JP4040112B2 - ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 - Google Patents
ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、NotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
制限エンドヌクレアーゼは細菌に天然に認められる種類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混在する細菌成分を含まないように精製すると、実験室内でＤＮＡ分子を正確な断片に切断するために使用できる。この特性により、ＤＮＡ分子を単一的に同定し、また構成遺伝子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研究に不可欠な道具であることが証明されている。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実施するための生化学的な「はさみ」である。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿って特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これと結合することによって作用する。一度結合すると、認識配列内またはその一方にある分子を切断する。制限エンドヌクレアーゼにはそれぞれ異なる認識配列に対する親和性がある。これまでに研究されている数百種の細菌から１００種以上の種々の制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】
細菌は１つの種につきわずかな制限エンドヌクレアーゼしか持たない傾向がある。エンドヌクレアーゼは一般にその酵素の由来となる細菌の名前に従って命名されている。従って、Neisseria lactamica 種は、例えば４種の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成し、これらはNlaI、NlaII 、NlaIII及びNlaIV と呼ばれている。これらの酵素は各々、配列GGCC、GATC、CATG及びGGNNCCを認識し、切断する。一方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は１つの酵素EcoRI のみを合成し、これは配列GAATTCを認識する。
【０００５】
理論と結び付けようとするのではないが、制限エンドヌクレアーゼは天然では細菌細胞の繁栄を保護する働きをしているものと考えられる。制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼがなければ細菌を破壊するか細菌に寄生するであろうウィルスやプラスミドのような外来ＤＮＡ分子の感染に対し細菌が耐性を持つようにすることができる。制限エンドヌクレアーゼは感染するＤＮＡ分子の長さを測り、認識配列がある度にそのＤＮＡ分子を切断することによって耐性を付与する。切断されると、感染遺伝子の多くは能力を失い、ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによってさらに分解され易くになる。
【０００６】
細菌の防御系の第二の成分は修飾メチラーゼである。修飾メチラーゼは制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌が自分自身のＤＮＡを保護し、自分自身のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから識別できるための手段を提供する。修飾メチラーゼは対応の制限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド配列を認識し、その配列と結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を添加することによりその配列内にあるヌクレオチド１つ以上を化学的に修飾する。メチル化されると、認識配列はもう制限エンドヌクレアーゼに結合またはこの酵素で切断されなくなる。細菌細胞のＤＮＡは細菌の持つ修飾メチラーゼ活性で完全に修飾され、従って、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対し感受性を失う。制限エンドヌクレアーゼによる認識や切断に感受性を持つものは修飾されていない、従って、識別不能な外来ＤＮＡのみとなる。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングし、その遺伝子がコードする蛋白質を従来の精製手法に比べて大量に製造できるようになった。所望のクローン（制限エンドヌクレアーゼ遺伝子）を単離する標準的な方法は、複雑な「ライブラリー」内でこのようなクローン、すなわち１０-3−１０-4と頻度の低い場合には「ショットガン」手法で得られるクローン集団を同定する簡単で信頼性の高い方法を開発することである。この方法は、所望ではない大部分のクローンを破壊し、所望のわずかなクローンのみが生存するような選択性を持つのが好ましい。
【０００８】
ますます多くのＩＩ型の制限−修飾系がクローニングされている。最初にクローニングされた系は制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択するための手段としてバクテリオファージ感染を使用した（EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178: 717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503-1507 (1981)）。細菌に制限−修飾系が存在するとバクテリオファージ感染耐性が得られるため、クローニングした制限−修飾遺伝子を持つ細胞は原則的にファージに露出されたライブラリーから生存体として選択的に単離できる。しかし、この方法は限定された価値しか持たないことが判っている。特に、クローニングされた制限−修飾遺伝子は選択的に生存させうるに十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが発見された。
【０００９】
別のクローニングの方法は、最初にプラスミド−ボーン(plasmid-borne) として特性化されている系を大腸菌クローニングプラスミドに移入することを含んでいる（EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras & Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983); Theriault & Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985) ）。
【００１０】
第三の方法は、ますます多くの系をクローニングするために使用されており、活性メチラーゼ遺伝子の選択を含んでいる（例えば、１９８６年９月３日公開のEPO No.: 195,413及びBsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985) 参照）。制限及び修飾遺伝子はしばしば密接に結合しているため、両方の遺伝子を同時にクローニングできることが多い。しかし、この選択ではいつでも完全な制限系が得られるのではないが、メチラーゼ遺伝子のみは得られる（BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss & Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983);及びMspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983) ）。
【００１１】
一部の系では、宿主に修飾で保護されていないエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に問題が生じることがある。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡ断片に導入する場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主ゲノムを切断する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を修飾または保護しなければならない。
【００１２】
大腸菌で制限−修飾系をクローニングする際、広範なメチラーゼをクローニングする過程に、もう１つの障害があることが発見された。多くの大腸菌株（クローニングに一般に使用されているものも含む）はシトシンメチル化に関わるＤＮＡの導入に耐性な系を有している（Raleigh & Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070-9074 (1986)）。従って、クローニングにどの大腸菌株を使用するかを慎重に検討することも必要である。
【００１３】
もう１つの可能性のある問題は、供給源となる生物と大腸菌との間の転写機構の違い、例えばプロモータ及びリボソーム結合部位の差のために、一部の制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は大腸菌内で発現できないことである。メチラーゼ選択手法では、メチラーゼ遺伝子を持つプラスミドの少なくとも一部を完全に保護するのに十分なだけメチラーゼが発現される必要がある。
【００１４】
精製した制限エンドヌクレアーゼは実験室でＤＮＡを特性化し、再配列させる有用な道具であり、修飾メチラーゼもまたその程度は低いものの有用であることから、これらの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ手法で得ることは商業上重要である。このような株は精製を簡単にすると同時に商業上有用な量を製造する手段を提供するため有用であろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、Nocardia otitidis-caviarum（ＡＴＣＣ １４６３０）から得られ得るNotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関係する方法に係る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするための公知の方法はNotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子のクローニングには成功しなかった。多くの試みが行なわれ、非常に成功した活性メチラーゼ遺伝子選択法及びファージ選択法があった。ここで、上記の方法を使用するとメチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子のどちらも発現されないため、これらの方法が機能しないことが判った。従って、NotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニングする新規な方法が必要とされていた。新規の方法はNotI制限エンドヌクレアーゼを均質になるまで精製し、蛋白質のＮ末端及び内部臭化シアン分解断片のアミノ配列を決定することを含んでいる。アミノ酸配列を使用してＰＣＲプライマーを作成し、N. otitidis-caviarumゲノムから直接エンドヌクレアーゼの一部を増幅させ、次に、遺伝子全体を含むクローンを同定するためのプローブとして使用する。
【００１６】
本発明は制限エンドヌクレアーゼNotIを発現する形質転換した宿主にも係る。この制限エンドヌクレアーゼNotIはＤＮＡ配列５′-GCGGCCGC-３′を認識し、４塩基５′オーバーハングを残して最初の-CG-対の間でこの認識配列を切断する（Roberts, R., Nucl. Acid Res., supplement 13: 165 (1985) ）。本発明に従って製造したNotI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、実施例１のステップ２に示すような慣用手法で製造した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混在物を含まない。NotI制限−修飾系をクローニングするための１つの好適法は次のステップからなる：N. otitidis-caviarumからエンドヌクレアーゼをほぼ均質になるように精製し、Ｎ末端及び内部臭化シアン断片のアミノ酸配列を決定し、アミノ酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプライマーを作製し、このプライマーによりゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡからのエンドヌクレアーゼの一部を増幅させ、適当なベクターを選択し、N. otitidis caviarum由来のＤＮＡを含有するライブラリーを形成し、エンドヌクレアーゼの一部に対応する増幅ＤＮＡとハイブリッド形成するＤＮＡを含有するクローンを単離し、クローニングしたＤＮＡの配列を決定してエンドヌクレアーゼの先端のＤＮＡ配列を決定し、隣接したメチラーゼ（NotIメチラーゼ）を同定し、ＰＣＲによりエンドヌクレアーゼ全体を増幅させ、NotI AUG開始コドンで始まる発現ベクターに連結し、別の相容性ベクター上でEagIメチラーゼ（-CGGCCG-）で適当な宿主細胞を予め修飾し、上記のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する連結した発現ベクターを予め修飾した宿主に導入し、宿主を増殖させ、適切な発現条件で誘導し、細胞を採取し、NotIエンドヌクレアーゼを精製する。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、NotI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えＤＮＡ及びこのような組換えＤＮＡから産生される酵素に係る。
【００１８】
Nocardia otitidis-caviarum 由来のNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは非常に困難であることが示されていた。多種のライブラリーが構築され、スクリーニングされているにも関わらず、標準のメチラーゼ選択手法ではメチラーゼクローンは得られていなかった。これはNotIメチラーゼが大腸菌内で保護するレベルで発現されないことによると思われる。ファージ選択法も試みられたが成功しなかった。これらの結果はNocardiaと大腸菌の間で認められた転写機構の違いと一致している。従って、NotIエンドヌクレアーゼをクローニングするには新しい方法が必要であった。
【００１９】
エンドヌクレアーゼ蛋白質をほぼ均質になるまで精製し、蛋白質の部分のアミノ酸配列を決定するために使用した。Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、エンドヌクレアーゼを臭化シアンで消化すると、約２４ｋＤ、１０ｋＤ、４ｋＤ及び３ｋＤの４つの主要なペプチド断片が得られた。２４ｋＤ、１０ｋＤ及び４ｋＤ断片については明確なアミノ酸配列が決定されたが、３ｋＤペプチドでは混合されたシグナルが得られた。２４ｋＤペプチドはエンドヌクレアーゼのＮ末端断片であることが判った。Ｎ末端領域のアミノ酸配列に基づいた縮退ＤＮＡプライマー及び１０ｋＤ断片を合成し、ゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子のこの部分をＰＣＲで増幅するために使用した。増強させた約６８０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９に二次クローニングし、配列を決定した。このＰＣＲ断片のＤＮＡ配列から推測したアミノ酸配列はＮ末端（２４ｋＤ）、１０ｋＤ及び４ｋＤペプチドから決定したNotIエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と一致しており、このＤＮＡ配列がNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を表わすことが確認された。N. otitidis-caviarum ＤＮＡのライブラリーをLambda Dash ベクター系で構築し、N. otitidis-caviarum ＤＮＡの９−２３ｋｂ挿入物を含有するクローンを生成した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の６８０ｂｐ断片をプローブとして使用し、エンドヌクレアーゼ遺伝子のこの部分を含有するLambda Dash クローンを同定した。これらのラムダクローンを精製すると、すべてのクローンが14.5kb BamHI断片を含有することが判った。プローブはBamHI 断片上で、およそ８２００−８９００の位置にマッピングされた。この結果、クローンはプローブの一方の側に約８２００ｂｐ、他方の側に約５６００ｂｐを含んでいたことから、エンドヌクレアーゼ遺伝子全体が存在するであろうことが示された。14.5kb BamHI断片をｐＵＣ１９に二次クローニングし、NotIエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼについてアッセイしたが、どちらの活性も検出されなかった。この結果は、遺伝子の上流の元のNocardiaＤＮＡがそのままの位置に残っているときにはエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は大腸菌内で発現されないことを示している。プローブの隣のＤＮＡの配列を決定し、エンドヌクレアーゼのＮ末端の正確なヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡプライマーは、ＡＴＧ開始コドン（-CATATG-）にNdeI部位を導入するNotI遺伝子のＮ末端部分から、NotI遺伝子の末端の約５００ｂｐの３−プライムであるSalI部位までNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅させるように設計した。14.5kb BamHIプラスミド及びゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡの両者から遺伝子全体を増幅させた。増幅させたＤＮＡをNdeI及びSalIエンドヌクレアーゼで切断し、予めSalI及びNdeIで切断してあるＴ７発現ベクターpSYX22に連結した。連結反応物を相容性プラスミドpACYC184上でEagIメチラーゼ（-CGGCCG-）で予め修飾したER2169コンピテント細胞に形質転換した。所望の大きさの挿入物を含有するベクターをミニプレップ（miniprepp ）法で同定した。これらのクローンを中間対数増殖期まで増殖させ、IPTGで誘導した。次に、細胞を遠心分離により採取し、音波処理バッファに再懸濁させ、音波処理により溶解させた。抽出物を清澄にし、NotIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。N. otitidis-caviarumゲノムＤＮＡ及び14.5kb BamHI断片プラスミド由来のクローンでは細胞１グラム（湿潤重量）当り５，０００，０００単位のNotI活性が得られた。
