CN1688709A

CN1688709A - 核酸的解旋酶依赖性扩增

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Publication number: CN1688709A
Application number: CN 03824150
Authority: CN
Inventors: H·孔; M·文森特; Y·徐
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2005-10-26
Anticipated expiration: 2023-09-19
Also published as: CN100519758C

Abstract

提供了选择性地指数扩增核酸的方法和试剂盒，包括应用解旋酶制剂和DNA聚合酶，以使扩增可以等温进行。

Description

核酸的解旋酶依赖性扩增

技术领域

本发明的实施方案涉及应用解旋酶来呈指数地和选择性地扩增目标核酸的方法，以及这些方法在检测样品中核酸的应用。

背景技术

核酸扩增广泛用于研究、法学、医学和农业。最著名的扩增方法之一是聚合酶链式反应(PCR)，这是一种目标扩增方法(见如美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159)。PCR反应通常使用两个寡核苷酸引物和DNA聚合酶来产生双链产物，其中，引物与目标序列的5’和3’端杂交，而DNA聚合酶通过添加脱氧核苷三磷酸(dNTPs)来延伸退火引物。通过提高和降低反应混合物的温度，DNA的两条链被分开并作为下一循环的退火和延伸的模板，并重复这样的过程。

尽管PCR已经被研究人员广泛使用，但它需要热循环来分开两条DNA链。在过去的10年里，已经开发出若干种等温目标扩增方法。其中之一是链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)。SDA综合了限制性内切酶在其目标DNA的未修饰链上制造切口(nick)的能力以及外切酶缺陷型DNA聚合酶延伸切口3’端和置换下游DNA链的作用。被置换的链充当反义(antisense)反应的模板，反之亦然，从而导致目标DNA的指数性扩增(见如美国专利5,455,166和5,470,723)。在最初设计的SDA中，DNA首先被限制性酶切割以产生具有限定的5’末端和3’末端的可扩增目标片段，但是由于需要限制性酶切割位点，这便限制了目标DNA序列的选择(见如Walker et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：392-396(1992))。已经通过利用位于待扩增区域的两侧的缓冲引物(bumper primers)克服了这一不便(Walker et al.，supra(1992))。SDA技术主要用于传染病如衣原体和淋病的临床诊断。SDA最吸引人的一个特点是其在单一的温度下操作，不需要装备昂贵的热循环仪器。然而，SDA在扩增长目标序列时效率低。

第二种等温扩增技术，转录介导扩增(Transcription-MediatedAmplification，TMA)，利用RNA聚合酶的功能，由构建在引物区域的启动子来制备RNA，并用逆转录酶由RNA模板制备DNA。通过引入第三种酶活性，核糖核酸酶H(RNase H)，在无需热变性步骤的情况下从cDNA中去除RNA，这样RNA扩增技术可得到进一步改善。因此，去除了热循环步骤，产生了称为自主序列复制(Self-sustained SequenceReplication)(3SR)的等温扩增方法(如见Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878(1990))。然而，TMA和3SR的起始材料仅限于RNA分子。

第三种等温目标扩增方法，滚环扩增(Rolling Circle Amplication，RCA)，产生序列的多个拷贝以用于由体内滚环DNA复制变化而来的体外DNA扩增(参见，例如Fire和Xu，Proc.Natl.Acad Sci.USA 92：4641-4645(1995)；Lui，et al.，J.Am.Chem.Soc.118：1587-1594(1996)；Lizardi，et al.，Nature Genetics 19：225-232(1998)，美国专利5,714,320和6,235,502)。在该反应中，DNA聚合酶在环状模板上延伸引物，产生该模板的互补序列的串连拷贝(tandemly linked copies)(参见如Kornbergand Baker，DNA Replication，W.H.Freeman and Company，New York(2^nd ed.(1992))。最近，RCA在称为多重置换扩增(Multiple DisplacementAmplification，MDA)的技术中得到进一步发展，MDA技术在全基因组扩增方面具有高度一致的表现(参见如Dean et.al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 99：5261-5266(2002))。

其它的核酸扩增方法包括连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction，LCR)，这是一种探针扩增技术(probe amplification technology)(参见如Barany，Proc.Natl.Acad Sci.USA 88：189-193(1991))；和美国专利5,494,810)，还包括分支DNA(bDNA)技术(Horn et al.，Nucleic Acids Res.25：4842-4849(1997))，这是一种信号扩增技术(signal amplificationtechnology)。

上面提到的扩增技术都有它们的局限性。例如，PCR和LCR需要热循环仪和相关的仪器操作。除了PCR，没有其它的目标扩增方法能够扩增可用于克隆基因和毒性因子及抗生素抗性基因的分析的具有足够长度的DNA目标。尽管PCR能够扩增长达10-20kb的目标，但高突变率可能会限制PCR扩增产物的应用(Cline et al.，Nucleic Acids Res.24，3546-3551(1996))。因此，为了最小化这些问题，需要扩增长目标的高保真扩增方法。此外，所有现有的扩增方法都需要预先热变性和退火步骤，以产生DNA聚合酶能利用的引物模板。这使扩增过程需要额外的时间。

核酸扩增技术的潜在应用在持续增加。例如，核酸阵列常常要利用大量的扩增反应。对有环境污染的地方的检测要求诊断测试的灵敏性和分析能力，所述诊断测试包括核酸扩增程序。因此，改善扩增技术是必要的。

发明概述

在本发明的实施方案中，提供了指数性地和选择性地扩增目标核酸的方法，包括步骤：提供将要扩增的目标核酸的单链模板；加入用以与模板杂交的寡核苷酸引物；通过DNA聚合酶合成与模板相互补的寡核苷酸引物的延伸产物，形成双螺旋；将该双螺旋与用于解开双螺旋的解旋酶制剂接触；重复上述步骤，从而选择性地指数扩增目标核酸。

在本发明的其它实施方案中，扩增可以是等温的，可以在约20℃到75℃的范围内完成，优选在室温下。

在本发明的其它实施方案中，目标核酸可以是单链核酸，更特别地，是单链DNA或单链RNA，也可以是双链核酸，更特别地，是双链DNA。当核酸是双链时，其可以通过加热或酶学方法变性以形成单链模板用于DNA聚合酶依赖性扩增。此外，目标核酸的大小可以在约50bp到100kb的范围内。

在本发明的其它实施方案中，用于该扩增方法的寡核苷酸引物是一对寡核苷酸引物，其中一条引物与要被选择性扩增的目标核酸的5’端杂交，一条引物与要被选择性扩增的目标核酸的3’端杂交。在多重反应(multiplexing)的情形中，可以使用多个引物对在同一反应混合物中扩增多个目标核酸。此外，寡核苷酸引物可以具有一定的长度和GC含量以使得所述寡核苷酸引物的解链温度高于扩增期间杂交的反应温度10℃到30℃。

在本发明的其它实施方案中，DNA聚合酶选自大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的Klenow片段、T7DNA聚合酶(测序酶)和Bst聚合酶大片段(Bst polymerase large fragment)。优选地，DNA聚合酶缺少5’至3’外切酶活性并具有链置换活性(strand displacement activity)。

在本发明的其它实施方案中，解旋酶制剂可以包括单种解旋酶或许多种解旋酶。制剂中的解旋酶可以选自3’至5’端解旋酶类型或5’至3’端解旋酶类型。更特别的，解旋酶制剂可以包括来自超家族1-4的解旋酶或AAA⁺解旋酶。解旋酶可以是六聚体解旋酶(hexameric helicase)或单体解旋酶(monomeric helicase)或二聚体解旋酶(dimeric helicase)。更特别地，解旋酶可以是UvrD解旋酶或其同源物(homolog)，例如热稳定的解旋酶或其同源物。

在本发明的其它实施方案中，解旋酶制剂可以包括一个或多个选自酶的解旋酶：大肠杆菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7 Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、SV40大T抗原解旋酶(SV40 large T antigen helicase)、疱疹病毒解旋酶、酵母Sgsl解旋酶、DEAH_ATP依赖性解旋酶(DEAH_ATP-dependent helicases)和乳头瘤病毒解旋酶E1蛋白(Papilliomavirus helicase E1 protein)及其同源物。

此外，解旋酶制剂包括三磷酸核苷酸(NTP)或三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，如三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)或三磷酸脱氧腺苷(dATP)。适于用作能量来源的浓度在约0.1到50mM范围内。

在本发明的其它实施方案中，解旋酶制剂包括单链结合蛋白(SSB)，例如T4基因32SSB、大肠杆菌SSB、T7基因2.5SSB、噬菌体phi 29 SSB和它们的衍生物，以及辅助蛋白，如MutL。

本发明的实施方案包括利用解旋酶依赖性扩增来检测生物样品中的病原体，其中目标核酸是来自病原体的核酸。可选择地，当目标核酸是染色体DNA的片断时，可以检测在染色体DNA中的序列差异。该方法可以用于检测在不同来源的目标核酸中的单核苷酸多态性。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于实施解旋酶依赖性扩增的试剂盒，该试剂盒包括解旋酶制剂、三磷酸核苷酸或三磷酸脱氧核苷酸、DNA聚合酶和说明书。该试剂盒可以用于例如本领域、具有标准设备的实验室，或用于样品的高通量筛选。

在本发明的一个实施方案中，提供了用于确定在解旋酶制剂中所使用的解旋酶是否适于选择性地指数扩增目标核酸的方法，其包括步骤：制备包含有解旋酶、NTP或dNTP、缓冲液以及可选配的单链结合蛋白和/或辅助蛋白的解旋酶制剂，其中Tris-乙酸盐或Tris-HCl缓冲液提供大约pH6.0-9.0的pH范围，NaCl或KCl的浓度范围为0-200mM；将不同浓度或拷贝数的目标核酸、寡核苷酸引物、四种dNTPs和DNA聚合酶加入到解旋酶制剂中；在约20℃和75℃之间的温度温育混合物；和分析扩增的DNA，从而确定是否发生了选择性的指数扩增。

为了确定解旋酶依赖性扩增的最佳条件，反应混合物的组成、反应条件和反应物浓度可以在本文所提供的某些范围内变化。

附图说明

图1.解旋酶置换扩增(Helicase Displacement Amplification)的示意图，其中(1)表示引物与单链DNA退火，(2)表示DNA聚合酶延伸引物，其中一个双链体被扩增为两个双链体，和(3)表示重复循环以得到指数性扩增。

图2A.示意性图示了用引物对寡核苷酸进行HDA扩增，得到扩增产物。

图2B.根据图2A的HDA反应，其中HDA产物在3％LMP琼脂糖凝胶上鉴定(泳道1)，泳道2含有用作大小标记(M)的pBR322/MspI梯度。

图3.示意性图示了利用HDA选择性扩增在包含有目标序列的大DNA分子中的目标序列，其中(4)是双链DNA分离/引物退火，(5)是用聚合酶延伸引物，(6)解旋酶解旋和随后的引物退火，(7)是DNA聚合酶延伸引物，和(8)为解旋、退火和延伸。

图4.来自DNA质粒的各种大小的目标序列的扩增。

使用解旋酶制剂加上聚合酶和两个引物(1224和1233)，以及质粒pAH1中不同长度的目标DNA进行HDA反应，其中解旋酶制剂包含大肠杆菌UvrD解旋酶、大肠杆菌MutL、T4 Gp32和ATP。通过凝胶电泳在3％LMP琼脂糖凝胶上分析扩增产物。泳道1：110-bp；泳道2：200bp；泳道3：300bp；泳道4：400bp；泳道5：650bp长度的目标DNA。M：100bp DNA梯度大小标记。

图5.使用两种不同的聚合酶扩增来自细菌基因组DNA的目标序列。使用UvrD解旋酶制剂加上两种不同的聚合酶从龋垢密螺旋体(T.denticola)基因组DNA中扩增出目标核酸，解旋酶制剂包含大肠杆菌UvrD解旋酶、大肠杆菌MutL、T4 Gp32和ATP。通过凝胶电泳在3％LMP琼脂糖凝胶上分析扩增产物。

图5A：使用DNA聚合酶I的exo-Klenow片段的HDA；

泳道1：使用引物-58861和引物-58862的HDA产物；

泳道2：使用引物-58861和引物-58863的HDA产物。

图5B：使用T7测序酶和引物-58861及58863的HDA：

泳道1：1.5单位的T7测序酶；

泳道2：3.5单位的T7测序酶；和

泳道M显示了用作大小标记的100bp DNA梯度。

图6.来自人基因组DNA的目标序列的扩增。

使用下列试剂进行HDA反应：含有大肠杆菌UvrD解旋酶、MutL、T4 Gp32和ATP的解旋酶制剂加上DNA聚合酶、两条引物和人基因组DNA。通过凝胶电泳在3％LMP琼脂糖凝胶上分析扩增产物。M：100bpDNA梯度用作大小标记。HDA产物来自：100ng初始人基因组DNA(泳道1)；来自150ng初始人基因组DNA(泳道2)；来自200ng初始人基因组DNA(泳道3)。

