳性结果。
尚无将胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配位化学和熵驱动催化显色反应联用的汞离子检测方法的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种将胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配位化学和熵驱动催化显色反应联用的汞离子检测方法。
本发明包括如下步骤：
(1)在待测溶液中加入适量DNA复合物、序列T和燃料链F，所述序列T为：5’-TTCATTGTGTTACTTT_TCTCCA-3’；所述DNA复合物由序列R、序列Q和序列P杂交形成，其中序列R为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGTTTCAC-3’，序列Q为5’-TGGAGA_TTTGTTTCTCTTTGTT_AGGG_GTGAAACCCATCCCG-3’，序列P为5’-CCACATACATCATATT_CCCT_AACAAAGAGAAACAAA-3’；所述燃料链F为5’-CGGGATGGGTTTCAC_CCCT_AACAAAGAGAAACAAA-3’；
(2)将步骤(1)所得溶液加入含有适量MgCl2的Tris-HCl缓冲溶液中孵育；
(3)在步骤(2)所得溶液中加入适量氯化血红素和适量KCl；
(4)将步骤(3)所得溶液加入含有适量3,3',5,5'-四甲基联苯胺和H2O2的Tris-HCl溶液中；
(5)测定其UV-vis吸收光谱，并用标准曲线法计算溶液中汞离子浓度。
优选的，所述DNA复合物形成步骤如下：将50nM序列P，50nM序列R和50nM序列Q混合在一起并在10mM Tris-HCl溶液(pH8)中加热至90℃保持5分钟，然后将其缓慢冷却以形成DNA复合物。
优选的，步骤(1)中加入的DNA复合物、序列T和燃料链F分别为50nM、100nM和100nM。
优选的，步骤(2)具体为将步骤(1)所得溶液加入含有5mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中在37℃下孵育120分钟。
优选的，步骤(3)中加入的氯化血红素和KCl分别为30nM和25mM。
优选的，步骤(4)具体为：将步骤(4)所得溶液加入含有600μM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺和10mM H2O2的Tris-HCl溶液(pH 5.5)中。
本发明创造性地将胸腺嘧啶-Hg2+-胸腺嘧啶(T-Hg2+-T)配位化学和熵驱动催化显色反应联用，不仅多级放大汞离子信号，提高了灵敏度，还使得信号以肉眼可见形式出现，直观且容易检测，降低成本。
附图说明
图1(A)不同浓度的Hg2+(0.05nM，0.1nM，1nM，2nM，4nM，5nM和10nM)的UV-vis吸收光谱曲线。(B)作为Hg2+浓度的函数的Δ吸光度强度和具有不同浓度的Hg2+的样品的照片。插图：浓度校准曲线在0.05nM至2pM范围内。
图2为本发明检测过程示意图。
图3为对比例一中不同样品的紫外-可见吸收光谱曲线和△吸光度强度(插图：照片)。
图4为对比例二中不同样品的吸光度对比。
具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
绘制标准曲线：配制梯度浓度的汞离子标准溶液，溶液浓度分别为：0.05nM,0.1nM,0.5nM,1nM,2nM,4nM,5nM,10nM。将适量上述标准溶液分别与100nM序列T，50nM DNA复合物和100nM燃料链F混合，在37℃下在含有5mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中孵育120分钟。然后，在上述溶液中加入30nM氯化血红素和25mM KCl，最后，将其加入600μM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺和10mM H2O2的Tris-HCl溶液(pH 5.5)中用于显色反应。通过UV-vis分光光度计检测UV-vis吸收光谱。如图1A所示，吸光度强度随着Hg2+浓度的增加而升高。在0.05nM至2nM的吸光度强度和Hg2+浓度之间显示出良好的线性相关性(图1B)。回归方程可表示为Y＝0.11331+0.0575C(R2＝0.999)，其中Y和C分别代表吸光度强度和Hg2+浓度。检测限(LOD)计算为7pM，Hg2+的目测检测限约为0.1nM。绘制吸光度-浓度标准曲线。
将适量待测溶液与100nM序列T，50nM DNA复合物和100nM燃料链F混合，在37℃下在含有5mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中孵育120分钟。然后，在上述溶液中加入30nM氯化血红素和25mM KCl，最后，将其加入600μM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺和10mMH2O2的Tris-HCl溶液(pH 5.5)中用于显色反应。通过UV-vis分光光度计检测UV-vis吸收光谱。通过标准曲线计算待测溶液中汞离子浓度。
检测微观过程如图2所示：序列Q显示为链1*，2*，3*，4*；序列R显示为链1；序列P显示为链5，2，3；序列T显示为链3’，4；燃料链F显示为链1”，2”，3”。序列T后端(表示为4)可以结合在序列Q的前端(表示为4*)。在序列Q的尾部存在富含胸腺嘧啶的部分。在Hg2+存在下，序列T和Q之间的T-Hg2+-T配位化学可以从DNA复合物中取代序列R，然后暴露序列Q的结构域2*。然后结构域2*成为燃料链F置换序列R和序列T的立足点。序列T可以进入下一个循环并引起大量序列R的释放。氯化血红素与富含G的序列R形成氯化血红素/G-四联体结构，形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，氧化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺，颜色从无色变为蓝色，。
