CN112609010A

CN112609010A - 一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN112609010A
Application number: CN202011436758.1A
Authority: CN
Inventors: 邓锐杰; 张婷
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112609010B

Abstract

本发明公开了一种基于点亮型RNA适体的CRISPR‑Cas13核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：点亮型RNA适体、Cas13蛋白、crRNA和核酸染料；所述点亮型RNA适体可结合核酸染料并使其发射荧光，点亮型RNA适体如果被Cas13蛋白剪切，则荧光淬灭；所述crRNA为一段RNA，可与Cas13蛋白形成crRNA‑Cas13复合物，当Cas 13‑crRNA结合靶标RNA序列以后，激活Cas13蛋白的酶切活性，切除RNA适体。本发明的试剂盒可通过检测RNA来检测活病原体和RNA标志物，相较于现有的基于CRISPR‑Cas13的核酸检测方法，该方法不依赖逆转录和核酸扩增，一步完成靶标RNA序列检测，检测成本低，操作步骤简单，且能保证较高的特异性和灵敏度，利于产业化应用。

Description

一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于核酸检测领域。

背景技术

由病原菌或者病毒引起地传染疾病是威胁人类健康的最重要因素。此外，外周血核酸逐渐被公认为包括癌症在内的分子标志物，可以应用于疾病的早期预警。近年来，对病原菌、病毒、疾病标志物等生物体的分子检测得到了广泛的应用，主要包括抗体检测和核酸检测。

由于抗体在血清免疫中的重要性，抗体检测在分子检测领域非常重要，例如，广东康健生物科技医药公司的专利申请CN 111562370 A公开了一种基于胶体金的病毒抗体检测方法，可获得快速准确的病毒检测结果。然而，与基于蛋白质的抗体相比，核酸具有化学稳定性好、再生方便、储存方便等优点。并且，核酸检测可以直接地，在病原菌感染、病毒感染或者肿瘤细胞出现地早期检测基因来确定是否感染或者患病。因此，核酸检测技术分析已经被广泛应用于实际样品检测。其中荧光定量PCR(qPCR)技术是最强有力的定量工具。例如，2020年5月26日授权的专利CN 110982876 B采用qPCR扩增技术，实现了病毒的高效短时间检测。此外，基于荧光，电化学和比色原理的DNA生物传感器也得到了开发和应用。通过分子探针(例如DNA，mRNA和rRNA)监测生物体生存能力，对于生物体的核酸检测至关重要。

但是，由于DNA可长期存在于生物体的任意生存状态，并不能作为生物体活性鉴定的的理想指标。相比较而言，RNA会随着生物体的死亡在短时间内降解，是生物体活性的标志。目前也有大量学者构建了一些节省时间和成本效益，可以通过RNA检测来定量生物体的方法。但这些方法无法满足同时具有高效率、高灵敏度、强特异性和低成本的需求。

CRISPR-Cas(聚簇的规则间隔的短回文重复序列)是一类特殊的核酸蛋白复合体，一般具有RNA降解酶(RNase)或DNA降解酶(DNase)的活性。其中，在Cas蛋白中，Cas 13可以结合并切割RNA，是一种RNA导向酶。该切割过程需要CRISPR RNA(crRNA)的参与。crRNA是一种由锚定序列和向导序列组成的RNA，其向导序列负责与特征单链RNA通过碱基互补配对相结合，形成杂交RNA，而锚定序列则可辅助前述杂交RNA进入Cas13的特定结构域，激活Cas13的酶切活性，进而特征单链RNA被切割，切割后，Cas13会保持活性，对所处环境中的其他RNA分子进行非特异性的切割，被称作“旁切割(collateral cleavage)”。