图7.与cDNA合成(RT扩增)相结合的目标序列扩增。

HDA反应与cDNA合成相结合。第一链cDNA(RNA/DNA杂交体)使用下列试剂进一步HDA扩增：含有大肠杆菌UvrD解旋酶、MutL、T4Gp32和ATP的解旋酶制剂加上DNA聚合酶，和对鼠GAPDH基因具有特异性的两条引物。扩增产物：2μl的第一cDNA链(泳道1)，4μl的第一cDNA链(泳道2)，其通过凝胶电泳在3％LMP琼脂糖凝胶上分析。M：X174 DNA-HaeIII DNA梯度。

图8.来自细菌基因组DNA的不同拷贝数的目标序列的扩增的灵敏度。使用下列试剂进行HDA反应：含有大肠杆菌UvrD解旋酶、MutL、T4Gp32和ATP的解旋酶制剂加上DNA聚合酶、两条引物(引物58861和引物58862)和不同数量的龋垢密螺旋体基因组DNA。通过凝胶电泳在3％LMP琼脂糖凝胶上分析HDA产物。最初存在于每个HDA反应中的单龋垢密螺旋体染色体的拷贝数显示在每个泳道的上方，每个泳道的拷贝数递减：10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10和0。

图9.来自细菌基因组DNA的目标序列的扩增，无预先变性。

使用下列试剂进行HDA反应：含有大肠杆菌UvrD解旋酶、MutL、T4Gp32和ATP的解旋酶制剂加上DNA聚合酶、两条引物(引物58861和引物58862)和龋垢密螺旋体基因组DNA。通过凝胶电泳在3％LMP琼脂糖凝胶上分析HDA产物。M：X174DNA-HaeIII DNA梯度。

图10.用单一的一种解旋酶(T7 Gp4B解旋酶)或两种解旋酶(UvrD解旋酶和T7 Gp4B解旋酶)对2.3-kb的目标DNA进行扩增。

使用两种引物(1224和1233)和质粒pCR-Rep进行HDA反应：存在包括T7 Gp4B解旋酶和T7 Gp2.5SSB的T7 Gp4B解旋酶制剂(泳道1)；存在包括T7 Gp4B解旋酶和UvrD解旋酶的解旋酶制剂(泳道2)；阴性对照，无解旋酶(泳道3)；M：2-log DNA梯度用作大小标记。HDA产物由1％的凝胶电泳显示。

图11.使用RecBCD解旋酶对400bp的目标DNA进行的扩增。

使用下列试剂进行HDA反应：含有RecB^D1067ACD解旋酶、T4 Gp32和ATP的RecBCD解旋酶制剂加上聚合酶(T7测序酶)、两条引物(1224和1233)和目标DNA。HDA产物由1％的凝胶电泳显示。其中，泳道2显示由包含RecB^D1067ACD解旋酶和T7测序酶的解旋酶制剂产生的扩增产物；泳道3显示没有解旋酶的阴性对照。标记：2-log DNA梯度用作大小标记(NEB)。

图12.来自细菌基因组DNA的目标序列的热稳定性HDA扩增。

使用下列试剂进行HDA反应：含有热稳定性Tte-UvrD解旋酶、T4Gp32和dATP的解旋酶制剂加上热稳定性Bst DNA聚合酶、两条引物和龋垢密螺旋体基因组DNA。通过凝胶电泳在2％LMP琼脂糖凝胶上分析扩增产物。M：100bp DNA梯度用作大小标记(NEB)。泳道1：82bp产物。

图13.利用热稳定性解旋酶对来自淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)基因组DNA的目标序列进行扩增，其中缺少某些或全部的辅助蛋白。

使用不同的解旋酶制剂加上热稳定性Bst DNA聚合酶、两种引物和淋病奈瑟球菌基因组DNA进行HDA反应。一种解旋酶制剂包括热稳定性Tte-UvrD解旋酶、T4 Gp32和dATP(泳道1)；第二种解旋酶制剂包含热稳定性Tte-UvrD解旋酶和dATP(泳道2)；在对照反应中，仅T4 Gp32和ATP存在于制剂中(泳道3)；M：100bp DNA梯度用作大小标记(NEB)。

图14.通过HDA方法实时检测口腔病原体，龋垢密螺旋体。

使用下列试剂进行HDA反应：包含大肠杆菌UvrD解旋酶、MutL、T4 Gp32和ATP的UvrD解旋酶制剂加上DNA聚合酶、龋垢密螺旋体基因组DNA、荧光标记的LUX引物(Invitrogen)和反向引物。通过使用实时PCR仪iCycler(Bio-Rad)测定FAM荧光信号来检测扩增产物。1&2：两个相同的反应，其中HDA在存在基因组DNA、引物和UvrD HDA体系的情况下进行；3：HDA扩增类似1&2，除了不存在基因组DNA(阴性对照)。

图15.质粒pAH1的序列(SEQ ID NO：9)。

图16.龋垢密螺旋体earRI基因的序列(SEQ ID NO：10)。

实施方案详细描述

在此描述了一种新颖的扩增方法，其称之为“解旋酶依赖性扩增(HDA)”。解旋酶依赖性扩增(HDA)是基于DNA解旋酶的解旋活性。这种新颖的方法使用解旋酶而不是利用加热来分开DNA双螺旋的两条链，产生单链模板，用于体外扩增目标核酸的目的。序列特异性引物与模板杂交，然后被DNA聚合酶延伸，从而扩增目标序列。重复该过程，以便实现在单一温度下的指数性扩增(图1)。

这一扩增系统相对现有技术中描述的扩增程序具有改进的特征。这些改进包括如，能够等温高保真地扩增核酸的长目标序列。

HDA依靠一种或者多种解旋酶来分开(解链或解旋)核酸双螺旋的两条链。HDA还利用DNA或RNA聚合酶来延伸与单链核苷酸序列杂交的引物，从而形成互补的引物延伸产物。重复该过程，以便实现在单一温度下的指数性扩增。本实施方案相对于现有技术中的扩增方法的优势包括能够等温扩增长目标DNA和RNA序列(长度大于约200个核苷酸，更特别的大于500个核苷酸，更特别的大于1000个核苷酸，更特别的大于2000个核苷酸，更特别的长达50,000个核苷酸，更特别的长达100,000个核苷酸)，以及能够从头到尾在一个温度下扩增目标序列。

定义

为了方便起见，用于说明书、实施例和权利要求书的某些术语整理如下：

术语“核酸”指双链或单链DNA、RNA分子或DNA/RNA杂交体。那些双链核酸分子可以是有缺口的或完整的。双链或单链核酸分子可以是线性的或环状的。双螺旋可以是平末端的或具有单链尾巴(tail)。单链分子可以具有发夹(hairpins)或环茎(loops and stems)形式的二级结构。核酸可以分离自许多来源，包括环境、食物、农业、发酵、生物液体如血液、乳液、脑脊髓液、痰、唾液、粪、肺抽吸物(lung aspirates)，粘膜组织或组织样品或细胞的拭样(swabs)。核酸样品可以取自细胞或病毒，可以包括任何下述物质：染色体DNA，染色体外DNA包括质粒DNA、重组DNA、DNA片段，信使RNA，转运RNA，核糖体RNA，双链RNA或存在于细胞或病毒中的其它RNA。核酸可以被分离、克隆或在体外用化学合成的方法合成获得。任何上述核酸都可以进行修饰，其中可以化学改变核酸中的某个核苷(如，通过甲基化作用)。修饰可以自然发生，或体外合成。术语“双螺旋”指整个或者部分为双链的核酸分子。

术语“目标核酸”是指将被选择性扩增的核酸的整体或部分，其由3’和5’边界来限定。目标核酸也可以指想要扩增的片段或序列。将要扩增的目标核酸的大小可以，例如在50bp到约100kp范围内，包括在大于100-5000bp的范围内。目标核酸可以包含在更长的双链或单链核酸中。可选择地，目标核酸可以是整个双链或单链核酸。

术语“解链(melting)”、“解旋(unwinding)”或“变性(denaturing)”指分开核酸双螺旋的两条互补链的所有或部分。

术语“杂交”指将寡核苷酸引物与单链核酸模板的某区域杂交，杂交是在引物仅特异性结合一条模板链上的互补序列，而不结合模板的其它区域的条件下进行的。杂交的特异性可能受到寡核苷酸引物的长度、进行杂交反应的温度、离子强度和pH值的影响。

术语“引物”指单链核酸，其能够结合目标核酸上的单链区域，以便对目标核酸进行聚合酶依赖性复制。

术语“辅助蛋白(accessory protein)”指任何能刺激解旋酶活性的蛋白。例如，大肠杆菌MutL蛋白是辅助蛋白(Yamaguchi et al.J.Biol.Chem.273：9197-9201(1998)；Mechanic et al.，J.Biol.Chem.275：38337-38346(2000))，其可增强UvrD解旋酶的解链活性。在本方法的实施方案中，辅助蛋白与所选的解旋酶一起使用是有利的。在可替代的实施方案中，可以在辅助蛋白不存在的情况下实现解旋酶对核酸的解旋。

术语“辅助因子(cofactor)”指解旋酶解旋活性所需要的小分子试剂。解旋酶辅助因子包括三磷酸核苷(NTP)和三磷酸脱氧核苷(dNTP)和镁(或其他二价阳离子)。例如，ATP(三磷酸腺苷)可以用作UvrD解旋酶的辅助因子，浓度在0.1-100mM范围内，优选在1到10mM范围内(例如3mM)。类似地，dTTP(三磷酸脱氧胸苷)可以用作T7 Gp4B解旋酶的辅助因子，浓度在1-10mM的范围内(例如3mM)。

术语“解旋酶”指任何能够通过酶学方法解旋双链核酸的酶。例如，解旋酶是在所有生物体的所有涉及例如核酸复制、重组、修复、转录、翻译和RNA拼接过程中发现的酶(Kornberg and Baker，DNA Replication，W.H.Freeman and Company(2^nd ed.(1992))，特别是第11章)。在5’到3’方向，或在相反的3’到5’方向沿着DNA或RNA移位的任何解旋酶都可以用于本发明实施方案中。这包括来自原核生物、病毒、古细菌和真核生物或自然发生的酶的重组形式以及具有特定活性的同源物或衍生物。由Kornberg和Baker在他们的书DNA Replication，W.H.Freeman andCompany(2^nd ed.(1992))的第11章中描述的天然发生的DNA解旋酶的例子包括大肠杆菌解旋酶I、II、III、IV；Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4 Gp41解旋酶、T4 Dda解旋酶、T7 Gp4解旋酶、SV40大T抗原、酵母RAD。其他可以用于HDA的解旋酶包括RecQ解旋酶(Harmon andKowalczykowski，J.Biol.Chem.276：232-243(2001))、来自腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)(公开于本发明，实施例XII)和嗜热菌T.thermophilus(Collins and McCarthy，Extremophiles.7：35-41.(2003))的热稳定性UvrD解旋酶、来自栖热水生菌(T.aquaticus)的热稳定性DnaB解旋酶(Kaplan and Steitz，J.Biol.Chem.274：6889-6897(1999))，和来自古细菌和真核生物的MCM解旋酶(Grainge et al.，Nucleic Acids Res.31：4888-4898(2003))。

用于本发明的实施方案的解旋酶的例子也可以在下述网址找到：http：//blocks.fhcrc.org(Get Blocks利用关键词：解旋酶)。该网址列举了49种疱疹解旋酶，224种DnaB解旋酶，250种UvrD-解旋酶和UvrD/Rep解旋酶，276种DEAH_ATP_依赖性解旋酶，147种乳头瘤_E1乳头瘤病毒解旋酶E1蛋白，608种病毒解旋酶1病毒(超家族1)RNA解旋酶和556种DEAD_ATP依赖性解旋酶。通常在5’到3’方向复制的解旋酶的例子是T7 Gp4解旋酶、DnaB解旋酶和Rho解旋酶，而在3’到5’方向复制的解旋酶的例子包括UvrD解旋酶、HCV的PcrA、Rep、NS3 RNA解旋酶。

在本发明的优选实施方案中，解旋酶以“解旋酶制剂”的形式提供。解旋酶制剂指试剂的混合物，其当与DNA聚合酶、核酸模板、四种三磷酸脱氧核苷酸和引物组合时能够实现等温、指数性和特异性的体外核酸扩增。

更特别地，解旋酶制剂包括解旋酶、能量来源如三磷酸核苷酸(NTP)或三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和单链DNA结合蛋白(SSB)。一种或多种其他试剂可以包括在解旋酶制剂中，其中这些试剂选自：一种或多种其他的解旋酶、辅助蛋白、小分子、化学试剂和缓冲液。

当解旋酶制剂中使用热稳定性解旋酶时，单链结合蛋白可以存在也可以不存在。

在此使用的术语“HDA体系”用来描述一组相互作用的元素(interacting elements)，它们可依据在此描述的解旋酶依赖性扩增方法来实施扩增核酸的功能。HDA体系包括解旋酶制剂、聚合酶和可选配的拓扑异构酶。

