JP2005034001A - 大腸菌におけるＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ並びにＢｓａＩメチラーゼをコードする組換えＤＮＡと、該組換えＤＮＡを含んでなる大腸菌細胞を用いたＢｓａＩエンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明は、バチルスステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）６−５５から得られる、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ、該ＤＮＡ断片が挿入されたベクターを含んでなる組換えＤＮＡベクター、該組換えＤＮＡベクターで形質転換された宿主細胞、並びに該ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含んでなる組換えＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法に関する。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＢｓａＩエンドヌクレアーゼ又はＢｓａＩ）並びにＢｓａＩメチルトランスフェラーゼ（ＢｓａＩメチラーゼ、Ｍ．ＢｓａＩＡ及びＭ．ＢｓａＩＢ、又はＭ．ＢｓａＩＡＢ）をコードする組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを含有する大腸菌細胞におけるＢｓａＩエンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼの発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＢｓａＩエンドヌクレアーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バチラス・ステアロサーモフィルス）６−５５（ニューイングランド・バイオラボズの株収集＃４８１；マサチューセッツ州バーバリ）株に見出される。 それは、２本鎖ＤＮＡ配列５’ＧＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５に結合し、Ｎ１（上の鎖）及びＮ５（下の鎖）にて下流の配列を切断し、４塩基５’側にはみ出した末端を生じる（／ホスホジエステル結合の切断を指す）。ＢｓａＩメチラーゼ（Ｍ．ＢｓａＩＡ及びＭ．ＢｓａＩＢ）も同じ株に見出される。Ｍ．ＢｓａＩＡは、下の鎖（５’ＧＡＧＡＣＣ３’）のアデニンを修飾するアデニンメチラーゼであると思われる。Ｍ．ＢｓａＩＢは、Ｃ５メチラーゼであり、ＢｓａＩ部位の上の鎖を修飾するものと思われる。
【０００３】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは細菌及び一部のウイルス中に自然に存在する酵素の部類である。制限エンドヌクレアーゼは、他の細菌／ウイルスタンパク質から単離した場合には、実験室において分子クローニングや遺伝子の特性分析のためにＤＮＡ分子を小さな断片に切断するのに使用することができる。
【０００４】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子上の特定のヌクレオチドの配列（「制限配列」）を認識し、結合する。いったん結合すると、それらは、認識配列の中で（例えば、ＢａｍＨＩ）、一方の側で（例えば、ＳａｐＩ）、又は両側で（例えば、ＴｓｐＲＩ）分子を切断する。異なった制限エンドヌクレアーゼは異なった認識配列に対して親和性を有する。今日までに調べられた何百もの細菌種の中で、独特の特異性を持つ２１１を超える制限エンドヌクレアーゼが同定されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
制限エンドヌクレアーゼは一般的にはそれが発見された細菌に基づいて命名される。従って、例えば、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ、及びＤｒａＩＩＩと命名された３つの異なった制限エンドヌクレアーゼを生じる。このような酵素はそれぞれ、配列５’ＴＴＴ／ＡＡＡ３’、５’ＰｕＧ／ＧＮＣＣｐｙ３’及び５’ＣＡＣＮＮＮ／ＧＴＧ３’を認識する。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＲＹ１３は、配列５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ３’を認識するたった１つの酵素、ＥｃｏＲＩしか生じない。
【０００６】
細菌／ウイルスの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）システムの第２の構成成分は、メチラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼと共存し、細菌がそれ自体のＤＮＡを保護し、外来ＤＮＡから区別することができる手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、それに結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することによって配列の中で特定のヌクレオチドを１つ化学的に修飾する（Ｃ５メチルシトシン、Ｎ４メチルシトシン、又はＮ６メチルアデニン）。メチル化の後、その認識配列は同起源の制限エンドヌクレアーゼによってはもはや切断されない。細菌細胞のＤＮＡは、修飾メチラーゼの活性化によって常に完全に修飾されている。従って、ＤＮＡは内在性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感応性である。修飾されていない、従って識別可能な外来のＤＮＡだけが制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感応性がある。ＤＮＡ複製の間及びその後では、通常、半メチル化されたＤＮＡ（一方の鎖でメチル化されたＤＮＡ）は、同起源の制限消化に対しても抵抗性がある。
【０００７】
組換えＤＮＡ技術の進歩によって、今や、遺伝子をクローン化し、酵素を大量に過剰生産することが可能である。１０^−３〜１０^−４の低い頻度で存在する場合、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるのは、ゲノムのＤＮＡライブラリ、すなわち、ショットガン法に由来するクローンの集団の中で、かかるクローンを識別するための効率的な方法を開発することである。好ましくは、望ましい稀少なクローンが生き残る一方で、非メチラーゼ挿入を伴った望ましくないクローンが破壊されるように、該方法は選択されるべきである。
【０００８】
多数のＩＩ型制限修飾システムがクローン化されている。最初のクローニング方法では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定する又は選択する手段としてバクテリオファージの感染が用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：例えば、非特許文献２参照。ＨｈａＩＩ：例えば、非特許文献３参照。ＰｓｔＩ：例えば、非特許文献４参照。）。細菌における制限−修飾システムの発現によって細菌は、バクテリオファージによる感染に抵抗することが可能になるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を持つ細胞は、原則として、ファージにさらされたゲノムＤＮＡライブラリからの生き残りとして選択的に単離される。しかしながら、この方法では成功率が限定されることが判った。具体的には、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、選択的生き残りを達成するために十分なファージ抵抗性を必ずしも与えないことが判明した。