Cas13a是Cas13家族中的一员。国家纳米科学中心的专利申请CN 107557455A公开了一种核酸检测方法，其利用CRISPR-Cas13的思路是：通过crRNA结合靶点RNA，激活CRISPR-Cas13复合体中Cas13a的酶切活性，会剪切检测体系中添加的信号分子。该信号分子是预先加入的两端分别带有荧光基团和淬灭基团的RNA，RNA被剪切后，荧光基团就会发出荧光。该方法的灵敏度很高，可达到10^-18M。但是该灵敏度完全依赖对其模板提前进行恒温扩增(RPA)，提高模板量。目前RPA检测的最低检测限可达1拷贝(CN111593141A)。但是，CN107557455A的方法存在如下局限性：其信号分子制备需要在RNA的两头标记荧光基团和淬灭基团，同时在实际样品检测时需要提取RNA先逆转录成DNA再扩增检测，导致检测成本极其昂贵，操作流程也十分复杂。

点亮型RNA适体(light-up RNA aptamer)是一种具有特定二级结构的RNA分子，可结合荧光染料，触发强荧光。目前已筛选点亮型RNA适体包括Broccoli、DIR2-1、Spinach、Spinach2等，，这些点亮型核酸适体可特异性结合DFHBI或DFHBI-1T，并使DFHBI或DFHBI-1T发出强荧光(Broccoli：Rapid Selection of an RNA Mimic of Green FluorescentProtein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution.Journal of theAmerican Chemical Society，2014，136(46)：16299-308.)。点亮型RNA适体通常的用法是：将点亮型RNA适体嵌入靶标RNA序列中结合DFHBI-1T染料，用于直接标记细胞内RNA成像(Use of Baby Spinach and Broccoli for imaging of structured cellular RNAs，Nucleic Acids Research，2017，1404-1415)，或将核酸适体嵌入点亮型RNA适体的可变序列部分，通过靶标分子的结合诱导点亮型RNA适体结构变化，进而可以结合并点亮DFHBI染料，用于检测靶标小分子(Fluorescence Imaging of Cellular Metabolites withRNA.Science 2012，335，1194)。

当前尚未见点亮型RNA适体与CRISPR-Cas体系相结合的用于检测核酸的技术。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)点亮型RNA适体或其DNA模板；

(2)Cas13蛋白；

(3)crRNA或其DNA模板；

(4)核酸染料；

当试剂盒包括第(1)和/或第(3)项的DNA模板时，使用前需要将DNA模板转录成RNA；

所述点亮型RNA适体可特异性结合核酸染料并使其发射荧光，点亮型RNA适体如果被Cas13蛋白剪切，将无法与核酸染料结合，则荧光淬灭；

所述crRNA为一段RNA，序列包括2部分：(1)向导序列：负责与待检靶标RNA进行互补配对，形成双链；(2)锚定序列：位于向导序列的5’端，依赖其二级结构，可结合Cas13蛋白；

所述二级结构表达式为.......((((........)))).............，式中左边为5’端，“.”表示未配对碱基，“(”与“)”表示配对碱基，其中最左边的“(”与最右边的“)”配对，左边第二个“(”与右边第二个“)”配对；

二级结构表达式可通过RNAfold软件计算得到(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)；

所述crRNA能与Cas13结合后形成Cas13-crRNA复合物，且形成Cas13-crRNA复合物后，在crRNA的向导序列与靶标RNA形成双链的情况下能激活Cas13蛋白的酶切活性。

在形成Cas13-crRNA复合物后，向导序列若与靶标RNA形成双链，则激活Cas13蛋白的酶切活性，切除RNA适体，进而产生荧光信号响应。

进一步地，所述crRNA的锚定序列如SEQ ID NO.13所示，或满足以下条件：

与SEQ ID NO.13同源性在30％以内，且形成的crRNA结合Cas13形成Cas13-crRNA复合物后，若向导序列能与靶标RNA形成双链，则能激活Cas13蛋白的酶切活性。

进一步地，所述点亮型RNA适体为可以特异性结合核酸染料的核酸，并使染料增强荧光；

优选地，所述RNA适体为下列适体中的至少一种：Broccoli、Spinach、Spinach2、DiR2s-Apt、Apt II-mini3-4c、DNB、Mango、Corn、BHQ apt(A1)、Red-Broccoli、DIR apt、MGaptamer、DIR2s-Apt、SRB apt。