例如，UvrD HDA体系可以通过混和下述物质来构成：UvrD解旋酶制剂(如大肠杆菌UvrD解旋酶制剂或Tte-UvrD解旋酶制剂)和DNA聚合酶，例如Exo^-Klenow片段、DNA聚合酶大片段、Exo⁺Klenow片段或T7测序酶。

另一例子是T7 HDA体系，其包括T7解旋酶制剂(T7 Gp4B解旋酶、T7 Gp2.5 SSB和dTTP)，和T7测序酶。

另一例子是RecBCD HDA体系，其包括RecBCD制剂(RecBCD解旋酶以及T4gp 32)和T7测序酶。

任何被选择的HDA体系都可以通过替代、增加、削减在下面更详细描述的混和物中的成分来加以优化。

术语“HDA”指解旋酶依赖性扩增(Helicase DependentAmplification)，这是一种利用解旋酶制剂来扩增核酸的体外方法，其中解旋酶制剂用于解开双链核酸以产生用于引物杂交和随后的引物延伸的模板。该过程使用两条寡核苷酸引物，每一引物与包含目标序列的正义链的3’端杂交或与包含反向互补目标序列的反义链的3’端杂交。HDA反应是解旋酶依赖性核酸扩增的通用方法。

“等温扩增”指在单一温度下进行扩增。这不包括扩增起始时的一小段时间(小于15分钟)，其可以在与扩增程序相同的温度下进行，也可以在更高的温度下进行。

解旋酶如何工作

解旋酶利用三磷酸核苷(例如ATP)水解产生的能量来破坏在双螺旋DNA和RNA中将两链维持在一起的氢键(Kornberg and Baker，DNAReplication，W.H.Freeman and Company(2^nd ed.(1992))，特别是第11章)。解旋酶涉及细胞中核酸新陈代谢的各个方面，如DNA复制、DNA修复和重组、转录和RNA加工。在活的生物体中发现大量的解旋酶反映了解旋酶应用的广泛性。

解旋酶分类

已经依据许多不同的特征将解旋酶分类。例如，不同解旋酶的特征是它们的寡聚结构(oligomeric structure)，包括具有单聚体结构或多聚体结构的解旋酶。例如，其中一个解旋酶超家族以六聚体结构为特征，而另外一个超家族由单聚体或二聚体解旋酶组成。

解旋酶的另一特征是存在的保守基序(motif)。所有解旋酶都具有经典的Walker A和B基序，其与ATP结合和Mg²⁺结合相关(在Caruthers andMcKay.Curr.Opin.Struct.Biol.12：123-133(2002)和Sultanas and Wigley.Trends Biochem.Sci.26：47-54(2001)中有综述)。依据解旋酶的特征基序的数量和在基序的保守序列中的差异，解旋酶已经被分为若干超家族(Gorbalenya and Koonin.Curr.Opin.Struct.Biol.3：419-429(1993))。超家族1和2具有7个特征性的解旋酶特征基序，包括来自古细菌、真核生物、原核生物和病毒的解旋酶，这些解旋酶以3’到5’或5’到3’的方向解旋双螺旋DNA或RNA。超家族1解旋酶的例子包括大肠杆菌UvrD解旋酶、腾冲嗜热厌氧菌UvrD解旋酶和RecBCD的B亚基。超家族3具有3个基序，超家族4具有5个基序。超家族4解旋酶的例子包括T7 Gp4解旋酶和DnaB解旋酶。与那些规范的解旋酶有所不同的一个新家族是AAA⁺超家族(ATP酶的延伸家族(extended family)，与各种细胞活性有关)。

第三种分类涉及解旋酶的解旋方向，也就是说，基于解旋酶所结合和在其上移位的链，解旋酶是以5’到3’方向解旋核酸双螺旋(如T7 Gp4解旋酶)还是以3’到5’方向解旋双螺旋(例如UvrD解旋酶)。

第四种分类涉及解旋酶是优选解旋具平末端的核酸双螺旋，还是具有叉或单链尾巴的双螺旋。平末端核酸双螺旋在第一轮的解旋酶依赖性扩增中可能并不是必需的，但其对随后的扩增循环是有利的，因为随着扩增反应的进程，具有平末端的目标片段将占主要部分(dominantspecies)(图3)。这些具有平末端的目标核酸形成模板底物以用于随后的扩增循环(图3)。

为了实现在此描述的HDA，依据任何上述分类来分类的解旋酶都适用于核酸扩增。事实上，实施例II-IX、X、XI和XII显示了具有解旋酶多样性的样品，它们能够依据本发明的方法来应用以实现解旋酶依赖性扩增。

实施例I描述了UvrD解旋酶制剂。UvrD解旋酶具有单链DNA依赖性ATP酶的活性，这导致3’到5’方向的解旋(Matson，J.Biol.Chem.261：10169-10175(1986))，而且该酶参与DNA修复和重组。在体内，UvrD与另一蛋白MutL相互作用。MutL是错配修复途径的主协调子(mastercoordinator)，它能显著地刺激UvrD催化的解旋作用(参见如Yamaguchiet.al.，J.Biol.Chem.273，9197-9201(1998)；Mechanic et al.，J.Bio.Chem.275，38337-38346(2000))。实施例XII和XIII显示，在优化的解旋酶制剂中辅助蛋白不总是必须的，尽管辅助蛋白可以优选地用于某些解旋酶诸如UvrD。通过使用实施例II到V中描述的分析方法，并用凝胶电泳分析HDA产物，可以容易的确定在DHA中特定解旋酶对辅助蛋白的需求。

大肠杆菌UvrD解旋酶是超家族1解旋酶。大肠杆菌UvrD解旋酶能够解旋具有平末端的DNA双螺旋和带有切口的环状DNA分子(Runyonand Lohman，J.Biol.Chem.264：17502-17512(1989))。在低的UvrD浓度下，最佳的解旋是需要3′-单链DNA尾，但在高浓度下，解旋能够在切口或平末端处起始(Runyon，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6383-6387(1990))。

在HDA的另一实例中，T7基因4蛋白被用于解旋酶制剂，来扩增目标核酸。T7基因4蛋白是六聚体复制型解旋酶，其含有引物酶活性和3’到5’解旋酶活性(Lechner and Richardson，J.Biol.Chem.258：11185-11196(1983))。氨基端截短的基因4蛋白——T7基因4B蛋白(T7 Gp4B解旋酶)——只含有DNA解旋酶活性。Bernstein和Richardson(J.Biol.Chem.263：14891-14899(1988))已经描述了T7 Gp4B的克隆与纯化。T7基因2.5蛋白是单链DNA结合蛋白，其刺激T7 DNA聚合酶活性(Kim et al.，J.Biol.Chem.267：15032-15040(1992))。T7 Gp2.5 SSB的制备已经被描述过(Kim et al.，J.Biol.Chem.267：15022-5031(1992))。

在HDA的另一实例中，大肠杆菌RecBCD蛋白用于解旋酶制剂中。大肠杆菌RecBCD是含有一种超家族1解旋酶(RecB)和一种5’到3’解旋酶(RecD)的蛋白复合物，它可用于扩增目标片段。大肠杆菌RecBCD解旋酶是三聚体的多功能酶，其不但是ATP依赖性解旋酶而且是DNA核酸酶(Roman and Kowalczykowski，Biochemistry.28：2863-2873(1989))。RecB亚基具有3’到5’DNA解旋酶活性，也具有外切核酸酶活性。通过定点诱变可以消除外切酶活性，从而形成外切酶缺陷型RecB^D1067ACD，其能解旋双螺旋DNA而不会降解DNA(Wang et al.，J.Biol.Chem.275，507-513(2000))。RecD蛋白也是DNA解旋酶，其具有5’到3’极性(Taylorand Smith，Nature 423，889-893(2003))。通过双极性移位模式(bipolartranslocation model)RecB和RecD解旋酶在完整的RecBCD中都具有活性。这两种DNA解旋酶是互补的，在反向平行的DNA双螺旋的每条链上按相反的极性移动，但移动的方向相同。这种双极行动结构(bipolarmotor organization)可帮助解释其异常高的速度(500-1000bp/秒)和持续的解旋能力(processivity)(＞30kb，对于每次结合)；Dillingham et al.，Nature 423，893-897(2003))。

在HDA的另一实例中，六聚体复制解旋酶，T7 Gp4解旋酶，被用于解旋酶制剂，来扩增长于1kb的目标片段。T7 Gp4解旋酶属于超家族4，超家族4的成员包括若干的六聚体解旋酶诸如DnaB和T4 Gp41，这些解旋酶具有快速的解旋速率和高度的持续解旋能力。这些解旋酶识别位于将被解旋的双螺旋区域的边缘处的单链尾巴。例如，在存在DNA聚合酶时，大肠杆菌DnaB解旋酶以750bp/秒的速度和大于50kb的处理能力解开DNA，T7 gp4解旋酶以300bp/秒的速度和高的持续处理能力解开DNA(Kornberg and Baker，supra(1992))。SV40大T抗原以75到100bp/秒的速率和高的持续处理能力解旋DNA(Kornberg and Baker，supra(1992)；Li et al.，Nature.423：512-518(2003))。

不期望受到理论的约束，尽管某些解旋酶，诸如T7 Gp4，优选具有单链尾的双螺旋DNA，但它们对平末端双螺旋DNA分子仍可能具有低的解旋活性。还可能的是，单链尾巴可能通过双螺旋DNA分子的“末端呼吸(terminal breathing)”而暂时存在于双螺旋DNA的边缘处(Roychoudhury et al.，Nucleic acid Res.6：1323-3123(1979))。这些短时间内出现的单链尾可以被T7解旋酶捕获，然后它便可继续解链过程。

不管什么来源的目标核酸，在核酸的扩增过程中，解旋酶制剂都可以在不改变反应温度的情况下解开双链分子来产生用于聚合酶依赖性扩增的单链分子，从而替代热变性步骤。因此，可以免除在使用Taq聚合酶的标准PCR扩增中所需要的热循环。

一般来说，允许引物-模板的识别和随后的退火特异性地发生的适合的变性温度可以在一个温度范围内，例如在20℃到75℃。优选的变性温度可以依据针对解链过程所选择的解旋酶来进行选择。在存在所选的解旋酶的情况下确定核酸扩增的最佳温度的测试可以通过常规的实验方法来确定，可以通过改变反应混合物的温度和使用凝胶电泳比较扩增产物来确定。

在某些温育条件下可以通过使用热稳定的解旋酶来加速核酸双螺旋的变性，所述温育条件包括较高的温度，例如在45℃到75℃范围内(实施例XII)。在高温下，使用热稳定性解旋酶制剂和热稳定性聚合酶进行HDA可以增加引物结合的特异性，从而改善扩增的特异性。

在某些情况下，在扩增反应中利用多种不同的解旋酶是可取的。在HDA中使用多种解旋酶可以在某些条件下增加目标扩增的产量和长度，其中不同的解旋酶协调各种功能以增加双螺旋核酸解旋的效率。例如，具有低的持续解旋能力但能够解链平末端DNA的解旋酶可以与具有高的持续解旋能力但识别双螺旋区域边缘处的单链尾来起始解旋的第二解旋酶组合(实施例X)。在这个实施例中，第一解旋酶将长核酸双螺旋的平末端分离开，产生5’和3’单链尾，然后由于它有限的持续解旋能力第一解旋酶将从底物上解离下来。这样的部分未解旋的底物继而被第二解旋酶识别，第二解旋酶以出色的持续解旋能力继续这个解旋过程。这样，核酸双螺旋中的长目标可以通过使用包含有多种解旋酶的解旋酶制剂来解旋，然后在HDA反应中扩增。

引物

通常，适合在HDA中使用的引物对是短的合成寡核苷酸，例如具有大于10个核苷酸小于50个核苷酸的长度。寡核苷酸引物设计涉及各种参数，如链比对分值(string-based alignment scores)、解链温度、引物长度和GC含量(Kampke et al.，Bioinformatics 17：214-225(2003))。当设计引物时，一个重要因素是选择目标片段中的序列，其对将被扩增的核酸分子要具有特异性。另一个重要因素是用于HDA反应的引物的解链温度。引物的解链温度由寡核苷酸的长度和GC含量决定。优选地，引物的解链温度应该比杂交和扩增发生时的温度高约10℃到30℃。例如，如果在使用大肠杆菌UvrD解旋酶制剂时杂交和扩增温度设定在37℃，为该反应设计的引物对的解链温度应该在约47℃到67℃范围内。如果杂交和扩增温度设定在60℃，为该反应设计的引物对的解链温度应该在约65℃到90℃范围内。为了针对HDA反应选择最好的引物，可以在平行测试中测试一组具有不同解链温度的引物。更多关于引物设计的信息在Kampke et al.，Bioinformatics 17：214-225(2003)中被描述。

