DE60028685T2

DE60028685T2 - Verfahren zur Klonierung und Expression des Nhe I Restriktionsenzym in E. coli

Info

Publication number: DE60028685T2
Application number: DE60028685T
Authority: DE
Inventors: Shuang-yong Lexington XU; Jian-ing Wenham Xiao
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2020-10-27
Also published as: JP4719347B2; EP1096015B1; EP1096015A2; EP1721984A3; EP1721984A2; US6387681B1; JP2001197889A; DE60028685D1; EP1096015A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen rekombinanten DNA-Vektor, der eine rekombinante DNA umfasst, die die NheI Restriktionsendonuclease sowie die NheI Methyltransferase kodiert, und die Expression von NheI Restriktionsendonuclease von E. coli Zellen ermöglicht, die die rekombinante DNA enthalten.
NheI Restriktionsendonuclease ist im Stamm von Neisseria mucosa heidelbergensis (ATCC 25999) zu finden. Sie spaltet doppelsträngige DNA G/CTAGC, um einen 4-Basen-Überhang an 5' Enden zu erzeugen.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die in Bakterien und in einigen Viren natürlich vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienproteinen weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb, an einer Seite oder an beiden Seiten der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Unter den bisher untersuchten vielen hundert Bakterienspezies wurden mehr als zweihundertundelf Restriktionsendonuclasen mit einzigartigen Spezifitäten identifiziert (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27: 312–313 (1999)).
Restriktionsendonucleasen werden typischerweise nach den Bakterien benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit dem Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTT/AAA3', 5'PuG/GNCCPy3' und 5'CACNNN/GTG3'. Escherichia coli RY13 produziert dagegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'G/AATTC3' erkennt.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methyltransferasen (Methylasen). Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid in der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N4-Methyl-Cytosin oder N6-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert empfindlich auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease.
Anhand der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer genomischer DNA-Bibliotheken, d.h. Populationen von Klonen, die mit "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in tiefen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Es wurde eine große Anzahl von Restriktions-Modifikationssystemen des Typs II kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine Bakteriophage-Infektion als Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717–719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507 (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standzuhalten, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501–509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene 202: 83–88 (1997)).
Gemäß einem dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 6,383,770, WO9964632, veröffentlicht am 16. Dezember 1999, US-Patent Nr. 5,200,333 vom 6. April 1993 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403–6421 (1985)). Da R-M-Gene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
Es wurde ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens wird die E. coli SOS-Reaktion im Anschluss an DNA-Schäden genutzt, die durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht werden. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (TaqI, Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535 (1996)).
Sechs Restriktions-Modifikationssysteme, einschließlich der NspI und NspHI R-M-Systeme, wurden mit Varianten des in der US 5,200,333 offenbarten Systems kloniert (siehe Xu et al., Gen. Genet. 260: 226–231 (1998)).
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Genomische Neisseria mucosa heidelbergensis DNA wurde teilweise mit ApoI verdaut und genomische DNA-Fragmente im Bereich von 2–10 kb wurden durch ein leicht schmelzbares Agarosegel gereinigt. Die ApoI-partiellen DNA-Fragmente wurden mit EcoRI-verdautem und CIP-behandeltem pRRS-Vektor 1igiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente E. coli RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Transformanten wurden gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Zellen präpariert und mit BfaI in Kontakt gebracht. Die BfaI Erkennungssequenz C/TAG umfasst die internen 4 bp der NheI Erkennungssequenz G/CTAGC. Es wurde argumentiert, dass eine Klonierung und Expression von NheI Methylase Resistenz gegen BfaI Verdau verleihen kann. Die mit BfaI in Kontakt gebrachte DNA wurde in RR1 Zellen transformiert. Überlebende wurden im Hinblick auf Resistenz gegen NheI Verdau gescreent. Es wurden jedoch keine NheI-resistenten Klone nachgewiesen.
Zum Klonieren des NheI Methylasegens (nheIM) wurde ein NheI-Linker jeweils in SspI und HincII Orte in pRRS eingesetzt. Das modifizierte Plasmid mit zwei NheI Orten wurde pRRS10 genannt. Der Vektor pRRS10 wurde mit EcoRI verdaut, mit CIP behandelt und gelgereinigt. Die ApoI-partiellen DNA-Fragmente wurden mit pRRS10 mit kompatiblen Enden ligiert. Das Methylaseselektionsverfahren wurde zum Klonieren des nheIM Gens angewendet. Zehn resistente Klone wurden von der ApoI-partiellen Bibliothek isoliert. Ein resistenter Klon, Nr. 22, enthält ein Insert von etwa 2,8–3 kb. Das gesamte Insert wurde durch Primer-Walking sequenziert. Das nheIM Gen umfasst 882 bp und kodiert ein 293-aa Protein mit vorhergesagter Molekülmasse von 33.268 Dalton.