进一步地，所述核酸染料为如下染料中的至少一种：3，5-difluoro-4-hydroxybenzyhdene imidazohnone(DFHBI)、(Z)-4-(3，5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2，2，2-trifluoroethyl)-1Himidazol-5(4H)-one(DFHBI-1T)、silicon rhodamines、sulforhodamine B、oxazolethiazole blue(OTB)、Hoescht、3，5-difluoro-4-hydroxybenzylideneimidazolinone-2-oxime(DFHO)、rhodamine green-dinitro-aniline(RG-DN)、tetramethylrhodamine-dinitroaniline(TMR-DN)、sulforhodamine-dinitroaniline(SR-DN)、TexasRed-dinitroaniline(TR-DN)、dimethylindole red(DIR)、DIR-pro、Malachite Green Dye(Mal.Green)、Patent bluevital(PBV)。

进一步地，所述试剂盒是检测蜡样芽孢杆菌(B.cereus)RNA的试剂盒，其crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

或，所述试剂盒是检测沙门氏菌(S.enterica)RNA的试剂盒，其crRNA的序列如SEQID NO.2所示。

或，所述试剂盒是检测大肠杆菌(E.coli)RNA的试剂盒，其crRNA的序列如SEQ IDNO.3所示。

一种定性检测RNA样本中靶标RNA的方法，包括如下步骤：

1)在RNA样本中加入前述试剂盒的点亮型RNA适体、核酸染料，检测荧光；

2)加入前述试剂盒的crRNA和Cas13蛋白的混合物；

3)检测荧光；

当步骤3)检测的荧光明显弱于步骤1)的荧光，则表示检测到了靶标RNA。

将步骤2)中的crRNA和Cas13蛋白分开加入，或，分开加入的同时，在加入crRNA和Cas13之间检测荧光，再与最后步骤荧光进行比较，属于本发明的常规替换方式。

一种检测RNA样本中靶标RNA的含量的方法，包括如下步骤：

1)准备靶标RNA的标准品；

2)向标准品加入前述试剂盒的点亮型RNA适体、crRNA和核酸染料、Cas13蛋白，在核酸染料的激发光下检测荧光，绘制标准曲线；

3)向RNA样本中加入前述试剂盒的点亮型RNA适体、crRNA和核酸染料、Cas13蛋白，在核酸染料的激发光下检测荧光，代入标准曲线，得到靶标RNA浓度。

进一步地，所述靶标RNA为人体、动物体、植物、细菌或病毒的RNA；

当所述细菌为蜡样芽孢杆菌时，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所不；

当所述细菌为沙门氏菌时，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2所示；

当所述细菌为大肠杆菌时，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述crRNA与Cas13的摩尔比为1∶0.25～2；优选地，为1∶0.25～1；进一步优选地，为1∶1。

本发明的试剂盒与方法的检测原理是：

根据靶标RNA(需要最终确认是否存在或是确定其含量的RNA)的序列设计crRNA，令crRNA的部分序列(向导序列)与靶标RNA反向互补。依赖锚定序列，crRNA本身具有识别并结合Cas13的能力，形成Cas13-crRNA复合物。当样本中存在靶标RNA时，Cas13-crRNA复合物中crRNA向导序列与靶标RNA结合，进而可激活Cas13蛋白酶切活性，后者可进行非序列依赖性的RNA酶切。当存在点亮型RNA适体时，Cas13蛋白剪切RNA适体，后者结构破坏，预先与点亮型RNA适体结合的核酸染料的荧光淬灭(如图1)。通过荧光强度的改变，或者通过做标准曲线，即可实现靶标RNA的相对或绝对定量检测。

