JPH08224088A - ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡおよび関連したその製造方法 - Google Patents
ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡおよび関連したその製造方法Info
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- JPH08224088A JPH08224088A JP7270314A JP27031495A JPH08224088A JP H08224088 A JPH08224088 A JP H08224088A JP 7270314 A JP7270314 A JP 7270314A JP 27031495 A JP27031495 A JP 27031495A JP H08224088 A JPH08224088 A JP H08224088A
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来法によるＦｓｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子のクローン化は困難であり、これに替わる方法
を見出すこと。 【解決手段】 １）Frankia species 由来のＦｓｅＩ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を宿主に導入して制限遺伝
子を発現させ、２）ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活
性をコードして発現させるプラスミドを含む宿主を醗酵
させ、３）ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコー
ドして発現させるプラスミドを含む醗酵宿主からＦｓｅ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼを精製することによる、Ｆｓ
ｅＩ制限エンドヌクレアーゼのクローン化法および製造
法。
ゼ遺伝子のクローン化は困難であり、これに替わる方法
を見出すこと。 【解決手段】 １）Frankia species 由来のＦｓｅＩ制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を宿主に導入して制限遺伝
子を発現させ、２）ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活
性をコードして発現させるプラスミドを含む宿主を醗酵
させ、３）ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコー
ドして発現させるプラスミドを含む醗酵宿主からＦｓｅ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼを精製することによる、Ｆｓ
ｅＩ制限エンドヌクレアーゼのクローン化法および製造
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＦｓｅＩ制限エン
ドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換
えＤＮＡならびに組換えＤＮＡからのこれら酵素の製造
に関する。
ドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換
えＤＮＡならびに組換えＤＮＡからのこれら酵素の製造
に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】制限
エンドヌクレアーゼは細菌に天然に存在する酵素群であ
る。制限エンドヌクレアーゼが、混入する他の細菌成分
から分離して精製されると、実験室で制限酵素を使用す
ることによりＤＮＡ分子を精確なフラグメントに切断す
ることができる。この性質を利用すると、ＤＮＡ分子を
他と区別して同定することができ、また、それらの構成
遺伝子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼ
は、現代の遺伝子研究において不可欠な道具であること
が分かっている。制限エンドヌクレアーゼは生化学にお
ける「はさみ」であり、それによって遺伝子工学および
分析が可能となる。
エンドヌクレアーゼは細菌に天然に存在する酵素群であ
る。制限エンドヌクレアーゼが、混入する他の細菌成分
から分離して精製されると、実験室で制限酵素を使用す
ることによりＤＮＡ分子を精確なフラグメントに切断す
ることができる。この性質を利用すると、ＤＮＡ分子を
他と区別して同定することができ、また、それらの構成
遺伝子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼ
は、現代の遺伝子研究において不可欠な道具であること
が分かっている。制限エンドヌクレアーゼは生化学にお
ける「はさみ」であり、それによって遺伝子工学および
分析が可能となる。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の
特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識して結
合することにより作用する。制限エンドヌクレアーゼ
は、いったん結合すると、そのＤＮＡ分子を認識配列
内、あるいは、認識配列の一端で切断する。異なる制限
エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対して親和性
を有する。１００種類以上の制限エンドヌクレアーゼ
が、今日までに調べた何百という細菌種の間で同定され
ている。
特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識して結
合することにより作用する。制限エンドヌクレアーゼ
は、いったん結合すると、そのＤＮＡ分子を認識配列
内、あるいは、認識配列の一端で切断する。異なる制限
エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対して親和性
を有する。１００種類以上の制限エンドヌクレアーゼ
が、今日までに調べた何百という細菌種の間で同定され
ている。
【０００４】細菌は、種ごとにほんの少数の制限エンド
ヌクレアーゼを有する傾向にある。制限エンドヌクレア
ーゼは、典型的には、その起源である細菌に従って命名
される。すなわち、例えば Neisseria lactamica 種は
４種類の制限エンドヌクレアーゼを合成し、それらは、
ＮｌａＩ、ＮｌａII、ＮｌａIII およびＮｌａＩＶと命
名されている。これらの酵素は、各々、ＧＧＣＣ、ＧＡ
ＴＣ、ＣＡＴＧおよびＧＧＮＮＣＣの配列を認識して切
断する。他方、大腸菌 Escherichia coli ＲＹ１３は唯
一の酵素ＥｃｏＲＩを合成し、これは、ＧＡＡＴＴＣの
配列を認識する。
ヌクレアーゼを有する傾向にある。制限エンドヌクレア
ーゼは、典型的には、その起源である細菌に従って命名
される。すなわち、例えば Neisseria lactamica 種は
４種類の制限エンドヌクレアーゼを合成し、それらは、
ＮｌａＩ、ＮｌａII、ＮｌａIII およびＮｌａＩＶと命
名されている。これらの酵素は、各々、ＧＧＣＣ、ＧＡ
ＴＣ、ＣＡＴＧおよびＧＧＮＮＣＣの配列を認識して切
断する。他方、大腸菌 Escherichia coli ＲＹ１３は唯
一の酵素ＥｃｏＲＩを合成し、これは、ＧＡＡＴＴＣの
配列を認識する。
【０００５】理論に縛られるつもりはないが、制限エン
ドヌクレアーゼは、自然界では細菌細胞の自己保護的な
役割を果たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼに
より、細菌は、そうでなければ破壊しあるいは寄生する
であろうウィルスおよびプラスミドなどの外来ＤＮＡ分
子による感染に抵抗することができる。制限エンドヌク
レアーゼは、感染性のＤＮＡ分子の全長を走査し、認識
配列が現れるごとにそのＤＮＡ分子を切断することによ
り、抵抗性を付与する。切断が生じると、多くの感染性
遺伝子は無能になり、非特異的ヌクレアーゼによる分解
をさらに受けやすいＤＮＡになる。
ドヌクレアーゼは、自然界では細菌細胞の自己保護的な
役割を果たすと考えられる。制限エンドヌクレアーゼに
より、細菌は、そうでなければ破壊しあるいは寄生する
であろうウィルスおよびプラスミドなどの外来ＤＮＡ分
子による感染に抵抗することができる。制限エンドヌク
レアーゼは、感染性のＤＮＡ分子の全長を走査し、認識
配列が現れるごとにそのＤＮＡ分子を切断することによ
り、抵抗性を付与する。切断が生じると、多くの感染性
遺伝子は無能になり、非特異的ヌクレアーゼによる分解
をさらに受けやすいＤＮＡになる。
【０００６】細菌の保護系の第二成分は、修飾メチラー
ゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼに対し
て相補的であり、細菌自身のＤＮＡを保護し、外来性の
感染ＤＮＡと区別することができる手段を提供する。修
飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、ＤＮＡ
を切断する代わりに、その配列内のヌクレオチドのどれ
かをメチル基の付加により化学的に修飾する。メチル化
の後、認識配列は、もはや制限エンドヌクレアーゼによ
る結合または切断を受けることはない。細菌細胞のＤＮ
Ａは、その修飾メチラーゼの活性により完全に修飾さ
れ、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に
対して非感受的である。制限エンドヌクレアーゼの認識
および切断を受け易いのは、未修飾であり、従って同定
可能な外来ＤＮＡだけである。
ゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼに対し
て相補的であり、細菌自身のＤＮＡを保護し、外来性の
感染ＤＮＡと区別することができる手段を提供する。修
飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同
じヌクレオチド認識配列を認識して結合するが、ＤＮＡ
を切断する代わりに、その配列内のヌクレオチドのどれ
かをメチル基の付加により化学的に修飾する。メチル化
の後、認識配列は、もはや制限エンドヌクレアーゼによ
る結合または切断を受けることはない。細菌細胞のＤＮ
Ａは、その修飾メチラーゼの活性により完全に修飾さ
れ、従って、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に
対して非感受的である。制限エンドヌクレアーゼの認識
および切断を受け易いのは、未修飾であり、従って同定
可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】遺伝子工学技術の出現により、今日、通常
の精製法で得られる場合と比べて、遺伝子のクローン化
およびその遺伝子によりコードされる蛋白質の大量生産
が可能となる。問題のクローン（制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子）を単離するための標準的方法は、該クローン
が１０-3〜１０-4という低い頻度で現れるときに、複雑
な「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法によ
り誘導されるクローン集団の中から該クローンを同定す
るための簡単で信頼性のある方法を開発することであ
る。好ましくは、望ましくない大部分のクローンは破壊
され、一方、所望の数少ないクローンは生き残るよう
に、その方法が選択的であるようにする。
の精製法で得られる場合と比べて、遺伝子のクローン化
およびその遺伝子によりコードされる蛋白質の大量生産
が可能となる。問題のクローン（制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子）を単離するための標準的方法は、該クローン
が１０-3〜１０-4という低い頻度で現れるときに、複雑
な「ライブラリー」、すなわち「ショットガン」法によ
り誘導されるクローン集団の中から該クローンを同定す
るための簡単で信頼性のある方法を開発することであ
る。好ましくは、望ましくない大部分のクローンは破壊
され、一方、所望の数少ないクローンは生き残るよう
に、その方法が選択的であるようにする。
【０００８】タイプIIの制限−修飾系は、頻度の増加と
ともにクローン化されている。最初にクローン化された
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンの同定または
選択手段として、バクテリオファージ感染が使用された
（ＥｃｏＲII：Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 17
8:717-719, (1980)；ＨｈａII：Mann et al., Gene 3:9
7-112, (1978)；ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 78:1503-1507, (1981) ）。細菌中に制限
−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ感染
に対して抵抗することができるので、クローン化された
制限−修飾遺伝子を有する細胞は、原理的には、ファー
ジにさらされているライブラリーから生存物として選択
的に単離することができる。しかし、この方法の有用性
はほんの限られたものであることが分かった。特に、ク
ローン化された制限−修飾遺伝子は、選択的生存を授け
るのに十分なファージ耐性を常に明示するとは限らない
ことが分かっている。
ともにクローン化されている。最初にクローン化された
系では、制限エンドヌクレアーゼクローンの同定または
選択手段として、バクテリオファージ感染が使用された
（ＥｃｏＲII：Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 17
8:717-719, (1980)；ＨｈａII：Mann et al., Gene 3:9
7-112, (1978)；ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. 78:1503-1507, (1981) ）。細菌中に制限
−修飾系が存在すると、細菌はバクテリオファージ感染
に対して抵抗することができるので、クローン化された
制限−修飾遺伝子を有する細胞は、原理的には、ファー
ジにさらされているライブラリーから生存物として選択
的に単離することができる。しかし、この方法の有用性
はほんの限られたものであることが分かった。特に、ク
ローン化された制限−修飾遺伝子は、選択的生存を授け
るのに十分なファージ耐性を常に明示するとは限らない
ことが分かっている。
【０００９】別のクローン化法としては、最初にプラス
ミド由来のものとして特性化された系を大腸菌クローン
化用プラスミドに転移するものがある（ＥｃｏＲＶ：Bo
ugueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1
984)；ＰａｅＲ７：Gingerasand Brooks, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80:402-406, (1983)；Theriault and R
oy, Gene 19:355-359, (1982)；ＰｖｕII：Blumenthal
et al., J. Bacteriol. 164:501-509, (1985)）。
ミド由来のものとして特性化された系を大腸菌クローン
化用プラスミドに転移するものがある（ＥｃｏＲＶ：Bo
ugueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676 (1
984)；ＰａｅＲ７：Gingerasand Brooks, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80:402-406, (1983)；Theriault and R
oy, Gene 19:355-359, (1982)；ＰｖｕII：Blumenthal
et al., J. Bacteriol. 164:501-509, (1985)）。
【００１０】第三の方法は、数が増大している系のクロ
ーン化に使用されているが、活性メチラーゼ遺伝子の選
択に関与する（例えば、米国特許第．５，２００，３３
３号およびＢｓｕＲＩ：Kiss et al., Nucl. Acid. Re
s. 13:6403-6421, (1985)参照）。制限および修飾遺伝
子は、しばしば密接に結合しているので、両方の遺伝子
は同時にクローン化されることが多い。しかし、この選
択では、常に完全な制限系が得られるわけではなく、む
しろ、メチラーゼ遺伝子のみを生じる（ＢｓｐＲＩ：Sz
omolanyi et al., Gene 10:219-225, (1980)；Ｂｃｎ
Ｉ：Janulaitis etal., Gene 20:197-204 (1982) ；Ｂ
ｓｕＲＩ：Kiss and Baldauf, Gene 21:111-119, (198
3) ；およびＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem.
258:1235-1241, (1983) ）。
ーン化に使用されているが、活性メチラーゼ遺伝子の選
択に関与する（例えば、米国特許第．５，２００，３３
３号およびＢｓｕＲＩ：Kiss et al., Nucl. Acid. Re
s. 13:6403-6421, (1985)参照）。制限および修飾遺伝
子は、しばしば密接に結合しているので、両方の遺伝子
は同時にクローン化されることが多い。しかし、この選
択では、常に完全な制限系が得られるわけではなく、む
しろ、メチラーゼ遺伝子のみを生じる（ＢｓｐＲＩ：Sz
omolanyi et al., Gene 10:219-225, (1980)；Ｂｃｎ
Ｉ：Janulaitis etal., Gene 20:197-204 (1982) ；Ｂ
ｓｕＲＩ：Kiss and Baldauf, Gene 21:111-119, (198
3) ；およびＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem.
258:1235-1241, (1983) ）。
【００１１】メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝
子をクローン化するための別の方法は、ＤＮＡの損傷の
比色分析法に基づく。メチラーゼをスクリーニングする
ときは、プラスミドライブラリーをＡＰ１−２００など
の宿主大腸菌株内に形質転換する。メチラーゼの発現
は、大腸菌株中で、ＭｃｒＡ+ 、ＭｃｒＢＣ+ 、または
Ｍｒｒ+ であるＳＯＳ反応を誘発する。ＡＰ１−２００
株は、ＭｃｒおよびＭｒｒ系に対して温度感受性であ
り、大腸菌の損傷誘発ｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌａ
ｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼまたはエンドヌクレア
ーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドの検出は、ｌ
ａｃＺ遺伝子の限定温度での誘発に基づく。メチラーゼ
遺伝子をコードする形質転換細胞は、Ｘ−ｇａｌを青色
コロニーとして含むＬＢ寒天プレート上で検出される
（Piekarowicz, et al., Nucleic AcidsRes. 19:1831-1
835, (1991)および Piekarowicz, et al., J. Bacterio
logy 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌株ＥＲ１
９９２はｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含むが、メチル化
依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣおよびＭｒｒを欠い
ている。この系（「エンド−ブルー」法と言う。）で
は、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡを損傷してＳ
ＯＳ反応を誘発すると、同種のメチラーゼの不存在下で
エンドヌクレアーゼ遺伝子を検出することができる。Ｓ
ＯＳ誘発細胞は、Ｘ−ｇａｌを補ったＬＢ寒天プレート
上に濃青色のコロニーを形成する（Xu et al.,Nucleic
Acids Res. 22:2399-2403 (1994) ）。
子をクローン化するための別の方法は、ＤＮＡの損傷の
比色分析法に基づく。メチラーゼをスクリーニングする
ときは、プラスミドライブラリーをＡＰ１−２００など
の宿主大腸菌株内に形質転換する。メチラーゼの発現
は、大腸菌株中で、ＭｃｒＡ+ 、ＭｃｒＢＣ+ 、または
Ｍｒｒ+ であるＳＯＳ反応を誘発する。ＡＰ１−２００
株は、ＭｃｒおよびＭｒｒ系に対して温度感受性であ
り、大腸菌の損傷誘発ｄｉｎＤ遺伝子座に融合したｌａ
ｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼまたはエンドヌクレア
ーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドの検出は、ｌ
ａｃＺ遺伝子の限定温度での誘発に基づく。メチラーゼ
遺伝子をコードする形質転換細胞は、Ｘ−ｇａｌを青色
コロニーとして含むＬＢ寒天プレート上で検出される
（Piekarowicz, et al., Nucleic AcidsRes. 19:1831-1
835, (1991)および Piekarowicz, et al., J. Bacterio
logy 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌株ＥＲ１
９９２はｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含むが、メチル化
依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣおよびＭｒｒを欠い
ている。この系（「エンド−ブルー」法と言う。）で
は、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡを損傷してＳ
ＯＳ反応を誘発すると、同種のメチラーゼの不存在下で
エンドヌクレアーゼ遺伝子を検出することができる。Ｓ
ＯＳ誘発細胞は、Ｘ−ｇａｌを補ったＬＢ寒天プレート
上に濃青色のコロニーを形成する（Xu et al.,Nucleic
Acids Res. 22:2399-2403 (1994) ）。
【００１２】簡単なメチラーゼ選択法の場合は、種々の
障害のために、メチラーゼ（および／またはエンドヌク
レアーゼ）クローンが得られない場合がある。例えば、
Lunnen, et al., Gene, 74(1):25-32 (1988)参照。制限
−修飾遺伝子のクローン化に対して潜在的な障害は、エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾による保護がまだなされ
ていない宿主に導入しようとする際に見られる。メチラ
ーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子を単一クロ
ーンとして一緒に導入する場合は、宿主ＤＮＡがエンド
ヌクレアーゼによって切断される前に、メチラーゼによ
って保護的に修飾されなければならい。従って、場合に
よっては、最初にメチラーゼ、次いでエンドヌクレアー
ゼと逐次遺伝子をクローン化することのみが可能であ
る。
障害のために、メチラーゼ（および／またはエンドヌク
レアーゼ）クローンが得られない場合がある。例えば、
Lunnen, et al., Gene, 74(1):25-32 (1988)参照。制限
−修飾遺伝子のクローン化に対して潜在的な障害は、エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を修飾による保護がまだなされ
ていない宿主に導入しようとする際に見られる。メチラ
ーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子を単一クロ
ーンとして一緒に導入する場合は、宿主ＤＮＡがエンド
ヌクレアーゼによって切断される前に、メチラーゼによ
って保護的に修飾されなければならい。従って、場合に
よっては、最初にメチラーゼ、次いでエンドヌクレアー
ゼと逐次遺伝子をクローン化することのみが可能であ
る。
【００１３】制限−修飾系のクローン化に対する別の障
害は、大腸菌のいくつかの株がシトシンまたはアデニン
修飾に対して逆に反応するという発見に見られる。それ
らの株は、メチル化シトシン（Raleigh and Wilson, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA83:9070-9074, (1986)）ま
たはメチル化アデニン（Heitman and Model, J. Bact.
196:3243-3250, (1987) ；Raleigh, Trimarchi, and Re
vel, Genetics, 122:279-296, (1989); Waite-Rees, et
al., J. Bacteriology, 173:5207-5219 (1991) ）を含
むＤＮＡを破壊する系を有する。シトシンに特異的また
はアデニンに特異的なメチラーゼ遺伝子は、これらの株
の中では、単独でも、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝
子と一緒でも、容易にクローン化することができない。
この問題を避けるために、これらの系が欠けている大腸
菌の突然変異株（ＭｃｒＡ- およびＭｃｒＢ- またはＭ
ｒｒ- ）を使用する必要がある。
害は、大腸菌のいくつかの株がシトシンまたはアデニン
修飾に対して逆に反応するという発見に見られる。それ
らの株は、メチル化シトシン（Raleigh and Wilson, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA83:9070-9074, (1986)）ま
たはメチル化アデニン（Heitman and Model, J. Bact.
