CN103108961A

CN103108961A - 使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增

Info

Publication number: CN103108961A
Application number: CN2011800395886A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂安·科夫哈格; 戈尔德·格洛豪瑟; 托马斯·罗特曼; 拉尔夫·希默尔赖希
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2011-08-16
Publication date: 2013-05-15
Also published as: WO2012022755A1; JP5945271B2; EP2606148A1; EP2606148B1; US9005933B2; CN107012205A; EP3339449A1; JP2013535225A; US20130210019A1; EP2420579A1

Abstract

本发明涉及用于扩增模板核酸的方法，其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应扩增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中。本发明还涉及用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包含切口核酸内切酶、解旋酶和DNA聚合酶。

Description

使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增

技术领域

本发明属于生物学和化学领域，特别是属于分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于扩增核酸的方法和试剂盒。

背景技术

核酸扩增被广泛用在研究、诊断学、法医学、医学、食物科学和农业中。“现场即时测试（Point of Care Testing）”（POCT）是指在患者医疗点处或附近进行的诊断性测试，即去集中化的检查，例如可以在私人医疗实践、小医院、药店中或者甚至在事故或其它医疗紧急事件的现场或位点处或者在救护车内执行所述检查。现场即时诊断需要快速且简单的测试。因此，在基于核酸的检测方法的情况下，与已建立的但较慢的基于PCR的方法相比，快速等温扩增技术最近已变得越来越重要。PCR需要热循环，以便将双链核酸例如DNA的两条链分离开。相反，例如等温扩增方法不需要热循环仪。

最杰出的等温扩增方法之一是所谓的解旋酶依赖性扩增（HDA）（例如被描述在Vincent等.（2004），EMBO reports 5(8):795-800；Jeong等.（2009），Cell.Mol.Life Sci 66:3325-3336；WO-A2 2004/027025；WO-A2 2006/074334中，所有均通过参考结合于此）。HDA是基于解旋酶将双链核酸特别是DNA解旋的能力，而不需要加热或甚至热循环。在HDA中，使用DNA聚合酶和合适的寡核苷酸引物来复制分离的DNA链。因此，HDA模拟天然的复制叉机制。HDA需要存在ATP、二价镁离子和dNTP。某些基于HDA的方法还采用单链结合蛋白（SSB）来包被置换的DNA链。事实上，取决于所使用的酶，可以在热不稳定或热稳定的反应中执行HDA方法。典型地，在25℃和50℃之间、优选在37℃和42℃之间的温度下执行热不稳定的HDA反应。相反，在超过50℃、典型地在60℃和70℃之间的温度下执行热稳定的HDA或嗜热的HDA（tHDA）反应。

HDA反应选择性地扩增由两个引物限定的靶序列。HDA使用解旋酶而不是像PCR中那样使用热来将双链核酸的两条链分离开。因此，可以在单个温度下执行HDA，而不需要热循环。常规的标准HDA反应的步骤示于图1中：在第一个步骤中，通过解旋酶将双链核酸解旋，产生（部分）单链的序列。然后，引物与单链区结合。在步骤2中，聚合酶合成互补链。最后，解旋酶和聚合酶共同起作用，导致模板的扩增（步骤3）。

其它等温扩增包括链置换扩增（SDA），链置换扩增是基于使用限制性酶在DNA的未修饰链上造成切口并通过核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶的作用来延伸切口处的3’末端以置换下游的DNA链。

另一种等温扩增是滚环扩增（RCA），其中线性ssDNA被退火到环状ssDNA模板上，所述环状ssDNA模板是通过使用DNA连接酶连接模板DNA的两个末端而生成的。接着，使用DNA聚合酶延伸退火的引物，并生成互补模板序列的串联连接的拷贝。RCA和SDA两者都需要初始的热变性步骤。

其它等温扩增包括例如切口酶扩增反应（NEAR）和相关的指数扩增反应（EXPAR），两者都采用切口酶和聚合酶来扩增短的双链模板序列（例如被描述在van Ness等.（2003），Proc.Natl.Acad.Sci.100(8):4504-4509；US-A1 2003/0082590；WO-A2 2004/022701；WO-A22009/012246；WO-A2 2004/067726中，所有均通过参考结合于此）。

然而，所有上述等温扩增方法均需要复杂的反应方案，是相对慢的和/或仅限于相对短的模板序列。

发明内容

本发明提供了用于扩增核酸、优选双链核酸的改进的方法，所述方法克服了现有技术的这些限制。本发明的方法基于改良的HDA方法。所提供的方法比常规的tHDA快，同时具有可靠的特异性。与类似于NEAR和EXPAR的方法相比，本发明的方法可以扩增更长的模板核酸。

本发明涉及在切口核酸内切酶存在下执行的HDA扩增方法。因此，在本发明的情形下，在解旋酶、合适的聚合酶、和切口核酸内切酶存在下扩增模板核酸。

具体地，本发明涉及用于扩增模板核酸、特别是DNA的方法，其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应、特别是嗜热的HDA（tHDA）扩增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中。

可以使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中。这样的引物可以包含不与模板核酸杂交但是包含由切口核酸内切酶识别的序列或其部分的5’标签序列。

本发明还涉及用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包含

-切口核酸内切酶，

-解旋酶，和

-DNA聚合酶。

本发明的方法和试剂盒可用于扩增核酸，也可用于检测核酸和/或对核酸进行定量。

附图说明

图1示出了现有技术的且可商购的例如来自于biohelix/NewEngland Biolabs的标准tHDA反应、即在切口核酸内切酶不存在下的tHDA反应的方案。

