DE60215746T2

DE60215746T2 - Verfahren zur Klonierung und Exprimierung von BsmBI-Restriktionsendonuklease und BsmBI-Methylase in E. coli, und zur Purifizierung von BsmBI-Endonuklease

Info

Publication number: DE60215746T2
Application number: DE60215746T
Authority: DE
Inventors: Shuang-yong Lexington XU; Andrew Nr. Uckfield Dore; Adam Lewiston Hume; John Amesbury Pellitier; Jing Beverly Zhou
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2022-09-28
Also published as: JP4115248B2; EP1298212B1; US20030100052A1; DE60215746D1; EP1298212A2; US6764843B2; JP2003230390A; EP1298212A3; EP1298212B8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BsmBI Restriktionsendonuclease (Endonuclease) sowie die BsmAI Methyltransferase (Methylase) kodiert, die Expression von BsmBI Endonuclease und BsmAI Methylase in E. coli Zellen, die rekombinante DNA enthalten.
BsmBI Endonuclease ist im Stamm von Bacillus stearothermophilus B61 (New England Biolabs' Stammsammlung Nr. 857) zu finden. Sie erkennt die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'CGTCTC3'N₁/N₅ (SEQ ID Nr. 1) und spaltet bei N₁ (oberer Strang) und N₅ (unterer Strang) stromabwärts der Erkennungssequenz, um einen 4-Basen-Überhang am 5' Ende zu erzeugen (N = A, T, C oder G;/gibt die Spaltung einer Phosphodiesterbindung an). BsmBI Methylase (M.BsmBI) ist ebenfalls im Stamm von Bacillus stearothermophilus B61 zu finden. Sie erkennt die doppelsträngigen DNA-Sequenzen 5'CGTCTC3' (SEQ ID Nr. 2) (oberer Strang) und 5'GAGACG3' (SEQ ID Nr. 3) (unterer Strang) und modifiziert vermutlich ein Cytosin (5mC) auf dem oberen Strang und ein Adenosin (N6mA) auf dem unteren Strang innerhalb der Erkennungssequenzen.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die in Bakterien und in einigen Viren natürlich vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterien-/Virenproteinen weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen erkennen und binden sich an spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang den DNA-Molekülen. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül in (z.B. BamHI), auf einer Seite (z.B. SapI) oder auf beiden Seiten (z.B. TspRI) der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertelf Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den bisher untersuchten vielen hundert Bakterienspezies identifiziert (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27:312-313 (1999)).
Restriktionsendonucleasen werden typischerweise nach den Bakterien benannt, bei denen sie entdeckt werden. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit den Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTT/AAA3' (SEQ ID Nr. 4), 5'PuG/GNCCPy3' (SEQ ID Nr. 5) und 5'CACNNN/GTG3' (SEQ ID Nr. 6). Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'G/AATTC3' (SEQ ID Nr. 7) erkennt.
Eine zweite Komponente von bakteriellen/viralen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methylasen. Diese Enzyme koexistieren mit Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder DNA zu unterscheiden.
Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid in der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N₄-Methyl-Cytosin oder N₆-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich.
Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich. Während und nach der DNA-Replikation ist gewöhnlich auch die halbmethylierte DNA (auf einem Strang methylierte DNA) gegen den kognaten Restriktionsverdau resistent.
Mit dem Fortschritt der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines effizienten Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb genomischer DNA-Bibliotheken, d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschten Klone mit Nicht-Methylase-Inserts zerstört werden, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Es wurde eine große Zahl von Restriktions-Modifikationssystemen des Typs II kloniert. Das erste Klonierungsverfahren nutzte eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178:717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)). Da die Expression von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standzuhalten, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur begrenzt Erfolg hat. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand verleihen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz beinhaltet das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsvektoren (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12:3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501-509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene 202:83-88 (1997)).
Gemäß einem dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13:6403-6421 (1985)). Da Restriktionsmodifikationsgene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion ergibt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyl et al., Gene 10:219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20:197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21:111-119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258:1235-1241 (1983)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von thermostabilen Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstamms von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22:2399-2403 (1994)). Bei diesem Verfahren werden die E. coli SOS-Reaktionssignale im Anschluss an einen DNA-Schaden genutzt, der durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht wird. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (TagI, Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535, 1996). Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass einige positive blaue Klone, die ein Restriktionsendonucleasegen enthalten, infolge des Fehlens des zugehörigen Methylasegens schwer zu kultivieren sind.
Es gibt drei Hauptgruppen von DNA-Methyltransferasen auf der Basis der Position und der modifizierten Base (C5 Cytosinmethylasen, N4 Cytosinmethylasen und N6 Adeninmethylasen). N4 Cytosin- und N6 Adeninmethylasen sind Aminomethyltransferasen (Malone et al. J. Mol. Biol. 253-618-632 (1995)). Wird ein Restriktionsort auf der DNA durch die Methylase modifiziert (methyliert), dann ist er gegen einen Verdau durch die zugehörige Restriktionsendonuclease resistent. Manchmal kann eine Methylierung durch eine nicht zugehörige Methylase dem DNA-Ort ebenfalls Resistenz gegen einen Restriktionsverdau verleihen. So kann z.B. eine Dcm Methylasenmodifikation von 5'CCWGG3' (SEQ ID Nr. 8) (W = A oder T) kann die DNA auch resistent gegen einen PspGI Restriktionsverdau machen. Ein weiteres Beispiel ist, dass CpM Methylase das CG Dinucleotid modifizieren und den NotI Ort (5'GCGGCCGC3') (SEQ ID Nr. 9) gegen NotI Verdau widerstandsfähig machen kann (New England Biolabs' Katalog, 2000-01, Seite 220). Folglich können Methylasen als ein Werkzeug zum Modifizieren bestimmter DNA-Sequenzen verwendet werden, damit sie von Restriktionsenzymen nicht gespalten werden können.
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es ein starkes kommerzielles Interesse daran, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren der BsmBI Restriktionsendonuclease von Bacillus stearothermophilus B61 in E. coli durch Methylaseselektion und inverse PCR. Ein Methylasegen mit hoher Homologie zu C₅ Methylase wurde in einer DNA-Bibliothek nach der Methylaseselektion gefunden. Ein zweites Methylasegen mit hoher Homologie zu Aminomethylasen (N₆-Adenosinmethylasen) wurde nach dem Sequenzieren der genomischen DNA gefunden, die das erste Methylasegen umgibt. Später wurde festgestellt, dass diese beiden Gene miteinander verschmolzen sind und ein einzelnes Fusionsprotein kodieren. Dieses Fusionsgen wurde BsmBI Methylasegen (bsmBIM) genannt. Das bsmBIM Gen wurde durch PCR amplifiziert und in pACYC184 kloniert. Der zuvor modifizierte Wirt ER2744 [pACYC-BsmBIM] wurde zur BsmBI Endonucleaseexpression verwendet.