196:3243-3250, (1987) ；Raleigh, Trimarchi, and Re
vel, Genetics, 122:279-296, (1989); Waite-Rees, et
al., J. Bacteriology, 173:5207-5219 (1991) ）を含
むＤＮＡを破壊する系を有する。シトシンに特異的また
はアデニンに特異的なメチラーゼ遺伝子は、これらの株
の中では、単独でも、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝
子と一緒でも、容易にクローン化することができない。
この問題を避けるために、これらの系が欠けている大腸
菌の突然変異株（ＭｃｒＡ- およびＭｃｒＢ- またはＭ
ｒｒ- ）を使用する必要がある。
【００１４】第三の潜在的な困難性は、起源微生物およ
び大腸菌の転写機構の違い（プロモーターおよびリボソ
ーム結合部位の相違など）により、いくつかの制限エン
ドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子が大腸菌で発現
しない可能性があるということである。メチラーゼ選択
法では、メチラーゼが大腸菌で十分に発現し、その遺伝
子を有するプラスミドの少なくともいくつかは完全に保
護されることが必要である。
び大腸菌の転写機構の違い（プロモーターおよびリボソ
ーム結合部位の相違など）により、いくつかの制限エン
ドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子が大腸菌で発現
しない可能性があるということである。メチラーゼ選択
法では、メチラーゼが大腸菌で十分に発現し、その遺伝
子を有するプラスミドの少なくともいくつかは完全に保
護されることが必要である。
【００１５】精製した制限エンドヌクレアーゼおよび
（有用性の程度は小さいが）修飾メチラーゼは、実験室
でのＤＮＡの特性化および再構成において有用な道具で
あるため、これらの酵素を多量に合成する細菌株を組換
えＤＮＡ技術により得るための商業上の誘因がある。そ
のような株は、精製作業を簡単にするとともに、商業的
に有用な量で生産するための手段を提供するので、有用
である。
（有用性の程度は小さいが）修飾メチラーゼは、実験室
でのＤＮＡの特性化および再構成において有用な道具で
あるため、これらの酵素を多量に合成する細菌株を組換
えＤＮＡ技術により得るための商業上の誘因がある。そ
のような株は、精製作業を簡単にするとともに、商業的
に有用な量で生産するための手段を提供するので、有用
である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、Frankia spec
ies （ＮＲＲＬ １８５２８）から得ることが可能なＦ
ｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの
遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、ならびに組換えＤＮ
Ａからこれらの酵素を製造するための関連方法に関す
る。本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼＦｓｅＩを
発現する形質転換宿主にも関する。ＦｓｅＩは、ＤＮＡ
配列５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣ−３’を認識し、認識配列
の第二の−ＧＣ−対の間を切断して４塩基の３’オーバ
ーハングを残す酵素である（ＦｓｅＩ：Nelson et al.,
Nucl. Acid. Res. 18:2061-2064 (1990) ）。本発明に
従って得られるＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実
質的に純粋であり、常法によって作られる制限エンドヌ
クレアーゼ調製物中に通常存在する不純物を含まない。
ies （ＮＲＲＬ １８５２８）から得ることが可能なＦ
ｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼの
遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、ならびに組換えＤＮ
Ａからこれらの酵素を製造するための関連方法に関す
る。本発明はまた、制限エンドヌクレアーゼＦｓｅＩを
発現する形質転換宿主にも関する。ＦｓｅＩは、ＤＮＡ
配列５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣ−３’を認識し、認識配列
の第二の−ＧＣ−対の間を切断して４塩基の３’オーバ
ーハングを残す酵素である（ＦｓｅＩ：Nelson et al.,
Nucl. Acid. Res. 18:2061-2064 (1990) ）。本発明に
従って得られるＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは、実
質的に純粋であり、常法によって作られる制限エンドヌ
クレアーゼ調製物中に通常存在する不純物を含まない。
【００１７】メチラーゼ選択法では、メチラーゼクロー
ンが得られなかったので、ＦｓｅＩ制限−修飾系のクロ
ーン化を行うための新規方法を立案した。ＦｓｅＩ制限
−修飾系のクローン化の好ましい方法は、Frankia spec
ies 由来のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製してほぼ
均一にし、その蛋白質のＮ−末端のアミノ酸配列を決定
し、（１）ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端アミノ
酸配列および（２）シトシンメチラーゼの保存アミノ酸
配列に基づいて縮重ＤＮＡプライマーを合成し、これら
のプライマーにより、エンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼの一部分をゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅
した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは次いで、Frankia
species ＤＮＡから完全遺伝子を増幅し、それをｐＡＩ
Ｉ１７またはｐＲＲＳなどの発現ベクターにクローン化
することにより発現させることができる。この構築物
を、別の適合するプラスミド上に有する外来メチラーゼ
（ＮｌａＩなど）またはＦｓｅＩメチラーゼによってＦ
ｓｅＩ部位を予め修飾した宿主に導入する。
ンが得られなかったので、ＦｓｅＩ制限−修飾系のクロ
ーン化を行うための新規方法を立案した。ＦｓｅＩ制限
−修飾系のクローン化の好ましい方法は、Frankia spec
ies 由来のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製してほぼ
均一にし、その蛋白質のＮ−末端のアミノ酸配列を決定
し、（１）ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端アミノ
酸配列および（２）シトシンメチラーゼの保存アミノ酸
配列に基づいて縮重ＤＮＡプライマーを合成し、これら
のプライマーにより、エンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼの一部分をゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅
した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは次いで、Frankia
species ＤＮＡから完全遺伝子を増幅し、それをｐＡＩ
Ｉ１７またはｐＲＲＳなどの発現ベクターにクローン化
することにより発現させることができる。この構築物
を、別の適合するプラスミド上に有する外来メチラーゼ
（ＮｌａＩなど）またはＦｓｅＩメチラーゼによってＦ
ｓｅＩ部位を予め修飾した宿主に導入する。
【００１８】ＦｓｅＩメチラーゼをクローン化し、Ｆｓ
ｅＩエンドヌクレアーゼを選択的に発現させるために、
Frankia species 由来のＤＮＡを含むライブラリーを作
製する。メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝子を
含むクローンは、上記で得られた増幅ＤＮＡに対してハ
イブリッド形成することにより同定される。クローン化
したＤＮＡは、配列分析を行ってエンドヌクレアーゼお
よびメチラーゼのＤＮＡ配列を決定し、メチラーゼおよ
びエンドヌクレアーゼを別々にFrankia species ゲノム
ＤＮＡから増幅して、適切な発現ベクター中にクローン
化する。ＦｓｅＩの産生は、ＦｓｅＩエンドヌクレアー
ゼおよびＦｓｅＩまたはＮｌａＩメチラーゼ遺伝子のい
ずれかを含む宿主を増殖させ、適切な発現条件で誘発
し、細胞を採取してＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製
することにより行う。
ｅＩエンドヌクレアーゼを選択的に発現させるために、
Frankia species 由来のＤＮＡを含むライブラリーを作
製する。メチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝子を
含むクローンは、上記で得られた増幅ＤＮＡに対してハ
イブリッド形成することにより同定される。クローン化
したＤＮＡは、配列分析を行ってエンドヌクレアーゼお
よびメチラーゼのＤＮＡ配列を決定し、メチラーゼおよ
びエンドヌクレアーゼを別々にFrankia species ゲノム
ＤＮＡから増幅して、適切な発現ベクター中にクローン
化する。ＦｓｅＩの産生は、ＦｓｅＩエンドヌクレアー
ゼおよびＦｓｅＩまたはＮｌａＩメチラーゼ遺伝子のい
ずれかを含む宿主を増殖させ、適切な発現条件で誘発
し、細胞を採取してＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを精製
することにより行う。
【００１９】本発明は、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアー
ゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡなら
びに該組換えＤＮＡから産生される酵素に関する。
ゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡなら
びに該組換えＤＮＡから産生される酵素に関する。
【００２０】Frankia species 由来のＦｓｅＩ制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローン化は、非常に困難であ
ることが分かった。メチラーゼクローンは、たとえ、多
くの異なるライブラリーを作製して大腸菌および Strep
tomyces の両方の宿主系でスクリーニングを行っても、
標準的なメチラーゼ選択法では全く得られなかった。こ
れは、ＦｓｅＩメチラーゼが大腸菌または Streptomyce
s において保護を与えるレベルで発現できなかったこと
によると考えられる。
ドヌクレアーゼ遺伝子のクローン化は、非常に困難であ
ることが分かった。メチラーゼクローンは、たとえ、多
くの異なるライブラリーを作製して大腸菌および Strep
tomyces の両方の宿主系でスクリーニングを行っても、
標準的なメチラーゼ選択法では全く得られなかった。こ
れは、ＦｓｅＩメチラーゼが大腸菌または Streptomyce
s において保護を与えるレベルで発現できなかったこと
によると考えられる。
【００２１】従って、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼは新
規方法によってクローン化した。エンドヌクレアーゼ蛋
白質は、ほぼ均一に精製し、その蛋白質のアミノ末端の
アミノ酸配列の決定を行った。Ｎ−末端領域のアミノ酸
配列に基づく縮重ＤＮＡプライマーを合成した。さら
に、シトシンメチラーゼのアミノ酸配列の保存アミノ酸
モチーフを比較し、これらの保存アミノ酸配列に基づく
縮重ＤＮＡプライマーを合成した。ＦｓｅＩ認識部位は
ＧおよびＣの塩基対のみを含むので、ＦｓｅＩメチラー
ゼは、シトシンメチラーゼでなければならず、シトシン
メチラーゼの保存アミノ酸モチーフの何れかを含むべき
である。（エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼがアデ
ニンおよびシトシン塩基を認識し、それらの塩基のメチ
ル化部位が未知であるとすると、遺伝子のクローン化に
は同じ方法が有効であるはずであるが、アデニンメチラ
ーゼ保存モチーフに対しても同様に実施しようとするな
らば、プライマーのより多くの組み合わせが必要であ
る。）ＦｓｅＩメチラーゼおよびＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の一部の増幅を、ある種の縮重シトシンメ
チラーゼプライマーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ
−末端に相補的な縮重プライマーと組み合わせて使用す
ることにより行った。約１６５０ｂｐの増幅されたＤＮ
ＡフラグメントをｐＵＣ１９中でサブクローン化し、配
列分析を行った。このＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼのアミノ酸配列とある領域で一致し、別の領域
は、シトシンメチラーゼの保存モチーフと一致し、この
ＤＮＡフラグメントがＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝
子の一部および相接するシトシンメチラーゼ遺伝子を表
す（その結果、ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子であることを
示す）ことが確認された。
規方法によってクローン化した。エンドヌクレアーゼ蛋
白質は、ほぼ均一に精製し、その蛋白質のアミノ末端の
アミノ酸配列の決定を行った。Ｎ−末端領域のアミノ酸
配列に基づく縮重ＤＮＡプライマーを合成した。さら
に、シトシンメチラーゼのアミノ酸配列の保存アミノ酸
モチーフを比較し、これらの保存アミノ酸配列に基づく
縮重ＤＮＡプライマーを合成した。ＦｓｅＩ認識部位は
ＧおよびＣの塩基対のみを含むので、ＦｓｅＩメチラー
ゼは、シトシンメチラーゼでなければならず、シトシン
メチラーゼの保存アミノ酸モチーフの何れかを含むべき
である。（エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼがアデ
ニンおよびシトシン塩基を認識し、それらの塩基のメチ
ル化部位が未知であるとすると、遺伝子のクローン化に
は同じ方法が有効であるはずであるが、アデニンメチラ
ーゼ保存モチーフに対しても同様に実施しようとするな
らば、プライマーのより多くの組み合わせが必要であ
る。）ＦｓｅＩメチラーゼおよびＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の一部の増幅を、ある種の縮重シトシンメ
チラーゼプライマーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ
−末端に相補的な縮重プライマーと組み合わせて使用す
ることにより行った。約１６５０ｂｐの増幅されたＤＮ
ＡフラグメントをｐＵＣ１９中でサブクローン化し、配
列分析を行った。このＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼのアミノ酸配列とある領域で一致し、別の領域
は、シトシンメチラーゼの保存モチーフと一致し、この
ＤＮＡフラグメントがＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝
子の一部および相接するシトシンメチラーゼ遺伝子を表
す（その結果、ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子であることを
示す）ことが確認された。
【００２２】ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を
コードする配列が、最初の５個のアミノ酸コドンを除い
て、偶然にも１６５０ｂｐＰＣＲ産物上に存在すること
が本発明によって初めて明らかにされたので、迅速クロ
ーン化法を試みた。合成ＤＮＡプライマーを合成し、こ
れは、クローニングを容易にするためにＡＴＧ開始コド
ンに制限部位を有し、次いで、ＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼアミノ酸配列分析により決定された第２〜５番目の
アミノ酸に対するコドンを有し（コドンは、大腸菌で高
度に発現される遺伝子コドンを主に使用した。）、その
後に１６５０ｂｐＰＣＲ産物から決定されるＤＮＡ配列
に相補的な配列が続く。このプライマーを、ＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子の３’であることが知られてい
る（蛋白質の大きさに基づく）１６５０ｂｐＰＣＲ産物
の配列に相補的なプライマーとともに使用してＦｓｅＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅させた。増幅させた産
物をｐＡＩＩ１７発現ベクターに結合させ、別の適合す
るプラスミド上でクローン化したＮｌａＩメチラーゼ遺
伝子によりＦｓｅＩ切断に対して予め保護した宿主に導
入した。個々のクローンを調べ、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼを発現するクローンをＦｓｅＩの産生に使用し
た。
コードする配列が、最初の５個のアミノ酸コドンを除い
て、偶然にも１６５０ｂｐＰＣＲ産物上に存在すること
が本発明によって初めて明らかにされたので、迅速クロ
ーン化法を試みた。合成ＤＮＡプライマーを合成し、こ
れは、クローニングを容易にするためにＡＴＧ開始コド
ンに制限部位を有し、次いで、ＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼアミノ酸配列分析により決定された第２〜５番目の
アミノ酸に対するコドンを有し（コドンは、大腸菌で高
度に発現される遺伝子コドンを主に使用した。）、その
後に１６５０ｂｐＰＣＲ産物から決定されるＤＮＡ配列
に相補的な配列が続く。このプライマーを、ＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子の３’であることが知られてい
る（蛋白質の大きさに基づく）１６５０ｂｐＰＣＲ産物
の配列に相補的なプライマーとともに使用してＦｓｅＩ
エンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅させた。増幅させた産
物をｐＡＩＩ１７発現ベクターに結合させ、別の適合す
るプラスミド上でクローン化したＮｌａＩメチラーゼ遺
伝子によりＦｓｅＩ切断に対して予め保護した宿主に導
入した。個々のクローンを調べ、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼを発現するクローンをＦｓｅＩの産生に使用し
た。
【００２３】ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の最初
と終わりをコードする配列の決定および／または確認の
ために、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ
遺伝子全体を含むクローンを、両方の遺伝子のＤＮＡ配
列の決定を可能にするために増幅することなくFrankia
species ＤＮＡから得た。こうすると、ＦｓｅＩおよび
他の部位を修飾するメチラーゼを使用するよりも（Ｎｌ
ａＩメチラーゼは、大腸菌ＤＮＡを１０，０００部位以
上でメチル化するが、ＦｓｅＩメチラーゼは１０〜２０
部位でメチル化する。）、保護のためのＦｓｅＩメチラ
ーゼの発現が可能になり、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
の最初のアミノ酸配列の確認が可能になる。このため
に、Frankia species ＤＮＡのライブラリーをλ’ベク
ター系で作製して、９〜２３ｋｂFrankia species ＤＮ
Ａ挿入体を含有するクローンを生成した。１６５０ｂｐ
増幅産物をプローブとして使用して、エンドヌクレアー
ゼおよびメチラーゼ遺伝子を含むλ’クローンを同定し
た。これらのλクローンを精製し、それらのＤＮＡを抽
出して制限酵素で消化し、Frankia species ＤＮＡとの
サザンハイブリッド形成により同定されたフラグメント
と同じ大きさのクローンからフラグメントを同定した。
共にＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝
子全体を含む２つのＫｐｎＩフラグメント（１．８ｋｂ
のものと７．０ｋｂのもの）および３．６ｋｂのＳａｃ
Ｉフラグメントをλ’クローンからｐＵＣ１９中にサブ
クローン化した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメ
チラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡのアミノ酸配列分析
を行い、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端の正確な
ヌクレオチド配列を決定した。そのＤＮＡ配列は、Ｆｓ
ｅＩエンドヌクレアーゼの２番目のアミノ酸残基がトレ
オニンであって、最初に蛋白質配列データから考えられ
たヒスチジンではないことを示すことが分かった。ヒス
チジンであるという最初のアミノ酸配列の発表は、分析
者から疑わしいとして報告されていた。その後の調査で
トレオニン残基が示され、このトレオニン残基は、デー
タに曖昧さがあったこの位置に対するアミノ酸配列分析
データと一致する。すなわち、ＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼ活性を発現した第一のクローンのｐＲＭＦｓｅＲ１
は、第２番目のアミノ酸が不意に変異していたが、酵素
機能には何ら顕著な影響はなかった。従って、たとえ非
保存性のアミノ酸変化があっても、機能上活性なＦｓｅ
Ｉエンドヌクレアーゼを生産することができることが分
かった。
と終わりをコードする配列の決定および／または確認の
ために、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ
遺伝子全体を含むクローンを、両方の遺伝子のＤＮＡ配
列の決定を可能にするために増幅することなくFrankia
species ＤＮＡから得た。こうすると、ＦｓｅＩおよび
他の部位を修飾するメチラーゼを使用するよりも（Ｎｌ
ａＩメチラーゼは、大腸菌ＤＮＡを１０，０００部位以
上でメチル化するが、ＦｓｅＩメチラーゼは１０〜２０
部位でメチル化する。）、保護のためのＦｓｅＩメチラ
ーゼの発現が可能になり、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
の最初のアミノ酸配列の確認が可能になる。このため
に、Frankia species ＤＮＡのライブラリーをλ’ベク
ター系で作製して、９〜２３ｋｂFrankia species ＤＮ
Ａ挿入体を含有するクローンを生成した。１６５０ｂｐ
増幅産物をプローブとして使用して、エンドヌクレアー
ゼおよびメチラーゼ遺伝子を含むλ’クローンを同定し
た。これらのλクローンを精製し、それらのＤＮＡを抽
出して制限酵素で消化し、Frankia species ＤＮＡとの
サザンハイブリッド形成により同定されたフラグメント
と同じ大きさのクローンからフラグメントを同定した。
共にＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼ遺伝
子全体を含む２つのＫｐｎＩフラグメント（１．８ｋｂ
のものと７．０ｋｂのもの）および３．６ｋｂのＳａｃ
Ｉフラグメントをλ’クローンからｐＵＣ１９中にサブ
クローン化した。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメ
チラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡのアミノ酸配列分析
を行い、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端の正確な
ヌクレオチド配列を決定した。そのＤＮＡ配列は、Ｆｓ
ｅＩエンドヌクレアーゼの２番目のアミノ酸残基がトレ
オニンであって、最初に蛋白質配列データから考えられ
たヒスチジンではないことを示すことが分かった。ヒス
チジンであるという最初のアミノ酸配列の発表は、分析
者から疑わしいとして報告されていた。その後の調査で
トレオニン残基が示され、このトレオニン残基は、デー
タに曖昧さがあったこの位置に対するアミノ酸配列分析
データと一致する。すなわち、ＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼ活性を発現した第一のクローンのｐＲＭＦｓｅＲ１
は、第２番目のアミノ酸が不意に変異していたが、酵素
機能には何ら顕著な影響はなかった。従って、たとえ非
保存性のアミノ酸変化があっても、機能上活性なＦｓｅ
Ｉエンドヌクレアーゼを生産することができることが分
かった。
【００２４】ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼ遺伝子全体のＤＮＡアミノ酸配列は、１．８ｋｂお
よび７．０ｋｂのＫｐｎＩならびに３．６ｋｂのＳａｃ
Ｉクローンから決定した。ＦｓｅＩメチラーゼは、ベク
ターｐＳＹＸ２０にクローン化した。ＦｓｅＩメチラー
ゼ遺伝子を増幅し、ｐＳＹＸ２０ベクターでのその発現
を容易にするように設計されたオリゴヌクレオチドプラ
イマーを合成し、メチラーゼ遺伝子をFrankia species
ＤＮＡから増幅し、増幅された産物は適切な制限酵素で
切断し、同じ制限エンドヌクレアーゼで予め切断したｐ
ＳＹＸ２０ベクターに連結し、ＥＲ２４２７宿主細胞内
に形質転換した。個々の形質転換体を拾い上げ、所望の
構築物の有無を分析した。
ーゼ遺伝子全体のＤＮＡアミノ酸配列は、１．８ｋｂお
よび７．０ｋｂのＫｐｎＩならびに３．６ｋｂのＳａｃ
Ｉクローンから決定した。ＦｓｅＩメチラーゼは、ベク
ターｐＳＹＸ２０にクローン化した。ＦｓｅＩメチラー
ゼ遺伝子を増幅し、ｐＳＹＸ２０ベクターでのその発現
を容易にするように設計されたオリゴヌクレオチドプラ
イマーを合成し、メチラーゼ遺伝子をFrankia species
ＤＮＡから増幅し、増幅された産物は適切な制限酵素で
切断し、同じ制限エンドヌクレアーゼで予め切断したｐ
ＳＹＸ２０ベクターに連結し、ＥＲ２４２７宿主細胞内
に形質転換した。個々の形質転換体を拾い上げ、所望の
構築物の有無を分析した。
【００２５】ＤＮＡプライマーは、ＦｓｅＩエンドヌク
レアーゼ遺伝子全体を増幅するように設計した。前進
（forward ）プライマーは次の要素を有していた：Ｂａ
ｍＨＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と結合したフ
レーム内停止コドン、大腸菌認識強力リボソーム結合部
位、リボソーム結合部位とＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
のＡＴＧ開始コドンとの間の７ヌクレオチドのスペーサ
ー配列、第２番目の位置の正しいトレオニンコドン、第
５番目のアミノ酸のコドンの大腸菌優先コドンへの変
更、およびＦｓｅＩＤＮＡ配列とのハイブリッド形成に
適合する２４個のヌクレオチド。３’（逆進）プライマ
ーは、エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端でちょうど
ハイブリッド形成され、メチラーゼクローンとの重複が
最小になるように設計された。クローン化を容易にする
ために、ＢａｍＨＩ部位をこのプライマーに導入した。
エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ゲノムFrankia species
ＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡは、ＢａｍＨＩで
切断し、予めＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化を行った
発現ベクターｐＲＲＳに連結した。連結したベクター