一条引物与目标核酸的一个末端杂交，聚合酶使用目标核苷酸序列作为模板而使引物按3’到5’的方向延伸(图3)。杂交条件为在“MolecularCloning and Laboratory Manual”2^nd ed.Sambrook，Rich and Maniatis，pub.Cold Spring Harbor(2003)中描述的标准条件。为了实现特异性扩增，同源或完全匹配的引物是优选的。然而，引物可以在5’端包括与目标核苷酸序列不互补的序列。可选择地，引物可以包括与目标核酸不精确互补的核苷或整个序列。用于HDA的引物可以表现为同功引物(analogousprimers)，或者可以是非特异性的或通用的引物，只要在预先设定的温度可以通过引物-模板结合获得特异性杂交。

引物可以包括任何脱氧核糖核苷酸碱基A、T、G或C和/或一个或多个核糖核苷酸碱基A、C、U、G和/或一个或多个修饰了的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，其中，所述修饰并不阻碍引物与核酸的杂交或引物的延伸或双链分子的变性。引物可以用化学基团如硫代磷酸或甲基膦酸酯修饰，或用非核苷酸的连接子(linker)修饰，以增强它们的作用或方便扩增产物的表征。

为了检测扩增产物，引物可以被修饰，如进行荧光标记或化学发光标记，以及生物素化(例如，荧光标记诸如胺反应活性荧光素酯(aminereactive fluorescein ester)羰基荧光素-Glen Research，Sterling，Virginia)。其他标记方法包括放射性同位素、生色团和配体诸如生物素或半抗原，其尽管不能直接被检测到，但通过与它们的标记形式的特异性结合伴侣(partner)——分别例如抗生物素蛋白和抗体——反应便可以容易地被检测到。

在此描述的引物可以用本领域已知的方法制备(参见如美国专利6,214,587)。

在实施方案中，一对具有序列特异性的引物——其中一条与目标序列的5’端杂交而另一条与目标的3’端杂交(图3)——被用于HDA以实现目标序列的指数性扩增。该方法能容易地与Lee et al.(J.Mol.Biol.316：19-34(2002))区别开来。多对引物能用于单个反应以同时扩增多个目标，并在该多重反应中使用不同的检测标记。多重反应普遍应用于SNP分析以及病原体检测(Jessing et al.，J.Clin.Microbiol.41：4095-4100(2003))。

聚合酶

依据持续性和链置换活性来选择用于HDA的聚合酶。解链和用引物杂交之后，对核酸进行聚合步骤。如果要扩增的核酸是DNA，选择DNA聚合酶。当起始目标是RNA时，首先使用逆转录酶将RNA目标拷贝成cDNA分子，cDNA然后进一步在HDA中被所选的DNA聚合酶扩增(实施例VII)。在四种dNTP存在的情况下，DNA聚合酶作用在目标核酸上，延伸与核酸模板杂交的引物，形成与核酸模板上的核苷酸序列互补的引物延伸产物(图1和图3)。

DNA聚合酶选自缺少5’到3’外切核酸酶活性的聚合酶，另外，作为选择，它也可以缺少3’到5’外切核酸酶活性。

合适的DNA聚合酶的例子包括大肠杆菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷型Klenow片段(New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA))、外切核酸酶缺陷型T7 DNA聚合酶(测序酶；USB，(Cleveland，OH))、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA))、Bst DNA聚合酶的大片段(New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA))、Klen Taq DNA聚合酶(AB Peptides，(St Louis，MO))、T5 DNA聚合酶(美国专利5,716,819)、Pol III DNA聚合酶(美国专利6,555,349)。具有链置换活性的DNA聚合酶，诸如大肠杆菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷型Klenow片段、Bst DNA聚合酶大片段和测序酶，对于解旋酶依赖性扩增是优选的。T7聚合酶是高保真的聚合酶，错误率在3.5×10⁵，其大大小于Taq聚合酶(Keohavong and Thilly，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，9253-9257(1989))。然而T7聚合酶不是热稳定性的，因此对于需要热循环的扩增系统不是理想的。而在HDA中，由于其可以在等温条件下操作，所以T7聚合酶是用于DNA扩增的优选聚合酶之一。

单链DNA结合蛋白

在存在单链结合蛋白(SSB)时，解旋酶活性会得到改善。在这些情况下，SSB的选择通常不局限于特定的蛋白。单链结合蛋白的例子是T4基因32蛋白、大肠杆菌SSB、T7 gp2.5 SSB、噬菌体phi29 SSB(Kornbergand Baker，supra(1992))以及上述蛋白的截短形式。

其他化学试剂

除了盐和pH，其它化学试剂，诸如变性试剂包括尿素和二甲基亚砜(DMSO)，可以加入到HDA反应中以部分变性双螺旋DNA或使双螺旋DNA不稳定。可以比较在不同变性试剂浓度下、有或无SSB蛋白时的HDA反应。这样，可以鉴定能够增加HDA效率和/或在单链DNA稳定作用中替代SSB蛋白的化学化合物。大多数生物大分子诸如核酸和蛋白都被设计成能够在活细胞中行使其功能和/或形成天然的结构，在活细胞中它们的浓度要比体外实验条件下的浓度高得多。聚乙二醇(PEG)已经被用于创造人造分子聚集条件(artificial molecular crowding condition)，这是通过除去水和创造与聚阳离子溶质的静电相互作用完成的(Miyoshi，et al.，Biochemistry 4：15017-15024(2002))。当PEG(7.5％)加入到DNA连接反应中时，反应时间会减少到5分钟(Quick Ligation Kit，New EnglandBiolabs，Inc.(Beverly，MA))。PEG已经被加到解旋酶解旋测试中以提高反应的效率(Dong，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14456-14461(1996))。HDA中的PEG或分子聚集试剂(molecular crowding reagents)可以增加HDA反应中酶和核酸的有效浓度，从而减少反应时间和反应需要的蛋白浓度。

辅助因子

ATP或TTP对于具有高效处理能力的解旋酶来说是常用的优选能量来源。平均每个ATP分子被DNA解旋酶消耗可解旋1到4个碱基对(Kornberg and Baker，supra(1992))。在本发明的实施方案中，基于UvrD的HDA体系的最佳起始ATP浓度是3mM。为了扩增更长的目标，可能要消耗比短目标更多的ATP。在这样的情况下，将基于丙酮酸激酶的ATP再生体系(pyruvate kinase-based ATP regenerating system)与解旋酶一起使用是可取的(Harmon and Kowalczykowski，Journal of BiologicalChemistry 276：232-243(2001))。

拓扑异构酶

拓扑异构酶可以应用于长HDA反应，以便提高HDA扩增长目标扩增子(amplicons)的能力。当非常长的线性DNA双螺旋被解旋酶分开时，拓扑异构酶的旋转(松弛)功能可除去缠绕和防止过度螺旋化(over-winding)(Kornberg and Baker，supra(1992))。例如，大肠杆菌拓扑异构酶I(Fermentas，Vilnius，Lithuania)可以用于松弛负超螺旋DNA，这是通过在DNA链中引入切口来完成的。相反，大肠杆菌DNA旋转酶(拓扑异构酶II)将瞬时的双链断裂引入DNA中，使得DNA链可彼此穿过(Kornberg and Baker，supra(1992))。

扩增核酸的检测

扩增的核酸产物可以通过各种方法来检测，包括溴化乙啶染色和借助标记来检测扩增序列，所述标记选自放射性同位素、荧光标记和酶。例如，HDA扩增产物可以使用荧光标记的LUX^TM引物(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)来实时检测，LUX^TM引物是在发夹结构中靠近3’端设计有荧光基团的寡核苷酸。这个构象固有地赋予荧光淬灭能力而无需分离的淬灭组分。当引物掺入到双链扩增产物中时，荧光基团被反淬灭(dequenched)，使得荧光信号显著增加。实施例XIV显示了应用荧光标记引物和HDA方法对目标序列的实时检测。

确定可以用于HDA的解旋酶

为了测试解旋酶能否用于HDA反应来扩增目标核酸，HDA反应如下设计：

(a)短双链寡核苷酸(小于100个核苷酸)可被用作扩增底物。制备可与该寡核苷酸的5’端和3’端杂交的引物。在含有引物的第一混合物中双链寡核苷酸变性形成单链，所述混合物是在标准的Tris-醋酸盐缓冲液(10mM，pH7.5)或ThermoPol(New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA))缓冲液中，而且还有变化数量的dNTPs或NTPs。混合物加热到95℃10分钟，53℃1分钟。

(b)制备第二混合物，该第二混合物含有将被测试的一定浓度的解旋酶，它们是在pH在6.0到9.0之间变化的HDA缓冲液中。标准缓冲液中可以含有一定浓度的NaCl和KCl，它们各自的浓度在约0到200mM范围内。解旋酶的浓度也可以变化。单链结合蛋白诸如T4gp 32以在扩增反应中所应用的标准数量与DNA聚合酶和四种dNTPs一起加入，扩增反应还要包括要扩增的核酸和引物。

(c)混和两混合物，在37℃(或在某温度)温育2小时，然后在3％GPG LMP琼脂糖凝胶上分析。

通过在不同条件下如上所述地进行重复反应，可以确定针对特定解旋酶的最佳HDA条件。

然后测试解旋酶扩增质粒DNA、更长的DNA分子的能力以及扩增基因组DNA中短序列的能力，如大肠杆菌UvrD解旋酶的实施例中描述的。

解旋酶依赖性扩增在此被证明是一种改进的核酸扩增方法，具有广泛应用。这些应用包括逆转录之后的扩增和使用实时HDA的定量扩增。下面的例子显示了，HDA方法对于扩增具有广泛范围的各种大小的核酸是如何的灵敏和有效。HDA反应的灵敏性的一个量度是其可扩增核酸序列至10倍到超过10亿倍的能力。

表1包含了某些样品的评估，尽管这些不是限制性的。

表1：扩增率

底物	起始数量	终数量	扩增倍数
底物	起始数量	终数量	扩增倍数	寡核苷酸	5ng	500ng	100
质粒	2700bp，25ng	100bp，500ng	5000	寡核苷酸	5ng	500ng	100
质粒	2700bp，25ng	100bp，500ng	5000	基因组DNA	3Mb，100ng	100bp，300ng	1×10⁵
基因组DNA	3Mb，0.1ng	100bp，300ng	1×10⁵	基因组DNA	3Mb，100ng	100bp，300ng	1×10⁵

扩增条件——温度

尽管其它的等温核酸扩增方法，诸如链置换扩增，在恒定温度下无需热循环就能扩增目标，但它们的确需要起始的变性步骤，以产生单链模板。本方法实施方案的优点是解旋酶解旋和扩增能有效地始终在单一温度下进行，如实施例IX中描述。可选择的，提高温度有助于解旋酶在刚开始时解开目标核酸，然后可在单一温度下扩增。

我们已经说明，HDA能替代PCR用于扩增RNA的逆转录产物(实施例VII)。此外，HDA有望用于定量扩增，例如它被发现可用于基因表达研究和环境分析。相应地，当需要确定目标核酸的数量时，可以以实时终点分析(real time end point assay)的方式利用HDA。相应地，HDA可以用于确定基因表达研究中细胞内信使RNA的相对数量。例如，描述于WO 0125473的校准基因表达谱型(calibrated gene expression profiles)能应用定量解旋酶依赖性扩增或Q-HDA来产生。

实时HDA可以用作灵敏性技术，来确定污染样品中的生物体数量，如海水中的大肠杆菌。在HDA反应中使用灵敏性标记如荧光的实时检测已经在实施例XIV中被示范。

HDA可以按紧凑型仪器(compact device)的方向发展，这样便可用于野外活动和/或实验室诊断。例如，HDA可以用于微流体环境。作为可节省成本和时间的重要策略，微流体技术(芯片上的实验室)正迅速涌现，其是在通常为纳升级别的小型化环境中进行生物化学分析。当与核酸扩增和检测方法结合时，微流体技术具有巨大的潜力作为野外便携式设备而用于病原体检测。HDA能在等温条件下扩增核酸，无需开始时的热变性，这使得HDA极有可能用于微流体设备中的核酸扩增程序。类似地，HDA可以在试剂盒中或在实验室扩增程序中得到应用，从而产生描述于国际公开WO 0202740的那类应答图谱(response profiles)或用于监测疾病(美国公开2001018182)。

实施例II-XIV证明了，HDA对于扩增不同来源的和具有不同序列的目标核酸是有效的。实施例IV描述了使用HDA扩增来自DNA质粒的不同长度的目标序列。实施例X证明了，更长的目标序列(＞2kb)能被基于T7 Gp4B的HDA体系扩增。实施例X进一步证明了，对于使用解旋酶依赖性扩增来扩增核酸的方法，可以使用不同的解旋酶制剂来进行，不同的解旋酶制剂例如包含T7 Gp4B解旋酶的解旋酶制剂，或包含一种以上的解旋酶，如T7 Gp4B解旋酶和UvrD解旋酶的解旋酶制剂。

