KR20180105709A - 중추 신경계의 암의 치료를 위한 조작된 t 세포의 투여 - Google Patents

중추 신경계의 암의 치료를 위한 조작된 t 세포의 투여 Download PDF

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Abstract

조작된 T 세포로 암을 치료하는 개선된 방법이 기재된다.
[대표도]
도 25I

Description

중추 신경계의 암의 치료를 위한 조작된 T 세포의 투여
조작된 T 세포 및 생체외 확장 또는 선택된 T 세포를 사용하는 요법을 포함한 종양-특이적 T 세포 기반 면역요법이 항종양 치료를 위해 조사되어 왔다. 일부 경우에, 이러한 요법에 사용되는 T 세포는 생체내에서 장시간의 충분한 기간 동안 활성으로 유지되지 않는다. 일부 경우에, T 세포의 종양-특이성은 비교적 낮다. 일부 경우에, 조작된 T 세포는 종양에 대한 접근이 불충분하다. 따라서, 관련 기술분야에는 보다 효과적인 항종양 기능을 갖는 종양-특이적 암 요법에 대한 필요가 존재한다.
중추 신경계의 암의 치료는 특히 도전과제일 수 있다. 예를 들어, 역형성 성상세포종 (AA-등급 III) 및 다형성 교모세포종 (GBM-등급 IV)을 포함한 고-등급 악성 신경교종 (MG)의 치료는 유의한 치료 도전과제로 남아 있다. 현재 이용가능한 치료 옵션은 치유 잠재력을 제한해왔고, 환자의 단지 5% 미만만이 초기 진단 후 5년을 초과하여 생존한다.
환자의 뇌 척수액 ("CSF")에 T 세포 (예를 들어, CAR T 세포, 종양 침윤 림프구 ("TIL"), TCR-조작된 T 세포, 또는 T 세포 클론)를 포함하는 조성물을 투여함으로써, 중추 신경계의 악성종양을 치료하는 방법이 본원에 기재된다. T 세포는 예를 들어, 목적하는 수용체를 발현하는 핵산 분자의 도입에 의해, 단리된 또는 유전자-변형된 T 세포의 생체외 확장에 의해 또는 환자 또는 공여자로부터 수득된 T 세포의 하위세트의 생체외 선택에 의해 또는 이들 기술 중 2종 이상의 조합에 의해 조작된 T 세포를 포함한다. CNS에의 투여는, 예를 들어, 뇌실계 또는 척주의 중심 공동에의 투여에 의해 달성될 수 있다. 본원에 사용된 용어 CNS에의 투여는 종양내 투여 (종양 그 자체 내로의 주사 또는 주입) 및 종양의 절제에 의해 생성된 공동에의 투여 둘 다와 구분된다. 그러나, 본원에 기재된 CNS 투여 방법은 종양내 및/또는 절제-후, 공동내 투여와 조합될 수 있다.
본원에 기재된 CNS 투여는 T 세포를 포함하는 조성물의 상대적으로 큰 부피의 주입, 예를 들어 단일 주입으로 1 ml - 2 ml 또는 그 초과의 주입을 가능하게 한다. 따라서, 수백만개의 T 세포가 단일 주입으로 투여될 수 있다.
따라서, 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF)을 함유하는 해부학적 구획 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 주입하는 것을 포함하는, 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자를 치료하는 방법이 개시된다. 방법은 예를 들어 뇌실계 또는 척수의 중심관의 부분으로 조성물을 주입하는 것을 포함한다. 개시된 방법의 한 실시양태에서, 중추 신경계의 악성종양은 원발성 종양 또는 뇌, 척주 부분 등을 포함한 중추 신경계의 다른 곳에서 발견되는 전이된 종양을 포함한다. 바람직하게는 해부학적 구획은 적어도 약 50, 100, 또는 150 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유한다.
본원에 기재된 방법으로 주입되는 조작된 T 세포는 종양 항원, 예를 들어 표면 단백질 및 세포내 단백질을 표적으로 한다. 치료되는 악성종양은 원발성 종양 또는 신체의 다른 곳에서 기원한 암으로부터 발생한 속발성 종양일 수 있다. 뇌 척수액에의 투여는 T 세포가 국부 주사 부위를 넘어선 영역으로 접근가능하게 하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 주사 부위로부터는 원격이지만 CNS 내인 종양을 공격하고 그의 크기를 감소시키는데 사용될 수 있다. TCR-조작된 T 세포는 TCRαβ 유전자를 T 세포 (예를 들어, 자가 T 세포) 내로 도입한 다음 T 세포를 생체외 확장하고; T 세포를 환자 내로 주입하는 것에 의해 제조된다. TCR-조작된 T 세포의 주입은 종양이 적절한 항원 및 HLA 제한 요소를 발현하는 환자에 대해 종양 반응성을 부여한다. TCR은 예를 들어 T 세포에 의해 인식되는 흑색종-연관 항원 1 (MART-1), 당단백질 (gp) 100, 암배아성 항원 (CEA), p53, 흑색종-연관 항원 (MAGE-A3, 및 뉴욕 식도 편평 세포 암종 항원 (NYESO)을 포함한 다양한 종양 항원 중 임의의 것에 대해 표적화될 수 있다.
중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 도입하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
다양한 실시양태에서: T 세포는 자가 또는 동종 T 세포이고; T 세포는 확장, 분획화 또는 재조합 핵산 분자에 의한 형질감염 중 1종 이상에 의해 생체외 조작되고; T 세포는 종양 세포 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 형질감염된 세포를 포함하고; 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체이고; 조성물은 뇌실내로 투여되고; 조성물은 척수의 중심관으로 투여되고; 투여는 좌 뇌실 또는 우 뇌실에 대한 것이고; 조성물은 적어도 1 x 106개 세포를 포함하고; T 세포를 포함하는 조성물은 적어도 2회 투여되고; 투여는 투여되는 T 세포의 총수에서 상이하고; 투여는 용량에서 증량되고; 투여는 용량에서 감량되고; T 세포는 CAR T 세포를 포함하고; T 세포는 자가 종양 침윤 림프구를 포함하고; T 세포는 TCR-조작된 T 세포를 포함하고; 악성종양은 미만성, 침윤 종양이고; 악성종양은 원발성 뇌 종양이고; 1개 이상의 종양 병소는 크기에서 적어도 25% 감소하고; 악성종양은 유방암, 폐암, 두경부암 및 흑색종으로부터 선택된 원발성 암에서 발생하고; 방법은 종양 절제 후에 수행되고; 방법은 T 세포를 포함하는 조성물의 종양내 투여를 추가로 포함하고; 악성종양은 속발성 뇌 종양이고; 방법은 교모세포종 세포의 표면 상에 발현된 단백질에 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 치료 T 세포를 포함하는 조성물의 종양내 투여를 추가로 포함하고; 환자는 이전에 종양 병변의 절제를 거쳤고; 종양 항원은 IL13Rα2, HER2, PSCA, EGFR, EGFRvIII, EphA2, NY-ESO-1, 및 CD19로 이루어진 군으로부터 선택되고; T 세포는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포 둘 다를 포함하고; T 세포는 생체외 확장을 거쳤고; T 세포는 적어도 10% TCM 세포를 포함하고; 주입된 세포 중 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 초과는 CD4+이고; 주입된 세포 중 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 초과는 종양 항원 (예를 들어, IL13Rα2)을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하고; 세포의 용량은 종양 항원 (예를 들어, IL13Rα2)을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 주입된 세포의 수를 기초로 한다.
일부 실시양태에서 T 세포는 IL13Rα2를 표적화하는 CAR T 세포를 포함하고, 세포는 인간 IL-13 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 적어도 1개의 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서: 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되고; 인간 IL13의 변이체는 IL13Rα1 대비 IL13Rα2에 대한 결합 특이성을 증가시키는 1-10개의 아미노산 변형을 갖고; 인간 IL-13 또는 그의 변이체는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는 서열식별번호(SEQ ID NO): 3의 아미노산 서열을 포함하되, 서열식별번호: 3의 위치 11에서의 아미노산이 E 이외의 것인 IL-13 변이체이고; 키메라 항원 수용체는 CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 인간 IL-13 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하고; CAR은 IL-13 또는 그의 변이체 및 막횡단 도메인 사이에 위치한 스페이서 영역을 포함하고; 스페이서 영역은 서열식별번호: 4, 14-20, 50 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 10 및 31-48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 T 세포는 HER2에 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하고, HER2 표적화 서열; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3s 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3s 신호전달 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서: HER2 표적화 도메인은 HER2 scFv; 아미노산 서열:
Figure pct00001
를 포함하는 HER2 scFv 또는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체이고; 키메라 항원 수용체는 HER2 표적화 서열; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3s 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하고; 핵산 분자는 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 발현한다.
또한 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF)을 함유하는 해부학적 구획 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 주입하는 것을 포함하는, 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 다양한 실시양태에서: 해부학적 구획은 뇌실계의 부분을 포함하고; 해부학적 구획은 척수의 중심관의 부분을 포함하고; 중추 신경계의 악성종양은 뇌 종양을 포함하고; 중추 신경계의 악성종양은 전이된 종양을 포함하고; 해부학적 구획은 적어도 약 50 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유하고; 해부학적 구획은 적어도 약 100 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유하고; 해부학적 구획은 적어도 약 150 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유한다.
그 중 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 원발성 CNS 악성종양, 및 다른 곳에 위치한 암에서 발생한 속발성 악성종양, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추 신경계, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 중추 신경계암, 자궁경부암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 배아성 종양, 중추 신경계, 자궁내막암, 상의모세포종, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 종양의 유잉 육종 패밀리, 두개외 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 간외 담관암, 안암, 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종, 담낭암, 위 (위의)암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST) - 연부 조직 육종, 배세포 종양, 임신성 영양막 종양, 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간)암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 도세포 종양 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 구순암 및 구강암, 간암 (원발성), 소엽성 상피내 암종 (LCIS), 폐암, 림프종, 마크로글로불린혈증, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠재성 원발성인 전이성 편평 경부암, NUT 유전자 수반 정중선 관 암종, 입암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 골수 백혈병, 만성 (CML), 골수성 백혈병, 급성 (AML), 골수종, 다발성, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구암, 구강암, 구인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방암, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 (신장)암, 신우 및 요관, 이행 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 세자리 증후군, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위의 (위)암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, T-세포 림프종, 피부, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 영양막 종양, 요관 및 신우암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 윌름스 종양이다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법에 따라 치료되는 악성종양은 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료는 종양 부피의 적어도 50% 감소, 종양 부피의 적어도 60% 감소, 종양 부피의 적어도 70% 감소, 종양 부피의 적어도 80% 감소, 또는 종양 부피의 적어도 90% 감소를 발생시킨다. 그리고 일부 실시양태에서, 치료는 악성종양의 제거를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, 환자는 임의의 등급 3 이상의 독성을 경험하지 않는다.
일부 실시양태에서, 환자는 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물에 의한 치료 전 스테로이드 요법을 투여받았고, 일부 실시양태에서 스테로이드 요법은 치료 후에 더 낮은 용량으로 감소된다.
일부 실시양태에서, 환자는 방사선 요법, 소분자 약물 요법, 항체 치료제 또는 그의 조합을 포함한 표준 관리 치료를 받은 환자와 비교하여 증가된 기대 수명을 갖는다. 그리고 일부 실시양태에서, 표준 관리 ("SOC") 치료를 받은 환자는 초기 진단으로부터 약 15개월 생존할 것 (전체 생존 또는 OS)으로 예상할 수 있고, 개시된 치료를 받은 환자는 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상의 OS를 예상할 수 있다. 일부 실시양태에서, 청구된 치료를 받은 환자는 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90개월 이상의 OS를 예상할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 종양 항원을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 적어도 2 x 106개 T 세포 또는 2 x 106개 T 세포를 포함하는 한편, 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 항원을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 적어도 1 x 106개 T 세포 또는 1 x 106개 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 항원을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 적어도 5 x 106개 T 세포 또는 5 x 106개 T 세포를 포함하는 한편, 일부 실시양태에서, 조성물은 종양 항원을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 적어도 10 x 106개 T 세포 또는 10 x 106개 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 조성물의 반복 투여, 예를 들어 조성물의 적어도 5회의 반복 투여, 조성물의 적어도 10회의 반복 투여, 또는 환자가 종양 항원을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 적어도 90 x 106개 T 세포 또는 T 세포의 총 용량을 제공받을 때까지의 반복 투여를 포함하였다. 일부 실시양태에서, 투여는 1주 1회 또는 2주마다 1회 반복된다. 일부 실시양태에서, 반복 투여는 15주의 기간에 걸쳐 계속된다.
또한 중추 신경계의 악성종양을 갖는 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준을 증가시키는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준은 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물의 투여 후에 투여 전의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 기준선 수준과 비교하여 증가된다.
개시된 방법의 일부 실시양태에서, 투여 후의 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준은 기준선 수준과 비교하여 10-배 또는 5-배 증가된다.
일부 실시양태에서, 적어도 5종 또는 적어도 10종의 시토카인 또는 케모카인의 수준은 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물의 투여 후에 투여 전의 적어도 5종의 시토카인 또는 케모카인의 기준선 수준과 비교하여 증가된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인은 EGF, 에오탁신, FGF, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-α, IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Rα, IL-1β, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNF-α, 또는 VEGF를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 또는 케모카인 발현에서의 증가는 국부 증가이다 (즉, CSF에 특이적).
또한 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 주입하는 것을 포함하는, 기준선 개수와 비교하여, 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 CSF에서 관찰되는 T 세포의 증가된 개수를 적어도 약 5일 동안 지속시키는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 주입 단계 전에 관찰되는 기준선 개수와 비교하여 관찰되는 T 세포의 증가된 개수는 적어도 약 5일 동안 지속된다.
일부 실시양태에서, 유효량의 T 세포 (또는 종양 항원을 표적화하는 세포 표면 수용체를 발현하는 T 세포)는 약 1 x 106개 세포 내지 약 100 x 106개 세포의 범위이고, 일부 실시양태에서, 유효량의 T 세포는 약 2 x 106개 세포 내지 약 50 x 106개 세포의 범위이다.
일부 실시양태에서, 관찰되는 T 세포의 증가된 개수는 적어도 약 6일 동안 지속되거나, 또는 관찰되는 T 세포의 개수는 약 7일 동안 기준선 개수로 되돌아가지 않는다.
일부 실시양태에서, 관찰되는 T 세포는 주입된 T 세포 (예를 들어 CAR-발현 T 세포)를 포함하고, 일부 실시양태에서, 관찰되는 T 세포는 내인성 T 세포를 포함한다.
또한 중추 신경계의 악성종양을 갖는 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CSF 내의 T 세포의 개수를 증가시키는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 CSF에서 검출가능한 T 세포의 개수는 투여-전 수준과 비교하여 증가된다.
일부 실시양태에서, CSF에서 검출가능한 T 세포의 개수는 투여-전 수준과 비교하여 투여 후 최대 7일 동안 증가된다. 일부 실시양태에서, CSF에서 검출가능한 T 세포는 내인성 T 세포 및 CAR-발현 T 세포, 및/또는 유형 1 T 세포, 및/또는 유형 2 T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, CSF에서 검출가능한 T 세포는 CD3+ T 세포를 포함하고, 일부 실시양태에서, CSF에서 검출가능한 T 세포는 CD14+ CD11b+ HLA-DR+ 성숙 골수 집단을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD19+ B 세포 및 CD11b+ CD15+ 과립구는 조성물의 투여 후 CSF에서 검출가능하다.
일부 실시양태에서, 반응성 림프구, 단핵구, 및 대식세포는 조성물의 투여 후 CSF에서 검출가능하다.
또한 악성종양을 갖는 환자로부터의 샘플에 기인한 점수가 사전결정된 역치를 초과하는 IL-13Rα2 발현을 나타내는지 결정하는 것을 포함하는, 환자의 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포에 의한 치료에 대한 적합성을 결정하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 샘플에 기인한 점수는 IL-13Rα2의 마커에 의한 샘플의 면역조직화학적 염색에 의해 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자로부터의 절제된 종양 샘플의 면역반응성을 결정하고, 염색의 강도를 분석하고, 염색의 강도에 기초하여 점수를 계산함으로써 계산되며, 여기서 샘플에서 중 내지 강 염색 세기에 상응하는 점수는 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포에 의한 치료가 환자에게 적합하다는 것을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 점수는 약, 중, 또는 강 염색 세기를 갖는 세포의 개수를 카운팅하고 각각의 세기에 가중치를 할당하는 것을 포함한다 (면역조직화학적 결과를 정량화하는 방법인 H 점수는 하기 식: (3 x 강하게 염색된 세포의 백분율) + (2 x 중간 정도로 염색된 세포의 백분율) + (1 x 약하게 염색된 세포의 백분율)에 기초하며, 결과는 0 내지 300 범위임). 일부 경우에, 환자는 관련 종양-연관 항원에 대해 50 초과, 50-100, 100 초과, 100-200, 200 초과, 100-300, 또는 250 초과인 H 점수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플에서의 Ki67의 발현은 또한 면역조직화학적 염색에 의해 결정된다.
또한 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자에게 유효 용량의 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 악성종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 환자는 사전결정된 역치를 초과하는 IL-13Rα2를 발현한다.
일부 실시양태에서, IL-13Rα2 발현의 사전결정된 역치는 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포 요법을 포함하는 치료에 적합한 것으로 이전에 확인되었다.
TIL은 환자 또는 공여자로부터 단리될 수 있고, 생체외 확장될 수 있고, 그를 필요로 하는 환자 내로 재-주입될 수 있는 종양 침윤 림프구이다.
CAR T 세포는 세포외 도메인, 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 T 세포 수용체를 발현한다. 세포외 도메인은 표적화된 세포에 결합하는 부분 및, 임의로 예를 들어 인간 Fc 도메인의 부분을 포함하는 스페이서를 포함한다. 막횡단 부분은 적합한 막횡단 도메인, 예를 들어, CD4 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD3 막횡단 도메인 또는 4IBB 막횡단 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄 (CD3ζ)로부터의 신호전달 도메인 및 1개 이상의 공동자극 도메인, 예를 들어, 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 세포외 도메인의 표적 세포 결합 부분 (예를 들어 scFv 또는 리간드)은 CAR이, T 세포의 표면 상에 발현된 경우에, T 세포 활성을 표적화된 세포 표면 분자, 예를 들어 악성 신경교종 세포를 포함한 종양 세포의 표면 상에 발현되는 수용체인 HER2 또는 IL13Rα2를 발현하는 세포로 향하도록 할 수 있다.
다양한 상이한 T 세포, 예를 들어, 환자-특이적, 자가 T 세포는 TCR 또는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있다. 다양한 T 세포 하위세트가 사용될 수 있다. 또한, CAR은 다른 면역 세포, 예컨대 NK 세포에서 발현될 수 있다. 환자가 CAR 또는 TCR을 발현하는 면역 세포에 의해 치료되는 경우에, 세포는 자가 또는 동종 T 세포일 수 있다. 일부 경우에, 사용되는 세포는 CD45RO+CD62L+인, CD4+ 및 CD8+ 중심 기억 T 세포 (TCM)이고, 이러한 세포의 사용은 다른 유형의 환자-특이적 T 세포의 사용과 비교하여 입양 전달 후 세포의 장기 지속성을 개선시킬 수 있다. TCM 세포는 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포를 포함할 수 있다.
그 중 본원에 기재된 방법에 유용한 CAR은 IL13Rα2를 표적화하는 것이다. 이러한 CAR은 결합 특이성을 증가시키는 아미노산 변형, 예컨대 E13Y 돌연변이를 갖는 IL13을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 분자를 함유할 수 있고, 여기서 키메라 항원 수용체는 인간 IL-13 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
세포내 영역에서 CD3ζ와 연속하여 공동자극 도메인, 예컨대 4-1BB (CD137) 또는 CD28 공동자극 도메인을 포함하는 것은 T 세포가 공동자극 신호를 수신하게 할 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체가 존재한다.
방법의 추가의 실시양태에서, T 세포에 의해 발현되는 CAR은 IL13Rα1 대비 IL13Rα2에 대한 결합 특이성을 증가시키는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 인간 IL13의 변이체를 포함하고; 인간 IL-13 또는 그의 변이체는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하되, 서열식별번호: 3의 위치 11에서의 아미노산이 E 이외의 것인 IL-13 변이체이고; 또한, CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 상이한 공동자극 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 상이한 공동자극 도메인; 인간 IL-13 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; IL-13 또는 그의 변이체 및 막횡단 도메인 사이에 위치한 스페이서 영역 (예를 들어, 스페이서 영역은 서열식별번호: 4, 14-20, 50 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함)을 포함하고; 스페이서는 IgG 힌지 영역을 포함하고; 스페이서 영역은 10-150개의 아미노산을 포함하고; 4-1BB 신호전달 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하고; CD3ζ 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고; 또한, 공동자극 도메인 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 그의 변이체 사이에 위치한 3 내지 15개의 아미노산의 링커를 포함한다. 특정 실시양태에서 2개의 공동자극 도메인이 존재하는 경우에, 하나는 4-IBB 공동자극 도메인이고, 다른 것은 CD28 및 CD28gg로부터 선택된 공동자극 도메인이다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서 T 세포는 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 분자를 보유하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 11의 아미노산을 포함하는 IL-13/IgG4/CD4t/41-BB 영역 및 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 10 및 31-48의 아미노산 서열을 포함한다.