は、ＮｌａＩメチラーゼ遺伝子を有する大腸菌ＥＲ２４
２７コンピテント細胞内に形質転換した。所望の大きさ
の挿入体を含むベクターを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法により
同定した。これらのクローンを対数増殖中期まで増殖さ
せ、ＩＰＴＧで誘発した。次いで、細胞を遠心により採
取し、音波処理緩衝液に再懸濁して、超音波処理により
溶解した。抽出物を透明となし、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼ活性を測定した。一つのＦｓｅＩ発現宿主を増殖
させ、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に使用し
た。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを下記に記載する標準
的な蛋白質精製法により精製した。
レアーゼ遺伝子全体を増幅するように設計した。前進
（forward ）プライマーは次の要素を有していた：Ｂａ
ｍＨＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と結合したフ
レーム内停止コドン、大腸菌認識強力リボソーム結合部
位、リボソーム結合部位とＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
のＡＴＧ開始コドンとの間の７ヌクレオチドのスペーサ
ー配列、第２番目の位置の正しいトレオニンコドン、第
５番目のアミノ酸のコドンの大腸菌優先コドンへの変
更、およびＦｓｅＩＤＮＡ配列とのハイブリッド形成に
適合する２４個のヌクレオチド。３’（逆進）プライマ
ーは、エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端でちょうど
ハイブリッド形成され、メチラーゼクローンとの重複が
最小になるように設計された。クローン化を容易にする
ために、ＢａｍＨＩ部位をこのプライマーに導入した。
エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ゲノムFrankia species
ＤＮＡから増幅した。増幅したＤＮＡは、ＢａｍＨＩで
切断し、予めＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化を行った
発現ベクターｐＲＲＳに連結した。連結したベクター
は、ＮｌａＩメチラーゼ遺伝子を有する大腸菌ＥＲ２４
２７コンピテント細胞内に形質転換した。所望の大きさ
の挿入体を含むベクターを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法により
同定した。これらのクローンを対数増殖中期まで増殖さ
せ、ＩＰＴＧで誘発した。次いで、細胞を遠心により採
取し、音波処理緩衝液に再懸濁して、超音波処理により
溶解した。抽出物を透明となし、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼ活性を測定した。一つのＦｓｅＩ発現宿主を増殖
させ、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に使用し
た。ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを下記に記載する標準
的な蛋白質精製法により精製した。
【００２６】
【発明の実施の形態】本明細書に記載するＦｓｅＩ制限
エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を好ましく
クローン化し、発現させる方法は、図１で説明するが、
下記の工程を含む。
エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を好ましく
クローン化し、発現させる方法は、図１で説明するが、
下記の工程を含む。
【００２７】１．Frankia species を、富栄養培地を含
むフラスコ中で増殖させ、細胞を溶解して、ゲノムFran
kia species ＤＮＡを精製する。
むフラスコ中で増殖させ、細胞を溶解して、ゲノムFran
kia species ＤＮＡを精製する。
【００２８】２．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ蛋白
を、New England Biolabs で開発された蛋白質精製法を
組み合わせることにより、Frankia species 細胞からほ
ぼ均一に精製する（実施例１参照）。精製したエンドヌ
クレアーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
においてほぼ均一であり、見掛けの分子量は２８，００
０ダルトンであった。
を、New England Biolabs で開発された蛋白質精製法を
組み合わせることにより、Frankia species 細胞からほ
ぼ均一に精製する（実施例１参照）。精製したエンドヌ
クレアーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
においてほぼ均一であり、見掛けの分子量は２８，００
０ダルトンであった。
【００２９】３．エンドヌクレアーゼのアミノ末端配列
は、Applied Biosystems４７０Ａ蛋白質配列分析装置
（Brooks, et al., Nucleic Acids Research, 17:979-9
97,(1989) ）を使用して得られ、いくつかの縮重ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドプライマーを、その蛋白質アミノ酸
配列に基づいて作製する。アミノ酸配列およびそれから
誘導されるオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例で
挙げる。
は、Applied Biosystems４７０Ａ蛋白質配列分析装置
（Brooks, et al., Nucleic Acids Research, 17:979-9
97,(1989) ）を使用して得られ、いくつかの縮重ＤＮＡ
オリゴヌクレオチドプライマーを、その蛋白質アミノ酸
配列に基づいて作製する。アミノ酸配列およびそれから
誘導されるオリゴヌクレオチドプライマーは、実施例で
挙げる。
【００３０】４．シトシンメチラーゼ遺伝子のアミノ酸
配列を比較し、ホモロジー領域を同定する（Wilson, Me
thods in Enzymology, 216:259-279, (1992)）。縮重Ｄ
ＮＡプライマーを各タイプのシトシンメチラーゼ（５−
メチルシトシン、α−Ｎ４シトシンおよびβ−Ｎ４シト
シンメチラーゼ）のアミノ酸配列モチーフに基づいて合
成する。合成したプライマーを実施例で列挙する。
配列を比較し、ホモロジー領域を同定する（Wilson, Me
thods in Enzymology, 216:259-279, (1992)）。縮重Ｄ
ＮＡプライマーを各タイプのシトシンメチラーゼ（５−
メチルシトシン、α−Ｎ４シトシンおよびβ−Ｎ４シト
シンメチラーゼ）のアミノ酸配列モチーフに基づいて合
成する。合成したプライマーを実施例で列挙する。
【００３１】５．シトシンメチラーゼプライマーをＦｓ
ｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマーと組み合わ
せて使用し、Frankia species ＤＮＡ由来のＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の一部をＰＣ
Ｒ法により増幅する。エンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼ遺伝子の一部を増幅するために、シトシンメチラー
ゼプライマーおよびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末
端プライマーの種々の組み合わせをＰＣＲ反応で試す。
連結したエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子
は、相対的位置に関する４つの可能な組み合わせで存在
しうる。すなわち、相近（convergent）、相離（diverg
ent ）、一列でエンドヌクレアーゼ第一（aligned endo
first）、および一列でメチラーゼ第一（aligned meth
ylase first）である（Wilson, Nucleic Acids Researc
h, 19:2539-2566, (1991)）。シトシンメチラーゼの３
つの可能な型と組み合わせると、１２個の可能な遺伝子
の組み合わせができる。全てを説明するためのプライマ
ーの組み合わせを試す。約１．５ｋｂの顕著な増幅産物
が、５−メチルシトシンモチーフ４前進プライマーおよ
びＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端前進プライマー
により、相近遺伝子位置で認められ、５−メチルシトシ
ンモチーフ１前進プライマーおよび同じＮ−末端エンド
ヌクレアーゼプライマーを用いると、１．６５ｋｂのあ
まり顕著でない産物が認められる。１．６ｋｂ産物を鋳
型として使用すると、１．５ｋｂの産物がモチーフ４プ
ライマーおよび同じＦｓｅＩＮ−末端プライマーにより
増幅できる。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂ産物をベク
ターｐＵＣ１９にクローン化する。
ｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマーと組み合わ
せて使用し、Frankia species ＤＮＡ由来のＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の一部をＰＣ
Ｒ法により増幅する。エンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼ遺伝子の一部を増幅するために、シトシンメチラー
ゼプライマーおよびＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末
端プライマーの種々の組み合わせをＰＣＲ反応で試す。
連結したエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子
は、相対的位置に関する４つの可能な組み合わせで存在
しうる。すなわち、相近（convergent）、相離（diverg
ent ）、一列でエンドヌクレアーゼ第一（aligned endo
first）、および一列でメチラーゼ第一（aligned meth
ylase first）である（Wilson, Nucleic Acids Researc
h, 19:2539-2566, (1991)）。シトシンメチラーゼの３
つの可能な型と組み合わせると、１２個の可能な遺伝子
の組み合わせができる。全てを説明するためのプライマ
ーの組み合わせを試す。約１．５ｋｂの顕著な増幅産物
が、５−メチルシトシンモチーフ４前進プライマーおよ
びＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端前進プライマー
により、相近遺伝子位置で認められ、５−メチルシトシ
ンモチーフ１前進プライマーおよび同じＮ−末端エンド
ヌクレアーゼプライマーを用いると、１．６５ｋｂのあ
まり顕著でない産物が認められる。１．６ｋｂ産物を鋳
型として使用すると、１．５ｋｂの産物がモチーフ４プ
ライマーおよび同じＦｓｅＩＮ−末端プライマーにより
増幅できる。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂ産物をベク
ターｐＵＣ１９にクローン化する。
【００３２】６．工程５のＰＣＲ産物の両末端のＤＮＡ
配列を決定する。ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配
列は、上記工程３で決定されたＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼのアミノ酸配列と一致する。また、増幅されたＤＮ
Ａの他端から推定されるアミノ酸配列は、５−メチルシ
トシンメチラーゼのアミノ酸モチーフを含み、１．５ｋ
ｂ産物が１．６５ｋｂ産物の内部サブセットであること
が分かる。
配列を決定する。ＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配
列は、上記工程３で決定されたＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼのアミノ酸配列と一致する。また、増幅されたＤＮ
Ａの他端から推定されるアミノ酸配列は、５−メチルシ
トシンメチラーゼのアミノ酸モチーフを含み、１．５ｋ
ｂ産物が１．６５ｋｂ産物の内部サブセットであること
が分かる。
【００３３】７．ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の
過発現： Ａ．一般的事項：制限遺伝子を過発現させる方法は数多
い。ＤＮＡ配列および詳細な制限地図の情報は、制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子の過発現のための最良の方法を
決定するのに役立つ。過発現の一つの方法は、ＰＣＲ法
を使用してエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅するた
めに、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端および
その遺伝子のいくらか下流（３’）で直接ハイブリッド
形成を行うプライマーを設計することを含む。得られる
ＤＮＡフラグメントは、ｐＡＩＩ１７などの発現ベクタ
ーの誘発プロモーター（Ｔ７）のすぐ下流に挿入するこ
とができる。あるいは、ｐＡＧＲ３上のＰtac （W. Jac
k, New England Biolabs 製）などの大腸菌が強く認識
するプロモーターを制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開
始のすぐ前に挿入することにより過発現を行うことがで
きる。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始お
よび末端付近の都合のよい制限部位ならびにｐＡＧＲ３
のプロモーター付近の適合する制限部位を見つけ、制限
遺伝子をｐＡＧＲ３に移してＰtac プロモーターと結合
させることにより行うことができる。使用することがで
きる他の調節されたプロモーターは、ｐＵＣ１９および
ｐＢＲ３２２誘導体上のＰｌａｃＵＶ５（Fuller, Gene
19:43-54, (1982) ）およびｌＰＬ（Shimatake and Ro
senberg, Nature 254:128, (1981) ）である。さらに、
強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346, (1974) ）をその
遺伝子の前において発現を高めることもできる。制限エ
ンドヌクレアーゼを過発現する安定クローンを得るため
に、宿主は、一般に、予め制限エンドヌクレアーゼ消化
から保護する。これは、本発明では、ＦｓｅＩメチラー
ゼまたは、すべてのＦｓｅＩ部位（および他の多くの部
位）を修飾することによりＦｓｅＩ消化から保護する外
来メチラーゼ（ＮｌａＩなど）のいずれにおいても別の
プラスミドにクローン化することにより行う。使用する
プラスミドは、発現ベクターに適合するものでなければ
ならない。また、メチラーゼは、宿主のゲノムを過発現
された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から保
護するレベルで生産されなければならない。
過発現： Ａ．一般的事項：制限遺伝子を過発現させる方法は数多
い。ＤＮＡ配列および詳細な制限地図の情報は、制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子の過発現のための最良の方法を
決定するのに役立つ。過発現の一つの方法は、ＰＣＲ法
を使用してエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅するた
めに、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端および
その遺伝子のいくらか下流（３’）で直接ハイブリッド
形成を行うプライマーを設計することを含む。得られる
ＤＮＡフラグメントは、ｐＡＩＩ１７などの発現ベクタ
ーの誘発プロモーター（Ｔ７）のすぐ下流に挿入するこ
とができる。あるいは、ｐＡＧＲ３上のＰtac （W. Jac
k, New England Biolabs 製）などの大腸菌が強く認識
するプロモーターを制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開
始のすぐ前に挿入することにより過発現を行うことがで
きる。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始お
よび末端付近の都合のよい制限部位ならびにｐＡＧＲ３
のプロモーター付近の適合する制限部位を見つけ、制限
遺伝子をｐＡＧＲ３に移してＰtac プロモーターと結合
させることにより行うことができる。使用することがで
きる他の調節されたプロモーターは、ｐＵＣ１９および
ｐＢＲ３２２誘導体上のＰｌａｃＵＶ５（Fuller, Gene
19:43-54, (1982) ）およびｌＰＬ（Shimatake and Ro
senberg, Nature 254:128, (1981) ）である。さらに、
強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 71:1342-1346, (1974) ）をその
遺伝子の前において発現を高めることもできる。制限エ
ンドヌクレアーゼを過発現する安定クローンを得るため
に、宿主は、一般に、予め制限エンドヌクレアーゼ消化
から保護する。これは、本発明では、ＦｓｅＩメチラー
ゼまたは、すべてのＦｓｅＩ部位（および他の多くの部
位）を修飾することによりＦｓｅＩ消化から保護する外
来メチラーゼ（ＮｌａＩなど）のいずれにおいても別の
プラスミドにクローン化することにより行う。使用する
プラスミドは、発現ベクターに適合するものでなければ
ならない。また、メチラーゼは、宿主のゲノムを過発現
された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から保
護するレベルで生産されなければならない。
【００３４】前記遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌でより
効率的に利用されるコドンを使用するために、部位特異
的突然変異誘発または遺伝子自体の再合成により変える
ことができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151:389-409,
(1981)）。
効率的に利用されるコドンを使用するために、部位特異
的突然変異誘発または遺伝子自体の再合成により変える
ことができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151:389-409,
(1981)）。
【００３５】Ｂ．ＦｓｅＩの初期の迅速発現：合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを設計・使用してゲノムFran
kia species ＤＮＡからＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子を増幅し、Ｔ７発現ベクターであるＰＡＩＩ１７に
クローン化する。上記の１６５０ｂｐＰＣＲ産物および
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列からのＤＮ
Ａ配列情報を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライ
マーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始
コドンに位置するＮｄｅＩ部位（−ＣＡＴＡＴＧ−）と
ともに構築することにより、Ｔ７発現ベクターであるＰ
ＡＩＩ１７のＮｄｅＩ部位（その後に、アミノ酸配列か
ら示されるようにＦｓｅＩの最初の５個のアミノ酸をコ
ードするＤＮＡ配列が続く。）でのクローン化を容易に
する。コドンの縮重問題のために、上記の１６５０ｂｐ
産物の増幅に使用するプライマーをＦｓｅＩエンドヌク
レアーゼ蛋白質配列のアミノ酸６をコードするコドンで
開始したので、発現プライマーのベースとなるアミノ酸
２〜５に対するＤＮＡ配列情報は得られなかった。従っ
て、プライマー配列は、上記工程３において、最初の５
個の位置に対するアミノ酸が、発現の高い大腸菌遺伝子
で最も頻繁に使用されるコドンを使用して挿入されるよ
うに選択する。発現プライマーは、その後に、１６５０
ｂｐＰＣＲ産物の配列と合致する２１個の塩基対配列が
続く。シトシンメチラーゼモチーフ４の領域のＤＮＡ配
列と合致させるためには、逆向プライマーを選択する。
逆向プライマーであれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子全
体が確実に存在し、Frankia species ＤＮＡ配列の１個
の塩基対を変化させるだけで、都合のよいＳａｌＩ制限
部位をこのプライマーに作り出すことができるからであ
る。増幅されたＤＮＡは、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切
断し、予めＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断したベクター
ｐＡＩＩ１７に連結する。連結したベクターを、誘発Ｔ
７ポリメラーゼ遺伝子を有し、適合するベクターｐＳＹ
Ｘ２０上にあるＮａＩメチラーゼ遺伝子の発現によりＦ
ｓｅＩ部位が予め修飾された適する宿主の大腸菌ＥＲ２
４１７に導入する。個々の形質転換体を分析し、Ｆｓｅ
Ｉエンドヌクレアーゼを発現する形質転換体を使用して
酵素の産生を行う。
ゴヌクレオチドプライマーを設計・使用してゲノムFran
kia species ＤＮＡからＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺
伝子を増幅し、Ｔ７発現ベクターであるＰＡＩＩ１７に
クローン化する。上記の１６５０ｂｐＰＣＲ産物および
ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列からのＤＮ
Ａ配列情報を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライ
マーをＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始
コドンに位置するＮｄｅＩ部位（−ＣＡＴＡＴＧ−）と
ともに構築することにより、Ｔ７発現ベクターであるＰ
ＡＩＩ１７のＮｄｅＩ部位（その後に、アミノ酸配列か
ら示されるようにＦｓｅＩの最初の５個のアミノ酸をコ
ードするＤＮＡ配列が続く。）でのクローン化を容易に
する。コドンの縮重問題のために、上記の１６５０ｂｐ
産物の増幅に使用するプライマーをＦｓｅＩエンドヌク
レアーゼ蛋白質配列のアミノ酸６をコードするコドンで
開始したので、発現プライマーのベースとなるアミノ酸
２〜５に対するＤＮＡ配列情報は得られなかった。従っ
て、プライマー配列は、上記工程３において、最初の５
個の位置に対するアミノ酸が、発現の高い大腸菌遺伝子
で最も頻繁に使用されるコドンを使用して挿入されるよ
うに選択する。発現プライマーは、その後に、１６５０
ｂｐＰＣＲ産物の配列と合致する２１個の塩基対配列が
続く。シトシンメチラーゼモチーフ４の領域のＤＮＡ配
列と合致させるためには、逆向プライマーを選択する。
逆向プライマーであれば、エンドヌクレアーゼ遺伝子全
体が確実に存在し、Frankia species ＤＮＡ配列の１個
の塩基対を変化させるだけで、都合のよいＳａｌＩ制限
部位をこのプライマーに作り出すことができるからであ
る。増幅されたＤＮＡは、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切
断し、予めＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断したベクター
ｐＡＩＩ１７に連結する。連結したベクターを、誘発Ｔ
７ポリメラーゼ遺伝子を有し、適合するベクターｐＳＹ
Ｘ２０上にあるＮａＩメチラーゼ遺伝子の発現によりＦ
ｓｅＩ部位が予め修飾された適する宿主の大腸菌ＥＲ２
４１７に導入する。個々の形質転換体を分析し、Ｆｓｅ
Ｉエンドヌクレアーゼを発現する形質転換体を使用して
酵素の産生を行う。
【００３６】８．産生：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
は、ＮｌａＩメチラーゼ遺伝子（またはＦｓｅＩメチラ
ーゼ遺伝子）および過発現したＦｓｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子を有するクローンから、醗酵槽にて、適
当な抗生物質選択および誘発剤を含む富栄養培地中で増
殖させることにより産生させることができる。その後、
細胞を遠心により採取し、超音波処理により破砕して、
ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出
物を得る。
は、ＮｌａＩメチラーゼ遺伝子（またはＦｓｅＩメチラ
ーゼ遺伝子）および過発現したＦｓｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子を有するクローンから、醗酵槽にて、適
当な抗生物質選択および誘発剤を含む富栄養培地中で増
殖させることにより産生させることができる。その後、
細胞を遠心により採取し、超音波処理により破砕して、
ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出
物を得る。
【００３７】９．精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼを
含む粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィ
ーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な
蛋白質精製法を組み合わせることにより精製する。
含む粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィ
ーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な
蛋白質精製法を組み合わせることにより精製する。
【００３８】ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラ
ーゼのさらなる特性化およびそれらの酵素の別の発現： １０．Frankia species ＤＮＡを、λ’IIまたは類似ベ
クター中でクローン化可能で、ＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼおよび／またはメチラーゼ遺伝子全体を含むフラグ
メントを生じるように切断するＳａｕ３ＡＩまたはその
アイソシゾマーなどの制限エンドヌクレアーゼで完全に
および／または部分的に消化する。
ーゼのさらなる特性化およびそれらの酵素の別の発現： １０．Frankia species ＤＮＡを、λ’IIまたは類似ベ
クター中でクローン化可能で、ＦｓｅＩエンドヌクレア
ーゼおよび／またはメチラーゼ遺伝子全体を含むフラグ
メントを生じるように切断するＳａｕ３ＡＩまたはその
アイソシゾマーなどの制限エンドヌクレアーゼで完全に
および／または部分的に消化する。
【００３９】１１．消化されたＤＮＡをλファージクロ
ーニングベクターに連結する。得られる混合物をｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージし、大腸菌株ＥＲ１４５８（ＮＥ
Ｂ＃４０１−Ｃ）などの適切な宿主の感染に使用する。
感染ファージのタイターは、パッケージしたファージの
一部を平板培養し、得られるプラークを計数することに
より求める。
ーニングベクターに連結する。得られる混合物をｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージし、大腸菌株ＥＲ１４５８（ＮＥ