实施例VIII证明，利用HDA能成功地扩增只有10个拷贝的细菌基因组DNA，这就支持HDA能应用于由病原细菌如沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)和淋病奈瑟球菌引起的传染病的分子诊断。实施例VI证明，来自人基因组DNA样品的目标序列能被扩增，这就支持HDA应用于鉴定对应于特定疾病的遗传等位基因，包括单个核苷酸多态性，以及应用于法医鉴定，其依赖于对案发现场或考古地点的少量核酸的表征。

提供下述实施例以帮助理解本发明，但不是对本发明的限制。

在上面和下面引用的参考文献并入本文，以作参考。

实施例I

克隆和纯化UVRD解旋酶及其辅助蛋白MUTL

1.克隆编码UvrD解旋酶和MutL蛋白的基因。

利用Impact^TM系统克隆编码大肠杆菌解旋酶II或UvrD解旋酶(Swissprot Accession No.：P03018)和它的辅助蛋白大肠杆菌MutL蛋白(Swissprot Accession No.：P23367)的基因，Impact^TM系统可导致双功能标记物的C-端翻译融合，所述双功能标记物由酿酒酵母(S.cerevisiae)VMA内含肽和几丁质结合结构域(New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA))组成。这种蛋白纯化体系利用蛋白剪接元件(protein splicingelement)(称为内含肽)的DTT诱导性自切割活性来将目标蛋白从亲和标记(几丁质结合结构域)上分离出来。Vent DNA聚合酶被用来扩增来自大肠杆菌K12基因组DNA的UvrD基因，其中使用引物5A(5′GGTGGTACCATGGACGTTTCTTACCTGCTC 3′(SEQ ID NO：1))和引物3A(5′GGTGGTGCTCTTCCGCACACCGACTCCAGCCGGGC 3′(SEQ ID NO：2))。用引物5B(5′GGTGGTCATATGCCAATTCAGGTCTTACCG 3′(SEQ ID NO：3))和引物3B(5′GGTGGTTGCTCTTCCGCACTCATCTTTCAGGGCTTTTATC3′(SEQ ID NO：4))扩增来自大肠杆菌K12基因组DNA的mutL基因。大肠杆菌K-12取自New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)。基因组DNA用Qiagen基因组DNA试剂盒(Qiagen，Hilden(Germany))分离。所述引物包含限制性酶位点，这允许mutL基因克隆到pTYB1(New EnglandBiolabs，Inc.，(Beverly，MA))的NdeI和SapI位点以及将uvrD基因克隆到pTYB3(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))的NcoI和SapI位点。将连接产物转化到ER2502细胞。通过在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上进行选择性生长、菌落PCR和插入片段测序，可以筛选阳性克隆。分析测序结果后，将正确的构建物转化到大肠杆菌ER2566细胞。含有pTYB1-MutL或者pTYB3-UvrD的ER2566细胞，在37℃在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中从生长。当OD₅₅₀达到～0.5时，用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。15℃，过夜培养后，离心收获细胞。

2.UvrD和MutL纯化

内含肽标记的几丁质结合结构域(CBD)允许在几丁质珠柱(chitinbead column)(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))上亲和纯化融合蛋白。所有程序在4℃进行。将来自6升培养物的表达UvrD的细胞重新悬浮于210ml超声缓冲液(20mM Tris pH7.8、0.1mM EDTA、50mMNaCl、20μM PMSF、5％甘油)，并用超声破碎。将澄清的提取物装载于45ml几丁质珠柱，用500ml的缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH8)、1mMEDTA)加上500mM NaCl预平衡。柱用500ml的缓冲液A加上1M NaCl以及500ml的缓冲液A加上500mM NaCl洗涤。通过用三倍柱体积(135ml)的切割缓冲液(缓冲液A+500mM NaCl+50mM二硫苏糖醇(DTT))冲洗柱来诱导自切割。切割反应在4℃切割缓冲液中进行64小时。蛋白用67ml的缓冲液B(20mM Tris-HCl(pH8)、1mM EDTA、1mM DTT)加上50mM NaCl洗脱。收集阳性级分，并装载于已经用缓冲液B加上50mM NaCl预平衡的1ml MonoQ柱(Pharmacia(Piscataway，NJ))。穿流(flow-through)和洗脱级分(eluted fractions)用SDS-PAGE分析。通过测定解旋酶从部分双螺旋中置换荧光标记寡核苷酸(30个核苷酸，(nt))的能力，进一步测试阳性级分的解旋酶活性，所述的部分双螺旋是通过将30nt的寡核苷酸和互补的非标记的70nt寡核苷酸退火制备而得。被置换的30nt标记寡核苷酸被其他非标记的30nt互补寡核苷酸捕获。在20％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离寡核苷酸，被置换的寡核苷酸在紫外光下观察。在穿流和洗涤(wash fractions)级分发现UvrD蛋白和解旋酶活性。混和这些级分，然后装载于1ml肝素TSK柱(Pharmacia(Piscataway，NJ))。UvrD没有结合到该柱上。1ml羟基磷灰石柱(TosoHaas(Philadelphia，PA))保留住了UvrD，其在线性梯度(50mM-1MNaCl)中约340mM NaCl时被洗脱出。收集纯化的级分，用储存缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.2)、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、15mM 2-巯基乙醇、50％甘油)透析过夜。使用Bradford蛋白测定法(Bradford，Anal.Biochem.72：248-254(1976))和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定最终浓度。

用类似于UvrD的方法纯化MutL。使用6升的ER2566/pTYB1-MutL培育物。所有程序在4℃进行。几丁质珠柱纯化条件类似于UvrD，除了柱体积为14ml。柱用125ml的缓冲液A加上1M NaCl以及125ml的缓冲液A加上500mM NaCl洗涤。通过用45ml切割缓冲液(缓冲液A+500mM NaCl+50mM DTT)冲洗柱，诱导自切割。自切割反应在4℃，于切割缓冲液中进行40小时。蛋白质用36ml的缓冲液B+50mM NaCl洗脱。收集阳性级分，并装载于MonoQ柱。在柱的穿流级分发现MutL。因此收集穿流和洗涤级分，透析，其中使用缓冲液B+40mM NaCl，最终的NaCl浓度为50mM。将样品装载于1ml肝素TSK柱。MutL被保留住，在565mM NaCl处洗脱。然而，在SDS-PAGE上能检测到其他蛋白带，而且外切酶分析显示，外切核酸酶活性存在于感兴趣的级分。收集这些级分，用缓冲液B+50mM NaCl透析。再次使用1ml MonoQ柱以将MutL从杂质蛋白中分离出来。用220mM NaCl洗脱MutL。收集纯化的级分，用Centriplus YM 10(Millipore，(Bedford MA))浓缩，然后用储存缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM NaCl、1mM 2-巯基乙醇、0.1mMEDTA、50％甘油)透析过夜。使用Bradford蛋白测定法和聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)测定最终浓度。

3.其他克隆和纯化系统

除了Impact^TM，解旋酶和它们的辅助蛋白可以使用若干可选择的方法纯化，诸如直接克隆(将基因克隆到质粒而无需额外标记)、His-Tag(Novagen，Inc.(Madison，WI))和pMAL^TM蛋白融合&纯化系统(NewEngland Biolabs，Inc.(Beverly，MA))。大肠杆菌UvrD解旋酶被克隆到质粒pET15b(Novagen，Inc.(Madison，WI))和pMAL-c2X(New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA))。带有His标记的融合物，UvrD-His，使用His.Bind柱和制造商(Novagen，Inc.(Madison，WI))提供的程序纯化。UvrD-His蛋白进一步用羟基磷灰石柱纯化。MBP-UvrD融合蛋白用直链淀粉柱和制造商(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))提供的程序纯化。UvrD-His蛋白和MBP-UvrD融合蛋白显示出有功能的解旋活性，可以用于解旋酶依赖性扩增反应。

实施例II

核酸双螺旋目标的扩增方法

作为解旋酶依赖性扩增的模型体系，合成的DNA双螺旋被用作HDA反应的模板。本实施例阐释了应用UvrD HDA体系的DNA双螺旋扩增。模板变性、引物退火和延伸的方法描述如下。

通过混和下列物质制备35μl的反应组分A：10μl的5×HDA缓冲液A(175mM Tris-HCI(pH7.5)、5mM DTT)、0.5μl 70bp的源自上端寡脱氧核苷酸(2μM：5′TGGCTGGTCACCAGAGGGTGGCGCGGACCGAGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGTAGAGCAGGCAGC 3′(SEQ IDNO：5))和底端寡脱氧核苷酸(2μM：5′GCTGCCTGCTCTACCCCTCTCCGCAGCCGCCGAGCGCACTCGGTCCGCGCCACCCTCTGGTGACCAGCCA 3′(SEQ ID N0：6))的DNA模板、1μl的5′引物(10μM；5′CATGTTAGGTTCTATGGATCGAGTCTGGCTGGTCACCAGAGGG 3′(SEQID NO：7))、1μl的3′引物(10μM；5′TCCCTTAGAGGTCACATTGGATCGAGTCGCTGCCTGCTCTACCCC 3′(SEQ ID NO：8))、10μl的四种dNTPs(各自2mM)、1.5μl的ATP(100mM)以及11μl的dH₂O。

将反应组分A在95℃加热2分钟以变性模板，53℃处理3分钟以退火引物，37℃保持2分钟，再加入0.5μl的MutL蛋白(800ng/μl)。

通过混和下述物质制备15μl的反应组分B：10μl的5×HDA缓冲液B(5mM Tris-HCl(pH7.9)、25mM NaCl、55mM MgCl₂、0.5mg/ml BSA、0.5mM DTT)、0.5μl的大肠杆菌DNA聚合酶I exo-Klenow片段(5单位/μl)、0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)、0.9μl的T4基因32蛋白(gp32；5μg/μl)和3.1μl的dH₂O。在加入MutL之后，将组分B加入到组分A中。exo-Klenow片段购自(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))，T4基因32蛋白也可以从市场上购得(Roche Applied Science，(Indianapolis，IN))。反应在37℃继续30分钟，然后通过加入12.5μl终止缓冲液(1％SDS、0.05M EDTA、30％甘油、0.2％溴酚蓝)终止反应。在置于Tris-硼酸EDTA(TBE)缓冲液和溴化乙啶中的3％基因组分析级(Genomic PerformanceGrade，GPG)低熔点(LMP)琼脂糖凝胶(American Bioanalytical(Natick，MA))上分析反应产物(图2B)。观察到约120bp的DNA片段(图2B)，其与预测的123bp的产物大小相匹配(图2A)。

实施例III

来自质粒DNA的特异性序列的HDA扩增

为了测试HDA是否能用于扩增DNA模板中的特异目标序列，我们应用UvrD HDA体系，使用两条pUC19/M13通用引物——引物1224和引物1233——来扩增2647bp的DNA质粒pAH1(图15(SEQ ID NO：9))中的110bp序列。引物1224和引物1233可以商购得到，它们的序列可以从公司(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))获得。扩增方案在图3中描述。

预制两种醋酸盐反应缓冲液：10×HDA缓冲液A，含有350mM Tris-醋酸盐(pH7.5)和100mM DTT；10×HDA缓冲液B，含有10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)、1mg/ml BSA和90mM醋酸镁。通过组合下列物质制备HDA反应组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

1.5μl的23nM AhdI切割的pAH1质粒

1μl的10μM引物1224

1μl的10μM引物1233

2μl的dNTPs(10mM)

1.5μl的ATP(100mM)

8μl的dH₂O

反应组分A在95℃加热2分钟以变性模板，69℃处理3分钟退火引物，37℃持续2分钟，再加入组分B。

通过混和下列物质制备15μl的反应组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

1μl的exo^-Klenow片段(5单位/μl)

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

1μl的MutL蛋白(400ng/μl)

0.9μl的T4gp32(5μl/μl)

21.6μl的dH₂O

然后将组分B加入到组分A中。反应继续在37℃再进行一小时，然后通过加入12.5μl终止缓冲液(1％SDS、0.05M EDTA、30％甘油、0.2％溴酚蓝)终止反应。在含有溴化乙啶的2％GPG LMP凝胶上分析反应产物(图4)。

在2％琼脂糖凝胶上观察到110bp扩增产物。该产物大小与目标序列的预测长度相匹配(图4，泳道1)。在UvrD解旋酶不存在的情况下，没有观察到扩增，这证明解旋酶对扩增是必须的。此外，该结果说明，UvrD在存在MutL和T4Gp32 SSB时扩增目标DNA的效率会提升。

实施例IV

来自DNA质粒的各种目标序列的扩增方法

为了测试基于UvrD的HDA体系能否扩增各种目标序列，使用在引物1224和引物1233之间包含有不同序列和大小的插入片段的pAH1衍生的质粒进行若干平行反应。

使用两种反应组分A和B，配置50μl的HDA反应，组分A和B描述如下，按照次序混和。预先制备两种醋酸盐反应缓冲液：10×HDA缓冲液A，含有350mM Tris-醋酸盐(pH7.5)和100mM DTT；10×HDA缓冲液B，含有10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)、1mg/ml BSA和100mM醋酸镁。

