ES2879700T3

ES2879700T3 - Administración de células T genomanipuladas para el tratamiento de cánceres en el sistema nervioso central

Info

Publication number: ES2879700T3
Application number: ES17748349T
Authority: ES
Inventors: Benham Badie; Christine E Brown; Stephen J Forman; Saul J Priceman
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2017-02-06
Publication date: 2021-11-22
Anticipated expiration: 2037-02-06
Also published as: JP7189019B2; WO2017136829A1; MX2023006304A; BR112018015836A2; HK1257741A1; AU2017213661A1; US20170224733A1; RU2018130752A3; DK3411393T3; KR20180105709A; IL287889B2; EP3411393A4; CN108779160A; CA3013773A1; EP3912993A1; AU2017213661B2; JP2019504105A; AU2022224866A1; US20210244761A1; RU2018130752A

Abstract

Una composición para el uso en un método para tratar a un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central que comprende introducir en un compartimento anatómico que contiene el líquido cefalorraquídeo (CSF) del paciente la composición que comprende una cantidad eficaz de células T, en donde las células T comprenden células T CAR que expresan un receptor antigénico quimérico.

Description

d e s c r ip c ió n

Administración de células T genomanipuladas para el tratamiento de cánceres en el sistema nervioso central

a n t e c e d e n t e s

Se han investigado inmunoterapias basadas en células T específicas de un tumor, incluyendo terapias que emplean células T genomanipuladas expandidas o seleccionadas ex vivo, para el tratamiento antitumoral. En algunos casos, las células T usadas en estas terapias no permanecen activas in vivo durante un período suficientemente prolongado. En algunos casos, la especificidad para un tumor de las células T es relativamente baja. En algunos casos, las células T genomanipuladas tienen un acceso insuficiente al tumor. Por lo tanto, existe una necesidad en la especialidad de terapias para el cáncer específicas de un tumor con una función antitumoral más eficaz.

El tratamiento de cánceres del sistema nervioso central puede ser particularmente problemático. Por ejemplo, el tratamiento del glioma maligno (MG) de alto grado, incluyendo astrocitoma anaplástico (AA-grado III) y glioblastoma multiforme (GBM-grado IV), sigue siendo un reto terapéutico significativo. Las opciones terapéuticas disponibles actualmente tienen un potencial curativo limitado y solamente menos de 5% de los pacientes sobreviven más de cinco años después del diagnóstico inicial.

Brown y cols. describen en Clin. Cancer Res., vol. 21, n° 18, 15 de septiembre de 2015, en las páginas 4062-4072, experiencias clínicas con administración intracraneal de células T CAR específicas para IL13Ra2 para el tratamiento del glioblastoma.

s u m a r io

La presente invención se define mediante la reivindicación independiente 1. Las reivindicaciones dependientes representan realizaciones adicionales de la invención.

Se describen en la presente composiciones para el uso en métodos para tratar enfermedades malignas del sistema nervioso central al administrar composiciones que comprenden células T (p. ej., células T CAR, linfocitos infiltrantes de tumores ("TIL"), células T genomanipuladas por TCR o clones de células T) al líquido cefalorraquídeo ("CSF") de un paciente. Las células T incluyen células T que tienen que genomanipularse, por ejemplo, mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico que expresa un receptor deseado, mediante la expansión ex vivo de células T aisladas o modificadas genéticamente o mediante la selección ex vivo de un subgrupo de células T obtenidas de un paciente o un donante o mediante una combinación de dos o más de estas técnicas. La administración al CNS se puede efectuar, por ejemplo, mediante la administración al sistema ventricular o la cavidad central de la columna vertebral. La administración al CNS, según se usa el término en la presente, es distinta tanto de la administración intratumoral (inyección o infusión en el propio tumor) como de la administración a una cavidad creada mediante la resección de un tumor. Sin embargo, los métodos de administración al CNS descritos en la presente se pueden combinar con la administración intracavitaria intratumoral y/o posterior a la resección.

La administración al CNS descrita en la presente permite la infusión de volúmenes relativamente grandes de la composición que comprende células T, por ejemplo 1 ml - 2 ml o más en una sola infusión. Así, se pueden administrar en una sola infusión varios millones de células T.

Se divulga así una composición para el uso en un método para tratar a un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central, que comprende infundir una composición que comprende una cantidad eficaz de células T en un compartimento anatómico de un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central, conteniendo el compartimento anatómico líquido cefalorraquídeo ("CSF"). Las células T incluyen células T CAR que expresan un receptor antigénico quimérico. El método incluye la infusión de una composición en un sistema ventricular o una porción de un canal central de una médula espinal, por ejemplo. En una realización del método divulgado, la enfermedad maligna del sistema nervioso central incluye un tumor primario o un tumor metastasizado encontrado en algún lugar del sistema nervioso central, incluyendo una porción del cerebro, la columna vertebral o similares. Preferiblemente, el compartimento anatómico contiene un volumen contiguo de al menos aproximadamente 50, 100 o 150 ml de líquido cefalorraquídeo.

Las células T manipuladas infundidas en los métodos descritos en la presente se orientan a antígenos tumorales, por ejemplo, proteína superficial y proteínas intracelulares. Las enfermedades malignas tratadas pueden ser tumores primarios o tumores secundarios que surgen de cánceres que se originan en cualquier parte del cuerpo. Debido a que la administración al líquido cefalorraquídeo permite a las células T el acceso a regiones más allá del punto de inyección, los métodos descritos en la presente se pueden usar para atacar y reducir el tamaño de tumores remotos al punto de inyección, pero dentro del SNC. Las células T genomanipuladas por TCR se preparan mediante la introducción de genes TCRap en células T (p. ej., células T autólogas) seguido por la expansión ex vivo de las células T ; e infusión de las células T en el paciente. La infusión de las células T genomanipuladas por TCR confiere reactividad tumoral a pacientes cuyo tumor expresa el antígeno apropiado y el elemento de restricción de HLA. El TCR se puede orientar a cualquiera de una variedad de antígenos tumorales, incluyendo, por ejemplo, antígeno asociado a melanoma reconocido por células T 1 (MART-1), glicoproteína (gp) 100, antígeno carcinoembriogénico (CEA), p53, antígeno asociado a melanoma (MAGE-A3, y antígeno de carcinoma de células escamosas esofágicas de Nueva York (NYESO).

Se describe en la presente un método para tratar a un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central que comprende introducir en el líquido cefalorraquídeo (CSF) de un paciente una composición que comprende una cantidad eficaz de células T.

En diversas realizaciones: las células T son células T autólogas o alogénicas; las células T se han manipulado ex vivo mediante una o más de: expansión, fraccionación o transfección con una molécula de ácido nucleico recombinante; las células T comprenden células que se han transfectado con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que se une a un antígeno de células tumorales; el polipéptido es un receptor antigénico quimérico; la composición se administra intraventricularmente; la composición se administra al canal central de la médula espinal; la administración es al ventrículo izquierdo o al ventrículo derecho; la composición comprende al menos 1 x 106 células; la composición que comprende células T se administra al menos dos veces; las administraciones difieren en el número total de células T administradas; las administraciones se aumentan a escala en dosis; las administraciones se disminuyen a escala en dosis; las células T comprenden células T CAR; las células T comprenden linfocitos infiltrantes de tumores autólogos; las células T comprenden células T genomanipuladas por TCR; la enfermedad maligna es un tumor infiltrante difuso; la enfermedad maligna es un tumor cerebral primario; uno o más focos tumorales disminuyen de tamaño en al menos 25%; la enfermedad maligna surge de un cáncer primario seleccionado de: cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y melanoma; el método se realiza después de la resección de un tumor; el método comprende además la administración intratumoral de una composición que comprende células T; la enfermedad maligna es tumor cerebral secundario; el método comprende además la administración intratumoral de una composición que comprende células T terapéuticas que expresan un receptor antigénico quimérico que se une a una proteína expresada sobre la superficie de células de glioblastoma; el paciente ha sufrido previamente la resección de una lesión tumoral; el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en: IL13Ra2, HER2, PSCA, EGFR, EGFRvIII, EphA2, NY-ESO-1 y CD19; las células T comprenden tanto células CD4+ como células CD8+; las células T han sufrido expansión ex vivo; las células T comprenden al menos 10% de células T^cm; al menos 40%, 50%, 60%, 70% o más de las células infundidas son CD4+; al menos al menos 40%, 50%, 60%, 70% o más de las células infundidas expresan un receptor superficial celular que se orienta al antígeno tumoral (p. ej., IL13Ra2); y la dosis de células se basa en el número de células infundidas que expresan un receptor superficial celular que se orienta al antígeno tumoral (p. ej., IL13Ra2).

En algunas realizaciones, las células T comprenden células T CAR que se orientan a IL13Ra2 y las células comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico que comprende: IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos; al menos un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1 -10 modificaciones de aminoácidos. En algunas realizaciones: el dominio coestimulante se selecciona del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos; la variante de una IL13 humana tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos que incrementan la especificidad de unión para IL13Ra2 frente a IL13Ra1; la IL-13 humana o su variante es una variante de IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 con de 1 a 5 modificaciones de aminoácidos, con la condición de que el aminoácido en la posición 11 de SEQ ID NO:3 sea distinto de E; el receptor antigénico quimérico comprende dos dominios coestimulantes diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1 -10 modificaciones de aminoácidos; el receptor antigénico quimérico comprende dos dominios coestimulantes diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; el receptor antigénico quimérico comprende: IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; el CAR comprende una región espaciadora situada entre la IL-13 o su variante y el dominio transmembranario; la región espaciadora comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 14-20, 50 y 52; el receptor antigénico quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 10 y 31-48.

En algunas realizaciones, las células T expresan un receptor antigénico quimérico que se une a HER2 comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico que comprende: una secuencia que se orienta a HER2; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3s o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante seleccionado de un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante 4-IBB o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos; y un dominio de señalización CD3s de una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos. En ciertas realizaciones: el dominio que se dirige a HER2 es un scFv de HER2; el scFv de HER2 que comprende la secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFN IKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:49) o una de sus variantes que tiene de 1 a 5 modificaciones de aminoácidos; el receptor antigénico quimérico comprende: una secuencia que se orienta a HER2; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3s o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante seleccionado de un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante 4-IBB o una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos; y un dominio de señalización CD3 de una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos; la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 26 y 27 o una de sus variantes que tiene 1 -5 modificaciones de aminoácidos.

También se describe en la presente una composición para el uso en un método para tratar a un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central que comprende infundir una composición que comprende una cantidad eficaz de células T en un compartimento anatómico de un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central, conteniendo el compartimento anatómico líquido cefalorraquídeo (CSF). En diversas realizaciones: el compartimento anatómico comprende una porción de un sistema ventricular; el compartimento anatómico comprende una porción de un canal central de una médula espinal; la enfermedad maligna del sistema nervioso central incluye un tumor cerebral; la enfermedad maligna del sistema nervioso central incluye un tumor metastasizado; el compartimento anatómico contiene un volumen contiguo de al menos aproximadamente 50 ml de líquido cefalorraquídeo; el compartimento anatómico contiene un volumen contiguo de al menos aproximadamente 100 ml de líquido cefalorraquídeo; y el compartimento anatómico contiene un volumen contiguo de al menos aproximadamente 150 ml de líquido cefalorraquídeo.

Entre los cánceres que se pueden tratar mediante los métodos descritos en la presente están enfermedades malignas primarias del CNS y enfermedades malignas secundarias que surgen de un cáncer localizado en cualquier parte, por ejemplo. Leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el sida, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor teratoide/raboide atípico, carcinoma del sistema nervioso central y de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de huesos, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumores carcinoides, cánceres del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, cordoma, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma de células T cutáneo, tumores embrionarios, cáncer del sistema nervioso central y endometrial, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer esofágico, estesioneuroblastoma, la familia del sarcoma de Ewing de tumores tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular histiocitoma fibroso del hueso, maligno, y osteosarcoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromáticos gastrointestinales (GIST) - véanse sarcoma de tejidos blandos, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, glioma, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, cáncer hepatocelular (hígado), histiocitosis, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, insulinomas (endocrino páncreas), sarcoma de Kaposi, cáncer renal, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer laríngeo, leucemia, cáncer de los labios y la cavidad oral, cáncer hepático (primario), carcinoma lobular in situ (LCIS), cáncer de pulmón, linfoma, macroglobulinemia, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso y osteosarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con carcinoma del tracto de la línea media primario oculto que implica el gen NUT, cáncer de boca, síndromes de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasma de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásticos, neoplasmas mielodisplásticos/mieloproliferativos, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML), mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y el seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer oral, cáncer de la cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer ovárico, cáncer pancreático, papilomatosis, paraganglioma, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumores parenquimales pineales de diferenciación intermedia, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, embarazo y cáncer de mama, linfoma primario del sistema nervioso central (CNS), cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (riñón), cáncer de células transicionales de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivares, sarcoma, síndrome de Sezary, cáncer de pulmón microcítico, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular cutáneo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer tiroideo, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico, cáncer de uréter y pelvis renal, cáncer uretral, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.

En algunas realizaciones, la enfermedad maligna tratada según los métodos divulgados comprende un tumor. En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado una reducción de al menos 50% en el volumen del tumor, una reducción de al menos 60% en el volumen del tumor, una reducción de al menos 70% en el volumen del tumor, una reducción de al menos 80% en el volumen del tumor o una reducción de al menos 90% en el volumen del tumor. Y en algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado la eliminación de la enfermedad maligna.

En algunas realizaciones, el paciente no experimenta toxicidad de grado 3 o superior.

En algunas realizaciones, al paciente se le administró un régimen de esteroides antes del tratamiento con la composición que comprende una cantidad eficaz de células T, y en algunas realizaciones el régimen de esteroides se reduce hasta una dosis inferior después del tratamiento.

En algunas realizaciones, el paciente tiene un incremento en la esperanza de vida en comparación con un paciente que reciba un tratamiento de referencia, incluyendo radioterapia, terapia con fármacos de molécula pequeña, terapia con anticuerpos, o una de sus combinaciones. Y en algunas realizaciones, en las que se puede esperar que el paciente que recibe un tratamiento de referencia ("SOC") sobreviva aproximadamente 15 meses desde el diagnóstico inicial (supervivencia global u OS), el paciente que recibe el tratamiento divulgado puede esperar una OS de 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 meses o más. En algunas realizaciones, el paciente que recibe el tratamiento reivindicado puede esperar una OS de 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90 meses o más.

En algunas realizaciones, la composición comprende al menos 2 x 106 células T o 2 x 106 células T que expresan un receptor superficial celular que se orienta a un antígeno tumoral, mientras que, en algunas realizaciones, la composición comprende al menos 1 x 106 células T o 1 x 106 células T que expresan un receptor superficial celular que se orienta a un antígeno tumoral. En algunas realizaciones, la composición comprende al menos 5 x 106 células T o 5 x 106 células T que expresan un receptor superficial celular que se orienta a un antígeno tumoral, mientras que, en algunas realizaciones, la composición comprende al menos 10 x 106 células T o 10 x 106 células T que expresan un receptor superficial celular que se orienta a un antígeno tumoral. En algunas realizaciones, los métodos divulgados comprendían administraciones repetidas de las composiciones, a modo de ejemplo, repetir la administración de la composición al menos cinco veces, repetir la administración de la composición al menos diez veces o repetir la administración hasta que el paciente reciba una dosis total de al menos 90 x 106 células T o células T que expresan un receptor superficial celular que se orienta a un antígeno tumoral. En algunas realizaciones, la administración se repite una vez por semana o una vez cada dos semanas. En algunas realizaciones, las administraciones repetidas se continúan a lo largo del transcurso de 15 semanas.

También se divulgan en la presente métodos para incrementar un nivel de al menos una citocina o quimiocina en el líquido cefalorraquídeo (CSF) de un paciente, que comprende administrar una composición que comprende una cantidad eficaz de células T en el CSF de un paciente con una enfermedad maligna del sistema nervioso central, en donde el nivel de al menos una citocina o quimiocina en el CSF se incrementa después de la administración de la composición que comprende una cantidad eficaz de células T en comparación con un nivel de referencia de la al menos una citocina o quimiocina antes de la administración.

En algunas realizaciones de los métodos divulgados, el nivel de la al menos una citocina o quimiocina en el CSF después de la administración se incrementa 10 veces o 5 veces en comparación con el nivel de referencia.

En algunas realizaciones, el nivel de al menos cinco o al menos diez citocinas o quimiocinas se incrementa después de la administración de la composición que comprende una cantidad eficaz de células T en comparación con un nivel de referencia de las al menos cinco citocinas o quimiocinas antes de la administración. En algunas realizaciones, la al menos una citocina o quimiocina comprende EGF, eotaxina, FGF, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-a, IFN-y, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1 Ra, IL-1 p, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-1 p, RANTES, TNF-a o VEGF. En algunas realizaciones, el incremento en la expresión de citocina o quimiocina es un incremento local (es decir, específico para el CSF).

También se divulgan en la presente métodos para sostener durante al menos aproximadamente cinco días un incremento en el número de células T, en comparación con un número de referencia, observado en un líquido cefalorraquídeo (CSF) de un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna de un sistema nervioso central, que comprende infundir una cantidad eficaz de células T en un CSF de un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna de un sistema nervioso central, en el que un incremento en el número de células T observado, en comparación con un número de referencia observado antes de la etapa de infusión, se sostiene durante al menos aproximadamente cinco días.

En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de células T (o células T que expresan un receptor superficial celular que se orienta al antígeno tumoral) varía de aproximadamente 1 x 106 células a aproximadamente 100 x 106 células, y en algunas realizaciones, una cantidad eficaz de células T varía de aproximadamente 2 x 106 células a aproximadamente 50 x 106 células.

En algunas realizaciones, el incremento en el número de células T observado se sostiene durante al menos aproximadamente seis días, o el número de células T observado no vuelve al número de referencia durante aproximadamente siete días.

En algunas realizaciones, las células T observadas incluyen células T (p. ej. células T que expresan CAR) infundidas y, en algunas realizaciones, las células T observadas incluyen células T endógenas.

También se divulgan en la presente composiciones para el uso en métodos para incrementar un número de células T en el líquido cefalorraquídeo (CSF) de un paciente que comprende administrar una composición que comprende una cantidad eficaz de células T en el CSF de un paciente con una enfermedad maligna del sistema nervioso central, en donde el número de células T detectable en el CSF se incrementa en comparación con los niveles anteriores a la administración.

En algunos ejemplos, el número de células T detectable en el CSF se incrementa en comparación con los niveles anteriores a la administración durante hasta siete días después de la administración. En algunas realizaciones, las células T detectables en el CSF comprenden células T endógenas y células T que expresan CAR y/o células T tipo 1 y/o células T tipo 2.

En algunos ejemplos, las células T detectables en el CSF comprenden células T CD3+ y, en algunas realizaciones, las células T detectables en el CSF comprenden poblaciones mieloides maduras CD14+ CD11b+ HLA-DR+. En algunos ejemplos, son detectables células B CD19+ y granulocitos CD11b+ CD15+ en el CSF después de la administración de la composición.

En algunos ejemplos, son detectables linfocitos, monocitos y macrófagos reactivos en el CSF después de la administración de la composición.

También se divulgan en la presente métodos para determinar la idoneidad de un paciente con una enfermedad maligna para el tratamiento con una célula T CAR específica de IL-13Ra2 que comprende determinar si una puntuación atribuida a una muestra procedente del paciente exhibe expresión de IL-13Ra2 por encima de un umbral predeterminado.