또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단의 뇌실내 투여를 포함하는 방법이 개시되며, 여기서 키메라 항원 수용체는 인간 IL-13 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 다양한 실시양태에서 인간 T 세포의 집단은 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터를 포함하고; 인간 T 세포의 집단은 중심 기억 T 세포 (TCM 세포)를 포함한다 (예를 들어, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%는 TCM 세포이고; T 세포 또는 TCM 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%는 CD4+이고, T 세포 또는 TCM 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 35%는 CD8+ 세포임).
또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 자가 또는 동종 인간 T 세포 (예를 들어, TCM 세포를 포함하는 자가 또는 동종 T 세포, 예를 들어, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%는 TCM 세포이고; TCM 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%는 CD4+이고, TCM 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%는 CD8+ 세포임)의 집단의 CNS 투여를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이 기재되며, 여기서 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서 인간 T 세포의 집단은 중심 기억 T 세포를 포함하고; 암은 교모세포종이고; 형질도입된 인간 T 세포는 환자로부터 T 세포를 수득하는 단계, T 세포를 처리하여 중심 기억 T 세포를 단리하는 단계, 및 중심 기억 세포의 적어도 일부를 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또한 환자에게 투여되는 T 세포가 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 5개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 존재하는 것을 제외하고 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 5개 이하의 아미노산 치환이 존재하는 것을 제외하고 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 2개 이하의 아미노산 치환이 존재하는 것을 제외하고 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 10 및 31-48로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 보유하는 것인 방법이 기재된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 분자를 보유하는 T 세포의 CSF 투여에 의해 환자를 치료하는 방법이 본원에 기재되며, 여기서 키메라 항원 수용체는 HER2에 대해 표적화된 scFv (예를 들어, 아미노산 서열
Figure pct00002
를 포함함) 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; 스페이서 영역; CD4 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
다양한 실시양태에서 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체가 존재한다.
추가의 실시양태에서 환자에게 투여되는 T 세포는 HER2에 대해 표적화된 scFv (예를 들어, 인간화 scFv); CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인; 인간 IL-13 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3ζ 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; IL-13 또는 그의 변이체 및 막횡단 도메인 사이에 위치한 스페이서 영역 (예를 들어, 스페이서 영역은 서열식별번호: 4, 14-20, 50 및 52로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함); (스페이서는 IgG 힌지 영역을 포함하고; 스페이서 영역은 10-150개의 아미노산을 포함하고; 4-1BB 신호전달 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하고; CD3ζ 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함함); 및 공동자극 도메인 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 그의 변이체 사이에 위치한 3 내지 15개의 아미노산의 링커를 포함하는 CAR을 발현한다. 특정 실시양태에서 2개의 공동자극 도메인이 존재하는 경우에, 하나는 4-IBB 공동자극 도메인이고, 다른 것은 CD28 및 CD28gg로부터 선택된 공동자극 도메인이다.
일부 실시양태에서 환자에게 투여되는 T 세포는 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 분자를 보유한다.
또한 HER2에 대해 표적화된 scFv; CD4 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단의 뇌실내 투여를 포함하는 방법이 개시된다. 다양한 실시양태에서 인간 T 세포의 집단은 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터를 포함하고; 인간 T 세포의 집단은 중심 기억 T 세포 (TCM 세포)를 포함한다 (예를 들어, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%는 TCM 세포이고; T 세포 또는 TCM 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%는 CD4+이고/거나 T 세포 또는 TCM 세포의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%는 CD8+ 세포임).
또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 자가 또는 동종 인간 T 세포 (예를 들어, TCM 세포를 포함하는 자가 또는 동종 T 세포, 예를 들어, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%는 TCM 세포이고; TCM 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%는 CD4+이고/거나, TCM 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%는 CD8+ 세포임)의 집단의 뇌실내 투여를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이 기재되며, 여기서 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 실시양태에서 인간 T 세포의 집단은 중심 기억 T 세포를 포함하고; 암은 교모세포종이고; 형질도입된 인간 T 세포는 환자로부터 T 세포를 수득하는 단계, T 세포를 처리하여 중심 기억 T 세포를 단리하는 단계, 및 중심 기억 세포의 적어도 일부를 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또한 자가 또는 동종 인간 T 세포 (예를 들어, 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 5개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 존재하는 것을 제외하고 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 5개 이하의 아미노산 치환이 존재하는 것을 제외하고 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 2개 이하의 아미노산 치환이 존재하는 것을 제외하고 서열식별번호: 53-56으로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 보유하는 TCM 세포를 포함하는 자가 또는 동종 T 세포)의 집단의 뇌실내 투여를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이 기재된다.
본원에 기재된 특정 CAR, 예를 들어, IL13(EQ)BBζ CAR 및 IL13(EQ)CD28- BBζ CAR은 특정의 다른 IL13-표적화된 CAR과 비교하여 특정의 유익한 특징을 갖는다. 예를 들어, 이는 IL13Rα에 대해 개선된 선택성을 갖고, 더 낮은 Th2 시토카인 생산, 특히 더 낮은 IL13 생산을 도출한다.
IL13Rα2를 표적화하는 CAR을 발현하는 T 세포는 암 예컨대 교모세포종, 뿐만 아니라 IL13Rα2를 발현하는 다른 암을 치료하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 암을 치료하는 방법을 포함한다.
HER2를 표적화하는 CAR을 발현하는 T 세포는 암 예컨대 교모세포종, 뿐만 아니라 HER2를 발현하는 다른 암, 예를 들어 중추 신경계로 확산된 유방암을 치료하는데 유용할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 암을 치료하는 방법을 포함한다.
본원에 기재된 CAR은 표적화 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치한 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 다양한 상이한 스페이서가 사용될 수 있다. 그 중 일부는 인간 Fc 영역의 적어도 일부, 예를 들어, 인간 Fc 영역의 힌지 일부 또는 CH3 도메인 또는 그의 변이체를 포함한다. 하기 표 1은 본원에 기재된 CAR에 사용될 수 있는 다양한 스페이서를 제공한다.
표 1: 스페이서의 예
Figure pct00003
일부 스페이서 영역은 이뮤노글로불린 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 힌지 영역의 모두 또는 일부, 즉, 이뮤노글로불린의 CH1과 CH2 도메인 사이에 속하는 서열, 예를 들어, IgG4 Fc 힌지 또는 CD8 힌지를 포함한다. 일부 스페이서 영역은 이뮤노글로불린 CH3 도메인, 또는 CH3 도메인 및 CH2 도메인 둘 다를 포함한다. 이뮤노글로불린 유래 서열은 1개 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 예를 들어, 오프-타겟 결합을 감소시키는 치환을 포함할 수 있다.
"아미노산 변형"은 단백질 또는 펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 지칭한다. "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 펩티드 또는 단백질 서열 내의 특정한 위치에 있는 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 대체를 지칭한다. 치환은 생성된 단백질 내의 아미노산을 비-보존적 방식으로 (즉, 특정한 크기 또는 특징을 갖는 아미노산 군에 속하는 아미노산으로부터 또 다른 군에 속하는 아미노산으로 코돈을 변화시킴으로써), 또는 보존적 방식으로 (즉, 특정한 크기 또는 특징을 갖는 아미노산 군에 속하는 아미노산으로부터 동일한 군에 속하는 아미노산으로 코돈을 변화시킴으로써) 변화시킬 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로, 생성된 단백질의 구조 및 기능을 덜 변화시킨다. 하기는 아미노산의 다양한 군의 예이다: 1) 비극성 R 기를 갖는 아미노산: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌; 2) 비하전된 극성 R 기를 갖는 아미노산: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민; 3) 하전된 극성 R 기를 갖는 아미노산 (pH 6.0에서 음으로 하전된 것): 아스파르트산, 글루탐산; 4) 염기성 아미노산 (pH 6.0에서 양으로 하전된 것): 리신, 아르기닌, 히스티딘 (pH 6.0). 또 다른 군은 페닐 기를 갖는 아미노산: 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 CAR에 다양한 막횡단 도메인이 사용될 수 있다. 표 2는 적합한 막횡단 도메인의 예를 포함한다. 스페이서 영역이 존재하는 경우에, 막횡단 도메인은 스페이서 영역의 카르복시 말단에 위치한다.
표 2: 막횡단 도메인의 예
Figure pct00004
본원에 기재된 방법에 사용되는 세포에 의해 발현되는 많은 CAR은 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 공동자극 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인(들)은 막횡단 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인 사이에 위치한다. 표 3은 CD3ζ 신호전달 도메인의 서열과 함께 적합한 공동자극 도메인의 예를 포함한다.
표 3: 공동자극 도메인의 예
Figure pct00005
도 1은 제시된 바와 같이 IL13Rα2-특이적 인간 IL-13 변이체 (huIL-13(E13Y)), 인간 IgG4 Fc 스페이서 (huγ4Fc), 인간 CD4 막횡단 (huCD4 tm), 및 인간 CD3ζ 쇄 세포질 (huCD3ζ cyt) 부분으로 구성된 IL13(E13Y)-제타카인 CAR (좌측)의 개략적 도시이다. 또한, IgG4 스페이서의 CH2 도메인에 위치한 적색으로 표시된 2개의 점 돌연변이, L235E 및 N297Q, 및 공동자극 4-1BB 세포질 도메인 (4-1BB cyt)의 부가를 제외하고 IL13(E13Y)-제타카인과 동일한 IL13(EQ)BBζ CAR이 도시된다.
도 2A-C는 특정 벡터 및 오픈 리딩 프레임을 도시한다. A는 2670개의 뉴클레오티드 IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t 구축물의 cDNA 오픈 리딩 프레임의 다이어그램으로, 여기서 IL13(EQ)BBZ CAR의 IL13Rα2-특이적 리간드 IL13(E13Y), IgG4(EQ) Fc 힌지, CD4 막횡단, 4-1BB 세포질 신호전달, 3개의-글리신 링커, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인, 뿐만 아니라 T2A 리보솜 스킵 및 말단절단된 CD19 서열이 표시된다. IL13(EQ)BBζ CAR 및 CD19t의 표면 발현을 구동시키는 인간 GM-CSF 수용체 알파 및 CD19 신호 서열이 또한 표시된다. B는 숙주 게놈 내로 통합될 긴 말단 반복부 ('R'에 의해 표시됨)에 플랭킹된 서열의 다이어그램이다. C는 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 플라스미드의 지도이다.
도 3은 pHIV7의 구축을 도시한다.
도 4는 pHIV7의 요소를 도시한다.
도 5는 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM에 대한 생산 계획을 도시한다.
도 6A-C는 표면 트랜스진 및 T 세포 마커 발현의 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한다. IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 항-IL13-PE 및 항-CD8-FITC로 공동-염색하여 CD8+ CAR+ 및 CD4+ (즉, CD8 음성) CAR+ 세포를 검출하거나 (A), 또는 항-CD19-PE 및 항-CD4-FITC로 공동-염색하여 CD4+ CD19t+ 및 CD8+ (즉, CD4 음성) CAR+ 세포를 검출하였다 (B). 형광색소 접합된 항-CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L 및 CD28 (회색 히스토그램) 또는 이소형 대조군 (흑색 히스토그램)으로 염색된 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1 (C). 모든 경우에 백분율은 이소형을 초과하여 염색된 생존 림프구 (DAPI 음성)에 기초한다.
도 7A-D는 확립된 대형 종양에 대해 CAR+ T 세포 전달 경로 (i.c. 대 i.v.)를 비교한 실험 결과를 도시한다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TS (1 x 105개)를 NSG 마우스의 우 전뇌에 이식하였다. 제19일 및 제26일에, 마우스에 꼬리 정맥을 통해 5 x 106개 CAR+ IL13(EQ)BBζ+ TCM (11.8 x 106개 총 세포; n = 4), 또는 모의 TCM (11.8 x 106개 세포; n = 4)을 i.v. 주사하였다. 대안적으로, 제19일, 제22일, 제26일 및 제29일에 마우스에 1 x 106개 CAR+ IL13(EQ)BBζ+ TCM (2.4 x 106개 총 세포; n = 4), 또는 모의 TCM (2.4 x 106개 세포; n = 5)을 i.c. 주사하였다. 시간의 경과에 따른 평균 ffLuc 유동 (광자/초)은 i.c. 전달된 IL13(EQ)BBζ TCM이 제19일 종양의 종양 퇴행을 매개한다는 것을 보여준다. 비교하면, i.v. 전달된 T 세포는 비치료 또는 모의 TCM 대조군과 비교하여 종양 부담에서 감소를 나타내지 않는다 (A). 카플란 마이어 생존 곡선은 i.v. 투여된 CAR+ TCM으로 치료된 마우스와 비교하여 i.c. IL13(EQ)BBZ TCM으로 치료된 마우스의 개선된 생존을 입증한다 (p = 0.0003 로그 순위 검정) (B). IL13(EQ)BBZ+ TCM으로 i.v. (C) 대 i.c. (D) 치료된 마우스의 대표적인 H&E 및 CD3 IHC. CD3+ T 세포는 오직 i.c. 치료된 그룹에서만 검출되었고, i.v. 치료된 마우스의 경우 종양 또는 주위 뇌 실질에서 어떠한 CD3+ 세포도 검출되지 않았다.
도 8A-B는 종양내 (i.c.t.) 또는 뇌실내 (i.c.v.)로 두개내로 주사된 CAR+ T 세포가 반대쪽 반구의 종양으로 이동할 수 있다는 것을 보여주는 연구 결과를 도시한다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TS (1 x 105개)를 NSG 마우스의 우 및 좌 전뇌 내로 정위 이식하였다. 제6일에, 마우스에 우 종양 부위에 1.0 x 106개 IL13(EQ)BBζ+ TCM (1.6 x 106개 총 세포; 63% CAR; n = 4)을 i.c. 주사하였다. 다초점성 신경교종 실험 모델의 개략도 (A). 우 및 좌 종양 부위 둘 다에의 T 세포 침윤을 보여주는 CD3 IHC (B).
도 9는 IL13(EQ)BBζ/CD19t+의 아미노산 서열 (서열식별번호: 10)을 도시한다.
도 10은 IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (서열식별번호: 12) 및 CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (서열식별번호: 13)의 서열 비교를 도시한다.
도 11은 IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm2-41BB 제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 31, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 39, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 12는 IL13(EmY)-CD8h3-CD28tm-CD28gg-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 32, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 40, GMSCFRa 신호 펩티드 부재).
도 13은 IL13(EmY)-IgG4(HL-CH3)-CD4tm-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 33, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 41, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 14는 IL13(EmY)-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 34, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 42, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 15는 IL13(EmY)-링커-CD28tm-CD28gg-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 35, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 43, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 16은 IL13(EmY)-HL-CD28m-CD28gg-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 36, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 44, GMSCFRa 신호 펩티드 부재).
도 17은 IL13(EmY)-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 37, GMSCFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 45, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 18은 IL13(EmY) IgG4(L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-41BB-제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 38, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 46, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 19는 IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm-41BB 제타의 아미노산 서열을 도시한다 (서열식별번호: 47, GMCSFRa 신호 펩티드 존재; 서열식별번호: 48, GMCSFRa 신호 펩티드 부재).
도 20은 Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-CD19t의 아미노산 서열을 도시한다. 다양한 도메인이 서열 아래에 순서대로 열거되고, 밑줄표시 및 비-밑줄표시로 교대로 표시된다. 성숙 CAR 서열 (서열식별번호: 26)은 GMCSFRa 신호 펩티드, T2A 스킵 서열 또는 말단절단된 CD19를 포함하지 않는다.
도 21은 Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-제타-T2A-CD19t의 아미노산 서열을 도시한다. 다양한 도메인이 서열 아래에 순서대로 열거되고, 밑줄표시 및 비-밑줄표시로 교대로 표시된다. 성숙 CAR 서열 (서열식별번호: 27)은 GMCSFRa 신호 펩티드, T2A 스킵 서열 또는 말단절단된 CD19를 포함하지 않는다.
도 22A-D는 HER2-특이적 CAR 구축물 및 CAR T 세포 확장 데이터를 도시한다.
도 23A-D는 유방암 세포주에 대한 HER2-CAR T 세포의 시험관내 특징화를 도시한다.
도 24A-F는 HER2-CAR T 세포의 시험관내 종양 활성에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 25A-I는 국부 종양내로-전달된 HER2-CAR T 세포의 생체내 항종양 효능에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 26A-D는 인간 동소 BBM 이종이식편 모델에서의 HER2-CAR T 세포의 국부 전달에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 27A-D는 HER2-CAR T 세포의 뇌실내 전달에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 28은 교모세포종의 뮤린 모델에서의 IL13α2R을 표적화하는 CAR T 세포의 종양내 및 뇌실내 주사 연구에 대한, 종양 세포 주사 및 CAR T 세포 주사 위치를 개략적으로 도시한다.
도 29A-C는 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM의 투여 후 확립된 신경교종 종양 이종이식편의 퇴행을 입증하는 연구 결과를 도시한다. ffLuc+ PBT030-2 종양 세포 (1 x 105개)를 NSG 마우스의 우 및 좌 전뇌 내로 정위 이식하였다. 제6일에, 상기 도 4.1에 기재된 바와 같이 마우스에게 1 x 106개 IL13(EQ)BBζ+ Tcm (1.6 x 106개 총 세포; 63% CAR+)을 ict 또는 icv 주사하였다. A, 제노겐 리빙 영상화를 사용하여 상대적인 종양 부담을 보여주는, 각각의 그룹으로부터의 대표적인 마우스. B, 각각의 그룹의 마우스 (n = 4-5)로부터의 좌 및 우뇌 반구 (관심 영역, ROI)의 평균 제노겐 유동, 여기서 각각의 연속 막대는 각각 제5일, 제9일, 제12일, 제15일, 및 제19일을 나타낸다. *, 독립표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 각각의 ROI 및 일/비치료 PBT030-2 그룹의 막대를 비교하는 경우 p < 0.05. C, T 세포 주사 13일 후 전체 뇌의 평균 제노겐 유동. *, 독립표본 스튜던트 t-검정을 사용하여 icv 그룹을 비치료 PBT030-2 그룹과 비교하는 경우 p = 0.0407. 이들 데이터는 3회의 개별 다초점성 GBM 실험을 대표한다.
도 30은 huCD3+ 세포가 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM의 ict 및 icv 투여 후에 우 및 좌뇌 종양/반구에서 검출된다는 것을 입증하는 연구 결과를 도시한다. ffLuc+ PBT030-2 종양 세포 (1 x 105개)를 NSG 마우스의 우 및 좌 전뇌 내로 정위 이식하였다. 제6일에, 마우스에게 1 x 106개 IL13(EQ)BBζ+ Tcm (1.6 x 106개 총 세포; 63% CAR+)을 ict (좌 영상) 또는 icv (우 영상) 주사하였다. T 세포 투여 1주 후 (상부 영상) 및 2주 후 (하부 영상), 각각의 그룹으로부터 2-3마리의 마우스를 안락사시키고, 뇌를 수거하여, 파라핀 포매하고, 항-인간 CD3 항체를 사용하여 IHC를 수행하여 T 세포를 검출하였다. 각각의 그룹의 마우스로부터의 좌 및 우 종양 부위의 대표적인 IHC 영상 (ict: m406 및 m410; icv: m414 및 m415)을 도시한다. 인레이는 안락사일 및 뇌수거일의 마우스의 제노겐 유동 영상을 도시한다.
도 31은 교모세포종의 치료를 위한 CAR T 세포의 임상 시험을 위한 CAR T 세포 제조 및 치료의 시간 경과를 개략적으로 도시하고 (A) 여러 투여 계획을 제공한다 (B).
도 32는 CD19에 의해 모니터링된 바와 같은 CAR T 세포 지속성의 분석 (A) 및 IL13Rα2 발현에 의해 모니터링된 바와 같은 GBM 세포의 존재 (B)를 나타낸다.
도 33은 종양내 투여에 사용된 카테터 영역에서의 환자 UPN097로부터의 영상화 결과를 나타낸다.
도 34는 1인의 환자에 대한 치료 과정 동안 다양한 시토카인의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 35A-C는 IL13Rα2-표적화 CAR T 세포의 뇌실내 전달 후 척추 전이를 포함한 재발성 다초점성 교모세포종의 퇴거를 도시한 영상이다. 척추 내 1개의 전위 부위를 포함한 재발성 다초점성 GBM 및 광범위한 연수막 질환을 나타내는 환자를 가장 큰 재발성 종양 병소의 절제 공동 내로의 IL13BBζ Tcm의 6회 국부 주입에 의해 치료하였다 (2 M 1 사이클, 및 10M CAR+ T 세포 5 사이클). CAR T 세포 주사 부위는 7-주를 초과하는 동안 질환 재발의 증거 없이 안정하게 유지되었지만, CAR T 세포 주사 부위에서 떨어진 다른 질환 병소는 계속 진행되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이어서 이러한 환자에게 IL13BBζ Tcm을 5회 매주 뇌실내 (icv) 주입으로 제공하였다 (2 M 1 사이클, 및 10M CAR+ T 세포 4 사이클). i.c.v. 요법 전 (좌) 및 i.c.v. 요법 완료 1주 후 (우)의 (A) 횡축 뇌 절편, (B) 시상면 뇌절편, 및 (C) 척추의 횡축 (상부) 및 정면 (하부) 절편의 MRI 및/또는 PET 영상을 제시하며, 종양 병변 부위는 각각의 영상에서 적색 화살표로 나타내어진다.
도 36A-B는 NCT02208362 등록 및 동정적 사용 프로토콜에 의한 치료 요법을 보여준다. NCT02208362 등록은 제0일로 설정되었고 (A), 동정적 사용 프로토콜의 개시는 제107일이다 (B). 노보TTF-100A, 비침습적, 일회용 두피 전극에 의해 낮은 세기의, 중간 주파수의, 교류 전기장을 전달하는 휴대용 의료 장치; FGFR, 섬유모세포 성장 인자 수용체; MRI, 자기 공명 영상화, 이는 달리 나타내지 않는 한 모두 뇌에 대해 수행됨; ICT, 공동내; PET, 양전자 방출 단층촬영, 표시된 부위에서 수행됨; ICV, 뇌실안.