Ｂ＃４０１−Ｃ）などの適切な宿主の感染に使用する。
感染ファージのタイターは、パッケージしたファージの
一部を平板培養し、得られるプラークを計数することに
より求める。
【００４０】１２．ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージしたフ
ァージは、好ましくは、富栄養培地上でＥＲ１４５８
（ＮＥＢ＃４０１−Ｃ）などの適切な大腸菌宿主の軟寒
天における密度を変えて平板培養する。インキュベート
した後、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ
遺伝子を含むファージを、ＰＣＲにより得た１６５０ｂ
ｐの遺伝子部分をプラークのニトロセルロースフィルタ
ーリフトに対するプローブとして使用し、ベントン−デ
イヴィス・サザンハイブリッド形成により同定する。陽
性のプラークをプレートから取り出し、平板培養および
ハイブリッド形成を連続して数回行うことにより精製す
る。陽性クローンを増殖させ、そのＤＮＡを精製する。
ァージは、好ましくは、富栄養培地上でＥＲ１４５８
（ＮＥＢ＃４０１−Ｃ）などの適切な大腸菌宿主の軟寒
天における密度を変えて平板培養する。インキュベート
した後、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ
遺伝子を含むファージを、ＰＣＲにより得た１６５０ｂ
ｐの遺伝子部分をプラークのニトロセルロースフィルタ
ーリフトに対するプローブとして使用し、ベントン−デ
イヴィス・サザンハイブリッド形成により同定する。陽
性のプラークをプレートから取り出し、平板培養および
ハイブリッド形成を連続して数回行うことにより精製す
る。陽性クローンを増殖させ、そのＤＮＡを精製する。
【００４１】１３．Frankia species ＤＮＡのＦｓｅＩ
エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ領域における制限
フラグメントの地図を、種々の制限酵素で消化したゲノ
ムFrankia species ＤＮＡに対する１６５０ｂｐＰＣＲ
産物プローブのサザンハイブリッド形成により作る。１
８００ｂｐおよび７０００ｂｐのＫｐｎＩフラグメント
ならびに３６００ｂｐのＳａｃＩフラグメントはいくつ
かのλ’クローンに共通であり、Frankia species ゲノ
ム地図は、続く工程での操作を容易にするために、λ’
ベクターからｐＵＣ１９に移してサブクローニングす
る。
エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ領域における制限
フラグメントの地図を、種々の制限酵素で消化したゲノ
ムFrankia species ＤＮＡに対する１６５０ｂｐＰＣＲ
産物プローブのサザンハイブリッド形成により作る。１
８００ｂｐおよび７０００ｂｐのＫｐｎＩフラグメント
ならびに３６００ｂｐのＳａｃＩフラグメントはいくつ
かのλ’クローンに共通であり、Frankia species ゲノ
ム地図は、続く工程での操作を容易にするために、λ’
ベクターからｐＵＣ１９に移してサブクローニングす
る。
【００４２】１４．配列分析：１６５０ｂｐ増幅産物を
含むＤＮＡおよびその位置に隣接するＤＮＡの配列分析
を行い、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端での正確
なＤＮＡ配列（４個の「欠けた」アミノ酸コドンおよび
ＡＴＧ開始コドンならびに最初の増幅産物には無いメチ
ラーゼの開始部分の配列を含む）を決定する。エンドヌ
クレアーゼの２番目のアミノ酸は、最初の配列分析（工
程３）とは異なることが分かった。このアミノ酸は、エ
ンドヌクレアーゼのその後の発現で、正しいトレオニン
に変わる。メチラーゼ遺伝子の推定上の開始および停止
部分を、エンドヌクレアーゼの末端と同様に同定する。
エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子は、１２個
のヌクレオチドが重複することが認められる。
含むＤＮＡおよびその位置に隣接するＤＮＡの配列分析
を行い、エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端での正確
なＤＮＡ配列（４個の「欠けた」アミノ酸コドンおよび
ＡＴＧ開始コドンならびに最初の増幅産物には無いメチ
ラーゼの開始部分の配列を含む）を決定する。エンドヌ
クレアーゼの２番目のアミノ酸は、最初の配列分析（工
程３）とは異なることが分かった。このアミノ酸は、エ
ンドヌクレアーゼのその後の発現で、正しいトレオニン
に変わる。メチラーゼ遺伝子の推定上の開始および停止
部分を、エンドヌクレアーゼの末端と同様に同定する。
エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子は、１２個
のヌクレオチドが重複することが認められる。
【００４３】１５．ＦｓｅＩメチラーゼの発現：Ｆｓｅ
Ｉメチラーゼを、ベクターｐＡＩＩ１７およびｐＲＲＳ
と適合性のあるベクターｐＳＹＸ２０にクローン化す
る。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、そのｐＳＹＸ
２０ベクターでの発現を容易にするためにオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、メチラーゼ遺伝子をFranki
aspecies ＤＮＡから増幅し、増幅産物を適切な制限酵
素で切断して、同じ制限エンドヌクレアーゼで予め切断
したｐＳＹＸ２０ベクターに連結し、ＥＲ２４２７宿主
細胞内に形質転換する。個々の形質転換体を拾い上げ、
所望の構築物の有無を分析する。正しい構築物を有する
一つの形質転換体をｐＲＭＦｓｅＭ１と命名する。
Ｉメチラーゼを、ベクターｐＡＩＩ１７およびｐＲＲＳ
と適合性のあるベクターｐＳＹＸ２０にクローン化す
る。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子を増幅し、そのｐＳＹＸ
２０ベクターでの発現を容易にするためにオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、メチラーゼ遺伝子をFranki
aspecies ＤＮＡから増幅し、増幅産物を適切な制限酵
素で切断して、同じ制限エンドヌクレアーゼで予め切断
したｐＳＹＸ２０ベクターに連結し、ＥＲ２４２７宿主
細胞内に形質転換する。個々の形質転換体を拾い上げ、
所望の構築物の有無を分析する。正しい構築物を有する
一つの形質転換体をｐＲＭＦｓｅＭ１と命名する。
【００４４】１６．ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの発
現：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅する
ためのＤＮＡプライマーを設計した。前進プライマー
は、ＢａｍＨＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と結
合したフレーム内停止コドン、大腸菌認識強リボソーム
結合部位、リボソーム結合部位とＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼのＡＴＧ開始コドンとの間の７ヌクレオチドのス
ペーサー配列、第２番目の正しいトレオニンコドン、５
番目のロイシンに対するコドンの大腸菌優先コドンへの
変更、およびハイブリッド形成のためのＦｓｅＩＤＮＡ
配列と合致する２４個のヌクレオチドを有する。このプ
ライマーは、ＨｉｎｆＩ発現の例に従う（Skoglund, et
al., Gene 88:1-5 (1990)）。３’（逆向）プライマー
は、エンドヌクレアーゼ遺伝子のちょうど３’端でハイ
ブリッド形成し、メチラーゼクローンとのオーバーラッ
プを最小にする、すなわち宿主における２つのプラスミ
ド間の相同組換えの可能性を最小にするように設計す
る。ＢａｍＨＩ部位は、クローニングを容易にするため
にこのプライマーに導入する。エンドヌクレアーゼ遺伝
子は、ゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅する。増
幅したＤＮＡは、ＢａｍＨＩで切断し、予めＢａｍＨＩ
で切断して脱リン酸化した発現ベクターｐＲＲＳに連結
し、連結体を、ｐＳＹＸ２０上にあるＮｌａＩメチラー
ゼで予め修飾した大腸菌ＥＲ２４２７などの適切な宿主
細胞内に形質転換する。所望の大きさの挿入物を含むベ
クターを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法で同定する。これらのク
ローンを対数増殖中期まで増殖し、０．５ｍＭのＩＰＴ
Ｇで誘発する。次いで、細胞を遠心により採取して、超
音波処理緩衝液に再懸濁し、超音波処理により溶解す
る。抽出物を透明にし、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ活
性を測定する。ｐＲＲＳ ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
構築物をｐＲＭＦｓｅＲ２と命名する。プラスミドｐＲ
ＭＦｓｅＲ２を含む一つのＦｓｅＩ発現宿主を増殖さ
せ、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に使用す
る。
現：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅する
ためのＤＮＡプライマーを設計した。前進プライマー
は、ＢａｍＨＩクローニング部位、ｌａｃＺ遺伝子と結
合したフレーム内停止コドン、大腸菌認識強リボソーム
結合部位、リボソーム結合部位とＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼのＡＴＧ開始コドンとの間の７ヌクレオチドのス
ペーサー配列、第２番目の正しいトレオニンコドン、５
番目のロイシンに対するコドンの大腸菌優先コドンへの
変更、およびハイブリッド形成のためのＦｓｅＩＤＮＡ
配列と合致する２４個のヌクレオチドを有する。このプ
ライマーは、ＨｉｎｆＩ発現の例に従う（Skoglund, et
al., Gene 88:1-5 (1990)）。３’（逆向）プライマー
は、エンドヌクレアーゼ遺伝子のちょうど３’端でハイ
ブリッド形成し、メチラーゼクローンとのオーバーラッ
プを最小にする、すなわち宿主における２つのプラスミ
ド間の相同組換えの可能性を最小にするように設計す
る。ＢａｍＨＩ部位は、クローニングを容易にするため
にこのプライマーに導入する。エンドヌクレアーゼ遺伝
子は、ゲノムFrankia species ＤＮＡから増幅する。増
幅したＤＮＡは、ＢａｍＨＩで切断し、予めＢａｍＨＩ
で切断して脱リン酸化した発現ベクターｐＲＲＳに連結
し、連結体を、ｐＳＹＸ２０上にあるＮｌａＩメチラー
ゼで予め修飾した大腸菌ＥＲ２４２７などの適切な宿主
細胞内に形質転換する。所望の大きさの挿入物を含むベ
クターを、ｍｉｎｉｐｒｅｐ法で同定する。これらのク
ローンを対数増殖中期まで増殖し、０．５ｍＭのＩＰＴ
Ｇで誘発する。次いで、細胞を遠心により採取して、超
音波処理緩衝液に再懸濁し、超音波処理により溶解す
る。抽出物を透明にし、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ活
性を測定する。ｐＲＲＳ ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
構築物をｐＲＭＦｓｅＲ２と命名する。プラスミドｐＲ
ＭＦｓｅＲ２を含む一つのＦｓｅＩ発現宿主を増殖さ
せ、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの産生に使用す
る。
【００４５】１７．産生：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
は、過発現したＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
およびＮｌａＩメチラーゼ遺伝子またはＦｓｅＩメチラ
ーゼ遺伝子のいずれかを有する宿主細胞から、適切な抗
生物質選択および誘発剤を含む富栄養培地中で醗酵槽に
よる増殖によって産生させることができる。その後、細
胞を遠心によって採取し、超音波処理により破砕して、
ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出
物を産生する。
は、過発現したＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
およびＮｌａＩメチラーゼ遺伝子またはＦｓｅＩメチラ
ーゼ遺伝子のいずれかを有する宿主細胞から、適切な抗
生物質選択および誘発剤を含む富栄養培地中で醗酵槽に
よる増殖によって産生させることができる。その後、細
胞を遠心によって採取し、超音波処理により破砕して、
ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出
物を産生する。
【００４６】１８．精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
を含む粗細胞抽出物をアフィニティークロマトグラフィ
ーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な
蛋白質精製法の組み合わせにより精製する。
を含む粗細胞抽出物をアフィニティークロマトグラフィ
ーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な
蛋白質精製法の組み合わせにより精製する。
【００４７】上記で概説した工程は、本発明を実施する
ための好ましい態様を表すが、上記の方法は、公知の方
法に準じて変更することができることは、当業者であれ
ば明らかである。
ための好ましい態様を表すが、上記の方法は、公知の方
法に準じて変更することができることは、当業者であれ
ば明らかである。
【００４８】下記実施例により本発明の実施態様を説明
するが、下記実施例は、現在好ましく実施されるもので
ある。理解されるように、この実施例は説明のためのも
のであり、本発明は、特許請求の範囲で示した範囲を除
けば、この実施例に限定されるものではない。
するが、下記実施例は、現在好ましく実施されるもので
ある。理解されるように、この実施例は説明のためのも
のであり、本発明は、特許請求の範囲で示した範囲を除
けば、この実施例に限定されるものではない。
【００４９】なお、表１は、アミノ酸配列の一文字コー
ドの説明である。
ドの説明である。
【００５０】
【表１】
【００５１】実施例１ ＦｓｅＩ修飾メチラーゼおよび制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子のクローン化 １．ＤＮＡの精製：Frankia species のＤＮＡを得るた
めに、５ｇの細胞ペーストを、２０ｍｌの２５％ショ
糖、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）中で１０分間静かに攪拌することにより、再
懸濁した。１０ｍｌの０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）および新しく調製した６ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム／０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添
加し、その溶液を４℃で１６時間インキュベートした。
溶液を５０ｍｌの平衡化フェノールで抽出し、水相を回
収して、５０ｍｌのクロロホルムで２回抽出した。１／
１０容の５Ｍ−ＮａＣｌおよび１容の２−プロパノール
の添加によりＤＮＡを沈澱させ、遠心により集めた。Ｄ
ＮＡペレットを１時間風乾した後、１１ｍｌのＤＮＡ緩
衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０））に再懸濁した。１０ｇのＣｓＣｌをＤ
ＮＡ溶液に溶解し、０．５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌの臭化エ
チジウム水溶液を添加した。ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液を、
ベックマンＴｉ７０ローターで４４，０００ｒｐｍ、３
６時間遠心した。遠心の後、ＤＮＡバンドを１７ゲージ
の針で引き上げ、ＣｓＣｌ−水−飽和２−プロパノール
で４回抽出し、４容のＤＮＡ緩衝液で希釈し、等量の２
−プロパノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心によって集
め、７０％エタノールで２回洗浄し、風乾して２ｍｌの
ＤＮＡ緩衝液に再懸濁した。
遺伝子のクローン化 １．ＤＮＡの精製：Frankia species のＤＮＡを得るた
めに、５ｇの細胞ペーストを、２０ｍｌの２５％ショ
糖、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８．０）中で１０分間静かに攪拌することにより、再
懸濁した。１０ｍｌの０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）および新しく調製した６ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム／０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添
加し、その溶液を４℃で１６時間インキュベートした。
溶液を５０ｍｌの平衡化フェノールで抽出し、水相を回
収して、５０ｍｌのクロロホルムで２回抽出した。１／
１０容の５Ｍ−ＮａＣｌおよび１容の２−プロパノール
の添加によりＤＮＡを沈澱させ、遠心により集めた。Ｄ
ＮＡペレットを１時間風乾した後、１１ｍｌのＤＮＡ緩
衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０））に再懸濁した。１０ｇのＣｓＣｌをＤ
ＮＡ溶液に溶解し、０．５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌの臭化エ
チジウム水溶液を添加した。ＣｓＣｌ−ＤＮＡ溶液を、
ベックマンＴｉ７０ローターで４４，０００ｒｐｍ、３
６時間遠心した。遠心の後、ＤＮＡバンドを１７ゲージ
の針で引き上げ、ＣｓＣｌ−水−飽和２−プロパノール
で４回抽出し、４容のＤＮＡ緩衝液で希釈し、等量の２
−プロパノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心によって集
め、７０％エタノールで２回洗浄し、風乾して２ｍｌの
ＤＮＡ緩衝液に再懸濁した。
【００５２】２．Frankia species （ＮＲＲＬ１８５２
８）からのＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの精製：Fr
ankia species 細胞を富栄養ブロスを含むフラスコ中で
対数増殖中期まで増殖させることにより、ＦｓｅＩ制限
酵素をＮＲＲＬ１８５２８から産生させることができ
る。細胞は、遠心により採取する。続く操作は全て、氷
上または４℃で行った。２５ｇの細胞を５０ｍｌの緩衝
液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．
６）に再懸濁し、超音波処理により破砕した。抽出物を
３ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌの添加により０．２ＭのＮａＣ
ｌにし、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分遠心した。
上清を、０．２ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ（緩衝液
Ａ．２）で平衡化した１５ｍｌのヘパリン−セファロー
スカラムにロードした。カラムを４５ｍｌの緩衝液Ａ．
２で洗浄した後、６０ｍｌの緩衝液Ａ．２と１．０Ｍの
ＮａＣｌを含む６０ｍｌの緩衝液Ａとで形成されるＮａ
Ｃｌの直線勾配で洗浄した。３ｍｌづつの画分を集め
た。制限酵素活性のピークが、０．８および０．９Ｍ−
ＮａＣｌの間のカラムから溶離され、それをプールし
た。このヘパリン−セファロースプールを３容の緩衝液
Ａで希釈し、緩衝液Ａ．２中で平衡にした１ｍｌのホス
ホセルロースカラムにかけた。そのカラムを５ｍｌの緩
衝液Ａ．２で洗浄した後、緩衝液Ａ中の０．２ＭのＮａ
Ｃｌ→１．０ＭのＮａＣｌ４０ｍｌの直線勾配で洗浄し
た。制限酵素活性のピークが０．５ＭのＮａＣｌで溶離
され、プールした。ホスホセルロースのプールを Amico
n Centricon −１０微小濾過装置で０．５６ｍｌに濃縮
し、５ｍｌの緩衝液Ａで希釈した後、０．０５ＭのＮａ
Ｃｌを含む緩衝液Ａで平衡化した１ｍｌのＭｏｎｏ−Ｑ
カラム（Pharmacia ）にかけた。０．０５→０．６Ｍ−
ＮａＣｌの直線勾配の緩衝液Ａを使用すると、ＦｓｅＩ
活性が０．２ＭのＮａＣｌで溶離された。最も純粋なＦ
ｓｅＩを含むＭｏｎｏ−Ｑ画分を Amicon Centricon −
１０装置で濃縮した。しかし、この結果、９０％以上の
可溶性ＦｓｅＩ活性の損失があった。従って、Centrico
n −１０装置のフィルター膜を、０．０５ｍｌのＳＤＳ
−蛋白質−ゲルローディング緩衝液中で煮沸して上清を
回収し、 Matsudaira の方法（Matsudaira, P., J. Bio
l. Chem. 262:10035-10038, 1987）に前述した改良（Lo
oney, et al., Gene 80:193-208, (1989)）を加えて、
電気泳動および電気ブロット法にかけた。膜をクーマシ
ーブルーＲ−２５０で染色し、約２８ｋＤの蛋白質のバ
ンドを切り取って逐次分解を行った（Waite-Rees et a
l., J. Bacteriol. 173:5207-5219, (1991)）。
８）からのＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの精製：Fr
ankia species 細胞を富栄養ブロスを含むフラスコ中で
対数増殖中期まで増殖させることにより、ＦｓｅＩ制限
酵素をＮＲＲＬ１８５２８から産生させることができ
る。細胞は、遠心により採取する。続く操作は全て、氷
上または４℃で行った。２５ｇの細胞を５０ｍｌの緩衝
液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．
６）に再懸濁し、超音波処理により破砕した。抽出物を
３ｍｌの５Ｍ−ＮａＣｌの添加により０．２ＭのＮａＣ
ｌにし、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分遠心した。
上清を、０．２ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ（緩衝液
Ａ．２）で平衡化した１５ｍｌのヘパリン−セファロー
スカラムにロードした。カラムを４５ｍｌの緩衝液Ａ．
２で洗浄した後、６０ｍｌの緩衝液Ａ．２と１．０Ｍの
ＮａＣｌを含む６０ｍｌの緩衝液Ａとで形成されるＮａ
Ｃｌの直線勾配で洗浄した。３ｍｌづつの画分を集め
た。制限酵素活性のピークが、０．８および０．９Ｍ−
ＮａＣｌの間のカラムから溶離され、それをプールし
た。このヘパリン−セファロースプールを３容の緩衝液
Ａで希釈し、緩衝液Ａ．２中で平衡にした１ｍｌのホス
ホセルロースカラムにかけた。そのカラムを５ｍｌの緩
衝液Ａ．２で洗浄した後、緩衝液Ａ中の０．２ＭのＮａ
Ｃｌ→１．０ＭのＮａＣｌ４０ｍｌの直線勾配で洗浄し
た。制限酵素活性のピークが０．５ＭのＮａＣｌで溶離
され、プールした。ホスホセルロースのプールを Amico
n Centricon −１０微小濾過装置で０．５６ｍｌに濃縮
し、５ｍｌの緩衝液Ａで希釈した後、０．０５ＭのＮａ
Ｃｌを含む緩衝液Ａで平衡化した１ｍｌのＭｏｎｏ−Ｑ
カラム（Pharmacia ）にかけた。０．０５→０．６Ｍ−
ＮａＣｌの直線勾配の緩衝液Ａを使用すると、ＦｓｅＩ
活性が０．２ＭのＮａＣｌで溶離された。最も純粋なＦ
ｓｅＩを含むＭｏｎｏ−Ｑ画分を Amicon Centricon −
１０装置で濃縮した。しかし、この結果、９０％以上の
可溶性ＦｓｅＩ活性の損失があった。従って、Centrico
n −１０装置のフィルター膜を、０．０５ｍｌのＳＤＳ
−蛋白質−ゲルローディング緩衝液中で煮沸して上清を
回収し、 Matsudaira の方法（Matsudaira, P., J. Bio
l. Chem. 262:10035-10038, 1987）に前述した改良（Lo
oney, et al., Gene 80:193-208, (1989)）を加えて、
電気泳動および電気ブロット法にかけた。膜をクーマシ
ーブルーＲ−２５０で染色し、約２８ｋＤの蛋白質のバ
ンドを切り取って逐次分解を行った（Waite-Rees et a
l., J. Bacteriol. 173:5207-5219, (1991)）。
【００５３】３．アミノ末端ＦｓｅＩ蛋白質の配列：得
られた約２８ｋＤの蛋白質のバンドをApplied Biosyste
ms Model 470A 気相蛋白質配列分析器でのアミノ末端蛋
白質配列分析にかけた（Brooks, et al., Nucleic Acid
s Research, 17:979-997,(1989) ）。得られた最初の２
３個の残基の配列は、ＨＤＥＬＦＰＩＰＥＰＬＶＸＰＶ
ＩＡＬＰＰＬＬＫ（配列番号１）であった。ＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼのアミノ末端から得られるこのペプチ
ド配列データを使用して一連のＰＣＲプライマーを構築
した。
られた約２８ｋＤの蛋白質のバンドをApplied Biosyste
ms Model 470A 気相蛋白質配列分析器でのアミノ末端蛋
白質配列分析にかけた（Brooks, et al., Nucleic Acid
s Research, 17:979-997,(1989) ）。得られた最初の２
３個の残基の配列は、ＨＤＥＬＦＰＩＰＥＰＬＶＸＰＶ
ＩＡＬＰＰＬＬＫ（配列番号１）であった。ＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼのアミノ末端から得られるこのペプチ
ド配列データを使用して一連のＰＣＲプライマーを構築
した。
【００５４】１）ＴＴＹ ＣＣＮ ＡＴＨ ＣＣＮ Ｇ
ＡＲ ＣＣ １７−マー（配列番号２）； ２）ＧＡＧ ＣＴＳ ＴＴＣ ＣＣＳ ＡＴＣ ＣＣＮ
ＧＡＲ ＣＣ ２３−マー（配列番号３）； ３）ＣＣＳ ＧＴＳ ＡＴＣ ＧＣＳ ＣＴＳ ＣＣＳ
ＣＣ ２０−マー（配列番号４）； ４）ＧＧＣ ＴＣＳ ＧＧＧ ＡＴＳ ＧＧＲ ＡＡＮ
ＡＧＹ ＴＣ ２３−マー（配列番号５）； ５）ＧＧＣ ＴＣＳ ＧＧＧ ＡＴＳ ＧＧＲ ＡＡＹ
ＡＡＹ ＴＣ ２３−マー（配列番号６）； ［式中、Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｈ＝Ａ，Ｔ，Ｃ；Ｓ
＝Ｇ，Ｃ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔである。］ プライマー１、２および３は前進プライマー、すなわち
コーディング鎖プライマーであり、４および５は逆向プ
ライマー、すなわち非コーディング鎖プライマーであ
る。
ＡＲ ＣＣ １７−マー（配列番号２）； ２）ＧＡＧ ＣＴＳ ＴＴＣ ＣＣＳ ＡＴＣ ＣＣＮ
ＧＡＲ ＣＣ ２３−マー（配列番号３）； ３）ＣＣＳ ＧＴＳ ＡＴＣ ＧＣＳ ＣＴＳ ＣＣＳ
ＣＣ ２０−マー（配列番号４）； ４）ＧＧＣ ＴＣＳ ＧＧＧ ＡＴＳ ＧＧＲ ＡＡＮ
ＡＧＹ ＴＣ ２３−マー（配列番号５）； ５）ＧＧＣ ＴＣＳ ＧＧＧ ＡＴＳ ＧＧＲ ＡＡＹ
ＡＡＹ ＴＣ ２３−マー（配列番号６）； ［式中、Ｙ＝Ｔ，Ｃ；Ｒ＝Ａ，Ｇ；Ｈ＝Ａ，Ｔ，Ｃ；Ｓ
＝Ｇ，Ｃ；Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔである。］ プライマー１、２および３は前進プライマー、すなわち
コーディング鎖プライマーであり、４および５は逆向プ
ライマー、すなわち非コーディング鎖プライマーであ
る。
【００５５】４．シトシンメチラーゼ保存配列に合致す
るプライマー：多くのシトシンメチラーゼ遺伝子のアミ
ノ酸配列が決定され、比較されている（Wilson, Method
s in Enzymology, 216:259-279, (1992)）。シトシンメ
チル化は、２つの型に区別される。シトシン環の５位の
