CN114457044A - 武装有异源基因的溶瘤腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及武装有异源基因的溶瘤腺病毒。本公开涉及包含式(I)的序列的B群腺病毒：5'ITR‑B1‑BA‑B2‑BX‑BB‑BY‑B3‑3'ITR，其中：B1是键或包含E1A、E1B或E1A‑E1B；BA包含‑E2B‑L1‑L2‑L3‑E2A‑L4；B2是键或包含E3；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX或BY中的至少一个不是键，包含其的药物组合物以及病毒和组合物用于治疗、特别是用于治疗癌症的用途。本公开还扩展至用于制备所述病毒的质粒和方法。

Description

武装有异源基因的溶瘤腺病毒
本申请是分案申请，原申请的申请日为2014年10月24日，申请号为201480062880.3，发明名称为“武装有异源基因的溶瘤腺病毒”。
技术领域
本公开涉及修饰的腺病毒，例如武装有至少一种转基因(包括治疗性和/或报告转基因)，特别是B群病毒，例如血清11型腺病毒或与Ad11的纤维、五邻体和六邻体的嵌合病毒；包含所述病毒的组合物，例如药物制剂；所述病毒和病毒制剂特别是用于治疗、尤其用于治疗癌症的用途。本公开还扩展至制备所述病毒的方法。
背景技术
多年来已研究了用于递送转基因的复制缺陷型腺病毒载体。在大部分情况下所述基因已经被插入E1区和/或E3区中，因为病毒基因组的这些区域对于载体是非必需的。
令人惊讶的是，对于用于在腺病毒基因组中插入转基因的可选位置上所进行的研究相对很少。此外，大部分研究已在Ad5中进行。
新一代的具有复制能力的溶瘤腺病毒目前正在临床中。这些病毒不需要互补细胞系来复制。E1是病毒复制的必需区域，而E3区在理论上可以用作插入转基因的位置，其将可用于能够将转基因插入不止这个位置。然而，必须注意不破坏病毒生命周期和/或有利的病毒特性，例如病毒的治疗特性。
Enadenotucirev(EnAd)是一种嵌合溶瘤腺病毒，先前称为EnAd(WO2005/118825)，具有来自Ad11p的纤维、五邻体和六邻体，因此它是B亚群病毒。它具有嵌合E2B区，其包含来自Ad11p和Ad3的DNA。EnAd中缺失几乎所有的E3区和一部分的E4区。因此，其在基因组中具有显著空间以容纳额外的遗传物质，而其余仍具活力。此外，因为EnAd是B亚群腺病毒，所以预先存在的在人类中的免疫性不如例如Ad5常见。具有Ad11纤维、五邻体和六邻体的嵌合溶瘤病毒的其他实例包括OvAd1和OvAd2(参见WO2006/060314)。
EnAd似乎优先感染肿瘤细胞，在这些细胞中迅速复制并导致细胞裂解。这又可产生炎性免疫反应，从而刺激身体也对抗癌症。EnAd的成功在某种程度上假定与所述病毒在体内的快速复制有关。
虽然EnAd选择性裂解肿瘤细胞，但是有可能引入其他的有利特性，例如通过使其武装有转基因、例如编码细胞信号传导蛋白或抗体的转基因或编码刺激细胞信号传导蛋白的实体的转基因，而增加病毒的治疗活性或降低病毒的副作用。
有利的是，使病毒武装有编码可以在癌细胞内部表达的某些蛋白的DNA，可使得身体的自身防御用于更有效地对抗肿瘤细胞，例如通过使所述细胞为免疫系统更可见或通过优先递送治疗性基因/蛋白以靶向肿瘤细胞。
此外，将作为报告基因的转基因插入基因组中的能力可以辅助临床或临床前研究。
重要的是所述转基因的表达不会不利地影响病毒的复制或其他有利特性。因此，必须在不损害病毒的复制能力和其他有利特性的位置中插入一种或多种基因。另外，腺病毒的基因组是紧密结合的，因此可能难以找到适于插入转基因的位置。这也限制了可以容纳的转基因的大小。
在治疗性产品中，重要的是精确控制活性剂的特性，因此它被充分表征并且可以再现地制备。使用随机插入转座子的现有技术系统不能充分适用于药物产品中，因为所述转基因随机插入病毒基因组中并且插入位点可能受转基因本身影响。此外可能难以用替代基因置换被转座子插入的基因。
因此，希望开发一种产生武装化腺病毒的强大且可重复的方法，其容许广泛多种转基因。
本发明人已经开发出在内源或外源启动子的控制下适合容纳广泛多种转基因的腺病毒的武装方法，其产生在肿瘤细胞中表达转基因的具活力、稳定、可恢复的病毒。所述方法是强大且可重复的并且可以严格控制。
所述转基因接近(相邻)编码纤维蛋白的基因定位，在所述基因的5'端和/或3'端，其不会不利地影响病毒的稳定性。
本发明人已经确定，呈抗体或抗体片段形式的复杂蛋白和细胞信号传导蛋白可以插入腺病毒、例如B组病毒如Ad11和Ad11衍生病毒的基因组中的这个位置中，并且例如在内源E4或主要晚期启动子的控制下成功表达，以使得所述蛋白被表达并且所述病毒的复制不受损害。
本发明人开发的质粒在腺病毒基因组中提供新型限制性位点，其可以用于接近L5(纤维)基因插入转基因盒以提供本公开的病毒。可选地，可以在不进行克隆步骤并且因此无需使用限制性位点的情况下直接完全地合成在这些插入位点位置含有转基因或转基因盒的质粒。
发明内容
本公开提供包含包括式(I)序列的基因组的腺病毒：
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
其中：
B1是键或包含：E1A、E1B或E1A-E1B；
BA是E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；
B2是键或包含E3；
BX是键或包含以下的DNA序列：限制性位点、一种或多种转基因或二者；
BB包含L5；
BY是键或包含以下的DNA序列：限制性位点、一种或多种转基因或二者；
B3是键或包含E4；
其中BX和BY中的至少一个不是键，例如BX和BY中的至少一个包含转基因、限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，BX包含限制性位点，例如1、2、3或4个限制性位点，例如1或2个。在一个实施方案中，BX包含至少一种转基因，例如1或2种转基因。在一个实施方案中，BX包含至少一种转基因，例如1或2种转基因和一个或多个限制性位点，例如2或3个限制性位点，特别是其中所述限制性位点夹着基因或包含所述基因的DNA序列以允许其从基因组特异性切除和/或置换。可选地，所述限制性位点可夹着每个基因，例如当存在两种转基因时，需要三个不同限制性位点来确保所述基因可以选择性切除和/或置换。在一个实施方案中，一种或多种、例如所有的转基因呈转基因盒形式。在一个实施方案中，BX包含SEQ ID NO:10。在一个实施方案中，SEQ ID NO:10被例如转基因间断。在实施方案中，SEQ ID NO:10是不间断的。在一个实施方案中，BX不包含限制性位点。在一个实施方案中，BX是键。在一个实施方案中，Bx包含一种或多种转基因或由一种或多种转基因组成。
在一个实施方案中，BY包含限制性位点，例如1、2、3或4个限制性位点，例如1或2个。在一个实施方案中，BY包含至少一种转基因，例如1或2种转基因。在一个实施方案中，BY包含至少一种转基因，例如1或2种转基因和一个或多个限制性位点，例如2或3个限制性位点，特别是其中所述限制性位点夹着基因或包含所述基因的DNA序列以允许其从基因组特异性切除和/或置换。可选地，所述限制性位点可夹着每个基因，例如当存在两种转基因时，需要三个不同限制性位点来确保所述基因可以选择性切除和/或置换。在一个实施方案中，一种或多种、例如所有的转基因呈转基因盒形式。在一个实施方案中，BY包含SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，SEQ ID NO:11被例如转基因间断。在实施方案中，SEQ ID NO:11是不间断的。在一个实施方案中，BY不包含限制性位点。在一个实施方案中，BY是键。在一个实施方案中，BY包含一种或多种转基因或由一种或多种转基因组成。
在一个实施方案中，BX和BY各自包含限制性位点，例如1、2、3或4个限制性位点，例如1或2个。在一个实施方案中，BX和BY各自包含至少一种转基因，例如1或2种转基因。在一个实施方案中，BX和BY各自包含至少一种转基因，例如1或2种转基因和一个或多个限制性位点，例如2或3个限制性位点，特别是其中所述限制性位点夹着基因或包含所述基因的DNA序列以允许其从基因组特异性切除和/或置换。可选地，所述限制性位点可夹着每个基因，例如当存在两种转基因时，需要三个不同限制性位点来确保所述基因可以选择性切除和/或置换。在一个实施方案中，一种或多种、例如所有的转基因呈转基因盒形式。在一个实施方案中，BX和BY分别包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。在一个实施方案中，BX和BY不包含限制性位点。在一个实施方案中，BX是键并且BY不是键。在一个实施方案中，BY是键并且BX不是键。
在一个实施方案中，所述转基因位于BX中。在一个实施方案中，所述转基因或转基因盒位于BY中。在一个实施方案中，转基因或转基因盒位于BX和BY中，例如在每个位置中，所述转基因可能相同或不同。
有利的是，本病毒构建体中的转基因被插入从早期基因去除的位置中，因为这降低了影响病毒基因表达或复制速度的可能性。
在一个独立的方面，提供具有复制能力的血清11型溶瘤腺病毒或其病毒衍生物，其中纤维、六邻体和衣壳是血清11型，其中病毒基因组包含编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列，所述DNA序列在选自由E4和主要晚期启动子组成的腺病毒内源启动子的控制下，以使得所述转基因不干扰病毒复制，例如其中编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列在E4启动子的控制下或者可选地在主要晚期启动子的控制下，特别是其中编码抗体或抗体结合片段的DNA序列定位在病毒基因组序列中的L5后(即接近病毒序列的3'端)。有利的是，使用内源启动子可最大化可用于插入转基因的空间量。
有利的是，当在这些启动子的控制下时，病毒保持复制能力并且还能够表达呈全长抗体或合适的结合片段形式的抗体或其他蛋白。因此所选择的抗体或其他蛋白将由癌细胞表达。使用内源启动子可能是有利的，因为其降低需要并入以表达抗体、片段或其他蛋白的转基因盒的大小，即所述盒可能较小，因为不需要包括外源启动子。
在治疗情形中在病毒中使用内源启动子也可能是有利的，因为转基因仅在病毒复制时表达，而相比之下，组成型外源启动子将连续地转录所述转基因并且可能导致不当浓度的抗体或片段。
在一个实施方案中，抗体或片段的表达在主要晚期启动子的控制下。
在一个实施方案中，抗体或片段的表达在E4启动子的控制下。
在一个独立的方面，提供具有复制能力的血清11型溶瘤腺病毒或其病毒衍生物，其中纤维、六邻体和衣壳是血清11型，其中所述病毒基因组包含位于所述病毒基因组的一部分中的编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列，其在病毒复制周期中晚期表达并且使得所述转基因不干扰病毒复制，其中所述DNA序列在腺病毒外源启动子的控制下，例如其中编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列在CMV启动子的控制下，特别是编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列定位在病毒基因组序列中的L5后(即接近病毒序列的3'端的末端)。
使用外源启动子可能是有利的，因为它可以强烈地且组成性地表达抗体或片段，这在一些情况下可能特别适用，例如当患者具有弥漫性很大的癌症时。
在一个实施方案中，所述抗体或片段的表达在CMV启动子的控制下。
在一个实施方案中，所述外源启动子与这种DNA序列相关，例如是编码所述抗体或片段的表达盒的一部分。
在一个实施方案中，编码所述抗体或片段的DNA序列定位在病毒序列中的L5基因后。有利的是，本发明人已经确定，多种转基因可在外源或内源启动子的控制下插入BX和/或BY中，而不会不利地影响病毒的生命周期或载体的稳定性。
在一个实施方案中，所述转基因是包含至少一个编码序列(即至少一种转基因)和任选地一种或多种元件的转基因盒的一部分，所述元件独立地选自：
i.基因表达的调节子，例如外源启动子或剪接受体；
ii.内部核糖体进入(IRES)DNA序列；
iii.编码高自我剪切效率2A肽的DNA序列；
iv.编码多聚腺苷酸化序列的DNA序列，和
v.其组合。
因此，在一个实施方案中，所述转基因盒包含i)或ii)或iii)或iv)。
在一个实施方案中，所述转基因盒包含i)和ii)，或i)和iii)，或i)和iv)，或ii)和iii)，或ii)和iv)，或iii)和iv)。
在一个实施方案中，所述转基因盒包含i)和ii)和iii)，或i)和ii)和iv)，或i)和iii)和iv)，或ii)和iii)和iv)。
在一个实施方案中，所述转基因盒包含i)和ii)和iii)和iv)。
在一个实施方案中，所述转基因或转基因盒包含Kozak序列，其辅助mRNA的翻译，例如在蛋白质编码序列的起始处。
在一个实施方案中，所述病毒具有复制能力。
在一个实施方案中，所述病毒具有复制缺陷，即是载体。
此外提供包含根据本公开的病毒或载体的组合物，特别是药物组合物，例如包含根据本公开的腺病毒和药学上可接受的赋形剂。
本公开还涉及根据本公开的腺病毒或组合物，其用于治疗、例如用于治疗癌症。
本公开还涉及一种治疗方法，其包括向有需要的患者、特别是人类患者施用治疗有效量的如本文所述的病毒或包含其的组合物。
附图说明
图1示出用NG-135病毒基因组转染后的HEK293细胞中的NG-135病毒粒子的转染和扩增。
用纯化的NG-135基因组DNA转染HEK293细胞并且通过观测细胞病变作用(CPE)来监测病毒产生。显微镜图像(A-E)显示，可从转染后144小时观测到以细胞单层中形成斑块为特征的CPE，在转染后216小时收集病毒(E)。使收集的病毒在HEK293细胞中扩增，当在72小时后观测到CPE时收集(F-G)并且然后扩增第二次，当在48小时后观测到CPE时收集(H-I)。
图2示出用NG-74病毒基因组转染后的HEK293细胞中的NG-74病毒粒子的转染和扩增。
用纯化的NG-74基因组DNA转染HEK293细胞并且通过观测细胞病变作用(CPE)来监测病毒产生。显微镜图像(A-J)显示，可从转染后336小时观测到以细胞单层中形成斑块为特征的CPE，在转染后384小时收集病毒(J)。使收集的病毒在HEK293细胞中扩增(K-R)，当在240小时后观测到CPE时收集(R)并且然后扩增第二次(S-V)、第三次(W-X)、第四次(Y-Z)和第五次(@)，当观测到显著CPE时收集。
图3示出用NG-73病毒基因组转染后的HEK293细胞中的NG-73病毒粒子的转染和扩增。
用纯化的NG-73基因组DNA转染HEK293细胞并且通过观测细胞病变作用(CPE)来监测病毒产生。显微镜图像(A-G)显示，可从转染后144小时观测到以细胞单层中形成斑块为特征的CPE，在转染后192小时收集病毒。使收集的病毒在HEK293细胞中扩增(H)并且然后扩增第二次(I-L)和第三次(M)，当观测到显著CPE时收集。
图4示出从NG-135感染的HEK293细胞分泌的抗VEGF抗体的ELISA检测。
使HEK293细胞在体外感染对照病毒、NG-47、或表达抗VEGF抗体的病毒NG-135持续72小时。使用人类VEGF涂布板和抗人类IgG-Fc检测抗体通过ELISA测量培养上清液中的人类IgG1抗VEGF抗体水平(A)。使用纯化的人类抗VEGF抗体贝伐单抗的标准曲线来定量抗体水平(B)。
图5示出从NG-135感染的HEK293细胞分泌的抗VEGF抗体的免疫印迹(westernblot)检测。
使HEK293细胞在体外感染表达抗VEGF抗体的病毒NG-135持续24小时。通过免疫印迹法用抗人类IgG检测抗体评估培养上清液中的人类IgG1抗VEGF抗体。
图6示出纯化的人类抗VEGF抗体贝伐单抗的标准曲线。
将纯化的人类抗VEGF抗体贝伐单抗连续稀释并使用人类VEGF涂布板通过ELISA定量。这确定了用于ELISA中的贝伐单抗标准曲线产生所需的浓度。
图7示出从NG-76感染的HEK293细胞分泌的抗VEGF ScFv的免疫印迹检测。
使HEK293细胞感染NG-76病毒，培养24或44小时并且然后使用抗His标签抗体通过免疫印迹法评估抗VEGF ScFv的表达来检测编码的ScFv产物。
图8示出从NG-76或NG-78感染的结肠癌细胞分泌的抗VEGF ScFv的免疫印迹检测。
使HT-29结肠癌细胞感染EnAd、NG-76或NG-78病毒，培养22、46或70小时并且然后使用抗His标签抗体通过免疫印迹法评估抗VEGF ScFv的表达来检测编码的ScFv产物(A)。
图9示出HT-29细胞中感染后48小时的NG-76病毒复制。
使HT-29结肠癌细胞感染10或1个NG-76病毒粒子/细胞(ppc)，培养48小时并且然后通过qPCR评估病毒基因组表达。
图10示出概述抗VEGF抗体转基因盒的结构的示意图。
将完全(重链和轻链)或ScFv形式的抗VEGF抗体的序列插入EnAd2.4基因组中位于病毒L5(纤维)基因下游的Sbf与Sgf限制性位点之间。
图11示出在结肠癌细胞系中NG-135病毒复制和基因表达与EnAd类似。使HT-29和DLD人类结肠直肠癌细胞系在体外感染EnAd或NG-135并培养3天。评估病毒复制(使用qPCR通过病毒DNA定量来测量)和病毒基因(六邻体)表达(使用RTqPCR通过病毒RNA定量来测量)。利用两种病毒获得类似数据(A和B)。
图12示出NG-135感染的结肠癌细胞系中的可检测抗VEGF抗体基因表达。使HT-29和DLD人类结肠直肠癌细胞系在体外感染EnAd或NG-135，培养3天并且然后通过来自细胞的RNA的RTqPCR评估抗VEGF抗体的表达。
图13示出抗VEGF抗体存在于NG-135感染的结肠癌细胞系的上清液中并且可以结合hVEGF-165。使HT-29、DLD和HCT-116人类结肠直肠癌细胞系在体外感染EnAd或NG-135，培养3天。使用人类VEGF涂布板和抗人类IgG-Fc检测抗体通过ELISA测量培养上清液中的人类IgG1抗VEGF抗体水平。使用纯化的人类抗VEGF抗体贝伐单抗的标准曲线定量抗体水平。
图14示出抗VEGF ScFv存在于NG-76感染的结肠癌细胞系的上清液中并且可以结合hVEGF-165。使HT-29结肠癌细胞感染EnAd、NG-76或NG-78病毒，培养22、46或70小时并且然后使用抗His标签通过免疫印迹法评估抗VEGF ScFv的表达来检测编码的ScFv产物(A)。
通过VEGF结合ELISA评估人类胚胎肾细胞中的ScFv表达。通过在ELISA中包括低浓度的纯化人类抗VEGF抗体贝伐单抗通过VEGF结合抑制来证实所表达ScFv对VEGF的特异性(B)。
图15：在植入有DLD细胞的皮下异种移植模型中NG-135病毒复制与EnAd类似。DLD人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且向确定肿瘤中注入5×109个EnAd或NG-135病毒粒子。通过qPCR在感染后第3、7(A，每个时间点n＝4)或28天(B，n＝10)评估肿瘤中的病毒复制。
图16示出在NG-135处理的皮下DLD肿瘤模型中检测到抗VEGF抗体基因表达。DLD人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且向确定肿瘤中注入5×109个EnAd或NG-135病毒粒子。在处理后第3和7天通过肿瘤组织RNA的RTqPCR评估病毒六邻体基因(A)和编码的抗VEGF抗体重链基因表达(B)(mRNA)。
图17示出抗VEGF抗体在NG-135处理的皮下DLD肿瘤模型中表达。DLD人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且向确定肿瘤中注入5×109个EnAd(n＝4)或NG-135(n＝8)病毒粒子。在感染后28天切除肿瘤，匀浆化并且通过ELISA评估可溶性提取物中的总人类IgG1含量(A)和抗VEGF抗体(B)。向来自一个EnAd肿瘤的提取物中掺入8ng/ml的在每次ELISA中作为阳性对照的人类抗VEGF抗体(贝伐单抗)。
图18：皮下异种移植模型的NG-135感染示出HCT-116肿瘤中的抗VEGF抗体表达和病毒复制。
HCT-116人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且向确定肿瘤中注入5×109个EnAd或NG-135病毒粒子。在第3、7和14天切除肿瘤(每个时间点n＝5)。通过qPCR评估病毒复制(A)并且通过人类IgG ELISA测定抗VEGF抗体(人类IgG1)的组织表达(B)。
图19：在异种移植肿瘤模型中在NG-135处理后28天在外周循环中可以检测到抗VEGF抗体。DLD人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且向确定肿瘤中注入5×109个EnAd或NG-135病毒粒子。通过人类IgG1 ELISA测定法评估带肿瘤小鼠的外周循环中的抗VEGF抗体水平。减去背景的450nm下的吸光度示于(A)中并且使用纯化的人类抗VEGF抗体贝伐单抗的标准曲线定量抗VEGF抗体的浓度(B)。
图20示出可存在于转基因盒中的示例元件的示意图。
图21示出在转基因盒中编码的示例元件的示意图。
图22示出编码报告基因的转基因盒的示意图。
图23示出编码细胞因子的转基因盒的示意图。
图24示出编码抗体或抗体结构域的转基因盒的示意图。
图25示出用NG-47和NG-61病毒感染的结肠癌细胞系中的病毒复制和功能报告蛋白表达。使HT-29人类结肠直肠癌细胞系感染EnAd或分别表达报告蛋白GFP或荧光素酶的病毒NG-47或NG-61持续24、48、72或96小时。通过qPCR在每个时间点评估病毒复制并且其与EnAd类似(A-B)。通过细胞裂解液中的可检测荧光水平来评估GFP表达(C)。
图26示出NG-47和NG-61病毒溶瘤效能与EnAd类似。
使HT-29人类结肠直肠癌细胞系感染EnAd、NG-47或NG-61病毒粒子。在感染后72小时定量细胞活力并以细胞存活％绘图(A-B)。在HT29细胞系中(A-B)以及在HT29、WI38和MRC5细胞系中(C)，NG-47和NG-61病毒效能与EnAd相当。
图27示出在表达报告基因的多种EnAd病毒中的病毒复制和转基因表达。使HT-29人类结肠直肠癌细胞系感染EnAd或在外源启动子CMV、内源主要晚期启动子(MLP)或内源E4启动子的控制下表达GFP的多种病毒。在24、48、72或96小时后，通过qPCR评估病毒复制(A)并且在板读取器上通过荧光检测定量GPF表达(B)。
图28示出在NG-135感染的结肠和肺癌细胞系中的抗VEGF抗体产生。使HT-29人类结肠直肠癌或A549肺癌细胞系感染NG-135病毒粒子持续24、48或72小时。在每个时间点，通过IgG1 ELISA经5分钟、1小时或3小时评估细胞上清液中的抗体产生(HT-29数据示于A中，A549数据示于B中)。在24、48或72小时内每1e6个细胞产生的IgG1量的计算示于表格(C)中。
图29示出在感染病毒NG-139的结肠癌细胞系中的NG-139病毒产生和TNFα表达。使HT-29细胞感染NG-139病毒持续36小时，然后通过CPE的显像评估病毒产生并且通过免疫组织化学(IHC)对病毒衣壳蛋白六邻体的产生进行染色(A和B)。通过ELISA评估NG-139感染细胞上清液中的TNFα产生并且在(C)中所示的表格中定量。DLD人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且用5×109个EnAd或NG-135病毒粒子处理确定肿瘤3次。通过ELISA评估处理后15天肿瘤中的TNF水平(D)。
图30示出腺病毒的基因组结构的图。
图31示出在植入有DLD细胞的皮下异种移植模型中处理后第3天和第7天的NG-61病毒复制。
图32示出在植入有DLD细胞的皮下异种移植模型中处理后第7天的肿瘤中的荧光素酶转基因表达。
图33示出结肠、肺和卵巢癌细胞系中的NG-135病毒复制和抗VEGF抗体表达。使HT-29、HCT-116、DLD(结肠)、SKOV(卵巢)或A549(肺)癌细胞系感染NG-135或EnAd病毒粒子持续24-120小时。通过qPCR每24小时评估病毒复制并且在时程上的最大复制绘制于(A)中。此外通过IgG1ELISA每24小时测量抗VEGF抗体产生并且在每个时间点分泌到细胞上清液中的总抗体示于(B)中。
图34示出编码肿瘤相关抗原、抗体或抗体结构域的转基因盒的示意图。
图35示出通过IT给药在体内感染的HCT-116皮下异种移植肿瘤的离体培养外植体中的NG-135病毒复制和抗VEGF抗体表达。
HCT-116人类结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中并且向确定肿瘤中注入5×109个NG-135病毒粒子。10天后切除肿瘤并且测试在7天离体培养之前或之后的病毒基因组水平(A)和抗VEGF抗体水平(B)。在血清中的抗VEGF抗体水平。
图36示出体内A549细胞肺肿瘤小鼠模型中的NG-135病毒复制和对肿瘤组织的作用。将人类A549细胞经静脉内注入SCID小鼠中以在肺中形成结节肿瘤。在第8周，当形成肿瘤时，经静脉内注射EnAd或NG-135病毒(5e9个粒子)并且在不同时间点下监测对肿瘤的作用。给药方案示于(A)中。对于不同小鼠，在给药后第3天和第25天，NG-135对于肺中的肿瘤负担的影响(如通过qPCR对人类基因PTGER2所测量)示于(B)中。(C)示出与肿瘤水平(人类PTGER2 qPCR)相关的病毒基因组水平(qPCR)。将肺解剖成可见肿瘤结节并且此外评估剩余肺组织的病毒基因组水平(D)。
图37示出使用通过腹膜内注射植入CB17-SCID小鼠中的稳定表达荧光素酶的人类SKOV-3卵巢癌细胞(5e6个细胞/小鼠)的鼠类原位异种移植卵巢癌模型中的NG-135和EnAd活性。在植入后22天，利用通过腹膜内注射递送的PBS(对照)或5e7个EnAd、NG-135或NG-78病毒粒子处理小鼠并且随时间以荧光素酶活性监测肿瘤生长。
图38示出NG-135病毒和所表达的抗VEGF抗体在来自在生物反应器中培养的HEK293细胞的病毒物质的按比例扩大产生和纯化后的表征。NG-135与EnAd病毒标准物在效能(A)和复制(B)方面是类似的，其中在培养上清液中检测的抗体水平随时间增加(C)。纯化抗体的免疫印迹(D)和Biacore(E)表征显示与商业制造的抗VEGF抗体(安维汀(Avastin))的可比性。
图39示出编码由可自我剪切的P2A肽连接的抗VEGF抗体重链和轻链的EnAd病毒(NG-165)的产生和表征，其中EnAd和NG-135的病毒效能(A)、复制(B)和抗VEGF抗体产生(C)具有类似数据。
图40示出在内源或外源启动子的控制下编码抗VEGF抗体ScFv的EnAd病毒NG-76和NG-78的表征。两种病毒都显示与标准EnAd病毒类似的溶瘤效能(A和B)。对于NG-78，在上清液和细胞裂解液级分中的ScFv与VEGF的直接结合活性示于(C)中，并且商业抗VEGF抗体(贝伐单抗)对于VEGF结合的竞争示于(D)中。
图41示出在带有肿瘤的小鼠中的NG-76病毒活性与EnAd的比较，其中测量病毒复制(A)、六邻体mRNA(B)和ScFv mRNA(C)。
图42示出在HT-29细胞中NG-135对抗体的复制和表达的时程。对于所测试的所有MOI在72小时可检测到分泌的抗体，但是抗体表达水平依赖于输入MOI(A)。在感染1或10个病毒ppc后24、48和72小时的抗体产生和复制示于(B-D)中。
图43示出HT-29癌细胞以及WI38和MRC5基质成纤维细胞中的NG-135复制(A)、抗VEGF抗体(B)和传染性病毒粒子产生(C)。
图44示出在原代人类树突状细胞中在(B)中所示的外源(CMV)启动子(NG-47)或(D)中所示的内源MLP(NG-107)的控制下表达的eGFP报告转基因的选择性表达。暴露于EnAd的树突状细胞的eGFP报告转基因表达示于(A)中并且未感染对照细胞的eGFP报告转基因表达示于(C)中。
图45示出当转基因表达在外源(CMV)启动子(NG-61)或内源MLP启动子(NG-63)的控制下时，在BALB/c小鼠中在肿瘤中的荧光素酶转基因表达和对转基因、病毒或肿瘤的功能免疫反应。向在免疫学完整BALB/c小鼠的腰窝上生长的CT-26肿瘤中经肿瘤内注射所述病毒中的任一种并且通过发光成像监测随时间的荧光素酶表达(A)并且通过ELISPOT测定法测量对荧光素酶(B)、EnAd(C)或肿瘤(D)抗原的T细胞反应。
图46示出编码免疫检查点抑制剂通路蛋白PD-L1的抗体(NG-190)或ScFv抗体变体(NG-221)的病毒的病毒溶瘤效能(A、B)和复制(C、D)，其中与作为标准比较物的EnAd病毒进行比较。
图47示出在NG190和NG-221感染的HT-29细胞的上清液中的抗PD-L1抗体或ScFv产生(A)和PD-L1配体结合活性(B、C、D)的表征，其中与作为特异性对照的产生抗VEGF IgG1抗体的NG-165的IgG1产生和结合进行比较。
图48示出通过混合淋巴细胞反应中的T细胞活化程度来评估在NG-190感染A549细胞的上清液中表达的抗PD-L1抗体的功能活性，以培养上清液中的IL-2测量。使用从两种不同供体的PBMC分化的树突状细胞作为刺激细胞，其中具有从第三供体纯化的CD4 T细胞。将NG-190上清液的T细胞反应增强与纯化的抗PDL1单克隆抗体和来自NG-165培养物的上清液进行比较。
图49示出在NG-177感染的293细胞上清液中表达的抗PD-L1抗体的功能活性与作为抗体特异性对照的NG-135的比较。两种病毒在293细胞中产生类似的IgG1水平(A)。相比于NG-135，NG-177上清液选择性抑制PD-L1与其配体PD1的结合(B)，并且这些相同的NG-177上清液能够增强MLR测定法中的IL-2产生，以纯化的单克隆抗PD-L1作为阳性对照(C)。
图50示出在IFNg刺激的A549细胞上的NG-177上清液的细胞PD-L1结合活性的FACS分析，与纯化的单克隆抗PD-L1抗体和NG-135上清液的结合进行比较。
图51示出编码免疫检查点抑制剂通路蛋白CTLA-4的抗体的EnAd病毒(NG-242)的表征。病毒复制与EnAd对照类似(A)。NG-242的IgG1产生与NG-135类似(B)。通过直接配体结合显示NG242上清液中的抗CTLA4抗体的功能活性(C)，与NG-165对照上清液进行比较，以及在ELISA实验中通过抑制重组CTLA4-Fc与其配体B7-1的结合(D)。
图52示出编码肿瘤相关抗原TAA(NY-ESO-1)的病毒(NG-220)的表征。NG-220(A)或NG-217(B)的病毒复制与EnAd对照类似。可在NG-220感染细胞裂解液中而非EnAd对照细胞中通过免疫印迹法检测NY-ESO-1(C)。
图53示出在基因组的区域Bx和By中具有插入的独特限制性位点的EnAd病毒(NG-185)的表征。通过细胞活力测定法比较的病毒溶瘤活性(A)和病毒复制(B)与EnAd对照类似。
图54示出编码多种ScFv、shRNA或碘化钠同向转运蛋白的转基因盒的示意图。
具体实施方式
如本文所用的转基因是指已经插入基因组序列中的基因，它是病毒的非天然(外源性)基因或在病毒中的特定位置中没有正常存在的基因。下文给出转基因的实例。如本文所用的转基因还包括作为基因的一部分的基因功能片段，其当插入时适合执行全长基因的功能或大部分功能。
除非上下文相反说明，否则转基因和编码序列在本文中在插入病毒基因组中的情形下可互换使用。如本文所用的编码序列是指例如编码功能性RNA、肽、多肽或蛋白质的DNA序列。通常，编码序列是编码所关注的功能性RNA、肽、多肽或蛋白质的转基因的cDNA。下文描述所关注的功能性RNA、肽、多肽和蛋白质。
明显地，病毒基因组含有DNA的编码序列。在本说明书的上下文中，除非已经通过重组技术修饰(例如它们处在非天然位置中或非天然环境中)，否则病毒的基因组序列中的内源(天然存在的基因)不被视为转基因。
在一个实施方案中，如本文所用的转基因是指含有已经从一种生物体分离并引入本公开的不同生物体、即病毒中的基因或cDNA序列的DNA区段。在一个实施方案中，这种非天然DNA区段可保持产生功能性RNA、肽、多肽或蛋白质的能力。
因此，在一个实施方案中，所插入的转基因编码人类或人源化蛋白质、多肽或肽。
在一个实施方案中，所插入的转基因编码例如来自小鼠、大鼠、兔、骆驼、美洲驼或类似物的非人类蛋白、多肽或肽(例如非人类哺乳动物蛋白、多肽或肽)或RNA分子。有利的是，本公开的病毒允许转基因在癌细胞内部传输。因此，人类患者对非人类序列(例如蛋白质)产生的反应可通过这种细胞内递送最小化。
DNA序列可包含一种以上的转基因，例如1、2、3或4种转基因，例如1或2种。
转基因盒可包含一种以上的转基因，例如1、2、3或4种转基因，例如1或2种。
在一个或多个实施方案中，所述盒是如一个或多个附图或实施例中所示布置的。
如本文所用的转基因盒是指编码呈一种或多种编码序列和一种或多种调节元件形式的一种或多种转基因的DNA序列。
转基因盒可编码一种或多种单顺反子和/或多顺反子mRNA序列。
在一个实施方案中，所述转基因或转基因盒编码单顺反子或多顺反子mRNA，并且例如所述盒适合在内源启动子或外源启动子或其组合的控制下的位置处插入腺病毒基因组中。
如本文所用的单顺反子mRNA是指编码单一功能性RNA、肽、多肽或蛋白质的mRNA分子。
在一个实施方案中，所述转基因盒编码单顺反子mRNA。
在一个实施方案中，在编码单顺反子mRNA的盒的情形中的转基因盒是指任选地含有外源启动子(它是将决定转基因何时何地具活性的调节序列)或剪接位点(它是决定mRNA分子何时将被剪接体剪切的调节序列)、通常源自所关注蛋白的cDNA的编码序列(即转基因)、任选地含有多聚A信号序列和终止子序列的DNA区段。
在一个实施方案中，所述转基因盒可编码一种或多种多顺反子mRNA序列。
如本文所用的多顺反子mRNA是指编码两种或更多种功能性RNA、肽或蛋白质或其组合的mRNA分子。在一个实施方案中，所述转基因盒编码多顺反子mRNA。
在一个实施方案中，在编码多顺反子mRNA的盒的情形下的转基因盒包括任选地含有外源启动子(它是将决定转基因何时何地具活性的调节序列)或剪接位点(它是决定mRNA分子何时将被剪接体剪切的调节序列)、通常源自所关注的蛋白质或肽的cDNA的两种或更多种编码序列(即转基因)的DNA区段，例如其中每个编码序列被IRES或2A肽隔开。在待转录的最后编码序列之后，所述盒可任选地含有多聚A序列和终止子序列。
在一个实施方案中，所述转基因盒编码单顺反子mRNA，接着是多顺反子mRNA。在另一个实施方案中，所述转基因盒编码多顺反子mRNA，接着是单顺反子mRNA。
在一个实施方案中，所述腺病毒是人类腺病毒。如本文所用的“腺病毒”、“血清型”或“腺病毒血清型”是指可指定为50种以上目前已知的腺病毒血清型中的任一种的任何腺病毒，其被分类为A-F亚群，并且进一步扩展至任何尚未鉴定或尚未分类的腺病毒血清型。参见例如Strauss,"Adenovirus infections in humans,"《腺病毒(The Adenoviruses)》,Ginsberg,ea.,Plenum Press,纽约,NY,第451-596页(1984)和Shenk,"Adenoviridae:TheViruses and Their Replication,"《费氏病毒学(Fields Virology)》,第2卷,第四版,Knipe,35ea.,Lippincott Williams&Wilkins,第2265-2267页(2001)，如表1中所示。
亚群 腺病毒血清型
A 12、18、31
B 3、7、11、14、16、21、34、35、51
C 1、2、5、6
D 8-10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-49、50
E 4
F 40、41
在一个实施方案中，所述腺病毒是B亚群，例如独立地选自包含以下或由以下组成的群组：Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34和Ad51，例如Ad11，特别是Ad11p(Slobitski菌株)。在一个实施方案中，本发明的腺病毒具有衣壳，例如B亚群腺病毒、例如Ad11、特别是Ad11p的六邻体和/或纤维。在一个实施方案中，所述腺病毒是Ad11或具有Ad11、例如Ad11p的纤维和/或六邻体和/或五邻体。
在一个实施方案中，它不是A群病毒。
在一个实施方案中，所述腺病毒不是C群病毒。在一个实施方案中，所述腺病毒不是Ad5。如本文所用的Ad5是指称为血清5型的已知腺病毒，其不扩展至包含来自Ad5的序列的遗传工程改造的病毒。在一个实施方案中，本公开的病毒不具有Ad5衣壳。
在一个实施方案中，本公开的腺病毒是嵌合的。当腺病毒是嵌合的时，则将使用外衣壳的特性来确定血清型。如本文所用的嵌合是指包含来自至少两种不同的病毒血清型(包括同一群内的不同血清型)的DNA的病毒。
在一个实施方案中，所述溶瘤病毒具有来自相同血清型、例如Ad11、特别是Ad11p的纤维、六邻体和五邻体蛋白，例如存在于Ad11p的基因组序列的位置30812-31789、18254-21100和13682-15367处，其中核苷酸位置是相对于genbank ID 217307399(登录号：GC689208)。
在一个实施方案中，所述腺病毒是enadenotucirev(也称为EnAd和先前称为EnAd)。如本文所用的Enadenotucirev是指SEQ ID NO:12的嵌合腺病毒。它是一种具有复制能力的溶瘤嵌合腺病毒，其相比于野生型腺病毒具有增强的治疗特性(参见WO2005/118825)。EnAd具有嵌合E2B区，其以来自Ad11p和Ad3的DNA和E3/E4中的缺失为特征。enadenotucirev的结构变化导致相比于Ad11p小约3.5kb的基因组，从而为转基因插入提供额外“空间”。
OvAd1和OvAd2也是与enadenotucirev类似的嵌合腺病毒，其也在基因组中具有额外“空间”(参见WO2008/080003)。因此在一个实施方案中，所述腺病毒是OvAd1或OvAd2。
在一个实施方案中，所述腺病毒是溶瘤的。如本文所用的溶瘤腺病毒是指相比于非癌细胞优先杀死癌细胞的腺病毒。
在一个实施方案中，所述溶瘤病毒是细胞凋亡的。也就是说，其促进程序化细胞死亡。
在一个实施方案中，所述溶瘤病毒是细胞溶解的。可以在代表性肿瘤细胞系中确定本公开的溶瘤腺病毒的细胞溶解活性并且将数据转换为效能测量结果，例如其中使用属于C亚群的腺病毒例如Ad5作为标准物(即假定效能为1)。适于测定细胞溶解活性的方法是MTS测定法(参见以引用的方式并入本文中的WO2005/118825的实施例4，图2)。
在一个实施方案中，所述溶瘤病毒是坏死性的。也就是说，其造成或促进细胞坏死或免疫原性细胞死亡。在一个实施方案中，坏死性细胞死亡是有利的，因为其触发、诱导患者(宿主)的免疫反应。
除非上下文另外说明，否则如本文所用的腺病毒是指具有复制能力的病毒以及复制缺陷型病毒载体。
在一个实施方案中，所述病毒具有复制能力。在本说明书的上下文中的具有复制能力是指具有在细胞中体外和体内复制的所有必要机制、即无需包装细胞系辅助的病毒。能够在互补的包装细胞系中复制的例如在E1区中缺失的病毒载体不是本上下文中的具有复制能力的病毒。
病毒载体是复制缺陷型的并且需要包装细胞以提供互补基因来允许复制。
如本文所用的腺病毒基因组是指编码与腺病毒的功能/生命周期相关的结构蛋白和元件的DNA序列。
迄今为止研究的所有人类腺病毒基因组具有相同的一般组织，即编码特定功能的基因位于病毒基因组中的相同位置(在本文中称为结构元件)。病毒基因组的每个末端具有称为反向末端重复序列(或ITR)的短序列，这是病毒复制所需的。病毒基因组含有五个早期转录单元(E1A、E1B、E2、E3和E4)、三个延迟早期单元(IX、IVa2和E2晚期)和经过加工以产生五个家族的晚期mRNA(L1-L5)的一个晚期单元(主要晚期)。由早期基因编码的蛋白质主要参与复制和宿主细胞对感染的反应的调节，而晚期基因编码病毒结构蛋白。早期基因以字母E作为前缀并且晚期基因以字母L作为前缀。
腺病毒的基因组是紧密结合的，也就是说，很少存在非编码序列，并且因此可能难以找到合适的位置来插入转基因。本发明人已经鉴定出容许转基因的两个DNA区域，特别地所鉴定的位点适合容纳复杂的转基因，例如编码抗体的那些。也就是说，转基因在没有不利影响病毒活力、天然特性例如溶瘤特性或复制的情况下表达。
在一个实施方案中，根据本公开的溶瘤或部分溶瘤病毒可能是由于E4和/或E3区的缺失，例如E4区的部分缺失或E3区的完全缺失，或者可选地E4区(例如E4或f4)的部分缺失和E3区的完全缺失，例如入本文公开的序列中所示例。
在一个实施方案中，本公开的溶瘤病毒是嵌合的。如本文所用的嵌合是指包含来自两种或更多种不同血清型的DNA并具有溶瘤病毒特性的病毒。
在一个实施方案中，溶瘤病毒是EnAd或保留病毒的基本有益特性的其活性衍生物。EnAd公开于WO2005/118825(以引用的方式并入本文)中并且病毒的完全序列在本文以SEQ ID NO:12提供。嵌合E2B区在本文以SEQ ID NO:47公开。
可选的溶瘤病毒包括OvAd1和OvAd2，其在WO2008/080003中分别以SEQ ID NO:2和3公开并以引用的方式并入本文中。
有利的是，本公开的腺病毒展现类似的病毒活性，例如在体外感染多种不同的结肠癌细胞系后EnAd的复制和/或传染性概况。
腺病毒的结构元件
本公开还涉及本文公开的病毒或病毒组分/构建体、例如质粒的新型序列。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(I)的序列的基因组
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR (I)
其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是键或包含E3；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(I)的序列的基因组，其中B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是键或包含E3；BX是键；BB包含L5；BY是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(I)的序列的基因组，其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是键或包含E3；BX是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB是L5；BY是键；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ia)的序列的基因组：
5'ITR-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR(Ia)
其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是键或包含E3；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且至少一个包含转基因或限制性位点，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ia)的序列的基因组，其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是键或包含E3；BX是键；BB包含L5；BY是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且至少一个包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ia)的序列的基因组，其中BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是键或包含E3；BX是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ib)的序列的基因组：
5'ITR-BA-BX-BB-BY-B3-3'ITR (Ib)
其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ib)的序列的基因组，其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；BX是键；BB包含L5；BY是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ib)的序列的基因组，其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；BX是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ic)的序列的基因组：
5'ITR-BA-B2-BX-BB-BY-3'ITR (Ic)
其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是E3；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ic)的序列的基因组，其中BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2包含E3；BX是键；BB包含L5；BY是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ic)的序列的基因组，其中：BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2是E3；BX是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因或限制性位点，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Id)的序列的基因组：
5'ITR-B1-BA-BX-BB-BY-B3-3'ITR (Id)
其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因、限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Id)的序列的基因组，其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA是E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；BX是键；BB包含L5；BY是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因、限制性位点或二者，例如转基因。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Id)的序列的基因组，其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；BX是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键；B3是键或包含E4；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因、限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ie)的序列的基因组：
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-3'ITR (Ie)
其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2包含E3；BX是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键或包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因、限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ie)的序列的基因组，其中：B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2包含E3；BX是键；BB包含L5；BY是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因、限制性位点或二者。
在一个实施方案中，所述腺病毒包含包括式(Ie)的序列的基因组，其中B1包含E1A、E1B或E1A-E1B；BA包含E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；B2包含E3；BX是包含限制性位点、一种或多种转基因或二者的DNA序列；BB包含L5；BY是键；其中BX和BY中的至少一个不是键并且包含转基因、限制性位点或二者。
在一个实施方案中，提供式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)的化合物，其中BX和BY不是键并且包含转基因、限制性位点或二者，例如BX和BY都是转基因。
键是指连接一个DNA序列与另一个DNA序列、例如连接病毒基因组的一个部分与另一个部分的共价键。因此当本文式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)或(Ie)中的变量代表键时，由所述键表示的特征或元件不存在，即缺失。
因为腺病毒的结构通常是类似的，所以在本领域技术人员已知的结构元件和其所涉及的常用命名法方面讨论了以下元件。当在本文提及元件时，则我们是指腺病毒中编码所述元件的DNA序列或编码所述元件的相同结构蛋白的DNA序列。由于DNA密码的冗余性，后者是相关的。对于优化结果，可能需要考虑病毒的密码子使用偏好。
用于本公开的病毒中的来自腺病毒的任何结构元件可包含天然序列或由天然序列组成或者可在给定长度上具有至少95％、例如96％、97％、98％、99％或100％的相似性。原始序列可被修饰以省略10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的遗传物质。本领域技术人员意识到，当作出变化时，病毒的阅读框必须不被破坏以使得结构蛋白的表达受到破坏。
在一个实施方案中，给定元件是全长序列，即全长基因。
在一个实施方案中，给定元件小于全长并且保持与全长序列相同或相应的功能。
在一个实施方案中，对于在本公开的构建体中任选的给定元件，DNA序列可能小于全长并且不具有功能性。
编码腺病毒的结构或功能蛋白的结构基因通常通过DNA的非编码区域连接。因此，关于出于将转基因插入本公开的病毒中的目的在何处“切断”相关结构元件(特别是其非编码区域)的基因组序列，存在一些灵活性。因此，出于本说明书的目的，所述元件将视为在其适合目的的程度上的参考结构元件并且不编码外来物质。因此，适当时所述基因将与合适的非编码区相关，例如病毒的天然结构中可见。
因此，在一个实施方案中，将插入片段(例如编码限制性位点和/或转基因的DNA)插入基因组病毒DNA的非编码区中，例如内含子或基因间序列。据称，腺病毒的一些非编码区域可例如在可选剪接、转录调节或翻译调节中具有功能，并且这可能需要考虑在内。
本文鉴定的与L5区相关的位点适合容纳多种编码复杂实体例如RNAi、细胞因子、单链或多聚蛋白例如抗体的DNA序列。
如本文所用的基因是指与其相关的编码和任何非编码序列，例如内含子和相关外显子。在一个实施方案中，基因仅包含基本结构组分例如编码区域或由基本结构组分例如编码区域组成。
下文是与腺病毒的特定结构元件有关的讨论。
反向末端重复(ITR)序列是所有已知腺病毒所共有的并且由于其对称性而被如此命名，并且是病毒染色体复制起点。这些序列的另一种特性是其形成发夹的能力。
如本文所用的5'ITR是指来自腺病毒的5'端的部分或全部的ITR，其当并入腺病毒中的适当位置时保留ITR的功能。在一个实施方案中，所述5'ITR包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:12的约1bp至138bp的序列或沿着全长与其具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，特别是由SEQ ID NO:12的约1bp至138bp组成的序列。
如本文所用的3'ITR是指来自腺病毒的3'端的部分或全部的ITR，其当并入腺病毒中的适当位置时保留ITR的功能。在一个实施方案中，所述3'ITR包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:12的约32189bp至32326bp的序列或沿着全长与其具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，特别是由SEQ ID NO:12的约32189bp至32326bp组成的序列。
如本文所用的B1是指编码以下的DNA序列：来自腺病毒的部分或全部的E1A、腺病毒的部分或全部的E1B区，和腺病毒的独立地部分或全部的E1A和E1B区。
当B1是键时，则将从病毒省略E1A和E1B序列。在一个实施方案中，B1是键并且因此病毒是载体。
在一个实施方案中，B1还包含转基因。本领域中已知，E1区可以容纳可以破坏性方式插入E1区(即在序列的“中部”)中的转基因或者部分或全部的E1区可能缺失以提供更多的空间来容纳遗传物质。
如本文所用的E1A是指编码部分或全部的腺病毒E1A区的DNA序列。此处后者是提及多肽/蛋白E1A。其可突变以使得由E1A基因编码的蛋白具有保守性或非保守性氨基酸变化，以使得其适当时具有：与野生型(即相应的非突变蛋白)相同的功能；相比于野生型蛋白增加的功能；相比于野生型蛋白降低的功能、例如无功能；或相比于野生型蛋白具有新的功能或其组合。
如本文所用的E1B是指编码部分或全部的腺病毒E1B区(即多肽或蛋白)的DNA序列，其可突变以使得由E1B基因/区域编码的蛋白具有保守性或非保守性氨基酸变化，以使得其适当时具有：与野生型(即相应的非突变蛋白)相同的功能；相比于野生型蛋白增加的功能；相比于野生型蛋白降低的功能、例如无功能；或相比于野生型蛋白具有新的功能或其组合。
因此B1可相对于野生型E1区、例如野生型E1A和/或E1B被修饰或未被修饰。本领域技术人员可以容易地鉴定E1A和/或E1B是否存在或(部分)缺失或突变。
如本文所用的野生型是指已知腺病毒。已知腺病毒是不考虑序列是否可用而已经鉴定和命名者。
在一个实施方案中，B1具有SEQ ID NO:12的139bp至3932bp的序列。
如本文所用的BA是指编码E2B-L1-L2-L3-E2A-L4区的DNA序列，适当时包括任何非编码序列。通常这个序列将不包含转基因。在一个实施方案中，所述序列与来自已知腺病毒的连续序列基本上类似或相同，例如表1中所示的血清型，特别是B群病毒，例如Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad51或其组合，例如Ad3、Ad11或其组合。在一个实施方案中，E2B-L1-L2-L3-E2A-L4是指包含这些元件和与所述区域相关的其他结构元件，例如BA通常将包括编码蛋白IV2a的序列，例如如下：IV2A IV2a-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4。
在一个实施方案中，所述E2B区是嵌合的。也就是说，包含来自两种或更多种不同的腺病毒血清型、例如来自Ad3和Ad11、例如Ad11p的DNA序列。在一个实施方案中，所述E2B区具有SEQ ID NO:12的5068bp至10355bp的序列或在全长上与其具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一个实施方案中，组分BA中的E2B包含以SEQ ID NO:47(其对应于WO2005/118825中公开的SEQ ID NO:3)所示的序列。
在一个实施方案中，BA具有SEQ ID NO:12的3933bp至27184bp的序列。
如本文所用的E3是指编码部分或全部的腺病毒E3区(即蛋白/多肽)的DNA序列，其可突变以使得由E3基因编码的蛋白具有保守性或非保守性氨基酸变化，以使得其适当时具有：与野生型(即相应的非突变蛋白)相同的功能；相比于野生型蛋白增加的功能；相比于野生型蛋白降低的功能、例如无功能；或相比于野生型蛋白具有新的功能或其组合。
在一个实施方案中，所述E3区是来自表1中给出的腺病毒血清型或其组合，特别是B群血清型，例如Ad3、Ad7、Ad11(特别是Ad11p)、Ad14、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35、Ad51或其组合，例如Ad3、Ad11(特别是Ad11p)或其组合。
在一个实施方案中，所述E3区是部分缺失的，例如95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％缺失。
在一个实施方案中，B2是键，其中不存在编码E3区的DNA。
在一个实施方案中，编码E3区的DNA可被转基因置换或间断。如本文所用，“被如本文所用的转基因置换的E3区”包括部分或全部的E3区被转基因置换。
在一个实施方案中，所述B2区包含SEQ ID NO:12的27185bp至28165bp的序列。
在一个实施方案中，B2由SEQ ID NO:12的27185bp至28165bp的序列组成。
如本文所用的BX是指在BB中的L5基因的5'端附近的DNA序列。如本文所用的在L5基因的5'端附近或近侧是指：与L5基因的5'端或与其固有地相关的非编码区域相邻(邻接)，即与L5基因的5'主要端或与其固有地相关的非编码区域紧靠或邻接。可选地，附近或近侧可能是指接近L5基因，以使得BX区与L5基因的5'端之间不存在编码序列。
因此，在一个实施方案中，BX直接接合至L5中代表例如L5基因的编码序列起点的碱基。
因此，在一个实施方案中，BX直接接合至L5中代表例如非编码序列起点的碱基，或者直接接合至与L5天然相关的非编码区域。如本文所用的非编码区域天然相关L5是指作为作为L5基因的一部分或邻接但并非另一个基因的一部分的部分或全部的非编码区域。
在一个实施方案中，BX包含SEQ ID NO:10的序列。这种序列是人工非编码序列，其中可在其中插入例如包含转基因(或转基因盒)、限制性位点或其组合的DNA序列。这种序列是有利的，因为其充当缓冲物的原因在于允许在转基因的确切位置上的一些灵活性，同时最小化对病毒稳定性和活力的破坏性作用。
一个或多个插入片段可能出现在SEQ ID NO:10内距5'端、3'端的任何地方或在bp1至201之间的任何点，例如碱基对1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34、34/35、35/36、36/37、37/38、38/39、39/40、40/41、41/42、42/43、43/44、44/45、45/46、46/47、47/48、48/49、49/50、50/51、51/52、52/53、53/54、54/55、55/56、56/57、57/58、58/59、59/60、60/61、61/62、62/63、63/64、64/65、65/66、66/67、67/68、68/69、69/70、70/71、71/72、72/73、73/74、74/75、75/76、76/77、77/78、78/79、79/80、80/81、81/82、82/83、83/84、84/85、85/86、86/87、87/88、88/89、89/90、90/91、91/92、92/93、93/94、94/95、95/96、96/97、97/98、98/99、99/100、100/101、101/102、102/103、103/104、104/105、105/106、106/107、107/108、108/109、109/110、110/111、111/112、112/113、113/114、114/115、115/116、116/117、117/118、118/119、119/120、120/121、121/122、122/123、123/124、124/125、125/126、126/127、127/128、128/129、129/130、130/131、131/132、132/133、133/134、134/135、135/136、136/137、137/138、138/139、139/140、140/141、141/142、142/143、143/144、144/145、145/146、146/147、147/148、148/149、150/151、151/152、152/153、153/154、154/155、155/156、156/157、157/158、158/159、159/160、160/161、161/162、162/163、163/164、164/165、165/166、166/167、167/168、168/169、169/170、170/171、171/172、172/173、173/174、174/175、175/176、176/177、177/178、178/179、179/180、180/181、181/182、182/183、183/184、184/185、185/186、186/187、187/188、189/190、190/191、191/192、192/193、193/194、194/195、195/196、196/197、197/198、198/199、199/200或200/201之间。
在一个实施方案中，BX包含SEQ ID NO:10，其具有插入bp 27与bp 28之间或对应于SEQ ID NO:12的位置28192bp与28193bp之间的地方的DNA序列。
在一个实施方案中，插入片段是限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段包含一个或两个限制性位点。在一个实施方案中，所述限制性位点是包含2个限制性位点的19bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段是包含1个限制性位点的9bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段包含一个或两个限制性位点和至少一种转基因，例如一种或两种转基因。在一个实施方案中，所述限制性位点是包含2个限制性位点和至少一种转基因、例如一种或两种转基因的19bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段是包含1个限制性位点和至少一种转基因、例如一种、两种或三种转基因、例如一种或两种转基因的9bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，两个限制性位点夹着一种或多种、例如两种转基因(例如在转基因盒中)。在一个实施方案中，当BX包含两个限制性位点时，所述限制性位点彼此不同。在一个实施方案中，BX中的所述一个或多个限制性位点非天然存在于已经将其插入的特定腺病毒基因组中。在一个实施方案中，BX中的所述一个或多个限制性位点不同于位于腺病毒基因组中其他地方的其他限制性位点，例如不同于天然存在的限制性位点和/或引入基因组的其他部分中的限制性位点，例如引入BY中的限制性位点。因此，在一个实施方案中，一个或多个限制性位点允许特异性切断区段中的DNA。
有利的是，简单地通过使用适当的限制性酶，“独特”限制性位点的使用提供选择性和对于在哪里切断病毒基因组的控制。
如本文所用的特异性切断是指当使用对限制性位点具特异性的酶时仅在所需位置切断病毒，通常是一个位置，但偶尔可能是一对位置。如本文所用的一对位置是指彼此接近的两个限制性位点，其被设计以通过相同(即不能彼此区分)的酶切断。
在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段是SEQ ID NO:55。
在一个实施方案中，BX具有SEQ ID NO:12的28166bp至28366bp的序列。
在一个实施方案中，BX是键。
如本文所用的BB是指编码L5区的DNA序列。如本文所用，L5区是指在上下文中适当时含有编码纤维多肽/蛋白的基因的DNA序列。所述纤维基因/区域编码作为腺病毒的主要衣壳组分的纤维蛋白。所述纤维在受体识别中起作用并且促进腺病毒选择性结合并感染细胞的能力。
在本公开的病毒中，所述纤维可能来自任何腺病毒血清型并且已知由于将纤维改变为另一种血清型之一而嵌合的腺病毒。在一个实施方案中，所述纤维是来自B群病毒，特别是Ad11，例如Ad11p。在一个实施方案中，BB具有SEQ ID NO:12的28367bp至29344bp的序列。
如本文所用的与BY有关的DNA序列是指在BB的L5基因的3'端附近的DNA序列。如本文所用的在L5基因的3'端附近或近侧是指：与L5基因的3'端或与其固有地相关的非编码区域相邻(邻接)，即与L5基因的3'主要端或与其固有地相关的非编码区域紧靠或邻接(即L5内源非编码序列的全部或部分)。可选地，附近或近侧可能是指接近L5基因，以使得BY区与L5基因的3'端之间不存在编码序列。
因此，在一个实施方案中，BY直接接合至代表编码序列的“末端”的L5的碱基。
因此，在一个实施方案中，BY直接接合至代表非编码序列的“末端”的L5的碱基，或直接接合至与L5天然相关的非编码区域。
固有地和天然地在本文可互换使用。在一个实施方案中，BY包含SEQ ID NO:11的序列。这个序列是非编码序列，其中可插入例如包含转基因(或转基因盒)、限制性位点或其组合的DNA序列。这个序列是有利的，因为其充当缓冲物的原因在于允许在转基因的确切位置上的一些灵活性，同时最小化对病毒稳定性和活力的破坏性作用。
一个或多个插入片段可能出现在SEQ ID NO:11内距5'端、3'端的任何地方或在bp1至35之间的任何点，例如碱基对1/2、2/3、3/4、4/5、5/6、6/7、7/8、8/9、9/10、10/11、11/12、12/13、13/14、14/15、15/16、16/17、17/18、18/19、19/20、20/21、21/22、22/23、23/24、24/25、25/26、26/27、27/28、28/29、29/30、30/31、31/32、32/33、33/34或34/35之间。
在一个实施方案中，BY包含SEQ ID NO:11，其具有插入位置bp 12与13之间或对应于SEQ ID NO:12中的29356bp和29357bp的地方的DNA序列。在一个实施方案中，所述插入片段是限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段包含一个或两个限制性位点。在一个实施方案中，所述限制性位点是包含2个限制性位点的19bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段是包含1个限制性位点的19bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段包含一个或两个限制性位点和至少一种转基因，例如一种或两种或三种转基因，例如一种或两种转基因。在一个实施方案中，所述限制性位点是包含2个限制性位点和至少一种转基因、例如一种或两种转基因的19bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段是包含1个限制性位点和至少一种转基因、例如一种或两种转基因的9bp限制性位点插入片段。在一个实施方案中，两个限制性位点夹着一个或多个、例如两个转基因(例如在转基因盒中)。在一个实施方案中，当BY包含两个限制性位点时，所述限制性位点彼此不同。在一个实施方案中，BY中的所述一个或多个限制性位点非天然存在于(例如独特的)已经将其插入的特定腺病毒基因组中。在一个实施方案中，BY中的所述一个或多个限制性位点不同于位于腺病毒基因组中其他地方的其他限制性位点，例如不同于天然存在的限制性位点或引入基因组的其他部分(例如BX)中的限制性位点。因此，在一个实施方案中，所述一个或多个限制性位点允许特异性切断区段中的DNA。
在一个实施方案中，所述限制性位点插入片段是SEQ ID NO:54。
在一个实施方案中，BY具有SEQ ID NO:12的29345bp至29379bp的序列。
在一个实施方案中，BY是键。
在一个实施方案中，所述插入片段是在SEQ ID NO:11中的bp 12之后。
在一个实施方案中，所述插入片段是在SEQ ID NO:12的大约位置29356bp处。
在一个实施方案中，所述插入片段是包含一种或多种转基因、例如1、2或3种、例如1或2种转基因的转基因盒。
如本文所用的E4是指编码部分或全部的腺病毒E4区(即多肽/蛋白区)的DNA序列，其可突变以使得由E4基因编码的蛋白具有保守性或非保守性氨基酸变化，并且适当时具有：与野生型(相应的非突变蛋白)相同的功能；相比于野生型蛋白增加的功能；相比于野生型蛋白降低的功能、例如无功能；或相比于野生型蛋白具有新的功能或其组合。
在一个实施方案中，所述E4区是部分缺失的，例如95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％缺失。在一个实施方案中，所述E4区具有SEQ ID NO:12的32188bp至29380bp的序列。
在一个实施方案中，B3是键，即其中E4不存在。
在一个实施方案中，B3具有由SEQ ID NO:12的32188bp至29380bp组成的序列。
如本文所用，数值范围包括端点。
本领域技术人员应理解，本文式、例如式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)中的元件是邻接的并且可实施非编码DNA序列以及本文提及的基因和编码DNA序列(结构特征)。在一个或多个实施方案中，本公开的式试图描述腺病毒基因组中的天然存在序列。在上下文中，本领域技术人员将显而易见的是，所述式是指以基因组的相关区段为特征的主要元件而不旨在是DNA的基因组伸展的详尽描述。
如本文所用的E1A、E1B、E3和E4各自独立地是指如本文所述的野生型和其等效物、每个区域的突变或部分缺失形式，特别是来自已知腺病毒的野生型序列。
如本文所用的“插入片段”是指并入5'端、3'端或给定DNA序列参考区段内以使得其间断参考序列的DNA序列。后者是用作相对于插入片段位置的参考点的参考序列。在本公开的上下文中，插入片段通常出现在SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11内。插入片段可以是限制性位点插入片段、转基因盒或二者。当序列被间断时，病毒仍将包含原始序列，但通常其将作为夹着插入片段的两个片段。
在一个实施方案中，所述转基因或转基因盒不包含无偏向插入转座子，例如TN7转座子或其一部分。如本文所用的Tn7转座子是指如WO2008/080003中所述的无偏向插入转座子。
限制性位点
本文公开位置中(例如BX和/或BY中)的限制性位点可用于本公开的病毒和构建体、例如质粒中，因为它们允许快速地和例如选择性地(当转基因周围的限制性位点是独特时)改变转基因。
如本文所用的独特是指在整个病毒或构建体中仅出现一次。
在一个实施方案中，所述转基因或转基因盒包含在每个末端的限制性位点，从而允许盒被置换。
限制性位点是DNA序列中可以被限制性酶、通常是对序列具特异性的酶切断的位置。在一个实施方案中，所述限制性位点包含3至22个碱基对，例如4至22个、例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个碱基对。被限制性酶切断的限制性位点的实例包括(但不限于)：
·被NotI和CciNI切断的序列GCGGCCGC，留下5'–GGCC悬垂物
·被FseI和RigI切断的序列GGCCGGCC，留下3'–CCGG悬垂物
·被AsiSI、RgaI、SgfI和SfaAI切断的序列GCGATCGC，留下3'–AT悬垂物
·被SbfI、SdaI和Sse83871切断的序列CCTGCAGG，留下3'–TGCA悬垂物
·被BclI、FbaI、Ksp221和BsiQ1切断的序列TGATCA，留下5'–GATC悬垂物
·被I-Cre1切断的序列CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG[SEQ ID NO:74]，留下3'–GTGA悬垂物
·被I-CeuI切断的序列TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA[SEQ ID NO:75]，留下3'CTAA悬垂物
·被I-Sce1切断的序列TAGGGATAACAGGGTAAT[SEQ ID NO:76]，留下3'ATAA悬垂物
·被SrfI切断的序列GCCCGGGC，留下钝端
·被MssI、PmeI切断的序列GTTTAAAC，留下钝端
·被SwaI、SmiI切断的序列ATTTAAAT，留下钝端
·被AscI、PalA1和SgsI切断的序列GGCGCGCC，留下5'CGCG悬垂物
切断相同识别位点的其他限制性酶也可能是合适的。
在一个实施方案中，BX和BY中的一个或多个限制性位点独立地选自对本文所述的酶例如NotI、FseI、AsiSI、SgfI和SbfI具特异性的限制性位点，特别地所插入的限制性位点都是不同的，例如对NotI具特异性的位点和对位于BX中的FseI和位于BY中的SgfI和SbfI具特异性的位点。
如上文所讨论，在一个实施方案中，区域BX和/或BY不包含限制性位点。有利的是，本公开的病毒和构建体可在无限制性位点下，例如使用合成技术来制备。这些技术在病毒和构建体的产生中允许很大的灵活性。此外，本发明人已经确定，当所述病毒和构建体通过合成技术制备时，其特性不会降低。
启动子
如本文所用的启动子是指起始一种或多种特定基因的转录的DNA区域。启动子通常位于它们转录的基因的近侧，在相同链上和在DNA的上游(即5')。如上下文中所用的近侧是指足够接近以充当启动子。在一个实施方案中，所述启动子在转录起始位点的100bp内。因此，如本文所用的内源启动子是指在插入转基因的腺病毒(或构建体)中天然存在(即天然)的启动子。在一个或多个实施方案中，所用的内源启动子是病毒中在其病毒基因组的原始位置中的天然存在启动子，特别地这是在一种或多种转基因的表达中使用的主要或唯一的启动子。在一个实施方案中，用于促进转基因的翻译和任选地转录的内源启动子是一种常驻物，即是整合到腺病毒的基因组中并且不是先前通过重组技术引入者。
如本文所用的在内源启动子的控制下是指其中在适当方向中插入转基因/转基因盒是在所述内源启动子的控制下。也就是说，其中启动子通常在反义链上，盒例如在反义方向上插入。
据称，基因可以在两个方向之一中表达。然而，对于给定(特定)转基因，通常一个方向相比于另一个方向提供增加水平的表达。
在一个实施方案中，所述盒在正义方向上。也就是说，在5'至3'方向上转录。在一个实施方案中，所述盒在反义方向上。也就是说，在3'至5'方向上转录。
病毒中的内源启动子可以例如通过使用编码转基因和剪接受体序列的基因来利用。因此，在一个实施方案中，当在内源启动子的控制下时，所述盒将包含剪接受体序列。因此，在一个实施方案中，编码序列、例如编码抗体或抗体结合片段的序列还包含剪接受体序列。
在一个实施方案中，所述转基因、多种转基因或转基因盒在E4启动子或主要晚期启动子、例如主要晚期启动子(ML启动子)的控制下。
如本文所用的在……的控制下是指当指定特定启动子时，转基因被激活，即转录。
如本文所用的主要晚期启动子(ML启动子或MLP)是指控制“晚期表达”基因、例如L5基因的表达的腺病毒启动子。所述MLP是“正义链”启动子。也就是说，所述启动子影响在5'-3'方向上的启动子下游的基因。如本文所用的主要晚期启动子是指位于病毒基因组中的原始主要晚期启动子。
如本文所用的E4启动子是指E4区的腺病毒启动子。所述E4区是反义区；因此所述启动子是反义启动子。也就是说，所述启动子在3'-5'方向上在E4区上游。因此，在E4启动子控制下的任何转基因盒可能需要适当定向。在一个实施方案中，在E4启动子控制下的所述盒在反义定向上。在一个实施方案中，所述盒在正义定向上在E4启动子的控制下。如本文所用的E4启动子是指位于病毒基因组中的原始E4启动子。
因此，在一个实施方案中，提供具有复制能力的溶瘤腺病毒血清11型(例如Ad11p)或其病毒衍生物，其中纤维、六邻体和衣壳是血清11型(例如Ad11p)，其中所述病毒基因组包含编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列，其中所述DNA序列在选自由E4和主要晚期启动子(即E4启动子或主要晚期启动子)组成的腺病毒内源启动子的控制下，以使得所述转基因不干扰病毒复制，例如与L5区(及在所述区域之前或之后)相关，例如位于病毒基因组中的L5之后，例如如SEQ ID NO:1至9、46、48至53、56至63、66-69和72-73中所示。
在一个实施方案中，通过重组技术将内源启动子引入病毒基因组中的所需位置处，例如引入转基因盒中。然而，在本说明书的上下文中，这种布置通常将被称为外源启动子。
在一个实施方案中，所述转基因盒包含外源启动子。如本文所用的外源启动子是指在被插入转基因的腺病毒中非天然存在的启动子。通常，外源启动子是来自其他病毒或者是哺乳动物启动子。如本文所用的外源启动子是指通常位于所关注基因上游的DNA元件，其调节所述基团的转录。
在一个实施方案中，基因表达的调节子是外源启动子，例如CMV(巨细胞病毒启动子)、CBA(鸡β肌动蛋白启动子)或PGK(磷酸甘油酸酯激酶1启动子)，例如CMV启动子。
在一个实施方案中，所用的CMV外源启动子具有SEQ ID NO:13的核苷酸序列。在一个实施方案中，所用的PGK外源启动子具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列。在一个实施方案中，所用的CBA外源启动子具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
在一个实施方案中，提供具有复制能力的溶瘤腺病毒血清11型(例如Ad11p)或其病毒衍生物，其中纤维、六邻体和衣壳是血清11型(例如Ad11p)，其中所述病毒基因组包含位于所述病毒基因组的一部分中的编码治疗抗体或抗体结合片段的DNA序列，其在病毒复制周期中晚期表达并且使得所述转基因不干扰病毒复制，其中所述DNA序列在腺病毒外源启动子(例如CMV启动子)的控制下。在一个实施方案中，编码抗体或片段的DNA序列与如本文其他地方所述的L5区相关。
在一个实施方案中，所述外源启动子是抗原呈递细胞启动子。如本文所用的抗原呈递细胞启动子是指由抗原呈递细胞(例如树突状细胞或巨噬细胞)选择性表达的基因的启动子。这些基因包括(但不限于)：FLT-3、FLT-3配体、TLR、CD1a、CD1c、CD11b、CD11c、CD80、CD83、CD86、CD123、CD172a、CD205、CD207、CD209、CD273、CD281、CD283、CD286、CD289、CD287、CXCR4、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、TSLP受体、CD141、CD303、CADM1、CLEC9a、XCR1或CD304；抗原加工和呈递介体，例如CTIIA或GILT。因此，在一个实施方案中，所述外源启动子适合转基因在所述抗原呈递细胞中的选择性表达。
其他调节序列
如本文所用的“基因表达的调节子”(或调节子/调节元件)是指通常通过起始或增强转录或翻译而在基因表达中起作用的遗传特征，例如启动子、增强子或剪接受体序列。
如本文所用的“剪接受体序列”、“剪接受体”或“剪接位点”是指决定mRNA分子何时将由剪接体复合物的小核核糖核蛋白识别的调节序列。一旦组装，剪接体就催化mRNA分子的剪接受体位点与上游剪接供体位点之间的剪接，产生成熟的mRNA分子，其可以被翻译以产生单一多肽或蛋白。
不同尺寸的剪接受体序列可用于本发明中并且这些可以被描述为短剪接受体(小)、剪接受体(中)和分支剪接受体(大)。
如本文所用的SSA是指通常仅包含剪接位点的短剪接受体，例如4bp。如本文所用的SA是指通常包含短剪接受体和多聚嘧啶区的剪接受体，例如16bp。如本文所用的bSA是指通常包含短剪接受体、多聚嘧啶区和分支点的分支剪接受体，例如26bp。
在一个实施方案中，在本公开的构建体中使用的剪接受体以SEQ ID NO:16至18示出。在一个实施方案中，所述SSA具有SEQ ID NO:16的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述SA具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述bSA具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述剪接受体序列独立地选自包含以下的群组：TGCTAATCTTCCTTTCTCTC TTCAGG(SEQ ID NO:18)、CCTTTCTCTCTT CAGG(SEQ ID NO:17)和CAGG(SEQ IDNO:16)。
在一个实施方案中，所述剪接位点被包含CCACC的共有Kozak序列立即加工(即遵循5'至3'方向)。在一个实施方案中，所述剪接位点和所述Kozak序列散布有至多100或100以下的bp。在一个实施方案中，所述Kozak序列具有SEQ ID NO:45的核苷酸序列。
通常，当在内源或外源启动子(例如内源启动子)的控制下时，编码序列前面将紧接着Kozak序列。编码区的起始由起始密码子(AUG)指示，例如在序列(gcc)gccRccAUGg[SEQID NO:77]的上下文中，编码序列的起始由粗体形式的碱基指示。小写字母表示在这个位置的常见碱基(其仍然可以改变)并且大写字母表示高度保守的碱基，即‘AUGG’序列是恒定的或很少(如果有的话)改变；‘R’表示通常在这个位置通常观测到嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)并且括号中的序列(gcc)具有不确定的意义。因此，在一个实施方案中，将起始密码子AUG并入Kozak序列中。
如本文所用的内部核糖体进入DNA序列是指编码内部核糖体进入序列(IRES)的DNA序列。如本文所用的IRES是指允许起始信使RNA(mRNA)序列的翻译(包括开始于mRNA序列内的起始)的核苷酸序列。当盒编码多顺反子mRNA时，这是特别有用的。使用IRES产生多顺反子mRNA，其被翻译成多种单独的蛋白质或肽。在一个实施方案中，所述内部核糖体进入DNA序列具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列。在一个实施方案中，特定IRES在基因组中仅使用一次。这可能具有在基因组稳定性方面的益处。
如本文所用的“高自我剪切效率2A肽”或“2A肽”是指在翻译后有效剪切的肽。合适的2A肽包括P2A、F2A、E2A和T2A。本发明人已经注意到，一旦编码给定2A肽的特定DNA序列使用一次，则相同的特定DNA序列可能不会使用第二次。然而，可利用DNA密码的冗余性来产生DNA序列，其被翻译成相同的2A肽。当盒编码多顺反子mRNA时，使用2A肽是特别有用的。使用2A肽产生被翻译的单一多肽链，其在翻译后修饰以产生多个单独的蛋白质或肽。
在一个实施方案中，所用的编码P2A肽具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一个实施方案中，所用的编码F2A肽具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一个实施方案中，所用的编码E2A肽具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一个实施方案中，所用的编码T2A肽具有SEQID NO:28的氨基酸序列。
在一个实施方案中，由转基因编码的mRNA或每个mRNA包含多聚腺苷酸化信号序列，例如通常在mRNA序列末端，例如如SEQ ID NO:20中所示。因此一个实施方案，所述转基因或所述转基因盒包含至少一个编码多聚腺苷酸化信号序列的序列。
如本文所用的“多聚A”、“多聚腺苷酸化信号”或“多聚腺苷酸化序列”是指通常含有AATAAA位点的DNA序列，其一旦被转录就可以被剪切并多聚腺苷酸化新生mRNA分子的多蛋白复合物识别。
在一个实施方案中，所述多聚腺苷酸化序列具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述构建体不包括多聚腺苷酸化序列。在一个实施方案中，所述基因表达调节子是剪接受体序列。
在一个实施方案中，编码蛋白/多肽/肽、例如抗体或抗体片段的序列还包含多聚腺苷酸化信号。
转基因编码
在一个实施方案中，所述一种或多种转基因独立地编码蛋白质、肽、RNA分子，例如RNA分子。有利的是，所述转基因可以在细胞内递送并且可以随后转录并且适当时翻译。由转基因编码的遗传物质的实例包括例如抗体或其结合片段、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂、酶(例如能够将前药转化成活性剂)和RNAi分子。
如本文所用的肽是指具有2至50个残基、例如5至20个残基的氨基酸序列。如本文所用的多肽是指具有超过50个残基而不具有三级结构、特别是不具有二级和三级结构的氨基酸序列。蛋白质是指具有超过50个残基、具有二级和/或三级结构、特别是具有二级和三级结构的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述编码序列编码治疗性RNA、治疗性肽、治疗性多肽或治疗性蛋白(即是治疗性基因)。
如本文所用的治疗性基因是指编码可用于治疗、改善或预防疾病的实体的基因，例如所述基因表达治疗性蛋白、多肽、肽或RNA，其至少减缓、停止或逆转疾病、例如癌症的进展。
在一个实施方案中，当在细胞、例如癌细胞中转录或翻译时，由转基因编码的实体增加细胞的危险信号产生。如本文所用的“危险信号”是指由经历损伤、应激或非凋亡性死亡的细胞产生的多种分子，其例如通过刺激先天免疫系统的细胞直接应答以及用于增强适应性免疫系统的细胞活化来充当报警信号。
众所周知，肿瘤微环境经常变化，使得天然人类免疫应答下调。因此，重新启动来自肿瘤内的免疫反应的能力可能在癌症治疗中非常引人关注。
在一个实施方案中，编码的治疗性肽或蛋白被设计以分泌到细胞外环境中。在一个实施方案中，功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体被释放到细胞的外部微环境中，例如释放到培养上清液中，或体内：组织、间质、循环、血液和/或淋巴系统。
在一个实施方案中，由转基因编码的肽、多肽或蛋白包含信号序列。如本文所用的信号肽是指位于蛋白的N端的短13-36个残基的肽序列，其辅助所述蛋白进入分泌通路中以进行分泌或膜表达。在一个实施方案中，前导序列(信号肽)具有SEQ ID NO:21或22的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码的治疗性肽或蛋白、例如抗体被设计成以膜锚定形式在细胞的表面膜中表达，例如通过包括编码蛋白质中的跨膜结构域或用于连接脂质膜锚定的位点。
在一个实施方案中，功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体是从被腺病毒感染的细胞释放的，例如通过活性分泌或由于细胞裂解。因此，在一个实施方案中，所述腺病毒裂解细胞，从而释放出功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体。
在另一个实施方案中，编码的治疗性肽或蛋白、例如抗体被设计成保留在完整细胞内。
有利的是，由本公开的腺病毒表达的功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体可以在体内在组织中检测为mRNA(参见图16、图41C)和抗体蛋白(参见图17A、图35B)。此外，所表达的功能性RNA、肽或蛋白、例如抗体在ELISA中可以结合其配体(参见图17B)。更进一步地，功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体可在早期检测(在感染3天内，参见图18B)并且表达持续数周(参见图17和图18B)。
在一个实施方案中，本公开的腺病毒在感染约3天或更多天内、例如在约36、48、60或72小时或例如2、3、4、5或6天内表达功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体。
在一个实施方案中，本公开的腺病毒表达功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体持续数周，例如约1、2、3、4、5或6周，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42天。
有利的是，功能性RNA、肽或蛋白表达、例如抗体表达足够高以能够检测血液中的功能性RNA、肽、多肽或蛋白、例如抗体(参见图19、图35B)。
在一个实施方案中，由本公开的腺病毒表达的功能性RNA、肽或蛋白、例如抗体进入血流和/或淋巴系统。
在一个实施方案中，本公开的腺病毒是对癌细胞具有增强的治疗指数的溶瘤病毒。
在一个实施方案中，所述编码序列编码功能性RNA、例如治疗性RNA。
如本文所用的功能性RNA是指具有除了编码蛋白或肽之外的功能的RNA并且包括例如适合抑制或降低基因活性的RNA构建体，包括RNAi，例如shRNA和miRNA。如本文所用的shRNA是指短发夹RNA，它是制造可通过RNA干扰(RNAi)用于使靶基因表达沉默的紧密发夹弯的RNA序列。如本文所用的miRNA(微RNA)是指通过与mRNA分子内的互补序列进行碱基配对而起作用以在转录或转录后水平下调节基因表达的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)。通过miRNA结合的mRNA链是沉默的，因为他们可能不再通过核糖体翻译成蛋白质，并且这些复合物通常被细胞积极地拆解。
在一个实施方案中，所述转基因编码蛋白质。如本文所用的蛋白质包括蛋白质配体、蛋白质受体或抗体分子。
如本文所用的蛋白质配体是指细胞表面膜或其分泌蛋白结合片段，其例如通过刺激细胞内信号传导并调节细胞内的基因转录而结合于或以其他方式接合细胞受体以影响细胞功能。在一个实施方案中，所表达的蛋白质被工程改造以在细胞表面上表达和/或从细胞中分泌。
在一个实施方案中，所编码的蛋白是酶，例如辅助降解肿瘤的细胞外基质的酶，例如DNA酶、胶原酶、基质金属蛋白酶(例如MMP2或14)或类似物。
合适的抗体和抗体片段可能是激动性或拮抗性的，并且包括具有抗癌活性的那些和调节宿主细胞对癌症的反应的那些，例如：激动剂或拮抗性抗体或抗体片段可降低肿瘤的血管形成或正常化肿瘤的血管形成。在一个实施方案中，激动性抗体或其他编码蛋白可使得宿主细胞对宿主的先天性和适应性免疫反应更明显，例如通过表达抗原、危险信号、细胞因子或趋化因子将其吸引和激活，或通过结合于共刺激或检查点通路分子来增强适应性免疫反应。
如本文所用的治疗抗体或抗体结合片段是指当插入溶瘤病毒中时对患者中的病变、例如对所治疗的癌症具有有益影响的抗体或抗体结合片段。
如本文所用的有益影响是指在体内表达的抗体的所需和/或有利作用。
治疗抗体和抗体结合片段的种类包括：抗EGF抗体、抗VEGF抗体、抗PDGF抗体、抗CTLA抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体和抗FGF抗体。
适合并入本公开的病毒中的已注册治疗抗体包括：阿昔单抗、阿达木单抗、阿伦珠单抗、巴利昔单抗、贝利单抗、贝伐单抗、贝伦妥单抗-魏多汀(brentuximab vedotin)、卡那单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、地诺单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗、依匹木单抗、莫罗单抗-CD3、奥法木单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗和曲妥珠单抗。
在一个实施方案中，所用的抗体或抗体片段的抗体可变区序列与贝伐单抗(也称为
Figure BDA0003363702110000451
)的可变区具有95％至100％相似性或同一性，例如96％、97％、98％或99％相似性或同一性。
也适合并入本公开的病毒中的是批准用于癌症适应症的那些抗体和其结合片段的编码序列，例如曲妥珠单抗、托西莫单抗、利妥昔单抗、帕尼单抗、奥法木单抗、依匹木单抗、替伊莫单抗、吉妥珠单抗、地诺单抗、西妥昔单抗、贝伦妥单抗-魏多汀、安维汀和阿达木单抗。
在一个实施方案中，所用的抗体或抗体片段的抗体可变区序列与已知抗体或本文公开的抗体的可变区具有95％至100％相似性或同一性。
如本文所用，“抗体分子”包括抗体和其结合片段。
如本文所用的抗体通常是指全长抗体和包含其的双特异性或多特异性形式。
抗体结合片段包括与产生其的原始“抗体”具有相同、相似或更好特异性的能够靶向抗原的抗体片段。抗体片段包括：Fab、修饰Fab、Fab'、修饰Fab'、F(ab')2、Fv、单结构域抗体(例如VH或VL或VHH)、scFv、二价、三价或四价抗体、双scFv、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体和上述中的任一种的表位结合片段(参见例如Holliger和Hudson,2005,《自然生物技术(Nature Biotech.)》23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,《药物设计评论(网络版)(Drug Design Reviews-Online)》2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法是本领域中众所周知的(参见例如Verma等,1998,《免疫学方法杂志(Journal ofImmunological Methods)》,216,165-181)。用于本发明中的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中描述的Fab和Fab'片段。多价抗体可包含多特异性例如双特异性或者可能是单特异性的(参见例如WO 92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。
如本文所用的特异性旨在是指仅识别其特异性抗原的抗体或片段或者是指对特异性抗原的结合亲和力相比于其对非特异性抗原的结合亲和力显著更高、例如5、6、7、8、9、10倍更高结合亲和力的抗体或片段。
已知的抗体或抗体结合片段可以用于产生具有相同CDR或相同可变区的替代抗体形式，例如，全长抗体可以容易地转化成Fab、Fab'或scFv片段。
广泛范围的不同形式的抗体可用于本公开的构建体中，包括来自非人类动物的抗体分子、人类抗体分子、人源化抗体分子和嵌合抗体分子。
在一个实施方案中，所述抗体或结合片段是单克隆的。单克隆抗体可通过本领域中已知的任何方法制备，例如杂交瘤技术(Kohler和Milstein,1975,《自然(Nature)》,256:495-497)、三源杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,1983,《今日免疫学(Immunology Today)》,4:72)和EBV杂交瘤技术(Cole等,《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》,第77-96页,Alan R Liss,Inc.,1985)。
在一个实施方案中，所述抗体或结合片段是非人类的，即完全来自非人类来源。这是可能的，因为所述抗体和片段可以通过病毒在癌细胞内部递送。
在一个实施方案中，所述抗体是嵌合的，例如具有人类恒定区和非人类可变区。
在一个实施方案中，所述抗体或结合片段是人类的，即来自完全人类来源。
在一个实施方案中，所述抗体或结合片段是人源化的。人源化抗体(其包括CDR移植抗体)是具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的抗体分子(参见例如US 5,585,089；WO91/09967)。应理解，可能只需要转移CDR的特异性决定残基而非整个CDR(参见例如Kashmiri等,2005,《方法(Methods)》,36,25-34)。人源化抗体可能任选地进一步包含源自非人类物种、例如来自产生CDR者的一个或多个框架残基。
在一个实施方案中，所述编码序列编码抗体重链、抗体轻链或抗体片段。如本文所用的重链(HC)是指抗体的大的多肽亚基。如本文所用的轻链(LC)是指抗体的小的多肽亚基。在一个实施方案中，所述抗体轻链包含κ或λCL结构域。