En algunos ejemplos, la puntuación atribuida a la muestra se calcula al determinar la inmunorreactividad de una muestra tumoral resecada de un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna al teñir inmunohistoquímicamente la muestra con un marcador de IL-13Ra2, analizar la fuerza de la tinción y calcular una puntuación basada en la fuerza de la tinción, en donde una puntuación que corresponde a una intensidad de tinción de moderada a fuerte en la muestra indica que el tratamiento con una célula T CAR específica de IL-13Ra2 es adecuado para el paciente. En algunos ejemplos, la puntuación comprende contar el número de células que tienen una intensidad de tinción débil, moderada o fuerte y asignar a cada intensidad un peso (La puntuación H, un método para cuantificar los resultados inmunohistoquímicos, se basa en la siguiente fórmula: (3 x el porcentaje de células que se tiñen fuertemente) (2 x el porcentaje de células que se tiñen moderadamente) (1 x el porcentaje de células que se tiñen débilmente), dando como resultado un intervalo de 0 a 300). En algunos casos, el paciente tiene una puntuación H que es: mayor de 50, 50-100, mayor de 100, 100-200, mayor de 200, 100-300, o mayor de 250 para el antígeno asociado a tumor pertinente. En algunos ejemplos, una expresión de Ki67 en la muestra también se determina mediante tinción inmunohistoquímica.

También se divulgan en la presente composiciones para el uso en métodos para tratar a un paciente con una enfermedad maligna que comprenden administrar a un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna una composición que comprende una dosis eficaz de células T CAR específicas para IL-13Ra2, en donde el paciente expresa IL-13Ra2 por encima de un umbral predeterminado.

En algunos ejemplos, el umbral predeterminado de expresión de IL-13Ra2 se identificaba previamente como adecuado para un tratamiento que comprende terapia con células T CAR específicas de IL-13Ra2.

TIL son linfocitos infiltrantes de tumores que se pueden aislar de un paciente o donante, expandir ex vivo y reinfundir en el paciente que lo necesite.

Las células T CAR expresan receptores de células T quiméricos que comprenden un dominio extracelular, una región transmembranaria y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular incluye una porción que se une a la célula elegida y, opcionalmente, un espaciador, que comprende, por ejemplo, un dominio FC humano parcial. La porción transmembranaria incluye un dominio transmembranario adecuado, por ejemplo, un dominio transmembranario CD4, un dominio transmembranario CD8, un dominio transmembranario CD28, un dominio transmembranario CD3 o un dominio transmembranario 4IBB. El dominio de señalización intracelular incluye el dominio de señalización procedente de la cadena zeta del complejo CD3 humano (CD3Z) y uno o más dominios coestimulantes, p. ej., un dominio coestimulante 4-1BB. La porción de unión a la célula diana del dominio extracelular (por ejemplo, un scFv o un ligando) permite que el CAR, cuando se exprese sobre la superficie de una T célula, dirija la actividad de las células T a las células que expresan la molécula superficial de la célula a la que se orienta, por ejemplo, HER2 o IL13Ra2, un receptor expresado sobre la superficie células tumorales, incluyendo células de glioma maligno.

Una variedad de células T diferentes, por ejemplo, células T autólogas específicas de un paciente, se puede genomanipular para expresar un TCR o un CAR. Se pueden usar diversos subgrupos de células T. Además, CAR se puede expresar en otras células inmunitarias tales como células NK. Cuando un paciente se trata con una célula inmunitaria que expresa un CAR o TCR, la célula puede ser una célula T autóloga o alogénica. En algunos casos, las células usadas son células T de memoria central (T^cm) CD4+ y CD8+, que son CD45RO+CD62L+, y el uso de estas células puede mejorar la persistencia a largo plazo de las células después de la transferencia adoptiva en comparación con el uso de otros tipos de células T específicas de un paciente. Las células T^cmpueden incluir células CD4+ y células CD8+.

Entre los CAR útiles en los métodos descritos en la presente están los que se orientan a IL13Ra2. Estos CAR pueden incluir IL13 que tiene una modificación de aminoácido, tal como una mutación E13Y, que incrementa la especificidad de unión.

Las células T usadas en las composiciones para el uso descrito en la presente pueden contener una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), en donde el receptor antigénico quimérico comprende: IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1 10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1 -10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos.

La inclusión de un dominio coestimulante, tal como el dominio coestimulante 4-1BB (CD137) o CD28 en serie con CD3Z en la región intracelular permite que la célula T reciba señales coestimulantes. Así, en diversos ejemplos, el dominio coestimulante se selecciona del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4-IBB o una de sus variantes que tiene 1 -10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos. En ciertos ejemplos, está presente un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1 -10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos.

En realizaciones adicionales de las composiciones para el uso, el CAR expresado por las células T comprende: una variante de una IL13 humana que tiene 1 -10 modificaciones de aminoácidos que incrementan la especificidad de unión para IL13Ra2 frente a IL13Ra1; la IL-13 humana o su variante es una variante de IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 con de 1 a 5 modificaciones de aminoácidos, con la condición de que el aminoácido en la posición 11 de SEQ ID NO:3 sea distinto de E; dos dominios coestimulantes diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos; dos dominios coestimulantes diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3Z de una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; una región espaciadora situada entre la IL-13 o una de sus variantes y el dominio transmembranario (p. ej., la región espaciadora comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 14-20, 50 y 52); el espaciador comprende una región de bisagra de IgG; la región espaciadora comprende 10-150 aminoácidos; el dominio de señalización 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; el dominio de señalización CD3Z comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; y un conector de 3 a 15 aminoácidos que está situado entre el dominio coestimulante y el dominio de señalización CD3 Z o una de sus variantes. En ciertas realizaciones en las que hay dos dominios coestimulantes, uno es un dominio coestimulante 4-IBB y el otro un dominio coestimulante seleccionado de: CD28 y CD28gg

En algunas realizaciones de las composiciones para el uso descrito en la presente, las células T alojan una molécula de ácido nucleico que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 10 y 31-48; el receptor antigénico quimérico comprende una región IL-13/IgG4/CD4t/41-BB que comprende el aminoácido de SEQ ID NO:11 y un dominio de señalización CD3 Z que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; y el receptor antigénico quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 y 31-48.

También se divulgan métodos que comprenden la administración intraventricular de una población de células T humanas transducidas por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor antigénico quimérico, en donde el receptor antigénico quimérico comprende: IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1 10 modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1 -10 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1 -10 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos. En diversas realizaciones: la población de células T humanas comprende un vector que expresa un receptor antigénico quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 10 y 31-48; la población de células T humanas comprende células T de memoria central (T^cmcélulas) (p. ej., al menos 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células T^cm; al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 35% de las células T o las células T^cmson CD4+ y al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 35% de las células T o las células T^cmson células CD8+).

También se describe una composición para el uso en un método para tratar el cáncer en un paciente que comprende la administración al CNS de una población de células T humanas autólogas o alogénicas (p. ej., células T autólogas o alogénicas que comprenden células T^cm, p. ej., al menos 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células T^cm; al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% de las células T^cmson CD4+ y al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% de las células T^cmson células CD8+) transducidas por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor antigénico quimérico, en donde el receptor antigénico quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 10 y 31-48. En diversos ejemplos: la población de células T humanas comprende células T de memoria central; el cáncer es glioblastoma; y las células T humanas transducidas se preparaban mediante un método que comprende obtener células T del paciente, tratar las células T para aislar células T de memoria central, y transducir al menos una porción de las células de memoria central con un vector viral que comprende un casete de expresión que codifica un receptor antigénico quimérico, en donde el receptor antigénico quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 10 y 31-48.

También se describen composiciones para el uso en métodos en los que las células T administradas al paciente alojan una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de y SEQ ID NOs: 10 y 31-48; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 10 y 31-48 excepto por la presencia de no más de 5 sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:10 y SEQ ID NOs: 10 y 31-48 excepto por la presencia de no más de 5 sustituciones de aminoácidos; y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:10 y SEQ ID NOs: 10 y 31-48 excepto por la presencia de no más de 2 sustituciones de aminoácidos.

Se describen en la presente composiciones para el uso en métodos para tratar a un paciente mediante la administración al CSF de células T que alojan una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), en donde el receptor antigénico quimérico comprende un scFv orientado a HER2 (p. ej., comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSL QPEDFATYYcQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLScAASGFN IKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVTVSS; SEQ ID NO: 49) o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos; una región espaciadora; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1 -10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1 -10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos.

En diversos ejemplos, el dominio coestimulante se selecciona del grupo que consiste en: un dominio coestimulante

CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante

4-IBB o una de sus variantes que tiene 1 -10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante

OX40 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos. En ciertos ejemplos, está presente un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos.

En ejemplos adicionales, las células T administradas al paciente expresan un CAR que comprende: un scFv dirigido a HER2 (p. ej., un scFv humanizado); dos dominios coestimulantes diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-10 (p. ej., 1 o 2) modificaciones de aminoácidos;

dos dominios coestimulantes diferentes seleccionados del grupo que consiste en: un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio coestimulante 4IBB o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante OX40 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene

1-2 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-2 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3Z de una de sus variantes que tiene 1 -2 modificaciones de aminoácidos; una región espaciadora situada entre la IL-13 o su variante y el dominio transmembranario (p. ej., la región espaciadora comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 14-20, 50 y 52); el espaciador comprende una región de bisagra de IgG; la región espaciadora comprende 10-150 aminoácidos; el dominio de señalización 4-1BB comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; el dominio de señalización CD3Z comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID

NO:7; y un conector de 3 a 15 aminoácidos que está situado entre el dominio coestimulante y el dominio de señalización CD3 Z o una de sus variantes. En ciertos ejemplos, cuando hay dos dominios coestimulantes, uno es un dominio coestimulante 4-IBB y el otro un dominio coestimulante seleccionado de: CD28 y CD28gg

En algunos ejemplos, las células T administradas al paciente alojan una molécula de ácido nucleico que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 53-56.

También se divulgan métodos que comprenden la administración intraventricular de una población de células T humanas transducidas por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor antigénico quimérico que comprende: un scFv dirigido a HER2; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos y un do transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos; un do coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos. En diversos ejemplos,: la población de células T humanas comprende un vector que expresa un receptor antigénico quimérico que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NOs: 53-56; la población de células T humanas está comprendida por células T de memoria central (células T^cm) (p. ej., al menos

20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células T^cm; al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% de las células T o células T^cmson CD4+ y/o al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% de las células T o células T^cmson células CD8+).

También se describe una composición para el uso en un método para tratar el cáncer en un paciente, que comprende la administración intraventricular de una población de células T humanas autólogas o alogénicas (p. ej., células T autólogas o alogénicas que comprenden células T^cm, p. ej., al menos 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80% de las células son células T^cm; al menos 15%, 20%, 25%, 30%, 35% de las células T^cmson CD4+ y/o al menos 15%, 20%,

25%, 30%, 35% de las células TCM son células CD8+) transducidas por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor antigénico quimérico, en donde el receptor antigénico quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de s Eq ID NOs: 53-56. En diversos ejemplos, la población de células T humanas comprende células T de memoria central; el cáncer es glioblastoma; y las células T humanas transducidas se prepararon mediante un método que comprende obtener células T del paciente, tratar las células T para aislar células T de memoria central, y transducir al menos una porción de las células T de memoria central con un vector viral que comprende un casete de expresión que codifica un receptor antigénico quimérico, en donde el receptor antigénico quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 53-56.

También se describe un método para tratar el cáncer en un paciente, que comprende la administración intraventricular de una población de células T humanas autólogas o alogénicas (p. ej., células T autólogas o alogénicas que comprenden células T^cmque alojan: una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 53-56; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 53-56, excepto por la presencia de no más de 5 sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 53-56, excepto por la presencia de no más de 5 sustituciones de aminoácidos; y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 53-56, excepto por la presencia de no más de 2 sustituciones de aminoácidos.

Ciertos CAR descritos en la presente, por ejemplo, el IL13(EQ)BBZ CAR y el IL13(EQ)CD28-BBZ CAR, tienen ciertas características beneficiosas en comparación con ciertos otros CAR dirigidos a IL13. Por ejemplo, tienen una selectividad mejorada para IL13Ra, provocan una producción inferior de citocina Th2, particularmente una producción inferior de IL13.

Las células T que expresan un CAR que se dirige a IL13Ra2 pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres tales como glioblastoma, así como otros cánceres que expresan IL13Ra2. Así, esta divulgación incluye métodos para tratar el cáncer usando células T que expresan un CAR descrito en la presente.

Las células T que expresan un CAR que se orienta a HER2 pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres tales como glioblastoma, así como otro cáncer que exprese HER2, por ejemplo, cáncer de mama que se ha extendido al sistema nervioso central. Así, esta divulgación incluye métodos para tratar el cáncer usando células T que expresan un CAR descrito en la presente.

El CAR descrito en la presente puede incluir una región espaciadora situada entre el dominio de orientación y el dominio transmembranario. Se puede usar una variedad de diferentes espaciadores. Algunos de ellos incluyen al menos una porción de una región Fc humana, por ejemplo, una porción de bisagra de una región Fc humana o un dominio CH3 o sus variantes. La Tabla 1 posterior proporciona diversos espaciadores que se pueden usar en los CARs descritos en la presente.

Tabla 1: Ejemplos de Espaciadores

Algunas regiones espaciadoras incluyen la totalidad o parte de una región de bisagra de inmunoglobulina (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), es decir, la secuencia que se encuentra entre los dominios CH1 y CH2 de una inmunoglobulina, p. ej., una bisagra de Fc de IgG4 o una bisagra de CD8. Algunas regiones espaciadoras incluyen un dominio CH3 de inmunoglobulina o tanto un dominio CH3 como un dominio CH2. Las secuencias derivadas de inmunoglobulina pueden incluir una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, p. ej., sustituciones que reducen la unión no orientada.

Una "modificación de aminoácido" se refiere a una sustitución, inserción y/o eliminación de aminoácido en una secuencia proteínica o peptídica. Una "sustitución de aminoácido" o "sustitución" se refiere al reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia peptídica o proteínica original por otro aminoácido. Una sustitución se puede realizar para cambiar un aminoácido en la proteína resultante de un modo no conservativo (es decir, al cambiar el codón de un aminoácido perteneciente a un agrupamiento de aminoácidos que tiene un tamaño particular o característico de un aminoácido perteneciente a otro agrupamiento) o de un modo conservativo (es decir, al cambiar el codón de un aminoácido perteneciente a un agrupamiento de aminoácidos que tiene un tamaño particular o característico de un aminoácido perteneciente al mismo agrupamiento). Este cambio conservativo conduce generalmente a menos cambio en la estructura y la función de la proteína resultante. Los siguientes son ejemplos de diversos agrupamientos de aminoácidos: 1) Aminoácidos con grupos R apolares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina; 2) Aminoácidos con grupos R polares no cargados: glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina; 3) Aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente a pH 6,0): ácido aspártico, ácido glutámico; 4) Aminoácidos básicos (cargados positivamente a pH 6,0): lisina, arginina, histidina (a pH 6,0). Otro agrupamiento puede ser los aminoácidos con grupos fenilo: fenilalanina, triptófano y tirosina.

Una variedad de dominios transmembranarios se pueden usar en CAR expresados por las células usadas en los métodos descritos en la presente. La Tabla 2 incluye ejemplos de dominios transmembranarios adecuados. Cuando esté presente una región espaciadora, el dominio transmembranario está situado carboxiterminal a la región espaciadora.

Tabla 2: Ejemplos de Dominios Transmembranarios

Muchos de los CAR expresados por las células usadas en los métodos descritos en la presente incluyen uno o más (p. ej., dos) dominios coestimulantes. El dominio o los dominios coestimulantes están situados entre el dominio transmembranario y el dominio de señalización CD3Z. La Tabla 3 incluye ejemplos de dominios coestimulantes adecuados junto con la secuencia del dominio de señalización CD3Z.

Tabla 3: Ejemplos de Dominios Coestimulantes

d e s c r ip c ió n de lo s d ib u jo s

La Figura 1 es una representación esquemática de IL13(E13Y)-zetacina CAR (Izquierda) compuesto por la variante de IL-13 humana específica de IL13Ra2 (huIL-13(E13Y)), el espaciador de Fc de IgG4 humana (huY4Fc), la transmembrana CD4 humana (huCD4 tm) y porciones citoplásmicas de la cadena CD3Z humana (huCD3Z cyt) según se indica. También se representa un IL13(EQ)BBZ CAR que es el mismo que la IL13(E13Y)-zetaquina con la excepción de las dos mutaciones puntuales, L235E y N297Q, indicadas en rojo, que están situadas en el dominio CH2 del espaciador IgG4, y la adición de un dominio citoplásmico 4-1BB coestimulante (4-1BB cyt).

Las Figuras 2A-C representan ciertos vectores y marcos de lectura abiertos. A es un diagrama del marco de lectura abierto de ADNc de la construcción IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t de 2670 nucleótidos, donde se indican el ligando específico para IL13Ra2 IL13(E13Y), donde se indican los dominios de bisagra de Fc de IgG4(EQ), transmembranario CD4, de señalización citoplásmica 4-1BB, conector de tres glicinas y de señalización citoplásmica CD3Z del IL13(EQ)BBZ CAR, así como las secuencias de salto ribosómico T2A y de CD19 truncadas. También se indican las secuencias de receptor de GM-CSF humano alfa y de señalización CD19 que conducen la expresión superficial del IL13(EQ)BBZ CAR y CD19t. B es un diagrama de las secuencias flanqueadas por repeticiones terminales largas (indicadas por 'R') que se integrarán en el genoma del hospedador. C es un mapa del plásmido IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7.

La Figura 3 representa la construcción de pHIV7.

La Figura 4 representa los elementos de pHIV7.

La Figura 5 representa un esquema de producción para IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cm.

Las Figuras 6A-C representan los resultados del análisis citométrico de flujo de la expresión del transgén superficial y el marcador de células T. IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cmHD006.5 y HD187.1 se cotiñen con anti-IL13-PE y anti-CD8-FITC para detectar células CAR+ CD8+ CAR+ y CD4+ (es decir, negativas a CD8) (A), o anti-CD19-PE y anti-CD4-FITC para detectar células CAR+ CD4+ CD19t+ y CD8+ (es decir, negativas a ^cD4) (B). IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cmHD006.5 y HD187.1 se teñían con anti-CD3, TCR, CD4, c D8, CD62L y CD28 conjugados a fluorocromo (histogramas grises) o controles isotípicos (histogramas negros) (C). En todos los casos, los porcentajes se basaban en linfocitos viables (negativos a DAPI) isotipo anterior teñido.

Las Figuras 7A-D representan los resultados de experimentos que comparan la vía del aporte de células T CAR+ (i.c. frente a i.v.) para tumores establecidos grandes. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TSs (1 x 105) se implantaron en el prosencéfalo derecho de ratones NSG. Los días 19 y 26, los ratones fueron inyectados i.v. a través de la vena caudal bien con 5 x 106 CAR+ IL13(EQ)BBZ+ TCM (11,8 x 106 células totales; n = 4) o bien TCM simuladas (11,8 x 106 células; n = 4). Alternativamente, los días 19, 22, 26 y 29 los ratones fueron inyectados i.c. bien con 1 x 106 CAR+ IL13(EQ)BBZ+ TCM (2,4 x 106 células totales; n = 4) o bien TCM simuladas (2,4 x 106 células; n = 5). El flujo ffLuc promedio (fotones/s) a lo largo del tiempo muestra que IL13(EQ)BBZ TCM aportadas i. e. median en la regresión tumoral de tumores de 19 días. En comparación, las células T aportadas i.v. no muestran reducción en la carga tumoral en comparación con controles no tratados o de TCM simuladas (A). La curva de supervivencia de Kaplan Meier demuestra una supervivencia mejorada para ratones con IL13(EQ)BBZ TCM i. e. en comparación con ratones tratados con CAR+ TCM administradas i. v. (prueba de rango logarítmico p = 0,0003) (B). H&E y CD3 IHC representativas de ratones tratados i.v. (C) frente a i. e. (D) con IL13(EQ)BBZ+ TCM. Solo se detectaron células T CD3+ en el grupo tratado i. e., sin células CD3+ detectadas en el tumor o que rodean el parénquima cerebral para ratones tratados i.v.