Die Expression der BsmBI Endonuclease in Expressionsvektoren mittlerer Kopienzahl erwies sich als schwierig. Als PCR DNA mit dem bsmBIR Gen mit pAII17 oder pET21at ligiert wurde, wurden keine aktiven Klone mit dem korrekten Insert gefunden, was in einer Untermethylierung von BsmBI Orten im E. coli Genom oder den Vektoren begründet sein kann.
Zum Konstruieren eines stabilen Expressionsklons wurde das bsmBIM Gen durch PCR amplifiziert und in pBR322 kloniert, wodurch der zuvor modifizierte Wirt ER2744 [pBR322-BsmBIM] hervorgebracht wurde. Das bsmBIR Gen wurde durch PCR amplifiziert und in pACYC-T7ter mit kompatiblen Enden eingefügt. Es wurde eine hohe BsmBI Endonucleaseaktivität nachgewiesen. Der Expressionsklon ER2744 [pBR-BsmBIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] war jedoch nicht sehr stabil, da eine geringere BsmBI Aktivität in größeren amplifizierten Kulturen nachgewiesen wurde. Zur weiteren Stabilisierung des Expressionsklons wurden zwei Strategien angewendet:

a. Einführen eines weiteren Plasmids, das das T7 lysS Gen trägt, das T7 Lysozym kodiert, das T7 RNA Polymerase inhibiert und folglich die konstitutive Expression vom T7 Promotor reduziert.
b. Verwenden einer nicht zugehörigen Methylase, BsmAI Methylase, zum Vormodifizieren des Expressionswirts (BsmAI Methylaseerkennungssequenz 5'GTCTC3'N₁/N₅ (SEQ ID Nr. 27).

Es wurden zwei Produktionsstämme konstruiert. Der erste war ER2566 [pBR322-BsmBIM, pCEF8, pACYC-T7ter-BsmBIR]. Der zweite Stamm war ein zuvor durch eine nicht zugehörige Methylase, BsmAI Methylase, modifizierter Stamm ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsmBIR]. Dieser zweite Stamm erzeugte die höchste BsmBI Produktionsausbeute in amplifizierten großen Kulturen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Genorganisation des BsmBI Restriktionsmodifikationssystems; bsmBIR, BsmBI Restriktionsendonucleasegen; bsmBIM, BsmBI Methylasegen.
2. DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 10) des BsmBI Methylasegens (bsmBIM, 3207 bp) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 11).
3. DNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 12) des BsmBI Endonucleasegens (bsmBIR, 1593 bp) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 13).
4. Aktivität rekombinanter BsmBI Endonuclease im Zellextrakt. Bahn 1–7, λ DNA behandelt mit Zellextrakt, der rekombinante BsmBI Restriktionsendonuclease enthält. Die Verdünnungsfaktoren in den Bahnen 1 bis 7 waren: 1x, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000. Bahn 8, λ DNA; Bahn 9 λ DNA verdaut mit gereinigter nativer BsmBI.
5. Gereinigte rekombinante BsmBI Endonuclease.
Bahn 1–4: 1 μl, 3 μl, 5 μl und 10 μl gereinigte BsmBI Endonuclease nach einer Reinigung durch eine Heparin 5PW Säule; Bahn 5: Proteingrößenmarker. Die vorhergesagte Größe der BsmBI Endonuclease beträgt 62 kDa. Die scheinbare Größe der BsmBI Endonuclease auf dem SDS-PAGE-Gel is ~60 kDa.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das bsmBIM Gen wurde zuerst durch Methlyaseselektion kloniert. Nach dem Sequenzieren des gesamten Gens wurde es von der genomischen DNA durch PCR amplifiziert. Nach einem Verdau mit BamHI und SalI wurde die PCR DNA mit pACYC184 ligiert. Fünf Klone, die das Plasmid pACYCl84-BsmBIM enthielten, wiesen völlige Resistenz gegen BsmBI-Spaltung auf. Kompetente Zellen ER2744 [pACYC-BsmBIM] wurden präpariert und zur BsmBI Endonucleaseexpression verwendet.
Die Expression der BsmBI Endonuclease in Expressionsvektoren mittlerer Kopienzahl erwies sich als schwierig. Das bsmBIR Gen wurde durch PCR amplifiziert und mit NdeI und BamHI über Nacht verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA in pA1117 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BsmBIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. Mini-Präparationen von einer großen Zahl von Transformanten ermittelten keine positiven Klone mit dem Insert korrekter Größe. Man folgerte, dass die Klonierung und Expression des bsmBIR Gens im Plasmid mittlerer Kopienzahl pAII17 mit ColEI Ursprung schwierig war.
Die restlichen gereinigten PCR-Produkte des bsmBIR Gens wurden mit NdeI und BamHI verdaut. Nach der Reinigung wurde die PCR DNA in pET21at mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BSmBIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R CM^R Transformanten selektiert. Wieder wurde eine große Zahl von Transformanten im Hinblick auf das Insert gescreent. Es wurden keine Klone mit dem gewünschten Insert gefunden. Das bsmBIR Gen schien toxisch zu sein, als es von einem Plasmid mittlerer Kopienzahl (pAII17 oder pET21a) exprimiert wurde, was in einer Untermethylierung von BsmBI Orten im E. coli Genom oder den Vektoren begründet sein kann.
Eine weitere Expressionsstrategie, die sich alternativ als erfolgreich erwies, umfasste die Expression des BsmBI Endonucleasegens, wobei das Methylasegen in pBR322 exprimiert und das Endonucleasegen in pACYC-T7ter exprimiert wurde. Das Plasmid pACYC-T7ter enthielt einen T7 Promotor, p15A Replikationsstartpunkt (niedrige Kopienzahl, 5–8 Kopien pro Zelle) und vier Kopien von Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des T7 Promotors.
Das BsmBI Restriktionsendonucleasegen wird unter Anwendung der folgenden Schritte in E. coli kloniert und exprimiert:
1. Konstruktion von ApoI-, NlaIII- und Sau3AI-partiellen genomischen DNA-Bibliotheken
NlaIII und Sau3AI Genombibliotheken wurden mit dem Vektor pUC19 konstruiert. Die NlaIII und Sau3AI Genombibliotheken wurden mit BsmBI in Kontakt gebracht und die resistente zirkuläre DNA wurde zum Transformieren kompetenter ER2502 Zellen verwendet. Plasmid-DNA wurde von den Transformanten präpariert und im Hinblick auf BsmBI Verdau gescreent. Es wurden drei gegen BsmBI Verdau resistente Klone identifiziert. Das Insert in einem der Klone wurde sequenziert, ein fusioniertes Methylasegen wurde gefunden und bsmBIM Gen genannt. Ein teilweises ORF befand sich stromabwärts des Methylasegens.