도 37A-C는 원발성 및 재발성 종양의 면역조직화학을 보여준다. NCT02208362 하의 초기 진단 시 절제된 종양 (A), 및 릭함 배치 시 절제된 재발성 종양 (T1) (B, C). IL13Rα2-특이적 또는 Ki67-특이적 DAB를 사용한 면역화학적 염색을 헤마톡실린 대조염색과 함께 도시하고, 적색 박스는 좌에서 우로 연속 확대 영상을 약술한다.
도 38A-B는 종양 병변 확인을 보여준다. (A) GBM 병변 T1-T8의 특징 확인. (B) T1-T7의 부위를 도시한 뇌 MRI 스캔.
도 39A-C는 절제된 종양 영역이 IL13BBζ TCM의 공동내 전달 후 질환 진행/재발의 증거 없이 안정하게 유지됨을 보여준다. (A) IL13BBζ TCM 세포 생성물의 유동 세포측정 분석. 상부 열, 표시된 구축물에 의한 형질도입은 T2A 리보솜 스킵 서열을 통한 IL13BBζ CAR (항-IL13에 의해 검출됨) 및 CD19t 마커 (항-CD19에 의해 검출됨)의 협응 표면 발현을 구동하였다. T 세포 마커 TCR-α/β, CD3, CD4 및 CD8, 뿐만 아니라 소진 마커 LAG-3, TIM-3, KLRG1 및 PD-1에 대한 염색 프로파일이 중간 열에 도시되고; 기억 마커 CD62L, CD45RO, CCR7, CD27, 및 CD28, 뿐만 아니라 나이브 T 세포 마커 CD45RA에 대한 염색 프로파일이 하부 열에 도시된다. (B) NCT02208362 하의 치료 계획. 환자가 재발을 겪고 공동내 (ICT) 릭함 카테터의 배치와 함께 종양 절제를 거친 후, 6 사이클의 ICT 세포 용량 (2 x 106개 1 사이클, 및 10 x 106개 CAR+ 세포 5 사이클)을 투여하였고, 사이클 3 및 4 사이에 1주 휴식하였다. 적색 화살표, IL13BBζ TCM 전달 부위. (C) 뇌 MRI 스캔 상의 황색 원형은 카테터가 배치된 절제된 종양 부위 (T1), 뿐만 아니라 전두엽의 절제된-단독 종양 부위 (T2, T3), 및 51-일 ICT 치료 기간에 걸쳐 새롭게 발생한 종양 부위 (T6, T7)를 보여준다.
도 40A-E는 IL13Rα2-표적화 CAR T 세포의 뇌실안 전달 후 척추 전이를 포함한 재발성 다초점성 교모세포종의 퇴행을 보여준다. (A) 동정적 사용 프로토콜 하의 치료 계획. 환자가 뇌실안 (ICV) 릭함 카테터의 배치를 거친 후, 5 사이클의 ICV 세포 용량 (2 x 106개 1 사이클 및 10 x 106개 CAR+ 세포 4 사이클, 사이클 7에서 11로 표시됨)을 투여하였고, 사이클 9 및 10 사이에 1주 휴식하였다. 적색 화살표, IL13BBζ TCM 전달 부위. ICV 요법 전 (좌) 및 ICV 요법 완료 1주 후 (우)의 (B) 횡축 뇌 절편, (C) 시상면 뇌 절편, 및 (D) 척추의 횡축 (상부) 및 정면 (하부) 절편의 MRI 및/또는 PET 영상, 종양 병변 부위는 각각의 영상에서 황색 원형으로 표시된다. (E) 비-절제된 종양 T4-T8에 대한 최대 병변 면적은 ICV 요법에 의해 시간의 경과에 따라 그의 각각의 감소를 도시한다.
도 41은 IL13Rα2-표적화 CAR T 세포의 ICV 전달 후 재발성 다초점성 GBM의 퇴행을 보여준다. 비-절제된 종양 T4-T7에 대한 최대 병변 면적이 도시된다.
도 42A-C는 뇌 척수액 (CSF) 샘플로부터의 세포 침윤물 및 시토카인의 분석을 도시한다. (A) CSF 세포 침윤물 수는 CD19+ B 세포, CAR+ (즉, CD19t+) 및 비-조작된 CD3+ T 세포 둘 다, CD11b+ CD15+ 과립구, 및 CD11b+ CD14+ HLA-DR+ 단핵구의 유동 세포측정 증거에 의하면 ICV 사이클 9, 10 및 11 후에 급등하였다. (B) 유전자-변형된 (즉, CD19t+) T 세포의 존재에 대한 CSF 내 CD3+ T 세포 집단의 평가. 사이클 9, 10 및 11의 표시된 날에 수집한 CSF로부터의 CD3-게이팅된 세포를 CD19 및 CD8에 대해 공동-염색하였다 (상부 히스토그램). 이어서 면역반응성 세포의 백분율을 사용하여 각각의 시점에서의 CSF 유체 mL당 총 CD3+ T 세포 및 CD19+ CD3+ (IL13BBζ TCM) 세포의 수를 계산하였다. (C) ICV 치료 사이클 7-11에 의한 시토카인 수준에서의 배수 변화. 치료-전 수준과 비교하여 10-배 이상의 변화를 나타내는 30-플렉스 분석으로부터의 시토카인만을 도시한다.
다양한 CAR T 세포의 구조, 구축 및 특징화 및 중추 신경계의 암의 치료에서의 그의 용도가 하기 기재된다. 키메라 항원 (CAR)은, 최소한, 세포외 인식 도메인, 막횡단 영역, 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 재조합 생체분자이다. 따라서, 용어 "항원"은 항체에 결합하는 분자로 제한되지 않고, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자로 제한된다. 예를 들어, CAR은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 세포외 인식 도메인 (또한 세포외 도메인으로서, 또는 간단히 그것이 함유하는 인식 요소로 지칭됨)은 표적 세포의 세포 표면 상에 존재하는 분자에 특이적으로 결합하는 인식 요소를 포함한다. 막횡단 영역은 CAR을 막에 고정시킨다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄로부터의 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. CAR은 MHC 제한에 비의존적으로 항원에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 T 세포 활성화를 변환시킬 수 있다. 따라서, CAR은 그의 HLA 유전자형과는 상관 없이 항원-양성 종양을 갖는 환자의 집단을 치료할 수 있는 "범용" 면역수용체이다. 종양-특이적 CAR을 발현하는 T 림프구를 사용하는 입양 면역요법은 암의 치료를 위한 강력한 치료 전략일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 CAR은 CAR 오픈 리딩 프레임에 이어 T2A 리보솜 스킵 서열, 및 세포질 신호전달 꼬리가 결여된 말단절단된 CD19 (CD19t) (아미노산 323에서 말단절단됨)가 이어지는 벡터를 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 배열에서, CD19t의 공동-발현은 유전자 변형된 세포의 정확한 측정을 가능하게 하고, 유전자 변형된 세포의 양성 선택 뿐만 아니라 입양 전달 후 생체내 치료 T 세포의 효율적 세포 추적 및/또는 영상화를 가능하게 하는, 불활성, 비-면역원성 표면 마커를 제공한다. CD19t의 공동-발현은 임상적으로 이용가능한 항체 및/또는 면역독소 시약을 사용한 생체내 형질도입된 세포의 면역학적 표적화를 위한 마커를 제공하여, 치료 세포를 선택적으로 제거하고, 그에 의해 자살 스위치로서 기능한다.
CAR T 세포를 사용하는 개시된 치료 방법은 다양한 용량으로, 다양한 시간프레임에 걸쳐 수행될 수 있다. 예를 들어, CAR T 세포 (예를 들어 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포)의 주입, 투여, 또는 주사를 제공받는 환자는 1 x 106 내지 15 x 106개 세포를 포함하는 단일 용량을 제공받을 수 있다. 다시 말해서, 개시된 방법에 사용하기 위한 단일 용량은 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 10 x 106, 11 x 106, 12 x 106, 13 x 106, 14 x 106, 또는 15 x 106개의 세포를 포함할 수 있다. 전체 치료 과정에 걸쳐, 환자는 20 x 106 내지 150 x 106개 T 세포의 누적 또는 총 세포 용량을 제공받을 수 있다. 예를 들어, 환자는 치료 과정에 걸쳐 약 20 x 106, 약 25 x 106, 약 30 x 106, 약 35 x 106, 약 40 x 106, 약 45 x 106, 약 50 x 106, 약 55 x 106, 약 60 x 106, 약 65 x 106, 약 70 x 106, 약 75 x 106, 약 80 x 106, 약 85 x 106, 약 90 x 106, 약 95 x 106, 약 100 x 106, 약 105 x 106, 약 110 x 106, 약 115 x 106, 약 120 x 106, 약 125 x 106, 약 130 x 106, 약 135 x 106, 약 140 x 106, 약 145 x 106, 또는 약 150 x 106개 또는 그 초과의 T 세포를 제공받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 적어도 90 x 106개 T 세포의 총 용량을 제공받을 수 있다. 한 실시양태에서, 환자는 94 x 106개 T 세포의 총 용량을 제공받을 수 있다.
또한, 용량은 상이한 요법 및 시간표에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법은 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월 1회, 격월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 주입, 투여, 또는 주사를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 예를 들어 착용가능한 펌프로부터의 연속 주입을 포함할 수 있다. 유사하게, 치료 과정의 총 시간은 약 5주, 약 10주, 약 15주, 약 20주, 약 25주, 약 30주, 약 35주, 약 40주, 약 45주, 약 50주, 약 55주, 약 60주, 약 65주, 약 70주, 약 75주, 또는 그 초과일 수 있다. 환자는 개시된 방법에 따라 치료 과정에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 또는 그 초과의 T 세포의 주입, 투여, 또는 주사를 제공받을 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 환자는 15주 과정에 걸쳐 11회의 T 세포 주입을 제공받을 수 있다.
개시된 방법에 따라 암, 및 보다 특히 신경교종 예컨대 교모세포종을 치료하는 것은 수많은 치료 효과를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 개시된 CAR T 세포에 의한 치료는 개시된 방법에 따라 치료받은 환자의 CSF 내 시토카인 및 케모카인의 수준의 증가를 발생시킬 수 있다. 시토카인 및/또는 케모카인 발현은, CAR T 세포를 포함하는 조성물에 의한 치료 전 측정된 바와 같은 기준선 수준과 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%만큼 증가할 수 있거나, 또는 시토카인 및/또는 케모카인 발현은 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 또는 적어도 10-배만큼 증가할 수 있다. 발현에서의 이러한 증가는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15종 또는 그 초과의 시토카인 또는 케모카인에 대해 관찰될 수 있다.
특히, EGF, 에오탁신, FGF, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-α, IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Rα, IL-1β, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNF-α, 및 VEGF 중 적어도 1종의 발현이 본원에 개시된 바와 같은 CAR T 세포에 의한 치료의 결과로서 증가할 수 있다. 또한, 시토카인 및/또는 케모카인 발현에서의 증가는 국부적일 수 있다 (즉 증가는 오직 CNS 및 CFS에서만 관찰가능하고, 시토카인 및 케모카인의 혈청 수준은 변화없이 유지됨).
개시된 방법에 따른 치료는 또한 CSF에서 검출가능한 T 세포의 증가를 발생시킬 수 있다. 치료 후 CSF에서 검출가능한 T 세포 중 적어도 일부는 아마도 CAR-발현 T 세포일 것이지만, CSF로 동원된 내인성 T 세포에서의 증가가 또한 존재할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 내인성 T 세포에서의 증가는 국부 시토카인 수준에서의 증가로 인한 유형 1 및 유형 2 T 헬퍼 세포의 동원의 결과일 수 있다. 추가적으로, 검출가능한 T 세포는 CD3+ T 세포, 뿐만 아니라 CD14+ CD11b+ HLA-DR+ 성숙 골수 집단, CD19+ B 세포 및 CD11b+ CD15+ 과립구, 및/또는 반응성 림프구, 단핵구, 및 대식세포를 포함할 수 있다.
CSF 내 T 세포의 수에서의 증가는 개시된 방법에 따른 치료 후 특정 기간 동안 검출가능할 수 있다. CSF 내 T 세포에서의 검출가능한 증가는 T 세포를 포함하는 조성물의 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 또는 그 초과 동안 지속 또는 유지될 수 있다. 예를 들어, CSF에서 관찰되는 T 세포의 수에서의 증가는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 동안 기준선 수준 (즉 치료 전 검출가능한 T 세포의 수)으로 되돌아가지 않을 수 있다. CSF에서 검출가능한 T 세포의 수는, CAR T 세포를 포함하는 조성물에 의한 치료 전 측정된 바와 같은 기준선 수준과 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%만큼, 또는 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 적어도 11-배, 적어도 12-배, 적어도 13-배, 적어도 14-배, 또는 적어도 15-배만큼 증가할 수 있다.
CAR T 세포 제조 및 치료의 시간 경과가 도 31에 도시된다. 제조 과정과 공동으로, 연구 참가자는 그의 종양(들)의 절제에 이어, 릭함(Rickham) 카테터의 배치 및 기준선 영상화를 거친다.
환자 UPN097은 종양 절제를 거치고, 사이클 1에서 2 x 106개 세포 및 사이클 2에서 10 x 106개 세포로 치료되었다. 사이클 1 및 사이클 2 둘 다에서, 세포는 절제에 의해 남겨진 공동에 투여되었다. 제2 사이클 후 환자 UPN097은 신속한 종양 진행으로 인해 연구에서 배제되었다.
환자 UPN109는 사이클 1에서 2 x 106개 세포 및 사이클 2 및 3에서 10 x 106개 세포로 치료되었다. 휴식 기간 후, 환자 UPN109는 사이클 4, 5 및 6에서 10 x 106개 세포로 치료되었다. 사이클 1-6에서, 세포는 종양내로 투여되었다. 사이클 7에서, 환자는 2 x 106개 세포로 치료되었다. 사이클 8 및 9에서, 환자는 10 x 106개 세포로 치료되었다. 사이클 7-10에서 투여는 뇌실내였다.
본원에 사용된 용어 "뇌실내"는 뇌실계, 구체적으로 뇌 뇌실 내부의 공간을 지칭한다. 따라서, 용어 "뇌실내" 및 "뇌실안"은 본 개시내용 전반에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 따라서, "뇌실내 투여" 또는 "뇌실내 주사"는 뇌의 뇌실 (즉 뇌 뇌실) 내로의 조성물의 전달을 지칭한다. 뇌 뇌실은 전뇌 및 뇌간의 코어에 놓인 일련의 상호연결된, 유체-충전 공간이다. 이러한 시스템은 4개의 뇌실: 우 및 좌측 뇌실 (이 중 하나는 뇌의 각각의 반구에서 발견됨), 제3 뇌실, 및 제4 뇌실을 포함한다.
개시된 방법은 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 다양한 경로를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 뇌실내로 전달 또는 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 척수관 내로 전달 또는 투여될 수 있다 (즉 척수강내 전달). 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 척수의 경막외강 내로 전달 또는 투여될 수 있다 (즉 경막외 전달). 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 종양 내로 직접 전달 또는 투여될 수 있다 (즉 종양내 전달). 일부 실시양태에서, 개시된 조성물은 종양 조직의 절제에 의해 형성된 공동내로 전달 또는 투여될 수 있다 (즉 공동내 전달). 또한, 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 상기 언급된 투여 경로의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자는 T 세포를 포함하는 조성물의 적어도 1회 용량을 공동내 전달을 통해 제공받은 다음, 조성물의 적어도 1회 용량을 뇌실내 전달을 통해 제공받을 수 있다.
도 32A는 CD19에 의해 모니터링된 바와 같은 CAR T 세포 지속성의 분석을 나타낸다. 이러한 분석은 사이클 2의 8일 후의 양호한 T 세포 지속성을 보여준다. 도 32B는 IL13Rα2 발현에 의해 모니터링된 바와 같은 GBM 세포의 감소된 존재를 보여준다.
도 33A 및 도 33B는 종양내 투여에 사용된 카테터 영역에서의 환자 UPN097로부터의 영상화 결과를 도시한다. 도 33A에서 CD3+ 또는 CD8+ T 세포는 치료전 거의 존재하지 않는다는 것을 볼 수 있다. 좌 전두 종양 공동 벽에서 채취한 치료-후 제16일의 샘플인 도 33B는 대형 괴사성 종양 구역 및 CD3+ 및 CD8+ 세포의 유의한 존재를 보여준다.
신경교종은 IL13 수용체, 및 특히, 고-친화도 IL13 수용체를 발현한다. 그러나, IL13 수용체와 달리, 신경교종 세포는 IL4Rβ 또는 γc44에 대한 요건과 독립적으로 IL13에 결합할 수 있는 고유한 IL13Rα2 쇄를 과다발현한다. 그의 상동체 IL4와 마찬가지로, IL13은 CNS 외부에서 다면발현성 면역조절 활성을 갖는다. IL13 및 IL4 둘 다는 B 림프구에 의한 IgE 생산을 자극하고, 대식세포에 의한 염증유발 시토카인 생산을 억제한다. 방사성표지된 IL13에 의한 자가방사선촬영을 사용한 상세한 연구는 연구된 거의 모든 악성 신경교종 조직에 대한 풍부한 IL13 결합을 입증하였다. 이러한 결합은 종양 절편 내에서 및 단일 세포 분석에서 고도로 균질하다. 그러나, IL13Rα2 mRNA에 특이적인 분자 프로브 분석은 정상 뇌 요소에 의해 신경교종-특이적 수용체의 발현을 검출하지 못했고, 방사성표지된 IL13에 의한 자가방사선촬영도 또한 정상 CNS에서 특이적 IL13 결합을 검출할 수 없었다. 이들 연구는 공유된 IL13Rα1/IL4β/γc 수용체가 정상 CNS에서는 검출가능하게 발현되지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, IL13Rα2는 신경교종에 대해 매우 특이적인 세포-표면 표적이며, 신경교종의 치료를 위해 설계된 CAR의 적합한 표적이다.
개시된 치료 방법을 제공받는데 특정 환자가 다른 환자보다 더 적합할 수 있다. 예를 들어, IL-13Rα2를 고도로 발현하는 악성종양을 갖는 환자는 개시된 CAR T-세포에 의한 치료로부터 특히 이익을 얻을 수 있다. 환자의 적합성은 환자로부터의 절제된 종양 샘플을 염색하여 IL-13Rα2의 발현 양을 결정함으로써 결정될 수 있다. 샘플은 약, 중, 또는 강 염색 세기를 나타내는 세포의 수에 기초하여 점수화될 수 있다. Ki67의 발현 수준을 결정하는 것은 또한 질환의 공격성을 결정하는데 유익할 수 있다. 환자가 개시된 CAR T 세포를 제공받는데 적절히 적합한 것으로 결정되면, 환자는 개시된 방법에 따라 치료될 수 있다.
그러나 IL13-기반 치료 분자의 광범위하게 발현된 IL13Rα1/IL4β/γc 수용체 복합체에의 결합은 CNS 외부의 정상 조직에 대해 원치않는 독성을 매개할 잠재력을 갖고, 따라서 이들 작용제의 전신 투여는 제한된다. IL13 알파 헬릭스 A에서 아미노산 13의 천연 글루탐산에서 티로신으로의 아미노산 치환은 IL13의 IL13Rα1/IL4β/γc 수용체에 대한 친화도를 선택적으로 감소시킨다. 그러나 이러한 돌연변이체 (IL13(E13Y)로 명명됨)의 IL13Rα2에의 결합은 야생형 IL13에 비해 증가된다. 따라서, 이러한 최소한으로 변경된 IL13 유사체는 신경교종 세포에 대한 IL13의 특이성 및 친화도를 동시에 증가시킨다. 따라서, 본원에 기재된 CAR은 아미노산 13 (문헌 [Debinski et al. 1999 Clin Cancer Res 5:3143s]의 넘버링에 따름)에서 돌연변이 (E에서 Y 또는 E에서 일부 다른 아미노산 예컨대 K 또는 R 또는 L 또는 V)를 함유하는 IL13을 포함한다. 그러나 천연 서열을 갖는 IL13도 또한 사용될 수 있고, 이는 특히 변형된 T 세포가 예컨대 종양 덩이 내로의 직접 주사에 의해 국부 투여되는 상황에서 유용할 수 있다.
추가적으로, 신경교종은 일반적으로 불량한 환자 예후를 갖는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 다형성 교모세포종 (GBM)은 CNS의 통상적인 악성 암이다. GBM의 1-년 및 2-년 상대 생존율은 각각 29.6% 및 9.0%이다. GBM 진단받은 환자 중 오직 3.4% 만이 5년을 초과하여 생존한다. 또한, 외과적 절제 및/또는 다른 통상적인 요법에 의한 치료 후 재발하는 것이 통상적이다. 현재의 통상적인 치료는 방사선 요법, 소분자 (예를 들어 테모졸로미드, 이리노테칸, 이마티닙 메실레이트, 에를로티닙 및 히드록시우레아), 및 생물제제 예컨대 항체 (예를 들어 베바시주맙)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
개시된 치료 방법은 현재의 표준법과 비교하여 환자에서 임상 예후를 개선시킨다. 예를 들어, 개시된 방법은 1-년, 2-년, 및 5-년 생존율을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법에 따라 치료될 환자의 1-년 생존율은 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법에 따라 치료될 환자의 2-년 생존율은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법에 따라 치료될 환자의 5-년 생존율은 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%일 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시된 방법은 또한 방사선 요법, 소분자 약물 요법, 치료 항체와 같은 치료 생물제제, 또는 그의 조합을 포함한 통상적인 치료 또는 SOC 치료를 받은 또 다른 환자와 비교하여 환자의 기대 수명을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, SOC 치료를 받은 환자는 초기 진단으로부터 약 15개월 생존할 것 (전체 생존 또는 OS)으로 예상할 수 있고, 개시된 치료를 받은 환자는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상의 OS를 예상할 수 있다. 일부 실시양태에서, 청구된 치료를 받은 환자는 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90개월 이상의 OS를 예상할 수 있다.
