JP2003230390A - Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｂｉ制限エンドヌクレアーゼとｂｓｍｂｉメチラーゼのクローニング及び発現の方法、並びにｂｓｍｂｉエンドヌクレアーゼの精製方法 - Google Patents
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｂｉ制限エンドヌクレアーゼとｂｓｍｂｉメチラーゼのクローニング及び発現の方法、並びにｂｓｍｂｉエンドヌクレアーゼの精製方法Info
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアー
ゼ及びＢｓｍＢＩメチルトランスフェラーゼをコードす
る組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを含有する大腸
菌細胞におけるＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ及び
ＢｓｍＢＩメチラーゼの発現に関する。本発明はまた、
組換えＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製方法に
も関する。 【解決手段】 本発明は、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレ
アーゼをコードしている単離されたＤＮＡであって、バ
チルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｂ６１から入
手可能である単離されたＤＮＡと、メチラーゼ選抜及び
インバースＰＣＲによってバチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）Ｂ６１のＢｓ
ｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを大腸菌にクローニング
する方法を提供する。
ゼ及びＢｓｍＢＩメチルトランスフェラーゼをコードす
る組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを含有する大腸
菌細胞におけるＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ及び
ＢｓｍＢＩメチラーゼの発現に関する。本発明はまた、
組換えＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製方法に
も関する。 【解決手段】 本発明は、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレ
アーゼをコードしている単離されたＤＮＡであって、バ
チルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｂ６１から入
手可能である単離されたＤＮＡと、メチラーゼ選抜及び
インバースＰＣＲによってバチルス・ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）Ｂ６１のＢｓ
ｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを大腸菌にクローニング
する方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＢｓｍＢＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ）及びＢｓｍＢ
Ｉメチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）をエンコー
ドする組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを含有する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＢｓｍＢＩエンド
ヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に関する。
ンドヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼ）及びＢｓｍＢ
Ｉメチルトランスフェラーゼ（メチラーゼ）をエンコー
ドする組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡを含有する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＢｓｍＢＩエンド
ヌクレアーゼ及びメチラーゼの発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼは、バチ
ルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＢ６１株（ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ社（New England Bi
olabs）の株コレクションＮｏ．８５７）で発見されて
いる。それは、２本鎖ＤＮＡ配列５’ＣＧＴＣＴＣ３’
Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を認識し、認識
配列の下流Ｎ１（上の鎖）及びＮ５（下の鎖）で切断し
て４−塩基５’側にオーバーハングを生じる（Ｎ＝Ａ、
Ｔ、Ｃ、又はＧ；／はリン酸ジエステル結合を示す）。
ＢｓｍＢＩメチラーゼ（Ｍ．ＢｓｍＢＩ）もバチルス・
ステアロサーモフィラスのＢ６１株で発見されている。
それは、２本鎖ＤＮＡ配列、５’ＣＧＴＣＴＣ３’（Ｓ
ＥＱ ＩＤＮＯ：２）（上の鎖）及び５’ＧＡＧＡＣＧ
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（下の鎖）を認識し、
認識配列の中で、おそらくは、上の鎖ではシトシン（５
ｍＣ）を、また下の鎖ではアデノシン（Ｎ６ｍＡ）を修
飾する。
ルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＢ６１株（ニ
ュー・イングランド・バイオラブズ社（New England Bi
olabs）の株コレクションＮｏ．８５７）で発見されて
いる。それは、２本鎖ＤＮＡ配列５’ＣＧＴＣＴＣ３’
Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を認識し、認識
配列の下流Ｎ１（上の鎖）及びＮ５（下の鎖）で切断し
て４−塩基５’側にオーバーハングを生じる（Ｎ＝Ａ、
Ｔ、Ｃ、又はＧ；／はリン酸ジエステル結合を示す）。
ＢｓｍＢＩメチラーゼ（Ｍ．ＢｓｍＢＩ）もバチルス・
ステアロサーモフィラスのＢ６１株で発見されている。
それは、２本鎖ＤＮＡ配列、５’ＣＧＴＣＴＣ３’（Ｓ
ＥＱ ＩＤＮＯ：２）（上の鎖）及び５’ＧＡＧＡＣＧ
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（下の鎖）を認識し、
認識配列の中で、おそらくは、上の鎖ではシトシン（５
ｍＣ）を、また下の鎖ではアデノシン（Ｎ６ｍＡ）を修
飾する。
【０００３】ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、細菌及
び一部のウイルスに天然に存在する一種の酵素である。
細菌／ウイルスのタンパク質から精製して取り出すと、
制限エンドヌクレアーゼは、分子クローニングや遺伝子
の特性決定のためにＤＮＡ分子を小さな断片に切断する
のに実験室で用いることができる。
び一部のウイルスに天然に存在する一種の酵素である。
細菌／ウイルスのタンパク質から精製して取り出すと、
制限エンドヌクレアーゼは、分子クローニングや遺伝子
の特性決定のためにＤＮＡ分子を小さな断片に切断する
のに実験室で用いることができる。
【０００４】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に
沿って核酸の特定の配列（「認識配列」）を認識して結
合する。いったん結合すると、それらは認識配列の中で
（例えば、ＢａｍＨＩ）、一方の端で（例えば、Ｓａｐ
Ｉ）又は両端で（例えば、ＴｓｐＲＩ）分子を切断す
る。別の制限エンドヌクレアーゼは、別の認識配列に対
して親和性を有する。今日までに調べられた何百という
細菌種の間で、独特の特異性をもつ２１１に及ぶ制限エ
ンドヌクレアーゼが同定されてきた（Roberts and Mace
lis, Nucl. Acids Res., 27:312-313, 1999）。
沿って核酸の特定の配列（「認識配列」）を認識して結
合する。いったん結合すると、それらは認識配列の中で
（例えば、ＢａｍＨＩ）、一方の端で（例えば、Ｓａｐ
Ｉ）又は両端で（例えば、ＴｓｐＲＩ）分子を切断す
る。別の制限エンドヌクレアーゼは、別の認識配列に対
して親和性を有する。今日までに調べられた何百という
細菌種の間で、独特の特異性をもつ２１１に及ぶ制限エ
ンドヌクレアーゼが同定されてきた（Roberts and Mace
lis, Nucl. Acids Res., 27:312-313, 1999）。
【０００５】制限エンドヌクレアーゼは通常、それが発
見された細菌に基づいて命名される。従って、Ｄｅｉｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、例え
ば、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと命名され
た３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを産生する。こ
のような酵素はそれぞれ、配列、５’ＴＴＴ／ＡＡＡ
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、５’ＰｕＧ／ＧＮＣ
ＣＰｙ３’（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５）及び５’ＣＡＣＮ
ＮＮ／ＧＴＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を切断す
る。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１
３はたった１つの酵素、ＥｃｏＲＩを産生し、それは、
配列５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７）を認識する。
見された細菌に基づいて命名される。従って、Ｄｅｉｎ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ種は、例え
ば、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩ及びＤｒａＩＩＩと命名され
た３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを産生する。こ
のような酵素はそれぞれ、配列、５’ＴＴＴ／ＡＡＡ
３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、５’ＰｕＧ／ＧＮＣ
ＣＰｙ３’（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：５）及び５’ＣＡＣＮ
ＮＮ／ＧＴＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を切断す
る。一方、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１
３はたった１つの酵素、ＥｃｏＲＩを産生し、それは、
配列５’Ｇ／ＡＡＴＴＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７）を認識する。
【０００６】細菌／ウイルスの制限−修飾（Ｒ−Ｍ）シ
ステムの第２の成分はメチラーゼである。このような酵
素は制限エンドヌクレアーゼと共存し、細菌が自らのＤ
ＮＡを保護し、それを外来のＤＮＡから区別する手段を
提供している。修飾メチラーゼは、相当する制限エンド
ヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、それに結合する
が、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基（Ｃ５メチル
シトシン、Ｎ４メチルシトシン、又はＮ６メチルアデニ
ン）を付加することによって配列内の特定の核酸の１つ
を修飾する。メチル化された後、認識配列はもはや同族
の制限エンドヌクレアーゼによって切断されることはな
い。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性に
よって常に完全に修飾されている。従って、それは内因
性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感受性
である。修飾されていない識別可能な外来のＤＮＡだけ
が制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感受性であ
る。ＤＮＡ複製の最中に及びその後に、通常、半メチル
化されたＤＮＡ（一方の鎖でメチル化されたＤＮＡ）も
同族の制限消化に対しては抵抗性である。
ステムの第２の成分はメチラーゼである。このような酵
素は制限エンドヌクレアーゼと共存し、細菌が自らのＤ
ＮＡを保護し、それを外来のＤＮＡから区別する手段を
提供している。修飾メチラーゼは、相当する制限エンド
ヌクレアーゼと同じ認識配列を認識し、それに結合する
が、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基（Ｃ５メチル
シトシン、Ｎ４メチルシトシン、又はＮ６メチルアデニ
ン）を付加することによって配列内の特定の核酸の１つ
を修飾する。メチル化された後、認識配列はもはや同族
の制限エンドヌクレアーゼによって切断されることはな
い。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性に
よって常に完全に修飾されている。従って、それは内因
性の制限エンドヌクレアーゼの存在には完全に非感受性
である。修飾されていない識別可能な外来のＤＮＡだけ
が制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感受性であ
る。ＤＮＡ複製の最中に及びその後に、通常、半メチル
化されたＤＮＡ（一方の鎖でメチル化されたＤＮＡ）も
同族の制限消化に対しては抵抗性である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】組換えＤＮＡ技術の進
歩と共に、今や、遺伝子をクローニングし、酵素を大量
生産することが可能になっている。制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるのは、それら
が１０−３〜１０−４という低い頻度で生じる場合、ゲ
ノムＤＮＡライブラリの中でこのようなクローン、例え
ば、「ショットガン」法で引き出されるクローン集団を
識別する効率的な方法を開発することである。好ましく
は、該方法は、望ましい稀なクローンが生き残る一方
で、メチラーゼでない挿入物を伴った望ましくないクロ
ーンが破壊されるように選択的であるべきである。
歩と共に、今や、遺伝子をクローニングし、酵素を大量
生産することが可能になっている。制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子のクローンを単離する鍵となるのは、それら
が１０−３〜１０−４という低い頻度で生じる場合、ゲ
ノムＤＮＡライブラリの中でこのようなクローン、例え
ば、「ショットガン」法で引き出されるクローン集団を
識別する効率的な方法を開発することである。好ましく
は、該方法は、望ましい稀なクローンが生き残る一方
で、メチラーゼでない挿入物を伴った望ましくないクロ
ーンが破壊されるように選択的であるべきである。
【０００８】今までにも、多数のＩＩ型制限−修飾シス
テムがクローニングされてきた。最初のクローニング法
は、制限エンドヌクレアーゼのクローンを識別し、選抜
する手段としてバクテリオファージの感染を用いた（Ｅ
ｃｏＲＩＩ：Kosykh et al.,Mol. Gen. Genet., 178:71
7-719, 1980; ＨｈａＩＩ：Mann et al., Gene 3:97-11
2, 1978; ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci., 78:1503-1507, 1981）。細菌における制限−
修飾システムの発現によってそれらをバクテリオファー
ジによる感染に抵抗性にすることができるので、クロー
ニングされた制限−修飾遺伝子を持つ細胞は、原則とし
てファージにさらされているゲノムＤＮＡライブラリの
生き残りとして選択的に単離することができる。しかし
ながら、この方法は、ごく限られた成功率しか有さない
ことが判った。具体的には、クローニングされた制限−
修飾遺伝子が常に選択的生き残りを達成するのに十分な
ファージ抵抗性を与えるとは限らないことが判った。
テムがクローニングされてきた。最初のクローニング法
は、制限エンドヌクレアーゼのクローンを識別し、選抜
する手段としてバクテリオファージの感染を用いた（Ｅ
ｃｏＲＩＩ：Kosykh et al.,Mol. Gen. Genet., 178:71
7-719, 1980; ＨｈａＩＩ：Mann et al., Gene 3:97-11
2, 1978; ＰｓｔＩ：Walder et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci., 78:1503-1507, 1981）。細菌における制限−
修飾システムの発現によってそれらをバクテリオファー
ジによる感染に抵抗性にすることができるので、クロー
ニングされた制限−修飾遺伝子を持つ細胞は、原則とし
てファージにさらされているゲノムＤＮＡライブラリの
生き残りとして選択的に単離することができる。しかし
ながら、この方法は、ごく限られた成功率しか有さない
ことが判った。具体的には、クローニングされた制限−
修飾遺伝子が常に選択的生き残りを達成するのに十分な
ファージ抵抗性を与えるとは限らないことが判った。
【０００９】もう１つのクローニング法には、プラスミ
ド由来で大腸菌でクローニングするベクターとして、当
初、特徴づけられた転移システムがある（ＥｃｏＲＶ：
Bougueleret et al., Nucl. Acids Res., 12:3659-367
6, 1984; ＰａｅＲ７：Gingeras and Brooks, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 80:402-406, 1983; Theriault and
Roy, Gene 19:355-359, 1982; ＰｖｕＩＩ：Blumentha
l et al., J. Bacteriol., 164:501-509, 1985; Ｔｓｐ
４５Ｉ：Wayne et al., Gene 202:83-88, 1997)。
ド由来で大腸菌でクローニングするベクターとして、当
初、特徴づけられた転移システムがある（ＥｃｏＲＶ：
Bougueleret et al., Nucl. Acids Res., 12:3659-367
6, 1984; ＰａｅＲ７：Gingeras and Brooks, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 80:402-406, 1983; Theriault and
Roy, Gene 19:355-359, 1982; ＰｖｕＩＩ：Blumentha
l et al., J. Bacteriol., 164:501-509, 1985; Ｔｓｐ
４５Ｉ：Wayne et al., Gene 202:83-88, 1997)。
【００１０】第３の方法は、メチラーゼ遺伝子の活性発
現について選抜することである（メチラーゼ選抜）（米
国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kiss e
t al., Nucl. Acids Res., 13:6403-6421, 1985)。制限
−修飾遺伝子は、しばしば、密接に連繋しているので、
双方の遺伝子が同時にクローニングされることがしばし
ば起こり得る。しかしながら、この選抜によって常に完
全な制限システムが得られるとは限らず、代わりにメチ
ラーゼ遺伝子のみが得られることがある（ＢｓｐＲＩ：
Szomolanyi et al., Gene 10:219-225, 1980; Ｂｃｎ
Ｉ：Janulaitis et al., Gene 20:197-204, 1982; Ｂｓ
ｕＲＩ：Kiss and Bladauf, Gene 21:111-119, 1983;及
びＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem.,258:1235
-1241, 1983)。
現について選抜することである（メチラーゼ選抜）（米
国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kiss e
t al., Nucl. Acids Res., 13:6403-6421, 1985)。制限
−修飾遺伝子は、しばしば、密接に連繋しているので、
双方の遺伝子が同時にクローニングされることがしばし
ば起こり得る。しかしながら、この選抜によって常に完
全な制限システムが得られるとは限らず、代わりにメチ
ラーゼ遺伝子のみが得られることがある（ＢｓｐＲＩ：
Szomolanyi et al., Gene 10:219-225, 1980; Ｂｃｎ
Ｉ：Janulaitis et al., Gene 20:197-204, 1982; Ｂｓ
ｕＲＩ：Kiss and Bladauf, Gene 21:111-119, 1983;及
びＭｓｐＩ：Walder et al., J. Biol. Chem.,258:1235
-1241, 1983)。
【００１１】つい最近の方法である「エンドブルー法」
は、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺの融合を含有する大腸菌の指
示菌に基づいた、熱安定性の制限エンドヌクレアーゼを
大腸菌に直接クローニングすることについて記載されて
いる（米国特許第５，４９８，５３５号（１９９６
年）；Fomenkov et al., Nucl. Acids Res., 22: 2399-
2403, 1994)。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又
は非特異的ヌクレアーゼにより生じたＤＮＡの損傷から
起こる大腸菌のＳＯＳ応答シグナルを利用する。この方
法によって多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔａｑ
Ｉ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）
がクローニングされている（米国特許第５，４９８，５
３５号、１９９６年）。この方法の欠点は、同族のメチ
ラーゼ遺伝子が欠如するために、制限エンドヌクレアー
ゼを含有する陽性の青色クローンは培養するのが難し
い、ということである。
は、ｄｉｎＤ：：ｌａｃＺの融合を含有する大腸菌の指
示菌に基づいた、熱安定性の制限エンドヌクレアーゼを
大腸菌に直接クローニングすることについて記載されて
いる（米国特許第５，４９８，５３５号（１９９６
年）；Fomenkov et al., Nucl. Acids Res., 22: 2399-
2403, 1994)。この方法は、制限エンドヌクレアーゼ又
は非特異的ヌクレアーゼにより生じたＤＮＡの損傷から
起こる大腸菌のＳＯＳ応答シグナルを利用する。この方
法によって多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（Ｔａｑ
Ｉ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＢｓｏＢＩ、Ｔｆヌクレアーゼ）
がクローニングされている（米国特許第５，４９８，５
３５号、１９９６年）。この方法の欠点は、同族のメチ
ラーゼ遺伝子が欠如するために、制限エンドヌクレアー
ゼを含有する陽性の青色クローンは培養するのが難し
い、ということである。
【００１２】ＤＮＡメチルトランスフェラーゼには、位
置及び修飾される塩基に基づいた３つの主なグループが
ある（Ｃ５シトシンメチラーゼ、Ｎ４シトシンメチラー
ゼ及びＮ６アデニンメチラーゼ）。Ｎ４シトシンメチラ
ーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼはアミノ−メチルトラ
ンスフェラーゼである（Malone et al., J. Mol. Biol.
, 253:618-632, 1995）。ＤＮＡの制限部位がメチラー
ゼによって修飾されると（メチル化されると）、それは
同族の制限エンドヌクレアーゼによる消化に対して抵抗
性となる。時々、同族ではないメチラーゼによるメチル
化が、ＤＮＡ部位に制限酵素に対する抵抗性を付与し得
る。例えば、５’ＣＣＷＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：８）（Ｗ＝Ａ又はＴ）のＤｃｍメチラーゼによる修
飾は、ＤＮＡをＰｓｐＧＩの制限消化に対して抵抗性に
することもできる。もう１つの例は、ＣｐＭメチラーゼ
がＣＧジヌクレオチドを修飾し、ＮｏｔＩ部位（５’Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９））をＮ
ｏｔＩ消化に不応性にすることができる（ニュー・イン
グランド・バイオラブズ社のカタログ２０００〜０１年
の２２０ページ）。従って、特定のＤＮＡ配列を修飾
し、制限酵素によってそれが切断されないようにするツ
ールとしてメチラーゼを用いることができる。
置及び修飾される塩基に基づいた３つの主なグループが
ある（Ｃ５シトシンメチラーゼ、Ｎ４シトシンメチラー
ゼ及びＮ６アデニンメチラーゼ）。Ｎ４シトシンメチラ
ーゼ及びＮ６アデニンメチラーゼはアミノ−メチルトラ
ンスフェラーゼである（Malone et al., J. Mol. Biol.