【００２０】
NotI制限遺伝子をクローニングし、発現させるのに好適な、本明細書に記載の方法は図１に説明するが、次のステップを含んでいる：
１．Nocardia otitidis-caviarumのＤＮＡを精製する。
【００２１】
２．NotI制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を標準の蛋白質精製手法で均質になるまで精製する。
【００２２】
３．精製したNotIエンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定する。精製したNotIエンドヌクレアーゼを臭化シアン消化して内部ペプチド断片を生成し、これらの断片からアミノ酸配列を決定する。
【００２３】
４．Ｎ末端及び内部ペプチド断片のアミノ酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプライマーを合成する。これらのプライマーを使用して、ＰＣＲ手法により、N. otitidis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。
【００２４】
５．N. otitidis-caviarum ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ例えばBamHI またはそのアイソシゾマーのいずれかで完全及び／または部分的に消化し、切断して、Lambda Dash IIまたはNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を含有する任意の同様なベクターにクローニングできる断片を作製する。
【００２５】
６．消化したＤＮＡをラムダファージクローニングベクターに連結する。得られた混合物をin vitroでパッケージし、適当な宿主例えば大腸菌株ER1458（New England Biolabs, Inc., Beverly, MAから市販されている）を感染させるために使用する。パッケージしたファージの一部を植え付け、得られたプラークを計数することにより、感染性ファージの力価を測定する。
【００２６】
７．in vitroでパッケージしたファージは富裕培地上で適当な大腸菌宿主例えばER1458の軟寒天ローンに種々の密度で植え付けるのが好ましい。インキュベーションした後、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するファージを、プラークのニトロセルロースフィルターリフトに対するプローブとしてNotIエンドヌクレアーゼのＰＣＲ由来の部分を使用して、Benton-Davisのサザン・ハイブリッド形成により同定する。陽性のプラークをプレートから取り出し、プレーティングとハイブリッド形成を数回連続して実施することにより精製する。
【００２７】
８．上記クローン上のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定し、従ってクローンがエンドヌクレアーゼ遺伝子全体及び任意の隣接したメチラーゼ遺伝子をコードするために十分なＤＮＡを含有しているかを決定するために、クローニングした断片の制限地図を作成し、上記と同じプローブを使用してクローンの種々の制限消化物へのサザン・ハイブリッド形成によりエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端部分の位置を決定する。制限遺伝子全体をコードするのに十分なＤＮＡがある場合、ステップ９に進む。プローブの３′側に完全な制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡがない場合には、さらに多くのクローンをスクリーニングする、及び／または、クローンの別のライブラリーを作成する。
【００２８】
lambda Dash ベクター内のN. otitidis-caviarum ＤＮＡ挿入物をプラスミドベクター例えばpUC19 （ATCC# 37254 ）にサブクローニングし、挿入物のマッピング及び遺伝子操作を簡単にすることができ、クローンがNotIエンドヌクレアーゼまたはメチラーゼのいずれを生成するかを決定することができる。本発明では、pUC19 中いずれの配向の14.5kb BamHI断片のクローンもin vitroで検出可能な量のNotIエンドヌクレアーゼは産生しなかった。この断片も４つのNotI部位を含んでおり、これらは全てin vitroでNotIで完全に切断され、このことはin vivo でNotIメチラーゼ活性がないことを示していた。
【００２９】
９．Ｎ末端から内部１０ｋＤ臭化シアン断片プローブを含むまたはそれに隣接したＤＮＡの配列決定し、遺伝子の配向、遺伝子のＮ末端の正確なＤＮＡ配列を決定し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接したシトシンメチラーゼ遺伝子の存在についてチェックする。
【００３０】
１０．NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現する：
制限遺伝子を含有するクローンを過剰発現できる方法は多数ある。ＤＮＡ配列及び詳細なマッピングは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現する最良の方法を決定する手助けとなる。過剰発現の１つの方法では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の幾分下流に直接ハイブリッド形成するプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅する。得られたＤＮＡ断片を切断して、エンドヌクレアーゼ遺伝子の前にあるNocardia ＤＮＡを全て取り出すことができ、これを発現ベクター例えば誘導可能なプロモータ（例えばＴ７）のすぐ下流にあるpSYX22に挿入できる。また、大腸菌が強く認識するプロモータ例えばpAGR3 上のPtac（New England Biolabs から入手できる）を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始の直前に挿入することにより過剰発現を実施できる。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始と終了の近くの好都合な制限部位及びpAGR3 のプロモータの近くの相容性の制限部位を見つけ、制限遺伝子をPtacプロモータと並べてpAGR3 に移すことにより実施できる。使用できるその他の調節プロモータはpUC19 及びpBR322誘導体上のPlacUV5 （Fuller, Gene 19: 43-54 (1982) ）及びλPL（Shimatake & Rosenberg, Nature 254: 128 (1981) ）である。また、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346 (1974) ）を遺伝子の前に置いて発現を増やすことができる。
【００３１】
１１．本発明によると、制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護する。これは、別のプラスミド上で、NotIメチラーゼまたは、NotI制限部位に重なる部位を修飾することによりNotI消化から保護するEagIのような異種のメチラーゼにクローニングすることにより実施できる。使用するプラスミドは発現ベクターと相容性でなければならない。メチラーゼも、過剰に発現された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産生されなければならない。本発明では、コピー数の低いプラスミド例えばpACYC184（Chang & Cohen, J. Bacteriol., 134: 1131 (1987)）にクローニングしたEagIメチラーゼ遺伝子はNotI消化から宿主ゲノムを適切に保護することが判った。
【００３２】
遺伝子のＤＮＡ配列は部位特異的変異によって、または遺伝子自体を再合成することにより、大腸菌内でさらに効率的に利用されるコドンを使用するよう変化させることができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151: 389-409 (1981)）。本発明では、エンドヌクレアーゼ遺伝子の第二及び第三コドンを、ＰＣＲ増幅法により大腸菌が最もよく使用するコドンに変化させた。
【００３３】
１２．製造：NotIエンドヌクレアーゼは、EagIメチラーゼ遺伝子（またはNotIメチラーゼ遺伝子）及び過剰に発現させたNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を持つクローンから、富裕培地中で培養器で増殖させ、適当に抗生物質選択させ、誘導することにより製造できる。次に、細胞を遠心分離により採取し、音波処理により破壊して、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性を持つ未精製の細胞抽出物を製造する。
【００３４】
１３．精製：NotI制限エンドヌクレアーゼを含有する未精製細胞抽出物は、標準の蛋白質精製手法例えば親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーで精製する。
【００３５】
上記に概説したステップは本発明を実施するための好ましい態様を示しているが、当業者には上記方法を当業界で公知の手法に準じて変化させうることは明らかであろう。
【００３６】
以下の実施例は本発明の好適実施態様を説明するために示している。この実施例は説明のためのものであり、本発明は特許請求の範囲に示される以外には、この実施例によって制限されないものであることは理解されよう。
【００３７】
実施例
実施例１ NotI 修飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．ＤＮＡの精製：Nocardia otitidis-caviarumのＤＮＡを調製するために、細胞ペースト６ｇを１０分間静かに振とうさせて、２５％蔗糖、０．０５Ｍトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍｌ中に再懸濁させた。０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌと調製したばかりの０．２５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．０）中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを加え、溶液を４℃で１６時間インキュベートした。次に、懸濁液を液体窒素で急速に凍結させ、次に３７℃の水浴で解凍することを３回繰り返した。プロテアーゼＫを最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、５０℃で１６時間インキュベートした。溶液を平衡化したフェノール５０ｍｌで抽出し、水相を回収し、クロロホルム５０ｍｌで２回抽出した。１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と１容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、遠心分離によって回収した。ＤＮＡペレットを１時間空気乾燥させ、次に１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含むＤＮＡバッファ（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度０．４Ｍとなるように加え、１容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物をガラス棒で溶液から取り出し、空気乾燥させ、１．５ｍｌのＤＮＡバッファに最終濃度が約２００μｇ／ｍｌとなるように溶解した。
【００３８】
２．Nocardia otitidis-caviarumからのNotI制限エンドヌクレアーゼの精製：NotI制限酵素はリッチ・ブロスを含む培養器で中間対数増殖期まで増殖させることによりNocardia otitidis-caviarumから作製できる。細胞は遠心分離によって採取する。以下の手順は全て氷上または４℃で実施した。３８４ｇの細胞をバッファＡ（１０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）７７０ｍｌに再懸濁し、１１，５００ＰＳＩＧのGaulonホノジェナイザーに５回通して破壊した。抽出物を４℃で４０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をバッファＡで平衡化したホスホセルロースカラム（５×１２ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＡ２００ｍｌ、次にバッファＡ１１００ｍｌと１．５ＭまでＮａＣｌを添加したバッファＡ１１００ｍｌで作製したＮａＣｌ直線勾配で洗った。２５ｍｌの画分を集めた。制限酵素活性プールは０．４Ｍから０．６ＭのＮａＣｌでカラムから溶出され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＮＨ4 ＳＯ4 、５％グリセロール及び０．１５％アジ化ナトリウム）に対して一晩透析した。次に、集めたものをバッファＢで平衡化したBaker-bond Wide-pore PEI(NH)（登録商標）カラム（１．５×１６ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＢ３０ｍｌ、次に、０．１Ｍから１．６ＭのＮａＣｌを加えたバッファＢの直線勾配４００ｍｌで洗った。制限酵素活性のピークは０．６−０．８ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。PEI プールを一晩バッファＣ（１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）に対し透析し、次にバッファＣで平衡化したMono-Q（登録商標）カラム（Pharmacia ）に載せた。０．１Ｍ−０．６ＭのＮａＣｌ直線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．３ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。Mono-Q（登録商標）で集めたものを３倍容量のバッファＤ（２０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）で希釈し、５０ｍＭ ＮａＣｌでMono-S（登録商標）（Pharmacia ）にかけた。バッファＤ中５０ｍＭから０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．２５ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。二番目のMono-Qカラムを上記のように流し、エンドヌクレアーゼ蛋白質が確実に均質になるようにした。最終的なNotI制限エンドヌクレアーゼ調製物ではクーマシーブルーR-250 で染色した１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約４２ｋＤの１つの主要なバンドが得られた。
【００３９】
３．上記２で製造したNotI制限エンドヌクレアーゼをMatsudairaの手順（Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262: 10035-10038 (1987)）に従って電気泳動にかけエレクトロブロットし、上記のように修飾した（Looney, M.C., Moran, L.S., Jack, W.E., Feehery, G.R., Benner, J.S., Slatko, B.E. & Wilson, G.G., Gene 80: 193-208 (1989)）。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、約４２ｋｄの蛋白質のバンドを切り出し、逐次分解にかけた（Waite-Rees, P.A., Keating, C.J., Moran, L.S., Slatko, B.E., Hornstra, L.J. & Benner, J.S., J. Bacteriol. 173: 5207-5219 (1991)）。
【００４０】