Las Figuras 8A-B representan los resultados de estudios que muestran que las células T CAR+ inyectadas intracranealmente, bien intratumoralmente (i.c.t.) o bien intraventricularmente (i.c.v.), pueden trasladarse a tumores del hemisferio opuesto. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TSs (1 x 105) se implantaron estereotácticamente en los prosencéfalos derecho e izquierdo de ratones NSG. El día 6, los ratones fueron inyectados i. e. en la zona tumoral derecha con 1,0 x 106 IL13(EQ)BBZ+ TCM (1,6 x 106 células totales; 63% CAR; n = 4). Esquema de modelo experimental de glioma multifocal (A). Células T que muestran CD3 IHC que se infiltran en las zonas tumorales tanto derecha como izquierda (B).

La Figura 9 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EQ)BB^/CD19t+ (SEQ ID NO:10).

La Figura 10 representa una comparación de secuencias de IL13(EQ)41BBZ[IL13{EQ}41BBZ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) y CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).

La Figura 11 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm2-41 BB Zeta (SEQ ID NO:31 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:39 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-CD8h3-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID NO:32 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:40 sin el péptido de señalización GMSCFRa).

La Figura 13 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-IgG4(HL-CH3)-CD4tm-41BB-Zeta (SEQ ID NO:33 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:41 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 14 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta (SEQ ID NO:34 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID n O:42 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 15 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-Conector-CD28tm-CD28gg-41 BB-Zeta (SEQ ID NO:35 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:43 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 16 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-HL-CD28m-CD28gg-41 BB-Zeta (SEQ ID NO:36 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:44 sin el péptido de señalización GMSCFRa).

La Figura 17 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID NO:37 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ iD NO:45 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 18 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY) IgG4(L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-41BB-Zeta (SEQ ID NO:38 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:46 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 19 representa la secuencia de aminoácidos de IL13(EmY)-CD8h3-CD8tm-41BB Zeta (SEQ ID NO:47 con el péptido de señalización GMCSFRa; SEQ ID NO:48 sin el péptido de señalización GMCSFRa).

La Figura 20 representa la secuencia de aminoácidos de Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t. Los diversos dominios se listan en orden debajo de la secuencia y se indican al alternar subrayado y no subrayado. La secuencia del CAR maduro (SEQ ID NO:26) no incluye el péptido de señalización GMCSFRa, la secuencia de salto T2A o CD19 truncado.

La Figura 21 representa la secuencia de aminoácidos de Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t. Los diversos dominios se listan en orden debajo de la secuencia y se indican al alternar subrayado y no subrayado. La secuencia del CAR maduro (SEQ ID NO:27) no incluye el péptido de señalización GMCSFRa, la secuencia de salto T2A o CD19 truncado.

Las Figuras 22A-D representan construcciones de CAR específicas de HER2 y datos de expansión de células T CAR.

Las Figuras 23A-D representan la caracterización in vitro de células T HER2-CAR contra líneas celulares de cáncer de mama.

Las Figuras 24A-F representan el resultado de estudios sobre la actividad tumoral in vitro de células T HER2-CAR.

Las Figuras 25A-I representan el resultado de estudios sobre la eficacia antitumoral in vivo de células T HER2-CAR aportadas intratumoralmente.

Las Figuras 26A-D representan los resultados de estudios sobre el aporte local de células T HER2-CAR en modelos de xenoinjertos de BBM ortotópicos humanos.

Las Figuras 27A-D representan los resultados de estudios sobre el aporte intraventricular de células T HER2-CAR.

La Figura 28 representa esquemáticamente las localizaciones de inyección de células tumorales y la inyección de células T CAR para un estudio de inyección intratumoral e intraventricular de células T CAR que se orientan a IL13a2R en un modelo murino de glioblastoma.

Las Figuras 29A-C representan los resultados de estudios que demuestran la regresión de xenoinjertos tumorales de glioma establecidos después de la administración de IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cm. Células tumorales ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) se implantaron estereotácticamente en los prosencéfalos derecho e izquierdo de ratones NSG. El día 6, los ratones fueron inyectados bien ict o bien icv con 1 x 106 IL13(EQ)BBZ+ Tcm (1,6 x 106 células totales; 63% CAR+) según se describe en la Figura 4.1 anteriormente. A , Ratones representativos de cada grupo que muestran carga tumoral relativa usando Xenogen Living Image. B, Flujo de Xenogen promedio de los hemisferios cerebrales izquierdo y derecho (región de interés, ROI) a partir de los ratones (n = 4-5) de cada grupo, donde cada barra sucesiva representa el día 5, 9, 12, 15 y 19, respectivamente. *, p < 0,05 cuando se comprara con la ROI respectiva y día/barra del grupo PBT030-2 no tratado usando una prueba de la t de Student desapareada. C, Flujo promedio de Xenogen de todo el cerebro 13 días después de la inyección de células T. *, p = 0,0407 cuando se compara el grupo icv con el grupo de PBT030-2 no tratado usando la prueba de la t de Student desapareada. Estos datos son representativos de tres experimentos de GBM multifocales separados.

La Figura 30 representa los resultados de estudios que demuestran que se detectan células huCD3+ en los tumores cerebrales/hemisferios derecho e izquierdo después de la administración ict e icv de IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cm. Células tumorales ffLuc+ PBT030-2 (1 x 105) se implantaron estereotácticamente en los prosencéfalos derecho e izquierdo de ratones NSG. El día 6, los ratones fueron inyectados bien ict (imágenes de la izquierda) o bien icv (imágenes de la derecha) con 1 x 106 IL13(EQ)BBZ+ Tcm (1,6 x 106 células totales; 63% CAR+). Una semana (imágenes de la parte superior) y dos semanas (imágenes de la parte inferior) después de la administración de células T, se sacrificaron 2-3 ratones de cada grupo, los cerebros se recogieron, se embebieron en parafina y se realizó IHC con anticuerpo anti-CD3 humano para detectar células T. Se representan imágenes de IHC representativas de las zonas tumorales izquierda y derecha de ratones de cada grupo (ict: m406 y m410; icv: m414 y m415). Las inserciones representan las imágenes del flujo de xenogen de los ratones el día del sacrificio y la recogida del cerebro.

La Figura 31 representa esquemáticamente el transcurso del tiempo de la preparación y el tratamiento de células T CAR para un experimento clínico de células T CAR para el tratamiento del glioblastoma (A) y proporciona varios esquemas de dosificación (B).

La Figura 32 presenta un análisis de la persistencia de células T CAR, según se comprueba mediante CD19 (A) y la presencia de células GBM según se comprueba mediante la expresión de IL13Ra2 (B).

La Figura 33 presenta resultados de la obtención de imágenes procedentes del Paciente UPN097 en la región del catéter usado para la administración intratumoral.

La Figura 34 es una serie de gráficos que muestran los niveles de diversas citocinas durante el ciclo de tratamiento para un paciente.

Las Figuras 35A-C son imágenes que representan la egresión de glioblastoma multifocal recurrente, incluyendo metástasis raquídea, después del aporte intraventricular de células T CAR orientadas a IL13Ra2. Un paciente que presenta un GBM multifocal recurrente, incluyendo una zona metastásica en la columna vertebral, y enfermedad leptomeníngea extensiva se trató con seis infusiones locales de IL13BBZ Tcm en la cavidad de resección del mayor foco tumoral recurrente (1 ciclo de 2 M y 5 ciclos de 10 M de células T CAR+). Aunque la zona de inyección de células T CAR permanecía estable sin evidencia de recurrencia de enfermedad a lo largo de 7 semanas, otros focos de enfermedad distantes de la zona de inyección de células T CAR continuaba progresando (datos no mostrados). A continuación, este paciente recibía semanalmente cinco infusiones intraventriculares (icv) de IL13BBZ Tcm (1 ciclo de 2 M y 4 ciclos de 10 M de células T CAR+). Se muestran imágenes de MRI y/o PET de (A) sección cerebral transversal, (B) sección cerebral sagital y (C) sección transversal (superior) y frontal (inferior) de la columna vertebral antes (izquierda) y una semana después (derecha) de la finalización de la terapia i.c.v., con las zonas de lesión tumoral indicadas por flechas rojas en cada imagen.

Las Figuras 36A-B muestran regímenes de tratamiento con incorporación en NCT02208362 y un protocolo de uso compasivo. La incorporación en NCT02208362 se fijó el día 0 (A), con inicio del protocolo de uso compasivo el día 107 (B). NovoTTF-100A, un dispositivo médico portátil que aporta campos eléctricos alternos de baja intensidad y frecuencia intermedia por medio de electrodos del cuero cabelludo desechables no invasivos; FGFR, receptor de factor de crecimiento de fibroblastos; MRI, obtención de imágenes por resonancia magnética, todas las cuales se realizaron sobre el cerebro a menos que se indique otra cosa; ICT, intracavitaria; PET, tomografía de emisión positrónica, realizada en las zonas indicadas; ICV, intracerebroventricular.

Las Figuras 37A-C muestran la inmunohistoquímica de tumores primarios y recurrentes. Un tumor resecado en el diagnóstico inicial (A) y un tumor recurrente (T1) resecado en el momento de la colocación de Rickham bajo NCT02208362 (B, C). Se representa la tinción inmunoquímica usando DAB bien específica para IL13Ra2 o bien específica para Ki67 con tinción de contraste con hematoxilina, con recuadros rojos que rodean las imágenes ampliadas sucesivas de izquierda a derecha.

Las Figuras 38A-B muestran la identificación de lesiones tumorales. (A) Identificación de las características de lesiones de GBM T1-T8. (B) Barridos de MRI cerebrales que representan las zonas de T1-T7.

Las Figuras 39A-C muestran que la región tumoral resecada permanece estable, sin evidencia de progresión/recurrencia de enfermedad después del aporte intracavitario de IL13BBZ TCM. (A) Análisis citométrico de flujo del producto celular de IL13BBZ TCM. Fila superior, la transducción la construcción indicada conducía la expresión superficial coordinada del IL13BBZ CAR (detectado con anti-IL13) y el marcador CD19t (detectado con anti-CD19) a través de la secuencia de salto ribosómico T2A. Los perfiles de tinción para los marcadores de células T TCR-a/p, CD3, CD4 y CD8, así como los marcadores de agotamiento LAG-3, TIM-3, KLRG1 y PD-1 se representan en la fila del medio; los perfiles de tinción para los marcadores de memoria CD62L, CD45RO, CCR7, CD27 y CD28, así como el marcador de células T vírgenes CD45RA, se representan en la fila inferior. (B) Esquema de tratamiento bajo NCT02208362. Después de que el paciente experimentara recurrencia y se sometiera a escisión del tumor con colocación de un catéter de Rickham intracavitario (ICT), se administraron 6 ciclos de dosis de células ICT (1 ciclo de 2 x 106 y 5 ciclos de 10 x 106 células CAR+) con un descanso de una semana entre los ciclos 3 y 4. Flecha roja, zona de aporte de IL13BBZ TCM. (C) Los círculos amarillos en barridos de MRI cerebrales muestran la zona de tumor resecado en la que se colocaba el catéter (T1), así como las zonas tumorales solo resecadas en el lóbulo frontal (T2, T3) y las zonas tumorales recientemente surgidas (T6, T7) a lo largo del período de tratamiento ICT de 51 días.

Las Figuras 40A-E muestran la regresión de glioblastoma multifocal recurrente, incluyendo metástasis en la columna vertebral, después del aporte intracerebroventricular de células T CAR orientadas a IL13Ra2. (A) Esquema de tratamiento bajo un protocolo de uso compasivo. Después de que el paciente se sometiera a la colocación de un catéter de Rickham intracerebroventricular (ICV), se administraron 5 ciclos de dosis de células ICV (1 ciclo de 2 x 106 y 4 ciclos de 10 x 106 células CAR+, indicados como ciclos 7 a 11) con un descanso de una semana entre los ciclos 9 y 10. Flecha roja, zona de aporte de IL13BBZ TCM. Imágenes de MRI y/o PET de (B) secciones cerebrales transversales, (C) secciones cerebrales sagitales y (D) sección transversal (parte superior) y frontal (parte inferior) de la columna vertebral antes (izquierda) y una semana después de la finalización (derecha) de la terapia ICV, con zonas de lesión tumoral indicadas por círculos amarillos en cada imagen. (E) Las superficies de lesión máximas para tumores no resecados T4-T8 representan sus respectivas disminuciones a lo largo del tiempo con terapia ICV.

La Figura 41 muestra la regresión de GBM multifocal recurrente después del aporte ICV de células T CAR orientadas a IL13Ra2. Se representan las superficies de lesión máximas para tumores no resecados T4-T7.

La Figura 42A-C muestra el análisis de infiltrados celulares y citocinas procedentes de muestras de líquido cefalorraquídeo (CSF). (A) Números de infiltrados celulares de CSF agregados después de los ciclos ICV 9, 10 y 11, con evidencia citométrica de flujo de células B CD19+, células T tanto CAR+ (es decir, CD19t+) como CD3+ no genomanipuladas, granulocitos CD11b+ CD15+ y monocitos CD11b+ CD14+ HLA-DR+. (B) Evaluación de la población de células T CD3+ en el CSF con respecto a la presencia de células T genomodificadas (es decir, CD19t+). Células acotadas a CD3 procedentes del CSF recogido el día indicado de los ciclos 9, 10 y 11 se cotiñeron con respecto a CD19 y CD8 (histogramas superiores). Los porcentajes de células inmunorreactivas se usaron para calcular los números de células T CD3+ totales y células CD19+ CD3+ (IL13BBZ TCM) por ml de fluido CSF en cada momento. (C) Cambio en número de veces en los niveles de citocinas con los ciclos de tratamiento ICV 7-11. Solo se representan las citocinas procedentes del análisis multiplicado por 30 que exhibían un cambio de 10 veces o más en comparación con los niveles anteriores al tratamiento.

d e s c r ip c ió n d e t a l l a d a

Posteriormente, se describe la estructura, la construcción y la caracterización de diversas células T CAR y su uso en el tratamiento de cánceres del sistema nervioso central. Un antígeno quimérico (CAR) es una biomolécula recombinante que contiene, como mínimo, un dominio de reconocimiento extracelular, una región transmembranaria y un dominio de señalización intracelular. Por lo tanto, el término "antígeno", no se limita a moléculas que se unen a anticuerpos, sino a cualquier molécula que se una específicamente a una diana. Por ejemplo, un CAR puede incluir un ligando que se une específicamente a un receptor superficial celular. El dominio de reconocimiento extracelular (también denominado el dominio extracelular o simplemente por el elemento de reconocimiento que contiene) comprende un elemento de reconocimiento que se une específicamente a una molécula presente sobre la superficie celular de una célula diana. La región transmembranaria ancla el CAR en la membrana. El dominio de señalización intracelular comprende el dominio de señalización desde la cadena zeta del complejo CD3 humano y opcionalmente comprende uno o más dominios de señalización coestimulantes. Los CARs tanto se pueden unir a antígeno como transducir la activación de células T, independientemente de la restricción de MHC. Así, los CARs son inmunorreceptores "universales" que pueden tratar a una población de pacientes con tumores positivos a antígenos independientemente de su genotipo de HLA. La inmunoterapia adoptiva que usa linfocitos T que expresan un CAR específico de un tumor puede ser una estrategia terapéutica potente para el tratamiento del cáncer.

En algunos casos, el CAR descrito en la presente se puede producir usando un vector en el que el marco de lectura abierto del CAR está seguido por una secuencia de salto ribosómico T2A y un CD19 truncado (CD19t), que carece de la cola de señalización citoplásmica (truncada en el aminoácido 323). En esta disposición, la coexpresión de CD19t proporciona un marcador superficial no inmunogénico inerte que permite la medida precisa de células genomodificadas, y permite la selección positiva de células genomodificadas, así como un seguimiento celular eficaz y/o una obtención de imágenes de las células T terapéuticas in vivo después de la transferencia adoptiva. La coexpresión de CD19t proporciona un marcador para la orientación inmunológica de las células transducidas in vivo usando anticuerpos y/o reactivos inmunotoxínicos clínicamente disponibles para eliminar selectivamente las células terapéuticas, y funciona de ese modo como un conmutador suicida.

Las composiciones divulgadas para el uso en métodos de tratamiento que usan células T CAR pueden hacerse actuar a diversas dosis y a través de diversos espacios de tiempo. Por ejemplo, un paciente que reciba esa infusión, administración o inyección de células T CAR (p. ej. células T CAR específicas para IL-13Ra2) puede recibir una sola dosis que comprende entre 1 x 106 y 15 x 106 células. En otras palabras, una sola dosis para el uso en los métodos divulgados puede comprender 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106, 6 x 106, 7 x 106, 8 x 106, 9 x 106, 10 x 106, 11 x 106, 12 x 106, 13 x 106, 14 x 106 o 15 x 106 células. A lo largo del transcurso del tratamiento, un paciente puede recibir una dosis acumulativa o total de células entre 20 x 106 y 150 x 106 células T. A modo de ejemplo, el paciente puede recibir aproximadamente 20 x 106, aproximadamente 25 x 106, aproximadamente 30 x 106, aproximadamente 35 x 106, aproximadamente 40 x 106, aproximadamente 45 x 106, aproximadamente 50 x 106, aproximadamente 55 x 106, aproximadamente 60 x 106, aproximadamente 65 x 106, aproximadamente 70 x 106, aproximadamente 75 x 106, aproximadamente 80 x 106, aproximadamente 85 x 106, aproximadamente 90 x 106, aproximadamente 95 x 106, aproximadamente 100 x 106, aproximadamente 105 x 106, aproximadamente 110 x 106, aproximadamente 115 x 106, aproximadamente 120 x 106, aproximadamente 125 x 106, aproximadamente 130 x 106, aproximadamente 135 x 106, aproximadamente 140 x 106, aproximadamente 145 x 106 o aproximadamente 150 x 106 o más células T a lo largo del transcurso del tratamiento. En algunas realizaciones, un paciente puede recibir una dosis total de al menos 90 x 106 células T. En una realización, un paciente puede recibir una dosis total de 94 x 106 células T.

Por otra parte, las dosis se pueden administrar según diferentes regímenes y calendarios. Por ejemplo, los métodos divulgados pueden comprender una infusión, administración o inyección una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, o una vez cada seis meses. En algunas realizaciones, los métodos divulgados pueden comprender la infusión continua, a modo de ejemplo, desde una bomba portátil. De forma similar, el transcurso de tiempo total de tratamiento puede ser aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 55 semanas, aproximadamente 60 semanas, aproximadamente 65 semanas, aproximadamente 70 semanas, aproximadamente 75 semanas, o más. El paciente puede recibir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 o más infusiones, administraciones o inyecciones de células T a lo largo del transcurso del tratamiento según los métodos divulgados. Por ejemplo, en una realización, un paciente puede recibir 11 infusiones de células T a lo largo del transcurso de 15 semanas.

El tratamiento del cáncer, y más específicamente gliomas como glioblastoma, según los métodos divulgados puede dar como resultado numerosos efectos terapéuticos. A modo de ejemplo, el tratamiento con las células T CAR divulgadas puede dar como resultado un incremento en el nivel de citocinas y quimiocinas en el CSF de un paciente que se trate según los métodos divulgados. La expresión de citocinas y/o quimiocinas se puede incrementar en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 100%, o la expresión de citocinas y/o quimiocinas se puede incrementar en al menos 1 vez, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces en comparación con niveles de referencia, según se mide antes del tratamiento con una composición que comprende células T CAR. Este incremento en la expresión se puede observar para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 o más citocinas o quimiocinas.