, 253:618-632, 1995）。ＤＮＡの制限部位がメチラー
ゼによって修飾されると（メチル化されると）、それは
同族の制限エンドヌクレアーゼによる消化に対して抵抗
性となる。時々、同族ではないメチラーゼによるメチル
化が、ＤＮＡ部位に制限酵素に対する抵抗性を付与し得
る。例えば、５’ＣＣＷＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：８）（Ｗ＝Ａ又はＴ）のＤｃｍメチラーゼによる修
飾は、ＤＮＡをＰｓｐＧＩの制限消化に対して抵抗性に
することもできる。もう１つの例は、ＣｐＭメチラーゼ
がＣＧジヌクレオチドを修飾し、ＮｏｔＩ部位（５’Ｇ
ＣＧＧＣＣＧＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９））をＮ
ｏｔＩ消化に不応性にすることができる（ニュー・イン
グランド・バイオラブズ社のカタログ２０００〜０１年
の２２０ページ）。従って、特定のＤＮＡ配列を修飾
し、制限酵素によってそれが切断されないようにするツ
ールとしてメチラーゼを用いることができる。
【００１３】精製した制限エンドヌクレアーゼ及び修飾
メチラーゼは実験室で組換え分子を創製するのに有用な
ツールなので、組換えＤＮＡ技術を介して大量に制限酵
素を生産する細菌株を入手しようという強い商業的関心
がある。かかる過剰発現株もまた酵素精製の作業を簡略
化するはずである。
メチラーゼは実験室で組換え分子を創製するのに有用な
ツールなので、組換えＤＮＡ技術を介して大量に制限酵
素を生産する細菌株を入手しようという強い商業的関心
がある。かかる過剰発現株もまた酵素精製の作業を簡略
化するはずである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、メチラーゼ選
抜及びインバースＰＣＲによってバチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）Ｂ６１
のＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを大腸菌にクロー
ニングする方法に関する。メチラーゼ選抜の後、ＤＮＡ
ライブラリの中にＣ５メチラーゼに高い相同性を持つメ
チラーゼ遺伝子が見い出された。第１のメチラーゼ遺伝
子の近傍のゲノムＤＮＡを配列決定した後、アミノ−メ
チラーゼ（Ｎ６−アデノシンメチラーゼ）に高い相同性
を持つ第２のメチラーゼ遺伝子を見い出した。後になっ
て、これら２つの遺伝子が一緒に融合して単一の融合タ
ンパク質をコードしていることが検証された。この融合
遺伝子をＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ）
と命名した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐ
ＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ＢｓｍＢＩエンド
ヌクレアーゼの発現には、予め修飾した宿主ＥＲ２７４
４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を用いた。
抜及びインバースＰＣＲによってバチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）Ｂ６１
のＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼを大腸菌にクロー
ニングする方法に関する。メチラーゼ選抜の後、ＤＮＡ
ライブラリの中にＣ５メチラーゼに高い相同性を持つメ
チラーゼ遺伝子が見い出された。第１のメチラーゼ遺伝
子の近傍のゲノムＤＮＡを配列決定した後、アミノ−メ
チラーゼ（Ｎ６−アデノシンメチラーゼ）に高い相同性
を持つ第２のメチラーゼ遺伝子を見い出した。後になっ
て、これら２つの遺伝子が一緒に融合して単一の融合タ
ンパク質をコードしていることが検証された。この融合
遺伝子をＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ）
と命名した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐ
ＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ＢｓｍＢＩエンド
ヌクレアーゼの発現には、予め修飾した宿主ＥＲ２７４
４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を用いた。
【００１５】中程度のコピー数の発現ベクターではＢｓ
ｍＢＩエンドヌクレアーゼを発現するのは困難であるこ
とが判っている。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を含有するＰＣＲ
のＤＮＡをｐＡＩＩ１７又はｐＥＴ２１ａｔに連結した
場合、正しい挿入で活性のあるクローンは見い出せなか
ったが、それは、大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢ
ｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化による可能性がある。
ｍＢＩエンドヌクレアーゼを発現するのは困難であるこ
とが判っている。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を含有するＰＣＲ
のＤＮＡをｐＡＩＩ１７又はｐＥＴ２１ａｔに連結した
場合、正しい挿入で活性のあるクローンは見い出せなか
ったが、それは、大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢ
ｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化による可能性がある。
【００１６】安定な発現クローンを構築するために、ｂ
ｓｍＢＩＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐＢＲ３２２にク
ローニングして、予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＢ
Ｒ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。ｂｓｍＢＩＲ
遺伝子をＰＣＲで増幅し、適合する末端を持ったｐＡＣ
ＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに挿入した。高いＢｓｍＢＩエンドヌ
クレアーゼ活性が検出された。しかしながら、さらに大
規模に増幅した培養ではさらに低いＢｓｍＢＩ活性が検
出されたので、発現クローンＥＲ２７４４「ｐＢＲ−Ｂ
ｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］
は極めて不安定であった。発現クローンをさらに安定化
するために、以下の２つの戦略を用いた： ａ） Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロ
モータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコー
ドしているＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラス
ミドを導入すること。 ｂ） 発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラ
ーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること（ＢｓｍＡＩ
メチラーゼの認識配列、５’ＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７））。
ｓｍＢＩＭ遺伝子をＰＣＲで増幅し、ｐＢＲ３２２にク
ローニングして、予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＢ
Ｒ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。ｂｓｍＢＩＲ
遺伝子をＰＣＲで増幅し、適合する末端を持ったｐＡＣ
ＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに挿入した。高いＢｓｍＢＩエンドヌ
クレアーゼ活性が検出された。しかしながら、さらに大
規模に増幅した培養ではさらに低いＢｓｍＢＩ活性が検
出されたので、発現クローンＥＲ２７４４「ｐＢＲ−Ｂ
ｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］
は極めて不安定であった。発現クローンをさらに安定化
するために、以下の２つの戦略を用いた： ａ） Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロ
モータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコー
ドしているＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラス
ミドを導入すること。 ｂ） 発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラ
ーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること（ＢｓｍＡＩ
メチラーゼの認識配列、５’ＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７））。
【００１７】２つの産生株を構築した。１番目は、ＥＲ
２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８、
ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］である。２番
目の株は、同族でないメチラーゼ、ＢｓｍＡＩメチラー
ゼにより予め修飾したＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂ
ｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］
である。この第２の株は、増幅した大規模培養で最高の
ＢｓｍＢＩ産物収量を生じた。
２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８、
ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］である。２番
目の株は、同族でないメチラーゼ、ＢｓｍＡＩメチラー
ゼにより予め修飾したＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂ
ｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］
である。この第２の株は、増幅した大規模培養で最高の
ＢｓｍＢＩ産物収量を生じた。
【００１８】先ず、メチラーゼ選抜によってｂｓｍＢＩ
Ｍ遺伝子をクローニングした。遺伝子全体を配列決定し
た後、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。Ｂａ
ｍＨＩ及びＳａｌＩによる消化に続いて、ＰＣＲのＤＮ
ＡをｐＡＣＹＣ１８４に連結した。プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４−ＢｓｍＢＩＭを含有する５つのクローンがＢ
ｓｍＢＩの切断に完全な抵抗性を示した。コンピテント
細胞ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を調製
し、ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現に用いた。
Ｍ遺伝子をクローニングした。遺伝子全体を配列決定し
た後、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。Ｂａ
ｍＨＩ及びＳａｌＩによる消化に続いて、ＰＣＲのＤＮ
ＡをｐＡＣＹＣ１８４に連結した。プラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４−ＢｓｍＢＩＭを含有する５つのクローンがＢ
ｓｍＢＩの切断に完全な抵抗性を示した。コンピテント
細胞ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を調製
し、ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現に用いた。
【００１９】中程度のコピー数の発現ベクターではＢｓ
ｍＢＩエンドヌクレアーゼを発現するのは困難であるこ
とが判っている。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子をＰＣＲで増幅
し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩消化した。ＤＮＡを
精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＡ
１１１７に連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４
［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質
転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。多
数の形質転換体のミニプレップでは正しいサイズの挿入
物を持った陽性クローンは同定されなかった。ＣｏｌＥ
Ｉ起源を持った中程度のコピー数のプラスミドｐＡＩＩ
１７ではｂｓｍＢＩＲ遺伝子をクローニングし、発現さ
せるのは困難であると結論付けた。
ｍＢＩエンドヌクレアーゼを発現するのは困難であるこ
とが判っている。ｂｓｍＢＩＲ遺伝子をＰＣＲで増幅
し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで一晩消化した。ＤＮＡを
精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＡ
１１１７に連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４
［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質
転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。多
数の形質転換体のミニプレップでは正しいサイズの挿入
物を持った陽性クローンは同定されなかった。ＣｏｌＥ
Ｉ起源を持った中程度のコピー数のプラスミドｐＡＩＩ
１７ではｂｓｍＢＩＲ遺伝子をクローニングし、発現さ
せるのは困難であると結論付けた。
【００２０】ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の残りの精製ＰＣＲ産
物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。精製した後、
ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔに
連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ
−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、Ａｐ
ＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。挿入物について
多数の形質転換体をスクリーニングした。所望の挿入物
を組み込んだクローンは見つからなかった。ｂｓｍＢＩ
Ｒ遺伝子は中程度のコピー数のプラスミド（ｐＡＩＩ１
７又はｐＥＴ２１ａｔのいずれか）から発現されると、
毒性があると思われたが、それは、大腸菌ゲノム又はベ
クターにおけるＢｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化によ
る可能性がある。
物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。精製した後、
ＰＣＲのＤＮＡを適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔに
連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ
−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、Ａｐ
ＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。挿入物について
多数の形質転換体をスクリーニングした。所望の挿入物
を組み込んだクローンは見つからなかった。ｂｓｍＢＩ
Ｒ遺伝子は中程度のコピー数のプラスミド（ｐＡＩＩ１
７又はｐＥＴ２１ａｔのいずれか）から発現されると、
毒性があると思われたが、それは、大腸菌ゲノム又はベ
クターにおけるＢｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化によ
る可能性がある。
【００２１】成功率の高いもう１つの発現戦略には、Ｂ
ｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現が含まれてお
り、その際、メチラーゼ遺伝子はｐＢＲ３２２で発現さ
れ、エンドヌクレアーゼ遺伝子はｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅ
ｒで発現された。プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ
は、Ｔ７プロモータ、ｐ１５Ａ複製開始点（低いコピー
数、細胞当り５〜８コピー）、及びＴ７プロモータの上
流に４コピーの転写ターミネータを含有していた。
ｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現が含まれてお
り、その際、メチラーゼ遺伝子はｐＢＲ３２２で発現さ
れ、エンドヌクレアーゼ遺伝子はｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅ
ｒで発現された。プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ
は、Ｔ７プロモータ、ｐ１５Ａ複製開始点（低いコピー
数、細胞当り５〜８コピー）、及びＴ７プロモータの上
流に４コピーの転写ターミネータを含有していた。
【００２２】
【発明の実施の形態】大腸菌においてＢｓｍＢＩメチラ
ーゼ遺伝子及びＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子が好ましくクローニングされ、発現される本明細書に
記載される方法は、以下の工程を用いた：
ーゼ遺伝子及びＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子が好ましくクローニングされ、発現される本明細書に
記載される方法は、以下の工程を用いた：
【００２３】１． ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ
３ＡＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリの構築 ベクターｐＵＣ１９を用いてＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３
ＡＩゲノムライブラリを構築した。ＮｌａＩＩＩ及びＳ
ａｕ３ＡＩゲノムライブラリをＢｓｍＢＩに曝し、抵抗
性の環状ＤＮＡを用いてＥＲ２５０２コンピテント細胞
を形質転換した。 形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製し、ＢｓｍＢＩの消化に抵抗性のものをスクリーニ
ングした。３つのクローンがＢｓｍＢＩの消化に抵抗性
であると同定された。クローンの１つにおける挿入物を
配列決定し、融合されたメチラーゼ遺伝子を見い出し、
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子と命名した。部分ＯＲＦはメチラー
ゼ遺伝子の下流に位置していた。
３ＡＩ部分ゲノムＤＮＡライブラリの構築 ベクターｐＵＣ１９を用いてＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３
ＡＩゲノムライブラリを構築した。ＮｌａＩＩＩ及びＳ
ａｕ３ＡＩゲノムライブラリをＢｓｍＢＩに曝し、抵抗
性の環状ＤＮＡを用いてＥＲ２５０２コンピテント細胞
を形質転換した。 形質転換体からプラスミドＤＮＡを
調製し、ＢｓｍＢＩの消化に抵抗性のものをスクリーニ
ングした。３つのクローンがＢｓｍＢＩの消化に抵抗性
であると同定された。クローンの１つにおける挿入物を
配列決定し、融合されたメチラーゼ遺伝子を見い出し、
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子と命名した。部分ＯＲＦはメチラー
ゼ遺伝子の下流に位置していた。
【００２４】２． ｂｓｍＢＩＲ遺伝子配列を増幅する
ためのインバースＰＣＲの使用 ｂｓｍＢＩＭ遺伝子を越えて隣接するＤＮＡ配列を得る
ために、ゲノムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓａ
ＨＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、Ｄｒａ
Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｙｐ９４Ｉ、Ｈｐ
ｙＣＨ４ＩＶ、ＰｓｉＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、Ｔｓｅ
Ｉ、及びＸｂａＩで消化した。消化したＤＮＡを連結
し、次いでｂｓｍＢＩＲ遺伝子のインバースＰＣＲ増幅
に用いた。ＡａｔＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ及び
ＸｂａＩ鋳型のインバースＰＣＲ産物を低融点アガロー
スからゲル精製し、直接配列を決定した。ｂｓｍＢＩＭ
遺伝子の下流に１５９３ｂｐのＯＲＦが見い出された。
このＯＲＦをｂｓｍＢＩＲと命名した。それは６２ｋＤ
ａの予想分子量を持つ５３０個のアミノ酸のタンパク質
をエンコードしている。
ためのインバースＰＣＲの使用 ｂｓｍＢＩＭ遺伝子を越えて隣接するＤＮＡ配列を得る
ために、ゲノムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、Ｂｓａ
ＨＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、Ｄｒａ
Ｉ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｙｐ９４Ｉ、Ｈｐ
ｙＣＨ４ＩＶ、ＰｓｉＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、Ｔｓｅ
Ｉ、及びＸｂａＩで消化した。消化したＤＮＡを連結
し、次いでｂｓｍＢＩＲ遺伝子のインバースＰＣＲ増幅
に用いた。ＡａｔＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ及び
ＸｂａＩ鋳型のインバースＰＣＲ産物を低融点アガロー
スからゲル精製し、直接配列を決定した。ｂｓｍＢＩＭ
遺伝子の下流に１５９３ｂｐのＯＲＦが見い出された。
このＯＲＦをｂｓｍＢＩＲと命名した。それは６２ｋＤ
ａの予想分子量を持つ５３０個のアミノ酸のタンパク質
をエンコードしている。
【００２５】３． 予め修飾した宿主を構築するための
ｐＢＲ３２２へのｂｓｍＢＩＭのクローニング 発現宿主においてＢｓｍＢＩメチラーゼの発現を高める
ために、ｂｓｍＢＩＭのＰＣＲのＤＮＡをＢａｍＨＩと
ＳａｌＩで消化して、適合する末端を持つｐＢＲ３２２
に連結した。連結したＤＮＡでＥＲ２５６６コンピテン
ト細胞を形質転換した。３つのクローンがＢｓｍＢＩの
切断に完全に抵抗性であると同定され、正しい挿入サイ
ズを有していた。次いでＣａＣｌ２処理によって細胞に
応答能を持たせ、予め修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢ
Ｒ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。
ｐＢＲ３２２へのｂｓｍＢＩＭのクローニング 発現宿主においてＢｓｍＢＩメチラーゼの発現を高める
ために、ｂｓｍＢＩＭのＰＣＲのＤＮＡをＢａｍＨＩと
ＳａｌＩで消化して、適合する末端を持つｐＢＲ３２２
に連結した。連結したＤＮＡでＥＲ２５６６コンピテン
ト細胞を形質転換した。３つのクローンがＢｓｍＢＩの
切断に完全に抵抗性であると同定され、正しい挿入サイ
ズを有していた。次いでＣａＣｌ２処理によって細胞に
応答能を持たせ、予め修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢ
Ｒ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を作り出した。
【００２６】４． Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒにおけるｂｓｍＢＩＲの発現 ＰＣＲによりｂｓｍＢＩＲを増幅し、ＢａｍＨＩで消化
した。ＤＮＡを精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する
