ES2909973T3 - Receptores quiméricos para el antígeno que se dirigen a HER2 - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico para el antígeno, en donde la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de **(Ver SECUENCIAS)** y **(Ver SECUENCIAS)**
Description
DESCRIPCIÓN
Receptores quiméricos para el antígeno que se dirigen a HER2
ANTECEDENTES
Se han investigado inmunoterapias basadas en linfocitos T específicos de tumor, que incluyen terapias que emplean linfocitos T manipulados, para el tratamiento antitumoral. En algunos casos, los linfocitos T usados en dichas terapias no siguen activos in vivo durante periodos suficientemente largos. En algunos casos, la especificidad por tumor de los linfocitos T es relativamente baja, debido en parte a la naturaleza heterogénea de los tumores sólidos y a las posibilidades de efectos inespecíficos sobre células no cancerosas cuando que dirigen a auto-antígenos. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de terapias contra el cáncer específicas de tumor con especificidad y función antitumoral mejoradas.
Los receptores quiméricos para el antígeno (CAR) están compuestos de un dominio de reconocimiento de /dirigido a tumores extracelular, un conector/espaciador extracelular, un dominio transmembranario y dominios de señalización activantes y estimuladores de linfocitos T intracelulares. El diseño del dominio de reconocimiento/dirigido es crítico para evitar efectos inespecíficos perjudiciales. La mayoría de los dominios dirigidos a tumores de CAR son fragmentos variables de una sola cadena (scFv) derivados de secuencias de anticuerpos que explotan la especificidad de la unión del anticuerpo a antígenos particulares. También hay ejemplos de dominios dirigidos a tumores de CAR derivados de ligandos de receptores normales, tales como el CAR de la citocina IL-13 que se dirige a células que expresan el receptor de IL-13, IL13Ra2.
La terapia adoptiva de linfocitos T (ACT) que utiliza linfocitos T manipulados que expresan un CAR ha mostrado eficacia clínica robusta y duradera en pacientes con tumores malignos de linfocitos B CD 19+ (Priceman et al. 2015 Curr Opin Oncol; Maus et al. 2014 Blood 123: 2625-2635). Con primeros éxitos en enfermedades hematológicas, ahora se está investigando intensamente una aplicación más amplia de este enfoque a tumores sólidos.
Según los datos del Programa de Vigilancia, Epidemiología y Resultados Finales (SEER) del Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos, hubo una estimación de 40.000 muertes por cáncer de mama en 2014, principalmente de enfermedad metastásica. Aproximadamente el 25-30 % de los pacientes con cáncer de mama tenían una amplificación del gen HER2, que confiere un pronóstico particularmente malo. Incluso con la aparición de agentes más nuevos, que incluyen terapias dirigidas, solo ha habido modestas mejoras en las tasas globales de mortalidad en la enfermedad de estadio IV. Por ejemplo, en un ensayo aleatorizado con pacientes con cáncer de mama HER2-positivo, la combinación de tratamientos más prometedora de dos anticuerpos dirigidos a HER2, trastuzumab y pertuzumab, más docetaxel, da una mediana de la supervivencia global de 56,5 meses y una extensión de la supervivencia sin progresión de solo 6,3 meses con respecto a trastuzumab y docetaxel solos.