2. Verwendung inverser PCR zur Amplifikation der bsmBIR Gensequenz
Zum Erlangen der angrenzenden DNA-Sequenz jenseits des bsmBIM Gens wurde die genomische DNA mit AatII, AluI, BsaHI, BsaWI, BspHI, BsrGI, DraI, EcoRV, HindIII, Hyp94I, HpyCH4IV, PsiI, SspI, TagI, TseI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde ligiert und dann zur inversen PCR Amplifikation des bsmBIR Gens verwendet. Inverse PCR-Produkte von AatII, HindIII, PsiI und XbaI Matrizen wurden von leicht schmelzender Agarose gelgereinigt und direkt sequenziert. Ein ORF von 1593 bp wurde stromabwärts des bsmBIM Gens gefunden. Dieses ORF wurde bsmBIR Gen genannt. Es kodiert ein 530-aa Protein mit vorhergesagter relativer Molekülmasse von 62 kDa.
3. Klonierung von bsmBIM in pBR322 zum Konstruieren eines zuvor modifizierten Wirts
Zum Verstärken der BsmBI Methylaseexpression im Expressionswirt wurde bsmBIM PCR DNA mit BamHI verdaut und SalI wurde in pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente ER2566 Zellen transformiert. Es wurden drei gegen BsmBI Spaltung völlig resistente Klone identifiziert, die das Insert korrekter Größe hatten. Die Zellen wurden dann durch eine CaCl₂-Behandlung kompetent gemacht, woraus ein zuvor modifizierter Wirt ER2566 [pBR322-BsmBIM] hervorging.
4. Expression des bsmBIR Gens im T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter
Das bsmBIR Gen wurde durch PCR amplifiziert und mit BamHI verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA in pACYC-T7ter mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pBR322-BsmBIM) transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. ER2744 ist ein E. coli K-Stamm-Derivat, das das T7 RNA Polymerasegen auf Chromosom trägt (NEB-Stammsammlung). Man fand neun Klone, die das gewünschte Insert trugen. Von den 9 Klonen wurden Zellextrakte präpariert und im Hinblick auf BsmBI-Aktivität untersucht. Zwei Klone, Nr. 24 und Nr. 26, wiesen eine hohe BsmBI-Aktivität auf. Der Expressionsklon ER2744 [pBR- BsmBIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] war nicht stabil, da eine geringere BsmBI-Aktivität in größeren amplifizierten Kulturen nachgewiesen wurde. Für eine weitere Stabilisierung des Expressionsklons wurden zwei Strategien angewendet:

a. Einführen eines weiteren Plasmids, das das T7 lysS Gen trägt, das T7 Lysozym kodiert, das T7 RNA Polymerase inhibiert und folglich die konstitutive Expression vom T7 Promotor reduziert.
b. Verwenden einer nicht zugehörigen Methylase, BsmAI Methylase, zum Vormodifizieren des Expressionswirts.

5. Konstruktion des zuvor modifizierten Wirts ER2566 [pBR322-BsmBIM, pCEF8]
Kompetente ER2566 Zellen [pBR322-BsmBIM] wurden mit pCEF8 (Km^R) transformiert. Das Plasmid pCEF8 trägt den pSC101 Ursprung und das lysS Gen, das T7 Lysozym kodiert. Ap^R, Km^R Transformanten wurden amplifiziert und durch Waschen mit kaltem CaCl₂ kompetent gemacht. ER2566 ist ein T7 Expressionswirt, der vom E. coli B-Stamm gewonnen wurde. ER2566 trägt außerdem das T7 RNA Polymerasegen auf Chromosom (NEB-Stammsammlung). Zum Reduzieren der PCR-Mutationsrate wurde das bsmBIR Gen durch PCR mit 13 PCR-Zyklen von genomischer DNA reamplifiziert und in den Expressionsvektor pACYC-T7ter rekloniert. Der zuvor modifizierte Wirt war ER2566 [pBR322-BsmBIM, pCEF8]. Das bsmBIR Endonucleasegen, das das Plasmid pACYC-T7ter-BsmBIR enthielt, wurde im Plasmid-Mini-Screening gefunden. IPTG-induzierte Zellextrakte wurden von Klonen mit dem Insert präpariert und im Hinblick auf BsmBI Endonucleaseaktivität untersucht.
6. Expression von BsmBI Endonuclease im mit BsmAI Methylase zuvor modifizierten Wirt
Die Erkennungssequenz von BsmAI und BsmBI ist jeweils 5'GTCTC3'N₁/N₅ (SEQ ID Nr. 27) und 5'CGTCTC3'N₁/N₅ (SEQ ID Nr. 1). BsmAI Orte sind eine Teilmenge von BsmBI Orten. Sowohl BsmAI Methylase als auch BsmBI Methylase sind eine Fusion von zwei Methylasen (N⁶A Methylase verschmolzen mit C₅ Methylase). Auf der Basis der Aminosäuresequenzhomologie zwischen BsmAI und BsmBI Methylasen und der Ähnlichkeit der DNA-Erkennungssequenzen der beiden Methylasen wurde vorhergesagt, dass BsmAI Methylase möglicherweise E. coli Genom-DNA vor BsmBI-Spaltung schützt. Das Expressionsplasmid pACYC-T7ter-BsmBIR wurde in ER2566 [pBR322-BsmAIM] transformiert (BsmAI, US-Anmeldung, Seriennummer 09/957,005). Zellextrakt von nicht induzierter, induzierter und induzierter/erwärmter (auf 55°C und 65°C) Kultur wurde im Hinblick auf BsmBI Aktivität untersucht. Die höchste Aktivität wurde im Extrakt der IPTG-induzierten Kultur und der auf 55°C erwärmten induzierten Kultur nachgewiesen. Die Ausbeute lag bei etwa > 10⁶ Einheiten pro Gramm nasser Zellen.
Das Proteinexpressionsprofil der nicht induzierten, induzierten und induzierten/erwärmten (auf 55°C und 65°C) Kultur wurde durch SDS-PAGE analysiert. Eine Proteinbande von ~60 kDa wurde in den induzierten Kulturextrakten nachgewiesen, lag im nicht induzierten Kulturextrakt jedoch nicht vor.
7. Reinigung der BsmBI Endonuclease auf Homogenität
Fünfundsiebzig Gramm IPTG-induzierte Zellen ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] wurden durch Beschallung lysiert. Der geklärte Zellextrakt wurde 20 Minuten lang auf 59–61°C erwärmt. Die hitzedenaturierten Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. BsmBI Endonuclease wurde auf fast Homogenität durch Heparin-Hyper-D-, Source-Q15-HR- und Heparin-5PW-Säulen mit einem Äkta^® FPLC-System gereinigt. Die gereinigte BsmBI Endonuclease hat eine scheinbare relative Molekülmasse von ~60 kDa auf SDS-PAGE im Vergleich zur vorgesagten Größe von 62 kDa.
Die vorliegende Erfindung ist in den beigefügten Ansprüchen definiert und wird anhand des folgenden Beispiels weiter illustriert.