通过组合下列物质制备35μl的组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

1μl的pAH1质粒或pAH1衍生物(50ng/μl)

1μl的10μM引物1224

1μl的10μM引物1233

10μl的dNTPs(2mM)

1.5μl的ATP(100mM)

15.5μl的dH₂O

通过混和下列物质制备15μl的组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

1μl的exo^-Klenow片段(5单位/μl)

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.5μl的MutL(800ng/μl)

0.9μl的T4gp32(5μg/μl)

7.1μl的dH₂O

在HDA反应刚开始时，首先将组分A在95℃加热2分钟以变性模板。然后在69℃温育组分A达3分钟以退火引物，再在37℃温育2分钟以冷却反应。变性、退火和冷却步骤后，将15μl新鲜制备的组分B加入到35μl的组分A中。反应在37℃下再继续进行1小时，然后通过加入12.5μl终止缓冲液(1％SDS、0.05M EDTA、30％甘油、0.2％溴酚蓝)终止反应。扩增产物在TBE缓冲液和溴化乙啶中的3％GPG LMP琼脂糖凝胶上显现(图4)。所有扩增产物都与预测的目标大小相符合(图4，泳道1-5)。而且，基于UvrD的HDA体系能在HDA反应中扩增长达650bp的目标DNA(图4，泳道5)。

实施例V

来自细菌基因组DNA的特异性序列的HDA扩增

HDA也能用来扩增来自更加复杂的核酸样品的特异性目标序列，诸如病毒基因组DNA或RNA、细菌基因组DNA或人基因组DNA。在本实施例中，我们公开了使用基于大肠杆菌UvrD的HDA体系扩增和检测来自细菌基因组的特定目标序列的方法，其中所用细菌为口腔病原体，龋垢密螺旋体，ATCC No.35405。选择一个限制性内切酶基因earIR作为目标基因(图16(SEQ ID NO：10))，设计一条5′引物和两条3′引物来杂交earIR基因的序列。对反应缓冲液和程序进行修饰以便于基因组DNA扩增。10×HDA缓冲液A含有350mM Tris-醋酸盐(pH7.5)和100mM DTT。10×HDA缓冲液B含有10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)、1mg/ml BSA和100mM醋酸镁。

通过混和下列物质制备20μl的组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

2μl的龋垢密螺旋体基因组DNA(50ng/μl)

2μl的10μM引物58861(5′CCAAATGATGCTTATGTTGCTT 3′(SEQID NO：11))

2μl的10μM引物58862(5′CATAAGCCTCTCTTGGATCT 3′(SEQ IDNO：12))或

2μl的10μM引物58863(5′TCCACATCTTTCACATTTCCAT 3′(SEQID NO：13))

2μl的dNTPs(10mM)

7μl的dH₂O

通过混和下列物质制备30μl的组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

4μl的100mM ATP

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.5μl的MutL(800ng/μl)

0.9μl的T4gp32(5μg/μl)

1μl的exo-Klenow片段(5单位/μl)

18.1μl的dH₂O

将反应组分A在95℃加热10分钟，在53℃1分钟，在37℃2分钟。冷却到37℃后，将新鲜制备的组分B加入到组分A中。反应在37℃再继续进行2小时，然后通过加入12.5μl终止缓冲液终止反应。在3％GPGLMP琼脂糖凝胶上分析反应产物(图5A)。目标DNA在引物58861和引物58862之间的预测大小为97bp(图5A，泳道1)，在引物58861和引物58863之间的预测长度是129bp(图5A，泳道2)。在琼脂糖凝胶上观察到两产物，都与目标DNA的预测尺寸相符。对扩增产物进行测序，测序结果证实了都与目标DNA的序列相符。

为了测试UvrD解旋酶制剂能否与不同的DNA聚合酶一起作用，使用UvrD解旋酶制剂和T7测序酶(USB，(Cleveland，Ohio))进行HDA反应，扩增来自龋垢密螺旋体基因组的129bp的目标序列。

通过混和下列物质制备组分A(20μl)：

5μl的10×HDA缓冲液A

2μl的龋垢密螺旋体基因组DNA(50ng/μl)

2μl的10μM引物58861(5′CCAAATGATGCTTATGTTGCTT 3′(SEQID NO：11))

2μl的10μM引物58863(5′TCCACATCTTTCACATTTCCAT 3′(SEQID NO：13))

2μl的dNTPs(10mM)

7μl的dH₂O

通过混和下列物质制备30μl的组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

4μl的100mM ATP

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.5μl的MutL(800ng/μl)

0.9μl的T4gp32(5μg/μl)

1μl的T7测序酶(1.5单位/μl，或3.5单位/μl)

18.1μl的dH₂O

HDA反应按与上述程序相同的程序进行。反应产物在3％GPG LMP琼脂糖凝胶上分析(图5B)。在琼脂糖凝胶上观察到约130bp的扩增产物，其与129bp的目标序列预测尺寸相符(图5B，泳道1和2)。

实施例VI

HDA扩增来自人基因组DNA样品的目标序列

在本实施例中，我们公开了应用基于大肠杆菌UvrD的HDA体系来扩增人基因组DNA样品中的目标序列的方法。由乳癌细胞系制备的人基因组DNA购自ATCC No.45537。合成两条对人DNA甲基转移酶基因(dnmt1)具有特异性的引物。在反应中，测试了不同数量的起始人基因组DNA，使用不同浓度的基因组DNA：50、75、100ng/μl。

通过组合下列物质制备20μl的组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

2μl的人基因组DNA(50到100ng/l)

2μl的10μM引物-dnmt5(5′GGAAGCTGCTAAGGACTAGTT 3′(SEQID NO：14))

2μl的10μM引物-dnmt3(5′CCATGTACCACACATGTGAAC 3′(SEQID NO：15))

2μl的dNTPs(10mM)

7μl的dH₂O

通过混和下列物质制备30μl的组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

3μl 100mM ATP

1μl的exo^-Klenow片段(5单位/μl)

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.5μl的MutL(800ng/μl)

0.9μl的T4 gp32(5μg/μl)

19.1μl的dH₂O

将反应组分A在95℃加热10分钟53℃1分钟，37℃2分钟。组分A冷却到37℃后，将组分B加到组分A中。反应在37℃再继续进行2小时，然后通过加入12.5μl终止缓冲液终止反应。反应产物在3％GPGLMP琼脂糖凝胶上分析(图6)。通过溴化乙啶染色，可检测到约124bp的条带，其大小与最初dnmt1基因中的目标的长度相一致。

实施例VII

来自RNA样品的目标序列的HDA扩增

在本实施例，我们公开了扩增来自RNA样品的目标序列的方法。鼠总RNA用作核酸底物，并先用New England Biolabs(Beverly，MA)的ProtoScript试剂盒转化为单链cDNA产物：

通过混和下列物质配制反应：

2μl的鼠总RNA(0.5μg/μl)

2μl的引物dT23VN(50μM，New England Biolabs(Beverly，MA))

4μl的dNTP(2.5mM)

8μl的H₂O

在70℃温育5分钟，然后保持在冰上。

之后，将下列试剂加入到反应管中：

2μl的10×RT缓冲液(New England Biolabs(Beverly，MA))

1μl的RNase抑制剂(10u/μl)

1μl的M-MulV逆转录酶(25u/μl)

RT反应在42℃温育1小时，然后95℃ 5分钟。将2μl的单链cDNA产物加到HDA中的组分A，通过混合下列物质来起始：

5μl的10×HDA缓冲液A

2μl的第一链cDNA产物

1μl的10μM引物-sfo(5′ACCGCATCGAATGCATGTGGATCTCACCACCAACTGCTTAGC 3′(SEQ ID NO：16))

1μl的10μM引物-sre(5′CGATTCCGCTCCAGACTTGGATCTGATGGCATGGACTGTGGT 3′(SEQ ID NO：17))

2μl的dNTPs(10mM)

9μl的dH₂O

通过混和下列物质制备30μl的反应组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

2μl的100mM ATP

1μl的exo^-Klenow片段(5单位/μl)

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.5μl的MutL(800ng/μl)

0.9μl的T4 gp32(5μg/μl)

20.1μl的dH₂O

将反应组分A在95℃加热2分钟，53℃1分钟，37℃2分钟。组分A冷却到37℃后，将新鲜制备的组分B加入到组分A中。反应在37℃继续进行2小时，然后通过加入12.5μl终止缓冲液终止反应。在3％GPGLMP凝胶上分析扩增产物(图7)。在琼脂糖凝胶上观察到130bp的带，与预测的136bp的大小相符。从琼脂糖凝胶上纯化得到扩增产物，并测序。扩增产物的序列与鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的起始目标的序列相符，证明扩增是序列特异性的。

实施例VIII

HDA能从低至10个拷贝的细菌基因组DNA中扩增和检测目标序列

为了确定HDA的扩增能力，我们用各种数量的龋垢密螺旋体基因组DNA进行HDA反应。每个反应如实施例V中详细描述的进行，除了基因组DNA的数量不同。第一个管含有100ng的龋垢密螺旋体基因组DNA，相当于约10⁷个拷贝的龋垢密螺旋体基因组，进行10倍的连续稀释，直到得到10个拷贝的龋垢密螺旋体基因组。

使用实施例V中的引物58861和引物58862进行基于UvrD的HDA反应。在3％GPG LMP琼脂糖凝胶上分析反应产物(图8)。大体上，97bp的HDA产物的亮度随着初始拷贝数的减少而减弱(图8)。没有加入目标而进行的反应在图8中显示有极其微弱的带，可能是由于试剂污染的缘故。将试剂中目标DNA污染控制在10个分子内是非常困难的。然而，即使对于大约10个拷贝的初始目标序列，亮度依然明显高于背景，这说明HDA能够扩增单拷贝的目标序列。对于10个拷贝的初始目标序列，HDA能够产生大约10ng的产物，其相当于97bp片段的1010个分子。因此，公开于此的HDA方法能够实现超过10亿倍的扩增。

实施例IX

利用HDA对细菌基因组中的目标序列进行无需热变性的扩增

绝大多数的等温的目标扩增方法都是以热变性步骤起始，以便序列特异性引物能与目标序列退火。免除热变性步骤能简化扩增程序。相应地，基于UvrD的HDA反应在37℃进行，而无需最初的变性/退火步骤。通过在一个管中混和下列物质配制HDA反应的组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

2μl的龋垢密螺旋体基因组DNA(50ng/μl)

2μl的10μM引物-58861(5′CCAAATGATGCTTATGTTGCTT 3′(SEQID NO：11))

2μl的10μM引物-58862(5′CATAAGCCTCTCTTGGATCT 3′(SEQ IDNO：12))

2μl的dNTPs(10mM)

5μl的10×HDA缓冲液B

3μl的100mM ATP

0.9μl的exo^-Klenow片段(5单位/μl)

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.5μl的MutL(800ng/μl)

0.9μl的T4 gp32(5μg/μl)

26.2μl的dH₂O

然后将该50μl的反应液在37℃温育2小时。然后通过加入12.5μl的终止缓冲液终止反应。在3％GPG LMP琼脂糖凝胶上分析扩增产物(图9)。扩增产物的大小与目标DNA的预测大小(97bp)相符。

实施例X

应用复制型解旋酶(T7基因4解旋酶)扩增长目标序列的方法为了测试六聚体复制解旋酶例如T7 Gp4B解旋酶能否用于扩增更长的目标序列以及测试不同的HDA体系是否能用于进行HDA反应，使用T7 Gp4B解旋酶制剂和T7测序酶(USB，(Cleveland，Ohio))来扩增2.3kb的目标序列。该目标序列是大肠杆菌Rep基因(GenBank号：U00096)，其被克隆到质粒pCR2.1(Invitrogen Corporation)，所获得的重组子命名为pCR-Rep。引物1224和引物1233位于插入位点两侧，被用于扩增所述的2.3kb的目标。使用两个反应组分A和B来配制50μl的HDA反应，组分A和B描述于下，按次序混和。预制两种醋酸盐反应缓冲液：10×HDA缓冲液A含有350mM Tris-醋酸盐(pH7.5)和100mM DTT；10×HDA缓冲液B含有10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)、1mg/ml BSA和100mM醋酸镁。配制3个平行管，通过在每个管中混和下列物质，使每个管含有20μl的反应组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

1μl的质粒pCR-Rep(50ng/μl)

1μl的10μM引物1224

1μl的10μM引物1233

3μl的dNTPs(10mM)

9μl的dH₂O

配制3个平行管，通过在每个管中混和下列物质，使每个管含有30μl的反应组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

9.3μl的解旋酶制剂^*

1μl的T7测序酶(1u/μl，USB Corporation)