En particular, la expresión de al menos uno de EGF, eotaxina, FGF, G-CSF, GM-CSF, HGF, IFN-a, IFN-y, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-1 Ra, IL-1 p, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, MIP-1a, MIP-1 p, RANTES, TNF-a y VEGF se puede incrementar como resultado del tratamiento con células T CAR según se divulga en la presente. Por otra parte, el incremento en la expresión de citocinas y/o quimiocinas puede ser local (es decir el incremento solo es observable en el CNS y el CFS, mientras que los niveles séricos de citocinas y quimiocinas permanecen inalterados.

El tratamiento según los métodos divulgados también puede dar como resultado un incremento en células T detectables en el CSF. Mientras que al menos algunas de las células T detectables en el CSF después del tratamiento sean probablemente células T que expresen CAR, puede haber un incremento en células T endógenas que son incorporadas al CSF. Aunque sin querer limitarse por una teoría, el incremento en células T endógenas puede ser un resultado de la incorporación de células T cooperadoras Tipo 1 y Tipo 2 debido al incremento en los niveles de citocinas locales. Adicionalmente, las células T detectables pueden comprender células T CD3+, así como poblaciones mieloides maduras CD14+ CD11b+ HLA-DR+, células B CD19+ y granulocitos CD11b+ CD15+ y/o linfocitos, monocitos y macrófagos reactivos.

El incremento en el número de células T en el CSF puede ser detectable durante un período específico después del tratamiento según los métodos divulgados. Un incremento detectable en las células T en el CSF puede persistir o estar sostenido durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más días después de la administración de una composición que comprende células T. Por ejemplo, un incremento en el número de células T observado en el CSF puede no volver hasta niveles de referencia (es decir el número de células T detectable antes del tratamiento) durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días. El número de células T detectable en el CSF se puede incrementar en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 100%, o en al menos 1 vez, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 11 veces, al menos 12 veces, al menos 13 veces, al menos 14 veces o al menos 15 veces en comparación con los niveles de referencia, según se mide antes del tratamiento con una composición que comprende células T CAR.

El transcurso del tiempo de la preparación y el tratamiento de células T CAR se representa en la Figura 31. Simultáneamente con el procedimiento de fabricación, los participantes en la investigación se sometían a resección de su tumor o sus tumores seguida por la colocación de un catéter de Rickham y una obtención de imágenes de referencia.

El Paciente UPN097 se sometió a resección tumoral y se trató en el Ciclo 1 con 2 x 106 células y en el Ciclo 2 con 10 x 106 células. Tanto en el Ciclo 1 como en el Ciclo 2 las células se administraron a la cavidad dejada por la resección. Después del segundo ciclo el Paciente UPN097 se retiró del estudio debido a una progresión tumoral rápida.

El Paciente UPN109 se trató en el Ciclo 1 con 2 x 106 células y en los Ciclos 2 y 3 con 10 x 106 células. Después de un período de descanso, el Paciente UPN109 se trató en los Ciclos 4, 5 y 6 con 10 x 106 células. En los Ciclos 1-6 las células se administraron intratumoralmente. En el Ciclo 7 el paciente se trató con 2 x 106 células. En los Ciclos 8 y 9 el paciente se trató con 10 x 106 células. En los Ciclos 7-10 la administración era intraventricular.

Según se usa en la presente, el término "intraventricular" se refiere al espacio dentro del sistema ventricular, específicamente los ventrículos cerebrales. Según esto, el término "intraventricular" e "intracerebroventricular" se puede usar intercambiablemente a lo largo de esta divulgación. Según esto, "administración intraventricular" o "inyección intraventricular" se refieren al aporte de una composición a los ventrículos del cerebro (es decir los ventrículos cerebrales). Los ventrículos cerebrales son una serie de espacios llenos de fluido interconectados que se encuentran en el núcleo del prosencéfalo y el tronco encefálico. Este sistema comprende cuatro ventrículos: los ventrículos laterales derecho e izquierdo (uno de los cuales se encuentra en cada hemisferio del cerebro), el tercer ventrículo y el cuarto ventrículo.

Los métodos divulgados comprenden diversas vías de administración de las composiciones que comprenden células T. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se pueden aportar o administrar intraventricularmente. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se pueden aportar o administrar al conducto raquídeo (es decir aporte intratecal). En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se pueden aportar o administrar al espacio epidural de la médula espinal (es decir aporte epidural). En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se pueden aportar o administrar directamente a un tumor (es decir aporte intratumoral). En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se pueden aportar o administrar a la cavidad formada por la resección de tejido tumoral (es decir aporte intracavitario). Por otra parte, en algunas realizaciones, los métodos divulgados pueden comprender una combinación de las susodichas vías de administración. A modo de ejemplo, un paciente puede recibir al menos una dosis de la composición que comprende células T a través de aporte intracavitario, seguido por al menos una dosis de la composición a través de aporte intraventricular.

La Figura 32A presenta un análisis de la persistencia de células T CAR, según se comprueba mediante CD19. Este análisis muestra buena persistencia de células T 8 días después del Ciclo 2. La Figura 32B muestra una disminución de la presencia de células de GMB según se comprueba mediante la expresión de IL13Ra2.

La Figura 33A y la Figura 33B representan resultados de obtención de imágenes procedentes del Paciente UPN097 en la región del catéter usada para la administración intratumoral. En la Figura 33A se puede observar que están presentes pocas células T CD3+ o CD8+ antes del tratamiento. La Figura 33B, que es una muestra el Día 16 después del tratamiento tomada de la pared de la cavidad tumoral frontal izquierda, muestra una gran superficie de tumor necrótico y una presencia significativa de células CD3+ y CD8+.

Los gliomas expresan receptores de IL13, y en particular receptores de IL13 de alta afinidad. Sin embargo, a diferencia del receptor de IL13, las células de glioma sobreexpresan una cadena de IL13Ra2 única capaz de unirse a IL13 independientemente del requerimiento de IL4Rp o yc44. Como su homólogo IL4, IL13 tiene actividad inmunorreguladora pleotrópica fuera del CNS. Tanto IL13 como IL4 estimulan la producción de IgE por linfocitos B y suprimen la producción de citocinas proinflamatorias por macrófagos. Estudios detallados que usan autorradiografía con IL13 radiomarcada han demostrado una unión a IL13 abundante en casi todos los tejidos de glioma maligno estudiados. Esta unión es muy homogénea dentro de las secciones tumorales y en el análisis de células individuales. Sin embargo, el análisis de sondas moleculares específico para ARNm de IL13Ra2 no detectaba la expresión del receptor específico de glioma por elementos cerebrales normales y la autorradiografía con IL13 radiomarcado tampoco podía detectar la unión a IL13 específica en el CNS normal. Estos estudios sugieren que el receptor IL13Ra 1/I l4 P/yc compartido no se expresa detectablemente en el CNS normal. Por lo tanto, IL13Ra2 es una diana superficial celular muy específica para el glioma y es una diana adecuada para un CAR diseñado para el tratamiento de un glioma.

Ciertos pacientes pueden ser más adecuados que otros para recibir los métodos divulgados de tratamiento. A modo de ejemplo, los pacientes con enfermedades malignas que expresan altamente IL-13Ra2 pueden beneficiarse particularmente del tratamiento con las células T CAR divulgadas. La idoneidad de un paciente se puede determinar al teñir una muestra tumoral resecada procedente de un paciente para determinar la cantidad de expresión de IL-13Ra2. La muestra se puede puntuar basándose en el número de células que exhiban intensidad de tinción débil, moderada o fuerte. Determinar el nivel de expresión de Ki67 también puede ser beneficioso para determinar la agresividad de la enfermedad. Una vez que se ha determinado que un paciente es totalmente adecuado para recibir las células T CAR divulgadas, el paciente se puede tratar según los métodos divulgados.

Sin embargo, la unión de moléculas terapéuticas basadas en IL13 al complejo receptor IL13Ra1/IL4p/Yc ampliamente expresado tiene el potencial de mediar en toxicidades no deseadas para tejidos normales fuera del CNS, y así limita la administración sistémica de estos agentes. Una sustitución de aminoácido en la hélice A de IL13 alfa en el aminoácido 13 del ácido glutámico natural por tirosina reduce selectivamente la afinidad de IL13 para el receptor IL13Ra1/IL4p/Yc. Sin embargo, la unión de este mutante (denominado IL13(E13Y)) a IL13Ra2 se incrementaba con relación a IL13 silvestre. Así, este análogo de IL13 mínimamente alterado incrementa simultáneamente la especificidad y la afinidad de IL13 para células de glioma. Por lo tanto, los CAR descritos en la presente incluyen una IL13 que contiene una mutación (E por Y o E por algún otro aminoácido tal como K o R o L o V) en el aminoácido 13 (según la numeración de Debinski y cols. 1999 Clin Cancer Res 5:3143s). Sin embargo, también se puede usar IL13 que tiene la secuencia natural, y puede ser útil, particularmente en situaciones en las que las células T modificadas se hayan de administrar localmente, tal como mediante inyección directamente a una masa tumoral.

Adicionalmente, se sabe que los gliomas tienen un pronóstico generalmente pobre para el paciente. Por ejemplo, el glioblastoma multiforme (GBM) es un cáncer maligno común del CNS. Las tasas de supervivencia relativa de 1 año y 2 años para GBM son 29,6% y 9,0%, respectivamente. Solo 3,4% de los pacientes con un diagnóstico de GBM sobreviven más de 5 años. Por otra parte, es común la recaída después de la resección quirúrgica y/o el tratamiento con otras terapias convencionales. Los tratamientos convencionales incluyen, pero no se limitan a, radioterapia, moléculas pequeñas (p. ej. temozolomida, irinotecano, mesilato de imatinib, erlotinib e hidroxiurea) y agentes biológicos tales como anticuerpos (p. ej. bevacizumab).

Los métodos de tratamiento divulgados mejoran el pronóstico clínico en pacientes en comparación con los estándares actuales. A modo de ejemplo, los métodos divulgados pueden incrementar las tasas de supervivencia de 1 año, 2 años y 5 años. En algunas realizaciones, la tasa de supervivencia de 1 año de un paciente que se trate según los métodos divulgados puede al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 100%. En algunas realizaciones, la tasa de supervivencia de 2 años de una paciente que se trate según los métodos divulgados puede al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 100%. En algunas realizaciones, la tasa de supervivencia de 5 años de un paciente que se trate según los métodos divulgados puede al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 100%.

En algunas realizaciones, los métodos divulgados también incrementan la esperanza de vida de un paciente en comparación con otro paciente que reciba tratamientos convencionales o tratamiento SOC, incluyendo radioterapia, terapia con fármacos de molécula pequeña, agentes biológicos terapéuticos como anticuerpos terapéuticos, o una de sus combinaciones. En algunas realizaciones, en las que el paciente que recibe tratamiento SOC puede esperar sobrevivir aproximadamente 15 meses desde el diagnóstico inicial (supervivencia global o OS), el paciente que recibe el tratamiento divulgado puede esperar una OS de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 meses o más. En algunas realizaciones, el paciente que recibe el tratamiento reivindicado puede esperar una OS de 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90 meses o más.

Los métodos divulgados pueden mejorar el pronóstico de un paciente a través de una variedad de resultados clínicos. A modo de ejemplo, los métodos divulgados pueden dar como resultado una reducción en el volumen del tumor en un paciente que se trate con una composición que comprende células T. En algunas realizaciones, los métodos de tratamiento divulgados pueden dar como resultado una reducción de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 100% en el volumen del tumor. En algunas realizaciones, los tumores en un paciente se pueden eliminar completamente y el paciente se puede curar de la enfermedad maligna.

Adicionalmente, los métodos divulgados son seguros y bien tolerados. Los pacientes que se tratan según los métodos divulgados pueden no experimentar efectos secundarios significativos y, por otra parte, pueden ser capaces de dejar de tomar medicaciones auxiliares. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos divulgados no darán como resultado toxicidades de grado 3 o superiores según los criterios de toxicidad comunes (CTC) del NIC. Los CTC proporcionan una escala cuantificable de 0-5, significando 0 sin episodios adversos, significando 1 leve, significando 2 moderado, significando 3 intenso e indeseable, significando 4 potencialmente letal o incapacitante y significando 5 la muerte. Así, los efectos secundarios y/o las toxicidades pueden incluir episodios como cefaleas leves o moderadas, fatiga, mialgia y trastornos menores del sistema nervioso tales como aura olfativa, pero se evitarán las toxicidades de alto grado.

Esteroides como la dexametasona se usan comúnmente en el manejo clínico de gliomas para evitar efectos secundarios neurológicos como edema cerebral. Los métodos de tratamiento divulgados pueden disminuir la necesidad de estos tratamientos auxiliares. A modo de ejemplo, si un paciente está recibiendo un régimen de esteroides (p. ej. dexametasona) antes del tratamiento según los métodos divulgados, el paciente puede ser capaz de reducir la dosis del régimen de esteroides o interrumpir el régimen de esteroides totalmente sin experimentar efectos clínicamente perjudiciales.

Las metástasis cerebrales de cáncer de mama pueden expresar HER2. Ciertos de los CAR descritos en la presente que son útiles en el tratamiento del glioma maligno se orientan a HER2.

Los CAR descritos en la presente se pueden producir por cualquier medio conocido en la especialidad, aunque preferiblemente se producen usando técnicas de ADN recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican las varias regiones del receptor quimérico se pueden preparar y ensamblar en una secuencia codificante completa mediante técnicas estándar de clonación molecular conocidas en la especialidad (cribado de bibliotecas genómicas, PCR, ligación asistida por cebadores, mutagénesis localmente dirigida, etc.) según sea conveniente. La región codificante resultante se inserta preferiblemente en un vector de expresión y se usa para transformar una línea de células hospedadoras de expresión adecuada, preferiblemente una línea celular de linfocitos T, y lo más preferiblemente una línea celular de linfocitos T autóloga.

Diversos subgrupos de células T aislados del paciente, incluyendo PBMC no seleccionadas o subgrupos de células T CD3 o de memoria o enriquecidas, se pueden transducir con un vector para la expresión de CAR. Las células T de memoria central son un subgrupo de células T útiles. La célula T de memoria central se puede aislar de células mononucleares de sangra periférica (PBMC) al seleccionar células CD45RO+/CD62L+, usando, por ejemplo, el dispositivo CliniMACS® para seleccionar inmunomagnéticamente células que expresan los receptores deseados. Las células enriquecidas con respecto a células T de memoria central se pueden activar con anti-CD3/CD28, transducir con, por ejemplo, un vector lentiviral SIN que dirige la expresión del CAR, así como un CD19 humano truncado (CD19t), un marcador superficial no inmunogénico tanto para la detección in vivo como para la selección potencial ex vivo. Las células T de memoria central activadas/genéticamente modificadas se pueden expandir in vitro con IL-2/IL-15 y a continuación crioconservarse.

Ejemplo 1: Construcción y Estructura de un CAR Específico para IL13Ro2

Se describe posteriormente la estructura de un CAR específico para IL13Ra2. La secuencia del CAR optimizada codónicamente contiene un ligando de IL-13 enlazado a la membrana mutado en un solo sitio (E13Y) para reducir la unión potencial a IL13Ra1, un espaciador de Fc de IgG4 que contiene dos mutaciones (L235E; N297Q) que reducen muchos modelos de reconocimiento mediado por el receptor de Fc, un dominio transmembranario CD4, un dominio de señalización citoplásmico 4-1BB coestimulante y un dominio de señalización citoplásmico CD3Z. Una secuencia de salto ribosómico T2A separa esta secuencia de lL13(EQ)BBZ CAR de CD19t, un marcador de detección/selección superficial celular no inmunogénico inerte. Esta conexión T2A da como resultado la expresión coordinada tanto de IL13(EQ)BBZ como de CD19t a partir de un solo transcrito. La Figura 1A es un dibujo esquemático del marco de lectura abierto de 2670 nucleótidos que codifica la construcción IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t. En este dibujo, se indican todos los dominios del ligando IL13(E13Y) específico de IL13Ra2, IgG4(EQ) Fc, transmembranario CD4, de señalización citoplásmica 4-1 BB, conector de tres glicinas y de señalización citoplásmica CD3Z del IL13(EQ)BBZ CAR, así como las secuencias de salto ribosómico T2A y CD19 truncado. También se indican las secuencias del receptor de GM-CSF humano alfa y de señalización CD19 que conducen la expresión superficial del IL13(EQ)BBZ CAR y el CD19t. Así, la construcción IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t incluye una secuencia inmunorreceptora quimérica coestimulante optimizada para la bisagra específica de IL13Ra2 (denominada IL13(EQ)BBZ), una secuencia T2A de salto ribosómico y una secuencia de CD19t.

La secuencia de IL13(EQ)BBZ se generó mediante la fusión de las secuencias del péptido líder del receptor de GM-CSF humano alfa con bisagra de Fc de IgG4 modificada con ligando 5 IL13(E13Y) L235E/N297Q (donde la doble mutación interfiere con el reconocimiento de FcR), transmembranaria CD4, del dominio de señalización citoplásmica 4-1 BB y del dominio de señalización citoplásmica de secuencias CD3Z. Esta secuencia se sintetizó de novo después de la optimización codónica. La secuencia T2A se obtuvo a partir de la digestión de un plásmido que contiene T2A. La secuencia de CD19t se obtuvo a partir de la que abarca desde la secuencia del péptido líder hasta los componentes transmembranarios (es decir, pares de bases 1-972) de un plásmido que contiene CD19. Los tres fragmentos, 1) IL13(EQ)BBZ, 2) T2A y 3) CD19t, se clonaron en el sitio de clonación múltiple del vector lentiviral epHIV7. Cuando se transfecta en células apropiadas, el vector integra la secuencia representada esquemática en la Figura 1B en el genoma de células hospedadoras. La Figura 1C proporciona un dibujo esquemático del propio plásmido IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 de 9515 pares de bases.

Según se muestra esquemáticamente en la Figura 2, IL13(EQ)BBZ CAR difiere en varios aspectos de un CAR específico de IL13Ra2 descrito previamente denominado IL13(E13Y)-zetacina (Brown y cols. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199). La IL13(E13Y)-zetacina está compuesta por las porciones de muteína de IL-13 humana específica de IL13Ra2 (huIL-13(E13Y)), del espaciador Fc de IgG4 humana (huY4Fc), transmembranaria CD4 humana (huCD4 tm) y citoplásmica de cadena CD3Z humana (huCD3Q cyt) como las indicadas. En contraste, el IL13(EQ)BBZ) tiene dos mutaciones puntuales, L235E y N297Q, que están situadas en el dominio CH2 del espaciador de IgG4, y un dominio citoplásmico 4-1 BB coestimulante (4-1 BB cyt).

Ejemplo 2: Construcción y Estructura de epHIV7 usado para la Expresión de un CAR específico de IL13Ro2

El plásmido pHIV7 es el plásmido original a partir del cual se derivaba el vector clínico IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 en the T Cell Therapeutics Research Laboratory (TCTRL) en City of Hope (COH). El vector epHIV7 usado para la expresión del CAR se produjo a partir del vector pHIV7. De forma importante, este vector usa el promotor EF1 humano para conducir la expresión del CAR. Las secuencias tanto 5' como 3' del vector se derivaban de pv653RSN como se derivaban previamente del provirus HXBc2. Las secuencias solapadas de ADN del tramo de polipurina (cPPT) se derivaban de la cepa de VIH-1 pNL4-3 a partir de the NIH AIDS Reagent Repository. Previamente, se describió la secuencia del elemento regulador postranscripcional de marmota de América (WPRE).