本发明的试剂盒和方法具有如下有益效果：

1)无需对RNA进行荧光基团和淬灭基团的修饰，可节省成本。

2)无需用等温扩增等核酸扩增技术对模板预先扩增以提高模板量，既节约成本，又简化操作流程。

3)对细菌的最低检测限低至9.83CFU，灵敏度高，可满足临床或环境检测的需求。

4)对细菌的检测特异性好，能区分蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌。

5)检测针对的是RNA，因此仅对活的病原体有效，可明显减少因死亡病原体产生的假阳性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

需要说明的是，本发明的核心是检测RNA，而检测RNA可直接应用于多种用途，包括鉴别生物品种、检测病原体等。即使名义上不是检测RNA，但实际上是借助本发明检测RNA的原理制备的用于鉴别生物(含病毒)品种、检测病原体的检测试剂，或者借助本发明的原理实施的鉴别生物(含病毒)品种或检测病原体的方法，均在本发明的范围内。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：本发明检测试剂盒的工作原理图。

图2：荧光强度与菌液浓度的标准曲线。A，的蜡样芽孢杆菌数量在0 lgCFU-7lgCFU下和荧光强度的关系。B，取图A中的0 lgCFU-3 lgCFU做线性拟合。C，取图A中的3lgCFU-5 lgCFU做线性拟合。0 lgCFU-7 lgCFU的蜡样芽孢杆菌和荧光强度的关系。

图3：牛奶和米饭中腊样芽孢杆菌在不同活菌比例下的检测。A，培养情况；B，检测结果。

图4：对蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌特异性选择性测试结果。划线序列为靶标RNA的区别序列。

图5：不同比例的活菌混合菌液的检测结果。

图6：不同比例的crRNA和Cas13复合获得的检测效果。

具体实施方式

本分部所用试剂为市售商品，所用序列按表1进行商业合成。

表1检测试剂盒相关序列

*注：crRNA 3’端划线部分序列为特异性识别待检靶标RNA(与靶RNA反向互补配对)的序列，需要随着待检靶标RNA序列的变化而变化；未划线的序列：GGGACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACGACCA(SEQ ID NO.13)，为相对保守的锚定序列，用于结合Cas13蛋白。需要强调的是：对SEQ ID NO.13进行30％以内的人工突变和长度变化且不损坏其前述的功能的技术方案在本发明的保护范围内。

实施例1制备点亮型RNA适体和信号识别探针crRNA

本实施例中，以Broccoli适体为例制备点亮型RNA适体，并制备CRISPR-RNA(crRNA)。点亮型RNA适体Broccoli适体可以特异性地和核酸染料DFHBI-1T结合，作为Cas13酶切的信标。信号识别探针crRNA可以特异性地结合目标RNA，起到分子识别的作用。

使用体外转录的方法得到Broccoli适体和crRNA，步骤如下：

100μL的离心管中，加入10μL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲液，10μL L-Broccoli适体，10μL启动子(promoter)，90℃下变性3～10min，室温下反应30～90min。加入3μL phi29DNA聚合酶，2μL dNTP混合物，30℃下30～90min使其延伸至完全互补。最后，加入20μL 5×转录缓冲液，2μL T7 RNA聚合酶，2μL rNTP混合物和41μL水，在37℃孵育4小时，得到Broccoli适体。

所述L-Broccoli适体的浓度为10μM，promoter的浓度为10μM，dNTP混合物的浓度为10mM，RNA聚合酶的浓度为20U/μL，rNTP混合物的浓度为25mM。

分子识别探针crRNA的制备方法和Broccoli适体的相同，具体如下：

100μL的离心管中，加入10μL 10×phi29 DNA聚合酶缓冲液，10μL L-crRNA适体，10μL启动子(promoter)，90℃下变性3～10min，室温下反应30～90min。加入3μL phi29 DNA聚合酶，2μL dNTP混合物，30℃下30～90min使其延伸至完全互补。最后，加入20μL 5×转录缓冲液，2μL T7 RNA聚合酶，2μL rNTP混合物和41μL水，在37℃孵育4小时，得到crRNA，稀释crRNA到1μM备用。