Es gibt ein Gen stromabwärts des nheIM Gens, das 43% Identität zu einem hyopthetischen 20 kDa Protein (O47152) von E. coli hat. Es gibt ein partielles offenes Leseraster (orf) stromaufwärts des nheIM Gens, das keine Homologie zu bekannten Genen in der GenBank aufweist. Da Restriktionsendonucleasen gewöhnlich nicht homolog zueinander sind (außer bei einigen Isoschizomeren), wurde der Schluss nahe gelegt, dass das stromaufwärtige orf höchstwahrscheinlich das nheIRs Gen ist. Es wurden Anstrengungen unternommen, die stromaufwärtige DNA-Kodierungssequenz durch inverse PCR-Amplifikation zu erhalten. Genomische N. mucosa heidelbergensis DNA wurde jeweils mit AluI, HaeII, HhaI, NheI, NlaIII, NspI, SphI, SspI, StyI, TaqI und TfiI verdaut. Die verdaute DNA wurde in einer niedrigen DNA-Konzentration selbstligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des nheIR Gens verwendet. Inverse PCR-Produkte wurden in AluI-, NlaIII-, NspI-, StyI- und TaqI-verdauter/selbstligierter DNA gefunden. Die inversen PCR-Produkte wurden gelgereinigt und sequenziert, woraus eine 339 bp umfassende neue DNA-Sequenz hervorging. Eine zweite Runde der inversen PCR wurde durchgeführt, um mehr von der stromaufwärtigen Sequenz zu amplifizieren. Inverse PCR-Produkte wurden in ApoI-, AseI-, RsaI-, SspI- und TaqI-verdauter/selbstligierter DNA gefunden. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von PCR-Primern direkt sequenziert. Es wurde eine zusätzliche 329 bp umfassende neue Sequenz gewonnen. Ein offenes Leseraster von 987 bp wurde stromaufwärts des nheIM Gens gefunden. Dieses orf wurde als nheIR Gen bezeichnet, das ein 328-aa Protein mit vorhergesagter Molekülmasse von 38.197 Dalton kodiert.
Zwei Primer wurden synthetisiert, um das nheIM Gen in PCR zu amplifizieren. Nach dem Verdau mit BamHI und SphI wurde das PCR-Produkt in pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert. Plasmide mit nheIM Geninserts wurden im Hinbick auf Resistenz gegen NheI Verdau gescreent. 11 von 18 Klonen waren gegen NheI Verdau resistent, was ein Hinweis auf eine effiziente M. NheI Expression in E. coli Zellen und eine NheI Ortsmodifikation auf dem Expressionsplasmid war. Die Wirtszelle ER2683 [pACYC-NheIM] wurde zur Expression des nheIR Gens verwendet.
Das nheIR Gen wurde in PCR amplifiziert, mit BamHI verdaut und in pUC191acI^q oder pAII17 ligiert. Das Expressionsniveau von pUC191acI^q-NheIR betrug etwa 10.000 Einheiten von NheI je Gramm nasser Zellen. Der native NheI produzierende Stamm N. mucosa heidelbergensis erzeugt etwa 100.000 Einheiten von NheI je Gramm nasser Zellen. Somit ist die NheI Ausbeute im ersten rekombinanten Stamm etwa 10 Mal geringer als beim nativen Stamm. Der zweite, pAII17-NheIR1 tragende Expressionsstamm erzeugt etwa 100.000 Einheiten NheI, was in etwa dem im nativen Stamm N. mucosa heidelbergensis erzeugten Niveau entspricht. Für eine weitere Verbesserung des NheI Expressionsniveaus wurde der interne NdeI Ort innerhalb des nheIR Gens durch die Einführung einer stillen Mutation mutagenisiert. Ein neuer NdeI Ort wurde am Anfang des Gens im Vorwärtsprimer eingebaut. Ein BamHI Ort wurde in den Rückwärtsprimer eingeführt. Das nheIR Gen wurde in PCR amplifiziert, mit NdeI und BamHI verdaut und in den T7 Expressionsvektor pAII17 kloniert. Die Fusion des ATG Startcodons des nheIR Gens mit dem NdeI Ort im Expressionsvektor erhöhte das NheI Expressionsniveau auf 10 Millionen Einheiten NheI je Gramm nasser E. coli Zellen. Das rekombinante NheI Expressionsniveau im E. coli Überproduktionsstamm ist 100 Mal höher als das der nativen Quelle.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Genorganisation des NheI Restriktions-Modifikationssystems. Die Gene nheIR und nheIM kodieren jeweils die NheI Endonuclease und NheI Methylase (M. NheI). O47152 kodiert ein hypothetisches 20 kDa Protein in E. coli.
2: Die DNA-Sequenz des NheI Methylasegens (SEQ ID Nr. 1) (nheIM) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3: Die DNA-Sequenz des NheI Endonucleasegens (SEQ ID Nr. 3) (nheIR) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4: Schematisches Diagramm einer PCR-Mutagenese zur Einführung einer stillen Mutation, um den internen NdeI Ort zu entfernen.
