DE60213688T2

DE60213688T2 - Verfahren zur Klonierung und Exprimierung von BstYI Restriktionsendonuklease und BstYI Methylase in E. coli und zur Purifizierung von BstYI und M.BstYI Enzymen

Info

Publication number: DE60213688T2
Application number: DE60213688T
Authority: DE
Inventors: Shuang-yong Lexington XU; Marion Beverly Sibley; James Danvers Samuelson; Geoffrey Boxford Wilson; John Amesbury Pelletier
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2022-01-18
Also published as: EP1225219B1; EP1225219A1; DE60213688D1; JP2002320493A; US6403354B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BstYI Restriktionsendonuclease (Endonuclease) sowie BstYI Methyltransferase (Methylase) kodiert, die Expression von BstYI Restriktionsendonuclease und Methylase in E. coli Zellen, die die rekombinante DNA enthalten.
BstYI Endonuclease ist im Stamm von Bacillus stearothermophilus Y406 (New England Biolabs' Stammsammlung Nr. 434) zu finden. Sie erkennt die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'Pu/GATCPy3' und spaltet zwischen Pu und G, um einen 4-Basen-Überhang am 5' Ende zu erzeugen (Pu = A oder G; Py = T oder C;/gibt die Spaltung einer Phosphodiesterbindung an). BstYI Methylase (M.BstYI) ist ebenfalls im Stamm von Bacillus stearothermophilus Y406 zu finden. Sie erkennt die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'PuGATCPy3' und modifiziert das N4-Cytosin durch die Zugabe einer Methylgruppe, damit es in der DNA-Sequenz N4-Methylcytosin wird. Der N4mC-modifizierte BstYI Ort ist gegen BstYI Restriktionsverdau resistent.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien und in einigen Viren vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterien-/Virenproteinen weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen erkennen und binden sich an spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang den DNA-Molekülen. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb (z.B. BamHI), an einer Seite (z.B. SapI) oder an beiden Seiten (z.B. TspRI) der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertelf Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den vielen hundert Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27: 312–313 (1999)).
Restriktionsendonucleasen werden gewöhnlich nach den Bakterien benannt, bei denen sie entdeckt werden. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit den Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTT/AAA3', 5'PuG/GNCCPy3' und 5'CACNNN/GTG3'. Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'G/AATTC3' erkennt.
Eine zweite Komponente von bakteriellen/viralen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methylasen. Diese Enzyme koexistieren mit Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N4-Methyl-Cytosin oder N6-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert empfindlich auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease. Während und nach der DNA-Replikation ist gewöhnlich auch die halbmethylierte DNA (auf einem Strang methylierte DNA) gegen den kognaten Restriktionsverdau resistent.
Mit dem Fortschritt der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines effizienten Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb genomischer DNA-Bibliotheken, d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von nur 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschten Klone mit Nicht-Methylase-Inserts zerstört werden, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Es wurde eine große Zahl von Restriktions-Modifikationssystemen des Typs II kloniert. Das erste Klonierungsverfahren nutzte eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)). Da die Expression von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standzuhalten, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand verleihen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsvektoren ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene 202:83-88 (1997)).
Gemäß einem dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403-6421 (1985)). Da Restriktionsmodifikationsgene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf Gene 21: 111-119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von thermostabilen Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399-2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens werden die E. coli SOS-Reaktionssignale im Anschluss an einen DNA-Schaden genutzt, der durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht wird. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (TagI, Tth111I, BsoBI, TfNuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535 (1996)). Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass positive blaue Klone, die ein Restriktionsendonucleasegen enthalten, infolge des Fehlens des zugehörigen Methylasegens manchmal schwierig zu kultivieren sind.
Es gibt drei Hauptgruppen von DNA-Methyltransferasen auf der Basis der Position und der modifizierten Base (C5 Cytosinmethylasen, N4 Cytosinmethylasen und N6 Adeninmethylasen). N4 Cytosin und N6 Adeninmethylasen sind Aminomethyltransferasen (Malone et al. J. Mol. Biol. 253-618-632 (1995)). Wird ein Restriktionsort auf der DNA durch die Methylase modifiziert (methyliert), dann ist er gegen einen Verdau durch die zugehörige Restriktionsendonuclease resistent. Manchmal kann eine Methylierung durch eine nicht zugehörige Methylase dem DNA Ort ebenfalls Resistenz gegen einen Restriktionsverdau verleihen. Eine Dcm Methylasemodifikation von 5'CCWGG3' (W = A oder T) kann die DNA auch resistent gegen einen PspGI Restriktionsverdau machen. Ein weiteres Beispiel ist, dass CpM Methylase das CG Dinucleotid modifizieren und den NotI Ort (5'GCGGCCGC3') gegen NotI Verdau widerstandsfähig machen kann (New England Biolabs' Katalog, 2000-01, Seite 220). Folglich können Methylasen als ein Werkzeug zum Modifizieren bestimmter DNA-Sequenzen verwendet werden, damit sie von Restriktionsenzymen nicht gespalten werden können.
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es ein starkes kommerzielles Interesse daran, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren der BstYI Restriktionsendonuclease von Bacillus stearothermophilus in E. coli durch Methylaseselektion und inverse PCR-Amplifikation der angrenzenden DNA. Ein Methylasegen mit hoher Homologie zu Amino-Methyltransferasen (N4-Cytosinmethylasen) wurde in einer DNA-Bibliothek nach einer Methylaseselektion gefunden. Dieses Gen wurde BstYI Methylasegen (bstYIM) genannt.
Zum Klonieren des BstYI Endonucleasegens in einem großen DNA-Fragment wurden HindIII-partielle genomische DNA-Fragmentbibliotheken mittels der Vektoren pBR322 und pUC19 konstruiert. Es wurden weitere methylasepositive Klone erhalten. Allerdings wurde in allen M.BstYI-positiven Klonen keine Endonucleaseaktivität nachgewiesen.
Zur Gewährleistung, dass ausreichend DNA-Kodierungskapazität auf beiden Seiten des bstYIM Gens vorhanden war, wurde eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt, um eine Restriktionskarte nahe dem bstYIM Gen zu erzeugen. Die Restriktionskartierung zeigte, dass ClaI, NsiI, PvuII und SphI Fragmente DNA aufweisen, die groß genug wären, um das bstYIR Gen auf beiden Seiten zu kodieren. Wieder wurden methylasepositive Klone von den neuen Bibliotheken gewonnen, es wurde jedoch keine Endonucleaseaktivität in Zellextrakt- oder gereinigten Zellextraktfraktionen nachgewiesen. Mehr als 14 kb DNA wurden von einer Seite des bstYIM gewonnen. Es war äußerst schwierig, DNA auf der anderen Seite des bstYIM zu gewinnen. Das DNA-Fragment, dessen simultane Klonierung mit dem bstYIM Gen schwierig war, enthielt möglicherweise das bstYIR Gen.