４２ｋｄ蛋白質の最初の１５残基はMet-Arg-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile 、配列番号１に対応した。２０μｌ中２０μｇのNotIエンドヌクレアーゼの別の試料を、暗室内、室温で、２４時間、８８％蒸留ギ酸２００μｌに溶解した２ｍｇの臭化シアンで処理した。この反応混合物を蒸発乾固させ、２０μｌのローディング・バッファ（１．５Ｍ トリス塩酸 ｐＨ８．５、１２％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０５％ Serva Blue G、０．０５％ Phenol Red）に１００℃で５分間再懸濁させた。この試料をトリス−トリシン１０−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Novex ）上の電気泳動に３時間かけ、次に１０ｍＭのＣＡＰＳバッファ（１０ｍＭ ３−［シクロヘキシルアミノ］−プロパンスルホン酸、１０％メタノール、０．０５％ ＳＤＳ、０．００５％ジチオスレイトール、ＮａＯＨでｐＨ１１．０に調整）を使用し、タンク・エレクトロブロッター（TE52、Hoeffer ）中、２００ボルトで１８時間かけて、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Problott, Applied BIosystems Inc. ）に移した。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色すると、２４ｋｄ、１０ｋｄ、４ｋｄ及び３ｋｄの主要なバンドが認められた。これらの染色された蛋白質バンドを膜から切り出し、各々を逐次分解（２）にかけた。２４ｋｄペプチドの最初の２７残基はMet-Arg-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile-Ala-Glu-Phe-Phe-Gly-X-X-Val-Tyr-Pro-Glu-Val 、配列番号２に対応した。残基２１及び２２は同定されなかった。従って、この断片はエンドヌクレアーゼのＮ末端からのものであると決定した。他のすべての断片は蛋白質内部からMet 残基で臭化シアンにより内部切断されて得られたものである。１０ｋｄペプチドの最初の９残基はAla-Tyr-Lys-Phe-Ala-Leu-Ser-Gly-Arg 、配列番号３に対応した。４ｋｄペプチドの最初の３６残基はAsp-Phe-His-Gly-Ser-Tyr-Lys-His-ALa-Val-Gly-Ala-Ile-Asp-Ile-Ala-Leu-Val-Glu-Gly-Ile-Asp-Phe-His-Gly-X-Leu-Pro-Thr-Pro-Ala-Gly-(TyrまたはArg)-Ala-Ala-(Lys またはLeu)、配列番号４に対応した。残基２６は決定されておらず、残基３３及び３６はいくらか不明確であった。この３ｋｄペプチドバンドはほとんどのサイクルで２つのシグナルを出し、２つのペプチドの混合物と思われた。
【００４１】
４．無傷のNotIエンドヌクレアーゼ、２４ｋｄ及び１０ｋｄペプチドからのペプチド配列データ及びその既知の配向を使用して一連の８個のＰＣＲプライマーを構築した：
１）GA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号５
２）AA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号６
３）GA SGC GAA CTT GTA SGC CAT 20-mer 、配列番号７
４）GAR CCN GAR GGN GCN AAR TTY AT 23-mer 、配列番号８
５）GAG CCS GAG GGS GCS AAG TTC AT 23-mer 、配列番号９
６）AAR TTY ATH GCN GAR TTY TTY GG 23-mer 、配列番号１０
７）AAG TTC ATC GCS GAG TTC TTC GG 23-mer 、配列番号１１
８）GTN TAY CCN GAR 14-mer、配列番号１２
［式中、 Y = T, C；R = A, G；H = A, T, C ；S = G, C；N = A, C, G, T］。
【００４２】
プライマー１から３はNotI １０ｋｄ ＣＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の５′末端に向かってプライムするように作製した。プライマー４から８はNotI２４ｋｄ ＣＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の３′末端に向かってプライムするように作製した。プライマー３、５及び７ははっきりしない位置にはＡまたはＴ残基を全く持たない。
【００４３】
５．プライマー３、５、７及び８を使用して遺伝子のＮ末端領域（プライマー５、７及び８）と１０ｋｄ臭化シアン断片のアミノ末端（プライマー３）の間のエンドヌクレアーゼ遺伝子の部分を増幅させた。３種のＭｇ++濃度と４種のアニーリング温度を試みた。マスター反応混合物は、１０×Vent（登録商標）反応バッファ６５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ ７μｌ、４ｍＭのｄＮＴＰ溶液４０μｌ、ＤＭＳＯ ３３μｌ、Nocardia otitidis-caviarum ＤＮＡ ３．５μｌ（７００ｎｇ）、ｄＨ2 Ｏ ４０８μｌ、プライマー３ １３μｌ（６５０ｎｇ）、プライマー５ １３μｌ（６５０ｎｇ）及びVentexo-（登録商標）ポリメラーゼ２０μｌ（４０ｕ）を含むように調製した。混合物を２００μｌずつの３つのアリコートに分けた。最初のアリコートにはｄＨ2 Ｏを１６μｌ（最終Ｍｇ++濃度＝２ｍＭ）、２番目のアリコートには１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を６μｌとｄＨ2 Ｏを１０μｌ（［Ｍｇ++］＝５ｍＭ）、３番目のアリコートには１００ｍＭのＭｇＳＯ4 を１６μｌ（［Ｍｇ++］＝１０ｍＭ）加えた。これらの反応混合物を４つに分け、４種のアニーリング温度で増幅させた。プライマー３とプライマー７を使用する反応とプライマー３とプライマー８を使用する反応は同様に実施した。ＰＣＲ増幅条件は９５℃で１分、４５℃（または５０℃、５５℃、６０℃）で１分、７２℃で１分半を３５サイクルであった。ＰＣＲ反応生成物１５μｌを１％アガロースゲル塩基泳動で分析した。所望の大きさのバンドが、プライマー３からプライマー５について、２ｍＭ Ｍｇ++／アニーリング温度６０℃以外の反応の全てで認められた。プライマー３とプライマー７の反応では、５ｍＭ中、４５℃でアニーリングした反応、１０ｍＭのＭｇ++中、５０℃及び５５℃でアニーリングした反応の３つの全ての反応で所望の大きさのバンドが得られたが、他の条件での反応では得られなかった。プライマー３とプライマー８の組み合わせでは、５ｍＭと１０ｍＭのＭｇ++で４５℃でアニーリングした場合と、１０ｍＭのＭｇ++で５０℃でアニーリングした場合のみに所望の大きさのバンドが得られた。所望の大きさのバンドを１％ＬＭＰアガロースの電気泳動にかけ、ゲルから切り出し、６５℃で５分間溶融させ、４０℃に５分間冷却し、β−アガロース（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）１μｌ（１ｕ）を加え、４０℃で１時間インキュベートすることによりアガロースを消化した。
【００４４】
６．部分消化：精製したＤＮＡをBamHI で切断して、次のように部分消化した：NEBuffer BamHI（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中５０μｇ／ｍｌのNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡ５００μｌを１００μｌのアリコート１つと５０μｌのアリコート７つに分けた。１００μｌの試験管にBamHI ２０単位を加えると、ＤＮＡ１μｇ当り酵素４単位となった。最初の試験管から５０μｌ取り、２番目の試験管に移し、BamHI ２単位／μｇとし、前のBamHI 量の半分となるようにこれを続けた。試験管を３７℃で１時間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽出し、２容のエタノールで沈澱させ、乾燥させ、２０μｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、各３μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。限定消化されたことを示す試験管と中等度の不完全な消化を示す試験管をクローニング用断片の供給源として選んだ。別々の反応物を一緒に合わせて混合し、下記ステップ７に記載するように使用した。
【００４５】
７．BamHI ライブラリー：BamHI ゲノムライブラリーはベクターLambda Dash（登録商標） II （Stratagene）を使用して構築した。lambda Dash II は９−２３ｋｂのＤＮＡ断片のクローニングに使用できるラムダ置換ベクターである。上記のようにBamHI で完全にまたは部分的に消化したNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）をBamHI で切断したLambda Dash II アーム５００ｎｇ（０．５μｌ）と混合した。１×１０3 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有する２×連結混合物（１００ｍＭ トリス ｐＨ７．８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＤＤＴ、２ｍＭ ＡＴＰ）２．５μｌを加え、混合物を１７℃で１６時間インキュベートした。製造業者の支持に従ってGigapack（登録商標）II Plus （Stratagene）を使用して、連結反応物２．５μｌをin vitroで感染性ファージ粒子にパッケージした。室温で２時間インキュベートした後、パッケージしたファージを５００μｌのＳＭ（ＳＭ＝１００ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、５０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）とクロロホルム３滴で希釈した。感染性ファージ粒子のタイターは次のように測定した。パッケージしたファージの溶液２μｌをＳＭ １９８μｌで希釈した。希釈したファージの１μｌ、１０μｌ及び１００μｌのアリコートを新しいER1458細胞の懸濁液（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600 ＝２．０中）１００μｌに加え、室温で１５分間インキュベートし、次に４０℃でトップアガー（top agar）３ｍｌと混合し、リッチ・プレートに広げた。トップアガーが固まった後、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、プラークを計数し、次の実験に使用するファージ・ストックのタイターを計算すると、２．８×１０5 ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００４６】
８．上記のようにin vitroでパッケージしたファージを植え付け、大腸菌ER1458のローン中によく分離されたプラークを形成した。約６００、１５００、３０００及び５０００ファージのプレートを作製した。lambda Dash II BamHI ライブラリーからのこれらのクローンのニトロセルロースフィルター・プラーク・リフトを、放射性標識し（Random Priming System I, New England Biolabs, Inc. Beverly, MA）ゲル精製したプライマー３からプライマー５の増幅反応からのＰＣＲ生成物（上記）（Benton-Davis法、Molecular Cloning, a Laboratory Manual、T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982, pp 320ff）でプロービングした。１７個の陽性プラークを同定したところ、全部が精製プラークであった。ＤＮＡを６つのファージの（トップアガロース中の）集密的なプレート溶解物から調製し、BamHI で消化した。６個全てが共通の14.5kb BamHI断片を含んでおり、これにプライマー３からプライマー５のプローブをハイブリッドさせた。
【００４７】
９．14.5kb BamHI断片のマッピング：マッピングを容易にするために、lambdaDash II クローンで同定したNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5kb BamHI断片をpUC19 にサブクローニングし、クローンpNOTB14.5 を作製した。pNOTB14.5 クローンを製造者の指示に従って種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片の制限地図を決定した（図２）。このクローン上のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置はプライマー３からプライマー５のプローブ（上記）をクローンの制限消化物にサザン・ハイブリッド形成させて決定した（Southern, E. 1975, J. Mol. Biol., 98:503）。この中では、HindIII 、PflMI 、XbaI、ClaI及びBstBI 消化物が14.5kb BamHI断片上のプローブの位置決定に特に有用であった（図２）。プローブはBamHI 断片の一方に約８２００ｂｐ、他方に５６００ｂｐを持つ中央部近くとハイブリッドし、このことは、制限及び修飾遺伝子全体を含有するのに十分なＤＮＡが存在することを示している。pNOTB14.5 クローンを増殖させ、NotI制限活性についてアッセイしたが、何も検出されなかった。クローニングしたＤＮＡで４つの部位を完全に切断するNotI酵素能で評価されたように、in vivo でメチラーゼ活性は検出されなかった。
【００４８】
プローブ近くのクローンの領域の配列決定を容易にするために、pNOTB14.5 の種々のサブクローンを構築した。サブクローンは、クローンの部分を欠失させることにより、または制限酵素で切断し、所望の断片をゲルで調製し、適切に切断し、脱燐酸化したpUC19 ベクターに連結して作製した。所望の構築物のクローンは、ミニプレップを実施し、精製ＤＮＡを消化し、アガロースゲル電気泳動で分析して同定した。
【００４９】
プラスミドクローンの分析：アンピシリンを含有するＬブロスの培養物１０ｍｌに各形質転換細胞を接種し、形質転換細胞を含むプラスミドをBirnboin & Doly （Nucleic Acids Res. 7: 1513, 1979）の方法から適用したミニプレップ・プラスミド精製手順で調製した。
【００５０】
ミニプレップ手順：各培養物を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２５ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース（ｐＨ８．０）１ｍｌに再懸濁させた。室温に１０分間置いた後、０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ２．０ｍｌを各試験管に加え、試験管を振って細胞を溶解させ、氷上に置いた。溶液が透明になったら、各試験管に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを加えて、振った。形成された沈澱物を４℃で１５０００ｒｐｍで１０分間回転させて沈澱させた。イソプロパノール３ｍｌを含む遠心管に各上清を加え、混合した。室温に１０分置いた後、遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間回転させて、沈澱した核酸をペレットとした。上清を捨て、ペレットを室温で３０分間、空気乾燥させた。乾燥したら、ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌに溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、次に３５０μｌのイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。室温に１０分間置いた後、５分間遠心分離してＤＮＡを沈澱させた。上清を捨て、ペレットを乾燥させ、次に１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ １５０μｌの最終溶液に再溶解させた。次に、プラスミド・ミニプレップを種々の制限エンドヌクレアーゼによる消化で分析した。
【００５１】
１０．ＤＮＡ配列決定：ＤＮＡ配列決定は、製造者の指示に従ってCircumvent（登録商標） DNA配列決定キット（New England Biolabs ）を使用して実施した。ミニプレップＤＮＡ調製物を鋳型として使用した。ＤＮＡ配列決定は次の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体をクローニングし、クローニングした遺伝子の大腸菌での発現を誘導するための操作の元となるデータを提供した。ＤＮＡ配列から推定のアミノ酸配列はＮ末端（２４ｋＤペプチド）、１０ｋＤ、４ｋＤ及び推定された２つの小さなペプチド（約３ｋＤ）の蛋白質配列と一致し、ペプチド断片の順序が２４ｋＤ、４ｋＤ、３（Ａ）ｋＤ、１０ｋＤ、３（Ｂ）ｋＤであることを示した。蛋白質のＮ末端の正確なＤＮＡ配列を使用してNotI遺伝子を発現するためのＰＣＲ増幅プライマーを設計した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流にあるSalI部位の周りの配列を使用して第二のＰＣＲ発現プライマーを設計した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流の配列は典型的な大腸菌転写因子を含んでおらず、これはpNOTB14.5 から発現されないことと一致している。エンドヌクレアーゼの出発点から４４ｎｔで分離された、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子に先立ち、同じ配向にある読み取り枠で、β型Ｎ４−メチルシトシンメチラーゼ遺伝子のコンセンサスモチーフ、モチーフＩＶ＝Ile-Thr-Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Gly-Met-Arg-Thr-Tyr （配列番号１３）及びモチーフＩ＝Gly-Gly-Leu-Val-Leu-Asp-Pro-Phe-Ala-Gly-Thr-Gly-Arg-Ala （配列番号１４）（Wilson, G.G., Methods in Enzymology, 216: Recombinant DNA Part G、Wu, R.編、Academic Press, 1992, pp259-279 ）が認められた。このデータは連結Ｒ−Ｍシステムと一致する。