1. BEISPIEL
Klonierung der BsmBI Methylase- und Restriktionsendonucleasegene in E. coli
1. Präparation genomischer DNA
Die genomische DNA von Bacillus stearothermophilus B61 (New England Biolabs Collection NEB Nr. 857) wurde durch Resuspendieren von 9,2 g Zellpaste in 50 ml von 25 Saccharose, 50 mM Tris-HCl durch 10-minütiges sanftes Schütteln präpariert. Die Zelllyse wurde durch Zugabe von sechs ml an frisch präpariertem 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0) abgeschlossen und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Fünf ml 0,25 M EDTA (pH 8,0) wurden dann zur Suspension gegeben und die Suspension wurde anschließend mit einer sauberen Pipette langsam vermischt. Die EDTA chelatisiert bivalente Kationen und inaktiviert unspezifische Endo/Exonucleasen. Die Zelllyse wurde durch Zugabe von SDS zu 1 % Endkonzentration weiter verbessert. Sechsunddreißig ml Lysepuffer (1 % Triton-X 100, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,62 M EDTA) wurden zugegeben und durch sanftes Schwenken vermischt. Die viskose lysierte Zellsuspension wurde mit 120 ml äquilibriertem Phenol extrahiert, die wässrige Phase wurde gewonnen und dieser Schritt wiederholt. Der Überstand wurde unter Zugabe von 100 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA) verdünnt, um die Viskosität zu verringern. Daraufhin folgte eine einmalige Extraktion mit 220 ml Phenol und eine einmalige Extraktion mit 200 ml Chloroform, wobei die DNA nach der Zentrifugation gewonnen wurde, um sie vom Chloroform zu trennen. Der Überstand wurde dann 4 Mal in 2– 4 l TE-Puffer bei 4°C dialysiert. RNase A (150 μl von 10 mg/ml Vorrat) wurde zur resultierenden 150-ml-Lösung gegeben und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3M NaOAc und 1 Volumen Isopropanol präzipitiert und dann durch Zentrifugation aufgefangen. Das DNA-Pellet wurde 30 Minuten lang an der Luft getrocknet und dann in 20 ml TE-Puffer durch 30-minütiges sanftes Schütteln auf eine Endkonzentration von etwa 250 μg/ml resuspendiert.
2. Teilverdau genomischer DNA
Die gereinigte DNA wurde mit ApoI, NlaIII und Sau3AI gespalten, um einen Teilverdau wie folgt zu erreichen: drei 500-μl-Lösungen wurden aus Bacillus stearothermophilus DNA zu 100 μg/ml hergestellt; eine in NEB-Puffer 3 + BSA (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA, pH 7,9 bei 25°C), eine in NEB-Puffer 4 + BSA (50 mM K-Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA, pH 7,9 bei 25°C) und eine in NEB-Puffer Sau3AI + BSA (100 mM NaCl, 10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA, pH 7,0 bei 25°C). Jede Lösung wurde in einen 200-μl-Aliquot und drei 100-μl-Aliquote unterteilt. Zu jedem 200-μl-Röhrchen wurden 2 μl des jeweiligen Enzyms (8 Einheiten ApoI, 20 Einheiten NlaIII und 8 Einheiten Sau3AI) gegeben, um 1 Einheit Enzym pro 2,5 μg DNA für beide Reaktionen mit ApoI und Sau3AI und 1 Einheit Enzym pro μg DNA für die Reaktion mit NlaIII zu erhalten. Einhundert μl wurden von jedem 200-μl-Aliquot genommen und zum zweiten Aliquot des gleichen Puffers gegeben, um 1 Einheit Enzym pro 5 μg DNA für die Reaktionen mit ApoI und Sau3AI und 1 Einheit Enzym pro 2 μg DNA für die Reaktion mit NlaIII zu erhalten, usw., wobei jedes folgende Röhrchen die Hälfte der vorherigen Menge des entsprechenden Enzyms aufnahm. Die ApoI-Röhrchen wurden bei 50°C inkubiert und NlaIII- und Sau3AI-Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert und 5 μl von jedem Röhrchen wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Dieses Verfahren wurde für NlaIII wiederholt, mit der Ausnahme, dass NlaIII vor der Zugabe zum Reaktionsgemisch vierfach verdünnt wurde, woraus sich 1 Einheit Enzym je 4 μg DNA im ersten Röhrchen, 1 Einheit Enzym pro 8 μg DNA im zweiten Röhrchen usw. ergab. Der Inhalt der Röhrchen, der einen begrenzten Verdau und einen mäßigen, aber unvollständigen Verdau aufwies, wurde auf einem 1%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt 2 Stunden lang laufen gelassen. DNA-Fragmente zwischen etwa 1 kb und 8 kb wurden von dem Gel exzidiert und gewogen. Zu jeder Bande wurde 1/10 Volumen β-Agarasepuffer (10 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,8, 1 mM Na₂EDTA) gegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 65°C. Die Agarose wurde mit 1/100 Volumen β-Agarase mit einer 90-minütigen Inkubation bei 42°C verdaut. Als sie auf Eis gegeben wurden, schienen die Lösungen gelatineartig zu werden. Folglich wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 65°C und dann 5 Minuten lang bei 42°C weiter inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1/100 Volumen β-Agarase und einer 90-minütigen Inkubation bei 42°C. Die DNA wurde präzipitiert durch die Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaOAc, 15-minütige Inkubation auf Eis und Zugabe von 2 Volumen Ethanol über Nacht. Die Lösung wurde dann zentrifugiert, dekantiert und das DNA-Pellet wurde in 20 μl TE resuspendiert, und jeweils 1 μl wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
3. Konstruktion von ApoI-, NlaIII- und Sau3AI-partiellen und -kompletten genomischen DNA-Bibliotheken
ApoI, NlaIII und Sau3AI Genom-Bibliotheken wurden mit dem Vektor pUC19 konstruiert. Etwa 0,5 μg (3 μl) von jeweils mit ApoI, NlaIII und Sau3AI teilweise verdauter Bacillus stearothermophilus DNA, wie oben beschrieben, wurden mit ~0,1 μg pUC19 vermischt, der jeweils mit EcoRI, SphI und BamHI verdaut und CIP-behandelt worden war. Zu jedem Röhrchen wurden 5 μl 10 X Ligationspuffer und 1 μl (400 Einheiten) T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 50 μl gegeben. Die Reaktionsgemische wurden über Nacht bei 16°C inkubiert. Die T4 DNA-Ligase wurde 30 Minuten lang bei 65°C hitzeinaktiviert und der Inhalt jedes Röhrchens wurde dann in 2 l dH₂O mit Filterpapier Typ VS 0,025 μm 4 Stunden lang tropfendialysiert, um die Salzkonzentration zu reduzieren, woraus sich ein Endvolumen von jeweils etwa 75 μl ergab.