炭素（Ｃ５）におけるメチル化と４位の窒素（Ｎ４）に
おけるメチル化である。Ｎ４型は、αおよびβの２種類
で現れる。それらは、同じモチーフを有するが、モチー
フの順序が異なる。シトシンメチラーゼの各タイプの保
存配列モチーフのいくつかとハイブリッド形成させるた
めに、縮重ＤＮＡプライマーを設計した。以下に示す、
いくつかの前進（コード化）方向のプライマーおよびい
くつかの逆方向のプライマーである。
るプライマー：多くのシトシンメチラーゼ遺伝子のアミ
ノ酸配列が決定され、比較されている（Wilson, Method
s in Enzymology, 216:259-279, (1992)）。シトシンメ
チル化は、２つの型に区別される。シトシン環の５位の
炭素（Ｃ５）におけるメチル化と４位の窒素（Ｎ４）に
おけるメチル化である。Ｎ４型は、αおよびβの２種類
で現れる。それらは、同じモチーフを有するが、モチー
フの順序が異なる。シトシンメチラーゼの各タイプの保
存配列モチーフのいくつかとハイブリッド形成させるた
めに、縮重ＤＮＡプライマーを設計した。以下に示す、
いくつかの前進（コード化）方向のプライマーおよびい
くつかの逆方向のプライマーである。
【００５６】Ａ．５−メチル−シトシン ５’ＴＴＣ ＧＣＮ ＧＧＮ ＡＴＨ ＧＧＮ ＧＧ
３’（配列番号７），モチーフ１：ＦＡＧＩＧＧ（配列
番号３７） ５’ＴＴＣ ＴＣＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＧＮ ＧＧ
３’（配列番号８），モチーフ１：ＦＳＧＡＧＧ（配列
番号３８） ５’ＴＴＹ ＴＣＮ ＧＧＮ ＴＧＹ ＧＧＮ ＧＧ
３’（配列番号９），モチーフ１：ＦＳＧＣＧＧ（配列
番号３９） ５’ＧＣＮ ＧＧＮ ＴＴＹ ＣＣＮ ＴＧＹ ＣＡ
３’（配列番号１０），モチーフ４：ＡＧＦＰＣＱ（配
列番号４０） ５’ＧＧＳ ＧＧＮ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＧＹ ＣＡ
３’（配列番号１１），モチーフ４：ＧＧＰＰＣＱ（配
列番号４１） ５’ＴＧ ＲＣＡ ＮＧＧ ＲＡＡ ＮＣＣ ＮＧＣ
３’（配列番号１２），モチーフ４：ＡＧＦＰＣＱ（配
列番号４２） ５’ＴＧ ＲＣＡ ＮＧＧ ＮＧＧ ＮＣＣ ３’（配
列番号１３），モチーフ４：ＧＰＰＣＱ（配列番号４
３） ５’ＣＣ ＹＴＴ ＮＡＣ ＲＴＴ ＹＴＣ ３’（配
列番号１４），モチーフ６：ＥＮＶＫＧ（配列番号４
４） ５’ＡＲ ＮＣＣ ＹＴＴ ＮＡＣ ＲＴＴ ＹＴＣ
３’（配列番号１５），モチーフ６：ＥＮＶＫＧＸ（Ｘ
＝ロイシン／フェニルアラニン（配列番号４５）） ５’ＡＣ ＳＧＧ ＳＡＣ ＳＧＣ ＧＴＴ ＳＣＣ
３’（配列番号１６），モチーフ１０：ＧＮＡＶＰＶ
（配列番号４６） Ｂ．Ｎ−４シトシンメチラーゼ 型 ５’ＧＧＮ ＴＣＮ ＧＧＮ ＡＣ ３’（配列番号１
７），モチーフ１：ＧＳＧＴ（配列番号４７） ５’ＴＡ ＮＧＧ ＮＧＧ ＮＧＡ ３’（配列番号１
８），モチーフ４：ＳＰＰＹ（配列番号４８） Ｃ．Ｎ−４シトシンメチラーゼ 型 ５’ＡＣＮ ＴＣＮ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＡ ３’（配
列番号１９），モチーフ４：ＴＳＰＰＹ（配列番号４
９） ５’ＡＣＮ ＡＧＹ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＡ ３’（配
列番号２０），モチーフ４：ＴＳＰＰＹ（配列番号４
９） ５’ＴＣＮ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＡＹ ＴＧＧ ３’
（配列番号２１），モチーフ４：ＳＰＰＹＷ（配列番号
５０） ５’ＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ＮＡＧ ＮＡＣ ３’（配
列番号２２），モチーフ１：ＶＬＤＰＦ（配列番号５
１） ５’ＧＴ ＮＧＴ ＮＣＣ ＮＧＡ ＮＣＣ ３’（配
列番号２３），モチーフ１：ＧＳＧＴＴ（配列番号５
２） ５’ＣＣ ＣＡＴ ＲＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ３’（配
列番号２４），モチーフ１：ＤＰＦＭＧ（配列番号５
３） ５’ＣＣ ＲＡＡ ＲＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ３’（配
列番号２５），モチーフ１：ＤＰＦＦＧ（配列番号５
４） ５’ＣＣ ＮＧＣ ＲＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ３’（配
列番号２６），モチーフ１：ＤＰＦＡＧ（配列番号５
５） ５．工程４のシトシンメチラーゼプライマーおよび工程
３のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端領域
に相補的なプライマーの種々の組み合わをＰＣＲ法で使
用して、エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の
一部を増幅する。典型的な反応では、親反応混合物を、
テストする一つのプライマーを含むように調製し、それ
をアリコートに分けてもう一つのプライマーを添加す
る。ＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼの一
部の増幅が成功した反応では、親反応混合物を、４０μ
ｌの１０ｘ Ｖｅｎｔ（登録商標）反応緩衝液、３０μ
ｌの４ｍＭ ｄＮＴＰ溶液、４μｌ（８００ｎｇ）のFr
ankia species ＤＮＡ、２０μｌ（１０μＭのストッ
ク）の上記配列番号２のプライマー（ＦｓｅＩエンドヌ
クレアーゼＮ−末端プライマー）、２８６μｌのｄＨ2
Ｏ、４μｌのＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ
（２５単位／μｌストック）および４μｌのＤｅｅｐ
Ｖｅｎｔポリメラーゼ（０．０２単位／μｌストック）
を混合して作った。
３’（配列番号７），モチーフ１：ＦＡＧＩＧＧ（配列
番号３７） ５’ＴＴＣ ＴＣＮ ＧＧＮ ＧＣＮ ＧＧＮ ＧＧ
３’（配列番号８），モチーフ１：ＦＳＧＡＧＧ（配列
番号３８） ５’ＴＴＹ ＴＣＮ ＧＧＮ ＴＧＹ ＧＧＮ ＧＧ
３’（配列番号９），モチーフ１：ＦＳＧＣＧＧ（配列
番号３９） ５’ＧＣＮ ＧＧＮ ＴＴＹ ＣＣＮ ＴＧＹ ＣＡ
３’（配列番号１０），モチーフ４：ＡＧＦＰＣＱ（配
列番号４０） ５’ＧＧＳ ＧＧＮ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＧＹ ＣＡ
３’（配列番号１１），モチーフ４：ＧＧＰＰＣＱ（配
列番号４１） ５’ＴＧ ＲＣＡ ＮＧＧ ＲＡＡ ＮＣＣ ＮＧＣ
３’（配列番号１２），モチーフ４：ＡＧＦＰＣＱ（配
列番号４２） ５’ＴＧ ＲＣＡ ＮＧＧ ＮＧＧ ＮＣＣ ３’（配
列番号１３），モチーフ４：ＧＰＰＣＱ（配列番号４
３） ５’ＣＣ ＹＴＴ ＮＡＣ ＲＴＴ ＹＴＣ ３’（配
列番号１４），モチーフ６：ＥＮＶＫＧ（配列番号４
４） ５’ＡＲ ＮＣＣ ＹＴＴ ＮＡＣ ＲＴＴ ＹＴＣ
３’（配列番号１５），モチーフ６：ＥＮＶＫＧＸ（Ｘ
＝ロイシン／フェニルアラニン（配列番号４５）） ５’ＡＣ ＳＧＧ ＳＡＣ ＳＧＣ ＧＴＴ ＳＣＣ
３’（配列番号１６），モチーフ１０：ＧＮＡＶＰＶ
（配列番号４６） Ｂ．Ｎ−４シトシンメチラーゼ 型 ５’ＧＧＮ ＴＣＮ ＧＧＮ ＡＣ ３’（配列番号１
７），モチーフ１：ＧＳＧＴ（配列番号４７） ５’ＴＡ ＮＧＧ ＮＧＧ ＮＧＡ ３’（配列番号１
８），モチーフ４：ＳＰＰＹ（配列番号４８） Ｃ．Ｎ−４シトシンメチラーゼ 型 ５’ＡＣＮ ＴＣＮ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＡ ３’（配
列番号１９），モチーフ４：ＴＳＰＰＹ（配列番号４
９） ５’ＡＣＮ ＡＧＹ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＡ ３’（配
列番号２０），モチーフ４：ＴＳＰＰＹ（配列番号４
９） ５’ＴＣＮ ＣＣＮ ＣＣＮ ＴＡＹ ＴＧＧ ３’
（配列番号２１），モチーフ４：ＳＰＰＹＷ（配列番号
５０） ５’ＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ＮＡＧ ＮＡＣ ３’（配
列番号２２），モチーフ１：ＶＬＤＰＦ（配列番号５
１） ５’ＧＴ ＮＧＴ ＮＣＣ ＮＧＡ ＮＣＣ ３’（配
列番号２３），モチーフ１：ＧＳＧＴＴ（配列番号５
２） ５’ＣＣ ＣＡＴ ＲＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ３’（配
列番号２４），モチーフ１：ＤＰＦＭＧ（配列番号５
３） ５’ＣＣ ＲＡＡ ＲＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ３’（配
列番号２５），モチーフ１：ＤＰＦＦＧ（配列番号５
４） ５’ＣＣ ＮＧＣ ＲＡＡ ＮＧＧ ＲＴＣ ３’（配
列番号２６），モチーフ１：ＤＰＦＡＧ（配列番号５
５） ５．工程４のシトシンメチラーゼプライマーおよび工程
３のＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−末端領域
に相補的なプライマーの種々の組み合わをＰＣＲ法で使
用して、エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の
一部を増幅する。典型的な反応では、親反応混合物を、
テストする一つのプライマーを含むように調製し、それ
をアリコートに分けてもう一つのプライマーを添加す
る。ＦｓｅＩメチラーゼおよびエンドヌクレアーゼの一
部の増幅が成功した反応では、親反応混合物を、４０μ
ｌの１０ｘ Ｖｅｎｔ（登録商標）反応緩衝液、３０μ
ｌの４ｍＭ ｄＮＴＰ溶液、４μｌ（８００ｎｇ）のFr
ankia species ＤＮＡ、２０μｌ（１０μＭのストッ
ク）の上記配列番号２のプライマー（ＦｓｅＩエンドヌ
クレアーゼＮ−末端プライマー）、２８６μｌのｄＨ2
Ｏ、４μｌのＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ
（２５単位／μｌストック）および４μｌのＤｅｅｐ
Ｖｅｎｔポリメラーゼ（０．０２単位／μｌストック）
を混合して作った。
【００５７】次いで、その混合物を８個の４７．５μｌ
アリコートに分けた。プライマー配列番号８、配列番号
１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１５および配列番号１６を使用して、第１のアリ
コートには２．５μｌのプライマー配列番号８（１０μ
Ｍのストック）を添加し、第２には２．５μｌのプライ
マー配列番号１０（１０μＭのストック）を添加し、以
下同様に添加した。第８のアリコートには、コントロー
ル反応として２．５μｌのｄＨ2 Ｏを添加した。ＰＣＲ
増幅条件は、９４℃で３分間を１サイクル、続いて、９
５℃で３０秒間、４６℃で３０秒間および７２℃で２分
間を２５サイクルとした。１５μｌのＰＣＲ反応生成物
を、１％アガロースゲル上での電気泳動により分析し
た。プライマー配列番号８および配列番号１６を有する
反応物では、種々の第二のプライマーにより多重バンド
が認められた。プライマー配列番号２および配列番号１
１を有する反応物では、約１．５ｋｂの顕著なバンドが
認められた。プライマー配列番号２および配列番号１０
では、同じ大きさで強度の弱い生成物が認められ、プラ
イマー配列番号２および配列番号８では、約１．６５ｋ
ｂの中位の強度のバンドが認められた。これらの大きさ
の生成物は、相近遺伝子配向に対する予想と一致する。
アリコートに分けた。プライマー配列番号８、配列番号
１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配
列番号１５および配列番号１６を使用して、第１のアリ
コートには２．５μｌのプライマー配列番号８（１０μ
Ｍのストック）を添加し、第２には２．５μｌのプライ
マー配列番号１０（１０μＭのストック）を添加し、以
下同様に添加した。第８のアリコートには、コントロー
ル反応として２．５μｌのｄＨ2 Ｏを添加した。ＰＣＲ
増幅条件は、９４℃で３分間を１サイクル、続いて、９
５℃で３０秒間、４６℃で３０秒間および７２℃で２分
間を２５サイクルとした。１５μｌのＰＣＲ反応生成物
を、１％アガロースゲル上での電気泳動により分析し
た。プライマー配列番号８および配列番号１６を有する
反応物では、種々の第二のプライマーにより多重バンド
が認められた。プライマー配列番号２および配列番号１
１を有する反応物では、約１．５ｋｂの顕著なバンドが
認められた。プライマー配列番号２および配列番号１０
では、同じ大きさで強度の弱い生成物が認められ、プラ
イマー配列番号２および配列番号８では、約１．６５ｋ
ｂの中位の強度のバンドが認められた。これらの大きさ
の生成物は、相近遺伝子配向に対する予想と一致する。
【００５８】これらの生成物がＦｓｅＩメチラーゼおよ
びエンドヌクレアーゼに由来するかどうかのテストとし
て、プライマー配列番号２および配列番号８の１．６５
ｋｂの生成物をゲル精製し、ＰＣＲ鋳型として使用し
た。ゲル精製：配列番号２および配列番号８のＰＣＲ反
応物３０μｌを１％ＬＭＰアガロースで電気泳動し、
１．６５ｋｂのバンドをゲルから切り取り、６５℃で５
分間溶融して５分間４０℃に冷却し、アガロースを１μ
ｌ（１ｕ）のβ−アガロース（New England Biolabs #3
92）の添加により消化し、４０℃で１時間インキュベー
トした。ＤＮＡを沈澱により回収し、７０％エタノール
で洗浄して風乾し、ＤＮＡ緩衝液に再懸濁した。ＰＣＲ
反応を上記と同じ条件を使用し、次のプライマーの組み
合わせにより行った。配列番号８のみの場合は１．６５
ｋｂとは異なる大きさで弱いバンドが６本得られ、プラ
イマー配列番号２のみの場合は生成物は得られず、プラ
イマー配列番号２および配列番号８の場合は顕著な１．
６５ｋｂのバンドが得られ、プライマー配列番号２およ
び配列番号１１（内部５−メチルシトシンメチラーゼプ
ライマー）の場合は顕著な１．５ｋｂのバンドが得ら
れ、これらのバンドはＦｒａｎｋｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ
ＤＮＡに由来するものであり、プライマー配列番号４
（内部ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマ
ー）および配列番号１１の場合は、約１．４５ｋｂの顕
著なバンドが得られた。これらの結果は、最初に得られ
た１．６５ｋｂの生成物および１．５ｋｂの生成物が恐
らくＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝
子に由来することを示した。１．６５ｋｂおよび１．５
ｋｂの生成物は、上記と同様にゲル精製し、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでを作用させ、予めＳｍａＩで切断
して牛の腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化したｐ
ＵＣ１９ベクターに連結した。次いで、連結混合物を大
腸菌株ＥＲ２４２０に形質転換し、個々のコロニーに対
して１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス
プレート上で平板培養した。所望の構築物のクローンの
同定を、ｍｉｎｉｐｒｅｐを行い、精製ＤＮＡを消化
し、アガロースゲル電気泳動により分析することにより
行った。
びエンドヌクレアーゼに由来するかどうかのテストとし
て、プライマー配列番号２および配列番号８の１．６５
ｋｂの生成物をゲル精製し、ＰＣＲ鋳型として使用し
た。ゲル精製：配列番号２および配列番号８のＰＣＲ反
応物３０μｌを１％ＬＭＰアガロースで電気泳動し、
１．６５ｋｂのバンドをゲルから切り取り、６５℃で５
分間溶融して５分間４０℃に冷却し、アガロースを１μ
ｌ（１ｕ）のβ−アガロース（New England Biolabs #3
92）の添加により消化し、４０℃で１時間インキュベー
トした。ＤＮＡを沈澱により回収し、７０％エタノール
で洗浄して風乾し、ＤＮＡ緩衝液に再懸濁した。ＰＣＲ
反応を上記と同じ条件を使用し、次のプライマーの組み
合わせにより行った。配列番号８のみの場合は１．６５
ｋｂとは異なる大きさで弱いバンドが６本得られ、プラ
イマー配列番号２のみの場合は生成物は得られず、プラ
イマー配列番号２および配列番号８の場合は顕著な１．
６５ｋｂのバンドが得られ、プライマー配列番号２およ
び配列番号１１（内部５−メチルシトシンメチラーゼプ
ライマー）の場合は顕著な１．５ｋｂのバンドが得ら
れ、これらのバンドはＦｒａｎｋｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ
ＤＮＡに由来するものであり、プライマー配列番号４
（内部ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼＮ−末端プライマ
ー）および配列番号１１の場合は、約１．４５ｋｂの顕
著なバンドが得られた。これらの結果は、最初に得られ
た１．６５ｋｂの生成物および１．５ｋｂの生成物が恐
らくＦｓｅＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝
子に由来することを示した。１．６５ｋｂおよび１．５
ｋｂの生成物は、上記と同様にゲル精製し、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼでを作用させ、予めＳｍａＩで切断
して牛の腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化したｐ
ＵＣ１９ベクターに連結した。次いで、連結混合物を大
腸菌株ＥＲ２４２０に形質転換し、個々のコロニーに対
して１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−ブロス
プレート上で平板培養した。所望の構築物のクローンの
同定を、ｍｉｎｉｐｒｅｐを行い、精製ＤＮＡを消化
し、アガロースゲル電気泳動により分析することにより
行った。
【００５９】プラスミドクローンの分析：個々の形質転
換体を、アンピシリンを含む１０ｍｌのＬ−ブロスに接
種し、それに含まれるプラスミドを、BirnboinとDolyの
方法（Nucleic Acids Res. 7:1513, (1979) ）から採用
した下記のｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド精製法により得
た。
換体を、アンピシリンを含む１０ｍｌのＬ−ブロスに接
種し、それに含まれるプラスミドを、BirnboinとDolyの
方法（Nucleic Acids Res. 7:1513, (1979) ）から採用
した下記のｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミド精製法により得
た。
【００６０】ｍｉｎｉｐｒｅｐ法：各培養液を８０００
ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨てて、細胞ペレット
を、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１．０ｍｌの２５
ｍＭトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのグルコー
ス，ｐＨ８．０に再懸濁した。室温で１０分後、２．０
ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを各チューブに
添加し、そのチューブを攪拌して細胞を溶解した後、氷
上に置いた。溶液がいったん透明になったら、３Ｍの酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを各チューブに
添加して攪拌した。生成した沈澱を１５，０００ｒｐ
ｍ、４℃で１０分間回転沈降させた。各上清を３ｍｌの
イソプロパノールを含む遠心管に注入して混合した。室
温で１０分後、そのチューブを１５，０００ｒｐｍで１
０分間回転させて、沈澱した核酸をペレット化した。上
清を捨ててペレットを室温で３０分間風乾した。乾燥し
たら、ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む５
００μｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ−ＥＤ
ＴＡに溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮ
Ａを消化した。ＤＮＡを、５０μｌの５Ｍ−ＮａＣｌ、
次いで３５０μｌのイソプロパノールを添加することに
より沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを５分間遠心
することにより回転沈降させ、上清を捨ててペレットを
乾燥させた後、１５０μｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭ−
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の最終溶液に再溶解した。次い
で、プラスミドのｍｉｎｉｐｒｅｐを、種々の制限エン
ドヌクレアーゼによる消化により分析した。
ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨てて、細胞ペレット
を、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１．０ｍｌの２５
ｍＭトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのグルコー
ス，ｐＨ８．０に再懸濁した。室温で１０分後、２．０
ｍｌの０．２Ｍ−ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを各チューブに
添加し、そのチューブを攪拌して細胞を溶解した後、氷
上に置いた。溶液がいったん透明になったら、３Ｍの酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを各チューブに
添加して攪拌した。生成した沈澱を１５，０００ｒｐ
ｍ、４℃で１０分間回転沈降させた。各上清を３ｍｌの
イソプロパノールを含む遠心管に注入して混合した。室
温で１０分後、そのチューブを１５，０００ｒｐｍで１
０分間回転させて、沈澱した核酸をペレット化した。上
清を捨ててペレットを室温で３０分間風乾した。乾燥し
たら、ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む５
００μｌの１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭ−ＥＤ
ＴＡに溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮ
Ａを消化した。ＤＮＡを、５０μｌの５Ｍ−ＮａＣｌ、
次いで３５０μｌのイソプロパノールを添加することに
より沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを５分間遠心
することにより回転沈降させ、上清を捨ててペレットを
乾燥させた後、１５０μｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭ−
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の最終溶液に再溶解した。次い
で、プラスミドのｍｉｎｉｐｒｅｐを、種々の制限エン
ドヌクレアーゼによる消化により分析した。
【００６１】６．ＤＮＡ配列：ＤＮＡ配列分析を、Circ
umvent（登録商標）ＤＮＡ配列分析キット（New Englan
d Biolabs ）を使用し、製造者の指示に従って行った。
ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ調製物を鋳型として使用し
た。そのＤＮＡ配列は、続く操作で制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子全体をクローン化し、クローン化した遺伝子
を大腸菌で発現させるためのベースとして使用するデー
タとなった。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂの両方のＰ
ＣＲ産物の一端におけるＤＮＡ配列から推定されるアミ
ノ酸配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−
末端の蛋白質配列と密接に一致した。このＤＮＡ配列
は、５’ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＡＧ Ｃ
ＣＡ ＴＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＴ
Ｃ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＴＧ
ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ３’（配列番号２
７）であり、これをアミノ酸配列に翻訳すると、ＦＰＩ
ＰＥＰＬＶＲＰＶＩＡＬＰＰＨＬＫＥＬＩ（配列番号２
８）であることが分かった。ここで、下線のアミノ酸
は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配
列データの結果と一致する。１．６５ｋｂの増幅産物の
他端におけるＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列
は、５−メチルシトシンメチラーゼの保存モチーフ１お
よび４を含んでおり、ＤＮＡ配列は、５’ＴＴＣ ＴＧ
Ｔ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＴＧ ＡＣＧ
ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＡ
ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＡＴＴ ＣＴＧ Ｔ
ＣＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＣ
Ａ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＡＴ ＣＧＣ
ＧＣＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＴＧ
ＴＣＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＧＡＣ ＡＴＴ Ｃ
ＧＣ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＣ
Ｔ ＴＣＣ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＴＣ
ＧＧＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＡＧ
ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＧＴ ＣＴＧ ＧＧＴ
３’（配列番号２９）であり、これをアミノ酸配列に翻
訳すると、ＦＣＧＡＧＧＭＴＬＧＦＭＱＡＧＦＱＰＩＬ
ＳＩＤＨＤＬＰＳＩＥＴＨＲＡＮＦＰＧＭＳＩＣＴＤＩ
ＲＤＦＶＤＦＰＳＡＤＶＶＶＧＧＰＣＱＧＦＳＲＬＧ
（配列番号３０）であった。
umvent（登録商標）ＤＮＡ配列分析キット（New Englan
d Biolabs ）を使用し、製造者の指示に従って行った。
ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ調製物を鋳型として使用し
た。そのＤＮＡ配列は、続く操作で制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子全体をクローン化し、クローン化した遺伝子
を大腸菌で発現させるためのベースとして使用するデー
タとなった。１．６５ｋｂおよび１．５ｋｂの両方のＰ
ＣＲ産物の一端におけるＤＮＡ配列から推定されるアミ
ノ酸配列は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ−
末端の蛋白質配列と密接に一致した。このＤＮＡ配列