El documento de patente WO 2014/100385 A1 describe CAR que son capaces de dirigir una célula inmunitaria a un antígeno diana que incluye Her2. El documento de patente US2014/0140976 A1 describe polipéptidos de serina proteasa truncados que están conjugados con un resto que se dirige a célula, tal como un resto que se une a HER2. Tobias Riét describe en una tesis doctoral en la Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultaet de la Universidad de Colonia publicada el 24 de noviembre de 2010 un aumento de la selectividad por antígeno de linfocitos T mediante la coexpresión de CAR de diferente especificidad. Zhao et al. describen en The Journal of Immunology, vol. 183, N.° 9, 1 de noviembre de 2009, en las páginas 5563-5574, que un CAR basado en Herceptin con dominios de señalización modificados conduce a una supervivencia potenciada de linfocitos T transducidos y a actividad antitumoral. El documento de patente WO2011/137245 A2 describe conjugados que se unen a Her2. El documento de patente US 2014/0099309 A1 describe linfocitos T-CAR que comprenden un CAR que tiene un primer módulo de señalización y un segundo CAR que tiene un segundo módulo de señalización distinto, en donde la primera y la segunda diana son cada una un antígeno de tumor asociado a un tumor sólido que incluye HER2. Ahmed et al. describen en Clinical Cancer Research, vol. 16, N.° 2, 15 de enero de 2010, en las páginas 474-485, linfocitos T específicos de HER2 que se dirigen a células madre de glioblastoma primario e inducen la regresión de tumores experimentales autólogos. Ahmed et al. describen en Cancer Research, vol. 67, N.° 12, 15 de junio de 2007, en las páginas 5957-5964 una regresión del meduloblastoma experimental tras una transferencia de linfocitos T específicos de HER2.
SUMARIO
La presente invención se define por las reivindicaciones independientes. Las reivindicaciones dependientes describen realizaciones adicionales de la invención. En el presente documento se describen inmunorreceptores transmembranarios quiméricos (receptores quiméricos para el antígeno o "CAR") que comprenden un dominio extracelular, una región transmembranaria y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular incluye un scFv dirigido a HER2 y, opcionalmente, un espaciador, que comprende, por ejemplo, una porción de dominio Fc humano. La porción transmembranaria incluye, por ejemplo, un dominio transmembranario CD4, un dominio transmembranario CD8, un dominio transmembranario CD28 o un dominio transmembranario CD3. El dominio de señalización intracelular incluye el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 (CD3^) humano y uno o más dominios coestimulantes, por ejemplo, un dominio coestimulante 4-IBB o un CD28. El dominio extracelular permite que el CAR, cuando se expresa sobre la superficie de un linfocito T, dirija la actividad de linfocitos T a las
células que expresan HER2. Dichas células incluyen ciertas células de cáncer de mama y ciertas células de cáncer cerebral. La inclusión de un dominio coestimulante, tal como el dominio coestimulante 4-IBB (CD137) en serie con CD3^ en la región intracelular, permite que el linfocito T reciba señales coestimulantes. Los linfocitos T, por ejemplo, linfocitos T autólogos específicos de paciente, se pueden manipular para expresar los CAR descritos en el presente documento, y las células manipuladas pueden ser expandidas y usadas en ACT. Se pueden usar diversos subconjuntos de linfocitos T, que incluye tanto los linfocitos T alfa beta como los linfocitos T gamma delta. Además, los CAR se pueden expresar en otras células inmunitarias, tales como células NK. Donde un paciente se trata con una célula inmunitaria que expresa un CAR descrito en el presente documento, la célula puede ser un linfocito T autólogo o un linfocito T alógeno. En algunos casos, las células usadas son una población de células que incluye tanto linfocitos T de memoria central (Tcm) CD4+ como c D8+, que son CD62L+, CCR7+, CD45RO+ y CD45RA-, o las células usadas son una población de células que incluye linfocitos Tcm CD4+ y CD8+, linfocitos T de memoria central progenitores y linfocitos T indiferenciados (es decir, una población de linfocitos Tcm/scm/n). Una población de linfocitos Tcm/scm/n son CD62L+, CCR7+ e incluyen tanto células CD45RA+ como CD45RO+, así como tanto linfocitos CD4+ como linfocitos CD8+. El uso de dichas células puede mejorar la persistencia a largo plazo de las células después de la transferencia adoptiva en comparación con el uso de otros tipos de linfocitos T específicos de paciente.
En el presente documento se desvela una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, en donde la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
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RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 27) .
También se desvela una población de linfocitos T humanos transducida por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor quimérico para el antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 26 y 27.
