JPH06277070A - ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 - Google Patents
ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法Info
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- JPH06277070A JPH06277070A JP6013245A JP1324594A JPH06277070A JP H06277070 A JPH06277070 A JP H06277070A JP 6013245 A JP6013245 A JP 6013245A JP 1324594 A JP1324594 A JP 1324594A JP H06277070 A JPH06277070 A JP H06277070A
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 １）Nocardia otitidis-caviarum由来の制限
エンドヌクレアーゼを宿主に導入して、制限遺伝子を発
現させ、２）NotI制限エンドヌクレアーゼ活性をコード
し発現するプラスミドを含有する宿主を培養し、３）No
tI制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし発現するプラ
スミドを含有する培養した宿主からNotI制限エンドヌク
レアーゼを精製することによるNotI制限エンドヌクレア
ーゼをクローニングし、製造する方法。 【効果】 制限エンドヌクレアーゼの商業的製造を可能
にする。
エンドヌクレアーゼを宿主に導入して、制限遺伝子を発
現させ、２）NotI制限エンドヌクレアーゼ活性をコード
し発現するプラスミドを含有する宿主を培養し、３）No
tI制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし発現するプラ
スミドを含有する培養した宿主からNotI制限エンドヌク
レアーゼを精製することによるNotI制限エンドヌクレア
ーゼをクローニングし、製造する方法。 【効果】 制限エンドヌクレアーゼの商業的製造を可能
にする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、NotI制限エンドヌクレ
アーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、
及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関する。
アーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、
及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】制限
エンドヌクレアーゼは細菌に天然に認められる種類の酵
素である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混在する細
菌成分を含まないように精製すると、実験室内でＤＮＡ
分子を正確な断片に切断するために使用できる。この特
性により、ＤＮＡ分子を単一的に同定し、また構成遺伝
子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究に不可欠な道具であることが証明されて
いる。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実
施するための生化学的な「はさみ」である。
エンドヌクレアーゼは細菌に天然に認められる種類の酵
素である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混在する細
菌成分を含まないように精製すると、実験室内でＤＮＡ
分子を正確な断片に切断するために使用できる。この特
性により、ＤＮＡ分子を単一的に同定し、また構成遺伝
子に分けることができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究に不可欠な道具であることが証明されて
いる。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実
施するための生化学的な「はさみ」である。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子に沿
って特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し、これと結合することによって作用する。一度結合す
ると、認識配列内またはその一方にある分子を切断す
る。制限エンドヌクレアーゼにはそれぞれ異なる認識配
列に対する親和性がある。これまでに研究されている数
百種の細菌から１００種以上の種々の制限エンドヌクレ
アーゼが同定されている。
って特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識
し、これと結合することによって作用する。一度結合す
ると、認識配列内またはその一方にある分子を切断す
る。制限エンドヌクレアーゼにはそれぞれ異なる認識配
列に対する親和性がある。これまでに研究されている数
百種の細菌から１００種以上の種々の制限エンドヌクレ
アーゼが同定されている。
【０００４】細菌は１つの種につきわずかな制限エンド
ヌクレアーゼしか持たない傾向がある。エンドヌクレア
ーゼは一般にその酵素の由来となる細菌の名前に従って
命名されている。従って、Neisseria lactamica 種は、
例えば４種の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成し、
これらはNlaI、NlaII 、NlaIII及びNlaIV と呼ばれてい
る。これらの酵素は各々、配列GGCC、GATC、CATG及びGG
NNCCを認識し、切断する。一方、大腸菌（Escherichia
coli）RY13は１つの酵素EcoRI のみを合成し、これは配
列GAATTCを認識する。
ヌクレアーゼしか持たない傾向がある。エンドヌクレア
ーゼは一般にその酵素の由来となる細菌の名前に従って
命名されている。従って、Neisseria lactamica 種は、
例えば４種の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成し、
これらはNlaI、NlaII 、NlaIII及びNlaIV と呼ばれてい
る。これらの酵素は各々、配列GGCC、GATC、CATG及びGG
NNCCを認識し、切断する。一方、大腸菌（Escherichia
coli）RY13は１つの酵素EcoRI のみを合成し、これは配
列GAATTCを認識する。
【０００５】理論と結び付けようとするのではないが、
制限エンドヌクレアーゼは天然では細菌細胞の繁栄を保
護する働きをしているものと考えられる。制限エンドヌ
クレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼがなければ細菌
を破壊するか細菌に寄生するであろうウィルスやプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子の感染に対し細菌が耐性を
持つようにすることができる。制限エンドヌクレアーゼ
は感染するＤＮＡ分子の長さを測り、認識配列がある度
にそのＤＮＡ分子を切断することによって耐性を付与す
る。切断されると、感染遺伝子の多くは能力を失い、Ｄ
ＮＡは非特異的ヌクレアーゼによってさらに分解され易
くになる。
制限エンドヌクレアーゼは天然では細菌細胞の繁栄を保
護する働きをしているものと考えられる。制限エンドヌ
クレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼがなければ細菌
を破壊するか細菌に寄生するであろうウィルスやプラス
ミドのような外来ＤＮＡ分子の感染に対し細菌が耐性を
持つようにすることができる。制限エンドヌクレアーゼ
は感染するＤＮＡ分子の長さを測り、認識配列がある度
にそのＤＮＡ分子を切断することによって耐性を付与す
る。切断されると、感染遺伝子の多くは能力を失い、Ｄ
ＮＡは非特異的ヌクレアーゼによってさらに分解され易
くになる。
【０００６】細菌の防御系の第二の成分は修飾メチラー
ゼである。修飾メチラーゼは制限エンドヌクレアーゼと
相補的であり、細菌が自分自身のＤＮＡを保護し、自分
自身のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから識別できるための
手段を提供する。修飾メチラーゼは対応の制限エンドヌ
クレアーゼと同じヌクレオチド配列を認識し、その配列
と結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を
添加することによりその配列内にあるヌクレオチド１つ
以上を化学的に修飾する。メチル化されると、認識配列
はもう制限エンドヌクレアーゼに結合またはこの酵素で
切断されなくなる。細菌細胞のＤＮＡは細菌の持つ修飾
メチラーゼ活性で完全に修飾され、従って、内因性制限
エンドヌクレアーゼの存在に対し感受性を失う。制限エ
ンドヌクレアーゼによる認識や切断に感受性を持つもの
は修飾されていない、従って、識別不能な外来ＤＮＡの
みとなる。
ゼである。修飾メチラーゼは制限エンドヌクレアーゼと
相補的であり、細菌が自分自身のＤＮＡを保護し、自分
自身のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから識別できるための
手段を提供する。修飾メチラーゼは対応の制限エンドヌ
クレアーゼと同じヌクレオチド配列を認識し、その配列
と結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を
添加することによりその配列内にあるヌクレオチド１つ
以上を化学的に修飾する。メチル化されると、認識配列
はもう制限エンドヌクレアーゼに結合またはこの酵素で
切断されなくなる。細菌細胞のＤＮＡは細菌の持つ修飾
メチラーゼ活性で完全に修飾され、従って、内因性制限
エンドヌクレアーゼの存在に対し感受性を失う。制限エ
ンドヌクレアーゼによる認識や切断に感受性を持つもの
は修飾されていない、従って、識別不能な外来ＤＮＡの
みとなる。
【０００７】遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子がコードする蛋白質を従来の
精製手法に比べて大量に製造できるようになった。所望
のクローン（制限エンドヌクレアーゼ遺伝子）を単離す
る標準的な方法は、複雑な「ライブラリー」内でこのよ
うなクローン、すなわち１０-3−１０-4と頻度の低い場
合には「ショットガン」手法で得られるクローン集団を
同定する簡単で信頼性の高い方法を開発することであ
る。この方法は、所望ではない大部分のクローンを破壊
し、所望のわずかなクローンのみが生存するような選択
性を持つのが好ましい。
ローニングし、その遺伝子がコードする蛋白質を従来の
精製手法に比べて大量に製造できるようになった。所望
のクローン（制限エンドヌクレアーゼ遺伝子）を単離す
る標準的な方法は、複雑な「ライブラリー」内でこのよ
うなクローン、すなわち１０-3−１０-4と頻度の低い場
合には「ショットガン」手法で得られるクローン集団を
同定する簡単で信頼性の高い方法を開発することであ
る。この方法は、所望ではない大部分のクローンを破壊
し、所望のわずかなクローンのみが生存するような選択
性を持つのが好ましい。
【０００８】ますます多くのＩＩ型の制限−修飾系がク
ローニングされている。最初にクローニングされた系は
制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する
ための手段としてバクテリオファージ感染を使用した
（EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178: 71
7-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112
(1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
78: 1503-1507 (1981)）。細菌に制限−修飾系が存在
するとバクテリオファージ感染耐性が得られるため、ク
ローニングした制限−修飾遺伝子を持つ細胞は原則的に
ファージに露出されたライブラリーから生存体として選
択的に単離できる。しかし、この方法は限定された価値
しか持たないことが判っている。特に、クローニングさ
れた制限−修飾遺伝子は選択的に生存させうるに十分な
ファージ耐性を常に示すとは限らないことが発見され
た。
ローニングされている。最初にクローニングされた系は
制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する
ための手段としてバクテリオファージ感染を使用した
（EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet 178: 71
7-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112
(1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
78: 1503-1507 (1981)）。細菌に制限−修飾系が存在
するとバクテリオファージ感染耐性が得られるため、ク
ローニングした制限−修飾遺伝子を持つ細胞は原則的に
ファージに露出されたライブラリーから生存体として選
択的に単離できる。しかし、この方法は限定された価値
しか持たないことが判っている。特に、クローニングさ
れた制限−修飾遺伝子は選択的に生存させうるに十分な
ファージ耐性を常に示すとは限らないことが発見され
た。
【０００９】別のクローニングの方法は、最初にプラス
ミド−ボーン(plasmid-borne) として特性化されている
系を大腸菌クローニングプラスミドに移入することを含
んでいる（EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid Re
s. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras & Brooks,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983);The
riault & Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blum
enthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985)
）。
ミド−ボーン(plasmid-borne) として特性化されている
系を大腸菌クローニングプラスミドに移入することを含
んでいる（EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid Re
s. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras & Brooks,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983);The
riault & Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blum
enthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985)
）。
【００１０】第三の方法は、ますます多くの系をクロー
ニングするために使用されており、活性メチラーゼ遺伝
子の選択を含んでいる（例えば、１９８６年９月３日公
開のEPO No.: 195,413及びBsuRI: Kiss et al., Nucl.
Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985) 参照）。制限及び修
飾遺伝子はしばしば密接に結合しているため、両方の遺
伝子を同時にクローニングできることが多い。しかし、
この選択ではいつでも完全な制限系が得られるのではな
いが、メチラーゼ遺伝子のみは得られる（BspRI: Szomo
lanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janul
aitis et al.,Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss
& Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983);及びMspI: Walde
r et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983)
）。
ニングするために使用されており、活性メチラーゼ遺伝
子の選択を含んでいる（例えば、１９８６年９月３日公
開のEPO No.: 195,413及びBsuRI: Kiss et al., Nucl.
Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985) 参照）。制限及び修
飾遺伝子はしばしば密接に結合しているため、両方の遺
伝子を同時にクローニングできることが多い。しかし、
この選択ではいつでも完全な制限系が得られるのではな
いが、メチラーゼ遺伝子のみは得られる（BspRI: Szomo
lanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janul
aitis et al.,Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss
& Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983);及びMspI: Walde
r et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983)
）。
【００１１】一部の系では、宿主に修飾で保護されてい
ないエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に
問題が生じることがある。メチラーゼ遺伝子及びエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡ断片に導入する場
合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主ゲノムを切断する
前にメチラーゼ遺伝子が宿主を修飾または保護しなけれ
ばならない。
ないエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする際に
問題が生じることがある。メチラーゼ遺伝子及びエンド
ヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡ断片に導入する場
合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主ゲノムを切断する
前にメチラーゼ遺伝子が宿主を修飾または保護しなけれ
ばならない。
【００１２】大腸菌で制限−修飾系をクローニングする
際、広範なメチラーゼをクローニングする過程に、もう
１つの障害があることが発見された。多くの大腸菌株
（クローニングに一般に使用されているものも含む）は
シトシンメチル化に関わるＤＮＡの導入に耐性な系を有
している（Raleigh & Wilson, Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA 83: 9070-9074 (1986)）。従って、クローニン
グにどの大腸菌株を使用するかを慎重に検討することも
必要である。
際、広範なメチラーゼをクローニングする過程に、もう
１つの障害があることが発見された。多くの大腸菌株
（クローニングに一般に使用されているものも含む）は
シトシンメチル化に関わるＤＮＡの導入に耐性な系を有
している（Raleigh & Wilson, Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA 83: 9070-9074 (1986)）。従って、クローニン
グにどの大腸菌株を使用するかを慎重に検討することも
必要である。
【００１３】もう１つの可能性のある問題は、供給源と
なる生物と大腸菌との間の転写機構の違い、例えばプロ
モータ及びリボソーム結合部位の差のために、一部の制
限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は大腸菌内
で発現できないことである。メチラーゼ選択手法では、
メチラーゼ遺伝子を持つプラスミドの少なくとも一部を
完全に保護するのに十分なだけメチラーゼが発現される
必要がある。
なる生物と大腸菌との間の転写機構の違い、例えばプロ
モータ及びリボソーム結合部位の差のために、一部の制
限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は大腸菌内
で発現できないことである。メチラーゼ選択手法では、
メチラーゼ遺伝子を持つプラスミドの少なくとも一部を
完全に保護するのに十分なだけメチラーゼが発現される
必要がある。
【００１４】精製した制限エンドヌクレアーゼは実験室
でＤＮＡを特性化し、再配列させる有用な道具であり、
修飾メチラーゼもまたその程度は低いものの有用である
ことから、これらの酵素を大量に合成する細菌株を組換
えＤＮＡ手法で得ることは商業上重要である。このよう
な株は精製を簡単にすると同時に商業上有用な量を製造
する手段を提供するため有用であろう。
でＤＮＡを特性化し、再配列させる有用な道具であり、
修飾メチラーゼもまたその程度は低いものの有用である
ことから、これらの酵素を大量に合成する細菌株を組換
えＤＮＡ手法で得ることは商業上重要である。このよう
な株は精製を簡単にすると同時に商業上有用な量を製造
する手段を提供するため有用であろう。
【００１５】
【課題を解決するための手段】発明の概要 本発明は、Nocardia otitidis-caviarum（ＡＴＣＣ １
４６３０）から得られ得るNotI制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、
及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関係する
方法に係る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニ
ングするための公知の方法はNotI制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子のクローニングには成功し
なかった。多くの試みが行なわれ、非常に成功した活性
メチラーゼ遺伝子選択法及びファージ選択法があった。
ここで、上記の方法を使用するとメチラーゼとエンドヌ
クレアーゼ遺伝子のどちらも発現されないため、これら
の方法が機能しないことが判った。従って、NotI制限エ
ンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニ
ングする新規な方法が必要とされていた。新規の方法は
NotI制限エンドヌクレアーゼを均質になるまで精製し、
蛋白質のＮ末端及び内部臭化シアン分解断片のアミノ配
列を決定することを含んでいる。アミノ酸配列を使用し
てＰＣＲプライマーを作成し、N. otitidis-caviarumゲ
ノムから直接エンドヌクレアーゼの一部を増幅させ、次
に、遺伝子全体を含むクローンを同定するためのプロー
ブとして使用する。
４６３０）から得られ得るNotI制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼ遺伝子をコードする組換えＤＮＡ、
及び組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造に関係する
方法に係る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニ
ングするための公知の方法はNotI制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子のクローニングには成功し
なかった。多くの試みが行なわれ、非常に成功した活性
メチラーゼ遺伝子選択法及びファージ選択法があった。
ここで、上記の方法を使用するとメチラーゼとエンドヌ
クレアーゼ遺伝子のどちらも発現されないため、これら
の方法が機能しないことが判った。従って、NotI制限エ
ンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子をクローニ
ングする新規な方法が必要とされていた。新規の方法は
NotI制限エンドヌクレアーゼを均質になるまで精製し、
蛋白質のＮ末端及び内部臭化シアン分解断片のアミノ配
列を決定することを含んでいる。アミノ酸配列を使用し
てＰＣＲプライマーを作成し、N. otitidis-caviarumゲ
ノムから直接エンドヌクレアーゼの一部を増幅させ、次
に、遺伝子全体を含むクローンを同定するためのプロー
ブとして使用する。
【００１６】本発明は制限エンドヌクレアーゼNotIを発
現する形質転換した宿主にも係る。この制限エンドヌク
レアーゼNotIはＤＮＡ配列５′-GCGGCCGC-３′を認識
し、４塩基５′オーバーハングを残して最初の-CG-対の
間でこの認識配列を切断する（Roberts, R., Nucl. Aci
d Res., supplement 13: 165 (1985) ）。本発明に従っ
て製造したNotI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋
で、実施例１のステップ２に示すような慣用手法で製造
した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混在
物を含まない。NotI制限−修飾系をクローニングするた
めの１つの好適法は次のステップからなる：N. otitidi
s-caviarumからエンドヌクレアーゼをほぼ均質になるよ
うに精製し、Ｎ末端及び内部臭化シアン断片のアミノ酸
配列を決定し、アミノ酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプラ
イマーを作製し、このプライマーによりゲノムN. otiti
dis-caviarum ＤＮＡからのエンドヌクレアーゼの一部
を増幅させ、適当なベクターを選択し、N. otitidis ca
viarum由来のＤＮＡを含有するライブラリーを形成し、
エンドヌクレアーゼの一部に対応する増幅ＤＮＡとハイ
ブリッド形成するＤＮＡを含有するクローンを単離し、
クローニングしたＤＮＡの配列を決定してエンドヌクレ
アーゼの先端のＤＮＡ配列を決定し、隣接したメチラー
ゼ（NotIメチラーゼ）を同定し、ＰＣＲによりエンドヌ
クレアーゼ全体を増幅させ、NotI AUG開始コドンで始ま
る発現ベクターに連結し、別の相容性ベクター上でEagI
メチラーゼ（-CGGCCG-）で適当な宿主細胞を予め修飾
し、上記のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する連
結した発現ベクターを予め修飾した宿主に導入し、宿主
を増殖させ、適切な発現条件で誘導し、細胞を採取し、
NotIエンドヌクレアーゼを精製する。
現する形質転換した宿主にも係る。この制限エンドヌク
レアーゼNotIはＤＮＡ配列５′-GCGGCCGC-３′を認識
し、４塩基５′オーバーハングを残して最初の-CG-対の
間でこの認識配列を切断する（Roberts, R., Nucl. Aci
d Res., supplement 13: 165 (1985) ）。本発明に従っ
て製造したNotI制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋
で、実施例１のステップ２に示すような慣用手法で製造
した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混在
物を含まない。NotI制限−修飾系をクローニングするた
めの１つの好適法は次のステップからなる：N. otitidi
s-caviarumからエンドヌクレアーゼをほぼ均質になるよ
うに精製し、Ｎ末端及び内部臭化シアン断片のアミノ酸
配列を決定し、アミノ酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプラ
イマーを作製し、このプライマーによりゲノムN. otiti
dis-caviarum ＤＮＡからのエンドヌクレアーゼの一部
を増幅させ、適当なベクターを選択し、N. otitidis ca
viarum由来のＤＮＡを含有するライブラリーを形成し、
エンドヌクレアーゼの一部に対応する増幅ＤＮＡとハイ
ブリッド形成するＤＮＡを含有するクローンを単離し、
クローニングしたＤＮＡの配列を決定してエンドヌクレ
アーゼの先端のＤＮＡ配列を決定し、隣接したメチラー
ゼ（NotIメチラーゼ）を同定し、ＰＣＲによりエンドヌ
クレアーゼ全体を増幅させ、NotI AUG開始コドンで始ま
る発現ベクターに連結し、別の相容性ベクター上でEagI
メチラーゼ（-CGGCCG-）で適当な宿主細胞を予め修飾
し、上記のNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含有する連
結した発現ベクターを予め修飾した宿主に導入し、宿主
を増殖させ、適切な発現条件で誘導し、細胞を採取し、
NotIエンドヌクレアーゼを精製する。
【００１７】詳細な説明 本発明は、NotI制限エンドヌクレアーゼをコードする組
換えＤＮＡ及びこのような組換えＤＮＡから産生される
酵素に係る。
換えＤＮＡ及びこのような組換えＤＮＡから産生される
酵素に係る。
【００１８】Nocardia otitidis-caviarum 由来のNotI
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは非常に
困難であることが示されていた。多種のライブラリーが
構築され、スクリーニングされているにも関わらず、標
準のメチラーゼ選択手法ではメチラーゼクローンは得ら
れていなかった。これはNotIメチラーゼが大腸菌内で保
護するレベルで発現されないことによると思われる。フ
ァージ選択法も試みられたが成功しなかった。これらの
結果はNocardiaと大腸菌の間で認められた転写機構の違
いと一致している。従って、NotIエンドヌクレアーゼを
クローニングするには新しい方法が必要であった。
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは非常に
困難であることが示されていた。多種のライブラリーが
構築され、スクリーニングされているにも関わらず、標
準のメチラーゼ選択手法ではメチラーゼクローンは得ら
れていなかった。これはNotIメチラーゼが大腸菌内で保
護するレベルで発現されないことによると思われる。フ
ァージ選択法も試みられたが成功しなかった。これらの
結果はNocardiaと大腸菌の間で認められた転写機構の違
いと一致している。従って、NotIエンドヌクレアーゼを
クローニングするには新しい方法が必要であった。
【００１９】エンドヌクレアーゼ蛋白質をほぼ均質にな
るまで精製し、蛋白質の部分のアミノ酸配列を決定する
ために使用した。Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、エンド
ヌクレアーゼを臭化シアンで消化すると、約２４ｋＤ、
１０ｋＤ、４ｋＤ及び３ｋＤの４つの主要なペプチド断
片が得られた。２４ｋＤ、１０ｋＤ及び４ｋＤ断片につ
いては明確なアミノ酸配列が決定されたが、３ｋＤペプ
チドでは混合されたシグナルが得られた。２４ｋＤペプ
チドはエンドヌクレアーゼのＮ末端断片であることが判
った。Ｎ末端領域のアミノ酸配列に基づいた縮退ＤＮＡ
プライマー及び１０ｋＤ断片を合成し、ゲノムN. otiti
dis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子
のこの部分をＰＣＲで増幅するために使用した。増強さ
せた約６８０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９に二次クロ
ーニングし、配列を決定した。このＰＣＲ断片のＤＮＡ
配列から推測したアミノ酸配列はＮ末端（２４ｋＤ）、
１０ｋＤ及び４ｋＤペプチドから決定したNotIエンドヌ
クレアーゼのアミノ酸配列と一致しており、このＤＮＡ
配列がNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を表わすこ
とが確認された。N. otitidis-caviarum ＤＮＡのライ
ブラリーをLambda Dash ベクター系で構築し、N. otiti
dis-caviarum ＤＮＡの９−２３ｋｂ挿入物を含有する
クローンを生成した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の６８
０ｂｐ断片をプローブとして使用し、エンドヌクレアー
ゼ遺伝子のこの部分を含有するLambdaDash クローンを
同定した。これらのラムダクローンを精製すると、すべ
てのクローンが14.5kb BamHI断片を含有することが判っ
た。プローブはBamHI 断片上で、およそ８２００−８９
００の位置にマッピングされた。この結果、クローンは
プローブの一方の側に約８２００ｂｐ、他方の側に約５
６００ｂｐを含んでいたことから、エンドヌクレアーゼ
遺伝子全体が存在するであろうことが示された。14.5kb
BamHI断片をｐＵＣ１９に二次クローニングし、NotIエ
ンドヌクレアーゼ及びメチラーゼについてアッセイした
が、どちらの活性も検出されなかった。この結果は、遺
伝子の上流の元のNocardiaＤＮＡがそのままの位置に残
っているときにはエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺
伝子は大腸菌内で発現されないことを示している。プロ
ーブの隣のＤＮＡの配列を決定し、エンドヌクレアーゼ
のＮ末端の正確なヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ
プライマーは、ＡＴＧ開始コドン（-CATATG-）にNdeI部
位を導入するNotI遺伝子のＮ末端部分から、NotI遺伝子
の末端の約５００ｂｐの３−プライムであるSalI部位ま
でNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅させるよう
に設計した。14.5kb BamHIプラスミド及びゲノムN. oti
tidis-caviarum ＤＮＡの両者から遺伝子全体を増幅さ
せた。増幅させたＤＮＡをNdeI及びSalIエンドヌクレア
ーゼで切断し、予めSalI及びNdeIで切断してあるＴ７発
現ベクターpSYX22に連結した。連結反応物を相容性プラ
スミドpACYC184上でEagIメチラーゼ（-CGGCCG-）で予め
修飾したER2169コンピテント細胞に形質転換した。所望
の大きさの挿入物を含有するベクターをミニプレップ
（miniprepp ）法で同定した。これらのクローンを中間
対数増殖期まで増殖させ、IPTGで誘導した。次に、細胞
を遠心分離により採取し、音波処理バッファに再懸濁さ
せ、音波処理により溶解させた。抽出物を清澄にし、No
tIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。N. otitidi
s-caviarumゲノムＤＮＡ及び14.5kb BamHI断片プラスミ
ド由来のクローンでは細胞１グラム（湿潤重量）当り
５，０００，０００単位のNotI活性が得られた。
るまで精製し、蛋白質の部分のアミノ酸配列を決定する
ために使用した。Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、エンド
ヌクレアーゼを臭化シアンで消化すると、約２４ｋＤ、
１０ｋＤ、４ｋＤ及び３ｋＤの４つの主要なペプチド断
片が得られた。２４ｋＤ、１０ｋＤ及び４ｋＤ断片につ
いては明確なアミノ酸配列が決定されたが、３ｋＤペプ