Zum Screenen nach einem DNA-Schaden infolge einer Expression der BstYI Endonuclease oder methylierungsabhängigen Restriktionssysteme wurde Primärplasmidbibliothek-DNA zum Transformieren in einen dinD::lacZ Fusionsstamm AP1-200 verwendet und auf X-Gal-Platten plattiert. Es wurde eine Reihe blauer Kolonien gefunden, von denen jedoch keine das BstYI Endonucleasegen enthielt.
Da sowohl der Methylaseselektions- als auch der SOS-Induktionsassay keinen BstYI Endonucleaseklon hervorbrachte, wurde eine inverse PCR durchgeführt, um die angrenzende stromabwärtige DNA-Sequenz zu amplifizieren. Ein offenes Leseraster wurde neben dem bstYIM Gen gefunden. Dieses ORF wurde bstYIR genannt und in einem T7 Expressionsvektor pET21b exprimiert. Dieser Klon produzierte mehr als 10⁶ Einheiten BstYI je Gramm Zellen. Dieser Klon war jedoch infolge eines hohen Expressionsniveaus unter nicht induzierten Bedingungen instabil. Zum Konstruieren eines stabileren Klons wurde ein interner NdeI Ort mutagenisiert und das bstYIR Gen (ein NdeI-XhoI Fragment) dann in einen T7 Expressionsvektor mit 4 Kopien eines Transkriptionsterminators stromaufwärts des T7 Promotors eingesetzt.
Zum Überexprimieren des bstYIM Gens wurde das Gen durch PCR amplifiziert und in den Expressionsvektor TYB2 kloniert. M.BstYI wurde als eine Fusion mit der Chitin-Bindedomäne und Intein exprimiert. Der Wirt ER2566 (ein E. coli B-Stamm) erwies sich als intolerant gegenüber einer Überexpression von M.BstYI und erzielte eine geringe Ausbeute des M.BstYI Proteins. Das Plasmid TYB2-BstYIM wurde später in den E. coli K Stamm ER1821 (λDE3) transferiert, ein Stamm, dem es an methylierungsabhängigen Restriktionssystemen (McrBC^–, McrA^–, Mrr^–) mangelt. Das M.BstYI Protein wurde durch Chromatographie durch Affinitäts-, Anionenaustausch- und Kationenaustauschsäulen gereinigt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Genorganisation des BstYI Restriktions-Modifikationssystems. bstYIR, BstYI Restriktionsendonucleasegen; bstYIM, BstYI Methylasegen.
2: DNA-Sequenz des BstYI Methylasegens (SEQ ID Nr. 1) (bstYIM, 957 bp) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3: DNA-Sequenz des BstYI Endonucleasegens (SEQ ID Nr. 3) (bstYIR, 612 bp) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4: Rekombinante BstYI Endonucleaseaktivität im Zellextrakt. Bahn 1, unzerschnittene Lambda-DNA; Bahn 2, Lambda-DNA, zerschnitten durch gereinigtes natives BstYI; Bahnen 3 bis 10, Lambda-DNA, behandelt mit Zellextrakt, der rekombinante BstYI Restriktionsendonuclease enthielt; Verdünnungsfaktoren in den Bahnen 3-10: 10^–1, 10^–2, 10^–3, 10^–4, 2 × 10^–5, 1 × 10^–5, 5 × 10^–6, 2 × 10^–6.
5: Gereinigte rekombinante BstYI Endonuclease. Bahn 1, Proteingrößenmarker; Bahn 2 und 3, nicht induzierte und IPTG-induzierte Zellextrakte; Bahn 4 und 5, gereinigte BstYI Restriktionsendonuclease nach Heparin-Sepharose- und DEAE-Sepharose-Säulen. Die vorhergesagte und beobachtete Molekülmasse der BstYI Endonuclease betrug 23 kDa.
6: Rekombinante BstYI Methylaseaktivität in gereinigten Fraktionen. Bahn 1, Kontrolle, Lambda-DNA, gespalten durch BstYI Endonuclease; Bahnen 2 bis 11, Lambda-DNA wurde zuerst durch M.BstYI 1 h lang modifiziert und dann mit BstYI Endonuclease 1 h lang behandelt. Bahnen 2 bis 6, gereinigte M.BstYI von Charge 2A; Bahnen 7 bis 11, gereinigtes M.BstYI von Charge 2B. Nach der Methylierung der BstYI Orte war das DNA-Substrat gegen BstYI Verdau resistent.
7: Gereinigtes rekombinantes M.BstYI Protein. Bahnen 1 und 11, Proteingrößenmarker; Bahn 2, gereinigtes M.BstYI Protein nach Heparin-5PW-Säule; Bahn 3, Durchfluss von Heparin-5PW-Säule; Bahnen 4 bis 10, M.BstYI-haltige Fraktionen von einer Source-S-Säule. Die vorhergesagte und beobachtete Molekülmasse von M.BstYI betrug 36,9 kDa.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das BstYI Methylasegen und die BstYI Restriktionsendonucleasegene vorzugsweise kloniert und exprimiert werden in E. coli, beinhaltet die folgenden Schritte:
1. Konstruktion genomischer DNA-Bibliotheken und Methylaseselektion
Genomische DNA wird von Bacillus stearothermophilus Y406 (Stammquelle von Professor Xingshi Pan; Institute of Genetics; Fudan University; Shanghai, 200433 Volksrepublik China) präpariert und mit Restriktionsenzymen wie BclI, EcoRI, HindIII, PstI und Sau3AI teilweise oder komplett verdaut. Die eingeschränkte genomische DNA wird mit E. coli Klonierungs-/Expressionsvektoren wie pUC19 oder pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wird in kompetenten Restriktion-minus-E.coli-Zellen wie RR1 transformiert und Transformanten werden gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA-Bibliotheken werden präpariert und mit BstYI oder einem beliebigen Isoschizomer in Kontakt gebracht. Nach dem Verdau werden die Plasmide zurück in RR1 Zellen transformiert. Ap^R oder Tc^R Überlebende werden im Hinblick auf Resistenz gegen BstYI Verdau gescreent. Die resistenten Klone werden als methylasepositive Klone oder Plasmide identifiziert, die einfach die Restriktionsorte verloren haben. Durch eine Sequenzierung des Inserts (siehe Schritt 5) wird die Klonierung eines Methylasegens verifiziert.