También se desvela una composición que comprende una población de linfocitos T humanos autólogos o alógenos transducidos por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor quimérico para el antígeno, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 26 y 27 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer que expresa HER2 en un paciente. En diversas realizaciones: el cáncer es cáncer cerebral, por ejemplo, un cáncer cerebral que expresa HER2 que es una metástasis
de cáncer de mama; y los linfocitos T humanos transducidos se prepararon por un método que comprende obtener linfocitos T del paciente, tratar los linfocitos T para aislar linfocitos T de memoria central, y transducir al menos una porción de las células de memoria central con un vector vírico que comprende un casete de expresión que codifica un receptor quimérico para el antígeno, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 26 o 27. En algunos casos, los linfocitos T-CAR se administran no directamente al tumor cerebral, sino que en su lugar se administran al espacio intraventricular dentro del cerebro del paciente.
El CAR descrito en el presente documento puede incluir una región espaciadora situada entre el dominio de unión a HER2 (por ejemplo, un scFv de HER2) y el dominio transmembranario. Se puede usar una variedad de diferentes espaciadores. Algunos de ellos incluyen al menos una porción de una región Fc humana, por ejemplo una porción bisagra de una región Fc humana o un dominio CH3 o variantes de los mismos. La Tabla 1 a continuación proporciona diversos espaciadores que se pueden usar en los CAR descritos en el presente documento.
Tabla 1: Ejemplos de espaciadores
Algunas regiones espaciadores incluyen toda o parte de una región bisagra de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), es decir, la secuencia que se encuentra entre los dominios CH1 y CH2 de una inmunoglobulina, por ejemplo, una bisagra de Fc de IgG4 o una bisagra de CD8. Algunas regiones espaciadores incluyen un dominio CH3 de inmunoglobulina o tanto un dominio CH3 como un dominio CH2. Las secuencias derivadas de inmunoglobulina pueden incluir una o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, por ejemplo, sustituciones que reducen la unión inespecífica.
Una "modificación de aminoácidos" se refiere a una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácidos en una proteína o secuencia de péptidos. Una "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" se refiere a una sustitución de un aminoácido en una posición particular en un péptido original o secuencia de proteínas con otro aminoácido. Se puede hacer una sustitución para cambiar un aminoácido en la proteína resultante en un modo no conservativo (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular por un aminoácido que pertenece a otro grupo) o en un modo conservativo (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular por un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio conservativo conduce, en general, a menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Lo siguiente son ejemplos de diversos grupos de aminoácidos: 1) Aminoácidos con grupos R no polares: Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Prolina, Fenilalanina, Triptófano, Metionina; 2) Aminoácidos con grupos R polares sin carga: Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Tirosina, Asparagina, Glutamina; 3) Aminoácidos con grupos R polares cargados (negativamente cargados a pH 6,0): Ácido aspártico, Ácido glutámico; 4) Aminoácidos básicos (positivamente cargados a pH 6,0): Lisina, Arginina, Histidina (a pH 6,0). Otro grupo puede ser los aminoácidos con grupos fenilo: Fenilalanina, Triptófano y Tirosina.
En ciertos ejemplos, el espaciador deriva de una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 que incluye uno o más restos de aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente del presente en un espaciador sin modificar. El uno o más restos de aminoácidos sustituidos se seleccionan de, pero no se limitan a, uno o más restos de aminoácidos en las posiciones 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, o una combinación de los mismos. En este esquema de numeración, descrito en mayor detalle a continuación, el primer aminoácido en el espaciador de IgG4(L235E,N297Q) en la Tabla 1 es 219 y el primer aminoácido en el espaciador de IgG4(HL-CH3) en la Tabla 1 es 219, ya que es el primer aminoácido en la secuencia bisagra de IgG y la secuencia del conector bisagra (HL) de IgG4 en la Tabla 1
En algunos ejemplos, el espaciador modificado deriva de una IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4 que incluye, pero no se limita a, una o más de las siguientes sustituciones de restos de aminoácido: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, E233P, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, T299A, Y300L, V305I, V309L, E318A, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, E333A, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L, o una combinación de los mismos.