チドでは混合されたシグナルが得られた。２４ｋＤペプ
チドはエンドヌクレアーゼのＮ末端断片であることが判
った。Ｎ末端領域のアミノ酸配列に基づいた縮退ＤＮＡ
プライマー及び１０ｋＤ断片を合成し、ゲノムN. otiti
dis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺伝子
のこの部分をＰＣＲで増幅するために使用した。増強さ
せた約６８０ｂｐのＤＮＡ断片をｐＵＣ１９に二次クロ
ーニングし、配列を決定した。このＰＣＲ断片のＤＮＡ
配列から推測したアミノ酸配列はＮ末端（２４ｋＤ）、
１０ｋＤ及び４ｋＤペプチドから決定したNotIエンドヌ
クレアーゼのアミノ酸配列と一致しており、このＤＮＡ
配列がNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の一部を表わすこ
とが確認された。N. otitidis-caviarum ＤＮＡのライ
ブラリーをLambda Dash ベクター系で構築し、N. otiti
dis-caviarum ＤＮＡの９−２３ｋｂ挿入物を含有する
クローンを生成した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の６８
０ｂｐ断片をプローブとして使用し、エンドヌクレアー
ゼ遺伝子のこの部分を含有するLambdaDash クローンを
同定した。これらのラムダクローンを精製すると、すべ
てのクローンが14.5kb BamHI断片を含有することが判っ
た。プローブはBamHI 断片上で、およそ８２００−８９
００の位置にマッピングされた。この結果、クローンは
プローブの一方の側に約８２００ｂｐ、他方の側に約５
６００ｂｐを含んでいたことから、エンドヌクレアーゼ
遺伝子全体が存在するであろうことが示された。14.5kb
BamHI断片をｐＵＣ１９に二次クローニングし、NotIエ
ンドヌクレアーゼ及びメチラーゼについてアッセイした
が、どちらの活性も検出されなかった。この結果は、遺
伝子の上流の元のNocardiaＤＮＡがそのままの位置に残
っているときにはエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺
伝子は大腸菌内で発現されないことを示している。プロ
ーブの隣のＤＮＡの配列を決定し、エンドヌクレアーゼ
のＮ末端の正確なヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ
プライマーは、ＡＴＧ開始コドン（-CATATG-）にNdeI部
位を導入するNotI遺伝子のＮ末端部分から、NotI遺伝子
の末端の約５００ｂｐの３−プライムであるSalI部位ま
でNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅させるよう
に設計した。14.5kb BamHIプラスミド及びゲノムN. oti
tidis-caviarum ＤＮＡの両者から遺伝子全体を増幅さ
せた。増幅させたＤＮＡをNdeI及びSalIエンドヌクレア
ーゼで切断し、予めSalI及びNdeIで切断してあるＴ７発
現ベクターpSYX22に連結した。連結反応物を相容性プラ
スミドpACYC184上でEagIメチラーゼ（-CGGCCG-）で予め
修飾したER2169コンピテント細胞に形質転換した。所望
の大きさの挿入物を含有するベクターをミニプレップ
（miniprepp ）法で同定した。これらのクローンを中間
対数増殖期まで増殖させ、IPTGで誘導した。次に、細胞
を遠心分離により採取し、音波処理バッファに再懸濁さ
せ、音波処理により溶解させた。抽出物を清澄にし、No
tIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。N. otitidi
s-caviarumゲノムＤＮＡ及び14.5kb BamHI断片プラスミ
ド由来のクローンでは細胞１グラム（湿潤重量）当り
５，０００，０００単位のNotI活性が得られた。
【００２０】NotI制限遺伝子をクローニングし、発現さ
せるのに好適な、本明細書に記載の方法は図１に説明す
るが、次のステップを含んでいる： １．Nocardia otitidis-caviarumのＤＮＡを精製する。
せるのに好適な、本明細書に記載の方法は図１に説明す
るが、次のステップを含んでいる： １．Nocardia otitidis-caviarumのＤＮＡを精製する。
【００２１】２．NotI制限エンドヌクレアーゼ蛋白質を
標準の蛋白質精製手法で均質になるまで精製する。
標準の蛋白質精製手法で均質になるまで精製する。
【００２２】３．精製したNotIエンドヌクレアーゼのＮ
末端アミノ酸配列を決定する。精製したNotIエンドヌク
レアーゼを臭化シアン消化して内部ペプチド断片を生成
し、これらの断片からアミノ酸配列を決定する。
末端アミノ酸配列を決定する。精製したNotIエンドヌク
レアーゼを臭化シアン消化して内部ペプチド断片を生成
し、これらの断片からアミノ酸配列を決定する。
【００２３】４．Ｎ末端及び内部ペプチド断片のアミノ
酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプライマーを合成する。こ
れらのプライマーを使用して、ＰＣＲ手法により、N. o
titidis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺
伝子の一部を増幅する。
酸配列に基づいて縮退ＤＮＡプライマーを合成する。こ
れらのプライマーを使用して、ＰＣＲ手法により、N. o
titidis-caviarum ＤＮＡ由来のエンドヌクレアーゼ遺
伝子の一部を増幅する。
【００２４】５．N. otitidis-caviarum ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼ例えばBamHI またはそのアイソシゾ
マーのいずれかで完全及び／または部分的に消化し、切
断して、Lambda Dash IIまたはNotIエンドヌクレアーゼ
遺伝子全体を含有する任意の同様なベクターにクローニ
ングできる断片を作製する。
エンドヌクレアーゼ例えばBamHI またはそのアイソシゾ
マーのいずれかで完全及び／または部分的に消化し、切
断して、Lambda Dash IIまたはNotIエンドヌクレアーゼ
遺伝子全体を含有する任意の同様なベクターにクローニ
ングできる断片を作製する。
【００２５】６．消化したＤＮＡをラムダファージクロ
ーニングベクターに連結する。得られた混合物をin vit
roでパッケージし、適当な宿主例えば大腸菌株ER1458
（NewEngland Biolabs, Inc., Beverly, MAから市販さ
れている）を感染させるために使用する。パッケージし
たファージの一部を植え付け、得られたプラークを計数
することにより、感染性ファージの力価を測定する。
ーニングベクターに連結する。得られた混合物をin vit
roでパッケージし、適当な宿主例えば大腸菌株ER1458
（NewEngland Biolabs, Inc., Beverly, MAから市販さ
れている）を感染させるために使用する。パッケージし
たファージの一部を植え付け、得られたプラークを計数
することにより、感染性ファージの力価を測定する。
【００２６】７．in vitroでパッケージしたファージは
富裕培地上で適当な大腸菌宿主例えばER1458の軟寒天ロ
ーンに種々の密度で植え付けるのが好ましい。インキュ
ベーションした後、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含
有するファージを、プラークのニトロセルロースフィル
ターリフトに対するプローブとしてNotIエンドヌクレア
ーゼのＰＣＲ由来の部分を使用して、Benton-Davisのサ
ザン・ハイブリッド形成により同定する。陽性のプラー
クをプレートから取り出し、プレーティングとハイブリ
ッド形成を数回連続して実施することにより精製する。
富裕培地上で適当な大腸菌宿主例えばER1458の軟寒天ロ
ーンに種々の密度で植え付けるのが好ましい。インキュ
ベーションした後、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含
有するファージを、プラークのニトロセルロースフィル
ターリフトに対するプローブとしてNotIエンドヌクレア
ーゼのＰＣＲ由来の部分を使用して、Benton-Davisのサ
ザン・ハイブリッド形成により同定する。陽性のプラー
クをプレートから取り出し、プレーティングとハイブリ
ッド形成を数回連続して実施することにより精製する。
【００２７】８．上記クローン上のNotIエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の位置を決定し、従ってクローンがエンドヌ
クレアーゼ遺伝子全体及び任意の隣接したメチラーゼ遺
伝子をコードするために十分なＤＮＡを含有しているか
を決定するために、クローニングした断片の制限地図を
作成し、上記と同じプローブを使用してクローンの種々
の制限消化物へのサザン・ハイブリッド形成によりエン
ドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端部分の位置を決定する。
制限遺伝子全体をコードするのに十分なＤＮＡがある場
合、ステップ９に進む。プローブの３′側に完全な制限
遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡがない場合には、
さらに多くのクローンをスクリーニングする、及び／ま
たは、クローンの別のライブラリーを作成する。
ーゼ遺伝子の位置を決定し、従ってクローンがエンドヌ
クレアーゼ遺伝子全体及び任意の隣接したメチラーゼ遺
伝子をコードするために十分なＤＮＡを含有しているか
を決定するために、クローニングした断片の制限地図を
作成し、上記と同じプローブを使用してクローンの種々
の制限消化物へのサザン・ハイブリッド形成によりエン
ドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端部分の位置を決定する。
制限遺伝子全体をコードするのに十分なＤＮＡがある場
合、ステップ９に進む。プローブの３′側に完全な制限
遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡがない場合には、
さらに多くのクローンをスクリーニングする、及び／ま
たは、クローンの別のライブラリーを作成する。
【００２８】lambda Dash ベクター内のN. otitidis-ca
viarum ＤＮＡ挿入物をプラスミドベクター例えばpUC1
9 （ATCC# 37254 ）にサブクローニングし、挿入物のマ
ッピング及び遺伝子操作を簡単にすることができ、クロ
ーンがNotIエンドヌクレアーゼまたはメチラーゼのいず
れを生成するかを決定することができる。本発明では、
pUC19 中いずれの配向の14.5kb BamHI断片のクローンも
in vitroで検出可能な量のNotIエンドヌクレアーゼは産
生しなかった。この断片も４つのNotI部位を含んでお
り、これらは全てin vitroでNotIで完全に切断され、こ
のことはin vivoでNotIメチラーゼ活性がないことを示
していた。
viarum ＤＮＡ挿入物をプラスミドベクター例えばpUC1
9 （ATCC# 37254 ）にサブクローニングし、挿入物のマ
ッピング及び遺伝子操作を簡単にすることができ、クロ
ーンがNotIエンドヌクレアーゼまたはメチラーゼのいず
れを生成するかを決定することができる。本発明では、
pUC19 中いずれの配向の14.5kb BamHI断片のクローンも
in vitroで検出可能な量のNotIエンドヌクレアーゼは産
生しなかった。この断片も４つのNotI部位を含んでお
り、これらは全てin vitroでNotIで完全に切断され、こ
のことはin vivoでNotIメチラーゼ活性がないことを示
していた。
【００２９】９．Ｎ末端から内部１０ｋＤ臭化シアン断
片プローブを含むまたはそれに隣接したＤＮＡの配列決
定し、遺伝子の配向、遺伝子のＮ末端の正確なＤＮＡ配
列を決定し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接した
シトシンメチラーゼ遺伝子の存在についてチェックす
る。
片プローブを含むまたはそれに隣接したＤＮＡの配列決
定し、遺伝子の配向、遺伝子のＮ末端の正確なＤＮＡ配
列を決定し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接した
シトシンメチラーゼ遺伝子の存在についてチェックす
る。
【００３０】１０．NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を過
剰発現する：制限遺伝子を含有するクローンを過剰発現
できる方法は多数ある。ＤＮＡ配列及び詳細なマッピン
グは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現する最良
の方法を決定する手助けとなる。過剰発現の１つの方法
では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端及び制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子の幾分下流に直接ハイブリッ
ド形成するプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応
を使用して、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅
する。得られたＤＮＡ断片を切断して、エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の前にあるNocardia ＤＮＡを全て取り出す
ことができ、これを発現ベクター例えば誘導可能なプロ
モータ（例えばＴ７）のすぐ下流にあるpSYX22に挿入で
きる。また、大腸菌が強く認識するプロモータ例えばpA
GR3 上のPtac（New England Biolabs から入手できる）
を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始の直前に挿入す
ることにより過剰発現を実施できる。これは、制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子の開始と終了の近くの好都合な制
限部位及びpAGR3 のプロモータの近くの相容性の制限部
位を見つけ、制限遺伝子をPtacプロモータと並べてpAGR
3 に移すことにより実施できる。使用できるその他の調
節プロモータはpUC19及びpBR322誘導体上のPlacUV5 （F
uller, Gene 19: 43-54 (1982) ）及びλPL（Shimatake
& Rosenberg, Nature 254: 128 (1981) ）である。ま
た、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346 (1974) ）を
遺伝子の前に置いて発現を増やすことができる。
剰発現する：制限遺伝子を含有するクローンを過剰発現
できる方法は多数ある。ＤＮＡ配列及び詳細なマッピン
グは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を過剰発現する最良
の方法を決定する手助けとなる。過剰発現の１つの方法
では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のＮ末端及び制限
エンドヌクレアーゼ遺伝子の幾分下流に直接ハイブリッ
ド形成するプライマーを設計し、ポリメラーゼ連鎖反応
を使用して、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子全体を増幅
する。得られたＤＮＡ断片を切断して、エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の前にあるNocardia ＤＮＡを全て取り出す
ことができ、これを発現ベクター例えば誘導可能なプロ
モータ（例えばＴ７）のすぐ下流にあるpSYX22に挿入で
きる。また、大腸菌が強く認識するプロモータ例えばpA
GR3 上のPtac（New England Biolabs から入手できる）
を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始の直前に挿入す
ることにより過剰発現を実施できる。これは、制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子の開始と終了の近くの好都合な制
限部位及びpAGR3 のプロモータの近くの相容性の制限部
位を見つけ、制限遺伝子をPtacプロモータと並べてpAGR
3 に移すことにより実施できる。使用できるその他の調
節プロモータはpUC19及びpBR322誘導体上のPlacUV5 （F
uller, Gene 19: 43-54 (1982) ）及びλPL（Shimatake
& Rosenberg, Nature 254: 128 (1981) ）である。ま
た、強力なリボソーム結合部位（Shine & Dalgarno, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 1342-1346 (1974) ）を
遺伝子の前に置いて発現を増やすことができる。
【００３１】１１．本発明によると、制限エンドヌクレ
アーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿
主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護する。こ
れは、別のプラスミド上で、NotIメチラーゼまたは、No
tI制限部位に重なる部位を修飾することによりNotI消化
から保護するEagIのような異種のメチラーゼにクローニ
ングすることにより実施できる。使用するプラスミドは
発現ベクターと相容性でなければならない。メチラーゼ
も、過剰に発現された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子に
よる消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産生されな
ければならない。本発明では、コピー数の低いプラスミ
ド例えばpACYC184（Chang & Cohen, J.Bacteriol., 13
4: 1131 (1987)）にクローニングしたEagIメチラーゼ遺
伝子はNotI消化から宿主ゲノムを適切に保護することが
判った。
アーゼを過剰発現する安定なクローンを得るために、宿
主を制限エンドヌクレアーゼ消化から予め保護する。こ
れは、別のプラスミド上で、NotIメチラーゼまたは、No
tI制限部位に重なる部位を修飾することによりNotI消化
から保護するEagIのような異種のメチラーゼにクローニ
ングすることにより実施できる。使用するプラスミドは
発現ベクターと相容性でなければならない。メチラーゼ