用于本公开中的抗体可使用本领域中已知的任何合适的方法获得。抗原多肽/蛋白，包括融合蛋白，包括(重组地或天然地)表达多肽的细胞(例如激活T细胞)可用于产生特异性识别抗原的抗体。所述多肽可能是‘成熟’多肽或其生物活性片段或衍生物。
用于免疫化宿主动物的多肽可通过本领域中众所周知的方法从包含表达系统的遗传工程改造的宿主细胞制备或者它们可从天然生物来源回收。在本申请中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另外说明，否则这些可互换使用。所述抗原多肽在一些情况下可能是较大蛋白(例如融合蛋白，例如与亲和标签融合)的一部分。
通过使用众所周知和常规的方案，向动物、优选地非人类动物施用多肽，可获得针对抗原多肽产生的抗体，其中动物的免疫化是必要的，参见例如《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》,D.M.Weir(编),第4卷,BlackwellScientific Publishers,英国牛津,1986。许多温血动物、例如兔、小鼠、大鼠、绵羊、牛、骆驼或猪可被免疫化。然而，小鼠、兔、猪和大鼠通常是最合适的。
用于本发明中的抗体也可使用单淋巴细胞抗体方法产生，其通过例如由Babcook,J.等,1996,《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和国际专利申请号WO2004/106377描述的方法克隆和表达从关于特异性抗体的产生所选择的单淋巴细胞产生的免疫球蛋白可变区cDNA。
可以使用测量抗原结合的测定法和/或测量拮抗受体的能力的测定法来进行抗体筛选。结合测定法的实例是ELISA，特别是，使用融合蛋白(任选地包含报告基因)，其被固定在板上，以及使用结合二级抗体来检测结合至融合蛋白的抗抗原抗体。
本发明的抗体分子的恒定区结构域(如果存在的话)可关于所提出的抗体分子功能并且特别是可能需要的效应功能来选择。例如，恒定区结构域可能是人类IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别是，当抗体分子旨在用于治疗用途并且需要抗体效应功能时，可使用人类IgG恒定区结构域，特别是IgG1和IgG3同种型。可选地，当抗体分子旨在用于治疗目的并且不需要抗体效应功能时，例如对于简单地激动活性或对于靶标中和，可使用IgG2和IgG4同种型。应理解，也可使用这些恒定区结构域的序列变体。可使用例如IgG4分子，其中位置241的丝氨酸已经变成脯氨酸，如Angal等,《分子免疫学(Molecular Immunology)》,1993,30(1),105-108中所述。
对于某些抗体功能，例如为了向带有抗体靶标分子的细胞、例如免疫系统的细胞递送活化信号，使用抗体的膜锚定形式可能是有利的，以使得所述抗体将在表达细胞表面上表达。这些细胞表面表达的结合分子能够实现增强活化信号从靶标分子向受体细胞的递送的另一个细胞表面上的靶标信号传导分子之间的有效多聚相互作用。
有利的是，本公开的腺病毒可以表达抗体的全长和scFv形式。
在一个实施方案中，编码抗体或抗体片段的序列包含或进一步包含内部核糖体进入序列。如本文所用的内部核糖体进入序列(IRES)是指允许在信使RNA(mRNA)序列中间起始翻译的核苷酸序列。
在一个实施方案中，编码的治疗性蛋白或肽是靶标特异性蛋白、多肽或肽。
如本文所用的靶标特异性蛋白或肽是指靶标蛋白本身，或者直接结合(例如对靶标具特异性)或者以其他方式改变靶标蛋白或肽的水平的不同蛋白或肽。前者的实例将是细胞因子，而后者的实例将是针对所述细胞因子的抗体。
所关注的靶标通常涉及与疾病、特别是癌症相关的特定细胞、细胞产物、抗原或信号传导通路。取决于上下文，靶标也涉及从编码所述蛋白或多肽的基因转录的mRNA或类似物，其例如可以通过RNAi类型技术抑制。因此，在RNA、例如RNAi技术的上下文中，靶标是由靶标基因编码的mRNA。
所关注的靶标的实例包括(但不限于)刺激T细胞共受体和其配体、检查点抑制T细胞共受体分子和其配体、由调节T细胞表达的受体和其配体、骨髓源抑制细胞和免疫抑制免疫细胞、树突状细胞和抗原呈递细胞受体和其配体、抗原加工和呈递介体、细胞因子和细胞因子受体、趋化因子和趋化因子受体、转录因子和转录调节子、细胞内运输分子和细胞功能调节子、肿瘤细胞和肿瘤微环境受体和产物、细胞内肿瘤细胞酶例如IDO、用于被免疫细胞识别的抗原。
因此，在一个实施方案中，如本文所用的靶标是指适当时可以例如被例如抗体或其结合片段抑制、中和或激活的蛋白质或多肽。在细胞因子上下文中的靶标是指细胞因子本身或对细胞因子具特异性的抗体或其结合片段。因此，所述病毒可编码并表达细胞因子本身，因为其释放可能刺激“宿主”免疫反应。在配体的上下文中，配体的突变形式可以被与天然配体竞争以结合受体的病毒编码。所述突变配体可对受体具有增加的结合亲和力，例如使得其具有缓慢的解离速率，从而占据受体并且增加或降低其信号传导。可选地，突变配体的活性相比于野生型配体可能降低，从而通过来自天然配体的受体降低结合和总体活性。
在一个实施方案中，根据本公开的病毒或构建体编码前药、免疫调节剂和/或酶。
如本文所用的前药是指以非活性(或小于完全活性)衍生物形式施用的分子，其随后通常通过正常的代谢过程在体内转化成活性医药剂。前药充当预期药物的一类前体。前药转化酶充当将前药转化成其药学活性形式的酶。
如本文所用的免疫调节剂是指免疫反应的调节剂。免疫调节剂在将免疫反应调节至所需水平中起作用，如在免疫增强、免疫抑制或免疫耐受诱导中。
如本文所用的酶是指充当活生物体中的催化剂的物质，其调节化学反应进行的速率，其在过程中没有改变。
以下是示例性靶标肽/多肽和蛋白的非详尽讨论。
在一个实施方案中，靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT或CD160，例如CTLA-4、PD-1、PD-L1和PD-L2。在一个实施方案中，提供对其中一种对特异性的抗体或其结合片段。因此，在一个实施方案中，转基因或转基因盒编码对CTLA-4、PD-1、PD-L1或PD-L2具特异性的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，腺病毒表达对CTLA-4、PD-1、PD-L1或PD-L2具特异性的抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，所述抗体是检查点抑制剂抗体，例如抗PD-L1。在一个实施方案中，所述腺病毒表达全长抗人类PD-L1抗体。在一个实施方案中，全长抗人类PD-L1抗体的表达在内源启动子、例如主要晚期启动子(MLP)的控制下，特别是在位置BY中。在一个实施方案中，所述腺病毒表达抗人类PD-L1抗体的scFv形式。在一个实施方案中，抗人类PD-L1抗体的scFv形式的表达在内源启动子、例如主要晚期启动子的控制下，特别是在位置BY中。
在一个实施方案中，由本公开的病毒或构建编码的抗PD-L1抗体VH链的氨基酸序列是SEQ ID NO:30。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体恒定重链的氨基酸序列是SEQ ID NO:33或34。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体VL链的氨基酸序列是SEQ ID NO:32。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体恒定轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:35。在一个实施方案中，抗PD-L1scFv抗体片段的氨基酸序列是SEQ ID NO:37。
在一个实施方案中，提供根据本公开的病毒或构建体，其对于全长抗体编码抗体或其结合片段，或对CTLA-4具特异性的scFv，例如如本文所示例。
在一个实施方案中，靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：CD16、CD25、CD33、CD332、CD127、CD31、CD43、CD44、CD162、CD301a、CD301b和Galectin-3。在一个实施方案中，提供对其具特异性的抗体或其结合片段，例如全长抗体或scFv。
在一个实施方案中，例如可被抗体或结合片段靶向的靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：FLT-3、FLT-3配体、TLRs、TLR配体、CCR7、CD1a、CD1c、CD11b、CD11c、CD80、CD83、CD86、CD123、CD172a、CD205、CD207、CD209、CD273、CD281、CD283、CD286、CD289、CD287、CXCR4、GITR配体、IFN-α2、IL-12、IL-23、ILT1、ILT2、ILT3、ILT4、ILT5、ILT7、TSLP受体、CD141、CD303、CADM1、CLEC9a、XCR1和CD304。
某些TLR配体能够刺激免疫反应并且例如用作佐剂。在一个实施方案中，所述病毒编码并分泌TRL配体。
在一个实施方案中，所述靶标选自抗原加工剂和抗原呈递介体，例如CTIIA或GILT。
在一个实施方案中，例如可被抗体或结合片段靶向的靶标是癌症靶标。
在一个实施方案中，所述靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS或ICOS配体，例如CD40和CD40配体。
在一个实施方案中，所述转基因盒编码包含CD40的配体或CD40配体，或靶向CD40或CD40配体的抗体、抗体片段或shRNA。在一个实施方案中，所述腺病毒表达包含CD40的配体或CD40配体、或靶向CD40或CD40配体(具特异性)的抗体、抗体片段或shRNA。
在一个实施方案中，所述靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-33、IL-35、白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-25、IL-1RA、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TGFβ、淋巴毒素α(LTA)和GM-CSF。
在一个实施方案中，所述转基因盒编码对IL-12、IL-18、IL-22、IL-7、IL-15、IL-21、IFNα、IFNγ、TNFα、TGFβ或淋巴毒素α(LTA)具特异性的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述腺病毒表达IL-12、IL-18、IL-22、IL-7、IL-15、IL-21、IFNα、IFNγ、TNFα、TGFβ或淋巴毒素α(LTA)。
在一个实施方案中，IFNγ的氨基酸序列是SEQ ID NO:41。在一个实施方案中，IFNα的氨基酸序列是SEQ ID NO:42。在一个实施方案中，TNFα的氨基酸序列是SEQ ID NO:40。
在一个实施方案中，所述靶标是趋化因子，例如独立地选自包含以下的群组的一种或多种：IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR3、CXCR4、CXCR5和CRTH2。
在一个实施方案中，所述转基因盒编码对CCL5、CXCL9、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21、CXCR2、CCR2、CCR4或CXCR4具特异性的抗体或抗体片段。在趋化因子的上下文中，靶标包括其中病毒编码并表达趋化因子，例如以诱导或增强宿主对癌症的免疫反应。
在一个实施方案中，所述腺病毒表达对CCL5、CXCL9、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21、CXCR2、CCR2、CCR4或CXCR4具特异性的抗体或抗体片段。
在一个实施方案中，所述靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：STAT3、STAT1、STAT4、STAT6、CTIIA、MyD88和NFκB家族成员，例如所述蛋白被抑制剂靶向，例如抗体或其结合片段，或者从相关基因转录的mRNA受到一种机制抑制，例如RNAi。
在一个实施方案中，所述靶标是HSp70或细胞存活和死亡的调节剂，例如所述蛋白被抑制剂靶向，例如抗体或其结合片段，或者从相关基因转录的mRNA受到一种机制抑制，例如RNAi。
在一个实施方案中，所述靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种：双调蛋白、BTC、NRG1a、NRG1b、NRG3、TGFα、LRIG1、LRIG3、EGF、EGF-L6、Epigen、HB-EGF、EGFR、Her2、Her3和Her4，例如所述蛋白被抑制剂靶向，例如抗体或其结合片段，或者从相关基因转录的mRNA受到一种机制抑制，例如RNAi。
在一个实施方案中，所述靶标是独立地选自包含以下的群组的一种或多种的配体或受体：刺猬蛋白(hedgehog)、FGF、IGF、Wnt、VEGF、TNF、TGFβ、PDGF和Notch。
在一个实施方案中，所述腺病毒表达对VEGF具特异性的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体。例如，具有抗体贝伐单抗或其等效物的氨基酸序列的抗体。在一个实施方案中，所述腺病毒表达全长抗人类VEGF抗体。在一个实施方案中，全长抗人类VEGF抗体的表达在内源启动子、例如主要晚期启动子(MLP)的控制下，特别是在位置BY中。在一个实施方案中，所述腺病毒表达抗人类VEGF抗体的scFv形式。在一个实施方案中，抗人类VEGF抗体的scFv形式的表达在内源启动子、例如主要晚期启动子(MLP)的控制下，特别是在位置BY中。在一个实施方案中，抗VEGF抗体VH链的氨基酸序列是SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，抗VEGF抗体恒定重链的氨基酸序列是SEQ ID NO:33或34。在一个实施方案中，抗VEGF抗体VL链的氨基酸序列是SEQ ID NO:31。在一个实施方案中，抗VEGF抗体恒定轻链的氨基酸序列是SEQ ID NO:35。在一个实施方案中，抗VEGF scFv抗体片段的氨基酸序列是SEQ ID NO:36。
在一个实施方案中，所述靶标是IDO。
在一个实施方案中，所述靶标是被独立地选自包含以下的群组的一种或多种蛋白或肽的免疫细胞识别的抗原：来自传染性生物体的免疫原性蛋白，例如巨细胞病毒抗原、流感抗原、乙型肝炎表面和核心抗原、白喉类毒素、Crm197、破伤风类毒素；源自作为已知T细胞或抗体表位的这些抗原或这些抗原的遗传工程改造的组合物或多聚体的肽；作为抗原的肿瘤源蛋白；源自作为已知T细胞或抗体表位的这些抗原的肽；和这些抗原的遗传工程改造的组合物或多聚体，例如WT1、MUC1、LMP2、独特型、HPV E6和E7、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGEA3、p53非突变体、p53突变体、NY-ESO-1、GD2、PSMA、PCSA、PSA、gp100、CEA、MelanA/MART1、Ras突变体、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪氨酸酶、存活蛋白、PSA、hTERT，特别是WT1、MUC1、HER-2/neu、NY-ESO-1、存活蛋白或hTERT。
本领域技术人员应理解，由于密码子冗余性，编码给定氨基酸序列的核酸序列存在许多可能性，沉默的核酸碱基对突变是容许的并且本公开设想编码如任一种SEQ ID NO所定义的给定氨基酸序列的所有核酸序列。
在一个实施方案中，由转基因编码的肽、多肽或蛋白是模拟表位。如本文所用，模拟表位是分子，通常是肽，其模拟表位的结构。后者特性造成与由表位所引起者类似的抗体反应。给定表位抗原的抗体将识别模拟所述表位的模拟表位。模拟表位通常通过生物淘选获自噬菌体展示文库。利用模拟表位的疫苗正在开发中。因此，具有已知特异性的抗体可用于筛选文库(例如噬菌体展示中的肽文库，例如抗体序列文库或非抗体肽文库，特别是为产生具有更稳定3D构象的肽而优化的那些)，模拟表位的产生在本领域中得到充分描述(参见Tribbick G,Rodda S.Combinatorial methods for discovery of peptide ligandswhich bind to antibody-like molecules.《分子识别杂志(J Mol Recognit.)》2002 15(5):306-10；Masuko T,Ohno Y,Masuko K,Yagi H,Uejima S,Takechi M,HashimotoY.Towards therapeutic antibodies to membrane oncoproteins by a robuststrategy using rats immunized with transfectants expressing target moleculesfused to green fluorescent protein.《癌症科学(Cancer Sci.)》2011 102(1):25-35)。
在一个实施方案中，模拟表位或其他设计疫苗抗原被转基因编码并表达以在受体患者中诱导抗体反应，其中所诱导的抗体具有所需治疗作用。在一个实施方案中，使用具有来自所需人类配体的肽序列的GFP-肽融合蛋白来诱导抗自我靶标抗体反应，例如已知对与靶标分子PD-1结合重要的PD-L1的肽区域可与GFP或其他高免疫原性外来载体蛋白遗传连接，以使得对肽的免疫抗体反应包括与天然PDL1分子交叉反应的抗体并且因此以与直接编码抗PDL1抗体相同的方式用于阻断PD-L1:PD-1相互作用。关于疫苗诱导抗自我治疗抗体反应的概念在本领域中充分描述(参见Spohn G,Bachmann MF.Therapeutic vaccination toblock receptor-ligand interactions.《生物疗法专家评论(Expert Opin Biol Ther.)》2003 3(3):469-76；Link A,Bachmann MF.《免疫疗法(Immunotherapy)》2010 2(4):561-74；Delavallée L,Assier E,Semerano L,Bessis N,Boissier MC.Emergingapplications of anticytokine vaccines.《疫苗专家评论(Expert Rev Vaccines.)》20087(10):1507-17)
在一个或多个实施方案中，所用的转基因编码以SEQ ID NO:29至44、67和70-71中的任一种所示的序列。
有利的是，本公开的腺病毒表达由其中转基因编码的抗体形式和其他蛋白例如细胞因子并在体外将其释放到培养上清液中或在体内释放到肿瘤组织基质中(参见图4-8、11-12、16-19、28-29、33、35、38-40、42-43、47、49、51)。
前导序列可辅助编码蛋白/多肽或肽离开癌细胞。因此，在一个实施方案中，编码“蛋白”包含前导序列。如本文所用的前导序列是指位于启动子序列与可以在转录或翻译水平下调节基因表达的编码区域之间的多聚核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述编码序列编码肽。如本文所用的肽是指并非完整功能蛋白的氨基酸链。通常，片段保留蛋白质的一些或所有的功能，它是例如可被T细胞识别的具有8个或更多个氨基酸的肽的片段或者可以被免疫系统识别。
在一个实施方案中，所述转基因是编码例如成像剂的报告基因，所述成像剂包括生物发光、荧光成像剂(包括可活化荧光成像剂)，例如荧光素酶、GFP或eGFP或红色荧光蛋白。
如本文所用的报告基因或报告序列是指产生容易在真核细胞中检测的产物的基因或DNA序列并且可用作测定其DNA已经紧密连接或组合的另一个基因的活性的标志物。报告基因在容易鉴定和测量的表达其的细胞或生物体上赋予特性，或者是可选择标志物。报告基因通常用作特定基因是否已经被细胞或生物群体吸收或在其中表达的指示。常见报告基因的实例包括(但不限于)LacZ、荧光素酶、GFP、eGFP、新霉素磷酸转移酶、氯霉素乙酰转移酶、碘化钠同向转运蛋白(NIS)、硝基还原酶(例如NfsA、NfsB)细胞内金属蛋白、HSV1-tk或雌激素受体。
在一个实施方案中，遗传物质(特别是转基因)不编码或表达报告基因，例如成像剂、荧光素酶、GFP或eGFP。
在一个实施方案中，NIS的氨基酸序列是SEQ ID NO:67。
可以通过研究根据本公开的病毒在多种肿瘤细胞中的裂解潜力来研究其对于特定肿瘤类型的偏好，例如结肠肿瘤细胞系包括HT-29、DLD-1、LS174T、LS1034、SW403、HCT116、SW48和Colo320DM。任何可用的结肠肿瘤细胞系将同样可用于这种评估。
前列腺细胞系包括DU145和PC-3细胞。胰腺细胞系包括Panc-1细胞。乳房肿瘤细胞系包括MDA231细胞系并且卵巢细胞系包括OVCAR-3细胞系。造血细胞系包括(但不限于)Raji和Daudi B淋巴样细胞、K562成红血细胞样细胞、U937髓样细胞和HSB2 T淋巴样细胞。其他可用的肿瘤细胞系同样可用。
本公开还扩展至本文公开的新型序列。在一个实施方案中，所述病毒以本文公开的序列中的任一种示出，例如SEQ ID NO:1至9、SEQ ID NO:48-53、SEQ ID NO:56-63、SEQID NO:66、SEQ ID NO:68-69和SEQ ID NO:72-73。
制剂
本公开还扩展至如本文所述的病毒的药物制剂。
在一个实施方案中，提供一种液体肠胃外制剂，例如用于输注或注射根据本公开的能够复制的溶瘤病毒，其中所述制剂提供在每体积剂量1×1010至1×1014个病毒粒子范围内的剂量。
肠胃外制剂是指设计成不通过胃肠道递送的制剂。典型的肠胃外递送途径包括注射、植入或输注。在一个实施方案中，所述制剂以团块递送形式提供。
在一个实施方案中，所述肠胃外制剂呈注射剂形式。注射包括静脉内、皮下、肿瘤内或肌肉内注射。如本文所用的注射是指通过针筒将液体插入体内。在一个实施方案中，本公开的方法不涉及肿瘤内注射。
在一个实施方案中，所述肠胃外制剂呈输注形式。
如本文所用的输注是指通过滴注、输注泵、针筒驱动器或等效设备以较缓慢的速率施用流体。在一个实施方案中，输注在1.5分钟至120分钟范围内、例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、65、80、85、90、95、100、105、110或115分钟的时期内施用。
在一个实施方案中，制剂的一次剂量小于100ml，例如30ml，例如通过针筒驱动器施用。
在一个实施方案中，注射以缓慢注射形式，例如经1.5至30分钟的时期施用。
在一个实施方案中，所述制剂是供静脉内(i.v.)施用。这种途径对于递送溶瘤病毒特别有效，因为它允许快速进入大多数器官和组织并且特别可用于治疗转移，例如已确定转移，特别是位于高度血管化区域例如肝脏和肺中的那些。
治疗制剂在制造和储存条件下通常将是无菌和稳定的。组合物可以配制成适于施用至人类的溶液、微乳液、脂质体或其他肠胃外制剂并且可被配制成预填充装置例如针筒或小瓶，特别是作为单次剂量。
所述制剂通常将包含药学上可接受的稀释剂或载体，例如与病毒相容的无毒、等渗载体，并且其中所述病毒在必要的时段内是稳定的。
所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用分散剂或表面活性剂例如卵磷脂或者非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯80或40来维持适当流动性。在分散液中，可通过表面活性剂的存在辅助维持所需粒度。等渗剂的实例包括于组合物中的糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。
在一个实施方案中，所用的肠胃外制剂可包含以下中的一种或多种：缓冲液，例如4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、磷酸盐缓冲液和/或Tris缓冲液；糖，例如右旋糖、甘露糖、蔗糖或类似物；盐，例如氯化钠、氯化镁或氯化钾；洗涤剂，例如非离子型表面活性剂，例如briji、PS-80、PS-40或类似物。所述制剂还可包含防腐剂，例如EDTA或乙醇或EDTA和乙醇的组合，其被认为防止一种或多种可能的降解途径。
在一个实施方案中，所述制剂将包含根据本公开的纯化溶瘤病毒，例如每剂1×1010至1×1014个病毒粒子，例如每剂1×1010至1×1012个病毒粒子。在一个实施方案中，所述制剂中的病毒浓度在2×108至2×1014vp/mL范围内，例如2×1012vp/ml。
在一个实施方案中，所述肠胃外制剂包含甘油。
在一个实施方案中，所述制剂包含如本文所述的溶瘤腺病毒、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、甘油和缓冲液。
在一个实施方案中，所述肠胃外制剂由本公开的病毒、例如5mM的HEPES、例如5-20％(v/v)的甘油、盐酸(例如将pH调节至范围7-8)和注射用水组成。
在一个实施方案中，将0.7mL的浓度为2×1012vp/mL的本公开病毒配制在5mMHEPES、20％甘油中，最终pH为7.8。
药学上可接受的载体的充分讨论可提供于雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Company,N.J.1991)中。
在一个实施方案中，所述制剂以用于局部施用(包括吸入)的制剂形式提供。
合适的可吸入制剂包括可吸入粉末、含有推进剂气体的计量气雾剂或不含推进剂气体的可吸入溶液。根据本公开的可吸入粉末通常将含有如本文所述的病毒与生理学上可接受的赋形剂。
这些可吸入粉末可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些彼此的混合物。单糖或二糖适合使用，乳糖或葡萄糖的使用，特别地但不排他地呈其水合物形式。
用于沉积在肺中的粒子需要小于10微米、例如1-9微米、例如0.1至5μm、特别是1至5μm的粒度。带有病毒的粒度是最重要的，并且因此在一个实施方案中，根据本公开的病毒可吸附或吸收在粒子上，例如给定尺寸的乳糖粒子。
可用于制备可吸入气雾剂的推进剂气体是本领域中已知的。合适的推进剂气体选自烃，例如正丙烷、正丁烷或异丁烷；和卤代烃，例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推进剂气体可独立地或以其混合物形式使用。
特别合适的推进剂气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)和其混合物是特别合适的。
含有推进剂气体的可吸入气雾剂还可含有其他成分，例如共溶剂、稳定剂、表面活化剂(表面活性剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的装置。所有这些成分都是本领域中已知的。
根据本发明的含有推进剂气体的可吸入气雾剂可含有至多5重量％的活性物质。根据本发明的气雾剂含有例如0.002重量％至5重量％、0.01重量％至3重量％、0.015重量％至2重量％、0.1重量％至2重量％、0.5重量％至2重量％或0.5重量％至1重量％的活性成分。
可选地，向肺部的局部施用还可以通过施用液体溶液或悬浮液制剂来实现，例如使用例如喷雾器的装置，例如连接至压缩机的喷雾器(例如，连接至Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器，由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造)。
本发明的病毒可以分散在溶剂中、例如以溶液或悬浮液形式递送，例如如上文关于肠胃外制剂已经描述。其可以悬浮在适当的生理溶液中，例如，盐水或其他药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液。本领域中已知的缓冲溶液可在每1ml水中含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠以达到约4.0至5.0的pH。
治疗性悬浮液或溶液制剂也可含有一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域中众所周知的并且包括缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油。溶液或悬浮液可以封装在脂质体或可生物降解的微球中。所述制剂通常将使用无菌制造方法以基本上无菌形式提供。
这可包括通过本领域普通技术人员熟悉的方法，用于制剂的缓冲溶剂/溶液、抗体于无菌缓冲溶剂溶液中的无菌悬浮液的制备和通过过滤灭菌以及将所述制剂分配到无菌容器中。
根据本公开的可喷雾制剂可以包装在箔壳中的单剂量单位(例如，密封塑料容器或小瓶)形式提供。每个小瓶含有一定体积(例如，2mL)的溶剂/溶液缓冲液的单位剂量。
治疗
在另一个方面，本公开扩展至用于治疗、特别是用于治疗癌症的如本文所述的病毒或其制剂。
在一个实施方案中，所述治疗方法是用于治疗肿瘤。
如本文所用的肿瘤旨在是指由不受控制和进行性的过度细胞分裂产生的组织的异常肿块，也称为赘瘤。肿瘤可能是良性(非癌性)或恶性的。肿瘤涵盖所有形式的癌症和转移。
在一个实施方案中，肿瘤是实体肿瘤。所述实体肿瘤可能是局部化或转移的。
在一个实施方案中，所述肿瘤是上皮源的。
在一个实施方案中，所述肿瘤是恶性肿瘤，例如结肠直肠癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。
在一个实施方案中，所述肿瘤是结肠直肠恶性肿瘤。
如本文所用的恶性肿瘤是指癌细胞。
在一个实施方案中，所述溶瘤腺病毒被用于治疗或预防转移。
在一个实施方案中，本文中的方法或制剂被用于治疗耐药癌症。
在一个实施方案中，所述病毒与另一种癌症治疗或疗法的施用组合施用。
在一个实施方案中，提供根据本公开的病毒或制剂，其用于制造用于治疗癌症、例如上述癌症的药物。
在另一个方面，提供治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者、例如人类患者施用治疗有效量的根据本公开的病毒或制剂。
在一个实施方案中，本文中的溶瘤病毒或制剂与另一种疗法组合施用。
如本文所用的“组合”旨在涵盖在癌症治疗或疗法之前、同时和/或之后施用溶瘤病毒。
癌症疗法包括手术、放射疗法、靶向疗法和/或化学疗法。如本文所用的癌症治疗是指用治疗性化合物或生物剂、例如旨在治疗癌症的抗体和/或其维持疗法进行治疗。
在一个实施方案中，所述癌症治疗选自任何其他抗癌疗法，包括化学治疗剂、靶向抗癌剂、放射疗法、放射性同位素疗法或其任何组合。
在一个实施方案中，本公开的病毒(例如溶瘤腺病毒)可以疗法的预治疗、例如手术(新辅助疗法)形式使用以缩小肿瘤，治疗转移和/或预防转移或进一步转移。所述溶瘤腺病毒可在疗法、例如手术(辅助疗法)后使用以治疗转移和/或预防转移或进一步转移。
如本文所用的同时是与溶瘤腺病毒制剂同时或大致同时施用另外的癌症治疗。所述治疗可包含在同一制剂内或以另一种制剂形式施用。
在一个实施方案中，所述病毒与化学治疗剂的施用组合施用。
如本文所用的化学治疗剂旨在是指选择性破坏恶性细胞和组织的特异性抗肿瘤化学剂或药物。例如，烷基化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂和其他抗肿瘤剂。化学疗法的其他实例包括阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、太平洋紫杉醇、卡培他滨、伊立替康，和铂类例如顺铂和奥沙利铂。优选的剂量可由专业人员基于所治疗癌症的性质进行选择。
在一个实施方案中，所述治疗剂是更昔洛韦，其可辅助控制免疫反应和/或肿瘤血管形成。
在一个实施方案中，用于本文方法中的一种或多种疗法是节律性的，即用低剂量的抗癌药物进行连续或频繁治疗，通常伴随着其他治疗方法一起提供。
B亚群溶瘤腺病毒，特别是Ad11和源自其的那些，例如EnAd，可能与化学治疗剂是特别协同增效的，因为它们似乎具有在很大程度上独立于细胞凋亡的作用机制，通过主要坏死性机制杀死癌细胞。此外，在化学疗法期间发生的免疫抑制可能允许溶瘤病毒在更大效率下起作用。
如本文所用的治疗剂量是指当用于合适的治疗方案中时适合达到预期治疗作用、例如改善疾病的症状或病状的病毒、例如溶瘤腺病毒的量。当病毒粒子数目可能足以产生以下结果时，剂量可视为治疗癌症或转移的治疗剂量：减缓或停止肿瘤或转移性生长，或者发现肿瘤或转移的尺寸缩小，和/或患者的寿命得以延长。合适的治疗剂量通常是治疗作用与可耐受毒性之间的平衡，例如其中考虑到由疗法所实现的益处，副作用和毒性是可忍受的。
在一个实施方案中，根据本公开的病毒或治疗性构建体(包括包含其的制剂)是每周一次施用的，例如在第1周的第1、3、5天施用剂量，接着在每个下一周施用一次剂量。
在一个实施方案中，根据本公开的病毒或治疗性构建体(包括包含其的制剂)是每周两次或每周三次施用的，例如在第1周的第1、3和5天施用，并且在第2或3周也在其第1、3和5天施用。这种给药方案可在适当时重复多次。
在一个实施方案中，根据本公开的病毒或治疗性构建体(包括包含其的制剂)是每月一次施用的。
在一个实施方案中，本公开的病毒和构建体是通过重组技术制备的。本领域技术人员应理解，武装化腺病毒基因组可以通过其他技术手段制造，包括完全合成基因组或包含部分或所有的基因组的质粒。本领域技术人员应理解，在合成基因组的情况下，插入区域可能不包含限制性位点核苷酸，因为后者是使用克隆方法插入基因后的人工产物。
在一个实施方案中，武装化腺病毒基因组完全是例如根据SEQ ID NO:63合成制造的。
本文公开内容进一步扩展至式(I)或其子式的腺病毒，其是从插入转基因或转基因盒获得的或者可从插入转基因或转基因盒获得。
如本文所用的“是”是指包含。
在本说明书的上下文中，“包含”应理解为“包括”。
包含某些特征/要素的本发明实施方案也旨在扩展至由相关要素/特征“组成”或“基本上组成”的可选实施方案。
在技术上适当时，本发明的实施方案可组合。
技术参考文献例如专利和申请是以引用的方式并入本文中。本文中特定地且明确地叙述的任何实施方案可单独地或与一种或多种其他实施方案组合构成放弃权利声明的基础。
本发明仅在以下实施例中通过说明的方式进一步描述，所述实施例涉及附图。
序列
SEQ ID NO:1 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-77病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'分支剪接受体序列(bSA)、具有5'前导序列的ab重链序列、IRES、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:2 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-135病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'短剪接受体序列(SSA)、具有5'前导序列的ab重链序列、IRES、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:3 包含插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、SSA和具有5'前导序列的ab轻链序列。
SEQ ID NO:4 包含插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、SSA和具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:5 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-74病毒基因组序列。所述转基因盒含有bSA、具有5'前导序列的抗VEGF ScFv序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:6 包含具有插入BY区中的编码具有C端His6标签的抗VEGF ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-78病毒基因组序列。所述转基因盒含有bSA、具有5'前导序列的抗VEGF ScFv序列和3'6x组氨酸序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:7 包含具有插入BY区中的编码具有C端His6标签的抗VEGF ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-76病毒基因组序列。所述转基因盒含有CMV启动子、具有5'前导序列的抗VEGF ScFv序列和3'6x组氨酸序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:8 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-73病毒基因组序列。所述转基因盒含有CMV启动子、具有5'前导序列的抗VEGF ScFv序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:9 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-134病毒基因组序列。所述转基因盒含有CMV启动子、具有5'前导序列的ab重链序列、IRES、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:10 对应于并包括EnAd基因组的bp 28166-28366的BX DNA序列。
SEQ ID NO:11 对应于并包括EnAd基因组的bp 29345-29379的BY DNA序列。
SEQ ID NO:12 EnAd基因组。
SEQ ID NO:13 CMV外源启动子。
SEQ ID NO:14 PGK外源启动子。
SEQ ID NO:15 CBA外源启动子。
SEQ ID NO:16 短剪接受体(SSA)。空序列
SEQ ID NO:17 剪接受体(SA)。
SEQ ID NO:18 分支剪接受体(bSA)。
SEQ ID NO:19 内部核糖体进入序列(IRES)。
SEQ ID NO:20 多聚腺苷酸化序列。
SEQ ID NO:21 前导序列(HuVH)。
SEQ ID NO:22 前导序列(HG3)。
SEQ ID NO:23 组氨酸标签。
SEQ ID NO:24 V5标签。
SEQ ID NO:25 P2A肽。
SEQ ID NO:26 F2A肽。
SEQ ID NO:27 E2A肽。
SEQ ID NO:28 T2A肽。
SEQ ID NO:29 抗VEGF抗体VH链氨基酸序列。
SEQ ID NO:30 抗PD-L1抗体VH链氨基酸序列。
SEQ ID NO:31 抗VEGF抗体VL链氨基酸序列。
SEQ ID NO:32 抗PD-L1抗体VL链氨基酸序列。
SEQ ID NO:33 人类IgG1恒定重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:34 人类IgG1修饰恒定重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:35 人类κ恒定轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:36 抗VEGF ScFv氨基酸序列。
SEQ ID NO:37 抗PD-L1 ScFv氨基酸序列。
SEQ ID NO:38 绿色荧光蛋白氨基酸序列。
SEQ ID NO:39 荧光素酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:40 人类肿瘤坏死因子α(TNFα)氨基酸序列。
SEQ ID NO:41 人类干扰素γ(IFNγ)氨基酸序列。
SEQ ID NO:42 人类干扰素α(IFNα)氨基酸序列。
SEQ ID NO:43 人类癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)氨基酸序列。
SEQ ID NO:44 人类MUC-1氨基酸序列。
SEQ ID NO:45 Kozak序列。gccaccatg(空序列)
SEQ ID NO:46 包含具有插入BY区中的编码抗PD-L全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-177病毒基因组序列。所述转基因盒含有CMV启动子、具有5'前导序列的ab重链序列、IRES、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:47 对应于EnAd基因组的E2B区(bp 10355-5068)的DNA序列。
SEQ ID NO:48 包含具有插入BY区中的编码具有C端His6标签的抗VEGF ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-167病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'SSA、具有5'前导序列的抗VEGF ScFv序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:49 包含插入BY区中的编码细胞因子IFNγ的转基因盒的NG-95病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'CMV启动子、IFNγcDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:50 包含插入BY区中的编码细胞因子IFNα的转基因盒的NG-97病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'CMV启动子、IFNαcDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:51 包含具有插入BY区中的编码细胞因子IFNγ的转基因盒的EnAd基因组的NG-92病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'bSA、IFNγcDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:52 包含具有插入BY区中的编码细胞因子IFNα的转基因盒的EnAd基因组的NG-96病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'bSA、IFNαcDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:53 包含具有插入BY区中的编码细胞因子IFNα的转基因盒的EnAd基因组的NG-139病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'SSA、TNFαcDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:54 限制性位点插入片段(BY)。
SEQ ID NO:55 限制性位点插入片段(BX)。
SEQ ID NO:56 包含具有插入BY区中的编码肿瘤相关抗原NY-ESO-1的转基因盒的EnAd基因组的NG-220病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'PGK启动子、NY-ESO-1cDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:57 包含具有插入BY区中的编码肿瘤相关抗原NY-ESO-1的转基因盒的EnAd基因组的NG-217病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'CMV启动子、NY-ESO-1cDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:58 包含具有插入BY区中的编码抗CTLA-4全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-242病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、IRES、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:59 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-165病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、P2A肽序列、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:60 包含具有插入BY区中的编码抗PD-L1全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-190病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、P2A肽序列、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:61 包含具有插入BY区中的编码具有C端His6标签的抗PD-L1 ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-221病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'SSA、具有5'前导序列的抗PD-L1 ScFv序列和3'6x组氨酸序列，然后多聚(A)序列。
SEQ ID NO:62 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒的EnAd基因组的NG-258病毒基因组序列。所述转基因盒含有CMV启动子、具有5'前导序列的ab重链序列、P2A肽序列、具有5'前导序列的ab轻链序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:63 包含具有插入BX和BY区中的独特限制性位点的EnAd基因组的NG-185病毒基因组序列。
SEQ ID NO:64 包含细菌复制起点(p15A)、抗生素抗性基因(KanR)和具有插入BY区中的独特限制性位点的EnAd基因组序列的pNG-33(pColoAd2.4)DNA质粒。
SEQ ID NO:65 包含细菌复制起点(p15A)、抗生素抗性基因(KanR)和具有插入BX和BY区中的独特限制性位点的EnAd基因组序列的pNG-185(pColoAd2.6)DNA质粒。
SEQ ID NO:66 包含插入BY区中的编码GAPDH的shRNA的转基因盒的NG-sh01病毒基因组序列。所述转基因盒含有U6 RNA polIII启动子和编码shRNA的DNA。
SEQ ID NO:67 碘化钠同向转运蛋白(NIS)氨基酸序列。
SEQ ID NO:68 包含插入BY区中的编码碘化钠同向转运蛋白(NIS)的转基因盒的NG-280病毒基因组序列。所述转基因盒含有5'SSA、NIS cDNA序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:69 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF ScFv和抗PD-L1 ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-272病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列和3'6xHis标签的抗PD-L1 ScFv序列、P2A肽序列、具有5'前导序列和3'V5标签的抗VEGF ScFv序列和3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:70 抗CTLA-4VH链氨基酸序列。
SEQ ID NO:71 抗CTLA-4VL链氨基酸序列。
SEQ ID NO:72 包含具有插入BX区中的编码抗VEGF ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-257病毒基因组序列。所述转基因盒含有bSA、具有5'前导序列和3'6xHis标签的抗VEGF ScFv序列，然后是3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:73 包含具有插入BX区中的编码抗VEGF ScFv的转基因盒和插入BY区中的编码抗PD-L1 ScFv的第二转基因盒的EnAd基因组的NG-281病毒基因组序列。所述转基因盒含有bSA、具有5'前导序列和3'6xHis标签的抗VEGF ScFv序列，然后是3'多聚(A)序列。
SEQ ID NO:74 被酶I-Cre1识别和切断的限制性位点。
SEQ ID NO:75 被酶I-Ceu1识别和切断的限制性位点。
SEQ ID NO:76 被酶I-SceI识别和切断的限制性位点。
SEQ ID NO:78-90 示出引物。
实施例
用作命名构建体中的前缀的“p”指示所述构建体是质粒。
实施例1-6
使用下述方法，利用以SEQ ID NO:2、5、6、7和8所示的序列制备病毒。
细胞培养
在具有谷氨酰胺(Gibco：10109163)、5mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸(PAA：M11-003)和青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM中培养AD293细胞(Agilent#240085)。这种培养基被称为‘AD293培养基’。对于常规的细胞培养，培养基补充有10％FBS(Gibco：41965062)，而对于转染和感染，补充有2％FBS。
在转染之前24小时将1.2×106个AD293细胞/烧瓶接种到T-25烧瓶中以使得转染时的密度是约75％汇合。
病毒基因组转染
测量质粒pNG-135、pNG-73、pNG-74、pNG-75和pNG-76的质粒DNA浓度(表2)，然后在37℃下将7.0μg或每一种用限制性酶AscI线性化2小时。用50μl不含核酸酶的水稀释所消化的DNA并且然后通过苯酚/氯仿提取纯化。然后在-20℃下使提取的DNA在300μl>95％分子生物级乙醇和10μl 3M乙酸钠中沉淀16小时。通过在14000rpm下离心5分钟使沉淀的DNA形成细胞团块，并且在500μl 70％乙醇中洗涤，然后在14000rpm下再次离心5分钟。将清洁的DNA团块风干，再次悬浮在含有15μl脂转染胺转染试剂的500μl OptiMEM中并在室温下温育30分钟。然后将转染混合物逐滴添加至含有AD293细胞的T-25烧瓶中。在37℃、5％CO2下用转染混合物温育细胞2小时后，向所述细胞中添加4ml的细胞培养基(补充有2％FBS的具有谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM)并且将烧瓶在37℃、5％CO2下温育。
每天对于细胞监测细胞病变作用(CPE)的存在(图1A-E、图2A-J、图3A-G)。一旦观测到实质性CPE，就收集病毒并且在表2中记录收集时间点。
病毒收集和扩增
从烧瓶底部抽吸培养基中的细胞并且转移到15ml falcon管中。
通过在1500rpm下离心5分钟使细胞形成团块，并且收集上清液并储存(约4ml)。将细胞团块再次悬浮在1ml AD293培养基中并且使用三次冷冻-解冻循环收集病毒。为此，将细胞团块在液氮中冷冻，然后在37℃水浴中解冻，然后在1200rpm下离心10分钟并且收集含有病毒的上清液。使用收集的病毒再次感染AD293细胞以扩增病毒储备液。通过观测细胞单层中的显著CPE证实扩增期间的活病毒产生(图1F-G、图2K-R、图3H)。一旦观测到CPE，就通过三次冷冻-解冻循环从293细胞收集病毒。将AD293细胞中的扩增重复至多5次，直至产生在感染48小时内在细胞单层中产生显著CPE的病毒储备液(图1H-I、图2S-Z、图2@、图3I-M，表2)。
病毒纯化
一旦有效的病毒储备液得到扩增，就通过双氯化铯条带分离(double caesiumchloride banding)来纯化病毒以产生NG-135、NG-73、NG-74、NG-76和NG-78病毒储备液。通过测量260/280nm吸光度来滴定这些储备液(滴度记录在表2中)。
表2
Figure BDA0003363702110000701
Figure BDA0003363702110000711
实施例7 VEGF结合ELISA：
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估具有从感染含有基因SSA-Bev-PA的EnAd(NG-135)的细胞分泌的贝伐单抗的氨基酸序列的全长抗体的VEGF结合活性。
将AD293细胞以3.25e5个细胞/毫升的浓度接种并使其生长20小时。使所述细胞感染含有SSA-Bev-PA转基因盒的EnAd或含有SSA-GFP-PA(NG-107)转基因盒的对照病毒EnAd(对照)。转染后44小时，从感染细胞收集上清液并且通过离心澄清。
通过在4℃下在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中用人类VEGF-165(0.5μg/ml，R and DSystems，293-VE-050)涂布过夜来制备ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp 96孔微板)。在所有后续结合步骤之间用PBS 0.05％Tween 20洗涤板。将板在室温下在PBS 0.05％Tween 20中用3％BSA阻断1小时。
将澄清的感染上清液稀释到PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中(1:2、1:8、1:32、1:128、1:512、1:2048)。制备纯化贝伐单抗的连续稀释液(1000ng/ml–0.0128ng/ml)并且也将40ng/ml和0.2ng/ml的稀释贝伐单抗样品掺入对照感染上清液中。将所有样品添加至VEGF-165涂布板并在室温下温育1小时。然后在室温下应用检测抗体HRP结合的抗人类-Fc(Abcam，ab97225)持续1小时，然后利用HRP底物溶液3,3,5,5'-四甲基乙二胺(TMB，Thermo-Fisher)进行HRP检测。使用1M HCl终止反应并且在板读取器上在450nm下测量显色。对于EnAd和对照感染上清液绘制450nm下的吸光度(图4A)，证实在NG-135感染细胞上清液中分泌的抗VEGF抗体的特异性结合。绘制贝伐单抗标准曲线(图6)并且通过从标准曲线外推来测定结合至VEGF的分泌抗VEGF抗体或掺入贝伐单抗样品的浓度(图4B)。
实施例8：编码抗VEGF抗体或抗VEGF ScFv的EnAd病毒的产生
通过将转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的pEnAd2.4独特限制性位点(BY区)中，使用质粒pEnAd2.4(在本文中也称为pColoAd2.4 SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-135、pNG-73、pNG-74、pNG-76、pNG-78和pNG-167。用于产生质粒的方法提供于实施例31中。
所制备的病毒
pNG-135含有通过在转基因盒中包括抗VEGF VH链(SEQ ID NO:29)、抗体恒定重链(SEQ ID NO:33)、抗VEGF VL链(SEQ ID NO:31)和抗体恒定轻链(SEQ ID NO:35)而编码的编码抗VEGF抗体的转基因盒。pNG-73和pNG-74含有在外源启动子CMV(SEQ ID NO:13)或EnAd内源主要晚期启动子(MLP)的控制下编码抗VEGF ScFv(SEQ ID NO:36)的转基因盒。pNG-76、pNG-78和pNG-167含有在外源启动子CMV(SEQ ID NO:13)或EnAd内源MLP的控制下编码具有C端组氨酸肽标签(SEQ ID NO.23)的抗VEGF ScFv(SEQ ID NO:36)的转基因盒。质粒pNG-135、pNG-73、pNG-74、pNG-76、pNG-78和pNG-167中所插入的转基因盒的示意图示于图24中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生
通过用酶AscI限制性消化将质粒pNG-135、pNG-73、pNG-74、pNG-76和pNG-78线性化以产生病毒基因组NG-135(SEQ ID NO:2)、NG-73(SEQ ID NO:8)、NG-74(SEQ ID NO:5)、NG-76(SEQ ID NO:7)和NG-78(SEQ ID NO:6)。根据表3设置限制性消化反应并在37℃下进行2小时：
表3
试剂 体积(μl) 供应商
质粒DNA(约7μg) 约15
AscI 2.5 NEB R0558S
缓冲液4 5 NEB B7004S
不含核酸酶的水 27.5 Fisher Scientific(BPE 2484-100)
用50μl不含核酸酶的水稀释所消化的DNA并且然后通过苯酚/氯仿提取纯化。然后在-20℃下使提取的DNA在300μl>95％分子生物级乙醇和10μl 3M乙酸钠中沉淀16小时。通过在14000rpm下离心5分钟使沉淀的DNA形成细胞团块，并且在500μl 70％乙醇中洗涤，然后在14000rpm下再次离心5分钟。将清洁的DNA团块风干，再次悬浮在含有15μl脂转染胺转染试剂的500μl OptiMEM中并在室温下温育30分钟。然后将转染混合物逐滴添加至含有AD293细胞的T-25烧瓶中，生长至70％汇合。在37℃、5％CO2下用转染混合物温育细胞2小时后，向所述细胞中添加4ml的细胞培养基(补充有2％FBS的具有谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM)并且将烧瓶在37℃、5％CO2下温育。
每24小时监测转染的HEK293细胞并且每48-72小时补充额外的培养基。通过观测细胞单层中的显著细胞病变作用(CPE)来监测病毒产生(图1A-E、图2A-J和图3A-G)。一旦观测到广泛的CPE，就通过三次冷冻-解冻循环从293细胞收集病毒。使用所收集的病毒再次感染293细胞以扩增病毒储备液。通过观测细胞单层中的显著CPE证实扩增期间的活病毒产生(图1F-G、图2K-RH、图3H)。一旦观测到CPE，就通过三次冷冻-解冻循环从293细胞收集病毒。将AD293细胞中的扩增重复至多5次，直至产生在感染48小时内在细胞单层中产生显著CPE的病毒储备液(图1H-I、图2S-Z、图2@、图3I-M)。一旦有效的病毒储备液得到扩增，就通过双氯化铯条带分离来纯化病毒以产生NG-135、NG-73、NG-74、NG-76和NG-78病毒储备液。
实施例9结肠癌细胞系中的NG-135病毒活性相比于EnAd的表征
在结肠癌细胞系中比较NG-135或EnAd病毒复制(通过qPCR评估)、基因表达(通过RTqPCR评估)和抗VEGF抗体表达(通过VEGF结合ELISA评估)。NG-135(SEQ ID NO:2)是源自EnAd的病毒，其在EnAd晚期基因L5(纤维)之后含有抗VEGF抗体转基因盒。所插入盒的示意图示于图10A和图24中。在实施例8中详述NG-135病毒的产生。将HCT-116、DLD或HT-29结肠癌细胞系以7.5e5个细胞/孔(对于HCT-116和DLD细胞)或2.e6个细胞/孔(对于HT-29细胞)的细胞密度接种在6孔板中。将板在37℃、5％CO2下温育18小时，然后使细胞感染100或10个EnAd或NG-135病毒粒子/细胞(ppc)或者保持未感染。在感染后24、48或72小时进行测定法。
通过qPCR定量病毒DNA
将感染10ppc EnAd或NG-135持续72小时或保持未感染的HT-29和DLD细胞系用于通过qPCR进行的病毒DNA定量。收集细胞上清液并通过在1200rpm下离心5分钟来澄清。将细胞用PBS洗涤一次并通过在-20℃下在400μl/孔1X报告基因裂解缓冲液(Promega：E3971)中冷冻-解冻来裂解。使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒根据制造商的方案从3μl细胞裂解液或10μl上清液提取DNA。此外制备使用EnAd病毒粒子(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线并使用Sigma Genelute试剂盒提取。使用在表4中详述的反应混合物中的EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析每种提取样品或标准物。
表4
试剂 体积/孔(μl)
Taqman快速进展主混合物(Lifetech) 5
EnAd正向引物 0.08
EnAd反向引物 0.08
EnAd探针 0.02
NFW 2.82
样品 2
孔体积 10
根据表5中的程序进行qPCR：
表5
Figure BDA0003363702110000741
每个细胞的检测病毒基因组数目的定量证实HT-29和DLD细胞系中的NG-135或EnAd病毒复制类似(图11A)。在未感染细胞中不能检测到病毒基因组(数据未示出)。
通过RTqPCR分析病毒(六邻体)或抗VEGF抗体基因表达
将感染10ppc EnAd或NG-135持续72小时或保持未感染的HT-29和DLD细胞系用于通过RTqPCR进行的六邻体或抗VEGF抗体基因表达分析。从每个孔中移出上清液并用PBS洗涤细胞并且然后在含有β-巯基乙醇(1:100)的600μl/孔RLT缓冲液(QIAgen)中裂解。通过在13000rpm下离心3分钟来澄清细胞裂解液并且然后使用Allprep DNA/RNA/蛋白质提取试剂盒(QIAgen)根据制造商的方案将200μl的裂解液用于RNA的提取。测量从每个样品提取的RNA浓度并且使用用于qRT-PCR的SuperScript III First Strand Synthesis SuperMix(Life Technologies；11752-050)根据制造商的方案将800ng用于cDNA合成。使用在下文表6中详述的反应混合物中的EnAd六邻体特异性引物-探针组或抗VEGF抗体特异性引物-探针组将1μl的每种合成DNA样品用于通过qPCR进行的分析。
表6
试剂 体积/孔(μl)
Taqman快速进展主混合物(Lifetech) 5
正向引物 0.08
反向引物 0.08
探针 0.02
NFW 3.82
样品 1
孔体积 10
根据表5中的程序进行qPCR。通过qPCR检测的DNA拷贝数的定量证实病毒晚期基因六邻体在NG-135或EnAd感染的HT-29或DLD细胞中的表达类似(图11B)。然而，仅在感染含有抗VEGF抗体转基因盒的NG-135病毒的HT-29或DLD细胞中检测到抗VEGF抗体基因表达(图12)。
通过VEGF结合ELISA分析抗VEGF抗体表达
将感染100ppc EnAd或NG-135持续24、48或72小时或保持未感染的HT-29、DLD和HCT-116细胞系用于通过VEGF结合ELISA进行的抗体表达分析。
从每个孔中移出培养上清液并在1200rpm下离心5分钟以除去细胞碎片。将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp 96孔微板)涂布人类VEGF-165(0.5μg/ml，R and D Systems，293-VE-050)并根据实施例7中详述的方法阻断。将感染上清液稀释到PBS/3％BSA/0.05％Tween 20(1:2或1:4)中并且制备纯化的抗VEGF抗体的连续稀释液(1000ng/ml–0.0128ng/ml)。将所有样品添加至VEGF-165涂布板并根据实施例7中详述的方法测定。
通过从标准曲线外推来测定结合至VEGF的所分泌抗VEGF抗体的浓度。在HT-29、DLD和HCT细胞中的抗VEGF抗体表达随时间增加，直至72小时，此时在所测定的所有细胞系的上清液中检测到类似的抗体表达(图13)。
实施例10在结肠癌和肺癌细胞系中的抗VEGF抗体表达的定量
将HT-29结肠癌和A549肺癌细胞系以1e6个细胞/孔(对于HT-29)和5e5个细胞/孔(对于A549细胞)的密度接种在12孔板中。将板在37℃、5％CO2下温育24小时，然后使细胞感染100个EnAd或NG-135病毒粒子/细胞(ppc)或保持未感染。在感染后24、48或72小时进行测定法。
在每个时间点，从每个孔中移出培养上清液并且用400μl的细胞培养基更换。然后将板温育5分钟、1小时或3小时，然后从每个孔收集培养基并在1200rpm下离心5分钟以除去细胞碎片。在4℃下将ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp 96孔微板)涂布16小时，在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释小鼠单克隆抗人类IgG1 Fc抗体(2μg/ml，ab1927，Abcam)。将板在室温下在PBS 0.05％Tween 20中用3％BSA阻断1小时，然后用PBS 0.05％Tween 20洗涤。在所有后续结合步骤期间用PBS 0.05％Tween 20将板洗涤3次。
将澄清的感染上清液稀释到3％BSA/PBS 0.05％Tween 20中(1:2、1:8、1:32)。此外在PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中制备纯化贝伐单抗的连续稀释液(200ng/ml–0.1ng/ml)。向涂布板添加样品和标准物并在室温下温育1小时。然后在室温下应用检测抗体HRP结合的抗人类-IgG-Fab(0.5μg/ml Abcam ab87422)持续1小时，然后利用HRP底物溶液3,3,5,5'-四甲基乙二胺(TMB，Thermo-Fisher)进行HRP检测。使用1M HCl终止反应并且在板读取器上在450nm下测量显色。通过从标准曲线外推来测定在HT-29细胞(图28A)和A549细胞(图28B)中所分泌的抗VEGF抗体的浓度。将预测在24、48和72小时内被1e6个HT-29或A549细胞表达的总蛋白概述于图28C中。
实施例11抗VEGF ScFv在结肠癌细胞系中的表达
通过免疫印迹法比较HT29结肠癌细胞中的NG-76(SEQ ID NO:7)、NG-78(SEQ IDNO:6)和EnAd抗VEGF ScFv表达。NG-76和NG-78是在EnAd晚期基因L5(纤维)后含有抗VEGFScFv转基因盒的源自EnAd的病毒。所插入盒的示意图示于图10B和图10C中并且病毒产生描述于实施例8中。
将HT-29细胞以4e6个细胞/孔的密度接种在6孔培养板中并且在37℃、5％CO2下温育5小时。然后使所述细胞感染50个NG-76、NG-78或EnAd病毒粒子/细胞持续22、46或70小时。从孔中移出培养基并且用PBS洗涤细胞一次，然后在含有抗蛋白酶抑制剂混合液III(Calbiochem：539134)的250μl裂解缓冲液(150mM NaCl、1％Triton X-100、0.5％SDS、50mMTris-HCl(pH 7.5))中裂解。用benzonase处理裂解液以降解基因组DNA并且用含有NuPAGELDS样品缓冲液和NuPAGE还原剂(Life Technologies)的裂解缓冲液进一步1:4稀释。将样品在70℃下加热10分钟，然后使用4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Life Technologies)根据制造商的方案进行SDS-PAGE。使用Xcell II印迹模块(Life Technologies)通过免疫印迹法将蛋白质转移至PVDF膜上。在补充有5％奶粉的PBS 0.1％Tween-20中进行阻断和免疫印迹并且在PBS 0.1％Tween-20中进行所有洗涤步骤。使用在ScFv的C端的His标签的小鼠单克隆抗Ct-Hisx6抗体来检测抗VEGF ScFv并且使用兔抗小鼠IgG-HRP进行二级抗体检测。通过增强化学发光使蛋白质可视化。可在感染NG-76或NG-78的HT-29细胞裂解液中检测到ScFv表达，但在感染EnAd的细胞中未检测到(在图14A中分别标记为76、78和Ad1)。直至22小时，在感染NG-76病毒的细胞中相比于感染NG-78病毒的细胞中可较早检测到ScFv表达，在感染NG-76病毒的细胞中ScFv表达是在外源启动子的控制下，而在感染NG-78病毒的细胞中ScFv表达是在内源主要晚期启动子的控制下。
实施例12通过VEGF结合ELISA检测的抗VEGF ScFv表达
通过VEGF结合ELISA或免疫印迹法比较人类胚胎肾细胞系中的NG-76(SEQ ID NO:7)和EnAd的抗VEGF ScFv表达。将AD293细胞以5e5个细胞/孔的密度接种在6孔培养板中。在接种后24小时，使AD293细胞感染100个病毒粒子/细胞的NG-76或EnAd。将细胞培养72小时，然后从孔收集上清液并在1200rpm下离心5分钟以除去细胞碎片。然后将澄清的上清液用于VEGF结合ELISA或免疫印迹分析。对于ELISA，将上清液以3％BSA/PBS 0.05％Tween进行1:2稀释并且然后具有掺入其中的8ng/ml抗VEGF抗体或保持不具有抗体。ELISA板用VEGF涂布并根据实施例7中详述的方法阻断。将样品以100μl/孔的密度添加至板并测定。然后在室温下应用检测抗体HRP结合多克隆抗His(Abcam ab1187)持续1小时，然后利用HRP底物溶液3,3,5,5'-四甲基乙二胺(TMB，Thermo-Fisher)进行HRP检测。使用1M HCl终止反应并且在板读取器上在450nm下测量显色。对于EnAd、NG-76和NG-76+8ng/ml抗VEGF抗体感染上清液绘制450nm下的吸光度(图14B)。通过添加8ng/ml的纯化人类抗VEGF抗体贝伐单抗，利用VEGF结合的部分抑制来确定NG-76感染细胞上清液中的所表达ScFv对于VEGF的特异性。
对于免疫印迹法，根据实施例11中详述的方法制备上清液并进行测定。在感染后24小时，可在低水平下检测到ScFv表达，并且直到44小时的表达显著增加(图7)。
实施例13在带肿瘤小鼠中的NG-135病毒活性相比于EnAd的表征DLD或HCT-116结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中。一旦肿瘤达到约100mm3，就将小鼠分组并用通过单次肿瘤内注射递送的5e9个EnAd或NG-135病毒粒子处理。在每项研究中，还包括未感染的对照小鼠群组。在处理后第3、7或28天切除DLD肿瘤并且在处理后第3、7或14天切除HCT-116肿瘤。
通过qPCR分析病毒基因组复制
将切除的肿瘤称重并以每25mg肿瘤100μl缓冲液的浓度在含有1:200抗蛋白酶抑制剂混合液III(Calbiochem)的1X报告基因裂解缓冲液(Promega E3971)中匀浆化。使用未被处理的肿瘤匀浆来制备EnAd病毒标准曲线(2.5e10–2.5e5 vp/肿瘤裂解液样品)。使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒，根据制造商的方案，从2μl的每种所处理肿瘤样品或从100μl的每种标准物提取DNA。根据实施例8中详述的qPCR方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析所提取样品和标准物。在处理后第3天或第7天(图15A)或处理后第28天(图15B)，对于DLD肿瘤示出每个肿瘤的病毒基因组数目的定量。在利用EnAd或NG-135处理后第3天、第7天或第14天，对于HCT肿瘤示出每个肿瘤的病毒基因组数目的定量(图18A)。总的来说，数据显示在HCT或DLD肿瘤中的EnAd与NG-135病毒复制之间没有显著差异。
通过RTqPCR分析病毒(六邻体)或抗VEGF抗体基因表达
将切除的肿瘤称重并以每20mg肿瘤350μl缓冲液的浓度在含有β-巯基乙醇(Sigma)的RLT裂解缓冲液(QIAgen)中匀浆化。使用AllPrep DNA/RNA/蛋白质微型试剂盒(QIAgen)从肿瘤样品提取RNA并利用不含RNA酶的DNA酶组(QIAgen)根据制造商的方案进行处理。测量从每个样品提取的RNA浓度并且将800ng用于cDNA合成并根据实施例8中详述的RTqPCR方法进行qPCR。通过qPCR检测的RNA拷贝数的定量证实，在处理后第3天或第7天，在NG-135或EnAd处理的DLD细胞中的病毒晚期基因六邻体的表达类似(图16A)。相反，仅在用NG-135病毒处理的DLD细胞中检测到抗VEGF抗体基因表达(RNA)(图16B)。
通过抗人类IgG1或VEGF结合ELISA检测的抗VEGF抗体表达
此外将为qPCR制备的切除肿瘤裂解液(上述)用于通过抗人类IgG1ELISA(Abcam试剂盒)或VEGF结合ELISA进行的抗VEGF抗体表达分析。此外通过ELISA测定在肿瘤切除时获取的血液样品的血清的人类IgG1。
在测定之前，将来自处理小鼠和对照小鼠的肿瘤裂解液用含有2％Triton X-100的150μl 1X报告基因或裂解缓冲液(Promega)进行1:2稀释，短暂涡旋并在超声水浴中超声处理5分钟。将血液样品在5000rpm下离心5分钟，并且收集血清。制备纯化抗VEGF抗体贝伐单抗的连续稀释液(1000ng/ml–0.0128ng/ml)并掺入来自未处理小鼠的汇集对照小鼠裂解液或血清样品以产生测定标准曲线。
人类IgG1 ELISA(Abcam)
将超声处理的来自NG-135或EnAd处理肿瘤的裂解液用测定缓冲液进一步1:2稀释并且作为阳性对照，向EnAd处理的小鼠肿瘤裂解液样品中掺入8ng/ml纯化贝伐单抗。将血液样品1:2或1:5稀释到测定缓冲液中。然后使用Abcam ELISA试剂盒根据制造商的方案测定所有样品和标准物的抗人类IgG1。通过从标准曲线外推来确定肿瘤中的抗体浓度。在用NG-135处理的DLD肿瘤中可检测到人类IgG1抗体表达并且在处理后第28天测定(图17A)并且在来自NG-135处理小鼠的血清样品中在处理后第28天测定(图19)。此外在所有用NG-135处理的HCT-116肿瘤中检测抗体并在处理后第3、7或14天测定(图18B)。在来自用EnAd处理的小鼠的任何肿瘤或血液样品中不能检测到抗体表达。
VEGF结合ELISA
将超声处理的来自NG-135或EnAd处理肿瘤的裂解液用测定缓冲液进一步1:2稀释并且作为阳性对照，向EnAd处理的小鼠肿瘤裂解液样品中掺入1.6ng/ml纯化贝伐单抗。根据实施例7中详述的方法向ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp 96孔微板)涂布人类VEGF-165(0.5μg/ml)。将样品和标准物上清液添加至VEGF-165涂布板并根据实施例7中详述的方法测定。通过从标准曲线外推来确定肿瘤中的抗VEGF结合抗体浓度。在NG-135处理的DLD肿瘤样品中可检测到能够结合hVEGF-165的抗VEGF抗体，但在EnAd处理的样品中未检测到(图17B)。
实施例14编码报告基因的EnAd病毒的产生和表征
产生多种表达报告病毒的GFP或荧光素酶，其中转基因表达在外源病毒启动子CMV(NG-47、NG-61、外源哺乳动物启动子、PGK(NG-159))、内源病毒主要晚期启动子(NG-62、NG-63、NG-93、NG-98、NG-105、NG-106、NG-107、NG-108)或内源病毒早期启动子E4(NG-109、NG-110)的控制下。所有病毒都是使用克隆质粒pEnAd2.4(在申请号GB1322851.5中描述)从EnAd产生的并且具有插入EnAd晚期基因L5(纤维)之后的转基因盒。
病毒产生
通过将编码绿色荧光蛋白(GFP，SEQ ID NO:38)的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的pEnAd2.4独特限制性位点中，使用质粒pEnAd2.4产生质粒pNG-47、pNG-62、pNG-93、pNG-105、pNG-106、pNG-107、pNG-108、pNG-109、pNG-110和pNG-159。质粒pNG-47、pNG-62、pNG-93、pNG-105、pNG-106、pNG-107、pNG-108、pNG-109、pNG-110和pNG-159中所插入的转基因盒的示意图示于图22中。此外通过将编码发光蛋白荧光素酶(SEQ ID NO:39)的转基因盒直接插入pEnAd2.4独特限制性位点中，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)产生质粒pNG-61和pNG-63。质粒pNG-61和pNG-63中所插入的转基因盒的示意图示于图22中。通过DNA测序确定所有质粒。
根据实施例8中详述的‘病毒产生’方法将编码报告基因的质粒线性化并转染到HEK293细胞中以产生病毒粒子。通过双氯化铯条带分离来纯化扩增的病毒粒子以产生病毒储备液；NG-47、NG-62、NG-93、NG-105、NG-106、NG-107、NG-108、NG-109、NG-110、NG-61和NG-63。
病毒表征
比较结肠癌细胞系HT-29中的NG-47、NG-62、NG-93、NG-105、NG-106、NG-107、NG-108、NG-109、NG-110或EnAd病毒复制(通过qPCR测定)和GFP基因表达(通过荧光测定法评估)。将HT-29结肠癌细胞系以1e6个细胞/孔的细胞密度接种在12孔板中。将板在37℃、5％CO2下温育24小时，然后使细胞感染1个病毒粒子/细胞(ppc)的每种上述病毒或保持未被感染。在感染后24、48、72或96小时进行测定法。
通过qPCR定量病毒DNA
收集细胞上清液并通过在1200rpm下离心5分钟来澄清。将细胞用PBS洗涤一次并通过在-20℃下在400μl/孔1X报告基因裂解缓冲液(Promega：E3971)中冷冻-解冻来裂解。使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒根据制造商的方案从1μl细胞裂解液或10μl上清液提取DNA。此外制备使用EnAd病毒粒子(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线并使用Sigma Genelute试剂盒提取。根据实施例9中详述的qPCR方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR来分析每种提取样品或标准物。示出感染后24、48、72或96小时的每个细胞的病毒基因组数目的定量(图27A)。
通过荧光定量转基因表达
使用25μl的解冻纯裂解液或用1x报告基因裂解缓冲液(Promega:E971)1:2稀释的裂解液测定上文制备的细胞裂解液。在板读取器(BioTek Synergy HT)上测量每个孔中的GFP荧光水平。所测量的减去背景的感染24、48、72或96小时的样品的荧光绘制于图27B中。
实施例15在外源启动子CMV的控制下编码报告基因的EnAd病毒的表征
将报告病毒NG-47和NG-61的病毒复制(通过qPCR评估)、溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)和报告基因表达(通过荧光评估)与EnAd进行比较。在实施例14中详述病毒NG-47和NG-61的产生和设计。
病毒复制和转基因表达的表征
将HT-29结肠癌细胞、WI38成纤维细胞系或MRC5成纤维细胞系以2.e6个细胞/孔的细胞密度接种在6孔板中。将板在37℃、5％CO2下温育18小时，然后使细胞感染1个EnAd、NG-47或NG-61病毒粒子/细胞(ppc)。在感染后24、48、72或96小时进行测定法。收集细胞上清液并通过在1200rpm下离心5分钟来澄清。将细胞用PBS洗涤一次并通过在-20℃下在400μl/孔1X报告基因裂解缓冲液(Promega：E3971)中冷冻-解冻来裂解。使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒根据制造商的方案从细胞裂解液或上清液提取DNA。此外制备使用EnAd病毒粒子(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线并使用Sigma Genelute试剂盒提取。使用EnAd E3基因特异性引物-探针通过qPCR分析每种提取样品或标准物。
每个细胞的所检测病毒基因组数目定量证实，在HT29细胞中(图25A和图25B)与在HT29、WI38和MRC5细胞系中(图26C)，NG-47和NG-61复制与EnAd类似(在图25和图26中标记为EnAd)。此外使用上文制备的NG-47和EnAd细胞裂解液评估转基因表达。在板读取器(BioTek)上对纯裂解液或在1X报告基因裂解缓冲液中1:2稀释的裂解液测量相对GFP荧光(图25C)。
病毒溶瘤效能的比较
将HT-29结肠癌细胞以2.5e4个细胞/孔的细胞密度接种在96孔板中。将板在37℃、5％CO2下温育4小时，然后使细胞以100-0.39个粒子/细胞(ppc)的感染密度范围感染EnAd、NG-47或NG-61病毒粒子。在感染后72小时，使用Cell Titre 96 MTS试剂(Promega：G3581)评估HT-29细胞活力。在每种感染密度下的细胞存活％的定量证实，在HT29细胞中的NG-47和NG-61溶瘤效能与EnAd类似(图26A和图26B)。
实施例16：编码免疫检查点抑制剂通路蛋白的抗体的EnAd病毒的产生
通过将编码抗人类PD-L1抗体(YW243.55.S70)的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的pEnAd2.4独特限制性位点之间，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-177。所述pNG-177质粒编码抗PD-L1 VH链(SEQ ID NO:30)、抗体恒定重链(SEQ ID NO:34)、抗VEGF VL链(SEQ ID NO:32)和抗体恒定轻链(SEQ ID NO:35)。存在于NG-177病毒基因组(SEQ ID NO:46)中的所插入抗PD-L1抗体盒的示意图示于图24中。
实施例17：编码细胞因子的EnAd病毒的产生和表征
病毒产生
通过将编码人类干扰素-γ(IFNγSEQ ID NO:41；pNG-92和pNG-95)、人类干扰素-α(IFNαSEQ ID NO:42；pNG-96和pNG97)或人类肿瘤坏死因子α(hTNFαSEQ ID NO:40；pNG-139)的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的pEnAd2.4独特限制性位点(BY区)中，使用质粒pEnAd2.4来产生质粒pNG-92、pNG-95、pNG-96、pNG-97、pNG-139和pNG-136。质粒pNG-92、pNG-95、pNG-96、pNG-97和pNG-139中所插入的转基因盒的示意图示于图23中。通过DNA测序确定质粒的结构。
将质粒pNG-92、pNG-95和pNG-139线性化以产生NG-92(SEQ ID NO:51)、NG-95(SEQID NO:49)和NG-139(SEQ ID NO:53)基因组。根据实施例8中详述的‘病毒产生’方法将基因组转染到HEK293细胞中以产生病毒粒子。通过双氯化铯条带分离纯化扩增的病毒粒子以产生NG-92、NG-95和NG-139病毒储备液。通过EnAd衣壳蛋白六邻体的免疫染色证实在扩增期间产生活NG-139病毒粒子。使HT-29细胞感染病毒裂解液48小时，然后从细胞中除去培养基，将细胞固定在1:1MeOH:丙酮中并在室温下用抗腺病毒抗体(Abcam：ab7428)染色1小时。然后将细胞洗涤并且使用HRP结合的抗小鼠IgG(Abcam：ab6728)进行二级抗体检测。通过添加DAB持续25分钟底物使六邻体蛋白可视化。在整个细胞单层中可检测到六邻体染色(图29A和图29B)。
结肠癌细胞系和结肠癌皮下异种移植肿瘤模型中的TNFα产生的定量
将HT-29结肠癌细胞系以5e5个细胞/孔的密度接种在6孔板中。使细胞感染100个NG-139病毒粒子/细胞(ppc)或保持未被感染。在感染后24或36小时进行测定法。
在每个时间点，从每个孔中移出培养上清液并在1200rpm下离心5分钟以除去细胞碎片。将澄清的上清液稀释到测定缓冲液中并根据制造商的方案用于TNFαELISA中。通过从标准曲线外推来确定所分泌TNFα的浓度并示于图29C中。
DLD结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中。一旦肿瘤达到约100mm3，就将小鼠分组并在第0、3和6天用通过单次肿瘤内注射递送的5e9个EnAd或NG-139病毒粒子处理。在每项研究中，还包括未感染的对照小鼠群组。在处理后第15天切除DLD肿瘤并且根据制造商的方案通过ELISA测定TNFα产生。通过从标准曲线外推来确定肿瘤中检测的TNFα浓度并示于图29D中。
实施例18：结肠癌、卵巢癌和肺癌细胞系中的病毒复制和抗VEGF抗体表达
通过hIgG1 ELISA比较结肠癌(HT-29、HCT116、DLD)、肺癌(A549)或卵巢癌(SKOV3)细胞系中的NG-135(SEQ ID NO:2)和EnAd的病毒复制和抗VEGF抗体表达。
将细胞以5e5-1e6个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中。在接种后24小时，使细胞系以100个病毒粒子/细胞的密度感染NG-135或EnAd。使细胞培养24、48、72、96或120小时，然后从孔收集上清液并在1200rpm下离心5分钟以除去细胞碎片。使用一半的上清液来评估抗体产生并且使用另一半来评估病毒基因组。然后用1xPBS洗涤每个孔中的细胞并在1X报告基因裂解缓冲液(Promega)中裂解。将裂解液冷冻解冻并且然后评估病毒复制。
使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒，根据制造商的方案，从1-5μl细胞裂解液或10μl上清液提取DNA。此外制备使用EnAd病毒粒子(2.5e10-2.5e5vp)的标准曲线并使用Sigma Genelute试剂盒提取。根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析每种提取样品或标准物。在图33A中对于EnAd和NG-135绘制每种细胞系在所有时间点的最大复制。
通过在4℃下在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中用小鼠单克隆抗人类IgG1Fc抗体(ab1927 Abcam)涂布过夜来制备ELISA板(Nunc Immuno MaxiSorp 96孔微板)。在所有后续结合步骤之间用PBS 0.05％Tween 20洗涤板。将板在室温下在PBS 0.05％Tween 20中用3％BSA阻断1小时。
将澄清的感染上清液稀释到PBS 0.05％Tween 20中的3％BSA中(1:2、1:4、1:16)。制备纯化贝伐单抗的连续稀释液(1000ng/ml–0.0128ng/ml)并且稀释。此外将8ng/ml的贝伐单抗样品掺入对照感染上清液中。将所有样品添加至涂布板并在室温下温育1小时。然后在室温下应用检测抗体HRP结合的抗人类-Fab持续1小时，然后利用HRP底物溶液3,3,5,5'-四甲基乙二胺(TMB，Thermo-Fisher)进行HRP检测。使用1M HCl终止反应并且在板读取器上在450nm下测量显色。通过从贝伐单抗标准曲线外推来确定所分泌抗VEGF抗体的浓度(图33B)。
实施例19：从NG-135处理的肿瘤产生抗体的表征
HCT-116结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1nu/nu小鼠中。一旦肿瘤达到约100mm3，就将小鼠分组并用通过单次肿瘤内注射递送的5e9个EnAd或NG-135病毒粒子处理。在处理后10天，从一些动物切除肿瘤，称重并切成约100mg切片。将每个切片放置在12孔板中的过滤杯(Nunc)中并且然后在补充有10％FBS的DMEM培养基中离体培养7天。在切除后第0或7天对肿瘤切片和离体培养基测定病毒基因组复制或抗体表达。从其他动物获取血清以测量循环抗VEGF抗体。
通过qPCR分析病毒基因组复制
从过滤杯和周围的孔中移出培养基。对于qPCR，将培养基样品在Sigma GeneluteDNA提取试剂盒再悬浮缓冲液中1:200稀释并切除肿瘤或者将培养肿瘤切片以每25mg肿瘤100μl缓冲液的浓度在含有1:200抗蛋白酶抑制剂混合液的1x报告基因裂解缓冲液(Promega E3971)中匀浆化。制备EnAd标准物并且根据实施例13中详述的方法进行DNA提取和qPCR。在切除后第0天或第7天的每个肿瘤的病毒基因组数目定量证实，对于EnAd和NG-135，在第7天的总病毒基因组增加表明在离体培养期间的持续病毒基因组产生。NG-135的数据示于图35A中。
通过抗人类IgG1分析抗VEGF抗体表达
将为qPCR制备的匀浆化肿瘤样品或纯培养基样品用于通过抗人类IgG1 ELISA进行的抗体表达分析。将样品1:2稀释到3％BSA/PBS 0.05％Tween中并且然后根据实施例18中详述的方法进行IgG1 ELISA。在切除时(第0天)在HCT-116肿瘤中可检测到抗体，但在离体培养7天后，由肿瘤产生的可检测抗体量显著增加(图35B)。通过抗人类IgG1 ELISA测试在IT注射NG-135后第7或14天时从小鼠获取的血清显示在第14天可检测水平的抗体(图35C)。在来自已经用EnAd处理的小鼠的血清或离体培养样品中未能检测到抗体。
实施例20：在鼠类原位异种移植肺癌模型中的NG-135病毒活性的表征
将A549肺癌细胞经静脉内注射到CB17 SCID小鼠中并且使得在肺中形成肿瘤。在注射后8周，将小鼠分组并用通过静脉内施用递送的5e9个EnAd或NG-135病毒粒子处理，或者通过仅注射PBS而保持未处理。在处理后第3、11、18或25天从小鼠收集肺和肝脏(图36A)。在每个时间点，切除肺中的任何明显肿瘤结节并且将来自每个肺和剩余肺组织的汇集结节在液氮中快速冷冻。通过qPCR评估肺组织和肺肿瘤结节的A549肿瘤负担和病毒基因组。
通过qPCR分析病毒基因组复制或A549细胞负担
将切除的肺组织、肿瘤结节或肝组织在1x报告基因裂解缓冲液中匀浆化。
使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒根据制造商的方案从10-100μl匀浆化样品中提取DNA。为了评估病毒基因组复制，根据实施例13中详述的方法制备样品和标准曲线并分析。为了评估A549细胞负担，通过将A549细胞(2.25e6-3.6e3个细胞)掺入未处理的匀浆化肺组织中并且然后使用Sigma Genelute DNA提取试剂盒提取总DNA来制备标准曲线。使用人类前列腺素E受体(PTGER2)基因特异性引物-探针组和用于实施例9中所详述的EnAdqPCR的反应混合物和程序，通过qPCR分析所提取标准物和样品的A549细胞负担。在处理后第3天的A549肿瘤负担的定量显示在NG-135处理小鼠和PBS对照小鼠中的A549肿瘤负担类似。但在第25天，NG-135处理小鼠中的肿瘤负担显著低于PBS对照组(图36B)。单独的小鼠肺中的肿瘤负担程度与病毒复制相关(图36C)并且相比于不具有显微镜可见肿瘤结节的周围肺组织，病毒复制的这种选择性通过肿瘤结节中的可检测病毒粒子的约2log增加而进一步证实(图36D)。
实施例21：在鼠类原位异种移植卵巢癌模型中的NG-135和EnAd活性的比较
通过5e6个细胞/小鼠的腹膜内注射将稳定表达荧光素酶的SKOV-3卵巢癌细胞植入CB17-SCID小鼠中。在植入后22天，利用通过腹膜内注射递送的PBS(对照)或5e7个EnAd、NG-135或NG-78病毒粒子处理小鼠。在腹膜内注射32mg荧光素后，使用IVIS成像相机每周两次对小鼠成像。在不同时间点对于所关注的固定区域测定作为肿瘤负担量度的相对光单位(RLU)。数据显示，相比于PBS对照，这种模型中的EnAd、NG-135和NG-78病毒显著降低肿瘤负担(图37)。
实施例22：在来自生物反应器的病毒物质的成比例放大的产生和纯化后的NG-135病毒和所表达抗VEGF抗体的表征
将HEK293细胞解冻并且在摇瓶中扩增，然后在5L搅拌槽(玻璃容器)生物反应器中扩增至3L工作体积。将生物反应器控制器设置为参数为37℃，pH设定点为7.4，溶解氧(DO)为50，气流速率为100mL/min并且在100rpm下搅拌。在生物反应器系统平衡后，在5×105个细胞/毫升的活细胞密度下用HEK293细胞接种初始体积为1.5L的EX-CELL培养基并且然后扩增至3L的工作体积，并且一旦细胞已经扩增至适当密度，就在50ppc的MOI下用NG-135感染培养物。在感染后48小时，收集3L培养物并且通过先前关于EnAd病毒的GMP制造所确定的方法(下文概述)从其纯化病毒以使得所产生的NG-135病毒可与先前制造的EnAd病毒进行比较。除了纯化病毒之外，也从细胞培养基纯化由感染细胞产生的抗VEGF抗体以允许进行结构和功能分析以与贝伐单抗临床产物安维汀进行比较。
NG-135病毒纯化
从生物反应器收集物纯化NG-135病毒。用
Figure BDA0003363702110000881
处理所收集的物质以消化宿主细胞DNA并且然后浓缩并通过使用500kD中空纤维膜的切向流过滤(TFF)来进行缓冲液交换。在这个步骤下，收集在正常情况下将弃去的TFF渗透液并用于纯化抗VEGF抗体(参见下文)。浓缩的TFF保留含有NG-135病毒的物质，通过选择性捕捉纯化并且使用Sartobind阴离子交换色谱树脂洗脱NG-135病毒。然后将纯化的病毒缓冲液交换到50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、5％甘油缓冲液中，通过HPLC滴定，并储存在-80℃下。
NG-135病毒表征
将纯化的NG-135病毒批次(名称为NG-135-BR1)、溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)、病毒复制(通过qPCR评估)和抗体表达(通过ELISA评估)与EnAd或先前表征的NG-135参考物质进行比较。
为评估相比于EnAd的溶瘤效能，根据实施例15中详述的方法进行细胞活力测定法。纯化的NG-135-BR1显示与所制造的EnAd参考物质类似的效能(图38A)。
为评估病毒复制或抗体表达，将HT-29细胞以1e6个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中，使其粘附并且然后感染100ppc的EnAd、NG-135或NG-135-BR1。
对于qPCR，在感染后24、48或72小时，根据实施例18中详述的方法，从细胞裂解液和上清液收集DNA。根据实施例9中详述的方法，使用EnAd E3基因特异性引物-探针组，通过qPCR相对于EnAd标准物分析所提取的DNA样品。对于所测试的所有病毒，在整个感染时程中检测到的总病毒基因组是相同的(图38B)。
为评估抗VEGF抗体表达，将澄清的感染上清液稀释到PBS/3％BSA/0.05％Tween20中，然后根据实施例18中详述的方法通过ELISA相对于贝伐单抗标准曲线进行测定。通过从标准曲线外推来确定抗体浓度(图38C)。
抗VEGF抗体纯化
将所收集的含有抗VEGF单克隆抗体的TFF渗透液浓缩并且使用第二TFF步骤利用30kD中空纤维膜缓冲液交换到蛋白A透滤缓冲液(200mM Na2PO4，pH 7.0)中。在AKTA纯化器系统上利用1ml蛋白A柱通过蛋白A色谱法纯化所浓缩的抗体。使用Amicon Ultra 50kD浓缩器浓缩洗脱的抗体级分并使用PD10柱缓冲液交换到储存缓冲液(50mM Tris-HCl，5％甘油，pH 7.0)中。通过OD测定纯化抗体浓度为0.15mg/ml并且通过SDS-PAGE确定纯度。