5: Restriktionsverdau mit E. coli Zellextrakt, der rekombinante NheI Restriktionsendonuclease enthält. AvaI-linearisierter pBR322 wurde als Substrat für den NheI Aktivitätsassay verwendet. Bahn 1–5, Reihenverdünnung von Klon Nr. 1 Zellextrakt; Bahn 6–10, Reihenverdünnung von Klon Nr. 9 Zellextrakt; Bahn 11, AvaI-linearisierter pBR322; Bahn 12, AvaI und NheI Doppelverdau von pBR322. pBR322 wurde in zwei Fragmente mit einer Größe von jeweils 1196 bp und 3165 bp gespalten. Bahn 1 und 6, 10fache Verdünnung von Zellextrakt; Bahn 2 und 7, 100fache Verdünnung; Bahn 3 und 8, 10³fache Verdünnung; Bahn 4 und 9, 10⁴fache Verdünnung; Bahn 5 und 10, 10⁵fache Verdünnung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren, mit dem das NheI Methlyasegen und das NheI Restriktionsendonucleasegen vorzugsweise kloniert werden, um einen rekominanten DNA-Vektor gemäß der Erfindung zu erzeugen, und in E. coli exprimiert werden, umfasst die folgenden Schritte:
1. Präparation von genomischer DNA und ApoI-partieller Verdau
Genomische DNA wird von Neisseria mucosa heidelbergensis (ATCC 25999) mit dem Standardverfahren präpariert. Die genomische DNA wurde partiell mit ApoI verdaut (ApoI Erkennungssequenz R/AATTY). Genomische DNA-Fragmente im Bereich von 2–10 kb werden durch ein leicht schmelzbares Agarosegel gereinigt.
2. Konstruktion einer ApoI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek und Inkontaktbringen der Bibliothek mit BfaI
Die ApoI-partiellen DNA-Fragmente werden mit EcoRI-verdautem und CIP-behandeltem pRRS Vektor ligiert. Die ligierte DNA wird in kompetente E. coli RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Transformanten werden gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA wird von den Zellen präpariert und mit BfaI in Kontakt gebracht. Die BfaI Erkennungssequenz C/TAG umfasst die internen 4 bp der NheI Erkennungssequenz G/CTAGC. Es wird argumentiert, dass eine Klonierung und Expression von NheI Methylase Resistenz gegen BfaI Verdau verleihen kann. Die mit BfaI in Kontakt gebrachte DNA wird in RR1-Zellen transformiert. Überlebende werden im Hinblick auf eine Resistenz gegen NheI Verdau gescreent. In der Bibliothek werden keine NheI-resistenten Klone gefunden.
3. Konstruktion eines neuen Klonierungsvektors mit zwei NheI Orten
Zum Erzeugen von NheI Orten im Klonierungsvektor pRRS [sic]. Zum Klonieren des NheI Methylasegens (nheIM) werden NheI Linker in die SspI und HincII Orte eingesetzt. Das resultierende Plasmid wird pRRS10 genannt. Das Plasmid pRRS10 wird mit EcoRI verdaut und mit CIP behandelt.
4. Konstruktion einer ApoI-partiellen Bibliothek unter Verwendung von pRRS10
Die gelgereinigten ApoI-partiellen DNA-Fragmente werden in EcoRI-verdautes und CIP-behandeltes pRRS10 ligiert. Die ligierte DNA wird in kompetente E. coli RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Transformanten werden gepoolt und in einer 1-Liter-Kultur amplifiziert. Eine Plasmid-DNA-Bibliothek wird von den Zellen präpariert und mit NheI in Kontakt gebracht. Die in Kontakt gebrachte DNA wird zur Transformation in RR1 Zellen verwendet. Transformanten werden über Nacht kultiviert und Plasmid-DNA wird präpariert. Die Plasmid-DNA wird mit NheI verdaut, um jegliche Resistenz zu überprüfen. Man findet zehn Isolate, die gegen NheI Verdau resistent sind. Resistenz gegen NheI Verdau könnte die Folge eines Verlustes von NheI Orten im Vektor oder einer Modifikation von NheI Orten durch NheI Methylase sein.
5. DNA-Sequenzierung resistenter Klone
Ein resistenter Klon, Nr. 22, enthält ein Insert von etwa 2,8–3 kb. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer von pUC19 werden zum Sequenzieren des Inserts verwendet. Es gibt einen in den vorherigen HincII Ort eingesetzten NheI Ort, was ein Hinweis darauf ist, dass die Resistenz durch Methylasemodifikation verursacht wird und nicht im Verlust des NheI Ortes begründet ist. N4-Cytosin-Methylase-Motive werden ebenfalls in der von der DNA-Sequenz vorhergesagten Aminosäuresequenz gefunden. Das gesamte Insert wird durch Primer-Walking sequenziert. Das nheIM Gen umfasst 882 bp und kodiert ein 293-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 33.268 Dalton.