も、過剰に発現された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子に
よる消化から宿主ゲノムを保護するレベルで産生されな
ければならない。本発明では、コピー数の低いプラスミ
ド例えばpACYC184（Chang & Cohen, J.Bacteriol., 13
4: 1131 (1987)）にクローニングしたEagIメチラーゼ遺
伝子はNotI消化から宿主ゲノムを適切に保護することが
判った。
【００３２】遺伝子のＤＮＡ配列は部位特異的変異によ
って、または遺伝子自体を再合成することにより、大腸
菌内でさらに効率的に利用されるコドンを使用するよう
変化させることができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 15
1: 389-409 (1981)）。本発明では、エンドヌクレアー
ゼ遺伝子の第二及び第三コドンを、ＰＣＲ増幅法により
大腸菌が最もよく使用するコドンに変化させた。
って、または遺伝子自体を再合成することにより、大腸
菌内でさらに効率的に利用されるコドンを使用するよう
変化させることができる（Ikemura, J. Mol. Biol. 15
1: 389-409 (1981)）。本発明では、エンドヌクレアー
ゼ遺伝子の第二及び第三コドンを、ＰＣＲ増幅法により
大腸菌が最もよく使用するコドンに変化させた。
【００３３】１２．製造：NotIエンドヌクレアーゼは、
EagIメチラーゼ遺伝子（またはNotIメチラーゼ遺伝子）
及び過剰に発現させたNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を持つクローンから、富裕培地中で培養器で増殖さ
せ、適当に抗生物質選択させ、誘導することにより製造
できる。次に、細胞を遠心分離により採取し、音波処理
により破壊して、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性を持
つ未精製の細胞抽出物を製造する。
EagIメチラーゼ遺伝子（またはNotIメチラーゼ遺伝子）
及び過剰に発現させたNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を持つクローンから、富裕培地中で培養器で増殖さ
せ、適当に抗生物質選択させ、誘導することにより製造
できる。次に、細胞を遠心分離により採取し、音波処理
により破壊して、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性を持
つ未精製の細胞抽出物を製造する。
【００３４】１３．精製：NotI制限エンドヌクレアーゼ
を含有する未精製細胞抽出物は、標準の蛋白質精製手法
例えば親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロ
マトグラフィーで精製する。
を含有する未精製細胞抽出物は、標準の蛋白質精製手法
例えば親和性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロ
マトグラフィーで精製する。
【００３５】上記に概説したステップは本発明を実施す
るための好ましい態様を示しているが、当業者には上記
方法を当業界で公知の手法に準じて変化させうることは
明らかであろう。
るための好ましい態様を示しているが、当業者には上記
方法を当業界で公知の手法に準じて変化させうることは
明らかであろう。
【００３６】以下の実施例は本発明の好適実施態様を説
明するために示している。この実施例は説明のためのも
のであり、本発明は特許請求の範囲に示される以外に
は、この実施例によって制限されないものであることは
理解されよう。
明するために示している。この実施例は説明のためのも
のであり、本発明は特許請求の範囲に示される以外に
は、この実施例によって制限されないものであることは
理解されよう。
【００３７】実施例実施例１ NotI修飾メチラーゼ遺伝子及び制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子のクローニング １．ＤＮＡの精製：Nocardia otitidis-caviarumのＤＮ
Ａを調製するために、細胞ペースト６ｇを１０分間静か
に振とうさせて、２５％蔗糖、０．０５Ｍトリス塩酸、
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍｌ中に再懸濁さ
せた。０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌと
調製したばかりの０．２５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．
０）中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを加え、溶液
を４℃で１６時間インキュベートした。次に、懸濁液を
液体窒素で急速に凍結させ、次に３７℃の水浴で解凍す
ることを３回繰り返した。プロテアーゼＫを最終濃度１
ｍｇ／ｍｌとなるように加え、５０℃で１６時間インキ
ュベートした。溶液を平衡化したフェノール５０ｍｌで
抽出し、水相を回収し、クロロホルム５０ｍｌで２回抽
出した。１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．
０）と１容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱さ
せ、遠心分離によって回収した。ＤＮＡペレットを１時
間空気乾燥させ、次に１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを
含むＤＮＡバッファ（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。次に、５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度
０．４Ｍとなるように加え、１容の２−プロパノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物をガラス棒で
溶液から取り出し、空気乾燥させ、１．５ｍｌのＤＮＡ
バッファに最終濃度が約２００μｇ／ｍｌとなるように
溶解した。
クレアーゼ遺伝子のクローニング １．ＤＮＡの精製：Nocardia otitidis-caviarumのＤＮ
Ａを調製するために、細胞ペースト６ｇを１０分間静か
に振とうさせて、２５％蔗糖、０．０５Ｍトリス塩酸、
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍｌ中に再懸濁さ
せた。０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌと
調製したばかりの０．２５Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．
０）中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを加え、溶液
を４℃で１６時間インキュベートした。次に、懸濁液を
液体窒素で急速に凍結させ、次に３７℃の水浴で解凍す
ることを３回繰り返した。プロテアーゼＫを最終濃度１
ｍｇ／ｍｌとなるように加え、５０℃で１６時間インキ
ュベートした。溶液を平衡化したフェノール５０ｍｌで
抽出し、水相を回収し、クロロホルム５０ｍｌで２回抽
出した。１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．
０）と１容の２−プロパノールを加えてＤＮＡを沈澱さ
せ、遠心分離によって回収した。ＤＮＡペレットを１時
間空気乾燥させ、次に１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを
含むＤＮＡバッファ（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。次に、５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度
０．４Ｍとなるように加え、１容の２−プロパノールを
加えてＤＮＡを沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物をガラス棒で
溶液から取り出し、空気乾燥させ、１．５ｍｌのＤＮＡ
バッファに最終濃度が約２００μｇ／ｍｌとなるように
溶解した。
【００３８】２．Nocardia otitidis-caviarumからのNo
tI制限エンドヌクレアーゼの精製：NotI制限酵素はリッ
チ・ブロスを含む培養器で中間対数増殖期まで増殖させ
ることによりNocardia otitidis-caviarumから作製でき
る。細胞は遠心分離によって採取する。以下の手順は全
て氷上または４℃で実施した。３８４ｇの細胞をバッフ
ァＡ（１０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール）７７
０ｍｌに再懸濁し、１１，５００ＰＳＩＧのGaulonホノ
ジェナイザーに５回通して破壊した。抽出物を４℃で４
０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をバ
ッファＡで平衡化したホスホセルロースカラム（５×１
２ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＡ２００ｍｌ、次
にバッファＡ１１００ｍｌと１．５ＭまでＮａＣｌを添
加したバッファＡ１１００ｍｌで作製したＮａＣｌ直線
勾配で洗った。２５ｍｌの画分を集めた。制限酵素活性
プールは０．４Ｍから０．６ＭのＮａＣｌでカラムから
溶出され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ
（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ
７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＮＨ4 ＳＯ
4 、５％グリセロール及び０．１５％アジ化ナトリウ
ム）に対して一晩透析した。次に、集めたものをバッフ
ァＢで平衡化したBaker-bond Wide-pore PEI(NH)（登録
商標）カラム（１．５×１６ｃｍ）にかけた。カラムを
バッファＢ３０ｍｌ、次に、０．１Ｍから１．６ＭのＮ
ａＣｌを加えたバッファＢの直線勾配４００ｍｌで洗っ
た。制限酵素活性のピークは０．６−０．８ＭのＮａＣ
ｌで溶出され、これを集めた。PEIプールを一晩バッフ
ァＣ（１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）
に対し透析し、次にバッファＣで平衡化したMono-Q（登
録商標）カラム（Pharmacia ）に載せた。０．１Ｍ−
０．６ＭのＮａＣｌ直線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵
素活性は０．３ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集め
た。Mono-Q（登録商標）で集めたものを３倍容量のバッ
ファＤ（２０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５％グリセロール）で希釈し、５０ｍＭ
ＮａＣｌでMono-S（登録商標）（Pharmacia）にかけ
た。バッファＤ中５０ｍＭから０．５ＭのＮａＣｌの直
線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．２５Ｍの
ＮａＣｌで溶出され、これを集めた。二番目のMono-Qカ
ラムを上記のように流し、エンドヌクレアーゼ蛋白質が
確実に均質になるようにした。最終的なNotI制限エンド
ヌクレアーゼ調製物ではクーマシーブルーR-250 で染色
した１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約４２ｋＤの
１つの主要なバンドが得られた。
tI制限エンドヌクレアーゼの精製：NotI制限酵素はリッ
チ・ブロスを含む培養器で中間対数増殖期まで増殖させ
ることによりNocardia otitidis-caviarumから作製でき
る。細胞は遠心分離によって採取する。以下の手順は全
て氷上または４℃で実施した。３８４ｇの細胞をバッフ
ァＡ（１０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール）７７
０ｍｌに再懸濁し、１１，５００ＰＳＩＧのGaulonホノ
ジェナイザーに５回通して破壊した。抽出物を４℃で４
０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をバ
ッファＡで平衡化したホスホセルロースカラム（５×１
２ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＡ２００ｍｌ、次
にバッファＡ１１００ｍｌと１．５ＭまでＮａＣｌを添
加したバッファＡ１１００ｍｌで作製したＮａＣｌ直線
勾配で洗った。２５ｍｌの画分を集めた。制限酵素活性
プールは０．４Ｍから０．６ＭのＮａＣｌでカラムから
溶出され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ
（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ
７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５０ｍＭ ＮＨ4 ＳＯ
4 、５％グリセロール及び０．１５％アジ化ナトリウ
ム）に対して一晩透析した。次に、集めたものをバッフ
ァＢで平衡化したBaker-bond Wide-pore PEI(NH)（登録
商標）カラム（１．５×１６ｃｍ）にかけた。カラムを
バッファＢ３０ｍｌ、次に、０．１Ｍから１．６ＭのＮ
ａＣｌを加えたバッファＢの直線勾配４００ｍｌで洗っ
た。制限酵素活性のピークは０．６−０．８ＭのＮａＣ
ｌで溶出され、これを集めた。PEIプールを一晩バッフ
ァＣ（１０ｍＭ トリス塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）
に対し透析し、次にバッファＣで平衡化したMono-Q（登
録商標）カラム（Pharmacia ）に載せた。０．１Ｍ−
０．６ＭのＮａＣｌ直線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵
素活性は０．３ＭのＮａＣｌで溶出され、これを集め
た。Mono-Q（登録商標）で集めたものを３倍容量のバッ
ファＤ（２０ｍＭ ＫＰＯ4 、ｐＨ６．８、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、５％グリセロール）で希釈し、５０ｍＭ
ＮａＣｌでMono-S（登録商標）（Pharmacia）にかけ
た。バッファＤ中５０ｍＭから０．５ＭのＮａＣｌの直
線勾配４０ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．２５Ｍの
ＮａＣｌで溶出され、これを集めた。二番目のMono-Qカ
ラムを上記のように流し、エンドヌクレアーゼ蛋白質が
確実に均質になるようにした。最終的なNotI制限エンド
ヌクレアーゼ調製物ではクーマシーブルーR-250 で染色
した１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約４２ｋＤの
１つの主要なバンドが得られた。
【００３９】３．上記２で製造したNotI制限エンドヌク
レアーゼをMatsudairaの手順（Matsudaira, P., J. Bio
l. Chem. 262: 10035-10038 (1987)）に従って電気泳動
にかけエレクトロブロットし、上記のように修飾した
（Looney, M.C., Moran, L.S.,Jack, W.E., Feehery,
G.R., Benner, J.S., Slatko, B.E. & Wilson, G.G., G
ene 80: 193-208 (1989)）。膜をクーマシーブルーＲ−
２５０で染色し、約４２ｋｄの蛋白質のバンドを切り出
し、逐次分解にかけた（Waite-Rees, P.A., Keating,
C.J., Moran, L.S., Slatko, B.E., Hornstra, L.J. &
Benner, J.S., J.Bacteriol. 173: 5207-5219 (199
1)）。
レアーゼをMatsudairaの手順（Matsudaira, P., J. Bio
l. Chem. 262: 10035-10038 (1987)）に従って電気泳動
にかけエレクトロブロットし、上記のように修飾した
（Looney, M.C., Moran, L.S.,Jack, W.E., Feehery,
G.R., Benner, J.S., Slatko, B.E. & Wilson, G.G., G
ene 80: 193-208 (1989)）。膜をクーマシーブルーＲ−
２５０で染色し、約４２ｋｄの蛋白質のバンドを切り出
し、逐次分解にかけた（Waite-Rees, P.A., Keating,
C.J., Moran, L.S., Slatko, B.E., Hornstra, L.J. &
Benner, J.S., J.Bacteriol. 173: 5207-5219 (199
1)）。
【００４０】４２ｋｄ蛋白質の最初の１５残基はMet-Ar
g-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-
Ile 、配列番号１に対応した。２０μｌ中２０μｇのNo
tIエンドヌクレアーゼの別の試料を、暗室内、室温で、
２４時間、８８％蒸留ギ酸２００μｌに溶解した２ｍｇ
の臭化シアンで処理した。この反応混合物を蒸発乾固さ
せ、２０μｌのローディング・バッファ（１．５Ｍ ト
リス塩酸 ｐＨ８．５、１２％グリセロール、４％ＳＤ
Ｓ、０．０５％ Serva Blue G、０．０５％Phenol Re
d）に１００℃で５分間再懸濁させた。この試料をトリ
ス−トリシン１０−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル
（Novex ）上の電気泳動に３時間かけ、次に１０ｍＭの
ＣＡＰＳバッファ（１０ｍＭ ３−［シクロヘキシルア
ミノ］−プロパンスルホン酸、１０％メタノール、０．
０５％ ＳＤＳ、０．００５％ジチオスレイトール、Ｎ
ａＯＨでｐＨ１１．０に調整）を使用し、タンク・エレ
クトロブロッター（TE52、Hoeffer ）中、２００ボルト
で１８時間かけて、ポリビニリデンジフルオライド（Ｐ
ＶＤＦ）膜（Problott, Applied BIosystems Inc.）に
移した。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色する
と、２４ｋｄ、１０ｋｄ、４ｋｄ及び３ｋｄの主要なバ
ンドが認められた。これらの染色された蛋白質バンドを
膜から切り出し、各々を逐次分解（２）にかけた。２４
ｋｄペプチドの最初の２７残基はMet-Arg-Ser-Asp-Thr-
Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile-Ala-Glu-Ph
e-Phe-Gly-X-X-Val-Tyr-Pro-Glu-Val 、配列番号２に対
応した。残基２１及び２２は同定されなかった。従っ
て、この断片はエンドヌクレアーゼのＮ末端からのもの
であると決定した。他のすべての断片は蛋白質内部から
Met残基で臭化シアンにより内部切断されて得られたも
のである。１０ｋｄペプチドの最初の９残基はAla-Tyr-
Lys-Phe-Ala-Leu-Ser-Gly-Arg 、配列番号３に対応し
た。４ｋｄペプチドの最初の３６残基はAsp-Phe-His-Gl
y-Ser-Tyr-Lys-His-ALa-Val-Gly-Ala-Ile-Asp-Ile-Ala-
Leu-Val-Glu-Gly-Ile-Asp-Phe-His-Gly-X-Leu-Pro-Thr-
Pro-Ala-Gly-(TyrまたはArg)-Ala-Ala-(Lys またはLe
u)、配列番号４に対応した。残基２６は決定されておら
ず、残基３３及び３６はいくらか不明確であった。この
３ｋｄペプチドバンドはほとんどのサイクルで２つのシ
グナルを出し、２つのペプチドの混合物と思われた。
g-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-
Ile 、配列番号１に対応した。２０μｌ中２０μｇのNo
tIエンドヌクレアーゼの別の試料を、暗室内、室温で、
２４時間、８８％蒸留ギ酸２００μｌに溶解した２ｍｇ
の臭化シアンで処理した。この反応混合物を蒸発乾固さ
せ、２０μｌのローディング・バッファ（１．５Ｍ ト
リス塩酸 ｐＨ８．５、１２％グリセロール、４％ＳＤ
Ｓ、０．０５％ Serva Blue G、０．０５％Phenol Re
d）に１００℃で５分間再懸濁させた。この試料をトリ
ス−トリシン１０−２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル
（Novex ）上の電気泳動に３時間かけ、次に１０ｍＭの
ＣＡＰＳバッファ（１０ｍＭ ３−［シクロヘキシルア
ミノ］−プロパンスルホン酸、１０％メタノール、０．
０５％ ＳＤＳ、０．００５％ジチオスレイトール、Ｎ
ａＯＨでｐＨ１１．０に調整）を使用し、タンク・エレ
クトロブロッター（TE52、Hoeffer ）中、２００ボルト
で１８時間かけて、ポリビニリデンジフルオライド（Ｐ
ＶＤＦ）膜（Problott, Applied BIosystems Inc.）に
移した。膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色する
と、２４ｋｄ、１０ｋｄ、４ｋｄ及び３ｋｄの主要なバ
ンドが認められた。これらの染色された蛋白質バンドを
膜から切り出し、各々を逐次分解（２）にかけた。２４
ｋｄペプチドの最初の２７残基はMet-Arg-Ser-Asp-Thr-
Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile-Ala-Glu-Ph
e-Phe-Gly-X-X-Val-Tyr-Pro-Glu-Val 、配列番号２に対
応した。残基２１及び２２は同定されなかった。従っ
て、この断片はエンドヌクレアーゼのＮ末端からのもの
であると決定した。他のすべての断片は蛋白質内部から
Met残基で臭化シアンにより内部切断されて得られたも
のである。１０ｋｄペプチドの最初の９残基はAla-Tyr-
Lys-Phe-Ala-Leu-Ser-Gly-Arg 、配列番号３に対応し
た。４ｋｄペプチドの最初の３６残基はAsp-Phe-His-Gl
y-Ser-Tyr-Lys-His-ALa-Val-Gly-Ala-Ile-Asp-Ile-Ala-
Leu-Val-Glu-Gly-Ile-Asp-Phe-His-Gly-X-Leu-Pro-Thr-
Pro-Ala-Gly-(TyrまたはArg)-Ala-Ala-(Lys またはLe
u)、配列番号４に対応した。残基２６は決定されておら
ず、残基３３及び３６はいくらか不明確であった。この
３ｋｄペプチドバンドはほとんどのサイクルで２つのシ
グナルを出し、２つのペプチドの混合物と思われた。
【００４１】４．無傷のNotIエンドヌクレアーゼ、２４
ｋｄ及び１０ｋｄペプチドからのペプチド配列データ及
びその既知の配向を使用して一連の８個のＰＣＲプライ
マーを構築した： １）GA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号５ ２）AA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号６ ３）GA SGC GAA CTT GTA SGC CAT 20-mer 、配列番号７ ４）GAR CCN GAR GGN GCN AAR TTY AT 23-mer 、配列番
号８ ５）GAG CCS GAG GGS GCS AAG TTC AT 23-mer 、配列番
号９ ６）AAR TTY ATH GCN GAR TTY TTY GG 23-mer 、配列番
号１０ ７）AAG TTC ATC GCS GAG TTC TTC GG 23-mer 、配列番
号１１ ８）GTN TAY CCN GAR 14-mer、配列番号１２ ［式中、 Y = T, C；R = A, G；H = A, T, C ；S = G,
C；N = A, C, G, T］。
ｋｄ及び１０ｋｄペプチドからのペプチド配列データ及
びその既知の配向を使用して一連の８個のＰＣＲプライ
マーを構築した： １）GA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号５ ２）AA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer 、配列番号６ ３）GA SGC GAA CTT GTA SGC CAT 20-mer 、配列番号７ ４）GAR CCN GAR GGN GCN AAR TTY AT 23-mer 、配列番
号８ ５）GAG CCS GAG GGS GCS AAG TTC AT 23-mer 、配列番
号９ ６）AAR TTY ATH GCN GAR TTY TTY GG 23-mer 、配列番
号１０ ７）AAG TTC ATC GCS GAG TTC TTC GG 23-mer 、配列番
号１１ ８）GTN TAY CCN GAR 14-mer、配列番号１２ ［式中、 Y = T, C；R = A, G；H = A, T, C ；S = G,
C；N = A, C, G, T］。
【００４２】プライマー１から３はNotI １０ｋｄ Ｃ
ＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の５′末端に向かっ
てプライムするように作製した。プライマー４から８は
NotI２４ｋｄ ＣＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の
３′末端に向かってプライムするように作製した。プラ
イマー３、５及び７ははっきりしない位置にはＡまたは
Ｔ残基を全く持たない。
ＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の５′末端に向かっ
てプライムするように作製した。プライマー４から８は
NotI２４ｋｄ ＣＮＢｒペプチド由来であり、遺伝子の
３′末端に向かってプライムするように作製した。プラ
イマー３、５及び７ははっきりしない位置にはＡまたは
Ｔ残基を全く持たない。
【００４３】５．プライマー３、５、７及び８を使用し
て遺伝子のＮ末端領域（プライマー５、７及び８）と１
０ｋｄ臭化シアン断片のアミノ末端（プライマー３）の
間のエンドヌクレアーゼ遺伝子の部分を増幅させた。３
種のＭｇ++濃度と４種のアニーリング温度を試みた。マ
スター反応混合物は、１０×Vent（登録商標）反応バッ
ファ６５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ ７μｌ、４ｍ
ＭのｄＮＴＰ溶液４０μｌ、ＤＭＳＯ ３３μｌ、Noca
rdia otitidis-caviarum ＤＮＡ ３．５μｌ（７００
ｎｇ）、ｄＨ2 Ｏ ４０８μｌ、プライマー３ １３μ
ｌ（６５０ｎｇ）、プライマー５ １３μｌ（６５０ｎ
ｇ）及びVentexo-（登録商標）ポリメラーゼ２０μｌ
（４０ｕ）を含むように調製した。混合物を２００μｌ
ずつの３つのアリコートに分けた。最初のアリコートに
はｄＨ2 Ｏを１６μｌ（最終Ｍｇ++濃度＝２ｍＭ）、２
番目のアリコートには１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を６μｌと
ｄＨ 2 Ｏを１０μｌ（［Ｍｇ++］＝５ｍＭ）、３番目の
アリコートには１００ｍＭのＭｇＳＯ4 を１６μｌ
（［Ｍｇ++］＝１０ｍＭ）加えた。これらの反応混合物
を４つに分け、４種のアニーリング温度で増幅させた。
プライマー３とプライマー７を使用する反応とプライマ
ー３とプライマー８を使用する反応は同様に実施した。
ＰＣＲ増幅条件は９５℃で１分、４５℃（または５０
℃、５５℃、６０℃）で１分、７２℃で１分半を３５サ
イクルであった。ＰＣＲ反応生成物１５μｌを１％アガ
ロースゲル塩基泳動で分析した。所望の大きさのバンド
が、プライマー３からプライマー５について、２ｍＭ
Ｍｇ++／アニーリング温度６０℃以外の反応の全てで認
められた。プライマー３とプライマー７の反応では、５
ｍＭ中、４５℃でアニーリングした反応、１０ｍＭのＭ
ｇ++中、５０℃及び５５℃でアニーリングした反応の３
つの全ての反応で所望の大きさのバンドが得られたが、
他の条件での反応では得られなかった。プライマー３と
プライマー８の組み合わせでは、５ｍＭと１０ｍＭのＭ
ｇ++で４５℃でアニーリングした場合と、１０ｍＭのＭ
ｇ++で５０℃でアニーリングした場合のみに所望の大き
さのバンドが得られた。所望の大きさのバンドを１％Ｌ
ＭＰアガロースの電気泳動にかけ、ゲルから切り出し、
６５℃で５分間溶融させ、４０℃に５分間冷却し、β−
アガロース（New England Biolabs, Inc., Beverly, M
A）１μｌ（１ｕ）を加え、４０℃で１時間インキュベ
ートすることによりアガロースを消化した。
て遺伝子のＮ末端領域（プライマー５、７及び８）と１
０ｋｄ臭化シアン断片のアミノ末端（プライマー３）の
間のエンドヌクレアーゼ遺伝子の部分を増幅させた。３
種のＭｇ++濃度と４種のアニーリング温度を試みた。マ
スター反応混合物は、１０×Vent（登録商標）反応バッ
ファ６５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ ７μｌ、４ｍ
ＭのｄＮＴＰ溶液４０μｌ、ＤＭＳＯ ３３μｌ、Noca
rdia otitidis-caviarum ＤＮＡ ３．５μｌ（７００
ｎｇ）、ｄＨ2 Ｏ ４０８μｌ、プライマー３ １３μ
ｌ（６５０ｎｇ）、プライマー５ １３μｌ（６５０ｎ
ｇ）及びVentexo-（登録商標）ポリメラーゼ２０μｌ
（４０ｕ）を含むように調製した。混合物を２００μｌ
ずつの３つのアリコートに分けた。最初のアリコートに
はｄＨ2 Ｏを１６μｌ（最終Ｍｇ++濃度＝２ｍＭ）、２
番目のアリコートには１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を６μｌと
ｄＨ 2 Ｏを１０μｌ（［Ｍｇ++］＝５ｍＭ）、３番目の
アリコートには１００ｍＭのＭｇＳＯ4 を１６μｌ
（［Ｍｇ++］＝１０ｍＭ）加えた。これらの反応混合物
を４つに分け、４種のアニーリング温度で増幅させた。
プライマー３とプライマー７を使用する反応とプライマ
ー３とプライマー８を使用する反応は同様に実施した。
ＰＣＲ増幅条件は９５℃で１分、４５℃（または５０
℃、５５℃、６０℃）で１分、７２℃で１分半を３５サ
イクルであった。ＰＣＲ反応生成物１５μｌを１％アガ
ロースゲル塩基泳動で分析した。所望の大きさのバンド
が、プライマー３からプライマー５について、２ｍＭ
Ｍｇ++／アニーリング温度６０℃以外の反応の全てで認
められた。プライマー３とプライマー７の反応では、５
ｍＭ中、４５℃でアニーリングした反応、１０ｍＭのＭ
ｇ++中、５０℃及び５５℃でアニーリングした反応の３
つの全ての反応で所望の大きさのバンドが得られたが、
他の条件での反応では得られなかった。プライマー３と
プライマー８の組み合わせでは、５ｍＭと１０ｍＭのＭ
ｇ++で４５℃でアニーリングした場合と、１０ｍＭのＭ
ｇ++で５０℃でアニーリングした場合のみに所望の大き
さのバンドが得られた。所望の大きさのバンドを１％Ｌ
ＭＰアガロースの電気泳動にかけ、ゲルから切り出し、
６５℃で５分間溶融させ、４０℃に５分間冷却し、β−
アガロース（New England Biolabs, Inc., Beverly, M
A）１μｌ（１ｕ）を加え、４０℃で１時間インキュベ
ートすることによりアガロースを消化した。
【００４４】６．部分消化：精製したＤＮＡをBamHI で
切断して、次のように部分消化した：NEBuffer BamHI
（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス塩酸、１０
ｍＭＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．
９）中５０μｇ／ｍｌのNocardia otitidis-caviarum
ＤＮＡ５００μｌを１００μｌのアリコート１つと５０
μｌのアリコート７つに分けた。１００μｌの試験管に
BamHI ２０単位を加えると、ＤＮＡ１μｇ当り酵素４単
位となった。最初の試験管から５０μｌ取り、２番目の
試験管に移し、BamHI ２単位／μｇとし、前のBamHI 量
の半分となるようにこれを続けた。試験管を３７℃で１
時間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽
出し、２容のエタノールで沈澱させ、乾燥させ、２０μ
ｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、各３μｌをアガロースゲ
ル電気泳動で分析した。限定消化されたことを示す試験
管と中等度の不完全な消化を示す試験管をクローニング
用断片の供給源として選んだ。別々の反応物を一緒に合
わせて混合し、下記ステップ７に記載するように使用し
た。
切断して、次のように部分消化した：NEBuffer BamHI
（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス塩酸、１０
ｍＭＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ７．
９）中５０μｇ／ｍｌのNocardia otitidis-caviarum
ＤＮＡ５００μｌを１００μｌのアリコート１つと５０
μｌのアリコート７つに分けた。１００μｌの試験管に
BamHI ２０単位を加えると、ＤＮＡ１μｇ当り酵素４単
位となった。最初の試験管から５０μｌ取り、２番目の
試験管に移し、BamHI ２単位／μｇとし、前のBamHI 量
の半分となるようにこれを続けた。試験管を３７℃で１
時間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで抽
出し、２容のエタノールで沈澱させ、乾燥させ、２０μ
ｌのＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、各３μｌをアガロースゲ
ル電気泳動で分析した。限定消化されたことを示す試験
管と中等度の不完全な消化を示す試験管をクローニング
用断片の供給源として選んだ。別々の反応物を一緒に合
わせて混合し、下記ステップ７に記載するように使用し
た。
【００４５】７．BamHI ライブラリー：BamHI ゲノムラ
イブラリーはベクターLambda Dash（登録商標） II
（Stratagene）を使用して構築した。lambda Dash II
は９−２３ｋｂのＤＮＡ断片のクローニングに使用でき
るラムダ置換ベクターである。上記のようにBamHI で完
全にまたは部分的に消化したNocardia otitidis-caviar
um ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）をBamHI で切断したLa
mbda Dash II アーム５００ｎｇ（０．５μｌ）と混合
した。１×１０3 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有す
る２×連結混合物（１００ｍＭ トリス ｐＨ７．８、
２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＤＤＴ、２ｍＭ Ａ
ＴＰ）２．５μｌを加え、混合物を１７℃で１６時間イ
ンキュベートした。製造業者の支持に従ってGigapack
（登録商標）II Plus （Stratagene）を使用して、連結
反応物２．５μｌをin vitroで感染性ファージ粒子にパ
ッケージした。室温で２時間インキュベートした後、パ
ッケージしたファージを５００μｌのＳＭ（ＳＭ＝１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、５０ｍＭトリ
ス塩酸 ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）とクロロホ
ルム３滴で希釈した。感染性ファージ粒子のタイターは
次のように測定した。パッケージしたファージの溶液２
μｌをＳＭ １９８μｌで希釈した。希釈したファージ
の１μｌ、１０μｌ及び１００μｌのアリコートを新し
いER1458細胞の懸濁液（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．
５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600＝２．０中）
１００μｌに加え、室温で１５分間インキュベートし、
次に４０℃でトップアガー（top agar）３ｍｌと混合
し、リッチ・プレートに広げた。トップアガーが固まっ
た後、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌
日、プラークを計数し、次の実験に使用するファージ・
ストックのタイターを計算すると、２．８×１０5 ｐｆ
ｕ／ｍｌであった。
イブラリーはベクターLambda Dash（登録商標） II
（Stratagene）を使用して構築した。lambda Dash II
は９−２３ｋｂのＤＮＡ断片のクローニングに使用でき
るラムダ置換ベクターである。上記のようにBamHI で完
全にまたは部分的に消化したNocardia otitidis-caviar
um ＤＮＡ２５０ｎｇ（２μｌ）をBamHI で切断したLa
mbda Dash II アーム５００ｎｇ（０．５μｌ）と混合
した。１×１０3 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含有す
る２×連結混合物（１００ｍＭ トリス ｐＨ７．８、
２０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ＤＤＴ、２ｍＭ Ａ
ＴＰ）２．５μｌを加え、混合物を１７℃で１６時間イ