【００５２】
１１．NotI制限エンドヌクレアーゼの過剰発現：制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターpSYX22の誘導可能なプロモータ（Ｔ７）及び強力に認識されるリボソーム結合部位のすぐ下流に遺伝子を挿入することにより過剰発現させた。これを実施するために、ＤＮＡ配列及び蛋白質配列データを使用して２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。最初のオリゴヌクレオチドプライマーはＡＴＧコドンに重なる配列を含有しており、蛋白質配列決定から、エンドヌクレアーゼの開始部分であるが、３個の塩基が変化してNdeI部位を形成し、エンドヌクレアーゼの第二及び第三コドンの３位の塩基が大腸菌が使用するのに好ましいコドンに変化していた：５′ GACG CAT ATG CGT TCC GAT ACG TCG GTG GAG CCA GAG ３′配列番号１５（NdeI部位は下線で示し、N. otitidis-caviarum配列から変化したヌクレオチドは太字で示す）。第二のオリゴヌクレオチドプライマーはNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子末端の３′に約５００個のヌクレオチドの配列を含み、増幅させた後の断片のクローニングを助けるためにプライマーに含まれている、N. otitidis-cavariarum ＤＮＡ中のSalI部位を有している：５′ GAAT GTC GAC CAT CTC CAC CCA CG 3′配列番号１６（SalI部位を下線で示す）。これらの２つのプライマーは、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応（９５℃１分間、５６℃１分間、７２℃２分間；pNOTB14.5 から１０サイクル、ゲノムＤＮＡから１０サイクル）に、鋳型としてのゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡ及びpNOTB14.5 プラスミドと共に使用し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む1.7kb ＤＮＡ断片を増幅させた。ステップ５に述べたように、バンドをゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を２０ＵのNdeI及び２０ＵのSalIを使用し、１×NEBuffer 3で１時間消化した。インキュベーションした後、消化物をフェノールとクロロホルムの１対１混合物で１回、クロロホルムで１回抽出し、２容のエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心分離によりペレットととし、７０％エタノールで１回洗い、乾燥させ、２０μｌのＴＥに再懸濁させた。精製した断片３μｌ（〜０．１μｇ）をＴ７発現ベクターpSYX22（S. Xu, New England Biolabsから入手）に連結した。このベクターはＴ４ ＤＮＡリガーゼ４００Ｕを含む全容量２０μｌ中、１７℃で４時間、NedI及びSalI（〜０．０５μｇ）で消化してあった。［pSYX22の誘導体化：pET-11a はＴ７プロモータの４ｂｐ下流にlac オペレータ（このＴ７プロモータとlac オペレータをＴ７ｌａｃプロモータと呼ぶ）、lacIq 遺伝子、及びクローニング用の２つの制限部位、NdeI及びBamHI を含むpBR322由来のＴ７発現ベクターである（Dubendorff, J.W. & Studier, F.W., J. Mol. Biiol. 219: 45-59, 1991 ）。］Ｔ７プロモータの上流のrrnB転写ターミネータを４コピー含むpET-11a 誘導体、pAII17を構築した（pAII17はNew England Biolabs, Beverly, MAのWilliam Jackが作製した）。Ｔ７プロモータの上流にある転写ターミネータはさらに標的遺伝子の発現の基礎レベルを下げる。クローニングが容易なように、ベクターのBamHI 部位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に充填し、SalIリンカーを挿入してBamHI 部位を置換した。このプラスミドをpSYX22.Jとした。連結物１０μｌを使用して、pEagM184-AのEagIメチラーゼ遺伝子で予め修飾したコンピテント大腸菌ＥＲ２１６９（New England Biolabs, Inc., Beverly, MAから入手できる）を形質転換した。［EagIメチル化認識部位CGGCCGはNotI制限エンドヌクレアーゼ認識部位と重なり合っており、従って宿主をNotIによる消化から保護する。pEagM184-Aはp15A複製開始点に camr 及びTcr 遺伝子を持つコピー数の低いプラスミドであるpACYC184由来である。Tcr 遺伝子に挿入したメチラーゼ遺伝子はTcプロモータから本質的に発現できる］。形質転換した細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天に植え付けた。ステップ９に記載のミニプラスミド・プレップ手順を使用して、プラスミドをゲノムＤＮＡとpNOTB14.5 由来の増幅ＤＮＡの両者からの各々１４個のコロニーから単離した。各ミニプレップ５μｌをNdeI及びSalIの両方で消化したものを、pAII17をNedI及びSalIの両方で消化したものと比較した。１４個のゲノム由来のクローンの内１つと１４個のpNOTB14.5 由来のクローンの内の２つは約１．７ｋｂの挿入物を含んでいた。これらの３つのクローン全部をさらに特性化するために選択した。これらの３つのクローンをアンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する２００ｍｌのＬブロス中でＫｌｅｔｔが８０（中間対数増殖期）になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導２時間後、細胞（約０．８ｇ）を遠心分離によって採取し、冷い音波処理バッファ（２０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で一回洗い、音波処理バッファ３ｍｌに再懸濁し、氷上で音波処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各抽出物４．５μｌをＤＮＡアッセイ混合物（NEBuffer NotI ５０μｌにAdeno2 ＤＮＡ １μｇを含む）７５μｌと混合した。この試験管からの２５μｌをＤＮＡ混合物５０μｌと混合し、１：２希釈とした。さらに３回続けて１：２希釈した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。反応混合物２０μｌを１％のアガロースゲルにかけた。３つのクローンはすべてこのアッセイで正確にタイターを測定するには強すぎるNotI制限エンドヌクレアーゼ活性を示した。しかし、酵素のタイターは細胞１ｇ当り２．５×１０5 単位より大きいと概算された。さらに滴定すると、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性は細胞１ｇ当り約５×１０6 単位となった。このレベルはNocardia otitidis-caviarumの未精製抽出物で認められる細胞１ｇ当りのNotI制限エンドヌクレアーゼ活性の約１０００倍である。これらのクローンの１つをさらに特性化するために選択し、株NEB# 816と表わし、プラスミドはpRM189-1と命名した。NEB# 816のサンプルはブダペスト条約に基づき、１９９２年１２月３日にRockville 、MarylandのAmerican Type Culture Collectionに寄託してあり、受託番号は６９１３９号である。
【００５３】
１２.NotI 制限エンドヌクレアーゼはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）を含む富裕培地を入れた発酵器中でレイト−ログ期(late-log phase)まで増殖させることによりNEB# 816から産生できる。次に、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えて培養物を誘導し、２時間培養を続けた。次に、細胞を遠心分離により採取した。
【００５４】
１３．NEB# 816からのNotI制限エンドヌクレアーゼの精製：以下の手順はすべて氷上または４℃で実施した。細胞１８ｇをバッファＡ（１０ｍＭ燐酸カリウムｐＨ６．９、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）７０ｍｌに再懸濁し、全力で１分間音波処理して破壊すると、Ｏ．Ｄ．２６０が０．１３となった。抽出物を４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、得られた上清をバッファＡで平衡化したホスホセルロースカラム（２．５×１５ｃｍ）に載せた。カラムをバッファＡ６０ｍｌで洗い、次に０．１Ｍから１ＭのＮａＣｌの直線勾配９００ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．２Ｍから０．３ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５％グリセロール及び０．１５％アジ化ナトリウム）に対して一晩透析し、バッファＢで平衡化したヘパリン−セルロースカラム（１．５×１７ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＢ ３０ｍｌで洗い、０．１Ｍから１．２ＭのＮａＣｌの直線勾配４００ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．５Ｍから０．６Ｍの間のＮａＣｌでヘパリンカラムから溶出され、これを集めた。集めたものをＮａＣｌを含まないバッファＢで１：１希釈し、ＮａＣｌ濃度０．３ＭのバッファＢで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（１．５×１６ｃｍ）に通した。制限酵素活性はカラムを素通りした。素通りしたものを集め、ＮａＣｌを含まないバッファＢで１：１に希釈し、ＮａＣｌ濃度０．１５ＭのバッファＢで平衡化したＰＥＩカラム（１．５×１０ｃｍ）に載せた。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗い、０．１５Ｍから１．８ＭのＮａＣｌの直線勾配３００ｍｌをかけた。制限酵素活性はＮａＣｌ０．６Ｍから０．８Ｍで溶出され、これを集めた。集めたものに、最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加えた。集めたものを保存バッファ（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１５％Triton-X 100及び５０％ｖ／ｖグリセロール）に対して透析した。この精製法で５３，０００，０００単位のNotI制限エンドヌクレアーゼが得られた。
【００５５】
この精製により得られたNotI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含まなかった。NotI制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度は次の基準を検討して調べた：１）連結：Adeno2ＤＮＡを２５倍過剰消化した後、産生されたＤＮＡ断片の９５％以上が（１６℃、５′末端濃度１−２ｕＭで）Ｔ４ＤＮＡリガーゼに連結した。これらの連結した断片の内、９５％は再度切断できた。２）長期消化：Adeno2 ＤＮＡ １μｇ及び酵素２００単位を含む反応混合物５０μｌを１６時間インキュベートした後、１単位の酵素で１時間反応したときと同じパターンのＤＮＡバンドが得られた。３）エキソヌクレアーゼ活性：超音波処理した 3Ｈ ＤＮＡ（１０5 ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む反応混合物５０μｌ中、３７℃で４時間、酵素２００単位をインキュベートした後、０．０３％未満の放射能が放出された。４）エンドヌクレアーゼの混在：１μｇのΦＸ１７４ ＲＦＩ ＤＮＡを含む反応混合物５０μｌ中、３７℃で４時間、酵素２００単位をインキュベートした後、５％未満がＲＦＩＩに変換された。５）メガベースゲノム消化：ＰＦＧ電気泳動で測定すると、０．５％アガロース中の大腸菌ゲノムＤＮＡ １μｇをNotI ２００ｕと共にNEBuffer#3 １００μｌ中で１６時間インキュベートして消化すると、５ｕで４時間の場合と同じ限定消化のバンドパターンが得られた。試験はすべて次の反応バッファ中で実施した：１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを補ったNEBuffer3 （１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）。
【００５６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００５７】
【表１】
配列番号：２
配列の長さ：２７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００５８】
【表２】
配列番号：３
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００５９】
【表３】
配列番号：４
配列の長さ：３６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の特徴
存在位置：３３
他の情報：３３位、Xaa=Tyr またはArg
存在位置：３６
他の情報：３６位、Xaa=LysAまたはLeu
配列
【００６０】
【表４】
配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６１】
【表５】
配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６２】
【表６】
配列の特徴：
配列番号：７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６３】
【表７】
配列番号：８
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６４】
【表８】
配列番号：９
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６５】
【表９】
配列番号：１０
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６６】
【表１０】
配列番号：１１
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６７】
【表１１】
配列番号：１２
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６８】
【表１２】
配列番号：１３
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６９】
【表１３】
配列番号：１４
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７０】
【表１４】
配列番号：１５
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７１】
【表１５】
配列番号：１６
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７２】
【表１６】
配列番号：１７
配列の長さ：９３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７３】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、NotI制限エンドヌクレアーゼをクローニングし、製造する好適方法を説明している。クローニング・プロジェクトを開始したときには、NotI制限−修飾系のクローニングを成功させる戦略または条件は公知ではなかった。実際、メチラーゼ選択法ではNotIメチラーゼ（及びエンドヌクレアーゼ）クローンは得られなかった。図１及び実施例１に示す蛋白質の配列決定、ＤＮＡ増幅及びクローニングの結果、また、それに続くクローンのＤＮＡ配列決定、マッピング及び特性化により、これまで知られていなかったNotI制限−修飾系をクローニングし、発現する直接経路が明らかにされる。
【図２】図２は、BamHI Lambda Dash IIライブラリーにNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅部分をハイブリッド形成させて得たN otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5 kb BamHI 断片の制限地図である。NotIエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子の位置及び配向を示す。
【図３】図３は過剰発現（overexpression）クローンpRM189-1の制限地図である。
【図４】図４はNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の５′末端のＤＮＡ配列である。
【産業上の利用分野】
本発明は、NotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