末端を持つｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに連結した。予め修
飾したＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を
連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体
について選抜した。ＥＲ２７４４は、染色体上にＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼを持つ大腸菌Ｋ株に由来する（ＮＥＢ
株コレクション）。所望の挿入物を持つ９つのクローン
が見い出された。９つのクローンで細胞抽出物を調製
し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。２つのクローン、Ｎ
ｏ．２４及びＮｏ．２６が高いＢｓｍＢＩ活性を示し
た。さらに大規模に増幅した培養ではさらに低いＢｓｍ
ＢＩ活性が検出されたので、発現クローンＥＲ２７４４
「ｐＢＲ−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂ
ｓｍＢＩＲ］は極めて不安定であった。発現クローンを
さらに安定化するために、以下の２つの戦略を用いた： ａ） Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロ
モータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコー
ドするＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミド
を導入すること。 ｂ） 発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラ
ーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること。
ｔｅｒにおけるｂｓｍＢＩＲの発現 ＰＣＲによりｂｓｍＢＩＲを増幅し、ＢａｍＨＩで消化
した。ＤＮＡを精製した後、ＰＣＲのＤＮＡを適合する
末端を持つｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒに連結した。予め修
飾したＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ］を
連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質転換体
について選抜した。ＥＲ２７４４は、染色体上にＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼを持つ大腸菌Ｋ株に由来する（ＮＥＢ
株コレクション）。所望の挿入物を持つ９つのクローン
が見い出された。９つのクローンで細胞抽出物を調製
し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。２つのクローン、Ｎ
ｏ．２４及びＮｏ．２６が高いＢｓｍＢＩ活性を示し
た。さらに大規模に増幅した培養ではさらに低いＢｓｍ
ＢＩ活性が検出されたので、発現クローンＥＲ２７４４
「ｐＢＲ−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂ
ｓｍＢＩＲ］は極めて不安定であった。発現クローンを
さらに安定化するために、以下の２つの戦略を用いた： ａ） Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロ
モータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコー
ドするＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミド
を導入すること。 ｂ） 発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラ
ーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること。
【００２７】５． ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂｓ
ｍＢＩＭ、 ｐＣＥＦ８］予め修飾した宿主の構築 コンピテント細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂｓｍ
ＢＩＭ］をｐＣＥＦ８（ＫｍＲ）で形質転換した。プラ
スミドｐＣＥＦ８は、ｐＳＣ１０１複製開始点及びＴ７
リゾチームをコードするｌｙｓＳ遺伝子を持つ。ＡｐＲ
ＫｍＲ形質転換体を増幅し、冷却ＣａＣｌ２で洗浄する
ことにより応答能を持たせた。ＥＲ２５６６は、大腸菌
Ｂ株に由来するＴ７発現宿主である。ＥＲ２５６６は、
また、染色体上にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子も持つ
（ＮＥＢ株コレクション）。ＰＣＲの突然変異率を減ら
すために、ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を１３回のＰＣＲサイク
ルによってゲノムＤＮＡから再び増幅し、発現ベクター
ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにクローニングし直した。予め
修飾した宿主はＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢ
ＩＭ、 ｐＣＥＦ８］だった。プラスミドのミニスクリ
ーニングにおいて、ｂｓｍＢＩＲエンドヌクレアーゼ遺
伝子を含有するプラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂ
ｓｍＢＩＲを見い出した。挿入物を持つクローンからＩ
ＰＴＧ誘導した細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩエンド
ヌクレアーゼ活性について測定した。
ｍＢＩＭ、 ｐＣＥＦ８］予め修飾した宿主の構築 コンピテント細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂｓｍ
ＢＩＭ］をｐＣＥＦ８（ＫｍＲ）で形質転換した。プラ
スミドｐＣＥＦ８は、ｐＳＣ１０１複製開始点及びＴ７
リゾチームをコードするｌｙｓＳ遺伝子を持つ。ＡｐＲ
ＫｍＲ形質転換体を増幅し、冷却ＣａＣｌ２で洗浄する
ことにより応答能を持たせた。ＥＲ２５６６は、大腸菌
Ｂ株に由来するＴ７発現宿主である。ＥＲ２５６６は、
また、染色体上にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子も持つ
（ＮＥＢ株コレクション）。ＰＣＲの突然変異率を減ら
すために、ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を１３回のＰＣＲサイク
ルによってゲノムＤＮＡから再び増幅し、発現ベクター
ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにクローニングし直した。予め
修飾した宿主はＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢ
ＩＭ、 ｐＣＥＦ８］だった。プラスミドのミニスクリ
ーニングにおいて、ｂｓｍＢＩＲエンドヌクレアーゼ遺
伝子を含有するプラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂ
ｓｍＢＩＲを見い出した。挿入物を持つクローンからＩ
ＰＴＧ誘導した細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩエンド
ヌクレアーゼ活性について測定した。
【００２８】６． ＢｓｍＡＩメチラーゼで予め修飾し
た宿主におけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現 ＢｓｍＡＩ及びＢｓｍＢＩの認識配列は、それぞれ、
５’ＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２７）及び５’ＣＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）である。ＢｓｍＡＩ部位は、ＢｓｍＢ
Ｉ部位のサブセットである。ＢｓｍＡＩメチラーゼ及び
ＢｓｍＢＩメチラーゼは双方共２つのメチラーゼ（Ｃ５
メチラーゼと融合したＮ６Ａメチラーゼ）の融合物であ
る。ＢｓｍＡＩメチラーゼとＢｓｍＢＩメチラーゼとの
間のアミノ酸配列の相同性及びＤＮＡ認識配列における
類似性に基づいて、ＢｓｍＡＩメチラーゼがＢｓｍＢＩ
の切断に対して大腸菌のゲノムＤＮＡを保護することが
予測された。ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩ
Ｍ］（ＢｓｍＡＩ、米国特許出願番号０９／９５７，０
０５）を発現プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂｓ
ｍＢＩＲで形質転換した。ＢｓｍＢＩ活性について、誘
導していない、誘導した、及び誘導し／加熱した（５５
℃及び６５℃にて）細胞抽出物を測定した。最も高い活
性は、ＩＰＴＧ誘導した培養からの抽出物及び誘導した
培養を５５℃に加熱したものから検出された。収量はお
よそ＞１０６単位／細胞の湿重量であると割り出され
た。
た宿主におけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現 ＢｓｍＡＩ及びＢｓｍＢＩの認識配列は、それぞれ、
５’ＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２７）及び５’ＣＧＴＣＴＣ３’Ｎ１／Ｎ５（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１）である。ＢｓｍＡＩ部位は、ＢｓｍＢ
Ｉ部位のサブセットである。ＢｓｍＡＩメチラーゼ及び
ＢｓｍＢＩメチラーゼは双方共２つのメチラーゼ（Ｃ５
メチラーゼと融合したＮ６Ａメチラーゼ）の融合物であ
る。ＢｓｍＡＩメチラーゼとＢｓｍＢＩメチラーゼとの
間のアミノ酸配列の相同性及びＤＮＡ認識配列における
類似性に基づいて、ＢｓｍＡＩメチラーゼがＢｓｍＢＩ
の切断に対して大腸菌のゲノムＤＮＡを保護することが
予測された。ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩ
Ｍ］（ＢｓｍＡＩ、米国特許出願番号０９／９５７，０
０５）を発現プラスミドｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂｓ
ｍＢＩＲで形質転換した。ＢｓｍＢＩ活性について、誘
導していない、誘導した、及び誘導し／加熱した（５５
℃及び６５℃にて）細胞抽出物を測定した。最も高い活
性は、ＩＰＴＧ誘導した培養からの抽出物及び誘導した
培養を５５℃に加熱したものから検出された。収量はお
よそ＞１０６単位／細胞の湿重量であると割り出され
た。
【００２９】誘導していない、誘導した、及び誘導し／
加熱した（５５℃及び６５℃にて）もののタンパク質の
発現の特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約６０ｋＤ
ａのタンパク質バンドが誘導した培養の抽出物において
検出されたが、誘導しなかった培養の抽出物には存在し
なかった。
加熱した（５５℃及び６５℃にて）もののタンパク質の
発現の特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約６０ｋＤ
ａのタンパク質バンドが誘導した培養の抽出物において
検出されたが、誘導しなかった培養の抽出物には存在し
なかった。
【００３０】７． ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの均
質になるまでの精製 ７５ｇのＩＰＴＧ誘導した細胞、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ
３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂｓ
ｍＢＩＲ］を超音波破砕によって溶解した。透明化した
細胞抽出物を５９〜６１℃で２０分間加熱した。熱変性
したタンパク質を遠心で取り除いた。アクタ（Akta：登
録商標）ＦＰＬＣシステムを用い、ヘパリンハイパー(H
eparin hyper)Ｄ、ソース(Source)Ｑ１５ＨＲカラム及
びヘパリン５ＰＷカラムによってほとんど均質になるま
でＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを精製した。精製した
ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼは６２ｋＤａの予想サイ
ズに比べ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６０ｋＤａの見かけ
の分子量を有する。
質になるまでの精製 ７５ｇのＩＰＴＧ誘導した細胞、ＥＲ２５６６［ｐＢＲ
３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−Ｂｓ
ｍＢＩＲ］を超音波破砕によって溶解した。透明化した
細胞抽出物を５９〜６１℃で２０分間加熱した。熱変性
したタンパク質を遠心で取り除いた。アクタ（Akta：登
録商標）ＦＰＬＣシステムを用い、ヘパリンハイパー(H
eparin hyper)Ｄ、ソース(Source)Ｑ１５ＨＲカラム及
びヘパリン５ＰＷカラムによってほとんど均質になるま
でＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを精製した。精製した
ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼは６２ｋＤａの予想サイ
ズに比べ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約６０ｋＤａの見かけ
の分子量を有する。
【００３１】以下の実施例によって本発明をさらに説明
する。実施例は、本発明の理解を助けるために提供され
るのであって、その限定として解釈されるものではな
い。
する。実施例は、本発明の理解を助けるために提供され
るのであって、その限定として解釈されるものではな
い。
【００３２】上記及び以下で引用される引用文献は参考
として本明細書に組み入れられる。
として本明細書に組み入れられる。
【００３３】
【実施例】大腸菌におけるＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子
及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング １． ゲノムＤＮＡの調製 ５０ｍｌの２５％スクロース、５０ｍＭのトリス塩酸中
で１０分間穏やかに振盪して９．２ｇの細胞ペーストを
再浮遊することにより、バチルス・ステアロサーモフィ
ラスＢ６１（ニュー・イングランド・バイオラブズ・コ
レクション ＮＥＢ Ｎｏ．８５７）からゲノムＤＮＡ
を調製した。新しく調製した０．２５Ｍのトリス塩酸
（ｐＨ８．０）中に１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌ
を添加することにより細胞溶解を完了し、室温にて１時
間インキュベートした。次いで５ｍｌの０．２５ＭのＥ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）を懸濁液に加え、続いて清潔なピ
ペットで懸濁液をゆっくり混合した。ＥＤＴＡは二価の
陽イオンをキレートし、非特異的エンドヌクレアーゼ／
エクソヌクレアーゼを不活化した。１％の最終濃度でＳ
ＤＳを添加することにより細胞溶解物をさらに改良し
た。３６ｍｌの溶解緩衝液（１％のトリトン−Ｘ１０
０、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．６２Ｍ
のＥＤＴＡ）を加え、穏かに回転して混合した。粘性の
溶解細胞懸濁液を平衡化した１２０ｍｌのフェノールで
抽出し、水性相を回収し、この工程を繰り返した。上清
に１００ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えて希釈し、粘性を軽
減した。これに２２０ｍｌのフェノールによる抽出が一
回、及び２００ｍｌのクロロホルムによる抽出が一回続
き、その際、クロロホルムから分離するための遠心の
後、ＤＮＡを回収した。次いで、４℃にて２〜４ＬのＴ
Ｅ緩衝液で上清を４回透析した。得られた１５０ｍｌの
溶液にＲＮＡ分解酵素Ａ（１０ｍｇ／ｍｌストックの１
５０μｌ）を加え、溶液を３７℃にて１時間インキュベ
ートした。１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃ及び１容量
のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿
させ、次いで、遠心により回収した。ＤＮＡ沈殿物を３
０分間風乾し、次いで３０分間穏かに振盪することによ
り２０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、最終濃度をおよそ
２５０μｇ／ｍｌとした。
及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング １． ゲノムＤＮＡの調製 ５０ｍｌの２５％スクロース、５０ｍＭのトリス塩酸中
で１０分間穏やかに振盪して９．２ｇの細胞ペーストを
再浮遊することにより、バチルス・ステアロサーモフィ
ラスＢ６１（ニュー・イングランド・バイオラブズ・コ
レクション ＮＥＢ Ｎｏ．８５７）からゲノムＤＮＡ
を調製した。新しく調製した０．２５Ｍのトリス塩酸
（ｐＨ８．０）中に１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌ
を添加することにより細胞溶解を完了し、室温にて１時
間インキュベートした。次いで５ｍｌの０．２５ＭのＥ
ＤＴＡ（ｐＨ８．０）を懸濁液に加え、続いて清潔なピ
ペットで懸濁液をゆっくり混合した。ＥＤＴＡは二価の
陽イオンをキレートし、非特異的エンドヌクレアーゼ／
エクソヌクレアーゼを不活化した。１％の最終濃度でＳ
ＤＳを添加することにより細胞溶解物をさらに改良し
た。３６ｍｌの溶解緩衝液（１％のトリトン−Ｘ１０
０、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．６２Ｍ
のＥＤＴＡ）を加え、穏かに回転して混合した。粘性の
溶解細胞懸濁液を平衡化した１２０ｍｌのフェノールで
抽出し、水性相を回収し、この工程を繰り返した。上清
に１００ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐ
Ｈ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ）を加えて希釈し、粘性を軽
減した。これに２２０ｍｌのフェノールによる抽出が一
回、及び２００ｍｌのクロロホルムによる抽出が一回続
き、その際、クロロホルムから分離するための遠心の
後、ＤＮＡを回収した。次いで、４℃にて２〜４ＬのＴ
Ｅ緩衝液で上清を４回透析した。得られた１５０ｍｌの
溶液にＲＮＡ分解酵素Ａ（１０ｍｇ／ｍｌストックの１
５０μｌ）を加え、溶液を３７℃にて１時間インキュベ
ートした。１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃ及び１容量
のイソプロパノールを添加することによりＤＮＡを沈殿
させ、次いで、遠心により回収した。ＤＮＡ沈殿物を３
０分間風乾し、次いで３０分間穏かに振盪することによ
り２０ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁し、最終濃度をおよそ
２５０μｇ／ｍｌとした。
【００３４】２． ゲノムＤＮＡの部分消化
精製したＤＮＡをＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３
ＡＩで切断して以下のように部分消化を達成した：３つ
の５００μｌ溶液を１００μｇ／ｍｌでバチルス・ステ
アロサーモフィラスのＤＮＡから作製し；１つは、ＮＥ
緩衝液３＋ＢＳＡ（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭの
トリス塩酸、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、
１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２５℃にてｐＨ７．９）中
で、１つはＮＥ緩衝液４＋ＢＳＡ（５０ｍＭのＫ−アセ
テート、２０ｍＭのトリスアセテート、１０ｍＭのＭｇ
−アセテート、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ、２５℃にてｐＨ７．９）中で、及び１つは、ＮＥ
緩衝液 Ｓａｕ３ＡＩ＋ＢＳＡ（１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのビストリスプロパン塩酸、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、
２５℃にてｐＨ７．０）中で溶液とした。各溶液を２０
０μｌを１つ、１００μｌを３つに分割した。２００μ
ｌのチューブそれぞれに、２μｌのそれぞれの酵素（８
単位のＡｐｏＩ、２０単位のＮｌａＩＩＩ及び８単位の
Ｓａｕ３ＡＩ）を加え、ＡｐｏＩ及びＳａｕ３ＡＩとの
反応の双方についてＤＮＡ２．５μｇ当り１単位の酵素
を達成し、ＮｌａＩＩＩとの反応についてはＤＮＡのμ
ｇ当り１単位の酵素を達成した。分取した２００μｌそ
れぞれから１００μｌを取って同一緩衝液の第二の分取
試料に加え、ＡｐｏＩ及びＳａｕ３ＡＩとの反応につい
て５μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素、及びＮｌａＩＩＩ
との反応について２μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素を達
成し、このようにして、適切な酵素の先の量の半分を次
のチューブが受け取るようにした。ＡｐｏＩのチューブ
を５０℃にてインキュベートし、ＮｌａＩＩＩとＳａｕ
３ＡＩのチューブを３７℃にて１時間インキュベート
し、各チューブの５μｌをアガロースゲル電気泳動で分
析した。この方法をＮｌａＩＩＩについても繰り返した
が、反応混合物への添加に先立ってＮｌａＩＩＩを４倍
に希釈することを例外とした結果、最初のチューブでは
４μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素となり、２番目のチュ
ーブでは８μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素というように
なった。限られた消化及び中程度の、しかし不完全な消
化を示すチューブの内容物を１％の低融点アガロースゲ
ルで２時間泳動した。およそ１ｋｂ〜８ｋｂの間のＤＮ
Ａ断片をゲルから切り出し、計量した。各バンドに１／
１０容量のβ−アガラーゼ緩衝液（１０ｍＭのビストリ
ス塩酸ｐＨ６．８、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）を加えた
後、６５℃にて１０分間インキュベートした。４２℃に
て９０分間インキュベートすることにより１／１００の
β−アガラーゼでアガロースを消化した。氷上に置く
と、溶液はゼリー状になると考えられた。従って、６５
℃にて１０分間、次いで４２℃にて５分間、チューブを
さらにインキュベートし、続いて１／１００容量のβ−
アガラーゼを加えて４２℃にて９０分間インキュベート
した。１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃを加えて氷上で
１５分間インキュベートし、２容量のエタノールを一晩
添加することによりＤＮＡを沈殿させた。次いで溶液を
遠心し、上清を捨てて、ＤＮＡ沈殿物を２０μｌのＴＥ
に再懸濁し、その各１μｌをアガロースゲル電気泳動で
分析した。
ＡＩで切断して以下のように部分消化を達成した：３つ
の５００μｌ溶液を１００μｇ／ｍｌでバチルス・ステ
アロサーモフィラスのＤＮＡから作製し；１つは、ＮＥ
緩衝液３＋ＢＳＡ（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭの
トリス塩酸、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、
１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、２５℃にてｐＨ７．９）中
で、１つはＮＥ緩衝液４＋ＢＳＡ（５０ｍＭのＫ−アセ
テート、２０ｍＭのトリスアセテート、１０ｍＭのＭｇ
−アセテート、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢ
ＳＡ、２５℃にてｐＨ７．９）中で、及び１つは、ＮＥ
緩衝液 Ｓａｕ３ＡＩ＋ＢＳＡ（１００ｍＭのＮａＣ
ｌ、１０ｍＭのビストリスプロパン塩酸、１０ｍＭのＭ
ｇＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、
２５℃にてｐＨ７．０）中で溶液とした。各溶液を２０
０μｌを１つ、１００μｌを３つに分割した。２００μ
ｌのチューブそれぞれに、２μｌのそれぞれの酵素（８
単位のＡｐｏＩ、２０単位のＮｌａＩＩＩ及び８単位の
Ｓａｕ３ＡＩ）を加え、ＡｐｏＩ及びＳａｕ３ＡＩとの
反応の双方についてＤＮＡ２．５μｇ当り１単位の酵素
を達成し、ＮｌａＩＩＩとの反応についてはＤＮＡのμ