2. Selektion weiterer M.BstYI positiver Klone
Da sich ein Restriktionsendonucleasegen gewöhnlich in unmittelbarer Nähe zu einem Methylasegen befindet, können Anstrengungen unternommen werden, um weitere genomische DNA-Bibliotheken zu konstruieren, die größere genomische DNA-Inserts enthalten. Genomische DNA wird teilweise mit 6-8 bp Schneidenzymen wie HindIII verdaut und mit pBR322 ligiert. Die ligierte DNA wird in RR1 Zellen transformiert und Plasmid-DNA wird präpariert und mit BstYI oder einem beliebigen Isoschizomer in Kontakt gebracht. Anschließend werden zusätzliche M.BstYI positive Klone gewonnen. BstYI Endonucleaseaktivitätsassays finden mit Zellextrakten der M⁺ Klone statt. Werden keine BstYI-Endonuclease-positiven Klone gefunden, ist mit Schritt 3 fortzufahren.
3. Restriktionskartierung der umliegenden DNA des bstYIM Gens und Konstruktion weiterer genomischer DNA-Bibliotheken
Genomische B. stearothermophilus Y406 DNA wurde mit Endonucleasen mit 6-8 bp Erkennungssequenzen verdaut, um DNA-Fragmente, die das bstYIM Gen umfassen, und die flankierende DNA zu identifizieren. Im Rahmen einer Southern-Blot-Analyse wurde gefunden, dass vier Enzyme (ClaI, NsiI, PvuI und SphI) große DNA-Fragmente erzeugen würden, die angrenzende DNA auf beiden Seiten des bstYIM Gens tragen.
Genomische B. stearothermophilus Y406 DNA wurde jeweils mit ClaI, NsiI, PvuI und SphI oder irgendwelchen anderen Enzymen verdaut, die große Fragmente erzeugen. Genomische DNA-Bibliotheken wurden mit pUC und pBR328 Vektoren konstruiert. Weitere M.BstYI-positive Klone wurden von den vier Bibliotheken gewonnen. Die angrenzende stromaufwärtige DNA wurde um wenigstens 14 kb weiter verlängert. Es wurde jedoch keine Endonucleaseaktivität unter diesen M.BstYI-positiven Klonen nachgewiesen. Die Klonierung der angrenzenden stromabwärtigen Sequenz erwies sich als äußerst schwierig, was ein Hinweis auf eine toxische Genwirkung war. Es wurde festgestellt, dass die angrenzende stromabwärtige Sequenz möglicherweise das bstYIR Gen kodiert.
4. Screenen eines nucleasehaltigen Klons durch den dinD::lacZ Indikatorstamm
Genomische ClaI, EcoRI, NsiI, PvuI und SphI DNA-Bibliotheken wurden in einen dinD::lacZ Indikatorstamm AP1-200 oder ein beliebiges mit einem Reportergen fusioniertes Gen transformiert, das einen DNA-Schaden induzieren kann. Wenn ein Plasmid ein Nucleasegen (Endonuclease, Exonuclease, Integrase oder Gyrase) trägt, kann das Genprodukt eine SOS-Reaktion auslösen und die Expression der dinD::lacZ Fusion (Produktion von β-Galactosidase) erhöhen. Die ein solches Plasmid tragende Kolonie würde auf einer X-Gal-Platte blau werden. Einige blaue Kolonien wurden unter den Transformanten gefunden, keine von ihnen trug jedoch das bstYIR Gen.
5. Seguenzierung des bstYIM Gens
Das bstYIM Gen wird durch Einfügen von Priming-Orten des GPS-1 Genome Priming Systems oder durch Primer-Walking sequenziert. Das bstYIM Gen umfasst 957 bp und kodiert ein 318-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 36,9 kDa.
6. Klonierung des bstYIM Gens in pACYC184, um einen zuvor modifizierten Wirt zu konstruieren
Das bstYIM Gen wurde von der genomischen DNA durch PCR unter Verwendung von zwei Primern amplifiziert. Die PCR DNA wurde mit BamHI und SphI verdaut und mit Plasmiden mit geringer/mittlere Kopiezahl wie pACYC184 ligiert, die mit pET T7 Expressionsvektoren kompatibel sind. Der zuvor modifizierte Wirt ER2744 [pACYC-BstYIM] wurde zur Expression des bstYIR Gens in E. coli verwendet.
7. Expression von M.BstYI als eine Fusion mit der Chitin-Bindungsdomäne und Intein und Reinigung von M.BstYI durch Affinitätschromatographie
Das bstYIM Gen wurde von der genomischen DNA durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit NdeI verdaut und mit NdeI und Smal zerschnittenem TYB2 Vektor ligiert. Der Expressionsstamm ER2566 [TYB2-BstYIM] wurde kultiviert und induziert. Protein im Zellextrakt wurde durch eine Chitinsäule und DTT-Spaltung gereinigt. Das gereinigte M.BstYI Protein wurde durch SDS-PAGE analysiert. Das Protein hatte die korrekte Größe von 36,9 kDa. Die M.BstYI Proteinausbeute war jedoch eher gering, was in einer nur teilweisen BstYI Ortsmodifikation resultierte. Zum Erhöhen des Niveaus der M.BstYI Expression wurde der Expressionsvektor in einen E. coli K-Stamm T7 Expressionswirt wie ER1821 (λDE3) eingeführt. Das Expressionsniveau im K-12-Stamm war wesentlich höher als das im B-Stamm ER2566.
8. Reinigung von M.BstYI durch Chromatographie
Der M.BstYI enthaltende Zellextrakt wurde durch Affinitätschromatographie mit einer Chitinsäule und Heparin-TSK-Säule fraktioniert. M.BstYI Protein kann durch Kationen- oder Anionenaustauschsäulen weiter gereinigt werden. Lambda-DNA oder jedes beliebige andere Substrat mit BstYI Orten kann zuerst durch M.BstYI in einem Methylierungspuffer modifiziert werden. Nach der Methylierung des Substrats kann die DNA im Hinblick auf einen Schutz vor BstYI Verdau geprüft werden. Wenn die DNA durch M.BstYI modifiziert wird, müsste die DNA gegen BstYI Verdau resistent werden.