14.7μl的dH₂O

*三种不同的解旋酶制剂被用于HDA反应。第一种是T7解旋酶制剂，其含有4.5μl的T7 Gp4B解旋酶(70ng/μl)、1.3μl的T7 Gp2.5 SSB(5μg/μl)、1.5μl的100mM dTTP和2μl的H₂O(图5，泳道1)。第二种解旋酶制剂包含两种解旋酶，它含有4.5μl的T7 Gp4B解旋酶(70ng/μl)、0.5μl大肠杆菌UvrD解旋酶(200ng/μl)、0.5μl的MutL(800ng/μl)、1.3μl的T7 Gp2.5SSB(5μg/μl)、1.5μl的100mM dTTP和1μl的100mM ATP(图5，泳道2)。第三种是阴性对照，其含有1.3μl的T7 Gp2.5 SSB(5μg/μl)、1.5μl的100mM dTTP和6.5μl的H₂O(图5，泳道3)。

HDA反应首先将含有相同的20μl组分A的三个管在95℃加热2分钟以变性模板，然后37℃1分钟以杂交引物。然后将新鲜制备的三种组分B——其中每种含有不同的解旋酶制剂——加入到各个组分A混合物中。在37℃，反应再继续进行2小时，然后通过加入12.5μl的终止缓冲液(1％SDS、0.05M EDTA、30％甘油、0.2％溴酚蓝)终止反应。在置于TBE缓冲液和溴化乙啶中的1％琼脂糖凝胶(图10)上显示扩增产物。在存在T7 Gp4B解旋酶制剂时，观察到约2.3kb的扩增产物，其与预测的目标大小相符(图10，泳道1)。在存在包含有T7 Gp4B解旋酶和大肠杆菌UvrD解旋酶的解旋酶制剂时，观察到类似的2.3kb扩增产物(图10，泳道2)。此外，在阴性对照中，没有观察到扩增产物，阴性对照中不存在解旋酶制剂(图10，泳道3)。随后，对泳道1和泳道2中的扩增产物进行测序，序列分析结果证实产物来自Rep基因。

实施例XI

使用RecBCD扩增DNA片段的方法

核酸酶缺陷型突变体RecB^D1067ACD(Wang et al.，J.Biol.Chem.275：507-513(2000))被应用于HDA反应来扩增400bp的DNA片段。该平末端dsDNA模板通过PCR反应产生，其中使用pUC19衍生物(New EnglandBiolabs，Inc.(Beverly，MA))，它在引物1224和引物1233之间含有400bp的插入片段。RecB^D1067ACD蛋白的克隆和纯化先前已被描述(Wang et al.，J.Biol.Chem.275：507-513(2000))。通过在一个管中混和下列物质配制50μl的反应：

5μl的10×HDA缓冲液(360mM Tris-醋酸盐(pH7.5)、250mM KOAC、100mM DTT、1mg/ml BSA和50mM醋酸镁)

1μl的400-bp模板(2ng/μl)

1.5μl的10μM引物1224

1.5μl的10μM引物1233

2μl的dNTPs(10mM)

2μl的100mM ATP

1μl的Sequenase Version 2.0(1.3单位/μl)

0.5μl的RecB^D1067ACD解旋酶(130ng/μl)

1.3μl的T4 gp32(3.8μl/μl)

26.2μl的dH₂O

将该50μl反应在37℃温育1小时，然后通过加入12.5μl终止缓冲液终止反应。在1％琼脂糖凝胶上分析扩增产物(图11，泳道2)。扩增产物的大小与目标DNA的预测大小(400bp)相符。无RecB^D1067ACD解旋酶的对照反应没有得到产物(图11，泳道3)。

实施例XII

特异性序列的热稳定性解旋酶依赖性扩增方法

在高温下使用热稳定性解旋酶和热稳定性聚合酶进行HDA反应，可以增加引物结合的特异性和改善扩增的特异性。在本实施例中，我们公开了使用基于Tte-UvrD热稳定性解旋酶依赖性扩增或t-HDA体系来扩增和检测来自口腔病原体龋垢密螺旋体ATCC No.35405细菌基因组的特异性目标序列的方法。

1.获得热稳定性解旋酶

热稳定性UvrD样解旋酶，Tte-UvrD，从已被完全测序的热稳定性细菌腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)克隆纯化而得(Bao，et al.，Genome Res.12：689-700(2000))。编码Tte-UvrD解旋酶的腾冲嗜热厌氧菌UvrD基因的核酸序列位于腾冲嗜热厌氧菌基因组的位点605,527和607,668之间，该序列能在GenBank中找到(Accession No.：NC_003869；Bao，et al.，Genome Res.12：689-700(2000))。使用腾冲嗜热厌氧菌基因组DNA(100ng)加上引物TUF(5′-ATACATATGATTGGAGTGAAAAAGATGAA-3′(SEQ ID NO：18))和引物TUR(5′-AAATAAGCTCTTCAGCAAGAAATTGCCTTAATAGGAG-3′(SEQ ID NO：19))通过PCR来扩增Tte-UvrD基因。所述引物包含限制性酶切位点，这使得Tte-UvrD基因可以被克隆到pTYBI(New EnglandBiolabs，Inc.，(Beverly，MA))的NdeI和SapI位点。PCR产物用NdeI和SapI消化，然后与消化的pTYBI连接。连接产物转化到ER2502细胞中。通过在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上选择性生长、菌落PCR和插入片段测序筛选出阳性克隆。分析测序结果后，将正确的构建物转化到大肠杆菌ER2566细胞。含有pTYB1-Tte-UvrD的ER2566细胞，在37℃培养于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。当OD₅₅₀达到～0.65时，用0.4mM IPTG诱导蛋白表达。15℃过夜培养后，离心收获细胞。

内含肽标记的几丁质结合结构域(CBD)允许在几丁质珠柱上进行融合蛋白的亲和纯化(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))。首先用几丁质柱纯化Tte-UvrD解旋酶，程序在实施例I(UvrD和MutL纯化)中详细描述。然后，用1ml肝素TSK柱(Pharmacia(Piscataway，NJ))进一步纯化Tte-UvrD。含有Tte-UvrD的级分用SDS-PAGE分析。收集纯化的级分，用保存缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8.2)、200mM NaCl、1mMEDTA、1mM EGTA、15mM 2-巯基乙醇、50％甘油)透析过夜。使用Bradford蛋白定量法(Bradford Anal.Biochem.72：248-254(1976))和SDS-PAGE测定最终浓度。

2.热稳定性解旋酶依赖性HDA扩增(t-HDA)

纯化的热稳定性Tte-UvrD解旋酶连同热稳定性Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))一起被应用，以在高温选择性扩增来自基因组DNA的目标序列。选择限制性内切酶基因earIR作为目标基因(图16(SEQ ID NO：10))。设计两条引物，每一条对应于目标片段的一端，而且它们被设计成具有高的解链温度(～75℃)，以便它们能在高温下杂交目标序列。修改反应缓冲液和程序以适于基因组DNA扩增。反应缓冲液是10×耐热聚合酶(ThermoPol)反应缓冲液(NewEngland Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))：200mM Tris-HCl(pH8.8)、100mMKCl、100mM(NH₄)₂SO₄、20mM MgSO₄、1％Triton×100。

通过混和下述物质制备35μl的组分A：

3.5μl的10×耐热聚合酶缓冲液

2μl的0.83pM龋垢密螺旋体基因组DNA

1μl的10μM引物p5-76(5′-GGCCAGTTTGAATAAGACAATGAATTATT-3′(SEQ ID NO：20))

1μl的10μM引物p3-76(5′-ATTTTGAAACACAAGAATGGAAATGTGAAAG-3′(SEQ ID NO：21))

2μl的dNTPs(10mM)

1.5μl的dATP(100mM)

24μl的dH₂O

通过混和下述物质制备15μl组分B：

1.5μl的10×耐热聚合酶缓冲液

2.6μl的Bst DNA聚合酶大片段(8单位/μl)

1μl的UvrD-tte解旋酶(100ng/μl)

0.9μl的T4 gp32(5μg/μl)

9μl的dH₂O

在HDA反应开始时，先将组分A在95℃加热2分钟以变性模板。然后将组分A冷却到60℃，并在60℃保持3分钟以退火引物。变性和退火后，将15μl新鲜制备的组分B加入到35μl组分A中。反应在60℃再继续进行1小时，通过加入12.5μl终止缓冲液(1％SDS、0.05M EDTA、30％甘油、0.2％溴酚蓝)终止反应。在置于TBE缓冲液和溴化乙啶中的2％GPG LMP琼脂糖凝胶上显现扩增产物。扩增DNA的大小与预测的目标大小82bp相符(图12)。

实施例XIIII

利用t-HDA扩增和检测来自淋病奈瑟球菌的特异序列的方法

在本实施例中，我们公开了扩增和检测来自一个不同的细菌基因组淋病奈瑟球菌基因组的特异性目标序列的方法，淋病奈瑟球菌是人病原体，其引起最常见的性传播疾病之一，淋病。淋病奈瑟球菌基因组DNA购自American Type Culture Collection(ATCC No.700825，(Manassas，VA))。合成两条引物，各条引物对应于目标序列(CATATGTAACAGCAGGTCAGGCCATATCCAATATTCCACAAAATGCCAGTAATAATGAATTACTGAAAATCAGCGATAAAACACGCCGTATGTTG(SEQ ID NO：22))的各端，它们具有约78℃的解链温度。修改反应缓冲液和程序以适于基因组DNA扩增。反应缓冲液是10×耐热聚合酶反应缓冲液(New England Biolabs，Inc.，(Beverly，MA))。

通过组合下述物质制备35μl的组分A：

3.5μl的10×耐热聚合酶缓冲液

2μl的淋病奈瑟球菌基因组DNA(50ng/μl)

1μl的10μM引物H153(5′-CATATGTAACAGCAGGTCAGGCCATAT-3′(SEQ ID NO：23))

1μl的10μM引物H154(5′-CAACATACGGCGTGTTTTATCGCTGAT-3′(SEQ ID NO：24))

2μl的dNTPs(10mM)

1.5μl的dATP(100mM)

24μl的dH₂O

通过混和下列物质制备15μl的组分B：

1.5μl的10×耐热聚合酶缓冲液

2.6μl的Bst DNA聚合酶，大片段(8单位/μl)

1μl的UvrD-tte解旋酶(100ng/μl)

0.9μl的T4 gp32(5μg/μl)

9μl的dH₂O

在HDA反应的开始，先将组分A在95℃加热2分钟以变性模板。然后将组分A冷却到60℃，并在60℃保持3分钟以退火引物。变性和退火步骤后将15μl新鲜配制的组分B加入到35μl组分A中。反应在60℃下再继续进行1小时，通过加入12.5μl终止缓冲液(1％SDS、0.05M EDTA、30％甘油、0.2％溴酚蓝)来终止反应。在处于TBE缓冲液和溴化乙啶中的2％GPG LMP琼脂糖凝胶上显现扩增产物。在存在Tte-UvrD解旋酶、Gp32 SSB和Bst DNA聚合酶大片段时，在凝胶上观察到约95bp的明显条带，与预测的目标大小相符(图13，泳道1)。在平行反应中没有使用Gp32 SSB，也观察到95bp的产物(图13，泳道2)，这说明单链DNA结合蛋白对HDA体系是非必要的。当反应不存在Tte-UvrD解旋酶时，未观察到扩增(图13，泳道3)，这进一步证实这是解旋酶依赖性的扩增。本实施例显示HDA至少需要两种酶活性，DNA解旋酶活性和DNA聚合酶活性。

实施例XIV

实时检测样品中病原细菌的目标序列

HDA可以与其他技术组合，用于基因组分型(genome typing)如测定单核苷多态性(SNP)和用于鉴定传染原。例如，HDA可以与其他的核酸检测方法偶联，例如荧光标记的LUX^TM引物(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)和实时荧光检测系统(iCycler，Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)，来实时扩增和检测目标序列的存在。本实施例显示了使用HDA方法和UvrD HDA体系来实时扩增和检测在细菌病原体龋垢密螺旋体(ATCC No.35405)中的目标序列(图16(SEQ ID NO：10))。荧光标记引物，引物175-LUX(5′cacatttTGAAACACAAGAATGGAAATGTG3′(SEQ ID NO：25))，依据目标序列(图16(SEQ ID NO：10))设计，购自Invitrogen Corporation。预制反应缓冲液：10×HDA缓冲液A，含有350mM Tris-醋酸盐(pH7.5)和100mM DTT；10×HDA缓冲液B，含有10mM Tris-醋酸盐(pH7.5)、1mg/ml BSA和100mM醋酸镁。

为了测试实时HDA反应的可重复性，进行两个平行反应(图12，线1和线2)。如下地配制各个反应：通过组合下述物质制备20μl组分A：

5μl的10×HDA缓冲液A

1μl的龋垢密螺旋体基因组DNA(30ng/μl)

2μl的10μM引物175-LUX(5′cacatttTGAAACACAAGAATGGAAATGTG 3′(SEQ ID NO：25))