图2示出了本发明的使用带标签引物的切口tHDA的具体实施方案的反应方案。

图3示出了本发明的使用不带标签引物的切口tHDA的具体实施方案的反应方案。

图4示出了在管扫描器中来自于实施例1的不同的实时（切口）tHDA反应的结果（扩增曲线）。图中所示的是随时间推移的原始荧光强度。

图5示出了实施例1的扩增产物的熔融曲线。A）标准tHDA，B）无Nb.BsmI的切口tHDA，C）有Nb.BsmI的切口tHDA。

图6示出了具有扩增和电泳后的实施例1的各个反应混合物的聚丙烯酰胺凝胶。A）染色前的凝胶，B）用EtBr染色后的凝胶。C）凝胶上各个条带B1至B5的内含物还被图示在图6B1至6B5中。

图7示出了实施例2的靶DNA连同所使用的引物的序列。

图8示出了反应速率对切口核酸内切酶的浓度的依赖性。图中示出的是在可以检测到显著高于背景信号的扩增子信号之前的以分钟（min）为单位的时间。在存在较低浓度的切口核酸内切酶时，比无切口核酸内切酶的反应早约5min检测到信号，表示反应更快。

图9示出了标准tHDA即无任何切口核酸内切酶的tHDA的扩增曲线（随时间推移的荧光）。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。

图10示出了在0.1U切口核酸内切酶Nt.BstNBI存在下tHDA的扩增曲线。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。

图11示出了在无切口核酸内切酶Nt.BstNBI的标准tHDA之后的熔融曲线分析。对图9中示出的反应进行熔融曲线分析。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。

图12示出了在0.1U切口核酸内切酶Nt.BstNBI存在下标准tHDA之后的熔融曲线分析。对图10中示出的反应进行熔融曲线分析。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。

图13示出了反应速率对切口核酸内切酶的存在的依赖性。图中示出的是在可以检测到显著高于背景信号的扩增子信号之前的以分钟（min）为单位的时间。在切口核酸内切酶存在下，比无切口核酸内切酶的反应早约6min检测到信号，表示反应更快。

图14示出了实施例1的扩增子的一条链的序列，实施例1的扩增子是指淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）基因组的孔蛋白基因的一部分。指出了引物和探针的杂交区。（A）：标准tHDA；（B）：本发明的方法的使用带标签引物的切口tHDA，带下划线的是Nb.BsmI的识别序列，由带标签引物引入的序列是斜体的。

详细描述

本发明提供了用于扩增并任选地检测核酸、特别是DNA的方法和试剂盒。本发明的方法基于解旋酶依赖性扩增（HDA）反应。然而，不同于现有技术的HDA反应，在本发明的扩增反应中存在切口核酸内切酶。因此，本发明的试剂盒也包含切口核酸内切酶。本发明的方法在本文中可以被称为“切口HDA”。

具体地，本发明的方法和试剂盒可用于扩增和检测短DNA序列，优选小于400bp的序列，更优选小于200bp的序列，甚至更优选150bp以下的序列，最优选在70bp和120bp之间的序列。典型地，用本发明的方法和试剂盒，扩增或检测双链核酸。然而，也可以扩增和检测单链核酸，只要在实际的基于HDA的扩增开始之前用聚合酶将它们转录成核酸双链即双链模板即可。

具体地，本发明涉及用于扩增模板核酸的方法，其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应扩增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中。

可以采用多种模板核酸、优选采用双链核酸来使用所述方法和试剂盒。典型地，用本发明的试剂盒和方法扩增和/或检测DNA。因此，在本发明的情形下，模板核酸优选为双链核酸，更优选为DNA。

例如，待扩增或检测的序列可以是线性DNA或环状DNA。DNA例如可以选自基因组DNA，例如微生物基因组DNA、病毒DNA、质粒DNA和cDNA。模板可以反转录自RNA，特别是mRNA。

在本发明的情形下，“dsDNA”和“DNA”双链是指双链DNA，“ssDNA”是指单链DNA，“dsRNA”是指双链RNA，“ssRNA”是指单链RNA。

还可以用本发明的试剂盒和方法扩增其它核酸，例如dsRNA或DNA/RNA杂交体。可以在HDA之前执行其它的酶促步骤例如反转录或体外转录，以形成可用的核酸。

本发明要求待扩增的模板核酸中存在由切口核酸内切酶识别的序列。由于不是每个待扩增的靶序列都包含这样的切口核酸内切酶识别序列，因此，可以通过合适的引物来引入这样的序列。

因此，在本发明的方法的优选实施方案中，使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中。

在某些实施方案中，包含由切口核酸内切酶识别的序列的引物包含不与模板核酸杂交的5’标签序列，并且由切口核酸内切酶识别的序列处于所述标签序列中。这样的引物在本文中被称为“带标签引物”，图2中示意性示出了对应的实施方案。

还可以采用诱变引物，即，与原始模板序列不是100%互补的引物，由此引入合适的切口核酸内切酶的识别序列。

本发明的HDA反应优选为嗜热的HDA（tHDA），即，所使用的酶在所述方法的温度下是热稳定的。热稳定的酶典型地为源自于热稳定的生物的酶。因此，优选地，在超过60℃、更优选在60℃和70℃之间、甚至更优选在60℃和65℃之间、最优选在约64℃至65℃的温度下执行本发明的方法。例如可以使用水浴、加热模块、温箱或热循环仪来维持温度。