【０００９】
もう１つのクローニングへのアプローチには、当初、プラスミド由来の大腸菌にクローニングするベクターとして特徴付けされた転移システムが関与する（ＥｃｏＲＶ：例えば、非特許文献５参照。ＰａｅＲ７：例えば、非特許文献６、非特許文献７参照。例えば、非特許文献８参照。Ｔｓｐ４５Ｉ：例えば、非特許文献９参照。）。
【００１０】
第３のアプローチは、メチラーゼ遺伝子の活性発現について選択することである（メチラーゼ選抜）［例えば、特許文献１及び非特許文献１０（ＢｓｕＲＩ）参照。］。制限−修飾遺伝子は互いに密着していることが多いので、両遺伝子を同時にクローニングできることが多い。この選抜によって必ずしも完全な制限システムが得られるとは限らないが、しかし、その代わりメチラーゼ遺伝子だけが得られる（ＢｓｐＲＩ：例えば、非特許文献１１参照。ＢｃｎＩ：例えば、非特許文献１２参照。ＢｓｕＲＩ：例えば、非特許文献１３参照。ＭｓｐＩ：例えば、非特許文献１４参照。）。
【００１１】
ごく最近の方法として、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺ融合を含んだ大腸菌の指示株に基づいて大腸菌の中に熱安定性の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングする、「エンドブルー法」が開示されている（例えば、特許文献２及び非特許文献１５参照。）。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼによって誘発されたＤＮＡの損傷に続く大腸菌のＳＯＳ反応シグナルを利用する。この方法によって多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（ＴａｑＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）がクローニングされている（特許文献２参照。）。この方法の欠点は、同起源のメチラーゼ遺伝子を欠如するために、場合によっては制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する陽性の青色クローンを培養するのが難しいということである。
【００１２】
修飾される位置及び塩基に基づいて主として３群のＤＮＡメチラーゼがある（Ｃ５シトシンメチラーゼ、Ｎ４シトシンメチラーゼ、及びＮ６アデニンメチラーゼ）。Ｎ４シトシンメチラーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼは、アミノ−メチルトランスフェラーゼである（例えば、非特許文献１６参照。）。メチラーゼによってＤＮＡにおける制限部位が修飾される（メチル化される）と、それは、同起源の制限エンドヌクレアーゼによる消化に抵抗性となる。同起源ではないメチラーゼによるメチル化によっても、制限消化に対してＤＮＡ部位を抵抗性にすることができることがある。例えば、Ｄｃｍメチラーゼの５’ＣＣＷＧＧ３’（Ｗ＝Ａ又はＴ）の修飾によってＰｓｐＧＩの制限消化に対してＤＮＡを抵抗性にすることができる。もう１つの例は、ＣｐＧメチラーゼはＣＧの２ヌクレオチドを修飾し、ＮｏｔＩ消化に対してＮｏｔＩ部位（５’ＧＣＧＧＣＣＧＣ３’）を不応性にすることができる（ニューイングランドバイオラボズのカタログ２０００−０１の２２０ページ；マサチューセッツ州、バーバリ）。従って、特定のＤＮＡ配列を修飾して、制限酵素によってそれを切断できないようにするツールとしてメチラーゼを使うことができる。
【００１３】
ＩＩ型メチラーゼ遺伝子は多数の配列決定された細菌ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；及びＲｅｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ）に見出されている。メチラーゼ遺伝子に隣接するＯＲＦの直接クローニング及び過剰発現によって新規の特異性を持った制限酵素が得られた（例えば、非特許文献１７参照。）。新しいＩＩ型の制限酵素及びメチラーゼ及びそれらのイソ制限酵素をスクリーニング／クローニングする新しい方法として微生物ゲノムの掘り起こしが浮かんだ。
【００１４】
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組換え分子を創る有用なツールなので、組換えＤＮＡ技術を介して大量の制限酵素を生産する細菌株を入手するための強い商業的関心がある。かかる過剰発現株は、酵素の精製作業も簡略化するはずである。
【００１５】
【非特許文献１】
Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｍａｃｅｌｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：３１２−３１３，１９９９
【非特許文献２】
Ｋｏｓｙｋｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１７８：７１７−７１９，１９８０
【非特許文献３】
Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３：９７−１１２，１９７８
【非特許文献４】
Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８：１５０３−１５０７，１９８１
【非特許文献５】
Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：３６５９−３６７６，１９８４
【非特許文献６】
Ｇｉｎｇｅｒａｓ ａｎｄ Ｂｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８０：４０２−４０６，１９８３
【非特許文献７】
Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ ａｎｄ Ｒｏｙ，Ｇｅｎｅ １９：３５５−３５９，１９８２
【非特許文献８】
ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６４：５０１−５０９，１９８５
【非特許文献９】
Ｗａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２０２：８３−８８，１９９７
【非特許文献１０】
Ｋｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６４０３−６４２１，１９８５
【非特許文献１１】
Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０：２１９−２２５，１９８０
【非特許文献１２】
Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２０：１９７−２０４，１９８２
【非特許文献１３】
Ｋｉｓｓ ａｎｄ Ｂａｌｄａｕｆ， Ｇｅｎｅ ２１：１１１−１１９，１９８３
【非特許文献１４】
Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１２３５−１２４１，１９８３
【非特許文献１５】
Ｆｏｍｅｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２：２３９９−２４０３，１９９４
【非特許文献１６】
Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５３：６１８−６３２，１９９５
【非特許文献１７】
Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：３２１６−３２２３，２０００
【特許文献１】
米国特許第５，２００，３３３号
【特許文献２】
米国特許第５，４９８，５３５号
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ並びにＢｓａＩメチラーゼをコードする組換えＤＮＡと、該組換えＤＮＡを含んでなる大腸菌細胞を用いたＢｓａＩエンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ゲノムＤＮＡから逆ＰＣＲ及び直接ＰＣＲによる増幅によってバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）６−５５に由来するＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ（ｂｓａＩＲ）を大腸菌でクローニングする方法に関する。逆ＰＣＲのプライマー配列は、メチラーゼ選抜に由来するＢｓａＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓａＩＭＢ）に基づく。
標準のメチラーゼ選抜法によってｂｓａＩＭ遺伝子をクローニングするのは難しいことが判明した。修飾されたクローニングベクターｐＲＲＳ（Ａｐ^Ｒ）を用いてＡｐｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ及びＮｌａＩＩＩの部分ゲノムＤＮＡライブラリを構築した。ＢｓａＩ処理とメチラーゼ選抜の結果、メチラーゼ陽性クローンは同定されなかった。選抜効率を高めるためにＢｓａＩ消化の後に第２段階として緑豆ヌクレアーゼ処理を行なうことにより、ＤＮＡ末端を破壊し、β−ラクタマーゼ遺伝子を不活化した。この追加工程によってメチラーゼ選抜の効率は高められ、２０のＢｓａＩ抵抗性クローンを生じた。
【００１８】
特に、Ｒ−Ｍシステムでは、制限遺伝子は普通、同起源のメチラーゼ遺伝子の近傍に位置するので、逆ＰＣＲを用いて、ｂｓａＩＭＢ遺伝子を取り囲む隣接するＤＮＡをクローニングした。ｂｓａＩＭＢ遺伝子の両側でオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定した。第２のメチラーゼ遺伝子が上流で見出され、制限遺伝子が下流で見い出された。
【００１９】
ＢｓｍＡＩ部位（５’ＧＴＣＴＣ）は、ＢｓａＩ部位（５’ＧＧＴＣＴＣ）と重なり合い、Ｍ．ＢｓｍＡＩは、ＢｓａＩの消化から大腸菌の染色体ＤＮＡを保護している。大腸菌においてｂｓａＩＲ遺伝子を発現させるために、同起源ではないメチラーゼ遺伝子、ｂｓｍＡＩＭ遺伝子（Ｍ１：：Ｍ２融合）を先ずｐＢＲ３２２にクローニングし、Ｔ７を発現する宿主ＥＲ２５６６を事前に修飾した。ｂｓａＩＲ遺伝子をＰＣＲで増幅し、適合する末端でｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに連結し、事前に修飾した宿主ＥＲ２５６６を形質転換した［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］。形質転換体を培養し、ＩＰＴＧ誘導の細胞抽出物にてＢｓａＩエンドヌクレアーゼ活性を検出した。高いＢｓａＩ活性を持つ３つのクローンを配列決定し、クローン＃５が野生型配列を含むことを確認した。
【００２０】
同起源のメチラーゼ遺伝子を用いてさらに２つの発現株を構築した；ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ＢｓａＩＭＡ＆Ｂ，ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲ］又はＥＲ２６８３［ｐＡＣＹＣ−ＢｓａＩＭＡ＆Ｂ，ｐＵＣ１９−ＢｓａＩＲ］。細胞の湿重量グラム当りさらなるＢｓａＩ単位を生じた株はなかった。従って、同起源ではないメチラーゼで修飾した株、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ１Ｍ２，ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩ］をＢｓａＩ産生株として用いた。
【００２１】
【発明の実施の形態】
ＡｐｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ及びＮｌａＩＩＩのゲノムＤＮＡライブラリからＭ．ＢｓａＩ陽性クローンを単離するのは困難であった。ＡｐｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ及びＮｌａＩＩＩのプラスミドＤＮＡライブラリをＢｓａＩで処理した後、消化したＤＮＡをＥＲ２５０２に導入してＭ．ＢｓａＩ陽性クローンをスクリーニングした。しかしながら、３６のＡｐ^Ｒ生き残りをスクリーニングした後、Ｍ．ＢｓａＩ陽性クローンは同定されなかった。ＢｓａＩの処理効率を高め、形質転換のバックグランドを減らすために、ＢｓａＩで消化したＤＮＡをさらに緑豆ヌクレアーゼで処理した。このヌクレアーゼは末端の４塩基を外し、β−ラクタマーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームのシフトを生じるので、Ａｐ^Ｒ遺伝子を不活化する。この戦略はｂｓａＩＭＢ遺伝子のクローニングで上手く行くことが判った。
【００２２】
下記の工程に従って、大腸菌においてｂｓａＩＭＡ、ｂｓａＩＭＢ、及びｂｓａＩＲの遺伝子がより好ましくクローニングされ、発現する方法を以下に示す。
【００２３】
［１］ゲノムＤＮＡライブラリの構築及びメチラーゼ選抜
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バチラス・ステアロサーモフィルス）６−５５からゲノムＤＮＡを調製し、制限酵素、ＡｐｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ及びＮｌａＩＩＩで消化した。２つのＢｓａＩ部位で修飾したｐＲＲＳベクターを用いてゲノムＤＮＡライブラリを構築した。連結したＤＮＡを形質転換により、制限マイナス大腸菌ＥＲ２５０２コンピテント細胞に導入した。およそ１０^４の形質転換体をプールして０．５Ｌ培養で一晩増殖させた。キアゲンマキシ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ）カラムにより１次プラスミドＤＮＡライブラリを調製し、ＢｓａＩ及び緑豆ヌクレアーゼで処理した。消化に続いて、プラスミドをＥＲ２５０２に導入した。Ａｐ^Ｒの生き残りからプラスミドを調製し、ＢｓａＩ消化に対する抵抗性についてスクリーニングした。抵抗性クローンは、ＤＮＡの配列決定により真のメチラーゼ陽性クローンとして同定された。ｐＵＣ１９プライマーと特製のプライマーによって挿入物全体の配列決定を行った。１１８８ｂｐのＯＲＦが１つ見出され、ｂｓａＩＭＢと命名され、予測分子量４４．４ｋＤａを持つ３９５個のアミノ酸をコードしていた。Ｍ．ＢｓａＩＢは、その他のＣ５メチラーゼと広範な相同性を示した。しかしながら、保存されたモチーフＩＸ及びＸは、Ｃ末端の代わりにＮ末端に位置している。逆ＰＣＲを用いて、隣接するＤＮＡ配列を増幅した。５回の逆ＰＣＲの後、さらに２つの遺伝子が同定された。