は、５’ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＡＧ Ｃ
ＣＡ ＴＴＧ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＴＣ ＡＴ
Ｃ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＣＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＴＧ
ＡＡＧ ＧＡＡ ＴＴＧ ＡＴＣ ３’（配列番号２
７）であり、これをアミノ酸配列に翻訳すると、ＦＰＩ
ＰＥＰＬＶＲＰＶＩＡＬＰＰＨＬＫＥＬＩ（配列番号２
８）であることが分かった。ここで、下線のアミノ酸
は、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配
列データの結果と一致する。１．６５ｋｂの増幅産物の
他端におけるＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列
は、５−メチルシトシンメチラーゼの保存モチーフ１お
よび４を含んでおり、ＤＮＡ配列は、５’ＴＴＣ ＴＧ
Ｔ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＴＧ ＡＣＧ
ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＡ
ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＡＴＴ ＣＴＧ Ｔ
ＣＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＣＡＴ ＧＡＣ ＣＴＴ ＣＣ
Ａ ＴＣＴ ＡＴＣ ＧＡＧ ＡＣＧ ＣＡＴ ＣＧＣ
ＧＣＡ ＡＡＣ ＴＴＣ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＴＧ
ＴＣＧ ＡＴＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＧＡＣ ＡＴＴ Ｃ
ＧＣ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＣ
Ｔ ＴＣＣ ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＴＣ ＧＴＣ
ＧＧＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＡＧ
ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＧＴ ＣＧＴ ＣＴＧ ＧＧＴ
３’（配列番号２９）であり、これをアミノ酸配列に翻
訳すると、ＦＣＧＡＧＧＭＴＬＧＦＭＱＡＧＦＱＰＩＬ
ＳＩＤＨＤＬＰＳＩＥＴＨＲＡＮＦＰＧＭＳＩＣＴＤＩ
ＲＤＦＶＤＦＰＳＡＤＶＶＶＧＧＰＣＱＧＦＳＲＬＧ
（配列番号３０）であった。
【００６２】７．ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの過発
現：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクタ
ーｐＡＩＩ１７の誘発プロモーター（Ｔ７）のすぐ下流
に挿入することによって過発現させると、リボソーム結
合部位が強く認識された。これを達成するために、二つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡおよび蛋白
質配列データを使用して作った。前進オリゴヌクレオチ
ドプライマーは、エンドヌクレアーゼのＡＴＧ開始コド
ンにＮｄｅＩクローニング部位を作る配列を含み、続い
て、蛋白質配列によって示される第２、第３、第４およ
び第５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含み（コドン
の選択は、発現の高い遺伝子の最も普通に使用される大
腸菌コドンに合致するように行った。）、続いて、１．
６５ｋｂ増幅産物から得られるＤＮＡ配列に相補的な２
１個の塩基を含んでいた。すなわち、５’ＧＧＡ ＧＧ
Ｔ ＴＡＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＡＡ
ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＡＧ
ＣＣＡ ＴＴＧ ３’（配列番号３１）（ＣＡＴ ＡＴ
ＧはＮｄｅＩクローニング部位であり、下線は最初の５
個のアミノ酸コドンである。）である。第二のオリゴヌ
クレオチドプライマーは、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の３’端に約８００ヌクレオチドの配列を含み、
一度増幅されたフラグメントのクローニングを促進する
ためのＳａｌＩ部位を作るように１個のヌクレオチドを
変化させた。すなわち、５’ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＴＣ
ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ
３’（配列番号３２）（下線がＳａｌＩ部位である。）
である。これら二つのプライマーを、Vent ＤＮＡポリ
メラーゼを使用するＰＣＲ反応において、鋳型としての
ゲノムFrankia speciesＤＮＡとともに使用して、Ｆｓ
ｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを増幅させた。バンドを上記と同様にゲ
ル精製した。精製したＤＮＡを２０ＵのＮｄｅＩおよび
２０ＵのＳａｌＩ／１ｘＮＥ緩衝液３で１時間消化し
た。インキュベートした後、消化物をフェノール：クロ
ロホルムの１：１混合物で１回、クロロホルムで２回抽
出し、２容のエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心に
よりペレット化し、７０％エタノールで１回洗浄し、脱
水して２０μｌのＴＥに再懸濁した。精製したフラグメ
ントの３μｌ（約０．０５μｇ）を、１７℃で４時間、
４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼとともに全体積２０μｌ
でＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（約０．０５μｇ）で消化し
たＴ７発現ベクターｐＡＩＩ１７（S. Xu, New England
Biolabs製）に連結した。〔ｐＡＩＩ１７は、Ｔ７プロ
モータの４ｂｐ下流のｌａｃオペレーター（Ｔ７ｌａｃ
という。）、ｌａｃＩq 遺伝子、アンピシリン耐性およ
びクローニング用の二つの制限部位ＮｄｅＩおよびＳａ
ｌＩ（ＳａｌＩはＢａｍＨＩの代わりである。）を含む
ｐＢＲ３２２由来のＴ７発現ベクターである。ｐＡＩＩ
１７はまた、標的遺伝子の発現の基底レベルをさらに低
下させるために、Ｔ７プロモーターの上流にｒｒｎＢ転
写終結因子の４個のコピーを含む。（ｐａＩＩ１７は、
W. JackがNew England BiolabsでｐＥＴ−１ｌａから
構築した。）（Dubendorff, J. W.and Studier, F. W.,
J. Mol. Biol. 219:45-59, (1991) ）１０μｌの連結
体を使用して、適合するプラスミドｐＮｌａＩＨ１４上
に有するＮｌａＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾したコン
ピテント大腸菌ＥＲ２４１７を形質転換した。〔Ｎｌａ
Ｉメチル化認識部位ＧＧＣＣは、ＦｓｅＩ制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位毎に２回現れるので、ＮｌａＩによ
るメチル化は、宿主ＤＮＡをＦｓｅＩ消化から保護す
る。ｐＮｌａＩＨ１４は、ｋａｎr およびＴｃr 遺伝子
ならびにｐＳＣ１０１複製起点を有するコピー数が中位
のプラスミドであるｐＳＹＸ２０から誘導される。Ｔｃ
r 遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子は、Ｔｃプロモ
ーターから構成的に発現可能である。〕形質転換された
細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナ
マイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−寒天上で平板培
養した。プラスミドを、工程５で記載したように、プラ
スミドｍｉｎｉｐｒｅｐ法を使用して、個々のコロニー
から単離した。各ｍｉｎｉｐｒｅｐ５μｌのＮｄｅＩお
よびＳａｌＩによる二重消化をｐＡＩＩ１７のＮｄｅＩ
およびＳａｌＩによる二重消化と比較した。約１．５ｋ
ｂの挿入物を含むクローンを選択してさらに特性化を行
った。これらのクローンを、アンピシリンおよびカナマ
イシンを含む２００ｍｌのＬ−ブロスでＫｌｅｔｔ８０
（対数増殖中期）まで増殖させて、０．５ｍＭのＩＰＴ
Ｇにより誘導した。誘導の２時間後に、細胞（約０．８
ｇ）を遠心により採取し、３ｍｌの超音波緩衝液（２０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、
０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、氷上で超音波処理
した。超音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した。各抽出物４．５μｌを７５μ
ｌのＤＮＡアッセイ混合物（１μｇの Adeno２ＤＮＡ／
５０μｌのＮＥ緩衝液１）と混合した。このチューブの
２５μｌを５０μｌのＤＮＡ混合物と別のチューブで混
合した（１：２希釈）。別に逐次１：２希釈を３回行っ
た。反応物は３０℃で１時間インキュベートした。各反
応物２０μｌを１％アガロースゲルにかけた。テストし
た全てのクローンが、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性を生じた。酵素力価は、１ｘ１０4 単位／ｇ細胞よ
り大きいと推定された。これらのクローンの一つを選択
してさらに特性化を行い、株をＮＥＢ＃９１８と命名
し、プラスミドはｐＲＭＦｓｅＲ１と命名した。ＮＥＢ
＃９１８の粗抽出物から生じたＦｓｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ活性の力価を図４に示す。
現：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクタ
ーｐＡＩＩ１７の誘発プロモーター（Ｔ７）のすぐ下流
に挿入することによって過発現させると、リボソーム結
合部位が強く認識された。これを達成するために、二つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡおよび蛋白
質配列データを使用して作った。前進オリゴヌクレオチ
ドプライマーは、エンドヌクレアーゼのＡＴＧ開始コド
ンにＮｄｅＩクローニング部位を作る配列を含み、続い
て、蛋白質配列によって示される第２、第３、第４およ
び第５アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含み（コドン
の選択は、発現の高い遺伝子の最も普通に使用される大
腸菌コドンに合致するように行った。）、続いて、１．
６５ｋｂ増幅産物から得られるＤＮＡ配列に相補的な２
１個の塩基を含んでいた。すなわち、５’ＧＧＡ ＧＧ
Ｔ ＴＡＡ ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＡＡ
ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＴ ＣＣＧ ＧＡＧ
ＣＣＡ ＴＴＧ ３’（配列番号３１）（ＣＡＴ ＡＴ
ＧはＮｄｅＩクローニング部位であり、下線は最初の５
個のアミノ酸コドンである。）である。第二のオリゴヌ
クレオチドプライマーは、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の３’端に約８００ヌクレオチドの配列を含み、
一度増幅されたフラグメントのクローニングを促進する
ためのＳａｌＩ部位を作るように１個のヌクレオチドを
変化させた。すなわち、５’ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＴＣ
ＧＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＧＣ
３’（配列番号３２）（下線がＳａｌＩ部位である。）
である。これら二つのプライマーを、Vent ＤＮＡポリ
メラーゼを使用するＰＣＲ反応において、鋳型としての
ゲノムFrankia speciesＤＮＡとともに使用して、Ｆｓ
ｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む１．５ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントを増幅させた。バンドを上記と同様にゲ
ル精製した。精製したＤＮＡを２０ＵのＮｄｅＩおよび
２０ＵのＳａｌＩ／１ｘＮＥ緩衝液３で１時間消化し
た。インキュベートした後、消化物をフェノール：クロ
ロホルムの１：１混合物で１回、クロロホルムで２回抽
出し、２容のエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心に
よりペレット化し、７０％エタノールで１回洗浄し、脱
水して２０μｌのＴＥに再懸濁した。精製したフラグメ
ントの３μｌ（約０．０５μｇ）を、１７℃で４時間、
４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼとともに全体積２０μｌ
でＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（約０．０５μｇ）で消化し
たＴ７発現ベクターｐＡＩＩ１７（S. Xu, New England
Biolabs製）に連結した。〔ｐＡＩＩ１７は、Ｔ７プロ
モータの４ｂｐ下流のｌａｃオペレーター（Ｔ７ｌａｃ
という。）、ｌａｃＩq 遺伝子、アンピシリン耐性およ
びクローニング用の二つの制限部位ＮｄｅＩおよびＳａ
ｌＩ（ＳａｌＩはＢａｍＨＩの代わりである。）を含む
ｐＢＲ３２２由来のＴ７発現ベクターである。ｐＡＩＩ
１７はまた、標的遺伝子の発現の基底レベルをさらに低
下させるために、Ｔ７プロモーターの上流にｒｒｎＢ転
写終結因子の４個のコピーを含む。（ｐａＩＩ１７は、
W. JackがNew England BiolabsでｐＥＴ−１ｌａから
構築した。）（Dubendorff, J. W.and Studier, F. W.,
J. Mol. Biol. 219:45-59, (1991) ）１０μｌの連結
体を使用して、適合するプラスミドｐＮｌａＩＨ１４上
に有するＮｌａＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾したコン
ピテント大腸菌ＥＲ２４１７を形質転換した。〔Ｎｌａ
Ｉメチル化認識部位ＧＧＣＣは、ＦｓｅＩ制限エンドヌ
クレアーゼ認識部位毎に２回現れるので、ＮｌａＩによ
るメチル化は、宿主ＤＮＡをＦｓｅＩ消化から保護す
る。ｐＮｌａＩＨ１４は、ｋａｎr およびＴｃr 遺伝子
ならびにｐＳＣ１０１複製起点を有するコピー数が中位
のプラスミドであるｐＳＹＸ２０から誘導される。Ｔｃ
r 遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子は、Ｔｃプロモ
ーターから構成的に発現可能である。〕形質転換された
細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナ
マイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−寒天上で平板培
養した。プラスミドを、工程５で記載したように、プラ
スミドｍｉｎｉｐｒｅｐ法を使用して、個々のコロニー
から単離した。各ｍｉｎｉｐｒｅｐ５μｌのＮｄｅＩお
よびＳａｌＩによる二重消化をｐＡＩＩ１７のＮｄｅＩ
およびＳａｌＩによる二重消化と比較した。約１．５ｋ
ｂの挿入物を含むクローンを選択してさらに特性化を行
った。これらのクローンを、アンピシリンおよびカナマ
イシンを含む２００ｍｌのＬ−ブロスでＫｌｅｔｔ８０
（対数増殖中期）まで増殖させて、０．５ｍＭのＩＰＴ
Ｇにより誘導した。誘導の２時間後に、細胞（約０．８
ｇ）を遠心により採取し、３ｍｌの超音波緩衝液（２０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、
０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、氷上で超音波処理
した。超音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離した。各抽出物４．５μｌを７５μ
ｌのＤＮＡアッセイ混合物（１μｇの Adeno２ＤＮＡ／
５０μｌのＮＥ緩衝液１）と混合した。このチューブの
２５μｌを５０μｌのＤＮＡ混合物と別のチューブで混
合した（１：２希釈）。別に逐次１：２希釈を３回行っ
た。反応物は３０℃で１時間インキュベートした。各反
応物２０μｌを１％アガロースゲルにかけた。テストし
た全てのクローンが、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
活性を生じた。酵素力価は、１ｘ１０4 単位／ｇ細胞よ
り大きいと推定された。これらのクローンの一つを選択
してさらに特性化を行い、株をＮＥＢ＃９１８と命名
し、プラスミドはｐＲＭＦｓｅＲ１と命名した。ＮＥＢ
＃９１８の粗抽出物から生じたＦｓｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ活性の力価を図４に示す。
【００６３】８．産生：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
は、ＮＥＢ＃９１８をアンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有する富
栄養培地を含む醗酵槽中で対数増殖後期まで増殖させる
ことにより産生させることができる。培養物は、次い
で、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加することに
より誘発し、２〜４時間増殖を続ける。その後、細胞を
遠心により採取する。
は、ＮＥＢ＃９１８をアンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を有する富
栄養培地を含む醗酵槽中で対数増殖後期まで増殖させる
ことにより産生させることができる。培養物は、次い
で、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加することに
より誘発し、２〜４時間増殖を続ける。その後、細胞を
遠心により採取する。
【００６４】９．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ
ＥＢ＃９１８からの精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
を含む粗細胞抽出物を、上記工程２と同様に、アフィニ
ティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグ
ラフィーなどの標準的な蛋白質精製法を組み合わせるこ
とにより精製する。この精製により得られるＦｓｅＩ制
限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、非特異
的なエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは含
んでいなかった。
ＥＢ＃９１８からの精製：ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
を含む粗細胞抽出物を、上記工程２と同様に、アフィニ
ティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグ
ラフィーなどの標準的な蛋白質精製法を組み合わせるこ
とにより精製する。この精製により得られるＦｓｅＩ制
限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋であり、非特異
的なエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼは含
んでいなかった。
【００６５】ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼの詳しい解析
およびＦｓｅＩメチラーゼのクローン化： １０．Frankia species ゲノムＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ切断：Frankiaspecies ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
で切断して、次のように部分消化を行った。ＮＥ緩衝液
Ｓａｕ３ＡＩ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのビス
トリスプロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍ
ＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０、２５℃）における５０μｇ／
ｍｌのFrankia species ＤＮＡ４５０μｌを１００μｌ
のアリコート１本および５０μｌのアリコート７本に分
けた。１００μｌのチューブに５単位のＳａｕ３ＡＩを
添加して１μｇＤＮＡあたり１単位の酵素とした。第一
のチューブから５０μｌを取り出して第二のチューブに
移し、０．５単位のＳａｕ３ＡＩ／μｇとし、同様にし
て、続く各々のチューブのＳａｕ３ＡＩが、その前のチ
ューブのＳａｕ３ＡＩ量の半分になるようにする。それ
らのチューブを３７℃で１時間インキュベートした後、
フェノール／クロロホルムで抽出し、２容のエタノール
で沈澱させ、乾燥して、３０μｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
に再懸濁し、各々の３μｌをアガロースゲル電気泳動に
より分析した。９〜２３ｋｂの範囲に消化物質を示すチ
ューブをクローニング用のフラグメント源として選択し
た。個々の反応物を一緒にして、所望の９〜２３ｋｂの
範囲のフラグメントを上述したように低融点アガロース
からゲル精製し、クローンライブラリーの作製に使用し
た。
およびＦｓｅＩメチラーゼのクローン化： １０．Frankia species ゲノムＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ切断：Frankiaspecies ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
で切断して、次のように部分消化を行った。ＮＥ緩衝液
Ｓａｕ３ＡＩ（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのビス
トリスプロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍ
ＭのＤＴＴ、ｐＨ７．０、２５℃）における５０μｇ／
ｍｌのFrankia species ＤＮＡ４５０μｌを１００μｌ
のアリコート１本および５０μｌのアリコート７本に分
けた。１００μｌのチューブに５単位のＳａｕ３ＡＩを
添加して１μｇＤＮＡあたり１単位の酵素とした。第一
のチューブから５０μｌを取り出して第二のチューブに
移し、０．５単位のＳａｕ３ＡＩ／μｇとし、同様にし
て、続く各々のチューブのＳａｕ３ＡＩが、その前のチ
ューブのＳａｕ３ＡＩ量の半分になるようにする。それ
らのチューブを３７℃で１時間インキュベートした後、
フェノール／クロロホルムで抽出し、２容のエタノール
で沈澱させ、乾燥して、３０μｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
に再懸濁し、各々の３μｌをアガロースゲル電気泳動に
より分析した。９〜２３ｋｂの範囲に消化物質を示すチ
ューブをクローニング用のフラグメント源として選択し
た。個々の反応物を一緒にして、所望の９〜２３ｋｂの
範囲のフラグメントを上述したように低融点アガロース
からゲル精製し、クローンライブラリーの作製に使用し
た。
【００６６】１１．Ｓａｕ３ＡＩライブラリー：Ｓａｕ
３ＡＩゲノムライブラリーを、ベクターλ’（登録商
標）ＩＩ（Stratagene）を使用して作製した。λ’ＩＩ
はλ置換ベクターであり、９〜２３ｋｂのＤＮＡフラグ
メントをクローン化するために使用することができる。
上述したようにＳａｕ３ＡＩ部分消化されたFrankia sp
ecies ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）を５００ｎｇのＢａ
ｍＨＩ−切断λ’ＩＩアーム（０．５μｌ）と混合し
た。１０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２．５μ
ｌの２ｘライゲーション混合物（１００ｍＭのトリス、
ｐＨ７．８、２０ｍＭのＭｇＣｌ2 、２０ｍＭのＤＴ
Ｔ、２ｍＭのＡＴＰ）を添加し、その混合物を１７℃で
１６時間インキュベートした。２．５μｌのライゲーシ
ョン反応物を、Gigapack II Plus（Stratagene）を使用
し、製造者の指示に従って、感染性ファージ粒子にｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージした。室温で２時間インキュベ
ートした後、パッケージされたファージを５００μｌの
ＳＭ（ＳＭ＝１００ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ
4 、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１
％のゼラチン）および３滴のクロロホルムで希釈した。
感染性ファージ粒子の力価を次のように測定した。パッ
ケージされたファージ溶液２μｌを１９８μｌのＳＭで
希釈した。その希釈されたファージの１μｌ、１０μｌ
および１００μｌアリコートを、ＥＲ１４５８細胞の新
しい懸濁物（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600 ＝２．０における
懸濁物）１００μｌに添加し、室温で１５分間インキュ
ベートした後、４０℃で３ｍｌのトップアガーと混合
し、富栄養プレートに播いた。トップアガーが固まった
後、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。翌日
プラーク数を数え、次の実験で使用するファージストッ
クの力価を計算すると、５×１０4 ｐｆｕ／ｍｌであっ
た。
３ＡＩゲノムライブラリーを、ベクターλ’（登録商
標）ＩＩ（Stratagene）を使用して作製した。λ’ＩＩ
はλ置換ベクターであり、９〜２３ｋｂのＤＮＡフラグ
メントをクローン化するために使用することができる。
上述したようにＳａｕ３ＡＩ部分消化されたFrankia sp
ecies ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）を５００ｎｇのＢａ
ｍＨＩ−切断λ’ＩＩアーム（０．５μｌ）と混合し
た。１０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む２．５μ
ｌの２ｘライゲーション混合物（１００ｍＭのトリス、
ｐＨ７．８、２０ｍＭのＭｇＣｌ2 、２０ｍＭのＤＴ
Ｔ、２ｍＭのＡＴＰ）を添加し、その混合物を１７℃で
１６時間インキュベートした。２．５μｌのライゲーシ
ョン反応物を、Gigapack II Plus（Stratagene）を使用
し、製造者の指示に従って、感染性ファージ粒子にｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージした。室温で２時間インキュベ
ートした後、パッケージされたファージを５００μｌの
ＳＭ（ＳＭ＝１００ｍＭのＮａＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ
4 、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１
％のゼラチン）および３滴のクロロホルムで希釈した。