纯化抗VEGF抗体的表征
通过遵循非还原或还原SDS-PAGE的免疫印迹法比较纯化抗VEGF抗体与临床安维汀的结构并且通过Biacore评估抗体对VEGF的亲和力。对于免疫印迹法，在NuPAGE LDS样品缓冲液中制备7.5μg/ml的安维汀或6μg/ml的纯化抗体产物。对于还原凝胶NuPAGE，还向每个样品中添加还原剂，然后将所有样品在70℃下加热10分钟。使用4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶根据制造商的方案进行SDS-PAGE。使用Xcell II Blot模块通过免疫印迹法将蛋白质转移到PVDF膜上。在补充有5％奶粉的PBS 0.1％Tween-20中进行阻断和免疫印迹。使用HRP结合的多克隆抗人类IgG(Promega，W4031)检测抗VEGF抗体。通过增强化学发光(ECL)使蛋白质可视化。从NG-135病毒产生方法产生的纯化抗VEGF抗体在非还原和还原印迹上显示类似的可检测蛋白质带为安维汀(图38D)。
对于纯化抗体物质相比于安维汀的VEGF结合亲和力的分析，使用已验证的VEGF结合Biacore测定法(通过BioOutsource,UK进行)测定所述物质。遵循确定的测定法方案的动力学分析(Biacore T200评估软件)证实，纯化的抗VEGF抗体样品能够在与安维汀参考标准物质类似的动力学和亲和力下结合VEGF165(图38E)。
实施例23：编码通过可自我剪切P2A肽连接的抗VEGF单克隆抗体链的EnAd病毒(NG-165)的产生和表征
通过将编码抗VEGF抗体的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的独特限制性位点中，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)产生质粒pNG-165(SEQ ID NO:59)。所述pNG-165转基因盒通过包括抗VEGF VH链序列(SEQ ID NO:29)、抗体恒定重链序列(SEQ ID NO:33)、高自我剪切效率P2A肽序列(SEQ ID NO:25)、抗VEGF VL链序列(SEQ ID NO:31)和抗体恒定轻链序列(SEQ ID NO:35)而编码抗VEGF抗体。所述抗体编码序列侧接5'短剪接受体序列(SEQ ID NO:16)和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:20)。所插入的转基因盒的示意图示于图34中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法来扩增和纯化病毒NG-165。
病毒表征
在结肠癌细胞中将NG-165溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)、病毒复制(通过qPCR评估)和抗VEGF抗体表达(通过ELISA评估)与EnAd或NG-135进行比较。为评估相比于EnAd的溶瘤效能，根据实施例15中详述的方法进行细胞活力测定法。NG-165病毒显示与所制造的EnAd参考物质类似的效能(图39A)。
为评估病毒复制或抗体表达，将HT-29细胞以1e6个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中，使其粘附并且然后感染100ppc的EnAd、NG-135或NG-165。对于qPCR，在感染后24、48或72小时根据实施例18中详述的方法从细胞裂解液和上清液收集DNA。根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析所提取的DNA样品。关于在整个感染时程中的NG-165所检测的总病毒基因组与EnAd参考病毒类似(图39B)。
为评估抗VEGF抗体表达，将感染后24、48或72小时澄清的感染上清液稀释到PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中，然后根据实施例18中详述的方法使用贝伐单抗标准曲线通过IgG1 ELISA测定。通过从标准曲线外推测定IgG1抗体的浓度并且指示NG-165相比于NG-135参考病毒表达类似水平的IgG1(图39C)。
实施例24：在内源或外源启动子的控制下编码抗VEGF ScFv的EnAd病毒的表征
对先前描述于实施例8和11中的NG-76和NG-78病毒进一步表征其在结肠癌细胞中的溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)和功能性抗VEGF ScFv蛋白的表达(通过VEGF结合ELISA评估)。为评估相比于EnAd的溶瘤效能，根据实施例15中详述的方法进行细胞活力测定法。NG-76和NG-78都显示与所制造的EnAd参考物质类似的溶瘤效能(图40A和图40B)。
对于NG-76，在外源(CMV)启动子下表达的抗VEGF scFv的结合活性描述于实施例12中。对于NG-78，通过直接VEGF结合ELISA或在其中包括贝伐单抗临床产物以竞争VEGF结合的ELISA中评估从内源病毒主要晚期启动子表达的抗VEGF scFv的结合活性。对于两种ELISA，使293F细胞感染50ppc NG-78病毒并培养70小时。从烧瓶中收集细胞和培养基并且通过在1000rpm下离心10分钟来分离上清液和细胞。收集上清液并且将剩余细胞团块再次悬浮在1ml细胞培养基中，然后进行3次冷冻-解冻循环以裂解细胞。在裂解后，通过第二离心步骤分离细胞碎片和培养基，并且从裂解液收集上清液。将上清液或裂解液1:2稀释在3％BSA/PBS0.05％tween中。对于直接结合ELISA，将样品进一步连续稀释至1:1024的最低稀释度。对于竞争ELISA，已向样品中添加浓度为0、0.05、0.5或5μg/ml的贝伐单抗。根据实施例7中详述的方法将ELISA板涂以VEGF，阻断并洗涤。将样品以100μl/孔的密度添加至板并温育1小时，使用HRP结合的多克隆抗His(Abcam ab1187)检测VEGF结合的ScFv，接着TMB检测。在板读取器上在450nm下读取吸光度并且对于样品与VEGF的直接结合(图40C)和在递增浓度的贝伐单抗存在下的直接结合(图40D)绘制减去背景的吸光度。如先前对于NG-76所证实，特异性结合VEGF165的功能性抗VEGF ScFv可以表达并从NG-78感染细胞分泌。
实施例25.在带肿瘤小鼠中NG-76病毒活性相比于EnAd的表征
DLD结肠癌细胞以皮下异种移植物形式植入CD1 nu/nu小鼠中。一旦肿瘤达到约100mm3，就将小鼠分组并用通过单次肿瘤内注射递送的5e9个EnAd或NG-76病毒粒子处理。在每项研究中，还包括未感染的对照小鼠群组。在处理后第7天切除DLD肿瘤并且评估病毒复制(通过qPCR)和病毒或抗VEGF ScFv基因表达(通过RTqPCR)。
通过qPCR分析病毒基因组复制
将切除的肿瘤称重，匀浆化并根据实施例13中详述的方法提取DNA。根据实施例9中详述的qPCR方法，使用EnAd E3基因特异性引物-探针组，通过qPCR分析所提取样品和标准物。对于处理后第7天的DLD肿瘤示出每个肿瘤的病毒基因组数目的定量并且证实NG-76和EnAd具有高于输入的显著病毒复制(图41A)。
通过RTqPCR分析病毒(六邻体)或抗VEGF ScFv抗体基因表达
根据实施例13中详述的方法从所切除肿瘤的RNA制备cDNA。通过qPCR检测的cDNA拷贝数的定量证实，在处理后第7天，病毒晚期基因六邻体在NG-76或EnAd处理的DLD肿瘤中的表达类似(图41B)。相反，仅在用NG-76病毒处理的DLD细胞中检测到抗VEGF ScFv基因表达(图41C)。
实施例26：通过利用内源或外源启动子(NG-135、NG-47、NG-61、NG-63和NG-107)在病毒编码转基因的细胞或肿瘤中的表达的选择性
NG-135抗体表达依赖于病毒复制
NG-135病毒中的抗VEGF抗体盒是在EnAd内源主要晚期启动子(MLP)的控制下编码。先前已经表征，在腺病毒感染期间，来自主要晚期启动子的大多数基因表达依赖于病毒复制。为了证实当通过EnAd控制时的抗体表达，MLP因此也取决于病毒复制，在不同MOI下比较NG-135病毒复制的动力学(通过qPCR评估)和抗体表达(通过ELISA评估)。
将HT-29结肠癌细胞以2e6个细胞/孔的密度接种于6孔板中。在接种后18小时，使细胞感染1、10或100ppc的NG-135病毒。
为评估抗VEGF抗体表达，将感染后24、48或72小时的澄清感染上清液稀释于PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中，然后根据实施例9中详述的方法通过抗VEGF结合ELISA测定。通过从标准曲线外推来测定抗体浓度。
为通过qPCR分析病毒复制，根据实施例9中详述的方法在感染后24、48或72小时从细胞裂解液和上清液收集DNA。根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析所提取的DNA样品。在感染后72小时的抗体表达分析显示对于所测试的所有MOI的可检测分泌抗体，但抗体表达水平依赖于输入MOI(图42A)。抗体表达动力学显示抗体表达在感染过程中增加，但可检测的抗体表达与显著高于输入的病毒复制水平相关(图42B和图42C)。
癌瘤、间质成纤维细胞和原代细胞中的NG-135抗体表达
为了证实抗体可以在容许NG-135感染和病毒复制的细胞中选择性表达，在已知容许EnAd感染的癌细胞(HT-29)和先前表征为非容许性的成纤维细胞(WI-38和MRC-5)中确定NG-135病毒复制(通过qPCR评估)、抗体表达(通过ELISA评估)和产生传染性病毒粒子的能力(通过再次感染测定法评估)。简言之，将细胞接种在12孔板中并在接种后18小时感染100ppc NG-135病毒持续4小时，然后从细胞中移出感染培养基并用培养基更换。在4小时感染期后1小时或72小时，根据实施例18中详述的方法从板收集细胞上清液和裂解液。
对于qPCR，提取DNA并根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组分析样品。为评估抗VEGF抗体表达，将感染后澄清的感染上清液稀释于PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中，然后根据实施例18中详述的方法通过ELISA测定。
为评估传染性病毒粒子产生，将收集的上清液从纯物质10倍连续稀释并用于再次感染以3e4个细胞/孔的密度接种在96孔板中的HT-29细胞的新鲜培养物。在再次感染后72小时从板移出培养基并且在室温下用Me:Ac固定细胞10分钟。然后用PBS洗涤孔并且通过与兔抗六邻体初级抗体(1:800稀释)和二级HRP偶合抗兔检测抗体依次温育而对于EnAd衣壳蛋白表达将细胞染色。通过添加DAB底物并使用光学显微镜成像来使六邻体蛋白可视化。通过对所有含有阳性衣壳蛋白染色的孔评分来确定传染性滴度(TCID50/ml)。
数据分析揭示，仅HT-29细胞显示高于感染输入水平的NG-135病毒复制(图43A)或可检测抗体表达(图43B)。使用IgG1 ELISA测定法灵敏度信息，非肿瘤细胞缺乏可检测抗体表达指示，这些细胞产生小于0.33fg/细胞/24小时，相比之下HT-29肿瘤细胞的水平高于100fg/细胞/24小时。这些数据与传染性病毒粒子在HT-29肿瘤细胞中的广泛产生相关，但在成纤维细胞系中不产生可检测病毒(图43C)。
转基因在原代免疫细胞中的选择性表达
对于分别在外源(CMV)启动子或内源MLP的控制下表达报告基因eGFP的EnAd病毒NG-47和NG-107表征转基因在原代先天免疫细胞中的选择性表达。实施例14中详述NG-47和NG-107病毒表征。
根据实施例28中详述的方法从全血中分离单核细胞并培养以分化成树突状细胞。在培养第5天时，将分化的单核细胞源树突状细胞接种在96孔板中并暴露于200ppc的EnAd、NG-47或NG-107或保持未被处理。在48小时后，从孔中收集细胞，洗涤并用PE/Cy5结合的抗CD83抗体(CD83-PE/Cy5(BioLegend))标记。然后通过流式细胞术(Applied Biosystems)评估DC上的CD83和eGFP表达并使用FlowJo软件分析数据。仅可在暴露于NG-47的细胞中检测到GFP表达，其中eGFP表达在外源CMV启动子下，其不依赖于基因表达的病毒复制(图44)。
转基因在体内模型中的选择性表达
为了研究转基因表达在体内的选择性，使用报告基因病毒来确定在已知非容许EnAd病毒复制的鼠类癌细胞肿瘤中的转基因表达。评估当转基因表达在外源(CMV)启动子或内源MLP控制下时的转基因表达和对转基因、病毒或肿瘤的功能性免疫反应。
先前在实施例14中描述并表征表达发光蛋白荧光素酶的报告基因病毒NG-61和NG-63。向BALB/c小鼠在其腰窝经皮下植入1e6个鼠类结肠癌细胞(CT26)。一旦达到约100mm3的平均尺寸，就向肿瘤中注入2.5e9个NG-61或NG-63粒子。在腹膜内注射32mg荧光素后使用IVIS成像相机对于处理后14天的小鼠规律性成像。在肿瘤周围绘制固定尺寸的所关注区域以允许对于每个肿瘤测量相对光单位(RLU)。此外对未被处理的带肿瘤小鼠成像以确定成像背景。在治疗组上的转基因表达定量证实，仅在用NG-61病毒处理的肿瘤中可检测到荧光素酶，其中荧光素酶在外源CMV启动子的控制下(图45A)。
在处理后第14天，从小鼠切除脾脏并离解。将抗干扰素γ抗体固定在PVDF板上。将脾细胞和刺激物(EnAd病毒、CT26细胞裂解液或胰蛋白酶消化重组荧光素酶蛋白)添加至PVDF板并温育过夜。然后将板洗涤并与生物素标记的抗干扰素γ抗体一起温育，然后再次洗涤并与抗生蛋白链菌素-ALP结合物一起温育。然后将板洗涤，添加BCIP/NBT底物并且然后使板显色直至可见明显斑点。将板再次洗涤并且然后干燥，然后在CTL Europe,Germany进行分析。定量揭示出来自NG-61而非NG-63处理的小鼠的脾细胞显示对荧光素酶转基因的特异性反应(图45B)。这种结果将NG-61处理小鼠中的反应增加与EnAd病毒和CT26肿瘤细胞相关联(图45C和图45D)。
实施例27：编码免疫检查点抑制剂通路蛋白PD-L1的抗体(NG-190、NG-177)或ScFv抗体变体(NG-221)的EnAd病毒的产生和表征
通过将编码抗PD-L1抗体(YW243)或YW243抗体的抗PD-L1 ScFv的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的独特限制性位点中，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-177(实施例16中描述的SEQ ID NO:46)、pNG-190(SEQ ID NO:60)和pNG-221(SEQ IDNO:61)。所述pNG-177转基因盒通过包括抗PD-L1 VH链序列(SEQ ID NO:30)、抗体恒定重链序列(SEQ ID NO:34)、内部核糖体进入序列(SEQ ID NO.19)、抗PD-L1 VL链序列(SEQ IDNO:32)和抗体恒定轻链序列(SEQ ID NO:35)而编码抗PD-L1抗体。所述pNG-190转基因盒通过包括抗PD-L1 VH链序列(SEQ ID NO:30)、抗体恒定重链序列(SEQ ID NO:34)、高自我剪切效率P2A肽序列(SEQ ID NO:25)、抗PD-L1 VL链序列(SEQ ID NO:32)和抗体恒定轻链序列(SEQ ID NO:35)而编码抗PD-L1抗体。所述pNG-221转基因盒编码抗PD-L1 ScFv(SEQ IDNO:37)。所述抗体或ScFv编码序列侧接5'短剪接受体序列(SEQ ID NO:16)和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:20)。所插入的转基因盒的示意图示于图34中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法扩增和纯化病毒NG-190和NG-221。
病毒表征
将结肠癌细胞中的NG-190和NG-221溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)、病毒复制(通过qPCR评估)和抗PD-L1抗体或ScFv表达(通过ELISA评估)与先前已经表征并表达抗VEGF抗体的EnAd参考病毒或NG-165、NG-135病毒进行比较。为评估相比于EnAd的溶瘤效能，根据实施例15中详述的方法进行细胞活力测定法。所述NG-190和NG-221病毒显示与EnAd类似的溶瘤活性(图46A、图46B)。
为评估病毒复制或抗体表达，将HT-29细胞以1e6个细胞/孔的密度接种于12孔培养板中，并且在粘附后感染100ppc的EnAd、NG-190、NG-221或NG-165。对于qPCR，在感染后24、48或72小时根据实施例18中详述的方法从细胞裂解液和上清液收集DNA。根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析所提取的DNA样品。在整个感染时程中，关于NG-190(图46C)或NG-221(图46D)所检测的总病毒基因组与EnAd参考病毒类似。
为评估来自NG-190或NG-165感染细胞的分泌抗体表达，将感染后24、48或72小时收集的澄清感染上清液稀释于PBS/3％BSA/0.05％Tween20中，然后根据实施例18中详述的方法通过抗人类IgG1 ELISA测定。类似地，在感染后72小时的澄清上清液中评估来自NG-177或NG-135感染细胞的分泌抗体表达。通过从测定标准曲线外推来确定样品中的抗体浓度并且证实，在与比较病毒NG-165类似的水平下从NG-190感染细胞中分泌出可检测抗体(图47A)并且在与比较病毒NG-135类似的水平下从NG-177感染细胞中分泌出可检测抗体(图49A)。
实施例28：从NG-190、NG-177或NG-221感染细胞表达的抗PD-L1抗体或ScFv的表征
PD-L1直接结合测定法
通过直接PD-L1结合ELISA评估从NG-190和NG-221感染细胞表达的抗体或ScFv的抗PD-L1结合活性。
使A549肺癌细胞感染100ppc的NG-190、NG-221或对照病毒NG-165持续72小时。收集培养上清液并在300g下离心5分钟以除去细胞碎片。然后通过在9K MWCO蛋白浓缩仪旋转柱(Pierce，87748)中在4000g下离心20分钟将培养上清液浓缩10倍。将ELISA板(NunCImmuno MaxiSorp 96孔微板)在4℃下涂布重组PDL1-Fc(0.5μg/ml，R&D Systems，156-B7-100)过夜。将板用PBS-0.05％Tween-20洗涤三次，然后用PBS/3％BSA/0.05％Tween 20阻断。在PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中在1:2至1:2048的范围内制备浓缩上清液的连续双倍稀释，然后添加至ELISA板并在室温下温育1小时。
对于NG-190和NG-165样品，将板用PBS-0.05％Tween-20洗涤三次，然后向所有孔添加50μl 1/8000抗κ轻链抗体(Abcam，ab124727)。在温育1小时并洗涤后，使用山羊抗兔IgG H&L(HRP)(Abcam，ab6721)进行二次检测。然后通过添加50ul/孔单步Ultra TMB-ELISA底物溶液(thermo，34028)使板显色。在20分钟后，通过添加50μl 1M HCl来终止反应并且测量450nm下的吸光度并绘图。在NG-190感染A549细胞而非NG-165感染A549细胞的上清液中可特异性检测到抗PD-L1结合活性(图47B)。
对于NG-221样品，将板用PBS-0.05％Tween-20洗涤三次，然后在室温下向所有孔添加50μl 1:5000抗6X His
Figure BDA0003363702110000981
抗体(HRP)(Abcam，ab1187)持续1小时，然后洗涤。通过添加50ul单步Ultra TMB-ELISA底物溶液(thermo，34028)使板显色。在20分钟后，通过添加50μl 1M HCl来终止反应并且测量450nm下的吸光度。在NG-221上清液中可特异性检测到ScFv抗PD-L1结合活性(图47C)。
PD-L1受体结合抑制测定法
在PD-L1配体:PD-1受体相互作用测定法中评估在NG-190或NG-177感染细胞的上清液中表达的抗PD-L1抗体的阻断活性。
使293细胞感染100ppc的NG-190或NG-177持续72小时。根据上述方法收集并浓缩培养上清液。将ELISA板在4℃下涂布PDL1-Fc(2μg/ml，R&D Systems，156-B7-100)过夜。用PBS将板洗涤三次，然后在室温下用PBS/3％BSA/0.05％Tween 20阻断一小时。在PBS中制备浓缩上清液的连续双倍稀释液，然后向ELISA板中添加45ul的每种稀释液。向每个孔添加10ng重组PD1-Fc(R&D Systems,1086-PD-050)并且将板温育1小时。然后将所有孔用PBS/0.05％Tween 20洗涤三次并且用PBS/3％BSA/0.05％Tween 20阻断10分钟。然后以0.4μg/ml向孔添加人类PD-1(R&D Systems，BAF1086)的生物素标记的亲和纯化的抗体1小时。将孔用PBS/0.05％Tween 20洗涤三次，然后添加抗生蛋白链菌素-HRP(R&D Systems，DY998)的1:200稀释液持续1小时。通过添加50ul单步Ultra TMB-ELISA底物溶液(thermo，34028)使板显色。在20分钟后，通过添加50μl 1M HCl终止反应并且测量450nm下的吸光度。为了确定PD-1结合百分比，所测量的吸光度值以不含抗PD-L1抗体的对照样品的百分比形式表达。从NG-190感染细胞分泌的抗PD-L1抗体能够以剂量依赖性方式抑制PD-1受体结合(图47D)。类似地，来自NG-177、而非NG-135感染细胞的纯上清液能够将PD-1受体与PD-L1的结合抑制>50％(图49B)。
混合淋巴细胞反应(MLR)
通过混合淋巴细胞反应中的T细胞激活程度来评估NG-190或NG-177感染细胞的上清液中表达的抗PD-L1抗体的功能活性。
通过在13ml Ficoll-Paque Plus(GE healthcare life sciences，17-1440-02)上在1300rpm下离心1:2稀释血液30分钟而从新鲜人类血液(Clinical Trials LaboratoryServices)分离外周血单核细胞(PBMC)。使用人类CD14微珠(Miltenyi，130-050-201)根据制造商的方案分离CD14+单核细胞。将分离的单核细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺(GEHealthcare：M11-003)、1mM丙酮酸钠(GE Healthcare：S11-003)、1mM非必需氨基酸(GEHealthcare：M11-004)、1mM青霉素/链霉素(GE Healthcare：P11-010)和10％FBS(Thermofisher，SV30160.03)、500U/ml IL-4(R&D Systems，204-IL-050)和800U/ml GM-CSF(R&DSystems，215-GM-050)的RPMI 1640(life technologies，11875-093)中培养。每两天通过用新鲜培养基置换一半培养物体积来供给培养物。
在培养第5天通过添加1μg/ml LPS(Sigma-Aldrich，L2654)使单核细胞源树突状细胞成熟24小时。在第6天将细胞用于MLR测定法。
使用人类CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi，130-096-533)根据制造商的方案从PBMC分离(如上所述分离)CD4 T细胞。在分离当天在MLR中使用分离的CD4+ T细胞。
对于MLR，将每孔1e5个分离的CD4+ T细胞与2e4个LPS成熟的单核细胞源树突状细胞混合并且然后向测试孔添加阳性对照抗PD-L1抗体(5μg/ml，Biolegend 329716)或20μl的浓缩上清液(上文制备)。将MLR在37℃下温育4天。从板中移出上清液，澄清并且然后通过ELISA测定细胞因子IL-2。简言之，将ELISA板在4℃下用人类IL-2mAb(R&D Systems，MAB602)涂布过夜。用PBS将板洗涤三次，然后在室温下用PBS/3％BSA/0.05％Tween阻断一小时。在2000pg/ml至31.3pg/ml的范围内从重组IL-2蛋白(R&D Systems，202-IL-050)制备IL-2标准曲线。通过将上文制备的澄清上清液1:4稀释于PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中来制备MLR样品。在室温下将样品和标准物以50μl/孔的密度添加至ELISA板持续1小时，然后将它们用PBS/0.05％Tween 20洗涤三次，然后添加生物素标记的抗人类IL-2检测抗体(R&DSystems，BAF202)。在1小时温育后，将板再用PBS/0.05％Tween 20洗涤三次并且添加抗生蛋白链菌素-HRP(R&D Systems，DY998)的1:200稀释液持续1小时。通过添加50μl单步UltraTMB-ELISA底物溶液(thermo，34028)使板显色。在20分钟后，通过添加50μl 1M HCl来终止反应并且测量在450nm下的吸光度。对于来自独立实验的两种不同的DC:T细胞供体组，对于NG-190感染的培养上清液而非对于NG-165可检测到增强的CD4 T细胞反应(在增加的IL-2表达方面)(图48A和图48B)。类似地，对于NG-177而非NG-135培养上清液的CD4 T反应也增强(图49C)。总而言之，这些数据证实，在对于NG-190和NG-177武装化病毒的肿瘤细胞感染的情况下产生功能性抗PD-L1抗体。
细胞PD-L1配体结合
对于从NG-177感染细胞表达的抗体的抗PD-L1结合活性评估其直接结合在肺癌细胞(A549)表面上在膜环境中表达的非重组PD-L1配体的能力。
A549细胞用50ng/ml人类IFNγ刺激以促进在细胞表面上的PD-L1表达上调或保持未被刺激。在24小时后，将细胞用胰蛋白酶处理并在4℃下仅用培养基或50μl的浓缩NG-177或NG-135感染细胞上清液(上文制备)温育1小时。将细胞用PBS/1％BSA洗涤两次，然后在4℃下用1:250稀释的50μl Alexa-fluor 488标记的山羊抗人类IgG(H+L)(LifeTechnologies，A11013)温育30分钟。将细胞再次洗涤，再次悬浮在PBS/1％BSA中并利用Attune声波聚集流式细胞仪(Life Technologies)分析。在NG-177上清液中可检测到与PE标记的纯化抗PD-L1对照抗体(29E.2A3，来自Biolegend)的结合类似的PD-L1结合活性，但在NG-135对照病毒上清液中不能检测到(图50)。
实施例29：编码免疫检查点抑制剂通路蛋白CTLA-4的抗体的EnAd病毒(NG-242)的产生和表征
通过将编码抗CTLA-4抗体(11.2.1)的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的独特限制性位点，使用质粒pEnAd2.4来产生质粒pNG-242(SEQ ID NO:58)。所述pNG-242转基因盒通过包括抗CTLA-4VH链序列(SEQ ID NO:70)、抗体恒定重链序列(SEQ ID NO:33)、内部核糖体进入序列(SEQ ID NO:19)、抗CTLA-4VL链序列(SEQ ID NO.71)和抗体恒定轻链序列(SEQ ID NO:35)而编码抗CTLA-4抗体。所插入的转基因盒的示意图示于图34中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法来扩增和纯化病毒NG-242。
病毒表征
在结肠癌细胞中比较NG-242溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)和抗CTLA-4抗体表达(通过ELISA评估)与表达抗VEGF抗体的EnAd参考病毒或NG-135参考病毒。为评估相比于EnAd的溶瘤效能，根据实施例15中详述的方法进行细胞活力测定法。NG-242病毒显示与所制造EnAd参考材料类似的效能(图51A)。
为评估抗体表达，将HT-29细胞以1e6个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中并且在粘附后感染100ppc的EnAd、NG-242或NG-135。将感染后24、48或72小时收集的感染上清液稀释于PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中，然后根据实施例18中详述的方法通过抗人类IgG1ELISA评估。通过从测定标准曲线外推来测定样品中的抗体浓度并且证实在与比较病毒NG-135类似的水平下从NG-242感染细胞分泌出可检测抗体(图51B)。
CTLA-4直接结合测定法
通过直接CTLA-4结合ELISA评估从NG-242感染细胞表达的抗体的抗CTLA-4结合活性。
使A549细胞感染100ppc的表达IgG1抗VEGF抗体的NG-242或NG-165对照病毒72小时。收集培养上清液并在300g下离心5分钟以除去细胞碎片。在4℃下将ELISA板涂布重组CTLA4-Fc(0.5μg/ml，R&D Systems，325-CT-200)过夜。将板用PBS/0.05％Tween 20洗涤三次，然后用PBS/3％BSA/0.05％Tween 20阻断。在PBS/3％BSA/0.05％Tween 20中制备浓缩上清液的连续双倍稀释液(1:2至1:2048)，然后添加至ELISA板并在室温下温育1小时。然后根据实施例28中详述的用于检测PD-L1结合的方法进行这种ELISA。在NG-242感染A549细胞而非NG-165感染A549细胞的上清液中可特异性检测到抗CTLA-4结合活性(图51C)。
CTLA-4受体结合抑制测定法
在CTLA-4配体:B7-1受体相互作用测定法中评估在NG-242感染细胞的上清液中表达的抗CTLA-4抗体的阻断活性。
根据实施例28中详述的方法收集并浓缩上述NG-242感染细胞的培养上清液。在4℃下将ELISA板涂布CTLA4-Fc(2μg/ml，R&D Systems，325-CT-200)过夜。将板用PBS洗涤三次，然后在室温下用PBS/3％BSA/0.05％Tween 20阻断1小时。在PBS中制备浓缩上清液的连续双倍稀释液，然后向ELISA板添加45μl的每种稀释液。向每个孔添加10ng重组B7-1-Fc(R&D Systems，140-B1-100)并且将板温育1小时。然后将所有孔用PBS/0.05％Tween 20洗涤三次，然后用PBS/3％BSA/0.05％Tween 20阻断10分钟。添加2μg/ml的生物素标记的抗人类B7-1抗体(R&D Systems，BAM-402)并且将板温育1小时。进行三次洗涤，然后添加抗生蛋白链菌素-HRP(R&D Systems，DY998)的1:200稀释液。通过添加50μl单步Ultra TMB-ELISA底物溶液(thermo，34028)使板显色。在20分钟后，通过添加50μl 1M HCl来终止反应并且测量450nm下的吸光度。通过如下来分析结果：将样品吸收除以对照(不具有测试抑制剂)的吸收并乘以100以确定最大结合B7-1百分比。从NG-242感染细胞分泌的抗CTLA-4抗体能够抑制B7-1受体结合(图51D)。
实施例30：编码肿瘤相关抗原(TAA)的EnAd病毒(NG-217、NG-220)的产生和表征
通过将编码肿瘤相关抗原NY-ESO-1的转基因盒直接插入位于L5与E4基因之间的独特限制性位点中，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-217(SEQ ID NO:57)、pNG-220(SEQ ID NO:56)。所述pNG-217转基因盒编码侧接CMV启动子序列(SEQ ID NO:13)和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:20)的NY-ESO-1基因(SEQ ID NO:43)。所述pNG-220转基因盒编码侧接PGK启动子序列(SEQ ID NO:14)和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:20)的NY-ESO-1基因。所插入的转基因盒的示意图示于图34中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法来扩增和纯化病毒NG-217和NG-220。
病毒表征
将结肠癌细胞中的NG-220和NG-217病毒复制(通过qPCR评估)和NG-220NY-ESO-1转基因表达(通过免疫印迹法评估)与EnAd进行比较。为评估病毒复制，使HT-29细胞以1e6个细胞/孔的密度接种于12孔培养板中并且在粘附后感染100ppc的EnAd、NG-220或NG-217。对于qPCR，在感染后24或48小时根据实施例18中详述的方法从细胞裂解液和上清液收集DNA。根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析所提取的DNA样品。关于NG-220(图52A)或NG-217(图52B)检测的总病毒基因组与EnAd参考病毒类似。
为评估NY-ESO-1表达免疫印迹法，使HT-29细胞以4e6个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中并在37℃、5％CO2下温育5小时。然后使所述细胞感染100个NG-220或EnAd病毒粒子/细胞持续48或72小时。从孔中移出培养基并且将细胞用PBS洗涤一次，然后在含有抗蛋白酶抑制剂混合液III(Calbiochem：539134)的250μl裂解缓冲液(150mM NaCl、1％TritonX-100、0.5％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5))中裂解。用benzonase处理裂解液以降解基因组DNA并且用含有NuPAGE LDS样品缓冲液和NuPAGE还原剂(Life Technologies)的裂解缓冲液进一步1:4稀释。将样品在70℃下加热10分钟，然后使用4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(Life Technologies)根据制造商的方案进行SDS-PAGE。使用Xcell II印迹模块(LifeTechnologies)通过免疫印迹法将蛋白质转移至PVDF膜上。在补充有5％奶粉的PBS 0.1％Tween-20中进行阻断和免疫印迹并且在PBS 0.1％Tween-20中进行所有洗涤步骤。使用小鼠单克隆抗NY-ESO-1抗体(3μg/ml)检测NY-ESO-1并且使用兔抗小鼠IgG-HRP进行二级抗体检测。通过增强化学发光使蛋白质可视化。在感染NG-220而非EnAd对照后48和72小时，可检测到NY-ESO-1表达(图52B)。
实施例31：用于在L5纤维基因下游插入转基因盒的EnAd克隆质粒pEnAd2.4的构建
通过穿梭载体pEnAd2.4穿梭与EnAd基因组之间的同源重组获得质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)。所述pEn2.4质粒含有细菌p15A复制起点、卡那霉素抗性基因和具有插入BY区中的独特限制性位点的EnAd基因组。
pColoAd2.4质粒的构建如下。最初构建约12kb穿梭质粒pColoAd1穿梭以使得独特限制性位点可引入EnAd基因组的晚期基因L5区(BY区)中。分别使用引物5'–TTGGCGGCGCGCCTATCTATATAATATACC-3'[SEQ ID NO:80]和引物5'-AATGCAAATCTGTGAGGGG-3'[SEQ ID NO:82]或5'–CTTAGTGGTGTTGTGGTATTGG-3'[SEQ ID NO:83]通过PCR从EnAd基因组扩增EnAd的5'(nt 1-4632)和3'(nt 27837-32326)端。5'臂PCR产物含有5'引入AscI位点和对应于EnAd基因组中的nt 4626的PspOMI位点的3'PspOMI位点。3'臂PCR产物含有对应于EnAd基因组中的nt 27837的PspOMI位点的5'PspOMI位点和所引入的3'AscI位点。将PCR产物用AscI/PspOMI进行限制性消化并以单步三向连接而连接至含有p15A复制起点和卡那霉素抗性盒的AscI线性化质粒。这产生pEnAd穿梭质粒。利用插入对应于By区中的EnAd nt29356的位置的外加区域19bp 5'-GCGATCGCTACCCTGCAGG-3'[SEQ ID NO:90]来合成对应于侧接PspOMI和AclI限制性位点并含有晚期基因L5(nt 27837-30060)的EnAd基因组区域的DNA片段。这个额外区域包括不存在于EnAd基因组中的两种酶(GCGATCGC和CCTGCAGG)的限制性位点，并且可通过SgfI和SbfI切断。将合成的DNA片段用酶PspOMI和AclI进行限制性消化并克隆到PspOMI/AclI消化的pColoAd1穿梭质粒中的相应区域中以产生质粒pColoAd2.4穿梭。为了通过同源重组获得pColoAd2.4质粒，通过用酶PspOMI限制性消化使pColoAd2.4穿梭质粒线性化并用碱性磷酸酶处理以除去5'磷酸酯。根据制造商的方案通过电穿孔将线性化质粒和EnAd基因组共转化到BJ5183细胞中并且通过限制性消化确定通过同源重组的pColoAd2.4质粒产生。通过DNA测序确定所有质粒的适当结构。
实施例32：用于在L5纤维基因上游或下游插入转基因盒的EnAd克隆质粒pColoAd2.6的合成
通过利用SGI-DNA(La Jolla,CA,USA)的合成基因区段组装方法来产生质粒pColoAd2.6(pNG-185，SEQ ID NO:65)。使用下一代测序(SGI-DNA)确定质粒的适当结构。所述pNG-185质粒含有细菌p15A复制起点、卡那霉素抗性基因和具有插入BX和BY区中的独特限制性位点的EnAd基因组。
病毒产生
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法来扩增和纯化病毒NG-185。
病毒表征
将NG-185溶瘤活性(通过细胞活力测定法评估)和病毒复制(通过qPCR评估)与EnAd参考病毒进行比较。为评估相比于EnAd的溶瘤效能，根据实施例15中详述的方法进行细胞活力测定法。NG-185病毒显示与EnAd类似的溶瘤活性(图53A)。
为评估病毒复制，使HT-29细胞以1e6个细胞/孔的密度接种在12孔板中并且在粘附后感染100ppc的EnAd或NG-185。对于qPCR，在感染后48或72小时根据实施例18中详述的方法从细胞裂解液和上清液收集DNA。根据实施例9中详述的方法使用EnAd E3基因特异性引物-探针组通过qPCR分析所提取的DNA样品。在整个感染时程中，关于NG-185所检测的总病毒基因组(图53B)与EnAd参考病毒类似。
实施例33：从质粒pColoAd2.6产生EnAd病毒(pNG-185)
通过将转基因盒直接插入位于BX和BY区中的pEnAd2.6独特限制性位点，使用质粒pEnAd2.6(SEQ ID NO:65)来产生质粒pNG-257和pNG-281。pNG-257含有插入BX区中的编码抗VEGF ScFv(SEQ ID NO:36)的转基因盒，其具有C端His肽标签(SEQ ID NO:23)，侧接5'bSA(SEQ ID NO:18)和3'多聚(A)序列(SEQ ID NO:20)。pNG-281含有插入BX区中的编码抗VEGF ScFv(SEQ ID NO:36)的转基因盒，所述抗VEGF ScFv(SEQ ID NO:36)具有C端组氨酸肽标签(SEQ ID NO:23)，侧接5'bSA(SEQ ID NO:18)和3'多聚(A)序列(SEQ ID NO:20)；和插入BY区中的编码抗PD-L1 ScFv(SEQ ID NO:37)的第二转基因盒，所述抗PD-L1 ScFv(SEQID NO:37)具有V5标签(SEQ ID NO:24)，侧接5'SSA(SEQ ID NO:16)和3'多聚(A)序列(SEQID NO:20)。质粒pNG-257和pNG-281中的所插入的转基因盒的示意图示于图54中。通过DNA测序确定质粒的结构。这些质粒含有EnAd病毒基因组NG-257(SEQ ID NO:72)和NG-281(SEQID NO:73)。
实施例34：表达多种ScFv抗体变体的EnAd病毒的产生
通过将编码抗VEGF ScFv和抗PD-L1 ScFv的盒直接插入位于L5与E4基因之间的独特限制性位点(BY区)中，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-272。所述pNG-272转基因盒通过包括抗PD-L1 ScFv序列(SEQ ID NO:37)、高自我剪切效率P2A肽序列(SEQID NO:25)、抗VEGF ScFv序列(SEQ ID NO.36)和3'多聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:20)而编码抗PD-L1 ScFv和抗VEGF ScFv。所插入的转基因盒的示意图示于图54中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法来扩增和纯化病毒NG-272(SEQID NO:69)。
实施例35：编码跨膜蛋白碘化钠同向转运蛋白(NIS)的EnAd病毒的产生
通过将编码碘化钠同向转运蛋白(NIS)的转基因盒直接插入BY区中，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-280。所述pNG-280盒含有5'SSA(SEQ ID NO:16)、NIS cDNA序列(SEQ ID NO:67)和3'多聚(A)序列(SEQ ID NO:20)并编码NG-280病毒基因组(SEQ ID NO:68)。所插入的转基因盒的示意图示于图54中。通过测序确定质粒的结构。
实施例36：表达shRNA的EnAd病毒的产生
通过直接插入分别编码蛋白GAPDH的shRNA或与任何人类基因不共有序列的对照shRNA的盒，使用质粒pEnAd2.4(SEQ ID NO:64)来产生质粒pNG-sh01和pNG-sh02。所述pNG-sh01盒含有U6人类RNA聚合酶III启动子，和由以下组成的shRNA序列：29nt反义序列、环序列、29nt正义序列和3'TTTTTT序列。所插入的转基因盒的示意图示于图54中。通过DNA测序确定质粒的结构。
病毒产生和表征
根据实施例8中详述的用于纯化NG-135病毒的方法来扩增和纯化病毒NG-sh01(SEQ ID NO:66)和NG-sh02。在用NG-sh01处理的细胞而非用NG-sh02处理的细胞中，人类细胞系中的GAPDH表达降低。
序列表
<110> 普西奥克瑟斯医疗有限公司
<120> 武装有异源基因的溶瘤腺病毒
<130> P000100_WO
<160> 38
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 35373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-77病毒基因组序列
<400> 1
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
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agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
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tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
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tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
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gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
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tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
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tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
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tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
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caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
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ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
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gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
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ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
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cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240
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gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
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cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
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gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
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gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
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cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100
gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220
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gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
atcaacattc tacagagtat catagtgcag gagcggagcc tgggcctggc cgagaaggtg 11400
gctgccatca attactcggt tttgagcttg ggaaaatatt acgctcgcaa aatctacaag 11460
actccatacg ttcccataga caaggaggtg aagatagatg ggttctacat gcgcatgacg 11520
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cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760
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gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
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ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
atacaacgct ctcttagaac gcgtggctcg ctacaacagt agcaatgtgc aaaccaattt 12180
ggaccgtatg ataacagatg tacgcgaagc cgtgtctcag cgcgaaaggt tccagcgtga 12240
tgccaacctg ggttcgctgg tggcgttaaa tgctttcttg agtactcagc ctgctaatgt 12300
gccgcgtggt caacaggatt atactaactt tttaagtgct ttgagactga tggtatcaga 12360
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ctttctaaaa aaaaaaaaaa tgtccattct tatctcgccc agtaataaca ccggttgggg 15420
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aagcgctact tttaagcgtt cctatgatga ggtgtacggg gatgatgata ttcttgagca 16320
ggcggctgac cgattaggcg agtttgctta tggcaagcgt agtagaataa cttccaagga 16380
tgagacagtg tcgataccct tggatcatgg aaatcccacc cctagtctta aaccggtcac 16440
tttgcagcaa gtgttacccg taactccgcg aacaggtgtt aaacgcgaag gtgaagattt 16500
gtatcccact atgcaactga tggtacccaa acgccagaag ttggaggacg ttttggagaa 16560
agtaaaagtg gatccagata ttcaacctga ggttaaagtg agacccatta agcaggtagc 16620
gcctggtctg ggggtacaaa ctgtagacat taagattccc actgaaagta tggaagtgca 16680
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catgcctatt acaactgacg ccgccggtcc cactcgaaga tcccgacgaa agtacggtcc 16800
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gccttcgcgt tcccatcact ggttaccgag gaagaaactc gcgccgtaga agagggatgt 17160
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gttttttacc agccttaatt ccaattatcg ctgctgcaat tggcgcgata ccaggcatag 17280
cttccgtggc ggttcaggcc tcgcaacgac attgacattg gaaaaaaacg tataaataaa 17340
aaaaaaaaaa tacaatggac tctgacactc ctggtcctgt gactatgttt tcttagagat 17400
ggaagacatc aatttttcat ccttggctcc gcgacacggc acgaagccgt acatgggcac 17460
ctggagcgac atcggcacga gccaactgaa cgggggcgcc ttcaattgga gcagtatctg 17520
gagcgggctt aaaaattttg gctcaaccat aaaaacatac gggaacaaag cttggaacag 17580
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cgatgggata gcttccggca tcaatggagt ggtagatttg gctaaccagg ctgtgcagaa 17700
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caccactaga ccgatagccc caatggccac cggggtgatg aaaccttctc agttgcatcg 17940
acccgtcacc ttggatttgc cccctccccc tgctgctact gctgtacccg cttctaagcc 18000
tgtcgctgcc ccgaaaccag tcgccgtagc caggtcacgt cccgggggcg ctcctcgtcc 18060
aaatgcgcac tggcaaaata ctctgaacag catcgtgggt ctaggcgtgc aaagtgtaaa 18120
acgccgtcgc tgcttttaat taaatatgga gtagcgctta acttgcctat ctgtgtatat 18180
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ccggacagga tgcttcggag tacctgagtc cgggtctggt gcagttcgcc cgcgccacag 18360
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atacatactc ttacaaagtg cggtacaccc tggccgtggg cgacaacaga gtgctggata 18540
tggccagcac gttctttgac attaggggtg tgttggacag aggtcccagt ttcaaaccct 18600
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cttatgagtg gaactttagg aaggatgtga acatggttct acagagttcc ctcggtaacg 20040
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atcagtcatt caacgactac ctatctgcag ctaacatgct ctaccccatt cctgccaatg 20220
caaccaatat tcccatttcc attccttctc gcaactgggc ggctttcaga ggctggtcat 20280
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cacacatcga aagggccact gcgttcgacc gtatggatgt tcaataatga ctcatgtaaa 21780
caacgtgttc aataaacatc actttatttt tttacatgta tcaaggctct gcattactta 21840
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gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga 30240
ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta 30300
cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag 30360
cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga 30420
gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa 30480
agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat 30540
gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc 30600
cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct 30660
ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca 30720
gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcacgaggct ctgcacaacc actacacgca 30780
gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaatg atctagactc gaggtttcta gaagttgtct 30840
cctcctgcac tgactgactg acctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 30900
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ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 31080
caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 31140
ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 31200
cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tcccctcaag cgtattcaac 31260
aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 31320
tgcacatgct tttcatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 31380
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attagcaact atttaaactg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa agtcctgatt 31620
tacttcacct cctctctcca ctctggagtc ccttctcgct tctctggatc cggttctggg 31680
acggatttca ctctgaccat cagcagtctg cagccagaag acttcgcaac ttattactgt 31740
caacagtata gcaccgtgcc gtggacgttt ggacagggta ccaaggtgga gatcaaacga 31800
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 31860
actgcttctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 31920
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cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 32100
ttcaacaggg gagagtgtta agctagcttg actgactgag atacagcgta ccttcagctc 32160
acagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa 32220
aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc 32280
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tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtagtcgtca gctatcctgc 32400
aggaacttgt ttatttgaaa atcaattcac aaaatccgag tagttatttt gcctccccct 32460
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ttagatatag acatggtttt agattccaca ttccaaacag tttcagagcg agccaatctg 32580
gggtcagtga tagataaaaa tccatcggga tagtctttta aagcgctttc acagtccaac 32640
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cataatccga aaacggtatc ggacgattgt gtctcatcaa acccacaagc agccgctgtc 32760
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taaaagcgct ccagccaaaa ctcatatctg atataatcgc ccctgcatga ccatcatacc 33000
aaagtttaat ataaattaaa tgacgttccc tcaaaaacac actacccaca tacatgatct 33060
cttttggcat gtgcatatta acaatctgtc tgtaccatgg acaacgttgg ttaatcatgc 33120
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gagaatgaaa aatatctata gtggcacaac atagacataa atgcatgcat cttctcataa 33300
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cacaatctgg caacagcggg tggtcttcag tcatagaagc tcgggtttca ttttcctcac 33480
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ccacagccaa tcaccacacg atccacactt tttaaaatca cctcatttac atattggcac 35340
cattccatct ataaggtata ttatatagat aga 35373
<210> 2
<211> 35355
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-135病毒基因组序列
<400> 2
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
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tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
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aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
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ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
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gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
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ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
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ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
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cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
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caggacctgc tcgaaaactg gttagctgca cagccggcat cattcacaca gcagcgggcg 22440
tcattgttag ctatttgcac cacacttctg ccccagcggt tttgggtgat tttggttcgc 22500
tcgggattct cctttaaggc tcgttgtccg ttctcgctgg ccacatccat ctcgataatc 22560
tgctccttct gaatcataat attgccatgc aggcacttca gcttgccctc ataatcattg 22620
cagccatgag gccacaacgc acagcctgta cattcccaat tatggtgggc gatctgagaa 22680
aaagaatgta tcattccctg cagaaatctt cccatcatcg tgctcagtgt cttgtgacta 22740
gtgaaagtta actggatgcc tcggtgctcc tcgtttacgt actggtgaca gatgcgcttg 22800
tattgttcgt gttgctcagg cattagttta aaagaggttc taagttcgtt atccagcctg 22860
tacttctcca tcagcagaca catcacttcc atgcctttct cccaagcaga caccaggggc 22920
aagctaatcg gattcttaac agtgcaggca gcagctcctt tagccagagg gtcatcttta 22980
gcgatcttct caatgcttct tttgccatcc ttctcaacga tgcgcacggg cgggtagctg 23040
aaacccactg ctacaagttg cgcctcttct ctttcttctt cgctgtcttg actgatgtct 23100
tgcatgggga tatgtttggt cttccttggc ttctttttgg ggggtatcgg aggaggagga 23160
ctgtcgctcc gttccggaga cagggaggat tgtgacgttt cgctcaccat taccaactga 23220
ctgtcggtag aagaacctga ccccacacgg cgacaggtgt ttctcttcgg gggcagaggt 23280
ggaggcgatt gcgaagggct gcggtccgac ctggaaggcg gatgactggc agaacccctt 23340
ccgcgttcgg gggtgtgctc cctgtggcgg tcgcttaact gatttccttc gcggctggcc 23400
attgtgttct cctaggcaga gaaacaacag acatggaaac tcagccattg ctgtcaacat 23460
cgccacgagt gccatcacat ctcgtcctca gcgacgagga aaaggagcag agcttaagca 23520
ttccaccgcc cagtcctgcc accacctcta ccctagaaga taaggaggtc gacgcatctc 23580
atgacatgca gaataaaaaa gcgaaagagt ctgagacaga catcgagcaa gacccgggct 23640
atgtgacacc ggtggaacac gaggaagagt tgaaacgctt tctagagaga gaggatgaaa 23700
actgcccaaa acaacgagca gataactatc accaagatgc tggaaatagg gatcagaaca 23760
ccgactacct catagggctt gacggggaag acgcgctcct taaacatcta gcaagacagt 23820
cgctcatagt caaggatgca ttattggaca gaactgaagt gcccatcagt gtggaagagc 23880
tcagccgcgc ctacgagctt aacctctttt cacctcgtac tccccccaaa cgtcagccaa 23940
acggcacctg cgagccaaat cctcgcttaa acttttatcc agcttttgct gtgccagaag 24000
tactggctac ctatcacatc ttttttaaaa atcaaaaaat tccagtctcc tgccgcgcta 24060
atcgcacccg cgccgatgcc ctactcaatc tgggacctgg ttcacgctta cctgatatag 24120
cttccttgga agaggttcca aagatcttcg agggtctggg caataatgag actcgggccg 24180
caaatgctct gcaaaaggga gaaaatggca tggatgagca tcacagcgtt ctggtggaat 24240
tggaaggcga taatgccaga ctcgcagtac tcaagcgaag catcgaggtc acacacttcg 24300
catatcccgc tgtcaacctg ccccctaaag tcatgacggc ggtcatggac cagttactca 24360
ttaagcgcgc aagtcccctt tcagaagaca tgcatgaccc agatgcctgt gatgagggta 24420
aaccagtggt cagtgatgag cagctaaccc gatggctggg caccgactct cccagggatt 24480
tggaagagcg tcgcaagctt atgatggccg tggtgctggt taccgtagaa ctagagtgtc 24540
tccgacgttt ctttaccgat tcagaaacct tgcgcaaact cgaagagaat ctgcactaca 24600
cttttagaca cggctttgtg cggcaggcat gcaagatatc taacgtggaa ctcaccaacc 24660
tggtttccta catgggtatt ctgcatgaga atcgcctagg acaaagcgtg ctgcacagca 24720
ccctgaaggg ggaagcccgc cgtgattaca tccgcgattg tgtctatctg tacctgtgcc 24780
acacgtggca aaccggcatg ggtgtatggc agcaatgttt agaagaacag aacttgaaag 24840
agcttgacaa gctcttacag aaatctctta aggttctgtg gacagggttc gacgagcgca 24900
ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
acggattgcc tgactttatg agccagagca tgcttaacaa ttttcgctct ttcatcctgg 25020
aacgctccgg tatcctgccc gccacctgct gcgcactgcc ctccgacttt gtgcctctca 25080
cctaccgcga gtgccccccg ccgctatgga gtcactgcta cctgttccgt ctggccaact 25140
atctctccta ccactcggat gtgatcgagg atgtgagcgg agacggcttg ctggagtgtc 25200
actgccgctg caatctgtgc acgccccacc ggtccctagc ttgcaacccc cagttgatga 25260
gcgaaaccca gataataggc acctttgaat tgcaaggccc cagcagccaa ggcgatgggt 25320
cttctcctgg gcaaagttta aaactgaccc cgggactgtg gacctccgcc tacttgcgca 25380
agtttgctcc ggaagattac cacccctatg aaatcaagtt ctatgaggac caatcacagc 25440
ctccaaaggc cgaactttcg gcctgcgtca tcacccaggg ggcaattctg gcccaattgc 25500
aagccatcca aaaatcccgc caagaatttc tactgaaaaa gggtaagggg gtctaccttg 25560
acccccagac cggcgaggaa ctcaacacaa ggttccctca ggatgtccca acgacgagaa 25620
aacaagaagt tgaaggtgca gccgccgccc ccagaagata tggaggaaga ttgggacagt 25680
caggcagagg aggcggagga ggacagtctg gaggacagtc tggaggaaga cagtttggag 25740
gaggaaaacg aggaggcaga ggaggtggaa gaagtaaccg ccgacaaaca gttatcctcg 25800
gctgcggaga caagcaacag cgctaccatc tccgctccga gtcgaggaac ccggcggcgt 25860
cccagcagta gatgggacga gaccggacgc ttcccgaacc caaccagcgc ttccaagacc 25920
ggtaagaagg atcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc ataagaatgc catcatctcc 25980
tgcttgcatg agtgcggggg caacatatcc ttcacgcggc gctacttgct attccaccat 26040
ggggtgaact ttccgcgcaa tgttttgcat tactaccgtc acctccacag cccctactat 26100
agccagcaaa tcccggcagt ctcgacagat aaagacagcg gcggcgacct ccaacagaaa 26160
accagcagcg gcagttagaa aatacacaac aagtgcagca acaggaggat taaagattac 26220
agccaacgag ccagcgcaaa cccgagagtt aagaaatcgg atctttccaa ccctgtatgc 26280
catcttccag cagagtcggg gtcaagagca ggaactgaaa ataaaaaacc gatctctgcg 26340
ttcgctcacc agaagttgtt tgtatcacaa gagcgaagat caacttcagc gcactctcga 26400
ggacgccgag gctctcttca acaagtactg cgcgctgact cttaaagagt aggcagcgac 26460
cgcgcttatt caaaaaaggc gggaattaca tcatcctcga catgagtaaa gaaattccca 26520
cgccttacat gtggagttat caaccccaaa tgggattggc ggcaggcgcc tcccaggact 26580
actccacccg catgaattgg ctcagcgccg ggccttctat gatttctcga gttaatgata 26640
tacgcgccta ccgaaaccaa atacttttgg aacagtcagc tcttaccacc acgccccgcc 26700
aacaccttaa tcccagaaat tggcccgccg ccctagtgta ccaggaaagt cccgctccca 26760
ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
agttagctgg cggctccacc ctatgtcgtc acaggcctcg gcataatata aaacgcctga 26880
tgatcagagg ccgaggtatc cagctcaacg acgagtcggt gagctctccg cttggtctac 26940
gaccagacgg aatctttcag attgccggct gcgggagatc ttccttcacc cctcgtcagg 27000
ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
aatttgtgga ggagtttact ccctctgtct acttcaaccc cttctccgga tctcctgggc 27120
attacccgga cgagttcata ccgaacttcg acgcgattag cgagtcagtg gacggctacg 27180
attgatgtct ggtgacgcgg ctgagctatc tcggctgcga catctagacc actgccgccg 27240
ctttcgctgc tttgcccggg aactcattga gttcatctac ttcgaactcc ccaaggatca 27300
ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat ttctatcgaa ggcaaaatag actctcgcct 27360
gcaacgaatt ttctcccagc ggcccgtgct gatcgagcga gaccagggaa acaccacggt 27420
ttccatctac tgcatttgta atcaccccgg attgcatgaa agcctttgct gtcttatgtg 27480
tactgagttt aataaaaact gaattaagac tctcctacgg actgccgctt cttcaacccg 27540
gattttacaa ccagaagaac gaaacttttc ctgtcgtcca ggactctgtt aacttcacct 27600
ttcctactca caaactagaa gctcaacgac tacaccgctt ttccagaagc attttcccta 27660
ctaatactac tttcaaaacc ggaggtgagc tccaaggtct tcctacagaa aacccttggg 27720
tggaagcggg ccttgtagtg ctaggaattc ttgcgggtgg gcttgtgatt attctttgct 27780
acctatacac accttgcttc actttcttag tggtgttgtg gtattggttt aaaaaatggg 27840
gcccatacta gtcttgcttg ttttactttc gcttttggaa ccgggttctg ccaattacga 27900
tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 28200
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc caccatggga tggagctgta tcatcctctt 29400
cttggtagca acagctacag gtgtccactc cgaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg 29460
cctggtgcag ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct ataccttcac 29520
caactatggt atgaactggg tccgtcaggc cccgggtaag ggcctggaat gggttggatg 29580
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cactgccgtc tattactgtg caaagtaccc gcactattat gggagcagcc actggtattt 29760
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cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 30000
cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 30060
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cacatgccca ccgtgcccag cacctgagct cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc 30180
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gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag 30360
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cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa 30600
tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt 30660
cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc 30720
atgctccgtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc 30780
tccgggtaaa tgatctagac tcgaggtttc tagaagttgt ctcctcctgc actgactgac 30840
tgacctaacg ttactggccg aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg 30900
ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc 30960
ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg 31020
aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg 31080
accctttgca ggcagcggaa ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca 31140
cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata 31200
gttgtggaaa gagtcaaatg gctcccctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc 31260
cagaaggtac cccattgtat gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg cttttcatgt 31320
gtttagtcga ggttaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt 31380
gaaaaacacg atgataataa catggactgg acctggcgcg tgttttgcct gctcgccgtg 31440
gctcctgggg cccacagcga tatccagatg acccagtccc cgagctccct gtccgcctct 31500
gtgggcgata gggtcaccat cacctgcagc gcaagtcagg atattagcaa ctatttaaac 31560
tggtatcaac agaaaccagg aaaagctccg aaagtcctga tttacttcac ctcctctctc 31620
cactctggag tcccttctcg cttctctgga tccggttctg ggacggattt cactctgacc 31680
atcagcagtc tgcagccaga agacttcgca acttattact gtcaacagta tagcaccgtg 31740
ccgtggacgt ttggacaggg taccaaggtg gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct 31800
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcttc tgttgtgtgc 31860
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 31920
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ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 32040
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 32100
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attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 32220
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aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 32340
aagtaaaacc tctacaaatg tggtagtcgt cagctatcct gcaggaactt gtttatttga 32400
aaatcaattc acaaaatccg agtagttatt ttgcctcccc cttcccattt aacagaatac 32460
accaatctct ccccacgcac agctttaaac atttggatac cattagatat agacatggtt 32520
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tcggacgatt gtgtctcatc aaacccacaa gcagccgctg tctgcgtcgc tccgtgcgac 32760
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tcaactttct ggtgcgatgc gcgcagcaac gcattctgat ttcactcaaa tctttgcagt 32880
aggtacaaca cattattaca atattgttta ataaaccata attaaaagcg ctccagccaa 32940
aactcatatc tgatataatc gcccctgcat gaccatcata ccaaagttta atataaatta 33000
aatgacgttc cctcaaaaac acactaccca catacatgat ctcttttggc atgtgcatat 33060
taacaatctg tctgtaccat ggacaacgtt ggttaatcat gcaacccaat ataaccttcc 33120
ggaaccacac tgccaacacc gctcccccag ccatgcattg aagtgaaccc tgctgattac 33180
aatgacaatg aagaacccaa ttctctcgac cgtgaatcac ttgagaatga aaaatatcta 33240
tagtggcaca acatagacat aaatgcatgc atcttctcat aatttttaac tcctcaggat 33300
ttagaaacat atcccaggga ataggaagct cttgcagaac agtaaagctg gcagaacaag 33360
gaagaccacg aacacaactt acactatgca tagtcatagt atcacaatct ggcaacagcg 33420
ggtggtcttc agtcatagaa gctcgggttt cattttcctc acaacgtggt aactgggctc 33480
tggtgtaagg gtgatgtctg gcgcatgatg tcgagcgtgc gcgcaacctt gtcataatgg 33540
agttgcttcc tgacattctc gtattttgta tagcaaaacg cggccctggc agaacacact 33600
cttcttcgcc ttctatcctg ccgcttagcg tgttccgtgt gatagttcaa gtacaaccac 33660
actcttaagt tggtcaaaag aatgctggct tcagttgtaa tcaaaactcc atcgcatcta 33720
atcgttctga ggaaatcatc caagcaatgc aactggattg tgtttcaagc aggagaggag 33780
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cacatccaag aacaaaagaa taccaaaaga aggagcattt tctaactcct caatcatcat 34020
attacattcc tgcaccattc ccagataatt ttcagctttc cagccttgaa ttattcgtgt 34080
cagttcttgt ggtaaatcca atccacacat tacaaacagg tcccggaggg cgccctccac 34140
caccattctt aaacacaccc tcataatgac aaaatatctt gctcctgtgt cacctgtagc 34200
gaattgagaa tggcaacatc aattgacatg cccttggctc taagttcttc tttaagttct 34260
agttgtaaaa actctctcat attatcacca aactgcttag ccagaagccc cccgggaaca 34320
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acaagattgg aataagcata ttgggaaccg ccagtaatat catcgaagtt gctggaaata 34440
taatcaggca gagtttcttg taaaaattga ataaaagaaa aatttgccaa aaaaacattc 34500
aaaacctctg ggatgcaaat gcaataggtt accgcgctgc gctccaacat tgttagtttt 34560
gaattagtct gcaaaaataa aaaaaaaaac aagcgtcata tcatagtagc ctgacgaaca 34620
gatggataaa tcagtctttc catcacaaga caagccacag ggtctccagc tcgaccctcg 34680
taaaacctgt catcatgatt aaacaacagc accgaaagtt cctcgcggtg accagcatga 34740
ataattcttg atgaagcata caatccagac atgttagcat cagttaacga gaaaaaacag 34800
ccaacatagc ctttgggtat aattatgctt aatcgtaagt atagcaaagc cacccctcgc 34860
ggatacaaag taaaaggcac aggagaataa aaaatataat tatttctctg ctgctgttca 34920
ggcaacgtcg cccccggtcc ctctaaatac acatacaaag cctcatcagc catggcttac 34980
cagacaaagt acagcgggca cacaaagcac aagctctaaa gtgactctcc aacctctcca 35040
caatatatat atacacaagc cctaaactga cgtaatggga gtaaagtgta aaaaatcccg 35100
ccaaacccaa cacacacccc gaaactgcgt caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc 35160
aatcccaaca ggcgtaactt cctctttctc acggtacgtg atatcccact aacttgcaac 35220
gtcattttcc cacggtcgca ccgccccttt tagccgttaa ccccacagcc aatcaccaca 35280
cgatccacac tttttaaaat cacctcattt acatattggc accattccat ctataaggta 35340
tattatatag ataga 35355
<210> 3
<211> 34493