本发明的方法通常为等温方法，这意味着，该方法是在单个温度下执行的，而不像例如在PCR中那样需要温度循环。然而，在本发明的某些实施方案中，在恒定的实际反应温度下执行反应之前，可以包括在典型地超过90℃、优选约95℃的高温下的热变性步骤。于是，与在单个温度下执行的“一步法”方案不同，这被称为“两步法”反应。在某些情况下，两步法方案可以产生更高的灵敏度。因此，在本发明的情形下，两步法方案是优选的。

事实上，在本发明的切口HDA方法中，在解旋酶、聚合酶、切口酶以及合适的正向和反向寡核苷酸引物存在下温育模板核酸。另外，需要存在用于扩增反应的其它试剂，例如dNTP、ATP或dATP以及镁离子。反应混合物优选地还包含缓冲剂和盐例如NaCl和/KCl。

各个酶和试剂可以在开始扩增之前被一起加入或者可以被顺次加入。在某些具体实施方案中，在其它组分之后加入切口核酸内切酶。在两步法方案的优选实施方案中，在初始的热变性步骤之后加入酶。

术语“引物”是指能够与靶核酸上的单链区结合以促进靶核酸的聚合酶依赖性复制的单链核酸。在本发明的情形下，向模板核酸添加一个或多个引物。使用一个引物引起线性扩增，而使用两个或甚至更多个引物引起指数扩增。

术语“解旋酶”在本文中是指能够将双链核酸酶促解旋的任何酶。例如，解旋酶是可见于所有生物以及所有涉及核酸的过程例如复制、重组、修复、转录、翻译和RNA剪接的酶。（Kornberg和Baker，《DNA复制》（DNA Replication），W.H.Freeman and Company（第2版（1992）），特别是第11章）。任何沿着DNA或RNA以5’至3’方向或以相反的3’至5’方向易位的解旋酶均可用于本发明的实施方案。这包括从原核生物、病毒、古生菌和真核生物获得的解旋酶或天然存在的酶的重组形式，以及具有指定的活性的类似物或衍生物。由Kornberg和Baker在他们的书《DNA复制》，W.H.Freeman and Company（第2版（1992））的第11章中描述的天然存在的DNA解旋酶的实例包括大肠杆菌（E.coli）解旋酶I、II、III和IV，Rep，DnaB，PriA，PcrA，T4 Gp41解旋酶，T4 Dda解旋酶，T7 Gp4解旋酶，SV40大T抗原，酵母RAD。可用于HDA的其它解旋酶包括RecQ解旋酶（Harmon和Kowalczykowski，J.Biol，Chem.276:232-243（2001））、来自于腾冲嗜热菌（T.tengcongensis）和极端嗜热菌（T.thermophilus）的热稳定的UvrD解旋酶（Collins和McCarthy，Extremophiles.7:35-41.（2003））、来自于水生嗜热菌（T.aquaticus）的热稳定的DnaB解旋酶（Kaplan和Steitz，J.Biol.Chem.274:6889-6897（1999））、以及来自于古生菌和真核生物的MCM解旋酶（Grainge等，Nucleic Acids Res.31:4888-4898（2003））。

通常以5’至3’方向复制的解旋酶的实例是T7 Gp4解旋酶、DnaB解旋酶和Rho解旋酶，而以3’-5’方向复制的解旋酶的实例包括UvrD解旋酶、PcrA、Rep、HCV的NS3 RNA解旋酶。

解旋酶可能需要辅因子，即，解旋酶的解旋活性所需要的小分子剂。解旋酶的辅因子包括三磷酸核苷（NTP）和脱氧核苷三磷酸（dNTP浓度）和镁（或其它二价阳离子）。例如，浓度在0.1-100mM范围内、优选在1-10mM范围内（例如3mM）的ATP（三磷酸腺苷）可以用作UvrD解旋酶的辅因子。类似地，在1-10mM范围内（例如3mM）的dTTP（脱氧胸苷三磷酸）可以用作T7 Gp4B解旋酶的辅因子。

在本发明的某些实施方案中，特别是对于非嗜热的HDA来说，反应中可以存在其它蛋白例如拓扑异构酶或辅助蛋白例如单链DNA结合蛋白（SSB），以便促进解旋酶活性。在单链结合蛋白（SSB）存在下，解旋酶显示出改进的活性。在这些情况下，SSB的选择通常不限于特定的蛋白。单链结合蛋白的实例是T4基因32蛋白、大肠杆菌SSB、T7gp2.5 SSB、噬菌体phi29 SSB（Kornberg和Baker，同上（1992））和前述蛋白的截短形式。在使用热稳定的解旋酶的情况下，一种或多种SSB或其它辅助蛋白的存在是任选的。

在EP-B1 1 539 979中，特别是在[0039]至[0066]章节中更详细地描述了用于HDA和tHDA中的解旋酶和包含解旋酶的制剂。

优选地，在超过50℃、优选在50℃和70℃之间、更优选在60℃和65℃之间的温度下执行本发明的切口HDA扩增反应。

在本发明的情形下，解旋酶可以来自于不同的解旋酶家族。解旋酶优选选自超家族I解旋酶、超家族II解旋酶、超家族III解旋酶、来自于dnaB样超家族的解旋酶或者来自于rho样超家族的解旋酶。解旋酶可以源自于嗜中温或耐热的生物。解旋酶可以是遗传或化学修饰的。超家族I解旋酶例如包括dda、pcrA、F质粒traI蛋白解旋酶和UvrD。超家族II解旋酶例如包括recQ和NS3解旋酶。超家族III解旋酶例如包括AAV rep解旋酶。来自于dnaB样超家族的解旋酶例如包括T7噬菌体解旋酶。在本发明的方法和试剂盒的情形下，优选的是，解旋酶是热稳定的解旋酶。热稳定的Tte-UvrD解旋酶是优选的。