En ciertos ejemplos, el espaciador modificado deriva de una región de IgG4 que incluye uno o más restos de aminoácidos sustituidos con un resto de aminoácido diferente del presente en una región sin modificar. El uno o más restos de aminoácidos sustituidos se seleccionan de, pero no se limitan a, uno o más restos de aminoácidos en las posiciones 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331,332, 333, 334, 336, 339, o una combinación de los mismos.
En algunos ejemplos, el espaciador modificado deriva de una región de IgG4 que incluye, pero no se limita a, uno o más de las siguientes sustituciones de restos de aminoácidos: 220S, 226S, 228P, 229S, 230S, 233P, 234A, 234V, 234F, 234A, 235A, 235E, 236A, 237A, 238S, 239D, 243L, 2471, 267E, 268Q, 280H, 290S, 290E, 290N, 292P, 297A, 297Q, 298A, 298G, 298D, 298V, 299A, 300L, 3051,309L, 318A, 326A, 326W, 326E, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332E, 333A, 333S, 333S, 334A, 339D, 339Q, 396L, o una combinación de los mismos, en donde el aminoácido en el espaciador sin modificar está sustituido con los aminoácidos anteriormente identificados en la posición indicada.
Para las posiciones de aminoácidos en la inmunoglobulina tratadas en el presente documento, la numeración es según el índice EU o el esquema de numeración EU (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). El índice EU o el índice EU como en Kabat o el esquema de numeración EU se refieren a la numeración del anticuerpo EU (Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).
Se puede usar una variedad de dominios transmembranarios. La Tabla 2 incluye ejemplos de dominios transmembranarios adecuados. Donde está presente un dominio espaciador, el dominio transmembranario se localiza carboxiterminal al dominio espaciador.
Tabla 2: Ejemplos de dominios transmembranarios
Muchos de los CAR descritos en el presente documento incluyen uno o más (por ejemplo, dos) dominios coestimulantes. El (Los) dominio(s) coestimulante(s) se localizan entre el dominio transmembranario y el dominio de señalización de CD3^. La Tabla 3 incluye ejemplos de dominios coestimulantes adecuados junto con la secuencia del dominio de señalización de CD3^.
Tabla 3: Dominio de CD3 y ejemplos de dominios coestimulantes
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de Her2scFv-IgG4(S228P,L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t. Los diversos dominios se enumeran en orden debajo de la secuencia y se indican alternando subrayado y no subrayado. La secuencia de CAR madura (SEQ ID NO: 26) no incluye el péptido señal GMCSFRa, la secuencia de salto de T2A ni CD19 truncado.
La Figura 2 representa la secuencia de aminoácidos de Her2scFv-IgG4(S228P,L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t. Los diversos dominios se enumeran en orden debajo de la secuencia y se indican alternando
subrayado y no subrayado. La secuencia de CAR madura (SEQ ID NO: 27) no incluye el péptido señal GMCSFRa, la secuencia de salto de T2A ni CD19 truncado.
Las Figuras 3A-D representan construcciones de CAR específicas de HER2 y datos de expansión de linfocitos T-CAR.
Las Figuras 4A-D representan la caracterización in vitro de linfocitos T CAR-HER2 frente a líneas de células de cáncer de mama.
Las Figuras 5A-5F representan el resultado de estudios sobre la actividad tumoral in vitro de linfocitos T CAR-HER2.
Las Figuras 6A-6I representan el resultado de estudios sobre la eficacia tumoral in vivo de linfocitos T CAR-HER2 administrados por vía intratumoral.
Las Figuras 7A-7D representan los resultados de estudios sobre la administración local de linfocitos T CAR-HER2 en modelos de xenoinjerto de BBM ortotópico humano.
Las Figuras 8A-8D representan los resultados de estudios sobre la administración intraventricular de linfocitos T CAR-HER2.
Las Figuras 9-14 representan CAR adicionales dirigidos a HER2.
Las Figuras 15A-15C representan los resultados de estudios que caracterizan CAR adicionales con diversos espaciadores. IgG3(EQ) está en la Figura 2; DeltaCh2 está en la Figura 11; CD8h está en la Figura 9; HL está en la Figura 10; y L está en la Figura 14.