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒组成的病毒基因组序列。所述转基因盒含有SSA、具有5'前导序列的ab重链序列、SSA和具有以下的ab轻链序列
<400> 3
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
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tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
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ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
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gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320
gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380
agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500
gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940
cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000
tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120
tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180
cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240
atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300
acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360
gtgacggcgc ggccgttctc gcgcggtcgc agagtaaaaa caccgccgcg catctcctta 9420
aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480
aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540
aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600
tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660
ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720
gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900
tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020
taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140
agatactggt accctataag aaaatgcggc ggtggttggc ggtagagagg ccatcgttct 10200
gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380
cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560
acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620
gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860
aaagattctc gcgaggcgta tgtgccccaa cagaacctat ttagagacag aagcggcgag 10920
gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980
gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040
cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100
gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220
actagcaaac ctctgaccgc ccagctgttt ctggtggtgc aacacagcag agacaatgag 11280
gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
atcaacattc tacagagtat catagtgcag gagcggagcc tgggcctggc cgagaaggtg 11400
gctgccatca attactcggt tttgagcttg ggaaaatatt acgctcgcaa aatctacaag 11460
actccatacg ttcccataga caaggaggtg aagatagatg ggttctacat gcgcatgacg 11520
ctcaaggtct tgaccctgag cgatgatctt ggggtgtatc gcaatgacag aatgcatcgc 11580
gcggttagcg ccagcaggag gcgcgagtta agcgacaggg aactgatgca cagtttgcaa 11640
agagctctga ctggagctgg aaccgagggt gagaattact tcgacatggg agctgacttg 11700
cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760
atagaagagg cggatgaagg cgaggaggaa gagggcgagt acttggaaga ctgatggcac 11820
aacccgtgtt ttttgctaga tggaacagca agcaccggat cccgcaatgc gggcggcgct 11880
gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
atcggccatc atggaagctg tagtgccttc ccgctctaat cccactcatg agaaggtcct 12060
ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
atacaacgct ctcttagaac gcgtggctcg ctacaacagt agcaatgtgc aaaccaattt 12180
ggaccgtatg ataacagatg tacgcgaagc cgtgtctcag cgcgaaaggt tccagcgtga 12240
tgccaacctg ggttcgctgg tggcgttaaa tgctttcttg agtactcagc ctgctaatgt 12300
gccgcgtggt caacaggatt atactaactt tttaagtgct ttgagactga tggtatcaga 12360
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ctatcaagaa attacccaag tcagtcgcgc tttgggacag gaagacactg gcagtttgga 12720
agccactctg aacttcttgc ttaccaatcg gtctcaaaag atccctcctc aatatgctct 12780
tactgcggag gaggagagga tccttagata tgtgcagcag agcgtgggat tgtttctgat 12840
gcaagagggg gcaactccga ctgcagcact ggacatgaca gcgcgaaata tggagcccag 12900
catgtatgcc agtaaccgac ctttcattaa caaactgctg gactacttgc acagagctgc 12960
cgctatgaac tctgattatt tcaccaatgc catcttaaac ccgcactggc tgcccccacc 13020
tggtttctac acgggcgaat atgacatgcc cgaccctaat gacggatttc tgtgggacga 13080
cgtggacagc gatgtttttt cacctctttc tgatcatcgc acgtggaaaa aggaaggcgg 13140
cgatagaatg cattcttctg catcgctgtc cggggtcatg ggtgctaccg cggctgagcc 13200
cgagtctgca agtccttttc ctagtctacc cttttctcta cacagtgtac gtagcagcga 13260
agtgggtaga ataagtcgcc cgagtttaat gggcgaagag gagtatctaa acgattcctt 13320
gctcagaccg gcaagagaaa aaaatttccc aaacaatgga atagaaagtt tggtggataa 13380
aatgagtaga tggaagactt atgctcagga tcacagagac gagcctggga tcatggggat 13440
tacaagtaga gcgagccgta gacgccagcg ccatgacaga cagaggggtc ttgtgtggga 13500
cgatgaggat tcggccgatg atagcagcgt gctggacttg ggtgggagag gaaggggcaa 13560
cccgtttgct catttgcgcc ctcgcttggg tggtatgttg taaaaaaaaa taaaaaaaaa 13620
actcaccaag gccatggcga cgagcgtacg ttcgttcttc tttattatct gtgtctagta 13680
taatgaggcg agtcgtgcta ggcggagcgg tggtgtatcc ggagggtcct cctccttcgt 13740
acgagagcgt gatgcagcag cagcaggcga cggcggtgat gcaatcccca ctggaggctc 13800
cctttgtgcc tccgcgatac ctggcaccta cggagggcag aaacagcatt cgttattcgg 13860
aactggcacc tcagtacgat accaccaggt tgtatctggt ggacaacaag tcggcggaca 13920
ttgcttctct gaactatcag aatgaccaca gcaacttctt gaccacggtg gtgcaaaaca 13980
atgactttac ccctacggaa gccagcaccc agaccattaa ctttgatgaa cgatcgcggt 14040
ggggcggtca gctaaagacc atcatgcata ctaacatgcc aaacgtgaac gagtatatgt 14100
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ttggggatac ttatgatcac aagcaggata ttttgaaata tgagtggttc gagtttactt 14220
tgccagaagg caacttttca gttactatga ctattgattt gatgaacaat gccatcatag 14280
ataattactt gaaagtgggt agacagaatg gagtgcttga aagtgacatt ggtgttaagt 14340
tcgacaccag gaacttcaag ctgggatggg atcccgaaac caagttgatc atgcctggag 14400
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ttaccgagag tcgtttgagc aaccttcttg gtatcagaaa aaaacagcca tttcaagagg 14520
gttttaagat tttgtatgaa gatttagaag gtggtaatat tccggccctc ttggatgtag 14580
atgcctatga gaacagtaag aaagaacaaa aagccaaaat agaagctgct acagctgctg 14640
cagaagctaa ggcaaacata gttgccagcg actctacaag ggttgctaac gctggagagg 14700
tcagaggaga caattttgcg ccaacacctg ttccgactgc agaatcatta ttggccgatg 14760
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gaagctataa tgtgttggaa gacaaaatca acacagccta tcgcagttgg tatctttcgt 14880
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gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc accatgggat ggagctgtat catcctcttc 29400
ttggtagcaa cagctacagg tgtccactcc gaggttcagc tggtggagtc tggcggtggc 29460
ctggtgcagc cagggggctc actccgtttg tcctgtgcag cttctggcta taccttcacc 29520
aactatggta tgaactgggt ccgtcaggcc ccgggtaagg gcctggaatg ggttggatgg 29580
attaacacct ataccggtga accgacctat gctgcggatt tcaaacgtcg ttttactttt 29640
tctctggaca cctccaagag cacagcttac ctgcagatga acagcctgcg cgctgaggac 29700
actgccgtct attactgtgc aaagtacccg cactattatg ggagcagcca ctggtatttc 29760
gacgtctggg gtcaaggaac cctggtcacc gtctcctcgg cctccaccaa gggcccatcg 29820
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 29880
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 29940
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 30000
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 30060
aagcccagca acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 30120
acatgcccac cgtgcccagc acctgagctc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 30180
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 30240
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 30300
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 30360
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 30420
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 30480
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 30540
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 30600
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 30660
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 30720
tgctccgtga tgcacgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 30780
ccgggtaaat gatctagact cgagcaggcg agcatggact ggacctggcg cgtgttttgc 30840
ctgctcgccg tggctcctgg ggcccacagc gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc 30900
ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc atcacctgca gcgcaagtca ggatattagc 30960
aactatttaa actggtatca acagaaacca ggaaaagctc cgaaagtcct gatttacttc 31020
acctcctctc tccactctgg agtcccttct cgcttctctg gatccggttc tgggacggat 31080
ttcactctga ccatcagcag tctgcagcca gaagacttcg caacttatta ctgtcaacag 31140
tatagcaccg tgccgtggac gtttggacag ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg 31200
gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct 31260
tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 31320
gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 31380
agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 31440
gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 31500
aggggagagt gttaacctgc aggaacttgt ttatttgaaa atcaattcac aaaatccgag 31560
tagttatttt gcctccccct tcccatttaa cagaatacac caatctctcc ccacgcacag 31620
ctttaaacat ttggatacca ttagatatag acatggtttt agattccaca ttccaaacag 31680
tttcagagcg agccaatctg gggtcagtga tagataaaaa tccatcggga tagtctttta 31740
aagcgctttc acagtccaac tgctgcggat gcgactccgg agtctggatc acggtcatct 31800
ggaagaagaa cgatgggaat cataatccga aaacggtatc ggacgattgt gtctcatcaa 31860
acccacaagc agccgctgtc tgcgtcgctc cgtgcgactg ctgtttatgg gatcagggtc 31920
cacagtgtcc tgaagcatga ttttaatagc ccttaacatc aactttctgg tgcgatgcgc 31980
gcagcaacgc attctgattt cactcaaatc tttgcagtag gtacaacaca ttattacaat 32040
attgtttaat aaaccataat taaaagcgct ccagccaaaa ctcatatctg atataatcgc 32100
ccctgcatga ccatcatacc aaagtttaat ataaattaaa tgacgttccc tcaaaaacac 32160
actacccaca tacatgatct cttttggcat gtgcatatta acaatctgtc tgtaccatgg 32220
acaacgttgg ttaatcatgc aacccaatat aaccttccgg aaccacactg ccaacaccgc 32280
tcccccagcc atgcattgaa gtgaaccctg ctgattacaa tgacaatgaa gaacccaatt 32340
ctctcgaccg tgaatcactt gagaatgaaa aatatctata gtggcacaac atagacataa 32400
atgcatgcat cttctcataa tttttaactc ctcaggattt agaaacatat cccagggaat 32460
aggaagctct tgcagaacag taaagctggc agaacaagga agaccacgaa cacaacttac 32520
actatgcata gtcatagtat cacaatctgg caacagcggg tggtcttcag tcatagaagc 32580
tcgggtttca ttttcctcac aacgtggtaa ctgggctctg gtgtaagggt gatgtctggc 32640
gcatgatgtc gagcgtgcgc gcaaccttgt cataatggag ttgcttcctg acattctcgt 32700
attttgtata gcaaaacgcg gccctggcag aacacactct tcttcgcctt ctatcctgcc 32760
gcttagcgtg ttccgtgtga tagttcaagt acaaccacac tcttaagttg gtcaaaagaa 32820
tgctggcttc agttgtaatc aaaactccat cgcatctaat cgttctgagg aaatcatcca 32880
agcaatgcaa ctggattgtg tttcaagcag gagaggagag ggaagagacg gaagaaccat 32940
gttaattttt attccaaacg atctcgcagt acttcaaatt gtagatcgcg cagatggcat 33000
ctctcgcccc cactgtgttg gtgaaaaagc acagctagat caaaagaaat gcgattttca 33060
aggtgctcaa cggtggcttc cagcaaagcc tccacgcgca catccaagaa caaaagaata 33120
ccaaaagaag gagcattttc taactcctca atcatcatat tacattcctg caccattccc 33180
agataatttt cagctttcca gccttgaatt attcgtgtca gttcttgtgg taaatccaat 33240
ccacacatta caaacaggtc ccggagggcg ccctccacca ccattcttaa acacaccctc 33300
ataatgacaa aatatcttgc tcctgtgtca cctgtagcga attgagaatg gcaacatcaa 33360
ttgacatgcc cttggctcta agttcttctt taagttctag ttgtaaaaac tctctcatat 33420
tatcaccaaa ctgcttagcc agaagccccc cgggaacaag agcaggggac gctacagtgc 33480
agtacaagcg cagacctccc caattggctc cagcaaaaac aagattggaa taagcatatt 33540
gggaaccgcc agtaatatca tcgaagttgc tggaaatata atcaggcaga gtttcttgta 33600
aaaattgaat aaaagaaaaa tttgccaaaa aaacattcaa aacctctggg atgcaaatgc 33660
aataggttac cgcgctgcgc tccaacattg ttagttttga attagtctgc aaaaataaaa 33720
aaaaaaacaa gcgtcatatc atagtagcct gacgaacaga tggataaatc agtctttcca 33780
tcacaagaca agccacaggg tctccagctc gaccctcgta aaacctgtca tcatgattaa 33840
acaacagcac cgaaagttcc tcgcggtgac cagcatgaat aattcttgat gaagcataca 33900
atccagacat gttagcatca gttaacgaga aaaaacagcc aacatagcct ttgggtataa 33960
ttatgcttaa tcgtaagtat agcaaagcca cccctcgcgg atacaaagta aaaggcacag 34020
gagaataaaa aatataatta tttctctgct gctgttcagg caacgtcgcc cccggtccct 34080
ctaaatacac atacaaagcc tcatcagcca tggcttacca gacaaagtac agcgggcaca 34140
caaagcacaa gctctaaagt gactctccaa cctctccaca atatatatat acacaagccc 34200
taaactgacg taatgggagt aaagtgtaaa aaatcccgcc aaacccaaca cacaccccga 34260
aactgcgtca ccagggaaaa gtacagtttc acttccgcaa tcccaacagg cgtaacttcc 34320
tctttctcac ggtacgtgat atcccactaa cttgcaacgt cattttccca cggtcgcacc 34380
gcccctttta gccgttaacc ccacagccaa tcaccacacg atccacactt tttaaaatca 34440
cctcatttac atattggcac cattccatct ataaggtata ttatatagat aga 34493
<210> 4
<211> 34754
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒组成的病毒基因组序列。
<400> 4
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
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gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
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tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
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tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
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agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
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gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
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cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
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tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
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aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480
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tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660
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tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
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gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
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taactggagt gccaaacaac atgcttcatt ctcctaaagt ccagcccacc ctgtgtgaca 21660
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<210> 5
<211> 33442
<212> DNA
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<220>
<223> NG-74病毒基因组序列
<400> 5
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ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
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caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
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gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
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agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
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tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
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cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
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gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
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gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
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tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
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ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
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aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
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tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
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cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
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tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
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ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
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cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320
gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380
agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
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gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
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ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
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acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940
cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000
tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120
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cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240
atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300
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aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540
aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600
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ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720
gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
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tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020
taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140
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gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
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ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380
cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560
acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620
gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860
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gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980
gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040
cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100
gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
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gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
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gccgcgtggt caacaggatt atactaactt tttaagtgct ttgagactga tggtatcaga 12360
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attattactg ttggtagctc ctttcaccga cagcggtagc atcgaccgta attcctattt 12600
gggttaccta ctaaacctgt atcgcgaagc catagggcaa agtcaggtgg acgagcagac 12660
ctatcaagaa attacccaag tcagtcgcgc tttgggacag gaagacactg gcagtttgga 12720
agccactctg aacttcttgc ttaccaatcg gtctcaaaag atccctcctc aatatgctct 12780
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cgctatgaac tctgattatt tcaccaatgc catcttaaac ccgcactggc tgcccccacc 13020
tggtttctac acgggcgaat atgacatgcc cgaccctaat gacggatttc tgtgggacga 13080
cgtggacagc gatgtttttt cacctctttc tgatcatcgc acgtggaaaa aggaaggcgg 13140
cgatagaatg cattcttctg catcgctgtc cggggtcatg ggtgctaccg cggctgagcc 13200
cgagtctgca agtccttttc ctagtctacc cttttctcta cacagtgtac gtagcagcga 13260
agtgggtaga ataagtcgcc cgagtttaat gggcgaagag gagtatctaa acgattcctt 13320
gctcagaccg gcaagagaaa aaaatttccc aaacaatgga atagaaagtt tggtggataa 13380
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tacaagtaga gcgagccgta gacgccagcg ccatgacaga cagaggggtc ttgtgtggga 13500
cgatgaggat tcggccgatg atagcagcgt gctggacttg ggtgggagag gaaggggcaa 13560
cccgtttgct catttgcgcc ctcgcttggg tggtatgttg taaaaaaaaa taaaaaaaaa 13620
actcaccaag gccatggcga cgagcgtacg ttcgttcttc tttattatct gtgtctagta 13680
taatgaggcg agtcgtgcta ggcggagcgg tggtgtatcc ggagggtcct cctccttcgt 13740
acgagagcgt gatgcagcag cagcaggcga cggcggtgat gcaatcccca ctggaggctc 13800
cctttgtgcc tccgcgatac ctggcaccta cggagggcag aaacagcatt cgttattcgg 13860
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tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 28200
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgctgctaa tcctttctct cttcaggcca ccatgggatg 29400
gagctgtatc atcctcttct tggtagcaac agctacaggt gtccactccg aggttcagct 29460
ggtggagtct ggcggtggcc tggtgcagcc agggggctca ctccgtttgt cctgtgcagc 29520
ttctggctat accttcacca actatggtat gaactgggtc cgtcaggccc cgggtaaggg 29580
cctggaatgg gttggatgga ttaacaccta taccggtgaa ccgacctatg ctgcggattt 29640
caaacgtcgt tttacttttt ctctggacac ctccaagagc acagcttacc tgcagatgaa 29700
cagcctgcgc gctgaggaca ctgccgtcta ttactgtgca aagtacccgc actattatgg 29760
gagcagccac tggtatttcg acgtctgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcctcggg 29820
tggcggtggc tcgggcggtg gtggatctgg tggcggcgga tctgatatcc agatgaccca 29880
gtccccgagc tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc accatcacct gcagcgcaag 29940
tcaggatatt agcaactatt taaactggta tcaacagaaa ccaggaaaag ctccgaaagt 30000
cctgatttac ttcacctcct ctctccactc tggagtccct tctcgcttct ctggatccgg 30060
ttctgggacg gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag ccagaagact tcgcaactta 30120
ttactgtcaa cagtatagca ccgtgccgtg gacgtttgga cagggtacca aggtggagat 30180
caaacgataa gctagcttga ctgactgaga tacagcgtac cttcagctca cagacatgat 30240
aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat 30300
ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt 30360
taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt 30420
ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg tagtcgtcag ctatcctgca ggaacttgtt 30480
tatttgaaaa tcaattcaca aaatccgagt agttattttg cctccccctt cccatttaac 30540
agaatacacc aatctctccc cacgcacagc tttaaacatt tggataccat tagatataga 30600
catggtttta gattccacat tccaaacagt ttcagagcga gccaatctgg ggtcagtgat 30660
agataaaaat ccatcgggat agtcttttaa agcgctttca cagtccaact gctgcggatg 30720
cgactccgga gtctggatca cggtcatctg gaagaagaac gatgggaatc ataatccgaa 30780
aacggtatcg gacgattgtg tctcatcaaa cccacaagca gccgctgtct gcgtcgctcc 30840
gtgcgactgc tgtttatggg atcagggtcc acagtgtcct gaagcatgat tttaatagcc 30900
cttaacatca actttctggt gcgatgcgcg cagcaacgca ttctgatttc actcaaatct 30960
ttgcagtagg tacaacacat tattacaata ttgtttaata aaccataatt aaaagcgctc 31020
cagccaaaac tcatatctga tataatcgcc cctgcatgac catcatacca aagtttaata 31080
taaattaaat gacgttccct caaaaacaca ctacccacat acatgatctc ttttggcatg 31140
tgcatattaa caatctgtct gtaccatgga caacgttggt taatcatgca acccaatata 31200
accttccgga accacactgc caacaccgct cccccagcca tgcattgaag tgaaccctgc 31260
tgattacaat gacaatgaag aacccaattc tctcgaccgt gaatcacttg agaatgaaaa 31320
atatctatag tggcacaaca tagacataaa tgcatgcatc ttctcataat ttttaactcc 31380
tcaggattta gaaacatatc ccagggaata ggaagctctt gcagaacagt aaagctggca 31440
gaacaaggaa gaccacgaac acaacttaca ctatgcatag tcatagtatc acaatctggc 31500
aacagcgggt ggtcttcagt catagaagct cgggtttcat tttcctcaca acgtggtaac 31560
tgggctctgg tgtaagggtg atgtctggcg catgatgtcg agcgtgcgcg caaccttgtc 31620
ataatggagt tgcttcctga cattctcgta ttttgtatag caaaacgcgg ccctggcaga 31680
acacactctt cttcgccttc tatcctgccg cttagcgtgt tccgtgtgat agttcaagta 31740
caaccacact cttaagttgg tcaaaagaat gctggcttca gttgtaatca aaactccatc 31800
gcatctaatc gttctgagga aatcatccaa gcaatgcaac tggattgtgt ttcaagcagg 31860
agaggagagg gaagagacgg aagaaccatg ttaattttta ttccaaacga tctcgcagta 31920
cttcaaattg tagatcgcgc agatggcatc tctcgccccc actgtgttgg tgaaaaagca 31980
cagctagatc aaaagaaatg cgattttcaa ggtgctcaac ggtggcttcc agcaaagcct 32040
ccacgcgcac atccaagaac aaaagaatac caaaagaagg agcattttct aactcctcaa 32100
tcatcatatt acattcctgc accattccca gataattttc agctttccag ccttgaatta 32160
ttcgtgtcag ttcttgtggt aaatccaatc cacacattac aaacaggtcc cggagggcgc 32220
cctccaccac cattcttaaa cacaccctca taatgacaaa atatcttgct cctgtgtcac 32280
ctgtagcgaa ttgagaatgg caacatcaat tgacatgccc ttggctctaa gttcttcttt 32340
aagttctagt tgtaaaaact ctctcatatt atcaccaaac tgcttagcca gaagcccccc 32400
gggaacaaga gcaggggacg ctacagtgca gtacaagcgc agacctcccc aattggctcc 32460
agcaaaaaca agattggaat aagcatattg ggaaccgcca gtaatatcat cgaagttgct 32520
ggaaatataa tcaggcagag tttcttgtaa aaattgaata aaagaaaaat ttgccaaaaa 32580
aacattcaaa acctctggga tgcaaatgca ataggttacc gcgctgcgct ccaacattgt 32640
tagttttgaa ttagtctgca aaaataaaaa aaaaaacaag cgtcatatca tagtagcctg 32700
acgaacagat ggataaatca gtctttccat cacaagacaa gccacagggt ctccagctcg 32760
accctcgtaa aacctgtcat catgattaaa caacagcacc gaaagttcct cgcggtgacc 32820
agcatgaata attcttgatg aagcatacaa tccagacatg ttagcatcag ttaacgagaa 32880
aaaacagcca acatagcctt tgggtataat tatgcttaat cgtaagtata gcaaagccac 32940
ccctcgcgga tacaaagtaa aaggcacagg agaataaaaa atataattat ttctctgctg 33000
ctgttcaggc aacgtcgccc ccggtccctc taaatacaca tacaaagcct catcagccat 33060
ggcttaccag acaaagtaca gcgggcacac aaagcacaag ctctaaagtg actctccaac 33120
ctctccacaa tatatatata cacaagccct aaactgacgt aatgggagta aagtgtaaaa 33180
aatcccgcca aacccaacac acaccccgaa actgcgtcac cagggaaaag tacagtttca 33240
cttccgcaat cccaacaggc gtaacttcct ctttctcacg gtacgtgata tcccactaac 33300
ttgcaacgtc attttcccac ggtcgcaccg ccccttttag ccgttaaccc cacagccaat 33360
caccacacga tccacacttt ttaaaatcac ctcatttaca tattggcacc attccatcta 33420
taaggtatat tatatagata ga 33442
<210> 6
<211> 33460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-78病毒基因组序列
<400> 6
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
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gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
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tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
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agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500
gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
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ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
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ggatctgcaa tcatgcccac atccagatct tcagcattgg caatgctgaa cggggtcatc 22200
ttgcaggtct gcctacccat ggcgggcacc caattaggct tgtggttgca atcgcagtgc 22260
agggggatca gtatcatctt ggcctgatcc tgtctgattc ctggatacac ggctctcatg 22320
aaagcatcat attgcttgaa agcctgctgg gctttactac cctcggtata aaacatcccg 22380
caggacctgc tcgaaaactg gttagctgca cagccggcat cattcacaca gcagcgggcg 22440
tcattgttag ctatttgcac cacacttctg ccccagcggt tttgggtgat tttggttcgc 22500
tcgggattct cctttaaggc tcgttgtccg ttctcgctgg ccacatccat ctcgataatc 22560
tgctccttct gaatcataat attgccatgc aggcacttca gcttgccctc ataatcattg 22620
cagccatgag gccacaacgc acagcctgta cattcccaat tatggtgggc gatctgagaa 22680
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gtgaaagtta actggatgcc tcggtgctcc tcgtttacgt actggtgaca gatgcgcttg 22800
tattgttcgt gttgctcagg cattagttta aaagaggttc taagttcgtt atccagcctg 22860
tacttctcca tcagcagaca catcacttcc atgcctttct cccaagcaga caccaggggc 22920
aagctaatcg gattcttaac agtgcaggca gcagctcctt tagccagagg gtcatcttta 22980
gcgatcttct caatgcttct tttgccatcc ttctcaacga tgcgcacggg cgggtagctg 23040
aaacccactg ctacaagttg cgcctcttct ctttcttctt cgctgtcttg actgatgtct 23100
tgcatgggga tatgtttggt cttccttggc ttctttttgg ggggtatcgg aggaggagga 23160
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catatcccgc tgtcaacctg ccccctaaag tcatgacggc ggtcatggac cagttactca 24360
ttaagcgcgc aagtcccctt tcagaagaca tgcatgaccc agatgcctgt gatgagggta 24420
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ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
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atctctccta ccactcggat gtgatcgagg atgtgagcgg agacggcttg ctggagtgtc 25200
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ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
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<210> 7
<211> 34117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-76病毒基因组序列
<400> 7
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
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ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
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aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
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ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
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cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
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gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
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ggcggctgac cgattaggcg agtttgctta tggcaagcgt agtagaataa cttccaagga 16380
tgagacagtg tcgataccct tggatcatgg aaatcccacc cctagtctta aaccggtcac 16440
tttgcagcaa gtgttacccg taactccgcg aacaggtgtt aaacgcgaag gtgaagattt 16500
gtatcccact atgcaactga tggtacccaa acgccagaag ttggaggacg ttttggagaa 16560
agtaaaagtg gatccagata ttcaacctga ggttaaagtg agacccatta agcaggtagc 16620
gcctggtctg ggggtacaaa ctgtagacat taagattccc actgaaagta tggaagtgca 16680
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ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct gtgcagcttc 30180
tggctatacc ttcaccaact atggtatgaa ctgggtccgt caggccccgg gtaagggcct 30240
ggaatgggtt ggatggatta acacctatac cggtgaaccg acctatgctg cggatttcaa 30300
acgtcgtttt actttttctc tggacacctc caagagcaca gcttacctgc agatgaacag 30360
cctgcgcgct gaggacactg ccgtctatta ctgtgcaaag tacccgcact attatgggag 30420
cagccactgg tatttcgacg tctggggtca aggaaccctg gtcaccgtct cctcgggtgg 30480
cggtggctcg ggcggtggtg gatctggtgg cggcggatct gatatccaga tgacccagtc 30540
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ggatattagc aactatttaa actggtatca acagaaacca ggaaaagctc cgaaagtcct 30660
gatttacttc acctcctctc tccactctgg agtcccttct cgcttctctg gatccggttc 30720
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ctgcaggaac ttgtttattt gaaaatcaat tcacaaaatc cgagtagtta ttttgcctcc 31200
cccttcccat ttaacagaat acaccaatct ctccccacgc acagctttaa acatttggat 31260
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atctcttttg gcatgtgcat attaacaatc tgtctgtacc atggacaacg ttggttaatc 31860
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aaccccacag ccaatcacca cacgatccac actttttaaa atcacctcat ttacatattg 34080
gcaccattcc atctataagg tatattatat agataga 34117
<210> 8
<211> 34099
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-73病毒基因组序列
<400> 8
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
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gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
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atgacatgca gaataaaaaa gcgaaagagt ctgagacaga catcgagcaa gacccgggct 23640
atgtgacacc ggtggaacac gaggaagagt tgaaacgctt tctagagaga gaggatgaaa 23700
actgcccaaa acaacgagca gataactatc accaagatgc tggaaatagg gatcagaaca 23760
ccgactacct catagggctt gacggggaag acgcgctcct taaacatcta gcaagacagt 23820
cgctcatagt caaggatgca ttattggaca gaactgaagt gcccatcagt gtggaagagc 23880
tcagccgcgc ctacgagctt aacctctttt cacctcgtac tccccccaaa cgtcagccaa 23940
acggcacctg cgagccaaat cctcgcttaa acttttatcc agcttttgct gtgccagaag 24000
tactggctac ctatcacatc ttttttaaaa atcaaaaaat tccagtctcc tgccgcgcta 24060
atcgcacccg cgccgatgcc ctactcaatc tgggacctgg ttcacgctta cctgatatag 24120
cttccttgga agaggttcca aagatcttcg agggtctggg caataatgag actcgggccg 24180
caaatgctct gcaaaaggga gaaaatggca tggatgagca tcacagcgtt ctggtggaat 24240
tggaaggcga taatgccaga ctcgcagtac tcaagcgaag catcgaggtc acacacttcg 24300
catatcccgc tgtcaacctg ccccctaaag tcatgacggc ggtcatggac cagttactca 24360
ttaagcgcgc aagtcccctt tcagaagaca tgcatgaccc agatgcctgt gatgagggta 24420
aaccagtggt cagtgatgag cagctaaccc gatggctggg caccgactct cccagggatt 24480
tggaagagcg tcgcaagctt atgatggccg tggtgctggt taccgtagaa ctagagtgtc 24540
tccgacgttt ctttaccgat tcagaaacct tgcgcaaact cgaagagaat ctgcactaca 24600
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tggtttccta catgggtatt ctgcatgaga atcgcctagg acaaagcgtg ctgcacagca 24720
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ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
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atctctccta ccactcggat gtgatcgagg atgtgagcgg agacggcttg ctggagtgtc 25200
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gcgaaaccca gataataggc acctttgaat tgcaaggccc cagcagccaa ggcgatgggt 25320
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agtttgctcc ggaagattac cacccctatg aaatcaagtt ctatgaggac caatcacagc 25440
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gctgcggaga caagcaacag cgctaccatc tccgctccga gtcgaggaac ccggcggcgt 25860
cccagcagta gatgggacga gaccggacgc ttcccgaacc caaccagcgc ttccaagacc 25920
ggtaagaagg atcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc ataagaatgc catcatctcc 25980
tgcttgcatg agtgcggggg caacatatcc ttcacgcggc gctacttgct attccaccat 26040
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catcttccag cagagtcggg gtcaagagca ggaactgaaa ataaaaaacc gatctctgcg 26340
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ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
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ctttcgctgc tttgcccggg aactcattga gttcatctac ttcgaactcc ccaaggatca 27300
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cggccgctgc caagcttccg agctctcgaa ttcaaaggag gtacccacca tgggatggag 30060
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atattaacaa tctgtctgta ccatggacaa cgttggttaa tcatgcaacc caatataacc 31860
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cactcttctt cgccttctat cctgccgctt agcgtgttcc gtgtgatagt tcaagtacaa 32400
ccacactctt aagttggtca aaagaatgct ggcttcagtt gtaatcaaaa ctccatcgca 32460
tctaatcgtt ctgaggaaat catccaagca atgcaactgg attgtgtttc aagcaggaga 32520
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ctagatcaaa agaaatgcga ttttcaaggt gctcaacggt ggcttccagc aaagcctcca 32700
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ctcgtaaaac ctgtcatcat gattaaacaa cagcaccgaa agttcctcgc ggtgaccagc 33480
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ttaccagaca aagtacagcg ggcacacaaa gcacaagctc taaagtgact ctccaacctc 33780
tccacaatat atatatacac aagccctaaa ctgacgtaat gggagtaaag tgtaaaaaat 33840
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ccgcaatccc aacaggcgta acttcctctt tctcacggta cgtgatatcc cactaacttg 33960
caacgtcatt ttcccacggt cgcaccgccc cttttagccg ttaaccccac agccaatcac 34020
cacacgatcc acacttttta aaatcacctc atttacatat tggcaccatt ccatctataa 34080
ggtatattat atagataga 34099
<210> 9
<211> 36030
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG-134病毒基因组序列
<400> 9
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
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cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
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taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
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tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
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gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
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tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
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tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
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caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
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ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
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tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
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ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900
tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
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ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
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gccttcgcgt tcccatcact ggttaccgag gaagaaactc gcgccgtaga agagggatgt 17160
tgggacgcgg aatgcgacgc tacaggcgac ggcgtgctat ccgcaagcaa ttgcggggtg 17220
gttttttacc agccttaatt ccaattatcg ctgctgcaat tggcgcgata ccaggcatag 17280
cttccgtggc ggttcaggcc tcgcaacgac attgacattg gaaaaaaacg tataaataaa 17340
aaaaaaaaaa tacaatggac tctgacactc ctggtcctgt gactatgttt tcttagagat 17400
ggaagacatc aatttttcat ccttggctcc gcgacacggc acgaagccgt acatgggcac 17460
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ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gagctcctgg ggggaccgtc 30840
agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt 30900
cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt 30960
ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac 31020
gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta 31080
caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc 31140
caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac 31200
caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt 31260
ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 31320
ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 31380
ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca cgaggctctg cacaaccact acacgcagaa 31440
gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgatc tagactcgag gtttctagaa gttgtctcct 31500
cctgcactga ctgactgacc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata aggccggtgt 31560
gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt gagggcccgg 31620
aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct cgccaaagga 31680
atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc ttgaagacaa 31740
acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga caggtgcctc 31800
tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc ccagtgccac 31860
gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctcc cctcaagcgt attcaacaag 31920
gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg gcctcggtgc 31980
acatgctttt catgtgttta gtcgaggtta aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg 32040
acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aataacatgg actggacctg gcgcgtgttt 32100
tgcctgctcg ccgtggctcc tggggcccac agcgatatcc agatgaccca gtccccgagc 32160
tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc accatcacct gcagcgcaag tcaggatatt 32220
agcaactatt taaactggta tcaacagaaa ccaggaaaag ctccgaaagt cctgatttac 32280
ttcacctcct ctctccactc tggagtccct tctcgcttct ctggatccgg ttctgggacg 32340
gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag ccagaagact tcgcaactta ttactgtcaa 32400
cagtatagca ccgtgccgtg gacgtttgga cagggtacca aggtggagat caaacgaact 32460
gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 32520
gcttctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 32580
gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 32640
gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 32700
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 32760
aacaggggag agtgttaagc tagcttgact gactgagata cagcgtacct tcagctcaca 32820
gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 32880
tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat 32940
aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 33000
gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta gtcgtcagct atcctgcagg 33060
aacttgttta tttgaaaatc aattcacaaa atccgagtag ttattttgcc tcccccttcc 33120
catttaacag aatacaccaa tctctcccca cgcacagctt taaacatttg gataccatta 33180
gatatagaca tggttttaga ttccacattc caaacagttt cagagcgagc caatctgggg 33240
tcagtgatag ataaaaatcc atcgggatag tcttttaaag cgctttcaca gtccaactgc 33300
tgcggatgcg actccggagt ctggatcacg gtcatctgga agaagaacga tgggaatcat 33360
aatccgaaaa cggtatcgga cgattgtgtc tcatcaaacc cacaagcagc cgctgtctgc 33420
gtcgctccgt gcgactgctg tttatgggat cagggtccac agtgtcctga agcatgattt 33480
taatagccct taacatcaac tttctggtgc gatgcgcgca gcaacgcatt ctgatttcac 33540
tcaaatcttt gcagtaggta caacacatta ttacaatatt gtttaataaa ccataattaa 33600
aagcgctcca gccaaaactc atatctgata taatcgcccc tgcatgacca tcataccaaa 33660
gtttaatata aattaaatga cgttccctca aaaacacact acccacatac atgatctctt 33720
ttggcatgtg catattaaca atctgtctgt accatggaca acgttggtta atcatgcaac 33780
ccaatataac cttccggaac cacactgcca acaccgctcc cccagccatg cattgaagtg 33840
aaccctgctg attacaatga caatgaagaa cccaattctc tcgaccgtga atcacttgag 33900
aatgaaaaat atctatagtg gcacaacata gacataaatg catgcatctt ctcataattt 33960
ttaactcctc aggatttaga aacatatccc agggaatagg aagctcttgc agaacagtaa 34020
agctggcaga acaaggaaga ccacgaacac aacttacact atgcatagtc atagtatcac 34080
aatctggcaa cagcgggtgg tcttcagtca tagaagctcg ggtttcattt tcctcacaac 34140
gtggtaactg ggctctggtg taagggtgat gtctggcgca tgatgtcgag cgtgcgcgca 34200
accttgtcat aatggagttg cttcctgaca ttctcgtatt ttgtatagca aaacgcggcc 34260
ctggcagaac acactcttct tcgccttcta tcctgccgct tagcgtgttc cgtgtgatag 34320
ttcaagtaca accacactct taagttggtc aaaagaatgc tggcttcagt tgtaatcaaa 34380
actccatcgc atctaatcgt tctgaggaaa tcatccaagc aatgcaactg gattgtgttt 34440
caagcaggag aggagaggga agagacggaa gaaccatgtt aatttttatt ccaaacgatc 34500
tcgcagtact tcaaattgta gatcgcgcag atggcatctc tcgcccccac tgtgttggtg 34560
aaaaagcaca gctagatcaa aagaaatgcg attttcaagg tgctcaacgg tggcttccag 34620
caaagcctcc acgcgcacat ccaagaacaa aagaatacca aaagaaggag cattttctaa 34680
ctcctcaatc atcatattac attcctgcac cattcccaga taattttcag ctttccagcc 34740
ttgaattatt cgtgtcagtt cttgtggtaa atccaatcca cacattacaa acaggtcccg 34800
gagggcgccc tccaccacca ttcttaaaca caccctcata atgacaaaat atcttgctcc 34860
tgtgtcacct gtagcgaatt gagaatggca acatcaattg acatgccctt ggctctaagt 34920
tcttctttaa gttctagttg taaaaactct ctcatattat caccaaactg cttagccaga 34980
agccccccgg gaacaagagc aggggacgct acagtgcagt acaagcgcag acctccccaa 35040
ttggctccag caaaaacaag attggaataa gcatattggg aaccgccagt aatatcatcg 35100
aagttgctgg aaatataatc aggcagagtt tcttgtaaaa attgaataaa agaaaaattt 35160
gccaaaaaaa cattcaaaac ctctgggatg caaatgcaat aggttaccgc gctgcgctcc 35220
aacattgtta gttttgaatt agtctgcaaa aataaaaaaa aaaacaagcg tcatatcata 35280
gtagcctgac gaacagatgg ataaatcagt ctttccatca caagacaagc cacagggtct 35340
ccagctcgac cctcgtaaaa cctgtcatca tgattaaaca acagcaccga aagttcctcg 35400
cggtgaccag catgaataat tcttgatgaa gcatacaatc cagacatgtt agcatcagtt 35460
aacgagaaaa aacagccaac atagcctttg ggtataatta tgcttaatcg taagtatagc 35520
aaagccaccc ctcgcggata caaagtaaaa ggcacaggag aataaaaaat ataattattt 35580
ctctgctgct gttcaggcaa cgtcgccccc ggtccctcta aatacacata caaagcctca 35640
tcagccatgg cttaccagac aaagtacagc gggcacacaa agcacaagct ctaaagtgac 35700
tctccaacct ctccacaata tatatataca caagccctaa actgacgtaa tgggagtaaa 35760
gtgtaaaaaa tcccgccaaa cccaacacac accccgaaac tgcgtcacca gggaaaagta 35820
cagtttcact tccgcaatcc caacaggcgt aacttcctct ttctcacggt acgtgatatc 35880
ccactaactt gcaacgtcat tttcccacgg tcgcaccgcc ccttttagcc gttaacccca 35940
cagccaatca ccacacgatc cacacttttt aaaatcacct catttacata ttggcaccat 36000
tccatctata aggtatatta tatagataga 36030
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 对应于并包括EnAd基因组的bp 29345-29379的BY DNA序列
<400> 11
caaataaagt ttaacttgtt tatttgaaaa tcaat 35
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 剪接受体(SA)
<400> 17
cctttctctc ttcagg 16
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 分支剪接受体(bSA)
<400> 18
tgctaatcct ttctctcttc agg 23
<210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF抗体VH链氨基酸序列
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1抗体VH链氨基酸序列
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 31