2μl的10μM引物175-Rev(5′GGCCAGTTTGAATAAGACAATG 3′(SEQ ID NO：26))

2μl的10mM dNTPs

8μl的dH₂O

通过混和下述物质制备30μl组分B：

5μl的10×HDA缓冲液B

1.5μl的100mM ATP

1μl的exo-Klenow片段(5单位/μl)

0.5μl的UvrD解旋酶(200ng/μl)

0.8μl的MμlL(800ng/μl)

1.2μl的T4 gp32(5μg/μl)

20μl的dH₂O

将组分A在95℃温育2分钟，然后37℃保持1分钟。冷却到37℃后，将新鲜制备的组分B加入到组分A中。在37℃、在iCyler(Bio-Rad)中继续反应。通过使用实时PCR仪iCycler(Bio-Rad)每隔5分钟测量一次荧光信号(490nM，FAM)，从而实时检测扩增产物。来自反应1和2的荧光信号在40分钟时开始增加，在约50分钟时通过T_t(时间阀值)线(图14，线1和2)。这两个反应的T_t值约为50分钟。而且，来自反应1和2的曲线非常相似，这说明实时HDA反应的可重复性是好的。在阴性对照中，荧光信号低于T_t线(图14，线3)。

序列表

<110>新英格兰生物实验室公司(NEW ENGLAND BIOLABS)

H·孔(Kong，Huimin)

M·文森特(Vincent，Myriam)

Y·徐(Xu，Yan)

<120>核酸的解旋酶依赖性扩增

<130>NEB-210-PEP

<150>US 60/412,298

<151>2002-09-20

<150>US 60/446,662

<151>2003-02-11

<160>26

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物5A

<400>1

ggtggtacca tggacgtttc ttacctgctc 30

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物3A

<400>2

ggtggtgctc ttccgcacac cgactccagc cgggc 35

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物5B

<400>3

ggtggtcata tgccaattca ggtcttaccg 30

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物3B

<400>4

ggtggttgct cttccgcact catctttcag ggcttttatc 40

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>顶部寡核苷酸

<400>5

tggctggtca ccagagggtg gcgcggaccg agtgcgctcg gcggctgcgg agaggggtag 60

agcaggcagc 70

<210>6

<211>70

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>底部寡核苷酸

<400>6

gctgcctgct ctacccctct ccgcagccgc cgagcgcact cggtccgcgc caccctctgg 60

tgaccagcca 70

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>5’引物

<400>7

catgttaggt tctatggatc gagtctggct ggtcaccaga ggg 43

<210>8

<211>45

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>3’引物

<400>8

tcccttagag gtcacattgg atcgagtcgc tgcctgctct acccc 45

<210>9

<211>2647

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>质粒pAH1

<400>9

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gcatgctcag cttggcgtaa 420

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 480

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 540

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 600

tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 660

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 720

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 780

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 840

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 900

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 960

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 1020

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 1080

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 1140

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 1200

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 1260

actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 1320

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 1380

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 1440

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 1500

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 1560

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 1620

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 1680

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 1740

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 1800

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 1860

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 1920

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 1980

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 2040

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 2100

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 2160

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 2220

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 2280

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 2340

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 2400

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 2460

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 2520

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 2580

gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc 2640

tttcgtc 2647

<210>10

<211>993

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>龋垢密螺旋体(T.denticola)的earRI基因

<400>10

atgagtaggc gtgaagtaaa aaatcaaaca aatatttcta gaattgaagg aattaaacca 60

aatgatgctt atgttgctta tgtatgtgta caatgtaaca atttgaatat gataaatatt 120

ggacaaaaat tattagatcc aagagaggct tatgaaacac aagaatggaa atgtgaaaga 180

tgtggatttt tacatagtaa aaataattca ttgtcttatt caaactggcc agaagaaagt 240

aaaaagaaag gttctattcc tgtacaaaga ttttggcaag ctttttttag agtatataca 300

gagaataaag aagcatattg gaaacaatgt aattgttgtg gaaaaatatt accattttcc 360

gcatttagca agcatattgg ttttggccct cttgaaagac aaatggaatg tagagcttgt 420

aagggagtga taaatgcatt tttaaatcca gaaagaacag aagatcaatt aagagagtca 480

aatgttagga gacgtgttgc cgatttgttt gttaaaaaag aaaataaatc taaagatgat 540

ggatttatta aagatttatt taaacgtttt ggttcaaagt gctttaaaac aaagaaatat 600

ctaaatattc atgatagaaa ttcttgggct atagatcata ttttaccatc aaaatatctt 660

tatcctctta caaaagaaaa tgctgcacta ttatctgtag aagctaattc caataaaaga 720

gatcgttggc cttcagaatt ttatacaaat aatgaattaa tagaacttgc tacaataaca 780

ggagctgatt tacaattatt atcaaataaa acacctatta taaatccaaa tcttactgat 840

gaggatataa atgcaggtat tgagaattat ttgtctgttc gtgaaaattc aaaccttgag 900

aagcgagtag ctgaaataaa aaaaatcata atagactatc aattaacgga taaattatcg 960

aaaagcaaca agaatttact tggtttatct taa 993

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物58861

<400>11

ccaaatgatg cttatgttgc tt 22

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物58862

<400>12

cataagcctc tcttggatct 20

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物58863

<400>13

tccacatctt tcacatttcc at 22

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物dnmt5

<400>14

ggaagctgct aaggactagt t 21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物dnmt3

<400>15

ccatgtacca cacatgtgaa c 21

<210>16

<211>42

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物sfo

<400>16

accgcatcga atgcatgtgg atctcaccac caactgctta gc 42

<210>17

<211>42

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物sre

<400>17

cgattccgct ccagacttgg atctgatggc atggactgtg gt 42

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物TUF

<400>18

atacatatga ttggagtgaa aaagatgaa 29

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物TUR

<400>19

aaataagctc ttcagcaaga aattgcctta ataggag 37

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物p5-76

<400>20

ggccagtttg aataagacaa tgaattatt 29

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物p376

<400>21

attttgaaac acaagaatgg aaatgtgaaa g 31

<210>22

<211>95

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)的特定目标序列

<400>22

catatgtaac agcaggtcag gccatatcca atattccaca aaatgccagt aataatgaat 60

tactgaaaat cagcgataaa acacgccgta tgttg 95

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物H153

<400>23

catatgtaac agcaggtcag gccatat 27

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物H154

<400>24

caacatacgg cgtgttttat cgctgat 27

<210>25

<211>30

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物175-LUX

<400>25

cacattttga aacacaagaa tggaaatgtg 30

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>未知

<220>

<223>引物-175-Rev

<400>26

ggccagtttg aataagacaa tg 22

Claims

1.呈指数地选择性扩增目标核酸的方法，该方法包括：

(a)提供将要被扩增的目标核酸的单链模板；

(b)加入可与步骤(a)的模板杂交的寡核苷酸引物；

(c)借助DNA聚合酶合成与所述模板相互补的寡核苷酸引物的延伸产物，形成双螺旋；

(d)将步骤(c)的双螺旋与可解旋双螺旋的解旋酶制剂接触；和

(e)重复步骤(b)-(d)，从而选择性地指数扩增所述目标核酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述扩增是等温的。

3.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(a)中的核酸是单链核酸。

4.根据权利要求3的方法，其中所述单链核酸是单链DNA。

5.根据权利要求3的方法，其中所述单链核酸是单链RNA。

6.根据权利要求1的方法，其中所述目标核酸是双链核酸，在步骤(a)之前已经通过加热或酶法变性所述双链核酸。

7.根据权利要求1的方法，其中所述目标核酸大小在约50bp到100kb范围内。

8.根据权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物是一对寡核苷酸引物，其中一条引物与要选择性扩增的目标核酸的5’端杂交，一条引物与要选择性扩增的目标核酸的3’端杂交。

9.根据权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸引物具有使所述寡核苷酸引物的解链温度比扩增期间的杂交反应温度高约10℃到30℃的长度和GC含量。

10.根据权利要求9的方法，其中所述DNA聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T7 DNA聚合酶(测序酶)和Bst聚合酶大片段。

11.根据权利要求10的方法，其中所述DNA聚合酶缺少5′到3′外切核酸酶活性。

12.根据权利要求11的方法，其中所述DNA聚合酶具有链置换活性。

13.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含单种解旋酶。

14.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含多种解旋酶。

15.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括3′到5′解旋酶。

16.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括5′到3′解旋酶。

17.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括超家族1解旋酶。

18.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括超家族4解旋酶。

19.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂选自超家族2解旋酶、超家族3解旋酶和AAA⁺解旋酶。

20.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括六聚体解旋酶。

21.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括单体解旋酶或二聚体解旋酶。

22.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括UvrD解旋酶或其同源物。

23.根据权利要求22的方法，其中所述UvrD解旋酶包括热稳定性解旋酶或其同源物。

24.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包括一种或多种选自下列的解旋酶：大肠杆菌UvrD解旋酶、Tte-UvrD解旋酶、T7 Gp4解旋酶、RecBCD解旋酶、DnaB解旋酶、MCM解旋酶、Rep解旋酶、RecQ解旋酶、PcrA解旋酶、SV40大T抗原解旋酶、疱疹病毒解旋酶、酵母Sgs1解旋酶、DEAH ATP依赖性解旋酶和乳头瘤病毒解旋酶E1蛋白及其同源物。

25.根据权利要求22的方法，其中所述UvrD解旋酶是大肠杆菌UvrD解旋酶。

26.根据权利要求23的方法，其中所述热稳定性解旋酶是Tte-UvrD解旋酶。

27.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含RecBCD解旋酶。

28.根据权利要求14的方法，其中所述解旋酶制剂包含T7基因4解旋酶和大肠杆菌UvrD解旋酶。

29.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂中的能量来源选自三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)或三磷酸脱氧腺苷(dATP)。

30.根据权利要求29的方法，其中所述ATP、dATP或dTTP的浓度在约0.1到50mM范围内。

31.根据权利要求1的方法，其中所述热稳定性解旋酶制剂包含单链结合蛋白。

32.根据权利要求1的方法，其中所述单链结合蛋白(SSB)选自T4基因32 SSB、大肠杆菌SSB、T7基因2.5 SSB、噬菌体phi29 SSB和它们的衍生物。

33.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含辅助蛋白。

34.根据权利要求33的方法，其中所述辅助蛋白在用于UvrD解旋酶时是MutL。

35.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含大肠杆菌UvrD解旋酶、ATP、大肠杆菌MutL蛋白和T4Gp32。

36.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含大肠杆菌RecBCD、ATP和T4 Gp32 SSB。

37.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含T7 Gp4B解旋酶、dTTP和T7 Gp2.5 SSB。

38.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含热稳定的Tte-UvrD解旋酶、dATP或ATP。

39.根据权利要求1的方法，其中所述解旋酶制剂包含热稳定的Tte-UvrD解旋酶、dATP或ATP以及T4 gp32 SSB。

40.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)-(e)在约20℃-75℃范围内的基本上单一的温度处进行。

41.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)-(e)在约37℃进行。

42.根据权利要求23的方法，其中步骤(b)-(e)在约60℃进行。

43.根据权利要求1的方法，其中所述目标核酸来自生物样品中的病原体，并且步骤(e)进一步包括扩增所述目标核酸来检测所述病原体。

44.根据权利要求1的方法，其中目标DNA是染色体DNA，并且步骤(e)进一步包括检测染色体DNA中的序列变异。

45.根据权利要求44的方法，其所述序列变异是单核苷酸多态性。

46.用于进行权利要求1的解旋酶依赖性扩增的核酸扩增试剂盒，包括：解旋酶制剂、DNA聚合酶和说明书。

47.根据权利要求46的用于进行权利要求1的扩增的核酸扩增试剂盒，其中所述解旋酶制剂包括：UvrD解旋酶、单链结合蛋白和三磷酸腺苷。

48.等温扩增体系，其能扩增大于大约1000个核苷酸的目标序列。

49.用于检测解旋酶是否适于选择性地指数扩增目标核酸的方法，包括：

(a)制备包含有解旋酶、NTP或dNTP、缓冲液以及可选配的一种或多种单链结合蛋白和辅助蛋白的解旋酶制剂，其中所述缓冲液具有大约pH 6.0-9.0范围内的pH，NaCl或KCl的浓度范围在0-200mM内，含有Tris-醋酸盐或Tris-HCl；

(b)将目标核酸、寡核苷酸引物、四种dNTPs和DNA聚合酶加入到所述解旋酶制剂中；

(c)在约20℃和75℃之间的温度温育混合物；和

(d)在琼脂糖凝胶上分析DNA，从而检测是否发生选择性的指数扩增。

50.根据权利要求49的方法，进一步包括通过改变下述任何物质或各种物质的浓度：解旋酶、单链结合蛋白、辅助蛋白、NTP或dNTP、盐浓度、pH值，以及改变缓冲液类型、温度、温育时间和目标核酸的长度，来优化解旋酶依赖性扩增的条件。