上流の遺伝子、ＢｓａＩＭＡは、１７１０ｂｐであり、６５．７ｋＤａの予測分子量を持つアミノ−メチルトランスフェラーゼ（５６９アミノ酸）をコードしている。
【００２４】
［２］逆ＰＣＲによるｂｓａＩＲ遺伝子のクローニング
ｂｓａＩＭＢ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて逆ＰＣＲのプライマーを作製した。４〜６塩基の認識配列を持つ制限酵素でゲノムＤＮＡを消化し、自己連結した。逆ＰＣＲの鋳型として環状ＤＮＡ分子を用いた。ｂｓａＩＭＢの下流の逆ＰＣＲ産物を得て、ゲル精製し、配列を決定した。ｂｓａＩＭＢ遺伝子の下流に１６３５ｂｐのＯＲＦを見出した。このＯＲＦをｂｓａＩＲ遺伝子と命名した。それは、予測分子量６３．７ｋＤａを持つ５４４のアミノ酸をコードしている。
【００２５】
［３］事前修飾した宿主を構築するための、ｐＢＲ３２２へのｂｓｍＡＩＭ遺伝子のクローニング
ＢｓｍＡＩの認識配列（５’ＧＴＣＴＣ’）はＢｓａＩの認識配列（５’ＧＧＴＣＴＣ３’）と重なり合うので、Ｍ．ＢｓｍＡＩはＢｓａＩの消化に対して、大腸菌の染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡを交叉保護する。先ず、Ｍ．ＢｓａＡＩを過剰発現させ、予め修飾された発現宿主を構築する努力が払われた（２００１年９月２０日に出願され、受理された米国特許出願番号０９／９５７，００５のＢｓｍＡＩの制限−修飾）。
【００２６】
２つのプライマーを用いたＰＣＲによりゲノムＤＮＡからｂｓｍＡＩＭ遺伝子を増幅した。ＰＣＲのＤＮＡをＮｈｅＩ及びＳｐｈＩで消化し、適合する末端にてｐＢＲ３２２に連結した。大腸菌におけるｂｓａＩＲ遺伝子の過剰発現のために、予め修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］を用いた。
【００２７】
［４］Ｔ７発現ベクター、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにおけるｂｓａＩＲ遺伝子の発現
ｂｓａＩＲ遺伝子を含有するＢａｍＨＩ断片をｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ発現ベクターにクローニングした。連結したＤＮＡを予め修飾した宿主、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］に形質転換により導入した。Ａｐ^ＲＣｍ^Ｒ形質転換体を培養し、ＩＰＴＧで誘導した。ＩＰＴＧ誘導した細胞抽出物の上清にて組換えＢｓａＩの活性が検出された。高いＢｓａＩ活性を持つそれらのクローンからプラスミドを抽出した。挿入物の配列を決定した後、野生型配列を持つクローンを安定性試験及びＢｓａＩエンドヌクレアーゼの精製に用いた。
【００２８】
［５］同起源のメチラーゼで修飾した宿主におけるｂｓａＩＲ遺伝子の発現
同起源のメチラーゼ遺伝子を用いて第２の発現株：ＥＲ２５６６［ｐＢＲ−ＢｓａＩＭＡ＆Ｂ，ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲ］を構築した。この発現クローンからの組換えＢｓａＩの収量は、細胞の湿重量のｇ当り０．７〜１．４×１０^６単位のＢｓａＩと概算された。第１の発現株、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ１Ｍ２，ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲ］は、細胞の湿重量のｇ当り１．０〜２．０×１０^６単位のＢｓａＩを生じる。ｂｓａＩＭＡ及びｂｓａＩＭＢの遺伝子がｐＡＣＹＣ１８４から発現され、ｂｓａＩＲ遺伝子がｐＵＣ１９か発現される第３の発現株：ＥＲ２６８３［ｐＡＣＹＣ−ＢｓａＩＭＡ＆Ｂ，ｐＵＣ１９−ＢｓａＩＲ］も構築した。この株も細胞の湿重量ｇ当りさらに少ないＢｓａＩ単位を生じた。従って、ＢｓａＩ産生株として、前記［４］に記載される株ＥＲ２５５６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ１Ｍ２，ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩ］を用いた。
【００２９】
［６］ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの精製
大腸菌のタンパク質を変性させるために５５℃にて１時間、加熱処理を行うことによって、組換えＢｓａＩエンドヌクレアーゼを含有するＩＰＴＧ誘導した細胞抽出物を精製した。遠心により熱変性したタンパク質を取り除いた。ヘパリン−セファロース及びＤＥＡＥセルロースのカラムを介したクロマトグラフィによってＢｓａＩ活性を持つ上清をさらに精製した。精製したＢｓａＩタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、組換えＢｓａＩタンパク質のＮ末端の配列を決定して最初の２０のアミノ酸残基を得た。実際のアミノ酸配列は、ＤＮＡのコーディング配列に基づいて予測されたアミノ酸配列に完全に一致していた。
【００３０】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。本実施例は、本発明の理解を助けるために提供されるのであって、その限定として解釈されるものではない。上記及び以下で引用される参考文献は、参考として本明細書に組み入れられる。
【００３１】
実施例１ 大腸菌におけるＢｓａＩ制限−修飾システムのクローニング
（１）ゲノムＤＮＡの調製及びゲノムＤＮＡの制限消化及びゲノムＤＮＡライブラリの構築
以下の工程から成る常法に従って、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バチラス・ステアロサーモフィルス）６−５５（ニューイングランド・バイオラボズのコレクション＃４８１；マサチューセッツ州バーバリ）からゲノムＤＮＡを調製した。：
ａ）リゾチーム（最終２ｍｇ／ｍｌ）、スクロース（最終１％）及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の添加による細胞溶解
ｂ）１０％ＳＤＳ（最終濃度０．１％）の添加による細胞溶解
ｃ）１％のトリトンＸ−１００及び６２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の添加によるさらなる細胞溶解
ｄ）フェノール−ＣＨＣｌ３によるＤＮＡの抽出３回（等容量）及びＣＨＣｌ３による抽出１回
ｅ）４リットルのＴＥ緩衝液に対するＤＮＡ透析３回
ｆ）ＲＮＡ分解酵素処理によるＲＮＡの除去、及び９５％エタノールによるゲノムＤＮＡの沈殿、７０％エタノールによる洗浄、真空乾燥及びＴＥ緩衝液中への再懸濁。
【００３２】
繰り返し２倍希釈によって制限酵素ＡｐｏＩを希釈した。種々の量のＡｐｏＩ（２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６１単位）により５０℃にて３０分間、９ｍｇのゲノムＤＮＡを部分的に消化した。０．５、０．２５及び０．１２５単位のＡｐｏＩで良好な部分消化が達成された。３〜１０ｋｂの範囲の、ＡｐｏＩで部分消化したゲノムＤＮＡ断片をゲル精製して、適合する末端にてＣＩＰ処理したｐＲＲＳベクターに連結した。ｐＲＲＳベクターは、ＳｓｐＩ部位にＢｓａＩリンカーを挿入することにより修飾されている。この修飾の目的は、メチラーゼ選抜の効率を高めるためである。ゲノムＤＮＡにおける部分消化はＳａｕ３ＡＩ及びＮｌａＩＩＩによっても行った（Ｓａｕ３ＡＩの２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６１単位及びＮｌａＩＩＩの０．１２、０．０６、０．０３、０．０１５、０．００７５単位）。再び、３〜１０ｋｂの範囲のＤＮＡ断片をゲル精製し、それぞれＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化したｐＲＲＳに連結した。連結したＤＮＡをエレクトロポレーションによりＥＲ２５０２細胞を電気的コンピテント細胞に形質転換するのに用いた。Ａｐプレート（１００μｇ／ｍｌ