6. Klonierung des NheI Restriktionsendonucleasegens (nheIR)
Es gibt ein Gen stromabwärts des nheIM Gens, das 43% Identität zu einem hypothetischen 20 kDa Protein (O47152) von E. coli hat. Stromaufwärts des nheIM Gens gibt es ein offenes Leseraster (orf), das keinerlei Homologie zu bekannten Genen in der GenBank aufweist. Da Restriktionsendonucleasen gewöhnlich nicht homolog zueinander sind (außer bei einigen Isoschizomeren), wird der Schluss nahe gelegt, dass das stromaufwärtige orf höchstwahrscheinlich das nheIR Gen ist. Es werden Anstrengungen unternommen, die stromaufwärtige DNA-Kodierungssequenz durch inverse PCR-Amplifikation zu erhalten. Genomische N. mucosa heidelbergensis DNA wird jeweils mit AluI, HaeII, HhaI, NheI, NlaIII, NspI, SphI, SspI, StyI, TaqI und TfiI verdaut. Die verdaute DNA wird in einer niedrigen DNA-Konzentration ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des nheIR Gens verwendet. Inverse PCR-Produkte werden in AluI-, NlaIII-, NspI-, StyI- und TaqI-verdauter/selbstligierter DNA gefunden. Die inversen PCR-Produkte werden gelgereinigt und sequenziert, woraus eine 339 bp umfassende neue DNA-Sequenz hervorgeht. Eine zweite Runde der inversen PCR wird durchgeführt, um mehr von der stromaufwärtigen Sequenz zu amplifizieren. Inverse PCR-Produkte werden in ApoI-, AseI-, RsaI-, SspI- und TaqI-verdauter/selbstligierter DNA gefunden. Die PCR-Produkte werden unter Verwendung von PCR-Primern direkt sequenziert. Es wird eine zusätzliche 329 bp umfassende neue Sequenz erhalten. Ein offenes Leseraster von 987 bp wird stromaufwärts des nheIM Gens gefunden. Dieses orf wird als nheIR Gen bezeichnet, das ein 328-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 38.197 Dalton kodiert.
7. Expression des nheIM Gens in E. coli
Zwei Primer werden synthetisiert, um das nheIM Gen in PCR zu amplifizieren. Nach einem Verdau mit BamHI und SphI wird das PCR-Produkt in pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wird in kompetente ER2683 Zellen transformiert. Plasmide mit nheIM Geninserts werden im Hinblick auf Resistenz gegen NheI Verdau getestet. Elf Klone von 18 sind gegen NheI Verdau resistent, was ein Hinweis auf eine effiziente M. NheI Expression in E. coli Zellen und eine NheI Ortsmodifikation auf dem Expressionsplasmid ist. Die Wirtszelle ER2683 [pACYC-NheIM] wird zur Expression des nheIR Gens verwendet.
8. Expression des nheIR Gens in E. coli unter Verwendung des Plasmids hoher Kopiezahl pUC191acI^q
Das nheIR Gen wird in PCR amplifiziert, mit BamHI verdaut und in pUC191acI^q ligiert (BamHI-verdaut und CIP-behandelt). Nach der Transformation der ligierten DNA in ER2683 [pACYC-NheIM] werden die Transformanten im Hinblick auf das Endonucleasegen-Insert gescreent. Vier von 36 Klonen enthalten das nheIR Geninsert. Alle vier Klone (Nr. 2, Nr. 11, Nr. 12 und Nr. 30) werden mit IPTG induziert und Zellextrakte werden präpariert und hinsichtlich NheI Endonucleaseaktivität überprüft. Klon Nr. 12 erzeugt etwa 10.000 Einheiten NheI je Gramm nasser Zellen. Der native NheI produzierende Stamm N. mucosa heidelbergensis erzeugt etwa 100.000 Einheiten NheI je Gramm nasser Zellen. Somit ist die NheI Ausbeute im rekombinanten Stamm etwa 10 Mal geringer als beim nativen Stamm.
9. Expression des nheIR Gens im T7 Expressionsvektor pAII17
Der T7 Expressionsvektor pAII17 verwendet NdeI und BamHI Orte zum Einfügen des Targetgens in den Vektor. Es gibt eine Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts des NdeI Ortes. Das Startcodon (ATG) des zu exprimierenden Gens ist mit dem NdeI Ort fusioniert (CATATG). Es gibt jedoch einen NdeI Ort innerhalb des nheIR Gens, so dass der NdeI Ort nicht zum Klonieren in pAII17 verwendet werden kann. Zur Lösung dieses Problems werden BamHI Orte in den Vorwärts- und Rückwärtsprimern eingebaut. Außerdem wird eine Ribosomenbindungsstelle in den Vorwärtsprimer einbezogen. Das nheIR Gen wird in PCR amplifiziert, mit BamHI verdaut und mit BamHI-verdautem und CIP-behandeltem pAII17 Vektor ligiert. Die ligierte DNA wird in ER2683 [pACYC-NheIM] transformiert. Drei von 36 Klonen enthalten das nheIR Geninsert. ER2683 Zellen [pACYC-NheIM, pAII17-NheIR1] werden mit IPTG induziert und Zellextrakte werden präpariert und hinsichtlich NheI Aktivität überprüft. Der T7 Expressionsstamm erzeugt etwa 100.000 Einheiten NheI, was in etwa dem Niveau entspricht, das in dem nativen Stamm N. mucosa heidelbergensis erzeugt wird. Zur Verbesserung der NheI Ausbeute ist weitere Überexpressionsarbeit nötig.