La construcción de pHIV7 se representa esquemáticamente en la Figura 3. Brevemente, pv653RSN, que contiene 653 bp desde gag-pol más las repeticiones terminales largas (LTRs) 5' y 3' con un gen de SL3-neomicina fosfotransferasa (Neo) intermedio, se subclonó en pBluescript, como sigue: En la Etapa 1, las secuencias desde LTR 5' hasta el elemento sensible a rev (RRE) formaban p5'HIV-1 51, y a continuación la LTR 5' se modificó al retirar las secuencias aguas arriba de la secuencia TATA, y se ligó en primer lugar a un potenciador de CMV y a continuación al origen de replicación de SV40 (p5'HIV-2). En la Etapa 2, después de clonar la LTR 3' en pBluescript para formar p3'HIV-1, se realizó una eliminación de 400 bp en el potenciador/promotor de LTR 3' para retirar los elementos reguladores cis en HIV U3 y formar p3'HIV-2. En la Etapa 3, los fragmentos aislados del p5'HIV-3 y p3'HIV-2 se ligaron para formar pHIV-3. En la Etapa 4, el p3'HIV-2 se modificó adicionalmente al retirar secuencias de HIV aguas arriba adicionales para generar p3'HIV-3 y un fragmento BamHI-SalI de 600 bp que contenía WPRE se añadió a p3'HIV-3 para formar el p3'HIV-4. En la Etapa 5, el tamaño del RRE de pHIV-3 se redujo mediante PCR y se ligó a un fragmento 5' procedente de pHIV-3 (no mostrado) y al p3'HIV-4, para formar pHIV-6. En la Etapa 6, un fragmento BglII-BamHI de 190 bp que contenía la secuencia solapada de ADN de cPPT procedente de pNL4-3 de HIV-1 (55) se amplificó a partir de pNL4-3 y se colocó entre el RRE y las secuencias de WPRE en pHIV6 para formar pHIV-7. Este plásmido original pHIV7-GFP (GFP, proteína fluorescente verde) se usó para empaquetar el vector original usando un sistema de cuatro plásmidos.

Se requiere una señal de empaquetamiento, psi y , para el empaquetamiento eficaz del genoma viral en el vector. El RRE y el WPRE potencian el transporte y la expresión del transcrito de ARN del transgén. Se ha demostrado que la secuencia solapada, en combinación con WPRE, potencia la eficacia de transducción del vector lentiviral en células de mamífero.

Las funciones cooperadoras, requeridas para la producción del vector viral), se dividen en tres plásmidos separados para reducir la probabilidad de generación de lentivirus competentes para la replicación a través de recombinación: 1) pCgp codifica la proteína gag/pol requerida para el ensamblaje del vector viral; 2) pCMV-Rev2 codifica la proteína Rev, que actúa sobre la secuencia de RRE para ayudar en el transporte del genoma viral para el empaquetamiento eficaz; y 3) pCMV-G codifica la glicoproteína del virus de la vesiculoestomatitis (VSV), que se requiere para la infectividad del vector viral.

Hay una homología de secuencia de ADN mínima entre el genoma vectorial codificado por pHIV7 y los plásmidos cooperadores. Las regiones de homología incluyen una región de señalización de empaquetamiento de aproximadamente 600 nucleótidos, situada en la secuencia gag/pol del plásmido cooperador pCgp; una secuencia promotora de CMV en los tres plásmidos cooperadores; y una secuencia de RRE en el plásmido cooperador pCgp. Es altamente improbable que el virus recombinante competente para la replicación se pueda generar debido a la homología en estas regiones, ya que requeriría múltiples episodios de recombinación. Adicionalmente, cualesquiera recombinantes resultantes carecería de las secuencias de LTR y tantas funcionales requeridas para la replicación lentiviral.

El promotor de CMV se reemplazó por el promotor EF1a-HTLV (EF1p), y el nuevo plásmido se denominó epHIV7 (Figura 4). El EFlp tiene 563 bp y se introdujo en epHIV7 usando NruI y NheI, después de que se cortara el promotor de CMV.

El genoma lentiviral, excluyendo gag/pol y rev que son necesarios para la patogenicidad del virus silvestre y se requieren para la infección productiva de células diana, se ha retirado de este sistema. Además, la construcción del vector IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 no contiene un promotor 3'LTR intacto, de modo que el genoma proviral de ADN expresado y transcrito inversamente resultante en células elegidas tendrá LTRs inactivas. Como resultado de este diseño, no se transcribirán secuencias derivadas de VIH-I desde el provirus y solo se expresarán las secuencias terapéuticas a partir de sus promotores respectivos. Se espera que la retirada de la actividad del promotor LTR en el vector SIN reduzca significativamente la posibilidad de activación involuntaria de genes hospedadores. La Tabla 4 resume los diversos elementos reguladores presentes en IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t _epHIV7.

Ejemplo 3: Producción de Vectores para la Transducción de Células T de Pacientes

Para cada plásmido (IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7; pCgp; pCMV-G; y pCMV-Rev2), se genera un banco de semillas, que se usa para inocular el fermentador para producir cantidades suficientes de ADN plasmídico. El ADN plasmídico se prueba con respecto a la identidad, la esterilidad y la endotoxina antes de su uso en la producción de vector lentiviral.

Brevemente, las células se expandieron a partir de la célula de trabajo 293T (WCB), que se ha probado para confirmar la esterilidad y la ausencia de contaminación viral. Un vial de células T 293 procedentes de las WCB 293T se descongeló. Las células se hicieron crecer y se expandieron hasta que existieran suficientes números de células para sembrar un número apropiado de fábricas celulares (CFs) de 10 capas para la producción de vectores y el mantenimiento de la serie celular. Se puede usar una sola serie de células para la producción.

El vector lentiviral se produjo en subpartidas de hasta 10 CFs. Se pueden producir dos subpartidas en la misma semana conduciendo a la producción de aproximadamente 20 l de sobrenadante lentiviral/semana. El material producido a partir de todas las subpartidas se reunió durante la fase de procesamiento aguas abajo, a fin de producir un lote de producto. Células T 293 se sembraron en CFs en medio 293T (DMEM con FBS al 10%). Las fábricas se pusieron en una incubadora de 37°C y se nivelaron horizontalmente a fin de obtener una distribución uniforme de las células sobre todas las capas de la CF. Dos días más tarde, las células se transfectaron con los cuatro plásmidos lentivirales descritos anteriormente usando el método del CaPO4, que implica una mezcla de Tris:EDTA, CaCl22 M, 2X HBS y los cuatro plásmidos de ADN. El día 3 después de la transfección, el sobrenadante que contenía vectores lentivirales secretados se recogió, se purificó y se concentró. Después de que el sobrenadante se retirara de las CFs, se recogieron células finales. Las células se recogieron de cada CF. Las células se tripsinizaron desde cada fábrica y se recogieron mediante centrifugación. Las células se resuspendieron en medio de congelación y se crioconservaron. Estas células se usaron más tarde para la prueba de lentivirus competentes para la replicación (RCL).

Para purificar y formular vectores, el sobrenadante en bruto se clarificó mediante filtración con membrana para retirar el residuo celular. El ADN de las células hospedadoras y el ADN plasmídico residual se degradaron mediante digestión con endonucleasa (Benzonase®). El sobrenadante viral se clarificó del residuo celular usando un filtro de 0,45 pm. El sobrenadante clarificado se recogió en un recipiente prepesado al que se añade Benzonase® (concentración final 50 U/ml). La digestión con endonucleasa para ADN plasmídico residual y ADN genómico del hospedador según se realiza a 37°C durante 6 h. La concentración por ultrafiltración con flujo tangencial (TFF) inicial del sobrenadante tratado con endonucleasa se usó para retirar componentes de bajo peso molecular residuales del sobrenadante en bruto, mientras el virus se concentraba ~20 veces. El sobrenadante viral tratado con endonucleasa clarificado se hizo circular a través de un cartucho de fibra hueca con un NMWCO de 500 kD a un caudal diseñado para mantener la velocidad de cizalladura a -4.000 s-1 o menos, mientras se maximizaba la velocidad del flujo. La diafiltración del sobrenadante tratado con nucleasa se inició durante el procedimiento de concentración para mantener el rendimiento del cartucho. Se estableció una tasa de sustitución del permeado de 80%, usando lactosa al 4% en PBS como el tampón de diafiltración. El sobrenadante viral se llevó hasta el volumen elegido, que representa una concentración de 20 veces del sobrenadante en bruto, y la diafiltración se continuó durante 4 volúmenes de intercambio adicionales, con la tasa de sustitución del permeado al 100%.

Se efectuó una concentración adicional del producto viral al usar una técnica de centrifugación a alta velocidad. Cada subpartida del lentivirus se nodulizó usando una centrífuga Sorvall RC-26 plus a 6000 RPM (6.088 RCF) a 6°C durante 16-20 h. A continuación, la pella viral procedente de cada subpartida se reconstituyó en un volumen de 50 ml con lactosa al 4% en PBS. La pella reconstituida en este tampón representa la formulación final para la preparación del virus. Todo el procedimiento de concentración del vector daba como resultado una reducción de volumen de 200 veces, aproximadamente. Después de la finalización de todas las subpartidas, el material se puso a continuación a -80°C, mientras muestras de cada subpartida se probaban con respecto a la esterilidad. Después de la confirmación de la esterilidad de la muestra, las subpartidas se descongelaron rápidamente a 37°C con agitación frecuente. A continuación, el material se reunió y se dividió en partes alícuotas manualmente en la cabina de bioseguridad Clase II Tipo A/B3 en el conjunto de vectores virales. Se usó una configuración de carga de 1 ml del lentivirus concentrado en crioviales con junta tórica con rosca externa USP clase 6 estériles. Los sistemas de calidad (QS) del Center for Applied Technology Development (CATD) en COH aprobaban todos los materiales según las políticas y los procedimientos de trabajo estándar para el CBG y de acuerdo con las correctas prácticas de fabricación actuales (cGMPs).

Para asegurar la pureza de la preparación del vector lentiviral, se probó con respecto a contaminantes del ADN del hospedador residual y la transferencia del ADN plasmídico y del hospedador residual. Entre otras pruebas, se evaluó la identidad del vector mediante RT-PCR para asegurar que esté presente el vector correcto. Todos los criterios de aprobación se cumplían para el vector destinado para el uso en este estudio.

Ejemplo 4: Preparación de células T Adecuadas para el Uso en ACT

Se obtienen linfocitos T de un paciente mediante leucoféresis, y el subgrupo de células T alogénicas o autólogas apropiado, por ejemplo, células T de memoria central (T^cm), se altera genéticamente para expresar el CAR, a continuación, se administra de nuevo al paciente mediante cualquier medio clínicamente aceptable, para conseguir una terapia anticancerosa.

Se pueden preparar T^cmadecuadas como sigue. Productos de aféresis obtenidos de participantes en la investigación con consentimiento se tratan con Ficoll, se lavan y se incuban durante la noche. A continuación, las células se agotan de poblaciones de monocitos, células T reguladoras y células T vírgenes usando reactivos anti-CD14, anti-CD25 y anti-CD45RA (Miltenyi Biotec) de calidad GMP y el dispositivo de separación CliniMACS™. Después del agotamiento, las células de la fracción negativa se enriquecen con respecto a células T^cmCD62L+ usando DREG56-biotina (calidad clínica COH) y microcuentas antibiotina (Miltenyi Biotec) en el dispositivo de separación CliniMACSTM.

Después del enriquecimiento, las células T^cmse formulan en X-Vivo15 completo más 50 lU/ml de IL-2 y 0,5 ng/ml de IL-15 se transfieren a una bolsa de cultivo celular de Teflon, donde son estimuladas con cuentas Dynal ClinEx™ Vivo CD3/CD28. Hasta cinco días después de la estimulación, las células se transducen con vector lentiviral IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,0 a 0,3. Los cultivos se mantienen durante hasta 42 días con adición de X-Vivo15 completo y citocina IL-2 e IL-15 según se requiera para la expansión celular (manteniendo la densidad celular entre 3 x 105 y 2 x 106 células viables/ml, y complementación de citocina cada lunes, miércoles y viernes de cultivo). Típicamente, las células se expanden hasta aproximadamente 109 células bajo estas condiciones en 21 días. Al final del período de cultivo las células se recogen, se lavan dos veces y se formulan en medio de crioconservación de calidad clínica (Cryostore CS5, BioLife Solutions).

El día o los días de la infusión de células T, el producto crioconservado y autorizado se descongela, se lava y se formula para la reinfusión. Los viales crioconservados que contienen el producto celular autorizado se retiran del almacenamiento en nitrógeno líquido, se descongelan, se enfrían y se lavan con un tampón de lavado de PBS/albúmina sérica humana (HSA) al 2%. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retira y las células se resuspenden en un diluyente de infusión de solución salina normal libre de conservantes (PFNS)/HSA al 2%. Las muestras se retiran para la prueba de control de calidad.

Se realizaron dos rondas de calificación sobre células obtenidas de donantes sanos usando la plataforma de fabricación descrita anteriormente. Cada producto de la ronda de calificación preclínica se asignaba a un número de donante humano (HD) - HD006.5 y HD 187.1. De forma importante, según se muestra en la Tabla 5, estas rondas de calificación se expandían >80 veces en 28 días y las células expandidas expresaban los transgenes IL13(EQ)BBY/CD19t.

Tabla 5: Resumen de I^osDatos de Expresión procedentes

de un Producto de la Ronda de Calificación Preclínica

Ejemplo 5: Análisis citométrico de flujo de la expresión de transgén superficial y marcador de células T en IL13(EQ)BBY/CD19t+TcM

Los productos de las dos rondas de calificación preclínicas descritos en el Ejemplo 4 se usaron en estudios preclínicos según se describe posteriormente. Las Figuras 6A-C representan los resultados del análisis citométrico de flujo de la expresión de transgén superficial y marcador de células T. IL13(EQ)BBY/CD19t+ Tcm HD006.5 y HD187.1 se cotiñeron con anti-IL13-PE y anti-CD8-FITC para detectar células CD8+ CAR+ y CD4+ (es decir, negativas a CD8) CAR+ (Figura 6A), o anti-CD19-PE y anti-CD4-FITC para detectar células CD4+ CD19t+ y CD8+ (es decir, negativas a CD4) CAR+ (Figura 6B). IL13(EQ)BB^y/CD19t+ T^cmHD006.5 y HD187.1 se tiñeron con anti-CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L y CD28 conjugados a fluorocromo (histogramas grises) o controles isotípicos (histogramas negros). (Figura 6C). En cada una de las Figuras 6A-C, los porcentajes indicados se basan en el isotipo anterior teñido de linfocitos viables (negativos a DAPI).

Ejemplo 6: Comparación de la vía de aporte de células T CAR para el tratamiento de tumores PBT grandes iniciados por TS

Se describen posteriormente estudios que comparan la vía de aporte, intravenosa (i.v.) o intracraneal (i.c.), sobre la actividad antitumoral contra líneas de PBT primario invasivo. En estudios piloto (datos no mostrados), se observó inesperadamente que IL13(EQ)BBZ+ TCM administradas i. v. no proporcionaban beneficio terapéutico en comparación con PBS para el tratamiento de tumores PBT030-2 EGFP:ffLuc pequeños (día 5). Esto está en contraste con la fuerte eficacia terapéutica observada con células T CAR+ administradas i. e. Razonando que el día 5 los tumores PBT030-2 pueden haber sido demasiado pequeños para incorporar células T terapéuticas de la periferia, se realizó una comparación de aporte i.v. frente a i. e. contra tumores PBT030-2 EGFP:ffLuc del día 19 más grandes. Para estos estudios, ratones con injerto de PBT030-2 se trataron bien con dos infusiones i.v. (5 x 106 TCM CAR+; días 19 y 26) o bien cuatro infusiones i. e. (1 x 106 CAR+ TCM; días 19, 22, 26 y 29) de IL13(EQ)BBZ+ TCM, o TCM simuladas (sin CAR). Aquí tampoco había beneficio terapéutico según se comprobaba mediante obtención de imágenes con Xenogen o análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para células T CAR+ administradas i.v. (Figuras 7A y 7B). En contraste, se observaba una potente actividad antitumoral para IL13(EQ)BBZ+ TCM administradas i. e. (Figuras 7A-B). Posteriormente, cerebros procedentes de una cohorte de ratones 7 días después de la inyección de células T se recogieron y se evaluaron con respecto a células T humanas CD3+ mediante IHC. Sorprendentemente, para ratones tratados i.v. bien con TCM simuladas o bien con IL13(EQ)BBZ TCM, no había células T humanas CD3+ detectables en el tumor o en otras regiones cerebrales del ratón en las que típicamente residen células T humanas (es decir las leptomeninges) (Figura 7C), sugiriendo un déficit en el tropismo tumoral. Esto está en contraste con el número significativo de células T detectado en los ratones tratados i.e. (Figura 7D).

Las citocinas derivadas de tumores, particularmente MCP-1/CCL2, son importantes en la incorporación de células T al tumor. Así, se evaluaron células tumorales PBT030-2 y se encontró que esta línea produce altos niveles de MCP-1/CCL2 comparables a células T U251 (datos no mostrados), una línea de glioma que previamente se mostraba que atraía células T CD8+ efectoras administradas i.v. a tumores injertados i.e. Los gliomas malignos son tumores muy invasivos y a menudo tienen una presentación multifocal. Los estudios descritos anteriormente establecen que IL13BBZ Tcm pueden eliminar tumores infiltrados tales como PBT030-2, y mediar en la actividad antitumoral duradera a largo plazo. También se examinó la capacidad de células T CAR aportadas intracranealmente para trasladarse a una enfermedad multifocal. Para este estudio, se implantaron PBT030-2 EGFP:ffLuc TSs en los hemisferios tanto izquierdo como derecho (Figura 8A) y se inyectaron células T CAR+ solo en la zona tumoral derecha. De modo alentador, para todos los ratones evaluados (n = 3) se detectaron células T mediante IHC CD3 7 días después de la infusión de células T tanto en la zona de inyección (es decir tumor derecho) como dentro del tumor en el hemisferio izquierdo (Figura 8B). Estos hallazgos proporcionan evidencia de que las células T CAR+ son capaces de trasladarse a e infiltrar focos tumorales en zonas distantes. También se observaron hallazgos similares en un segundo modelo tumoral usando la línea celular de glioma U251T (datos no mostrados).

Ejemplo 7: Secuencia de aminoácidos de IL13(EQ)BB£/CD19t

La secuencia de aminoácidos completa de IL13(EQ)BB^/CD19t se representa en la Figura 9. Toda la secuencia (SEQ ID NO:1) incluye: un péptido de señalización de GMCSF de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:2), una secuencia de IL-13 de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:3; sustitución de aminoácido E13Y mostrada en negrita); una secuencia de IgG4 de 229 aminoácidos (SEQ ID NO:4; con sustituciones de aminoácidos L235E y N297Q mostradas en negrita); una secuencia transmembranaria CD4 de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:5); una secuencia 4-1BB de 42 aminoácidos (SEQ ID NO:6); un conector de Gly de 3 aminoácidos; una secuencia CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:7); una secuencia T2A de 24 aminoácidos (SEQ ID NO:8); y una secuencia CD19t de 323 aminoácidos (SEQ ID NO:9).