ンキュベートした。製造業者の支持に従ってGigapack
（登録商標）II Plus （Stratagene）を使用して、連結
反応物２．５μｌをin vitroで感染性ファージ粒子にパ
ッケージした。室温で２時間インキュベートした後、パ
ッケージしたファージを５００μｌのＳＭ（ＳＭ＝１０
０ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ4 、５０ｍＭトリ
ス塩酸 ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）とクロロホ
ルム３滴で希釈した。感染性ファージ粒子のタイターは
次のように測定した。パッケージしたファージの溶液２
μｌをＳＭ １９８μｌで希釈した。希釈したファージ
の１μｌ、１０μｌ及び１００μｌのアリコートを新し
いER1458細胞の懸濁液（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．
５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、Ｏ．Ｄ．600＝２．０中）
１００μｌに加え、室温で１５分間インキュベートし、
次に４０℃でトップアガー（top agar）３ｍｌと混合
し、リッチ・プレートに広げた。トップアガーが固まっ
た後、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌
日、プラークを計数し、次の実験に使用するファージ・
ストックのタイターを計算すると、２．８×１０5 ｐｆ
ｕ／ｍｌであった。
【００４６】８．上記のようにin vitroでパッケージし
たファージを植え付け、大腸菌ER1458のローン中によく
分離されたプラークを形成した。約６００、１５００、
３０００及び５０００ファージのプレートを作製した。
lambda Dash II BamHI ライブラリーからのこれらのク
ローンのニトロセルロースフィルター・プラーク・リフ
トを、放射性標識し（Random Priming System I, New E
ngland Biolabs, Inc.Beverly, MA）ゲル精製したプラ
イマー３からプライマー５の増幅反応からのＰＣＲ生成
物（上記）（Benton-Davis法、Molecular Cloning, a L
aboratory Manual、T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. S
ambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
2, pp 320ff）でプロービングした。１７個の陽性プラ
ークを同定したところ、全部が精製プラークであった。
ＤＮＡを６つのファージの（トップアガロース中の）集
密的なプレート溶解物から調製し、BamHI で消化した。
６個全てが共通の14.5kb BamHI断片を含んでおり、これ
にプライマー３からプライマー５のプローブをハイブリ
ッドさせた。
たファージを植え付け、大腸菌ER1458のローン中によく
分離されたプラークを形成した。約６００、１５００、
３０００及び５０００ファージのプレートを作製した。
lambda Dash II BamHI ライブラリーからのこれらのク
ローンのニトロセルロースフィルター・プラーク・リフ
トを、放射性標識し（Random Priming System I, New E
ngland Biolabs, Inc.Beverly, MA）ゲル精製したプラ
イマー３からプライマー５の増幅反応からのＰＣＲ生成
物（上記）（Benton-Davis法、Molecular Cloning, a L
aboratory Manual、T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. S
ambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
2, pp 320ff）でプロービングした。１７個の陽性プラ
ークを同定したところ、全部が精製プラークであった。
ＤＮＡを６つのファージの（トップアガロース中の）集
密的なプレート溶解物から調製し、BamHI で消化した。
６個全てが共通の14.5kb BamHI断片を含んでおり、これ
にプライマー３からプライマー５のプローブをハイブリ
ッドさせた。
【００４７】９．14.5kb BamHI断片のマッピング：マッ
ピングを容易にするために、lambdaDash II クローンで
同定したNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5kb
BamHI断片をpUC19 にサブクローニングし、クローンpN
OTB14.5 を作製した。pNOTB14.5 クローンを製造者の指
示に従って種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断
片の制限地図を決定した（図２）。このクローン上のNo
tIエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置はプライマー３から
プライマー５のプローブ（上記）をクローンの制限消化
物にサザン・ハイブリッド形成させて決定した（Southe
rn, E. 1975, J. Mol. Biol., 98:503）。この中では、
HindIII 、PflMI 、XbaI、ClaI及びBstBI 消化物が14.5
kb BamHI断片上のプローブの位置決定に特に有用であっ
た（図２）。プローブはBamHI 断片の一方に約８２００
ｂｐ、他方に５６００ｂｐを持つ中央部近くとハイブリ
ッドし、このことは、制限及び修飾遺伝子全体を含有す
るのに十分なＤＮＡが存在することを示している。pNOT
B14.5 クローンを増殖させ、NotI制限活性についてアッ
セイしたが、何も検出されなかった。クローニングした
ＤＮＡで４つの部位を完全に切断するNotI酵素能で評価
されたように、in vivo でメチラーゼ活性は検出されな
かった。
ピングを容易にするために、lambdaDash II クローンで
同定したNocardia otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5kb
BamHI断片をpUC19 にサブクローニングし、クローンpN
OTB14.5 を作製した。pNOTB14.5 クローンを製造者の指
示に従って種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断
片の制限地図を決定した（図２）。このクローン上のNo
tIエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置はプライマー３から
プライマー５のプローブ（上記）をクローンの制限消化
物にサザン・ハイブリッド形成させて決定した（Southe
rn, E. 1975, J. Mol. Biol., 98:503）。この中では、
HindIII 、PflMI 、XbaI、ClaI及びBstBI 消化物が14.5
kb BamHI断片上のプローブの位置決定に特に有用であっ
た（図２）。プローブはBamHI 断片の一方に約８２００
ｂｐ、他方に５６００ｂｐを持つ中央部近くとハイブリ
ッドし、このことは、制限及び修飾遺伝子全体を含有す
るのに十分なＤＮＡが存在することを示している。pNOT
B14.5 クローンを増殖させ、NotI制限活性についてアッ
セイしたが、何も検出されなかった。クローニングした
ＤＮＡで４つの部位を完全に切断するNotI酵素能で評価
されたように、in vivo でメチラーゼ活性は検出されな
かった。
【００４８】プローブ近くのクローンの領域の配列決定
を容易にするために、pNOTB14.5 の種々のサブクローン
を構築した。サブクローンは、クローンの部分を欠失さ
せることにより、または制限酵素で切断し、所望の断片
をゲルで調製し、適切に切断し、脱燐酸化したpUC19 ベ
クターに連結して作製した。所望の構築物のクローン
は、ミニプレップを実施し、精製ＤＮＡを消化し、アガ
ロースゲル電気泳動で分析して同定した。
を容易にするために、pNOTB14.5 の種々のサブクローン
を構築した。サブクローンは、クローンの部分を欠失さ
せることにより、または制限酵素で切断し、所望の断片
をゲルで調製し、適切に切断し、脱燐酸化したpUC19 ベ
クターに連結して作製した。所望の構築物のクローン
は、ミニプレップを実施し、精製ＤＮＡを消化し、アガ
ロースゲル電気泳動で分析して同定した。
【００４９】プラスミドクローンの分析：アンピシリン
を含有するＬブロスの培養物１０ｍｌに各形質転換細胞
を接種し、形質転換細胞を含むプラスミドをBirnboin &
Doly （Nucleic Acids Res. 7: 1513, 1979）の方法か
ら適用したミニプレップ・プラスミド精製手順で調製し
た。
を含有するＬブロスの培養物１０ｍｌに各形質転換細胞
を接種し、形質転換細胞を含むプラスミドをBirnboin &
Doly （Nucleic Acids Res. 7: 1513, 1979）の方法か
ら適用したミニプレップ・プラスミド精製手順で調製し
た。
【００５０】ミニプレップ手順：各培養物を８０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレット
を１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２５ｍＭトリ
ス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース（ｐＨ
８．０）１ｍｌに再懸濁させた。室温に１０分間置いた
後、０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ２．０ｍｌを各
試験管に加え、試験管を振って細胞を溶解させ、氷上に
置いた。溶液が透明になったら、各試験管に３Ｍの酢酸
ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを加えて、振っ
た。形成された沈澱物を４℃で１５０００ｒｐｍで１０
分間回転させて沈澱させた。イソプロパノール３ｍｌを
含む遠心管に各上清を加え、混合した。室温に１０分置
いた後、遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ
て、沈澱した核酸をペレットとした。上清を捨て、ペレ
ットを室温で３０分間、空気乾燥させた。乾燥したら、
ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む１０ｍＭ
トリスｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌに溶
解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化
した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、次に３５０μｌのイ
ソプロパノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。室温に
１０分間置いた後、５分間遠心分離してＤＮＡを沈澱さ
せた。上清を捨て、ペレットを乾燥させ、次に１０ｍＭ
トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ １５０μｌの
最終溶液に再溶解させた。次に、プラスミド・ミニプレ
ップを種々の制限エンドヌクレアーゼによる消化で分析
した。
ｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレット
を１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２５ｍＭトリ
ス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭグルコース（ｐＨ
８．０）１ｍｌに再懸濁させた。室温に１０分間置いた
後、０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ ２．０ｍｌを各
試験管に加え、試験管を振って細胞を溶解させ、氷上に
置いた。溶液が透明になったら、各試験管に３Ｍの酢酸
ナトリウム（ｐＨ４．８）１．５ｍｌを加えて、振っ
た。形成された沈澱物を４℃で１５０００ｒｐｍで１０
分間回転させて沈澱させた。イソプロパノール３ｍｌを
含む遠心管に各上清を加え、混合した。室温に１０分置
いた後、遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ
て、沈澱した核酸をペレットとした。上清を捨て、ペレ
ットを室温で３０分間、空気乾燥させた。乾燥したら、
ペレットを５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含む１０ｍＭ
トリスｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌに溶
解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを消化
した。５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、次に３５０μｌのイ
ソプロパノールを添加してＤＮＡを沈澱させた。室温に
１０分間置いた後、５分間遠心分離してＤＮＡを沈澱さ
せた。上清を捨て、ペレットを乾燥させ、次に１０ｍＭ
トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ １５０μｌの
最終溶液に再溶解させた。次に、プラスミド・ミニプレ
ップを種々の制限エンドヌクレアーゼによる消化で分析
した。
【００５１】１０．ＤＮＡ配列決定：ＤＮＡ配列決定
は、製造者の指示に従ってCircumvent（登録商標） DNA
配列決定キット（New England Biolabs ）を使用して実
施した。ミニプレップＤＮＡ調製物を鋳型として使用し
た。ＤＮＡ配列決定は次の制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子全体をクローニングし、クローニングした遺伝子の大
腸菌での発現を誘導するための操作の元となるデータを
提供した。ＤＮＡ配列から推定のアミノ酸配列はＮ末端
（２４ｋＤペプチド）、１０ｋＤ、４ｋＤ及び推定され
た２つの小さなペプチド（約３ｋＤ）の蛋白質配列と一
致し、ペプチド断片の順序が２４ｋＤ、４ｋＤ、３
（Ａ）ｋＤ、１０ｋＤ、３（Ｂ）ｋＤであることを示し
た。蛋白質のＮ末端の正確なＤＮＡ配列を使用してNotI
遺伝子を発現するためのＰＣＲ増幅プライマーを設計し
た。エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流にあるSalI部位の
周りの配列を使用して第二のＰＣＲ発現プライマーを設
計した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流の配列は典型
的な大腸菌転写因子を含んでおらず、これはpNOTB14.5
から発現されないことと一致している。エンドヌクレア
ーゼの出発点から４４ｎｔで分離された、NotIエンドヌ
クレアーゼ遺伝子に先立ち、同じ配向にある読み取り枠
で、β型Ｎ４−メチルシトシンメチラーゼ遺伝子のコン
センサスモチーフ、モチーフＩＶ＝Ile-Thr-Ser-Pro-Pr
o-Tyr-Trp-Gly-Met-Arg-Thr-Tyr （配列番号１３）及び
モチーフＩ＝Gly-Gly-Leu-Val-Leu-Asp-Pro-Phe-Ala-Gl
y-Thr-Gly-Arg-Ala （配列番号１４）（Wilson, G.G.,
Methods in Enzymology, 216: Recombinant DNA Part
G、Wu, R.編、Academic Press, 1992,pp259-279 ）が認
められた。このデータは連結Ｒ−Ｍシステムと一致す
る。
は、製造者の指示に従ってCircumvent（登録商標） DNA
配列決定キット（New England Biolabs ）を使用して実
施した。ミニプレップＤＮＡ調製物を鋳型として使用し
た。ＤＮＡ配列決定は次の制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子全体をクローニングし、クローニングした遺伝子の大
腸菌での発現を誘導するための操作の元となるデータを
提供した。ＤＮＡ配列から推定のアミノ酸配列はＮ末端
（２４ｋＤペプチド）、１０ｋＤ、４ｋＤ及び推定され
た２つの小さなペプチド（約３ｋＤ）の蛋白質配列と一
致し、ペプチド断片の順序が２４ｋＤ、４ｋＤ、３
（Ａ）ｋＤ、１０ｋＤ、３（Ｂ）ｋＤであることを示し
た。蛋白質のＮ末端の正確なＤＮＡ配列を使用してNotI
遺伝子を発現するためのＰＣＲ増幅プライマーを設計し
た。エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流にあるSalI部位の
周りの配列を使用して第二のＰＣＲ発現プライマーを設
計した。エンドヌクレアーゼ遺伝子の上流の配列は典型
的な大腸菌転写因子を含んでおらず、これはpNOTB14.5
から発現されないことと一致している。エンドヌクレア
ーゼの出発点から４４ｎｔで分離された、NotIエンドヌ
クレアーゼ遺伝子に先立ち、同じ配向にある読み取り枠
で、β型Ｎ４−メチルシトシンメチラーゼ遺伝子のコン
センサスモチーフ、モチーフＩＶ＝Ile-Thr-Ser-Pro-Pr
o-Tyr-Trp-Gly-Met-Arg-Thr-Tyr （配列番号１３）及び
モチーフＩ＝Gly-Gly-Leu-Val-Leu-Asp-Pro-Phe-Ala-Gl
y-Thr-Gly-Arg-Ala （配列番号１４）（Wilson, G.G.,
Methods in Enzymology, 216: Recombinant DNA Part
G、Wu, R.編、Academic Press, 1992,pp259-279 ）が認
められた。このデータは連結Ｒ−Ｍシステムと一致す
る。
【００５２】１１．NotI制限エンドヌクレアーゼの過剰
発現：制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクター
pSYX22の誘導可能なプロモータ（Ｔ７）及び強力に認識
されるリボソーム結合部位のすぐ下流に遺伝子を挿入す
ることにより過剰発現させた。これを実施するために、
ＤＮＡ配列及び蛋白質配列データを使用して２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを作製した。最初のオリゴヌ
クレオチドプライマーはＡＴＧコドンに重なる配列を含
有しており、蛋白質配列決定から、エンドヌクレアーゼ
の開始部分であるが、３個の塩基が変化してNdeI部位を
形成し、エンドヌクレアーゼの第二及び第三コドンの３
位の塩基が大腸菌が使用するのに好ましいコドンに変化
していた：５′ GACG CAT ATG CGT TCC GAT ACG TCG GT
G GAG CCA GAG ３′配列番号１５（NdeI部位は下線で示