Las Figuras 16A-16C muestran los resultados de estudios que examinan CD107a e INF gamma producidos cuando TCM que expresan los diversos CAR se exponen a células que no expresan HER2 (MDA-MB-468), HER2 bajo (231BR), HER2 bajo (231BRHER2LO) o HER2 alto (231BRHER2HI).
Las Figuras 17A-17D muestran los resultados de estudios que examinan la producción de PD-1 y la destrucción de células tumorales en diversas estirpes celulares con el CAR de la Figura 2 (HER2(EQ)BBZ) o la Figura 14 (HER2(L)BB Z).
Las Figuras 18A-18B muestran los resultados de estudios que examinan CD107a e INF gamma producidos cuando TCM que expresan los diversos CAR se exponen a células que no expresan HER2 (MDA-MB-468), HER2 bajo (231 BR), HER2 bajo (231BRHER2LO) o HER2 alto (231BRHER2HI).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A continuación, se describe la estructura, la construcción y la caracterización de diversos receptores quiméricos para el antígeno que se dirigen a HER2 y son útiles en el tratamiento de cáncer de mama que expresa HER2, así como metástasis de mama al cerebro. Y, lo que es más importante, los CAR descritos en el presente documento se pueden usar en ACT para tratar tumores que expresan HER2 en el cerebro por administración intraventricular o intratumoral.
Un antígeno quimérico (CAR) es una biomolécula recombinante que contiene, como mínimo, un dominio de reconocimiento extracelular, una región transmembranaria y un dominio de señalización intracelular. El término "antígeno", por lo tanto, no se limita a las moléculas que se unen a anticuerpos, sino a cualquier molécula que se pueda unir específicamente a una diana. Por ejemplo, un CAR puede incluir un ligando que se une específicamente a un receptor de la superficie celular. El dominio de reconocimiento extracelular (también denominado el dominio extracelular o simplemente el elemento de reconocimiento que lo contiene) comprende un elemento de reconocimiento que se une específicamente a una molécula presente sobre la superficie celular de una célula diana. La región transmembranaria ancla el CAR en la membrana. El dominio de señalización intracelular comprende el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 humano y opcionalmente comprende uno o más dominios de señalización coestimulantes. Los CAR se pueden unir tanto al antígeno como transducir la activación de linfocitos T, independiente de la restricción del MHC. Por lo tanto, los CAR son inmunorreceptores "universales" que pueden tratar a una población de pacientes con tumores positivos para antígeno independientemente de su genotipo de HLA. La inmunoterapia adaptiva usando linfocitos T que expresan un CAR específico de tumor puede ser una poderosa estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer.
En algunos casos, los CAR descritos en el presente documento se pueden producir usando un vector en el que el marco de lectura abierto del CAR va seguido por una secuencia de salto del ribosoma T2A y un CD19 truncado (CD19t), que carece de la cola de señalización citoplásmica (truncado en el aminoácido 323). En esta disposición, la coexpresión de CD19t proporciona un marcador superficial no inmunogénico inerte que permite la precisa medición de células modificadas por genes, y permite la selección positiva de células modificadas por genes, así como el eficiente seguimiento de células y/o la obtención de imágenes de los linfocitos T terapéuticos in vivo tras la transferencia adoptiva. La coexpresión de CD19t proporciona un marcador para el direccionamiento inmunológico de
las células transducidas in vivo usando anticuerpos clínicamente disponibles y/o reactivos de inmunotoxina para delecionar selectivamente las células terapéuticas, y por lo que funciona como un interruptor suicida.
Los CAR descritos en el presente documento se pueden producir mediante cualquier medio conocido en la técnica, aunque se producen preferentemente usando técnicas de ADN recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican las diversas regiones del receptor quimérico se pueden preparar y ensamblar en una secuencia codificante completa por técnicas convencionales de clonación molecular conocidas en la técnica (cribado de bibliotecas genómicas, PCR, ligación asistida por cebador, mutagénesis dirigida al sitio, etc.), según sea conveniente. La región codificante resultante se inserta preferentemente en un vector de expresión y se usa para transformar una estirpe de expresión adecuada de células hospedadoras, preferentemente una estirpe celular de linfocitos T, y lo más preferentemente una estirpe celular de linfocitos T autólogos.