La secuencia del receptor antigénico quimérico maduro (SEQ ID NO:10) incluye: una secuencia de IL-13 de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:3; sustitución de aminoácido E13Y mostrada en negrita); una secuencia de IgG4 de 229 aminoácidos (SEQ ID NO:4; con sustituciones de aminoácidos L235E y N297Q mostradas en negrita); en la secuencia CD4 de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:5); una secuencia 4-1 BB de 42 aminoácidos (SEQ ID NO:6); un conector de Gly de 3 aminoácidos; y una secuencia CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:7). Dentro de esta secuencia de CAR (SEQ ID NO:10) está la secuencia IL-13/IgG4/CD4t/41-BB (SEQ ID NO:11), que incluye: una secuencia de IL-13 de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:3; sustitución de aminoácido E13Y mostrada en negrita); una secuencia de IgG4 de 229 aminoácidos (SEQ ID NO:4; con sustituciones de aminoácidos L235E y N297Q mostradas en negrita); en la secuencia CD4 de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:5); y una secuencia 4-1BB de 42 aminoácidos (SEQ ID NO:6). La secuencia IL13/IgG4/CD4t/4-1 BB (SEQ ID NO:11) se puede empalmar a la secuencia CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:7) mediante un conector tal como un conector Gly Gly Gly. La secuencia de CAR (SEQ ID NO:10) puede estar precedida por un péptido de señalización de GMCSF de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:2).

La Figura 10 representa una comparación de las secuencias de IL13(EQ)41 BBZ[IL13{EQ}41 BBZ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (SEQ ID NO:12) y CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (SEQ ID NO:13).

Ejemplo 8: Secuencia de aminoácidos de IL13R^o2 que se Orienta a CAR Adicional

Las Figuras 11-18 representan la secuencia de aminoácidoss de CAR adicional dirigido contra IL13Ra2. En cada caso, los diversos dominios están marcados excepto para el espaciador GlyGlyGly situado entre ciertos dominios intracelulares. Cada uno incluye IL13 humana con y Glu a Tyr (SEQ ID NO:3; sustitución de aminoácido E13Y mostrada destacada). En el vector de expresión usado para expresar estos CAR, la secuencia de aminoácidos expresada puede incluir una secuencia T2A de 24 aminoácidos (SEQ ID NO:8); y una secuencia CD19t de 323 aminoácidos (SEQ ID NO:9) para permitir la expresión coordinada de una secuencia CD19 truncada sobre la superficie de células que expresan CAR.

Un grupo de CAR que comprende dominio IL13(E13Y) humano, un dominio CD28 tm, un dominio coestimulante CD28gg, un dominio coestimulante 4-1 BB y un esqueleto de CAR del dominio CD3Z y que incluye un espaciador HL (22 aminoácidos), un espaciador de bisagra de CD8 (48 aminoácidos), un espaciador IgG4-HL-CH3 (129 aminoácidos) o un espaciador IgG4(EQ) (229 aminoácidos) se probó con respecto a su capacidad para mediar en la destrucción específica para IL13Ra2 según se evaluaba en un ensayo de cocultivo de 72 horas. Con la excepción de HL (22 aminoácidos) que parecía tener escasa expresión de CAR en este sistema, todos eran activos.

Ejemplo 9: Estructura de Dos HER2-CAR

Un CAR que comprende un scFv de HER2 descrito en la presente se denomina Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t. Este CAR incluye una variedad de características importantes incluyendo: un scFv dirigido a HER2; una región Fc de IgG4 que está mutada en dos sitios dentro de la región CH2 (L235E; N297Q) de un modo que reduce la unión mediante receptores de Fc (FcRs); un dominio transmembranario CD28, un dominio coestimulante CD28 y un dominio de activación CD3Z. La Figura 20 presenta la secuencia de aminoácidos de este CAR, incluyendo la secuencia de la secuencia de CD19 truncada usada para comprobar la expresión de CAR y la secuencia de salto ribosómico T2A que permite que el CAR se produzca sin fusión de la secuencia de CD19 truncada. Según se muestra en la Figura 21, el CAR inmaduro incluye: péptido de señalización GMCSFR, scFv de HER2, IgG4 que actúa como un espaciador, un dominio transmembranario CD8, un dominio coestimulante 4-IBB que incluye una alteración de la secuencia LL hasta GG, una secuencia de tres Gly, un dominio estimulante CD3 Zeta. El transcrito también codifica una secuencia ribosómica T2A y una secuencia de CD19 truncada que no son parte de la secuencia proteínica de CAR. El CAR maduro es idéntico al CAR inmaduro, pero carece del péptido de señalización GMCSF.

Ejemplo 10: Expresión de CAR Dirigido a HER2

La Figura 22A es un diagrama esquemático de dos construcciones de CAR específicas para HER2 representadas en la Figura 20 y la Figura 21. En ^hER2(EQ)28Z, el scFv está enlazado a la membrana mediante un conector de Fc de IgG4 modificado (mutante doble, L235E; N297Q), que contiene un dominio transmembranario CD28, un dominio coestimulante CD28 intracelular y un dominio CD3Z citolítico. La secuencia de salto T2A separa el CAR de una proteína CD19 truncada (CD19t) empleada para el seguimiento celular. HER2(EQ)BBZ es similar, excepto que el dominio coestimulante es 4-IBB en lugar de CD28 y el dominio transmembranario es un dominio transmembranario CD8 en lugar de un dominio transmembranario CD28. Células de memoria central (TCM) humanas se transfectaron con un vector lentiviral que expresa bien HER2(EQ)28Z o bien HER2(EQ)BBZ. La Figura 22B representa datos de FACS representativos del fenotipo superficial de TCM humanas. La Figura 22C representa los resultados de ensayos para la expresión de CD19 y proteína L en TCM transfectadas con un vector lentiviral que expresa bien HER2(EQ)28Z o bien HER2(EQ)BBZ. Como se puede observar a partir de estos resultados, la eficacia de transfección que se valora mediante la expresión de CD19 era similar para ambos CAR. Sin embargo, la expresión de proteína L era inferior para HER2(EQ)BBZ que para HER2(EQ)28Z, sugiriendo que el CAR HER2(Eq )BBZ es menos estable que el HER2(EQ)BBZ. Un análisis de la expansión celular (Figura 22D) muestra que ningún CAR interfiere con la expansión de células T.

Ejemplo 11: Caracterización in vitro de CAR Orientado a HER2

Se usó una variedad de líneas celulares de cáncer de mama, incluyendo líneas negativas a HER2 (linfoma LCL, MDA-MB-468, glioma U87), líneas de baja expresión de HER2 (MDA-MB-361, 231BR) y líneas de alta expresión de HER2 (SKBR3, BT474, BBM1) para caracterizar HER2(EQ)28Z y HER2(EQ)BBZ. La Figura 23A representa el nivel de expresión de HER2 de cada una de estas líneas. La citometría de flujo (acotada en células T CAR+) se usó para caracterizar la desgranulación de CD107a y la producción de IFNy en células T CAR simuladas (no transducidas), HER2(EQ)28Z o HER2(EQ)BBZ después de un cocultivo de 5 h bien con células tumorales MDA-MB-361 (baja expresión de HER2) o bien con células tumorales BBM1 (alta expresión de HER2). Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 23B. Se efectuaron estudios similares con las otras líneas celulares de cáncer de mama y los resultados se resumen en la Figura 23C. La producción de producción de IFN^ypor células T HER2-CAR después de un cultivo de 24 h con proteína HER2 recombinante o dianas tumorales se midió mediante ELISA y los resultados de este análisis se muestran en la Figura 23D.

Ejemplo 12: Actividad Antitumoral in vitro de CAR Orientado a HER2

Se usó citometría de flujo para valorar la destrucción de células tumorales después de un cocultivo de 72 h de células T CAR simuladas (no transducidas), HER2(EQ)28Z o HER2(EQ)BBZ con dianas tumorales. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 24A. Se midió la inducción de PD-1 y LAG-3 en células T CAR totales después de un cocultivo de 72 h con células MDA-MB-468 negativas a HER2 o BBM1 positivas a HER2, y los resultados de este análisis se presentan en la Figura 24B. Se midió la inducción de PD-1 en células T CAR CD8+ después de un cocultivo de 72 h con dianas tumorales que eran negativas a HER2 (linfoma LCL, MDA-MB-468, glioma U87), de baja expresión de HER2 (MDA-MB-361, 231Br ) o de alta expresión de HER2 (SKBR3, BT474, BBM1), y los resultados de este análisis se presentan en la Figura 24C. Estos estudios sugieren que HER2(EQ)BBZ provoca una inducción de PD-1 menor que HER2(EQ)28Z. La destrucción de células tumorales con una relación Efector:Tumor (E:T) que varía de 0,25:1 a 2:1 se midió para células T CAR bien HER2(EQ)28Z o bien HER2(EQ)BBZ. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 24D, que muestra que tanto ^hER2(EQ)28Z como ^hER2(EQ)BBZ son eficaces para destruir células tumorales in vitro. La proliferación en CFSE de células T HER2-CAR después de un cocultivo de 72 h con células MDA-MB-468 o BBM1 se midió mediante citometría de flujo. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 24E, que muestra que las células T CAR HER2(EQ)BBZ proliferan más que las células T CAR HER2(EQ)28Z.

Ejemplo 13: Actividad Antitumoral in vivo de CAR Dirigido a HER2

La actividad de células T CAR HER2 se valoró en un modelo de metástasis de mama a cerebro derivado de pacientes. Las Figuras 25A-25C son tinciones con H&E de tumores. Los ratones se trataron mediante la inyección directa en el tumor con células T CAR simuladas (no transducidas) o HER2(EQ)BBZ. Las Figuras 25D-25F representan los resultados de la obtención de imágenes óptica de los tumores y las Figuras 25G-25I son curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para ratones tratados localmente bien el día 3, bien el 8 o bien el 14 después de la inyección tumoral. Estos estudios muestran que las células T CAR HER2(EQ)BBZ tienen una potente eficacia antitumoral in vivo cuando se inyectan directamente en el tumor.

Para valorar la eficacia antitumoral en modelos de xenoinjerto humano de metástasis de mama a cerebro, células BBM1 (0,2 M) o BT474 (0,15 M) se inyectaron intracranealmente en ratones NSG. El día 8 después de la inyección tumoral, se inyectaron intratumoralmente células T HER2(EQ)28Z o HER2(EQ)BBZ o simuladas (no transducidas) (1 M). Los tumores BBM1 (Figura 26A) y BT474 (Figura 26B) se comprobaron mediante obtención de imágenes óptica basada en luciferasa. Las curvas de Kaplan Meier se presentan en la Figura 26C y la Figura 26D.

También se usó un modelo de xenoinjerto ortotópico derivado de pacientes humanos de metástasis de mama a cerebro para valorar células T CAR HER2(EQ)28Z y ^hE^r2(EQ)BBZ. La Figura 27A ilustra la región de implantación tumoral mediante inyección estereotáctica de células BBM1 (0,2 M) y aporte intraventricular de células T. La tinción de tumores se representa en la Figura 27B. El día 14 después de la inyección tumoral, se inyectaron intratumoralmente células T HER2(EQ)28Z, HER2(EQ)BBZ o simuladas (no traducidas) (0,5 M). El crecimiento del tumor se comprobó mediante obtención de imágenes óptica basada en luciferasa. La Figura 27C presenta los promedios de flujo para cada grupo de tratamiento y la Figura 27D presenta la curva de Kaplan Meier para cada grupo de tratamiento.

Ejemplo 14: Comparación de la Administración Intracraneal e intratumoral de T^cmque Expresan un CAR Dirigido a IL13Ra2

Dos vías de aporte intracraneal (ic) diferentes, intratumoral (ict) e intraventricular (icv), se valoraron en un modelo murino de glioblastoma con respecto a la seguridad, el traslado y la eficacia in vivo de células T CAR generadas a partir de líneas celulares enriquecidas en T^cmque se transducían con el vector lentiviral IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 y se expandieron in vitro como se propone para el tratamiento clínico del glioblastoma (GBM). La seguridad y la potencia funcional in vivo de estas células administradas bien ict o bien icv se examinó en ratones NSG inmunodeficientes usando la línea esférica de tumor GBM primario de pocos pases IL13Ra2+, PBT030-2, que se ha genomanipulado para expresar el gen indicador de luciferasa de luciérnaga (ffLuc).

Líneas celulares de T^cmque se han enriquecido a partir de PBMC mediante selección con CliniMACS™/AutoMACS se lentitransdujeron con lentivirus IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7, se expandieron y a continuación se crioconservaron usando métodos similares a los descritos anteriormente. Células T CAR recientemente descongeladas administradas bien ict o bien icv se evaluaron a continuación con respecto a la toxicidad potencial, su capacidad para trasladarse a tumores GBM multifocales y su potencia para controlar el crecimiento in vivo de células PBT030-2 de la línea de GBM IL13Ra2+ injertadas ic. Para valorar la toxicidad general, los ratones se observaron diariamente con respecto a la salud general, incluyendo peso corporal y vigilancia. Se examinó la carga tumoral, según se mide mediante obtención de imágenes con Xenogen; y también se realizó inmunohistoquímica (IHC) para detectar la incorporación/infiltración de células T de los tumores sobre un subgrupo de ratones.

Ratones NSG macho (10-12 semanas de edad) fueron inyectados ic estereotácticamente con 1 x 105 células ffLuc+ PBT030-2 en los hemisferios contralaterales tanto derecho como izquierdo el día 0 y se dejaron injertar durante 6 días. A continuación, los ratones se agruparon basándose en el tamaño del tumor según se determina mediante obtención de imágenes con Xenogen para distribuciones de tamaños de tumores iguales por grupo. A continuación, los grupos de ratones se dejaron sin tratar (n = 4) o se trataron bien ict (hemisferio derecho, n = 8) o bien icv (n = 8) con 1 x 106 CAR+ IL13(EQ)BBZ/CD19t+ T^cm(Figura 28). El crecimiento del tumor PBT030-2 se comprobó a lo largo del tiempo mediante obtención de imágenes con Xenogen y cuantificación del flujo de ffLuc (fotones/s). En diferentes momentos, se sacrificaron ratones de cada grupo, sus cerebros se recogieron, se embebieron en parafina y se realizó inmunohistoquímica (IHC) para evaluar la presencia de células que expresan CD3 humano (es decir, células T humanas). Específicamente, se sacrificaron tres ratones de cada grupo tratado con células T CAR una semana después de la administración de células T (Día 13 del experimento), y estos ratones no se incluían en el análisis de obtención de imágenes con Xenogen de la Figura 29; y a continuación, dos ratones en cada uno de los grupos de ratones se sacrificaron dos semanas después de la administración de células T (Día 21 del experimento).

Aunque este no era un estudio de supervivencia, y así todos los ratones se sacrificaban en momentos específicos para evaluar el traslado de células T en los cerebros (descrito posteriormente), los ratones se comprobaron diariamente con respecto a cualesquiera signos obvios de molestias o toxicidad general. Los ratones tratados con el régimen bien ict o bien icv no exhibían pérdida de peso y estaban despejados, alerta y reactivos a lo largo del experimento. Así, independientemente de la vía de administración de células T, no había signos de ningún efecto adverso asociado a la terapia.

Según se muestra en las Figuras 29A-C, el aporte ict de IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cmexhibía una actividad antitumoral robusta contra los tumores PBT030-2 según se esperaba. Sin embargo, el aporte icv de IL13(EQ)BB^/CD19t+ T^cmparecía proporcionar mayor efecto terapéutico contra tumores PBT030-2 injertados ic que el observado con la administración ict, especialmente contra la lesión tumoral en el hemisferio contralateral (izquierdo).

Para determinar si la vía de administración afectaba a la capacidad de las células T para migrar a la zona del tumor, se realizó un análisis IHC para células T CD3+ sobre los cerebros de ratones procedentes de cada grupo a las una y dos semanas después de la administración de células T. Según se muestra en la Figura 30, células T CD3+ humanas se encontraban en las zonas tumorales tanto izquierda como derecha en ratones que hubieran recibido células T administradas bien ict o bien icv. Estos datos son representativos de 3 ratones en cada grupo en una semana, y 2 ratones en cada grupo en dos semanas después de la administración de células T.

Este estudio demuestra que la administración tanto intratumoral como intraventricular de células T era bien tolerada en este modelo de ratones NSG. Por otra parte, la eficacia antitumoral multifocal in vivo y la detección IHC de células T en las zonas tumorales se pueden observar con el aporte tanto ict como icv de células de la ronda de calificación de T^cmque se han transducido con el vector IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7. Este estudio sugiere además que las células T aportadas icv pueden tener más eficacia que las células T aportadas itc.

Ejemplo 15: Prueba Clínica en Fase 1 que Evalúa Células T CAR IL-13Ra2 para el Tratamiento de Glioblastoma

Este ejemplo describe los hallazgos iniciales de un examen clínico que evalúa la seguridad, la factibilidad y la bioactividad de infusiones intracraneales semanales de IL13BBZ Tcm autólogas en pacientes con GBM IL13Ra2+ recurrente. Según se describe con mayor detalle posteriormente, los pacientes incorporados se sometían a leucaféresis para recoger PBMC autólogas y, simultáneamente con la fabricación de IL13BBZ+ Tcm, se realiza biopsia tumoral o resección, con colocación de un dispositivo de depósito/catéter. Después de la obtención de imágenes por MR y PET y la recuperación de la cirugía, los pacientes se tratan en un régimen terapéutico de 4 semanas, que consiste en 3 infusiones intracraneales semanales de IL13BBZ+ Tcm seguido por una semana de descanso para la valoración de la enfermedad y la toxicidad. Los resultados hasta la fecha para esta primera cohorte de dosis de tres pacientes de resección sugieren que el aporte local de IL13BBZ Tcm después de la resección quirúrgica es seguro y bien tolerado sin toxicidades de grado 3 o superiores atribuidas a la terapia observada, y, de forma importe, demuestran una evidencia temprana de actividad antitumoral después de la administración de células T CAR. Para todos los pacientes en los que estaba disponible una muestra, se detectaban células T CAR en el fluido quístico tumoral o el líquido encefalorraquídeo (CSF) mediante citometría de flujo durante un mínimo de 7 días después del tratamiento. Un paciente de particular interés presentaba un GBM multifocal recurrente, incluyendo una zona metastásica en la columna vertebral y enfermedad leptomeníngea extensiva. Este paciente se trató inicialmente por protocolo con seis infusiones locales de IL13BBZ Tcm en la cavidad de resección del foco tumoral recurrente más grande en la región temporooccipital posterior. De modo alentador, esta zona de inyección de células T CAR permanecía estable sin evidencia de recaída de la enfermedad durante más de 7 semanas, mientras que otros focos de enfermedad distantes de la zona de inyección de células T CAR continuaban progresando. A continuación, este paciente se trató con un protocolo de uso compasivo con cinco infusiones intraventriculares semanales de IL13BBZ Tcm sin ninguna otra intervención terapéutica. Una semana después de la infusión intraventricular final de células T CAR, todos los tumores intracraneales y raquídeos habían retrocedido con la mayoría disminuyendo más de 75% en volumen, y este paciente permanecía clínicamente estable cuatro meses después del inicio del tratamiento con células T CAR.

Se describe posteriormente el CAR, IL13(EQ)BBZ, usado en este estudio. La secuencia del CAR inmaduro, que incluye el marcador CD19t, se representa en la Figura 9. Toda la secuencia inmadura (SEQ ID NO:1) incluye: un péptido de señalización GMCSF de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:2), una secuencia de IL-13 de 112 aminoácidos (SeQ ID NO:3; sustitución de aminoácido E13Y mostrada en negrita); una secuencia de IgG4 de 229 aminoácidos (SEQ ID NO:4; con las sustituciones de aminoácidos L235E y N297Q mostradas en negrita); una región transmembranaria CD4 de 22 aminoácidos (SEQ ID NO:5); una secuencia 4-1BB de 42 aminoácidos (SEQ ID NO:6); un conector de Gly de 3 aminoácidos; una secuencia CD3Z de 112 aminoácidos (SEQ ID NO:7); una secuencia T2A de 24 aminoácidos (SEQ ID NO:8); y una secuencia CD19t de 323 aminoácidos (SeQ ID NO:9).