制限エンドヌクレアーゼは細菌に天然に認められる種類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混在する細菌成分を含まないように精製すると、実験室内でＤＮＡ分子を正確な断片に切断するために使用できる。この特性により、ＤＮＡ分子を単一的に同定し、また構成遺伝子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研究に不可欠な道具であることが証明されている。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実施するための生化学的な「はさみ」である。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿って特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、これと結合することによって作用する。一度結合すると、認識配列内またはその一方にある分子を切断する。制限エンドヌクレアーゼにはそれぞれ異なる認識配列に対する親和性がある。これまでに研究されている数百種の細菌から１００種以上の種々の制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【０００４】
細菌は１つの種につきわずかな制限エンドヌクレアーゼしか持たない傾向がある。エンドヌクレアーゼは一般にその酵素の由来となる細菌の名前に従って命名されている。従って、Neisseria lactamica 種は、例えば４種の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成し、これらはNlaI、NlaII 、NlaIII及びNlaIV と呼ばれている。これらの酵素は各々、配列GGCC、GATC、CATG及びGGNNCCを認識し、切断する。一方、大腸菌（Escherichia coli）RY13は１つの酵素EcoRI のみを合成し、これは配列GAATTCを認識する。
【０００５】
理論と結び付けようとするのではないが、制限エンドヌクレアーゼは天然では細菌細胞の繁栄を保護する働きをしているものと考えられる。制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼがなければ細菌を破壊するか細菌に寄生するであろうウィルスやプラスミドのような外来ＤＮＡ分子の感染に対し細菌が耐性を持つようにすることができる。制限エンドヌクレアーゼは感染するＤＮＡ分子の長さを測り、認識配列がある度にそのＤＮＡ分子を切断することによって耐性を付与する。切断されると、感染遺伝子の多くは能力を失い、ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによってさらに分解され易くになる。
【０００６】
細菌の防御系の第二の成分は修飾メチラーゼである。修飾メチラーゼは制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌が自分自身のＤＮＡを保護し、自分自身のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから識別できるための手段を提供する。修飾メチラーゼは対応の制限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド配列を認識し、その配列と結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を添加することによりその配列内にあるヌクレオチド１つ以上を化学的に修飾する。メチル化されると、認識配列はもう制限エンドヌクレアーゼに結合またはこの酵素で切断されなくなる。細菌細胞のＤＮＡは細菌の持つ修飾メチラーゼ活性で完全に修飾され、従って、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対し感受性を失う。制限エンドヌクレアーゼによる認識や切断に感受性を持つものは修飾されていない、従って、識別不能な外来ＤＮＡのみとなる。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をクローニングし、その遺伝子がコードする蛋白質を従来の精製手法に比べて大量に製造できるようになった。所望のクローン（制限エンドヌクレアーゼ遺伝子）を単離する標準的な方法は、複雑な「ライブラリー」内でこのようなクローン、すなわち１０-3−１０-4と頻度の低い場合には「ショットガン」手法で得られるクローン集団を同定する簡単で信頼性の高い方法を開発することである。この方法は、所望ではない大部分のクローンを破壊し、所望のわずかなクローンのみが生存するような選択性を持つのが好ましい。
【０００８】
ますます多くのＩＩ型の制限−修飾系がクローニングされている。最初にクローニングされた系は制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択するための手段としてバクテリオファージ感染を使用した（EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178: 717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503-1507 (1981)）。細菌に制限−修飾系が存在するとバクテリオファージ感染耐性が得られるため、クローニングした制限−修飾遺伝子を持つ細胞は原則的にファージに露出されたライブラリーから生存体として選択的に単離できる。しかし、この方法は限定された価値しか持たないことが判っている。特に、クローニングされた制限−修飾遺伝子は選択的に生存させうるに十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが発見された。
【０００９】
別のクローニングの方法は、最初にプラスミド−ボーン(plasmid-borne) として特性化されている系を大腸菌クローニングプラスミドに移入することを含んでいる（EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras & Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983); Theriault & Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985) ）。
【００１０】
第三の方法は、ますます多くの系をクローニングするために使用されており、活性メチラーゼ遺伝子の選択を含んでいる（例えば、１９８６年９月３日公開のEPO No.: 195,413及びBsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985) 参照）。制限及び修飾遺伝子はしばしば密接に結合しているため、両方の遺伝子を同時にクローニングできることが多い。しかし、この選択ではいつでも完全な制限系が得られるのではないが、メチラーゼ遺伝子のみは得られる（BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss & Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983);及びMspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983) ）。
【００１１】
一部の系では、宿主に修飾で保護されていないエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に問題が生じることがある。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡ断片に導入する場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主ゲノムを切断する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を修飾または保護しなければならない。
【００１２】
大腸菌で制限−修飾系をクローニングする際、広範なメチラーゼをクローニングする過程に、もう１つの障害があることが発見された。多くの大腸菌株（クローニングに一般に使用されているものも含む）はシトシンメチル化に関わるＤＮＡの導入に耐性な系を有している（Raleigh & Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070-9074 (1986)）。従って、クローニングにどの大腸菌株を使用するかを慎重に検討することも必要である。
【００１３】
もう１つの可能性のある問題は、供給源となる生物と大腸菌との間の転写機構の違い、例えばプロモータ及びリボソーム結合部位の差のために、一部の制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は大腸菌内で発現できないことである。メチラーゼ選択手法では、メチラーゼ遺伝子を持つプラスミドの少なくとも一部を完全に保護するのに十分なだけメチラーゼが発現される必要がある。
【００１４】
精製した制限エンドヌクレアーゼは実験室でＤＮＡを特性化し、再配列させる有用な道具であり、修飾メチラーゼもまたその程度は低いものの有用であることから、これらの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ手法で得ることは商業上重要である。このような株は精製を簡単にすると同時に商業上有用な量を製造する手段を提供するため有用であろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、Nocardia otitidis-caviarum（ＡＴＣＣ １４６３０）から得られ得るNotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関係する方法に係る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするための公知の方法はNotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子のクローニングには成功しなかった。多くの試みが行なわれ、非常に成功した活性メチラーゼ遺伝子選択法及びファージ選択法があった。ここで、上記の方法を使用するとメチラーゼとエンドヌクレアーゼ遺伝子のどちらも発現されないため、これらの方法が機能しないことが判った。従って、NotI制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニングする新規な方法が必要とされていた。新規の方法はNotI制限エンドヌクレアーゼを均質になるまで精製し、蛋白質のＮ末端及び内部臭化シアン分解断片のアミノ配列を決定することを含んでいる。アミノ酸配列を使用してＰＣＲプライマーを作成し、N. otitidis-caviarumゲノムから直接エンドヌクレアーゼの一部を増幅させ、次に、遺伝子全体を含むクローンを同定するためのプローブとして使用する。
【００１６】
本発明は制限エンドヌクレアーゼNotIを発現する形質転換した宿主にも係る。この制限エンドヌクレアーゼNotIはＤＮＡ配列５′-GCGGCCGC-３′を認識し、４塩基５′オーバーハングを残して最初の-CG-対の間でこの認識配列を切断する（Roberts, R., Nucl. Acid Res., supplement 13: 165 (1985) ）。本発明に従って製造したNotI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、実施例１のステップ２に示すような慣用手法で製造した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混在物を含まない。NotI制限−修飾系をクローニングするための１つの好適法は次のステップからなる：N. otitidis-caviarumからエンドヌクレアーゼをほぼ均質になるように精製し、Ｎ末端及び内部臭化シアン断片のアミノ酸配列を決定し、アミノ酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプライマーを作製し、このプライマーによりゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡからのエンドヌクレアーゼの一部を増幅させ、適当なベクターを選択し、N. otitidis caviarum由来のＤＮＡを含有するライブラリーを形成し、エンドヌクレアーゼの一部に対応する増幅ＤＮＡとハイブリッド形成するＤＮＡを含有するクローンを単離し、クローニングしたＤＮＡの配列を決定してエンドヌクレアーゼの先端のＤＮＡ配列を決定し、隣接したメチラーゼ（NotIメチラーゼ）を同定し、ＰＣＲによりエンドヌクレアーゼ全体を増幅させ、NotI AUG開始コドンで始まる発現ベクターに連結し、別の相容性ベクター上でEagIメチラーゼ（-CGGCCG-）で適当な宿主細胞を予め修飾し、上記のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する連結した発現ベクターを予め修飾した宿主に導入し、宿主を増殖させ、適切な発現条件で誘導し、細胞を採取し、NotIエンドヌクレアーゼを精製する。
【００１７】
詳細な説明
本発明は、NotI制限エンドヌクレアーゼをコードする組換えＤＮＡ及びこのような組換えＤＮＡから産生される酵素に係る。
【００１８】
Nocardia otitidis-caviarum 由来のNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは非常に困難であることが示されていた。多種のライブラリーが構築され、スクリーニングされているにも関わらず、標準のメチラーゼ選択手法ではメチラーゼクローンは得られていなかった。これはNotIメチラーゼが大腸菌内で保護するレベルで発現されないことによると思われる。ファージ選択法も試みられたが成功しなかった。これらの結果はNocardiaと大腸菌の間で認められた転写機構の違いと一致している。従って、NotIエンドヌクレアーゼをクローニングするには新しい方法が必要であった。
【００１９】
エンドヌクレアーゼ蛋白質をほぼ均質になるまで精製し、蛋白質の部分のアミノ酸配列を決定するために使用した。Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、エンドヌクレアーゼを臭化シアンで消化すると、約２４ｋＤ、１０ｋＤ、４ｋＤ及び３ｋＤの４つの主要なペプチド断片が得られた。２４ｋＤ、１０ｋＤ及び４ｋＤ断片については明確なアミノ酸配列が決定されたが、３ｋＤペプチドでは混合されたシグナルが得られた。２４ｋＤペプチドはエンドヌクレアーゼのＮ末端断片であることが判った。Ｎ末端領域のアミノ酸配列に基づいた縮退ＤＮＡプライマー及び１０ｋＤ断片を合成し、ゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子のこの部分をＰＣＲで増幅するために使用した。増強させた約６８０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９に二次クローニングし、配列を決定した。このＰＣＲ断片のＤＮＡ配列から推測したアミノ酸配列はＮ末端（２４ｋＤ）、１０ｋＤ及び４ｋＤペプチドから決定したNotIエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と一致しており、このＤＮＡ配列がNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を表わすことが確認された。N. otitidis-caviarum ＤＮＡのライブラリーをLambda Dash ベクター系で構築し、N. otitidis-caviarum ＤＮＡの９−２３ｋｂ挿入物を含有するクローンを生成した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の６８０ｂｐ断片をプローブとして使用し、エンドヌクレアーゼ遺伝子のこの部分を含有するLambda Dash クローンを同定した。これらのラムダクローンを精製すると、すべてのクローンが14.5kb BamHI断片を含有することが判った。プローブはBamHI 断片上で、およそ８２００−８９００の位置にマッピングされた。この結果、クローンはプローブの一方の側に約８２００ｂｐ、他方の側に約５６００ｂｐを含んでいたことから、エンドヌクレアーゼ遺伝子全体が存在するであろうことが示された。14.5kb BamHI断片をｐＵＣ１９に二次クローニングし、NotIエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼについてアッセイしたが、どちらの活性も検出されなかった。この結果は、遺伝子の上流の元のNocardiaＤＮＡがそのままの位置に残っているときにはエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は大腸菌内で発現されないことを示している。プローブの隣のＤＮＡの配列を決定し、エンドヌクレアーゼのＮ末端の正確なヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡプライマーは、ＡＴＧ開始コドン（-CATATG-）にNdeI部位を導入するNotI遺伝子のＮ末端部分から、NotI遺伝子の末端の約５００ｂｐの３−プライムであるSalI部位までNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅させるように設計した。14.5kb BamHIプラスミド及びゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡの両者から遺伝子全体を増幅させた。増幅させたＤＮＡをNdeI及びSalIエンドヌクレアーゼで切断し、予めSalI及びNdeIで切断してあるＴ７発現ベクターpSYX22に連結した。連結反応物を相容性プラスミドpACYC184上でEagIメチラーゼ（-CGGCCG-）で予め修飾したER2169コンピテント細胞に形質転換した。所望の大きさの挿入物を含有するベクターをミニプレップ（miniprepp ）法で同定した。これらのクローンを中間対数増殖期まで増殖させ、IPTGで誘導した。次に、細胞を遠心分離により採取し、音波処理バッファに再懸濁させ、音波処理により溶解させた。抽出物を清澄にし、NotIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。N. otitidis-caviarumゲノムＤＮＡ及び14.5kb BamHI断片プラスミド由来のクローンでは細胞１グラム（湿潤重量）当り５，０００，０００単位のNotI活性が得られた。