Ａｐ）上でＡｐ^Ｒ形質転換体を選抜した。
【００３３】
（２）メチラーゼ選抜法によるｂｓａＩＭＢのクローニング
ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａｕ３ＡＩのライブラリから１０，０００を超えるＡｐ^Ｒ形質転換体が得られた。 コロニーをすべてプールして１リットルのＬＢ＋Ａｐ中にて一晩培養して増殖させた。キアゲンマキシ−プレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ ｋｉｔ）によってプラスミドＤＮＡを調製した。１００単位のＢｓａＩを５０℃にて２時間、０．８ｎｇ〜０．２ｍｇのライブラリＤＮＡで処理した。処理したプラスミドＤＮＡを用いてＥＲ２５０２を再形質転換し、Ａｐプレート上で平板培養した。生き残りのＡｐ^Ｒ形質転換体を選抜した。３６のコロニーを２ｍｌのＬＢ＋Ａｐに接種し、一晩培養した。キアゲンスピンカラムによってプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｓａＩの消化に対する抵抗性についてスクリーニングした。３６のプラスミドはいずれもＢｓａＩ消化に抵抗性を示さなかった。
【００３４】
メチラーゼ選抜の効率を高めるために、プラスミドライブラリのＢｓａＩ消化の後、消化したプラスミドをさらに１００単位の緑豆ヌクレアーゼで３７℃にて１時間処理した。緑豆ヌクレアーゼは、はみ出している４塩基を除いた後、Ａｐ^Ｒ耐性遺伝子を破壊した（β−ラクタマーゼ遺伝子の中での４塩基の欠失はこの遺伝子を不活化する）。同一のプラスミドライブラリをＢｓａＩで処理して２つに分けた。片方のＤＮＡをさらに緑豆ヌクレアーゼで処理した。両方のＤＮＡ試料を用いてＥＲ２５０２コンピテント細胞を形質転換した。緑豆ヌクレアーゼ処理したＤＮＡは、処理していないＤＮＡよりも５倍少ない形質転換体を生じることが判った。緑豆ヌクレアーゼ処理したＤＮＡからの３６個各々の形質転換体を取り出し、２ｍｌのＬＢ＋Ａｐに接種し、一晩培養した。プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｓａＩ消化及びアガロースゲル電気泳動により分析した。スクリーニングした３６のうち２０が抵抗性を示した。単離物＃７、＃８、＃１０、＃１２及び＃１３は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化による１．３ｋｂの共通するＨｉｎｄＩＩＩ断片を有する。この共通するＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１９にサブクローニングし、配列を決定して、Ｃ５メチラーゼをコードすることを見出した。この遺伝子は１１８８ｂｐであり、Ｍ．ＢｓａＩＢをコードするｂｓａＩＭＢ遺伝子と命名した。ＢｓａＩの認識配列は非対称性なので、第２のメチラーゼがこのＲ−Ｍシステムに存在するはずであると予測された。
【００３５】
（３）隣接するＤＮＡの逆ＰＣＲ増幅と配列の決定並びにｂｓａＩＲ遺伝子の同定
ＩＩ型のＲ−Ｍ遺伝子は通常、互いに近傍に位置するのでｂｓａＩＭＢ遺伝子に隣接するＤＮＡ配列を増幅することに努力が払われた。４〜６ｂｐの認識配列を持つ制限酵素によってＢ．ステアロサーモフィルス６−５５のゲノムＤＮＡを消化し、ｂｓａＩＭＢ遺伝子及び隣接するＤＮＡを包含するＤＮＡ断片を同定した。それぞれ、ＡａｔＩＩ、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＤｒａＩ、ＨａｅＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｓｐＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩによって、Ｂ．ステアロサーモフィルスのゲノムＤＮＡを消化した。ゲノムＤＮＡを低濃度（２ｍｇ／ｍｌ）にて自己連結し、連結した環状分子を逆ＰＣＲの鋳型として用いた。
逆ＰＣＲのプライマーは以下の配列である：
【００３６】
５’−ａｇａｔａａａｔｔａｇｃｔｃｔｔａｃｔｔｇａｇｃｔｔｃ−３’（２５８−９８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
５’−ｇｇａｇａｇｃａｃａｔａｔａｃｃｇａａｇｔｔａｇ−３’（２５８−９９）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
【００３７】
逆ＰＣＲの条件は以下のとおりである：
ベント（Ｖｅｎｔ）（登録商標）（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼを用いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル実施。
ＮｄｅＩ鋳型の中に１．２ｋｂの逆ＰＣＲ産物が見出された。１．２ｋｂの断片をゲル精製し、プライマー２５８−９８及び９９により直接配列決定し、およそ７００ｂｐの新しいＤＮＡ配列を創製した。
【００３８】
以下の配列を持つ逆ＰＣＲ用プライマーの第２のセットを合成した：
５’−ｇｃｔｃｔｔｃａｇｔｇｔａｔｔｔｔｇｔａｔｃｔｃ−３’（２５９−１３７）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
５’−ｔｇａｇａａｔｔｇｇａｔｔｃｇａａｇｃａｃｔｔａ−３’（２５９−１３８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
【００３９】
逆ＰＣＲの鋳型として、ＡａｔＩＩ、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＤｒａＩ、ＨａｅＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ，ＮｓｐＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ、及びＸｈｏＩで消化し、自己連結したＤＮＡ分子を用いた。
逆ＰＣＲの条件は以下のとおりである：
ディープベント（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）（登録商標）（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼを用いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル実施した。
ＤｒａＩ鋳型の中に６００ｂｐの逆ＰＣＲ産物が見出された。６００ｂｐの断片をゲル精製し、プライマー２５９−１３７及び１３８により直接配列決定し、およそ２００ｂｐの新しいＤＮＡ配列を創製した。
【００４０】
以下の配列を持つ逆ＰＣＲ用プライマーの第３のセットを合成した：