感染性ファージ粒子の力価を次のように測定した。パッ
ケージされたファージ溶液２μｌを１９８μｌのＳＭで
希釈した。その希釈されたファージの１μｌ、１０μｌ
および１００μｌアリコートを、ＥＲ１４５８細胞の新
しい懸濁物（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
１０ｍＭのＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600 ＝２．０における
懸濁物）１００μｌに添加し、室温で１５分間インキュ
ベートした後、４０℃で３ｍｌのトップアガーと混合
し、富栄養プレートに播いた。トップアガーが固まった
後、プレートを３７℃で一夜インキュベートした。翌日
プラーク数を数え、次の実験で使用するファージストッ
クの力価を計算すると、５×１０4 ｐｆｕ／ｍｌであっ
た。
【００６７】１２．ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージしたフ
ァージを上記と同様にプレーティングして、大腸菌ＥＲ
１４５８の菌叢に十分分離したプラークを形成させた。
約２５０、５００および１５００ファージのプレートを
作った。これらのクローンのλ’ＩＩＳａｕ３ＡＩライ
ブラリーからのニトロセルロースフィルタープラークリ
フトを、放射能標識した（Random Priming System I, #
1550, New England Biolabs ）ゲル精製１．６５ｋｂＰ
ＣＲ産物（Benton-Davis法、Molecular Cloning,a Labo
ratory Manual, T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. S
ambrook, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1982,
pp.320ff）をプローブとして行った。陽性の６個のプ
ラークが同定され、全て、精製されたプラークであっ
た。ＤＮＡを４個のファージの集密的プレートライセー
ト（トップアガロース中）から調製し、ＳａｃＩ、Ｋｐ
ｎＩおよびＳａｌＩで消化した。４個とも、共通して
１．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含み、これに１．
６５ｋｂのプローブをハイブリッド形成させた。
ァージを上記と同様にプレーティングして、大腸菌ＥＲ
１４５８の菌叢に十分分離したプラークを形成させた。
約２５０、５００および１５００ファージのプレートを
作った。これらのクローンのλ’ＩＩＳａｕ３ＡＩライ
ブラリーからのニトロセルロースフィルタープラークリ
フトを、放射能標識した（Random Priming System I, #
1550, New England Biolabs ）ゲル精製１．６５ｋｂＰ
ＣＲ産物（Benton-Davis法、Molecular Cloning,a Labo
ratory Manual, T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. S
ambrook, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1982,
pp.320ff）をプローブとして行った。陽性の６個のプ
ラークが同定され、全て、精製されたプラークであっ
た。ＤＮＡを４個のファージの集密的プレートライセー
ト（トップアガロース中）から調製し、ＳａｃＩ、Ｋｐ
ｎＩおよびＳａｌＩで消化した。４個とも、共通して
１．８ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含み、これに１．
６５ｋｂのプローブをハイブリッド形成させた。
【００６８】１３．サザンハイブリッド形成：サザンブ
ロットを次のように調製した。１μｇのFrankia specie
s ゲノムＤＮＡを、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＢａｍＨＩ、
ＥａｇＩ、ＨｉｎｄIII 、ＫｐｎＩ、ＭｓｃＩ、Ｎｏｔ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、Ｓｐｈ
Ｉ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩまたはＸｈｏＩで消化した。消
化物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。
ゲルを０．２５ＭのＨＣｌ（溶液を２回換える）で１５
分間、次いで、０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣ
ｌ（溶液を２回換える）で各１５分、最後に１ＭのＮＨ
4 ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨ（溶液を２回換える）
で３０分間洗浄した。ＤＮＡをニトロセルロースに移す
ために、孔径０．４５μｍのニトロセルロースのシート
を１ＭのＮＨ4 ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで湿ら
し、ゲルと同じ大きさのものをゲルの一方の側に置い
た。これを２インチの高さに積み重ねたペーパータオル
の上に置き、別の２インチの高さのペーパータオルの束
をその上に置いた。そのペーパータオルの束の上にガラ
ス板を置き、そのガラス板の上に小さい重しを載せた。
ＤＮＡを一晩トランスファーさせ、ニトロセルロースを
８０℃で１時間乾熱処理した。
ロットを次のように調製した。１μｇのFrankia specie
s ゲノムＤＮＡを、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＢａｍＨＩ、
ＥａｇＩ、ＨｉｎｄIII 、ＫｐｎＩ、ＭｓｃＩ、Ｎｏｔ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、Ｓｐｈ
Ｉ、ＳｔｕＩ、ＸｂａＩまたはＸｈｏＩで消化した。消
化物を０．７％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。
ゲルを０．２５ＭのＨＣｌ（溶液を２回換える）で１５
分間、次いで、０．５ＭのＮａＯＨ、１．５ＭのＮａＣ
ｌ（溶液を２回換える）で各１５分、最後に１ＭのＮＨ
4 ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨ（溶液を２回換える）
で３０分間洗浄した。ＤＮＡをニトロセルロースに移す
ために、孔径０．４５μｍのニトロセルロースのシート
を１ＭのＮＨ4 ＯＡｃ、０．０２ＭのＮａＯＨで湿ら
し、ゲルと同じ大きさのものをゲルの一方の側に置い
た。これを２インチの高さに積み重ねたペーパータオル
の上に置き、別の２インチの高さのペーパータオルの束
をその上に置いた。そのペーパータオルの束の上にガラ
ス板を置き、そのガラス板の上に小さい重しを載せた。
ＤＮＡを一晩トランスファーさせ、ニトロセルロースを
８０℃で１時間乾熱処理した。
【００６９】ニトロセルロースブロットを１５ｍｌの５
０ｘ Denhardt （５ｇのフィコール、５ｇのポリビニル
ピロリドン、５ｇのＢＳＡ／５００ｍｌのＨ2 Ｏ）、２
０ｘＳＳＣ（１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのク
エン酸ナトリウム／１ｌのＨ2 Ｏ）、１０％のＳＤＳお
よび１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリッド形
成した。室温で１時間、プレハイブリッド形成した後、
ラベルしたプローブ（上記と同様にラベルした１．６５
ｋｂ増幅産物）を添加し、ハイブリッド形成の工程を６
８℃で一夜行った。ブロットを、６５℃で１時間かけ
て、２ｘＳＳＣ（溶液を３回換える）および０．１％の
ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ（溶液を３回換える）で洗浄し
た。ブロットをＸ線フィルムに２４時間あてた。
０ｘ Denhardt （５ｇのフィコール、５ｇのポリビニル
ピロリドン、５ｇのＢＳＡ／５００ｍｌのＨ2 Ｏ）、２
０ｘＳＳＣ（１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのク
エン酸ナトリウム／１ｌのＨ2 Ｏ）、１０％のＳＤＳお
よび１０％の硫酸デキストラン中でプレハイブリッド形
成した。室温で１時間、プレハイブリッド形成した後、
ラベルしたプローブ（上記と同様にラベルした１．６５
ｋｂ増幅産物）を添加し、ハイブリッド形成の工程を６
８℃で一夜行った。ブロットを、６５℃で１時間かけ
て、２ｘＳＳＣ（溶液を３回換える）および０．１％の
ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ（溶液を３回換える）で洗浄し
た。ブロットをＸ線フィルムに２４時間あてた。
【００７０】このブロットおよびλクローンの消化パタ
ーンから、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ全体およびＦｓ
ｅＩメチラーゼ遺伝子のカルボキシル末端の一部を含む
３．６ｋｂのＳａｃＩフラグメントが同定され、λファ
ージの一つをｐＵＣ１９に入れてサブクローニングを行
った。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子全体およびＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキシ末端を含む７．０
ｋｂのＫｐｎＩフラグメントも、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の残りのアミノ末端部分を含む１．８ｋｂ
のＫｐｎＩフラグメントと同様に、ｐＵＣ１９に入れて
サブクローニングを行った。
ーンから、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ全体およびＦｓ
ｅＩメチラーゼ遺伝子のカルボキシル末端の一部を含む
３．６ｋｂのＳａｃＩフラグメントが同定され、λファ
ージの一つをｐＵＣ１９に入れてサブクローニングを行
った。ＦｓｅＩメチラーゼ遺伝子全体およびＦｓｅＩエ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のカルボキシ末端を含む７．０
ｋｂのＫｐｎＩフラグメントも、ＦｓｅＩエンドヌクレ
アーゼ遺伝子の残りのアミノ末端部分を含む１．８ｋｂ
のＫｐｎＩフラグメントと同様に、ｐＵＣ１９に入れて
サブクローニングを行った。
【００７１】１４．ＤＮＡ配列分析：ＦｓｅＩエンドヌ
クレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列分析
を、CircumventＤＮＡ配列分析キット（New England Bi
olabs ）および Sequenase２．０配列分析キット（Unit
ed States Biochemicals）を使用し、製造者の指示に従
って行った。種々のサブクローンを作り、合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを合成して、配列分析を行った。
ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ製剤を鋳型として使用した。Ｄ
ＮＡ配列分析により、続く操作でＦｓｅＩメチラーゼ遺
伝子をクローン化し、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝
子を再クローン化し、これらの遺伝子の大腸菌での発現
を誘発するためのベースとして使用するためのデータが
得られた。エンドヌクレアーゼの開始におけるＤＮＡ配
列は、５’ＡＴＧ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＴＴＧ
ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＣＧ ＧＡＧ ＣＣＡ Ｔ
ＴＧ ＧＴＣ ３’（配列番号３３）であることが分か
った。これは、アミノ酸配列：ＭＴＤＥＬＦＰＩＰＥＰ
ＬＶ（配列番号３４）に翻訳される。すなわち、エンド
ヌクレアーゼの２番目のアミノ酸は、工程３のアミノ酸
配列データから最初に考えられたヒスチジンではなく、
トレオニンであることが分かった。メチラーゼ遺伝子の
推定上の開始および停止コドンが、停止コドンがエンド
ヌクレアーゼの末端であると推定されたと同様に、同定
された。エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の
読み取り枠は１２個のヌクレオチドが重複することが認
められた。ＦｓｅＩメチラーゼを適合するベクターで発
現させて、宿主ゲノムをＦｓｅＩ切断から保護するため
にＦｓｅＩメチラーゼを使用し、エンドヌクレアーゼを
別に発現させて、２番目の位置に適切なトレオニンを挿
入し、保護のためにＦｓｅＩメチラーゼを使用した。
クレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子のＤＮＡ配列分析
を、CircumventＤＮＡ配列分析キット（New England Bi
olabs ）および Sequenase２．０配列分析キット（Unit
ed States Biochemicals）を使用し、製造者の指示に従
って行った。種々のサブクローンを作り、合成オリゴヌ
クレオチドプライマーを合成して、配列分析を行った。
ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ製剤を鋳型として使用した。Ｄ
ＮＡ配列分析により、続く操作でＦｓｅＩメチラーゼ遺
伝子をクローン化し、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ遺伝
子を再クローン化し、これらの遺伝子の大腸菌での発現
を誘発するためのベースとして使用するためのデータが
得られた。エンドヌクレアーゼの開始におけるＤＮＡ配
列は、５’ＡＴＧ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＴＴＧ
ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＣＧ ＧＡＧ ＣＣＡ Ｔ
ＴＧ ＧＴＣ ３’（配列番号３３）であることが分か
った。これは、アミノ酸配列：ＭＴＤＥＬＦＰＩＰＥＰ
ＬＶ（配列番号３４）に翻訳される。すなわち、エンド
ヌクレアーゼの２番目のアミノ酸は、工程３のアミノ酸
配列データから最初に考えられたヒスチジンではなく、
トレオニンであることが分かった。メチラーゼ遺伝子の
推定上の開始および停止コドンが、停止コドンがエンド
ヌクレアーゼの末端であると推定されたと同様に、同定
された。エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子の
読み取り枠は１２個のヌクレオチドが重複することが認
められた。ＦｓｅＩメチラーゼを適合するベクターで発
現させて、宿主ゲノムをＦｓｅＩ切断から保護するため
にＦｓｅＩメチラーゼを使用し、エンドヌクレアーゼを
別に発現させて、２番目の位置に適切なトレオニンを挿
入し、保護のためにＦｓｅＩメチラーゼを使用した。
【００７２】１５．メチラーゼのクローン化：ＦｓｅＩ
メチラーゼ遺伝子を増幅してｐＳＹＸ２０でクローン化
するために、２個のプライマーを設計した。ＦｓｅＩメ
チラーゼ遺伝子は、VentＤＮＡポリメラーゼを使用し
て、Frankia species ゲノムＤＮＡら増幅した。約１１
００ｂｐの増幅産物を上記と同様にゲル精製し、Ｂａｍ
ＨＩおよびＳａｌＩで切断し、フェノール−クロロホル
ム抽出を行い、沈澱させて、予めＢａｍＨＩおよびＳａ
ｌＩで切断したｐＳＹＸ２０ベクターに連結した。連結
反応物を大腸菌株ＥＲ２４２７に形質転換し、個々の形
質転換体をｍｉｎｉｐｒｅｐ法にかけて、ＢａｍＨＩお
よびＳａｌＩで消化した。正しい挿入物を有する形質転
換体を単離した。
メチラーゼ遺伝子を増幅してｐＳＹＸ２０でクローン化
するために、２個のプライマーを設計した。ＦｓｅＩメ
チラーゼ遺伝子は、VentＤＮＡポリメラーゼを使用し
て、Frankia species ゲノムＤＮＡら増幅した。約１１
００ｂｐの増幅産物を上記と同様にゲル精製し、Ｂａｍ
ＨＩおよびＳａｌＩで切断し、フェノール−クロロホル
ム抽出を行い、沈澱させて、予めＢａｍＨＩおよびＳａ
ｌＩで切断したｐＳＹＸ２０ベクターに連結した。連結
反応物を大腸菌株ＥＲ２４２７に形質転換し、個々の形
質転換体をｍｉｎｉｐｒｅｐ法にかけて、ＢａｍＨＩお
よびＳａｌＩで消化した。正しい挿入物を有する形質転
換体を単離した。
【００７３】１６．エンドヌクレアーゼのクローン化：
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＲＲ
Ｓの、強力な誘発プロモーター（ＰｌａｃＵＶ５）およ
び強く認識されるリボソーム結合部位のすぐ下流に挿入
することにより発現させた。これを行うために、ＤＮＡ
および蛋白質配列データを使用して二つのオリゴヌクレ
オチドプライマーを作った。第一のオリゴヌクレオチド
プライマーは、ＢａｍＨＩ部位、続いてｌａｃＺ蛋白質
の翻訳を停止するためのｌａｃＺ遺伝子と結合したフレ
ーム内停止コドン、強いリボソーム結合部位、７個のヌ
クレオチドのスペーサー、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の開始コドン、第２番目のトレオニン（ヒスチジ
ンではない）コドン、５番目のアミノ酸におけるロイシ
ンに対するコドン使用の変更およびハイブリッド形成の
ためのFrankia species ＤＮＡに相補的な配列を含ん
だ。すなわち、５’ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＧ
ＧＴＴＴＡＡ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴＡＴＣ Ｃ ３’（配列番
号３５）であった。逆向きプライマーは、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の３’端に位置し、クローニングのための
ＢａｍＨＩ部位が加えられ、５’ＴＡＡ ＧＧＡ ＴＣ
Ｃ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＧＧ ３’
（配列番号３６）であった。これら二つのプライマーを
使用し、１０μｌの１０ｘ Vent 反応緩衝液、８μｌの
４ｍＭｄＮＴＰ溶液、１μｌ（２００ｎｇ）のFrankia
species ＤＮＡ、５μｌ（１０μＭストック）のプライ
マー（配列番号３５）、５μｌ（１０μＭストック）の
プライマー（配列番号３６）、７１μｌのｄＨ2 Ｏ、
０．５μｌの Vent ポリメラーゼ（２単位／μｌストッ
ク）を混合して、９５℃１分間、５６℃１分間および７
２℃１分間で２５サイクル増幅することにより、Franki
a species ゲノムＤＮＡからＦｓｅＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を増幅した。約７００ｂｐの増幅産物を上記と
同様にゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断し、フェノール−
クロロホルム抽出を行い、沈澱させ、予めＢａｍＨＩで
切断して脱リン酸化したｐＲＲＳベクターに連結した。
連結反応物を、適合するプラスミドｐＳＹＸ２０に載せ
たＮｌａＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾した大腸菌株Ｅ
Ｒ２４２７に形質転換した。個々の形質転換体を分析す
ると、いくつかの発現ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼが認
められた。酵素力価は、１×１０4 単位／ｇ細胞より大
きいと推定された。これらのクローンの一つを選択して
さらに解析を行い、その株をＮＥＢ＃９４３と命名し、
プラスミドはｐＲＭＦｓｅＲ２と命名した。ＮＥＢ＃９
４３は、１９９４年１０月１８日に受託番号６９７０７
でＡＴＣＣに寄託した。ＮＥＢ＃９４３の粗抽出物から
得られたＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を
図５に示す。
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＲＲ
Ｓの、強力な誘発プロモーター（ＰｌａｃＵＶ５）およ
び強く認識されるリボソーム結合部位のすぐ下流に挿入
することにより発現させた。これを行うために、ＤＮＡ
および蛋白質配列データを使用して二つのオリゴヌクレ
オチドプライマーを作った。第一のオリゴヌクレオチド
プライマーは、ＢａｍＨＩ部位、続いてｌａｃＺ蛋白質
の翻訳を停止するためのｌａｃＺ遺伝子と結合したフレ
ーム内停止コドン、強いリボソーム結合部位、７個のヌ
クレオチドのスペーサー、ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼ
遺伝子の開始コドン、第２番目のトレオニン（ヒスチジ
ンではない）コドン、５番目のアミノ酸におけるロイシ
ンに対するコドン使用の変更およびハイブリッド形成の
ためのFrankia species ＤＮＡに相補的な配列を含ん
だ。すなわち、５’ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＧ
ＧＴＴＴＡＡ ＡＡＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＡ
Ｇ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴＡＴＣ Ｃ ３’（配列番
号３５）であった。逆向きプライマーは、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の３’端に位置し、クローニングのための
ＢａｍＨＩ部位が加えられ、５’ＴＡＡ ＧＧＡ ＴＣ
Ｃ ＴＣＴ ＡＧＡ ＧＣＡ ＧＧＴ ＣＧＧ ３’
（配列番号３６）であった。これら二つのプライマーを
使用し、１０μｌの１０ｘ Vent 反応緩衝液、８μｌの
４ｍＭｄＮＴＰ溶液、１μｌ（２００ｎｇ）のFrankia
species ＤＮＡ、５μｌ（１０μＭストック）のプライ
マー（配列番号３５）、５μｌ（１０μＭストック）の
プライマー（配列番号３６）、７１μｌのｄＨ2 Ｏ、
０．５μｌの Vent ポリメラーゼ（２単位／μｌストッ
ク）を混合して、９５℃１分間、５６℃１分間および７
２℃１分間で２５サイクル増幅することにより、Franki
a species ゲノムＤＮＡからＦｓｅＩエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を増幅した。約７００ｂｐの増幅産物を上記と
同様にゲル精製し、ＢａｍＨＩで切断し、フェノール−
クロロホルム抽出を行い、沈澱させ、予めＢａｍＨＩで
切断して脱リン酸化したｐＲＲＳベクターに連結した。
連結反応物を、適合するプラスミドｐＳＹＸ２０に載せ
たＮｌａＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾した大腸菌株Ｅ
Ｒ２４２７に形質転換した。個々の形質転換体を分析す
ると、いくつかの発現ＦｓｅＩエンドヌクレアーゼが認
められた。酵素力価は、１×１０4 単位／ｇ細胞より大
きいと推定された。これらのクローンの一つを選択して
さらに解析を行い、その株をＮＥＢ＃９４３と命名し、
プラスミドはｐＲＭＦｓｅＲ２と命名した。ＮＥＢ＃９
４３は、１９９４年１０月１８日に受託番号６９７０７
でＡＴＣＣに寄託した。ＮＥＢ＃９４３の粗抽出物から
得られたＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を
図５に示す。
【００７４】１７．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼ
は、ＮＥＢ＃９４３を、アンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラム
フェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を有する富栄養培地を
含む醗酵槽中で対数増殖後期まで増殖させることにより
産生させることができる。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度
０．５ｍＭまで添加することによりその培養物を誘発
し、２〜４時間増殖を続ける。次いで、細胞を遠心によ
り採取する。
は、ＮＥＢ＃９４３を、アンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびクロラム
フェニコール（１５μｇ／ｍｌ）を有する富栄養培地を
含む醗酵槽中で対数増殖後期まで増殖させることにより
産生させることができる。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度
０．５ｍＭまで添加することによりその培養物を誘発
し、２〜４時間増殖を続ける。次いで、細胞を遠心によ
り採取する。
【００７５】１８．ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼの
ＮＥＢ＃９４３からの精製は、上記工程９におけるＮＥ
Ｂ＃９１８の場合と同様に行う。この精製により得られ
るＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であ
り、非特異的エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレア
ーゼは含んでいなかった。
ＮＥＢ＃９４３からの精製は、上記工程９におけるＮＥ
Ｂ＃９１８の場合と同様に行う。この精製により得られ
るＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であ
り、非特異的エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレア
ーゼは含んでいなかった。
【００７６】
配列番号１： 配列の長さ：２３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列： His Asp Glu Leu Phe Pro Ile Pro Glu Pro Leu Val Xaa Pro Val Ile 1 5 10 15 Ala Leu Pro Pro Leu Leu Lys 20 配列番号２： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTYCCNATHC CNGARCC 17 配列番号３： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GAGCTSTTCC CSATCCCNGA RCC ２３ 配列番号４： 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ＣＣＳＧＴＳＡＴＣＧ ＣＳＣＴＳＣＣＳＣＣ