【００２０】
NotI制限遺伝子をクローニングし、発現させるのに好適な、本明細書に記載の方法は図１に説明するが、次のステップを含んでいる：
１．Nocardia otitidis-caviarumのＤＮＡを精製する。
【００２１】
２．NotI制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を標準の蛋白質精製手法で均質になるまで精製する。
【００２２】
３．精製したNotIエンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定する。精製したNotIエンドヌクレアーゼを臭化シアン消化して内部ペプチド断片を生成し、これらの断片からアミノ酸配列を決定する。
【００２３】
４．Ｎ末端及び内部ペプチド断片のアミノ酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプライマーを合成する。これらのプライマーを使用して、ＰＣＲ手法により、N. otitidis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を増幅する。
【００２４】
５．N. otitidis-caviarum ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ例えばBamHI またはそのアイソシゾマーのいずれかで完全及び／または部分的に消化し、切断して、Lambda Dash IIまたはNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を含有する任意の同様なベクターにクローニングできる断片を作製する。
【００２５】
６．消化したＤＮＡをラムダファージクローニングベクターに連結する。得られた混合物をin vitroでパッケージし、適当な宿主例えば大腸菌株ER1458（New England Biolabs, Inc., Beverly, MAから市販されている）を感染させるために使用する。パッケージしたファージの一部を植え付け、得られたプラークを計数することにより、感染性ファージの力価を測定する。
【００２６】
７．in vitroでパッケージしたファージは富裕培地上で適当な大腸菌宿主例えばER1458の軟寒天ローンに種々の密度で植え付けるのが好ましい。インキュベーションした後、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するファージを、プラークのニトロセルロースフィルターリフトに対するプローブとしてNotIエンドヌクレアーゼのＰＣＲ由来の部分を使用して、Benton-Davisのサザン・ハイブリッド形成により同定する。陽性のプラークをプレートから取り出し、プレーティングとハイブリッド形成を数回連続して実施することにより精製する。
【００２７】
８．上記クローン上のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定し、従ってクローンがエンドヌクレアーゼ遺伝子全体及び任意の隣接したメチラーゼ遺伝子をコードするために十分なＤＮＡを含有しているかを決定するために、クローニングした断片の制限地図を作成し、上記と同じプローブを使用してクローンの種々の制限消化物へのサザン・ハイブリッド形成によりエンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端部分の位置を決定する。制限遺伝子全体をコードするのに十分なＤＮＡがある場合、ステップ９に進む。プローブの３′側に完全な制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡがない場合には、さらに多くのクローンをスクリーニングする、及び／または、クローンの別のライブラリーを作成する。
【００２８】
lambda Dash ベクター内のN. otitidis-caviarum ＤＮＡ挿入物をプラスミドベクター例えばpUC19 （ATCC# 37254 ）にサブクローニングし、挿入物のマッピング及び遺伝子操作を簡単にすることができ、クローンがNotIエンドヌクレアーゼまたはメチラーゼのいずれを生成するかを決定することができる。本発明では、pUC19 中いずれの配向の14.5kb BamHI断片のクローンもin vitroで検出可能な量のNotIエンドヌクレアーゼは産生しなかった。この断片も４つのNotI部位を含んでおり、これらは全てin vitroでNotIで完全に切断され、このことはin vivo でNotIメチラーゼ活性がないことを示していた。
【００２９】
９．Ｎ末端から内部１０ｋＤ臭化シアン断片プローブを含むまたはそれに隣接したＤＮＡの配列決定し、遺伝子の配向、遺伝子のＮ末端の正確なＤＮＡ配列を決定し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接したシトシンメチラーゼ遺伝子の存在についてチェックする。
【００３０】
１０．NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現する：
制限遺伝子を含有するクローンを過剰発現できる方法は多数ある。ＤＮＡ配列及び詳細なマッピングは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現する最良の方法を決定する手助けとなる。過剰発現の１つの方法では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の幾分下流に直接ハイブリッド形成するプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅する。得られたＤＮＡ断片を切断して、エンドヌクレアーゼ遺伝子の前にあるNocardia ＤＮＡを全て取り出すことができ、これを発現ベクター例えば誘導可能なプロモータ（例えばＴ７）のすぐ下流にあるpSYX22に挿入できる。また、大腸菌が強く認識するプロモータ例えばpAGR3 上のPtac（New England Biolabs から入手できる）を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始の直前に挿入することにより過剰発現を実施できる。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始と終了の近くの好都合な制限部位及びpAGR3 のプロモータの近くの相容性の制限部位を見つけ、制限遺伝子をPtacプロモータと並べてpAGR3 に移すことにより実施できる。使用できるその他の調節プロモータはpUC19 及びpBR322誘導体上のPlacUV5 （Fuller, Gene 19: 43-54 (1982) ）及びλPL（Shimatake & Rosenberg, Nature 254: 128 (1981) ）である。また、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346 (1974) ）を遺伝子の前に置いて発現を増やすことができる。
【００３１】
１１．本発明によると、制限エンドヌクレアーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護する。これは、別のプラスミド上で、NotIメチラーゼまたは、NotI制限部位に重なる部位を修飾することによりNotI消化から保護するEagIのような異種のメチラーゼにクローニングすることにより実施できる。使用するプラスミドは発現ベクターと相容性でなければならない。メチラーゼも、過剰に発現された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産生されなければならない。本発明では、コピー数の低いプラスミド例えばpACYC184（Chang & Cohen, J. Bacteriol., 134: 1131 (1987)）にクローニングしたEagIメチラーゼ遺伝子はNotI消化から宿主ゲノムを適切に保護することが判った。
【００３２】
遺伝子のＤＮＡ配列は部位特異的変異によって、または遺伝子自体を再合成することにより、大腸菌内でさらに効率的に利用されるコドンを使用するよう変化させることができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 151: 389-409 (1981)）。本発明では、エンドヌクレアーゼ遺伝子の第二及び第三コドンを、ＰＣＲ増幅法により大腸菌が最もよく使用するコドンに変化させた。
【００３３】
１２．製造：NotIエンドヌクレアーゼは、EagIメチラーゼ遺伝子（またはNotIメチラーゼ遺伝子）及び過剰に発現させたNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を持つクローンから、富裕培地中で培養器で増殖させ、適当に抗生物質選択させ、誘導することにより製造できる。次に、細胞を遠心分離により採取し、音波処理により破壊して、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性を持つ未精製の細胞抽出物を製造する。
【００３４】
１３．精製：NotI制限エンドヌクレアーゼを含有する未精製細胞抽出物は、標準の蛋白質精製手法例えば親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーで精製する。
【００３５】
上記に概説したステップは本発明を実施するための好ましい態様を示しているが、当業者には上記方法を当業界で公知の手法に準じて変化させうることは明らかであろう。
【００３６】
以下の実施例は本発明の好適実施態様を説明するために示している。この実施例は説明のためのものであり、本発明は特許請求の範囲に示される以外には、この実施例によって制限されないものであることは理解されよう。
【００３７】
実施例
実施例１ NotI 修飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．ＤＮＡの精製：Nocardia otitidis-caviarumのＤＮＡを調製するために、細胞ペースト６ｇを１０分間静かに振とうさせて、２５％蔗糖、０．０５Ｍトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍｌ中に再懸濁させた。０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌと調製したばかりの０．２５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．０）中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを加え、溶液を４℃で１６時間インキュベートした。次に、懸濁液を液体窒素で急速に凍結させ、次に３７℃の水浴で解凍することを３回繰り返した。プロテアーゼＫを最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、５０℃で１６時間インキュベートした。溶液を平衡化したフェノール５０ｍｌで抽出し、水相を回収し、クロロホルム５０ｍｌで２回抽出した。１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）と１容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させ、遠心分離によって回収した。ＤＮＡペレットを１時間空気乾燥させ、次に１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含むＤＮＡバッファ（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度０．４Ｍとなるように加え、１容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物をガラス棒で溶液から取り出し、空気乾燥させ、１．５ｍｌのＤＮＡバッファに最終濃度が約２００μｇ／ｍｌとなるように溶解した。
【００３８】
２．Nocardia otitidis-caviarumからのNotI制限エンドヌクレアーゼの精製：NotI制限酵素はリッチ・ブロスを含む培養器で中間対数増殖期まで増殖させることによりNocardia otitidis-caviarumから作製できる。細胞は遠心分離によって採取する。以下の手順は全て氷上または４℃で実施した。３８４ｇの細胞をバッファＡ（１０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）７７０ｍｌに再懸濁し、１１，５００ＰＳＩＧのGaulonホノジェナイザーに５回通して破壊した。抽出物を４℃で４０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をバッファＡで平衡化したホスホセルロースカラム（５×１２ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＡ２００ｍｌ、次にバッファＡ１１００ｍｌと１．５ＭまでＮａＣｌを添加したバッファＡ１１００ｍｌで作製したＮａＣｌ直線勾配で洗った。２５ｍｌの画分を集めた。制限酵素活性プールは０．４Ｍから０．６ＭのＮａＣｌでカラムから溶出され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＮＨ4 ＳＯ4 、５％グリセロール及び０．１５％アジ化ナトリウム）に対して一晩透析した。次に、集めたものをバッファＢで平衡化したBaker-bond Wide-pore PEI(NH)（登録商標）カラム（１．５×１６ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＢ３０ｍｌ、次に、０．１Ｍから１．６ＭのＮａＣｌを加えたバッファＢの直線勾配４００ｍｌで洗った。制限酵素活性のピークは０．６−０．８ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。PEI プールを一晩バッファＣ（１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）に対し透析し、次にバッファＣで平衡化したMono-Q（登録商標）カラム（Pharmacia ）に載せた。０．１Ｍ−０．６ＭのＮａＣｌ直線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．３ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。Mono-Q（登録商標）で集めたものを３倍容量のバッファＤ（２０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）で希釈し、５０ｍＭ ＮａＣｌでMono-S（登録商標）（Pharmacia ）にかけた。バッファＤ中５０ｍＭから０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．２５ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。二番目のMono-Qカラムを上記のように流し、エンドヌクレアーゼ蛋白質が確実に均質になるようにした。最終的なNotI制限エンドヌクレアーゼ調製物ではクーマシーブルーR-250 で染色した１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約４２ｋＤの１つの主要なバンドが得られた。
【００３９】
３．上記２で製造したNotI制限エンドヌクレアーゼをMatsudairaの手順（Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262: 10035-10038 (1987)）に従って電気泳動にかけエレクトロブロットし、上記のように修飾した（Looney, M.C., Moran, L.S., Jack, W.E., Feehery, G.R., Benner, J.S., Slatko, B.E. & Wilson, G.G., Gene 80: 193-208 (1989)）。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、約４２ｋｄの蛋白質のバンドを切り出し、逐次分解にかけた（Waite-Rees, P.A., Keating, C.J., Moran, L.S., Slatko, B.E., Hornstra, L.J. & Benner, J.S., J. Bacteriol. 173: 5207-5219 (1991)）。
【００４０】