개시된 방법은 다양한 임상 결과를 통해 환자의 예후를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법은 T 세포를 포함하는 조성물로 치료될 환자에서 종양 부피의 감소를 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 개시된 치료 방법은 종양 부피의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 감소를 발생시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자의 종양은 완전히 제거될 수 있고 환자는 악성종양이 치유될 수 있다.
추가적으로, 개시된 방법은 안전하고 잘-용인된다. 개시된 방법에 따라 치료되는 환자는 유의한 부작용을 겪지 않을 수 있고, 또한, 보조 의약의 복용을 중단할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 NCI 일반 독성 기준 (CTC)에 따른 임의의 등급 3 이상의 독성을 발생시키지 않을 것이다. CTC는 0-5의 정량화가능한 척도를 제공하며, 0은 유해 사건이 없음을 의미하고, 1은 경도를 의미하고, 2는 중등도를 의미하고, 3은 중증 및 바람직하지 않은 것을 의미하고, 4는 생명을 위협하는 것 또는 장애를 초래하는 것을 의미하고, 5는 사망을 의미한다. 따라서, 부작용 및 또는 독성은 경도 또는 중등도의 두통, 피로, 근육통, 및 부차적인 신경계 장애, 예컨대 후각 전조와 같은 사건은 포함할 수 있지만, 고등급 독성은 회피될 것이다.
덱사메타손과 같은 스테로이드는 뇌 부종과 같은 신경계 부작용을 방지하기 위해 신경교종의 임상 관리에 통상적으로 사용된다. 개시된 치료 방법은 이러한 보조 치료에 대한 필요를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 환자가 개시된 방법에 따른 치료 전 스테로이드 (예를 들어 덱사메타손) 요법을 제공받고 있는 경우, 환자는 스테로이드 요법의 용량을 감소시킬 수 있거나 또는 임상적 유해 효과를 겪지 않으면서 스테로이드 요법을 전적으로 중단할 수 있다.
유방암의 뇌 전이는 HER2를 발현할 수 있다. 악성 신경교종의 치료에 유용한 본원에 기재된 특정 CAR은 HER2에 대해 표적화된다.
본원에 기재된 CAR은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있지만, 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된다. 키메라 수용체의 여러 영역을 코딩하는 핵산은 제조되어 관련 기술분야에 편리한 것으로 공지된 분자 클로닝의 표준 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-보조 라이게이션, 부위-지정 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 어셈블리될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 바람직하게는 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 발현 숙주 세포주, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주를 형질전환시키는데 사용된다.
비선택된 PBMC 또는 풍부화된 CD3 T 세포 또는 풍부화된 CD3 또는 기억 T 세포 하위세트를 포함한, 환자로부터 단리된 다양한 T 세포 하위세트가 CAR 발현을 위한 벡터로 형질도입될 수 있다. 중심 기억 T 세포는 1종의 유용한 T 세포 하위세트이다. 중심 기억 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터, 예를 들어 목적하는 수용체를 발현하는 세포를 면역자기적으로 선택하기 위한 클리니MACS(CliniMACS)® 장치를 사용하여 CD45RO+/CD62L+ 세포를 선택함으로써 단리될 수 있다. 중심 기억 T 세포가 풍부화된 세포는 항-CD3/CD28에 의해 활성화될 수 있고, CAR 뿐만 아니라 생체내 검출 및 잠재적 생체외 선택 둘 다를 위한 비-면역원성 표면 마커인 말단절단된 인간 CD19 (CD19t)의 발현을 지시하는, 예를 들어, SIN 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입될 수 있다. 활성화된/유전자 변형된 중심 기억 T 세포는 시험관내에서 IL-2/IL-15에 의해 확장될 수 있고, 이어서, 동결보존될 수 있다.
실시예 1: IL13Rα2-특이적 CAR의 구축 및 구조
유용한 IL13Rα2-특이적 CAR의 구조가 하기 기재된다. 코돈 최적화된 CAR 서열은 IL13Rα1에의 잠재적 결합을 감소시키기 위해 단일 부위에서 돌연변이된 (E13Y) 막-테더링된 IL-13 리간드, Fc 수용체-매개 인식 모델을 크게 감소시키는 2개의 돌연변이 (L235E; N297Q)를 함유하는 IgG4 Fc 스페이서, CD4 막횡단 도메인, 공동자극 4-1BB 세포질 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 함유한다. T2A 리보솜 스킵 서열은 이러한 IL13(EQ)BBζ CAR 서열을 불활성, 비-면역원성 세포 표면 검출/선택 마커인 CD19t로부터 분리시킨다. 이러한 T2A 연결은 단일 전사체로부터 IL13(EQ)BBζ 및 CD19t 둘 다의 협응 발현을 발생시킨다. 도 1A는 IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t 구축물을 코딩하는 2670개의 뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임의 개략적 도면이다. 이 도면에서, IL13(EQ)BBZ CAR의 IL13Rα2-특이적 리간드 IL13(E13Y), IgG4(EQ) Fc, CD4 막횡단, 4-1BB 세포질 신호전달, 3개의-글리신 링커, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인, 뿐만 아니라 T2A 리보솜 스킵 및 말단절단된 CD19 서열이 모두 제시된다. IL13(EQ)BBZ CAR 및 CD19t의 표면 발현을 구동시키는 인간 GM-CSF 수용체 알파 및 CD19 신호 서열이 또한 표시된다. 따라서, IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t 구축물은 IL13Rα2-특이적, 힌지-최적화된, 공동자극 키메라 면역수용체 서열 (IL13(EQ)BBZ로 지정됨), 리보솜-스킵 T2A 서열, 및 CD19t 서열을 포함한다.
인간 GM-CSF 수용체 알파 리더 펩티드를 IL13(E13Y) 리간드 5 L235E/N297Q-변형된 IgG4 Fc 힌지 (여기서 이중 돌연변이는 FcR 인식을 방해함), CD4 막횡단, 4-1BB 세포질 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인 서열과 융합함으로써 IL13(EQ)BBZ 서열을 생성하였다. 이러한 서열은 코돈 최적화 후에 신생 합성하였다. T2A 서열은 T2A-함유 플라스미드를 소화시켜 수득하였다. CD19t 서열은 CD19-함유 플라스미드의 리더 펩티드 서열에서 막횡단 성분에 걸친 것 (즉, 염기쌍 1-972)으로부터 수득하였다. 모든 3개의 단편, 1) IL13(EQ)BBZ, 2) T2A, 및 3) CD19t를 epHIV7 렌티바이러스 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 적절한 세포 내로 형질감염되었을 때, 벡터는 도 1B에 개략적으로 도시된 서열을 숙주 세포 게놈 내로 통합시킨다. 도 1C는 9515개 염기쌍의 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t _epHIV7 플라스미드 그 자체의 개략적 도면을 제공한다.
도 2에 개략적으로 제시된 바와 같이, IL13(EQ)BBZ CAR은 IL13(E13Y)-제타카인으로 지칭되는 이전에 기재된 IL13Rα2-특이적 CAR (Brown et al. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199)과 여러 중요한 측면에서 상이하다. IL13(E13Y)-제타카인은 제시된 바와 같이 IL13Rα2-특이적 인간 IL-13 뮤테인 (huIL-13(E13Y)), 인간 IgG4 Fc 스페이서 (huγ4Fc), 인간 CD4 막횡단 (huCD4 tm), 및 인간 CD3ζ 쇄 세포질 (huCD3ζ cyt) 부분으로 구성된다. 대조적으로, IL13(EQ)BBζ는 IgG4 스페이서의 CH2 도메인에 위치하는 2개의 점 돌연변이, L235E 및 N297Q, 및 공동자극 4-1BB 세포질 도메인 (4-1BB cyt)을 갖는다.
실시예 2: IL13Rα2-특이적 CAR의 발현을 위해 사용되는 epHIV7의 구축 및 구조
pHIV7 플라스미드는 모 플라스미드로, 그로부터 임상 벡터 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7가 시티 오브 호프(City of Hope) (COH)의 T 세포 치료제 연구 실험실 (TCTRL)에서 유래되었다. CAR의 발현을 위해 사용된 epHIV7 벡터는 pHIV7 벡터로부터 생산되었다. 중요한 것으로, 이러한 벡터는 CAR의 발현을 구동시키기 위해 인간 EF1 프로모터를 사용한다. 벡터의 5' 및 3' 서열 둘 다는, 이전에 HXBc2 프로바이러스로부터 유래된 pv653RSN으로부터 유래되었다. 폴리퓨린 트랙 DNA 플랩 서열 (cPPT)은 NIH AIDS 시약 저장소로부터의 HIV-1 균주 pNL4-3으로부터 유래되었다. 우드척 전사-후 조절 요소 (WPRE) 서열은 이전에 기재되었다.
pHIV7의 구축을 도 3에 개략적으로 도시한다. 간략하게, SL3-네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (Neo)가 개재된 gag-pol 플러스 5' 및 3' 긴-말단 반복부 (LTR)로부터의 653 bp를 함유하는 pv653RSN을 하기와 같이 pBluescript 내로 서브클로닝하였다: 단계 1에서, 5' LTR로부터 rev-반응성 요소 (RRE)까지의 서열로 p5'HIV-1 51을 제조하였고, 이어서 TATA 박스의 상류 서열을 제거하여 5' LTR을 변형시키고, 먼저 CMV 인핸서에, 이어서, SV40 복제 기점에 라이게이션시켰다 (p5'HIV-2). 단계 2에서, 3' LTR을 pBluescript 내로 클로닝하여 p3'HIV-1을 제조한 후, 3' LTR 인핸서/프로모터에서 400-bp를 결실시켜 HIV U3 내의 시스-조절 요소를 제거하고, p3'HIV-2를 형성하였다. 단계 3에서, p5'HIV-3 및 p3'HIV-2로부터 단리된 단편을 라이게이션시켜 pHIV-3을 제조하였다. 단계 4에서, 추가의 상류 HIV 서열을 제거하여 p3'HIV-2를 추가로 변형시킴으로써 p3'HIV-3을 생성하고, WPRE를 함유하는 600-bp BamHI-SalI 단편을 p3'HIV-3에 부가하여 p3'HIV-4를 제조하였다. 단계 5에서, PCR에 의해 pHIV-3 RRE의 크기를 감소시키고, pHIV-3으로부터의 5' 단편 (제시되지 않음) 및 p3'HIV-4에 라이게이션시켜 pHIV-6을 제조하였다. 단계 6에서, HIV-1 pNL4-3 (55)으로부터의 cPPT DNA 플랩 서열을 함유하는 190-bp BglII-BamHI 단편을 pNL4-3으로부터 증폭시키고, pHIV6 내의 RRE와 WPRE 서열 사이에 배치하여 pHIV-7을 제조하였다. 이러한 모 플라스미드 pHIV7-GFP (GFP, 녹색 형광 단백질)를 사용하여, 4-플라스미드 시스템을 사용하여 모 벡터를 패키징하였다.
패키징 신호, 프사이 ψ는 바이러스 게놈의 벡터 내로의 효율적 패키징을 위해 필요하다. RRE 및 WPRE는 RNA 전사체 수송 및 트랜스진의 발현을 증강시킨다. WPRE와 조합된 플랩 서열은 표유동물 세포에서 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효율을 증강시키는 것으로 입증된 바 있다.
바이러스 벡터의 생산에 필요한 헬퍼 기능은 재조합을 통한 복제 적격 렌티바이러스의 생성 가능성을 감소시키기 위해 3개의 별개의 플라스미드로 나누어진다: 1) pCgp는 바이러스 벡터 어셈블리에 필요한 gag/pol 단백질을 코딩하고; 2) pCMV-Rev2는 효율적인 패키징을 위한 바이러스 게놈의 수송을 보조하기 위해 RRE 서열에 대해 작용하는 Rev 단백질을 코딩하고; 3) pCMV-G는 바이러스 벡터의 감염성에 필요한 수포성-구내염 바이러스 (VSV)의 당단백질을 코딩한다.
pHIV7 코딩 벡터 게놈과 헬퍼 플라스미드 사이에는 최소 DNA 서열 상동성이 존재한다. 상동성 영역은 pCgp 헬퍼 플라스미드의 gag/pol 서열에 위치하는, 대략 600개의 뉴클레오티드의 패키징 신호 영역; 모든 3개의 헬퍼 플라스미드 내의 CMV 프로모터 서열; 및 헬퍼 플라스미드 pCgp 내의 RRE 서열을 포함한다. 이들 영역에서의 상동성으로 인해 복제 적격 재조합 바이러스가 생성될 수 있는 가능성은 매우 낮은데, 이는 다중 재조합 이벤트를 필요로 할 것이기 때문이다. 추가적으로, 임의의 생성된 재조합체는 렌티바이러스 복제에 필요한 기능성 LTR 및 tat 서열을 누락하게 될 것이다.
CMV 프로모터를 EF1α-HTLV 프로모터 (EF1p)로 대체하였고, 새로운 플라스미드를 epHIV7로 명명하였다 (도 4). EF1p는 563 bp를 가지며, CMV 프로모터를 잘라낸 후, NruI 및 NheI를 사용하여 epHIV7 내로 도입하였다.
야생형 바이러스의 병원성을 위해 필요하고 표적 세포의 증식성 감염에 요구되는 gag/pol 및 rev가 배제된 렌티바이러스 게놈을 이러한 시스템으로부터 제거하였다. 또한, IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 벡터 구축물은 무손상 3'LTR 프로모터를 함유하지 않고, 따라서 표적화된 세포에서 생성되는 발현되고 역전사된 DNA 프로바이러스 게놈은 불활성 LTR을 갖게 될 것이다. 이러한 설계의 결과로서, 어떠한 HIV-I 유래 서열도 프로바이러스로부터 전사되지 않을 것이고, 오직 치료 서열만이 그의 각각의 프로모터로부터 발현될 것이다. SIN 벡터에서 LTR 프로모터 활성의 제거는 숙주 유전자의 비의도적 활성화의 가능성을 유의하게 감소시킬 것으로 예상된다. 표 4는 IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7에 존재하는 다양한 조절 요소를 요약한다.
Figure pct00006
실시예 3: 환자 T 세포의 형질도입을 위한 벡터의 생산
각각의 플라스미드 (IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7; pCgp; pCMV-G; 및 pCMV-Rev2)에 대해 시드 뱅크를 생성하고, 이를 사용하여 발효기에 접종하여 충분한 양의 플라스미드 DNA를 생산하였다. 플라스미드 DNA를 렌티바이러스 벡터를 생산하는데 사용하기 전에, 아이덴티티, 멸균성 및 내독소에 대해 시험하였다.
간략하게, 멸균성 및 바이러스 오염의 부재를 확인하기 위해 시험한 293T 작업 세포 (WCB)로부터 세포를 확장시켰다. 293T WCB로부터의 293T 세포의 바이알을 해동시켰다. 벡터 생산 및 세포주 유지를 위해 적절한 수의 10층 세포 공장 (CF)을 플레이팅하기 위해, 충분한 수의 세포가 존재할 때까지 세포를 성장시키고 확장시켰다. 단일 세포주가 생산에 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 최대 10 CF의 하위-배치에서 생산하였다. 2개의 하위-배치를 동일한 주에 생산하여 대략 20 L의 렌티바이러스 상청액/주로 생산할 수 있다. 1 로트의 생성물을 생산하기 위해, 하류 프로세싱 단계 동안 모든 하위-배치로부터 생산된 물질을 풀링하였다. 293T 세포를 293T 배지 (10% FBS를 포함하는 DMEM) 중 CF에 플레이팅하였다. 공장을 37℃ 인큐베이터 내에 넣고, CF의 모든 층 상에서 세포가 균등하게 분포하도록 수평으로 평평하게 하였다. 2일 후, 트리스:EDTA, 2M CaCl2, 2X HBS, 및 4종의 DNA 플라스미드의 혼합물을 수반하는 CaPO4 방법을 사용하여, 상기 기재된 4종의 렌티바이러스 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 제3일에, 분비된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 수집하고, 정제하고, 농축시켰다. CF로부터 상청액을 제거한 후, 각각의 CF로부터 생산-종료 세포를 수집하였다. 세포를 각각의 공장으로부터 트립신처리하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 냉동 배지 중에 재현탁시키고, 동결보존하였다. 이들 세포를 추후에 복제-적격 렌티바이러스 (RCL) 검사에 사용하였다.
벡터를 정제하고 제제화하기 위해, 막 여과에 의해 조 상청액을 정화하여 세포 파편을 제거하였다. 숙주 세포 DNA 및 잔류 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 소화 (벤조나제(Benzonase)®)에 의해 분해하였다. 0.45 μm 필터를 사용하여 세포 파편으로부터 바이러스 상청액을 정화하였다. 정화된 상청액을 벤조나제®가 첨가되어 있는 (최종 농도 50 U/mL) 사전-칭량된 용기 내로 수집하였다. 잔류 플라스미드 DNA 및 숙주 게놈 DNA에 대한 엔도뉴클레아제 소화를 37℃에서 6시간 동안 수행하였다. 엔도뉴클레아제-처리된 상청액의 초기 접선 흐름 한외여과 (TFF) 농축을 사용하여 조 상청액으로부터 잔류 저분자량 성분을 제거하는 한편, 바이러스를 ~20배 농축시켰다. 정화된 엔도뉴클레아제-처리된 바이러스 상청액을 500 kD의 NMWCO를 갖는 중공 섬유 카트리지를 통해, 전단 속도는 ~4,000 sec-1 이하로 유지하면서 유동 속도는 최대화하도록 설계된 유량으로 순환시켰다. 카트리지 성능을 지속시키기 위해 농축 프로세스 동안 뉴클레아제-처리된 상청액의 투석여과를 개시하였다. 투석여과 완충제로서 PBS 중 4% 락토스를 사용하여 80%의 투과물 교체율을 확립하였다. 바이러스 상청액을 조 상청액의 20-배 농도를 나타내는 표적 부피로 만들었고, 4회 추가의 교환 부피를 위해 투석여과를 계속하였고, 투과물 교체율은 100%였다.
바이러스 생성물의 추가의 농축은 고속 원심분리 기술을 사용하여 달성하였다. 6000 RPM (6,088 RCF)에서의 소르발(Sorvall) RC-26 플러스 원심분리를 6℃에서 16-20시간 동안 사용하여 렌티바이러스의 각각의 하위-배치를 펠릿화하였다. 이어서 각각의 하위-배치로부터의 바이러스 펠릿을 PBS 중 4% 락토스에 의해 50 mL 부피로 재구성하였다. 이러한 완충제 중에 재구성된 펠릿은 바이러스 제조를 위한 최종 제제를 나타낸다. 전체 벡터 농축 프로세스는 대략 200-배 부피 감소를 발생시켰다. 모든 하위-배치의 완료 후, 이어서 물질을 -80℃에 두는 한편, 각각의 하위-배치로부터의 샘플을 멸균성에 대해 시험하였다. 샘플 멸균성을 확인한 후, 하위-배치를 37℃에서 빈번한 교반 하에 신속하게 해동시켰다. 이어서, 물질을 풀링하고, 바이러스 벡터 스위트 내의 클래스 II 유형 A/B3 생물안전 캐비넷으로 수동으로 분취하였다. O-링 크리오바이알이 외부 장착된 멸균 USP 클래스 6 내의 농축된 렌티바이러스의 1 mL 충전 구성을 사용하였다. COH의 응용 기술 개발 센터 (CATD)의 품질 시스템 (QS)은 CBG를 위한 정책 및 표준 운영 절차에 따라, 현행 우수 제조 관리기준 (cGMP)을 준수하여 모든 물질을 출시하였다.
렌티바이러스 벡터 제제의 순도를 확실하게 하기 위해, 잔류 숙주 DNA 오염물, 및 잔류 숙주 및 플라스미드 DNA의 전달에 대해 시험하였다. 다른 시험들 중에서, RT-PCR에 의해 벡터 아이덴티티를 평가하여 올바른 벡터가 존재하는지 확실하게 하였다. 본 연구에 사용하기 위해 의도되는 벡터는 모든 출시 기준을 충족시켰다.
실시예 4: ACT에서의 사용에 적합한 T 세포의 제조
T 림프구를 환자로부터 백혈구분리반출술에 의해 수득하고, 적절한 동종 또는 자가 T 세포 하위세트, 예를 들어, 중심 기억 T 세포 (TCM)를 CAR을 발현하도록 유전자 변경한 다음, 임의의 임상적으로 허용되는 수단에 의해 환자에게 다시 투여하여 항암 요법을 달성한다.
적합한 TCM은 하기와 같이 제조될 수 있다. 동의한 연구 참가자로부터 수득한 분리반출술 생성물을 피콜화하고, 세척하고, 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 GMP 등급 항-CD14, 항-CD25 및 항-CD45RA 시약 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)) 및 클리니MACS(CliniMACS)™ 분리 장치를 사용하여 세포에서 단핵구, 조절 T 세포 및 나이브 T 세포 집단을 고갈시켰다. 고갈 후, 클리니MACS™ 분리 장치 상에서 DREG56-비오틴 (COH 임상 등급) 및 항-비오틴 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)를 사용하여 음성 분획 세포를 CD62L+ TCM 세포에 대해 풍부화하였다.