20 配列番号５： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGCTCSGGGA TSGGRAANAG YTC 23 配列番号６： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGCTCSGGGA TSGGRAAYAA YTC 23 配列番号７： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTCGCNGGNA THGGNGG 17 配列番号８： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTCTCNGGNG CNGGNGG 17 配列番号９： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTYTCNGGNT GYGGNGG 17 配列番号１０： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GCNGGNTTYC CNTGYCA 17 配列番号１１： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGSGGNCCNC CNTGYCA 17 配列番号１２： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TGRCANGGRA ANCCNGC 17 配列番号１３： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TGRCANGGNG GNCC 14 配列番号１４： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCYTTNACRT TYTC 14 配列番号１５： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ARNCCYTTNA CRTTYTC 17 配列番号１６： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ACSGGSACSG CGTTSCC 17 配列番号１７： 配列の長さ：１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGNTCNGGNA C 11 配列番号１８： 配列の長さ：１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TANGGNGGNG A 11 配列番号１９： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ACNTCNCCNC CNTA 14 配列番号２０： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ACNAGYCCNC CNTA 14 配列番号２１： 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TCNCCNCCNT AYTGG 15 配列番号２２： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： AANGGRTCNA GNAC 14 配列番号２３： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GTNGTNCCNG ANCC 14 配列番号２４： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCCATRAANG GRTC 14 配列番号２５： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCRAARAANG GRTC 14 配列番号２６： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCNGCRAANG GRTC 14 配列番号２７： 配列の長さ：６６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTTCCTATTC CGGAGCCATT GGTCAGACCA GTCATCGCAC TCCCCCCTCA TCTGAAGGAA 60 TTGATC 66 配列番号２８： 配列の長さ：２２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Pro Ile Pro Glu Pro Leu Val Arg Pro Val Ile Ala Leu Pro Pro 1 5 10 15 His Leu Lys Glu Leu Ile 20 配列番号２９： 配列の長さ：２１０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTCTGTGGCG CCGGAGGGAT GACGTTGGGA TTCATGCAGG CAGGATTCCA GCCGATTCTG 60 TCCATCGACC ATGACCTTCC ATCTATCGAG ACGCATCGCG CAAACTTCCC TGGAATGTCG 120 ATCTGCACGG ACATTCGCGA CTTTGTTGAT TTTCCTTCCG CAGATGTTGT CGTCGGAGGT 180 CCCCCATGCC AGGGATTCAG TCGTCTGGGT 210 配列番号３０： 配列の長さ：７０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Cys Gly Ala Gly Gly Met Thr Leu Gly Phe Met Gln Ala Gly Phe 1 5 10 15 Gln Pro Ile Leu Ser Ile Asp His Asp Leu Pro Ser Ile Glu Thr His 20 25 30 Arg Ala Asn Phe Pro Gly Met Ser Ile Cys Thr Asp Ile Arg Asp Phe 35 40 45 Val Asp Phe Pro Ser Ala Asp Val Val Val Gly Gly Pro Pro Cys Gln 50 55 60 Gly Phe Ser Arg Leu Gly 65 ７０ 配列番号３１： 配列の長さ：４８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣ ＡＴＡＴＧＣＡＣＧＡ ＣＧＡＡＣＴＧＴＴＴ ＣＣＴ
ＡＴＴＣＣＧＧ ＡＧＣＣＡＴＴＧ 48 配列番号３２： 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GATGTTGTCG ACGGAGGTCC CCCATGC 27 配列番号３３： 配列の長さ：３９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ATGACCGACG AGTTGTTTCC TATCCCGGAG CCATTGGTC 39 配列番号３４： 配列の長さ：１３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Met Thr Asp Glu Leu Phe Pro Ile Pro Glu Pro Leu Val 1 5 10 配列番号３５： 配列の長さ：４６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TAGGATCCGG AGGTTTAAAA TATGACCGAC GAGCTGTTTC CTATCC 46 配列番号３６： 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TAAGGATCCT CTAGAGCAGG TCGG 24 配列番号３７： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Ala Gly Ile Gly Gly 1 ５ 配列番号３８： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ １ 5 配列番号３９： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Ser Gly Cys Gly Gly 1 5 配列番号４０： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Gly Phe Pro Cys Gln 1 5 配列番号４１： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Gly Pro Pro Cys Gln 1 5 配列番号４２： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Gly Phe Pro Cys Gln 1 5 配列番号４３： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Pro Pro Cys Gln 1 5 配列番号４４： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Glu Asn Val Lys Gly 1 5 配列番号４５： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：６ 他の情報：/note ＝“６位の“Ｘ”＝ロイシン／フェニ
ルアラニン” 配列： Glu Asn Val Lys Gly Xaa 1 5 配列番号４６： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Asn Ala Val Pro Val 1 5 配列番号４７： 配列の長さ：４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Ser Gly Thr 1 配列番号４８： 配列の長さ：４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ser Pro Pro Tyr 1 配列番号４９： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Thr Ser Pro Pro Tyr 1 5 配列番号５０： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ser Pro Pro Tyr Trp 1 5 配列番号５１： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Val Leu Asp Pro Phe 1 5 配列番号５２： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Ser Gly Thr Thr 1 5 配列番号５３： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質配列： Asp Pro Phe Met Gly 1 5 配列番号５４： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Asp Pro Phe Phe Gly 1 5 配列番号５５： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Asp Pro Phe Ala Gly 1 5
20 配列番号５： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGCTCSGGGA TSGGRAANAG YTC 23 配列番号６： 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGCTCSGGGA TSGGRAAYAA YTC 23 配列番号７： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTCGCNGGNA THGGNGG 17 配列番号８： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTCTCNGGNG CNGGNGG 17 配列番号９： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTYTCNGGNT GYGGNGG 17 配列番号１０： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GCNGGNTTYC CNTGYCA 17 配列番号１１： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGSGGNCCNC CNTGYCA 17 配列番号１２： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TGRCANGGRA ANCCNGC 17 配列番号１３： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TGRCANGGNG GNCC 14 配列番号１４： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCYTTNACRT TYTC 14 配列番号１５： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ARNCCYTTNA CRTTYTC 17 配列番号１６： 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ACSGGSACSG CGTTSCC 17 配列番号１７： 配列の長さ：１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GGNTCNGGNA C 11 配列番号１８： 配列の長さ：１１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TANGGNGGNG A 11 配列番号１９： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ACNTCNCCNC CNTA 14 配列番号２０： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ACNAGYCCNC CNTA 14 配列番号２１： 配列の長さ：１５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TCNCCNCCNT AYTGG 15 配列番号２２： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： AANGGRTCNA GNAC 14 配列番号２３： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GTNGTNCCNG ANCC 14 配列番号２４： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCCATRAANG GRTC 14 配列番号２５： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCRAARAANG GRTC 14 配列番号２６： 配列の長さ：１４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： CCNGCRAANG GRTC 14 配列番号２７： 配列の長さ：６６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTTCCTATTC CGGAGCCATT GGTCAGACCA GTCATCGCAC TCCCCCCTCA TCTGAAGGAA 60 TTGATC 66 配列番号２８： 配列の長さ：２２アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Pro Ile Pro Glu Pro Leu Val Arg Pro Val Ile Ala Leu Pro Pro 1 5 10 15 His Leu Lys Glu Leu Ile 20 配列番号２９： 配列の長さ：２１０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TTCTGTGGCG CCGGAGGGAT GACGTTGGGA TTCATGCAGG CAGGATTCCA GCCGATTCTG 60 TCCATCGACC ATGACCTTCC ATCTATCGAG ACGCATCGCG CAAACTTCCC TGGAATGTCG 120 ATCTGCACGG ACATTCGCGA CTTTGTTGAT TTTCCTTCCG CAGATGTTGT CGTCGGAGGT 180 CCCCCATGCC AGGGATTCAG TCGTCTGGGT 210 配列番号３０： 配列の長さ：７０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Cys Gly Ala Gly Gly Met Thr Leu Gly Phe Met Gln Ala Gly Phe 1 5 10 15 Gln Pro Ile Leu Ser Ile Asp His Asp Leu Pro Ser Ile Glu Thr His 20 25 30 Arg Ala Asn Phe Pro Gly Met Ser Ile Cys Thr Asp Ile Arg Asp Phe 35 40 45 Val Asp Phe Pro Ser Ala Asp Val Val Val Gly Gly Pro Pro Cys Gln 50 55 60 Gly Phe Ser Arg Leu Gly 65 ７０ 配列番号３１： 配列の長さ：４８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣ ＡＴＡＴＧＣＡＣＧＡ ＣＧＡＡＣＴＧＴＴＴ ＣＣＴ
ＡＴＴＣＣＧＧ ＡＧＣＣＡＴＴＧ 48 配列番号３２： 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： GATGTTGTCG ACGGAGGTCC CCCATGC 27 配列番号３３： 配列の長さ：３９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： ATGACCGACG AGTTGTTTCC TATCCCGGAG CCATTGGTC 39 配列番号３４： 配列の長さ：１３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Met Thr Asp Glu Leu Phe Pro Ile Pro Glu Pro Leu Val 1 5 10 配列番号３５： 配列の長さ：４６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TAGGATCCGG AGGTTTAAAA TATGACCGAC GAGCTGTTTC CTATCC 46 配列番号３６： 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列： TAAGGATCCT CTAGAGCAGG TCGG 24 配列番号３７： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Ala Gly Ile Gly Gly 1 ５ 配列番号３８： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ １ 5 配列番号３９： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Phe Ser Gly Cys Gly Gly 1 5 配列番号４０： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Gly Phe Pro Cys Gln 1 5 配列番号４１： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Gly Pro Pro Cys Gln 1 5 配列番号４２： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ala Gly Phe Pro Cys Gln 1 5 配列番号４３： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Pro Pro Cys Gln 1 5 配列番号４４： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Glu Asn Val Lys Gly 1 5 配列番号４５： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：タンパク質 存在位置：６ 他の情報：/note ＝“６位の“Ｘ”＝ロイシン／フェニ
ルアラニン” 配列： Glu Asn Val Lys Gly Xaa 1 5 配列番号４６： 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Asn Ala Val Pro Val 1 5 配列番号４７： 配列の長さ：４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Ser Gly Thr 1 配列番号４８： 配列の長さ：４アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ser Pro Pro Tyr 1 配列番号４９： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Thr Ser Pro Pro Tyr 1 5 配列番号５０： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Ser Pro Pro Tyr Trp 1 5 配列番号５１： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Val Leu Asp Pro Phe 1 5 配列番号５２： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Gly Ser Gly Thr Thr 1 5 配列番号５３： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質配列： Asp Pro Phe Met Gly 1 5 配列番号５４： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Asp Pro Phe Phe Gly 1 5 配列番号５５： 配列の長さ：５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列： Asp Pro Phe Ala Gly 1 5
【図１Ａ】ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローン
化して産生するための好ましい方法を説明する。クロー
ン化計画に着手するときは、どの方法または条件を使用
するとＦｓｅＩ制限−修飾系のクローン化がうまくいく
か分からなかった。実際、メチラーゼ選択方法では、Ｆ
ｓｅＩメチラーゼ（またはエンドヌクレアーゼ）のクロ
ーンは得られなかった。図１および実施例１に記載した
蛋白質配列分析、メチラーゼ比較、プライマー設計、Ｄ
ＮＡ増幅およびクローニング結果、ならびにクローンの
ＤＮＡ配列決定、マッピングおよび特性化は、ＦｓｅＩ
制限−修飾系のクローン化および発現のための、以前に
は知られていなかった直接方法を示す。
化して産生するための好ましい方法を説明する。クロー
ン化計画に着手するときは、どの方法または条件を使用
するとＦｓｅＩ制限−修飾系のクローン化がうまくいく
か分からなかった。実際、メチラーゼ選択方法では、Ｆ
ｓｅＩメチラーゼ（またはエンドヌクレアーゼ）のクロ
ーンは得られなかった。図１および実施例１に記載した
蛋白質配列分析、メチラーゼ比較、プライマー設計、Ｄ
ＮＡ増幅およびクローニング結果、ならびにクローンの
ＤＮＡ配列決定、マッピングおよび特性化は、ＦｓｅＩ
制限−修飾系のクローン化および発現のための、以前に
は知られていなかった直接方法を示す。
【図１Ｂ】図１Ａのつづき。
【図２】過発現クローンｐＲＭＦｓｅＲ１を作るための
ベクターｐＡＩＩ１７に挿入されたＤＮＡの制限地図で
ある。
ベクターｐＡＩＩ１７に挿入されたＤＮＡの制限地図で
ある。
【図３】過発現クローンｐＲＭＦｓｅＲ２を作るための
ベクターｐＲＲＳに挿入されたＤＮＡの制限地図であ
る。
ベクターｐＲＲＳに挿入されたＤＮＡの制限地図であ
る。
【図４】ｐＡＩＩ１７由来プラスミドｐＲＭＦｓｅＲ１
上のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌
ＥＲ２４１７の細胞抽出物中のＦｓｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。
上のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌
ＥＲ２４１７の細胞抽出物中のＦｓｅＩ制限エンドヌク
レアーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。
【図５】ｐＲＲＳ由来のプラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２上
のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌Ｅ
Ｒ２４２７の細胞抽出物中のＦｓｅＩ制限エンドヌクレ
アーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。
のＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼを含有する大腸菌Ｅ
Ｒ２４２７の細胞抽出物中のＦｓｅＩ制限エンドヌクレ
アーゼ活性を示すアガロースゲルの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (8)
- 【請求項１】 プラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２から得るこ
とができる、ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコード
する単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＦｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドするＤＮＡが挿入されたベクターを含む組換えベクタ
ー。 - 【請求項３】 請求項１に記載の単離ＤＮＡを含む組換
えベクター。 - 【請求項４】 ベクターがプラスミドｐＲＭＦｓｅＲ２
を含むことを特徴とする請求項３に記載の組換えベクタ
ー。 - 【請求項５】 請求項２、３または４に記載の組換えベ
クターで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項２、３または４に記載の組換えベ
クターで形質転換された宿主細胞を該エンドヌクレアー
ゼの発現に適した条件下で培養することを含むＦｓｅＩ
制限エンドヌクレアーゼの製造方法。 - 【請求項７】 単離ＤＮＡが配列番号２７の配列を含む
ことを特徴とする請求項１に記載の単離ＤＮＡ。 - 【請求項８】 メチラーゼ遺伝子の保存アミノ酸配列に
基づく縮重プライマーをエンドヌクレアーゼの部分蛋白
配列データに基づく縮重ＤＮＡプライマーとともに使用
して両方の遺伝子の一部を増幅し、この増幅産物を使用
してエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子全体を
クローン化することを含む制限エンドヌクレアーゼおよ
びメチラーゼ遺伝子のクローン化法。
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|---|---|---|---|
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| US08/325,509 US5543308A (en) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | Isolated DNA encoding the FSEI restriction endonuclease and related methods for producing the same |
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- 1994-10-18 US US08/325,509 patent/US5543308A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-12 EP EP95307228A patent/EP0712933B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 DE DE69533434T patent/DE69533434T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-18 JP JP27031495A patent/JP3939375B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| EP0712933B1 (en) | 2004-09-01 |
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| JP3939375B2 (ja) | 2007-07-04 |
| DE69533434T2 (de) | 2005-09-22 |
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