10. Einführung einer stillen Mutation in das nheIR Gen, um den NdeI Ort zu beseitigen, und Klonierung des nheIR Gens in pAII17 durch NdeI und BamHI Fragmentinsertion
Zum Entfernen des NdeI Ortes innerhalb des nheIR Gens wird eine stille Mutation in die PCR-Primer eingeführt. Eine PCR-Mutagenese erfolgt in den PCR-Reaktionen 1, 2 und 3, wie in 4 graphisch dargestellt ist. Das PCR-Produkt in Reaktion 3 wird mit NdeI und BamHI verdaut. Der NdeI Verdau zerstört jegliche überlebende Wildtypsequenzen mit dem internen NdeI Ort und reichert die PCR-Produkte mit der stillen Mutation an. Das NdeI-BamHI Fragment, das das nheIR Gen enthält, wird mit dem T7 Expressionsvektor pAII17 mit kompatiblen Enden ligiert und in den zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pACYC-NheIM] transformiert. Transformanten werden im Hinblick auf das nheIR Geninsert gescreent. Der E. coli Stamm ER2566 [pACYC-NheIM, pAII17-NheIR2] wird mit IPTG 3 Stunden lang bei 37°C induziert. Zellextrakte werden präpariert und hinsichtlich NheI Aktivität überprüft. Er produziert 10⁷ Einheiten an rekombinantem NheI je Gramm nasser Zellen, was etwa 100 Mal höher ist als bei der nativen Quelle. Der Assay hinsichtlich rekombinanter NheI Aktivität in zwei Zellextrakten ist in 5 dargestellt.
BEISPIEL 1
KLONIERUNG DES NHEI RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEMS IN E. COLI
1. Herstellung genomischer DNA
Genomische DNA wurde von Neisseria mucosa heideibergensis (ATCC 25999) mit dem Standardverfahren mit den folgenden Schritten präpariert: 1. Zellyse mit Lysozym, Triton X-100 und SDS; 2. Phenol-CHCl₃ und CHCl₃ Extraktionen; 3. Ethanolpräzipitation; 4. Dialyse in TE-Puffer (Puffer 4 Mal wechseln); 5. RNase-A-Behandlung; 6. Ethanolpräzipitation und Resuspension genomischer DNA in TE-Puffer.
2. Konstruktion einer ApoI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines pRRS-Vektors
Fünf μg genomische N. mucosa heidelbergensis DNA wurden mit 1 und 0,5 Einheit(en) ApoI bei 50°C 30 Minuten lang verdaut. Die mit ApoI partiell verdaute genomische DNA im Bereich von 2–10 kb wurde gelgereinigt. Die mit ApoI partiell verdaute genomische DNA wurde in den EcoRI-zerschnittenen und CIP-behandelten Vektor pRRS bei 16°C über Nacht ligiert. Nach der Ligationsreaktion wurde die Ligase 30 Minuten lang bei 65°C inaktiviert. Die ligierte DNA wurde durch Tropfendialyse auf einer Membran auf 2 Liter sdH₂O dialysiert. Die DNA wurde in kompetente RR1 (TonA^–, DnaseI^–) Zellen durch Elektroporation transferiert. Transformanten wurden auf LB-Agar plus Amp (100 μg/ml) plattiert. Etwa 10.000 Kolonien wurden in der Elektroporation erhalten. Alle Transformanten wurden gepoolt und in 1 Liter LB-Nährlösung plus Amp inokuliert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen durch eine Qiagen Mega-Prep-Säule präpariert.
3. Aussetzen der ApoI-partiellen Bibliothek-DNA einem BfaI Verdau und Screenen von NheI-resistenten Klonen
Die BfaI Erkennungssequenz C/TAG umfasst die internen 4 bp der NheI Erkennungssequenz G/CTAGC. Man rechnete damit, dass eine Klonierung und Expression von NheI Methylase Resistenz gegen BfaI Verdau verleihen kann. „Non-cognate" Methylasemodifikationen können manchmal überlappende Restriktionsorte blockieren. 1–5 μg der Bibliothek-DNA wurden über Nacht mit BfaI verdaut. Die mit BfaI in Kontakt gebrachte DNA wurde zum Transformieren kompetenter RR1 Zellen verwendet. Ap^R Überlebende wurden im Hinblick auf NheI Verdau gescreent. Nach Screening und Verdau von 8 DNA-Proben wurden keine NheI-resistenten Klone gefunden.