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF抗体VL链氨基酸序列
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1抗体VL链氨基酸序列
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 36
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF ScFv氨基酸序列
<400> 36
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80
Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
145 150 155 160
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
165 170 175
Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp
180 185 190
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr
195 200 205
Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
260 265
<210> 37
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗PD-L1 ScFv氨基酸序列
<400> 37
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
165 170 175
Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
210 215 220
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Arg
260
<210> 46
<211> 35334
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码抗PD-L1全长抗体的转基因盒组成的NG-177病毒基因组序列。
<400> 46
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
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caccactaga ccgatagccc caatggccac cggggtgatg aaaccttctc agttgcatcg 17940
acccgtcacc ttggatttgc cccctccccc tgctgctact gctgtacccg cttctaagcc 18000
tgtcgctgcc ccgaaaccag tcgccgtagc caggtcacgt cccgggggcg ctcctcgtcc 18060
aaatgcgcac tggcaaaata ctctgaacag catcgtgggt ctaggcgtgc aaagtgtaaa 18120
acgccgtcgc tgcttttaat taaatatgga gtagcgctta acttgcctat ctgtgtatat 18180
gtgtcattac acgccgtcac agcagcagag gaaaaaagga agaggtcgtg cgtcgacgct 18240
gagttacttt caagatggcc accccatcga tgctgcccca atgggcatac atgcacatcg 18300
ccggacagga tgcttcggag tacctgagtc cgggtctggt gcagttcgcc cgcgccacag 18360
acacctactt caatctggga aataagttta gaaatcccac cgtagcgccg acccacgatg 18420
tgaccaccga ccgtagccag cggctcatgt tgcgcttcgt gcccgttgac cgggaggaca 18480
atacatactc ttacaaagtg cggtacaccc tggccgtggg cgacaacaga gtgctggata 18540
tggccagcac gttctttgac attaggggtg tgttggacag aggtcccagt ttcaaaccct 18600
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cctacgacta catgaacggg cgggtggtgc cgccatctct agtagacacc tatgtgaaca 19800
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ctacccagac cgtgcagggt ccccgttctg ccgcctgcgg acttttctgc tgcatgttcc 21540
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atcaaaaagc actctaccat tttcttaata cccattcgcc ttattttcgc tcccatcgta 21720
cacacatcga aagggccact gcgttcgacc gtatggatgt tcaataatga ctcatgtaaa 21780
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gatttcgcga cgtactactg tcagcagtat ctgtatcacc ccgctacatt tgggcaaggg 31740
acaaaagtgg agatcaaacg gactgtagcc gcacccagcg tgttcatctt tccaccctct 31800
gatgagcagc ttaagagcgg tacggcatct gtcgtgtgct tgctgaacaa cttctatcct 31860
cgtgaagcca aagtccagtg gaaggtggac aatgccttgc agtcaggcaa ctcacaggaa 31920
agcgtcactg aacaggacag caaggatagt acctacagcc tgtccagcac actgactctc 31980
tccaaagccg actatgagaa gcacaaggtt tacgcttgcg aagtgaccca tcaaggcctt 32040
agcagtccag tcaccaagtc cttcaatcgc ggagagtgct gagctagctt gactgactga 32100
gatacagcgt accttcagct cacagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 32160
acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 32220
tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 32280
tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 32340
ggtagtcgtc agctatcctg caggaacttg tttatttgaa aatcaattca caaaatccga 32400
gtagttattt tgcctccccc ttcccattta acagaataca ccaatctctc cccacgcaca 32460
gctttaaaca tttggatacc attagatata gacatggttt tagattccac attccaaaca 32520
gtttcagagc gagccaatct ggggtcagtg atagataaaa atccatcggg atagtctttt 32580
aaagcgcttt cacagtccaa ctgctgcgga tgcgactccg gagtctggat cacggtcatc 32640
tggaagaaga acgatgggaa tcataatccg aaaacggtat cggacgattg tgtctcatca 32700
aacccacaag cagccgctgt ctgcgtcgct ccgtgcgact gctgtttatg ggatcagggt 32760
ccacagtgtc ctgaagcatg attttaatag cccttaacat caactttctg gtgcgatgcg 32820
cgcagcaacg cattctgatt tcactcaaat ctttgcagta ggtacaacac attattacaa 32880
tattgtttaa taaaccataa ttaaaagcgc tccagccaaa actcatatct gatataatcg 32940
cccctgcatg accatcatac caaagtttaa tataaattaa atgacgttcc ctcaaaaaca 33000
cactacccac atacatgatc tcttttggca tgtgcatatt aacaatctgt ctgtaccatg 33060
gacaacgttg gttaatcatg caacccaata taaccttccg gaaccacact gccaacaccg 33120
ctcccccagc catgcattga agtgaaccct gctgattaca atgacaatga agaacccaat 33180
tctctcgacc gtgaatcact tgagaatgaa aaatatctat agtggcacaa catagacata 33240
aatgcatgca tcttctcata atttttaact cctcaggatt tagaaacata tcccagggaa 33300
taggaagctc ttgcagaaca gtaaagctgg cagaacaagg aagaccacga acacaactta 33360
cactatgcat agtcatagta tcacaatctg gcaacagcgg gtggtcttca gtcatagaag 33420
ctcgggtttc attttcctca caacgtggta actgggctct ggtgtaaggg tgatgtctgg 33480
cgcatgatgt cgagcgtgcg cgcaaccttg tcataatgga gttgcttcct gacattctcg 33540
tattttgtat agcaaaacgc ggccctggca gaacacactc ttcttcgcct tctatcctgc 33600
cgcttagcgt gttccgtgtg atagttcaag tacaaccaca ctcttaagtt ggtcaaaaga 33660
atgctggctt cagttgtaat caaaactcca tcgcatctaa tcgttctgag gaaatcatcc 33720
aagcaatgca actggattgt gtttcaagca ggagaggaga gggaagagac ggaagaacca 33780
tgttaatttt tattccaaac gatctcgcag tacttcaaat tgtagatcgc gcagatggca 33840
tctctcgccc ccactgtgtt ggtgaaaaag cacagctaga tcaaaagaaa tgcgattttc 33900
aaggtgctca acggtggctt ccagcaaagc ctccacgcgc acatccaaga acaaaagaat 33960
accaaaagaa ggagcatttt ctaactcctc aatcatcata ttacattcct gcaccattcc 34020
cagataattt tcagctttcc agccttgaat tattcgtgtc agttcttgtg gtaaatccaa 34080
tccacacatt acaaacaggt cccggagggc gccctccacc accattctta aacacaccct 34140
cataatgaca aaatatcttg ctcctgtgtc acctgtagcg aattgagaat ggcaacatca 34200
attgacatgc ccttggctct aagttcttct ttaagttcta gttgtaaaaa ctctctcata 34260
ttatcaccaa actgcttagc cagaagcccc ccgggaacaa gagcagggga cgctacagtg 34320
cagtacaagc gcagacctcc ccaattggct ccagcaaaaa caagattgga ataagcatat 34380
tgggaaccgc cagtaatatc atcgaagttg ctggaaatat aatcaggcag agtttcttgt 34440
aaaaattgaa taaaagaaaa atttgccaaa aaaacattca aaacctctgg gatgcaaatg 34500
caataggtta ccgcgctgcg ctccaacatt gttagttttg aattagtctg caaaaataaa 34560
aaaaaaaaca agcgtcatat catagtagcc tgacgaacag atggataaat cagtctttcc 34620
atcacaagac aagccacagg gtctccagct cgaccctcgt aaaacctgtc atcatgatta 34680
aacaacagca ccgaaagttc ctcgcggtga ccagcatgaa taattcttga tgaagcatac 34740
aatccagaca tgttagcatc agttaacgag aaaaaacagc caacatagcc tttgggtata 34800
attatgctta atcgtaagta tagcaaagcc acccctcgcg gatacaaagt aaaaggcaca 34860
ggagaataaa aaatataatt atttctctgc tgctgttcag gcaacgtcgc ccccggtccc 34920
tctaaataca catacaaagc ctcatcagcc atggcttacc agacaaagta cagcgggcac 34980
acaaagcaca agctctaaag tgactctcca acctctccac aatatatata tacacaagcc 35040
ctaaactgac gtaatgggag taaagtgtaa aaaatcccgc caaacccaac acacaccccg 35100
aaactgcgtc accagggaaa agtacagttt cacttccgca atcccaacag gcgtaacttc 35160
ctctttctca cggtacgtga tatcccacta acttgcaacg tcattttccc acggtcgcac 35220
cgcccctttt agccgttaac cccacagcca atcaccacac gatccacact ttttaaaatc 35280
acctcattta catattggca ccattccatc tataaggtat attatataga taga 35334
<210> 48
<211> 33432
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码具有C端His6标签的抗VEGF ScFv的转基因盒组成的NG-167病毒基因组序列。
<400> 48
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
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tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
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cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
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taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
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ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
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gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
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gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
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tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
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gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
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gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
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gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
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ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
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cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
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ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
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tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
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atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300
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tcagccgcgc ctacgagctt aacctctttt cacctcgtac tccccccaaa cgtcagccaa 23940
acggcacctg cgagccaaat cctcgcttaa acttttatcc agcttttgct gtgccagaag 24000
tactggctac ctatcacatc ttttttaaaa atcaaaaaat tccagtctcc tgccgcgcta 24060
atcgcacccg cgccgatgcc ctactcaatc tgggacctgg ttcacgctta cctgatatag 24120
cttccttgga agaggttcca aagatcttcg agggtctggg caataatgag actcgggccg 24180
caaatgctct gcaaaaggga gaaaatggca tggatgagca tcacagcgtt ctggtggaat 24240
tggaaggcga taatgccaga ctcgcagtac tcaagcgaag catcgaggtc acacacttcg 24300
catatcccgc tgtcaacctg ccccctaaag tcatgacggc ggtcatggac cagttactca 24360
ttaagcgcgc aagtcccctt tcagaagaca tgcatgaccc agatgcctgt gatgagggta 24420
aaccagtggt cagtgatgag cagctaaccc gatggctggg caccgactct cccagggatt 24480
tggaagagcg tcgcaagctt atgatggccg tggtgctggt taccgtagaa ctagagtgtc 24540
tccgacgttt ctttaccgat tcagaaacct tgcgcaaact cgaagagaat ctgcactaca 24600
cttttagaca cggctttgtg cggcaggcat gcaagatatc taacgtggaa ctcaccaacc 24660
tggtttccta catgggtatt ctgcatgaga atcgcctagg acaaagcgtg ctgcacagca 24720
ccctgaaggg ggaagcccgc cgtgattaca tccgcgattg tgtctatctg tacctgtgcc 24780
acacgtggca aaccggcatg ggtgtatggc agcaatgttt agaagaacag aacttgaaag 24840
agcttgacaa gctcttacag aaatctctta aggttctgtg gacagggttc gacgagcgca 24900
ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
acggattgcc tgactttatg agccagagca tgcttaacaa ttttcgctct ttcatcctgg 25020
aacgctccgg tatcctgccc gccacctgct gcgcactgcc ctccgacttt gtgcctctca 25080
cctaccgcga gtgccccccg ccgctatgga gtcactgcta cctgttccgt ctggccaact 25140
atctctccta ccactcggat gtgatcgagg atgtgagcgg agacggcttg ctggagtgtc 25200
actgccgctg caatctgtgc acgccccacc ggtccctagc ttgcaacccc cagttgatga 25260
gcgaaaccca gataataggc acctttgaat tgcaaggccc cagcagccaa ggcgatgggt 25320
cttctcctgg gcaaagttta aaactgaccc cgggactgtg gacctccgcc tacttgcgca 25380
agtttgctcc ggaagattac cacccctatg aaatcaagtt ctatgaggac caatcacagc 25440
ctccaaaggc cgaactttcg gcctgcgtca tcacccaggg ggcaattctg gcccaattgc 25500
aagccatcca aaaatcccgc caagaatttc tactgaaaaa gggtaagggg gtctaccttg 25560
acccccagac cggcgaggaa ctcaacacaa ggttccctca ggatgtccca acgacgagaa 25620
aacaagaagt tgaaggtgca gccgccgccc ccagaagata tggaggaaga ttgggacagt 25680
caggcagagg aggcggagga ggacagtctg gaggacagtc tggaggaaga cagtttggag 25740
gaggaaaacg aggaggcaga ggaggtggaa gaagtaaccg ccgacaaaca gttatcctcg 25800
gctgcggaga caagcaacag cgctaccatc tccgctccga gtcgaggaac ccggcggcgt 25860
cccagcagta gatgggacga gaccggacgc ttcccgaacc caaccagcgc ttccaagacc 25920
ggtaagaagg atcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc ataagaatgc catcatctcc 25980
tgcttgcatg agtgcggggg caacatatcc ttcacgcggc gctacttgct attccaccat 26040
ggggtgaact ttccgcgcaa tgttttgcat tactaccgtc acctccacag cccctactat 26100
agccagcaaa tcccggcagt ctcgacagat aaagacagcg gcggcgacct ccaacagaaa 26160
accagcagcg gcagttagaa aatacacaac aagtgcagca acaggaggat taaagattac 26220
agccaacgag ccagcgcaaa cccgagagtt aagaaatcgg atctttccaa ccctgtatgc 26280
catcttccag cagagtcggg gtcaagagca ggaactgaaa ataaaaaacc gatctctgcg 26340
ttcgctcacc agaagttgtt tgtatcacaa gagcgaagat caacttcagc gcactctcga 26400
ggacgccgag gctctcttca acaagtactg cgcgctgact cttaaagagt aggcagcgac 26460
cgcgcttatt caaaaaaggc gggaattaca tcatcctcga catgagtaaa gaaattccca 26520
cgccttacat gtggagttat caaccccaaa tgggattggc ggcaggcgcc tcccaggact 26580
actccacccg catgaattgg ctcagcgccg ggccttctat gatttctcga gttaatgata 26640
tacgcgccta ccgaaaccaa atacttttgg aacagtcagc tcttaccacc acgccccgcc 26700
aacaccttaa tcccagaaat tggcccgccg ccctagtgta ccaggaaagt cccgctccca 26760
ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
agttagctgg cggctccacc ctatgtcgtc acaggcctcg gcataatata aaacgcctga 26880
tgatcagagg ccgaggtatc cagctcaacg acgagtcggt gagctctccg cttggtctac 26940
gaccagacgg aatctttcag attgccggct gcgggagatc ttccttcacc cctcgtcagg 27000
ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
aatttgtgga ggagtttact ccctctgtct acttcaaccc cttctccgga tctcctgggc 27120
attacccgga cgagttcata ccgaacttcg acgcgattag cgagtcagtg gacggctacg 27180
attgatgtct ggtgacgcgg ctgagctatc tcggctgcga catctagacc actgccgccg 27240
ctttcgctgc tttgcccggg aactcattga gttcatctac ttcgaactcc ccaaggatca 27300
ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat ttctatcgaa ggcaaaatag actctcgcct 27360
gcaacgaatt ttctcccagc ggcccgtgct gatcgagcga gaccagggaa acaccacggt 27420
ttccatctac tgcatttgta atcaccccgg attgcatgaa agcctttgct gtcttatgtg 27480
tactgagttt aataaaaact gaattaagac tctcctacgg actgccgctt cttcaacccg 27540
gattttacaa ccagaagaac gaaacttttc ctgtcgtcca ggactctgtt aacttcacct 27600
ttcctactca caaactagaa gctcaacgac tacaccgctt ttccagaagc attttcccta 27660
ctaatactac tttcaaaacc ggaggtgagc tccaaggtct tcctacagaa aacccttggg 27720
tggaagcggg ccttgtagtg ctaggaattc ttgcgggtgg gcttgtgatt attctttgct 27780
acctatacac accttgcttc actttcttag tggtgttgtg gtattggttt aaaaaatggg 27840
gcccatacta gtcttgcttg ttttactttc gcttttggaa ccgggttctg ccaattacga 27900
tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 28200
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc accatgggat ggagctgtat catcctcttc 29400
ttggtagcaa cagctacagg tgtccactcc gaagtgcaac tggtggagtc tggcggaggt 29460
ctggtgcagc ctggaggctc tctcagactg tcatgcgctg caagcggttt taccatctct 29520
gactactgga tccattgggt gcgtcaggct cctggaaaag gccttgagtg ggttgcgggt 29580
ataactccag caggcgggta cacctactac gccgatagcg ttaaaggccg ctttaccatt 29640
agcgcggaca ccagcaagaa taccgcctat ctgcagatga actcactgag agcggaggat 29700
acagcagtgt actattgcgc aagattcgtg ttctttctgc catacgctat ggactattgg 29760
ggccaaggga cactggttac agtatcctcg ggtggcggtg gctcgggcgg tggtggatct 29820
ggtggcggcg gatctgacat ccagatgacc cagagcccat caagtctgtc cgccagcgtt 29880
ggcgatcgag tcaccattac ttgtagggct tctcaggacg tgtctacagc tgttgcttgg 29940
tatcagcaga aaccagggaa agcacccaaa cttctgatct actcagcttc cttcctgtac 30000
tcaggagttc ctagtcggtt tagtggcagc ggcagtggca cagacttcac gctcaccatt 30060
agcagtctcc agcctgagga ttttgccact tactactgtc agcaagggta tggaaatccc 30120
ttcacattcg ggcaaggaac caaagtcgag attaagaggc atcatcacca ccaccattaa 30180
gctagcttga ctgactgaga tacagcgtac cttcagctca cagacatgat aagatacatt 30240
gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt 30300
tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac 30360
aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag 30420
taaaacctct acaaatgtgg tagtcgtcag ctatcctgca ggaacttgtt tatttgaaaa 30480
tcaattcaca aaatccgagt agttattttg cctccccctt cccatttaac agaatacacc 30540
aatctctccc cacgcacagc tttaaacatt tggataccat tagatataga catggtttta 30600
gattccacat tccaaacagt ttcagagcga gccaatctgg ggtcagtgat agataaaaat 30660
ccatcgggat agtcttttaa agcgctttca cagtccaact gctgcggatg cgactccgga 30720
gtctggatca cggtcatctg gaagaagaac gatgggaatc ataatccgaa aacggtatcg 30780
gacgattgtg tctcatcaaa cccacaagca gccgctgtct gcgtcgctcc gtgcgactgc 30840
tgtttatggg atcagggtcc acagtgtcct gaagcatgat tttaatagcc cttaacatca 30900
actttctggt gcgatgcgcg cagcaacgca ttctgatttc actcaaatct ttgcagtagg 30960
tacaacacat tattacaata ttgtttaata aaccataatt aaaagcgctc cagccaaaac 31020
tcatatctga tataatcgcc cctgcatgac catcatacca aagtttaata taaattaaat 31080
gacgttccct caaaaacaca ctacccacat acatgatctc ttttggcatg tgcatattaa 31140
caatctgtct gtaccatgga caacgttggt taatcatgca acccaatata accttccgga 31200
accacactgc caacaccgct cccccagcca tgcattgaag tgaaccctgc tgattacaat 31260
gacaatgaag aacccaattc tctcgaccgt gaatcacttg agaatgaaaa atatctatag 31320
tggcacaaca tagacataaa tgcatgcatc ttctcataat ttttaactcc tcaggattta 31380
gaaacatatc ccagggaata ggaagctctt gcagaacagt aaagctggca gaacaaggaa 31440
gaccacgaac acaacttaca ctatgcatag tcatagtatc acaatctggc aacagcgggt 31500
ggtcttcagt catagaagct cgggtttcat tttcctcaca acgtggtaac tgggctctgg 31560
tgtaagggtg atgtctggcg catgatgtcg agcgtgcgcg caaccttgtc ataatggagt 31620
tgcttcctga cattctcgta ttttgtatag caaaacgcgg ccctggcaga acacactctt 31680
cttcgccttc tatcctgccg cttagcgtgt tccgtgtgat agttcaagta caaccacact 31740
cttaagttgg tcaaaagaat gctggcttca gttgtaatca aaactccatc gcatctaatc 31800
gttctgagga aatcatccaa gcaatgcaac tggattgtgt ttcaagcagg agaggagagg 31860
gaagagacgg aagaaccatg ttaattttta ttccaaacga tctcgcagta cttcaaattg 31920
tagatcgcgc agatggcatc tctcgccccc actgtgttgg tgaaaaagca cagctagatc 31980
aaaagaaatg cgattttcaa ggtgctcaac ggtggcttcc agcaaagcct ccacgcgcac 32040
atccaagaac aaaagaatac caaaagaagg agcattttct aactcctcaa tcatcatatt 32100
acattcctgc accattccca gataattttc agctttccag ccttgaatta ttcgtgtcag 32160
ttcttgtggt aaatccaatc cacacattac aaacaggtcc cggagggcgc cctccaccac 32220
cattcttaaa cacaccctca taatgacaaa atatcttgct cctgtgtcac ctgtagcgaa 32280
ttgagaatgg caacatcaat tgacatgccc ttggctctaa gttcttcttt aagttctagt 32340
tgtaaaaact ctctcatatt atcaccaaac tgcttagcca gaagcccccc gggaacaaga 32400
gcaggggacg ctacagtgca gtacaagcgc agacctcccc aattggctcc agcaaaaaca 32460
agattggaat aagcatattg ggaaccgcca gtaatatcat cgaagttgct ggaaatataa 32520
tcaggcagag tttcttgtaa aaattgaata aaagaaaaat ttgccaaaaa aacattcaaa 32580
acctctggga tgcaaatgca ataggttacc gcgctgcgct ccaacattgt tagttttgaa 32640
ttagtctgca aaaataaaaa aaaaaacaag cgtcatatca tagtagcctg acgaacagat 32700
ggataaatca gtctttccat cacaagacaa gccacagggt ctccagctcg accctcgtaa 32760
aacctgtcat catgattaaa caacagcacc gaaagttcct cgcggtgacc agcatgaata 32820
attcttgatg aagcatacaa tccagacatg ttagcatcag ttaacgagaa aaaacagcca 32880
acatagcctt tgggtataat tatgcttaat cgtaagtata gcaaagccac ccctcgcgga 32940
tacaaagtaa aaggcacagg agaataaaaa atataattat ttctctgctg ctgttcaggc 33000
aacgtcgccc ccggtccctc taaatacaca tacaaagcct catcagccat ggcttaccag 33060
acaaagtaca gcgggcacac aaagcacaag ctctaaagtg actctccaac ctctccacaa 33120
tatatatata cacaagccct aaactgacgt aatgggagta aagtgtaaaa aatcccgcca 33180
aacccaacac acaccccgaa actgcgtcac cagggaaaag tacagtttca cttccgcaat 33240
cccaacaggc gtaacttcct ctttctcacg gtacgtgata tcccactaac ttgcaacgtc 33300
attttcccac ggtcgcaccg ccccttttag ccgttaaccc cacagccaat caccacacga 33360
tccacacttt ttaaaatcac ctcatttaca tattggcacc attccatcta taaggtatat 33420
tatatagata ga 33432
<210> 49
<211> 33765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码细胞因子IFNγ的转基因盒组成的NG-95病毒基因组序列。
<400> 49
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
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ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
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tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
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tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
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tgtcgctgcc ccgaaaccag tcgccgtagc caggtcacgt cccgggggcg ctcctcgtcc 18060
aaatgcgcac tggcaaaata ctctgaacag catcgtgggt ctaggcgtgc aaagtgtaaa 18120
acgccgtcgc tgcttttaat taaatatgga gtagcgctta acttgcctat ctgtgtatat 18180
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gagttacttt caagatggcc accccatcga tgctgcccca atgggcatac atgcacatcg 18300
ccggacagga tgcttcggag tacctgagtc cgggtctggt gcagttcgcc cgcgccacag 18360
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cttgcagaac agtaaagctg gcagaacaag gaagaccacg aacacaactt acactatgca 31800
tagtcatagt atcacaatct ggcaacagcg ggtggtcttc agtcatagaa gctcgggttt 31860
cattttcctc acaacgtggt aactgggctc tggtgtaagg gtgatgtctg gcgcatgatg 31920
tcgagcgtgc gcgcaacctt gtcataatgg agttgcttcc tgacattctc gtattttgta 31980
tagcaaaacg cggccctggc agaacacact cttcttcgcc ttctatcctg ccgcttagcg 32040
tgttccgtgt gatagttcaa gtacaaccac actcttaagt tggtcaaaag aatgctggct 32100
tcagttgtaa tcaaaactcc atcgcatcta atcgttctga ggaaatcatc caagcaatgc 32160
aactggattg tgtttcaagc aggagaggag agggaagaga cggaagaacc atgttaattt 32220
ttattccaaa cgatctcgca gtacttcaaa ttgtagatcg cgcagatggc atctctcgcc 32280
cccactgtgt tggtgaaaaa gcacagctag atcaaaagaa atgcgatttt caaggtgctc 32340
aacggtggct tccagcaaag cctccacgcg cacatccaag aacaaaagaa taccaaaaga 32400
aggagcattt tctaactcct caatcatcat attacattcc tgcaccattc ccagataatt 32460
ttcagctttc cagccttgaa ttattcgtgt cagttcttgt ggtaaatcca atccacacat 32520
tacaaacagg tcccggaggg cgccctccac caccattctt aaacacaccc tcataatgac 32580
aaaatatctt gctcctgtgt cacctgtagc gaattgagaa tggcaacatc aattgacatg 32640
cccttggctc taagttcttc tttaagttct agttgtaaaa actctctcat attatcacca 32700
aactgcttag ccagaagccc cccgggaaca agagcagggg acgctacagt gcagtacaag 32760
cgcagacctc cccaattggc tccagcaaaa acaagattgg aataagcata ttgggaaccg 32820
ccagtaatat catcgaagtt gctggaaata taatcaggca gagtttcttg taaaaattga 32880
ataaaagaaa aatttgccaa aaaaacattc aaaacctctg ggatgcaaat gcaataggtt 32940
accgcgctgc gctccaacat tgttagtttt gaattagtct gcaaaaataa aaaaaaaaac 33000
aagcgtcata tcatagtagc ctgacgaaca gatggataaa tcagtctttc catcacaaga 33060
caagccacag ggtctccagc tcgaccctcg taaaacctgt catcatgatt aaacaacagc 33120
accgaaagtt cctcgcggtg accagcatga ataattcttg atgaagcata caatccagac 33180
atgttagcat cagttaacga gaaaaaacag ccaacatagc ctttgggtat aattatgctt 33240
aatcgtaagt atagcaaagc cacccctcgc ggatacaaag taaaaggcac aggagaataa 33300
aaaatataat tatttctctg ctgctgttca ggcaacgtcg cccccggtcc ctctaaatac 33360
acatacaaag cctcatcagc catggcttac cagacaaagt acagcgggca cacaaagcac 33420
aagctctaaa gtgactctcc aacctctcca caatatatat atacacaagc cctaaactga 33480
cgtaatggga gtaaagtgta aaaaatcccg ccaaacccaa cacacacccc gaaactgcgt 33540
caccagggaa aagtacagtt tcacttccgc aatcccaaca ggcgtaactt cctctttctc 33600
acggtacgtg atatcccact aacttgcaac gtcattttcc cacggtcgca ccgccccttt 33660
tagccgttaa ccccacagcc aatcaccaca cgatccacac tttttaaaat cacctcattt 33720
acatattggc accattccat ctataaggta tattatatag ataga 33765
<210> 50
<211> 33868
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码细胞因子IFNα的转基因盒组成的NG-97病毒基因组序列。
<400> 50
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320
gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380
agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500
gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940
cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000
tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120
tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180
cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240
atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300
acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360
gtgacggcgc ggccgttctc gcgcggtcgc agagtaaaaa caccgccgcg catctcctta 9420
aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480
aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540
aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600
tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660
ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720
gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900
tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020
taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140
agatactggt accctataag aaaatgcggc ggtggttggc ggtagagagg ccatcgttct 10200
gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380
cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560
acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620
gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860
aaagattctc gcgaggcgta tgtgccccaa cagaacctat ttagagacag aagcggcgag 10920
gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980
gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040
cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100
gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220
actagcaaac ctctgaccgc ccagctgttt ctggtggtgc aacacagcag agacaatgag 11280
gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
atcaacattc tacagagtat catagtgcag gagcggagcc tgggcctggc cgagaaggtg 11400
gctgccatca attactcggt tttgagcttg ggaaaatatt acgctcgcaa aatctacaag 11460
actccatacg ttcccataga caaggaggtg aagatagatg ggttctacat gcgcatgacg 11520
ctcaaggtct tgaccctgag cgatgatctt ggggtgtatc gcaatgacag aatgcatcgc 11580
gcggttagcg ccagcaggag gcgcgagtta agcgacaggg aactgatgca cagtttgcaa 11640
agagctctga ctggagctgg aaccgagggt gagaattact tcgacatggg agctgacttg 11700
cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760
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aacccgtgtt ttttgctaga tggaacagca agcaccggat cccgcaatgc gggcggcgct 11880
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aagccatcca aaaatcccgc caagaatttc tactgaaaaa gggtaagggg gtctaccttg 25560
acccccagac cggcgaggaa ctcaacacaa ggttccctca ggatgtccca acgacgagaa 25620
aacaagaagt tgaaggtgca gccgccgccc ccagaagata tggaggaaga ttgggacagt 25680
caggcagagg aggcggagga ggacagtctg gaggacagtc tggaggaaga cagtttggag 25740
gaggaaaacg aggaggcaga ggaggtggaa gaagtaaccg ccgacaaaca gttatcctcg 25800
gctgcggaga caagcaacag cgctaccatc tccgctccga gtcgaggaac ccggcggcgt 25860
cccagcagta gatgggacga gaccggacgc ttcccgaacc caaccagcgc ttccaagacc 25920
ggtaagaagg atcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc ataagaatgc catcatctcc 25980
tgcttgcatg agtgcggggg caacatatcc ttcacgcggc gctacttgct attccaccat 26040
ggggtgaact ttccgcgcaa tgttttgcat tactaccgtc acctccacag cccctactat 26100
agccagcaaa tcccggcagt ctcgacagat aaagacagcg gcggcgacct ccaacagaaa 26160
accagcagcg gcagttagaa aatacacaac aagtgcagca acaggaggat taaagattac 26220
agccaacgag ccagcgcaaa cccgagagtt aagaaatcgg atctttccaa ccctgtatgc 26280
catcttccag cagagtcggg gtcaagagca ggaactgaaa ataaaaaacc gatctctgcg 26340
ttcgctcacc agaagttgtt tgtatcacaa gagcgaagat caacttcagc gcactctcga 26400
ggacgccgag gctctcttca acaagtactg cgcgctgact cttaaagagt aggcagcgac 26460
cgcgcttatt caaaaaaggc gggaattaca tcatcctcga catgagtaaa gaaattccca 26520
cgccttacat gtggagttat caaccccaaa tgggattggc ggcaggcgcc tcccaggact 26580
actccacccg catgaattgg ctcagcgccg ggccttctat gatttctcga gttaatgata 26640
tacgcgccta ccgaaaccaa atacttttgg aacagtcagc tcttaccacc acgccccgcc 26700
aacaccttaa tcccagaaat tggcccgccg ccctagtgta ccaggaaagt cccgctccca 26760
ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
agttagctgg cggctccacc ctatgtcgtc acaggcctcg gcataatata aaacgcctga 26880
tgatcagagg ccgaggtatc cagctcaacg acgagtcggt gagctctccg cttggtctac 26940
gaccagacgg aatctttcag attgccggct gcgggagatc ttccttcacc cctcgtcagg 27000
ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
aatttgtgga ggagtttact ccctctgtct acttcaaccc cttctccgga tctcctgggc 27120
attacccgga cgagttcata ccgaacttcg acgcgattag cgagtcagtg gacggctacg 27180
attgatgtct ggtgacgcgg ctgagctatc tcggctgcga catctagacc actgccgccg 27240
ctttcgctgc tttgcccggg aactcattga gttcatctac ttcgaactcc ccaaggatca 27300
ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat ttctatcgaa ggcaaaatag actctcgcct 27360
gcaacgaatt ttctcccagc ggcccgtgct gatcgagcga gaccagggaa acaccacggt 27420
ttccatctac tgcatttgta atcaccccgg attgcatgaa agcctttgct gtcttatgtg 27480
tactgagttt aataaaaact gaattaagac tctcctacgg actgccgctt cttcaacccg 27540
gattttacaa ccagaagaac gaaacttttc ctgtcgtcca ggactctgtt aacttcacct 27600
ttcctactca caaactagaa gctcaacgac tacaccgctt ttccagaagc attttcccta 27660
ctaatactac tttcaaaacc ggaggtgagc tccaaggtct tcctacagaa aacccttggg 27720
tggaagcggg ccttgtagtg ctaggaattc ttgcgggtgg gcttgtgatt attctttgct 27780
acctatacac accttgcttc actttcttag tggtgttgtg gtattggttt aaaaaatggg 27840
gcccatacta gtcttgcttg ttttactttc gcttttggaa ccgggttctg ccaattacga 27900
tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 28200
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgcggctcc cgccagatct agtaatcaat tacggggtca 29400
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 29460
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 29520
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 29580
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 29640
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 29700
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgctgatgc ggttttggca gtacatcaat 29760
gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 29820
gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 29880
ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctggt 29940
ttagtgaacc gtcagatcag atctttgtcg atcctaccat ccactcgaca cacccgccag 30000
cggccgctgc caagcttccg agctctcgaa ttcaaaggag gtacccacca tggccttgac 30060
ctttgcttta ctggtggccc tcctggtgct cagctgcaag tcaagctgct ctgtgggctg 30120
tgatctgcct caaacccaca gcctgggtag caggaggacc ttgatgctcc tggcacagat 30180
gaggagaatc tctcttttct cctgcttgaa ggacagacat gactttggat ttccccagga 30240
ggagtttggc aaccagttcc aaaaggctga aaccatccct gtcctccatg agatgatcca 30300
gcagatcttc aatctcttca gcacaaagga ctcatctgct gcttgggatg agaccctcct 30360
agacaaattc tacactgaac tctaccagca gctgaatgac ctggaagcct gtgtgataca 30420
gggggtgggg gtgacagaga ctcccctgat gaaggaggac tccattctgg ctgtgaggaa 30480
atacttccaa agaatcactc tctatctgaa agagaagaaa tacagccctt gtgcctggga 30540
ggttgtcaga gcagaaatca tgagatcttt ttctttgtca acaaacttgc aagaaagttt 30600
aagaagtaag gaatgagcta gcttgactga ctgagataca gcgtaccttc agctcacaga 30660
catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 30720
ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 30780
acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 30840
ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtagt cgtcagctat cctgcaggaa 30900
cttgtttatt tgaaaatcaa ttcacaaaat ccgagtagtt attttgcctc ccccttccca 30960
tttaacagaa tacaccaatc tctccccacg cacagcttta aacatttgga taccattaga 31020
tatagacatg gttttagatt ccacattcca aacagtttca gagcgagcca atctggggtc 31080
agtgatagat aaaaatccat cgggatagtc ttttaaagcg ctttcacagt ccaactgctg 31140
cggatgcgac tccggagtct ggatcacggt catctggaag aagaacgatg ggaatcataa 31200
tccgaaaacg gtatcggacg attgtgtctc atcaaaccca caagcagccg ctgtctgcgt 31260
cgctccgtgc gactgctgtt tatgggatca gggtccacag tgtcctgaag catgatttta 31320
atagccctta acatcaactt tctggtgcga tgcgcgcagc aacgcattct gatttcactc 31380
aaatctttgc agtaggtaca acacattatt acaatattgt ttaataaacc ataattaaaa 31440
gcgctccagc caaaactcat atctgatata atcgcccctg catgaccatc ataccaaagt 31500
ttaatataaa ttaaatgacg ttccctcaaa aacacactac ccacatacat gatctctttt 31560
ggcatgtgca tattaacaat ctgtctgtac catggacaac gttggttaat catgcaaccc 31620
aatataacct tccggaacca cactgccaac accgctcccc cagccatgca ttgaagtgaa 31680
ccctgctgat tacaatgaca atgaagaacc caattctctc gaccgtgaat cacttgagaa 31740
tgaaaaatat ctatagtggc acaacataga cataaatgca tgcatcttct cataattttt 31800
aactcctcag gatttagaaa catatcccag ggaataggaa gctcttgcag aacagtaaag 31860
ctggcagaac aaggaagacc acgaacacaa cttacactat gcatagtcat agtatcacaa 31920
tctggcaaca gcgggtggtc ttcagtcata gaagctcggg tttcattttc ctcacaacgt 31980
ggtaactggg ctctggtgta agggtgatgt ctggcgcatg atgtcgagcg tgcgcgcaac 32040
cttgtcataa tggagttgct tcctgacatt ctcgtatttt gtatagcaaa acgcggccct 32100
ggcagaacac actcttcttc gccttctatc ctgccgctta gcgtgttccg tgtgatagtt 32160
caagtacaac cacactctta agttggtcaa aagaatgctg gcttcagttg taatcaaaac 32220
tccatcgcat ctaatcgttc tgaggaaatc atccaagcaa tgcaactgga ttgtgtttca 32280
agcaggagag gagagggaag agacggaaga accatgttaa tttttattcc aaacgatctc 32340
gcagtacttc aaattgtaga tcgcgcagat ggcatctctc gcccccactg tgttggtgaa 32400
aaagcacagc tagatcaaaa gaaatgcgat tttcaaggtg ctcaacggtg gcttccagca 32460
aagcctccac gcgcacatcc aagaacaaaa gaataccaaa agaaggagca ttttctaact 32520
cctcaatcat catattacat tcctgcacca ttcccagata attttcagct ttccagcctt 32580
gaattattcg tgtcagttct tgtggtaaat ccaatccaca cattacaaac aggtcccgga 32640
gggcgccctc caccaccatt cttaaacaca ccctcataat gacaaaatat cttgctcctg 32700
tgtcacctgt agcgaattga gaatggcaac atcaattgac atgcccttgg ctctaagttc 32760
ttctttaagt tctagttgta aaaactctct catattatca ccaaactgct tagccagaag 32820
ccccccggga acaagagcag gggacgctac agtgcagtac aagcgcagac ctccccaatt 32880
ggctccagca aaaacaagat tggaataagc atattgggaa ccgccagtaa tatcatcgaa 32940
gttgctggaa atataatcag gcagagtttc ttgtaaaaat tgaataaaag aaaaatttgc 33000
caaaaaaaca ttcaaaacct ctgggatgca aatgcaatag gttaccgcgc tgcgctccaa 33060
cattgttagt tttgaattag tctgcaaaaa taaaaaaaaa aacaagcgtc atatcatagt 33120
agcctgacga acagatggat aaatcagtct ttccatcaca agacaagcca cagggtctcc 33180
agctcgaccc tcgtaaaacc tgtcatcatg attaaacaac agcaccgaaa gttcctcgcg 33240
gtgaccagca tgaataattc ttgatgaagc atacaatcca gacatgttag catcagttaa 33300
cgagaaaaaa cagccaacat agcctttggg tataattatg cttaatcgta agtatagcaa 33360
agccacccct cgcggataca aagtaaaagg cacaggagaa taaaaaatat aattatttct 33420
ctgctgctgt tcaggcaacg tcgcccccgg tccctctaaa tacacataca aagcctcatc 33480
agccatggct taccagacaa agtacagcgg gcacacaaag cacaagctct aaagtgactc 33540
tccaacctct ccacaatata tatatacaca agccctaaac tgacgtaatg ggagtaaagt 33600
gtaaaaaatc ccgccaaacc caacacacac cccgaaactg cgtcaccagg gaaaagtaca 33660
gtttcacttc cgcaatccca acaggcgtaa cttcctcttt ctcacggtac gtgatatccc 33720
actaacttgc aacgtcattt tcccacggtc gcaccgcccc ttttagccgt taaccccaca 33780
gccaatcacc acacgatcca cactttttaa aatcacctca tttacatatt ggcaccattc 33840
catctataag gtatattata tagataga 33868
<210> 51
<211> 33132
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码细胞因子IFNγ的转基因盒组成的NG-92病毒基因组序列。
<400> 51
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
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ttgacttgca ggacagaaac acagaacttt cttaccaact cttgcttgac tctctgggcg 19380
acagaaccag atactttagc atgtggaatc aggctgtgga cagttatgat cctgatgtac 19440
gtgttattga aaatcatggt gtggaagatg aacttcccaa ctactgtttt ccactggacg 19500
gcataggtgt tccaacaacc agttacaaat caatagttcc aaatggagac aatgcgccta 19560
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cttatgagtg gaactttagg aaggatgtga acatggttct acagagttcc ctcggtaacg 20040
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<210> 52
<211> 33199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码细胞因子IFNα的转基因盒组成的NG-96病毒基因组序列。
<400> 52
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320
gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380
agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500
gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940
cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000
tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120
tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180
cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240
atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300
acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360
gtgacggcgc ggccgttctc gcgcggtcgc agagtaaaaa caccgccgcg catctcctta 9420
aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480
aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540
aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600
tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660
ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720
gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900
tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020
taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140
agatactggt accctataag aaaatgcggc ggtggttggc ggtagagagg ccatcgttct 10200
gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380
cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560
acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620
gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860
aaagattctc gcgaggcgta tgtgccccaa cagaacctat ttagagacag aagcggcgag 10920
gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980
gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040
cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100
gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220
actagcaaac ctctgaccgc ccagctgttt ctggtggtgc aacacagcag agacaatgag 11280
gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
atcaacattc tacagagtat catagtgcag gagcggagcc tgggcctggc cgagaaggtg 11400
gctgccatca attactcggt tttgagcttg ggaaaatatt acgctcgcaa aatctacaag 11460
actccatacg ttcccataga caaggaggtg aagatagatg ggttctacat gcgcatgacg 11520
ctcaaggtct tgaccctgag cgatgatctt ggggtgtatc gcaatgacag aatgcatcgc 11580
gcggttagcg ccagcaggag gcgcgagtta agcgacaggg aactgatgca cagtttgcaa 11640
agagctctga ctggagctgg aaccgagggt gagaattact tcgacatggg agctgacttg 11700
cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760
atagaagagg cggatgaagg cgaggaggaa gagggcgagt acttggaaga ctgatggcac 11820
aacccgtgtt ttttgctaga tggaacagca agcaccggat cccgcaatgc gggcggcgct 11880
gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
atcggccatc atggaagctg tagtgccttc ccgctctaat cccactcatg agaaggtcct 12060
ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
atacaacgct ctcttagaac gcgtggctcg ctacaacagt agcaatgtgc aaaccaattt 12180
ggaccgtatg ataacagatg tacgcgaagc cgtgtctcag cgcgaaaggt tccagcgtga 12240
tgccaacctg ggttcgctgg tggcgttaaa tgctttcttg agtactcagc ctgctaatgt 12300
gccgcgtggt caacaggatt atactaactt tttaagtgct ttgagactga tggtatcaga 12360
agtacctcag agcgaagtgt atcagtccgg tcctgattac ttctttcaga ctagcagaca 12420
gggcttgcag acggtaaatc tgagccaagc ttttaaaaac ctttaaaggt ttgtggggag 12480
tgcatgcccc ggtaggagaa agagcaaccg tgtctagctt gttaactccg aactcccgcc 12540
tattattact gttggtagct cctttcaccg acagcggtag catcgaccgt aattcctatt 12600
tgggttacct actaaacctg tatcgcgaag ccatagggca aagtcaggtg gacgagcaga 12660
cctatcaaga aattacccaa gtcagtcgcg ctttgggaca ggaagacact ggcagtttgg 12720
aagccactct gaacttcttg cttaccaatc ggtctcaaaa gatccctcct caatatgctc 12780
ttactgcgga ggaggagagg atccttagat atgtgcagca gagcgtggga ttgtttctga 12840
tgcaagaggg ggcaactccg actgcagcac tggacatgac agcgcgaaat atggagccca 12900
gcatgtatgc cagtaaccga cctttcatta acaaactgct ggactacttg cacagagctg 12960
ccgctatgaa ctctgattat ttcaccaatg ccatcttaaa cccgcactgg ctgcccccac 13020
ctggtttcta cacgggcgaa tatgacatgc ccgaccctaa tgacggattt ctgtgggacg 13080
acgtggacag cgatgttttt tcacctcttt ctgatcatcg cacgtggaaa aaggaaggcg 13140
gcgatagaat gcattcttct gcatcgctgt ccggggtcat gggtgctacc gcggctgagc 13200
ccgagtctgc aagtcctttt cctagtctac ccttttctct acacagtgta cgtagcagcg 13260
aagtgggtag aataagtcgc ccgagtttaa tgggcgaaga ggagtatcta aacgattcct 13320
tgctcagacc ggcaagagaa aaaaatttcc caaacaatgg aatagaaagt ttggtggata 13380
aaatgagtag atggaagact tatgctcagg atcacagaga cgagcctggg atcatgggga 13440
ttacaagtag agcgagccgt agacgccagc gccatgacag acagaggggt cttgtgtggg 13500
acgatgagga ttcggccgat gatagcagcg tgctggactt gggtgggaga ggaaggggca 13560
acccgtttgc tcatttgcgc cctcgcttgg gtggtatgtt gtaaaaaaaa ataaaaaaaa 13620
aactcaccaa ggccatggcg acgagcgtac gttcgttctt ctttattatc tgtgtctagt 13680
ataatgaggc gagtcgtgct aggcggagcg gtggtgtatc cggagggtcc tcctccttcg 13740
tacgagagcg tgatgcagca gcagcaggcg acggcggtga tgcaatcccc actggaggct 13800
ccctttgtgc ctccgcgata cctggcacct acggagggca gaaacagcat tcgttattcg 13860
gaactggcac ctcagtacga taccaccagg ttgtatctgg tggacaacaa gtcggcggac 13920
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tttcctactc acaaactaga agctcaacga ctacaccgct tttccagaag cattttccct 27660
actaatacta ctttcaaaac cggaggtgag ctccaaggtc ttcctacaga aaacccttgg 27720
gtggaagcgg gccttgtagt gctaggaatt cttgcgggtg ggcttgtgat tattctttgc 27780
tacctataca caccttgctt cactttctta gtggtgttgt ggtattggtt taaaaaatgg 27840
ggcccatact agtcttgctt gttttacttt cgcttttgga accgggttct gccaattacg 27900
atccatgtct agacttcgac ccagaaaact gcacacttac ttttgcaccc gacacaagcc 27960
gcatctgtgg agttcatcgc ctctcttacg aacttggccc ccaacgacaa aaatttacct 28020
gcatggtggg aatcaacccc atagttatca cccagcaaag tggagatact aagggttgca 28080
ttcactgctc ctgcgattcc atcgagtgca cctacaccct gctgaagacc ctatgcggcc 28140
taagagacct gctaccaatg aattaaaaaa tgattaataa aaaatcactt acttgaaatc 28200
agcaataagg tctctgttga aattttctcc cagcagcacc tcacttccct cttcccaact 28260
ctggtattct aaaccccgtt cagcggcata ctttctccat actttaaagg ggatgtcaaa 28320
ttttagctcc tctcctgtac ccacaatctt catgtctttc ttcccagatg accaagagag 28380
tccggctcag tgactccttc aaccctgtct acccctatga agatgaaagc acctcccaac 28440
acccctttat aaacccaggg tttatttccc caaatggctt cacacaaagc ccaaacggag 28500
ttcttacttt aaaatgttta accccactaa caaccacagg cggatctcta cagctaaaag 28560
tgggaggggg acttacagtg gatgacacca acggtttttt gaaagaaaac ataagtgcca 28620
ccacaccact cgttaagact ggtcactcta taggtttacc actaggagcc ggattgggaa 28680
cgaatgaaaa taaactttgt atcaaattag gacaaggact tacattcaat tcaaacaaca 28740
tttgcattga tgacaatatt aacaccttat ggacaggagt caaccccacc gaagccaact 28800
gtcaaatcat gaactccagt gaatctaatg attgcaaatt aattctaaca ctagttaaaa 28860
ctggagcact agtcactgca tttgtttatg ttataggagt atctaacaat tttaatatgc 28920
taactacaca cagaaatata aattttactg cagagctgtt tttcgattct actggtaatt 28980
tactaactag actctcatcc ctcaaaactc cacttaatca taaatcagga caaaacatgg 29040
ctactggtgc cattactaat gctaaaggtt tcatgcccag cacgactgcc tatcctttca 29100
atgataattc tagagaaaaa gaaaactaca tttacggaac ttgttactac acagctagtg 29160
atcgcactgc ttttcccatt gacatatctg tcatgcttaa ccgaagagca ataaatgacg 29220
agacatcata ttgtattcgt ataacttggt cctggaacac aggagatgcc ccagaggtgc 29280
aaacctctgc tacaacccta gtcacctccc catttacctt ttactacatc agagaagacg 29340
actgacaaat aaagtttgcg atcgctgcta atcctttctc tcttcaggcc accatggcct 29400
tgacctttgc tttactggtg gccctcctgg tgctcagctg caagtcaagc tgctctgtgg 29460
gctgtgatct gcctcaaacc cacagcctgg gtagcaggag gaccttgatg ctcctggcac 29520
agatgaggag aatctctctt ttctcctgct tgaaggacag acatgacttt ggatttcccc 29580
aggaggagtt tggcaaccag ttccaaaagg ctgaaaccat ccctgtcctc catgagatga 29640
tccagcagat cttcaatctc ttcagcacaa aggactcatc tgctgcttgg gatgagaccc 29700
tcctagacaa attctacact gaactctacc agcagctgaa tgacctggaa gcctgtgtga 29760
tacagggggt gggggtgaca gagactcccc tgatgaagga ggactccatt ctggctgtga 29820
ggaaatactt ccaaagaatc actctctatc tgaaagagaa gaaatacagc ccttgtgcct 29880
gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ctttttcttt gtcaacaaac ttgcaagaaa 29940
gtttaagaag taaggaatga gctagcttga ctgactgaga tacagcgtac cttcagctca 30000
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 30060
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 30120
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 30180
gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg tcctgcagga acttgtttat 30240
ttgaaaatca attcacaaaa tccgagtagt tattttgcct cccccttccc atttaacaga 30300
atacaccaat ctctccccac gcacagcttt aaacatttgg ataccattag atatagacat 30360
ggttttagat tccacattcc aaacagtttc agagcgagcc aatctggggt cagtgataga 30420