拓扑异构酶可用于长HDA反应，以提高HDA扩增长的靶扩增子的能力。当解旋酶将非常长的线性DNA双链分离开时，拓扑异构酶的旋转（松弛）功能消除缠绕并防止过旋（Kornberg和Baker，同上（1992））。例如，大肠杆菌拓扑异构酶I（Fermentas，Vilnius，Lithuania）可通过在一条DNA链中引入切口而用于松弛负超螺旋DNA。相反，大肠杆菌DNA促旋酶（拓扑异构酶II）在DNA中引入瞬时的双链断裂，从而允许DNA链相互穿过（Kornberg和Baker，同上（1992））。

原则上，可以选择在所需的反应温度下有活性、即能够延长游离3’-OH末端的所有聚合酶。具有附加功能例如校对功能、核酸内切酶活性、链置换活性和/或反转录酶活性的聚合酶也可用于本发明的情形。基于持续性和链置换活性，选择用于HDA的聚合酶。在熔融并与引物杂交之后，使核酸经受聚合步骤。如果待扩增的核酸是DNA，则选择DNA聚合酶。当初始靶标是RNA时，则首先使用反转录酶将RNA靶标复制成cDNA分子，然后通过所选择的DNA聚合酶在HDA中进一步扩增cDNA。DNA聚合酶作用于靶核酸，以在4种dNTP存在下延伸与核酸模板杂交的引物，从而形成与核酸模板上的核苷酸序列互补的引物延伸产物。

DNA聚合酶选自缺乏5’至3’核酸外切酶活性的聚合酶，并且所述聚合酶还可以任选地缺乏3’-5’核酸外切酶活性。

合适的DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I的核酸外切酶缺陷的Klenow片段（New England Biolabs，Inc.（Beverly，MA））、核酸外切酶缺陷的T7 DNA聚合酶（测序酶；USB（Cleveland，OH））、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（New England Biolabs，Inc.（Beverly，MA））、Bst DNA聚合酶的大片段（New England Biolabs，Inc.（Beverly，MA））、KlenTaq DNA聚合酶（AB Peptides（St Louis，MO））、T5 DNA聚合酶（美国专利No.5,716,819）、和Pol III DNA聚合酶（美国专利No.6,555,349）。在本发明的情形下，优选的是具有链置换活性的DNA聚合酶，例如大肠杆菌DNA聚合酶I的核酸外切酶缺陷的Klenow片段、Bst DNA聚合酶的大片段和测序酶。T7聚合酶是高保真的聚合酶，出错率为3.5x10⁵，显著低于Tag聚合酶（Keohavong和Thilly，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，9253-9257（1989））。然而，T7聚合酶不是热稳定的，因此，对于在需要热循环的扩增系统中的使用而言，T7聚合酶不是最佳的。在可以等温执行的HDA中，T7测序酶是用于扩增DNA的优选聚合酶之一。

在本发明的方法和试剂盒的情形下，聚合酶优选为热稳定的聚合酶。优选地，聚合酶选自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。没有显著的核酸外切酶活性的聚合酶是优选的。

一般来说，适合用于HDA和切口HDA的引物是短的合成寡核苷酸，例如具有大于10个核苷酸且小于50个核苷酸的长度。寡核苷酸引物的设计涉及多种参数，例如基于链的比对得分（string-basedalignment score）、熔融温度、引物长度和GC含量（Kampke等，Bioinformatics 17:214-225（2003））。在设计引物时，重要的因素之一是选择的序列在待扩增的核酸分子特有的靶片段内。另一个重要因素是确定用于HDA反应的引物的熔融温度。引物的熔融温度由寡核苷酸的长度和GC含量决定。优选地，引物的熔融温度在会发生杂交和扩增的温度范围内。例如，如果当使用大肠杆菌UvrD解旋酶制剂时，杂交和扩增的温度被设定在37℃，则被设计用于该反应的引物对的熔融温度应在约30℃至50℃范围内。如果杂交和扩增的温度是60℃，则被设计用于该反应的引物对的熔融温度应在55℃和70℃之间、优选在55℃和65℃之间的范围内。熔融温度显著高于反应温度的引物可能引起非特异性副反应，因此是不太优选的。为了选择用于HDA反应的最佳引物，可以在平行分析中测试一组具有各种不同的熔融温度的引物。Kampke等，Bioinformatics 17:214-225（2003）描述了关于引物设计的更多信息。各引物与靶核酸的每一末端杂交，并可以由聚合酶使用靶核苷酸序列作为模板以3’至5’方向延伸。杂交条件是如《分子克隆和实验指南》（“Molecular Cloning and Laboratory Manual”）第二版，Sambrook、Rich和Maniatis出版，Cold Spring Harbor（2003）中描述的标准条件。为了实现特异性扩增，同源或完全匹配的引物是优选的。然而，引物可以在5’末端包含不与靶核苷酸序列互补的序列。或者，整个引物中都可以含有不与靶核酸精确互补的核苷酸或序列。引物可以表示类似的引物，或者可以是用于HDA的非特异性引物或通用引物，只要可以在预定温度下通过引物-模板结合实现特异性杂交即可。

引物可以包含脱氧核糖核苷酸碱基A、T、G或C中的任一种和/或一个或多个核糖核苷酸碱基A、C、U、G和/或一个或多个修饰的核苷酸（脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸），其中修饰不会阻止引物与核酸的杂交或者引物的延长或者双链分子的变性。可以用化学基团例如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或者用非核苷酸接头修饰引物，以提高它们的性能或促进扩增产物的表征。