实施例2
从自来水，溪流和泉水中收集水样。在测量之前，将所有水样品通过0.22μm膜过滤以除去固体残余物。检测过程同实施例1，检测结果如表1所示，实际水样中Hg2+的浓度分别为自来水，小溪水和泉水。回收率从91.6％上升至105.3％。这些结果表明在真实环境水样中检测汞离子具有很大的前景。
表1.真实水样检测结果
对比例一
为体现上述实施例的技术效果，特提供以下对比例：1、空白样品，待测溶液中不含有汞离子，其余检测过程同实施例1。2、用序列T’替换实施例1中的序列T，序列T’为：5’-CCCACCGCGCCACCCC_TCTCCA-3’，其余检测过程同实施例1。3、检测过程不添加燃料链F，其余检测过程同实施例1。4、燃料链F的浓度为实施例1中燃料链F的浓度的一半，其余检测过程同实施例1。5、DNA复合物由序列P，R'和Q'形成，序列R'5’-CTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3’，序列Q'为：5’-TGGAGA_TTTGTTTCTCTTTGTT_AGGG_CCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAG-3’，其余检测过程同实施例1。6、检测过程同实施例1。
结果显示在图3中，对比例1中，样品不含Hg2+，检测结果显示出背景吸光度强度。对比例2中，由于更换序列T的胸腺嘧啶区域，得到低吸光度强度。对比例3中，在没有燃料链的情况下，熵驱动的催化反应不能进行，显示出弱的吸收强度证明T-Hg2+-T碱基对启动熵驱动的催化反应至关重要。对比例4中，具有一半浓度燃料链的样品显示出强吸收强度和浅蓝色，证明熵驱动的催化反应不能仅用一半浓度的燃料链完全完成。对比例5中，序列R的G富集区域被没有G富集区域的R'取代，导致弱吸光度强度。因为没有G富集区域的存在而不能形成氯化血红素/G-四联体结构，。样品6的检测结果显示出强吸收强度和深蓝色，所有反应成分均表明T-Hg2+-T配位化学成功启动了熵驱动的催化反应，并且成功形成了氯化血红素/G-四联体结构，形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，氧化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺，颜色从无色变为蓝色。
对比例二
将实施例1中的汞离子分别替换成相同浓度的Cu2+，Ca2+，Pb2+，Co2+，Fe2+，Sn2+和Zn2 +，其余检测过程同实施例1。检测结果如图4所示，该方法对Hg2+表现出强烈的响应信号。然而，用其他干扰金属离子获得的信号可忽略不计。与2nM Hg2+信号相比，干扰金属离子的信号强度要弱得多。由于T-Hg2+-T配位化学的强亲和力，这些结果证明了所提出方法的良好选择性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种溶液中汞离子浓度的检测方法，包括如下步骤：
(1)在待测溶液中加入适量DNA复合物、序列T和燃料链F，所述序列T为：5’-TTCATTGTGTTACTTT_TCTCCA-3’；所述DNA复合物由序列R、序列Q和序列P杂交形成，其中序列R为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGTTTCAC-3’，序列Q为5’-TGGAGA_TTTGTTTCTCTTTGTT_AGGG_GTGAAACCCATCCCGCCCAACCC-3’，序列P为5’-CCACATACATCATATT_CCCT_AACAAAGAGAAACAAA-3’；所述燃料链F为5’-GGGTTGGGCGGGATGGGTTTCAC_CCCT_AACAAAGAGAAACAAA-3’；
(2)将步骤(1)所得溶液加入含有适量MgCl2的Tris-HCl缓冲溶液中孵育；
(3)在步骤(2)所得溶液中加入适量氯化血红素和适量KCl；
(4)将步骤(3)所得溶液加入含有适量3,3',5,5'-四甲基联苯胺和H2O2的Tris-HCl溶液中；
(5)测定其UV-vis吸收光谱，并用标准曲线法计算溶液中汞离子浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA复合物形成步骤如下：将50nM序列P，50nM序列R和50nM序列Q混合在一起并在10mM Tris-HCl溶液(pH＝8)中加热至90℃5分钟，然后将其缓慢冷却以形成DNA复合物。
3.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(1)中加入的DNA复合物、序列T和燃料链F分别为50nM、100nM和100nM。
4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(2)具体为将步骤(1)所得溶液加入含有5mM MgCl2的10mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.5)中在37℃下孵育120分钟。
5.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(3)中加入的氯化血红素和KCl分别为30nM和25mM。
6.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(4)具体为：将步骤(4)所得溶液加入含有600μM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺和10mM H2O2的Tris-HCl溶液(pH 5.5)中。
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