５’ｇａｇａｔａｇａｇｔａｔａｔｔｇａａａｔａｃｔａ３’（２５９−１３９）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
５’ｔｔａｃｃｃａｔｇｇｃｇｇｇｔｔｔｇｔａａｔａｃ３’（２５９−１４０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
【００４１】
逆ＰＣＲの鋳型として、ＡａｔＩＩ、ＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＤｒａＩ、ＨａｅＩＩ、ＭｆｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ，ＮｓｐＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩ、ＸｂａＩ、及びＸｈｏＩで消化し、自己連結したＤＮＡ分子を用いた。
逆ＰＣＲの条件は以下のとおりである：
ディープベント（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ）（登録商標）（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼを用いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル実施した。
ＡｓｅＩ鋳型の中に６５０ｂｐの逆ＰＣＲ産物が見出された。６５０ｂｐの断片をゲル精製し、プライマー２５９−１３９及び１４０により直接配列決定し、およそ４００ｂｐの新しいＤＮＡ配列を創製した。
【００４２】
以下の配列を持つ逆ＰＣＲ用プライマーの第４のセットを合成した：
５’ｔｃｔｇｃａｇａａｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇｇｔｇｇ３’（２６４−２１０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
５’ｃａｔａｔｔｇｇｔｃｃｔａｔｔｔｃｃｃｔｔｇｇｔ３’（２６４−２１１）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
【００４３】
Ｂ．ステアロサーモフィルスのゲノムＤＮＡをそれぞれ、ＡｃｉＩ、ＡｐｏＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＴｆｉＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、及びＸｍｎＩで消化した。ゲノムＤＮＡ断片を低濃度（２μｇ／ｍｌ）にて自己連結し、連結した環状分子を逆ＰＣＲの鋳型として用いた。
逆ＰＣＲの条件は以下のとおりである：
ベント（Ｖｅｎｔ）（登録商標）（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル実施。
ＳｓｐＩ鋳型の中に１．２ｋｂの逆ＰＣＲ産物が見出された。１．２ｋｂの断片をゲル精製し、プライマー２６４−２１０及び２１１により直接配列決定し、およそ５４０ｂｐの新しいＤＮＡ配列を創製した。
【００４４】
以下の配列を持つ逆ＰＣＲ用プライマーの第５のセットを合成した：
５’ｃａａｔｔｔａａｃｃａａｇｔａｔｃｔａａａｔｃｇ（２７０−２２３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
５’ｔｔｃｔｇｔｔｔａｔａｔｔｃｃｇａｇｔｇａａｃｃ（２７０−２２４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
【００４５】
ＡｃｉＩ、ＡｐｏＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＲｓａＩ、ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＴｆｉＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、及びＸｍｎＩで消化し、自己連結した環状分子を、逆ＰＣＲの鋳型として用いた。
逆ＰＣＲの条件は以下のとおりである：
ベント（Ｖｅｎｔ）（登録商標）（ｅｘｏ⁻）ＤＮＡポリメラーゼを用いて９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル実施。
ＡｐｏＩ、ＲｓａＩ及びＴａｑＩ鋳型の中にそれぞれ、０．９、１．６及び１．２ｋｂの逆ＰＣＲ産物が見出された。１．２ｋｂの断片をゲル精製し、プライマー２７０−２２３及び２２４により直接配列決定し、およそ６００ｂｐの新しいＤＮＡ配列を創製した。
【００４６】
最初のメチラーゼ陽性クローンの５回の逆ＰＣＲ及び配列決定の後、２つの更なるＯＲＦが上流と下流に見出された。上流のＯＲＦは、ｂｓａＩＭＡと命名され、Ｍ．ＢｓａＩＡ、アデニンメチルトランスフェラーゼをコードしていた。他のアミノメチラーゼとの、アミノ酸配列の比較に基づいて、Ｍ．ＢｓａＡメチラーゼはγ型のＮ６Ａメチラーゼに属する。
【００４７】
Ｃ５メチラーゼの中では、保存されたアミノ酸ブロックＩＸ及びＸはタンパク質のＣ末端に位置する。保存されたブロックＩ〜ＶＩＩＩ及び可変領域はブロックＩＸ及びＸの前に位置する。しかしながら、Ｍ．ＢｓａＩＢでは、Ｃ５メチラーゼのブロックＩＸ及びＸは、Ｎ末端に位置し、２つのブロックの環状順列を示している。
かかる環状順列は、ＢｓｓＨＩＩメチラーゼで見出されている。
【００４８】
ｂｓａＩＭＡ及びｂｓａＩＭＢ遺伝子の下流に１６３５ｂｐのＯＲＦが見出された。このＯＲＦはｂｓａＩＲ遺伝子と命名された。それは、予測分子量６３．７ｋＤａを持つ５４４アミノ酸のタンパク質をコードしている（図４）。以下に立証するように、それは、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをコードしている正真正銘のＲ遺伝子である。
【００４９】
（４）ｂｓｍＡＩＭ１Ｍ２遺伝子のｐＢＲ３２２へのクローニング及び事前修飾した宿主の構築
ＢｓｍＡＩの認識配列（５’ＧＴＣＴＣ’）は、ＢｓａＩの認識配列（５’ＧＧＴＣＴＣ３’）と重なり合っているので、Ｍ．ＢｓｍＡＩは、ＢｓａＩの消化に対して大腸菌染色体のＤＮＡを交差保護する。先ずＭ．ＢｓｍＡＩを過剰発現させて事前修飾した発現宿主を構築する努力が払われた。Ｍ．ＢｓｍＡＩはＭ１とＭ２の融合体である（ＢｓｍＡＩ制限−修飾特許出願、２００１年９月２０日に出願された米国特許出願、出願番号０９／９５７，００５）。ＢｓｍＡＩ制限−修飾に関する特許出願は米国において係属中である。
【００５０】
以下の配列を有する２つのプライマーを合成した：
５’ＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＴＡＧＡＴ３’（２５３−２４５、下線のヌクレオチドはＮｈｅＩ部位）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
５’ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴ３’（２５３−２４６、下線のヌクレオチドはＳｐｈＩ部位）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
【００５１】