Se usaron células autólogas procedentes de cada paciente para preparar células T^cmCD8+ CD4+ que a continuación se transfectaron con un vector lentiviral, descrito anteriormente, que expresa IL13(EQ)BBZ. Brevemente, las T^cmse enriquecieron a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando el dispositivo CliniMACS® para seleccionar inmunomagnéticamente CD45RO+/CD62L+ T^cm. Estas células se activaron con cuentas Dynal anti-CD3/CD28, transducidas con un vector lentiviral SIN que dirige la expresión del IL13(EQ)BBZ CAR. Las células IL13(EQ)BBZ/CD19t+ T^cmactivadas/genéticamente modificadas se expandieron in vitrocon IL-2/IL-15 y a continuación se crioconservaron.

El tratamiento de dos pacientes, que sufrían ambos GBM recidivante/refractario, se describe posteriormente. La administración intracavitaria de células T CAR se realizó manualmente a lo largo de aproximadamente 5-10 minutos a través de un catéter de Rickham seguido por hasta 1,0 ml de barrido de solución salina normal libre de conservante (PFNS) aportado mediante aporte potenciado por convección (CED) a 0,5 ml/hora. La administración intraventricular de células T CAR se realizó manualmente a lo largo de aproximadamente 5-10 minutos a través de un catéter de Rickham situado en el ventrículo lateral. Esto fue seguido por hasta 0,5 ml de barrido de solución salina normal libre de conservante (PFNS) aportado a través de una técnica de empuje manual a lo largo de 5-10 minutos. El barrido de PFNS está destinado a limpiar el conducto de administración y empujar las células T CAR restantes a través del catéter.

El transcurso del tiempo de la preparación de y el tratamiento con células T CAR se representa en la Figura 31. Simultáneamente con el procedimiento de fabricación, los participantes en la investigación se sometían a resección de su tumor o sus tumores seguido por colocación de un catéter de Rickham y obtención de imágenes de referencia.

El Paciente UPN097 se sometió a resección tumoral y se trató en el Ciclo 1 con 2 x 106 células y en el Ciclo 2 con 10 x 106 células. Tanto en el Ciclo 1 como en el Ciclo 2, las células fueron administradas a la cavidad dejada por la resección. Después del segundo ciclo, el Paciente UPN097 se retiró del estudio debido a la rápida progresión tumoral.

El Paciente UPN109 se trató en el Ciclo 1 con 2 x 106 células y en los Ciclos 2 y 3 con 10 x 106 células. Después de un período de descanso, el Paciente UPN109 se trató en los Ciclos 4, 5 y 6 con 10 x 106 células. En los Ciclos 1-6 las células se administraron dentro. En el Ciclo 7 el paciente se trató con 2 x 106 células. En los Ciclos 8 y 9 el paciente se trató con 10 x 106 células. En los Ciclos 7-10 la administración era intraventricular.

La Figura 32A presenta un análisis de la persistencia de células T CAR, según se comprueba mediante CD19. Este análisis muestra buena persistencia de células T 8 días después del Ciclo 2. La Figura 32B muestra una disminución de la presencia de células de GBM según se comprueba mediante la expresión de IL13Ra2 sobre las células.

La Figura 33A y la Figura 33B representan resultados de obtención de imágenes del Paciente UPN097 en la región del catéter usado para la administración intratumoral. En la Figura 33A, se puede observan que están presentes pocas células T CD3+ o CD8+ antes del tratamiento. La Figura 33B, que es una muestra el Día 16 después del tratamiento tomada de la pared de la cavidad tumoral frontal, muestra una gran superficie de tumor necrótico y presencia significativa de células CD3+ y CD8+.

Según se muestra en las Figuras 34A-D, había un incremento en IFN-gamma (una citocina Th1) a lo largo de dos Ciclos de tratamiento mientras que los niveles de IL-13 (una citocina Th2) no cambiaban significativamente (Figuras 34A y Figura 34B). IL-6, una citocina relacionada con tumores, disminuía durante el Ciclo 1 y permanecía al nivel inferior durante el Ciclo 2 (Figura 34C). IL-8, otra citocina relacionada con tumores, disminuía durante el Ciclo 1, pero se incrementaba hasta su nivel anterior al Ciclo 1 durante el Ciclo 2 (Figura 34D).

El Paciente UPN109 presentaba un GBM multifocal recurrente, que incluía una zona metastásica en la columna vertebral y enfermedad leptomeníngea extensiva. Según se describe anteriormente, esta paciente se trató con seis infusiones locales de E13BBZ Tcm en la cavidad de resección del foco tumoral recurrente más grande. Aunque la zona de inyección de células T CAR permanecía estable sin evidencia de recaída de la enfermedad durante más de 7 semanas, otros focos de enfermedad distantes de la zona de inyección de células T CAR continuaban progresando (datos no mostrados). A continuación, este paciente recibía infusiones intraventriculares semanales de IL13BBZ Tcm, según se describe anteriormente. Las Figuras 35A-B presentan imágenes de MRI y/o PET de la sección cerebral transversal (Figura 35A) y la sección cerebral sagital (Figura 35B). La Figura 35C presenta las secciones transversal (parte superior) y frontal (parte inferior) de la columna vertebral antes (izquierda) y una semana después (derecha) de la finalización de la terapia intraventricular, con las zonas de lesión tumoral indicadas por flechas rojas en cada imagen.

Ejemplo 16: Caso Clínico durante la Administración intraventricular

Un varón de 50 años de edad fue diagnosticado inicialmente de un tumor cerebral de grado bajo en el lóbulo temporal después de presentar convulsiones tonicoclónicas. Después de cuatro meses de comprobación, este tumor temporal derecho presentaba un incremento de intensidad mediante MRI, y el paciente se sometió a resección del tumor que confirmaba un diagnóstico de glioma grado IV según la OMS (GBM). A continuación, el paciente recibía radiación protónica adyuvante de referencia hasta una dosis total de 59,4 Gy de cobalto equivalente con temozolomida simultánea (140 mg al día), seguido por 4-ciclos de temozolomida con uso concomitante del dispositivo Novocure (NovoTTF-100A) durante tres meses. Seis meses después de la resección del tumor primario, las imágenes de PET y MRI mostraban evidencia de progresión de la enfermedad.

A continuación, el paciente se trató células T CAR dirigidas a IL13Ra2 autólogas (Figura 36) después de la confirmación de la expresión de IL13Ra2 en el tumor primario del lóbulo temporal derecho mediante IHC, con una puntuación H de 100 (Figura 37). A continuación, se recogieron células mononucleares de sangre periférico (PBMC) mediante leucaféresis seguido por enriquecimiento de TCM CD4+ CD8+ a través de un procedimiento de selección por agotamiento en dos etapas según se describe previamente. Durante la fabricación de TCM IL13BBZ, el paciente se trató en un protocolo clínico separado que evaluaba un inhibidor del factor de crecimiento fibroblástico (NCT01975701), y progresaba a través de la terapia con síntomas crecientes de cefaleas, confusión y desorientación. Adicionalmente, se disminuyeron paulatinamente los esteroides en el paciente antes de las inyecciones de células T.

Diez meses después de la resección del tumor primario, el paciente se sometió a otra resección quirúrgica para tres de cinco lesiones de GBM progresivas identificadas (Figura 38), incluyendo la lesión más grande de la región temporooccipital posterior derecha (T1) donde estaba colocado el depósito/catéter, y dos lesiones en el lóbulo frontal derecho (T2, T3). Dos tumores adicionales en la zona temporal izquierda no se extirparon quirúrgicamente (T4,T5). Seis días después de la resección quirúrgica, el paciente recibía dos regímenes de tratamiento de 4 semanas, cada uno consistente en tres infusiones intracavitarias (ICT) semanales de IL13BBZ TCM seguido por una semana para la evaluación de la toxicidad y la valoración de la enfermedad. Este paciente se trató partiendo de una dosis baja de 2 x 106 células T CAR+ seguido por cinco infusiones de 10 x 106 células T CAR+ (Figura 39). Después de estas seis infusiones ICT, bajo un protocolo de uso compasivo, un segundo catéter se puso en el ventrículo lateral derecho, permitiendo que el paciente recibiera cinco ciclos de tratamiento intracerebroventriculares (ICV) adicionales de IL13BBZ TCM, de nuevo partiendo de una dosis baja de 2 x 106 células T CAR seguido por cuatro infusiones de 10 x 106 células T CAR (Figura 40).

Debido a la limitación del producto terapéutico, solo eran factibles cinco ciclos de infusión ICV. En general, el paciente recibía 11 infusiones de células para una dosis total de 94 x 106 células T CAR+. El transcurso del tratamiento abarcaba 15 semanas, teniendo lugar semanas de evaluación para la valoración de la toxicidad y la enfermedad (es decir, obtención de imágenes por MRI y PET) después de cada tercer ciclo, y después de las dos infusiones ICV finales. El paciente no recibía otras intervenciones terapéuticas durante este plan de tratamiento con células T CAR, y se presentan aquí hallazgos hasta el período de evaluación de 190 días, que abarca los ciclos de 11 infusiones. Posteriormente, se fabricó un segundo producto de TCM IL13BBZ y empezando el día 192 este paciente ha continuado recibiendo infusiones ICV de este segundo producto fabricado aproximadamente cada 3 semanas.

Ejemplo 17: Diseño del estudio

Estos estudios, incluyendo el protocolo de uso compasivo, fueron aprobados por un comité de revisión institucional, y el paciente proporcionaba un consentimiento informado por escrito. La capacidad de elección incluía el diagnóstico confirmado histológicamente previo de un glioma de grado IV IL13Ra2+ que ahora es recurrente, edad > 18 años con un estado de comportamiento de Karnofsky (KPS) > 60, función cardiopulmonar adecuada y una expectativa de supervivencia > 4 semanas. El paciente debe tener una radioterapia inicial completada al menos 12 semanas antes de la incorporación, y no debe tener otras enfermedades malignas activas, infecciones o dolencia intercurrente o estar recibiendo otros agentes de investigación o requerir más de 2 mg de TID (3x/día) de dexametasona durante la terapia con células T.

Este paciente fue tratado inicialmente bajo el estudio en fase I en marcha de los presentes inventores (NCT02208362) para evaluar la seguridad y la factibilidad de infusiones intracraneales semanales de células T CAR orientadas a IL13Ra2 (IL13BBZ TCM) autólogas en pacientes diagnosticados de glioma de grado alto IL13Ra2+ recurrente/refractario (Grados III y IV de la OMS). Este es un estudio de dos ramas con células T administradas bien directamente en el tumor (estrato 1 = intratumoral) o bien en la cavidad de resección tumoral (estrato 2 = intracavitaria). Después de completar los ciclos de seis infusiones intracavitarias (ICT), este paciente se trató a continuación bajo un protocolo de uso compasivo separado permitiendo el aporte intracerebroventricular (ICV) de IL13BBZ TCM.

Ejemplo 18: Fabricación e infusión de Productos Celulares

Se detalla en la presente el vector lentiviral que codifica el CAR orientado a IL13Ra2 coestimulante con 4-1BB, IL13BBZ. Brevemente, la secuencia de CAR optimizada codónicamente contiene un ligando de IL-13 humana ligado a la membrana mutado en un solo sitio (E13Y) para reducir la unión potencial a IL13Ra1, un espaciador de Fc de IgG4 humana que contiene dos mutaciones (L235E; N297Q) que evita el reconocimiento mediado por el receptor de Fc, un dominio transmembranario CD4 humano, un dominio de señalización citoplásmica 4-1BB coestimulante humano y un dominio de señalización citoplásmica CD3Z humano. Una secuencia de salto ribosómico T2A separa a continuación esta secuencia de CAR IL13BBZ de una secuencia de CD19 humano truncada (CD19t), un marcador de la superficie celular no inmunogénico inerte.

Para la fabricación de IL13BBZ TCM, el día de la leucaféresis, las PBMC se aislaron mediante centrifugación con gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare) seguido por dos lavados en PBS/EDTA. A continuación, las PBMC se lavaron una vez en PBS, se resuspendieron en medio X Vivo15 (Bio Whittaker) que contenía 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Hyclone), se transfirieron a una bolsa de transferencia de 300 cc y se almacenaron en un rotador tridimensional durante la noche a temperatura ambiente (RT). Al día siguiente, 5x109 PBMC se incubaron en una bolsa de transferencia de 300 cc con microcuentas de anti-CD14 (1,25 ml), anti-CD25 (2,5 ml) y anti-CD45RA (2,5 ml) de calidad clínica (Miltenyi Biotec) durante 30 minutos a RT en X Vivo15 que contiene 10% de FCS. A continuación, las células CD14+, CD25+ y CD45RA+ se agotaron inmediatamente usando el modo de agotamiento CliniMACS™ según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Después de la centrifugación, la fracción de células negativa no cargada se resuspendió en tampón de PBS/EDTA CliniMACS™ (Miltenyi Biotec) que contenía 0,5% de albúmina sérica humana (HSA) (CSL Behring) y a continuación se marcaron con mAb DREG56 biotinilado de calidad clínica (COHNMC CBG) a 0,6 ml durante 30 minutos a RT. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en un volumen final de 100 ml de PBS/EDTA CliniMACS™ que contenía 0,5% de HSA y se transfirieron a una nueva bolsa de transferencia de 300 cc. Después de 30 minutos de incubación con 1,25 ml de cuentas de antibiotina (Miltenyi Biotec), la fracción CD62L+ (TCM) se purificó con selección positiva en CliniMACS™ según las instrucciones del fabricante, y se resuspendió en X Vivo15 que contenía 10% de FCS.

En 2 horas desde el enriquecimiento, se estimularon 26,9 x 106 TCM con GMP Dynabeads® Human T expander CD3/CD28 (Invitrogen) en una relación de 1:3 (célula T:cuenta) y se transdujeron con IL13BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 de calidad clínica a una MOI de 0,3 en 5,5 ml de X Vivo15 que contenía 10% de FCS con 5 pg/ml de sulfato de protamina (APP Pharmaceutical), 50 U/ml de rhIL-2 y 0,5 ng/ml de rhIL-15 en una bolsa de cultivo tisular 32 Vuelife (AFC) que se puso en una posición horizontal sobre una rejilla de cultivo a 37°C, 5% de CO2. A continuación, los cultivos se mantuvieron con la adición de X-Vivo15 10% FCS según se requiriera para mantener la densidad celular entre 4 x 105 y 2 x 106 células viables/ml, con complementación con citocinas (concentración final de 50 U/ml de rhIL-2 y 0,5 ng/ml de rhIL-15) cada lunes, miércoles y viernes de cultivo. Basándose en el volumen de cultivo, las células T se transfirieron a bolsas 730 Vuelife (AFC). Siete días después de la transducción lentiviral, las CD3/CD28 Dynabeads se retiraron usando el imán de la bolsa concentradora de partículas magnéticas Dynal ClinEx Vivo, y las células T libres de cuentas se drenaron a una nueva bolsa 730 Vuelife. Los cultivos propagados hasta aproximadamente 4,53 x 108 células se generaron según se determina mediante Guava PCA, momento en el cual los cultivos se recogieron, se lavaron en Isolyte (Braun) con 2% de HSA, a continuación, se resuspendieron en Cryostor CS5 (BioLife Solutions) a aproximadamente 1,3 x 107 células/ml para la crioconservación usando un Mr. Frosty (Nalgene) y un sistema congelador de velocidad controlada portátil (Custom Biogenics). Las pruebas de control de calidad incluían viabilidad, potencia (expresión de CD19t), identidad (expresión de CD3), número de copias del transgén (WPRE qPCR), prueba de virus competente para la replicación (VSV-G qPCR y prueba de RCL formal en the University of Indiana), recuento de cuentas residuales y esterilidad.

Según se apunta anteriormente, la secuencia de salto ribosómico T2A 12 separa a continuación esta secuencia de IL13BBZ de CD19t, un marcador de la superficie celular no inmunogénico inerte que marca la transducción celular (Figura 39A). Este enlace T2A da como resultado la expresión coordinada tanto de IL13BBZ como de CD19t a partir de un solo transcrito.

También se detallan en la presente métodos de fabricación para el enriquecimiento inmunomagnético de células T de memoria central (TCM) CD62L+ CD45RA- CD4+ CD8+, transducción lentiviral y expansión ex vivo. El producto de IL13BBZ TCM crioconservado final (EOP) se sometía a una prueba de aprobación del control de calidad como para el protocolo clínico. Para cada infusión, las células T se descongelaron, se lavaron y se reformularon en un volumen final de 0,5 ml en solución salina normal libre de conservantes farmacéutica (PFNS) con 2% de albúmina sérica humana (HSA). Las células se inyectaron manualmente en el depósito de Rickham usando una aguja de mariposa de calibre 21 para aportar un volumen de 0,5 ml a lo largo de 5-10 minutos, seguido por hasta 1 ml de PFNS de barrido aportado mediante aporte potenciado por convección (CED) a 0,5 ml por hora.

Ejemplo 19: Obtención de imágenes Clínica

Las secuencias de MRI ponderadas T1 después del gadolinio del cerebro y la columna vertebral se adquirieron en un escáner Siemens Viro 3 Tesla. Las lesiones se midieron sobre imágenes ponderadas MPR T1 de axiales obtenidas después de la administración de Multihance. La obtención de imágenes con 18-F-fluorodesoxiglucosa (18-F-FDG) se realizó usando un escáner de PET-CT GE Discovery DST HP60 (70 cm de campo de visión axial, grosor del corte 3,75 mm). Los valores de captación estandarizados (SUVs) máximos se obtuvieron utilizando el programa Vital Images Vitrea versión 6.7.2. Las regiones de focos tumorales con mejora por contraste fueron esbozadas por un radiólogo para las medidas de la superficie tumoral mayor (mm2) y se computaron los volúmenes tumorales (cm3).

Bancos de células crioconservados de IL13BBZ TCM autólogas aprobadas por control de calidad se descongelaron y se reformularon para la infusión al lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 2% de HSA y resuspender en solución salina normal libre de conservantes farmacéutica con 2% de HSA. El aporte de las células T CAR terapéuticas bien a la cavidad de resección del glioma (ICT) o bien al ventrículo lateral (ICV) se consiguió usando un depósito de ventriculostomía de Rickham Holter™ (Codman), con un catéter ventricular (Integra Pudenz), y un estilete. Para el aporte ICT, el sistema de depósito/catéter se insertó en el momento de la resección del tumor y la punta del catéter se embebió parcialmente en la pared de resección a fin de permitir el aporte celular tanto a la cavidad como al tejido cerebral peritumoral. Se obtuvieron imágenes posoperatorias (CT y MRI) para confirmar la posición del catéter y ampliar la resección del tumor.

Ejemplo 20: IL13BBZ TCM presentan un fenotipo de célula T similar a las de memoria central

TCM enriquecidas (36 x 106) se estimularon ex vivo, se transdujeron lentiviralmente y se expandieron para dar 638 x 106 células totales en 17 días. El producto de células T final (CD3+ y TCR+) consistía en subgrupos de células T CD4 (74%) y CD8 (16%) y expresaba IL13BBZ y CD19t con cotinción genomodificada para ambas proteínas de la superficie celular (Figura 39A). El producto de células T CAR exhibía un fenotipo de células T de memoria central, que expresa CD45RO (97%), CD62L (57%), CCR7 (28%), CD28 (97%) y CD27 (59%) (Figura 39A). El producto también expresaba algunos marcadores de agotamiento, incluyendo TIM-3 (65%) y LAG-3 (49%), pero no niveles significativos de PD-1 y KLRG1 (Figura 39A).