し、N. otitidis-caviarum配列から変化したヌクレオチ
ドは太字で示す）。第二のオリゴヌクレオチドプライマ
ーはNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子末端の３′に約５０
０個のヌクレオチドの配列を含み、増幅させた後の断片
のクローニングを助けるためにプライマーに含まれてい
る、N. otitidis-cavariarum ＤＮＡ中のSalI部位を有
している：５′ GAAT GTC GAC CAT CTC CAC CCA CG 3′
配列番号１６（SalI部位を下線で示す）。これらの２つ
のプライマーは、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
を使用するＰＣＲ反応（９５℃１分間、５６℃１分間、
７２℃２分間；pNOTB14.5 から１０サイクル、ゲノムＤ
ＮＡから１０サイクル）に、鋳型としてのゲノムN. oti
tidis-caviarum ＤＮＡ及びpNOTB14.5 プラスミドと共
に使用し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む1.7kb
ＤＮＡ断片を増幅させた。ステップ５に述べたように、
バンドをゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を２０Ｕ
のNdeI及び２０ＵのSalIを使用し、１×NEBuffer 3で１
時間消化した。インキュベーションした後、消化物をフ
ェノールとクロロホルムの１対１混合物で１回、クロロ
ホルムで１回抽出し、２容のエタノールで沈澱させた。
ＤＮＡを遠心分離によりペレットととし、７０％エタノ
ールで１回洗い、乾燥させ、２０μｌのＴＥに再懸濁さ
せた。精製した断片３μｌ（〜０．１μｇ）をＴ７発現
ベクターpSYX22（S. Xu, New England Biolabsから入
手）に連結した。このベクターはＴ４ ＤＮＡリガーゼ
４００Ｕを含む全容量２０μｌ中、１７℃で４時間、Ne
dI及びSalI（〜０．０５μｇ）で消化してあった。［pS
YX22の誘導体化：pET-11a はＴ７プロモータの４ｂｐ下
流にlac オペレータ（このＴ７プロモータとlac オペレ
ータをＴ７ｌａｃプロモータと呼ぶ）、lacIq 遺伝子、
及びクローニング用の２つの制限部位、NdeI及びBamHI
を含むpBR322由来のＴ７発現ベクターである（Dubendor
ff, J.W. & Studier, F.W., J. Mol. Biiol. 219: 45-5
9, 1991 ）。］Ｔ７プロモータの上流のrrnB転写ターミ
ネータを４コピー含むpET-11a 誘導体、pAII17を構築し
た（pAII17はNew England Biolabs, Beverly, MAのWill
iam Jackが作製した）。Ｔ７プロモータの上流にある転
写ターミネータはさらに標的遺伝子の発現の基礎レベル
を下げる。クローニングが容易なように、ベクターのBa
mHI 部位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片
に充填し、SalIリンカーを挿入してBamHI 部位を置換し
た。このプラスミドをpSYX22.Jとした。連結物１０μｌ
を使用して、pEagM184-AのEagIメチラーゼ遺伝子で予め
修飾したコンピテント大腸菌ＥＲ２１６９（New Englan
d Biolabs, Inc., Beverly, MAから入手できる）を形質
転換した。［EagIメチル化認識部位CGGCCGはNotI制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位と重なり合っており、従って
宿主をNotIによる消化から保護する。pEagM184-Aはp15A
複製開始点に camr 及びTcr 遺伝子を持つコピー数の低
いプラスミドであるpACYC184由来である。Tcr 遺伝子に
挿入したメチラーゼ遺伝子はTcプロモータから本質的に
発現できる］。形質転換した細胞をアンピシリン（１０
０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３５μｇ／
ｍｌ）を含むＬ寒天に植え付けた。ステップ９に記載の
ミニプラスミド・プレップ手順を使用して、プラスミド
をゲノムＤＮＡとpNOTB14.5 由来の増幅ＤＮＡの両者か
らの各々１４個のコロニーから単離した。各ミニプレッ
プ５μｌをNdeI及びSalIの両方で消化したものを、pAII
17をNedI及びSalIの両方で消化したものと比較した。１
４個のゲノム由来のクローンの内１つと１４個のpNOTB1
4.5 由来のクローンの内の２つは約１．７ｋｂの挿入物
を含んでいた。これらの３つのクローン全部をさらに特
性化するために選択した。これらの３つのクローンをア
ンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する２００
ｍｌのＬブロス中でＫｌｅｔｔが８０（中間対数増殖
期）になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し
た。誘導２時間後、細胞（約０．８ｇ）を遠心分離によ
って採取し、冷い音波処理バッファ（２０ｍＭトリス塩
酸 ｐＨ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）で一回洗い、音波処理バッファ３ｍｌに再懸濁し、
氷上で音波処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各抽出物４．５
μｌをＤＮＡアッセイ混合物（NEBufferNotI ５０μｌ
にAdeno2 ＤＮＡ １μｇを含む）７５μｌと混合し
た。この試験管からの２５μｌをＤＮＡ混合物５０μｌ
と混合し、１：２希釈とした。さらに３回続けて１：２
希釈した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベート
した。反応混合物２０μｌを１％のアガロースゲルにか
けた。３つのクローンはすべてこのアッセイで正確にタ
イターを測定するには強すぎるNotI制限エンドヌクレア
ーゼ活性を示した。しかし、酵素のタイターは細胞１ｇ
当り２．５×１０5 単位より大きいと概算された。さら
に滴定すると、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性は細胞
１ｇ当り約５×１０6 単位となった。このレベルはNoca
rdia otitidis-caviarumの未精製抽出物で認められる細
胞１ｇ当りのNotI制限エンドヌクレアーゼ活性の約１０
００倍である。これらのクローンの１つをさらに特性化
するために選択し、株NEB# 816と表わし、プラスミドは
pRM189-1と命名した。NEB# 816のサンプルはブダペスト
条約に基づき、１９９２年１２月３日にRockville 、Ma
rylandのAmerican Type Culture Collectionに寄託して
あり、受託番号は６９１３９号である。
発現：制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は、発現ベクター
pSYX22の誘導可能なプロモータ（Ｔ７）及び強力に認識
されるリボソーム結合部位のすぐ下流に遺伝子を挿入す
ることにより過剰発現させた。これを実施するために、
ＤＮＡ配列及び蛋白質配列データを使用して２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを作製した。最初のオリゴヌ
クレオチドプライマーはＡＴＧコドンに重なる配列を含
有しており、蛋白質配列決定から、エンドヌクレアーゼ
の開始部分であるが、３個の塩基が変化してNdeI部位を
形成し、エンドヌクレアーゼの第二及び第三コドンの３
位の塩基が大腸菌が使用するのに好ましいコドンに変化
していた：５′ GACG CAT ATG CGT TCC GAT ACG TCG GT
G GAG CCA GAG ３′配列番号１５（NdeI部位は下線で示
し、N. otitidis-caviarum配列から変化したヌクレオチ
ドは太字で示す）。第二のオリゴヌクレオチドプライマ
ーはNotIエンドヌクレアーゼ遺伝子末端の３′に約５０
０個のヌクレオチドの配列を含み、増幅させた後の断片
のクローニングを助けるためにプライマーに含まれてい
る、N. otitidis-cavariarum ＤＮＡ中のSalI部位を有
している：５′ GAAT GTC GAC CAT CTC CAC CCA CG 3′
配列番号１６（SalI部位を下線で示す）。これらの２つ
のプライマーは、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ
を使用するＰＣＲ反応（９５℃１分間、５６℃１分間、
７２℃２分間；pNOTB14.5 から１０サイクル、ゲノムＤ
ＮＡから１０サイクル）に、鋳型としてのゲノムN. oti
tidis-caviarum ＤＮＡ及びpNOTB14.5 プラスミドと共
に使用し、NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む1.7kb
ＤＮＡ断片を増幅させた。ステップ５に述べたように、
バンドをゲル精製した。精製したＰＣＲ生成物を２０Ｕ
のNdeI及び２０ＵのSalIを使用し、１×NEBuffer 3で１
時間消化した。インキュベーションした後、消化物をフ
ェノールとクロロホルムの１対１混合物で１回、クロロ
ホルムで１回抽出し、２容のエタノールで沈澱させた。
ＤＮＡを遠心分離によりペレットととし、７０％エタノ
ールで１回洗い、乾燥させ、２０μｌのＴＥに再懸濁さ
せた。精製した断片３μｌ（〜０．１μｇ）をＴ７発現
ベクターpSYX22（S. Xu, New England Biolabsから入
手）に連結した。このベクターはＴ４ ＤＮＡリガーゼ
４００Ｕを含む全容量２０μｌ中、１７℃で４時間、Ne
dI及びSalI（〜０．０５μｇ）で消化してあった。［pS
YX22の誘導体化：pET-11a はＴ７プロモータの４ｂｐ下
流にlac オペレータ（このＴ７プロモータとlac オペレ
ータをＴ７ｌａｃプロモータと呼ぶ）、lacIq 遺伝子、
及びクローニング用の２つの制限部位、NdeI及びBamHI
を含むpBR322由来のＴ７発現ベクターである（Dubendor
ff, J.W. & Studier, F.W., J. Mol. Biiol. 219: 45-5
9, 1991 ）。］Ｔ７プロモータの上流のrrnB転写ターミ
ネータを４コピー含むpET-11a 誘導体、pAII17を構築し
た（pAII17はNew England Biolabs, Beverly, MAのWill
iam Jackが作製した）。Ｔ７プロモータの上流にある転
写ターミネータはさらに標的遺伝子の発現の基礎レベル
を下げる。クローニングが容易なように、ベクターのBa
mHI 部位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片
に充填し、SalIリンカーを挿入してBamHI 部位を置換し
た。このプラスミドをpSYX22.Jとした。連結物１０μｌ
を使用して、pEagM184-AのEagIメチラーゼ遺伝子で予め
修飾したコンピテント大腸菌ＥＲ２１６９（New Englan
d Biolabs, Inc., Beverly, MAから入手できる）を形質
転換した。［EagIメチル化認識部位CGGCCGはNotI制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位と重なり合っており、従って
宿主をNotIによる消化から保護する。pEagM184-Aはp15A
複製開始点に camr 及びTcr 遺伝子を持つコピー数の低
いプラスミドであるpACYC184由来である。Tcr 遺伝子に
挿入したメチラーゼ遺伝子はTcプロモータから本質的に
発現できる］。形質転換した細胞をアンピシリン（１０
０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３５μｇ／
ｍｌ）を含むＬ寒天に植え付けた。ステップ９に記載の
ミニプラスミド・プレップ手順を使用して、プラスミド
をゲノムＤＮＡとpNOTB14.5 由来の増幅ＤＮＡの両者か
らの各々１４個のコロニーから単離した。各ミニプレッ
プ５μｌをNdeI及びSalIの両方で消化したものを、pAII
17をNedI及びSalIの両方で消化したものと比較した。１
４個のゲノム由来のクローンの内１つと１４個のpNOTB1
4.5 由来のクローンの内の２つは約１．７ｋｂの挿入物
を含んでいた。これらの３つのクローン全部をさらに特
性化するために選択した。これらの３つのクローンをア
ンピシリン及びクロラムフェニコールを含有する２００
ｍｌのＬブロス中でＫｌｅｔｔが８０（中間対数増殖
期）になるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し
た。誘導２時間後、細胞（約０．８ｇ）を遠心分離によ
って採取し、冷い音波処理バッファ（２０ｍＭトリス塩
酸 ｐＨ７．５、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）で一回洗い、音波処理バッファ３ｍｌに再懸濁し、
氷上で音波処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，
０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各抽出物４．５
μｌをＤＮＡアッセイ混合物（NEBufferNotI ５０μｌ
にAdeno2 ＤＮＡ １μｇを含む）７５μｌと混合し
た。この試験管からの２５μｌをＤＮＡ混合物５０μｌ
と混合し、１：２希釈とした。さらに３回続けて１：２
希釈した。反応混合物を３７℃で１時間インキュベート
した。反応混合物２０μｌを１％のアガロースゲルにか
けた。３つのクローンはすべてこのアッセイで正確にタ
イターを測定するには強すぎるNotI制限エンドヌクレア
ーゼ活性を示した。しかし、酵素のタイターは細胞１ｇ
当り２．５×１０5 単位より大きいと概算された。さら
に滴定すると、NotI制限エンドヌクレアーゼ活性は細胞
１ｇ当り約５×１０6 単位となった。このレベルはNoca
rdia otitidis-caviarumの未精製抽出物で認められる細
胞１ｇ当りのNotI制限エンドヌクレアーゼ活性の約１０
００倍である。これらのクローンの１つをさらに特性化
するために選択し、株NEB# 816と表わし、プラスミドは
pRM189-1と命名した。NEB# 816のサンプルはブダペスト
条約に基づき、１９９２年１２月３日にRockville 、Ma
rylandのAmerican Type Culture Collectionに寄託して
あり、受託番号は６９１３９号である。
【００５３】１２.NotI 制限エンドヌクレアーゼはアン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコー
ル（３５μｇ／ｍｌ）を含む富裕培地を入れた発酵器中
でレイト−ログ期(late-log phase)まで増殖させること
によりNEB# 816から産生できる。次に、ＩＰＴＧを最終
濃度０．５ｍＭまで加えて培養物を誘導し、２時間培養
を続けた。次に、細胞を遠心分離により採取した。
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコー
ル（３５μｇ／ｍｌ）を含む富裕培地を入れた発酵器中
でレイト−ログ期(late-log phase)まで増殖させること
によりNEB# 816から産生できる。次に、ＩＰＴＧを最終
濃度０．５ｍＭまで加えて培養物を誘導し、２時間培養
を続けた。次に、細胞を遠心分離により採取した。
【００５４】１３．NEB# 816からのNotI制限エンドヌク
レアーゼの精製：以下の手順はすべて氷上または４℃で
実施した。細胞１８ｇをバッファＡ（１０ｍＭ燐酸カリ
ウムｐＨ６．９、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、５％グリセロール）７０ｍｌに再懸濁し、全力
で１分間音波処理して破壊すると、Ｏ．Ｄ．２６０が
０．１３となった。抽出物を４℃、１０，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心し、得られた上清をバッファＡで平衡化
したホスホセルロースカラム（２．５×１５ｃｍ）に載
せた。カラムをバッファＡ６０ｍｌで洗い、次に０．１
Ｍから１ＭのＮａＣｌの直線勾配９００ｍｌをかけた。
制限酵素活性は０．２Ｍから０．３ＭのＮａＣｌで溶出
され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ（０．
１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５％グリセロール及び０．１５％
アジ化ナトリウム）に対して一晩透析し、バッファＢで
平衡化したヘパリン−セルロースカラム（１．５×１７
ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＢ ３０ｍｌで洗
い、０．１Ｍから１．２ＭのＮａＣｌの直線勾配４００
ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．５Ｍから０．６Ｍの
間のＮａＣｌでヘパリンカラムから溶出され、これを集
めた。集めたものをＮａＣｌを含まないバッファＢで
１：１希釈し、ＮａＣｌ濃度０．３ＭのバッファＢで平
衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（１．５×１６
ｃｍ）に通した。制限酵素活性はカラムを素通りした。
素通りしたものを集め、ＮａＣｌを含まないバッファＢ
で１：１に希釈し、ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍのバッファ
Ｂで平衡化したＰＥＩカラム（１．５×１０ｃｍ）に載
せた。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗い、０．１５
Ｍから１．８ＭのＮａＣｌの直線勾配３００ｍｌをかけ
た。制限酵素活性はＮａＣｌ０．６Ｍから０．８Ｍで溶
出され、これを集めた。集めたものに、最終濃度１００
μｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
を加えた。集めたものを保存バッファ（１０ｍＭトリス
塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１５％Triton-X 100及
び５０％ｖ／ｖグリセロール）に対して透析した。この
精製法で５３，０００，０００単位のNotI制限エンドヌ
クレアーゼが得られた。
レアーゼの精製：以下の手順はすべて氷上または４℃で
実施した。細胞１８ｇをバッファＡ（１０ｍＭ燐酸カリ
ウムｐＨ６．９、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、５％グリセロール）７０ｍｌに再懸濁し、全力
で１分間音波処理して破壊すると、Ｏ．Ｄ．２６０が