９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間を２５サイクルのＰＣＲ条件下で、プライマー２５３−２４５及び２５３−２４６を用いたＰＣＲにおいてゲノムＤＮＡからｂｓｍＡＩＭ遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラムを介してＰＣＲのＤＮＡを精製し、ＮｈｅＩ及びＳｐｈＩで消化した。低融点アガロースゲルでＰＣＲ断片を再び精製し、適合する末端でｐＢＲ３２２に連結した。連結したプラスミドでＥＲ２５６６（Ｔ７発現株、ＮＥＢのコレクション）を形質転換した。Ａｐ^Ｒ形質転換体をプールし、プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミド混合物をＢｓｍＡＩエンドヌクレアーゼで処理し、ＥＲ２５６６細胞に再形質転換した。６つのクローンのうち４つが正しい挿入物サイズを有し、ＢｓｍＡＩの消化に抵抗性であることが判った。大腸菌におけるｂｓａＩＲ遺伝子の発現に事前修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］を用いた。
【００５２】
（５）Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにおけるｂｓａＩＲ遺伝子の発現
安定した発現クローンを構築するために、中程度のコピー数のベクターｐＢＲ３２２からｂｓｍＡＩＭ遺伝子を発現させ、低コピー数のベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒからｂｓａＩＲ遺伝子を発現させた。ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒは、Ｔ７プロモータ、Ｃｍ^Ｒ遺伝子、ｌａｃＩ遺伝子、ｐ１５Ａ複製開始点、及び潜在性大腸菌プロモータからのランオフ転写を減らすためのＴ７プロモータの上流の転写ターミネータの４コピーを含有する。
【００５３】
ＰＣＲによるｂｓａＩＲ遺伝子の増幅のために、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩの制限部位をそれぞれ正方向及び逆方向のＰＣＲプライマーに導入した。プライマーは以下の配列を有する：
５’ＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡ３’（２７１−１６１、下線のヌクレオチドはＮｄｅＩ部位）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
５’ＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＴ３’（２７１−１６２、下線のヌクレオチドはＢａｍＨＩ部位）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）。
【００５４】
ベント（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼとプライマー２７１−１６１及び１６２を用い、９５℃で１分間、５０℃で１．５分間、７２℃で１．５分間を２５サイクルの条件下でＰＣＲによりｂｓａＩＲ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物をキアゲンスピンカラムで精製し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより一晩消化した。低融点アガロースゲル及びβ−アガラーゼ処理により精製した後、エタノールとＮａＯＡｃによりＤＮＡを沈殿させた。適合する末端によりＰＣＲのＤＮＡをＣＩＰ処理したｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに連結した。連結したＤＮＡにより事前に修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ］を形質転換し、Ａｐ^ＲＣｍ^Ｒの形質転換体を選抜した。次いで個々の形質転換体を選択し、Ａｐ（１００μｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３３μｇ／ｍｌ）を加えた１０ｍｌのＬＢにて後期対数増殖期まで培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。ＢｓａＩ活性について３６の細胞抽出物を測定した。７つのクローン（＃２、＃３、＃５、＃１８、＃２１、＃２５及び＃３２）が高いＢｓａＩ活性を示した。高い活性のクローンからの３つのプラスミド（＃２、＃３、＃５）の配列を決定し、＃５が野生型配列を有することが判明し、その後のＢｓａＩエンドヌクレアーゼタンパク質の大規模精製にそれを用いた。
【００５５】
（６）事前に修飾された宿主を構築するためのｂｓａＩＭＡ及びｂｓａＩＭＢ遺伝子のｐＢＲ３２２へのクローニング
以下の配列を持つ２つのプライマーを合成した。
５’ＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＴＡＡＡＡＧＴＴＴＣＴＣＴ３’（２７０−１４８、下線のヌクレオチドはＢａｍＨＩ部位）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
５’ＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＧＣＴＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＡ３’（２７０−１５０、下線のヌクレオチドはＳｐｈＩ部位）（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２２）
【００５６】
プライマー２７０−１４８及び２７０−１５０を用い、９５℃で１分間、５５℃で１．５分間、７２℃で４分間を２５サイクルのＰＣＲ条件を用いたＰＣＲにてベント（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼによりゲノムＤＮＡからｂｓａＩＭＡ及びｂｓａＩＭＢの遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラムを介してＰＣＲのＤＮＡをゲル精製し、ＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで消化した。低融点アガロースゲルでＰＣＲ断片を再び精製し、適合する末端でｐＢＲ３２２に連結した。連結したプラスミドでＥＲ２５６６（Ｔ７発現株、ＮＥＢの株コレクション）を形質転換した。Ａｐ^Ｒ形質転換体をプールしてプラスミドＤＮＡを調製した。ＢｓａＩエンドヌクレアーゼをプラスミド混合物で処理し、ＥＲ２５６６細胞を再形質転換した。プラスミドＤＮＡを再び調製し、ＢｓａＩエンドヌクレアーゼにより消化した。３つのクローンのうち１つが正しいサイズの挿入物を有し、ＢｓａＩの消化に抵抗性であることが判った。大腸菌におけるｂｓａＩＲ遺伝子の発現に、事前修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓａＩＭＡ＆Ｂ］を用いた。
【００５７】