ｇ当り１単位の酵素を達成した。分取した２００μｌそ
れぞれから１００μｌを取って同一緩衝液の第二の分取
試料に加え、ＡｐｏＩ及びＳａｕ３ＡＩとの反応につい
て５μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素、及びＮｌａＩＩＩ
との反応について２μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素を達
成し、このようにして、適切な酵素の先の量の半分を次
のチューブが受け取るようにした。ＡｐｏＩのチューブ
を５０℃にてインキュベートし、ＮｌａＩＩＩとＳａｕ
３ＡＩのチューブを３７℃にて１時間インキュベート
し、各チューブの５μｌをアガロースゲル電気泳動で分
析した。この方法をＮｌａＩＩＩについても繰り返した
が、反応混合物への添加に先立ってＮｌａＩＩＩを４倍
に希釈することを例外とした結果、最初のチューブでは
４μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素となり、２番目のチュ
ーブでは８μｇのＤＮＡ当り１単位の酵素というように
なった。限られた消化及び中程度の、しかし不完全な消
化を示すチューブの内容物を１％の低融点アガロースゲ
ルで２時間泳動した。およそ１ｋｂ〜８ｋｂの間のＤＮ
Ａ断片をゲルから切り出し、計量した。各バンドに１／
１０容量のβ−アガラーゼ緩衝液（１０ｍＭのビストリ
ス塩酸ｐＨ６．８、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）を加えた
後、６５℃にて１０分間インキュベートした。４２℃に
て９０分間インキュベートすることにより１／１００の
β−アガラーゼでアガロースを消化した。氷上に置く
と、溶液はゼリー状になると考えられた。従って、６５
℃にて１０分間、次いで４２℃にて５分間、チューブを
さらにインキュベートし、続いて１／１００容量のβ−
アガラーゼを加えて４２℃にて９０分間インキュベート
した。１／１０容量の３ＭのＮａＯＡｃを加えて氷上で
１５分間インキュベートし、２容量のエタノールを一晩
添加することによりＤＮＡを沈殿させた。次いで溶液を
遠心し、上清を捨てて、ＤＮＡ沈殿物を２０μｌのＴＥ
に再懸濁し、その各１μｌをアガロースゲル電気泳動で
分析した。
【００３５】３． ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａ
ｕ３ＡＩの部分消化及び完全消化したゲノムＤＮＡライ
ブラリの構築 ベクターｐＵＣ１９を用いてＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、
及びＳａｕ３ＡＩのゲノムＤＮＡライブラリを構築し
た。上述のように、ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａ
ｕ３ＡＩで部分的に消化したバチルス・ステアロサーモ
フィラスＤＮＡの約０．５μｇ（３μｌ）を、それぞれ
ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化した並びに
ＣＩＰ処理した約０．１μｇのｐＵＣ１９と混合した。
各チューブに合計５０μｌ容量で５μｌの１０ｘ連結緩
衝液及び１μｌ（４００単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼを
加えた。反応物を１６℃にて一晩インキュベートした。
６５℃にて３０分間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを熱で不活化
し、次いで、ＶＳ型０．０２５μｍの濾紙を用いて２Ｌ
のｄＨ２Ｏ中で４時間、各チューブの内容物を微量透析
し、塩濃度を減らした結果、それぞれおよそ７５μｌの
最終容量が得られた。
ｕ３ＡＩの部分消化及び完全消化したゲノムＤＮＡライ
ブラリの構築 ベクターｐＵＣ１９を用いてＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、
及びＳａｕ３ＡＩのゲノムＤＮＡライブラリを構築し
た。上述のように、ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ、及びＳａ
ｕ３ＡＩで部分的に消化したバチルス・ステアロサーモ
フィラスＤＮＡの約０．５μｇ（３μｌ）を、それぞれ
ＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化した並びに
ＣＩＰ処理した約０．１μｇのｐＵＣ１９と混合した。
各チューブに合計５０μｌ容量で５μｌの１０ｘ連結緩
衝液及び１μｌ（４００単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼを
加えた。反応物を１６℃にて一晩インキュベートした。
６５℃にて３０分間、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを熱で不活化
し、次いで、ＶＳ型０．０２５μｍの濾紙を用いて２Ｌ
のｄＨ２Ｏ中で４時間、各チューブの内容物を微量透析
し、塩濃度を減らした結果、それぞれおよそ７５μｌの
最終容量が得られた。
【００３６】４． メチラーゼ選抜法によるＭ．Ｂｓｍ
ＢＩの選抜 形質転換実験については、電気容量２５μＦ、電圧２．
５ｋＶ及び抵抗２００オームに設定したバイオラッド
（BioRad）のジーンパルサー（Gene Pulser）を用いた
エレクトロポレーションによってＥＲ２５０２を、上記
のような透析したＤＮＡライブラリ各２μｌで形質転換
した。各チューブにＬＢ培地（０．５ｍｌ）を加え、３
７℃にて１時間インキュベートした。各チューブの内容
物をＡｐプレート上に播き、ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及
びＳａｕ３ＡＩのゲノム断片挿入物を持つｐＵＣ１９の
形質転換体を選抜するために３７℃にて一晩インキュベ
ートした。
ＢＩの選抜 形質転換実験については、電気容量２５μＦ、電圧２．
５ｋＶ及び抵抗２００オームに設定したバイオラッド
（BioRad）のジーンパルサー（Gene Pulser）を用いた
エレクトロポレーションによってＥＲ２５０２を、上記
のような透析したＤＮＡライブラリ各２μｌで形質転換
した。各チューブにＬＢ培地（０．５ｍｌ）を加え、３
７℃にて１時間インキュベートした。各チューブの内容
物をＡｐプレート上に播き、ＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及
びＳａｕ３ＡＩのゲノム断片挿入物を持つｐＵＣ１９の
形質転換体を選抜するために３７℃にて一晩インキュベ
ートした。
【００３７】およそ１，０００の形質転換体がＮｌａＩ
ＩＩライブラリについて得られ、およそ９００の形質転
換体がＳａｕ３ＡＩライブラリについて得られた。Ａｐ
ｏＩライブラリの形質転換からはＡｐＲ形質転換体は得
られなかった。ＮｌａＩＩＩライブラリ及びＳａｕ３Ａ
Ｉライブラリからの形質転換体をプールし、それぞれ３
７℃にて一晩のＬＢ＋Ａｐの培養で増やした。キアゲン
マキシ（Qiagen（登録商標） Maxi）カラム法によって
一晩培養の細胞からプラスミドＤＮＡを調製した。各プ
ラスミドライブラリから１、２、５及び１０μｌ（約
０．２μｇ、０．４μｇ、１μｇ、２μｇのＤＮＡ）を
５５℃にて一晩ＢｓｍＢＩに曝した。ＢｓｍＢＩの消化
に続いて、常法により、消化物のそれぞれ５μｌでＥＲ
２５０２及びＥＲ２６８３コンピテント細胞の各１００
μｌを形質転換した（１００μｌのコンピテント細胞と
プラスミドＤＮＡを混合し、氷上で３０分間、３７℃で
５分間、室温で５分間、１００μｌのＳＯＢを加えて３
７℃にて１時間インキュベートする）。形質転換産物を
Ａｐプレートにて３７℃で一晩増殖させる。個々のＡｐ
Ｒコロニー（ＥＲ２６８３細胞からは３３個、ＥＲ２５
０２細胞からは３個）に２ｍｌのＬＢ＋Ａｐを接種し
た。３０単位（３μｌ）のＢｓｍＢＩと５５℃にて１時
間インキュベートすることによって、各プラスミドのミ
ニプレップから１μｇ（５μｌ）を抵抗性についてスク
リーニングし、アガロースゲル電気泳動によって分析し
た。３つのコロニーがＢｓｍＢＩの消化に抵抗性である
と同定された。これら３つのうち２つが挿入物を有する
ことが判った。完全に抵抗性のクローン（ＢｓｍＢＩＭ
陽性）はＮｌａＩＩＩ部分ライブラリに由来していた。
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子を含有する断片又はｐＵＣ１９のい
ずれかがＢｓｍＢＩＭ部位を喪失したと結論付けた。
（後になって、挿入物を配列決定した際、それがＢｓｍ
ＢＩメチラーゼをコードしており、ベクターのＢｓｍＢ
Ｉ部位は無傷であることが確認された）。
ＩＩライブラリについて得られ、およそ９００の形質転
換体がＳａｕ３ＡＩライブラリについて得られた。Ａｐ
ｏＩライブラリの形質転換からはＡｐＲ形質転換体は得
られなかった。ＮｌａＩＩＩライブラリ及びＳａｕ３Ａ
Ｉライブラリからの形質転換体をプールし、それぞれ３
７℃にて一晩のＬＢ＋Ａｐの培養で増やした。キアゲン
マキシ（Qiagen（登録商標） Maxi）カラム法によって
一晩培養の細胞からプラスミドＤＮＡを調製した。各プ
ラスミドライブラリから１、２、５及び１０μｌ（約
０．２μｇ、０．４μｇ、１μｇ、２μｇのＤＮＡ）を
５５℃にて一晩ＢｓｍＢＩに曝した。ＢｓｍＢＩの消化
に続いて、常法により、消化物のそれぞれ５μｌでＥＲ
２５０２及びＥＲ２６８３コンピテント細胞の各１００
μｌを形質転換した（１００μｌのコンピテント細胞と
プラスミドＤＮＡを混合し、氷上で３０分間、３７℃で
５分間、室温で５分間、１００μｌのＳＯＢを加えて３
７℃にて１時間インキュベートする）。形質転換産物を
Ａｐプレートにて３７℃で一晩増殖させる。個々のＡｐ
Ｒコロニー（ＥＲ２６８３細胞からは３３個、ＥＲ２５
０２細胞からは３個）に２ｍｌのＬＢ＋Ａｐを接種し
た。３０単位（３μｌ）のＢｓｍＢＩと５５℃にて１時
間インキュベートすることによって、各プラスミドのミ
ニプレップから１μｇ（５μｌ）を抵抗性についてスク
リーニングし、アガロースゲル電気泳動によって分析し
た。３つのコロニーがＢｓｍＢＩの消化に抵抗性である
と同定された。これら３つのうち２つが挿入物を有する
ことが判った。完全に抵抗性のクローン（ＢｓｍＢＩＭ
陽性）はＮｌａＩＩＩ部分ライブラリに由来していた。
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子を含有する断片又はｐＵＣ１９のい
ずれかがＢｓｍＢＩＭ部位を喪失したと結論付けた。
（後になって、挿入物を配列決定した際、それがＢｓｍ
ＢＩメチラーゼをコードしており、ベクターのＢｓｍＢ
Ｉ部位は無傷であることが確認された）。
【００３８】５． ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定
ＧＰＳ（登録商標）−１ゲノムのプライミングシステム
（ニューイングランドバイオラブズ（登録商標））のプ
ライミング部位の挿入及びプライマーウォーキングによ
ってｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定を行った。ｂｓｍＢ
ＩＭ遺伝子は、予想分子量１２２．４ｋＤａを持つ１０
６８個のアミノ酸の融合タンパク質をコードする３２０
７ｂｐである。ジェンバンク（GenBank）におけるその
他のメチラーゼとの配列の比較は、Ｍ．ＢｓｍＢＩが、
アミノメチラーゼ（Ｎ６Ａメチラーゼ）とＣ５−メチラ
ーゼの融合の結果である融合タンパク質であること示し
た。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定の間に、部分ＯＲＦ
（後に１５８７ｂｐであると決定された）がそこにある
ので、制限遺伝子（ｂｓｍＢＩＲ）はおそらくｂｓｍＢ
ＩＭ遺伝子の下流に位置するらしいことが判った。ほと
んどの制限−修飾システムにおける制限遺伝子と修飾遺
伝子は今日まで、互いに数百塩基対の範囲内で同定され
ることが判っているので、これを仮説立てた。
（ニューイングランドバイオラブズ（登録商標））のプ
ライミング部位の挿入及びプライマーウォーキングによ
ってｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定を行った。ｂｓｍＢ
ＩＭ遺伝子は、予想分子量１２２．４ｋＤａを持つ１０
６８個のアミノ酸の融合タンパク質をコードする３２０
７ｂｐである。ジェンバンク（GenBank）におけるその
他のメチラーゼとの配列の比較は、Ｍ．ＢｓｍＢＩが、
アミノメチラーゼ（Ｎ６Ａメチラーゼ）とＣ５−メチラ
ーゼの融合の結果である融合タンパク質であること示し
た。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の配列決定の間に、部分ＯＲＦ
（後に１５８７ｂｐであると決定された）がそこにある
ので、制限遺伝子（ｂｓｍＢＩＲ）はおそらくｂｓｍＢ
ＩＭ遺伝子の下流に位置するらしいことが判った。ほと
んどの制限−修飾システムにおける制限遺伝子と修飾遺
伝子は今日まで、互いに数百塩基対の範囲内で同定され
ることが判っているので、これを仮説立てた。
【００３９】６． 予め修飾した宿主を構築するための
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子のｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３
９へのクローニング以下の配列で３つのプライマーを合
成した： ５’ｔａａｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇａａｃｔｃｃｔｔａｔｃａｃｔａａａａｇａｔｇａａ
３’ （２４９−１６４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４） ５’ａｔｇａａａｇｔｃｇａｃｃｃｃｇｔａａｔｔｔｔ
ａｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔｔａａａａ３’ （２４９−１６５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５） ５’ｔａｔｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇａａａｇｔａａｔａｃｔｇａａｔｇａｔｔｔａｇａａ
３’ （２４９−２５５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
ｂｓｍＢＩＭ遺伝子のｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３
９へのクローニング以下の配列で３つのプライマーを合
成した： ５’ｔａａｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇａａｃｔｃｃｔｔａｔｃａｃｔａａａａｇａｔｇａａ
３’ （２４９−１６４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４） ５’ａｔｇａａａｇｔｃｇａｃｃｃｃｇｔａａｔｔｔｔ
ａｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔｔａａａａ３’ （２４９−１６５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５） ５’ｔａｔｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇａａａｇｔａａｔａｃｔｇａａｔｇａｔｔｔａｇａａ
３’ （２４９−２５５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
【００４０】プライマー２４６−１６４及び２４９−１
６５を用い、９５℃で５分間を１サイクル、９５℃で１
分間、５５℃で１分間、７２℃で５分間を、２５サイク
ルの条件下で、ベント（Vent）ＤＮＡポリメラーゼによ
るＰＣＲによってゲノムＤＮＡからｂｓｍＢＩＭ遺伝子
を上手く増幅した。キアゲンスピンカラムによりＰＣＲ
のＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、
テトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子の真ん中をＰＣＲ
のＤＮＡの挿入目的位置として適合する末端を持つ、Ｃ
ＩＰ処理したｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９に連結
した。
６５を用い、９５℃で５分間を１サイクル、９５℃で１
分間、５５℃で１分間、７２℃で５分間を、２５サイク
ルの条件下で、ベント（Vent）ＤＮＡポリメラーゼによ
るＰＣＲによってゲノムＤＮＡからｂｓｍＢＩＭ遺伝子
を上手く増幅した。キアゲンスピンカラムによりＰＣＲ
のＤＮＡを精製し、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、
テトラサイクリン（Ｔｃ）耐性遺伝子の真ん中をＰＣＲ
のＤＮＡの挿入目的位置として適合する末端を持つ、Ｃ
ＩＰ処理したｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９に連結
した。
【００４１】常法を用いて、連結したｂｓｍＢＩＭ遺伝
子を持つベクターｐＡＣＹＣ１８４で大腸菌ＥＲ２６８
３を形質転換し、クロラムフェニコール（Ｃｍ）プレー
トに播いた。常法を用いて、連結したｂｓｍＢＩＭ遺伝
子を持つｐＬＧ３３９で大腸菌ＥＲ２５０２を形質転換
し、カナマイシン（Ｋｍ）プレートで増殖させた。それ
ぞれ、Ｃｍ＋Ｔｃプレート及びＫｍ＋Ｔｃプレートにお
いてＴｃの感受性について形質転換体を調べた。Ｔｃ耐
性遺伝子に挿入物を持つクローンは、Ｔｃ耐性遺伝子の
真ん中における挿入物の挿入のためにＴｃに感受性を示
すはずである。
子を持つベクターｐＡＣＹＣ１８４で大腸菌ＥＲ２６８
３を形質転換し、クロラムフェニコール（Ｃｍ）プレー
トに播いた。常法を用いて、連結したｂｓｍＢＩＭ遺伝
子を持つｐＬＧ３３９で大腸菌ＥＲ２５０２を形質転換
し、カナマイシン（Ｋｍ）プレートで増殖させた。それ
ぞれ、Ｃｍ＋Ｔｃプレート及びＫｍ＋Ｔｃプレートにお
いてＴｃの感受性について形質転換体を調べた。Ｔｃ耐
性遺伝子に挿入物を持つクローンは、Ｔｃ耐性遺伝子の
真ん中における挿入物の挿入のためにＴｃに感受性を示
すはずである。
【００４２】精製したｂｓｍＢＩＭのＰＣＲＤＮＡをＢ
ａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、適合する末端を持つ、Ｃ
ＩＰ処理したｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９に連結
した。常法を用いて、連結したｐＬＧ３３９−ＢｓｍＢ
ＩＭでＥＲ２５０２を形質転換し、Ｋｍプレートで増殖
させた。常法を用いて、連結したｐＡＣＹＣ１８４−Ｂ
ｓｍＢＩＭでＥＲ２５０２を形質転換し、Ｃｍプレート
で増殖させた。次いで、Ｋｍプレート及びＣｍプレート
双方からのコロニーをそれぞれＫｍ＋Ｔｃプレート及び
Ｃｍ＋Ｔｃプレートに接種した。Ｔｃ感受性を示したＫ
ｍ＋Ｔｃプレートからの１８コロニー及びＣｍ＋Ｔｃプ
レートからの１８コロニーをそれぞれ、ＬＢ＋Ｋｍプレ
ート及びＬＢ＋Ｃｍプレートに接種した。このような培
養のそれぞれからのミニプレップＤＮＡをＢｓｍＢＩで
消化して切断への抵抗性を調べた。 プラスミドｐＬＧ
３３９を含有する１８コロニー（Ｋｍ含有プレートから
の）のうち、４つは切断への完全な抵抗性を示し、３つ
は切断への部分的な抵抗性を示し、１１は切断への抵抗
性を示さなかった。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を含有
する１８コロニー（Ｃｍ含有プレートからの）のうち、
６つは切断への完全な抵抗性を示し、４つは切断への部
分的な抵抗性を示し、８つは切断への抵抗性を示さなか
った。
ａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、適合する末端を持つ、Ｃ
ＩＰ処理したｐＡＣＹＣ１８４及びｐＬＧ３３９に連結
した。常法を用いて、連結したｐＬＧ３３９−ＢｓｍＢ
ＩＭでＥＲ２５０２を形質転換し、Ｋｍプレートで増殖
させた。常法を用いて、連結したｐＡＣＹＣ１８４−Ｂ
ｓｍＢＩＭでＥＲ２５０２を形質転換し、Ｃｍプレート
で増殖させた。次いで、Ｋｍプレート及びＣｍプレート
双方からのコロニーをそれぞれＫｍ＋Ｔｃプレート及び
Ｃｍ＋Ｔｃプレートに接種した。Ｔｃ感受性を示したＫ
ｍ＋Ｔｃプレートからの１８コロニー及びＣｍ＋Ｔｃプ
レートからの１８コロニーをそれぞれ、ＬＢ＋Ｋｍプレ
ート及びＬＢ＋Ｃｍプレートに接種した。このような培
養のそれぞれからのミニプレップＤＮＡをＢｓｍＢＩで
消化して切断への抵抗性を調べた。 プラスミドｐＬＧ
３３９を含有する１８コロニー（Ｋｍ含有プレートから
の）のうち、４つは切断への完全な抵抗性を示し、３つ
は切断への部分的な抵抗性を示し、１１は切断への抵抗
性を示さなかった。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４を含有
する１８コロニー（Ｃｍ含有プレートからの）のうち、
６つは切断への完全な抵抗性を示し、４つは切断への部
分的な抵抗性を示し、８つは切断への抵抗性を示さなか
った。
【００４３】切断への完全な抵抗性を示した６つのｐＡ
ＣＹＣ１８４クローンのうち５つからのプラスミドをＢ
ａｍＨＩとＳａｌＩで切断して挿入物のサイズをチェッ
クした。５つのクローンはすべて、ｂｓｍＢＩＭ遺伝子
のサイズである、およそ３．２ｋｂの挿入物を有してい
た。ＢｓｍＢＩによる切断に完全な抵抗性を示し、Ｂｓ
ｍＢＩＭ遺伝子のサイズの挿入物を示したので、このよ
うなクローンはＭ．ＢｓｍＢＩ陽性であると結論付け
た。このような５つのＭ．ＢｓｍＢＩ陽性クローンのう
ちの４つからのミニプレップＤＮＡで常法を用いてＥＲ
２７４４を形質転換し、Ｃｍプレートで増殖させた。得
られた形質転換体をＬＢ培地＋Ｃｍで増殖させ、遠心
し、冷却ＣａＣｌ２により受容能を持たせ、予め修飾し
た宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を作
り出した。
ＣＹＣ１８４クローンのうち５つからのプラスミドをＢ
ａｍＨＩとＳａｌＩで切断して挿入物のサイズをチェッ
クした。５つのクローンはすべて、ｂｓｍＢＩＭ遺伝子
のサイズである、およそ３．２ｋｂの挿入物を有してい
た。ＢｓｍＢＩによる切断に完全な抵抗性を示し、Ｂｓ
ｍＢＩＭ遺伝子のサイズの挿入物を示したので、このよ
うなクローンはＭ．ＢｓｍＢＩ陽性であると結論付け
た。このような５つのＭ．ＢｓｍＢＩ陽性クローンのう
ちの４つからのミニプレップＤＮＡで常法を用いてＥＲ
２７４４を形質転換し、Ｃｍプレートで増殖させた。得
られた形質転換体をＬＢ培地＋Ｃｍで増殖させ、遠心
し、冷却ＣａＣｌ２により受容能を持たせ、予め修飾し
た宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩＭ］を作
り出した。
【００４４】７． インバースＰＣＲによるｂｓｍＢＩ
Ｒのクローニング及びｂｓｍＢＩＲ遺伝子の配列決定以
下の配列で７つのプライマーを合成した： ５’ｃｃｃａｔａａａｇｃｃｃｇｃａｃｔｔｇｃｃａｔ
ｇ３’（２４９−３３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７） ５’ｔｇａｃｇａｔｇａｔｔｃｃａａａｔｔａｃｔｔａ
ｇ３’（２４９−３４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８） ５’ｃｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｃｔａｃｔｔａａｔｔｇ
ａａｃｔ３’（２４９−２５６）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１９） ５’ｔｔａｔａａｃａａｃａａｔａｃａｃａａｇｃｔｔ
ｔｃｃｃ３’（２４９−２５７）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２０） ５’ｔｃｔｔａｃｃｃｃａｔｃｃｔｔｃａｇａｃａａａ
ｃ３’（２５０−５５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１） ５’ａａｇａｃｃｃａｇｇｇｃｇａｃａｔｇａｃｇａｔ
ａａ３’（２５０−５６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
２） ５’ｔｇｔａｔａｔｇｇａｃａｔａｔｔｇｇａａａｇａ
ｔ３’（２５０−５７）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
Ｒのクローニング及びｂｓｍＢＩＲ遺伝子の配列決定以
下の配列で７つのプライマーを合成した： ５’ｃｃｃａｔａａａｇｃｃｃｇｃａｃｔｔｇｃｃａｔ
ｇ３’（２４９−３３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７） ５’ｔｇａｃｇａｔｇａｔｔｃｃａａａｔｔａｃｔｔａ
ｇ３’（２４９−３４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８） ５’ｃｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｃｔａｃｔｔａａｔｔｇ
ａａｃｔ３’（２４９−２５６）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１９） ５’ｔｔａｔａａｃａａｃａａｔａｃａｃａａｇｃｔｔ