풍부화 후, TCM 세포를 완전 엑스-비보15(X-Vivo15) 플러스 50 IU/mL IL-2 및 0.5 ng/mL IL-15 중에 제제화하고, 테플론 세포 배양 백으로 옮겨, 여기서 디날 클린Ex™ 비보(Dynal ClinEx™ Vivo) CD3/CD28 비드로 이를 자극하였다. 자극 후 최대 5일째에, IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 렌티바이러스 벡터로 1.0 내지 0.3의 감염 다중도 (MOI)로 세포를 형질도입하였다. 세포 확장을 위해 필요에 따라 완전 엑스-비보15 및 IL-2 및 IL-15 시토카인을 첨가하면서 최대 42일 동안 배양을 유지시켰다 (세포 밀도를 3 x 105 및 2 x 106개 생존 세포/mL로 유지시키고, 배양의 월요일, 수요일, 및 금요일마다 시토카인 보충). 세포는 전형적으로 이들 조건 하에 21일 내에 대략 109개 세포로 확장되었다. 배양 기간 말미에 세포를 수거하고, 2회 세척하고, 임상 등급 동결보존 배지 (크리오스토어 CS5(Cryostore CS5), 바이오라이프 솔루션즈(BioLife Solutions)) 중에 제제화하였다.
T 세포 주입일(들)에, 동결보존되고 출시된 생성물을 재-주입을 위해 해동하고, 세척하고, 제제화하였다. 출시된 세포 생성물을 함유하는 동결보존된 바이알을 액체 질소 보관에서 꺼내어, 해동하고, 냉각시키고, PBS/2% 인간 혈청 알부민 (HSA) 세척 완충제로 세척하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고, 세포를 보존제-무함유 생리 식염수 (PFNS)/2% HSA 주입 희석제 중에 재현탁시켰다. 샘플을 품질 관리 검사를 위해 꺼내었다.
상기 기재된 제조 플랫폼을 사용하여 건강한 공여자로부터 입수된 세포에 대해 2회의 적격 작업을 수행하였다. 각각의 전임상 적격 작업 생성물에 인간 공여자 (HD) 번호 - HD006.5 및 HD187.1을 배정하였다. 중요한 것으로, 표 5에 제시된 바와 같이, 이들 적격 작업은 28일 내에 >80배 확장시켰고, 확장된 세포는 IL13(EQ)BBγ/CD19t 트랜스진을 발현하였다.
표 5: 전임상 적격 작업 생성물로부터의 발현 데이터의 요약
Figure pct00007
실시예 5: IL13(EQ)BBγ/CD19t+TCM에서의 표면 트랜스진 및 T 세포 마커 발현의 유동 세포측정 분석
실시예 4에 기재된 2개의 전임상 적격 작업 생성물을 하기 기재된 바와 같은 전임상 연구에 사용하였다. 도 6A-C는 표면 트랜스진 및 T 세포 마커 발현의 유동 세포측정 분석의 결과를 도시한다. IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 항-IL13-PE 및 항-CD8-FITC로 공동-염색하여 CD8+ CAR+ 및 CD4+ (즉, CD8 음성) CAR+ 세포를 검출하거나 (도 6A), 또는 항-CD19-PE 및 항-CD4-FITC로 공동-염색하여 CD4+ CD19t+ 및 CD8+ (즉, CD4 음성) CAR+ 세포를 검출하였다 (도 6B). IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 형광색소-접합된 항-CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L 및 CD28 (회색 히스토그램) 또는 이소형 대조군 (흑색 히스토그램)으로 염색하였다 (도 6C). 도 6A-C 각각에서, 표시된 백분율은 이소형을 초과하여 염색된 생존 림프구 (DAPI 음성)에 기초한다.
실시예 6: 대형 TS-개시된 PBT 종양의 치료를 위한 CAR T 세포 전달 경로의 비교
침습성 원발성 PBT 세포주에 대한 항종양 활성에 대해 전달 경로, 정맥내 (i.v.) 또는 두개내 (i.c.)를 비교하는 연구가 하기 기재된다. 파일럿 연구에서 (데이터는 제시되지 않음), 소형 (제5일) PBT030-2 EGFP:ffLuc 종양을 치료하는 경우, i.v. 투여된 IL13(EQ)BBζ+ TCM이 PBS와 비교하여 어떠한 치료 이익도 제공하지 않는다는 것이 예상외로 관찰되었다. 이는 i.c. 투여된 CAR+ T 세포의 경우에 관찰된 강력한 치료 효능과 대조적이다. 주변부로부터 치료 T 세포를 동원하기에는 제5일의 PBT030-2 종양이 너무 작을 수 있다고 추론하면서, 보다 큰 제19일의 PBT030-2 EGFP:ffLuc 종양에 대해 i.v. 대 i.c. 전달을 비교하였다. 이들 연구를 위해, PBT030-2 생착된 마우스를 IL13(EQ)BBZ+ TCM, 또는 모의 TCM (CAR 없음)의 2회 i.v. 주입 (5 x 106개 CAR+ TCM; 제19일 및 제26일) 또는 4회 i.c. 주입 (1 x 106개 CAR+ TCM; 제19일, 제22일, 제26일 및 제29일)에 의해 치료하였다. 여기에서 또한 i.v. 투여된 CAR+ T 세포에 대한 제노겐 영상화 또는 카플란-마이어 생존 분석에 의하면 어떠한 치료 이익도 모니터링되지 않았다 (도 7A 및 7B). 대조적으로, i.c. 투여된 IL13(EQ)BBζ+ TCM의 경우, 강력한 항종양 활성이 관찰되었다 (도 7A-B). 다음으로, T 세포 주사 7일 후의 마우스 코호트로부터 뇌를 수거하고, IHC에 의해 CD3+ 인간 T 세포에 대해 평가하였다. 놀랍게도, 모의 TCM 또는 IL13(EQ)BBζ TCM을 사용하여 i.v.로 치료된 마우스의 경우, 종양 또는 전형적으로 인간 T 세포가 존재하는 다른 마우스 뇌 영역 (즉, 연수막)에서 어떠한 검출가능한 CD3+ 인간 T 세포도 존재하지 않았고 (도 7C), 이는 종양 향성의 결손을 시사한다. 이는 i.c. 치료된 마우스에서 유의한 수의 T 세포가 검출된 것과 대조적이다 (도 7D).
종양 유래 시토카인, 특히 MCP-1/CCL2는 T 세포를 종양으로 동원하는데 중요하다. 따라서, PBT030-2 종양 세포를 평가하였고, 이러한 세포주가, i.v. 투여된 이펙터 CD8+ T 세포를 i.c. 생착된 종양으로 유인하는 것으로 이전에 밝혀진 신경교종 세포주인 U251T 세포와 대등하게 (데이터는 나타내지 않음), 높은 수준의 MCP-1/CCL2를 생산한다는 것을 발견하였다. 악성 신경교종은 고도로 침습성인 종양이고, 종종 다초점성으로 제시된다. 상기 기재된 연구는 IL13BBZ TCM이 침윤된 종양, 예컨대 PBT030-2를 제거할 수 있고, 장기간 지속되는 항종양 활성을 매개할 수 있다는 것을 확립한다. 두개내로 전달된 CAR T 세포가 다초점성 질환으로 이동하는 능력을 또한 검사하였다. 이러한 연구를 위해, PBT030-2 EGFP:ffLuc TS를 좌 및 우 반구 둘 다에 이식하고 (도 8A), CAR+ T 세포를 오직 우 종양 부위에만 주사하였다. 고무적으로, 평가된 모든 마우스에 대해 (n=3), 본 발명자들은 T 세포 주입 7-일 후 주사 부위 (즉 우 종양)에서 뿐만 아니라 좌 반구의 종양 내 둘 다에서 CD3 IHC에 의해 T 세포를 검출하였다 (도 8B). 이들 발견은 CAR+ T 세포가 원위 부위에서 종양 병소로 이동할 수 있고, 침윤될 수 있다는 증거를 제공한다. 또한 U251T 신경교종 세포주를 사용한 제2 종양 모델에서 유사한 관찰 결과가 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 7: IL13(EQ)BBζ/CD19t의 아미노산 서열
IL13(EQ)BBζ/CD19t의 완전한 아미노산 서열이 도 9에 도시된다. 전체 서열 (서열식별번호: 1)은 22개의 아미노산 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 2), 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y, 볼드체로 표시됨); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q 포함, 볼드체로 표시됨); 22개의 아미노산 CD4 막횡단 서열 (서열식별번호: 5); 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6); 3개의 아미노산 Gly 링커; 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7); 24개의 아미노산 T2A 서열 (서열식별번호: 8); 및 323개의 아미노산 CD19t 서열 (서열식별번호: 9)을 포함한다.
성숙 키메라 항원 수용체 서열 (서열식별번호: 10)은 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y, 볼드체로 표시됨); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q 포함, 볼드체로 표시됨); 22개의 아미노산 CD4 서열 (서열식별번호: 5); 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6); 3개의 아미노산 Gly 링커; 및 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 이러한 CAR 서열 (서열식별번호: 10) 내에는 IL-13/IgG4/CD4t/41-BB 서열 (서열식별번호: 11)이 존재하고, 이는 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y, 볼드체로 표시됨); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q 포함, 볼드체로 표시됨); 22개의 아미노산 CD4 서열 (서열식별번호: 5); 및 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6)을 포함한다. IL13/IgG4/CD4t/4-1BB 서열 (서열식별번호: 11)은 링커 예컨대 Gly Gly Gly 링커에 의해 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7)에 연결될 수 있다. CAR 서열 (서열식별번호: 10)은 22개의 아미노산 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 2)가 선행할 수 있다.
도 10은 IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (서열식별번호: 12) 및 CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (서열식별번호: 13)의 서열의 비교를 도시한다.
실시예 8: IL13Rα2를 표적화하는 추가의 CAR의 아미노산 서열
도 11-18은 IL13Rα2에 대해 지시된 추가의 CAR의 아미노산 서열을 도시한다. 특정 세포내 도메인 사이에 위치한 GlyGlyGly 스페이서를 제외하고 각각의 경우에 다양한 도메인이 라벨링된다. 각각은 Glu에서 Tyr를 포함하는 인간 IL13 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y, 강조표시됨)을 포함한다. 이들 CAR을 발현시키는데 사용되는 발현 벡터에서, 발현된 아미노산 서열은 24개의 아미노산 T2A 서열 (서열식별번호: 8); 및 323개의 아미노산 CD19t 서열 (서열식별번호: 9)을 포함할 수 있고, 이는 CAR-발현 세포의 표면 상에서의 말단절단된 CD19 서열의 협응 발현을 가능하게 한다.
인간 IL13(E13Y) 도메인, CD28 tm 도메인, CD28gg 공동자극 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 도메인 CAR 백본을 포함하고, HL (22개의 아미노산) 스페이서, CD8 힌지 (48개의 아미노산) 스페이서, IgG4-HL-CH3 (129개의 아미노산) 스페이서 또는 IgG4(EQ) (229개의 아미노산) 스페이서를 포함하는 CAR 패널을, 72-시간 공동 배양 검정에서 평가되는 바와 같은, 그것이 IL13Ra2-특이적 사멸을 매개하는 능력에 대해 시험하였다. 이러한 시스템에서 불량한 CAR 발현을 갖는 것으로 보이는 HL (22개의 아미노산)을 제외하고, 모두 활성이었다.
실시예 9: 2종의 HER2-CAR의 구조
본원에 기재된 HER2 scFv를 포함하는 1종의 CAR을 Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-CD19t로 지칭한다. 이러한 CAR는 HER2에 대해 표적화된 scFv; Fc 수용체 (FcR)에 의한 결합을 감소시키는 방식으로 CH2 영역 내 2개의 부위에서 돌연변이된 (L235E; N297Q) IgG4 Fc 영역; CD28 막횡단 도메인, CD28 공동자극 도메인, 및 CD3ζ 활성화 도메인을 포함한 다양한 중요한 특색을 포함한다. 도 20은 CAR 발현을 모니터링하는데 사용되는 말단절단된 CD19 서열, 및 CAR이 말단절단된 CD19 서열의 융합 없이 생산되게 하는 T2A 리보솜 스킵 서열의 서열을 포함하는, 이러한 CAR의 아미노산 서열을 제시한다. 도 21에 제시된 바와 같이, 미성숙 CAR은 GMCSFR 신호 펩티드, HER2 scFv, 스페이서로서 작용하는 IgG4, CD8 막횡단 도메인, LL에서 GG 서열로의 변경을 포함하는 4-IBB 공동자극 도메인, 3개의 Gly 서열, CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 전사체는 또한 CAR 단백질 서열의 일부가 아닌 T2A 리보솜 서열 및 말단절단된 CD19 서열을 코딩한다. 성숙 CAR은 미성숙 CAR과 동일하지만, GMCSF 신호 펩티드가 결여되어 있다.
실시예 10: HER2에 대해 표적화된 CAR의 발현
도 22A는 도 20 및 도 21에 도시된 2종의 HER2-특이적 CAR 구축물의 개략적 다이어그램이다. HER2(EQ)28ζ에서, scFv는 변형된 IgG4 Fc 링커 (이중 돌연변이체, L235E; N297Q)에 의해 막에 테더링되고, CD28 막횡단 도메인, 세포내 CD28 공동자극 도메인 및 세포용해 CD3ζ 도메인을 함유한다. T2A 스킵 서열은 CAR을 세포 추적에 사용되는 말단절단된 CD19 (CD19t) 단백질로부터 분리한다. HER2(EQ)BBζ는 공동자극 도메인이 CD28이 아닌 4-1BB이고 막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인이 아닌 CD8 막횡단 도메인인 것을 제외하고 유사하다. 인간 중심 기억 (TCM) 세포를 HER2(EQ)28ζ 또는 HER2(EQ)BBζ를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 도 22B는 인간 TCM 표면 표현형의 대표적인 FACS 데이터를 도시한다. 도 22C는 HER2(EQ)28ζ 또는 HER2(EQ)BBζ를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 TCM에서의 CD19 및 단백질 L 발현에 대한 검정 결과를 도시한다. 이들 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, CD19 발현에 의해 평가된 바와 같은 형질감염 효율은 둘 다의 CAR에 대해 유사하였다. 그러나, 단백질 L 발현은 HER2(EQ)28ζ의 경우보다 HER2(EQ)BBζ의 경우에 더 낮았고, 이는 HER2(EQ)BBζ CAR이 HER2(EQ)BBζ보다 덜 안정하다는 것을 시사한다. 세포 확장의 분석 (도 22D)은 어떠한 CAR도 T 세포 확장을 방해하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 11: HER2 표적화된 CAR의 시험관내 특징화
HER2-음성 세포주 (LCL 림프종, MDA-MB-468, U87 신경교종), 낮은-HER2 발현 세포주 (MDA-MB-361, 231BR) 및 높은-HER2 발현 세포주 (SKBR3, BT474, BBM1)를 포함한 다양한 유방암 세포주를 사용하여 HER2(EQ)28ζ 및 HER2(EQ)BBζ를 특징화하였다. 도 23A는 각각의 이들 세포주의 HER2 발현 수준을 도시한다. 유동 세포측정법 (CAR+ T 세포에 대해 게이팅됨)을 사용하여 모의 (비형질도입됨), HER2(EQ)28ζ 또는 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포에서 MDA-MB-361 종양 세포 (낮은 HER2 발현) 또는 BBM1 종양 세포 (높은 HER2 발현)와의 5시간 공동-배양 후 CD107a 탈과립화 및 IFNγ 생산을 특징화하였다. 이러한 분석의 결과를 도 23B에 제시한다. 다른 유방암 세포주를 사용하여 유사한 연구를 수행하였고, 결과를 도 23C에 요약한다. 재조합 HER2 단백질 또는 종양 표적과의 24시간 배양 후 HER2-CAR T 세포에 의한 IFNγ 생산을 ELISA에 의해 측정하였고, 이러한 분석의 결과를 도 23D에 제시한다.
실시예 12: HER2 표적화된 CAR의 시험관내 항종양 활성
유동 세포측정법을 사용하여, 모의 (비형질도입됨), HER2(EQ)28ζ 또는 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포와 종양 표적의 72시간 공동-배양 후 종양 세포 사멸을 평가하였다. 이러한 분석의 결과를 도 24A에 제시한다. HER2-음성 MDA-MB-468 또는 HER2-양성 BBM1 세포와의 72시간 공동-배양 후 총 CAR T 세포에서의 PD-1 및 LAG-3 유도를 측정하고, 이러한 분석의 결과를 도 24B에 제시한다. HER2-음성 (LCL 림프종, MDA-MB-468, U87 신경교종), 낮은-HER2 발현 (MDA-MB-361, 231BR) 또는 높은-HER2 발현 (SKBR3, BT474, BBM1)인 종양 표적과의 72시간 공동-배양 후 CD8+ CAR T 세포에서의 PD-1 유도를 측정하고, 이러한 분석의 결과를 도 24C에 제시한다. 이들 연구는 HER2(EQ)BBζ가 HER2(EQ)28ζ보다 낮은 PD-1 유도를 발생시킨다는 것을 시사한다. 0.25:1 내지 2:1 범위의 이펙터:종양 (E:T) 비에 의한 종양 세포 사멸을 HER2(EQ)28ζ 또는 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포 둘 다에 대해 측정하였다. 이러한 분석의 결과를 도 24D에 제시하며, 이는 HER2(EQ)28ζ 및 HER2(EQ)BBζ 둘 다가 시험관내 종양 세포 사멸에 효과적이라는 것을 보여준다. MDA-MB-468 또는 BBM1 세포와의 72시간 공동-배양 후 HER2-CAR T 세포의 CFSE 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 이러한 분석의 결과를 도 24E에 제시하며, 이는 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포가 HER2(EQ)28ζ CAR T 세포보다 더 증식한다는 것을 보여준다.
실시예 13: HER2 표적화된 CAR의 생체내 항종양 활성
종양내로 전달된 HER2 CAR T 세포의 활성을 환자-유래 유방-뇌 전이 모델에서 평가하였다. 도 25A-25C는 종양의 H&E 염색이다. 마우스를 모의 (비형질도입됨) 또는 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포를 사용하여 종양 내로의 직접 주사에 의해 치료하였다. 도 25D-25F는 종양의 광학 영상화의 결과를 도시하고, 도 25G-25I는 종양 주사 후 제3일, 제8일 또는 제14일에 국부 치료된 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선이다. 이들 연구는 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포가 종양 내로 직접 주사된 경우에 강력한 생체내 항종양 효능을 갖는다는 것을 보여준다.
유방-뇌 전이의 인간 이종이식편 모델에서 항종양 효능을 평가하기 위해, BBM1 세포 (0.2M) 또는 BT474 (0.15M)를 NSG 마우스에 두개내로 주사하였다. 종양 주사 후 제8일에, HER2(EQ)28ζ 또는 HER2(EQ)BBζ, 또는 모의 (비형질도입됨) T 세포 (1M)를 종양내로 주사하였다. BBM1 (도 26A) 및 BT474 (도 26B) 종양을 루시페라제-기반 광학 영상화에 의해 모니터링하였다. 카플란 마이어 곡선을 도 26C 및 도 26D에 제시한다.
유방-뇌 전이의 인간 환자-유래 동소 이종이식편 모델을 사용하여 또한 HER2(EQ)28ζ 및 HER2(EQ)BBζ CAR T 세포를 평가하였다. 도 27A는 BBM1 세포 (0.2M)의 정위 주사에 의한 종양 이식, 및 뇌실내 T 세포 전달의 영역을 예시한다. 종양의 염색을 도 27B에 도시한다. 종양 주사 후 제14일에, HER2(EQ)28ζ, HER2(EQ)BBζ, 또는 모의 (비형질도입됨) T 세포 (0.5M)를 종양내로 주사하였다. 종양 성장을 루시페라제-기반 광학 영상화에 의해 모니터링하였다. 도 27C는 각각의 치료 그룹에 대한 유동 평균을 제시하고, 도 27D는 각각의 치료 그룹에 대한 카플란 마이어 생존 곡선을 제시한다.
실시예 14: IL13Ra2에 대해 표적화된 CAR을 발현하는 TCM의 두개내 및 종양내 투여의 비교
2가지 상이한 두개내 (ic) 전달 경로, 종양내 (ict) 및 뇌실내 (icv)를, 교모세포종 (GBM)의 임상 치료를 위해 제안되는 바와 같은 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 렌티바이러스 벡터로 형질도입되고 시험관내 확장된 TCM-풍부화 세포주로부터 생성된 CAR T 세포의 생체내 안전성, 트래픽킹 및 효능에 대해, 교모세포종의 뮤린 모델에서 평가하였다. ict 또는 icv로 투여된 이들 세포의 생체내 안전성 및 기능적 효력을 반딧불이 루시페라제 (ffLuc) 리포터 유전자를 발현하도록 조작된 IL13Rα2+ 원발성 낮은-계대 GBM 종양 구체 세포주 PBT030-2를 사용하여 면역결핍 NSG 마우스에서 검사하였다.