为了检测扩增产物，可以使引物经受修饰，例如荧光或化学发光标记和生物素化。其它标记方法包括放射性同位素、发色团和配体例如生物素或半抗原，所述配体尽管不能被直接检测到，但可以通过与其特异性结合伙伴例如分别为抗生物素蛋白和抗体的标记形式反应而被容易地检测到。可以通过本领域已知的方法制备如本文所述的引物。（参见，例如美国专利No.6,214,587）。在某些实施方案中，在本发明的方法中使用一对的两个序列特异性引物来实现靶序列的指数扩增，其中一个引物与靶序列的5’边界杂交，另一个引物与靶序列的3’边界杂交。该方法可以容易地与Lee等（J.Mol.Biol.316:19-34（2002））区分开。在单个HDA反应中可以利用多对引物以扩增多个靶标，同时在多重反应中使用不同的检测标签。多重反应常用于SNP分析以及病原体检测（Jessing等，J.Clin.Microbiol.41:4095-4100（2003））。

例如可以使用PrimerQuest程序（http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/Advanced.aspx）或Primer3程序（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）来设计tHDA引物。

在本文中使用时，“切口”是指在相对于由执行切口的酶识别的核苷酸序列而言的特定位置处只对完全双链的核酸分子或部分双链的核酸分子的双链部分的一条链进行的切割。其中核酸被切口的特定位置被称为“切口位点”。

“切口核酸内切酶”是识别完全或部分双链的核酸分子的特定核苷酸序列并在相对于识别序列而言的特定位置处只切割核酸分子的一条链的酶。在本文中使用时，“切口核酸内切酶”是指识别完全或部分双链的核酸分子的核苷酸序列并在相对于识别序列而言的特定位置处只切割核酸分子的一条链的核酸内切酶。限制性核酸内切酶典型地识别只由天然核苷酸构成的核苷酸序列，并只切割含有核苷酸序列的完全或部分双链的核酸分子的一条链。

在本发明的方法和试剂盒的情形下，切口核酸内切酶优选为热稳定的切口核酸内切酶。切口核酸内切酶是可商购的，例如购自NewEngland Biolabs（NEB）。优选地，切口核酸内切酶选自Nb.BsmI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI和Nt.AlwI。Nb.BsmI和Nt.BstNBI是特别优选的切口核酸内切酶。例如通过遗传工程改造标准的限制性核酸内切酶而获得的切口核酸内切酶也可用于本发明的情形。Nb.BsmI是只切割双链DNA底物上的一条DNA链的切口核酸内切酶；它识别序列5’-GAATGC-3’并在互补链上如斜线所指示的进行切割：5’-G/CATTC-3’。Nt.BstNBI是位点特异性核酸内切酶，其只切割双链DNA底物上的一条DNA链；它在其识别序列5’-GAGTC-3’的3’侧之外4个碱基处催化单链断裂。

根据本发明所使用的反应温度，选择在该温度下有活性的合适的切口核酸内切酶。

在“包含标签序列的引物”（“带标签引物”）的情况下，“由切口核酸内切酶识别的序列”（“切口核酸内切酶识别序列”）可以完全或部分处于所述标签序列中。切割位点也可以处于所述标签序列中，或者它可以在上游或下游的一个或几个碱基对（bp）处。切割位点（“切口位点”）可以在与所指示的识别序列相同的链上，或者在另一条链上。

在一个实施方案中，本发明的方法可以被描述为包括以下步骤：

（i）提供双链模板核酸，

（ii）使模板核酸与用于使双链模板核酸解旋的解旋酶接触，以形成至少部分单链的模板核酸，

（iii）加入用于与步骤（ii）的单链模板杂交的寡核苷酸引物，其中至少一个寡核苷酸引物包含由切口核酸内切酶识别的序列，

（iv）用聚合酶合成与单链模板核酸互补的寡核苷酸引物的延伸产物，以形成双链模板核酸，

（v）使在步骤（iv）中合成的双链模板核酸与用于在模板核酸中引入切口的切口核酸内切酶接触，

（vi）使步骤（v）的模板核酸与使双链模板核酸解旋的解旋酶接触，以形成至少部分单链的模板核酸，

（vii）加入用于与步骤（vi）的单链模板杂交的寡核苷酸引物，

（viii）用聚合酶合成与单链模板核酸互补的寡核苷酸引物的延伸产物，以形成双链模板核酸，

（ix）根据需要重复步骤（v）至（viii），以扩增模板核酸。

在扩增单链模板核酸的情况下，必须通过例如反转录或体外转录将单链模板核酸转录成双链核酸。

在本发明的方法的具体实施方案中，寡核苷酸引物的由切口核酸内切酶识别的序列处于不与模板核酸杂交的5’标签序列中，并且所述方法在步骤（iv）和（v）之间还包括以下步骤：