taaaaatcca tcgggatagt cttttaaagc gctttcacag tccaactgct gcggatgcga 30480
ctccggagtc tggatcacgg tcatctggaa gaagaacgat gggaatcata atccgaaaac 30540
ggtatcggac gattgtgtct catcaaaccc acaagcagcc gctgtctgcg tcgctccgtg 30600
cgactgctgt ttatgggatc agggtccaca gtgtcctgaa gcatgatttt aatagccctt 30660
aacatcaact ttctggtgcg atgcgcgcag caacgcattc tgatttcact caaatctttg 30720
cagtaggtac aacacattat tacaatattg tttaataaac cataattaaa agcgctccag 30780
ccaaaactca tatctgatat aatcgcccct gcatgaccat cataccaaag tttaatataa 30840
attaaatgac gttccctcaa aaacacacta cccacataca tgatctcttt tggcatgtgc 30900
atattaacaa tctgtctgta ccatggacaa cgttggttaa tcatgcaacc caatataacc 30960
ttccggaacc acactgccaa caccgctccc ccagccatgc attgaagtga accctgctga 31020
ttacaatgac aatgaagaac ccaattctct cgaccgtgaa tcacttgaga atgaaaaata 31080
tctatagtgg cacaacatag acataaatgc atgcatcttc tcataatttt taactcctca 31140
ggatttagaa acatatccca gggaatagga agctcttgca gaacagtaaa gctggcagaa 31200
caaggaagac cacgaacaca acttacacta tgcatagtca tagtatcaca atctggcaac 31260
agcgggtggt cttcagtcat agaagctcgg gtttcatttt cctcacaacg tggtaactgg 31320
gctctggtgt aagggtgatg tctggcgcat gatgtcgagc gtgcgcgcaa ccttgtcata 31380
atggagttgc ttcctgacat tctcgtattt tgtatagcaa aacgcggccc tggcagaaca 31440
cactcttctt cgccttctat cctgccgctt agcgtgttcc gtgtgatagt tcaagtacaa 31500
ccacactctt aagttggtca aaagaatgct ggcttcagtt gtaatcaaaa ctccatcgca 31560
tctaatcgtt ctgaggaaat catccaagca atgcaactgg attgtgtttc aagcaggaga 31620
ggagagggaa gagacggaag aaccatgtta atttttattc caaacgatct cgcagtactt 31680
caaattgtag atcgcgcaga tggcatctct cgcccccact gtgttggtga aaaagcacag 31740
ctagatcaaa agaaatgcga ttttcaaggt gctcaacggt ggcttccagc aaagcctcca 31800
cgcgcacatc caagaacaaa agaataccaa aagaaggagc attttctaac tcctcaatca 31860
tcatattaca ttcctgcacc attcccagat aattttcagc tttccagcct tgaattattc 31920
gtgtcagttc ttgtggtaaa tccaatccac acattacaaa caggtcccgg agggcgccct 31980
ccaccaccat tcttaaacac accctcataa tgacaaaata tcttgctcct gtgtcacctg 32040
tagcgaattg agaatggcaa catcaattga catgcccttg gctctaagtt cttctttaag 32100
ttctagttgt aaaaactctc tcatattatc accaaactgc ttagccagaa gccccccggg 32160
aacaagagca ggggacgcta cagtgcagta caagcgcaga cctccccaat tggctccagc 32220
aaaaacaaga ttggaataag catattggga accgccagta atatcatcga agttgctgga 32280
aatataatca ggcagagttt cttgtaaaaa ttgaataaaa gaaaaatttg ccaaaaaaac 32340
attcaaaacc tctgggatgc aaatgcaata ggttaccgcg ctgcgctcca acattgttag 32400
ttttgaatta gtctgcaaaa ataaaaaaaa aaacaagcgt catatcatag tagcctgacg 32460
aacagatgga taaatcagtc tttccatcac aagacaagcc acagggtctc cagctcgacc 32520
ctcgtaaaac ctgtcatcat gattaaacaa cagcaccgaa agttcctcgc ggtgaccagc 32580
atgaataatt cttgatgaag catacaatcc agacatgtta gcatcagtta acgagaaaaa 32640
acagccaaca tagcctttgg gtataattat gcttaatcgt aagtatagca aagccacccc 32700
tcgcggatac aaagtaaaag gcacaggaga ataaaaaata taattatttc tctgctgctg 32760
ttcaggcaac gtcgcccccg gtccctctaa atacacatac aaagcctcat cagccatggc 32820
ttaccagaca aagtacagcg ggcacacaaa gcacaagctc taaagtgact ctccaacctc 32880
tccacaatat atatatacac aagccctaaa ctgacgtaat gggagtaaag tgtaaaaaat 32940
cccgccaaac ccaacacaca ccccgaaact gcgtcaccag ggaaaagtac agtttcactt 33000
ccgcaatccc aacaggcgta acttcctctt tctcacggta cgtgatatcc cactaacttg 33060
caacgtcatt ttcccacggt cgcaccgccc cttttagccg ttaaccccac agccaatcac 33120
cacacgatcc acacttttta aaatcacctc atttacatat tggcaccatt ccatctataa 33180
ggtatattat atagataga 33199
<210> 53
<211> 33314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码细胞因子IFNα的转基因盒组成的NG-139病毒基因组序列。
<400> 53
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
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ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320
gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380
agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500
gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
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tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
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gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
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ttgcggaact gatacttggg ttgccacttg aattcgggaa tcaccaactt gggaaccggt 21960
atatcgggca ggatgtcact ccacagcttt ctggtcagct gcaaagctcc aagcaggtca 22020
ggagccgaaa tcttgaaatc acaattagga ccagtgcttt gagcgcgaga gttgcggtac 22080
accggattgc agcactgaaa caccatcagc gacggatgtc tcacgcttgc cagcacggtg 22140
ggatctgcaa tcatgcccac atccagatct tcagcattgg caatgctgaa cggggtcatc 22200
ttgcaggtct gcctacccat ggcgggcacc caattaggct tgtggttgca atcgcagtgc 22260
agggggatca gtatcatctt ggcctgatcc tgtctgattc ctggatacac ggctctcatg 22320
aaagcatcat attgcttgaa agcctgctgg gctttactac cctcggtata aaacatcccg 22380
caggacctgc tcgaaaactg gttagctgca cagccggcat cattcacaca gcagcgggcg 22440
tcattgttag ctatttgcac cacacttctg ccccagcggt tttgggtgat tttggttcgc 22500
tcgggattct cctttaaggc tcgttgtccg ttctcgctgg ccacatccat ctcgataatc 22560
tgctccttct gaatcataat attgccatgc aggcacttca gcttgccctc ataatcattg 22620
cagccatgag gccacaacgc acagcctgta cattcccaat tatggtgggc gatctgagaa 22680
aaagaatgta tcattccctg cagaaatctt cccatcatcg tgctcagtgt cttgtgacta 22740
gtgaaagtta actggatgcc tcggtgctcc tcgtttacgt actggtgaca gatgcgcttg 22800
tattgttcgt gttgctcagg cattagttta aaagaggttc taagttcgtt atccagcctg 22860
tacttctcca tcagcagaca catcacttcc atgcctttct cccaagcaga caccaggggc 22920
aagctaatcg gattcttaac agtgcaggca gcagctcctt tagccagagg gtcatcttta 22980
gcgatcttct caatgcttct tttgccatcc ttctcaacga tgcgcacggg cgggtagctg 23040
aaacccactg ctacaagttg cgcctcttct ctttcttctt cgctgtcttg actgatgtct 23100
tgcatgggga tatgtttggt cttccttggc ttctttttgg ggggtatcgg aggaggagga 23160
ctgtcgctcc gttccggaga cagggaggat tgtgacgttt cgctcaccat taccaactga 23220
ctgtcggtag aagaacctga ccccacacgg cgacaggtgt ttctcttcgg gggcagaggt 23280
ggaggcgatt gcgaagggct gcggtccgac ctggaaggcg gatgactggc agaacccctt 23340
ccgcgttcgg gggtgtgctc cctgtggcgg tcgcttaact gatttccttc gcggctggcc 23400
attgtgttct cctaggcaga gaaacaacag acatggaaac tcagccattg ctgtcaacat 23460
cgccacgagt gccatcacat ctcgtcctca gcgacgagga aaaggagcag agcttaagca 23520
ttccaccgcc cagtcctgcc accacctcta ccctagaaga taaggaggtc gacgcatctc 23580
atgacatgca gaataaaaaa gcgaaagagt ctgagacaga catcgagcaa gacccgggct 23640
atgtgacacc ggtggaacac gaggaagagt tgaaacgctt tctagagaga gaggatgaaa 23700
actgcccaaa acaacgagca gataactatc accaagatgc tggaaatagg gatcagaaca 23760
ccgactacct catagggctt gacggggaag acgcgctcct taaacatcta gcaagacagt 23820
cgctcatagt caaggatgca ttattggaca gaactgaagt gcccatcagt gtggaagagc 23880
tcagccgcgc ctacgagctt aacctctttt cacctcgtac tccccccaaa cgtcagccaa 23940
acggcacctg cgagccaaat cctcgcttaa acttttatcc agcttttgct gtgccagaag 24000
tactggctac ctatcacatc ttttttaaaa atcaaaaaat tccagtctcc tgccgcgcta 24060
atcgcacccg cgccgatgcc ctactcaatc tgggacctgg ttcacgctta cctgatatag 24120
cttccttgga agaggttcca aagatcttcg agggtctggg caataatgag actcgggccg 24180
caaatgctct gcaaaaggga gaaaatggca tggatgagca tcacagcgtt ctggtggaat 24240
tggaaggcga taatgccaga ctcgcagtac tcaagcgaag catcgaggtc acacacttcg 24300
catatcccgc tgtcaacctg ccccctaaag tcatgacggc ggtcatggac cagttactca 24360
ttaagcgcgc aagtcccctt tcagaagaca tgcatgaccc agatgcctgt gatgagggta 24420
aaccagtggt cagtgatgag cagctaaccc gatggctggg caccgactct cccagggatt 24480
tggaagagcg tcgcaagctt atgatggccg tggtgctggt taccgtagaa ctagagtgtc 24540
tccgacgttt ctttaccgat tcagaaacct tgcgcaaact cgaagagaat ctgcactaca 24600
cttttagaca cggctttgtg cggcaggcat gcaagatatc taacgtggaa ctcaccaacc 24660
tggtttccta catgggtatt ctgcatgaga atcgcctagg acaaagcgtg ctgcacagca 24720
ccctgaaggg ggaagcccgc cgtgattaca tccgcgattg tgtctatctg tacctgtgcc 24780
acacgtggca aaccggcatg ggtgtatggc agcaatgttt agaagaacag aacttgaaag 24840
agcttgacaa gctcttacag aaatctctta aggttctgtg gacagggttc gacgagcgca 24900
ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
acggattgcc tgactttatg agccagagca tgcttaacaa ttttcgctct ttcatcctgg 25020
aacgctccgg tatcctgccc gccacctgct gcgcactgcc ctccgacttt gtgcctctca 25080
cctaccgcga gtgccccccg ccgctatgga gtcactgcta cctgttccgt ctggccaact 25140
atctctccta ccactcggat gtgatcgagg atgtgagcgg agacggcttg ctggagtgtc 25200
actgccgctg caatctgtgc acgccccacc ggtccctagc ttgcaacccc cagttgatga 25260
gcgaaaccca gataataggc acctttgaat tgcaaggccc cagcagccaa ggcgatgggt 25320
cttctcctgg gcaaagttta aaactgaccc cgggactgtg gacctccgcc tacttgcgca 25380
agtttgctcc ggaagattac cacccctatg aaatcaagtt ctatgaggac caatcacagc 25440
ctccaaaggc cgaactttcg gcctgcgtca tcacccaggg ggcaattctg gcccaattgc 25500
aagccatcca aaaatcccgc caagaatttc tactgaaaaa gggtaagggg gtctaccttg 25560
acccccagac cggcgaggaa ctcaacacaa ggttccctca ggatgtccca acgacgagaa 25620
aacaagaagt tgaaggtgca gccgccgccc ccagaagata tggaggaaga ttgggacagt 25680
caggcagagg aggcggagga ggacagtctg gaggacagtc tggaggaaga cagtttggag 25740
gaggaaaacg aggaggcaga ggaggtggaa gaagtaaccg ccgacaaaca gttatcctcg 25800
gctgcggaga caagcaacag cgctaccatc tccgctccga gtcgaggaac ccggcggcgt 25860
cccagcagta gatgggacga gaccggacgc ttcccgaacc caaccagcgc ttccaagacc 25920
ggtaagaagg atcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc ataagaatgc catcatctcc 25980
tgcttgcatg agtgcggggg caacatatcc ttcacgcggc gctacttgct attccaccat 26040
ggggtgaact ttccgcgcaa tgttttgcat tactaccgtc acctccacag cccctactat 26100
agccagcaaa tcccggcagt ctcgacagat aaagacagcg gcggcgacct ccaacagaaa 26160
accagcagcg gcagttagaa aatacacaac aagtgcagca acaggaggat taaagattac 26220
agccaacgag ccagcgcaaa cccgagagtt aagaaatcgg atctttccaa ccctgtatgc 26280
catcttccag cagagtcggg gtcaagagca ggaactgaaa ataaaaaacc gatctctgcg 26340
ttcgctcacc agaagttgtt tgtatcacaa gagcgaagat caacttcagc gcactctcga 26400
ggacgccgag gctctcttca acaagtactg cgcgctgact cttaaagagt aggcagcgac 26460
cgcgcttatt caaaaaaggc gggaattaca tcatcctcga catgagtaaa gaaattccca 26520
cgccttacat gtggagttat caaccccaaa tgggattggc ggcaggcgcc tcccaggact 26580
actccacccg catgaattgg ctcagcgccg ggccttctat gatttctcga gttaatgata 26640
tacgcgccta ccgaaaccaa atacttttgg aacagtcagc tcttaccacc acgccccgcc 26700
aacaccttaa tcccagaaat tggcccgccg ccctagtgta ccaggaaagt cccgctccca 26760
ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
agttagctgg cggctccacc ctatgtcgtc acaggcctcg gcataatata aaacgcctga 26880
tgatcagagg ccgaggtatc cagctcaacg acgagtcggt gagctctccg cttggtctac 26940
gaccagacgg aatctttcag attgccggct gcgggagatc ttccttcacc cctcgtcagg 27000
ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
aatttgtgga ggagtttact ccctctgtct acttcaaccc cttctccgga tctcctgggc 27120
attacccgga cgagttcata ccgaacttcg acgcgattag cgagtcagtg gacggctacg 27180
attgatgtct ggtgacgcgg ctgagctatc tcggctgcga catctagacc actgccgccg 27240
ctttcgctgc tttgcccggg aactcattga gttcatctac ttcgaactcc ccaaggatca 27300
ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat ttctatcgaa ggcaaaatag actctcgcct 27360
gcaacgaatt ttctcccagc ggcccgtgct gatcgagcga gaccagggaa acaccacggt 27420
ttccatctac tgcatttgta atcaccccgg attgcatgaa agcctttgct gtcttatgtg 27480
tactgagttt aataaaaact gaattaagac tctcctacgg actgccgctt cttcaacccg 27540
gattttacaa ccagaagaac gaaacttttc ctgtcgtcca ggactctgtt aacttcacct 27600
ttcctactca caaactagaa gctcaacgac tacaccgctt ttccagaagc attttcccta 27660
ctaatactac tttcaaaacc ggaggtgagc tccaaggtct tcctacagaa aacccttggg 27720
tggaagcggg ccttgtagtg ctaggaattc ttgcgggtgg gcttgtgatt attctttgct 27780
acctatacac accttgcttc actttcttag tggtgttgtg gtattggttt aaaaaatggg 27840
gcccatacta gtcttgcttg ttttactttc gcttttggaa ccgggttctg ccaattacga 27900
tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 28200
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc gccatgagca ctgaaagcat gatccgggac 29400
gtggagctgg ccgaggaggc gctccccaag aagacagggg ggccccaggg ctccaggcgg 29460
tgcttgttcc tcagcctctt ctccttcctg atcgtggcag gcgccaccac gctcttctgc 29520
ctgctgcact ttggagtgat cggcccccag agggaagagt tccccaggga cctctctcta 29580
atcagccctc tggcccaggc agtcagatca tcttctcgaa ccccgagtga caagcctgta 29640
gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc 29700
aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg agagataacc agctggtggt gccatcagag 29760
ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat 29820
gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc 29880
ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg gagaccccag agggggctga ggccaagccc 29940
tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc 30000
gctgagatca atcggcccga ctatctcgac tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg 30060
atcattgccc tgtgagctag cttgactgac tgagatacag cgtaccttca gctcacagac 30120
atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc 30180
tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa 30240
caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag 30300
gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtcctg caggaacttg tttatttgaa 30360
aatcaattca caaaatccga gtagttattt tgcctccccc ttcccattta acagaataca 30420
ccaatctctc cccacgcaca gctttaaaca tttggatacc attagatata gacatggttt 30480
tagattccac attccaaaca gtttcagagc gagccaatct ggggtcagtg atagataaaa 30540
atccatcggg atagtctttt aaagcgcttt cacagtccaa ctgctgcgga tgcgactccg 30600
gagtctggat cacggtcatc tggaagaaga acgatgggaa tcataatccg aaaacggtat 30660
cggacgattg tgtctcatca aacccacaag cagccgctgt ctgcgtcgct ccgtgcgact 30720
gctgtttatg ggatcagggt ccacagtgtc ctgaagcatg attttaatag cccttaacat 30780
caactttctg gtgcgatgcg cgcagcaacg cattctgatt tcactcaaat ctttgcagta 30840
ggtacaacac attattacaa tattgtttaa taaaccataa ttaaaagcgc tccagccaaa 30900
actcatatct gatataatcg cccctgcatg accatcatac caaagtttaa tataaattaa 30960
atgacgttcc ctcaaaaaca cactacccac atacatgatc tcttttggca tgtgcatatt 31020
aacaatctgt ctgtaccatg gacaacgttg gttaatcatg caacccaata taaccttccg 31080
gaaccacact gccaacaccg ctcccccagc catgcattga agtgaaccct gctgattaca 31140
atgacaatga agaacccaat tctctcgacc gtgaatcact tgagaatgaa aaatatctat 31200
agtggcacaa catagacata aatgcatgca tcttctcata atttttaact cctcaggatt 31260
tagaaacata tcccagggaa taggaagctc ttgcagaaca gtaaagctgg cagaacaagg 31320
aagaccacga acacaactta cactatgcat agtcatagta tcacaatctg gcaacagcgg 31380
gtggtcttca gtcatagaag ctcgggtttc attttcctca caacgtggta actgggctct 31440
ggtgtaaggg tgatgtctgg cgcatgatgt cgagcgtgcg cgcaaccttg tcataatgga 31500
gttgcttcct gacattctcg tattttgtat agcaaaacgc ggccctggca gaacacactc 31560
ttcttcgcct tctatcctgc cgcttagcgt gttccgtgtg atagttcaag tacaaccaca 31620
ctcttaagtt ggtcaaaaga atgctggctt cagttgtaat caaaactcca tcgcatctaa 31680
tcgttctgag gaaatcatcc aagcaatgca actggattgt gtttcaagca ggagaggaga 31740
gggaagagac ggaagaacca tgttaatttt tattccaaac gatctcgcag tacttcaaat 31800
tgtagatcgc gcagatggca tctctcgccc ccactgtgtt ggtgaaaaag cacagctaga 31860
tcaaaagaaa tgcgattttc aaggtgctca acggtggctt ccagcaaagc ctccacgcgc 31920
acatccaaga acaaaagaat accaaaagaa ggagcatttt ctaactcctc aatcatcata 31980
ttacattcct gcaccattcc cagataattt tcagctttcc agccttgaat tattcgtgtc 32040
agttcttgtg gtaaatccaa tccacacatt acaaacaggt cccggagggc gccctccacc 32100
accattctta aacacaccct cataatgaca aaatatcttg ctcctgtgtc acctgtagcg 32160
aattgagaat ggcaacatca attgacatgc ccttggctct aagttcttct ttaagttcta 32220
gttgtaaaaa ctctctcata ttatcaccaa actgcttagc cagaagcccc ccgggaacaa 32280
gagcagggga cgctacagtg cagtacaagc gcagacctcc ccaattggct ccagcaaaaa 32340
caagattgga ataagcatat tgggaaccgc cagtaatatc atcgaagttg ctggaaatat 32400
aatcaggcag agtttcttgt aaaaattgaa taaaagaaaa atttgccaaa aaaacattca 32460
aaacctctgg gatgcaaatg caataggtta ccgcgctgcg ctccaacatt gttagttttg 32520
aattagtctg caaaaataaa aaaaaaaaca agcgtcatat catagtagcc tgacgaacag 32580
atggataaat cagtctttcc atcacaagac aagccacagg gtctccagct cgaccctcgt 32640
aaaacctgtc atcatgatta aacaacagca ccgaaagttc ctcgcggtga ccagcatgaa 32700
taattcttga tgaagcatac aatccagaca tgttagcatc agttaacgag aaaaaacagc 32760
caacatagcc tttgggtata attatgctta atcgtaagta tagcaaagcc acccctcgcg 32820
gatacaaagt aaaaggcaca ggagaataaa aaatataatt atttctctgc tgctgttcag 32880
gcaacgtcgc ccccggtccc tctaaataca catacaaagc ctcatcagcc atggcttacc 32940
agacaaagta cagcgggcac acaaagcaca agctctaaag tgactctcca acctctccac 33000
aatatatata tacacaagcc ctaaactgac gtaatgggag taaagtgtaa aaaatcccgc 33060
caaacccaac acacaccccg aaactgcgtc accagggaaa agtacagttt cacttccgca 33120
atcccaacag gcgtaacttc ctctttctca cggtacgtga tatcccacta acttgcaacg 33180
tcattttccc acggtcgcac cgcccctttt agccgttaac cccacagcca atcaccacac 33240
gatccacact ttttaaaatc acctcattta catattggca ccattccatc tataaggtat 33300
attatataga taga 33314
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 限制性位点插入片段(BY)
<400> 54
gcgatcgcta ccctgcagg 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 限制性位点插入片段(BX)
<400> 55
gcggccgcta tggccggcc 19
<210> 58
<211> 35361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码抗CTLA-4全长抗体的转基因盒组成的NG-242病毒基因组序列。
<400> 58
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
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tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
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ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
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gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
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gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
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cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg 29820
cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 29880
gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 29940
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 30000
cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 30060
gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtcga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa 30120
aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgagctcctg gggggaccgt cagtcttcct 30180
cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt 30240
ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt 30300
ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt 30360
ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa 30420
ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca 30480
gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca 30540
ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga 30600
gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 30660
ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt 30720
cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc 30780
cctgtctccg ggtaaatgat ctagactcga ggtttctaga agttgtctcc tcctgcactg 30840
actgactgac ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc 30900
tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc 30960
cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt 31020
ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct 31080
gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa 31140
aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt 31200
tggatagttg tggaaagagt caaatggctc ccctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag 31260
gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt 31320
tcatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt 31380
tcctttgaaa aacacgatga taataacatg gactggacct ggcgcgtgtt ttgcctgctc 31440
gccgtggctc ctggggccca cagcgatatc cagatgaccc agtctccatc ctccctgtct 31500
gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcaa gtcagagcat taacagctat 31560
ttagattggt atcagcagaa accagggaaa gcccctaaac tcctgatcta tgctgcatcc 31620
agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc agtggcagtg gatctgggac agatttcact 31680
ctcaccatca gcagtctgca acctgaagat tttgcaactt actactgtca acagtattac 31740
agtactccat tcactttcgg ccctgggacc aaagtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca 31800
ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcttctgtt 31860
gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 31920
gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 31980
tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 32040
gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 32100
gagtgttaag ctagcttgac tgactgagat acagcgtacc ttcagctcac agacatgata 32160
agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 32220
tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 32280
aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 32340
taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt agtcgtcagc tatcctgcag gaacttgttt 32400
atttgaaaat caattcacaa aatccgagta gttattttgc ctcccccttc ccatttaaca 32460
gaatacacca atctctcccc acgcacagct ttaaacattt ggataccatt agatatagac 32520
atggttttag attccacatt ccaaacagtt tcagagcgag ccaatctggg gtcagtgata 32580
gataaaaatc catcgggata gtcttttaaa gcgctttcac agtccaactg ctgcggatgc 32640
gactccggag tctggatcac ggtcatctgg aagaagaacg atgggaatca taatccgaaa 32700
acggtatcgg acgattgtgt ctcatcaaac ccacaagcag ccgctgtctg cgtcgctccg 32760
tgcgactgct gtttatggga tcagggtcca cagtgtcctg aagcatgatt ttaatagccc 32820
ttaacatcaa ctttctggtg cgatgcgcgc agcaacgcat tctgatttca ctcaaatctt 32880
tgcagtaggt acaacacatt attacaatat tgtttaataa accataatta aaagcgctcc 32940
agccaaaact catatctgat ataatcgccc ctgcatgacc atcataccaa agtttaatat 33000
aaattaaatg acgttccctc aaaaacacac tacccacata catgatctct tttggcatgt 33060
gcatattaac aatctgtctg taccatggac aacgttggtt aatcatgcaa cccaatataa 33120
ccttccggaa ccacactgcc aacaccgctc ccccagccat gcattgaagt gaaccctgct 33180
gattacaatg acaatgaaga acccaattct ctcgaccgtg aatcacttga gaatgaaaaa 33240
tatctatagt ggcacaacat agacataaat gcatgcatct tctcataatt tttaactcct 33300
caggatttag aaacatatcc cagggaatag gaagctcttg cagaacagta aagctggcag 33360
aacaaggaag accacgaaca caacttacac tatgcatagt catagtatca caatctggca 33420
acagcgggtg gtcttcagtc atagaagctc gggtttcatt ttcctcacaa cgtggtaact 33480
gggctctggt gtaagggtga tgtctggcgc atgatgtcga gcgtgcgcgc aaccttgtca 33540
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cacactcttc ttcgccttct atcctgccgc ttagcgtgtt ccgtgtgata gttcaagtac 33660
aaccacactc ttaagttggt caaaagaatg ctggcttcag ttgtaatcaa aactccatcg 33720
catctaatcg ttctgaggaa atcatccaag caatgcaact ggattgtgtt tcaagcagga 33780
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cacgcgcaca tccaagaaca aaagaatacc aaaagaagga gcattttcta actcctcaat 34020
catcatatta cattcctgca ccattcccag ataattttca gctttccagc cttgaattat 34080
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gcaaaaacaa gattggaata agcatattgg gaaccgccag taatatcatc gaagttgctg 34440
gaaatataat caggcagagt ttcttgtaaa aattgaataa aagaaaaatt tgccaaaaaa 34500
acattcaaaa cctctgggat gcaaatgcaa taggttaccg cgctgcgctc caacattgtt 34560
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ccctcgtaaa acctgtcatc atgattaaac aacagcaccg aaagttcctc gcggtgacca 34740
gcatgaataa ttcttgatga agcatacaat ccagacatgt tagcatcagt taacgagaaa 34800
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cctcgcggat acaaagtaaa aggcacagga gaataaaaaa tataattatt tctctgctgc 34920
tgttcaggca acgtcgcccc cggtccctct aaatacacat acaaagcctc atcagccatg 34980
gcttaccaga caaagtacag cgggcacaca aagcacaagc tctaaagtga ctctccaacc 35040
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tgcaacgtca ttttcccacg gtcgcaccgc cccttttagc cgttaacccc acagccaatc 35280
accacacgat ccacactttt taaaatcacc tcatttacat attggcacca ttccatctat 35340
aaggtatatt atatagatag a 35361
<210> 59
<211> 34807
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码抗VEGF全长抗体的转基因盒组成的NG-165病毒基因组序列。
<400> 59
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
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tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
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cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
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ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
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ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
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ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
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gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
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cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
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gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
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gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
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gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
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cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
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gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
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cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
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cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
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atatcgggca ggatgtcact ccacagcttt ctggtcagct gcaaagctcc aagcaggtca 22020
ggagccgaaa tcttgaaatc acaattagga ccagtgcttt gagcgcgaga gttgcggtac 22080
accggattgc agcactgaaa caccatcagc gacggatgtc tcacgcttgc cagcacggtg 22140
ggatctgcaa tcatgcccac atccagatct tcagcattgg caatgctgaa cggggtcatc 22200
ttgcaggtct gcctacccat ggcgggcacc caattaggct tgtggttgca atcgcagtgc 22260
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aaagcatcat attgcttgaa agcctgctgg gctttactac cctcggtata aaacatcccg 22380
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tcgggattct cctttaaggc tcgttgtccg ttctcgctgg ccacatccat ctcgataatc 22560
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aaagaatgta tcattccctg cagaaatctt cccatcatcg tgctcagtgt cttgtgacta 22740
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tattgttcgt gttgctcagg cattagttta aaagaggttc taagttcgtt atccagcctg 22860
tacttctcca tcagcagaca catcacttcc atgcctttct cccaagcaga caccaggggc 22920
aagctaatcg gattcttaac agtgcaggca gcagctcctt tagccagagg gtcatcttta 22980
gcgatcttct caatgcttct tttgccatcc ttctcaacga tgcgcacggg cgggtagctg 23040
aaacccactg ctacaagttg cgcctcttct ctttcttctt cgctgtcttg actgatgtct 23100
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ccgactacct catagggctt gacggggaag acgcgctcct taaacatcta gcaagacagt 23820
cgctcatagt caaggatgca ttattggaca gaactgaagt gcccatcagt gtggaagagc 23880
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tactggctac ctatcacatc ttttttaaaa atcaaaaaat tccagtctcc tgccgcgcta 24060
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cttccttgga agaggttcca aagatcttcg agggtctggg caataatgag actcgggccg 24180
caaatgctct gcaaaaggga gaaaatggca tggatgagca tcacagcgtt ctggtggaat 24240
tggaaggcga taatgccaga ctcgcagtac tcaagcgaag catcgaggtc acacacttcg 24300
catatcccgc tgtcaacctg ccccctaaag tcatgacggc ggtcatggac cagttactca 24360
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ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
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atctctccta ccactcggat gtgatcgagg atgtgagcgg agacggcttg ctggagtgtc 25200
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catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
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cgaacacaac ttacactatg catagtcata gtatcacaat ctggcaacag cgggtggtct 32880
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gaggaaatca tccaagcaat gcaactggat tgtgtttcaa gcaggagagg agagggaaga 33240
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ctgcaaaaat aaaaaaaaaa acaagcgtca tatcatagta gcctgacgaa cagatggata 34080
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cgcccccggt ccctctaaat acacatacaa agcctcatca gccatggctt accagacaaa 34440
gtacagcggg cacacaaagc acaagctcta aagtgactct ccaacctctc cacaatatat 34500
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caggcgtaac ttcctctttc tcacggtacg tgatatccca ctaacttgca acgtcatttt 34680
cccacggtcg caccgcccct tttagccgtt aaccccacag ccaatcacca cacgatccac 34740
actttttaaa atcacctcat ttacatattg gcaccattcc atctataagg tatattatat 34800
agataga 34807
<210> 60
<211> 34792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码抗PD-L1全长抗体的转基因盒组成的NG-190病毒基因组序列。
<400> 60
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
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ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
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caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
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gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
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tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
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gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
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tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
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tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
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gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
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gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
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gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
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taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
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cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
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gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
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actagcaaac ctctgaccgc ccagctgttt ctggtggtgc aacacagcag agacaatgag 11280
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cgatagaatg cattcttctg catcgctgtc cggggtcatg ggtgctaccg cggctgagcc 13200
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tacaagtaga gcgagccgta gacgccagcg ccatgacaga cagaggggtc ttgtgtggga 13500
cgatgaggat tcggccgatg atagcagcgt gctggacttg ggtgggagag gaaggggcaa 13560
cccgtttgct catttgcgcc ctcgcttggg tggtatgttg taaaaaaaaa taaaaaaaaa 13620
actcaccaag gccatggcga cgagcgtacg ttcgttcttc tttattatct gtgtctagta 13680
taatgaggcg agtcgtgcta ggcggagcgg tggtgtatcc ggagggtcct cctccttcgt 13740
acgagagcgt gatgcagcag cagcaggcga cggcggtgat gcaatcccca ctggaggctc 13800
cctttgtgcc tccgcgatac ctggcaccta cggagggcag aaacagcatt cgttattcgg 13860
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tcagaggaga caattttgcg ccaacacctg ttccgactgc agaatcatta ttggccgatg 14760
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gaagctataa tgtgttggaa gacaaaatca acacagccta tcgcagttgg tatctttcgt 14880
acaattatgg cgatcccgaa aaaggagtgc gttcctggac attgctcacc acctcagatg 14940
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ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc caccatggga tggagctgca ttatcctgtt 29400
tctggttgct actgccactg gagtgcatag cgaggtacag cttgtcgagt ctggaggtgg 29460
gctggtacaa ccaggcggat ccctcagact gtcttgtgcc gcatctggct tcacgttcag 29520
cgatagttgg atacactggg tgaggcaggc accagggaaa ggtctggagt gggtggcttg 29580
gataagccca tatggtggct ccacatatta cgccgactca gtgaagggtc gcttcaccat 29640
ttctgctgat acgtcaaaga acacagccta tctccagatg aactcccttc gtgccgagga 29700
taccgctgtc tactattgtg cccggagaca ttggcctggc gggttcgact actggggaca 29760
ggggactctc gtcactgttt ctgcagcgtc tactaaaggg cccagcgtgt ttcctcttgc 29820
tccctccagt aagtcaacta gtggcggcac cgctgctttg ggctgcctgg tcaaggacta 29880
ttttccagag cctgtaaccg tgagctggaa tagtggagca ttgacctcag gagtgcacac 29940
atttcccgca gtgctgcagt caagcggact gtacagcctt tccagtgtgg tgaccgttcc 30000
ttcctcaagt ctgggcactc aaacctacat ctgcaacgtg aaccacaaac ccagcaatac 30060
caaagtcgac aagaaggttg agccgaagag ctgtgacaaa acgcacacat gccctccatg 30120
tcccgcccca gaactgctcg gtggaccgtc cgtgttcctg tttcctccga agcccaagga 30180
cacactgatg atcagtcgca ccccagaagt cacctgtgtg gtggtggcgg taagccacga 30240
agatcccgag gtcaagttca attggtatgt cgatggggtt gaggtccaca atgccaagac 30300
taagccaagg gaggaacagt atgccagcac ataccgagtc gtgtctgtgc tgaccgttct 30360
gcatcaggac tggctcaacg ggaaagagta caagtgcaaa gtgtccaaca aggcacttcc 30420
tgcccctatc gagaaaacca tcagcaaggc gaaaggtcag cccagagaac cacaagtcta 30480
cacactgcca ccctctcggg acgaactcac aaagaatcag gtgtcactga catgcttggt 30540
taaaggcttt taccccagcg atattgccgt ggaatgggaa tccaatgggc aacctgagaa 30600
caactacaag actacacctc ccgtattgga tagcgatgga agcttcttcc tgtactctaa 30660
gttgacggtt gacaaatcca ggtggcagca gggcaatgtg ttttcttgct ccgtaatgca 30720
tgaagctctg cataatcact atacccagaa atccctctca ctgagtccgg gcaaaggaag 30780
cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc 30840
tgactggacc tggcgcgtgt tttgcctgct cgccgtggct cctggggccc acagcgatat 30900
ccaaatgact cagtctccct cttcactgtc tgcaagcgtt ggcgataggg tgacaattac 30960
ctgtagagcg agtcaggacg tttcaaccgc tgtagcctgg taccagcaga aaccgggaaa 31020
agcccctaag ctgctcattt actccgcttc ctttctctat tccggagtgc ctagccgatt 31080
tagtggctct ggttcaggga ctgacttcac actgaccata tccagtctgc aaccagagga 31140
tttcgcgacg tactactgtc agcagtatct gtatcacccc gctacatttg ggcaagggac 31200
aaaagtggag atcaaacgga ctgtagccgc acccagcgtg ttcatctttc caccctctga 31260
tgagcagctt aagagcggta cggcatctgt cgtgtgcttg ctgaacaact tctatcctcg 31320
tgaagccaaa gtccagtgga aggtggacaa tgccttgcag tcaggcaact cacaggaaag 31380
cgtcactgaa caggacagca aggatagtac ctacagcctg tccagcacac tgactctctc 31440
caaagccgac tatgagaagc acaaggttta cgcttgcgaa gtgacccatc aaggccttag 31500
cagtccagtc accaagtcct tcaatcgcgg agagtgctga gctagcttga ctgactgaga 31560
tacagcgtac cttcagctca cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 31620
aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 31680
tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 31740
tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 31800
tagtcgtcag ctatcctgca ggaacttgtt tatttgaaaa tcaattcaca aaatccgagt 31860
agttattttg cctccccctt cccatttaac agaatacacc aatctctccc cacgcacagc 31920
tttaaacatt tggataccat tagatataga catggtttta gattccacat tccaaacagt 31980
ttcagagcga gccaatctgg ggtcagtgat agataaaaat ccatcgggat agtcttttaa 32040
agcgctttca cagtccaact gctgcggatg cgactccgga gtctggatca cggtcatctg 32100
gaagaagaac gatgggaatc ataatccgaa aacggtatcg gacgattgtg tctcatcaaa 32160
cccacaagca gccgctgtct gcgtcgctcc gtgcgactgc tgtttatggg atcagggtcc 32220
acagtgtcct gaagcatgat tttaatagcc cttaacatca actttctggt gcgatgcgcg 32280
cagcaacgca ttctgatttc actcaaatct ttgcagtagg tacaacacat tattacaata 32340
ttgtttaata aaccataatt aaaagcgctc cagccaaaac tcatatctga tataatcgcc 32400
cctgcatgac catcatacca aagtttaata taaattaaat gacgttccct caaaaacaca 32460
ctacccacat acatgatctc ttttggcatg tgcatattaa caatctgtct gtaccatgga 32520
caacgttggt taatcatgca acccaatata accttccgga accacactgc caacaccgct 32580
cccccagcca tgcattgaag tgaaccctgc tgattacaat gacaatgaag aacccaattc 32640
tctcgaccgt gaatcacttg agaatgaaaa atatctatag tggcacaaca tagacataaa 32700
tgcatgcatc ttctcataat ttttaactcc tcaggattta gaaacatatc ccagggaata 32760
ggaagctctt gcagaacagt aaagctggca gaacaaggaa gaccacgaac acaacttaca 32820
ctatgcatag tcatagtatc acaatctggc aacagcgggt ggtcttcagt catagaagct 32880
cgggtttcat tttcctcaca acgtggtaac tgggctctgg tgtaagggtg atgtctggcg 32940
catgatgtcg agcgtgcgcg caaccttgtc ataatggagt tgcttcctga cattctcgta 33000
ttttgtatag caaaacgcgg ccctggcaga acacactctt cttcgccttc tatcctgccg 33060
cttagcgtgt tccgtgtgat agttcaagta caaccacact cttaagttgg tcaaaagaat 33120
gctggcttca gttgtaatca aaactccatc gcatctaatc gttctgagga aatcatccaa 33180
gcaatgcaac tggattgtgt ttcaagcagg agaggagagg gaagagacgg aagaaccatg 33240
ttaattttta ttccaaacga tctcgcagta cttcaaattg tagatcgcgc agatggcatc 33300
tctcgccccc actgtgttgg tgaaaaagca cagctagatc aaaagaaatg cgattttcaa 33360
ggtgctcaac ggtggcttcc agcaaagcct ccacgcgcac atccaagaac aaaagaatac 33420
caaaagaagg agcattttct aactcctcaa tcatcatatt acattcctgc accattccca 33480
gataattttc agctttccag ccttgaatta ttcgtgtcag ttcttgtggt aaatccaatc 33540
cacacattac aaacaggtcc cggagggcgc cctccaccac cattcttaaa cacaccctca 33600
taatgacaaa atatcttgct cctgtgtcac ctgtagcgaa ttgagaatgg caacatcaat 33660
tgacatgccc ttggctctaa gttcttcttt aagttctagt tgtaaaaact ctctcatatt 33720
atcaccaaac tgcttagcca gaagcccccc gggaacaaga gcaggggacg ctacagtgca 33780
gtacaagcgc agacctcccc aattggctcc agcaaaaaca agattggaat aagcatattg 33840
ggaaccgcca gtaatatcat cgaagttgct ggaaatataa tcaggcagag tttcttgtaa 33900
aaattgaata aaagaaaaat ttgccaaaaa aacattcaaa acctctggga tgcaaatgca 33960
ataggttacc gcgctgcgct ccaacattgt tagttttgaa ttagtctgca aaaataaaaa 34020
aaaaaacaag cgtcatatca tagtagcctg acgaacagat ggataaatca gtctttccat 34080
cacaagacaa gccacagggt ctccagctcg accctcgtaa aacctgtcat catgattaaa 34140
caacagcacc gaaagttcct cgcggtgacc agcatgaata attcttgatg aagcatacaa 34200
tccagacatg ttagcatcag ttaacgagaa aaaacagcca acatagcctt tgggtataat 34260
tatgcttaat cgtaagtata gcaaagccac ccctcgcgga tacaaagtaa aaggcacagg 34320
agaataaaaa atataattat ttctctgctg ctgttcaggc aacgtcgccc ccggtccctc 34380
taaatacaca tacaaagcct catcagccat ggcttaccag acaaagtaca gcgggcacac 34440
aaagcacaag ctctaaagtg actctccaac ctctccacaa tatatatata cacaagccct 34500
aaactgacgt aatgggagta aagtgtaaaa aatcccgcca aacccaacac acaccccgaa 34560
actgcgtcac cagggaaaag tacagtttca cttccgcaat cccaacaggc gtaacttcct 34620
ctttctcacg gtacgtgata tcccactaac ttgcaacgtc attttcccac ggtcgcaccg 34680
ccccttttag ccgttaaccc cacagccaat caccacacga tccacacttt ttaaaatcac 34740
ctcatttaca tattggcacc attccatcta taaggtatat tatatagata ga 34792
<210> 61
<211> 34792
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由具有插入BY区中的编码具有C端His6标签的抗PD-L1 ScFv的转基因盒的EnAd基因组组成的NG-221病毒基因组序列。
<400> 61
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
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ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
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tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
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agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
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gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940
cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000
tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
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aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480
aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540
aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600
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ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900
tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
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taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
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gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380
cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
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acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620
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caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
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gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220
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gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
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gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
atcggccatc atggaagctg tagtgccttc ccgctctaat cccactcatg agaaggtcct 12060
ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
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gggttaccta ctaaacctgt atcgcgaagc catagggcaa agtcaggtgg acgagcagac 12660
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gctcagaccg gcaagagaaa aaaatttccc aaacaatgga atagaaagtt tggtggataa 13380
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tcccggggtt catggccccc gataagctcg cctgtgccat tgtaaatacg gccggacgtg 21300
agacgggggg agagcactgg ttggctttcg gttggaaccc acgttctaac acctgctacc 21360
tttttgatcc ttttggattc tcggatgatc gtctcaaaca gatttaccag tttgaatatg 21420
agggtctcct gcgccgcagc gctcttgcta ccaaggaccg ctgtattacg ctggaaaaat 21480
ctacccagac cgtgcagggt ccccgttctg ccgcctgcgg acttttctgc tgcatgttcc 21540
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taactggagt gccaaacaac atgcttcatt ctcctaaagt ccagcccacc ctgtgtgaca 21660
atcaaaaagc actctaccat tttcttaata cccattcgcc ttattttcgc tcccatcgta 21720
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caacgtgttc aataaacatc actttatttt tttacatgta tcaaggctct gcattactta 21840
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ttgcggaact gatacttggg ttgccacttg aattcgggaa tcaccaactt gggaaccggt 21960
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accggattgc agcactgaaa caccatcagc gacggatgtc tcacgcttgc cagcacggtg 22140
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tattgttcgt gttgctcagg cattagttta aaagaggttc taagttcgtt atccagcctg 22860
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ccgtcgcttc cgacctggca gacctcatct tcccagagcg tctcagggtt actttgcgaa 24960
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ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
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ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat ttctatcgaa ggcaaaatag actctcgcct 27360
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ccccttttag ccgttaaccc cacagccaat caccacacga tccacacttt ttaaaatcac 34740
ctcatttaca tattggcacc attccatcta taaggtatat tatatagata ga 34792
<210> 63
<211> 32364
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由具有插入BX和BY区中的独特限制性位点的EnAd基因组组成的NG-185病毒基因组序列。
<400> 63
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
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tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
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cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
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ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
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gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
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caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
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gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
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tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
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tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
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ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