ｔｃｃｃ３’（２４９−２５７）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２０） ５’ｔｃｔｔａｃｃｃｃａｔｃｃｔｔｃａｇａｃａａａ
ｃ３’（２５０−５５）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１） ５’ａａｇａｃｃｃａｇｇｇｃｇａｃａｔｇａｃｇａｔ
ａａ３’（２５０−５６）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
２） ５’ｔｇｔａｔａｔｇｇａｃａｔａｔｔｇｇａａａｇａ
ｔ３’（２５０−５７）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
【００４５】ゲノムＤＮＡをＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、Ｂ
ｓａＨＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、Ｄｒ
ａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｙｐ９４Ｉ、Ｈ
ｐｙＣＨ４ＩＶ、ＰｓｉＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、Ｔｓ
ｅＩ、及びＸｂａＩで消化した。 消化したＤＮＡを２
μｇ／ｍｌにて低いＤＮＡ濃度で連結し、次いで、プラ
イマー２４９−３３と２４９−３４を用いたｂｓｍＢＩ
Ｒ遺伝子のインバースＰＣＲ増幅に用いた。インバース
ＰＣＲの条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７
２℃で１分間を３５サイクルであった。インバースＰＣ
Ｒ産物は、ＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓｒＧＩ、Ｄｒａ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ、ＴａｑＩ及びＸｂａＩ
の鋳型に由来していた。ＡａｔＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＰｓｉＩ及びＸｂａＩの鋳型に由来するインバースＰＣ
Ｒ産物を低融点アガロースからゲル精製し、プライマー
２４９−３３及び２４９−３４を用いて配列決定した。
プライマー２４９−２３３及び２２９−２２４を用いて
さらにＰｓｉＩ及びＸｂａＩ断片の配列決定を行った。
次いで、ゲノムＤＮＡ及びプライマー２４９−３３及び
２４９−２５６並びにプライマー２４９−３３及び２４
９−２５７を用い、９４℃で５分間を１サイクル、９４
℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を２５サ
イクルの条件下で、ＰＣＲを行った。低融点アガロース
からＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマー２４９−３
３、２５０−５５、２５０−５６及び２５０−５７を用
いて配列決定した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の下流に１５４
７ｂｐのＯＲＦが見い出された。このＯＲＦをｂｓｍＢ
ＩＲ遺伝子と命名した。それは６２ｋＤａの予想分子量
を持つ５３０個のアミノ酸のタンパク質をコードしてい
る。
ｓａＨＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、Ｄｒ
ａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈｙｐ９４Ｉ、Ｈ
ｐｙＣＨ４ＩＶ、ＰｓｉＩ、ＳｓｐＩ、ＴａｑＩ、Ｔｓ
ｅＩ、及びＸｂａＩで消化した。 消化したＤＮＡを２
μｇ／ｍｌにて低いＤＮＡ濃度で連結し、次いで、プラ
イマー２４９−３３と２４９−３４を用いたｂｓｍＢＩ
Ｒ遺伝子のインバースＰＣＲ増幅に用いた。インバース
ＰＣＲの条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７
２℃で１分間を３５サイクルであった。インバースＰＣ
Ｒ産物は、ＡａｔＩＩ、ＡｌｕＩ、ＢｓｒＧＩ、Ｄｒａ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｉＩ、ＴａｑＩ及びＸｂａＩ
の鋳型に由来していた。ＡａｔＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、
ＰｓｉＩ及びＸｂａＩの鋳型に由来するインバースＰＣ
Ｒ産物を低融点アガロースからゲル精製し、プライマー
２４９−３３及び２４９−３４を用いて配列決定した。
プライマー２４９−２３３及び２２９−２２４を用いて
さらにＰｓｉＩ及びＸｂａＩ断片の配列決定を行った。
次いで、ゲノムＤＮＡ及びプライマー２４９−３３及び
２４９−２５６並びにプライマー２４９−３３及び２４
９−２５７を用い、９４℃で５分間を１サイクル、９４
℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を２５サ
イクルの条件下で、ＰＣＲを行った。低融点アガロース
からＰＣＲ産物をゲル精製し、プライマー２４９−３
３、２５０−５５、２５０−５６及び２５０−５７を用
いて配列決定した。ｂｓｍＢＩＭ遺伝子の下流に１５４
７ｂｐのＯＲＦが見い出された。このＯＲＦをｂｓｍＢ
ＩＲ遺伝子と命名した。それは６２ｋＤａの予想分子量
を持つ５３０個のアミノ酸のタンパク質をコードしてい
る。
【００４６】８． Ｔ７発現ベクターｐＡＩＩ１７にお
けるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現以下の配列で２つのプラ
イマーを合成した： ５’ｇｇｇｔａｇａｔｔｃａｔａｔｇｇｃｔａａａｔａ
ｃｇｇａｃｇｔｇｇａａａｇｔｔｔ３’（２５０−８
８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４） ５’ｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｃａｔａｔａａｔｃｔｔｔａ
ｇｃａａｔｃｔｇｃｔｃｃｃ３’（２５０−８９）（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
けるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現以下の配列で２つのプラ
イマーを合成した： ５’ｇｇｇｔａｇａｔｔｃａｔａｔｇｇｃｔａａａｔａ
ｃｇｇａｃｇｔｇｇａａａｇｔｔｔ３’（２５０−８
８）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４） ５’ｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｃａｔａｔａａｔｃｔｔｔａ
ｇｃａａｔｃｔｇｃｔｃｃｃ３’（２５０−８９）（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
【００４７】ベントＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー
２５０−８８と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を
１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃
で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによっ
てｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラ
ムによりＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ
で一晩消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を
持ったｐＡＩＩ１７にＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め
修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩ
Ｍ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質
転換体について選抜した。５４のプラスミドのミニプレ
ップの中には、所望の挿入物を持つクローンはなかっ
た。中程度のコピー数のプラスミドではｂｓｍＢＩＲ遺
伝子をクローニングし、発現させるのは困難であると結
論付けた。
２５０−８８と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を
１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃
で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによっ
てｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。キアゲンスピンカラ
ムによりＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ
で一晩消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を
持ったｐＡＩＩ１７にＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め
修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−ＢｓｍＢＩ
Ｍ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質
転換体について選抜した。５４のプラスミドのミニプレ
ップの中には、所望の挿入物を持つクローンはなかっ
た。中程度のコピー数のプラスミドではｂｓｍＢＩＲ遺
伝子をクローニングし、発現させるのは困難であると結
論付けた。
【００４８】９． Ｔ７発現ベクターｐＥＴ２１ａｔに
おけるｂｓｍＢＩＲの発現 ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の残りの精製したＰＣＲ産物をＮｄ
ｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、
適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔにＰＣＲのＤＮＡを
連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ
−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、Ａｐ
ＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。スクリーニング
した３６プラスミドの中に所望の挿入物を持つクローン
はなかった。
おけるｂｓｍＢＩＲの発現 ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の残りの精製したＰＣＲ産物をＮｄ
ｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、
適合する末端を持つｐＥＴ２１ａｔにＰＣＲのＤＮＡを
連結した。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ
−ＢｓｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、Ａｐ
ＲＣｍＲ形質転換体について選抜した。スクリーニング
した３６プラスミドの中に所望の挿入物を持つクローン
はなかった。
【００４９】ベントＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー
２５０−８８と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を
１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃
で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによる
ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の増幅を反復した。ＰＣＲ産物をフ
ェノール−ＣＨＣｌ３抽出により精製し、ＮｄｅＩ及び
ＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する
末端を持つｐＥＴ２１ａｔにＰＣＲのＤＮＡを連結し
た。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−Ｂｓ
ｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍ
Ｒ形質転換体について選抜した。２２のプラスミドのミ
ニプレップの中には、所望の挿入物を持つクローンはな
かった。おそらく大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢ
ｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化の結果として、ｐＥＴ
ベクターではｂｓｍＢＩＲ遺伝子のクローニングを行う
ことは困難であると結論付けた。
２５０−８８と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を
１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃
で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによる
ｂｓｍＢＩＲ遺伝子の増幅を反復した。ＰＣＲ産物をフ
ェノール−ＣＨＣｌ３抽出により精製し、ＮｄｅＩ及び
ＢａｍＨＩで消化した。ＤＮＡを精製した後、適合する
末端を持つｐＥＴ２１ａｔにＰＣＲのＤＮＡを連結し
た。予め修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＡＣＹＣ−Ｂｓ
ｍＢＩＭ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍ
Ｒ形質転換体について選抜した。２２のプラスミドのミ
ニプレップの中には、所望の挿入物を持つクローンはな
かった。おそらく大腸菌ゲノム又はベクターにおけるＢ
ｓｍＢＩ部位の不十分なメチル化の結果として、ｐＥＴ
ベクターではｂｓｍＢＩＲ遺伝子のクローニングを行う
ことは困難であると結論付けた。
【００５０】１０． 予め修飾された宿主を構築するた
めのｂｓｍＢＩＭのｐＢＲ３２２へのクローニング 次の発現戦略は、中程度のコピー数のプラスミドでｂｓ
ｍＢＩＭ遺伝子を発現させ、低いコピー数のプラスミド
でｂｓｍＢＩＲ遺伝子を発現させることである。発現宿
主においてＢｓｍＢＩメチラーゼの発現を高めるために
ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したｂｓｍＢＩＭのＰＣＲ
のＤＮＡを適合する末端を持つｐＢＲ３２２に連結し
た。コンピテントＥＲ２５６６及びコンピテントＥＲ２
６８３を連結したＤＮＡで形質転換し、アンピシリンプ
レートで増殖させた。１８のプラスミドのミニプレップ
のうち、３つのクローンがＢｓｍＢＩの切断に完全に抵
抗性であり、正しい挿入物サイズを有していた。次いで
冷却ＣａＣｌ２処理により細胞に受容能を持たせ、予め
修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩ
Ｍ］を作り出した。
めのｂｓｍＢＩＭのｐＢＲ３２２へのクローニング 次の発現戦略は、中程度のコピー数のプラスミドでｂｓ
ｍＢＩＭ遺伝子を発現させ、低いコピー数のプラスミド
でｂｓｍＢＩＲ遺伝子を発現させることである。発現宿
主においてＢｓｍＢＩメチラーゼの発現を高めるために
ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したｂｓｍＢＩＭのＰＣＲ
のＤＮＡを適合する末端を持つｐＢＲ３２２に連結し
た。コンピテントＥＲ２５６６及びコンピテントＥＲ２
６８３を連結したＤＮＡで形質転換し、アンピシリンプ
レートで増殖させた。１８のプラスミドのミニプレップ
のうち、３つのクローンがＢｓｍＢＩの切断に完全に抵
抗性であり、正しい挿入物サイズを有していた。次いで
冷却ＣａＣｌ２処理により細胞に受容能を持たせ、予め
修飾した宿主ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩ
Ｍ］を作り出した。
【００５１】１１． Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ
７ｔｅｒにおけるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現 以下の配列でプライマーを１つ合成した： ５’ａａｇｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇｇｃｔａａａｔａｃｇｇａａａｇｔｔｔ３’（２５２
−２７０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
７ｔｅｒにおけるｂｓｍＢＩＲ遺伝子の発現 以下の配列でプライマーを１つ合成した： ５’ａａｇｇｇａｔｃｃｇｇａｇｇｔａａａｔａａａｔ
ｇｇｃｔａａａｔａｃｇｇａａａｇｔｔｔ３’（２５２
−２７０）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
【００５２】ベントＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー
２５２−７０と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を
１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃
で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによっ
てｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。フェノール−ＣＨＣ
ｌ３抽出によってＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩで消
化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を持つｐＡ
ＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め
修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩ
Ｍ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質
転換体について選抜した。７２のプラスミドのミニプレ
ップのうちで９つのクローンが所望の挿入物を持ってい
た。９つのクローンすべてを１０ｍｌのＬＢにＡｐとＣ
ｍを加えたもので培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）
で３時間誘導した。細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩ活
性を測定した。２つのクローン、Ｎｏ．２４及びＮｏ．
２６が高いＢｓｍＢＩ活性を示した。このような２つの
クローンを５００ｍｌのＬＢにＡｐとＣｍを加えたもの
で培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導し
た。クローンＮｏ．２４とＮｏ．２６は双方共高いＢｓ
ｍＢＩ活性を示した。湿った細胞のグラム当り１０６単
位を上回って見い出された。ＢｓｍＢＩはＩＩ型制限酵
素の中でも最も高い比活性を示す。クローンＮｏ．２４
及びＮｏ．２６はそれぞれ２０ｍｌのＬＢプラスＡｐ及
びＣｍで増殖させ、それぞれ１０ｍｌはＩＰＴＧ（最終
０．５ｍＭ）で３時間誘導した。誘導した培養からそれ
ぞれ１ｍｌずつ取って、均等に３つに分け、１つは加熱
しないまま放置し、１つは５５℃にて４５分間加熱し、
１つは６５℃にて４５分間加熱した。クローンは双方
共、３つの誘導した培養及び誘導しない培養のすべてが
活性を示した。双方のクローンの４試料からそれぞれ、
５、１０及び１５μｌをポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析した。誘導した試料にはＢｓｍＢＩ（約６０ｋ
Ｄａ）のおよそのサイズのタンパク質が存在することが
ゲルから判明した。
２５２−７０と２５０−８９を用い、９５℃で２分間を
１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃
で２分間を２０サイクルという条件下でのＰＣＲによっ
てｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。フェノール−ＣＨＣ
ｌ３抽出によってＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩで消
化した。ＤＮＡを精製した後、適合する末端を持つｐＡ
ＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒにＰＣＲのＤＮＡを連結した。予め
修飾した宿主ＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩ
Ｍ］を連結したＤＮＡで形質転換し、ＡｐＲＣｍＲ形質
転換体について選抜した。７２のプラスミドのミニプレ
ップのうちで９つのクローンが所望の挿入物を持ってい
た。９つのクローンすべてを１０ｍｌのＬＢにＡｐとＣ
ｍを加えたもので培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）
で３時間誘導した。細胞抽出物を調製し、ＢｓｍＢＩ活
性を測定した。２つのクローン、Ｎｏ．２４及びＮｏ．
２６が高いＢｓｍＢＩ活性を示した。このような２つの
クローンを５００ｍｌのＬＢにＡｐとＣｍを加えたもの
で培養し、ＩＰＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導し
た。クローンＮｏ．２４とＮｏ．２６は双方共高いＢｓ
ｍＢＩ活性を示した。湿った細胞のグラム当り１０６単
位を上回って見い出された。ＢｓｍＢＩはＩＩ型制限酵
素の中でも最も高い比活性を示す。クローンＮｏ．２４
及びＮｏ．２６はそれぞれ２０ｍｌのＬＢプラスＡｐ及
びＣｍで増殖させ、それぞれ１０ｍｌはＩＰＴＧ（最終
０．５ｍＭ）で３時間誘導した。誘導した培養からそれ
ぞれ１ｍｌずつ取って、均等に３つに分け、１つは加熱
しないまま放置し、１つは５５℃にて４５分間加熱し、
１つは６５℃にて４５分間加熱した。クローンは双方
共、３つの誘導した培養及び誘導しない培養のすべてが
活性を示した。双方のクローンの４試料からそれぞれ、
５、１０及び１５μｌをポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析した。誘導した試料にはＢｓｍＢＩ（約６０ｋ
Ｄａ）のおよそのサイズのタンパク質が存在することが
ゲルから判明した。
【００５３】クローンＮｏ．２４を５００ｍｌのＬＢ＋
Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３７℃にて一晩増殖させた。一晩
培養した細胞１０ｍｌを用いて新鮮な５００ｍｌのＬＢ
＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３７℃にて４時間培養し、ＩＰ
ＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。細胞を回収
し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。細胞抽出物は、Ｂｓｍ
ＢＩエンドヌクレアーゼの切断に特徴的な活性を示した
が、その収量は、新鮮な形質転換体から増殖された小規
模１０ｍｌの培養よりもはるかに少なかった。発現クロ
ーンＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡ
ＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］はさほど安定なク
ローンではないと結論付けた。発現クローンをさらに安
定化するために２つの戦略を用いた： ａ） Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロ
モータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコー
ドするＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミド
を導入すること。 ｂ） 発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラ
ーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること。
Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３７℃にて一晩増殖させた。一晩
培養した細胞１０ｍｌを用いて新鮮な５００ｍｌのＬＢ
＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３７℃にて４時間培養し、ＩＰ