9. Klonierung des bstYIR Gens durch inverse PCR
Die genomische DNA wurde mit 4-6 bp zerschneidenden Restriktionsenzymen wie AciI, BfaI, BspHI, EcoRI, HhaI, HpyIV, MseI und NlaIII verdaut. Die verdaute DNA wurde mit einer geringen DNA-Konzentration ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des bstYIR Gens verwendet. Es wurden inverse PCR-Produkte gewonnen und sequenziert. Ein ORF von 612 bp wurde stromabwärts des bstYIM Gens gefunden. Dieses ORF wird als bstYIR Gen bezeichnet. Es kodiert ein 203-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 23 kDa.
10. Expression des bstYIR Gens im T7 Expressionsvektor pET21b
Da sich im bstYIR Gen ein NdeI Ort befindet, kann der NdeI Ort nicht zum Klonieren des bstYIR Gens in den pET21b Expressionsvektor verwendet werden. Die XbaI und XhoI Orte wurden in den Vorwärtsprimer und die Rückwärtsprimer integriert. Eine Ribosomenbindungsstelle wurde ebenfalls in den Vorwärtsprimer eingebaut.
Das bstYIR Gen wird durch PCR unter Verwendung einer „proof reading" DNA-Polymerase wie Vent^® DNA-Polymerase (New England Biolabs, Inc., Beverly, mA) und Primern amplifiziert. Das PCR Produkt wurde mit XbaI und XhoI verdaut und mit einem Expressionsvektor wie pET21b ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BstYIM] transformiert. Ap^R CM^R Transformanten wurden nach Plasmiden mit dem Insert korrekter Größe gescreent. Zellextrakte wurden präpariert und im Hinblick auf BstYI Aktivität geprüft. Ein Klon, Nr. 11, wies hohe BstYI Aktivität auf. Dieser Expressionsklon war jedoch infolge eines Aktivitätsverlustes nach der Subkultur von Zellvorräten instabil. Der Grund für die Instabilität war wahrscheinlich das hohe Expressionsniveau unter nicht induzierten Bedingungen. Das bstYIR Gen wurde in die XbaI und XhoI Orte von pET21b eingefügt. Der XbaI Ort ist 3-bp von der lac-Operatorsequenz entfernt, die der Lac-Repressor bindet. Aus irgendeinem unbekannten Grund behinderte die Einfügung des bstYIR Gens am XbaI Ort die Lac-Repression. Man bemühte sich, einen neuen Expressionsklon zu konstruieren.
11. Einführung einer stillen Mutation in das bstYIR Gen, um einen internen NdeI Ort zu beseitigen
T7 Expressionsvektoren enthalten gewöhnlich NdeI oder NcoI Orte für die Klonierung der 5' Startcodonseite des Targetgens. Das ATG Startcodon ist im NdeI Ort (5'CATATG3') oder im NcoI Ort (5'CCATGG3') enthalten. Eine effiziente Ribosomenbindungsstelle (Translationssignal) befindet sich stromaufwärts des NdeI oder NcoI Ortes. Zum Klonieren des bstYIR Gens in einen T7 Expressionsvektor musste ein interner NdeI Ort innerhalb des bstYIR Gens durch Mutagenese beseitigt werden. Es wurde eine Überhangverlängerungs-PCR durchgeführt, um den NdeI Ort zu beseitigen. Die ersten 449 bp des Gens wurden mit 5' Vorwärts- und internen mutagenen Rückwärtsprimern amplifiziert. Der zweite Teil des Gens wurde mit internen mutagenen Vorwärts- und 3' Rückwärtsprimern amplifiziert. Die beiden PCR-Produkte wurden gereinigt und durch die 5' Vorwärts- und 3' Rückwärtsprimer weiter amplifiziert. Alternativ kann eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese mit einer einzelsträngigen DNA-Matrize zur Durchführung der Mutagenese angewendet werden und anschließend das Gen in einen T7 Expressionsvektor wie pET21at kloniert werden. Der Vektor pET21at enthält 4 Transkriptionsterminator-Kopien stromaufwärts des T7 Promotors und folglich können Run-off-Transkriptionen von kryptischen E. coli Promotoren beendet werden. Es können auch andere Restriktionsorte im 5' und 3' Ende des bstYIR Gens und eine Ribosomenbindungsstelle (Translationssignal) hinter dem 5' Restriktionsort und vor dem ATG Startcodon konstruiert werden.
12. Expression des bstYIR Gens im T7 Expressionsvektor pET21at
Das bstYIR Gen-PCR-Produkt wurde mit NdeI und XhoI verdaut und mit pET21at oder einem beliebigen anderen T7 Expressionsvektor mit angemessenen Restriktionsorten oder einem beliebigen E. coli Expressionsvektor mit streng kontrollierten Promotoren ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BstYIM, pCEF8] transformiert und Transformanten wurden selektiert. Alternativ kann ein M.BstYI Isoschizomer wie M.XhoII verwendet werden, um den E. coli Wirt zuvor zu modifizieren. Man fand einen Klon, der die Wildtyp-bstYIR-Kodierungssequenz und die gewünschte stille Mutation am internen NdeI Ort enthielt.
13. Reinigung der BstYI Endonuclease durch Chromatographie
Zellextrakt, der die rekombinante BstYI Endonuclease enthielt, wurde 30 min lang auf 65°C erhitzt, und die hitzedenaturierten Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. BstYI Endonuclease wurde weiter per Chromatographie durch Heparin-Sepharose- und DEAE-Sepharose-Säulen gereinigt. Alternativ kann BstYI Endonuclease per Chromatographie durch Kationen-/Anionenaustauschsäulen und Gelfiltrationstrennsäulen oder durch Affinitätsreinigung durch Fusions-Tags wie His-Tag, GST-Tag, Chitin-Bindungsdomänen-Tag, MBP-Bindungsdomänen-Tag gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher anhand der folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele sollen dem Verständnis der Erfindung dienen und sind nicht als diese begrenzend anzusehen.