4. Selektion von M.BsmBI durch das Methylaseselektionsverfahren
Für ein Transformationsexperiment wurden 2 μl von jeder der dialysierten DNA-Bibliotheken, wie oben beschrieben, in ER2502 durch Elektroporation mit einem BioRad Gene Pulser, eingestellt auf eine Kapazität von 25 μF, eine Spannung von 2,5 kV und einen Widerstand von 200 Ω, transformiert. LB-Nährlösung (0,5 ml) wurde in jedes Röhrchen gegeben und dann 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Der Inhalt jedes Röhrchens wurde auf Ap-Platten verteilt und über Nacht bei 37°C inkubiert, um Transformanten von pUC19 mit genomischen ApoI-, NlaIII- und Sau3AI-Fragmentinserts zu selektieren.
Etwa 1000 Transformanten wurden für die NlaIII Bibliothek erhalten und etwa 900 Transformanten wurden für die Sau3AI Bibliothek erhalten. Es wurden keine Ap^R Transformanten von der ApoI Bibliothekentransformation erhalten. Die Transformanten von den NlaIII und Sau3AI Bibliotheken wurden gepoolt und jeweils in 1 Liter LB + Ap Übernachtkulturen bei 37°C amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen durch das Qiagen^® Maxi-Säulenverfahren präpariert. Ein, 2, 5 und 10 μl (~0,2 μg, 0,4 μg, 1 μg, 2 μg DNA) von jeder Plasmidbibliothek wurden _mit BsmBI über Nacht bei 55°C in Kontakt gebracht. Nach dem BsmBI-Verdau wurden 5 μl von jedem der Verdaus zurück in jeweils 100 μl kompetente ER2502 und ER2683 Zellen mit dem Standardverfahren transformiert (Vermischen von 100 μl kompetenten Zellen und Plasmid-DNA, 30 min auf Eis, 5 min bei 37°C, 5 min bei Raumtemperatur, Zugeben von 100 μl SOB, 1-stündiges Inkubieren bei 37°C). Die Transformationsprodukte wurden auf Ap-Platten bei 37°C über Nacht kultiviert. Zwei ml LB + Ap wurden mit individuellen Ap^R Kolonien (33 von ER2683 Zellen, 3 von ER2502 Zellen) inokuliert. Von jeder Plasmid-Mini-Präparation wurde 1 μg (5 μl) im Hinblick auf Resistenz durch Inkubation mit 30 Einheiten (3 μl) BsmBI 1 Stunde lang bei 55°C gescreent und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Es wurden drei gegen BsmBI Verdau resistente Klone identifiziert. Von diesen drei Klonen hatten zwei Inserts. Der völlig resistente Klon (BsmBIM-positiv) stammte von der NlaIII-partiellen Bibliothek. Man folgerte, dass entweder das Fragment das bsmBIM Gen enthielt oder pUC19 seine BsmBIM Orte verloren hatte. (Später, als das Insert sequenziert wurde, wurde bestätigt, dass es die BsmBI-Methylase kodiert und dass die BsmBI Orte im Vektor intakt waren).
5. Sequenzierung des bsmBIM Gens
Das bsmBIM Gen wurde durch Einfügen von Priming-Orten des GPS^TM-1 Genom-Primingsystems (New England Biolabs^®) und Primer-Walking sequenziert. Das bsmBIM Gen umfasst 3207 bp und kodiert ein 1068-aa Fusionsprotein mit vorhergesagter relativer Molekülmasse von 122,4 kDa. Ein Sequenzvergleich mit anderen Methylasen in der GenBank zeigte, dass M.BsmBI ein Fusionsprotein ist, das Ergebnis der Fusion einer Amino-Methylase (N₆A Methylase) und einer C₅-Methylase. Während der Sequenzierung des bsmBIM Gens wurde ermittelt, dass sich das Restriktionsgen (bsmBIR) wahrscheinlich stromabwärts des bsmBIM Gens befand, da sich ein partieller ORF (der, wie später ermittelt wurde, 1587 bp umfasste) dort befand. Dies wurde angenommen, weil man feststellte, dass das Restriktionsgen und die Modifikationsgene in den meisten bisher gefundenen Restriktionsmodifikationssystemen innerhalb von ein paar hundert Basenpaaren zueinander liegen.
6. Klonierung des bsmBIM Gens in pACYC184 und pLG339 zum Konstruieren eines zuvor modifizierten Wirts
Drei Primer wurden mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
5'taaggatccggaggtaaataaatgaactccttatcactaaaagatgaa3'
(249-164) (SEQ ID NO: 14)
5'atgaaagtcgaccccgtaattttacgggcttttttaaaa3'
(249-165) (SEQ ID NO: 15)
5'tatggatccggaggtaaataaatgaaagtaatactgaatgatttagaa3'
(249-255) (SEQ ID NO: 16)
Das bsmBIM Gen wurde erfolgreich von der genomischen DNA durch PCR mit den Primern 246-164 und 249-165 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C, 5 min, 1 Zyklus, 95°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 5 min, 27 Zyklen, mit Vent DNA-Polymerase. Die PCR DNA wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt, mit BamHI und SalI verdaut und mit CIP-behandeltem pACYC184 und pLG339 mit kompatiblen Enden mit dem Ziel ligiert, die PCR DNA in die Mitte des Tetracyclin-(Tc)-Resistenzgens einzufügen.
Der Vektor pACYC184 mit dem ligierten bsmBIM Gen wurde mit dem Standardverfahren in E. coli ER2683 transformiert und auf Chloramphenicol-(CM)-Platten plattiert. pLG339 mit dem ligierten bsmBIM Gen wurde mit dem Standardverfahren in E. coli ER2502 transformiert und auf Kanamycin-(Km)-Platten kultiviert. Transformanten wurden auf Tc-Empfindlichkeit jeweils auf Cm + Tc Platten und Km + Tc Platten getestet.
Klone mit Inserts im Tc-Resistenzgen müssten Tc- Empfindlichkeit aufgrund der Einfügung des Inserts in die Mitte des Tc-Resistenzgens aufweisen.
Gereinigte bsmBIM PCR DNA wurde mit BamHI und SalI verdaut und mit CIP-behandeltem pACYC184 und pLG339 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte pLG339-BsmBIM wurde mit dem Standardverfahren in ER2502 transformiert und auf Km-Platten kultiviert. Die ligierte pACYC184-BsmBIM wurde mit dem Standardverfahren in ER2502 transformiert und auf Cm-Platten kultiviert. Kolonien der Km-Platten wie auch der Cm-Platten wurden dann jeweils auf Km + Tc Platten und Cm + Tc Platten inokuliert. Achtzehn Kolonien von den Km + Tc Platten und 18 Kolonien von den Cm + Tc Platten, die Tc-Empfindlichkeit aufwiesen, wurden jeweils in LB + Km und LB + Cm inokuliert. Mini-Präparations-DNA von jeder dieser Kulturen wurde mit BsmBI verdaut, um im Hinblick auf Spaltungsresistenz zu testen. Von den 18 Klonen mit dem Plasmid pLG339 (von Km-haltigen Platten) wiesen 4 völlige Resistenz gegen Spaltung auf, 3 wiesen teilweise Resistenz gegen Spaltung auf und 11 wiesen keine Resistenz gegen Spaltung auf. Von den 18 Klonen mit dem Plasmid pACYC184 (von Cm-haltigen Platten) wiesen 6 völlige Resistenz gegen Spaltung auf, 4 wiesen teilweise Resistenz gegen Spaltung auf und 8 wiesen keine Resistenz gegen Spaltung auf.