ＴＧ（最終０．５ｍＭ）で３時間誘導した。細胞を回収
し、ＢｓｍＢＩ活性を測定した。細胞抽出物は、Ｂｓｍ
ＢＩエンドヌクレアーゼの切断に特徴的な活性を示した
が、その収量は、新鮮な形質転換体から増殖された小規
模１０ｍｌの培養よりもはるかに少なかった。発現クロ
ーンＥＲ２７４４［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＡ
ＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］はさほど安定なク
ローンではないと結論付けた。発現クローンをさらに安
定化するために２つの戦略を用いた： ａ） Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを阻害するためＴ７プロ
モータによる構成性発現を減らすＴ７リゾチームをコー
ドするＴ７ｌｙｓＳを組み込んだもう１つのプラスミド
を導入すること。 ｂ） 発現宿主を予め修飾するために同族でないメチラ
ーゼ、ＢｓｍＡＩメチラーゼを用いること。
【００５４】１２． ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂ
ｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８］予め修飾した宿主の構築 プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＳＣ１０１複製開始点及び
Ｔ７リゾチームをコードするｌｙｓＳ遺伝子を持ってい
る。プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＢＲ３２２及びｐＡＣ
ＹＣ−Ｔ７ｔｅｒと適合性があるので、同じ発現宿主を
形質転換することができる。１０μｌのｐＣＥＦ８（Ｋ
ｍＲ）でコンピテント細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２
−ＢｓｍＢＩＭ」（１００μｌ）を常法で形質転換し、
Ａｐ＋Ｋｍプレートで３７℃にて一晩増殖させた。８つ
の１０ｍｌＬＢとＡｐ＋ＫｍのチューブにＡｐＲＫｍＲ
形質転換体を接種し、３７℃で２．５時間増殖させ、冷
却ＣａＣｌ２で洗浄することにより受容能を持たせた。
ｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８］予め修飾した宿主の構築 プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＳＣ１０１複製開始点及び
Ｔ７リゾチームをコードするｌｙｓＳ遺伝子を持ってい
る。プラスミドｐＣＥＦ８は、ｐＢＲ３２２及びｐＡＣ
ＹＣ−Ｔ７ｔｅｒと適合性があるので、同じ発現宿主を
形質転換することができる。１０μｌのｐＣＥＦ８（Ｋ
ｍＲ）でコンピテント細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２
−ＢｓｍＢＩＭ」（１００μｌ）を常法で形質転換し、
Ａｐ＋Ｋｍプレートで３７℃にて一晩増殖させた。８つ
の１０ｍｌＬＢとＡｐ＋ＫｍのチューブにＡｐＲＫｍＲ
形質転換体を接種し、３７℃で２．５時間増殖させ、冷
却ＣａＣｌ２で洗浄することにより受容能を持たせた。
【００５５】１３． Ｔ７発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｔ
７ｔｅｒにおける及びｌｙｓＳの存在下におけるｂｓｍ
ＢＩＲ遺伝子の発現 プライマー２５２−２７０と２４９−８９を用い、９５
℃で２分間を１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１
分間、７２℃で２分間を１３サイクルという条件下でＰ
ＣＲを行い、ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。少ないＰ
ＣＲサイクル（１３サイクル）はＰＣＲにおける突然変
異率を減らすことを意図していた。ＰＣＲのＤＮＡを等
容量のフェノール−クロロホルムで２回抽出し、等容量
のクロロホルムで１回抽出し、ＮａＯＡｃ、９５％の冷
却エタノールで沈殿させ、７０％の冷却エタノールで洗
浄した。次いで、精製したＰＣＲのＤＮＡを３７℃にて
一晩ＢａｍＨＩで消化し、その０．５μｇを連結緩衝液
中での１６℃にて一晩の０．１μｇのｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒとの連結に用いた。
７ｔｅｒにおける及びｌｙｓＳの存在下におけるｂｓｍ
ＢＩＲ遺伝子の発現 プライマー２５２−２７０と２４９−８９を用い、９５
℃で２分間を１サイクル、９５℃で１分間、６０℃で１
分間、７２℃で２分間を１３サイクルという条件下でＰ
ＣＲを行い、ｂｓｍＢＩＲ遺伝子を増幅した。少ないＰ
ＣＲサイクル（１３サイクル）はＰＣＲにおける突然変
異率を減らすことを意図していた。ＰＣＲのＤＮＡを等
容量のフェノール−クロロホルムで２回抽出し、等容量
のクロロホルムで１回抽出し、ＮａＯＡｃ、９５％の冷
却エタノールで沈殿させ、７０％の冷却エタノールで洗
浄した。次いで、精製したＰＣＲのＤＮＡを３７℃にて
一晩ＢａｍＨＩで消化し、その０．５μｇを連結緩衝液
中での１６℃にて一晩の０．１μｇのｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒとの連結に用いた。
【００５６】連結したプラスミドＤＮＡ（５μｌ）で１
００μｌのＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩ
Ｍ、ｐＣＥＦ８］を形質転換し、３７℃にて一晩、ＬＢ
＋Ａｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍプレートで増殖させた。３６のＡｐ
ＲＣｍＲＫｍＲ形質転換体をそれぞれ２ｍｌのＬＢ＋Ａ
ｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍに接種し、３７℃にて一晩増殖させた。
３６クローンのミニプレップＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物
は、２４クローンが正しいサイズ（およそ１．５ｋｂ）
の挿入物を含有していることを示した。２４クローンの
ミニプレップＤＮＡのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物
は、このようなクローンのうち１５が正しい方向でｂｓ
ｍＢＩＲ遺伝子を有することを示した。このような１５
のクローンの培養の残りを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍ
＋Ｋｍに接種し、３７℃にて４時間増殖させ、６ｋｒｐ
ｍで１０分間遠心し、１ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再
懸濁し、３０秒間で２回、超音波破砕し、１４ｋｒｐｍ
で１０分間遠心した。活性について得られた上清を測定
し、１３のクローンでＢｓｍＢＩ様活性が見られた。こ
の新しい発現株は、３つのプラスミド、ＥＲ２５６６
［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８、ｐＡＣＹ
Ｃ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を含有していた。ｐＡ
ＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲにおけるｂｓｍＢＩ
Ｒ遺伝子にサイレント突然変異が１つ見い出された。遺
伝子全体を配列決定して、それが野生型アミノ酸配列を
コードすることを確認した。
００μｌのＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩ
Ｍ、ｐＣＥＦ８］を形質転換し、３７℃にて一晩、ＬＢ
＋Ａｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍプレートで増殖させた。３６のＡｐ
ＲＣｍＲＫｍＲ形質転換体をそれぞれ２ｍｌのＬＢ＋Ａ
ｐ＋Ｃｍ＋Ｋｍに接種し、３７℃にて一晩増殖させた。
３６クローンのミニプレップＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物
は、２４クローンが正しいサイズ（およそ１．５ｋｂ）
の挿入物を含有していることを示した。２４クローンの
ミニプレップＤＮＡのＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化物
は、このようなクローンのうち１５が正しい方向でｂｓ
ｍＢＩＲ遺伝子を有することを示した。このような１５
のクローンの培養の残りを１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍ
＋Ｋｍに接種し、３７℃にて４時間増殖させ、６ｋｒｐ
ｍで１０分間遠心し、１ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再
懸濁し、３０秒間で２回、超音波破砕し、１４ｋｒｐｍ
で１０分間遠心した。活性について得られた上清を測定
し、１３のクローンでＢｓｍＢＩ様活性が見られた。こ
の新しい発現株は、３つのプラスミド、ＥＲ２５６６
［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＢＩＭ、ｐＣＥＦ８、ｐＡＣＹ
Ｃ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を含有していた。ｐＡ
ＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲにおけるｂｓｍＢＩ
Ｒ遺伝子にサイレント突然変異が１つ見い出された。遺
伝子全体を配列決定して、それが野生型アミノ酸配列を
コードすることを確認した。
【００５７】１４． ＢｓｍＡＩで予め修飾した宿主に
おけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現 ２つのクローン（Ｎｏ．１及びＮｏ．１０）のミニプレ
ップＤＮＡでＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩ
Ｍ］（ＢｓｍＡＩ、米国特許係属（Z. Y .Zhu,J. Zhou,
S. Y. Xu））を形質転換し、３０℃にて一晩、ＬＢ＋
Ａｐ＋Ｃｍプレートで増殖させた。このようなクローン
からのコロニーを２．５ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種
し、３０℃にて一晩増殖させた。次いで、これをそれぞ
れ１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて４
時間増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃
にてさらに３時間増殖させた。１２ｋｒｐｍで１０分
間、細胞を遠心し、１ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再懸
濁し、ＢｓｍＢＩ活性について測定した。 最も高い活
性は、クローンＮｏ．１０（１０Ａ、１０Ｂ及び１０
Ｃ）を伴った３つの培養からＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２
２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢ
ＩＲ］で検出された。クローンＮｏ．１０ＢのＥＲ２５
６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を２本の５００ｍｌのＬＢ＋Ａ
ｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて７時間増殖させたが、う
ち１本は４時間後に０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。
細胞を６ｋｒｐｍで１０分間遠心し、計量した（１．６
３ｇ）。各培養からの細胞を１６ｍｌの超音波破砕用緩
衝液に再懸濁し、１０分間超音波破砕を行い、４℃にて
１４ｋｒｐｍで１２分間遠心した。誘導した培養からの
１ｍｌを５５℃にて４０分間加熱し、１ｍｌを６５℃に
て４０分間加熱し、双方共４℃にて１４ｋｒｐｍで１０
分間遠心した。誘導しなかった、誘導した、及び誘導し
て加熱した（５５℃及び６５℃の両方）細胞の抽出物を
ＢｓｍＢＩ活性について測定し、結果をアガロースゲル
電気泳動で分析した。最も高い活性は、誘導した培養及
び誘導し、５５℃に加熱した培養からの抽出物に見られ
た。誘導したクローン及び誘導して５５℃に加熱したク
ローンの活性から、細胞は、細胞のｇ当りおよそ＞１０
６単位を含有することが割り出された。
おけるＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの発現 ２つのクローン（Ｎｏ．１及びＮｏ．１０）のミニプレ
ップＤＮＡでＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩ
Ｍ］（ＢｓｍＡＩ、米国特許係属（Z. Y .Zhu,J. Zhou,
S. Y. Xu））を形質転換し、３０℃にて一晩、ＬＢ＋
Ａｐ＋Ｃｍプレートで増殖させた。このようなクローン
からのコロニーを２．５ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種
し、３０℃にて一晩増殖させた。次いで、これをそれぞ
れ１０ｍｌのＬＢ＋Ａｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて４
時間増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃
にてさらに３時間増殖させた。１２ｋｒｐｍで１０分
間、細胞を遠心し、１ｍｌの超音波破砕用緩衝液に再懸
濁し、ＢｓｍＢＩ活性について測定した。 最も高い活
性は、クローンＮｏ．１０（１０Ａ、１０Ｂ及び１０
Ｃ）を伴った３つの培養からＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２
２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢ
ＩＲ］で検出された。クローンＮｏ．１０ＢのＥＲ２５
６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７
ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］を２本の５００ｍｌのＬＢ＋Ａ
ｐ＋Ｃｍに接種し、３０℃にて７時間増殖させたが、う
ち１本は４時間後に０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。
細胞を６ｋｒｐｍで１０分間遠心し、計量した（１．６
３ｇ）。各培養からの細胞を１６ｍｌの超音波破砕用緩
衝液に再懸濁し、１０分間超音波破砕を行い、４℃にて
１４ｋｒｐｍで１２分間遠心した。誘導した培養からの
１ｍｌを５５℃にて４０分間加熱し、１ｍｌを６５℃に
て４０分間加熱し、双方共４℃にて１４ｋｒｐｍで１０
分間遠心した。誘導しなかった、誘導した、及び誘導し
て加熱した（５５℃及び６５℃の両方）細胞の抽出物を
ＢｓｍＢＩ活性について測定し、結果をアガロースゲル
電気泳動で分析した。最も高い活性は、誘導した培養及
び誘導し、５５℃に加熱した培養からの抽出物に見られ
た。誘導したクローン及び誘導して５５℃に加熱したク
ローンの活性から、細胞は、細胞のｇ当りおよそ＞１０
６単位を含有することが割り出された。
【００５８】誘導しなかった、誘導した、及び誘導して
加熱した（５５℃及び６５℃の両方）タンパク質発現の
特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約６０ｋＤａのタ
ンパク質バンド（ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼのサイ
ズ）が誘導した培養の抽出物で検出されたが、誘導しな
かった培養の抽出物では存在しなかった。
加熱した（５５℃及び６５℃の両方）タンパク質発現の
特徴をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。約６０ｋＤａのタ
ンパク質バンド（ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼのサイ
ズ）が誘導した培養の抽出物で検出されたが、誘導しな
かった培養の抽出物では存在しなかった。
【００５９】１５． ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの
均質になるまでの精製 穏かにピペッティングし、回すことによって７５ｇのＩ
ＰＴＧ誘導した細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂｓ
ｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］
を、２６０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１ＭのＮａＣｌ、２０
ｍＭのＫＰＯ４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ
−メルカプトエタノール）に再浮遊させた。細胞浮遊液
を２分間隔で超音波破砕し、各間隔後、ブラッドフォー
ド（Bradford）アッセイを用いてタンパク質濃度を推定
した。６回の超音波破砕の間隔の後、細胞を１２ｋｒｐ
ｍにて１時間遠心した。次いで、得られた上清を５９〜
６１℃にて２０分間加熱した。次いで、加熱処理した溶
液を１２ｋｒｐｍにて３０分間遠心して変性したタンパ
ク質を除いた。２５５ｍｌのヘパリンハイパーＤカラム
を４カラム容量の緩衝液Ａにて平衡化した。アクタ（登
録商標）ＦＰＬＣを用いてＮａＣｌの０．１Ｍ〜１．０
Ｍの濃度勾配で２５ｍｌ分画を溶出した。アクタ（登録
商標）で記録した分画のＵＶ分光分析は、それぞれおよ
そ０．７３Ｍと０．８５ＭのＮａＣｌで溶出された２つ
のピークを示した。分画の内容物の活性測定は活性がク
ロマトグラムの２番目のピークに一致することを示し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したタンパク組成は、第１
と第２のクロマトグラムのピークのタンパク質における
明瞭な差異を示した。高い塩濃度のために、８つの分画
（２００ｍｌ）をプールして１．１Ｌの緩衝液Ｃ（２０
ｍＭのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの
β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．８）で希釈した。
均質になるまでの精製 穏かにピペッティングし、回すことによって７５ｇのＩ
ＰＴＧ誘導した細胞ＥＲ２５６６［ｐＢＲ３２２−Ｂｓ
ｍＡＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］
を、２６０ｍｌの緩衝液Ａ（０．１ＭのＮａＣｌ、２０
ｍＭのＫＰＯ４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ
−メルカプトエタノール）に再浮遊させた。細胞浮遊液
を２分間隔で超音波破砕し、各間隔後、ブラッドフォー
ド（Bradford）アッセイを用いてタンパク質濃度を推定
した。６回の超音波破砕の間隔の後、細胞を１２ｋｒｐ
ｍにて１時間遠心した。次いで、得られた上清を５９〜
６１℃にて２０分間加熱した。次いで、加熱処理した溶
液を１２ｋｒｐｍにて３０分間遠心して変性したタンパ
ク質を除いた。２５５ｍｌのヘパリンハイパーＤカラム
を４カラム容量の緩衝液Ａにて平衡化した。アクタ（登
録商標）ＦＰＬＣを用いてＮａＣｌの０．１Ｍ〜１．０
Ｍの濃度勾配で２５ｍｌ分画を溶出した。アクタ（登録
商標）で記録した分画のＵＶ分光分析は、それぞれおよ
そ０．７３Ｍと０．８５ＭのＮａＣｌで溶出された２つ
のピークを示した。分画の内容物の活性測定は活性がク
ロマトグラムの２番目のピークに一致することを示し
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したタンパク組成は、第１
と第２のクロマトグラムのピークのタンパク質における
明瞭な差異を示した。高い塩濃度のために、８つの分画
（２００ｍｌ）をプールして１．１Ｌの緩衝液Ｃ（２０
ｍＭのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの
β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．８）で希釈した。
【００６０】７．１ｍｌのソースＱ１５ＨＲカラムを３
カラム容量の緩衝液Ａ２（０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ
−メルカプトエタノール）で平衡化した。アクタ（登録
商標）ＦＰＬＣを用い、０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ
濃度勾配で１ｍｌの分画を溶出した。ＵＶクロマトグラ
ムは勾配分画には主なピークを示さなかった。ブラッド
フォードアッセイ及びアガロースゲル電気泳動によって
分析した活性測定は酵素がカラムの流出部分にあること
を示した。洗浄溶液及び流出溶液をプールした。
カラム容量の緩衝液Ａ２（０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍのトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ
−メルカプトエタノール）で平衡化した。アクタ（登録
商標）ＦＰＬＣを用い、０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ
濃度勾配で１ｍｌの分画を溶出した。ＵＶクロマトグラ
ムは勾配分画には主なピークを示さなかった。ブラッド
フォードアッセイ及びアガロースゲル電気泳動によって
分析した活性測定は酵素がカラムの流出部分にあること
を示した。洗浄溶液及び流出溶液をプールした。
【００６１】７．１ｍｌのヘパリン５ＰＷカラムを３カ
ラム容量の緩衝液Ａで平衡化した。アクタ（登録商標）
ＦＰＬＣを用い、０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾
配で１ｍｌの分画を溶出した。クロマトグラム、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、及びアガロースゲル電気泳動で分析した活
性測定から得られたデータは、クロマトグラム上に認め
られる１本の主要なピークがＢｓｍＢＩエンドヌクレア
ーゼに相当することを示した。８本の１ｍｌ分画をプー
ルし、１Ｌの透析緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭ
のトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴ
Ｔ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０％のグリ
セロール、ｐＨ７．５）によって透析した。最終的な精
製したＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを図９に示した。
ラム容量の緩衝液Ａで平衡化した。アクタ（登録商標）
ＦＰＬＣを用い、０．１Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度勾
配で１ｍｌの分画を溶出した。クロマトグラム、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ、及びアガロースゲル電気泳動で分析した活
性測定から得られたデータは、クロマトグラム上に認め
られる１本の主要なピークがＢｓｍＢＩエンドヌクレア
ーゼに相当することを示した。８本の１ｍｌ分画をプー
ルし、１Ｌの透析緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭ
のトリス塩酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴ
Ｔ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、５０％のグリ
セロール、ｐＨ７．５）によって透析した。最終的な精
製したＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼを図９に示した。
【００６２】２００１年９月２８日、ブタペスト協定の
諸条件のもと、ＥＴ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡ
ＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］株をア
メリカンティッシュカルチャーコレクションに供託し、
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３７３９を受領した。
諸条件のもと、ＥＴ２５６６［ｐＢＲ３２２−ＢｓｍＡ
ＩＭ、ｐＡＣＹＣ−Ｔ７ｔｅｒ−ＢｓｍＢＩＲ］株をア
メリカンティッシュカルチャーコレクションに供託し、
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−３７３９を受領した。
【００６３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NEW ENGLAND BIOLABS, INC.