Die oben und im Folgenden genannten Quellenangaben sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
1. BEISPIEL
Klonierung des BstYI Restriktions-Modifikationssystems in E. coli
1. Präparation genomischer DNA und Restriktionsverdau genomischer DNA
Genomische DNA wurde von Bacillus stearothermophilus Y406 (New England Biolabs Sammlung Nr. 434) mit dem Standardverfahren präpariert, das die folgenden Schritte beinhaltet:

(a) Zelllyse durch Zugabe von Lysozym (2 mg/ml Endkonz.), Saccharose (1% Endkonz.) und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
(b) Zelllyse durch Zugabe von 10% SDS (Endkonzentration 0,1%);
(c) Zelllyse durch Zugabe von 1% Triton X-100 und 62 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
(d) Phenol-CHCl₃-Extraktion von DNA, dreimal (gleiches Volumen), und CHCl₃-Extraktion, einmal;
(e) DNA-Dialyse in 4 Liter TE-Puffer, dreimal Wechsel;
(f) RNA wurde durch RNase-A-Behandlung entfernt und die genomische DNA

Die Restriktionsenzyme BclI, EcoRI, HindIII, PstI und Sau3AI wurden durch 2fache Reihenverdünnungen verdünnt. Fünf bis zehn μg genomische DNA wurden teilweise oder komplett mit BclI, EcoRI, HindIII oder PstI bei 37°C 30 min lang verdaut. Die genomische DNA wurde ebenfalls mit Sau3AI teilweise verdaut. Die mit BclI und Sau3AI verdaute genomische DNA wurde mit BamHI-verdautem und CIP-behandeltem pUC19 Vektor ligiert. Die mit EcoRI, HindIII und PstI verdaute genomische DNA wurde mit CIP-behandeltem pUC19 mit kompatiblen Enden ligiert. PstI-verdaute genomische DNA wurde auch mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde zum Transformieren kompetenter E. coli RR1-Zellen mit dem Standardverfahren verwendet.
2. Konstruktion von BclI-, HindIII-, PstI-partiellen und -kompletten genomischen DNA-Bibliotheken und einer Sau3AI-partiellen genomischen DNA-Bibliothek und Selektion von M.BstYI durch das Methylaseselektionsverfahren
Für das Transformationsexperiment wurde das Antibiotikum Ampicillin (Ap) zum Selektieren von Tranformanten von BclI, EcoRI, HindIII, PstI und Sau3AI Bibliotheken verwendet. Tetracyclin (Tc) wurde zum Selektieren von pBR322 + genomische PstI Fragmentbibliothek verwendet. Insgesamt wurden mehr als 2 × 10⁴ Ap^R und 2,6 × 10³ Tc^R Transformanten in zwei Transformationsexperimenten erhalten. Diese Transformanten wurden gepoolt und in 1 Liter Übernachtkulturen amplifiziert. Plasmid- DNA wurde von den Übernachtzellen mit dem CsCl-Ultrazentrifugierverfahren präpariert (Maniatis et al. in Molecular Cloning, Seite 93). Die Plasmidbibliotheken wurden 3 h lang bei 60°C mit BstYI in Kontakt gebracht. Nach dem BstYI Verdau wurde die kontaktierte DNA zurück in kompetente RR1-Zellen transformiert. Ap^R oder Tc^R Überlebende wurden im Hinblick auf Resistenz gegen BstYI Verdau gescreent. Es erfolgten insgesamt 118 Plasmid-Mini-Präparationen. Es wurde festgestellt, dass 32 Klone teilweise resistent gegen BstYI-Verdau waren. Alle resistenten Klone (M.BstYI-positiv) stammten von HindIII-kompletten/partiellen Bibliotheken. Ein 1,3 kb Fragmentinsert war allen M'-Klonen gemein. Man kam zu dem Schluss, dass das 1,3 kb Fragment das bstYIM Gen enthalten muss. (Als das Insert später sequenziert wurde, wurde bestätigt, dass es M.BstYI kodiert; siehe Abschnitt 5 unten).
3. Selektion weiterer M.BstYI-positiver Klone
Da sich ein Restriktionsgen gewöhnlich in unmittelbarer Nähe zum zugehörigen Methylasegen befindet, wurden weitere genomische DNA-Bibliotheken konstruiert, die größere genomische DNA-Inserts enthielten. Genomische B. stearothermophilus Y406 DNA wurde teilweise mit HindIII verdaut und mit CIP-behandeltem pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente RR1-Zellen transformiert und Plasmid-DNA wurde präpariert und mit BstYI-Endonuclease in Kontakt gebracht. Es wurden sieben weitere M.BstYI-positive Klone von der HindIII-Bibliothek gewonnen, es wurden allerdings keine BstYI Endonuclease-positiven Klone gefunden.
4. Restriktionskartierung der flankierenden DNA des bstYIM Gens und Konstruktion weiterer genomischer DNA-Bibliotheken
Genomische B. stearothermophilus Y406 DNA wurde mit Restriktionsenzymen mit 6-bp Erkennungssequenz verdaut, um DNA-Fragmente zu identifizieren, die das bstYIM Gen und die flankierende DNA umfassen. Die genomische DNA wurde mit AseI, BilI, BstBI, ClaI, DraI, EcoRI, FspI, NaeI, NdeI, NheI, NsiI, PstI, PvuI, PvuII, ScaI, SphI, SalI, SspI und XmnI verdaut. Die genomischen DNA-Fragmente wurden in einem Agarosegel separiert. Die DNA wurde denaturiert und zu einer Nitrocellulosemembran transferiert. Die Membran wurde getrocknet, durch UV vernetzt und mit einer ³²P-markierten Sonde des 1,3 HindIII Fragments mit dem bstYIM Gen hybridisiert. Man stellte fest, dass vier Enzyme große DNA-Fragmente erzeugen würden, die angrenzende DNA auf beiden Seiten des bstYIM Gens tragen. Die ungefähren Größen der DNA-Fragmente waren: ClaI, 7,2 kb; NsiI, 6,5 kb; PvuI > 16 kb; SphI, 6 kb.
Genomische B. stearothermophilus Y406 DNA wurde jeweils mit ClaI, NsiI, PvuI und SphI verdaut. Die NsiI und SphI DNA-Fragmente wurden mit CIP-behandeltem pUC-Vektor ligiert; ClaI und PvuI Genomfragmente wurden mit CIP-behandeltem pBR328 Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente RR1-Zellen transformiert und Plasmid-DNA wurde präpariert und mit BstYI Endonuclease in Kontakt gebracht. Dreiundzwanzig weitere M.BstYI-positive Klone wurden von den vier Bibliotheken gewonnen. Die angrenzende stromaufwärtige DNA wurde um wenigstens 14 kb weiter verlängert. Es wurde jedoch keine Endonucleaseaktivität unter diesen M.BstYI-positiven Klonen nachgewiesen. Die Klonierung der angrenzenden stromabwärtigen Sequenz war äußerst schwierig, was auf eine toxische Genwirkung hinwies. Man kam zu dem Schluss, dass die angrenzende stromabwärtige Sequenz möglicherweise das bstYIR Gen kodiert. Die Klonierung des bstYIR Gens erfordert möglicherweise einen zuvor modifizierten M.BstYI Wirt.