클리니MACS™/오토MACS(AutoMACS) 선택에 의해 PBMC로부터 풍부화된 TCM 세포주를 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 렌티바이러스로 렌티-형질도입하고, 확장시킨 다음, 상기 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 동결보존하였다. 새롭게 해동된 CAR T 세포를 ict 또는 icv 투여한 다음, 잠재적 독성, 다초점성 GBM 종양으로 이동하는 그의 능력 및 ic 생착된 IL13Rα2+ GBM 세포주 PBT030-2 세포의 생체내 성장을 제어하는데 있어서의 그의 효력에 대해 평가하였다. 일반적 독성을 평가하기 위해, 체중 및 각성을 포함한 전체적 건강에 대해 매일 마우스를 관찰하였다. 제노겐 영상화에 의해 측정되는 바와 같은 종양 부담을 검사하고; 마우스의 하위세트에 대해 T 세포 동원/종양의 침윤을 검출하기 위한 면역조직화학 (IHC)을 또한 수행하였다.
수컷 NSG 마우스 (10-12주령)에게 제0일에 우 및 좌 반대측 반구 둘 다에 1 x 105개 ffLuc+ PBT030-2 세포를 ic 정위 주사하고, 6일 동안 생착되게 하였다. 이어서 그룹당 동등한 종양 크기 분포를 위해 제노겐 영상화에 의해 결정된 바와 같은 종양 크기에 기초하여 마우스를 그룹화하였다. 이어서 마우스 그룹을 비치료로 두거나 (n = 4), 또는 1 x 106개 CAR+ IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM으로 ict (우 반구, n = 8) 또는 icv (n = 8) 치료하였다 (도 28). PBT030-2 종양 성장을 제노겐 영상화 및 ffLuc 유동 (광자/초)의 정량화에 의해 시간의 경과에 따라 모니터링하였다. 상이한 시점에, 각각의 그룹으로부터의 마우스를 안락사시키고, 그의 뇌를 수거하고, 파라핀 포매하고, 면역조직화학 (IHC)을 수행하여 인간 CD3-발현 세포 (즉, 인간 T 세포)의 존재를 평가하였다. 구체적으로, T 세포 투여 1주 후 (실험 제13일)에 각각의 CAR T 세포 치료 그룹으로부터 3마리의 마우스를 안락사시켰고, 따라서 이들 마우스는 도 29의 제노겐 영상화 분석에 포함되지 않으며; 이어서 마우스의 각각의 그룹에서 2마리의 마우스를 T 세포 투여 2주 후 (실험 제21일)에 안락사시켰다.
이는 생존 연구가 아니고, 따라서 뇌 내 T 세포 트래픽킹을 평가하기 위해 특정 시점에 마우스를 모두 안락사시켰고 (하기 기재됨), 한편 곤란 또는 일반적 독성의 임의의 명백한 징후에 대해 마우스를 매일 모니터링하였다. ict 또는 icv 요법으로 치료된 마우스는 어떠한 체중 감소도 나타내지 않았고, 실험 내내 활발하고, 각성상태이며, 반응성이었다. 따라서, T 세포 투여의 경로에 관계없이, 임의의 요법-연관 유해 효과의 어떠한 징후도 존재하지 않았다.
도 29A-C에 제시된 바와 같이, IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM의 ict 전달은 PBT030-2 종양에 대해 예상되는 바와 같은 강건한 항종양 활성을 나타내었다. 그러나, IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM의 icv 전달은 ict 투여에 의해 관찰된 것보다 ic 생착된 PBT030-2 종양에 대해, 특히 반대측 (좌) 반구 내 종양 병변에 대해 더 큰 치료 이익을 제공하는 것으로 보였다.
T 세포가 종양 부위로 이동하는 능력에 투여 경로가 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, T 세포 투여 1 및 2주 후 각각의 그룹으로부터의 마우스의 뇌에 대해 CD3+ T 세포에 대한 IHC 분석을 수행하였다. 도 30에 제시된 바와 같이, ict 또는 icv 투여된 T 세포를 제공받은 마우스 내 좌 및 우 종양 부위 둘 다에서 인간 CD3+ T 세포가 발견되었다. 이들 데이터는 T 세포 투여 1주 후에는 각 그룹에서 3마리의 마우스, 및 2주 후에는 각 그룹에서 2마리의 마우스를 대표한다.
이러한 연구는 T 세포의 종양내 및 뇌실내 투여 둘 다가 이러한 NSG 마우스 모델에서 잘-용인된다는 것을 입증한다. 또한, 생체내 다초점성 항종양 효능 및 종양 부위에서의 T 세포의 IHC 검출이 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 벡터로 형질도입된 TCM 적격 작업 세포의 ict 및 icv 전달 둘 다에 의해 관찰될 수 있다. 이러한 연구는 추가로, icv 전달된 T 세포가 ict 전달된 T 세포보다 더 큰 효능을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 15: 교모세포종의 치료를 위해 IL-13Rα2 CAR T 세포를 평가하는 1상 임상 시험
본 실시예는 재발성 IL13Rα2+ GBM을 갖는 환자에서 자가 IL13BBζ Tcm의 매주 두개내 주입의 안전성, 실행가능성 및 생물활성을 평가한 임상 시험의 초기 발견을 기재한다. 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 등록된 환자는 IL13BBζ+ Tcm 제조와 공동으로, 백혈구분리반출술을 거쳐 자가 PBMC를 수집하고, 종양 생검 또는 절제가 저장소/카테터 장치의 배치와 함께 수행된다. 기준선 MR 및 PET 영상화 및 수술로부터의 회복 후, 환자를 IL13BBζ+ Tcm의 3회-매주 두개내 주입에 이은 독성 및 질환 평가를 위한 1주 휴식으로 이루어진 4-주 치료 요법으로 치료한다. 3명의 절제 환자의 이러한 제1 낮은 용량 코호트에 대한 지금까지의 결과는 외과적 절제 후 IL13BBζ Tcm의 국부 전달은 관찰되는 요법에 기인한 어떠한 등급 3 이상의 독성없이 안전하고 잘-용인된다는 것을 시사하고, 중요하게는, CAR T 세포 투여 후 항종양 활성에 대한 초기 증거를 입증한다. 샘플이 입수가능했던 모든 환자의 경우에, CAR T 세포가 유동 세포측정법에 의해 종양 낭액 또는 뇌 척수액 (CSF)에서 치료 후 최소 7일 동안 검출되었다. 1명의 특히 관심 환자는 척추 내 1개의 전이 부위를 포함한 재발성 다초점성 GBM 및 광범위한 연수막 질환을 나타내었다. 이러한 환자를 초기에, 후부 측두-후두 영역 내 가장 큰 재발성 종양 병소의 절제 공동 내로 IL13BBζ Tcm을 6회 국부 주입하는 프로토콜에 따라 치료하였다. 고무적으로, 이러한 CAR T 세포 주사 부위는 7-주를 초과하는 동안 질환 재발의 증거 없이 안정하게 유지되었지만, CAR T 세포 주사 부위에서 떨어진 다른 질환 병소는 계속 진행되었다. 이어서 이러한 환자를, 임의의 다른 치료적 개입 없이, 동정적 사용 프로토콜에 따라 IL13BBζ Tcm의 5회의 매주 뇌실내 주입으로 치료하였다. 최종 뇌실내 CAR T 세포 주입 1주 후, 모든 두개내 및 척추 종양이 퇴행하여 75 부피%를 초과하여 대부분 감소하였고, 이러한 환자는 CAR T 세포 치료를 시작하고 4개월 후에 임상적으로 안정하게 유지되었다.
본 연구에 사용된 CAR, IL13(EQ)BBζ는 상기 기재된다. CD19t 마커를 포함하는 미성숙 CAR의 서열이 도 9에 도시된다. 전체 미성숙 서열 (서열식별번호: 1)은 22개의 아미노산 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 2), 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y, 볼드체로 표시됨); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q 포함, 볼드체로 표시됨); 22개의 아미노산 CD4 막횡단 서열 (서열식별번호: 5); 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6); 3개의 아미노산 Gly 링커; 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7); 24개의 아미노산 T2A 서열 (서열식별번호: 8); 및 323개의 아미노산 CD19t 서열 (서열식별번호: 9)을 포함한다.
각각의 환자로부터의 자가 세포를 사용하여 CD8+ CD4+ TCM 세포를 제조한 다음, 상기 기재된, IL13(EQ)BBζ를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 간략하게, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 TCM을 풍부화하여 클리니MACS® 장치를 사용하여 CD45RO+/CD62L+ TCM을 면역자기적으로 선택하였다. 이들 세포를 항-CD3/CD28 디날 비드로 활성화하고, IL13(EQ)BBζ CAR의 발현을 지시하는 SIN 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 활성화/유전자 변형된 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM 세포를 IL-2/IL-15로 시험관내 확장시킨 다음 동결보존하였다.
둘 다 재발성/불응성 GBM을 앓고 있는 2명의 환자의 치료를 하기 기재한다. CAR T 세포의 공동내 투여를 릭함 카테터를 통해 약 5-10분에 걸쳐 수동으로 수행한 다음, 대류 증강 전달 (CED)에 의해 0.5 ml/시간으로 전달되는 최대 1.0 mL 보존제-무함유 생리-염수 (PFNS) 플러싱을 수행하였다. CAR T 세포의 뇌실내 투여는 측뇌실에 배치된 릭함 카테터를 통해 대략 5-10분에 걸쳐 수동으로 수행하였다. 이에 이어 수동 푸시 기술을 통해 5-10분에 걸쳐 전달되는 최대 0.5 mL 보존제-무함유 생리-염수 (PFNS) 플러싱을 수행하였다. PFNS 플러싱은 투여 라인을 깨끗하게 하고 나머지 CAR T 세포를 카테터를 통해 푸시하기 위해 의도된다.
CAR T 세포 제조 및 치료의 시간 경과를 도 31에 도시한다. 제조 과정과 공동으로, 연구 참가자는 그의 종양(들)의 절제에 이어, 릭함 카테터의 배치 및 기준선 영상화를 거친다.
환자 UPN097을 종양 절제를 거쳐, 사이클 1에서 2 x 106개 세포 및 사이클 2에서 10 x 106개 세포로 치료하였다. 사이클 1 및 사이클 2 둘 다에서, 절제에 의해 남겨진 공동에 세포를 투여하였다. 제2 사이클 후 환자 UPN097은 신속한 종양 진행으로 인해 연구에서 배제하였다.
환자 UPN109는 사이클 1에서 2 x 106개 세포 및 사이클 2 및 3에서 10 x 106개 세포로 치료하였다. 휴식 기간 후, 환자 UPN109를 사이클 4, 5 및 6에서 10 x 106개 세포로 치료하였다. 사이클 1-6에서, 세포를 투여하였다. 사이클 7에서, 환자를 2 x 106개 세포로 치료하였다. 사이클 8 및 9에서, 환자를 10 x 106개 세포로 치료하였다. 사이클 7-10에서 투여는 뇌실내였다.
도 32A는 CD19에 의해 모니터링된 바와 같은 CAR T 세포 지속성의 분석을 나타낸다. 이러한 분석은 사이클 2의 8일 후의 양호한 T 세포 지속성을 보여준다. 도 32B는 세포 상에서의 IL13Rα2 발현에 의해 모니터링된 바와 같은 GBM 세포의 감소된 존재를 보여준다.
도 33A 및 도 33B는 종양내 투여에 사용된 카테터 영역에서의 환자 UPN097로부터의 영상화 결과를 도시한다. 도 33A에서 CD3+ 또는 CD8+ T 세포는 치료전 거의 존재하지 않는다는 것을 볼 수 있다. 좌 전두 종양 공동 벽에서 채취한 치료-후 제16일의 샘플인 도 33B는 대형 괴사성 종양 구역 및 CD3+ 및 CD8+ 세포의 유의한 존재를 보여준다.
도 34A-D에 제시된 바와 같이, 치료의 2 사이클에 걸쳐 IFN-감마 (Th1 시토카인)의 증가가 존재하였지만, IL-13 (Th2 시토카인)의 수준은 유의하게 변하지 않았다 (도 34A 및 도 34B). 종양 관련 시토카인인 IL-6은 사이클 1 동안 감소되었고, 사이클 2 동안 보다 낮은 수준에서 유지되었다 (도 34C). 또 다른 종양 관련 시토카인인 IL-8은 사이클 1 동안 감소되었지만, 사이클 2 동안 그의 사이클 1-전의 수준으로 증가되었다 (도 34D).
환자 UPN109는 척추 내 1개의 전이 부위를 포함한 재발성 다초점성 GBM 및 광범위한 연수막 질환을 나타내었다. 상기 기재된 바와 같이, 이러한 환자를 가장 큰 재발성 종양 병소의 절제 공동 내로 IL13BBζ Tcm을 6회 국부 주입하여 치료하였다. CAR T 세포 주사 부위는 7-주를 초과하는 동안 질환 재발의 증거 없이 안정하게 유지되었지만, CAR T 세포 주사 부위에서 떨어진 다른 질환 병소는 계속 진행되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이어서 이러한 환자에게, 상기 기재된 바와 같이 IL13BBζ Tcm의 5회 매주 뇌실내 주입을 제공하였다. 도 35A-B는 횡축 뇌 절편 (도 35A) 및 시상면 뇌 절편 (도 35B)의 MRI 및/또는 PET 영상을 나타낸다. 도 35C는 뇌실내 요법 전 (좌) 및 요법 완료 1주 후 (우)의 척추의 횡축 (상부) 및 정면 (하부) 절편을 나타내며, 종양 병변 부위는 각각의 영상에서 적색 화살표로 나타내어진다.
실시예 16: 뇌실내 투여에 대한 사례 보고
50세 남성은 대발작을 나타낸 후, 처음에 우 측두엽에 저-등급 뇌 종양을 갖는 것으로 진단받았다. 4개월의 모니터링 후, 이러한 우 측두 종양은 MRI에 의해 증가된 증강을 디스플레이하였고, 환자는 종양 절제를 거쳐 WHO 등급 IV 신경교종 (GBM)의 진단을 확인받았다. 이어서 환자에게 테모졸로미드 (140 mg 매일)와 공동으로 표준 관리 보조 양성자 방사선을 59.4 코발트 Gy 등가의 총 용량으로 제공한 다음, 3개월 동안 노보큐어(Novocure) 장치 (노보TTF-100A)의 병행 사용과 함께 4-사이클의 테모졸로미드를 제공하였다. 원발성 종양 절제 6개월 후, PET 및 MRI 영상은 질환 진행의 증거를 나타내었다.
이어서 IHC, H 점수 100에 의해 원발성 우 측두엽 종양에서의 IL13Rα2-발현의 확인 후 (도 37) 환자를 자가 IL13Rα2-표적화 CAR T 세포로 치료하였다 (도 36). 이어서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 백혈구분리반출술에 의해 수집한 다음, 이전에 기재된 바와 같은 2-단계 고갈 선택 절차를 통해 CD4+ CD8+ TCM을 풍부화하였다. IL13BBζ TCM 제조 동안, 환자를 섬유모세포 성장 인자 억제제를 평가하는 별개의 임상 프로토콜 (NCT01975701)로 치료하였고, 요법에도 불구하고 진행되어 두통, 혼란 및 방향감각상실의 증상이 증가하였다. 추가적으로, T 세포 주사 전 환자에서 스테로이드를 점감하였다.
원발성 종양 절제 10개월 후, 환자는 5개의 확인된 진행성 GBM 병변 중 3개의 또 다른 외과적 절제를 거쳤고 (도 38), 이는 저장소/카테터 장치가 배치된 우 후부 측두-후두 영역 내의 가장 큰 병변 (T1), 및 우 전두엽 내의 2개의 병변 (T2, T3)을 포함한다. 좌 측두 구역 내의 2개의 추가의 종양은 외과적으로 제거하지 않았다 (T4,T5). 외과적 절제 6일 후, 환자에게 2종의 4-주 치료 요법을 제공하였고, 각각은 IL13BBζ TCM의 3회의 매주 공동내 (ICT) 주입에 이어 독성 평가 및 질환 평가를 위한 1주로 이루어졌다. 이러한 환자를 낮은 용량의 2 x 106개 CAR+ T 세포로 시작하고 이어서 10 x 106개 CAR+ T 세포를 5회 주입하여 치료하였다 (도 39). 이들 6회의 ICT 주입 후, 동정적 사용 프로토콜 하에, 우측 뇌실에 제2 카테터를 배치하여, 환자가 다시 낮은 용량의 2 x 106개 CAR T 세포로 시작하고 이어서 10 x 106개 CAR T 세포를 4회 주입하는 IL13BBζ TCM의 추가의 5회 뇌실안 (ICV) 치료 사이클을 제공받게 하였다 (도 40).
제한된 치료 생성물로 인해 오직 5회의 ICV 주입 사이클이 실현가능하였다. 전체적으로, 환자는 94 x 106개 CAR+ T 세포의 총 용량의 11회 세포 주입을 제공받았다. 치료 과정은 제3 사이클 후마다 및 최종 2회의 ICV 주입 후에 행한 독성 및 질환 평가 (즉, MRI 및 PET 영상화)를 위한 평가 주와 함께 15-주를 포괄하였다. 이러한 CAR T 세포 치료 과정 동안 환자는 어떠한 다른 치료적 개입도 받지 않았고, 11회의 주입 사이클을 포괄하여 190일 평가 기간까지의 발견을 여기서 보고한다. 후속해서, 제2 IL13BBζ TCM 생성물을 제조하여, 제192일에 시작하여, 이러한 환자에게 대략 3주마다 제2의 제조된 생성물의 ICV 주입을 계속 제공하였다.
실시예 17: 연구 설계
동정적 사용 프로토콜을 포함한 이들 연구는 임상시험 심사 위원회에 의해 승인받았고, 환자는 사전 동의서를 제공하였다. 적격성은 현재 재발성인 IL13Rα2+ 등급 IV 신경교종의 이전의 조직학적으로-확인된 진단, 카르노프스키 수행 상태 (KPS) > 60인 > 18세 연령, 적절한 심폐 기능, 및 > 4주의 생존 예상을 포함하였다. 환자는 적어도 등록 12주 전에 초기 방사선 요법을 완료하여야 하고, 임의의 다른 활성 악성종양, 감염 또는 병발 질병을 갖지 않거나 또는 다른 임상시험용 작용제를 제공받지 않거나 또는 T 세포 요법 동안 2 mg TID (3x/일) 초과의 덱사메타손을 필요로 하지 않아야 한다.
이러한 환자를 초기에 본 발명자들의 진행 중인 I상 연구 (NCT02208362) 하에 치료하여, 재발성/불응성 IL13Rα2+ 고-등급 신경교종 (WHO 등급 III 및 IV)을 갖는 것으로 진단된 환자에서의 자가 IL13Rα2-표적화 CAR T 세포 (IL13BBζ TCM)의 매주 두개내 주입의 안전성 및 실행가능성을 평가하였다. 이는 T 세포가 종양 내로 (층 1 = 종양내) 또는 종양 절제 공동 내로 (층 2 = 공동내) 직접 투여되는 2개 부문의 연구이다. 6회의 공동내 (ICT) 주입 사이클을 완료한 후, 이러한 환자를 이어서 IL13BBζ TCM의 뇌실안 (ICV) 전달을 가능하게 하는 별개의 동정적 사용 프로토콜 하에 치료하였다.
실시예 18: 세포 생성물 제조 및 주입
4-1BB 공동자극, IL13Rα2-표적화 CAR, IL13BBζ를 코딩하는 렌티바이러스 벡터가 본원에 상술되어 있다. 간략하게, 코돈 최적화된 CAR 서열은 IL13Rα1에의 잠재적 결합을 감소시키기 위해 단일 부위에서 돌연변이된 (E13Y) 막-테더링된 인간 IL-13 리간드, Fc 수용체-매개 인식을 방지하는 2개의 돌연변이 (L235E; N297Q)를 함유하는 인간 IgG4 Fc 스페이서, 인간 CD4 막횡단 도메인, 인간 공동자극 4-1BB 세포질 신호전달 도메인, 및 인간 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 함유한다. 이어서 T2A 리보솜 스킵 서열은 이러한 IL13BBζ CAR 서열을 불활성, 비면역원성 세포 표면 마커인 말단절단된 인간 CD19 서열 (CD19t)로부터 분리시킨다.
IL13BBζ TCM 제조를 위해, 백혈구분리반출술일에, 피콜-파크 (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 상에서의 밀도 구배 원심분리에 이은 PBS/EDTA 중 2회의 세척에 의해 PBMC를 단리하였다. 이어서 PBMC를 PBS 중에서 1회 세척하고, 10% 소 태아 혈청 (FCS) (하이클론(Hyclone))을 함유하는 엑스 비보15(X Vivo15) 배지 (바이오 휘태커(Bio Whittaker)) 중에 재현탁시키고, 300 cc 전송 백으로 옮기고, 3-D 회전기 상에서 밤새 실온 (RT)에서 저장하였다. 다음날, 5x109개 PBMC를 300 cc 전송 백에서 임상 등급 항-CD14 (1.25 mL), 항-CD25 (2.5 mL) 및 항-CD45RA (2.5 mL) 마이크로비드 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))와 함께, 10% FCS를 함유하는 엑스 비보15 중 RT에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 클리니MACS™ 고갈 모드를 사용하여 제조업체의 지침 (밀테니 바이오텍)에 따라 CD14+, CD25+, 및 CD45RA+ 세포를 즉시 고갈시켰다. 원심분리 후, 비표지된 음성 세포 분획을 0.5% 인간 혈청 알부민 (HSA) (씨에스엘 베링거(CSL Behring))을 함유하는 클리니MACS™ PBS/EDTA 완충제 (밀테니 바이오텍) 중에 재현탁시키고, 이어서 RT에서 30분 동안 임상 등급 비오티닐화된-DREG56 mAb (COHNMC CBG) 0.6 mL를 사용하여 표지하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 0.5% HSA를 함유하는 클리니MACS™ PBS/EDTA 최종 부피 100 mL 중에 재현탁시키고, 새로운 300 cc 전송 백으로 옮겼다. 1.25 mL 항-비오틴 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)와 함께 30분 인큐베이션 후, CD62L+ 분획 (TCM)을 클리니MACS™ 상에서 제조업체의 지침에 따라 양성 선택에 의해 정제하고, 10% FCS를 함유하는 엑스 비보15 중에 재현탁시켰다.