4. Konstruktion eines neuen Klonierungsvektors mit zwei NheI Orten
Der Plasmidvektor pRRS enthält keine NheI Orte. Zum Klonieren des NheI Methylasegens mit dem Methylaseselektionsverfahren wurden zwei NheI-Linker in SspI und HincII Orte in pRRS eingesetzt. Das resultierende Plasmid wurde pRRS10 genannt. Das Plasmid pRRS10 wurde mit Qiagen Spin-Säulen präpariert, mit EcoRI verdaut und mit CIP behandelt. Die EcoRI-verdaute DNA wurde durch ein leicht schmelzbares Agarosegel gereinigt. Nach der β-Agarase-Behandlung wurde die DNA durch Ethanol und Salz präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer resuspendiert.
5. Konstruktion einer ApoI-partiellen DNA-Bibliothek unter Verwendung von pRRS10
Die gelgereinigten ApoI-partiellen DNA-Fragmente wurden in EcoRI-verdauten und CIP-behandelten pRRS10 ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente E. coli RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Mehr als 10.000 Ap^R Transformanten wurden gepoolt und in 1-Liter-Übernachtzellkulturen amplifiziert. Eine Plasmid-DNR-Primärbibliothek wurde von Zellen präpariert und 3 Stunden lang bei 37°C mit NheI in Kontakt gebracht. Die in Kontakt gebrachte DNA wurde zur Transformation in RR1 Zellen verwendet. Es wurden etwa 110 Ap^R Überlebende gefunden. Die Transformanten wurden individuell über Nacht kultiviert und Plasmid-DNA wurde durch Qiagen Spin-Säulen präpariert. Die Plasmid-DNA wurde mit NheI verdaut, um die Resistenz zu prüfen. Zehn von 36 gescreenten Plasmidisolaten waren gegen NheI Verdau resistent. Resistenz gegen NheI Verdau könnte die Folge eines Verlustes von NheI Orten im Vektor pRRS10 oder einer Modifikation von NheI Orten durch NheI Methylase sein.
6. DNA-Sequenzierung der resistenten Klone
Eine Restriktionskartierung zeigte, dass ein resistenter Klon, Nr. 22, ein Insert von etwa 2,8–3 kb enthielt. Die universellen Vorwärts- und Rückwärtsprimer von pUC19 wurden zum Sequenzieren des Inserts verwendet. Es wurde ein NheI Ort gefunden, der in den vorherigen HincII Ort an Mehrfachklonierungsstellen eingefügt war, was ein Hinweis darauf war, dass die Resistenz durch Methylasemodifikation und nicht durch den Verlust des NheI Ortes verursacht wurde. N4-Methylase-Motive wurden auch in der von der DNA-Sequenz vorhergesagten Aminosäuresequenz gefunden. Drei ApoI-Fragmente wurden vom resistenten Klon Nr. 22 gelgereinigt und in pUC19 subkloniert. Das gesamte Insert wurde durch Primer-Walking und Subklonierung sequenziert. Das nheIM Gen umfasst 882 bp und kodiert ein 293-aa Protein mit vorhergesagter Molekülmasse von 33.268 Dalton.
7. Klonierung des NheI Restriktionsendonucleasegens (nheIR)
Es gibt ein Gen stromabwärts des nheIM Gens, das 43% Identität zu einem hypothetischen 20 kDa Protein (O47152) von E. coli hat. Stromaufwärts des nheIM Gens gibt es ein partielles offenes Leseraster (orf), das keinerlei Homologie zu bekannten Genen in der GenBank aufweist. Da Restriktionsendonucleasen gewöhnlich nicht homolog zueinander sind (außer bei einigen Isoschizomeren), wurde der Schluss nahe gelegt, dass das stromaufwärtige orf höchstwahrscheinlich das nheIR Gen ist. Es wurden Anstrengungen unternommen, die stromaufwärtige DNA- Kodierungssequenz durch inverse PCR-Amplifikation zu erhalten. Genomische N. mucosa heidelbergensis DNA wurde jeweils mit AluI, HaeII, HhaI, NheI, NlaIII, NspI, SphI, SspI, StyI, TaqI und TfiI verdaut. Die verdaute DNA wurde in einer niedrigen DNA-Konzentration bei 16°C über Nacht selbstligiert. Nach der Ligation wurde die Ligase durch 30-minütiges Erhitzen bei 65°C inaktiviert und die DNA wurde durch Ethanol präzipitiert. Die zirkuläre DNA wurde dann zur inversen PCR-Amplifikation des nheIR Gens verwendet. Zwei Primer wurden mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
Eine inverse PCR wurde mit den Primern 214-141, 214-142, selbstligierter DNA-Matrize, dNTP und Taq DNA-Polymerase plus Vent DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1) durchgeführt. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C für 1 min, 55°C für 1 min und 72°C für 2 min, 30–35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden in AluI-, NlaIII-, NspI-, StyI- und TaqI-verdauten/selbstligierten DNA-Proben gefunden. Die inversen PCR-Produkte wurden gelgereinigt und mit den Primern 214-141 und 214-142 sequenziert. Nach der ersten Runde der inversen PCR wurde eine neue Sequenz von 339 bp erhalten. Eine zweite Runde der inversen PCR wurde zum Amplifizieren eines weiteren Teils der stromaufwärtigen Sequenz durchgeführt. Genomische N. mucosa heidelbergensis DNA wurde jeweils mit ApoI, AseI, BssSI, BstUI, HaeIII, HinfI, MseI, NdeI, RsaI, SphI, SspI, TaqI, TfiI, TspRI und XbaI verdaut. Die folgenden Primer wurden synthetisiert:
Eine inverse PCR wurde mit den Primern 216-100, 216-101, selbstligierter DNA-Matrize, dNTP und Taq DNA-Polymerase plus Vent DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1) durchgeführt. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C für 1 min, 55°C für 1 min und 72°C für 2 min, 35 Zyklen. Die inversen PCR-Produkte wurden in ApoI-, AseI-, RsaI-, SspI- und TaqI-verdauter/selbstligierter DNA gefunden. Die PCR-Produkte wurden durch leicht schmelzbare Agarosegele gelgereinigt und mit den Primern 216-100 und 216-101 direkt sequenziert. Es wurde eine zusätzliche 329 bp umfassende neue Sequenz gewonnen. Ein offenes Leseraster von 987 bp wurde stromaufwärts des nheIM Gens gefunden. Dieses orf wird als nheIR Gen bezeichnet, das ein 328-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 38.197 Dalton kodiert.