４２ｋｄ蛋白質の最初の１５残基はMet-Arg-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile 、配列番号１に対応した。２０μｌ中２０μｇのNotIエンドヌクレアーゼの別の試料を、暗室内、室温で、２４時間、８８％蒸留ギ酸２００μｌに溶解した２ｍｇの臭化シアンで処理した。この反応混合物を蒸発乾固させ、２０μｌのローディング・バッファ（１．５Ｍ トリス塩酸 ｐＨ８．５、１２％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０５％ Serva Blue G、０．０５％ Phenol Red）に１００℃で５分間再懸濁させた。この試料をトリス−トリシン１０−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Novex ）上の電気泳動に３時間かけ、次に１０ｍＭのＣＡＰＳバッファ（１０ｍＭ ３−［シクロヘキシルアミノ］−プロパンスルホン酸、１０％メタノール、０．０５％ ＳＤＳ、０．００５％ジチオスレイトール、ＮａＯＨでｐＨ１１．０に調整）を使用し、タンク・エレクトロブロッター（TE52、Hoeffer ）中、２００ボルトで１８時間かけて、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Problott, Applied BIosystems Inc. ）に移した。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色すると、２４ｋｄ、１０ｋｄ、４ｋｄ及び３ｋｄの主要なバンドが認められた。これらの染色された蛋白質バンドを膜から切り出し、各々を逐次分解（２）にかけた。２４ｋｄペプチドの最初の２７残基はMet-Arg-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile-Ala-Glu-Phe-Phe-Gly-X-X-Val-Tyr-Pro-Glu-Val 、配列番号２に対応した。残基２１及び２２は同定されなかった。従って、この断片はエンドヌクレアーゼのＮ末端からのものであると決定した。他のすべての断片は蛋白質内部からMet 残基で臭化シアンにより内部切断されて得られたものである。１０ｋｄペプチドの最初の９残基はAla-Tyr-Lys-Phe-Ala-Leu-Ser-Gly-Arg 、配列番号３に対応した。４ｋｄペプチドの最初の３６残基はAsp-Phe-His-Gly-Ser-Tyr-Lys-His-ALa-Val-Gly-Ala-Ile-Asp-Ile-Ala-Leu-Val-Glu-Gly-Ile-Asp-Phe-His-Gly-X-Leu-Pro-Thr-Pro-Ala-Gly-(TyrまたはArg)-Ala-Ala-(Lys またはLeu)、配列番号４に対応した。残基２６は決定されておらず、残基３３及び３６はいくらか不明確であった。この３ｋｄペプチドバンドはほとんどのサイクルで２つのシグナルを出し、２つのペプチドの混合物と思われた。
【００４１】
４．無傷のNotIエンドヌクレアーゼ、２４ｋｄ及び１０ｋｄペプチドからのペプチド配列データ及びその既知の配向を使用して一連の８個のＰＣＲプライマーを構築した：
１）GA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号５
２）AA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号６
３）GA SGC GAA CTT GTA SGC CAT 20-mer 、配列番号７
４）GAR CCN GAR GGN GCN AAR TTY AT 23-mer 、配列番号８
５）GAG CCS GAG GGS GCS AAG TTC AT 23-mer 、配列番号９
６）AAR TTY ATH GCN GAR TTY TTY GG 23-mer 、配列番号１０
７）AAG TTC ATC GCS GAG TTC TTC GG 23-mer 、配列番号１１
８）GTN TAY CCN GAR 14-mer、配列番号１２
［式中、 Y = T, C；R = A, G；H = A, T, C ；S = G, C；N = A, C, G, T］。
【００４２】
プライマー１から３はNotI １０ｋｄ ＣＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の５′末端に向かってプライムするように作製した。プライマー４から８はNotI２４ｋｄ ＣＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の３′末端に向かってプライムするように作製した。プライマー３、５及び７ははっきりしない位置にはＡまたはＴ残基を全く持たない。
【００４３】
５．プライマー３、５、７及び８を使用して遺伝子のＮ末端領域（プライマー５、７及び８）と１０ｋｄ臭化シアン断片のアミノ末端（プライマー３）の間のエンドヌクレアーゼ遺伝子の部分を増幅させた。３種のＭｇ++濃度と４種のアニーリング温度を試みた。マスター反応混合物は、１０×Vent（登録商標）反応バッファ６５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ ７μｌ、４ｍＭのｄＮＴＰ溶液４０μｌ、ＤＭＳＯ ３３μｌ、Nocardia otitidis-caviarum ＤＮＡ ３．５μｌ（７００ｎｇ）、ｄＨ2 Ｏ ４０８μｌ、プライマー３ １３μｌ（６５０ｎｇ）、プライマー５ １３μｌ（６５０ｎｇ）及びVentexo-（登録商標）ポリメラーゼ２０μｌ（４０ｕ）を含むように調製した。混合物を２００μｌずつの３つのアリコートに分けた。最初のアリコートにはｄＨ2 Ｏを１６μｌ（最終Ｍｇ++濃度＝２ｍＭ）、２番目のアリコートには１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を６μｌとｄＨ2 Ｏを１０μｌ（［Ｍｇ++］＝５ｍＭ）、３番目のアリコートには１００ｍＭのＭｇＳＯ4 を１６μｌ（［Ｍｇ++］＝１０ｍＭ）加えた。これらの反応混合物を４つに分け、４種のアニーリング温度で増幅させた。プライマー３とプライマー７を使用する反応とプライマー３とプライマー８を使用する反応は同様に実施した。ＰＣＲ増幅条件は９５℃で１分、４５℃（または５０℃、５５℃、６０℃）で１分、７２℃で１分半を３５サイクルであった。ＰＣＲ反応生成物１５μｌを１％アガロースゲル塩基泳動で分析した。所望の大きさのバンドが、プライマー３からプライマー５について、２ｍＭ Ｍｇ++／アニーリング温度６０℃以外の反応の全てで認められた。プライマー３とプライマー７の反応では、５ｍＭ中、４５℃でアニーリングした反応、１０ｍＭのＭｇ++中、５０℃及び５５℃でアニーリングした反応の３つの全ての反応で所望の大きさのバンドが得られたが、他の条件での反応では得られなかった。プライマー３とプライマー８の組み合わせでは、５ｍＭと１０ｍＭのＭｇ++で４５℃でアニーリングした場合と、１０ｍＭのＭｇ++で５０℃でアニーリングした場合のみに所望の大きさのバンドが得られた。所望の大きさのバンドを１％ＬＭＰアガロースの電気泳動にかけ、ゲルから切り出し、６５℃で５分間溶融させ、４０℃に５分間冷却し、β−アガロース（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）１μｌ（１ｕ）を加え、４０℃で１時間インキュベートすることによりアガロースを消化した。
【００４４】
６．部分消化：精製したＤＮＡをBamHI で切断して、次のように部分消化した：NEBuffer BamHI（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）中５０μｇ／ｍｌのNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡ５００μｌを１００μｌのアリコート１つと５０μｌのアリコート７つに分けた。１００μｌの試験管にBamHI ２０単位を加えると、ＤＮＡ１μｇ当り酵素４単位となった。最初の試験管から５０μｌ取り、２番目の試験管に移し、BamHI ２単位／μｇとし、前のBamHI 量の半分となるようにこれを続けた。試験管を３７℃で１時間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽出し、２容のエタノールで沈澱させ、乾燥させ、２０μｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、各３μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。限定消化されたことを示す試験管と中等度の不完全な消化を示す試験管をクローニング用断片の供給源として選んだ。別々の反応物を一緒に合わせて混合し、下記ステップ７に記載するように使用した。
【００４５】
７．BamHI ライブラリー：BamHI ゲノムライブラリーはベクターLambda Dash（登録商標） II （Stratagene）を使用して構築した。lambda Dash II は９−２３ｋｂのＤＮＡ断片のクローニングに使用できるラムダ置換ベクターである。上記のようにBamHI で完全にまたは部分的に消化したNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）をBamHI で切断したLambda Dash II アーム５００ｎｇ（０．５μｌ）と混合した。１×１０3 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有する２×連結混合物（１００ｍＭ トリス ｐＨ７．８、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＤＤＴ、２ｍＭ ＡＴＰ）２．５μｌを加え、混合物を１７℃で１６時間インキュベートした。製造業者の支持に従ってGigapack（登録商標）II Plus （Stratagene）を使用して、連結反応物２．５μｌをin vitroで感染性ファージ粒子にパッケージした。室温で２時間インキュベートした後、パッケージしたファージを５００μｌのＳＭ（ＳＭ＝１００ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、５０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）とクロロホルム３滴で希釈した。感染性ファージ粒子のタイターは次のように測定した。パッケージしたファージの溶液２μｌをＳＭ １９８μｌで希釈した。希釈したファージの１μｌ、１０μｌ及び１００μｌのアリコートを新しいER1458細胞の懸濁液（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600 ＝２．０中）１００μｌに加え、室温で１５分間インキュベートし、次に４０℃でトップアガー（top agar）３ｍｌと混合し、リッチ・プレートに広げた。トップアガーが固まった後、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、プラークを計数し、次の実験に使用するファージ・ストックのタイターを計算すると、２．８×１０5 ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００４６】
８．上記のようにin vitroでパッケージしたファージを植え付け、大腸菌ER1458のローン中によく分離されたプラークを形成した。約６００、１５００、３０００及び５０００ファージのプレートを作製した。lambda Dash II BamHI ライブラリーからのこれらのクローンのニトロセルロースフィルター・プラーク・リフトを、放射性標識し（Random Priming System I, New England Biolabs, Inc. Beverly, MA）ゲル精製したプライマー３からプライマー５の増幅反応からのＰＣＲ生成物（上記）（Benton-Davis法、Molecular Cloning, a Laboratory Manual、T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982, pp 320ff）でプロービングした。１７個の陽性プラークを同定したところ、全部が精製プラークであった。ＤＮＡを６つのファージの（トップアガロース中の）集密的なプレート溶解物から調製し、BamHI で消化した。６個全てが共通の14.5kb BamHI断片を含んでおり、これにプライマー３からプライマー５のプローブをハイブリッドさせた。
【００４７】
９．14.5kb BamHI断片のマッピング：マッピングを容易にするために、lambdaDash II クローンで同定したNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5kb BamHI断片をpUC19 にサブクローニングし、クローンpNOTB14.5 を作製した。pNOTB14.5 クローンを製造者の指示に従って種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片の制限地図を決定した（図２）。このクローン上のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置はプライマー３からプライマー５のプローブ（上記）をクローンの制限消化物にサザン・ハイブリッド形成させて決定した（Southern, E. 1975, J. Mol. Biol., 98:503）。この中では、HindIII 、PflMI 、XbaI、ClaI及びBstBI 消化物が14.5kb BamHI断片上のプローブの位置決定に特に有用であった（図２）。プローブはBamHI 断片の一方に約８２００ｂｐ、他方に５６００ｂｐを持つ中央部近くとハイブリッドし、このことは、制限及び修飾遺伝子全体を含有するのに十分なＤＮＡが存在することを示している。pNOTB14.5 クローンを増殖させ、NotI制限活性についてアッセイしたが、何も検出されなかった。クローニングしたＤＮＡで４つの部位を完全に切断するNotI酵素能で評価されたように、in vivo でメチラーゼ活性は検出されなかった。
【００４８】
プローブ近くのクローンの領域の配列決定を容易にするために、pNOTB14.5 の種々のサブクローンを構築した。サブクローンは、クローンの部分を欠失させることにより、または制限酵素で切断し、所望の断片をゲルで調製し、適切に切断し、脱燐酸化したpUC19 ベクターに連結して作製した。所望の構築物のクローンは、ミニプレップを実施し、精製ＤＮＡを消化し、アガロースゲル電気泳動で分析して同定した。
【００４９】
プラスミドクローンの分析：アンピシリンを含有するＬブロスの培養物１０ｍｌに各形質転換細胞を接種し、形質転換細胞を含むプラスミドをBirnboin & Doly （Nucleic Acids Res. 7: 1513, 1979）の方法から適用したミニプレップ・プラスミド精製手順で調製した。
【００５０】
ミニプレップ手順：各培養物を８０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２５ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース（ｐＨ８．０）１ｍｌに再懸濁させた。室温に１０分間置いた後、０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ２．０ｍｌを各試験管に加え、試験管を振って細胞を溶解させ、氷上に置いた。溶液が透明になったら、各試験管に３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを加えて、振った。形成された沈澱物を４℃で１５０００ｒｐｍで１０分間回転させて沈澱させた。イソプロパノール３ｍｌを含む遠心管に各上清を加え、混合した。室温に１０分置いた後、遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間回転させて、沈澱した核酸をペレットとした。上清を捨て、ペレットを室温で３０分間、空気乾燥させた。乾燥したら、ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む１０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌに溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、次に３５０μｌのイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。室温に１０分間置いた後、５分間遠心分離してＤＮＡを沈澱させた。上清を捨て、ペレットを乾燥させ、次に１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ １５０μｌの最終溶液に再溶解させた。次に、プラスミド・ミニプレップを種々の制限エンドヌクレアーゼによる消化で分析した。
【００５１】
１０．ＤＮＡ配列決定：ＤＮＡ配列決定は、製造者の指示に従ってCircumvent（登録商標） DNA配列決定キット（New England Biolabs ）を使用して実施した。ミニプレップＤＮＡ調製物を鋳型として使用した。ＤＮＡ配列決定は次の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体をクローニングし、クローニングした遺伝子の大腸菌での発現を誘導するための操作の元となるデータを提供した。ＤＮＡ配列から推定のアミノ酸配列はＮ末端（２４ｋＤペプチド）、１０ｋＤ、４ｋＤ及び推定された２つの小さなペプチド（約３ｋＤ）の蛋白質配列と一致し、ペプチド断片の順序が２４ｋＤ、４ｋＤ、３（Ａ）ｋＤ、１０ｋＤ、３（Ｂ）ｋＤであることを示した。蛋白質のＮ末端の正確なＤＮＡ配列を使用してNotI遺伝子を発現するためのＰＣＲ増幅プライマーを設計した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流にあるSalI部位の周りの配列を使用して第二のＰＣＲ発現プライマーを設計した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流の配列は典型的な大腸菌転写因子を含んでおらず、これはpNOTB14.5 から発現されないことと一致している。エンドヌクレアーゼの出発点から４４ｎｔで分離された、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子に先立ち、同じ配向にある読み取り枠で、β型Ｎ４−メチルシトシンメチラーゼ遺伝子のコンセンサスモチーフ、モチーフＩＶ＝Ile-Thr-Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Gly-Met-Arg-Thr-Tyr （配列番号１３）及びモチーフＩ＝Gly-Gly-Leu-Val-Leu-Asp-Pro-Phe-Ala-Gly-Thr-Gly-Arg-Ala （配列番号１４）（Wilson, G.G., Methods in Enzymology, 216: Recombinant DNA Part G、Wu, R.編、Academic Press, 1992, pp259-279 ）が認められた。このデータは連結Ｒ−Ｍシステムと一致する。