<120> Method For Cloning And Expression of BsmBI Restriction
Endonuclese And BsmBI Methylase In E. coli And
Purification Of BsmBI Endonuclease
<130> PB792416
<140>
<141> 2002-09-30
<150> US 09/966,997
<151> 2001-09-28
<160> 27
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 6
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 1
cgtctc 6
<210> 2
<211> 6
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 2
cgtctc 6
<210> 3
<211> 6
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 3
gagacg 6
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> Deinococcus radiophilus
<400> 4
tttaaa 6
<210> 5
<211> 5
<212> DNA
<213> Deinococcus radiophilus
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> At position 3, N = G, A, C or T
<400> 5
ggncc 5
<210> 6
<211> 9
<212> DNA
<213> Deinococcus radiophilus
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> At positions 4, 5 and 6, N=G, A, C or T
<400> 6
cacnnngtg 9
<210> 7
<211> 6
<212> DNA
<213> Escherichia coli RY13
<400> 7
gaattc 6
<210> 8
<211> 5
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> At position 3, W = A or T
<400> 8
ccwgg 5
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> Nocardia otitidis-caviarum
<400> 9
gcggccgc 8
<210> 10
<211> 3207
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3207)
<400> 10
atg aac tcc tta tca cta aaa gat gaa atg gag att tgg aaa caa gct 48
Met Asn Ser Leu Ser Leu Lys Asp Glu Met Glu Ile Trp Lys Gln Ala
1 5 10 15
tct aat att cga aaa aaa att gca atg gaa acg gcg gcg gaa ttt tta 96
Ser Asn Ile Arg Lys Lys Ile Ala Met Glu Thr Ala Ala Glu Phe Leu
20 25 30
aat gaa ttt aat gct gaa aaa gca ctt aag caa ata aaa aat tca att 144
Asn Glu Phe Asn Ala Glu Lys Ala Leu Lys Gln Ile Lys Asn Ser Ile
35 40 45
cta aat ccg ctc tat gaa agg aat cct ttt caa aat aca ttg gaa aag 192
Leu Asn Pro Leu Tyr Glu Arg Asn Pro Phe Gln Asn Thr Leu Glu Lys
50 55 60
ctt tct ttc tct cta tat tta aca gaa aaa tct ata gat tat gtt ctt 240
Leu Ser Phe Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Ser Ile Asp Tyr Val Leu
65 70 75 80
caa atg gaa gtg gag cct ata aag aaa tta tca tat gcc aat ttt ttt 288
Gln Met Glu Val Glu Pro Ile Lys Lys Leu Ser Tyr Ala Asn Phe Phe
85 90 95
gtt gag ata gga gca agg gag ttt atc tca cct ttt cat cct gat aaa 336
Val Glu Ile Gly Ala Arg Glu Phe Ile Ser Pro Phe His Pro Asp Lys
100 105 110
att gag aag aat tta aca gct tca aaa gct tat gga tat ttt ttc aca 384
Ile Glu Lys Asn Leu Thr Ala Ser Lys Ala Tyr Gly Tyr Phe Phe Thr
115 120 125
cca att tca tta ggg aca aga atg gtt aag tta gct tta aaa gat aaa 432
Pro Ile Ser Leu Gly Thr Arg Met Val Lys Leu Ala Leu Lys Asp Lys
130 135 140
cct aaa aat cta aaa tct ata gtt gac cct gcc tgt ggt ata ggc agt 480
Pro Lys Asn Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ala Cys Gly Ile Gly Ser
145 150 155 160
tta cta gca ttg gct cta ata tat aat cca gaa ata gaa aat gtt gta 528
Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Tyr Asn Pro Glu Ile Glu Asn Val Val
165 170 175
gga ata gaa ttg gat agc ttt acc gct aat att tcc cat aaa tta ctt 576
Gly Ile Glu Leu Asp Ser Phe Thr Ala Asn Ile Ser His Lys Leu Leu
180 185 190
gtt aga ata agt aaa gac tta gga ata aca cct aag att aag ata att 624
Val Arg Ile Ser Lys Asp Leu Gly Ile Thr Pro Lys Ile Lys Ile Ile
195 200 205
aat caa aat ttc ttg gac tac gtt ttg aac tat gaa gaa gaa cat aag 672
Asn Gln Asn Phe Leu Asp Tyr Val Leu Asn Tyr Glu Glu Glu His Lys
210 215 220
gaa aag ttt gat ttg ctt att atg aat ccc cct tat gga agg gtg aga 720
Glu Lys Phe Asp Leu Leu Ile Met Asn Pro Pro Tyr Gly Arg Val Arg
225 230 235 240
ttc ctg aaa aat tct tta act aat aaa gaa act aaa agt ggg ctt act 768
Phe Leu Lys Asn Ser Leu Thr Asn Lys Glu Thr Lys Ser Gly Leu Thr
245 250 255
gag gga atc tct gag tta gaa aaa aag ctt aga gaa gaa aca atc ctt 816
Glu Gly Ile Ser Glu Leu Glu Lys Lys Leu Arg Glu Glu Thr Ile Leu
260 265 270
aac gca gcg gat tta cgg aag aaa ttt gca tcg gtt gga ctt gga aag 864
Asn Ala Ala Asp Leu Arg Lys Lys Phe Ala Ser Val Gly Leu Gly Lys
275 280 285
ggg acc cct gaa tat tca aag gta ttc cta gct att tca aca aag ata 912
Gly Thr Pro Glu Tyr Ser Lys Val Phe Leu Ala Ile Ser Thr Lys Ile
290 295 300
gta aag caa aat ggt tat gtt att gca ata acc cca tca tca tgg tta 960
Val Lys Gln Asn Gly Tyr Val Ile Ala Ile Thr Pro Ser Ser Trp Leu
305 310 315 320
ggt gat gaa agt gga aga gaa cta aga aag tat tta gtt gag aat cat 1008
Gly Asp Glu Ser Gly Arg Glu Leu Arg Lys Tyr Leu Val Glu Asn His
325 330 335
gga atc tca tgt ata tgg aat ttt aaa gaa agt gct aaa tta ttt tca 1056
Gly Ile Ser Cys Ile Trp Asn Phe Lys Glu Ser Ala Lys Leu Phe Ser
340 345 350
ggt gtt aat caa cct aca acc gtt gta aaa att aaa gtt aat tca aat 1104
Gly Val Asn Gln Pro Thr Thr Val Val Lys Ile Lys Val Asn Ser Asn
355 360 365
gaa tca aag ata gaa att caa ggt cct cta tct tct cta gaa gaa cta 1152
Glu Ser Lys Ile Glu Ile Gln Gly Pro Leu Ser Ser Leu Glu Glu Leu
370 375 380
gga agg gat atc cag tat ttg gac aca tgt aat ata aaa aaa tac agt 1200
Gly Arg Asp Ile Gln Tyr Leu Asp Thr Cys Asn Ile Lys Lys Tyr Ser
385 390 395 400
cca gaa tgg tat aga ata ccc caa tgc ggg aat gag cga gca aaa ata 1248
Pro Glu Trp Tyr Arg Ile Pro Gln Cys Gly Asn Glu Arg Ala Lys Ile
405 410 415
ctt tct aaa ttg cat aat cat gcc ccc tta tct tca cac aaa aaa atc 1296
Leu Ser Lys Leu His Asn His Ala Pro Leu Ser Ser His Lys Lys Ile
420 425 430
tat aat ctt aga gga gag tta gat tta aca tct cat aaa gat tta tta 1344
Tyr Asn Leu Arg Gly Glu Leu Asp Leu Thr Ser His Lys Asp Leu Leu
435 440 445
agt gat aat ccg aat cat tgg aga ctt att agg gga gac cat gtt gaa 1392
Ser Asp Asn Pro Asn His Trp Arg Leu Ile Arg Gly Asp His Val Glu
450 455 460
aaa ttt aat tta aag aat cca gag gaa tca gaa aag cta gga ttt gtt 1440
Lys Phe Asn Leu Lys Asn Pro Glu Glu Ser Glu Lys Leu Gly Phe Val
465 470 475 480
gac cat caa tta ttt att aaa aga atg gga aaa agt aat aag tta aga 1488
Asp His Gln Leu Phe Ile Lys Arg Met Gly Lys Ser Asn Lys Leu Arg
485 490 495
cac att aaa aac tgg aga ata aca ctt cca caa tgt tct tat atg aat 1536
His Ile Lys Asn Trp Arg Ile Thr Leu Pro Gln Cys Ser Tyr Met Asn
500 505 510
aaa aag aag cgg ata gag gca tgc ata gta gaa cca aat aat ata att 1584
Lys Lys Lys Arg Ile Glu Ala Cys Ile Val Glu Pro Asn Asn Ile Ile
515 520 525
gca aat tca tgt aat tat atc act tta gaa gat tgt aac gaa ttg gta 1632
Ala Asn Ser Cys Asn Tyr Ile Thr Leu Glu Asp Cys Asn Glu Leu Val
530 535 540
gac aac tta ctg tta ctc tgt gca att ata aat agt gct gta ata gag 1680
Asp Asn Leu Leu Leu Leu Cys Ala Ile Ile Asn Ser Ala Val Ile Glu
545 550 555 560
tgg aga ttt aga ttg ttc aat agt aat aat cat gtg tca aat tat gag 1728
Trp Arg Phe Arg Leu Phe Asn Ser Asn Asn His Val Ser Asn Tyr Glu
565 570 575
att gat gaa ttt cca ata ttt aaa ttt gat act gaa act gaa atg ttg 1776
Ile Asp Glu Phe Pro Ile Phe Lys Phe Asp Thr Glu Thr Glu Met Leu
580 585 590
act atg tta aaa ggt ttt ttg cat aag ccc ata gaa aat tgg tct aaa 1824
Thr Met Leu Lys Gly Phe Leu His Lys Pro Ile Glu Asn Trp Ser Lys
595 600 605
ata gaa gct ctt ata gct tta atg tat gga ttg aat ata gaa gat atg 1872
Ile Glu Ala Leu Ile Ala Leu Met Tyr Gly Leu Asn Ile Glu Asp Met
610 615 620
aaa gta ata ctg aat gat tta gaa tat gaa gat aaa gat aaa ata tta 1920
Lys Val Ile Leu Asn Asp Leu Glu Tyr Glu Asp Lys Asp Lys Ile Leu
625 630 635 640
aaa tat atg gat att tat caa gag aaa ttt agt aat aaa gac ttt ata 1968
Lys Tyr Met Asp Ile Tyr Gln Glu Lys Phe Ser Asn Lys Asp Phe Ile
645 650 655
gtt tat aac cat act tta cca aca ctt tca gaa tta gat aaa gag atg 2016
Val Tyr Asn His Thr Leu Pro Thr Leu Ser Glu Leu Asp Lys Glu Met
660 665 670
att tca tat gtt aaa caa ggg ggg aac tgg gag gac att cct gaa act 2064
Ile Ser Tyr Val Lys Gln Gly Gly Asn Trp Glu Asp Ile Pro Glu Thr
675 680 685
gtt cct tca aag aga tta gaa cag ata aga gaa atg agt aag aga aga 2112
Val Pro Ser Lys Arg Leu Glu Gln Ile Arg Glu Met Ser Lys Arg Arg
690 695 700
gga aaa gtt agg act acc tat tat ggt aga tta aac cct aat caa cct 2160
Gly Lys Val Arg Thr Thr Tyr Tyr Gly Arg Leu Asn Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
gct tat aca ata tcc act tat ttt aat agg ccg gga aat gga acg aat 2208
Ala Tyr Thr Ile Ser Thr Tyr Phe Asn Arg Pro Gly Asn Gly Thr Asn
725 730 735
att cat cct tgg gaa aat agg acc ata agt tgc aga gaa gct gcg aga 2256
Ile His Pro Trp Glu Asn Arg Thr Ile Ser Cys Arg Glu Ala Ala Arg
740 745 750
tta caa tca ttt cct gat agt ttt atc ttc tat ggg aag gag gga gca 2304
Leu Gln Ser Phe Pro Asp Ser Phe Ile Phe Tyr Gly Lys Glu Gly Ala
755 760 765
gtt aga aaa cag ata ggt aat gcc gtt cct cca tta tta agt tat gct 2352
Val Arg Lys Gln Ile Gly Asn Ala Val Pro Pro Leu Leu Ser Tyr Ala
770 775 780
tta ggt aag aca ata aaa gct aaa aca ttt gta gat tta ttt gct gga 2400
Leu Gly Lys Thr Ile Lys Ala Lys Thr Phe Val Asp Leu Phe Ala Gly
785 790 795 800
gca ggc gga ctt agc tat ggt ttt gaa ctt gct gga tta gaa ggg atg 2448
Ala Gly Gly Leu Ser Tyr Gly Phe Glu Leu Ala Gly Leu Glu Gly Met
805 810 815
gca gcc tta gag att gat aaa gat gcc gct gaa act tat gca aaa aat 2496
Ala Ala Leu Glu Ile Asp Lys Asp Ala Ala Glu Thr Tyr Ala Lys Asn
820 825 830
cat tca tct aat ata gac gta ata gtc ggt gat atc aga agc cca gaa 2544
His Ser Ser Asn Ile Asp Val Ile Val Gly Asp Ile Arg Ser Pro Glu
835 840 845
ata caa aat caa tta att gag tca gtg aaa aac aag tta aag ggt cga 2592
Ile Gln Asn Gln Leu Ile Glu Ser Val Lys Asn Lys Leu Lys Gly Arg
850 855 860
act tta gat tta att gct ggt ggt ctt cct tgt caa ggc ttt tca aca 2640
Thr Leu Asp Leu Ile Ala Gly Gly Leu Pro Cys Gln Gly Phe Ser Thr
865 870 875 880
gca gga tgg aga aag cca gat gat gag agg aat gct tta gtc act tat 2688
Ala Gly Trp Arg Lys Pro Asp Asp Glu Arg Asn Ala Leu Val Thr Tyr
885 890 895
ttt ttg cag gtt gtt cag aag tta atg cca aat tac gtt tta ata gaa 2736
Phe Leu Gln Val Val Gln Lys Leu Met Pro Asn Tyr Val Leu Ile Glu
900 905 910
aac gta gaa ggg ctt att aat atg aat aaa gga tta gta ctt aaa agt 2784
Asn Val Glu Gly Leu Ile Asn Met Asn Lys Gly Leu Val Leu Lys Ser
915 920 925
att cat gaa gta tta gat gag ttg ggc tat att tac tat aag aat cct 2832
Ile His Glu Val Leu Asp Glu Leu Gly Tyr Ile Tyr Tyr Lys Asn Pro
930 935 940
tgg gta tta agt gcg gaa caa tat ggg gta cct caa atg aga aaa agg 2880
Trp Val Leu Ser Ala Glu Gln Tyr Gly Val Pro Gln Met Arg Lys Arg
945 950 955 960
gtt ttt att gta gcc gca aaa aaa gga tta gaa tta cca aaa cca cca 2928
Val Phe Ile Val Ala Ala Lys Lys Gly Leu Glu Leu Pro Lys Pro Pro
965 970 975
gtt caa tac ttt gac aag tgt ctc ggt aga cgt gaa aaa gaa tcg gat 2976
Val Gln Tyr Phe Asp Lys Cys Leu Gly Arg Arg Glu Lys Glu Ser Asp
980 985 990
agg aaa act gat aga tat cca gta aca gtt gcg gaa gcc ttc ttt gga 3024
Arg Lys Thr Asp Arg Tyr Pro Val Thr Val Ala Glu Ala Phe Phe Gly
995 1000 1005
cta cct tgc tta tta agt ccg gta ttt act cct ccg tta gag att aac 3072
Leu Pro Cys Leu Leu Ser Pro Val Phe Thr Pro Pro Leu Glu Ile Asn
1010 1015 1020
cct ttg tac agt caa tgg tgt aat aat att atc act act gaa gag ttt 3120
Pro Leu Tyr Ser Gln Trp Cys Asn Asn Ile Ile Thr Thr Glu Glu Phe
1025 1030 1035 1040
ctt aat aag aga ggt aaa att aaa att gag caa gaa gaa cta gat gct 3168
Leu Asn Lys Arg Gly Lys Ile Lys Ile Glu Gln Glu Glu Leu Asp Ala
1045 1050 1055
cca caa cta aaa gta gaa caa cta gaa ttt acc ttt taa 3207
Pro Gln Leu Lys Val Glu Gln Leu Glu Phe Thr Phe
1060 1065
<210> 11
<211> 1068
<212> PRT
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 11
Met Asn Ser Leu Ser Leu Lys Asp Glu Met Glu Ile Trp Lys Gln Ala
1 5 10 15
Ser Asn Ile Arg Lys Lys Ile Ala Met Glu Thr Ala Ala Glu Phe Leu
20 25 30
Asn Glu Phe Asn Ala Glu Lys Ala Leu Lys Gln Ile Lys Asn Ser Ile
35 40 45
Leu Asn Pro Leu Tyr Glu Arg Asn Pro Phe Gln Asn Thr Leu Glu Lys
50 55 60
Leu Ser Phe Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Ser Ile Asp Tyr Val Leu
65 70 75 80
Gln Met Glu Val Glu Pro Ile Lys Lys Leu Ser Tyr Ala Asn Phe Phe
85 90 95
Val Glu Ile Gly Ala Arg Glu Phe Ile Ser Pro Phe His Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Glu Lys Asn Leu Thr Ala Ser Lys Ala Tyr Gly Tyr Phe Phe Thr
115 120 125
Pro Ile Ser Leu Gly Thr Arg Met Val Lys Leu Ala Leu Lys Asp Lys
130 135 140
Pro Lys Asn Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ala Cys Gly Ile Gly Ser
145 150 155 160
Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile Tyr Asn Pro Glu Ile Glu Asn Val Val
165 170 175
Gly Ile Glu Leu Asp Ser Phe Thr Ala Asn Ile Ser His Lys Leu Leu
180 185 190
Val Arg Ile Ser Lys Asp Leu Gly Ile Thr Pro Lys Ile Lys Ile Ile
195 200 205
Asn Gln Asn Phe Leu Asp Tyr Val Leu Asn Tyr Glu Glu Glu His Lys
210 215 220
Glu Lys Phe Asp Leu Leu Ile Met Asn Pro Pro Tyr Gly Arg Val Arg
225 230 235 240
Phe Leu Lys Asn Ser Leu Thr Asn Lys Glu Thr Lys Ser Gly Leu Thr
245 250 255
Glu Gly Ile Ser Glu Leu Glu Lys Lys Leu Arg Glu Glu Thr Ile Leu
260 265 270
Asn Ala Ala Asp Leu Arg Lys Lys Phe Ala Ser Val Gly Leu Gly Lys
275 280 285
Gly Thr Pro Glu Tyr Ser Lys Val Phe Leu Ala Ile Ser Thr Lys Ile
290 295 300
Val Lys Gln Asn Gly Tyr Val Ile Ala Ile Thr Pro Ser Ser Trp Leu
305 310 315 320
Gly Asp Glu Ser Gly Arg Glu Leu Arg Lys Tyr Leu Val Glu Asn His
325 330 335
Gly Ile Ser Cys Ile Trp Asn Phe Lys Glu Ser Ala Lys Leu Phe Ser
340 345 350
Gly Val Asn Gln Pro Thr Thr Val Val Lys Ile Lys Val Asn Ser Asn
355 360 365
Glu Ser Lys Ile Glu Ile Gln Gly Pro Leu Ser Ser Leu Glu Glu Leu
370 375 380
Gly Arg Asp Ile Gln Tyr Leu Asp Thr Cys Asn Ile Lys Lys Tyr Ser
385 390 395 400
Pro Glu Trp Tyr Arg Ile Pro Gln Cys Gly Asn Glu Arg Ala Lys Ile
405 410 415
Leu Ser Lys Leu His Asn His Ala Pro Leu Ser Ser His Lys Lys Ile
420 425 430
Tyr Asn Leu Arg Gly Glu Leu Asp Leu Thr Ser His Lys Asp Leu Leu
435 440 445
Ser Asp Asn Pro Asn His Trp Arg Leu Ile Arg Gly Asp His Val Glu
450 455 460
Lys Phe Asn Leu Lys Asn Pro Glu Glu Ser Glu Lys Leu Gly Phe Val
465 470 475 480
Asp His Gln Leu Phe Ile Lys Arg Met Gly Lys Ser Asn Lys Leu Arg
485 490 495
His Ile Lys Asn Trp Arg Ile Thr Leu Pro Gln Cys Ser Tyr Met Asn
500 505 510
Lys Lys Lys Arg Ile Glu Ala Cys Ile Val Glu Pro Asn Asn Ile Ile
515 520 525
Ala Asn Ser Cys Asn Tyr Ile Thr Leu Glu Asp Cys Asn Glu Leu Val
530 535 540
Asp Asn Leu Leu Leu Leu Cys Ala Ile Ile Asn Ser Ala Val Ile Glu
545 550 555 560
Trp Arg Phe Arg Leu Phe Asn Ser Asn Asn His Val Ser Asn Tyr Glu
565 570 575
Ile Asp Glu Phe Pro Ile Phe Lys Phe Asp Thr Glu Thr Glu Met Leu
580 585 590
Thr Met Leu Lys Gly Phe Leu His Lys Pro Ile Glu Asn Trp Ser Lys
595 600 605
Ile Glu Ala Leu Ile Ala Leu Met Tyr Gly Leu Asn Ile Glu Asp Met
610 615 620
Lys Val Ile Leu Asn Asp Leu Glu Tyr Glu Asp Lys Asp Lys Ile Leu
625 630 635 640
Lys Tyr Met Asp Ile Tyr Gln Glu Lys Phe Ser Asn Lys Asp Phe Ile
645 650 655
Val Tyr Asn His Thr Leu Pro Thr Leu Ser Glu Leu Asp Lys Glu Met
660 665 670
Ile Ser Tyr Val Lys Gln Gly Gly Asn Trp Glu Asp Ile Pro Glu Thr
675 680 685
Val Pro Ser Lys Arg Leu Glu Gln Ile Arg Glu Met Ser Lys Arg Arg
690 695 700
Gly Lys Val Arg Thr Thr Tyr Tyr Gly Arg Leu Asn Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
Ala Tyr Thr Ile Ser Thr Tyr Phe Asn Arg Pro Gly Asn Gly Thr Asn
725 730 735
Ile His Pro Trp Glu Asn Arg Thr Ile Ser Cys Arg Glu Ala Ala Arg
740 745 750
Leu Gln Ser Phe Pro Asp Ser Phe Ile Phe Tyr Gly Lys Glu Gly Ala
755 760 765
Val Arg Lys Gln Ile Gly Asn Ala Val Pro Pro Leu Leu Ser Tyr Ala
770 775 780
Leu Gly Lys Thr Ile Lys Ala Lys Thr Phe Val Asp Leu Phe Ala Gly
785 790 795 800
Ala Gly Gly Leu Ser Tyr Gly Phe Glu Leu Ala Gly Leu Glu Gly Met
805 810 815
Ala Ala Leu Glu Ile Asp Lys Asp Ala Ala Glu Thr Tyr Ala Lys Asn
820 825 830
His Ser Ser Asn Ile Asp Val Ile Val Gly Asp Ile Arg Ser Pro Glu
835 840 845
Ile Gln Asn Gln Leu Ile Glu Ser Val Lys Asn Lys Leu Lys Gly Arg
850 855 860
Thr Leu Asp Leu Ile Ala Gly Gly Leu Pro Cys Gln Gly Phe Ser Thr
865 870 875 880
Ala Gly Trp Arg Lys Pro Asp Asp Glu Arg Asn Ala Leu Val Thr Tyr
885 890 895
Phe Leu Gln Val Val Gln Lys Leu Met Pro Asn Tyr Val Leu Ile Glu
900 905 910
Asn Val Glu Gly Leu Ile Asn Met Asn Lys Gly Leu Val Leu Lys Ser
915 920 925