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gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
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gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
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gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
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taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
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tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
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ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
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aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
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ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
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caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
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atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
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gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
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gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
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gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
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gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
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gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
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ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
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gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
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gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
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cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
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caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
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gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
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ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
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cgagtctgca agtccttttc ctagtctacc cttttctcta cacagtgtac gtagcagcga 13260
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gctcagaccg gcaagagaaa aaaatttccc aaacaatgga atagaaagtt tggtggataa 13380
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tacaagtaga gcgagccgta gacgccagcg ccatgacaga cagaggggtc ttgtgtggga 13500
cgatgaggat tcggccgatg atagcagcgt gctggacttg ggtgggagag gaaggggcaa 13560
cccgtttgct catttgcgcc ctcgcttggg tggtatgttg taaaaaaaaa taaaaaaaaa 13620
actcaccaag gccatggcga cgagcgtacg ttcgttcttc tttattatct gtgtctagta 13680
taatgaggcg agtcgtgcta ggcggagcgg tggtgtatcc ggagggtcct cctccttcgt 13740
acgagagcgt gatgcagcag cagcaggcga cggcggtgat gcaatcccca ctggaggctc 13800
cctttgtgcc tccgcgatac ctggcaccta cggagggcag aaacagcatt cgttattcgg 13860
aactggcacc tcagtacgat accaccaggt tgtatctggt ggacaacaag tcggcggaca 13920
ttgcttctct gaactatcag aatgaccaca gcaacttctt gaccacggtg gtgcaaaaca 13980
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gcccatacta gtcttgcttg ttttactttc gcttttggaa ccgggttctg ccaattacga 27900
tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta ctgcggccgc 28200
tatggccggc ctgaaatcag caataaggtc tctgttgaaa ttttctccca gcagcacctc 28260
acttccctct tcccaactct ggtattctaa accccgttca gcggcatact ttctccatac 28320
tttaaagggg atgtcaaatt ttagctcctc tcctgtaccc acaatcttca tgtctttctt 28380
cccagatgac caagagagtc cggctcagtg actccttcaa ccctgtctac ccctatgaag 28440
atgaaagcac ctcccaacac ccctttataa acccagggtt tatttcccca aatggcttca 28500
cacaaagccc aaacggagtt cttactttaa aatgtttaac cccactaaca accacaggcg 28560
gatctctaca gctaaaagtg ggagggggac ttacagtgga tgacaccaac ggttttttga 28620
aagaaaacat aagtgccacc acaccactcg ttaagactgg tcactctata ggtttaccac 28680
taggagccgg attgggaacg aatgaaaata aactttgtat caaattagga caaggactta 28740
cattcaattc aaacaacatt tgcattgatg acaatattaa caccttatgg acaggagtca 28800
accccaccga agccaactgt caaatcatga actccagtga atctaatgat tgcaaattaa 28860
ttctaacact agttaaaact ggagcactag tcactgcatt tgtttatgtt ataggagtat 28920
ctaacaattt taatatgcta actacacaca gaaatataaa ttttactgca gagctgtttt 28980
tcgattctac tggtaattta ctaactagac tctcatccct caaaactcca cttaatcata 29040
aatcaggaca aaacatggct actggtgcca ttactaatgc taaaggtttc atgcccagca 29100
cgactgccta tcctttcaat gataattcta gagaaaaaga aaactacatt tacggaactt 29160
gttactacac agctagtgat cgcactgctt ttcccattga catatctgtc atgcttaacc 29220
gaagagcaat aaatgacgag acatcatatt gtattcgtat aacttggtcc tggaacacag 29280
gagatgcccc agaggtgcaa acctctgcta caaccctagt cacctcccca tttacctttt 29340
actacatcag agaagacgac tgacaaataa agtttgcgat cgctaccctg caggaacttg 29400
tttatttgaa aatcaattca caaaatccga gtagttattt tgcctccccc ttcccattta 29460
acagaataca ccaatctctc cccacgcaca gctttaaaca tttggatacc attagatata 29520
gacatggttt tagattccac attccaaaca gtttcagagc gagccaatct ggggtcagtg 29580
atagataaaa atccatcggg atagtctttt aaagcgcttt cacagtccaa ctgctgcgga 29640
tgcgactccg gagtctggat cacggtcatc tggaagaaga acgatgggaa tcataatccg 29700
aaaacggtat cggacgattg tgtctcatca aacccacaag cagccgctgt ctgcgtcgct 29760
ccgtgcgact gctgtttatg ggatcagggt ccacagtgtc ctgaagcatg attttaatag 29820
cccttaacat caactttctg gtgcgatgcg cgcagcaacg cattctgatt tcactcaaat 29880
ctttgcagta ggtacaacac attattacaa tattgtttaa taaaccataa ttaaaagcgc 29940
tccagccaaa actcatatct gatataatcg cccctgcatg accatcatac caaagtttaa 30000
tataaattaa atgacgttcc ctcaaaaaca cactacccac atacatgatc tcttttggca 30060
tgtgcatatt aacaatctgt ctgtaccatg gacaacgttg gttaatcatg caacccaata 30120
taaccttccg gaaccacact gccaacaccg ctcccccagc catgcattga agtgaaccct 30180
gctgattaca atgacaatga agaacccaat tctctcgacc gtgaatcact tgagaatgaa 30240
aaatatctat agtggcacaa catagacata aatgcatgca tcttctcata atttttaact 30300
cctcaggatt tagaaacata tcccagggaa taggaagctc ttgcagaaca gtaaagctgg 30360
cagaacaagg aagaccacga acacaactta cactatgcat agtcatagta tcacaatctg 30420
gcaacagcgg gtggtcttca gtcatagaag ctcgggtttc attttcctca caacgtggta 30480
actgggctct ggtgtaaggg tgatgtctgg cgcatgatgt cgagcgtgcg cgcaaccttg 30540
tcataatgga gttgcttcct gacattctcg tattttgtat agcaaaacgc ggccctggca 30600
gaacacactc ttcttcgcct tctatcctgc cgcttagcgt gttccgtgtg atagttcaag 30660
tacaaccaca ctcttaagtt ggtcaaaaga atgctggctt cagttgtaat caaaactcca 30720
tcgcatctaa tcgttctgag gaaatcatcc aagcaatgca actggattgt gtttcaagca 30780
ggagaggaga gggaagagac ggaagaacca tgttaatttt tattccaaac gatctcgcag 30840
tacttcaaat tgtagatcgc gcagatggca tctctcgccc ccactgtgtt ggtgaaaaag 30900
cacagctaga tcaaaagaaa tgcgattttc aaggtgctca acggtggctt ccagcaaagc 30960
ctccacgcgc acatccaaga acaaaagaat accaaaagaa ggagcatttt ctaactcctc 31020
aatcatcata ttacattcct gcaccattcc cagataattt tcagctttcc agccttgaat 31080
tattcgtgtc agttcttgtg gtaaatccaa tccacacatt acaaacaggt cccggagggc 31140
gccctccacc accattctta aacacaccct cataatgaca aaatatcttg ctcctgtgtc 31200
acctgtagcg aattgagaat ggcaacatca attgacatgc ccttggctct aagttcttct 31260
ttaagttcta gttgtaaaaa ctctctcata ttatcaccaa actgcttagc cagaagcccc 31320
ccgggaacaa gagcagggga cgctacagtg cagtacaagc gcagacctcc ccaattggct 31380
ccagcaaaaa caagattgga ataagcatat tgggaaccgc cagtaatatc atcgaagttg 31440
ctggaaatat aatcaggcag agtttcttgt aaaaattgaa taaaagaaaa atttgccaaa 31500
aaaacattca aaacctctgg gatgcaaatg caataggtta ccgcgctgcg ctccaacatt 31560
gttagttttg aattagtctg caaaaataaa aaaaaaaaca agcgtcatat catagtagcc 31620
tgacgaacag atggataaat cagtctttcc atcacaagac aagccacagg gtctccagct 31680
cgaccctcgt aaaacctgtc atcatgatta aacaacagca ccgaaagttc ctcgcggtga 31740
ccagcatgaa taattcttga tgaagcatac aatccagaca tgttagcatc agttaacgag 31800
aaaaaacagc caacatagcc tttgggtata attatgctta atcgtaagta tagcaaagcc 31860
acccctcgcg gatacaaagt aaaaggcaca ggagaataaa aaatataatt atttctctgc 31920
tgctgttcag gcaacgtcgc ccccggtccc tctaaataca catacaaagc ctcatcagcc 31980
atggcttacc agacaaagta cagcgggcac acaaagcaca agctctaaag tgactctcca 32040
acctctccac aatatatata tacacaagcc ctaaactgac gtaatgggag taaagtgtaa 32100
aaaatcccgc caaacccaac acacaccccg aaactgcgtc accagggaaa agtacagttt 32160
cacttccgca atcccaacag gcgtaacttc ctctttctca cggtacgtga tatcccacta 32220
acttgcaacg tcattttccc acggtcgcac cgcccctttt agccgttaac cccacagcca 32280
atcaccacac gatccacact ttttaaaatc acctcattta catattggca ccattccatc 32340
tataaggtat attatataga taga 32364
<210> 64
<211> 35208
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由细菌复制起点(p15A)、抗生素抗性基因(KanR)和EnAd基因组组成的pNG-33(pColoAd2.4) DNA质粒
<400> 64
ggcgcgccta tctatataat ataccttata gatggaatgg tgccaatatg taaatgaggt 60
gattttaaaa agtgtggatc gtgtggtgat tggctgtggg gttaacggct aaaaggggcg 120
gtgcgaccgt gggaaaatga cgttttgtgg gggtggagtt tttttgcaag ttgtcgcggg 180
aaatgtgacg cataaaaagg cttttttctc acggaactac ttagttttcc cacggtattt 240
aacaggaaat gaggtagttt tgaccggatg caagtgaaaa ttgttgattt tcgcgcgaaa 300
actgaatgag gaagtgtttt tctgaataat gtggtattta tggcagggtg gagtatttgt 360
tcagggccag gtagactttg acccattacg tggaggtttc gattaccgtg ttttttacct 420
gaatttccgc gtaccgtgtc aaagtcttct gtttttacgt aggtgtcagc tgatcgctag 480
ggtatttata cctcagggtt tgtgtcaaga ggccactctt gagtgccagc gagaagagtt 540
ttctcctctg cgccggcagt ttaataataa aaaaatgaga gatttgcgat ttctgcctca 600
ggaaataatc tctgctgaga ctggaaatga aatattggag cttgtggtgc acgccctgat 660
gggagacgat ccggagccac ctgtgcagct ttttgagcct cctacgcttc aggaactgta 720
tgatttagag gtagagggat cggaggattc taatgaggaa gctgtaaatg gcttttttac 780
cgattctatg cttttagctg ctaatgaagg gttagaatta gatccgcctt tggacacttt 840
tgatactcca ggggtaattg tggaaagcgg tacaggtgta agaaaattac ctgatttgag 900
ttccgtggac tgtgatttgc actgctatga agacgggttt cctccgagtg atgaggagga 960
ccatgaaaag gagcagtcca tgcagactgc agcgggtgag ggagtgaagg ctgccaatgt 1020
tggttttcag ttggattgcc cggagcttcc tggacatggc tgtaagtctt gtgaatttca 1080
caggaaaaat actggagtaa aggaactgtt atgttcgctt tgttatatga gaacgcactg 1140
ccactttatt tacagtaagt gtgtttaagt taaaatttaa aggaatatgc tgtttttcac 1200
atgtatattg agtgtgagtt ttgtgcttct tattataggt cctgtgtctg atgctgatga 1260
atcaccatct cctgattcta ctacctcacc tcctgagatt caagcacctg ttcctgtgga 1320
cgtgcgcaag cccattcctg tgaagcttaa gcctgggaaa cgtccagcag tggaaaaact 1380
tgaggacttg ttacagggtg gggacggacc tttggacttg agtacacgga aacgtccaag 1440
acaataagtg ttccatatcc gtgtttactt aaggtgacgt caatatttgt gtgacagtgc 1500
aatgtaataa aaatatgtta actgttcact ggtttttatt gctttttggg cggggactca 1560
ggtatataag tagaagcaga cctgtgtggt tagctcatag gagctggctt tcatccatgg 1620
aggtttgggc cattttggaa gaccttagga agactaggca actgttagag aacgcttcgg 1680
acggagtctc cggtttttgg agattctggt tcgctagtga attagctagg gtagttttta 1740
ggataaaaca ggactataaa caagaatttg aaaagttgtt ggtagattgc ccaggacttt 1800
ttgaagctct taatttgggc catcaggttc actttaaaga aaaagtttta tcagttttag 1860
acttttcaac cccaggtaga actgctgctg ctgtggcttt tcttactttt atattagata 1920
aatggatccc gcagactcat ttcagcaggg gatacgtttt ggatttcata gccacagcat 1980
tgtggagaac atggaaggtt cgcaagatga ggacaatctt aggttactgg ccagtgcagc 2040
ctttgggtgt agcgggaatc ctgaggcatc caccggtcat gccagcggtt ctggaggagg 2100
aacagcaaga ggacaacccg agagccggcc tggaccctcc agtggaggag gcggagtagc 2160
tgacttgtct cctgaactgc aacgggtgct tactggatct acgtccactg gacgggatag 2220
gggcgttaag agggagaggg catctagtgg tactgatgct agatctgagt tggctttaag 2280
tttaatgagt cgcagacgtc ctgaaaccat ttggtggcat gaggttcaga aagagggaag 2340
ggatgaagtt tctgtattgc aggagaaata ttcactggaa caggtgaaaa catgttggtt 2400
ggagcctgag gatgattggg aggtggccat taaaaattat gccaagatag ctttgaggcc 2460
tgataaacag tataagatta ctagacggat taatatccgg aatgcttgtt acatatctgg 2520
aaatggggct gaggtggtaa tagatactca agacaaggca gttattagat gctgcatgat 2580
ggatatgtgg cctggggtag tcggtatgga agcagtaact tttgtaaatg ttaagtttag 2640
gggagatggt tataatggaa tagtgtttat ggccaatacc aaacttatat tgcatggttg 2700
tagctttttt ggtttcaaca atacctgtgt agatgcctgg ggacaggtta gtgtacgggg 2760
atgtagtttc tatgcgtgtt ggattgccac agctggcaga accaagagtc aattgtctct 2820
gaagaaatgc atatttcaaa gatgtaacct gggcattctg aatgaaggcg aagcaagggt 2880
ccgccactgc gcttctacag atactggatg ttttattttg attaagggaa atgccagcgt 2940
aaagcataac atgatttgcg gtgcttccga tgagaggcct tatcaaatgc tcacttgtgc 3000
tggtgggcat tgtaatatgc tggctactgt gcatattgtt tcccatcaac gcaaaaaatg 3060
gcctgttttt gatcacaatg tgatgacgaa gtgtaccatg catgcaggtg ggcgtagagg 3120
aatgtttatg ccttaccagt gtaacatgaa tcatgtgaaa gtgttgttgg aaccagatgc 3180
cttttccaga atgagcctaa caggaatttt tgacatgaac atgcaaatct ggaagatcct 3240
gaggtatgat gatacgagat cgagggtacg cgcatgcgaa tgcggaggca agcatgccag 3300
gttccagccg gtgtgtgtag atgtgactga agatctcaga ccggatcatt tggttattgc 3360
ccgcactgga gcagagttcg gatccagtgg agaagaaact gactaaggtg agtattggga 3420
aaactttggg gtgggatttt cagatggaca gattgagtaa aaatttgttt tttctgtctt 3480
gcagctgtca tgagtggaaa cgcttctttt aaggggggag tcttcagccc ttatctgaca 3540
gggcgtctcc catcctgggc aggagttcgt cagaatgtta tgggatctac tgtggatgga 3600
agacccgtcc aacccgccaa ttcttcaacg ctgacctatg ctactttaag ttcttcacct 3660
ttggacgcag ctgcagctgc cgccgccgct tctgttgccg ctaacactgt gcttggaatg 3720
ggttactatg gaagcatcat ggctaattcc acttcctcta ataacccttc taccctgact 3780
caggacaagt tacttgtcct tttggcccag ctggaggctt tgacccaacg tctgggtgaa 3840
ctttctcagc aggtggtcga gttgcgagta caaactgagt ctgctgtcgg cacggcaaag 3900
tctaaataaa aaaatcccag aatcaatgaa taaataaaca agcttgttgt tgatttaaaa 3960
tcaagtgttt ttatttcatt tttcgcgcac ggtatgccct agaccaccga tctctatcat 4020
tgagaactcg gtggattttt tccaggatcc tatagaggtg ggattgaatg tttagataca 4080
tgggcattag gccgtctttg gggtggagat agctccattg aagggattca tgctccgggg 4140
tagtgttgta aatcacccag tcataacaag gtcgcagtgc atggtgttgc acaatatctt 4200
ttagaagtag gctgattgcc acagataagc ccttggtgta ggtgtttaca aaccggttga 4260
gctgggatgg gtgcattcgg ggtgaaatta tgtgcatttt ggattggatt tttaagttgg 4320
caatattgcc gccaagatcc cgtcttgggt tcatgttatg aaggaccacc aagacggtgt 4380
atccggtaca tttaggaaat ttatcgtgca gcttggatgg aaaagcgtgg aaaaatttgg 4440
agacaccctt gtgtcctcca agattttcca tgcactcatc catgataata gcaatggggc 4500
cgtgggcagc ggcgcgggca aacacgttcc gtgggtctga cacatcatag ttatgttcct 4560
gagttaaatc atcataagcc attttaatga atttggggcg gagagtacca gattggggta 4620
tgaatgttcc ttcgggcccc ggagcatagt tcccctcaca gatttgcatt tcccaagctt 4680
tcagttccga gggtggaatc atgtccacct ggggggctat gaaaaacacc gtttctgggg 4740
cgggggtgat taattgtgat gatagcaaat ttctgagcaa ttgagatttg ccacatccgg 4800
tggggccata aatgattccg attacgggtt gcaggtggta gtttagggaa cggcaactgc 4860
cgtcttctcg aagcaagggg gccacctcgt tcatcatttc ccttacatgc atattttccc 4920
gcaccaaatc cattaggagg cgctctcctc ctagtgatag aagttcttgt agtgaggaaa 4980
agtttttcag cggtttcaga ccgtcagcca tgggcatttt ggagagagtt tgctgcaaaa 5040
gttctagtct gttccacagt tcagtgatgt gttctatggc atctcgatcc agcagacctc 5100
ctcgtttcgc gggtttggac ggctcctgga atagggtatg agacgatggg cgtccagcgc 5160
tgccagggtt cggtccttcc agggtctcag tgttcgagtc agggttgttt ccgtcacagt 5220
gaaggggtgt gcgcctgctt gggcgcttgc cagggtgcgc ttcagactca tcctgctggt 5280
cgaaaacttc tgtcgcttgg cgccctgtat gtcggccaag tagcagttta ccatgagttc 5340
gtagttgagc gcctcggctg cgtggccttt ggcgcggagc ttacctttgg aagttttctt 5400
gcataccggg cagtataggc atttcagcgc atacaacttg ggcgcaagga aaacggattc 5460
tggggagtat gcatctgcgc cgcaggaggc gcaaacagtt tcacattcca ccagccaggt 5520
taaatccggt tcattggggt caaaaacaag ttttccgcca tattttttga tgcgtttctt 5580
acctttggtc tccatgagtt cgtgtcctcg ttgagtgaca aacaggctgt ccgtgtcccc 5640
gtagactgat tttacaggcc tcttctccag tggagtgcct cggtcttctt cgtacaggaa 5700
ctctgaccac tctgatacaa aggcgcgcgt ccaggccagc acaaaggagg ctatgtggga 5760
ggggtagcga tcgttgtcaa ccagggggtc caccttttcc aaagtatgca aacacatgtc 5820
accctcttca acatccagga atgtgattgg cttgtaggtg tatttcacgt gacctggggt 5880
ccccgctggg ggggtataaa agggggcggt tctttgctct tcctcactgt cttccggatc 5940
gctgtccagg aacgtcagct gttggggtag gtattccctc tcgaaggcgg gcatgacctc 6000
tgcactcagg ttgtcagttt ctaagaacga ggaggatttg atattgacag tgccggttga 6060
gatgcctttc atgaggtttt cgtccatctg gtcagaaaac acaatttttt tattgtcaag 6120
tttggtggca aatgatccat acagggcgtt ggataaaagt ttggcaatgg atcgcatggt 6180
ttggttcttt tccttgtccg cgcgctcttt ggcggcgatg ttgagttgga catactcgcg 6240
tgccaggcac ttccattcgg ggaagatagt tgttaattca tctggcacga ttctcacttg 6300
ccaccctcga ttatgcaagg taattaaatc cacactggtg gccacctcgc ctcgaagggg 6360
ttcattggtc caacagagcc tacctccttt cctagaacag aaagggggaa gtgggtctag 6420
cataagttca tcgggagggt ctgcatccat ggtaaagatt cccggaagta aatccttatc 6480
aaaatagctg atgggagtgg ggtcatctaa ggccatttgc cattctcgag ctgccagtgc 6540
gcgctcatat gggttaaggg gactgcccca tggcatggga tgggtgagtg cagaggcata 6600
catgccacag atgtcataga cgtagatggg atcctcaaag atgcctatgt aggttggata 6660
gcatcgcccc cctctgatac ttgctcgcac atagtcatat agttcatgtg atggcgctag 6720
cagccccgga cccaagttgg tgcgattggg tttttctgtt ctgtagacga tctggcgaaa 6780
gatggcgtga gaattggaag agatggtggg tctttgaaaa atgttgaaat gggcatgagg 6840
tagacctaca gagtctctga caaagtgggc ataagattct tgaagcttgg ttaccagttc 6900
ggcggtgaca agtacgtcta gggcgcagta gtcaagtgtt tcttgaatga tgtcataacc 6960
tggttggttt ttcttttccc acagttcgcg gttgagaagg tattcttcgc gatccttcca 7020
gtactcttct agcggaaacc cgtctttgtc tgcacggtaa gatcctagca tgtagaactg 7080
attaactgcc ttgtaagggc agcagccctt ctctacgggt agagagtatg cttgagcagc 7140
ttttcgtagc gaagcgtgag taagggcaaa ggtgtctctg accatgactt tgaggaattg 7200
gtatttgaag tcgatgtcgt cacaggctcc ctgttcccag agttggaagt ctacccgttt 7260
cttgtaggcg gggttgggca aagcgaaagt aacatcattg aagagaatct tgccggccct 7320
gggcatgaaa ttgcgagtga tgcgaaaagg ctgtggtact tccgctcggt tattgataac 7380
ctgggcagct aggacgatct cgtcgaaacc gttgatgttg tgtcctacga tgtataattc 7440
tatgaaacgc ggcgtgcctc tgacgtgagg tagcttactg agctcatcaa aggttaggtc 7500
tgtggggtca gataaggcgt agtgttcgag agcccattcg tgcaggtgag gattcgcttt 7560
aaggaaggag gaccagaggt ccactgccag tgctgtttgt aactggtccc ggtactgacg 7620
aaaatgccgt ccgactgcca ttttttctgg ggtgacgcaa tagaaggttt gggggtcctg 7680
ccgccagcga tcccacttga gttttatggc gaggtcatag gcgatgttga cgagccgctg 7740
gtctccagag agtttcatga ccagcatgaa ggggattagc tgcttgccaa aggaccccat 7800
ccaggtgtag gtttccacat cgtaggtgag aaagagcctt tctgtgcgag gatgagagcc 7860
aatcgggaag aactggatct cctgccacca gttggaggaa tggctgttga tgtgatggaa 7920
gtagaactcc ctgcgacgcg ccgagcattc atgcttgtgc ttgtacagac ggccgcagta 7980
gtcgcagcgt tgcacgggtt gtatctcgtg aatgagttgt acctggcttc ccttgacgag 8040
aaatttcagt gggaagccga ggcctggcga ttgtatctcg tgctttacta tgttgtctgc 8100
atcggcctgt tcatcttctg tctcgatggt ggtcatgctg acgagccctc gcgggaggca 8160
agtccagacc tcggcgcggc aggggcggag ctcgaggacg agagcgcgca ggctggagct 8220
gtccagggtc ctgagacgct gcggactcag gttagtaggc agtgtcagga gattaacttg 8280
catgatcttt tggagggcgt gcgggaggtt cagatagtac ttgatctcaa cgggtccgtt 8340
ggtggagatg tcgatggctt gcagggttcc gtgtcccttg ggcgctacca ccgtgccctt 8400
gtttttcatt ttggacggcg gtggctctgt tgcttcttgc atgtttagaa gcggtgtcga 8460
gggcgcgcac cgggcggcag gggcggctcg ggacccggcg gcatggctgg cagtggtacg 8520
tcggcgccgc gcgcgggtag gttctggtac tgcgccctga gaagactcgc atgcgcgacg 8580
acgcggcggt tgacatcctg gatctgacgc ctctgggtga aagctaccgg ccccgtgagc 8640
ttgaacctga aagagagttc aacagaatca atctcggtat cgttgacggc ggcttgccta 8700
aggatttctt gcacgtcacc agagttgtcc tggtaggcga tctccgccat gaactgctcg 8760
atctcttcct cttgaagatc tccgcggccc gctctctcga cggtggccgc gaggtcgttg 8820
gagatgcgcc caatgagttg agagaatgca ttcatgcccg cctcgttcca gacgcggctg 8880
tagaccacgg cccccacggg atctctcgcg cgcatgacca cctgggcgag gttgagctcc 8940
acgtggcggg tgaagaccgc atagttgcat aggcgctgga aaaggtagtt gagtgtggtg 9000
gcgatgtgct cggtgacgaa gaaatacatg atccatcgtc tcagcggcat ctcgctgaca 9060
tcgcccagag cttccaagcg ctccatggcc tcgtagaagt ccacggcaaa attaaaaaac 9120
tgggagtttc gcgcggacac ggtcaactcc tcttccagaa gacggataag ttcggcgatg 9180
gtggtgcgca cctcgcgctc gaaagcccct gggatttctt cctcaatctc ttcttcttcc 9240
actaacatct cttcctcttc aggtggggct gcaggaggag ggggaacgcg gcgacgccgg 9300
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gtttcagtga cggcgcggcc gttctcgcgc ggtcgcagag taaaaacacc gccgcgcatc 9420
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atgtcttgca tggggatatg tttggtcttc cttggcttct ttttgggggg tatcggagga 23160
ggaggactgt cgctccgttc cggagacagg gaggattgtg acgtttcgct caccattacc 23220
aactgactgt cggtagaaga acctgacccc acacggcgac aggtgtttct cttcgggggc 23280
agaggtggag gcgattgcga agggctgcgg tccgacctgg aaggcggatg actggcagaa 23340
ccccttccgc gttcgggggt gtgctccctg tggcggtcgc ttaactgatt tccttcgcgg 23400
ctggccattg tgttctccta ggcagagaaa caacagacat ggaaactcag ccattgctgt 23460
caacatcgcc acgagtgcca tcacatctcg tcctcagcga cgaggaaaag gagcagagct 23520
taagcattcc accgcccagt cctgccacca cctctaccct agaagataag gaggtcgacg 23580
catctcatga catgcagaat aaaaaagcga aagagtctga gacagacatc gagcaagacc 23640
cgggctatgt gacaccggtg gaacacgagg aagagttgaa acgctttcta gagagagagg 23700
atgaaaactg cccaaaacaa cgagcagata actatcacca agatgctgga aatagggatc 23760
agaacaccga ctacctcata gggcttgacg gggaagacgc gctccttaaa catctagcaa 23820
gacagtcgct catagtcaag gatgcattat tggacagaac tgaagtgccc atcagtgtgg 23880
aagagctcag ccgcgcctac gagcttaacc tcttttcacc tcgtactccc cccaaacgtc 23940
agccaaacgg cacctgcgag ccaaatcctc gcttaaactt ttatccagct tttgctgtgc 24000
cagaagtact ggctacctat cacatctttt ttaaaaatca aaaaattcca gtctcctgcc 24060
gcgctaatcg cacccgcgcc gatgccctac tcaatctggg acctggttca cgcttacctg 24120
atatagcttc cttggaagag gttccaaaga tcttcgaggg tctgggcaat aatgagactc 24180
gggccgcaaa tgctctgcaa aagggagaaa atggcatgga tgagcatcac agcgttctgg 24240
tggaattgga aggcgataat gccagactcg cagtactcaa gcgaagcatc gaggtcacac 24300
acttcgcata tcccgctgtc aacctgcccc ctaaagtcat gacggcggtc atggaccagt 24360
tactcattaa gcgcgcaagt cccctttcag aagacatgca tgacccagat gcctgtgatg 24420
agggtaaacc agtggtcagt gatgagcagc taacccgatg gctgggcacc gactctccca 24480
gggatttgga agagcgtcgc aagcttatga tggccgtggt gctggttacc gtagaactag 24540
agtgtctccg acgtttcttt accgattcag aaaccttgcg caaactcgaa gagaatctgc 24600
actacacttt tagacacggc tttgtgcggc aggcatgcaa gatatctaac gtggaactca 24660
ccaacctggt ttcctacatg ggtattctgc atgagaatcg cctaggacaa agcgtgctgc 24720
acagcaccct gaagggggaa gcccgccgtg attacatccg cgattgtgtc tatctgtacc 24780
tgtgccacac gtggcaaacc ggcatgggtg tatggcagca atgtttagaa gaacagaact 24840
tgaaagagct tgacaagctc ttacagaaat ctcttaaggt tctgtggaca gggttcgacg 24900
agcgcaccgt cgcttccgac ctggcagacc tcatcttccc agagcgtctc agggttactt 24960
tgcgaaacgg attgcctgac tttatgagcc agagcatgct taacaatttt cgctctttca 25020
tcctggaacg ctccggtatc ctgcccgcca cctgctgcgc actgccctcc gactttgtgc 25080
ctctcaccta ccgcgagtgc cccccgccgc tatggagtca ctgctacctg ttccgtctgg 25140
ccaactatct ctcctaccac tcggatgtga tcgaggatgt gagcggagac ggcttgctgg 25200
agtgtcactg ccgctgcaat ctgtgcacgc cccaccggtc cctagcttgc aacccccagt 25260
tgatgagcga aacccagata ataggcacct ttgaattgca aggccccagc agccaaggcg 25320
atgggtcttc tcctgggcaa agtttaaaac tgaccccggg actgtggacc tccgcctact 25380
tgcgcaagtt tgctccggaa gattaccacc cctatgaaat caagttctat gaggaccaat 25440
cacagcctcc aaaggccgaa ctttcggcct gcgtcatcac ccagggggca attctggccc 25500
aattgcaagc catccaaaaa tcccgccaag aatttctact gaaaaagggt aagggggtct 25560
accttgaccc ccagaccggc gaggaactca acacaaggtt ccctcaggat gtcccaacga 25620
cgagaaaaca agaagttgaa ggtgcagccg ccgcccccag aagatatgga ggaagattgg 25680
gacagtcagg cagaggaggc ggaggaggac agtctggagg acagtctgga ggaagacagt 25740
ttggaggagg aaaacgagga ggcagaggag gtggaagaag taaccgccga caaacagtta 25800
tcctcggctg cggagacaag caacagcgct accatctccg ctccgagtcg aggaacccgg 25860
cggcgtccca gcagtagatg ggacgagacc ggacgcttcc cgaacccaac cagcgcttcc 25920
aagaccggta agaaggatcg gcagggatac aagtcctggc gggggcataa gaatgccatc 25980
atctcctgct tgcatgagtg cgggggcaac atatccttca cgcggcgcta cttgctattc 26040
caccatgggg tgaactttcc gcgcaatgtt ttgcattact accgtcacct ccacagcccc 26100
tactatagcc agcaaatccc ggcagtctcg acagataaag acagcggcgg cgacctccaa 26160
cagaaaacca gcagcggcag ttagaaaata cacaacaagt gcagcaacag gaggattaaa 26220
gattacagcc aacgagccag cgcaaacccg agagttaaga aatcggatct ttccaaccct 26280
gtatgccatc ttccagcaga gtcggggtca agagcaggaa ctgaaaataa aaaaccgatc 26340
tctgcgttcg ctcaccagaa gttgtttgta tcacaagagc gaagatcaac ttcagcgcac 26400
tctcgaggac gccgaggctc tcttcaacaa gtactgcgcg ctgactctta aagagtaggc 26460
agcgaccgcg cttattcaaa aaaggcggga attacatcat cctcgacatg agtaaagaaa 26520
ttcccacgcc ttacatgtgg agttatcaac cccaaatggg attggcggca ggcgcctccc 26580
aggactactc cacccgcatg aattggctca gcgccgggcc ttctatgatt tctcgagtta 26640
atgatatacg cgcctaccga aaccaaatac ttttggaaca gtcagctctt accaccacgc 26700
cccgccaaca ccttaatccc agaaattggc ccgccgccct agtgtaccag gaaagtcccg 26760
ctcccaccac tgtattactt cctcgagacg cccaggccga agtccaaatg actaatgcag 26820
gtgcgcagtt agctggcggc tccaccctat gtcgtcacag gcctcggcat aatataaaac 26880
gcctgatgat cagaggccga ggtatccagc tcaacgacga gtcggtgagc tctccgcttg 26940
gtctacgacc agacggaatc tttcagattg ccggctgcgg gagatcttcc ttcacccctc 27000
gtcaggctgt tctgactttg gaaagttcgt cttcgcaacc ccgctcgggc ggaatcggga 27060
ccgttcaatt tgtggaggag tttactccct ctgtctactt caaccccttc tccggatctc 27120
ctgggcatta cccggacgag ttcataccga acttcgacgc gattagcgag tcagtggacg 27180
gctacgattg atgtctggtg acgcggctga gctatctcgg ctgcgacatc tagaccactg 27240
ccgccgcttt cgctgctttg cccgggaact cattgagttc atctacttcg aactccccaa 27300
ggatcaccct caaggtccgg cccacggagt gcggatttct atcgaaggca aaatagactc 27360
tcgcctgcaa cgaattttct cccagcggcc cgtgctgatc gagcgagacc agggaaacac 27420
cacggtttcc atctactgca tttgtaatca ccccggattg catgaaagcc tttgctgtct 27480
tatgtgtact gagtttaata aaaactgaat taagactctc ctacggactg ccgcttcttc 27540
aacccggatt ttacaaccag aagaacgaaa cttttcctgt cgtccaggac tctgttaact 27600
tcacctttcc tactcacaaa ctagaagctc aacgactaca ccgcttttcc agaagcattt 27660
tccctactaa tactactttc aaaaccggag gtgagctcca aggtcttcct acagaaaacc 27720
cttgggtgga agcgggcctt gtagtgctag gaattcttgc gggtgggctt gtgattattc 27780
tttgctacct atacacacct tgcttcactt tcttagtggt gttgtggtat tggtttaaaa 27840
aatggggccc atactagtct tgcttgtttt actttcgctt ttggaaccgg gttctgccaa 27900
ttacgatcca tgtctagact tcgacccaga aaactgcaca cttacttttg cacccgacac 27960
aagccgcatc tgtggagttc atcgcctctc ttacgaactt ggcccccaac gacaaaaatt 28020
tacctgcatg gtgggaatca accccatagt tatcacccag caaagtggag atactaaggg 28080
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cggcctaaga gacctgctac caatgaatta aaaaatgatt aataaaaaat cacttacttg 28200
aaatcagcaa taaggtctct gttgaaattt tctcccagca gcacctcact tccctcttcc 28260
caactctggt attctaaacc ccgttcagcg gcatactttc tccatacttt aaaggggatg 28320
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ccaacacccc tttataaacc cagggtttat ttccccaaat ggcttcacac aaagcccaaa 28500
cggagttctt actttaaaat gtttaacccc actaacaacc acaggcggat ctctacagct 28560
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taaaactgga gcactagtca ctgcatttgt ttatgttata ggagtatcta acaattttaa 28920
tatgctaact acacacagaa atataaattt tactgcagag ctgtttttcg attctactgg 28980
taatttacta actagactct catccctcaa aactccactt aatcataaat caggacaaaa 29040
catggctact ggtgccatta ctaatgctaa aggtttcatg cccagcacga ctgcctatcc 29100
tttcaatgat aattctagag aaaaagaaaa ctacatttac ggaacttgtt actacacagc 29160
tagtgatcgc actgcttttc ccattgacat atctgtcatg cttaaccgaa gagcaataaa 29220
tgacgagaca tcatattgta ttcgtataac ttggtcctgg aacacaggag atgccccaga 29280
ggtgcaaacc tctgctacaa ccctagtcac ctccccattt accttttact acatcagaga 29340
agacgactga caaataaagt ttgcgatcgc taccctgcag gaacttgttt atttgaaaat 29400
caattcacaa aatccgagta gttattttgc ctcccccttc ccatttaaca gaatacacca 29460
atctctcccc acgcacagct ttaaacattt ggataccatt agatatagac atggttttag 29520
attccacatt ccaaacagtt tcagagcgag ccaatctggg gtcagtgata gataaaaatc 29580
catcgggata gtcttttaaa gcgctttcac agtccaactg ctgcggatgc gactccggag 29640
tctggatcac ggtcatctgg aagaagaacg atgggaatca taatccgaaa acggtatcgg 29700
acgattgtgt ctcatcaaac ccacaagcag ccgctgtctg cgtcgctccg tgcgactgct 29760
gtttatggga tcagggtcca cagtgtcctg aagcatgatt ttaatagccc ttaacatcaa 29820
ctttctggtg cgatgcgcgc agcaacgcat tctgatttca ctcaaatctt tgcagtaggt 29880
acaacacatt attacaatat tgtttaataa accataatta aaagcgctcc agccaaaact 29940
catatctgat ataatcgccc ctgcatgacc atcataccaa agtttaatat aaattaaatg 30000
acgttccctc aaaaacacac tacccacata catgatctct tttggcatgt gcatattaac 30060
aatctgtctg taccatggac aacgttggtt aatcatgcaa cccaatataa ccttccggaa 30120
ccacactgcc aacaccgctc ccccagccat gcattgaagt gaaccctgct gattacaatg 30180
acaatgaaga acccaattct ctcgaccgtg aatcacttga gaatgaaaaa tatctatagt 30240
ggcacaacat agacataaat gcatgcatct tctcataatt tttaactcct caggatttag 30300
aaacatatcc cagggaatag gaagctcttg cagaacagta aagctggcag aacaaggaag 30360
accacgaaca caacttacac tatgcatagt catagtatca caatctggca acagcgggtg 30420
gtcttcagtc atagaagctc gggtttcatt ttcctcacaa cgtggtaact gggctctggt 30480
gtaagggtga tgtctggcgc atgatgtcga gcgtgcgcgc aaccttgtca taatggagtt 30540
gcttcctgac attctcgtat tttgtatagc aaaacgcggc cctggcagaa cacactcttc 30600
ttcgccttct atcctgccgc ttagcgtgtt ccgtgtgata gttcaagtac aaccacactc 30660
ttaagttggt caaaagaatg ctggcttcag ttgtaatcaa aactccatcg catctaatcg 30720
ttctgaggaa atcatccaag caatgcaact ggattgtgtt tcaagcagga gaggagaggg 30780
aagagacgga agaaccatgt taatttttat tccaaacgat ctcgcagtac ttcaaattgt 30840
agatcgcgca gatggcatct ctcgccccca ctgtgttggt gaaaaagcac agctagatca 30900
aaagaaatgc gattttcaag gtgctcaacg gtggcttcca gcaaagcctc cacgcgcaca 30960
tccaagaaca aaagaatacc aaaagaagga gcattttcta actcctcaat catcatatta 31020
cattcctgca ccattcccag ataattttca gctttccagc cttgaattat tcgtgtcagt 31080
tcttgtggta aatccaatcc acacattaca aacaggtccc ggagggcgcc ctccaccacc 31140
attcttaaac acaccctcat aatgacaaaa tatcttgctc ctgtgtcacc tgtagcgaat 31200
tgagaatggc aacatcaatt gacatgccct tggctctaag ttcttcttta agttctagtt 31260
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gattggaata agcatattgg gaaccgccag taatatcatc gaagttgctg gaaatataat 31440
caggcagagt ttcttgtaaa aattgaataa aagaaaaatt tgccaaaaaa acattcaaaa 31500
cctctgggat gcaaatgcaa taggttaccg cgctgcgctc caacattgtt agttttgaat 31560
tagtctgcaa aaataaaaaa aaaaacaagc gtcatatcat agtagcctga cgaacagatg 31620
gataaatcag tctttccatc acaagacaag ccacagggtc tccagctcga ccctcgtaaa 31680
acctgtcatc atgattaaac aacagcaccg aaagttcctc gcggtgacca gcatgaataa 31740
ttcttgatga agcatacaat ccagacatgt tagcatcagt taacgagaaa aaacagccaa 31800
catagccttt gggtataatt atgcttaatc gtaagtatag caaagccacc cctcgcggat 31860
acaaagtaaa aggcacagga gaataaaaaa tataattatt tctctgctgc tgttcaggca 31920
acgtcgcccc cggtccctct aaatacacat acaaagcctc atcagccatg gcttaccaga 31980
caaagtacag cgggcacaca aagcacaagc tctaaagtga ctctccaacc tctccacaat 32040
atatatatac acaagcccta aactgacgta atgggagtaa agtgtaaaaa atcccgccaa 32100
acccaacaca caccccgaaa ctgcgtcacc agggaaaagt acagtttcac ttccgcaatc 32160
ccaacaggcg taacttcctc tttctcacgg tacgtgatat cccactaact tgcaacgtca 32220
ttttcccacg gtcgcaccgc cccttttagc cgttaacccc acagccaatc accacacgat 32280
ccacactttt taaaatcacc tcatttacat attggcacca ttccatctat aaggtatatt 32340
atatagatag gcgcgccctc tcttaaggta gcatcgggat cgagtccctg agagaacatc 32400
ctcaatcccg atctatcctt agatccgagg aatatcgaaa tcagttacgc tagggataac 32460
agggtaatat agcatcccct cggattgcta tctaccggct cgtcagctat gatctctcga 32520
tttcgatcaa gaaatctcat tggttacctt gggctatcga aaccagtcaa gtcagctact 32580
tggcgagatc gacttgtctg agtttcgact acgctcagaa ttgcgtcagc gcctatcgcc 32640
aggtattact ccaatcccga atatccgagc ctgagagaac atcctcaatc ccgatctatc 32700
cttagatccg aggaatatcg aaatcgttta aatcttttct tgatggtaaa tcattcgaat 32760
ataagaatgg agagacgaat ggggaaacga caaagatgac attctttggt ccttctggtg 32820
aggttctcaa gtttttggtt aatcctgtca acaacttata tcgtatgggg ctgacttcag 32880
gtgctacatt tgaagagata aattgcactg aaatctagta atattttatc tgattaataa 32940
gatgatcttc ttgagatcgt tttggtctgc gcgtaatctc ttgctctgaa aacgaaaaaa 33000
ccgccttgca gggcggtttt tcgaaggttc tctgagctac caactctttg aaccgaggta 33060
actggcttgg cagagcgcag tcaccaaaac ttgtcctttc agtttagcct taaccggcgc 33120
atgacttcaa gactaactct gctaaatcaa ttaccagtgg ctgctgccag tggtgctttt 33180
gcatgtcttt ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcggac 33240
tgaacggggg gttcgtgcat acagtccagc ttggagcgaa ctgcctaccc ggaactgagt 33300
gtcaggcgtg gaatgagaca aacgcggcca taacagcgga atgacaccgg taaaccgaaa 33360
ggcaggaaca ggagagcgca cgagggagcc gccaggggga aacgcctggt atctttatag 33420
tcctgtcggg tttcgccacc actgatttga gcgtcagatt tcgtgatgct tgtcaggggg 33480
gcggagccta tggaaaaacg gctttgccgc ggccctctca cttccctgtt aagtatcttc 33540
ctggcatctt ccaggaaatc tccgccccgt tcgtaagcca tttccgctcg ccgcagtcga 33600
acgaccgagc gtagcgagtc agtgagcgag gaagcggaat atatcctgta tcacatattc 33660
tgctgacgca ccggtgcggc cttttttctc ctgccacatg aagcacttca ctgacaccct 33720
catcagtgcc aacatagtaa gccagtatac actccgctaa tttaaacgtg gtgtaccgag 33780
aacgatcctc tcagtgcgat ctcgacgatc agtggtattc cgacatatcg ttgcttggca 33840
gtcagccagt cgatcctagc ttgggaccca ggaagtccaa tcgtcagata ttgtactcag 33900
cctggtcacg gcagcgtacc gatctcgtaa ctataacggt cctaaggtag cgaactagat 33960
attgatagtc tgatcggtca acgtataatc gagtcctagc ttttgcaaac atctatcaag 34020
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cggcggcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct 34140
ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgtcc ggttcttttt gtcaagaccg 34200
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cgacgggcgt tccttgcgcg gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc 34320
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aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc 34440
cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc 34500
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cgcagaaaaa aatgcctgat gcgacgctgc gcgtcttata ctcccacata tgccagattc 34920
agcaacggat acggcttccc caacttgccc acttccatac gtgtcctcct taccagaaat 34980
ttatccttaa ggtccgtaac tataacggtc ctaaggtagc gaatcgacct agctctatcg 35040
aatctccctc gtttcgagct tacgcgaact agcctctggc gatagcatcc gaggggcagg 35100
catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgtcaagttc gatctgattg cttggcataa 35160
agtccgatgg ttcgagtaga ctcagttcaa cctctctctt aaggtagc 35208
<210> 65
<211> 35231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由细菌复制起点(p15A)、抗生素抗性基因(KanR)和在BX和BY区中具有插入的独特限制性位点的EnAd基因组序列组成的pNG-185 (pColoAd2.6) DNA质粒。
<400> 65
ggcgcgcctc tatctatata atatacctta tagatggaat ggtgccaata tgtaaatgag 60
gtgattttaa aaagtgtgga tcgtgtggtg attggctgtg gggttaacgg ctaaaagggg 120
cggtgcgacc gtgggaaaat gacgttttgt gggggtggag tttttttgca agttgtcgcg 180
ggaaatgtga cgcataaaaa ggcttttttc tcacggaact acttagtttt cccacggtat 240
ttaacaggaa atgaggtagt tttgaccgga tgcaagtgaa aattgttgat tttcgcgcga 300
aaactgaatg aggaagtgtt tttctgaata atgtggtatt tatggcaggg tggagtattt 360
gttcagggcc aggtagactt tgacccatta cgtggaggtt tcgattaccg tgttttttac 420
ctgaatttcc gcgtaccgtg tcaaagtctt ctgtttttac gtaggtgtca gctgatcgct 480
agggtattta tacctcaggg tttgtgtcaa gaggccactc ttgagtgcca gcgagaagag 540
ttttctcctc tgcgccggca gtttaataat aaaaaaatga gagatttgcg atttctgcct 600
caggaaataa tctctgctga gactggaaat gaaatattgg agcttgtggt gcacgccctg 660
atgggagacg atccggagcc acctgtgcag ctttttgagc ctcctacgct tcaggaactg 720
tatgatttag aggtagaggg atcggaggat tctaatgagg aagctgtaaa tggctttttt 780
accgattcta tgcttttagc tgctaatgaa gggttagaat tagatccgcc tttggacact 840
tttgatactc caggggtaat tgtggaaagc ggtacaggtg taagaaaatt acctgatttg 900
agttccgtgg actgtgattt gcactgctat gaagacgggt ttcctccgag tgatgaggag 960
gaccatgaaa aggagcagtc catgcagact gcagcgggtg agggagtgaa ggctgccaat 1020
gttggttttc agttggattg cccggagctt cctggacatg gctgtaagtc ttgtgaattt 1080
cacaggaaaa atactggagt aaaggaactg ttatgttcgc tttgttatat gagaacgcac 1140
tgccacttta tttacagtaa gtgtgtttaa gttaaaattt aaaggaatat gctgtttttc 1200
acatgtatat tgagtgtgag ttttgtgctt cttattatag gtcctgtgtc tgatgctgat 1260
gaatcaccat ctcctgattc tactacctca cctcctgaga ttcaagcacc tgttcctgtg 1320
gacgtgcgca agcccattcc tgtgaagctt aagcctggga aacgtccagc agtggaaaaa 1380
cttgaggact tgttacaggg tggggacgga cctttggact tgagtacacg gaaacgtcca 1440
agacaataag tgttccatat ccgtgtttac ttaaggtgac gtcaatattt gtgtgacagt 1500
gcaatgtaat aaaaatatgt taactgttca ctggttttta ttgctttttg ggcggggact 1560
caggtatata agtagaagca gacctgtgtg gttagctcat aggagctggc tttcatccat 1620
ggaggtttgg gccattttgg aagaccttag gaagactagg caactgttag agaacgcttc 1680
ggacggagtc tccggttttt ggagattctg gttcgctagt gaattagcta gggtagtttt 1740
taggataaaa caggactata aacaagaatt tgaaaagttg ttggtagatt gcccaggact 1800
ttttgaagct cttaatttgg gccatcaggt tcactttaaa gaaaaagttt tatcagtttt 1860
agacttttca accccaggta gaactgctgc tgctgtggct tttcttactt ttatattaga 1920
taaatggatc ccgcagactc atttcagcag gggatacgtt ttggatttca tagccacagc 1980
attgtggaga acatggaagg ttcgcaagat gaggacaatc ttaggttact ggccagtgca 2040
gcctttgggt gtagcgggaa tcctgaggca tccaccggtc atgccagcgg ttctggagga 2100
ggaacagcaa gaggacaacc cgagagccgg cctggaccct ccagtggagg aggcggagta 2160
gctgacttgt ctcctgaact gcaacgggtg cttactggat ctacgtccac tggacgggat 2220
aggggcgtta agagggagag ggcatctagt ggtactgatg ctagatctga gttggcttta 2280
agtttaatga gtcgcagacg tcctgaaacc atttggtggc atgaggttca gaaagaggga 2340
agggatgaag tttctgtatt gcaggagaaa tattcactgg aacaggtgaa aacatgttgg 2400
ttggagcctg aggatgattg ggaggtggcc attaaaaatt atgccaagat agctttgagg 2460
cctgataaac agtataagat tactagacgg attaatatcc ggaatgcttg ttacatatct 2520
ggaaatgggg ctgaggtggt aatagatact caagacaagg cagttattag atgctgcatg 2580
atggatatgt ggcctggggt agtcggtatg gaagcagtaa cttttgtaaa tgttaagttt 2640
aggggagatg gttataatgg aatagtgttt atggccaata ccaaacttat attgcatggt 2700
tgtagctttt ttggtttcaa caatacctgt gtagatgcct ggggacaggt tagtgtacgg 2760
ggatgtagtt tctatgcgtg ttggattgcc acagctggca gaaccaagag tcaattgtct 2820
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gtccgccact gcgcttctac agatactgga tgttttattt tgattaaggg aaatgccagc 2940
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gctggtgggc attgtaatat gctggctact gtgcatattg tttcccatca acgcaaaaaa 3060
tggcctgttt ttgatcacaa tgtgatgacg aagtgtacca tgcatgcagg tgggcgtaga 3120
ggaatgttta tgccttacca gtgtaacatg aatcatgtga aagtgttgtt ggaaccagat 3180
gccttttcca gaatgagcct aacaggaatt tttgacatga acatgcaaat ctggaagatc 3240
ctgaggtatg atgatacgag atcgagggta cgcgcatgcg aatgcggagg caagcatgcc 3300
aggttccagc cggtgtgtgt agatgtgact gaagatctca gaccggatca tttggttatt 3360
gcccgcactg gagcagagtt cggatccagt ggagaagaaa ctgactaagg tgagtattgg 3420
gaaaactttg gggtgggatt ttcagatgga cagattgagt aaaaatttgt tttttctgtc 3480
ttgcagctgt catgagtgga aacgcttctt ttaagggggg agtcttcagc ccttatctga 3540
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agtctaaata aaaaaatccc agaatcaatg aataaataaa caagcttgtt gttgatttaa 3960
aatcaagtgt ttttatttca tttttcgcgc acggtatgcc ctagaccacc gatctctatc 4020
attgagaact cggtggattt tttccaggat cctatagagg tgggattgaa tgtttagata 4080
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ggtagtgttg taaatcaccc agtcataaca aggtcgcagt gcatggtgtt gcacaatatc 4200
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ggcaatattg ccgccaagat cccgtcttgg gttcatgtta tgaaggacca ccaagacggt 4380
gtatccggta catttaggaa atttatcgtg cagcttggat ggaaaagcgt ggaaaaattt 4440
ggagacaccc ttgtgtcctc caagattttc catgcactca tccatgataa tagcaatggg 4500
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ctgagttaaa tcatcataag ccattttaat gaatttgggg cggagagtac cagattgggg 4620
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gccgtcttct cgaagcaagg gggccacctc gttcatcatt tcccttacat gcatattttc 4920
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tcgtagttga gcgcctcggc tgcgtggcct ttggcgcgga gcttaccttt ggaagttttc 5400
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gtccccgctg ggggggtata aaagggggcg gttctttgct cttcctcact gtcttccgga 5940
tcgctgtcca ggaacgtcag ctgttggggt aggtattccc tctcgaaggc gggcatgacc 6000
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ttcttgtagg cggggttggg caaagcgaaa gtaacatcat tgaagagaat cttgccggcc 7320
ctgggcatga aattgcgagt gatgcgaaaa ggctgtggta cttccgctcg gttattgata 7380
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ttaaggaagg aggaccagag gtccactgcc agtgctgttt gtaactggtc ccggtactga 7620
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aagtagaact ccctgcgacg cgccgagcat tcatgcttgt gcttgtacag acggccgcag 7980
tagtcgcagc gttgcacggg ttgtatctcg tgaatgagtt gtacctggct tcccttgacg 8040
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tgcatgatct tttggagggc gtgcgggagg ttcagatagt acttgatctc aacgggtccg 8340
ttggtggaga tgtcgatggc ttgcagggtt ccgtgtccct tgggcgctac caccgtgccc 8400
ttgtttttca ttttggacgg cggtggctct gttgcttctt gcatgtttag aagcggtgtc 8460
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cgtcggcgcc gcgcgcgggt aggttctggt actgcgccct gagaagactc gcatgcgcga 8580
cgacgcggcg gttgacatcc tggatctgac gcctctgggt gaaagctacc ggccccgtga 8640
gcttgaacct gaaagagagt tcaacagaat caatctcggt atcgttgacg gcggcttgcc 8700
taaggatttc ttgcacgtca ccagagttgt cctggtaggc gatctccgcc atgaactgct 8760
cgatctcttc ctcttgaaga tctccgcggc ccgctctctc gacggtggcc gcgaggtcgt 8820
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ccacgtggcg ggtgaagacc gcatagttgc ataggcgctg gaaaaggtag ttgagtgtgg 9000
tggcgatgtg ctcggtgacg aagaaataca tgatccatcg tctcagcggc atctcgctga 9060
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tctccttaaa gtggtgactg ggaggttctc cgtttgggag ggagagggcg ctgattatac 9480
attttattaa ttggcccgta gggactgcac gcagagatct gatcgtgtca agatccacgg 9540
gatctgaaaa cctttcgacg aaagcgtcta accagtcaca gtcacaaggt aggctgagta 9600
cggcttcttg tgggcggggg tggttatgtg ttcggtctgg gtcttctgtt tcttcttcat 9660
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ggatggtggc gaggagcacc aggtctttgg gtccggcttg ctggatacgc aggcgattgg 9780
ccattcccca agcattatcc tgacatctag caagatcttt gtagtagtct tgcatgagcc 9840
gttctacggg cacttcttcc tcacccgttc tgccatgcat acgtgtgagt ccaaatccgc 9900
gcattggttg taccagtgcc aagtcagcta cgactctttc ggcgaggatg gcttgctgta 9960
cttgggtaag ggtggcttga aagtcatcaa aatccacaaa gcggtggtaa gctcctgtat 10020
taatggtgta agcacagttg gccatgactg accagttaac tgtctggtga ccagggcgca 10080
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atcgttctgt agctggagcg ccaggggcga ggtcttccaa cataaggcgg tgatagccgt 10260
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agaaccctac tagcaaacct ctgaccgccc agctgtttct ggtggtgcaa cacagcagag 11280
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gtttgcaaag agctctgact ggagctggaa ccgagggtga gaattacttc gacatgggag 11700
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catcatagat aattacttga aagtgggtag acagaatgga gtgcttgaaa gtgacattgg 14340
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taatcataaa tcaggacaaa acatggctac tggtgccatt actaatgcta aaggtttcat 29100
gcccagcacg actgcctatc ctttcaatga taattctaga gaaaaagaaa actacattta 29160
cggaacttgt tactacacag ctagtgatcg cactgctttt cccattgaca tatctgtcat 29220
gcttaaccga agagcaataa atgacgagac atcatattgt attcgtataa cttggtcctg 29280
gaacacagga gatgccccag aggtgcaaac ctctgctaca accctagtca cctccccatt 29340