Se pueden transducir diversos subconjuntos de linfocitos T aislados del paciente, que incluyen CMSP no seleccionadas o linfocitos T CD3 enriquecidos o subconjuntos de linfocitos T CD3 enriquecidos o de memoria o Tcm o Tcm/scm/n con un vector para la expresión de CAR. Los linfocitos T de memoria central son un subconjunto de linfocitos T útil. El linfocito T de memoria central se puede aislar de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) enriqueciendo en células CD45RO+/CD62L+, usando, por ejemplo, el dispositivo CliniMACS® para seleccionar inmunomagnéticamente células que expresan los receptores deseados. Las células enriquecidas en linfocitos T de memoria central se pueden activar con anti-CD3/CD28, transducido con, por ejemplo, un vector lentivírico SIN que dirige la expresión del CAR, así como un CD19 truncado (CD19t) humano, un marcador superficial no inmunogénico para tanto la detección in vivo como la posible selección ex vivo. Los linfocitos T de memoria central activados/genéticamente modificados pueden ser expandidos in vitro con IL-2/IL-15 y luego se crioconservan.
Ejemplo 1: Estructura de dos CAR-HER2
Un CAR que comprende un scFv de HER2 descrito en el presente documento se denomina Her2scFv-IgG4(S228P, L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t. Este CAR incluye una variedad de características importantes que incluyen: un scFv dirigido a HER2; una región Fc de IgG4 que está mutada en dos sitios dentro de la región CH2 (L235E; N297Q) de modo que se reduzca la unión por receptores de Fc (FcR); un dominio transmembranario CD28, un dominio coestimulante CD28 y dominio de activación de CD3^. La Figura 1 presenta la secuencia de aminoácidos de este CAR, que incluye la secuencia de la secuencia de CD19 truncado usado para monitorizar la expresión de CAR y la secuencia de salto ribosómica T2A que permite que el CAR se produzca sin fusión de la secuencia de CD19 truncado. Como se muestra en la Figura 2, el CAR inmaduro incluye: péptido señal GMCSFR, scFv de HER2, IgG4 que actúa como espaciador, un dominio transmembranario CD8, un dominio coestimulante 4-IBB que incluye una alteración de secuencia de LL a GG, una secuencia de tres Gly, dominio estimulante zeta de CD3. El transcrito también codifica una secuencia ribosómica de T2A y una secuencia de CD19 truncado que no son parte de la secuencia de proteínas de CAR. El CAR maduro es idéntico al CAR inmaduro, pero carece del péptido señal GMCSF.
Ejemplo 2: Construcción y estructura de epHIV7 usado para la expresión de linfocitos T-CAR específicos de HER2
El vector epHIV7 es un vector que puede ser usado para la expresión del CAR específico de HER2. Se produjo a partir del vector pHIV7. Y, lo que es más importante, este vector usa el promotor EFI humano para conducir la expresión del CAR. Tanto las secuencias de 5' como de 3' del vector derivaron de pv653RSN como derivaron previamente del provirus HXBc2. Las secuencias de solapamiento de ADN del tracto de polipurina (cPPT) derivaron de la cepa pNL4-3 del HIV-I del NIH AIDS Reagent Repository. La secuencia del elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE) se describió previamente.