【００５２】
１１．NotI制限エンドヌクレアーゼの過剰発現：制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクターpSYX22の誘導可能なプロモータ（Ｔ７）及び強力に認識されるリボソーム結合部位のすぐ下流に遺伝子を挿入することにより過剰発現させた。これを実施するために、ＤＮＡ配列及び蛋白質配列データを使用して２つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。最初のオリゴヌクレオチドプライマーはＡＴＧコドンに重なる配列を含有しており、蛋白質配列決定から、エンドヌクレアーゼの開始部分であるが、３個の塩基が変化してNdeI部位を形成し、エンドヌクレアーゼの第二及び第三コドンの３位の塩基が大腸菌が使用するのに好ましいコドンに変化していた：５′ GACG CAT ATG CGT TCC GAT ACG TCG GTG GAG CCA GAG ３′配列番号１５（NdeI部位は下線で示し、N. otitidis-caviarum配列から変化したヌクレオチドは太字で示す）。第二のオリゴヌクレオチドプライマーはNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子末端の３′に約５００個のヌクレオチドの配列を含み、増幅させた後の断片のクローニングを助けるためにプライマーに含まれている、N. otitidis-cavariarum ＤＮＡ中のSalI部位を有している：５′ GAAT GTC GAC CAT CTC CAC CCA CG 3′配列番号１６（SalI部位を下線で示す）。これらの２つのプライマーは、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲ反応（９５℃１分間、５６℃１分間、７２℃２分間；pNOTB14.5 から１０サイクル、ゲノムＤＮＡから１０サイクル）に、鋳型としてのゲノムN. otitidis-caviarum ＤＮＡ及びpNOTB14.5 プラスミドと共に使用し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む1.7kb ＤＮＡ断片を増幅させた。ステップ５に述べたように、バンドをゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を２０ＵのNdeI及び２０ＵのSalIを使用し、１×NEBuffer 3で１時間消化した。インキュベーションした後、消化物をフェノールとクロロホルムの１対１混合物で１回、クロロホルムで１回抽出し、２容のエタノールで沈澱させた。ＤＮＡを遠心分離によりペレットととし、７０％エタノールで１回洗い、乾燥させ、２０μｌのＴＥに再懸濁させた。精製した断片３μｌ（〜０．１μｇ）をＴ７発現ベクターpSYX22（S. Xu, New England Biolabsから入手）に連結した。このベクターはＴ４ ＤＮＡリガーゼ４００Ｕを含む全容量２０μｌ中、１７℃で４時間、NedI及びSalI（〜０．０５μｇ）で消化してあった。［pSYX22の誘導体化：pET-11a はＴ７プロモータの４ｂｐ下流にlac オペレータ（このＴ７プロモータとlac オペレータをＴ７ｌａｃプロモータと呼ぶ）、lacIq 遺伝子、及びクローニング用の２つの制限部位、NdeI及びBamHI を含むpBR322由来のＴ７発現ベクターである（Dubendorff, J.W. & Studier, F.W., J. Mol. Biiol. 219: 45-59, 1991 ）。］Ｔ７プロモータの上流のrrnB転写ターミネータを４コピー含むpET-11a 誘導体、pAII17を構築した（pAII17はNew England Biolabs, Beverly, MAのWilliam Jackが作製した）。Ｔ７プロモータの上流にある転写ターミネータはさらに標的遺伝子の発現の基礎レベルを下げる。クローニングが容易なように、ベクターのBamHI 部位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片に充填し、SalIリンカーを挿入してBamHI 部位を置換した。このプラスミドをpSYX22.Jとした。連結物１０μｌを使用して、pEagM184-AのEagIメチラーゼ遺伝子で予め修飾したコンピテント大腸菌ＥＲ２１６９（New England Biolabs, Inc., Beverly, MAから入手できる）を形質転換した。［EagIメチル化認識部位CGGCCGはNotI制限エンドヌクレアーゼ認識部位と重なり合っており、従って宿主をNotIによる消化から保護する。pEagM184-Aはp15A複製開始点に camr 及びTcr 遺伝子を持つコピー数の低いプラスミドであるpACYC184由来である。Tcr 遺伝子に挿入したメチラーゼ遺伝子はTcプロモータから本質的に発現できる］。形質転換した細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天に植え付けた。ステップ９に記載のミニプラスミド・プレップ手順を使用して、プラスミドをゲノムＤＮＡとpNOTB14.5 由来の増幅ＤＮＡの両者からの各々１４個のコロニーから単離した。各ミニプレップ５μｌをNdeI及びSalIの両方で消化したものを、pAII17をNedI及びSalIの両方で消化したものと比較した。１４個のゲノム由来のクローンの内１つと１４個のpNOTB14.5 由来のクローンの内の２つは約１．７ｋｂの挿入物を含んでいた。これらの３つのクローン全部をさらに特性化するために選択した。これらの３つのクローンをアンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する２００ｍｌのＬブロス中でＫｌｅｔｔが８０（中間対数増殖期）になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導２時間後、細胞（約０．８ｇ）を遠心分離によって採取し、冷い音波処理バッファ（２０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で一回洗い、音波処理バッファ３ｍｌに再懸濁し、氷上で音波処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各抽出物４．５μｌをＤＮＡアッセイ混合物（NEBuffer NotI ５０μｌにAdeno2 ＤＮＡ １μｇを含む）７５μｌと混合した。この試験管からの２５μｌをＤＮＡ混合物５０μｌと混合し、１：２希釈とした。さらに３回続けて１：２希釈した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートした。反応混合物２０μｌを１％のアガロースゲルにかけた。３つのクローンはすべてこのアッセイで正確にタイターを測定するには強すぎるNotI制限エンドヌクレアーゼ活性を示した。しかし、酵素のタイターは細胞１ｇ当り２．５×１０5 単位より大きいと概算された。さらに滴定すると、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性は細胞１ｇ当り約５×１０6 単位となった。このレベルはNocardia otitidis-caviarumの未精製抽出物で認められる細胞１ｇ当りのNotI制限エンドヌクレアーゼ活性の約１０００倍である。これらのクローンの１つをさらに特性化するために選択し、株NEB# 816と表わし、プラスミドはpRM189-1と命名した。NEB# 816のサンプルはブダペスト条約に基づき、１９９２年１２月３日にRockville 、MarylandのAmerican Type Culture Collectionに寄託してあり、受託番号は６９１３９号である。
【００５３】
１２.NotI 制限エンドヌクレアーゼはアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍｌ）を含む富裕培地を入れた発酵器中でレイト−ログ期(late-log phase)まで増殖させることによりNEB# 816から産生できる。次に、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで加えて培養物を誘導し、２時間培養を続けた。次に、細胞を遠心分離により採取した。
【００５４】
１３．NEB# 816からのNotI制限エンドヌクレアーゼの精製：以下の手順はすべて氷上または４℃で実施した。細胞１８ｇをバッファＡ（１０ｍＭ燐酸カリウムｐＨ６．９、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール）７０ｍｌに再懸濁し、全力で１分間音波処理して破壊すると、Ｏ．Ｄ．２６０が０．１３となった。抽出物を４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、得られた上清をバッファＡで平衡化したホスホセルロースカラム（２．５×１５ｃｍ）に載せた。カラムをバッファＡ６０ｍｌで洗い、次に０．１Ｍから１ＭのＮａＣｌの直線勾配９００ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．２Ｍから０．３ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５％グリセロール及び０．１５％アジ化ナトリウム）に対して一晩透析し、バッファＢで平衡化したヘパリン−セルロースカラム（１．５×１７ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＢ ３０ｍｌで洗い、０．１Ｍから１．２ＭのＮａＣｌの直線勾配４００ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．５Ｍから０．６Ｍの間のＮａＣｌでヘパリンカラムから溶出され、これを集めた。集めたものをＮａＣｌを含まないバッファＢで１：１希釈し、ＮａＣｌ濃度０．３ＭのバッファＢで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（１．５×１６ｃｍ）に通した。制限酵素活性はカラムを素通りした。素通りしたものを集め、ＮａＣｌを含まないバッファＢで１：１に希釈し、ＮａＣｌ濃度０．１５ＭのバッファＢで平衡化したＰＥＩカラム（１．５×１０ｃｍ）に載せた。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗い、０．１５Ｍから１．８ＭのＮａＣｌの直線勾配３００ｍｌをかけた。制限酵素活性はＮａＣｌ０．６Ｍから０．８Ｍで溶出され、これを集めた。集めたものに、最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を加えた。集めたものを保存バッファ（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１５％Triton-X 100及び５０％ｖ／ｖグリセロール）に対して透析した。この精製法で５３，０００，０００単位のNotI制限エンドヌクレアーゼが得られた。
【００５５】
この精製により得られたNotI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含まなかった。NotI制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度は次の基準を検討して調べた：１）連結：Adeno2ＤＮＡを２５倍過剰消化した後、産生されたＤＮＡ断片の９５％以上が（１６℃、５′末端濃度１−２ｕＭで）Ｔ４ＤＮＡリガーゼに連結した。これらの連結した断片の内、９５％は再度切断できた。２）長期消化：Adeno2 ＤＮＡ １μｇ及び酵素２００単位を含む反応混合物５０μｌを１６時間インキュベートした後、１単位の酵素で１時間反応したときと同じパターンのＤＮＡバンドが得られた。３）エキソヌクレアーゼ活性：超音波処理した 3Ｈ ＤＮＡ（１０5 ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む反応混合物５０μｌ中、３７℃で４時間、酵素２００単位をインキュベートした後、０．０３％未満の放射能が放出された。４）エンドヌクレアーゼの混在：１μｇのΦＸ１７４ ＲＦＩ ＤＮＡを含む反応混合物５０μｌ中、３７℃で４時間、酵素２００単位をインキュベートした後、５％未満がＲＦＩＩに変換された。５）メガベースゲノム消化：ＰＦＧ電気泳動で測定すると、０．５％アガロース中の大腸菌ゲノムＤＮＡ １μｇをNotI ２００ｕと共にNEBuffer#3 １００μｌ中で１６時間インキュベートして消化すると、５ｕで４時間の場合と同じ限定消化のバンドパターンが得られた。試験はすべて次の反応バッファ中で実施した：１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを補ったNEBuffer3 （１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．９）。
【００５６】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００５７】
【表１】
配列の長さ：２７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００５８】
【表２】
配列の長さ：９
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００５９】
【表３】
配列の長さ：３６
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列の特徴
存在位置：３３
他の情報：３３位、Xaa=Tyr またはArg
存在位置：３６
他の情報：３６位、Xaa=LysAまたはLeu
配列
【００６０】
【表４】
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６１】
【表５】
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６２】
【表６】
配列番号：７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６３】
【表７】
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６４】
【表８】
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６５】
【表９】
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６６】
【表１０】
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６７】
【表１１】
配列の長さ：１４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６８】
【表１２】
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００６９】
【表１３】
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７０】
【表１４】
配列の長さ：３７
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７１】
【表１５】
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７２】
【表１６】
配列の長さ：９３
配列の型：核酸
鎖の数：不明
トポロジー：不明
配列
【００７３】
【表１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、NotI制限エンドヌクレアーゼをクローニングし、製造する好適方法を説明している。クローニング・プロジェクトを開始したときには、NotI制限−修飾系のクローニングを成功させる戦略または条件は公知ではなかった。実際、メチラーゼ選択法ではNotIメチラーゼ（及びエンドヌクレアーゼ）クローンは得られなかった。図１及び実施例１に示す蛋白質の配列決定、ＤＮＡ増幅及びクローニングの結果、また、それに続くクローンのＤＮＡ配列決定、マッピング及び特性化により、これまで知られていなかったNotI制限−修飾系をクローニングし、発現する直接経路が明らかにされる。
【図２】図２は、BamHI Lambda Dash IIライブラリーにNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅部分をハイブリッド形成させて得たN otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5 kb BamHI 断片の制限地図である。NotIエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子の位置及び配向を示す。
【図３】図３は過剰発現（overexpression）クローンpRM189-1の制限地図である。
【図４】図４はNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の５′末端のＤＮＡ配列である。
Claims (5)
- プラスミドｐＲＭ１８９−１（ＡＴＣＣ寄託番号６９１３９）から得ることができる、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ断片。
- 請求項１に記載のＤＮＡ断片を含む組換えベクター。
- ベクターがプラスミドｐＲＭ１８９−１（ＡＴＣＣ寄託番号６９１３９）からなる請求項２記載の組換えベクター。
- 請求項２または３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
- ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼの製造方法であって、前記エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下で、請求項２または３記載のベクターで形質転換した宿主細胞を培養することを包含する方法。
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