Ile His Glu Val Leu Asp Glu Leu Gly Tyr Ile Tyr Tyr Lys Asn Pro
930 935 940
Trp Val Leu Ser Ala Glu Gln Tyr Gly Val Pro Gln Met Arg Lys Arg
945 950 955 960
Val Phe Ile Val Ala Ala Lys Lys Gly Leu Glu Leu Pro Lys Pro Pro
965 970 975
Val Gln Tyr Phe Asp Lys Cys Leu Gly Arg Arg Glu Lys Glu Ser Asp
980 985 990
Arg Lys Thr Asp Arg Tyr Pro Val Thr Val Ala Glu Ala Phe Phe Gly
995 1000 1005
Leu Pro Cys Leu Leu Ser Pro Val Phe Thr Pro Pro Leu Glu Ile Asn
1010 1015 1020
Pro Leu Tyr Ser Gln Trp Cys Asn Asn Ile Ile Thr Thr Glu Glu Phe
1025 1030 1035 1040
Leu Asn Lys Arg Gly Lys Ile Lys Ile Glu Gln Glu Glu Leu Asp Ala
1045 1050 1055
Pro Gln Leu Lys Val Glu Gln Leu Glu Phe Thr Phe
1060 1065
<210> 12
<211> 1593
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1593)
<400> 12
ttg gct aaa tac gga cgt gga aag ttt tta cct cat caa aac tat atc 48
Leu Ala Lys Tyr Gly Arg Gly Lys Phe Leu Pro His Gln Asn Tyr Ile
1 5 10 15
gat tat atg cat ttt ata gtg aac cat aag aat tat tct ggt atg cca 96
Asp Tyr Met His Phe Ile Val Asn His Lys Asn Tyr Ser Gly Met Pro
20 25 30
aac gct att gga gag gat gga aga ata aat tgg cag gta agc tct gga 144
Asn Ala Ile Gly Glu Asp Gly Arg Ile Asn Trp Gln Val Ser Ser Gly
35 40 45
aaa aca acg tct ttt tat gaa tat tat caa gca aga ttt gaa tgg tgg 192
Lys Thr Thr Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Trp Trp
50 55 60
gag aag aaa gct gat gaa ctt aat tta cct gga acg ggt aat tca aac 240
Glu Lys Lys Ala Asp Glu Leu Asn Leu Pro Gly Thr Gly Asn Ser Asn
65 70 75 80
aaa agg ttt tct tta gca gca agg tta att cat cct aca gga caa agg 288
Lys Arg Phe Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ile His Pro Thr Gly Gln Arg
85 90 95
ccg tgt aga tta tgt ggt aag tac caa tat gtt ggt tac atg tat gtt 336
Pro Cys Arg Leu Cys Gly Lys Tyr Gln Tyr Val Gly Tyr Met Tyr Val
100 105 110
tca cac aac ctt tac aaa cga tgg agt aag ata aca ggt aga gaa gac 384
Ser His Asn Leu Tyr Lys Arg Trp Ser Lys Ile Thr Gly Arg Glu Asp
115 120 125
ctt ttt ttt aaa aaa cag aat atc att gag gca gct aac att ttt aaa 432
Leu Phe Phe Lys Lys Gln Asn Ile Ile Glu Ala Ala Asn Ile Phe Lys
130 135 140
tct att atg gga gaa caa gca ctt att aat gaa tta aca acc att ttt 480
Ser Ile Met Gly Glu Gln Ala Leu Ile Asn Glu Leu Thr Thr Ile Phe
145 150 155 160
cca gaa aga aaa gat tat ttc aac aga tta cca aac att gaa gat ttc 528
Pro Glu Arg Lys Asp Tyr Phe Asn Arg Leu Pro Asn Ile Glu Asp Phe
165 170 175
ttt gta agt tct agt cac ata aaa aat aat gga aat tat att agt cca 576
Phe Val Ser Ser Ser His Ile Lys Asn Asn Gly Asn Tyr Ile Ser Pro
180 185 190
gga ttt atg gct aat ccg cct gac cga cta gac gga ttt cac gat tat 624
Gly Phe Met Ala Asn Pro Pro Asp Arg Leu Asp Gly Phe His Asp Tyr
195 200 205
gga atc tgt tgt agg aaa gaa aaa gac cca ggg cga cat gac gat aac 672
Gly Ile Cys Cys Arg Lys Glu Lys Asp Pro Gly Arg His Asp Asp Asn
210 215 220
atg aga cta tat aat cat gat aga cgt gct ttt atg tgg tgg tca gaa 720
Met Arg Leu Tyr Asn His Asp Arg Arg Ala Phe Met Trp Trp Ser Glu
225 230 235 240
ggt gat tgg gca ctt gca gac gca cta tat aat aaa gct ggg gct gga 768
Gly Asp Trp Ala Leu Ala Asp Ala Leu Tyr Asn Lys Ala Gly Ala Gly
245 250 255
aaa tgt gct gac cca gat tgt caa aaa gaa gtt gaa aaa ata agc cct 816
Lys Cys Ala Asp Pro Asp Cys Gln Lys Glu Val Glu Lys Ile Ser Pro
260 265 270
gac cat gtt ggc cct atc tct tgt ggt ttt aaa cag att cct ttt ttt 864
Asp His Val Gly Pro Ile Ser Cys Gly Phe Lys Gln Ile Pro Phe Phe
275 280 285
aaa cca ctc tgt gca tca tgt aac tca gca aaa aat cgt agg ttt tca 912
Lys Pro Leu Cys Ala Ser Cys Asn Ser Ala Lys Asn Arg Arg Phe Ser
290 295 300
tat caa gat gta aag gaa tta tta aaa tat gaa aac tac aca gga gat 960
Tyr Gln Asp Val Lys Glu Leu Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Gly Asp
305 310 315 320
tcg gtt gct tca tgg caa gtg cgg gct tta tgg gat aac tgt aaa cat 1008
Ser Val Ala Ser Trp Gln Val Arg Ala Leu Trp Asp Asn Cys Lys His
325 330 335
tta gta aaa aat gac gat gat tcc aaa tta ctt agc aat tta atg aga 1056
Leu Val Lys Asn Asp Asp Asp Ser Lys Leu Leu Ser Asn Leu Met Arg
340 345 350
agc ttg caa gac tac tat tta cgg tct cta tat aaa ttg ttt tcg aat 1104
Ser Leu Gln Asp Tyr Tyr Leu Arg Ser Leu Tyr Lys Leu Phe Ser Asn
355 360 365
ggc ttt gca cat ctt cta tct tac ttc ctc aca ccc gaa tat gca cat 1152
Gly Phe Ala His Leu Leu Ser Tyr Phe Leu Thr Pro Glu Tyr Ala His
370 375 380
tat aaa att act ttt gag gga tta aat aca agc act cta gaa tat gaa 1200
Tyr Lys Ile Thr Phe Glu Gly Leu Asn Thr Ser Thr Leu Glu Tyr Glu
385 390 395 400
cga tac tac aaa act ttt aaa aag act aaa tcg acg tct agt ttg gct 1248
Arg Tyr Tyr Lys Thr Phe Lys Lys Thr Lys Ser Thr Ser Ser Leu Ala
405 410 415
gca cga att gtt aga att gca ttt gag gaa cta gaa ata tat aat tct 1296
Ala Arg Ile Val Arg Ile Ala Phe Glu Glu Leu Glu Ile Tyr Asn Ser
420 425 430
aag gat ata aat gag aga aag tta att aaa ttt gac act tca agt tgg 1344
Lys Asp Ile Asn Glu Arg Lys Leu Ile Lys Phe Asp Thr Ser Ser Trp
435 440 445
gaa aag gac ttt gag aat ata ata tcc tat gct acc aaa aac tta tct 1392
Glu Lys Asp Phe Glu Asn Ile Ile Ser Tyr Ala Thr Lys Asn Leu Ser
450 455 460
ttg gat gaa gaa gca tca aaa tgg aat aag gtt tta act gat aag aat 1440
Leu Asp Glu Glu Ala Ser Lys Trp Asn Lys Val Leu Thr Asp Lys Asn
465 470 475 480
tta agc tca acc gag aaa gac aag aaa att tcc tcc tta ctt gaa gat 1488
Leu Ser Ser Thr Glu Lys Asp Lys Lys Ile Ser Ser Leu Leu Glu Asp
485 490 495
aag aac tat gaa gtt tat aag aaa caa ttt tat atc ctc aaa gat ttg 1536
Lys Asn Tyr Glu Val Tyr Lys Lys Gln Phe Tyr Ile Leu Lys Asp Leu
500 505 510
ctt gta gaa cac ttt aac aaa att ggg gag cag att gct aaa gat tat 1584
Leu Val Glu His Phe Asn Lys Ile Gly Glu Gln Ile Ala Lys Asp Tyr
515 520 525
atg aaa taa 1593
Met Lys
530
<210> 13
<211> 530
<212> PRT
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 13
Leu Ala Lys Tyr Gly Arg Gly Lys Phe Leu Pro His Gln Asn Tyr Ile
1 5 10 15
Asp Tyr Met His Phe Ile Val Asn His Lys Asn Tyr Ser Gly Met Pro
20 25 30
Asn Ala Ile Gly Glu Asp Gly Arg Ile Asn Trp Gln Val Ser Ser Gly
35 40 45
Lys Thr Thr Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Trp Trp
50 55 60
Glu Lys Lys Ala Asp Glu Leu Asn Leu Pro Gly Thr Gly Asn Ser Asn
65 70 75 80
Lys Arg Phe Ser Leu Ala Ala Arg Leu Ile His Pro Thr Gly Gln Arg
85 90 95
Pro Cys Arg Leu Cys Gly Lys Tyr Gln Tyr Val Gly Tyr Met Tyr Val
100 105 110
Ser His Asn Leu Tyr Lys Arg Trp Ser Lys Ile Thr Gly Arg Glu Asp
115 120 125
Leu Phe Phe Lys Lys Gln Asn Ile Ile Glu Ala Ala Asn Ile Phe Lys
130 135 140
Ser Ile Met Gly Glu Gln Ala Leu Ile Asn Glu Leu Thr Thr Ile Phe
145 150 155 160
Pro Glu Arg Lys Asp Tyr Phe Asn Arg Leu Pro Asn Ile Glu Asp Phe
165 170 175
Phe Val Ser Ser Ser His Ile Lys Asn Asn Gly Asn Tyr Ile Ser Pro
180 185 190
Gly Phe Met Ala Asn Pro Pro Asp Arg Leu Asp Gly Phe His Asp Tyr
195 200 205
Gly Ile Cys Cys Arg Lys Glu Lys Asp Pro Gly Arg His Asp Asp Asn
210 215 220
Met Arg Leu Tyr Asn His Asp Arg Arg Ala Phe Met Trp Trp Ser Glu
225 230 235 240
Gly Asp Trp Ala Leu Ala Asp Ala Leu Tyr Asn Lys Ala Gly Ala Gly
245 250 255
Lys Cys Ala Asp Pro Asp Cys Gln Lys Glu Val Glu Lys Ile Ser Pro
260 265 270
Asp His Val Gly Pro Ile Ser Cys Gly Phe Lys Gln Ile Pro Phe Phe
275 280 285
Lys Pro Leu Cys Ala Ser Cys Asn Ser Ala Lys Asn Arg Arg Phe Ser
290 295 300
Tyr Gln Asp Val Lys Glu Leu Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Gly Asp
305 310 315 320
Ser Val Ala Ser Trp Gln Val Arg Ala Leu Trp Asp Asn Cys Lys His
325 330 335
Leu Val Lys Asn Asp Asp Asp Ser Lys Leu Leu Ser Asn Leu Met Arg
340 345 350
Ser Leu Gln Asp Tyr Tyr Leu Arg Ser Leu Tyr Lys Leu Phe Ser Asn
355 360 365
Gly Phe Ala His Leu Leu Ser Tyr Phe Leu Thr Pro Glu Tyr Ala His
370 375 380
Tyr Lys Ile Thr Phe Glu Gly Leu Asn Thr Ser Thr Leu Glu Tyr Glu
385 390 395 400
Arg Tyr Tyr Lys Thr Phe Lys Lys Thr Lys Ser Thr Ser Ser Leu Ala
405 410 415
Ala Arg Ile Val Arg Ile Ala Phe Glu Glu Leu Glu Ile Tyr Asn Ser
420 425 430
Lys Asp Ile Asn Glu Arg Lys Leu Ile Lys Phe Asp Thr Ser Ser Trp
435 440 445
Glu Lys Asp Phe Glu Asn Ile Ile Ser Tyr Ala Thr Lys Asn Leu Ser
450 455 460
Leu Asp Glu Glu Ala Ser Lys Trp Asn Lys Val Leu Thr Asp Lys Asn
465 470 475 480
Leu Ser Ser Thr Glu Lys Asp Lys Lys Ile Ser Ser Leu Leu Glu Asp
485 490 495
Lys Asn Tyr Glu Val Tyr Lys Lys Gln Phe Tyr Ile Leu Lys Asp Leu
500 505 510
Leu Val Glu His Phe Asn Lys Ile Gly Glu Gln Ile Ala Lys Asp Tyr
515 520 525
Met Lys
530
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 14
taaggatccg gaggtaaata aatgaactcc ttatcactaa aagatgaa 48
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 15
atgaaagtcg accccgtaat tttacgggct tttttaaaa 39
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 16
tatggatccg gaggtaaata aatgaaagta atactgaatg atttagaa 48
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 17
cccataaagc ccgcacttgc catg 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 18
tgacgatgat tccaaattac ttag 24
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 19
ctttccctaa agctacttaa ttgaact 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 20
ttataacaac aatacacaag ctttccc 27
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 21
tcttacccca tccttcagac aaac 24
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 22
aagacccagg gcgacatgac gataa 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 23
tgtatatgga catattggaa agat 24
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 24
gggtagattc atatggctaa atacggacgt ggaaagttt 39
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 25
gctggatcct catataatct ttagcaatct gctccc 36
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 26
aagggatccg gaggtaaata aatggctaaa tacggaaagt tt 42
<210> 27
<211> 5
<212> DNA
<213> Bacillus stearothermophilus B61
<400> 27
gtctc 5
【図１】ＢｓｍＢＩ制限−修飾システムの遺伝子構成を
示す。ｂｓｍＢＩＲ、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子；ｂｓｍＢＩＭ、ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝
子。
示す。ｂｓｍＢＩＲ、ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子；ｂｓｍＢＩＭ、ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝
子。
【図２】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
【図３】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
【図４】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
【図５】ＢｓｍＢＩメチラーゼ遺伝子（ｂｓｍＢＩＭ、
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
３２０７ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
０）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１）を示す。
【図６】ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓｍ
ＢＩＲ、１５９３ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３）を示す。
ＢＩＲ、１５９３ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３）を示す。
【図７】ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｂｓｍ
ＢＩＲ、１５９３ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３）を示す。
ＢＩＲ、１５９３ｂｐ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２）及びそれがコードするアミノ酸配列（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３）を示す。
【図８】細胞抽出物における組換えＢｓｍＢＩエンドヌ
クレアーゼ活性を示す。レーン１〜７、組換えＢｓｍＢ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で処理
したλＤＮＡ。レーン１〜７における希釈係数：１ｘ、
１：１０、１：１００、１：１０００、１：２０００、
１：３０００、１：４０００。 レーン８、λＤＮＡ；
レーン９、精製した天然のＢｓｍＢＩで消化したλＤＮ
Ａ。
クレアーゼ活性を示す。レーン１〜７、組換えＢｓｍＢ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼを含有する細胞抽出物で処理
したλＤＮＡ。レーン１〜７における希釈係数：１ｘ、
１：１０、１：１００、１：１０００、１：２０００、
１：３０００、１：４０００。 レーン８、λＤＮＡ；
レーン９、精製した天然のＢｓｍＢＩで消化したλＤＮ
Ａ。
【図９】精製した組換えＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ
を示す。レーン１〜４、ヘパリン５ＰＷカラムを通した
後の１μｌ、３μｌ、５μｌ及び１０μｌの精製したＢ
ｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ；レーン５、タンパク質の
サイズマーカー。ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの予想
サイズは６２ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＢｓ
ｍＢＩエンドヌクレアーゼの見かけのサイズは約６０ｋ
Ｄａである。
を示す。レーン１〜４、ヘパリン５ＰＷカラムを通した
後の１μｌ、３μｌ、５μｌ及び１０μｌの精製したＢ
ｓｍＢＩエンドヌクレアーゼ；レーン５、タンパク質の
サイズマーカー。ＢｓｍＢＩエンドヌクレアーゼの予想
サイズは６２ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＢｓ
ｍＢＩエンドヌクレアーゼの見かけのサイズは約６０ｋ
Ｄａである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:07
9/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｎ 9/10 5/00 Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(Ｃ１２Ｎ 9/16
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(72)発明者 シュアン・ヨン シュ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
02420 レキシントン カロル・レーン
15
(72)発明者 アンドリュー ドア
イギリス国 ティー・エヌ22 ５エヌ・エ
イチイースト・サセックス エヌ・アー
ル・ユックフィールド フラムフィールド
ザ・ビカレイジ
(72)発明者 アダム ヒューム
アメリカ合衆国 メイン州 04240 ルイ
ストン ボックス248 ベイツ・カレッジ
(72)発明者 ジョン・ペリティエ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
01913 エイムズバリー ホワイトホー
ル・ロード 130
(72)発明者 ジン ズー
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州
01915 ベバーリイ アパートメント５
レイルロード・アベニュー 32
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 BA11 CA04 DA06
EA04 GA11 HA12
4B050 CC03 DD02 EE10 LL03 LL10
4B065 AA18Y AA26X AB01 AC14
BA02 CA29 CA31 CA60
Claims (6)
- 【請求項１】 ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコ
ードしている単離されたＤＮＡであって、バチルス・ス
テアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｂ６１から入手可能である
単離されたＤＮＡ。 - 【請求項２】 そのなかにＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレ
アーゼをエンコードしているＤＮＡ断片が挿入されたベ
クターを含む組換えＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 ＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアーゼ及び
ＢｓｍＢＩメチラーゼをコードしている単離されたＤＮ
Ａであって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７３９から入
手可能な単離されたＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３に記載の単離されたＤＮＡを含
むベクター。 - 【請求項５】 請求項２又は４に記載のベクターによっ
て形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 組換えＢｓｍＢＩ制限エンドヌクレアー
ゼの製造方法であって、請求項２又は４に記載のベクタ
ーで形質転換された宿主細胞を前記エンドヌクレアーゼ
及びメチラーゼの発現に好適な条件下で培養することを
含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US966,997 | 2001-09-28 | ||
| US09/966,997 US6764843B2 (en) | 2001-09-28 | 2001-09-28 | Method of cloning and expression of BsmBI restriction endonuclease and BsmBI methylase in E. coli and purification of BsmBI endonuclease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003230390A true JP2003230390A (ja) | 2003-08-19 |
| JP4115248B2 JP4115248B2 (ja) | 2008-07-09 |
Family
ID=25512169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002320484A Expired - Fee Related JP4115248B2 (ja) | 2001-09-28 | 2002-09-30 | Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｂｓｍｂｉ制限エンドヌクレアーゼとｂｓｍｂｉメチラーゼのクローニング及び発現の方法、並びにｂｓｍｂｉエンドヌクレアーゼの精製方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6764843B2 (ja) |
| EP (1) | EP1298212B8 (ja) |
| JP (1) | JP4115248B2 (ja) |
| DE (1) | DE60215746T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002313965A (ja) * | 2001-04-16 | 2002-10-25 | Mitsubishi Electric Corp | 半導体装置とその製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007097778A2 (en) | 2005-08-04 | 2007-08-30 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, dna encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5200333A (en) | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
| DE3751730T2 (de) * | 1986-06-06 | 1996-09-12 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur Klonierung des Dde I- Restriktions-Modifikationssystems |
| US5498535A (en) | 1994-05-24 | 1996-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for direct cloning of nuclease genes in E. coli |
-
2001
- 2001-09-28 US US09/966,997 patent/US6764843B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-27 EP EP02256756A patent/EP1298212B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-27 DE DE60215746T patent/DE60215746T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-09-30 JP JP2002320484A patent/JP4115248B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002313965A (ja) * | 2001-04-16 | 2002-10-25 | Mitsubishi Electric Corp | 半導体装置とその製造方法 |
| JP4637397B2 (ja) * | 2001-04-16 | 2011-02-23 | ルネサスエレクトロニクス株式会社 | 半導体装置の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1298212A2 (en) | 2003-04-02 |
| US20030100052A1 (en) | 2003-05-29 |
| US6764843B2 (en) | 2004-07-20 |
| DE60215746T2 (de) | 2007-08-30 |
| EP1298212B8 (en) | 2006-12-20 |
| DE60215746D1 (de) | 2006-12-14 |
| EP1298212A3 (en) | 2003-08-27 |
| JP4115248B2 (ja) | 2008-07-09 |
| EP1298212B1 (en) | 2006-11-02 |
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