所述L-crRNA的浓度为10μM，promoter的浓度为10μM，dNTP混合物的浓度为10mM，RNA聚合酶的浓度为20U/μL，rNTP混合物的浓度为25mM。

实施例2绘制标准曲线

步骤如下：

①在37℃培养蜡样芽孢杆菌(B.cereus)至对数生长期后期，用生理盐水梯度系数，制备不同浓度的活菌溶液，提取RNA。

②取实施例1中制备得到的Broccoli适体10μL，crRNA 3μL，DFHBI-1T 4μL，加入①中获得的不同浓度蜡样芽孢杆菌菌液提取的RNA溶液，加Cas13溶液(1pmol/μL)0.3μL，加水19.7μL，37℃反应30min。

③在468nm的激发波长，发射波长范围498～560nm波长下检测荧光，检测步长为1nm，记录该活菌浓度下的荧光值。

④以腊样芽孢杆菌菌液液浓度为横坐标，以该浓度下的荧光值为纵坐标绘制标准曲线。拟合出的标准曲线的回归方程为y＝-647.85X+11453.1，LOD(最低检测限)＝9.83CFU其中，y代表荧光强度(a.u.)，x代表菌液浓度，标准曲线如图2所示。

小结：本实施例不仅得到了标准曲线，还得到其LOD为9.83CFU，可见其检测灵敏度很高。

实施例3牛奶和米饭中腊样芽孢杆菌数量检测

在牛奶和米饭中分别添加不同活菌浓度的蜡样芽孢杆菌，检测培养48h后样品中的活菌数，并分析各组与添加100％活菌的样品检测结果的显著性差异，步骤如下：

①取40g煮熟的米饭和40ml市售纯牛奶分装入4个锥形瓶，在121℃下灭菌20min。

②取对数生长后期的蜡样芽孢杆菌用0.85％的生理盐水稀释至10⁵CFU/mL。

③将②中制备的菌液离心，分别用70％的异丙醇和生理盐水重悬菌液，在室温下处理1h，离心，重新用生理盐水重悬，获得死菌和活菌。

④取③中制备的活菌菌液和死菌菌液，混合，获得含有0，1％，10％，100％活菌的菌液。分别取1mL的含不同活菌数的菌液加入到无菌牛奶和米饭中，37℃培养48h，分别取1mL牛奶样品和1g米饭样品提RNA，稀释到20μL。

⑤取2μL④中获得的RNA溶液，加Broccoli适体10μL，crRNA 3μL，DFHBI-1T 4μL，Cas13溶液(1pmol/μL)0.3μL，加水19.7μL，37℃反应30min，测定荧光强度，分别代入标准曲线的回归方程中，计算出各待测样品的活菌浓度。

结果：如图3所示，添加了不同活菌比例菌液的待测样品活菌含量与添加100％活菌的样品检测结果具有显著性差异，活菌浓度越大，检测的值越高。

结论：本发明的方法或者其衍生的方法可用于含有不同活菌的实际样品的检测，不受死菌干扰，得到可靠的检测结果。

实施例4本发明方法对蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌特异性选择性测试结果

方法如下：

①采用实例1所示的crRNA的方法制备沙门氏菌(S.enterica)、大肠杆菌(E.coli)的crRNA，核酸序列如表1的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

②取对数生长后期的蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌，用0.85％的生理盐水稀释至10⁵CFU/mL，提取RNA，稀释到20μL。

③取2μL②中获得的RNA溶液，加Broccoli适体10μL，crRNA 3μL，DFHBI-1T 4μL，Cas13溶液(1pmol/μL)0.3μL，加水19.7μL，37℃反应30min，测定荧光强度，绘制选择性热图，如图4所示。