5. Screenen eines nucleasehaltigen Klons durch den dinD::lacZ Indikatorstamm
Genomische ClaI, EcoRI, NsiI, PvuI und SphI DNA-Bibliotheken wurden in einen dinD::lacZ Indikatorstamm AP1-200 transformiert. Wenn das Plasmid ein Nucleasegen (z.B.. Endonuclease, Exonuclease, Integrase oder Gyrase) beinhaltet, dann kann das Genprodukt die SOS-Reaktion auslösen und die Expression einer dinD::lacZ Fusion erhöhen (Produktion von β-Galactosidase). Die ein solches Plasmid tragende Kolonie würde auf einer X-Gal-Platte blau werden. Unter den Transformanten wurden einige blaue Kolonien gefunden, keine von ihnen wies jedoch BstYI Endonucleaseaktivität auf.
6. Sequenzierung des bstYIM Gens
Das bstYIM Gen wurde durch das Einfügen von Priming-Orten des GPS-1 Genome Priming Systems (New England Biolabs) sequenziert. Das bstYIM Gen umfasst 957 bp und kodiert ein 318-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 36,9 kDa. Ein Sequenzvergleich mit anderen Methylasen in der GenBank ergab, dass M.BstYI wahrscheinlich eine N4-Cytosinmethylase ist. Darüber hinaus erbringt eine Dam-Methylierung des 5'GATC3' Ortes keine Resistenz gegen BstYI Verdau. Dam-Methylase ist eine N6 Adeninmethylase, die Adenin in der 5'GATC3' Sequenz modifiziert.
7. Klonierung des bstYIM Gens in pACYC184, um einen zuvor modifizierten Wirt zu konstruieren
Zwei Primer wurden mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
5' aaaactggatccggaggtaaaaaaatgaacttcttgagtctatttgaatat aga 3' (237-61) (SEQ ID Nr. 5)
5' taacacgcatgcttacttttgttctaggagttctttccattc 3' (235-257) (SEQ ID Nr. 6)
Das bstYIM Gen wurde von der genomischen DNA in PCR unter Verwendung der Primer 237-61 und 235-257 unter den folgenden PCR-Bedingungen amplifiziert: 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 1 min, 20 Zyklen. Die PCR DNA wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt, mit BamHI und SphI verdaut und mit CIP-behandeltem pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert. Nach dem Screenen von 18 Plasmid-Mini-Präparationen wurden 7 Klone gefunden, die gegen BstYI-Verdau resistent waren. Die resistenten Klone waren auch gegen BamHI-Verdau resistent, da BamHI Orte (5'GGATCC3') auch BstYI Orte (5'PuGATCPy3') sind. Der zuvor modifizierte Wirt ER2744 [pACYC-BstYIM] wurde zur Expression des bstYIR Gens in E. coli verwendet.
8. Expression von M.BstYI als eine Fusion mit der Chitin-Bindungsdomäne und Intein und Reinigung von M.BstYI durch Affinitätschromatographie
Zwei Primer wurden mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
5' gtagtgaggcatatgaacttcttgagtctatttgaatataga 3' (234-397) (SEQ ID Nr. 7)
5' cttttgttctaggagttctttccattc 3' (234-398) (SEQ ID Nr. 8)
Das bstYIM Gen wurde von der genomischen DNA in PCR unter Verwendung der Primer 234-397 und 234-398 unter den folgenden PCR-Bedingungen amplifiziert: 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 1 min, 20 Zyklen. Die PCR DNA wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit NdeI Endonuclease verdaut. Die PCR DNA wurde wieder durch eine Spin-Säule gereinigt und mit NdeI und SmaI zerschnittenem TYB2 Vektor ligiert. TYB2 ist ein Expressionsvektor mit Inteinspaltung des Fusionsproteins. Das Fusionsprotein kann durch eine Chitin-Affinitätssäule gereinigt werden. Nach dem Screenen von 18 Plasmid-Mini-Präparationen wurden 4 Klone gefunden, die gegen BstYI-Verdau resistent waren, was auf eine ausreichende Expression von M.BstYI in vivo unter nicht induzierten Bedingungen hinwies.
Der Expressionsstamm ER2566 [TYB2-BstYIM] wurde in 1 l LB plus Ap kultiviert und mit IPTG induziert. Zellen wurden durch Beschallung lysiert und Zellreste wurden durch Zentrifugation entfernt. Protein im Zellextrakt wurde auf eine Chitin-Säule geladen. Nach einer gründlichen Wäsche wurde die Säule mit 40 mM DTT enthaltendem Puffer geflutet, um die Spaltung von M.BstYI von dem Fusionsprotein zu erleichtern. Nach einer Übernachtspaltung wurde das M.BstYI Protein in einem Elutionspuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) eluiert. Das gereinigte M. BstYI Protein wurde auf SDS-PAGE analysiert und hatte die korrekte Größe von 36,9 kDa. Das M.BstYI Protein war teilweise aktiv in der Modifizierung von Lambda-DNA in vivo. Da die M.BstYI Proteinkonzentration gering war, kam es nur zu einer teilweisen BstYI Ortsmodifikation. Zum Erhöhen des Niveaus der M.BstYI Expression wurde der Expressionsvektor in zwei E. coli K-Stamm T7 Expressionswirte, RR1 (λDE3) und ER1821 (λDE3), eingeführt. Das Expressionsniveau in den K-12-Stämmen war wesentlich höher als das im B-Stamm ER2566. Drei l von RR1 (λDE3)[TYB2-BstYIM] und 3 l von ER1821 (λDE3[TYB2-BstYIM] Zellen wurden kultiviert und mit IPTG induziert und es wurden etwa 12 g Zellen erhalten. Sechs Gramm Zellen wurden zur Reinigung von M.BstYI lysiert.
