CN104531676A - 一种快速提取细菌dna的方法 - Google Patents

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肖性龙
胡双芳
李蓉
余以刚
万松华
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Abstract

本发明公开了一种快速提取细菌DNA的方法，包括以下步骤:(1)扩增样品中的细菌数；(2)将样品进行低速离心使样品与菌液分离；(3)在分离后的上清液中加入5～10％体积分数的裂解液，煮沸10min，所述裂解液为用TE缓冲液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液；(4)然后高速离心2min，上清即为DNA溶液。本发明通过裂解液和煮沸法相结合，能够达到快速提取DNA的目的。本发明具有操作步骤简单、耗时少、DNA裂解更充分、经济成本低等优点，满足现代微生物快速检测的需求。

Description

一种快速提取细菌DNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取细菌DNA的方法。
背景技术
食品安全一直以来都是社会各界的关注的重大问题，近年来，随着各种食品安全问题的不断曝光，人们对食品安全的认识也在不断提高。大多疾病的发生都和食品中的致病微生物有关，而传统的通过增菌、分离培养、生化反应与血清疑集等操作的方法已远远不能难以满足现代社会快速检测的要求。实时荧光定量PCR法以其特异性强、稳定性好、灵敏度高、快速准确等优点在食品微生物检测领域得到广泛的应用，模板DNA的提取是其中的重要步骤之一，如何快速提取DNA模板是提高实时荧光定量PCR法检测速度的关键。
目前，DNA提取方法主要包括物理提取法、化学提取法和商用试剂盒等，物理提取法包括超声法、煮沸法等，超声法对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌破碎率可达97％，但耗时较长，且强度过于激烈，易使DNA断裂。煮沸法快速、简便，但难以保证DNA充分裂解，影响检测的灵敏度；化学提取法包括CTAB法和十二烷基磺酸钠(SDS)法等，CTAB法是目前应用较多的DNA提取方法，操作方法相对成熟，但该法提取DNA操作繁琐、耗时长，且多次转移，DNA易损失，操作过程中还要使用氯仿等有毒溶剂。十二烷基磺酸钠(SDS)法被广泛用于动植物DNA的提取，但该方法对于多糖含量高的植物提取效果不佳，难以适应多种多样的食物基质中细菌DNA的提取，且操作繁琐、耗时长，操作过程中使用苯酚、氯仿等有毒溶剂。商用试剂盒法具有操作简便、结果稳定、高效的特点，但价格昂贵，成本较高。对于革兰氏阳性细菌，由于其细胞壁较厚，约20～80nm，一般的试剂盒方法中使用溶菌酶处理半个小时以上才能进行有效的破壁。而溶菌酶需要低温保存，对试剂盒的运输与储存要求较高。因此，寻找一种简单便捷、经济实惠、低毒低污染的快速提取方法意义重大。
发明内容
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取细菌DNA的方法。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速提取细菌DNA的方法，通过样品增菌、低速离心使样品与菌液分离、取上清液加入裂解液、煮沸等步骤可将细菌的DNA分离出来，具体包括以下步骤：
(1)扩增样品中的细菌数；
(2)将样品进行低速离心使样品与菌液分离；
(3)在分离后的上清液中加入5～10％体积分数的裂解液，煮沸10min，所述裂解液为用TE缓冲液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液；
(4)然后高速离心2min，上清即为DNA溶液(-20℃保存备用)。
所述裂解液为1％(体积分数)的Triton X-100和0.5％(体积分数)的Tween-20的混合液。
所述TE缓冲液为10mmol/L Tris/HCl,1mmol/L EDTA,pH 8.0。
所述扩增样品中的细菌数具体是：吸取少量细菌，均匀混在保健食品原料粉末中，静置10min，加入营养肉汤，混合均匀，37℃培养18h。
所述保健食品原料粉末为钙粉。
每克保健食品原料粉末中加入9ml的营养肉汤。
所述低速离心的转速为1000～3000rpm，高速离心的转速为12000～15000rpm。
所述细菌包括大肠杆菌(Escherichia Coli)、沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、志贺氏菌(Shigella flexneri)等所有革兰氏阴性菌和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、猪链球菌(Streptococcus suis)等所有革兰氏阳性菌。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用增菌后低速离心的方法分离食品样品基质与目标菌株，达到减少食品基质对DNA提取过程干扰的作用。
(2)本发明适用于所有的细菌的DNA提取，包括革兰氏阳性细菌，其中Triton X-100是一种非离子型表面活性剂，能溶解脂质，增加细胞膜的通透性，裂解细胞壁，和Tween-20一起能充分裂解细胞。
(3)本发明在化学裂解的基础上与煮沸法相组合，和化学法相比，操作步骤简单，所需时间大大减少，可在20分钟内完成DNA提取过程；和物理法相比，DNA裂解更充分；和试剂盒法相比，不需要溶菌酶的辅助裂解作用，摈弃了苯酚、氯仿等有毒溶剂的使用对环境友好，却具有相同的灵敏度检出限，经济成本也大大降低。