Plasmide von fünf der sechs pACYC184 Klone, die völlige Resistenz gegen Spaltung aufwiesen, wurden mit BamHI und SalI zerschnitten, um die Insertgröße zu prüfen. Alle fünf Klone hatten ein Insert von etwa 3,2 kb, der Größe des bsmBIM Gens. Es wurde gefolgert, dass diese Klone M.BsmBI-positiv waren, da sie sowohl völlige Resistenz gegen Spaltung durch BsmBI als auch ein Insert mit der Größe des bsmBIM Gens aufwiesen. Von vier dieser fünf M.BsmBI-positiven Klone wurde Mini-Präparations-DNA in ER2744 mit dem Standardverfahren transformiert und auf Cm-Platten kultiviert. Die resultierenden Transformanten wurden in LB-Nährlösung + Cm kultiviert, zentrifugiert und durch eine Behandlung mit kaltem CaCl₂ kompetent gemacht, woraus ein zuvor modifizierter Wirt ER2744 [pACYC-BsmBIM] hervorging.
7. Klonierung des bsmBIR Gens durch inverse PCR und Sequenzierung des bsmBIR Gens
Es wurden sieben Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
5'cccataaagcccgcacttgccatg3' (249-33) (SEQ ID Nr. 17)
5'tgacgatgattccaaattacttag3' (249-34) (SEQ ID Nr. 18)
5'ctttccctaaagctacttaattgaact3' (249-256) (SEQ ID Nr. 19)
5'ttataacaacaatacacaagctttccc3' (249-257) (SEQ ID Nr. 20)
5'tcttaccccatccttcagacaaac3' (250-55) (SEQ ID Nr. 21)
5'aagacccagggcgacatgacgataa3' (250-56) (SEQ ID Nr. 22)
5'tgtatatggacatattggaaagat3' (250-57) (SEQ ID Nr. 23)
Die genomische DNA wurde mit AatII, AluI, BsaHI, BsaWI, BspHI, BsrGI, DraI, EcoRV, HindIII, Hyp94I, HpyCH4IV, PsiI, SspI, TaqI, TseI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde mit einer niedrigen DNA-Konzentration von 2 μg/ml ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des bsmBIR Gens mit den Primern 249-33 und 249-34 verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren: 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 1 min, 35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden von AatII, AluI, BsrGI, DraI, HindIII, PsiI, TaqI und XbaI Matrizen hergeleitet. Inverse PCR-Produkte von AatII, HindIII, PsiI und XbaI Matrizen wurden von leicht schmelzender Agarose gelgereinigt und mit den Primern 249-33 und 249-34 sequenziert. Eine weitere Sequenzierung der PsiI und XbaI Fragmente fand mit den Primern 249-223 und 229-224 statt. Die PCR wurde dann unter Verwendung von genomischer DNA und den Primern 249-33 und 249-256 sowie den Primern 249-33 und 249-257 unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C, 5 min, 1 Zyklus, 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 2 min, 25 Zyklen. PCR- Produkte wurden von leicht schmelzender Agarose gelgereinigt und mit den Primern 249-33, 250-55, 250-56 und 250-57 sequenziert. Ein ORF von 1547 bp wurde stromabwärts des bsmBIM Gens gefunden. Dieses ORF wurde bsmBIR Gen genannt. Es kodiert ein 530-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 62 kDa.
8. Expression des bsmBIR Gens im T7 Expressionsvektor pAII17
Zwei Primer wurden mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
5'gggtagattcatatggctaaatacggacgtggaaagttt3'
(250-88) (SEQ ID NO: 24)
5'gctggatcctcatataatctttagcaatctgctccc3'
(250-89) (SEQ ID NO: 25)
Das bsmBIR Gen wurde durch PCR mit Vent DNA-Polymerase und den Primern 250-88 und 250-89 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C, 2 min, 1 Zyklus, 95°C, 1 min, 60°C, 1 min, 72°C, 2 min, 20 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden mit einer Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA in pAII17 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BsmBIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. Unter 54 Plasmid-Mini-Präparationen trugen keine Klone das gewünschte Insert. Es wurde gefolgert, dass die Klonierung und Exprimierung des bsmBIR Gens in einem Plasmid mittlerer Kopienzahl schwierig war.
9. Expression des bsmBIR Gens im T7 Expressionsvektor pET21at
Die restlichen gereinigten PCR-Produkte des bsmBIR Gens wurden mit NdeI und BamHI verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA in pET21at mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BsmBIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. Von 36 gescreenten Plasmiden trugen keine Klone das gewünschte Insert.
Die bsmBIR Genamplifikation durch PCR wurde mit Vent DNA-Polymerase und den Primern 250-88 und 250-89 unter den folgenden Bedingungen wiederholt: 95°C, 2 min, 1 Zyklus, 95°C, 1 min, 60°C, 1 min, 72°C, 2 min, 20 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden durch Phenol-CHCl₃-Extraktion gereinigt und mit NdeI und BamHI verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA in pET21at mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pACYC-BsmBIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. Unter 22 Plasmid-Mini-Präparationen trugen keine Klone das gewünschte Insert. Es wurde gefolgert, dass die Klonierung des bsmBIR Gens im pET Vektor wahrscheinlich infolge einer Untermethylierung von BsmBI Orten im E. coli Genom oder dem Vektor schwierig ist.
10. Klonierung von bsmBIM in pBR322 zum Konstruieren eines zuvor modifizierten Wirts
Die nächste Expressionsstrategie war die Expression des bsmBIM Gens in einem Plasmid mittlerer Kopienzahl und die Expression des bsmBIR Gens in einem Plasmid geringer Kopienzahl. Zum Verstärken der BsmBI Methylaseexpression im Expressionswirt wurde mit BamHI und SalI verdaute bsmBIM PCR DNA in pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente ER2566 und kompetente ER2683 transformiert und auf Ampicillin-Platten kultiviert. Unter 18 Plasmid-Mini-Präparationen waren 3 Klone völlig gegen BsmBI-Spaltung resistent und wiesen das Insert korrekter Größe auf. Die Zellen wurden dann durch eine Behandlung mit kaltem CaCl₂ kompetent gemacht, woraus sich ein zuvor modifizierter Wirt ER2566 [pBR322-BsmBIM] ergab.