9. Reinigung von M.BstYI durch Chromatographie
Der M.BstYI enthaltende Zellextrakt wurde auf eine Chitin-Säule (53 ml) geladen, die mit Puffer (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM EDTA) äquilibriert worden war. Nach einer gründlichen Reinigung der Säule mit dem Säulenpuffer (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM EDTA) wurde die Säule mit 150 ml 0,5 M NaCl und 40 mM DTT geflutet. Die Säule wurde über Nacht bei 4°C für eine DTT-erleichterte Spaltung des Fusionsproteins stehen gelassen. Das gespaltene Produkt von M.BstYI wurde mit Säulenpuffer eluiert und 10 ml Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen mit hoher Proteinkonzentration wurden auf Lambda-DNA hinsichtlich Methylaseaktivität geprüft. Nach der Methylierungsreaktion wurde die DNA einem BstYI-Verdau unterzogen. Es wurde gefunden, dass die Fraktionen 1-8 aktives M.BstYI enthielten. Die aktiven M.BstYI Fraktionen (etwa 20 mg Protein) wurden gepoolt und in einem Puffer aus 50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT bei 4°C über Nacht dialysiert. Das Protein wurde auf eine Source-Q-Säule geladen. Die Säule wurde gründlich mit dem salzarmen Puffer gewaschen. Protein wurde mit einem Gradient von 50 mM bis 1 M NaCl eluiert. Die Fraktionen 5-12 wurden durch SDS-PAGE analysiert und die M.BstYI Proteinbande wurde mit einer Reinheit von wenigstens 90% nachgewiesen. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und in Enzymlagerpuffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol (pH 7,6 bei 4°C) dialysiert. Das Protein wurde auf eine Heparin-TSK-5PW- Säule geladen und mit salzarmem Puffer gewaschen (0,1 M NaCl, 20 mM KPO₄, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) und mit einem NaCl-Gradient von 0,1 M bis 1 M eluiert. Die Hälfte des Heparin-TSK-5PW-Pools wurde in Enzymlagerpuffer (oben) dialysiert und als Charge 2A gekennzeichnet. Die verbleibende Hälfte wurde 20 min lang auf 60°C erwärmt und weiter durch eine Heparin-TSK-5PW-Säule und durch eine Source-S-Säule gereinigt und in Enzymlagerpuffer dialysiert, woraus das gereinigte Produkt für Charge 2B hervorging. Beide Präparate enthielten M.BstYI mit > 90% Reinheit und wiesen keine unspezifische Endonuclease und Exonuclease auf. Das Proteingel ist in 7 dargestellt. Das Ergebnis des M.BstYI Aktivitätsassays ist in 6 dargestellt. Lambda-DNA wurde zuerst durch M.BstYI in einem Methylierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 5 mM DTT, 80 μM S-Adenosyl-Methionin (SAM)) eine Stunde lang bei 60°C oder 37°C modifiziert. Nach der Methylierung des Substrats wurde die DNA mit BstYI in Restriktionspuffer gespalten, der 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂ und 1 mM DTT enthielt. Als die DNA durch M.BstYI modifiziert war, war sie gegen BstYI-Verdau resistent. Wie in 6 zu sehen ist, wiesen Charge 2A und 2B jeweils 15 ml und 8 ml an gereinigtem M.BstYI auf. Die Methylaseaktivität betrug etwa 60.000 – 80.000 Einheiten/ml. Die Endausbeute von M.BstYI lag somit etwa bei 1,4 × 10⁶ Einheiten von 6 Gramm IPTG-induzierten Zellen.
10. Klonierung des bstYIR Gens durch inverse PCR
Zwei Primer wurden mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
5' tattcgcatttgaacgggttggaa 3' (244-89) (SEQ ID Nr. 9)
5' tacttcaacaattctcatatctacact 3' (244-90) (SEQ ID Nr. 10)
Die genomische DNA wurde mit AciI, BfaI, BspHI, EcoRI, HhaI, HpyIV, MseI und NlaIIII verdaut. Die verdaute DNA wurde mit einer geringen DNA-Konzentration von 2 μg/ml ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des BstYR Gens verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren: 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 1 min, 35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden von BfaI, BspHI, HpyIV, MseI und NlaIIII Matrizen gewonnen, gelgereinigt von leicht schmelzbarer Agarose und mit den Primern 244-89 und 244-90 sequenziert. Ein ORF von 612 bp wurde stromabwärts des bstYIM Gens gefunden. Dieses ORF wurde bstYIR Gen genannt. Es kodiert ein 203-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 23 kDa.
11. Expression des bstYIR Gens im T7 Expressionsvektor pET21b
Da es einen NdeI Ort im bstYIR Gen gibt, kann der NdeI Ort nicht zum Klonieren des bstYIR Gens in den pET21b Expressionsvektor verwendet werden. Zwei Restriktionsorte (XbaI Ort und XhoI Ort) wurden jeweils in die Vorwärts- und Rückwärtsprimer eingebaut. Zwei Primer wurden synthetisiert, um das bstYIR Gen durch PCR zu amplifizieren. Die Primer hatten die folgende Sequenz:
5' ttttattctagaggaggtaaataaatgagaattgttgaagtatattcgcat 3' (244-191) (SEQ ID Nr. 11)
5' ccttctttcctcgagttaatttataccttataatactaacat 3' (244-192) (SEQ ID Nr. 12)
Das bstYIR Gen wurde durch PCR mit Vent^® DNA-Polymerase und den Primern 244-191 und 244-192 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 1 min, 25 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit XbaI und XhoI verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA mit pET21b mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BstYIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. Unter 36 Plasmid-Mini-Präparationen trugen 7 Klone das gewünschte Insert. Alle 7 Klone wurden in 10 ml LB plus Ap und Cm kultiviert und mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 h lang induziert. Zellextrakte wurden präpariert und hinsichtlich BstYI Aktivität geprüft. Ein Klon, Nr. 11, wies eine hohe BstYI Aktivität auf. Die Ausbeute lag etwa bei 10⁶ Einheiten/Gramm Zellen. Dieser Expressionsklon war jedoch nicht stabil, da er nach der Subkultur von Zellvorräten an Aktivität verlor (Zellvorrat wurde bei –20°C in 50% Glycerol aufbewahrt). Der Grund für die Instabilität war wahrscheinlich das hohe Expressionsniveau unter nicht induzierten Bedingungen. Als nicht induzierte und IPTG-induzierte Zellextrakte durch SDS-PAGE analysiert wurden, wiesen beide ein ähnliches Niveau der BstYI Endonucleaseproduktion auf. Das bstYIR Gen wurde in den XbaI und HhoI Ort von pET21b eingesetzt. Der XbaI Ort ist 3 bp entfernt von der lac-Operatorsequenz, die der Lac-Repressor bindet. Aus irgendeinem unbekannten Grund behinderte die Einfügung des bstYIR Gens in den XbaI Ort die Lac-Repression.