附图说明
图1为实施例1中菌株的实时荧光PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
1、分别取100μl大肠杆菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，志贺氏菌、猪链球菌(菌株全部为华南理工大学轻工与食品学院食品安全检测中心保藏菌)均匀混在25g由无限极(中国)有限公司保健食品原料钙粉中，静置10min，加入225ml营养肉汤增菌液，混合均匀，37℃培养18h。
2、取150μl到1.5ml的离心管中，2000g离心1min，使样品与菌液分离。将上清液转移至新的离心管中，取100μl上清液，加入10μl裂解液后，煮沸10min。15000rpm高速离心2min，上清即DNA溶液，-20℃保存备用。所述裂解液为1％的Triton X-100和0.5％的Tween-20的混合液，溶剂全部用TE缓冲液配置。
3、参考文献得到各种细菌的引物探针，见表1。实时荧光定量PCR采用20μl反应体系，每20μl的PCR反应体系包含10μl 2x PCR预混液(Premix ExTaq(Probe qPCR))，0.2μl参比染料(ROX Reference DyeⅡ)，1μl PCR上游引物，1μl下游引物，0.5μl探针，2μl模板，用DEPC水补齐至20μl，于ABI 7500Real Time PCR System进行实时荧光PCR扩增。反应程序：预变性95℃1min；扩增95℃5s，60℃40s(收集荧光)，每个循环收集一次荧光，共40个循环，荧光基团用FAM标记。
4、检测结果如图1所示，待检测的6种菌都显示阳性扩增曲线。
表1引物和探针序列
实施例2
1、选取大肠杆菌研究该方法的稳定性。吸取少量大肠杆菌均匀混在25g保健食品原料粉末中，静置10min，加入225ml营养肉汤增菌液，混合均匀，37℃培养18h后，取1ml菌液用无菌水按10倍依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
2、按照上述方法提取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的DNA，分别进行组内和组间稳定性测试，组内试验一次做4个重复，同时上机，计算CT值的标准差与CV值。组间试验不设重复，在不同的时间内分别做4次，计算CT值的标准差与CV值。
3、检测结果如表2所示，从表2可以看出，组内实验CV在0.99-1.61％之间波动，而组间实验在0.33-0.79％之间波动，可见本方法稳定性良好。
表2大肠杆菌组内与组间实验CV值
实施例3
1、选取大肠杆菌和单增李斯特菌研究该方法的灵敏度。吸取大肠杆菌和单增李斯特菌，分别均匀混在25g保健食品原料粉末中，静置10min，加入225ml营养肉汤增菌液，混合均匀，37℃培养18h后，取1ml菌液用无菌水按10倍依次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取10-6、10-7、10-8三个稀释梯度进行平板计数，每个梯度涂3个平板，每个平板100μl，37℃过夜培养计数。
2、按照上述方法提取10-5、10-6、10-7、10-8三个稀释梯度的DNA，做三次重复，得到DNA模板后上机。
3、结果如表3所示，经检测，荧光PCR方法一直稀释到10-6时还可以检出，检出限在1000cfu/ml，说明该方法具有良好的灵敏度。
表3灵敏度实验结果

Claims (7)

1.一种快速提取细菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)扩增样品中的细菌数；
(2)将样品进行低速离心使样品与菌液分离；
(3)在分离后的上清液中加入5～10％体积分数的裂解液，煮沸10min，所述裂解液为用TE缓冲液配制的Triton X-100和Tween-20的混合液；
(4)然后高速离心2min，上清即为DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液为1％的TritonX-100和0.5％的Tween-20的混合液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增样品中的细菌数具体是：吸取细菌，均匀混在保健食品原料粉末中，静置10min，加入营养肉汤，混合均匀，37℃培养18h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述保健食品原料粉末为钙粉。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，每克保健食品原料粉末中加入9ml的营养肉汤。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述低速离心的转速为1000～3000rpm，高速离心的转速为12000～15000rpm。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia Coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、志贺氏菌(Shigella flexneri)、猪链球菌(Streptococcus suis)。
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