2시간의 풍부화 내에, 26.9 x 106개 TCM을 GMP 디나비즈(Dynabeads)® 인간 T 확장자 CD3/CD28 (인비트로젠(Invitrogen))로 1:3 비 (T 세포:비드)로 자극하고, 37℃, 5% CO2에서, 배양 랙 상에 수평 위치로 배치되는 32 뷰라이프(Vuelife) 조직 배양 백 (AFC)에서 5μg/mL 프로타민 술페이트 (에이피피 파마슈티칼(APP Pharmaceutical)), 50 U/mL rhIL-2 및 0.5 ng/mL rhIL-15와 함께 10% FCS를 함유하는 5.5 mL 엑스 비보15 중 임상 등급 IL13BBζ-T2A-CD19t_epHIV7로 MOI 0.3으로 형질도입하였다. 이어서 배양의 월요일, 수요일 및 금요일마다 시토카인을 보충하면서 (최종 농도 50 U/mL rhIL-2 및 0.5 ng/mL rhIL-15) 4 x 105개 내지 2 x 106개 생존 세포/mL의 세포 밀도를 유지하는데 필요한 엑스-비보15 10% FCS를 첨가하여 배양을 유지시켰다. 배양 부피에 기초하여, T 세포를 730 뷰라이프 백 (AFC)으로 옮겼다. 렌티바이러스 형질도입 7일 후, 디날 클린엑스 비보(Dynal ClinEx Vivo) 자기 입자 농축기 백 자석을 사용하여 CD3/CD28 디나비즈를 제거하고, 비드-무함유 T 세포를 새로운 730 뷰라이프 백으로 배수하였다. 구아바(Guava) PCA에 의해 결정되는 바와 같이 대략 4.53 x 108개 세포가 생성될 때까지 배양물을 증식시켰고, 이때 배양물을 수거하고, 2% HSA를 함유하는 이소라이트 (브라운(Braun)) 중에서 세척한 다음, 미스터. 프로스티(Mr. Frosty) (날진(Nalgene)) 및 휴대용 제어 속도 동결기 시스템 (커스텀 바이오제닉스(Custom Biogenics))을 사용한 동결보존을 위해 크리오스토르 CS5 (바이오라이프 솔루션즈(BioLife Solutions)) 중에 대략 1.3 x 107개 세포/mL로 재현탁시켰다. 품질 관리 시험은 생존율, 효력 (CD19t 발현), 아이덴티티 (CD3 발현), 트랜스진 카피수 (WPRE qPCR), 복제 적격 바이러스 시험 (VSV-G qPCR 및 인디애나 대학에서의 형식적 RCL 시험), 잔류 비드 카운트, 및 멸균을 포함하였다.
상기 제시된 바와 같이, T2A 리보솜 스킵 서열12는 이어서 이러한 IL13BBζ 서열을 세포 형질도입을 마킹하는 불활성, 비면역원성 세포 표면 마커인 CD19t로부터 분리시킨다 (도 39A). 이러한 T2A 연결은 단일 전사체로부터 IL13BBζ 및 CD19t 둘 다의 협응 발현을 발생시킨다.
CD62L+ CD45RA- CD4+ CD8+ 중심 기억 T 세포 (TCM)의 면역자기적 풍부화를 위한 제조 방법, 렌티바이러스 형질도입 및 생체외 확장이 또한 본원에 상세하게 기재된다. 과정 말미 (EOP)에 동결보존된 IL13BBζ TCM 생성물은 임상 프로토콜에 따라 품질 관리 출시 시험을 거친다. 각각의 주입을 위해, T 세포를 해동하고, 세척하고, 2% 인간 혈청 알부민 (HSA)이 존재하는 제약 보존제-무함유 생리 염수 (PFNS) 중 0.5 mL 최종 부피로 재제제화하였다. 21 게이지 버터플라이 바늘을 사용하여 릭함 저장소 내로 세포를 수동 주사하여 5-10분에 걸쳐 0.5 mL 부피를 전달한 다음, 대류 증강 전달 (CED)에 의해 시간당 0.5 mL로 전달되는 최대 1 mL PFNS 플러싱을 행하였다.
실시예 19: 임상 영상화
뇌 및 척추의 가돌리늄-후 T1 강조 MRI 서열을 지멘스 비로 3(Siemens Viro 3) 테슬라 스캐너 상에서 획득하였다. 멀티한스(Multihance)의 투여 후에 수득된 축방향 T1 MPR 강조 영상에서 병변을 측정하였다. 지이 디스커버리(GE Discovery) DST HP60 PET-CT 스캐너 (70 cm 축방향 영상 영역, 슬라이스 두께 3.75mm)를 사용하여 18-F-플루오로데옥시글루코스 (18-F-FDG)에 의해 영상화를 수행하였다. 비탈(Vital) 영상 비트레아(Vitrea) 버전 6.7.2 소프트웨어를 사용하여 최대 표준화된 흡수 값 (SUV)을 수득하였다. 방사선과의사에 의해 가장 큰 종양 면적 (mm2)의 측정을 위한 조영-증강 종양 병소 영역이 윤곽화되었고, 종양 부피 (cm3)가 계산되었다.
품질 관리 출시된 자가 IL13BBζ TCM의 동결보존된 세포 은행을 해동하고, 2% HSA가 존재하는 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 2회 세척하고 이를 2% HSA가 존재하는 제약 보존제-무함유 생리 염수 중에 재현탁시킴으로써 주입을 위해 재제제화하였다. 신경교종 절제 공동 (ICT) 또는 측뇌실 (ICV) 내로의 치료 CAR T 세포의 전달은 뇌실 카테터 (인테그라 푸덴즈(Integra Pudenz)), 및 스타일렛이 구비된 홀터(Holter)™ 릭함 뇌실조루 저장소 (코드만(Codman))를 사용하여 달성하였다. ICT 전달을 위해, 저장소/카테터 시스템을 종양 절제시 삽입하고, 공동 내 및 종양주위 뇌 조직 내 둘 다로의 세포 전달을 가능하게 하기 위해 카테터의 팁을 절제 벽 내로 부분적으로 끼워넣었다. 수술후 영상화 (CT 및 MRI)를 수득하여 카테터 위치 및 종양 절제 범위를 확인하였다.
실시예 20: IL13BBζ TCM은 중심 기억-유사 T 세포 표현형을 디스플레이한다
풍부화된 TCM (36 x 106개)을 생체외 자극하고, 렌티바이러스로 형질도입하고, 확장시켜, 17일에 638 x 106개의 총 세포를 수득하였다. 최종 T 세포 생성물 (CD3+ 및 TCR+)은 CD4 (74%) 및 CD8 (16%) T 세포 하위세트로 이루어졌고, 세포 표면 단백질 둘 다에 대해 공동-염색되는 유전자 변형을 갖는 IL13BBζ 및 CD19t를 발현하였다 (도 39A). CAR T 세포 생성물은 CD45RO (97%), CD62L (57%), CCR7 (28%), CD28 (97%) 및 CD27 (59%)을 발현하여 중심 기억 T 세포 표현형을 나타내었다 (도 39A). 생성물은 또한 TIM-3 (65%) 및 LAG-3 (49%)을 포함한 일부 소진 마커를 발현하였지만, 유의한 수준의 PD-1 및 KLRG1은 발현하지 않았다 (도 39A).
실시예 21: IL13BBζ TCM의 반복적 두개내 주입의 안전성 및 허용성
저장소/카테터 장치에 의해 종양 절제 후 공동내 (ICT) 전달 (사이클 1-6) 및 뇌 척수액 (CSF) 내로의 뇌실안 (ICV) 전달 (사이클 7-11)인 2개의 상이한 두개내 전달 경로를 통해 투여되는 IL13BBζ TCM의 매주 주입으로 환자를 치료하였다. 최대 세포 용량 10 x 106개 CAR+ T 세포로의 11회의 두개내 주입은 요법으로 인한 가능성이 있거나 더 큰 원인이 되는 어떠한 등급 3 이상의 독성 (NCI 일반 독성 기준)도 관찰되지 않고 잘-용인되었다. CAR T 세포 주입 후 주목되는 경도의 사건은 하기를 포함한다.
Figure pct00008
* T 세포 투여로 인한 가능성이 있거나 더 큰 원인이 되는 사건만을 보고함; 모두 1회 발생하였고, NCI 일반 독성 기준에 따르면 등급 1-2이며, 등급 3 이상의 어떠한 사건도 관찰되지 않음.
실시예 22: 임상 반응
치료시, 환자의 종양은 불량한 예후 특색을 갖는 고도록 공격적인 재발성 GBM의 특징을 디스플레이하였다. 이는 표준 관리 요법 후 6개월 내 1차 진단으로부터의 재발의 증거, 척추 병변을 포함한 다초점성 종양 병변 및 광범위한 연수막 질환의 제시 (도 38), 탈분화된 GBM의 조직학적 특색, 및 60% 초과의 세포가 Ki67에 대해 양성 염색되는 높은 종양 증식 속도 (도 37B)를 포함하였다. 절제된 종양 조직의 FFPE에 대해 IHC에 의해 평가된 바와 같은 IL13Rα2의 종양 발현은 원발성 및 재발성 종양 사이에 유사하였고 H 점수가 각각 100 및 80이었다 (도 37). 재발성 종양의 경우 종양내 IL13Rα2 발현은 불균질하였고, 세포의 10%는 높은 염색 세기를 나타내고 (2-3+), 60%는 낮은 발현을 나타내고 (1+), 세포의 30%는 배경을 초과하는 염색을 나타내지 않았다 (0+). 잠재적 관심사로, 가장 높은 수준의 IL13Rα2 발현은 종종 다른 GBM 종양에 대해 주목되는 발현 패턴인 거짓울타리화 괴사 종양 영역에서 관찰되었다 (도 37A).
임상 프로토콜에의 등록 후, 이 환자는 5개의 재발성 병변 중 3개에 대해 외과적 절제를 거쳤고 (도 38), 우 후부 측두-후두 구역 내 가장 큰 재발성 병소의 절제된 공동 (T1)에 저장소/카테터 장치를 배치하였다. 이 환자를 초기에 CAR+ T 세포의 6회 매주 공동내 (ICT) 주입 (2 x 106개 사이클 1; 10 x 106개 사이클 2-6)에 의한 프로토콜에 따라 치료하였고 (도 1B), 이러한 기간 동안 측두-후두 종양 병변 (T1)은 수술 후 45-일을 초과하는 동안 진행성 질환의 증거없이 안정하게 유지되었다 (도 39C). 그러나 MRI는 좌 측두엽 내의 다른 비-절제된 종양 병소 (T4 및 T5), 뿐만 아니라 종양 3에 인접한 새로운 재발성 병변 (T6) 및 후각 구 내 병변 (T7)이 동일한 기간에 걸쳐 계속 진행하였음을 밝혀내었다 (도 39C). 추가적으로, 척추 내에서 1개의 대형 종양 (270 mm2) 및 1개 초과의 소형 종양 병소 (< 1 cm2)를 포함한 전이성 병변이 또한 검출되었다. 이들 결과는, 종합하면, IL13BBζ TCM이 절제된 후부 측두-후두 구역에서 질환 재발을 방지할 수 있다는 것을 시사하지만, 또한 국부 ICT 전달은 주입 부위에서 떨어진 원위 위치의 종양 진행을 효과적으로 제어하는데 충분하지 않다는 것을 시사한다는 점에서 고무적이었다.
이들 발견에 기초하고, CAR T 세포의 ICV 전달이 NSG 마우스 모델에서 다초점성 GBM으로 이동할 수 있다는 것을 보여주는 전임상 연구 (데이터는 제시되지 않음)에 의해 지지되는, 이러한 환자를 동정적 사용 프로토콜에 등록하고, 임의의 다른 치료적 개입 없이 IL13BBζ TCM의 5회의 매주 ICV 주입에 의해 치료하였다 (2 x 106개 사이클 7; 10 x 106개 사이클 8-11) (도 40A). 3회의 ICV 주입 1주 후 (사이클 9; 제133일) 모든 종양 병변은 현저한 퇴행을 나타내었고, 최종 ICV 주입 후 (사이클 11; 제156일), 대부분의 두개내 및 척추 종양이 최대 면적 및 부피 측정치 둘 다에서 70% 초과만큼 퇴행하였다 (도 40B-E, 하기 표 7, 및 도 41). 마지막 ICV 주입 6주 후 (제190일), 그 동안 환자는 어떠한 다른 치료적 개입도 받지 않았고, 추적 MR 및 PET 영상화는 계속적인 질환 퇴행을 나타내었고, 모든 종양은 최대 면적 및 부피 측정치 둘 다에서 ≥ 78%만큼 감소하였다 (도 40B-E, 하기 표 7, 및 도 41). 이러한 제190일 시점에, 염증, 반흔형성 및/또는 경막 증강에 대한 질환의 잔류 방사선촬영상 증거 사이를 구별하는 것은 가능하지 않았다. IL13BBζ TCM의 ICV 전달은 척추 내 모든 전이성 종양의 거의 완전한 제거를 도출하였고, 가장 큰 병변의 경우 최대 면적이 97% 감소하였고, ICV 치료 전 존재한 10개 초과 중에서 단지 1개의 작은 종양 병소만이 관찰되었다. ICV 치료의 시간 경과에 따라, 종양 퇴행과 일치하게, 환자는 시스템 덱사메타손을 2 mg bid에서 0.5 mg qd로 감소시킬 수 있었다. 이 환자는 임상적으로 안정하게 유지되었고, 정상 생활 및 작업 활동으로 복귀할 수 있었으며, 따라서 이러한 CAR T 세포-매개 항종양 반응의 지속성을 지지하였다. 이들 결과는 IL13BBζ TCM에 의한 치료가 엄격한 RANO 기준에 기초하여 거의 완전 반응을 매개하였음을 입증한다.
Figure pct00009
*, 사이클 1-6 동안 발생한 새로운 병변
볼드체, 최대 % 감소에 대해 비교된 값
NA, 어떠한 병변도 확인할 수 없음
0, 병변을 시각적으로 확인할 수 있지만, 값은 분석 소프트웨어 파라미터의 값 미만임
ND, 영상화가 이루어지지 않음
실시예 23: CAR T 세포 지속성 및 CNS 염증 반응
IL3BBζ TCM의 ICV 주입 (사이클 6-11) 후에 관찰되는 항종양 반응과 연관된 면역학적 변화를 규명하기 위해, 세포 침윤물, CAR+ T 세포 지속성, 및 시토카인 수준에 대해 CSF를 평가하였다. 각각의 ICV 주입 직후 (즉, 사이클 6-11의 제1일-제2일), CSF mL당 세포 수는 주입-전 수준 (각각의 사이클의 제0일)과 비교하여 7.0±3.6배 증가하였고, ICV-전 (C7D0) 수준과 비교하여 153±128배 증가하였다 (도 42). CSF 내 총 세포 수는 전형적으로 7-일 치료 사이클에 걸쳐 감소하였다. C9D2에 평가된 바와 같이, 세포 침윤물은 내인성 및 CAR-발현 둘 다인 CD3+ T 세포, 뿐만 아니라 CD14+ CD11b+ HLA-DR+ 성숙 골수 집단을 높은 비율로 포함하였다 (도 42A). CD19+ B 세포 및 CD11b+ CD15+ 과립구는 단지 드물게 검출되었다 (도 42A). 유동 세포측정 데이터와 일치하게, C11D1의 CSF 세포병리학은 반응성 림프구, 단핵구, 및 대식세포의 존재를 보고하였다.
또한 ICV 치료 과정에 걸쳐 CAR-T 지속성을 모니터링하였다. 사이클 7 및 8 동안 CSF에서의 낮은 세포 회수로 인해, 분석은 사이클 9 및 사이클 10 및 11 직후 시점을 평가하는데 초점이 맞춰졌다. 중요한 것으로, CAR+ T 세포는 사이클 8 후 7-일에 상응하는 C9D0을 포함한 평가된 모든 시점에서 검출되었고 (도 42B), 따라서 이는 주입-후 적어도 7 내지 8일 동안의 치료 세포의 지속성을 입증한다. 그러나, 주입 후 CSF 내 CAR T 수는 종양 부담이 또한 유의하게 감소되었을 때인 이후의 사이클 (C10D1 및 C11D1)에서 감소되었다 (도 40B). 주목할 것으로, 사이클 9를 경과하여 CSF에서 CAR T 세포의 유의한 확장은 검출되지 않았고, CAR+ 세포 수는 주입-전 (C9D0)으로부터 2일 후 (C9D2)에 1.6-배 증가한 다음, 8일째 (C9D8)에 2.3-배 감소하였다.
각각의 주입 후 CAR+ T 세포를 포함한 면역 세포의 존재는 CSF에서의 시토카인 수준의 유의한 상승에 상응한다. 측정된 수준 및 측정된 30종의-시토카인에 대한 기준선에 비해 계산된 배수-변화를 하기 표 9 및 10에 제시한다. 두드러지게, 시토카인 IFNγ, TNF, IL-2, IL-10, IL-5, IL-6, 및 IL-8 및 케모카인 CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, 및 CCR2/MCP-1 및 가용성 시토카인 수용체 IL-1Rα를 포함한 11종의 시토카인은 IL3BBζ TCM 주입 직후 ICV-전 기준선 (C7D0)으로부터 10-배를 초과하여 증가하였다 (도 3C). G-CSF, IL-12, IL2-R, IL-4, IL-7, 및 MIP-1b를 포함한 7종의 다른 시토카인은 기준선 (C7D0)으로부터 5-배 초과의 증가를 나타내었다. ICV-전 (C7D0)과 비교하여 IL3BBζ TCM 주입 직후 최고 배수 증가를 나타낸 염증성 시토카인은 IL-2 (C9D2의 경우 >90-배) 및 IFN-γ 유도성 케모카인 CXCL9 및 CXCL10 (C8D1, C9D2, C10D1 및 C11D2의 경우 >40-배)이었다. 이들 시토카인은 치료 사이클 사이의 7-일 내에 거의 기준선 수준으로 되돌아갔다. CAR T 세포 주입 후 유의한 증가를 나타내지 않은 시토카인은 IL-13, RANTES 및 VEGF를 포함한다 (표 9 및 10).
Figure pct00010
OOR <, 범위를 벗어남 (미만)
*, 표준 범위를 넘어 외삽된 값
Figure pct00011
표 10으로부터 'OOR<' 값인 볼드체 값은 배수 변화 계산을 가능하게 하는 그러한 시토카인에 대한 최저 측정가능한 값으로 대체됨
*, > 10 배수 증가가 적어도 1회 관찰된 시토카인
말초 혈액에서 시토카인 수준에서 어떠한 유의한 변화도 (표 11), qPCR 및 유동 세포측정법에 의해 어떠한 검출가능한 CAR+ T 세포도 (데이터는 제시되지 않음) 관찰되지 않았기 때문에, CSF에서의 이들 면역학적 변화는 국부적이었다. ICT 치료 과정 동안 공동으로부터 낭액을 수득할 수 없었기 때문에, CSF에서의 변화는 종양 병변의 절제된 공동 1 (T1)에서의 변화와 비교할 수 없었다.
Figure pct00012
OOR <, 범위를 벗어남 (미만)
*, 표준 범위를 넘어 외삽된 값
실시예 24: 환자 샘플 가공 및 분석
임상 프로토콜에 따라 COH 병리학부를 통해 종양 절제 물질을 수집하였다.
이전에 기재된 바와 같은 포르말린-고정 파라핀-포매 시편의 5 μm-절편에 대해 IL13Rα2 면역조직화학 (IHC)을 행하고, pH 8.0에서 가열하는 것에 의한 항원 회복, 및 1:75 희석된 항-K167 (다코 코포레이션(Dako Corp))과의 인큐베이션을 제외하고 Ki67 IHC를 유사하게 수행하였다. 임상 신경병리학자는 IL-13Rα2 면역반응성을 점수화하고, 약 (1+), 중 (2+), 또는 강 (3+) 세기의 세포질 및 골지-유사 염색을 나타내는 종양 세포의 백분율에 기초하여 정량화하였다. 식: (3 x 강하게 염색된 세포의 백분율) + (2 x 중간 정도로 염색된 세포의 백분율) + 약하게 염색된 세포의 백분율에 의해 H 점수를 수득하였고, 범위 0 내지 300이 제공되었다. H 점수는 등록 기준에 기재된 세기 점수화 시스템에서 하기와 같이 해석될 수 있다: 0은 음성을 나타내고 (H 점수 0), 1+는 낮음을 나타내고 (H 점수 1-100), 2+는 중간 정도를 나타내고 (H 점수 101-200) 및 3+은 높음을 나타낸다 (H 점수 201-300). 포함 기준은 H 점수 20으로 나타내어지는, 적어도 20%의, 1+ 염색 세기로 점수화된 세포 (> 20%, 1+)였다. IL-13Rα2 IHC 염색에 대해 적절한 양성 (고환) 및 음성 (전립선) 대조군을 사용하였다. "+" 사인은 막 염색의 존재를 반영한다. 이러한 시험은 시티 오브 호프 내셔널 메디칼 센터의 병리학부에서 수행하였고, 이곳은 연구 임상시험기관으로 간주된다. 이 실험실은 1988 임상 실험실 개선을 위한 개정안 (CLIA) 하에 높은 복잡성의 임상 실험실 시험을 수행하기 위한 자격을 갖춘 곳으로 인증되었다.