12. Beseitigung eines internen NdeI Ortes im bstYIR Gen und Expression des bstYIR Gens im T7 Expressionsvektor pET21at
Das bstYIR Gen wurde in pET21at unter Verwendung der Restriktionsorte NdeI und XhoI kloniert. Eine Überhangverlängerungs-PCR-Mutagenese wurde im Rahmen des Klonierungsverfahrens angewendet, um den internen NdeI Ort zu entfernen, wodurch ein stiller Basenpaarwechsel von T zu C in der Position 435 des Gens eingeführt wurde.
In diesem Verfahren wurden die ersten 449 bp des Gens mit den folgenden Primern amplifiziert:
5' gggagtgtacatatgagaattgttgaagta 3' (250-176) (SEQ ID Nr. 13) 5' vorwärts
5' aacatagaaagccatgtgtttgacgaaaag 3' (250-177) (SEQ ID Nr. 14) intern rückwärts mutagen
Die zweite Hälfte des Gens wurde mit den folgenden Primern amplifiziert:
5' cttttcgtcaaacacatggctttctatgtt 3' (250-178) (SEQ ID Nr. 15) intern vorwärts mutagen
5' ccttctttcctcgagttaatttataccttataatactaacat 3' (244-192) (SEQ ID Nr. 16) 3' rückwärts
Die beiden Genseqmente wurden individuell durch Vent^® Polymerase unter Verwendung von 22 Zyklen mit 95°C, 1 min, 58°C, 1 min, 72°C, 1 min amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden von einem leicht schmelzbaren Agarosegel gereinigt und dann zu einer PCR-Überhangverlängerungsreaktion gegeben. Die PCR-Überhangverlängerungsreaktion wurde durch Vent^® Polymerase unter Verwendung der oben aufgeführten 5' Vorwärts- und 3'-Rückwärtsprimer amplifiziert, um das Volllängen-bstYIR-Gen ohne einen internen NdeI Ort zu erhalten. Die Extension/Amplifikation wurde über 10 Zyklen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 95°C, 1 min, 58°C, 1 min, 72°C, 1 min. Das PCR-Endprodukt wurde durch Ethanolpräzipitation gereinigt und dann mit NdeI und XhoI verdaut. Nach der Gelreinigung wurde das bstYIR Gen mit pET21at unter Verwendung kompatibler Restriktionsorte ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BstYIM, pCEF8] transformiert und Transformanten wurden auf Amp/Cam/Kan-LB-Platten selektiert (Plasmid pCEF8 trägt pSC101 Ursprung und T7 Lysozymgen, dessen Produkt T7 RNA Polymerasektivität hemmt).
Plasmid-DNA wurde von 36 Transformanten durch Qiagen Spin-Säulen präpariert; 15 Klone trugen das gewünschte Insert. Alle 15 Klone wurden in 10 ml LB plus Amp (100 ug/ml), Cam (33 ug/ml) und Kan (50 ug/ml) kultiviert und mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 Stunden lang bei 30°C induziert. Zellextrakte wurden präpariert und hinsichtlich BstYI Aktivität geprüft. Von diesen 15 Klonen wiesen 12 eine hohe BstYI Aktivität auf. Klon Nr. 20 wurde in großem Maßstab (3 Liter) kultiviert und durch eine Prüfung des Zellextrakts wurde eine Aktivität von 2,4 × 10⁷ Einheiten je Gramm Zellen ermittelt. In Übereinstimmung mit dieser hohen Aktivität brachte die SDS-PAGE Analyse des Zellextrakts der IPTG-induzierten Kultur ein überexprimiertes Protein von etwa 23 kDa hervor (siehe 5).
Der E. coli Stamm ER2744 [pACYC-BstYIM, pET21at-BstYIR, pCEF8] wurde am 4. Januar 2001 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der ATCC-Akzessionsnr. PTA-2864 hinterlegt.
13. Reinigung der BstYI Endonuclease auf Homogenität
Zellextrakt wurde durch Beschallung von 12,0 Gramm IPTG-induzierten Zellen präpariert, die in 60 ml Beschallungspuffer (20 mM KPO₄, pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA) resuspendiert wurden. Nach der Beschallung wurden 50 mM NaCl zu dem Zellextrakt gegeben, gefolgt von einer 30-minütigen Erwärmung auf 65°C, um E. coli Proteine zu denaturieren. Der erwärmte Extrakt wurde mit 15.000 rpm 30 min lang zentrifugiert und der geklärte Überstand wurde zurückgehalten (57 ml). Glycerol wurde auf eine Endkonzentration von 5% zugegeben, bevor der Überstand auf eine Heparin-Sepharose-Säule geladen wurde, die mit 20 mM KPO₄, pH 6,8, 50 mM NaCl, 10 mM β-ME, 0,1 mM EDTA und 5% Glycerol äquilibriert worden war. Fraktionen wurden mit einem NaCl-Gradient von 0,05 M-0,8 M eluiert. Fraktionen, die gemäß einem Aktivitätsassay BstYI Endonuclease enthielten, wurden gepoolt und über Nacht in DEAE-Sepharose-Ladepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM (β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA und 5% Glycerol) dialysiert. Nach der Dialyse wurden 72 ml auf eine DEAE Sepharose-Säule geladen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Fraktionen wurden mit einem 0,05 M-0,6 M NaCl Gradient eluiert und Fraktionen, die gemäß SDS-PAGE-Analyse gereinigtes BstYI enthielten, wurden gepoolt. Der Endpool von 20 ml BstYI enthielt eine Proteinkonzentration von 0,75 mg/ml, wie anhand des Bradford Assay (Bio-Rad) bestimmt wurde. Das gereinigte Protein wurde durch SDS-PAGE analysiert und war schätzungsweise zu mehr als 98% rein.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die BstYI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment von einem Plasmid erhältlich ist, das in ATCC Nr. PTA-2864 enthalten ist.
Rekombinanter DNA-Klonierungsvektor, der ein DNA-Segment nach Anspruch 1 umfasst.
Isoliertes DNA-Segment, das die BstYI Restriktionsendonuclease und BstYI Methylase kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment von einem Plasmid erhältlich ist, das in ATCC Nr. PTA-2864 enthalten ist.
Klonierungsvektor, der das isolierte DNA-Segment nach Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, die durch den Klonierungsvektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen einer rekombinanten BstYI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert wurde, unter Bedingungen zur Expression von BstYI Endonuclease und Methylase beinhaltet.