taccttttac tacatcagag aagacgactg acaaataaag tttgcgatcg ctaccctgca 29400
ggaacttgtt tatttgaaaa tcaattcaca aaatccgagt agttattttg cctccccctt 29460
cccatttaac agaatacacc aatctctccc cacgcacagc tttaaacatt tggataccat 29520
tagatataga catggtttta gattccacat tccaaacagt ttcagagcga gccaatctgg 29580
ggtcagtgat agataaaaat ccatcgggat agtcttttaa agcgctttca cagtccaact 29640
gctgcggatg cgactccgga gtctggatca cggtcatctg gaagaagaac gatgggaatc 29700
ataatccgaa aacggtatcg gacgattgtg tctcatcaaa cccacaagca gccgctgtct 29760
gcgtcgctcc gtgcgactgc tgtttatggg atcagggtcc acagtgtcct gaagcatgat 29820
tttaatagcc cttaacatca actttctggt gcgatgcgcg cagcaacgca ttctgatttc 29880
actcaaatct ttgcagtagg tacaacacat tattacaata ttgtttaata aaccataatt 29940
aaaagcgctc cagccaaaac tcatatctga tataatcgcc cctgcatgac catcatacca 30000
aagtttaata taaattaaat gacgttccct caaaaacaca ctacccacat acatgatctc 30060
ttttggcatg tgcatattaa caatctgtct gtaccatgga caacgttggt taatcatgca 30120
acccaatata accttccgga accacactgc caacaccgct cccccagcca tgcattgaag 30180
tgaaccctgc tgattacaat gacaatgaag aacccaattc tctcgaccgt gaatcacttg 30240
agaatgaaaa atatctatag tggcacaaca tagacataaa tgcatgcatc ttctcataat 30300
ttttaactcc tcaggattta gaaacatatc ccagggaata ggaagctctt gcagaacagt 30360
aaagctggca gaacaaggaa gaccacgaac acaacttaca ctatgcatag tcatagtatc 30420
acaatctggc aacagcgggt ggtcttcagt catagaagct cgggtttcat tttcctcaca 30480
acgtggtaac tgggctctgg tgtaagggtg atgtctggcg catgatgtcg agcgtgcgcg 30540
caaccttgtc ataatggagt tgcttcctga cattctcgta ttttgtatag caaaacgcgg 30600
ccctggcaga acacactctt cttcgccttc tatcctgccg cttagcgtgt tccgtgtgat 30660
agttcaagta caaccacact cttaagttgg tcaaaagaat gctggcttca gttgtaatca 30720
aaactccatc gcatctaatc gttctgagga aatcatccaa gcaatgcaac tggattgtgt 30780
ttcaagcagg agaggagagg gaagagacgg aagaaccatg ttaattttta ttccaaacga 30840
tctcgcagta cttcaaattg tagatcgcgc agatggcatc tctcgccccc actgtgttgg 30900
tgaaaaagca cagctagatc aaaagaaatg cgattttcaa ggtgctcaac ggtggcttcc 30960
agcaaagcct ccacgcgcac atccaagaac aaaagaatac caaaagaagg agcattttct 31020
aactcctcaa tcatcatatt acattcctgc accattccca gataattttc agctttccag 31080
ccttgaatta ttcgtgtcag ttcttgtggt aaatccaatc cacacattac aaacaggtcc 31140
cggagggcgc cctccaccac cattcttaaa cacaccctca taatgacaaa atatcttgct 31200
cctgtgtcac ctgtagcgaa ttgagaatgg caacatcaat tgacatgccc ttggctctaa 31260
gttcttcttt aagttctagt tgtaaaaact ctctcatatt atcaccaaac tgcttagcca 31320
gaagcccccc gggaacaaga gcaggggacg ctacagtgca gtacaagcgc agacctcccc 31380
aattggctcc agcaaaaaca agattggaat aagcatattg ggaaccgcca gtaatatcat 31440
cgaagttgct ggaaatataa tcaggcagag tttcttgtaa aaattgaata aaagaaaaat 31500
ttgccaaaaa aacattcaaa acctctggga tgcaaatgca ataggttacc gcgctgcgct 31560
ccaacattgt tagttttgaa ttagtctgca aaaataaaaa aaaaaacaag cgtcatatca 31620
tagtagcctg acgaacagat ggataaatca gtctttccat cacaagacaa gccacagggt 31680
ctccagctcg accctcgtaa aacctgtcat catgattaaa caacagcacc gaaagttcct 31740
cgcggtgacc agcatgaata attcttgatg aagcatacaa tccagacatg ttagcatcag 31800
ttaacgagaa aaaacagcca acatagcctt tgggtataat tatgcttaat cgtaagtata 31860
gcaaagccac ccctcgcgga tacaaagtaa aaggcacagg agaataaaaa atataattat 31920
ttctctgctg ctgttcaggc aacgtcgccc ccggtccctc taaatacaca tacaaagcct 31980
catcagccat ggcttaccag acaaagtaca gcgggcacac aaagcacaag ctctaaagtg 32040
actctccaac ctctccacaa tatatatata cacaagccct aaactgacgt aatgggagta 32100
aagtgtaaaa aatcccgcca aacccaacac acaccccgaa actgcgtcac cagggaaaag 32160
tacagtttca cttccgcaat cccaacaggc gtaacttcct ctttctcacg gtacgtgata 32220
tcccactaac ttgcaacgtc attttcccac ggtcgcaccg ccccttttag ccgttaaccc 32280
cacagccaat caccacacga tccacacttt ttaaaatcac ctcatttaca tattggcacc 32340
attccatcta taaggtatat tatatagata gaggcgcgcc ctctcttaag gtagcatcgg 32400
gatcgagtcc ctgagagaac atcctcaatc ccgatctatc cttagatccg aggaatatcg 32460
aaatcagtta cgctagggat aacagggtaa tatagcatcc cctcggattg ctatctaccg 32520
gctcgtcagc tatgatctct cgatttcgat caagaaatct cattggttac cttgggctat 32580
cgaaaccagt caagtcagct acttggcgag atcgacttgt ctgagtttcg actacgctca 32640
gaattgcgtc agcgcctatc gccaggtatt actccaatcc cgaatatccg agcctgagag 32700
aacatcctca atcccgatct atccttagat ccgaggaata tcgaaatcgt ttaaatcttt 32760
tcttgatggt aaatcattcg aatataagaa tggagagacg aatggggaaa cgacaaagat 32820
gacattcttt ggtccttctg gtgaggttct caagtttttg gttaatcctg tcaacaactt 32880
atatcgtatg gggctgactt caggtgctac atttgaagag ataaattgca ctgaaatcta 32940
gtaatatttt atctgattaa taagatgatc ttcttgagat cgttttggtc tgcgcgtaat 33000
ctcttgctct gaaaacgaaa aaaccgcctt gcagggcggt ttttcgaagg ttctctgagc 33060
taccaactct ttgaaccgag gtaactggct tggcagagcg cagtcaccaa aacttgtcct 33120
ttcagtttag ccttaaccgg cgcatgactt caagactaac tctgctaaat caattaccag 33180
tggctgctgc cagtggtgct tttgcatgtc tttccgggtt ggactcaaga cgatagttac 33240
cggataaggc gcagcggtcg gactgaacgg ggggttcgtg catacagtcc agcttggagc 33300
gaactgccta cccggaactg agtgtcaggc gtggaatgag acaaacgcgg ccataacagc 33360
ggaatgacac cggtaaaccg aaaggcagga acaggagagc gcacgaggga gccgccaggg 33420
ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc accactgatt tgagcgtcag 33480
atttcgtgat gcttgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acggctttgc cgcggccctc 33540
tcacttccct gttaagtatc ttcctggcat cttccaggaa atctccgccc cgttcgtaag 33600
ccatttccgc tcgccgcagt cgaacgaccg agcgtagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 33660
aatatatcct gtatcacata ttctgctgac gcaccggtgc ggcctttttt ctcctgccac 33720
atgaagcact tcactgacac cctcatcagt gccaacatag taagccagta tacactccgc 33780
taatttaaac gtggtgtacc gagaacgatc ctctcagtgc gatctcgacg atcagtggta 33840
ttccgacata tcgttgcttg gcagtcagcc agtcgatcct agcttgggac ccaggaagtc 33900
caatcgtcag atattgtact cagcctggtc acggcagcgt accgatctcg taactataac 33960
ggtcctaagg tagcgaacta gatattgata gtctgatcgg tcaacgtata atcgagtcct 34020
agcttttgca aacatctatc aagagacagg atcagcagga ggctttcgca tgattgaaca 34080
agatggattg cacgcaggtt ctccggcggc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 34140
ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 34200
tccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc 34260
agcgcggcta tcgtggctgg cgacgacggg cgttccttgc gcggctgtgc tcgacgttgt 34320
cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 34380
atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 34440
tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 34500
acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 34560
gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgtct atgcccgacg gcgaggatct 34620
cgtcgtgacc cacggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 34680
tggattcatc gactgtggcc gtctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 34740
tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc ttgtgcttta 34800
cggtatcgcc gcgcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 34860
ctgaccgatt ctaggtgcat tggcgcagaa aaaaatgcct gatgcgacgc tgcgcgtctt 34920
atactcccac atatgccaga ttcagcaacg gatacggctt ccccaacttg cccacttcca 34980
tacgtgtcct ccttaccaga aatttatcct taaggtccgt aactataacg gtcctaaggt 35040
agcgaatcga cctagctcta tcgaatctcc ctcgtttcga gcttacgcga actagcctct 35100
ggcgatagca tccgaggggc aggcatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgtcaag 35160
ttcgatctga ttgcttggca taaagtccga tggttcgagt agactcagtt caacctctct 35220
cttaaggtag c 35231
<210> 67
<211> 643
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 碘化钠同向转运蛋白(NIS)氨基酸序列
<400> 67
Met Glu Ala Val Glu Thr Gly Glu Arg Pro Thr Phe Gly Ala Trp Asp
1 5 10 15
Tyr Gly Val Phe Ala Leu Met Leu Leu Val Ser Thr Gly Ile Gly Leu
20 25 30
Trp Val Gly Leu Ala Arg Gly Gly Gln Arg Ser Ala Glu Asp Phe Phe
35 40 45
Thr Gly Gly Arg Arg Leu Ala Ala Leu Pro Val Gly Leu Ser Leu Ser
50 55 60
Ala Ser Phe Met Ser Ala Val Gln Val Leu Gly Val Pro Ser Glu Ala
65 70 75 80
Tyr Arg Tyr Gly Leu Lys Phe Leu Trp Met Cys Leu Gly Gln Leu Leu
85 90 95
Asn Ser Val Leu Thr Ala Leu Leu Phe Met Pro Val Phe Tyr Arg Leu
100 105 110
Gly Leu Thr Ser Thr Tyr Glu Tyr Leu Glu Met Arg Phe Ser Arg Ala
115 120 125
Val Arg Leu Cys Gly Thr Leu Gln Tyr Ile Val Ala Thr Met Leu Tyr
130 135 140
Thr Gly Ile Val Ile Tyr Ala Pro Ala Leu Ile Leu Asn Gln Val Thr
145 150 155 160
Gly Leu Asp Ile Trp Ala Ser Leu Leu Ser Thr Gly Ile Ile Cys Thr
165 170 175
Phe Tyr Thr Ala Val Gly Gly Met Lys Ala Val Val Trp Thr Asp Val
180 185 190
Phe Gln Val Val Val Met Leu Ser Gly Phe Trp Val Val Leu Ala Arg
195 200 205
Gly Val Met Leu Val Gly Gly Pro Arg Gln Val Leu Thr Leu Ala Gln
210 215 220
Asn His Ser Arg Ile Asn Leu Met Asp Phe Asn Pro Asp Pro Arg Ser
225 230 235 240
Arg Tyr Thr Phe Trp Thr Phe Val Val Gly Gly Thr Leu Val Trp Leu
245 250 255
Ser Met Tyr Gly Val Asn Gln Ala Gln Val Gln Arg Tyr Val Ala Cys
260 265 270
Arg Thr Glu Lys Gln Ala Lys Leu Ala Leu Leu Ile Asn Gln Val Gly
275 280 285
Leu Phe Leu Ile Val Ser Ser Ala Ala Cys Cys Gly Ile Val Met Phe
290 295 300
Val Phe Tyr Thr Asp Cys Asp Pro Leu Leu Leu Gly Arg Ile Ser Ala
305 310 315 320
Pro Asp Gln Tyr Met Pro Leu Leu Val Leu Asp Ile Phe Glu Asp Leu
325 330 335
Pro Gly Val Pro Gly Leu Phe Leu Ala Cys Ala Tyr Ser Gly Thr Leu
340 345 350
Ser Thr Ala Ser Thr Ser Ile Asn Ala Met Ala Ala Val Thr Val Glu
355 360 365
Asp Leu Ile Lys Pro Arg Leu Arg Ser Leu Ala Pro Arg Lys Leu Val
370 375 380
Ile Ile Ser Lys Gly Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Ser Ala Cys Leu Thr
385 390 395 400
Val Ala Ala Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Ser
405 410 415
Phe Thr Val Met Gly Val Ile Ser Gly Pro Leu Leu Gly Ala Phe Ile
420 425 430
Leu Gly Met Phe Leu Pro Ala Cys Asn Thr Pro Gly Val Leu Ala Gly
435 440 445
Leu Gly Ala Gly Leu Ala Leu Ser Leu Trp Val Ala Leu Gly Ala Thr
450 455 460
Leu Tyr Pro Pro Ser Glu Gln Thr Met Arg Val Leu Pro Ser Ser Ala
465 470 475 480
Ala Arg Cys Val Ala Leu Ser Val Asn Ala Ser Gly Leu Leu Asp Pro
485 490 495
Ala Leu Leu Pro Ala Asn Asp Ser Ser Arg Ala Pro Ser Ser Gly Met
500 505 510
Asp Ala Ser Arg Pro Ala Leu Ala Asp Ser Phe Tyr Ala Ile Ser Tyr
515 520 525
Leu Tyr Tyr Gly Ala Leu Gly Thr Leu Thr Thr Val Leu Cys Gly Ala
530 535 540
Leu Ile Ser Cys Leu Thr Gly Pro Thr Lys Arg Ser Thr Leu Ala Pro
545 550 555 560
Gly Leu Leu Trp Trp Asp Leu Ala Arg Gln Thr Ala Ser Val Ala Pro
565 570 575
Lys Glu Glu Val Ala Ile Leu Asp Asp Asn Leu Val Lys Gly Pro Glu
580 585 590
Glu Leu Pro Thr Gly Asn Lys Lys Pro Pro Gly Phe Leu Pro Thr Asn
595 600 605
Glu Asp Arg Leu Phe Phe Leu Gly Gln Lys Glu Leu Glu Gly Ala Gly
610 615 620
Ser Trp Thr Pro Cys Val Gly His Asp Gly Gly Arg Asp Gln Gln Glu
625 630 635 640
Thr Asn Leu
<210> 68
<211> 34558
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由插入BY区中的编码碘化钠同向转运蛋白(NIS)的转基因盒组成的NG-280病毒基因组序列
<400> 68
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
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caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
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atcagaaagt cgaatatgat atcgacatgg agttttttga tgcggcatcg cagaaaacaa 19080
acttaagtcc taaaattgtc atgtatgcag aaaatgtaaa tttggaaact ccagacactc 19140
atgtagtgta caaacctgga acagaagaca caagttccga agctaatttg ggacaacaat 19200
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cttatgagtg gaactttagg aaggatgtga acatggttct acagagttcc ctcggtaacg 20040
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ctcgtatttt gtatagcaaa acgcggccct ggcagaacac actcttcttc gccttctatc 32820
ctgccgctta gcgtgttccg tgtgatagtt caagtacaac cacactctta agttggtcaa 32880
aagaatgctg gcttcagttg taatcaaaac tccatcgcat ctaatcgttc tgaggaaatc 32940
atccaagcaa tgcaactgga ttgtgtttca agcaggagag gagagggaag agacggaaga 33000
accatgttaa tttttattcc aaacgatctc gcagtacttc aaattgtaga tcgcgcagat 33060
ggcatctctc gcccccactg tgttggtgaa aaagcacagc tagatcaaaa gaaatgcgat 33120
tttcaaggtg ctcaacggtg gcttccagca aagcctccac gcgcacatcc aagaacaaaa 33180
gaataccaaa agaaggagca ttttctaact cctcaatcat catattacat tcctgcacca 33240
ttcccagata attttcagct ttccagcctt gaattattcg tgtcagttct tgtggtaaat 33300
ccaatccaca cattacaaac aggtcccgga gggcgccctc caccaccatt cttaaacaca 33360
ccctcataat gacaaaatat cttgctcctg tgtcacctgt agcgaattga gaatggcaac 33420
atcaattgac atgcccttgg ctctaagttc ttctttaagt tctagttgta aaaactctct 33480
catattatca ccaaactgct tagccagaag ccccccggga acaagagcag gggacgctac 33540
agtgcagtac aagcgcagac ctccccaatt ggctccagca aaaacaagat tggaataagc 33600
atattgggaa ccgccagtaa tatcatcgaa gttgctggaa atataatcag gcagagtttc 33660
ttgtaaaaat tgaataaaag aaaaatttgc caaaaaaaca ttcaaaacct ctgggatgca 33720
aatgcaatag gttaccgcgc tgcgctccaa cattgttagt tttgaattag tctgcaaaaa 33780
taaaaaaaaa aacaagcgtc atatcatagt agcctgacga acagatggat aaatcagtct 33840
ttccatcaca agacaagcca cagggtctcc agctcgaccc tcgtaaaacc tgtcatcatg 33900
attaaacaac agcaccgaaa gttcctcgcg gtgaccagca tgaataattc ttgatgaagc 33960
atacaatcca gacatgttag catcagttaa cgagaaaaaa cagccaacat agcctttggg 34020
tataattatg cttaatcgta agtatagcaa agccacccct cgcggataca aagtaaaagg 34080
cacaggagaa taaaaaatat aattatttct ctgctgctgt tcaggcaacg tcgcccccgg 34140
tccctctaaa tacacataca aagcctcatc agccatggct taccagacaa agtacagcgg 34200
gcacacaaag cacaagctct aaagtgactc tccaacctct ccacaatata tatatacaca 34260
agccctaaac tgacgtaatg ggagtaaagt gtaaaaaatc ccgccaaacc caacacacac 34320
cccgaaactg cgtcaccagg gaaaagtaca gtttcacttc cgcaatccca acaggcgtaa 34380
cttcctcttt ctcacggtac gtgatatccc actaacttgc aacgtcattt tcccacggtc 34440
gcaccgcccc ttttagccgt taaccccaca gccaatcacc acacgatcca cactttttaa 34500
aatcacctca tttacatatt ggcaccattc catctataag gtatattata tagataga 34558
<210> 69
<211> 34327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含具有插入BY区中的编码抗VEGF ScFv和抗PD-L1 ScFv的转基因盒的EnAd基因组的NG-272病毒基因组序列。
<400> 69
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
ccactctgat acaaaggcgc gcgtccaggc cagcacaaag gaggctatgt gggaggggta 5760
gcgatcgttg tcaaccaggg ggtccacctt ttccaaagta tgcaaacaca tgtcaccctc 5820
ttcaacatcc aggaatgtga ttggcttgta ggtgtatttc acgtgacctg gggtccccgc 5880
tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
caggaacgtc agctgttggg gtaggtattc cctctcgaag gcgggcatga cctctgcact 6000
caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
tttcatgagg ttttcgtcca tctggtcaga aaacacaatt tttttattgt caagtttggt 6120
ggcaaatgat ccatacaggg cgttggataa aagtttggca atggatcgca tggtttggtt 6180
cttttccttg tccgcgcgct ctttggcggc gatgttgagt tggacatact cgcgtgccag 6240
gcacttccat tcggggaaga tagttgttaa ttcatctggc acgattctca cttgccaccc 6300
tcgattatgc aaggtaatta aatccacact ggtggccacc tcgcctcgaa ggggttcatt 6360
ggtccaacag agcctacctc ctttcctaga acagaaaggg ggaagtgggt ctagcataag 6420
ttcatcggga gggtctgcat ccatggtaaa gattcccgga agtaaatcct tatcaaaata 6480
gctgatggga gtggggtcat ctaaggccat ttgccattct cgagctgcca gtgcgcgctc 6540
atatgggtta aggggactgc cccatggcat gggatgggtg agtgcagagg catacatgcc 6600
acagatgtca tagacgtaga tgggatcctc aaagatgcct atgtaggttg gatagcatcg 6660
cccccctctg atacttgctc gcacatagtc atatagttca tgtgatggcg ctagcagccc 6720
cggacccaag ttggtgcgat tgggtttttc tgttctgtag acgatctggc gaaagatggc 6780
gtgagaattg gaagagatgg tgggtctttg aaaaatgttg aaatgggcat gaggtagacc 6840
tacagagtct ctgacaaagt gggcataaga ttcttgaagc ttggttacca gttcggcggt 6900
gacaagtacg tctagggcgc agtagtcaag tgtttcttga atgatgtcat aacctggttg 6960
gtttttcttt tcccacagtt cgcggttgag aaggtattct tcgcgatcct tccagtactc 7020
ttctagcgga aacccgtctt tgtctgcacg gtaagatcct agcatgtaga actgattaac 7080
tgccttgtaa gggcagcagc ccttctctac gggtagagag tatgcttgag cagcttttcg 7140
tagcgaagcg tgagtaaggg caaaggtgtc tctgaccatg actttgagga attggtattt 7200
gaagtcgatg tcgtcacagg ctccctgttc ccagagttgg aagtctaccc gtttcttgta 7260
ggcggggttg ggcaaagcga aagtaacatc attgaagaga atcttgccgg ccctgggcat 7320
gaaattgcga gtgatgcgaa aaggctgtgg tacttccgct cggttattga taacctgggc 7380
agctaggacg atctcgtcga aaccgttgat gttgtgtcct acgatgtata attctatgaa 7440
acgcggcgtg cctctgacgt gaggtagctt actgagctca tcaaaggtta ggtctgtggg 7500
gtcagataag gcgtagtgtt cgagagccca ttcgtgcagg tgaggattcg ctttaaggaa 7560
ggaggaccag aggtccactg ccagtgctgt ttgtaactgg tcccggtact gacgaaaatg 7620
ccgtccgact gccatttttt ctggggtgac gcaatagaag gtttgggggt cctgccgcca 7680
gcgatcccac ttgagtttta tggcgaggtc ataggcgatg ttgacgagcc gctggtctcc 7740
agagagtttc atgaccagca tgaaggggat tagctgcttg ccaaaggacc ccatccaggt 7800
gtaggtttcc acatcgtagg tgagaaagag cctttctgtg cgaggatgag agccaatcgg 7860
gaagaactgg atctcctgcc accagttgga ggaatggctg ttgatgtgat ggaagtagaa 7920
ctccctgcga cgcgccgagc attcatgctt gtgcttgtac agacggccgc agtagtcgca 7980
gcgttgcacg ggttgtatct cgtgaatgag ttgtacctgg cttcccttga cgagaaattt 8040
cagtgggaag ccgaggcctg gcgattgtat ctcgtgcttt actatgttgt ctgcatcggc 8100
ctgttcatct tctgtctcga tggtggtcat gctgacgagc cctcgcggga ggcaagtcca 8160
gacctcggcg cggcaggggc ggagctcgag gacgagagcg cgcaggctgg agctgtccag 8220
ggtcctgaga cgctgcggac tcaggttagt aggcagtgtc aggagattaa cttgcatgat 8280
cttttggagg gcgtgcggga ggttcagata gtacttgatc tcaacgggtc cgttggtgga 8340
gatgtcgatg gcttgcaggg ttccgtgtcc cttgggcgct accaccgtgc ccttgttttt 8400
cattttggac ggcggtggct ctgttgcttc ttgcatgttt agaagcggtg tcgagggcgc 8460
gcaccgggcg gcaggggcgg ctcgggaccc ggcggcatgg ctggcagtgg tacgtcggcg 8520
ccgcgcgcgg gtaggttctg gtactgcgcc ctgagaagac tcgcatgcgc gacgacgcgg 8580
cggttgacat cctggatctg acgcctctgg gtgaaagcta ccggccccgt gagcttgaac 8640
ctgaaagaga gttcaacaga atcaatctcg gtatcgttga cggcggcttg cctaaggatt 8700
tcttgcacgt caccagagtt gtcctggtag gcgatctccg ccatgaactg ctcgatctct 8760
tcctcttgaa gatctccgcg gcccgctctc tcgacggtgg ccgcgaggtc gttggagatg 8820
cgcccaatga gttgagagaa tgcattcatg cccgcctcgt tccagacgcg gctgtagacc 8880
acggccccca cgggatctct cgcgcgcatg accacctggg cgaggttgag ctccacgtgg 8940
cgggtgaaga ccgcatagtt gcataggcgc tggaaaaggt agttgagtgt ggtggcgatg 9000
tgctcggtga cgaagaaata catgatccat cgtctcagcg gcatctcgct gacatcgccc 9060
agagcttcca agcgctccat ggcctcgtag aagtccacgg caaaattaaa aaactgggag 9120
tttcgcgcgg acacggtcaa ctcctcttcc agaagacgga taagttcggc gatggtggtg 9180
cgcacctcgc gctcgaaagc ccctgggatt tcttcctcaa tctcttcttc ttccactaac 9240
atctcttcct cttcaggtgg ggctgcagga ggagggggaa cgcggcgacg ccggcggcgc 9300
acgggcagac ggtcgatgaa tctttcaatg acctctccgc ggcggcggcg catggtttca 9360
gtgacggcgc ggccgttctc gcgcggtcgc agagtaaaaa caccgccgcg catctcctta 9420
aagtggtgac tgggaggttc tccgtttggg agggagaggg cgctgattat acattttatt 9480
aattggcccg tagggactgc acgcagagat ctgatcgtgt caagatccac gggatctgaa 9540
aacctttcga cgaaagcgtc taaccagtca cagtcacaag gtaggctgag tacggcttct 9600
tgtgggcggg ggtggttatg tgttcggtct gggtcttctg tttcttcttc atctcgggaa 9660
ggtgagacga tgctgctggt gatgaaatta aagtaggcag ttctaagacg gcggatggtg 9720
gcgaggagca ccaggtcttt gggtccggct tgctggatac gcaggcgatt ggccattccc 9780
caagcattat cctgacatct agcaagatct ttgtagtagt cttgcatgag ccgttctacg 9840
ggcacttctt cctcacccgt tctgccatgc atacgtgtga gtccaaatcc gcgcattggt 9900
tgtaccagtg ccaagtcagc tacgactctt tcggcgagga tggcttgctg tacttgggta 9960
agggtggctt gaaagtcatc aaaatccaca aagcggtggt aagctcctgt attaatggtg 10020
taagcacagt tggccatgac tgaccagtta actgtctggt gaccagggcg cacgagctcg 10080
gtgtatttaa ggcgcgaata ggcgcgggtg tcaaagatgt aatcgttgca ggtgcgcacc 10140
agatactggt accctataag aaaatgcggc ggtggttggc ggtagagagg ccatcgttct 10200
gtagctggag cgccaggggc gaggtcttcc aacataaggc ggtgatagcc gtagatgtac 10260
ctggacatcc aggtgattcc tgcggcggta gtagaagccc gaggaaactc gcgtacgcgg 10320
ttccaaatgt tgcgtagcgg catgaagtag ttcattgtag gcacggtttg accagtgagg 10380
cgcgcgcagt cattgatgct ctatagacac ggagaaaatg aaagcgttca gcgactcgac 10440
tccgtagcct ggaggaacgt gaacgggttg ggtcgcggtg taccccggtt cgagacttgt 10500
actcgagccg gccggagccg cggctaacgt ggtattggca ctcccgtctc gacccagcct 10560
acaaaaatcc aggatacgga atcgagtcgt tttgctggtt tccgaatggc agggaagtga 10620
gtcctatttt ttttttttgc cgctcagatg catcccgtgc tgcgacagat gcgcccccaa 10680
caacagcccc cctcgcagca gcagcagcag caatcacaaa aggctgtccc tgcaactact 10740
gcaactgccg ccgtgagcgg tgcgggacag cccgcctatg atctggactt ggaagagggc 10800
gaaggactgg cacgtctagg tgcgccttca cccgagcggc atccgcgagt tcaactgaaa 10860
aaagattctc gcgaggcgta tgtgccccaa cagaacctat ttagagacag aagcggcgag 10920
gagccggagg agatgcgagc ttcccgcttt aacgcgggtc gtgagctgcg tcacggtttg 10980
gaccgaagac gagtgttgcg ggacgaggat ttcgaagttg atgaaatgac agggatcagt 11040
cctgccaggg cacacgtggc tgcagccaac cttgtatcgg cttacgagca gacagtaaag 11100
gaagagcgta acttccaaaa gtcttttaat aatcatgtgc gaaccctgat tgcccgcgaa 11160
gaagttaccc ttggtttgat gcatttgtgg gatttgatgg aagctatcat tcagaaccct 11220
actagcaaac ctctgaccgc ccagctgttt ctggtggtgc aacacagcag agacaatgag 11280
gctttcagag aggcgctgct gaacatcacc gaacccgagg ggagatggtt gtatgatctt 11340
atcaacattc tacagagtat catagtgcag gagcggagcc tgggcctggc cgagaaggtg 11400
gctgccatca attactcggt tttgagcttg ggaaaatatt acgctcgcaa aatctacaag 11460
actccatacg ttcccataga caaggaggtg aagatagatg ggttctacat gcgcatgacg 11520
ctcaaggtct tgaccctgag cgatgatctt ggggtgtatc gcaatgacag aatgcatcgc 11580
gcggttagcg ccagcaggag gcgcgagtta agcgacaggg aactgatgca cagtttgcaa 11640
agagctctga ctggagctgg aaccgagggt gagaattact tcgacatggg agctgacttg 11700
cagtggcagc ctagtcgcag ggctctgagc gccgcgacgg caggatgtga gcttccttac 11760
atagaagagg cggatgaagg cgaggaggaa gagggcgagt acttggaaga ctgatggcac 11820
aacccgtgtt ttttgctaga tggaacagca agcaccggat cccgcaatgc gggcggcgct 11880
gcagagccag ccgtccggca ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgtat 11940
catggcgttg acgactcgca accccgaagc ctttagacag caaccccagg ccaaccgtct 12000
atcggccatc atggaagctg tagtgccttc ccgctctaat cccactcatg agaaggtcct 12060
ggccatcgtg aacgcgttgg tggagaacaa agctattcgt ccagatgagg ccggactggt 12120
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gctgcggaga caagcaacag cgctaccatc tccgctccga gtcgaggaac ccggcggcgt 25860
cccagcagta gatgggacga gaccggacgc ttcccgaacc caaccagcgc ttccaagacc 25920
ggtaagaagg atcggcaggg atacaagtcc tggcgggggc ataagaatgc catcatctcc 25980
tgcttgcatg agtgcggggg caacatatcc ttcacgcggc gctacttgct attccaccat 26040
ggggtgaact ttccgcgcaa tgttttgcat tactaccgtc acctccacag cccctactat 26100
agccagcaaa tcccggcagt ctcgacagat aaagacagcg gcggcgacct ccaacagaaa 26160
accagcagcg gcagttagaa aatacacaac aagtgcagca acaggaggat taaagattac 26220
agccaacgag ccagcgcaaa cccgagagtt aagaaatcgg atctttccaa ccctgtatgc 26280
catcttccag cagagtcggg gtcaagagca ggaactgaaa ataaaaaacc gatctctgcg 26340
ttcgctcacc agaagttgtt tgtatcacaa gagcgaagat caacttcagc gcactctcga 26400
ggacgccgag gctctcttca acaagtactg cgcgctgact cttaaagagt aggcagcgac 26460
cgcgcttatt caaaaaaggc gggaattaca tcatcctcga catgagtaaa gaaattccca 26520
cgccttacat gtggagttat caaccccaaa tgggattggc ggcaggcgcc tcccaggact 26580
actccacccg catgaattgg ctcagcgccg ggccttctat gatttctcga gttaatgata 26640
tacgcgccta ccgaaaccaa atacttttgg aacagtcagc tcttaccacc acgccccgcc 26700
aacaccttaa tcccagaaat tggcccgccg ccctagtgta ccaggaaagt cccgctccca 26760
ccactgtatt acttcctcga gacgcccagg ccgaagtcca aatgactaat gcaggtgcgc 26820
agttagctgg cggctccacc ctatgtcgtc acaggcctcg gcataatata aaacgcctga 26880
tgatcagagg ccgaggtatc cagctcaacg acgagtcggt gagctctccg cttggtctac 26940
gaccagacgg aatctttcag attgccggct gcgggagatc ttccttcacc cctcgtcagg 27000
ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc 27060
aatttgtgga ggagtttact ccctctgtct acttcaaccc cttctccgga tctcctgggc 27120
attacccgga cgagttcata ccgaacttcg acgcgattag cgagtcagtg gacggctacg 27180
attgatgtct ggtgacgcgg ctgagctatc tcggctgcga catctagacc actgccgccg 27240
ctttcgctgc tttgcccggg aactcattga gttcatctac ttcgaactcc ccaaggatca 27300
ccctcaaggt ccggcccacg gagtgcggat ttctatcgaa ggcaaaatag actctcgcct 27360
gcaacgaatt ttctcccagc ggcccgtgct gatcgagcga gaccagggaa acaccacggt 27420
ttccatctac tgcatttgta atcaccccgg attgcatgaa agcctttgct gtcttatgtg 27480
tactgagttt aataaaaact gaattaagac tctcctacgg actgccgctt cttcaacccg 27540
gattttacaa ccagaagaac gaaacttttc ctgtcgtcca ggactctgtt aacttcacct 27600
ttcctactca caaactagaa gctcaacgac tacaccgctt ttccagaagc attttcccta 27660
ctaatactac tttcaaaacc ggaggtgagc tccaaggtct tcctacagaa aacccttggg 27720
tggaagcggg ccttgtagtg ctaggaattc ttgcgggtgg gcttgtgatt attctttgct 27780
acctatacac accttgcttc actttcttag tggtgttgtg gtattggttt aaaaaatggg 27840
gcccatacta gtcttgcttg ttttactttc gcttttggaa ccgggttctg ccaattacga 27900
tccatgtcta gacttcgacc cagaaaactg cacacttact tttgcacccg acacaagccg 27960
catctgtgga gttcatcgcc tctcttacga acttggcccc caacgacaaa aatttacctg 28020
catggtggga atcaacccca tagttatcac ccagcaaagt ggagatacta agggttgcat 28080
tcactgctcc tgcgattcca tcgagtgcac ctacaccctg ctgaagaccc tatgcggcct 28140
aagagacctg ctaccaatga attaaaaaat gattaataaa aaatcactta cttgaaatca 28200
gcaataaggt ctctgttgaa attttctccc agcagcacct cacttccctc ttcccaactc 28260
tggtattcta aaccccgttc agcggcatac tttctccata ctttaaaggg gatgtcaaat 28320
tttagctcct ctcctgtacc cacaatcttc atgtctttct tcccagatga ccaagagagt 28380
ccggctcagt gactccttca accctgtcta cccctatgaa gatgaaagca cctcccaaca 28440
cccctttata aacccagggt ttatttcccc aaatggcttc acacaaagcc caaacggagt 28500
tcttacttta aaatgtttaa ccccactaac aaccacaggc ggatctctac agctaaaagt 28560
gggaggggga cttacagtgg atgacaccaa cggttttttg aaagaaaaca taagtgccac 28620
cacaccactc gttaagactg gtcactctat aggtttacca ctaggagccg gattgggaac 28680
gaatgaaaat aaactttgta tcaaattagg acaaggactt acattcaatt caaacaacat 28740
ttgcattgat gacaatatta acaccttatg gacaggagtc aaccccaccg aagccaactg 28800
tcaaatcatg aactccagtg aatctaatga ttgcaaatta attctaacac tagttaaaac 28860
tggagcacta gtcactgcat ttgtttatgt tataggagta tctaacaatt ttaatatgct 28920
aactacacac agaaatataa attttactgc agagctgttt ttcgattcta ctggtaattt 28980
actaactaga ctctcatccc tcaaaactcc acttaatcat aaatcaggac aaaacatggc 29040
tactggtgcc attactaatg ctaaaggttt catgcccagc acgactgcct atcctttcaa 29100
tgataattct agagaaaaag aaaactacat ttacggaact tgttactaca cagctagtga 29160
tcgcactgct tttcccattg acatatctgt catgcttaac cgaagagcaa taaatgacga 29220
gacatcatat tgtattcgta taacttggtc ctggaacaca ggagatgccc cagaggtgca 29280
aacctctgct acaaccctag tcacctcccc atttaccttt tactacatca gagaagacga 29340
ctgacaaata aagtttgcga tcgccaggcc caccatggga tggagctgca tcatactgtt 29400
cctggttgcc acagctacag gggtacactc cgaagtccag ctcgttgaaa gcggaggcgg 29460
gttggtccaa cctggcggct cacttcggct ttcctgtgca gctagtgggt tcaccttttc 29520
cgatagctgg atacactggg tgagacaggc tccaggcaaa ggcttggaat gggtcgcctg 29580
gattagcccc tatggaggca gcacctatta cgccgattct gtgaagggga ggttcacaat 29640
ctccgccgat accagtaaga acacagccta tctgcagatg aatagtctcc gagccgagga 29700
cactgcagtg tactactgcg ctaggcgtca ttggccagga ggctttgact actggggtca 29760
aggtaccctc gtgactgtga gtgcaggtgg cggtggctcg ggcggtggtg gatctggtgg 29820
cggcggatct gacatccaga tgacacagag ccctagctca ctgtctgcga gcgtaggcga 29880
cagagtgacc atcacttgtc gggcttccca ggatgtgtcc acagccgttg catggtacca 29940
gcagaaaccc gggaaagcac caaagctgct gatctacagc gcttctttcc tgtactcagg 30000
cgtgcctagc cgctttagtg ggtctggttc tgggactgac ttcaccctca cgatttcctc 30060
actgcaaccc gaggattttg cgacctatta ctgccagcag tatctgtatc atccggccac 30120
ttttgggcaa ggcacgaagg tcgagattaa gcgccatcat caccaccacc acggaagcgg 30180
agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctgg 30240
ttggtcgtgt ataatcctat ttctcgtagc aactgcgact ggcgtccata gtgaggttca 30300
gctggtggag tctggcggtg gcctggtgca gccagggggt tcactccgtt tgtcttgtgc 30360
ggcttctggc tataccttca ccaactatgg tatgaactgg gtccgtcagg ccccgggtaa 30420
gggcctggag tgggttggat ggattaacac ctataccggt gaaccgacct atgctgcgga 30480
tttcaaacgt cgttttactt tttctctgga cacctccaag agcacagctt acctccagat 30540
gaacagcctg cgcgctgagg acactgccgt ctattactgt gcaaagtacc cgcactatta 30600
tgggagcagc cactggtatt tcgacgtctg gggacaagga accctggtca ccgtctcctc 30660
gggaggtggt ggaagtgggg gcggcggtag cggagggggt ggtagcgata tacaaatgac 30720
ccagtccccg tctagcctgt ccgcctctgt gggcgatagg gtcaccatca cctgcagcgc 30780
aagtcaggat attagcaact atttaaactg gtatcaacag aaaccaggaa aagctccgaa 30840
agtcctgatt tacttcacct cctctctcca ctctggagtc ccttctcgct tctctggatc 30900
cggaagtggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg cagccagaag acttcgcaac 30960
ttattactgt caacagtata gcaccgtgcc gtggacgttt ggacagggta ccaaagtgga 31020
aataaaacga ggtaagccta tccctaaccc tctcctcggt ctcgattcta cgtaagctag 31080
cttgactgac tgagatacag cgtaccttca gctcacagac atgataagat acattgatga 31140
gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga 31200
tgctattgct ttatttgtaa ccattataag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 31260
cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa 31320
cctctacaaa tgtggtagtc gtcagctatc ctgcaggaac ttgtttattt gaaaatcaat 31380
tcacaaaatc cgagtagtta ttttgcctcc cccttcccat ttaacagaat acaccaatct 31440
ctccccacgc acagctttaa acatttggat accattagat atagacatgg ttttagattc 31500
cacattccaa acagtttcag agcgagccaa tctggggtca gtgatagata aaaatccatc 31560
gggatagtct tttaaagcgc tttcacagtc caactgctgc ggatgcgact ccggagtctg 31620
gatcacggtc atctggaaga agaacgatgg gaatcataat ccgaaaacgg tatcggacga 31680
ttgtgtctca tcaaacccac aagcagccgc tgtctgcgtc gctccgtgcg actgctgttt 31740
atgggatcag ggtccacagt gtcctgaagc atgattttaa tagcccttaa catcaacttt 31800
ctggtgcgat gcgcgcagca acgcattctg atttcactca aatctttgca gtaggtacaa 31860
cacattatta caatattgtt taataaacca taattaaaag cgctccagcc aaaactcata 31920
tctgatataa tcgcccctgc atgaccatca taccaaagtt taatataaat taaatgacgt 31980
tccctcaaaa acacactacc cacatacatg atctcttttg gcatgtgcat attaacaatc 32040
tgtctgtacc atggacaacg ttggttaatc atgcaaccca atataacctt ccggaaccac 32100
actgccaaca ccgctccccc agccatgcat tgaagtgaac cctgctgatt acaatgacaa 32160
tgaagaaccc aattctctcg accgtgaatc acttgagaat gaaaaatatc tatagtggca 32220
caacatagac ataaatgcat gcatcttctc ataattttta actcctcagg atttagaaac 32280
atatcccagg gaataggaag ctcttgcaga acagtaaagc tggcagaaca aggaagacca 32340
cgaacacaac ttacactatg catagtcata gtatcacaat ctggcaacag cgggtggtct 32400
tcagtcatag aagctcgggt ttcattttcc tcacaacgtg gtaactgggc tctggtgtaa 32460
gggtgatgtc tggcgcatga tgtcgagcgt gcgcgcaacc ttgtcataat ggagttgctt 32520
cctgacattc tcgtattttg tatagcaaaa cgcggccctg gcagaacaca ctcttcttcg 32580
ccttctatcc tgccgcttag cgtgttccgt gtgatagttc aagtacaacc acactcttaa 32640
gttggtcaaa agaatgctgg cttcagttgt aatcaaaact ccatcgcatc taatcgttct 32700
gaggaaatca tccaagcaat gcaactggat tgtgtttcaa gcaggagagg agagggaaga 32760
gacggaagaa ccatgttaat ttttattcca aacgatctcg cagtacttca aattgtagat 32820
cgcgcagatg gcatctctcg cccccactgt gttggtgaaa aagcacagct agatcaaaag 32880
aaatgcgatt ttcaaggtgc tcaacggtgg cttccagcaa agcctccacg cgcacatcca 32940
agaacaaaag aataccaaaa gaaggagcat tttctaactc ctcaatcatc atattacatt 33000
cctgcaccat tcccagataa ttttcagctt tccagccttg aattattcgt gtcagttctt 33060
gtggtaaatc caatccacac attacaaaca ggtcccggag ggcgccctcc accaccattc 33120
ttaaacacac cctcataatg acaaaatatc ttgctcctgt gtcacctgta gcgaattgag 33180
aatggcaaca tcaattgaca tgcccttggc tctaagttct tctttaagtt ctagttgtaa 33240
aaactctctc atattatcac caaactgctt agccagaagc cccccgggaa caagagcagg 33300
ggacgctaca gtgcagtaca agcgcagacc tccccaattg gctccagcaa aaacaagatt 33360
ggaataagca tattgggaac cgccagtaat atcatcgaag ttgctggaaa tataatcagg 33420
cagagtttct tgtaaaaatt gaataaaaga aaaatttgcc aaaaaaacat tcaaaacctc 33480
tgggatgcaa atgcaatagg ttaccgcgct gcgctccaac attgttagtt ttgaattagt 33540
ctgcaaaaat aaaaaaaaaa acaagcgtca tatcatagta gcctgacgaa cagatggata 33600
aatcagtctt tccatcacaa gacaagccac agggtctcca gctcgaccct cgtaaaacct 33660
gtcatcatga ttaaacaaca gcaccgaaag ttcctcgcgg tgaccagcat gaataattct 33720
tgatgaagca tacaatccag acatgttagc atcagttaac gagaaaaaac agccaacata 33780
gcctttgggt ataattatgc ttaatcgtaa gtatagcaaa gccacccctc gcggatacaa 33840
agtaaaaggc acaggagaat aaaaaatata attatttctc tgctgctgtt caggcaacgt 33900
cgcccccggt ccctctaaat acacatacaa agcctcatca gccatggctt accagacaaa 33960
gtacagcggg cacacaaagc acaagctcta aagtgactct ccaacctctc cacaatatat 34020
atatacacaa gccctaaact gacgtaatgg gagtaaagtg taaaaaatcc cgccaaaccc 34080
aacacacacc ccgaaactgc gtcaccaggg aaaagtacag tttcacttcc gcaatcccaa 34140
caggcgtaac ttcctctttc tcacggtacg tgatatccca ctaacttgca acgtcatttt 34200
cccacggtcg caccgcccct tttagccgtt aaccccacag ccaatcacca cacgatccac 34260
actttttaaa atcacctcat ttacatattg gcaccattcc atctataagg tatattatat 34320
agataga 34327
<210> 73
<211> 33464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含具有插入Bx区中的编码抗VEGF ScFv的转基因盒和插入BY区中的编码抗PD-L1 ScFv的第二转基因盒的EnAd基因组的NG-281病毒基因组序列。
<400> 73
tctatctata taatatacct tatagatgga atggtgccaa tatgtaaatg aggtgatttt 60
aaaaagtgtg gatcgtgtgg tgattggctg tggggttaac ggctaaaagg ggcggtgcga 120
ccgtgggaaa atgacgtttt gtgggggtgg agtttttttg caagttgtcg cgggaaatgt 180
gacgcataaa aaggcttttt tctcacggaa ctacttagtt ttcccacggt atttaacagg 240
aaatgaggta gttttgaccg gatgcaagtg aaaattgttg attttcgcgc gaaaactgaa 300
tgaggaagtg tttttctgaa taatgtggta tttatggcag ggtggagtat ttgttcaggg 360
ccaggtagac tttgacccat tacgtggagg tttcgattac cgtgtttttt acctgaattt 420
ccgcgtaccg tgtcaaagtc ttctgttttt acgtaggtgt cagctgatcg ctagggtatt 480
tatacctcag ggtttgtgtc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagaag agttttctcc 540
tctgcgccgg cagtttaata ataaaaaaat gagagatttg cgatttctgc ctcaggaaat 600
aatctctgct gagactggaa atgaaatatt ggagcttgtg gtgcacgccc tgatgggaga 660
cgatccggag ccacctgtgc agctttttga gcctcctacg cttcaggaac tgtatgattt 720
agaggtagag ggatcggagg attctaatga ggaagctgta aatggctttt ttaccgattc 780
tatgctttta gctgctaatg aagggttaga attagatccg cctttggaca cttttgatac 840
tccaggggta attgtggaaa gcggtacagg tgtaagaaaa ttacctgatt tgagttccgt 900
ggactgtgat ttgcactgct atgaagacgg gtttcctccg agtgatgagg aggaccatga 960
aaaggagcag tccatgcaga ctgcagcggg tgagggagtg aaggctgcca atgttggttt 1020
tcagttggat tgcccggagc ttcctggaca tggctgtaag tcttgtgaat ttcacaggaa 1080
aaatactgga gtaaaggaac tgttatgttc gctttgttat atgagaacgc actgccactt 1140
tatttacagt aagtgtgttt aagttaaaat ttaaaggaat atgctgtttt tcacatgtat 1200
attgagtgtg agttttgtgc ttcttattat aggtcctgtg tctgatgctg atgaatcacc 1260
atctcctgat tctactacct cacctcctga gattcaagca cctgttcctg tggacgtgcg 1320
caagcccatt cctgtgaagc ttaagcctgg gaaacgtcca gcagtggaaa aacttgagga 1380
cttgttacag ggtggggacg gacctttgga cttgagtaca cggaaacgtc caagacaata 1440
agtgttccat atccgtgttt acttaaggtg acgtcaatat ttgtgtgaca gtgcaatgta 1500
ataaaaatat gttaactgtt cactggtttt tattgctttt tgggcgggga ctcaggtata 1560
taagtagaag cagacctgtg tggttagctc ataggagctg gctttcatcc atggaggttt 1620
gggccatttt ggaagacctt aggaagacta ggcaactgtt agagaacgct tcggacggag 1680
tctccggttt ttggagattc tggttcgcta gtgaattagc tagggtagtt tttaggataa 1740
aacaggacta taaacaagaa tttgaaaagt tgttggtaga ttgcccagga ctttttgaag 1800
ctcttaattt gggccatcag gttcacttta aagaaaaagt tttatcagtt ttagactttt 1860
caaccccagg tagaactgct gctgctgtgg cttttcttac ttttatatta gataaatgga 1920
tcccgcagac tcatttcagc aggggatacg ttttggattt catagccaca gcattgtgga 1980
gaacatggaa ggttcgcaag atgaggacaa tcttaggtta ctggccagtg cagcctttgg 2040
gtgtagcggg aatcctgagg catccaccgg tcatgccagc ggttctggag gaggaacagc 2100
aagaggacaa cccgagagcc ggcctggacc ctccagtgga ggaggcggag tagctgactt 2160
gtctcctgaa ctgcaacggg tgcttactgg atctacgtcc actggacggg ataggggcgt 2220
taagagggag agggcatcta gtggtactga tgctagatct gagttggctt taagtttaat 2280
gagtcgcaga cgtcctgaaa ccatttggtg gcatgaggtt cagaaagagg gaagggatga 2340
agtttctgta ttgcaggaga aatattcact ggaacaggtg aaaacatgtt ggttggagcc 2400
tgaggatgat tgggaggtgg ccattaaaaa ttatgccaag atagctttga ggcctgataa 2460
acagtataag attactagac ggattaatat ccggaatgct tgttacatat ctggaaatgg 2520
ggctgaggtg gtaatagata ctcaagacaa ggcagttatt agatgctgca tgatggatat 2580
gtggcctggg gtagtcggta tggaagcagt aacttttgta aatgttaagt ttaggggaga 2640
tggttataat ggaatagtgt ttatggccaa taccaaactt atattgcatg gttgtagctt 2700
ttttggtttc aacaatacct gtgtagatgc ctggggacag gttagtgtac ggggatgtag 2760
tttctatgcg tgttggattg ccacagctgg cagaaccaag agtcaattgt ctctgaagaa 2820
atgcatattt caaagatgta acctgggcat tctgaatgaa ggcgaagcaa gggtccgcca 2880
ctgcgcttct acagatactg gatgttttat tttgattaag ggaaatgcca gcgtaaagca 2940
taacatgatt tgcggtgctt ccgatgagag gccttatcaa atgctcactt gtgctggtgg 3000
gcattgtaat atgctggcta ctgtgcatat tgtttcccat caacgcaaaa aatggcctgt 3060
ttttgatcac aatgtgatga cgaagtgtac catgcatgca ggtgggcgta gaggaatgtt 3120
tatgccttac cagtgtaaca tgaatcatgt gaaagtgttg ttggaaccag atgccttttc 3180
cagaatgagc ctaacaggaa tttttgacat gaacatgcaa atctggaaga tcctgaggta 3240
tgatgatacg agatcgaggg tacgcgcatg cgaatgcgga ggcaagcatg ccaggttcca 3300
gccggtgtgt gtagatgtga ctgaagatct cagaccggat catttggtta ttgcccgcac 3360
tggagcagag ttcggatcca gtggagaaga aactgactaa ggtgagtatt gggaaaactt 3420
tggggtggga ttttcagatg gacagattga gtaaaaattt gttttttctg tcttgcagct 3480
gtcatgagtg gaaacgcttc ttttaagggg ggagtcttca gcccttatct gacagggcgt 3540
ctcccatcct gggcaggagt tcgtcagaat gttatgggat ctactgtgga tggaagaccc 3600
gtccaacccg ccaattcttc aacgctgacc tatgctactt taagttcttc acctttggac 3660
gcagctgcag ctgccgccgc cgcttctgtt gccgctaaca ctgtgcttgg aatgggttac 3720
tatggaagca tcatggctaa ttccacttcc tctaataacc cttctaccct gactcaggac 3780
aagttacttg tccttttggc ccagctggag gctttgaccc aacgtctggg tgaactttct 3840
cagcaggtgg tcgagttgcg agtacaaact gagtctgctg tcggcacggc aaagtctaaa 3900
taaaaaaatc ccagaatcaa tgaataaata aacaagcttg ttgttgattt aaaatcaagt 3960
gtttttattt catttttcgc gcacggtatg ccctagacca ccgatctcta tcattgagaa 4020
ctcggtggat tttttccagg atcctataga ggtgggattg aatgtttaga tacatgggca 4080
ttaggccgtc tttggggtgg agatagctcc attgaaggga ttcatgctcc ggggtagtgt 4140
tgtaaatcac ccagtcataa caaggtcgca gtgcatggtg ttgcacaata tcttttagaa 4200
gtaggctgat tgccacagat aagcccttgg tgtaggtgtt tacaaaccgg ttgagctggg 4260
atgggtgcat tcggggtgaa attatgtgca ttttggattg gatttttaag ttggcaatat 4320
tgccgccaag atcccgtctt gggttcatgt tatgaaggac caccaagacg gtgtatccgg 4380
tacatttagg aaatttatcg tgcagcttgg atggaaaagc gtggaaaaat ttggagacac 4440
ccttgtgtcc tccaagattt tccatgcact catccatgat aatagcaatg gggccgtggg 4500
cagcggcgcg ggcaaacacg ttccgtgggt ctgacacatc atagttatgt tcctgagtta 4560
aatcatcata agccatttta atgaatttgg ggcggagagt accagattgg ggtatgaatg 4620
ttccttcggg ccccggagca tagttcccct cacagatttg catttcccaa gctttcagtt 4680
ccgagggtgg aatcatgtcc acctgggggg ctatgaaaaa caccgtttct ggggcggggg 4740
tgattaattg tgatgatagc aaatttctga gcaattgaga tttgccacat ccggtggggc 4800
cataaatgat tccgattacg ggttgcaggt ggtagtttag ggaacggcaa ctgccgtctt 4860
ctcgaagcaa gggggccacc tcgttcatca tttcccttac atgcatattt tcccgcacca 4920
aatccattag gaggcgctct cctcctagtg atagaagttc ttgtagtgag gaaaagtttt 4980
tcagcggttt cagaccgtca gccatgggca ttttggagag agtttgctgc aaaagttcta 5040
gtctgttcca cagttcagtg atgtgttcta tggcatctcg atccagcaga cctcctcgtt 5100
tcgcgggttt ggacggctcc tggaataggg tatgagacga tgggcgtcca gcgctgccag 5160
ggttcggtcc ttccagggtc tcagtgttcg agtcagggtt gtttccgtca cagtgaaggg 5220
gtgtgcgcct gcttgggcgc ttgccagggt gcgcttcaga ctcatcctgc tggtcgaaaa 5280
cttctgtcgc ttggcgccct gtatgtcggc caagtagcag tttaccatga gttcgtagtt 5340
gagcgcctcg gctgcgtggc ctttggcgcg gagcttacct ttggaagttt tcttgcatac 5400
cgggcagtat aggcatttca gcgcatacaa cttgggcgca aggaaaacgg attctgggga 5460
gtatgcatct gcgccgcagg aggcgcaaac agtttcacat tccaccagcc aggttaaatc 5520
cggttcattg gggtcaaaaa caagttttcc gccatatttt ttgatgcgtt tcttaccttt 5580
ggtctccatg agttcgtgtc ctcgttgagt gacaaacagg ctgtccgtgt ccccgtagac 5640
tgattttaca ggcctcttct ccagtggagt gcctcggtct tcttcgtaca ggaactctga 5700
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tgggggggta taaaaggggg cggttctttg ctcttcctca ctgtcttccg gatcgctgtc 5940
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caggttgtca gtttctaaga acgaggagga tttgatattg acagtgccgg ttgagatgcc 6060
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atgtagtgta caaacctgga acagaagaca caagttccga agctaatttg ggacaacaat 19200
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aagccacagg gtctccagct cgaccctcgt aaaacctgtc atcatgatta aacaacagca 32820
ccgaaagttc ctcgcggtga ccagcatgaa taattcttga tgaagcatac aatccagaca 32880
tgttagcatc agttaacgag aaaaaacagc caacatagcc tttgggtata attatgctta 32940
atcgtaagta tagcaaagcc acccctcgcg gatacaaagt aaaaggcaca ggagaataaa 33000
aaatataatt atttctctgc tgctgttcag gcaacgtcgc ccccggtccc tctaaataca 33060
catacaaagc ctcatcagcc atggcttacc agacaaagta cagcgggcac acaaagcaca 33120
agctctaaag tgactctcca acctctccac aatatatata tacacaagcc ctaaactgac 33180
gtaatgggag taaagtgtaa aaaatcccgc caaacccaac acacaccccg aaactgcgtc 33240
accagggaaa agtacagttt cacttccgca atcccaacag gcgtaacttc ctctttctca 33300
cggtacgtga tatcccacta acttgcaacg tcattttccc acggtcgcac cgcccctttt 33360
agccgttaac cccacagcca atcaccacac gatccacact ttttaaaatc acctcattta 33420
catattggca ccattccatc tataaggtat attatataga taga 33464

Claims (18)

1.一种具有复制能力的B群溶瘤腺病毒，其包含式(I)的序列：
5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR
其中：
B1包含：E1A、E1B或E1A-E1B；
BA包含-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4；
B2是键或包含：E3；
BX是键或包含以下的DNA序列：限制性位点、一种或多种转基因或二者；
BB包含L5；
BY包含转基因盒，所述转基因盒包含转基因和剪接受体序列；并且
B3是键或包含：E4，
其中所述转基因盒处于内源启动子的控制下，所述内源启动子选自E4和主要晚期启动子，并且其中所述转基因盒包含编码选自下列的物质的治疗基因：RNAi序列、蛋白质、抗体或其结合片段、趋化因子、细胞因子、免疫调节剂和酶。
2.根据权利要求1所述的具有复制能力的腺病毒，其中所述启动子是主要晚期启动子。
3.根据权利要求1或2所述的具有复制能力的腺病毒，其中BY还包含SEQ ID NO:11所示的序列或在严格条件下与其杂交的DNA序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的具有复制能力的腺病毒，其中所述剪接受体选自CAGG、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的具有复制能力的腺病毒，其中所述转基因盒还包含内部核糖体进入序列或高自我剪切效率2A肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的具有复制能力的腺病毒，其中所述转基因还包含Kozak序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的腺病毒，其中所述转基因盒还包含多聚腺苷酸化序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的腺病毒，其中所述转基因盒还包含在所述DNA序列的3'端和/或在所述DNA序列的5'端的限制性位点。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的腺病毒，其中至少一个转基因盒编码单顺反子mRNA或多顺反子mRNA。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的腺病毒，其中所述抗体或其结合片段对OX40、OX40配体、CD27、CD28、CD30、CD40、CD40配体、CD70、CD137、GITR、4-1BB、ICOS、ICOS配体、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、VISTA、B7-H3、B7-H4、HVEM、ILT-2、ILT-3、ILT-4、TIM-3、LAG-3、BTLA、LIGHT、CD160、CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2具有特异性。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的腺病毒，其中被编码的蛋白质是独立地选自包含以下的群组的细胞因子：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-33、IL-35、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IL-25、IL-1RA、IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα、TGFβ、淋巴毒素α(LTA)和GM-CSF。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的腺病毒，其中被编码的蛋白质是独立地选自包含以下的群组的趋化因子：IL-8、CCL5、CCL17、CCL20、CCL22、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL12、CCL2、CCL19、CCL21、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CXCR3、CXCR4、CXCR5和CRTH2。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的腺病毒，其中所述转基因是报告基因，例如碘化钠同向转运蛋白、细胞内金属蛋白、HSV1-tk、GFP、荧光素酶或雌激素受体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的腺病毒，其中所述腺病毒是Ad11。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的腺病毒，其中所述腺病毒是SEQ ID NO:12所示的被称为EnAd的病毒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的腺病毒，其中所述病毒包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:73的序列。
17.一种组合物，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的腺病毒。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的腺病毒或根据权利要求17所述的组合物，用于治疗。
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