말초 혈액 샘플을 바큐테이너 튜브 ±EDTA 내에 수집하였다. EDTA 함유 샘플은 수령하자마자 피콜화하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 크리스토르 CS5 내에서 -80℃에서 동결시킨 다음, 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다. EDTA 무함유 샘플은 실온에서 2-3시간 동안 응고되게 하였고; 원심분리에 의해 혈청을 수집하고, 단일 사용 100-200 μl 분취물로 분취하고, -80℃에서 저장하였다. ICV 저장소로부터 뇌 척수액 (CSF)을 3cc 시린지 내에 수집하고, 스핀 다운시키고, 상청액을 분취하고, -80℃에서 저장하였다. CSF 세포는 즉시 유동 세포측정 분석을 위해 2% FCS 및 아지드화나트륨 함유 HBSS-/- (코닝 셀그로(Corning CellGro)) 중에 재현탁시켰고, 나머지 세포는 재현탁시키고 크리오스토르 CS4 내에서 -80℃에서 동결시킨 다음, 장기간 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다.
면역 세포의 세포 표면 표현형결정은 CD3, CD4, CD11b, CD14, CD19, CD27, CD28, CD62L, CD45RA, CD45RO, IL-13, TCR-α/β (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)), KLRG1, CD15 (바이오레전드(BioLegend)), HLA-DR, PD1 (이바이오사이언시스(eBiosciences)), CD8 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)), LAG-3 (라이프스팬 바이오사이언시스(Lifespan Biosciences)), CCR7, 또는 TIM-3 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)), 및 그의 각각의 이소형 대조군에 특이적인 형광색소 접합된 항체를 사용한 유동 세포측정법에 의해 수행하였다.
연구 참가자 혈청 및 CSF 샘플을 시토카인 비드 어레이에 의해 분석하였다. 검정은 인간 시토카인 30-플렉스 패널 키트 (인비트로젠) 및 플렉스맵 3D(FLEXMAP 3D)® (루미넥스(Luminex))를 사용하여 수행하였다.
SEQUENCE LISTING <110> CITY OF HOPE <120> ADMINISTRATION OF ENGINEERED T CELLS FOR TREATMENT OF CANCERS IN THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM <130> 40056-0028WO1 <140> PCT/US2017/016711 <141> 2017-02-06 <150> 62/309,348 <151> 2016-03-16 <150> 62/292,152 <151> 2016-02-05 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 889 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro 35 40 45 Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met 50 55 60 Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala 65 70 75 80 Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val 85 90 95 Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu 100 105 110 Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys 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gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 6540 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 6600 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 6660 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 6720 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 6780 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 6840 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 6900 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 6960 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 7020 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 7080 ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 7140 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 7200 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 7260 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 7320 cgacggggag 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cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 9060 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 9120 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 9180 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 9240 acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 9300 gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 9360 tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 9420 cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggaatt cggagtggcg agccctcaga tcctgcatat 9480 aagcagctgc tttttgcctg tactgggtct ctctg 9515 <210> 13 <211> 8732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc 60 tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg 120 taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg 180 aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct 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gtacaggcca 1080 gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc 1140 aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg 1200 ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac 1260 tcatttgcac cactgctgtg ccttggatct acaaatggca gtattcatcc acaattttaa 1320 aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca taatagcaac 1380 agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa attcaaaatt ttcgggttta 1440 ttacagggac agcagagatc cagtttgggg atcaattgca tgaagaatct gcttagggtt 1500 aggcgttttg cgctgcttcg cgaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 1560 gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc 1620 ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 1680 tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 1740 caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 1800 cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 1860 cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc 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gcggcgtggc 3600 cgggctgctg ctgttcatcg gcctgggcat ctttttccgg gtgaagttca gccggtccgc 3660 cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag 3720 gcgggaggaa tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa 3780 gcccaggcgg aagaaccctc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc 3840 cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg gccacgacgg 3900 cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc 3960 cctgcccccc aggtgacccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc 4020 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4080 gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 4140 cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 4200 tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 4260 cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 4320 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 4380 tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu 1 5 10 15 Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met 20 25 30 Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg 50 55 60 Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser 65 70 75 80 Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys 85 90 95 Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn 100 105 110 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 115 120 125 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 130 135 140 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 145 150 155 160 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 165 170 175 Ser Leu Val Ile Thr Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 180 185 190 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 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<400> 50 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 51 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 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Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser 275 280 285 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 290 295 300 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 305 310 315 320 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 325 330 335 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 355 360 365 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 485 490 495 Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 500 505 510 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 515 520 525 Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 530 535 540 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 545 550 555 560 Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 565 570 575 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 580 585 590 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 595 600 605 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 610 615 620 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 625 630 635 640 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 645 650 655 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 660 665 670 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg 675 680 685 Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 690 695 700 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 705 710 715 720 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 725 730 735 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 740 745 750 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 755 760 765 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 770 775 780 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 785 790 795 800 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 805 810 815 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 820 825 830 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 835 840 845 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 850 855 860 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro 865 870 875 880 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 885 890 895 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 900 905 910 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 915 920 925 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 930 935 940 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 945 950 955 960 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 965 970 975 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly 980 985 990 Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 995 1000 1005 Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu 1010 1015 1020 Arg Arg Lys Arg 1025 <210> 59 <211> 1021 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser 275 280 285 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 290 295 300 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 305 310 315 320 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Phe Val His Asn Ala 325 330 335 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Phe Tyr 355 360 365 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 485 490 495 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 500 505 510 Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 515 520 525 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 530 535 540 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly 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Thr Ala Arg Pro 965 970 975 Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala 980 985 990 Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile 995 1000 1005 Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 1010 1015 1020

Claims (124)

  1. 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 도입하는 것을 포함하는, 상기 환자를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, T 세포가 자가 또는 동종 T 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, T 세포가 확장, 분획화 또는 재조합 핵산 분자에 의한 형질감염 중 1종 이상에 의해 생체외 조작된 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, T 세포가 종양 세포 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 형질감염된 세포를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 폴리펩티드가 키메라 항원 수용체인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 조성물이 뇌실내로 투여되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 조성물이 척수의 중심관으로 투여되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 투여가 좌 뇌실 또는 우 뇌실에 대한 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 조성물이 적어도 1 x 106개 세포를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물이 적어도 2회 투여되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 투여가 투여되는 T 세포의 총수에서 상이한 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 투여가 용량에서 증량되는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 투여가 용량에서 감량되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, T 세포가 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR T 세포를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, T 세포가 자가 종양 침윤 림프구를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, T 세포가 TCR-조작된 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 악성종양이 미만성, 침윤 종양인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 악성종양이 원발성 뇌 종양인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 1개 이상의 종양 병소가 크기에서 적어도 25% 감소하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 악성종양이 유방암, 폐암, 두경부암 및 흑색종으로부터 선택된 원발성 암에서 발생한 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 종양 절제 후에 수행되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, T 세포를 포함하는 조성물의 종양내 투여를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 악성종양이 속발성 뇌 종양인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 교모세포종 세포의 표면 상에 발현된 단백질에 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 치료 T 세포를 포함하는 조성물의 종양내 투여를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 환자가 이전에 종양 병변의 절제를 거친 것인 방법.
  26. 제4항에 있어서, 종양 항원이 IL13Rα2, HER2, PSCA, EGFR, EGFRvIII, EphA2, NY-ESO-1, 및 CD19로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, T 세포가 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포 둘 다를 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항에 있어서, T 세포가 생체외 확장을 거친 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, T 세포가 적어도 10% Tcm 세포를 포함하는 것인 방법.
  30. 제14항에 있어서, CAR T 세포가 IL13Rα2를 표적화하고, 인간 IL-13 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 적어도 1개의 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 공동자극 도메인이 CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 인간 IL-13의 변이체가 IL13Rα1 대비 IL13Rα2에 대한 결합 특이성을 증가시키는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 인간 IL-13 또는 그의 변이체가 1 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하되, 서열식별번호: 3의 위치 11에서의 아미노산이 E 이외의 것인 IL-13 변이체인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CD28 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-10개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인을 포함하는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인을 포함하는 것인 방법.
  36. 제30항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 인간 IL-13 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ζ 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인; 및 CD3 ζ 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  37. 제30항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 IL-13 또는 그의 변이체 및 막횡단 도메인 사이에 위치한 스페이서 영역을 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 스페이서 영역이 서열식별번호: 4, 14-20, 50 및 521로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  39. 제30항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 10 및 31-48로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  40. 제30항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 HER2에 결합하고, 중심 기억 T 세포가 HER2 표적화 도메인; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3s 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3s 신호전달 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, HER2 표적화 도메인이 HER2 scFv인 방법.
  42. 제41항에 있어서, HER2 scFv가 아미노산 서열:
    Figure pct00013

    를 포함하는 것 또는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 HER2 표적화 서열; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3s 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3s 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 핵산 분자가 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 발현하는 것인 방법.
  45. 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF)을 함유하는 해부학적 구획 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 주입하는 것을 포함하는, 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자를 치료하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 해부학적 구획이 뇌실계의 부분을 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 해부학적 구획이 척수의 중심관의 부분을 포함하는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 중추 신경계의 악성종양이 뇌 종양을 포함하는 것인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 중추 신경계의 악성종양이 전이된 종양을 포함하는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 해부학적 구획이 적어도 약 50 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유하는 것인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 해부학적 구획이 적어도 약 100 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유하는 것인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 해부학적 구획이 적어도 약 150 mL의 인접 부피의 뇌 척수액을 함유하는 것인 방법.
  53. 제1항 또는 제45항에 있어서, 악성종양이 원발성 CNS 악성종양, 및 다른 곳에 위치한 암에서 발생한 속발성 악성종양, 예를 들어 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련 암, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추 신경계, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 중추 신경계암, 자궁경부암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 배아성 종양, 중추 신경계, 자궁내막암, 상의모세포종, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 종양의 유잉 육종 패밀리, 두개외 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 간외 담관암, 안암, 골의 섬유성 조직구종, 악성, 및 골육종, 담낭암, 위 (위의)암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST) - 연부 조직 육종, 배세포 종양, 임신성 영양막 종양, 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간)암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 도세포 종양 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 구순암 및 구강암, 간암 (원발성), 소엽성 상피내 암종 (LCIS), 폐암, 림프종, 마크로글로불린혈증, 남성 유방암, 골의 악성 섬유성 조직구종 및 골육종, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠재성 원발성인 전이성 편평 경부암, NUT 유전자 수반 정중선 관 암종, 입암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 골수 백혈병, 만성 (CML), 골수성 백혈병, 급성 (AML), 골수종, 다발성, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구암, 구강암, 구인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방암, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 (신장)암, 신우 및 요관, 이행 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종, 세자리 증후군, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위의 (위)암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, T-세포 림프종, 피부, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 영양막 종양, 요관 및 신우암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 윌름스 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 암에서 발생한 것인 방법.
  54. 제1항 또는 제45항에 있어서, 악성종양이 종양을 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 치료가 종양 부피의 적어도 50% 감소를 발생시키는 것인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 치료가 종양 부피의 적어도 60% 감소를 발생시키는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 치료가 종양 부피의 적어도 70% 감소를 발생시키는 것인 방법.
  58. 제54항에 있어서, 치료가 종양 부피의 적어도 80% 감소를 발생시키는 것인 방법.
  59. 제54항에 있어서, 치료가 종양 부피의 적어도 90% 감소를 발생시키는 것인 방법.
  60. 제1항 또는 제45항에 있어서, 치료가 악성종양의 제거를 발생시키는 것인 방법.
  61. 제1항 또는 제45항에 있어서, 환자가 임의의 등급 3 이상의 독성을 경험하지 않는 것인 방법.
  62. 제1항 또는 제45항에 있어서, 환자가 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물에 의한 치료 전 스테로이드 요법을 투여받는 것인 방법.
  63. 제60항에 있어서, 스테로이드 요법이 치료 후에 더 낮은 용량으로 감소되는 것인 방법.
  64. 제1항 또는 제45항에 있어서, 환자가 적어도 50%의 1-년 생존율을 갖는 것인 방법.
  65. 제1항 또는 제45항에 있어서, 환자가 적어도 50%의 2-년 생존율을 갖는 것인 방법.
  66. 제1항 또는 제45항에 있어서, 환자가 적어도 50%의 5-년 생존율을 갖는 것인 방법.
  67. 제1항 또는 제45항에 있어서, 환자가 방사선 요법, 소분자 약물 요법, 항체 치료제 또는 그의 조합을 포함한 표준 관리 (SOC) 치료를 받은 환자와 비교하여 증가된 기대 수명을 갖는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, SOC 치료를 받은 환자가 초기 진단으로부터 약 15개월 생존할 것 (전체 생존 또는 OS)을 예상할 수 있는 반면에, 청구된 치료를 받은 환자는 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36개월 이상의 OS를 예상할 수 있는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 청구된 치료를 받은 환자가 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90개월 이상의 OS를 예상할 수 있는 것인 방법.
  70. 제1항 또는 제45항에 있어서, 조성물이 적어도 2 x 106개 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  71. 제1항 또는 제45항에 있어서, 조성물이 적어도 10 x 106개 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  72. 제1항 또는 제45항에 있어서, 조성물의 적어도 5회의 반복 투여를 포함하는 방법.
  73. 제1항 또는 제45항에 있어서, 조성물의 적어도 10회의 반복 투여를 포함하는 방법.
  74. 제1항 또는 제45항에 있어서, 조성물의 반복 투여를 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 환자가 적어도 90 x 106개 T 세포의 총 용량을 제공받는 것인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 투여가 1주 1회 반복되는 것인 방법.
  77. 제74항에 있어서, 투여가 2주마다 1회 반복되는 것인 방법.
  78. 제74항에 있어서, 반복 투여가 15주의 기간에 걸쳐 제공되는 것인 방법.
  79. 중추 신경계의 악성종양을 갖는 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준을 증가시키는 방법이며, 여기서 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준은 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물의 투여 후에 투여 전의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 기준선 수준과 비교하여 증가되는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 투여 후의 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준이 기준선 수준과 비교하여 10-배 증가되는 것인 방법.
  81. 제79항에 있어서, 투여 후의 CSF 내의 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인의 수준이 기준선 수준과 비교하여 5-배 증가되는 것인 방법.
  82. 제79항에 있어서, 적어도 5종의 시토카인 또는 케모카인의 수준이 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물의 투여 후에 투여 전의 적어도 5종의 시토카인 또는 케모카인의 기준선 수준과 비교하여 증가되는 것인 방법.
  83. 제79항에 있어서, 적어도 10종의 시토카인 또는 케모카인의 수준이 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물의 투여 후에 투여 전의 적어도 10종의 시토카인 또는 케모카인의 기준선 수준과 비교하여 증가되는 것인 방법.
  84. 제79항에 있어서, 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인이 EGF, 에오탁신, FGF, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-α, IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1Rα, IL-1β, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNF-α, 또는 VEGF를 포함하는 것인 방법.
  85. 제79항에 있어서, 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인이 IFNγ, TNF, IL-2, IL-10, IL-5, IL-6, IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CCR2/MCP-1, 또는 IL-1Rα를 포함하는 것인 방법.
  86. 제79항에 있어서, 적어도 1종의 시토카인 또는 케모카인이 IFNγ, TNF, IL-2, IL-10, IL-5, IL-6, IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CCR2/MCP-1, IL-1Rα, G-CSF, IL-12, IL2-R, IL-4, IL-7, 또는 MIP-1b를 포함하는 것인 방법.
  87. 제79항에 있어서, 적어도 1종의 시토카인의 증가된 수준이 적어도 1종의 시토카인의 수준에서의 국부 증가를 포함하는 것인 방법.
  88. 제79항에 있어서, 조성물이 뇌실내로 투여되는 것인 방법.
  89. 제79항에 있어서, T 세포가 자가 또는 동종 T 세포인 방법.
  90. 제79항에 있어서, T 세포가 확장, 분획화 또는 재조합 핵산 분자에 의한 형질감염 중 1종 이상에 의해 생체외 조작된 것인 방법.
  91. 제90항에 있어서, T 세포가 종양 세포 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 형질감염된 세포를 포함하는 것인 방법.
  92. 제91항에 있어서, 폴리펩티드가 키메라 항원 수용체인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 IL-13R에 특이적인 것인 방법.
  94. 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 주입하는 것을 포함하는, 기준선 개수와 비교하여, 중추 신경계의 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자의 CSF에서 관찰되는 T 세포의 증가된 개수를 적어도 약 5일 동안 지속시키는 방법이며, 여기서 주입 단계 전에 관찰되는 기준선 개수와 비교하여 관찰되는 T 세포의 증가된 개수가 적어도 약 5일 동안 지속되는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 유효량의 T 세포가 약 1 x 106개 세포 내지 약 100 x 106개 세포의 범위인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 유효량의 T 세포가 약 2 x 106개 세포 내지 약 50 x 106개 세포의 범위인 방법.
  97. 제94항에 있어서, 관찰되는 T 세포의 증가된 개수가 적어도 약 6일 동안 지속되는 것인 방법.
  98. 제94항에 있어서, 관찰되는 T 세포의 개수가 약 7일 동안 기준선 개수로 되돌아가지 않는 것인 방법.
  99. 제94항에 있어서, 관찰되는 T 세포가 주입된 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  100. 제94항에 있어서, 관찰되는 T 세포가 내인성 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  101. 중추 신경계의 악성종양을 갖는 환자의 뇌 척수액 (CSF) 내로 유효량의 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 CSF 내의 T 세포의 개수를 증가시키는 방법이며, 여기서 CSF에서 검출가능한 T 세포의 개수는 투여-전 수준과 비교하여 증가되는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, CSF에서 검출가능한 T 세포의 개수가 투여-전 수준과 비교하여 투여 후 최대 7일 동안 증가되는 것인 방법.
  103. 제101항에 있어서, CSF에서 검출가능한 T 세포가 내인성 T 세포 및 CAR-발현 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  104. 제101항에 있어서, CSF에서 검출가능한 T 세포가 내인성 유형 1 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  105. 제101항에 있어서, CSF에서 검출가능한 T 세포가 내인성 유형 2 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  106. 제101항에 있어서, CSF에서 검출가능한 T 세포가 CD3+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
  107. 제101항에 있어서, CSF에서 검출가능한 T 세포가 CD14+ CD11b+ HLA-DR+ 성숙 골수 집단을 포함하는 것인 방법.
  108. 제101항에 있어서, CD19+ B 세포 및 CD11b+ CD15+ 과립구가 조성물의 투여 후 CSF에서 검출가능한 것인 방법.
  109. 제101항에 있어서, 반응성 림프구, 단핵구, 및 대식세포가 조성물의 투여 후 CSF에서 검출가능한 것인 방법.
  110. 제101항에 있어서, 적어도 1종의 시토카인의 수준에서의 국부 증가가 관찰되는 것인 방법.
  111. 제101항에 있어서, 조성물이 뇌실내로 주입되는 것인 방법.
  112. 제101항에 있어서, T 세포가 자가 또는 동종 T 세포인 방법.
  113. 제101항에 있어서, T 세포가 확장, 분획화 또는 재조합 핵산 분자에 의한 형질감염 중 1종 이상에 의해 생체외 조작된 것인 방법.
  114. 제113항에 있어서, T 세포가 종양 세포 항원에 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산 분자에 의해 형질감염된 세포를 포함하는 것인 방법.
  115. 제114항에 있어서, 폴리펩티드가 키메라 항원 수용체인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 IL-13R에 특이적인 것인 방법.
  117. 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자로부터의 샘플에 기인한 점수가 사전결정된 역치를 초과하는 IL-13Rα2 발현을 나타내는지 결정하는 것을 포함하는, 상기 환자의 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포에 의한 치료에 대한 적합성을 결정하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 샘플에 기인한 점수가 IL-13Rα2의 마커에 의한 샘플의 면역조직화학적 염색에 의해 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자로부터의 절제된 종양 샘플의 면역반응성을 결정하고, 염색의 강도를 분석하고, 염색의 강도에 기초하여 점수를 계산함으로써 계산되며, 여기서 샘플에서 중 내지 강 염색 세기에 상응하는 점수는 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포에 의한 치료가 환자에게 적합하다는 것을 나타내는 것인 방법.
  119. 제117항에 있어서, 점수가 약, 중, 또는 강 염색 세기를 갖는 세포의 개수를 카운팅하고 각각의 세기에 가중치를 할당하는 것을 포함하는 것인 방법.
  120. 제117항에 있어서, 샘플에서의 Ki67의 발현이 또한 면역조직화학적 염색에 의해 결정되는 것인 방법.
  121. 악성종양을 갖는 것으로 진단된 환자에게 유효 용량의 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 악성종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이며, 여기서 환자는 사전결정된 역치를 초과하는 IL-13Rα2를 발현하는 것인 방법.
  122. 제120항에 있어서, IL-13Rα2 발현의 사전결정된 역치가 IL-13Rα2-특이적 CAR T 세포 요법을 포함하는 치료에 적합한 것으로 이전에 확인된 것인 방법.
  123. 제54항에 있어서, 환자가 다초점성 교모세포종을 앓고 있는 것인 방법.
  124. 제1항 또는 제45항에 있어서, 치료가 뇌 척수액 중 CXCL9 또는 CXCL10 또는 둘 다의 수준을 증가시키는 것인 방법.
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