０．１３となった。抽出物を４℃、１０，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心し、得られた上清をバッファＡで平衡化
したホスホセルロースカラム（２．５×１５ｃｍ）に載
せた。カラムをバッファＡ６０ｍｌで洗い、次に０．１
Ｍから１ＭのＮａＣｌの直線勾配９００ｍｌをかけた。
制限酵素活性は０．２Ｍから０．３ＭのＮａＣｌで溶出
され、これを集めた。Ｐ細胞プールをバッファＢ（０．
１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、５％グリセロール及び０．１５％
アジ化ナトリウム）に対して一晩透析し、バッファＢで
平衡化したヘパリン−セルロースカラム（１．５×１７
ｃｍ）にかけた。カラムをバッファＢ ３０ｍｌで洗
い、０．１Ｍから１．２ＭのＮａＣｌの直線勾配４００
ｍｌをかけた。制限酵素活性は０．５Ｍから０．６Ｍの
間のＮａＣｌでヘパリンカラムから溶出され、これを集
めた。集めたものをＮａＣｌを含まないバッファＢで
１：１希釈し、ＮａＣｌ濃度０．３ＭのバッファＢで平
衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラム（１．５×１６
ｃｍ）に通した。制限酵素活性はカラムを素通りした。
素通りしたものを集め、ＮａＣｌを含まないバッファＢ
で１：１に希釈し、ＮａＣｌ濃度０．１５Ｍのバッファ
Ｂで平衡化したＰＥＩカラム（１．５×１０ｃｍ）に載
せた。カラムを２０ｍｌのバッファＢで洗い、０．１５
Ｍから１．８ＭのＮａＣｌの直線勾配３００ｍｌをかけ
た。制限酵素活性はＮａＣｌ０．６Ｍから０．８Ｍで溶
出され、これを集めた。集めたものに、最終濃度１００
μｇ／ｍｌとなるようにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
を加えた。集めたものを保存バッファ（１０ｍＭトリス
塩酸 ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１５％Triton-X 100及
び５０％ｖ／ｖグリセロール）に対して透析した。この
精製法で５３，０００，０００単位のNotI制限エンドヌ
クレアーゼが得られた。
【００５５】この精製により得られたNotI制限エンドヌ
クレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌク
レアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含まなかった。NotI
制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度は次の基準を検討
して調べた：１）連結：Adeno2ＤＮＡを２５倍過剰消化
した後、産生されたＤＮＡ断片の９５％以上が（１６
℃、５′末端濃度１−２ｕＭで）Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
連結した。これらの連結した断片の内、９５％は再度切
断できた。２）長期消化：Adeno2 ＤＮＡ １μｇ及び
酵素２００単位を含む反応混合物５０μｌを１６時間イ
ンキュベートした後、１単位の酵素で１時間反応したと
きと同じパターンのＤＮＡバンドが得られた。３）エキ
ソヌクレアーゼ活性：超音波処理した 3Ｈ ＤＮＡ（１
０5 ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む反応混合物５０μｌ
中、３７℃で４時間、酵素２００単位をインキュベート
した後、０．０３％未満の放射能が放出された。４）エ
ンドヌクレアーゼの混在：１μｇのΦＸ１７４ ＲＦＩ
ＤＮＡを含む反応混合物５０μｌ中、３７℃で４時
間、酵素２００単位をインキュベートした後、５％未満
がＲＦＩＩに変換された。５）メガベースゲノム消化：
ＰＦＧ電気泳動で測定すると、０．５％アガロース中の
大腸菌ゲノムＤＮＡ １μｇをNotI ２００ｕと共にNE
Buffer#3 １００μｌ中で１６時間インキュベートして
消化すると、５ｕで４時間の場合と同じ限定消化のバン
ドパターンが得られた。試験はすべて次の反応バッファ
中で実施した：１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを補ったNEBu
ffer3 （１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ
７．９）。
クレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エンドヌク
レアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含まなかった。NotI
制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度は次の基準を検討
して調べた：１）連結：Adeno2ＤＮＡを２５倍過剰消化
した後、産生されたＤＮＡ断片の９５％以上が（１６
℃、５′末端濃度１−２ｕＭで）Ｔ４ＤＮＡリガーゼに
連結した。これらの連結した断片の内、９５％は再度切
断できた。２）長期消化：Adeno2 ＤＮＡ １μｇ及び
酵素２００単位を含む反応混合物５０μｌを１６時間イ
ンキュベートした後、１単位の酵素で１時間反応したと
きと同じパターンのＤＮＡバンドが得られた。３）エキ
ソヌクレアーゼ活性：超音波処理した 3Ｈ ＤＮＡ（１
０5 ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む反応混合物５０μｌ
中、３７℃で４時間、酵素２００単位をインキュベート
した後、０．０３％未満の放射能が放出された。４）エ
ンドヌクレアーゼの混在：１μｇのΦＸ１７４ ＲＦＩ
ＤＮＡを含む反応混合物５０μｌ中、３７℃で４時
間、酵素２００単位をインキュベートした後、５％未満
がＲＦＩＩに変換された。５）メガベースゲノム消化：
ＰＦＧ電気泳動で測定すると、０．５％アガロース中の
大腸菌ゲノムＤＮＡ １μｇをNotI ２００ｕと共にNE
Buffer#3 １００μｌ中で１６時間インキュベートして
消化すると、５ｕで４時間の場合と同じ限定消化のバン
ドパターンが得られた。試験はすべて次の反応バッファ
中で実施した：１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを補ったNEBu
ffer3 （１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃でｐＨ
７．９）。
【００５６】
配列番号：１ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００５７】
【表１】 配列番号：２ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００５８】
【表２】 配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００５９】
【表３】 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の特徴 存在位置：３３ 他の情報：３３位、Xaa=Tyr またはArg 存在位置：３６ 他の情報：３６位、Xaa=LysAまたはLeu 配列
【００６０】
【表４】 配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６１】
【表５】 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６２】
【表６】 配列の特徴： 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６３】
【表７】 配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６４】
【表８】 配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６５】
【表９】 配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６６】
【表１０】 配列番号：１１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６７】
【表１１】 配列番号：１２ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６８】
【表１２】 配列番号：１３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６９】
【表１３】 配列番号：１４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００７０】
【表１４】 配列番号：１５ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００７１】
【表１５】 配列番号：１６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００７２】
【表１６】 配列番号：１７ 配列の長さ：９３ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００７３】
【表１７】
【図１】図１は、NotI制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニングし、製造する好適方法を説明している。クローニ
ング・プロジェクトを開始したときには、NotI制限−修
飾系のクローニングを成功させる戦略または条件は公知
ではなかった。実際、メチラーゼ選択法ではNotIメチラ
ーゼ（及びエンドヌクレアーゼ）クローンは得られなか
った。図１及び実施例１に示す蛋白質の配列決定、ＤＮ
Ａ増幅及びクローニングの結果、また、それに続くクロ
ーンのＤＮＡ配列決定、マッピング及び特性化により、
これまで知られていなかったNotI制限−修飾系をクロー
ニングし、発現する直接経路が明らかにされる。
ニングし、製造する好適方法を説明している。クローニ
ング・プロジェクトを開始したときには、NotI制限−修
飾系のクローニングを成功させる戦略または条件は公知
ではなかった。実際、メチラーゼ選択法ではNotIメチラ
ーゼ（及びエンドヌクレアーゼ）クローンは得られなか
った。図１及び実施例１に示す蛋白質の配列決定、ＤＮ
Ａ増幅及びクローニングの結果、また、それに続くクロ
ーンのＤＮＡ配列決定、マッピング及び特性化により、
これまで知られていなかったNotI制限−修飾系をクロー
ニングし、発現する直接経路が明らかにされる。
【図２】図２は、BamHI Lambda Dash IIライブラリーに
NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅部分をハイブリッ
ド形成させて得たN otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5 k
b BamHI 断片の制限地図である。NotIエンドヌクレアー
ゼ及びメチラーゼ遺伝子の位置及び配向を示す。
NotIエンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅部分をハイブリッ
ド形成させて得たN otitidis-caviarum ＤＮＡの14.5 k
b BamHI 断片の制限地図である。NotIエンドヌクレアー
ゼ及びメチラーゼ遺伝子の位置及び配向を示す。
【図３】図３は過剰発現（overexpression）クローンpR
M189-1の制限地図である。
M189-1の制限地図である。
【図４】図４はNotI制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
５′末端のＤＮＡ配列である。
５′末端のＤＮＡ配列である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/54 //(Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:365） (72)発明者 ジヤツク・スタンレー・ベンナー アメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01936、ハミルトン、オーチヤード・ロー ド・24 (72)発明者 トビー・エリザベス・クラウス アメリカ合衆国、ニユー・ハンプシヤー・ 03801、ポーツマス、ステイト・ストリー ト・ナンバー・10・609
Claims (7)
- 【請求項１】 Nocardia otitidis-caviarumから得るこ
とができる、NotI制限エンドヌクレアーゼをコードする
単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 NotI制限エンドヌクレアーゼをコードす
るＤＮＡを挿入したベクターからなる組換えベクター。 - 【請求項３】 請求項１の単離ＤＮＡを含む組換えベク
ター。 - 【請求項４】 ベクターがプラスミドｐＲＭ１８９−１
からなる請求項３記載の組換えベクター。 - 【請求項５】 請求項２、３または４記載の組換えベク
ターで形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 NotI制限エンドヌクレアーゼの製造方法
であって、前記エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件
下で、請求項２、３または４記載のベクターで形質転換
した宿主細胞を培養することを包含する方法。 - 【請求項７】 単離ＤＮＡが配列番号１７からなる請求
項１記載の単離ＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/003,254 US5371006A (en) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | Isolated DNA encoding the NotI restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| US003254 | 1993-01-11 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004238241A Division JP2005046153A (ja) | 1993-01-11 | 2004-08-18 | ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06277070A true JPH06277070A (ja) | 1994-10-04 |
| JP4040112B2 JP4040112B2 (ja) | 2008-01-30 |
Family
ID=21704942
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01324594A Expired - Lifetime JP4040112B2 (ja) | 1993-01-11 | 1994-01-11 | ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 |
| JP2004238241A Pending JP2005046153A (ja) | 1993-01-11 | 2004-08-18 | ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004238241A Pending JP2005046153A (ja) | 1993-01-11 | 2004-08-18 | ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及びその製造に関する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5371006A (ja) |
| EP (1) | EP0607005B1 (ja) |
| JP (2) | JP4040112B2 (ja) |
| DE (2) | DE69402563T2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002306186A (ja) * | 2000-10-12 | 2002-10-22 | New England Biolabs Inc | ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングする方法及び製造する方法 |
| JP4498496B2 (ja) * | 1998-08-31 | 2010-07-07 | ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド | ＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび製造並びに組換えＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製のための方法 |
| JP2014027938A (ja) * | 2007-07-12 | 2014-02-13 | New England Biolabs Inc | 高精度制限エンドヌクレアーゼ |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993020096A1 (en) * | 1991-05-08 | 1993-10-14 | Stratagene | Oligonucleotide libraries useful for producing primers |
| US5543308A (en) * | 1994-10-18 | 1996-08-06 | New England Biolabs, Inc. | Isolated DNA encoding the FSEI restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| EP2568040A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-13 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identyfing new endonucleases with the same or varied specificity |
| KR100722255B1 (ko) * | 2005-08-19 | 2007-05-31 | 전광수 | 농축여과장치 |
| CN106967743A (zh) * | 2017-05-02 | 2017-07-21 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 一种重组NotI限制性内切酶在大肠杆菌中的生产方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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