11. Expression des bsmBIR Gens im T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter
Es wurde ein Primer mit der folgenden Sequenz sequenziert:
5'aagggatccggaggtaaataaatggctaaatacggaaagttt3'
(252-270) (SEQ ID NO: 26)
Das bsmBIR Gen wurde durch PCR mit Vent DNA-Polymerase und den Primern 252-70 und 250-89 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C, 2 min, 1 Zyklus, 95°C, 1 min, 60°C, 1 min, 72°C, 2 min, 20 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden durch Phenol-CHCl₃-Extraktion gereinigt und mit BamHI verdaut. Nach der DNA-Reinigung wurde die PCR DNA in pACYC-T7ter mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2744 [pBR322-BsmBIM] transformiert und im Hinblick auf Ap^R Cm^R Transformanten selektiert. Unter 72 Plasmid-Mini-Präparationen trugen 9 Klone das gewünschte Insert. Alle 9 Klone wurden in 10 ml LB plus Ap und Cm kultiviert und mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 Stunden lang induziert. Zellextrakte wurden präpariert und auf BsmBI Aktivität geprüft. Zwei Klone, Nr. 24 und Nr. 26, wiesen eine hohe BsmBI Aktivität auf. Diese beiden Klone wurden in 500 ml LB plus Ap und Cm kultiviert und mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 Stunden lang induziert. Die beiden Klone Nr. 24 und Nr. 26 wiesen eine hohe BsmBI Aktivität auf. Es wurden mehr als 10⁶ Einheiten pro Gramm nasser Zellen gefunden. BsmBI weist die höchste spezifische Aktivität unter den Restriktionsenzymen des Typs IIs auf. Die Klone Nr. 24 und Nr. 26 wurden jeweils in 20 ml LB plus Ap und Cm kultiviert und jeweils 10 ml wurden mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 Stunden lang induziert. Ein ml von jeder induzierten Kultur wurde dann in drei gleiche Aliquote unterteilt; eine, die nicht erwärmt wurde, eine, die 45 Minuten lang auf 55°C erwärmt wurde, und eine, die 45 Minuten lang auf 65°C erwärmt wurde. Bei beiden Klonen wiesen alle drei induzierten Kulturaliquote und die nicht induzierte Kultur Aktivität auf. 5, 10 und 15 μl von jeder der vier Proben von beiden Klonen wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Anhand des Gels wurde ermittelt, dass ein Protein etwa mit der Größe von BsmBI (~60 kDa) in den induzierten Proben vorlag.
Der Klon Nr. 24 wurde in 500 ml LB + Ap + Cm inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Zehn ml der Übernachtzellen wurden zum Inokulieren von frischen 500 ml LB + Ap + Cm verwendet, 4 Stunden lang bei 37°C kultiviert, mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 Stunden lang induziert. Zellen wurden geerntet und auf BsmBI Aktivität geprüft. Der Extrakt wies eine für BsmBI Endonucleasespaltung charakteristische Aktivität auf, allerdings war die Ausbeute weit geringer als die kleine 10-ml-Kultur, die von frischen Transformanten kultiviert wurde. Es wurde gefolgert, dass der Expressionsklon ER2744 [pBR322-BsmBIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] kein sehr stabiler Klon war. Für eine weitere Stabilisierung des Expressionsklons wurden zwei Strategien angewendet:

12. Konstruktion des zuvor modifizierten Wirts ER2566 [pBR322-BsmBIM, pCEF8]
Das Plasmid pCEF8 trägt den pSC101 Replikationsstartpunkt und das lysS Gen, das das T7 Lysozym kodiert. Plasmid pCEF8 ist mit pBR322 und pACYC-T7ter kompatibel und kann daher in den gleichen Expressionswirt transformiert werden. Kompetente ER2566 [pBR322-BsmBIM] Zellen (100 μl) wurden mit 10 μl pCEF8 (Km^R) mit dem Standardverfahren transformiert und auf Ap + Km Platten über Nacht bei 37°C kultiviert. Ap^R, Km^R Transformanten wurden in acht 10 ml LB Ap + Km Röhrchen inokuliert, 2,5 Stunden lang bei 37°C kultiviert und durch eine Wäsche mit kaltem CaCl₂ kompetent gemacht.
13. Expression des bsmBIR Gens im T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter und in Anwesenheit von lysS
Eine PCR wurde durchgeführt, um das bsmBIR Gen mit den Primern 252-270 und 249-89 unter den folgenden Bedingungen zu amplifizieren: 1 Zyklus, 95°C, 2 min, 13 Zyklen, 95°C, 1 min, 60°C, 1 min, und 72°C, 2 min. Mit den geringen PCR-Zyklen (13 Zyklen) wurde beabsichtigt, die Mutationsrate in PCR zu reduzieren. PCR DNA wurde zweimal mit dem gleichen Volumen von Phenol-Chloroform extrahiert, einmal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, präzipitiert mit NaOAc, kaltem 95%igem Ethanol und mit kaltem 70%igem Ethanol gewaschen. Die gereinigte PCR DNA wurde dann mit BamHI bei 37°C über Nacht verdaut, 0,5 μg davon wurden in einer Ligation mit 0,1 μg pACYC-T7ter in Ligationspuffer über Nacht bei 16°C verwendet.
Ligierte Plasmid-DNA (5 μl) wurde in 100 μl ER2566 [pBR322-BsmBIM, pCEF8] transformiert und bei 37°C über Nacht auf LB + Ap + Cm + Km Platten kultiviert. Sechsunddreißig Ap^R, Cm^R, Km^R Transformanten wurden jeweils in 2 ml LB + Ap + Cm + Km inokuliert und bei 37°C über Nacht kultiviert. Ein BamHI Verdau von Mini-Präparations-DNA von den 36 Klonen zeigte, dass 24 Klone ein Insert der korrekten Größe (etwa 1,5 kb) enthielten. Ein Verdau mit NdeI und BamHI der Mini-Präparations-DNA von den 24 Klonen zeigte, dass 15 dieser Klone das bsmBIR Gen in der korrekten Orientierung aufwiesen. Die restlichen Kulturen von diesen 15 Klonen wurden in 10 ml 1 LB + Ap + Cm + Km inokuliert, 4 Stunden lang bei 37°C kultiviert, 10 Minuten lang mit 6000 rpm zentrifugiert, in 1 ml Beschallungspuffer resuspendiert, zweimal 30 Sekunden lang beschallt und 10 Minuten lang mit 14.000 rpm zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde auf Aktivität untersucht, wodurch eine BsmBI-artige Aktivität in 13 der Klone aufgedeckt wurde. Dieser neue Expressionsstamm enthielt drei Plasmide, ER2566 [pBR322-BsmBIM, pCEF8, pACYC-T7ter-BsmBIR]. Eine stille Mutation wurde im bsmBIR Gen in pACYC-T7ter-BsmBIR gefunden. Das gesamte Gen wurde sequenziert, um zu gewährleisten, dass es die Wildtyp-Aminosäuresequenz kodiert.