实验结果表明：

如图4所示，腊样芽孢杆菌的crRNA对蜡样芽孢杆菌的识别能力很强，一旦加入蜡样芽孢杆菌活菌结合crRNA，Cas13的酶切活性会被激活，造成荧光猝灭，产生极弱的荧光值。同样的，沙门氏菌、大肠杆菌的crRNA对各自对应的活菌也有同样的识别效果。

相反的，用蜡样芽孢杆菌crRNA识别沙门氏菌和大肠杆菌时，产生的荧光极强，没有达到荧光淬灭的效果。同样地，用沙门氏菌和大肠杆菌的crRNA识别其他的活菌也会产生同样的效果。

结论：本发明对蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌特异性选择性测试结果。

实施例5不同比例的活菌混合菌液的检测结果

本实施例中，检测不同比例活菌混合菌液的测试结果。

①取对数生长后期的蜡样芽孢杆菌用0.85％的生理盐水稀释至10⁵CFU/mL。

②将①中制备的菌液离心，分别用70％的异丙醇和生理盐水重悬菌液，在室温下处理1h，离心，重新用生理盐水重悬，获得死菌和活菌。

③取②中制备的活菌菌液和死菌菌液，混合，获得含有0，1％，10％，40％，70％，100％活菌的菌液，并提取RNA，稀释到20μL。

④取2μL③中获得的RNA溶液，加Broccoli适体10μL，crRNA 3μL，DFHBI-1T 4μL，Cas13溶液(1pmol/μL)0.3μL，加水19.7μL，37℃反应30min，测定荧光强度，带入标准曲线，计算回收率。

结果：1％，10％，40％，70％，100％的活菌溶液的回收率在0.94到1.06之间(图5)。

本实施例结果表明，该方法的检测目标物确实为活菌，而非死菌，是一种良好的致病菌活菌的检测方法。

实施例6采用不同比例的crRNA和Cas13复合获得的检测效果。

本实施例中，采用不同比例的crRNA和Cas13复合，测试结果。

方法如下：

①取实施例1中制备得到的Broccoli适体10μL，DFHBI-1T(100μM)4μL，加入实施例2的步骤①中获得的不同浓度蜡样芽孢杆菌菌液提取的RNA溶液，设置crRNA和Cas 13(1pmol/μL)的摩尔浓度比为1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2或1∶2.5，加水到40μL，37℃反应30min。

②在468nm的激发波长，发射波长范围498～560nm波长下检测荧光，检测步长为1nm，记录该活菌浓度下的荧光值。

实验结果如图6所示。可以看出，当crRNA：Cas 13＝1∶1，1∶0.5，和1∶0.25时，背景荧光/信号荧光值分别为12.5，9.6和5.4，当比例为1∶2.5时，背景荧光/信号荧光值为1.5。

本实施例的结果表明，crRNA：Cas13的摩尔浓度比为1∶0.25～2时，尤其为1∶0.25～1时，背景荧光与信号荧光差值较大，可作为RNA检测时的优选参数。

综上，本发明的试剂盒可通过检测RNA来检测活病原体和RNA标志物，相较于现有的基于CRISPR-Cas13的核酸检测方法，该方法不依赖逆转录和核酸扩增，一步完成靶标RNA序列检测，检测成本低，操作步骤简单，且能保证较高的特异性和灵敏度，利于产业化应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒

<130> GYKH1817-2020P0112234CC

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gggaccaccc caaaaaugaa ggggacuaaa acgaccauca auuucgaacc augcgguuca 60

aaauguu 67

<210> 2

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gggaccaccc caaaaaugaa ggggacuaaa acgaccacaa gacucaagcc ugccaguuuc 60

gaaugca 67

<210> 3

<211> 67

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gggaccaccc caaaaaugaa ggggacuaaa acgaccauuu acucccuucc uccccgcuga 60

aagugcu 67

<210> 4

<211> 30

<212> RNA

<213> 蜡样芽孢杆菌（B. cereus）

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aacauuuuga accgcauggu ucgaaauuga 30