8. Expression des nheIM Gens in E. coli
Zwei Primer wurden synthetisiert, um das nheIM Gen in PCR zu amplifizieren. BamHI und SphI Orte wurden in die Vorwärts- und Rückwärtsprimer konstruiert. Die Primersequenzen sind:
Das nheIM Gen wurde in PCR unter Verwendung von 217-138 und 217-123, dNTP und Taq DNA-Polymerase plus Vent DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1) amplifiziert. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C für 1 min, 60°C für 1 min und 72°C für 1,5 min, 25 Zyklen.
Nach dem Verdau mit BamHI und SphI wurde das PCR-Produkt in pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente ER2683 Zellen transformiert. Plasmide mit nheIM Geninserts wurden im Hinblick auf Resistenz gegen NheI Verdau gescreent. Elf von 18 Klonen waren gegen NheI Verdau resistent, was ein Hinweis auf eine effiziente M. NheI Expression in E. coli Zellen und NheI Ortsmodifikation auf dem Expressionsplasmid war. Die Wirtszelle ER2683 [pACYC-NheIM] wurde zur Expression des nheIR Gens verwendet (siehe Abschnitt 9).
9. Expression des nheIR Gens in E. coli unter Verwendung des Plasmids hoher Kopiezahl, pUC191acI^q
Ein EcoRI-Fragment, das das lacI^q Gen enthielt, wurde gelgereinigt und in den EcoRI-Ort von pUC19 ligiert, um das Expressionsplasmid pUC191acI^q zu erzeugen. Das lacI^q Gen kodiert den Lac-Repressor, der die NheI Expression vom lac-Promotor regulieren kann.
Zwei Primer wurden mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
Das nheIR Gen wurde in PCR mit den 217-139 und 217-124 Primern, dNTP und Taq DNA-Polymerase plus Vent DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1) amplifiziert. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C für 1 min, 60°C für 1 min und 72°C für 1,5 min, 20 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden mit BamHI verdaut und durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt. Die PCR-DNA wurde in pUC191acI^q (BamHI-verdaut und CIP-behandelt) ligiert. Nach der Transformation der ligierten DNA in ER2683 [pACYC-NheIM] wurden die Transformatten im Hinblick auf das Endonucleasegeninsert gescreent. Vier von 36 Klonen enthielten das nheIR Geninsert. Diese vier Klone (Nr. 2, Nr. 11, Nr. 12 und Nr. 30) wurden mit IPTG induziert und Zellextrakte wurden präpariert und hinsichtlich NheI Endonucleaseaktivität gesprüft. Klon Nr. 12 produzierte etwa 10.000 Einheiten NheI je Gramm nasser Zellen. Die restlichen drei Klone produzierten weniger NheI Aktivität. Der native NheI produzierende Stamm N. mucosa heidelbergensis (ATCC 25999) erzeugt etwa 100.000 Einheiten NheI je Gramm nasser Zellen. Somit ist die NheI Ausbeute im ersten rekombinanten Stamm etwa 10 Mal niedriger als die des nativen Stammes. Um das NheI Expressionsniveau zu erhöhen, wurde das nheIR Gen in einen T7 Expressionsvektor kloniert (siehe Abschnitt 10).