（a）使步骤（iv）的模板核酸与用于使双链模板核酸解旋的解旋酶接触，以形成至少部分单链的模板核酸，

（b）加入用于与步骤（a）的单链模板杂交的寡核苷酸引物，

（c）用聚合酶合成与单链模板核酸互补的寡核苷酸引物的延伸产物，以形成双链模板核酸。

在图2中示意性地示出了在DNA上使用带标签引物的切口tHDA反应的过程：步骤A：通过解旋酶将dsDNA（“靶DNA”，“模板DNA”）解旋，并且引物对与单链DNA结合。一个引物具有不与模板DNA杂交的5’标签序列。DNA聚合酶开始合成从引物开始的互补链。步骤B：形成两条双链产物DNA：基于不带标签引物的产物1对应于模板DNA并再次进入步骤A中的反应；产物1’包含标签序列并被解旋酶解旋。步骤C：通过DNA聚合酶合成产物1’的互补链。步骤D：一条链产生产物1’并再次进入步骤C中的反应，另一条链产生产物2，产物2包含具有功能性切口位点和切口酶识别序列的标签序列。步骤E：产物2的一条链在切口位点处被切割，并被解旋酶从另一末端开始解旋。DNA聚合酶延长切割位点处的3’末端并置换链（“链置换扩增”（SDA））。引物结合在另一条链上并被DNA聚合酶延长。步骤F：引物延长产生了两种产物，产物3包含标签序列，产物3’不包含标签序列。产物3在切口位点处被再次切割，并合成了互补链。产物3’被解旋酶解旋。步骤G1：产物3的扩增产生了再次进入步骤G1的产物3和进入步骤G2的产物3’。步骤G2：合成两条ssDNA链的互补链，产生了再次进入步骤E和G2中的反应的产物2和3’。总反应导致产物3的积累。可以用杂交探针例如与扩增子的反向链互补的杂交探针检测该产物。

在图3中示意性地示出了在DNA上使用不带标签引物的切口tHDA反应的过程。步骤A：向dsDNA添加包含至少一个引物、DNA聚合酶、解旋酶和切口核酸内切酶的反应混合物。引物包含切口核酸内切酶的识别序列。dsDNA被解旋酶解旋，引物与单链杂交并被延长。在一条链中引入了切口核酸内切酶识别位点。步骤B：所产生的dsDNA被切口核酸内切酶切割。步骤C：解旋酶将dsDNA解旋，旧的引物或新结合的引物在3’末端处被DNA聚合酶延长。

在下文中，总结了DNA的一步法和两步法切口tHDA反应的典型的但仅仅是示例性的并且是非限制性的方案：

两步法tHDA方案

1.向包含dNTP、dATP或ATP，镁离子（例如硫酸镁MgSO₄），缓冲剂例如Tris HCl，以及盐例如NaCl和/或KCl的合适的水性反应缓冲液中加入模板DNA以及正向和反向引物。例如微量离心管类型可以被用作反应容器。

2.将反应混合物加热至变性温度（例如95℃，持续例如2min），任选地在4℃下冷却或置于冰上，然后在实际反应温度下持续短时间（例如64℃或65℃，持续例如1至3min）。然后，任选地将反应混合物置于冰上或4℃。

3.向反应混合物中加入酶，即解旋酶、DNA聚合酶和切口酶。例如可以通过短暂的涡旋或通过移液管吹打轻轻地混合反应混合物。可以将酶预先混合在合适的缓冲液中。

4.在合适的温度下例如在64℃或65℃下将反应混合物温育合适的时间，例如60至90min，优选为60至75min。

一步法tHDA方案

对于一步法方案而言，略过了两步法方案的步骤2。在步骤1之后，直接进行到步骤3。

用于本发明的方法的典型缓冲条件如下：

-Tris：5至100mM，优选为10mM

-pH7.5至9.5，优选为pH8.8

-KCl：0至50mM，优选为5mM

-MgSO₄：1至6mM，优选为3.5mM

-NaCl：0至100mM，优选为40mM

-dNTP：0.1至1mM，优选为0.4mM

-(d)ATP（即dATP和/或ATP）：1至7mM，优选为3mM

-引物（正向）：0.02至1.5μΜ，优选为0.1μΜ

-引物（反向）：0.02至1.5μΜ，优选为0.1μΜ

-切口核酸内切酶：0.01-10U/反应，优选为0.5至3U/反应（25μl/反应）

-聚合酶：0.3至3U/μl，优选为0.6至2U/μl

-解旋酶：1至100ng/μl，优选为3至20ng/μl

任选地可以加入甜菜碱，优选其浓度为100至2000mM，优选为700至1200mM。

然而，这些只是示例性的条件，可以根据其它参数例如所使用的具体的酶、模板和/或引物序列或者温度对所述条件进行调整。

在具体实施方案中，本发明的方法还包括检测扩增产物的步骤。例如可以使用凝胶电泳、嵌入染料或特异性寡核苷酸探针来检测扩增产物。

可通过多种方法来检测扩增的核酸产物，所述方法包括溴化乙锭染色以及用选自以下的标签检测扩增的序列：放射性标签、荧光标签和酶。例如可以使用荧光标记的LUX^TM引物（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）实时检测HDA扩增产物，所述引物是在3’末端附近设计有荧光团的发夹结构的寡核苷酸。该构型固有地赋予了荧光猝灭能力，而无需单独的淬灭基团。当引物变成被掺入到双链扩增产物中时，荧光团被去淬灭化，导致荧光信号显著增加。

寡核苷酸探针优选包含荧光标签，即典型地为共价连接的荧光染料。

具体地，荧光标记的探针可以标记有选自以下的染料：FAM、VIC、NED、荧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、BODIPY TMR、俄勒冈绿、罗丹明绿、罗丹明红、德克萨斯红、亚基马黄、Alexa Fluor和PET。

合适的杂交探针包括LightCycler探针（Roche）、TaqMan探针（Roche）、分子信标、Scorpion引物、Sunrise引物、LUX引物和Amplifluor引物。在本发明的情形下，TaqMn探针是优选的。

本发明还涉及用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包含

-切口核酸内切酶，

-解旋酶，和

-DNA聚合酶。

对于本发明的方法而言，试剂盒的解旋酶优选选自：超家族I解旋酶，例如dda、pcrA、F质粒traI蛋白解旋酶和UvrD；超家族II解旋酶，例如recQ和NS3解旋酶；超家族III解旋酶，例如AAV rep解旋酶；来自于dnaB样超家族的解旋酶，例如T7噬菌体解旋酶；以及来自于rho样超家族的解旋酶。优选的是，解旋酶是热稳定的解旋酶。热稳定的Tte-UvrD解旋酶是特别优选的。