前記［４］で単離したプラスミド、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲを形質転換によりＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓａＩＭＡ＆Ｂ］に導入した。Ａｐ^Ｒ及びＣｍ^Ｒのコロニーを選抜し、形質転換体をＡｐ及びＣｍを加えた１０ｍｌのＬＢにて一晩増殖させた。Ａｐ及びＣｍを加えた５００ｍｌのＬＢに１０ｍｌの細胞を接種し、５時間培養した。０．５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を加えた後、細胞増殖を３時間継続した。細胞を回収し、超音波破砕用緩衝液に再浮遊した。超音波破砕により細胞溶解を完了し、細胞の破片は遠心により除いた。細胞抽出物を希釈し、Ｔ７ＤＮＡについて測定した。この発現クローンからの組換えＢｓａＩの収量は、０．７〜１．４ｘ１０^６単位のＢｓａＩ／細胞の湿重量ｇと概算された。前出の発現株ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ１Ｍ２、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲ］からの組換えＢｓａＩの活性は、１．０〜２．０ｘ１０^６単位のＢｓａＩ／細胞の湿重量ｇと概算された。ｂｓａＩＭＡ及びｂｓａＩＭＢ遺伝子がｐＡＣＹＣ１８４から発現され、ｂｓａＩＲ遺伝子がｐＵ１９から発現される第３の発現株も構築した。この株も湿重量のｇ当りさらに少ないＢｓａＩ単位を生成した。従って、ＢｓａＩ産生株として、株ＥＲ２５５６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ１Ｍ２、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲ］を用いた。
【００５８】
（７）ＢｓａＩエンドヌクレアーゼの精製
２０ｍｌの超音波破砕用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）に再浮遊した４グラムのＩＰＴＧ誘導細胞を超音波破砕することによって細胞抽出物を調製した。１５ｋ ｒｐｍにて３０分間遠心することにより細胞破片を取り除いた。ＢｓａＩ活性を測定した。細胞抽出物を５５℃にて１時間加熱し、大腸菌の温度に不安定なタンパク質を変性させた。遠心により変性したタンパク質を除いた。上清を２０ｍｌのヘパリンセファロースカラムに流した。低塩緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）による大量の洗浄の後、０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ濃度勾配により分画を溶出した。λＤＮＡの活性測定により決定されるＢｓａＩエンドヌクレアーゼを含有する分画をプールし、ＤＥＡＥセファロース装填用緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）で一晩透析した。透析後、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムにタンパク質混合物を装填した。０．０５Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ濃度勾配で分画を溶出し、精製したＢｓａＩを含有する分画をプールした。組換えＢｓａＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。それは、＞９２％均質であると推定された（図６）。合計１０^６単位の機能的に精製されたＢｓａＩが得られた。ゲル上のＢｓａＩタンパク質の見かけの分子サイズは６１ｋＤａであると思われ、予想サイズの６３．７ｋＤａよりもやや小さかった。組換えＢｓａＩエンドヌクレアーゼの正確な開始アミノ酸を決定するために、精製タンパク質をＮ−末端配列決定解析にかけた。タンパク質は正しいＮ末端アミノ酸配列：（Ｍ）ＧＫＫＡＥＹＧＱＧＨＰＩＦＬＥＹＡＥＱ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）を含有することが確認された。
【００５９】
アミノ酸残基の組成及び側鎖の変化のような要因から移動度の差異が生じる可能性がある。
【００６０】
株ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓａＩＲ］は、ブタペスト条約の諸条件のもと、２００２年３月２６日アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４１８１を受領した。
【００６１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＢｓａＩ制限−修飾システムの遺伝子構成を示す。ｂｓａＩＭＡはＢｓａＩメチラーゼ１遺伝子；ｂｓａＩＭＢはＢｓａＩメチラーゼ２遺伝子；ｂｓａＩＲはｂｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子である。
【図２】図２は、Ｍ．ＢｓａＩＡ遺伝子（ｂｓａＩＭＡ、１７１０ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。
【図３】図３は、Ｍ．ＢｓａＢ遺伝子（ｂｓａＩＭＢ、１１８８ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。
【図４】図４は、ＢｓａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓａＩＲ、１６３５ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６）を示す。
【図５】図５は、細胞抽出物を用いた組換えＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性のアッセイ結果を示す。レーン１は、陽性対照で、精製した天然のＢｓａＩにより消化したＴ７ＤＮＡ；レーン２〜１１は、組換えＢｓａＩエンドヌクレアーゼを含有する希釈した細胞抽出物で処理したＴ７ＤＮＡ；レーン２〜１１の希釈係数は、１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、１：６４００、１：１２８００、１：２５６００、１：５１２００である。レーン１２は、１ｋｂのＤＮＡサイズマーカー。
【図６】図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧゲル上の精製した組換えＢｓａＩエンドヌクレアーゼタンパクで、レーン１は、広範囲のタンパク質サイズマーカー；レーン２は、精製した組換えＢｓａＩエンドヌクレアーゼ（組換えＢｓａＩエンドヌクレアーゼの見かけのサイズ＝６１ｋＤａ；予測されたサイズ＝６３．７ｋＤａ）。

Claims (6)

1. バチルスステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）６−５５から得られる、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
2. ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片が挿入されたベクターを含んでなる組換えＤＮＡベクター。
3. ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４１８１から入手し得る、ＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
4. 請求項３の単離されたＤＮＡを含んでなるベクター。
5. 請求項２又は４のベクターで形質転換された宿主細胞。
6. 前記エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に好適な条件下にて請求項２又は４のベクターで形質転換された宿主細胞を培養することを含んでなる組換えＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法。

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