10. Expression des nheIR Gens im T7 Expressionsvektor pAII17
Der T7 Expressionsvektor pAII17 verwendet NdeI und BamHI Orte zum Einfügen des Targetgens in den Vektor. Es gibt eine Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts des NdeI Ortes. Das Startcodon (ATG) des zu exprimierenden Gens wird mit dem NdeI Ort (CAT ATG) fusioniert. Es gibt einen NdeI Ort innerhalb des nheIR Gens, so dass der NdeI Verdau das Endonucleasegen zerstören würde. Folglich kann der NdeI Ort zur Klonierung in pAII17 nicht verwendet werden. Zur Lösung dieses Problems wurden BamBI Orte in die Vorwärts- und Rückwärtsprimer eingebaut. Außerdem wurde eine Ribosomenbindungsstelle GGAGGT in den Vorwärtsprimer einbezogen (siehe Primer 217-139). Das nheIR Gen wurde in PCR amplifiziert, mit BamHI verdaut und mit BamHI-verdautem und CIP-behandeltem pAII17 Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente ER2683 Zellen [pACYC-NheIM] transformiert. Drei (Nr. 9, Nr. 19 und Nr. 30) von 36 Klonen enthielten das nheIR Geninsert. ER2683 Zellen [pACYC-NheIM, pAII17-NheIR1] wurden mit IPTG induziert und Zellextrakte wurden präpariert, um die NheI Aktivität zu prüfen. Die T7 Expressionsstämme Nr. 9 und Nr. 19 erzeugten etwa 100.000 Einheiten NheI, was etwa dem Niveau entspricht, das in dem nativen Stamm N. mucosa heidelbergensis erzeugt wird. Zur Verbesserung der NheI Ausbeute war weitere Überexpressionsarbeit notwendig.
11. Einführung einer stillen Mutation in das nheIR Gen zur Beseitigung des NdeI Ortes und Klonierung des nheIR Gens in pAII17 durch NdeI und BamHI Fragmentinsertion
Zum Entfernen des NdeI Ortes innerhalb des nheIR Gens wurde eine stille Mutation in die PCR-Primer eingeführt. Eine PCR-Mutagenese wurde wie in 4 graphisch dargestellt durchgeführt.
Die folgenden Primer wurden in drei PCR-Reaktionen verwendet, um den internen NdeI Ort zu entfernen.
PCR-Reaktion 1

Vorwärtsprimer: 5'tatgaggttcatatgagttcttatcatgatgatttaaat 3' (225-80) (SEQ ID Nr. 13) (NdeI Ort = cat atg, ein neuer NdeI Ort wurde am Anfang des Gens eingebaut).
Mutagener Rückwärtsprimer: 5'ttcagctacaacatcgtatgttctatt 3' (225-82) (SEQ ID Nr. 14) (Die interne Wildtypsequenz catatg wird in cgtatg geändert, wodurch der interne NdeI Ort entfernt wird).

PCR-Reaktion 2

Mutagener Vorwärtsprimer: 5'aatagaacatacgatgttgtagctgaa 3' (225-81) (SEQ ID Nr. 15) (die interne Sequenz catatg wird in catatg geändert, wodurch der interne NdeI Ort entfernt wird).
Rückwärtsprimer: 5' tccggatcctcataataaaatcctttctaccaacct 3' (217-124) (SEQ ID Nr. 16) (gga tcc = BamHI Ort).

PCR-Reaktion 3

Matrizen = PCR-Produkte aus den Reaktionen 1 und 2
Vorwärtsprimer = 225-80
Rückwärtsprimer = 217-124

Das PCR-Produkt in Reaktion 3 wurde mit NdeI und BamHI verdaut. Der NdeI Verdau zerstörte alle überlebenden Wildtypsequenzen mit dem internen NdeI Ort und reicherte die PCR-Produkte mit der stillen Mutation an. Das NdeI-BamHI Fragment, das das nheIR Gen enthielt, wurde mit dem T7 Expressionsvektor pAII17 mit kompatiblen Enden ligiert und in den zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pACYC-NheIM] transformiert. Transformanten wurden im Hinblick auf das nheIR Geninsert gescreent. Der E. coli Stamm ER2566 [pACYC- NheIM, pAII17-NheIR2] wurde mit IPTG 3 Stunden lang bei 37°C induziert. Zellextrakte von zwei Klonen, Nr. 1 und Nr. 9, wurden präpariert und hinsichtlich NheI Aktivität geprüft. Er erzeugt 10⁷ Einheiten an rekombinantem NheI je Gramm nasser Zellen, was etwa 100 Mal höher ist als bei der nativen Quelle. Der Assay hinsichtlich rekombinanter NheI Aktivität in Zellextrakten ist in 5 dargestellt. Das gesamte nheIR Gen wurde unter Verwendung von drei Primern sequenziert und die stille C zu T Mutation innerhalb des Gens wurde durch Sequenzierung bestätigt. Es wurden keine anderen PCR-Mutationen nachgewiesen.
Der E. coli Stamm ER2566 [pACYC-NheIM, pAII17-NheIR2] wurde am 28. Oktober 1999 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der ATCC Patentakzessions-Nr. PTA-887 hinterlegt.

Claims

Rekombinanter DNA-Vektor, der ein DNA-Segment beinhaltet, das die NheI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei der Vektor von ATCC Nr. PTA-887 erhältlich ist.
Wirtszelle, die durch den Vektor aus Anspruch 1, transformiert ist und ferner durch einen Vektor transformiert ist, der die von ATCC Nr. PTA-887 erhältliche NheI Methylase kodiert.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten NheI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer mit dem Vektor aus Anspruch 1 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease beinhaltet.