试剂盒的聚合酶优选自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。

试剂盒的切口核酸内切酶优选自Nb.BsmI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI和Nt.AlwI。

本发明的试剂盒还可以包含

-缓冲剂，例如Tris，和/或

-dNTP，和/或

-(d)ATP，和/或

-镁盐，例如磷酸镁，和/或

-NaCl，和/或

-KCl。

本发明的试剂盒还可以包含拓扑异构酶和/或SSB。

试剂盒的各个组分可以在一个或多个容器中。两个或更多个组分可以例如共同在一个容器例如反应管或小瓶中。优选地，缓冲剂、盐、dNTP以及如果存在的话还有(d)ATP在预先混合的溶液中。所述试剂盒还可以包含手册。

本发明还涉及本发明的方法和试剂盒在扩增和/或检测核酸中的应用。所述方法和试剂盒例如可以用于检测微生物、病毒、病原体、人类的基因组DNA和cDNA等。对其中的核酸进行检测的样品例如可以是临床样品例如体液，例如血液、血浆、血清和尿液；或者可以是来自于环境、植物、动物、牲畜、食品的样品或来自于犯罪现场的样品。所述方法和试剂盒例如可以用于专用的实验室、护理点或现场。核酸可以在扩增之前从样品中被纯化和/或分离，或者它们可以在样品中被直接扩增和/或检测。

下面的实施例示出了本发明的具体实施方式，但所述实施例不是限制性的。

实施例

实施例1：使用带标签引物的切口tHDA

在该实施例中，使用标准tHDA和本发明的切口tHDA方法分别扩增和检测了来自于淋病奈瑟氏菌基因组的孔蛋白基因的序列（SEQID NO：1）：

5’-ATTTGTTCCGAGTCAAAACAGCAAGTCCGCCTATACGCCTGCTACTTTCACGCTGGAAAGTAATCAGATGAAACCAGTTCCG-3’

a）材料：

表1：用于扩增和检测SEQ ID NO：1的引物和探针

Tm：熔融温度；标准tHDA：引物PorA F5和PorA R5，探针PorA5 VD5FAM（标记有6-FAM和BHQl）；切口tHDA：引物PorA F5和porA_NS，探针PorA5_VD5FAM（标记有6-FAM和BHQl）

表2：用于淋病奈瑟氏菌（N.gonorrhoeae）基因组DNA的标准tHDA和切口tHDA的使用表1的引物的预混物1

反应混合物：

2.5μl 10x退火缓冲液

0.2μl 5M NaCl

0.4μl 25mM dNTP混合物

0.75μl l00mM dATP

1μl 100mM MgSO₄

10x退火缓冲液：

100mM KCl

200mM Tris/HCl pH8.8

表3：用于淋病奈瑟氏菌基因组DNA的标准tHDA和切口tHDA的使用表1和2的引物和试剂的预混物2

用于电泳的12%聚丙烯酰胺凝胶：

12ml 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺29:1

3ml TBE

13ml H₂O

150μl 10% APS

40μl TEMED

a）方法：

-用移液管将22μl预混物1吸到8x PCR排管中

-在PCR循环仪中在95℃下2min的变性步骤，然后立即在4℃下冷却，

-然后将排管在管扫描器（Tube Scanner）（ESE GmbH）中在65℃下温育1min

-在盖上盖离心后，用移液管向排管的盖子中各加入3μl预混物2

-将反应混合物通过振摇进行混合，再次离心，并置于管扫描器中

-然后在65℃下将管温育60min，每30秒读取荧光

-接着将各10μl的反应物转移到RotorGene管中，并用RotorGeneQ（QIAGEN GmbH）测定熔融曲线（55-95℃，增量0.5℃，保持5"）

-将各4μl的反应物荷载到12%聚丙烯酰胺凝胶（70min，140V）上

c）结果：

I）实时（切口）tHDA：

图4示出了在管扫描器中不同的实时（切口）tHDA反应的结果（扩增曲线）。图中所示的是随时间推移的原始荧光强度。

-所有无模板对照反应（NTC）均没有显示出非特异性扩增

-标准tHDA的扩增曲线在约15min处具有分接点（take-off point）

-无Nb.BsmI的切口tHDA的扩增曲线在24min处具有分接点，并具有显著小于另两条曲线的斜率

-有Nb.BsmI的切口tHDA的扩增曲线在约11min处具有分接点

II）熔融曲线：

图5示出了扩增产物的熔融曲线。A）标准tHDA，B）无Nb.BsmI的切口tHDA，C）有Nb.BsmI的切口tHDA。

对于所有包含靶（模板）DNA的反应，通过熔融温度（Tm）均可鉴定到特异性扩增产物。在所有NTC反应中，没有观察到可检测的扩增子。

III）聚丙烯酰胺凝胶：

图6示出了具有扩增和电泳后的各个反应混合物的聚丙烯酰胺凝胶。A）染色前的凝胶，B）用EtBr染色后的凝胶。凝胶上各个条带B1至B5的内含物还被图示在图6B1至6B5中。