Ejemplo 21: Seguridad y tolerabilidad de infusiones intracraneales repetitivas de IL13BBZ TCM

El paciente se trató con infusiones semanales de E13BBZ TCM administradas a través de un dispositivo de depósito/catéter a través de dos vías de aporte intracraneal diferentes, que son aporte intracavitario (ICT) después de la resección del tumor (ciclos 1-6) y aporte intracerebroventricular (ICV) al líquido cefalorraquídeo (CSF) (ciclos 7-11). Las 11 infusiones intracraneales, con una dosis de células máxima de 10 x 106 células T CAR+, eran bien toleradas sin toxicidad de grado 3 o superior (criterios de toxicidad comunes del NCI) con observación de una atribución posible o superior a la terapia. Episodios leves apreciados después de la infusión de células T CAR incluyen.

Ejemplo 22: Respuesta clínica

En el momento del tratamiento, el tumor del paciente presentaba características de un GBM recurrente muy agresivo con escasas particularidades de pronóstico. Esto incluía una evidencia de recaída desde el pronóstico inicial en seis meses después de una terapia de referencia, la presentación de lesiones tumorales multifocales, incluyendo lesiones de la columna vertebral y enfermedad leptomeníngea extensiva (Figura 38), las particularidades histológicas de un GBM indiferenciado y una alta velocidad de proliferación tumoral con más de 60% de tinción positiva de las células con respecto a Ki67 (Figura 37B). La expresión tumoral de IL13Ra2, según se evalúa mediante IHC sobre FFPE de tejido tumoral resecado, era similar entre los tumores primarios y recurrentes con una puntuación H de 100 y 80, respectivamente (Figura 37). La expresión intratumoral de IL13Ra2 para el tumor recurrente era heterogénea, mostrando 10% de las células alta intensidad de tinción (2-3+), mostrando 60% baja expresión (1+) y no tiñéndose 30% de las células por encima del fondo (0+). De interés potencial, los niveles más altos de expresión de IL13Ra2 se observaban a menudo en regiones tumorales de necrosis con pseudoempalizada (Figura 37A), un patrón de expresión apuntado para otros tumores GBM.

Después de la incorporación en el protocolo clínico, este paciente se sometía a resección quirúrgica para tres de las cinco lesiones recurrentes (Figura 38) y el dispositivo de depósito/catéter se puso en la cavidad resecada de los focos recurrentes más grandes (T1) en la zona temporooccipital posterior derecha. Este paciente se trató inicialmente por protocolo con seis infusiones intracavitarias (ICT) semanales de células T CAR+ (2 x 106 ciclo 1; 10 x 106 ciclos 2-6) (Figura IB), y durante este período la lesión tumoral temporooccipital (T1) permanecía estable durante más de 45 días después de la cirugía sin evidencia de enfermedad progresiva (Figura 39C). Sin embargo, la MRI revelaba que otros focos tumorales no resecados en los lóbulos temporales izquierdos (T4 y T5), así como una nueva lesión recurrente adyacente al tumor 3 (T6) y una lesión en el surco olfativo (T7) continuaban progresando a lo largo de este mismo período (Figura 39C). Adicionalmente, también se detectaron lesiones metastásicas en la columna vertebral, incluyendo un tumor grande (270 mm2) y más de un foco tumoral pequeño (< 1 cm2). Estos resultados, mientras se mezclaban, eran alentadores, ya que sugerían que las E13BBZ T^cmpueden haber evitado la recaída de la enfermedad en la zona temporooccipital posterior resecada, sin embargo, también sugieren que el aporte ICT local no era suficiente para controlar eficazmente la progresión tumoral en posiciones distantes alejadas de la zona de infusión.

Basándose en los hallazgos y apoyándose por estudios preclínicos que muestran que el aporte ICV de células T CAR puede trasladarse a GBM multifocal en modelos en ratones NSG (datos no mostrados), este paciente se incorporaba a un protocolo de uso compasivo y se trataba con cinco infusiones ICV semanales de IL13BBZ T^{c m}sin ninguna otra intervención terapéutica (2 x 106 ciclo 7; 10 x 106 ciclos 8-11) (Figura 40A). Una semana después de tres infusiones ICV (ciclo 9; día 133) todas las lesiones tumorales mostraban una regresión drástica, y después de la infusión ICV final (ciclo 11; día 156), la mayoría de los tumores intracraneales y raquídeos habían retrocedido más de 70% mediante medidas tanto de superficie como de volumen máximos (Figura 40B-E, Tabla 7 posterior, y Figura 41). La obtención de imágenes MR y PET de seguimiento seis semanas después de la última infusión ICV (día 190), durante las cuales el paciente no recibía otra intervención terapéutica, mostraba la regresión continuada de la enfermedad, disminuyendo todos los tumores > 78% mediante medidas tanto de la superficie como del volumen máximos (Figura 40B-E, Tabla 7 posterior y Figura 41). En este punto de 190 días, no era posible diferenciar entre la evidencia radiográfica residual de enfermedad frente a inflamación, cicatrices y/o acrecentamiento dural. El aporte ICV de E13BBZ T^{c m}provocaba la eliminación casi completa de todos los tumores metastásicos de la columna vertebral, con 97% de reducción en la superficie máxima para la lesión más grande y solo un pequeño foco tumoral visible aparte de los más de diez presentes antes del tratamiento ICV. A lo largo del transcurso del tiempo de tratamiento ICV, y coincidiendo con la regresión tumoral, el paciente era capaz de reducir dexamethosome sistémica de 2 mg dos veces al día a 0,5 mg cada día. Este paciente permanece clínicamente estable y ha vuelto a las actividades de la vida normal y el trabajo, apoyando así la durabilidad de esta respuesta antitumoral mediada por células T CAR. Estos resultados demuestran que el tratamiento con IL13BBZ T^{c m}mediaba en una respuesta casi completa basándose en los criterios de RANO restrictivos.

Ejemplo 23: Persistencia de células T CAR y Respuesta inflamatoria del CNS

Para elucidar cambios inmunológicos asociados con respuestas antitumorales observadas después de la infusión ICV de IL3BBZ T^{c m}(Ciclos 6-11), se evaluó el CSF con respecto a infiltrados celulares, persistencia de célula T CAR+ y niveles de citocinas. Inmediatamente después de cada infusión ICV, es decir, día 1 -2 de los ciclos 6-11), los números de células por ml de CSF se incrementaban 7,0±3,6 veces en comparación con los niveles anteriores a la infusión (día 0 de cada ciclo) y se incrementaban 153±128 veces en comparación con los niveles antes de ICV (C7D0) (Figura 42). Los números de células totales en el CSF típicamente disminuían a lo largo del ciclo de tratamiento de 7 días. Según se evalúa para C9D2, los infiltrados celulares incluían una gran proporción de células T CD3+, tanto endógenas como que expresan CAR, así como poblaciones mieloides maduras CD14+ CD11b+ HLA-DR+ (Figura 42A). Solo se detectaban células B CD19+ raras y granulocitos CD11b+ CD15+ (Figura 42A). De acuerdo con los datos de citometría de flujo, la citopatología del CSF sobre C11D1 presentaban la presencia de linfocitos, monocitos y macrófagos reactivos.

La persistencia de CAR-T también se comprobó a lo largo del transcurso del tratamiento ICV. Debido a la baja recuperación de células en el CSF durante los ciclos 7 y 8, el análisis se enfocaba a evaluar el ciclo 9 y los momentos inmediatamente posteriores a los ciclos 10 y 11. De forma importante, se detectaron células T CAR+ en todos los momentos evaluados (Figura 42B), incluyendo C9D0 que correspondía a 7 días después del ciclo 8, demostrando así la persistencia de las células terapéuticas durante al menos de 7 a 8 días después de la infusión. Sin embargo, los números de CAR T en el CSF después de la infusión disminuían en los ciclos posteriores (C10D1 y C11D1) cuando la carga tumoral también había disminuido significativamente (Figura 40B). A destacar, no se detectaba una expansión significativa de las células T CAR en el CSF a lo largo del ciclo 9, creciendo los números de células CAR+ 1,6 veces 2 días más tarde (C9D2) desde la preinfusión (C9D0) y a continuación disminuyendo 2,3 veces para el día 8 (C9D8).

La presencia de células inmunitarias, incluyendo células T CAR+, después de cada infusión correspondía a elevaciones significativas de los niveles de citocinas en el CSF. Los niveles medidos y el cambio en número de veces calculado sobre el valor de referencia para las 30 citocinas medidas se presentan en las Tablas 9 y 10 posteriormente. De forma notable, 11 citocinas se incrementaban más de 10 veces desde el valor de referencia anterior a ICV (C7D0) inmediatamente después de las infusiones de IL3BBZ T^{c m}, incluyendo las citocinas IFNy, TNF, IL-2, IL-10, IL-5, IL-6 y IL-8 y las quimiocinas CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 y CCR2/MCP-1 y el receptor de citocina soluble IL-1Ra (Figura 3C). Otras siete citocinas mostraban un incremento de más de 5 veces desde el valor de referencia (C7D0), incluyendo G-CSF, IL-12, IL2-R, IL-4, IL-7 y MIP-1 b. Las citocinas inflamatorias que exhibían el mayor incremento en número de veces inmediatamente después de la infusión de IL3BBZ T^{c m}en comparación con antes de ICV (C7D0) eran IL-2 (>90 veces para C9D2) y las quimiocinas inducibles por IFN-y CXCL9 y CXCL10 (>40 veces para C8D1, C9D2, C10D1 y C11D2). Estas citocinas volvían cerca de los niveles de referencia en 7 días entre ciclos de tratamiento. Las citocinas que no mostraban un incremento significativo después de infusiones de células T CAR incluyen IL-13, RANTES y VEGF (Tablas 9 y 10).

Estos cambios inmunológicos en el CSF eran locales, ya que no se observaban cambios significativos en los niveles de citocinas (Tabla 11) ni tampoco células T CAR+ detectables mediante qPCR y citometría de flujo (datos no mostrados) en la sangre periférica. Estos cambios en el CSF no se podían comparar con los cambios en la cavidad resecada de la lesión tumoral 1 (T1) debido a la incapacidad para obtener fluido quístico de la cavidad durante el transcurso del tratamiento ICT.

Ejemplo 24: Procesamiento y Análisis de Muestras de Pacientes

El material de resección tumoral se recogió a través del departamento de patología del COH según el protocolo clínico.

Se realizó inmunohistoquímica (IHC) de IL13Ra2 sobre secciones de 5 pm de especímenes embebidos en parafina fijados con formalina según se describe previamente, y de forma similar se realizó IHC de Ki67 con la excepción de la recuperación del antígeno al calentar a pH 8,0, e incubación con una dilución 1:75 de anti-K167 (Dako Corp). La inmunorreactividad de IL-13Ra2 fue puntuada por un neuropatólogo clínico y se cuantificó basándose en el porcentaje de células tumorales que exhibían intensidad débil (1+), moderada (2+) o fuerte (3+) de la tinción citoplásmica y pseudogolgiana. La puntuación H se obtiene mediante la fórmula: (3 x porcentaje de células que se tiñen fuertemente) (2 x porcentaje de células que se tiñen moderadamente) porcentaje de células que se tiñen débilmente, dando un intervalo de 0 a 300. La puntuación H se puede traducir en el sistema de puntuación de intensidad descrito en los criterios de incorporación como sigue: representando 0 negativa (puntuación H 0), 1+ baja (puntuación H 1-100), 2+ moderada (puntuación H 101 -200) y 3+ alta (puntuación H 201 -300). Los criterios para la inclusión eran que al menos 20% de las células puntuaran una intensidad de tinción 1+ (> 20%, 1+), representando una puntuación H de 20. Se emplearon controles positivos (testicular) y negativo (próstata) apropiados para la tinción IHC de IL-13Ra2. Un signo "+" refleja la presencia de tinción membranosa. Esta prueba se ha realizado en the Department of Pathology, City of Hope National Medical Center y se considera investigativa para la exploración. Se certifica bajo the Clinical Laboratory Improvement Amendments de 1988 (CLIA) que este laboratorio está cualificado para realizar una prueba clínica de laboratorio de gran complejidad.

Se recogieron muestras de sangre periférica en tubos al vacío ±EDTA. Las muestras con EDTA se trataron con Ficoll inmediatamente tras la recepción y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se congelaron en Crystor CS5 a -80°C y a continuación se transfirieron a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo. Las muestran sin EDTA se dejaron coagular durante 2-3 horas a temperatura ambiente; el suero se recogió mediante centrifugación, se dividió en partes alícuotas de 100-200 pl de un solo uso y se almacenaron a -80°C. El líquido cefalorraquídeo (CSF) se recogió del depósito ICV en una jeringa de 3 cc, se centrifugó y los sobrenadantes se dividieron en partes alícuotas y se almacenaron a -80°C. Las células del CSF se resuspendieron en HBSS-/- (Corning CellGro) con 2% de FCS y azida sódica para el análisis citométrico de flujo inmediato, con las células restantes resuspendidas y congeladas en Cryostor CS4 a -80°C y a continuación se transfirieron a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo

El fenotipaje de la superficie celular de células inmunitarias se realizó mediante citometría de flujo usando anticuerpos conjugados a fluorocromo específicos para CD3, CD4, CD11b, CD14, CD19, CD27, CD28, CD62L, CD45RA, CD45R0, IL-13, TCR-a/p (BD Biosciences), KLRG1, CD15 (BioLegend), HLA-DR, p D1 (eBiosciences), CD8 (Fisher Scientific), LAG-3 (Lifespan Biosciences), CCR7 o TIM-3 (R&D Systems), y sus respectivos controles de isotipo.

Muestras de suero y CSF de los participantes en la investigación se analizaron mediante una matriz de cuentas para determinar citocinas. Los ensayos se realizaron usando el estuche Human Cytokine 30-Plex Panel kit (Invitrogen) y un FLEXMAP 3D® (Luminex).

Claims

r e iv in d ic a c io n e s

1. Una composición para el uso en un método para tratar a un paciente diagnosticado de una enfermedad maligna del sistema nervioso central que comprende introducir en un compartimento anatómico que contiene el líquido cefalorraquídeo (CSF) del paciente la composición que comprende una cantidad eficaz de células T, en donde las células T comprenden células T CAR que expresan un receptor antigénico quimérico.

2. La composición para el uso según la reivindicación 1, en donde las células T son células T autólogas o alogénicas.

3. La composición para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la composición se administra intraventricularmente.

4. La composición para el uso según la reivindicación 3, en la que la administración es al ventrículo izquierdo.

5. La composición para el uso según la reivindicación 3, en donde la administración es al ventrículo derecho.

6. La composición para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la composición se administra al canal central de la médula espinal.

7. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde la composición comprende al menos 1 x 106 células.

8. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la composición que comprende células T se administra al menos dos veces, opcionalmente en donde las administraciones difieren en el número total de células T administradas o en donde las administraciones se aumentan a escala o se disminuyen a escala en la dosis.

9. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la enfermedad maligna es un tumor infiltrante difuso o en donde la enfermedad maligna es un tumor cerebral primario, o en donde la enfermedad maligna es tumor cerebral secundario o en donde la enfermedad maligna surge de un cáncer primario seleccionado de: cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello y melanoma.

10. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además la administración intratumoral de células T, en donde las células T expresan un receptor antigénico quimérico, en donde el receptor antigénico quimérico se une a una proteína expresada sobre la superficie de células de glioblastoma, en donde el paciente se ha sometido previamente a resección de una lesión tumoral.

11. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde las células T comprenden tanto células CD4+ como células CD8+, y/o en donde las células T comprenden al menos 10% de células Tcm.

12. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde las células T CAR se dirigen a IL13Ra2 y comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico que comprende: IL-13 humana o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos; un dominio transmembranario seleccionado de: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3Z o una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos; al menos un dominio coestimulante; y un dominio de señalización CD3 Z de una de sus variantes que tiene 1-10 modificaciones de aminoácidos, opcionalmente en donde la IL-13 humana o su variante es una variante de IL-13 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 con de 1 a 5 modificaciones de aminoácidos, con la condición de que el aminoácido en la posición 11 de SEQ ID NO:3 sea distinto de E.

13. La composición para el uso según la reivindicación 12, en donde el receptor antigénico quimérico comprende una región espaciadora situada entre la IL-13 o su variante y el dominio transmembranario, opcionalmente en donde la región espaciadora comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 14-20, 50 y 52.

14. La composición para el uso según la reivindicación 12, en donde el receptor antigénico quimérico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 10 y 31-48.

15. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el receptor antigénico quimérico se une a HER2 y las células T de memoria central comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico que comprende: un dominio de orientación a HER2; un dominio transmembranario seleccionado: un dominio transmembranario CD4 o una de sus variantes que tiene 1 -5 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD8 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos, un dominio transmembranario CD28 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos y un dominio transmembranario CD3s o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos; un dominio coestimulante seleccionado de un dominio coestimulante CD28 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos y un dominio coestimulante 4-IBB o una de sus variantes que tiene 1 -5 modificaciones de aminoácidos; y un dominio de señalización CD3s de una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos, opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 26 y 27 o una de sus variantes que tiene 1-5 modificaciones de aminoácidos.

16. La composición para el uso según la reivindicación 15, en donde el dominio de orientación a HER2 es un scFv de HER2, en donde opcionalmente el scFv de HER2 que comprende la secuencia de aminoácidos: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFN IKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFY AMDYWGQGTLVTVSS o una de sus variantes que tiene de 1 a 5 modificaciones de aminoácidos.

17. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la enfermedad maligna surge de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: enfermedades malignas primarias del CNS y enfermedades malignas secundarias que surgen de un cáncer situado en cualquier parte, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el sida, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor teratoide/raboide atípico, carcinoma del sistema nervioso central y de células basales, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de huesos, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales, cáncer de mama, tumores bronquiales, linfoma de Burkitt, tumores carcinoides, cánceres del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, cordoma, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma de células T cutáneo, tumores embrionarios, cáncer del sistema nervioso central y endometrial, ependimoblastoma, ependimoma, cáncer esofágico, estesioneuroblastoma, la familia del sarcoma de Ewing de tumores tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular histiocitoma fibroso del hueso, maligno, y osteosarcoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromáticos gastrointestinales (GIST) - véanse sarcoma de tejidos blandos, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, glioma, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, cáncer hepatocelular (hígado), histiocitosis, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, insulinomas (endocrino páncreas), sarcoma de Kaposi, cáncer renal, histiocitosis de células de Langerhans, cáncer laríngeo, leucemia, cáncer de los labios y la cavidad oral, cáncer hepático (primario), carcinoma lobular in situ (LCIS), cáncer de pulmón, linfoma, macroglobulinemia, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso y osteosarcoma, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con carcinoma del tracto de la línea media primario oculto que implica el gen NUT, cáncer de boca, síndromes de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasma de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásticos, neoplasmas mielodisplásticos/mieloproliferativos, leucemia mielógena crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML), mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, cáncer de la cavidad nasal y el seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer oral, cáncer de la cavidad oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer ovárico, cáncer pancreático, papilomatosis, paraganglioma, cáncer del seno paranasal y la cavidad nasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer faríngeo, feocromocitoma, tumores parenquimales pineales de diferenciación intermedia, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, embarazo y cáncer de mama, linfoma primario del sistema nervioso central (CNS), cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales (riñón), cáncer de células transicionales de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivares, sarcoma, síndrome de Sezary, cáncer de pulmón microcítico, cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular cutáneo, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer tiroideo, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico, cáncer de uréter y pelvis renal, cáncer uretral, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.

18. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la enfermedad maligna es glioblastoma.