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<211> 30

<212> RNA

<213> 沙门氏菌（S. enterica）

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ugcauucgaa acuggcaggc uugagucuug 30

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<211> 30

<212> RNA

<213> 大肠杆菌（E. coli）

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agcacuuuca gcggggagga agggaguaaa 30

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

taatacgact cactataggg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

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gagcccacac tctactcgac agatacgaat atctggaccc gaccgtctcc cctatagtga 60

gtcgtatta 69

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<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

gagcccacac ucuacucgac agauacgaau aucuggaccc gaccgucuc 49

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<211> 87

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌（B. cereus）

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aacattttga accgcatggt tcgaaattga tggtcgtttt agtccccttc atttttgggg 60

tggtcccccc tatagtgagt cgtatta 87

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<212> DNA

<213> 沙门氏菌（S. enterica）

<400> 11

tgcattcgaa actggcaggc ttgagtcttg tggtcgtttt agtccccttc atttttgggg 60

tggtcccccc tatagtgagt cgtatta 87

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<211> 87

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（E. coli）

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agcactttca gcggggagga agggagtaaa tggtcgtttt agtccccttc atttttgggg 60

tggtcccccc tatagtgagt cgtatta 87

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<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

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Claims

1.一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

(1)点亮型RNA适体或其DNA模板；

(2)Cas13蛋白；

(3)crRNA或其DNA模板；

(4)核酸染料；

所述二级结构表达式为.......((((........)))).............；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述crRNA的锚定序列如SEQ ID NO.13所示，或满足以下条件：

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述点亮型RNA适体为可以特异性结合核酸染料的核酸，并使染料增强荧光；

优选地，所述RNA适体为下列适体中的至少一种：Broccoli、Spinach、Spinach2、DiR2s-Apt、Apt II-mini3-4 c、DNB、Mango、Corn、BHQ apt(A1)、Red-Broccoli、DIR apt、MGaptamer、DIR2s-Apt、SRB apt。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸染料为如下染料中的至少一种：

3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone、(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1Himidazol-5(4H)-one、silicon rhodamines、sulforhodamine B、oxazole thiazole blue、Hoescht、3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone-2-oxime、rhodamine green-dinitro-aniline、tetramethylrhodamine-dinitroaniline、sulforhodamine-dinitroaniline、TexasRed-dinitroaniline、dimethylindole red DIR-pro、Malachite Green Dye、Patentblue vital。

5.如权利要求1～4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是检测蜡样芽孢杆菌(B.cereus)RNA的试剂盒，其crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

或，所述试剂盒是检测沙门氏菌(S.enterica)RNA的试剂盒，其crRNA的序列如SEQ IDNO.2所示；

或，所述试剂盒是检测大肠杆菌(E.coli)RNA的试剂盒，其crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种定性检测RNA样本中靶标RNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)在RNA样本中加入权利要求1～4任一所述试剂盒的点亮型RNA适体、核酸染料，检测荧光；

2)加入权利要求1～4任一所述试剂盒的crRNA和Cas13蛋白的混合物；

3)检测荧光；

7.一种检测RNA样本中靶标RNA的含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)准备靶标RNA的标准品；

2)向标准品加入权利要求1～4任一所述试剂盒的点亮型RNA适体、crRNA和核酸染料、Cas13蛋白，在核酸染料的激发光下检测荧光，绘制标准曲线；

3)向RNA样本中加入权利要求1～4任一所述试剂盒的点亮型RNA适体、crRNA和核酸染料、Cas13蛋白，在核酸染料的激发光下检测荧光，代入标准曲线，得到靶标RNA浓度。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述靶标RNA为人体、动物体、植物、细菌或病毒的RNA。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：

当所述细菌为蜡样芽孢杆菌时，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

当所述细菌为沙门氏菌时，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.2所示；

当所述细菌为大肠杆菌时，所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述crRNA与Cas13的摩尔比为1:0.25～2；优选地，为1:0.25～1；进一步优选地，为1:1。