泳道1：淋病奈瑟氏菌gDNA的标准tHDA

泳道2：NTC标准tHDA

泳道3：淋病奈瑟氏菌gDNA的无Nb.BsmI的切口tHDA

泳道4：NTC无Nb.BsmI的切口tHDA

泳道5：淋病奈瑟氏菌gDNA的有Nb.BsmI的切口tHDA

泳道6：NTC有Nb.BsmI的切口tHDA

L：10bp梯状条带（大小标记物）

未染色凝胶上的条带（图6A）是由于荧光标记的探针引起的。这些条带证实了所预期的产物对引物和切口核酸内切酶的初始量的依赖性（B1-B3）。

在染色凝胶上，可观察到dsDNA扩增产物（B4，B5）以及与探针的杂交产物（B1-B3）的显著条带，所述杂交产物在未染色凝胶上也可被观察到。所有NTC反应也显示出条带，但是所述条带在管扫描器或Tm分析中由于在该检测模式（ssDNA反向链与探针的特异性杂交）中它们的非特异性序列，因此均没有引起假阳性信号。所有NTC反应在未染色凝胶中也没有显示出条带，在未染色凝胶中的条带指示与探针杂交。

实施例2：使用不带标签引物的切口tHDA

a）靶序列

靶序列（SEQ ID NO：6）源自于人类p53基因的mRNA，并包含序列NM001126114的核苷酸残基322至395。

为了设计包含由切口核酸内切酶识别的序列的引物，对反向引物HDA-TP53rev的原始序列进行修饰，从而产生了引物序列HDA-TP53rev7。这引入了酶Nt.BstNBI的识别序列（参见图7）。

表4：用于扩增的引物序列

引物ID	序列ID	序列5’→3’
			HDA-TP53for	SEQ ID NO：7	ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATT
HDA-TP53rev	SEQ ID NO：8	CATTCTGGGAGCTTCATCTGGACCGT
			HDA-TP53rev7	SEQ ID NO：9	CATTCTGGGAGTCTCATCTGGACCTG

b）从人类cDNA扩增p53

材料：

对于该反应，将人类RNA转录成cDNA。对于tHDA反应，使用来自于10ng RNA的cDNA。在表5所概述的缓冲液（反应混合物）中执行该反应。

表5：用于tHDA扩增p53cDNA的反应混合物

Tris，pH8.8	10	mM
			KCl	5	mM
MgSO₄	3.5	mM
			NaCl	40	mM
dNTP	0.4	mM
			dATP	3	mM
甜菜碱	975	mM
			引物HDA-TP53	0.1	μM
引物HDA-TP53rev7	0.1	μM
			Nt.BstNBI切口核酸内切酶	0-10	U/反应
Bst聚合酶	1	U/μl
			解旋酶	10	ng/μl

反应混合物已被置于冰上，然后在实时PCR循环仪中在65℃下执行60min。

结果：

c）从人类基因组DNA（gDNA）扩增p53

100ng人类基因组DNA被用于该反应，并在95℃加热步骤中进行变性。在表6所概述的反应缓冲液中执行该反应。

表6：用于tHDA扩增p53gDNA的反应混合物

Tris，pH8.8	10	mM
			KCl	5	mM
MgSO₄	3.5	mM
			NaCl	40	mM
dNTP	0.4	mM
			dATP	3	mM
甜菜碱	975	mM
			引物HDA-TP53	0.1	μM
引物HDA-TP53rev7	0.1	μM
			Nt.BstNBI切口核酸内切酶	0-0.4	U/μl
Bst聚合酶	1	U/μl
			解旋酶	10	ng/μl

结果：

Claims

1.用于扩增模板核酸的方法，

其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应扩增所述模板核酸，并且

其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中，其中HDA反应是嗜热的HDA（tHDA），其中使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中，并且其中扩增的序列短于400bp。

2.权利要求1的方法，其中包含由切口核酸内切酶识别的序列的所述引物包含不与模板核酸杂交的5’标签序列，并且由切口核酸内切酶识别的序列处于所述标签序列中。

3.前述权利要求任一项的方法，其中模板核酸是双链模板核酸，优选为DNA。

4.前述权利要求任一项的方法，其中解旋酶选自：超家族I解旋酶，例如dda、pcrA、F质粒traI蛋白解旋酶和UvrD；超家族II解旋酶，例如recQ和NS3解旋酶；超家族III解旋酶，例如AAV rep解旋酶；来自于dnaB样超家族的解旋酶，例如T7噬菌体解旋酶；以及来自于rho样超家族的解旋酶。

5.前述权利要求任一项的方法，其中聚合酶选自Bst DNA聚合酶、PyroPhage聚合酶、DisplaceAce聚合酶和Vent(exo-)聚合酶。

6.前述权利要求任一项的方法，其中切口核酸内切酶选自Nb.BsmI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.BbvCI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.BsmAI、Nt.BbvCI、Nt.BspQI和Nt.AlwI。

7.前述权利要求任一项的方法，其中在超过50℃、优选在50℃和70℃之间、更优选在60℃和65℃之间的温度下执行HDA扩增反应。

8.前述权利要求任一项的方法，其还包括初始的热变性步骤。

9.前述权利要求任一项的方法，其还包括检测扩增产物的步骤。

10.权利要求9的方法，其中使用凝胶电泳、嵌入染料或特异性寡核苷酸探针来检测扩增产物。

11.用于扩增核酸的试剂盒，其包含

-切口核酸内切酶，

-解旋酶，和

-DNA聚合酶。

12.权利要求11的试剂盒，其还包含

-缓冲剂，例如Tris，和/或

-dNTP，和/或

-(d)ATP，和/或

-镁盐，例如磷酸镁，和/或

-NaCl，和/或

-KCl。

13.权利要求1至10任一项的方法或权利要求11或12任一项的试剂盒在扩增并任选检测核酸序列中的应用。