14. Expression der BsmBI Endonuclease im mit BsmAI zuvor modifizierten Wirt (erfindungsgemäß)
Mini-Präparations-DNA von zwei Klonen (Nr. 1 und Nr. 10) wurde in ER2566 [pBR322-BsmAIM] (BsmAI, Z.y.Zhu, J.Zhou, S.-y.Xu, USA-Patent anhängig) transformiert und über Nacht bei 30°C auf LB + Ap + Cm Platten kultiviert. Die Kolonie von jedem Klon wurde in 2,5 ml LB + Ap + Cm inokuliert und über Nacht bei 30°C kultiviert. Diese wurden dann jeweils in 10 ml LB + Ap + Cm inokuliert, 4 Stunden lang bei 30°C kultiviert, mit 0,5 mM IPTG induziert und weitere 3 Stunden lang bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden mit 12.000 rpm 10 Minuten lang zentrifugiert, in 1 ml Beschallungspuffer resuspendiert und im Hinblick auf BsmBI Aktivität geprüft. Die höchste Aktivität wurde in ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] von den drei Kulturen mit Klon Nr. 10 (10A, 10B und 10C) nachgewiesen. Klon Nr. 10B, ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] wurde in zwei 500 ml LB + Ap + Cm inokuliert, 7 Stunden lang bei 30°C kultiviert, wobei eine der Kulturen nach 4 Stunden mit 0,5 mM IPTG induziert wurde. Zellen wurden 10 Minuten lang mit 6000 rpm zentrifugiert und gewogen (1,63 g). Zellen von jeder Kultur wurden in 16 ml Beschallungspuffer resuspendiert, 10 Minuten lang beschallt und 12 Minuten lang bei 4°C mit 14.000 rpm zentrifugiert.
Von der induzierten Kultur wurde 1 ml 40 Minuten lang auf 55°C erwärmt und 1 ml wurde 40 Minuten lang auf 65°C erwärmt, woraufhin in beiden Fällen eine 10-minütige Zentrifugation mit 14.000 rpm bei 4°C folgte. Zellextrakte von der nicht induzierten, der induzierten und der induzierten & erwärmten (sowohl auf 55°C als auch 65°C) Kultur wurden auf BsmBI Aktivität untersucht und die Ergebnisse wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die höchste Aktivität lag im Extrakt von der induzierten Kultur und der auf 55°C erwärmten induzierten Kultur vor. Anhand der Aktivität des induzierten Klons und des auf 55°C erwärmten induzierten Klons wurde festgestellt, dass die Zellen etwa > 10⁶ Einheiten/g Zellen enthielten.
Proteinexpressionsprofile der nicht induzierten, der induzierten und der induzierten & erwärmten (auf 55°C wie auch auf 65°C) wurden durch SDS-PAGE analysiert. Eine Proteinbande mit etwa 60 kDa (die Größe der BsmBI Endonuclease) wurde in den induzierten Kulturextrakten nachgewiesen, lag in dem nicht induzierten Kulturextrakt jedoch nicht vor.
15. Reinigung der BsmBI Endonuclease auf Homogenität (erfindungsgemäß)
Fünfundsiebzig Gramm IPTG-induzierte Zellen ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] wurden in 260 ml Puffer A (0,1 M NaCl, 20 mM KPO₄, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanot) durch sanftes Pipettieren und Schwenken resuspendiert. Die Zellsuspensionen wurden in 2-Minuten-Intervallen beschallt und die Proteinkonzentration wurde mit einem Bradford-Assay nach jedem Intervall geschätzt. Nach 6 Beschallungsintervallen wurden die Zellen 1 Stunde lang mit 12.000 rpm zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde dann auf 59–61°C 20 Minuten lang erwärmt. Die wärmebehandelte Lösung wurde dann 30 Minuten lang mit 12.000 rpm zentrifugiert, um denaturierte Proteine zu entfernen. Eine 255 ml Heparin-Hyper-D-Säule wurde mit 4 Säulenvolumen Puffer A äquilibriert. 25-ml-Fraktionen wurden mit einem NaCl-Gradient von 0,1 M bis 1,0 M mit einer Äkta^® FPLC eluiert. Eine Äkta^®-aufgezeichnete UV-Spektoskopie der Fraktionen brachte zwei Peaks hervor, die jeweils bei etwa 0,73 und 0,85 M NaCl eluiert wurden. Ein Aktivitätsassay des Fraktionsinhalts zeigte, dass Aktivität mit dem zweiten Peak auf dem Chromatogramm zusammenfiel. Die durch SDS-PAGE analysierte Proteinzusammensetzung wies einen deutlichen Unterschied im Protein des ersten und zweiten Chromatogrammpeaks auf. Acht Fraktionen (200 ml) wurden gepoolt und mit 1,1 l Puffer C (20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol, pH 7,8) aufgrund der hohen Salzkonzentration verdünnt.
Eine 7,1 ml Source-Q15-HR-Säule wurde mit 3 Säulenvolumen Puffer A2 (0,1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol) äquilibriert. Ein-ml-Fraktionen wurden mit einem NaCl-Gradient von 0,1 M bis 1,0 M mit einer Äkta^® FPLC eluiert. Das UV-Chromatogramm zeigte lediglich kleinere Peaks in den Gradientfraktionen. Ein Bradford-Assay und Aktivitätsassay, analysiert durch Agarosegelelektrophorese, zeigte, dass das Enzym im Durchfluss der Säule vorlag. Wäsche und Durchfluss wurden gepoolt.
Eine 7,1 ml Heparin-5PW-Säule wurde mit 3 Säulenvolumen Puffer A äquilibriert. Ein-ml-Fraktionen wurden mit einem NaCl-Gradient von 0,1 M bis 1,0 M mit einer Äkta^® FPLC eluiert. Daten, die von dem Chromatogramm, SDS-PAGE und einem durch Agarosegelelektrophorese analysierten Aktivitätsassay gewonnen wurden, zeigten, dass der eine größere Peak auf dem Chromatogramm der BsmBI Endonuclease entsprach. Acht 1-ml-Fraktionen wurden gepoolt und mit 1 l Dialysepuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 mM β-Mercaptoethanol, 50 % Glycerol, pH 7,5) dialysiert. Das endgültige gereinigte BsmBI Endonucleaseprotein ist in 5 dargestellt.
Der Stamm ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsmBIR] wurde am 28. September 2001 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt und erhielt die ATCC-Akzessionsnummer PTA-3739.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die BsmBI Restriktionsendonuclease und BsmAI Methylase kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment von ATCC Akzessions-Nr. PTA-3739 erhältlich ist.
Vektor, der das isolierte DNA-Segment aus Anspruch 1 beinhaltet.
Wirtszelle, die durch den Vektor aus Anspruch 2 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen rekombinanter BsmBI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer mit dem Vektor aus Anspruch 2 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression von BsmBI Endonuclease und Methylase beinhaltet.