La construcción de pHIV7 se llevó a cabo del siguiente modo. Brevemente, pv653RSN, que contiene 653 pb de gagpol más repeticiones terminales largas (LTR) de 5' y 3' con un gen intermedio de SL3-neomicina fosfotransferasa (Neo), se subclonó en pBluescript, del siguiente modo: En la etapa 1, las secuencias de 5'LTR a un elemento sensible a rev (RRE) prepararon p5 'HIV-I 5I, y entonces 5'LTR se modificó retirando secuencias en la dirección 5' de la caja TATA, y se ligó primero con un potenciador del CMV y luego con el origen de replicación de SV40 (p5'HIV-2). En la etapa 2, después de la clonación de 3'LTR en pBluescript para producir p3'HIV-1, se hizo una deleción de 400 pb en el potenciador/promotor de 3'LTR para retirar elementos reguladores en cis en HIV U3 y formar p3'HIV-2. En la etapa 3, los fragmentos aislados de p5'HIV-3 y p3'HIV-2 se ligaron para producir pHIV-3. En la etapa 4, p3'HIV-2 se modificó aún más retirando secuencias adicionales del VIH en la dirección 5’ para generar p3'HIV-3 y un fragmento de BamHI-SalI de 600 pb que contenía WPRE se añadió a p3'HIV-3 para producir p3'HIV-4. En la etapa 5, el RRE de pHIV-3 se redujo en tamaño por PCR y se ligó a un fragmento de 5' de pHIV-3 (no mostrado) y a p3'HIV-4, para producir pHIV-6. En la etapa 6, un fragmento de BglII-BamHI de 190 pb que contenía la secuencia de solapamiento de ADN de cPPT de HIV-I pNL4-3 (55) se amplificó a partir de pNL4-3 y se puso entre las secuencias de RRE y WPRE en pHIV6 para producir pHIV-7. Este plásmido original pHIV7-GFP (GFP, proteína verde fluorescente) se usó para encapsidar el vector original usando un sistema de cuatro plásmidos.
Se requiere una señal de encapsidación, psi (y ), para la eficiente encapsidación del genoma vírico en el vector. RRE y WPRE potencian el transporte del transcrito de ARN y la expresión del transgén. Se ha mostrado que la secuencia
de solapamiento, en combinación con WPRE, potencia la eficiencia de transducción del vector lentivírico en células de mamífero.
Las funciones auxiliares, requeridas para la producción del vector vírico, se dividen en tres plásmidos separados para reducir la probabilidad de generación de lentivirus competente en la replicación por recombinación: 1) pCgp codifica la proteína gag/pol requerida para el ensamblaje de vectores víricos; 2) pCMV-Rev2 codifica la proteína Rev, que actúa sobre la secuencia de RRE para ayudar en el transporte del genoma vírico para la eficiente encapsidación; y 3) pCMV-G codifica la glucoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV), que se requiere para la infectividad del vector vírico.
Hay una homología de secuencia de ADN mínima entre el genoma del vector codificado pHIV7 y los plásmidos auxiliares. Las regiones de homología incluyen una región de señal de encapsidación de aproximadamente 600 nucleótidos, situada en la secuencia de gag/pol del plásmido auxiliar pCgp; una secuencia de promotor del CMV en los tres plásmidos auxiliares; y una secuencia de RRE en el plásmido auxiliar pCgp. Es muy poco probable que el virus recombinante competente en la replicación se pueda generar debido a la homología en estas regiones, ya que requeriría múltiples acontecimientos de recombinación. Además, a cualquier recombinante resultante le faltaría las LTR funcionales y secuencias tat requeridas para la replicación lentivírica.
El promotor del CMV se sustituyó por el promotor EFla-HTLV (EFIp), y el nuevo plásmido se denominó epHIV7. EFlp tiene 563 pb y se introdujo en epHIV7 usando NruI y Nhel, después de que se cortara el promotor del CMV.
Se ha retirado de este sistema el genoma lentivírico, excluyendo gag/pol y rev que son necesarios para la patogenicidad del virus no mutante y se requieren para la infección productiva de células diana. Además, la construcción de vector no contiene un promotor de 3'LTR intacto, por lo que el genoma provírico de ADN expresado y transcrito de forma inversa resultante en células elegidas tendrá LTR inactivas. Como resultado de este diseño, no se transcribirán secuencias derivadas del HIV-I del provirus y solo las secuencias terapéuticas se expresarán de sus promotores respectivos. Se espera que la retirada de la actividad del promotor de LTR en el vector SIN reduzca significativamente la posibilidad de activación accidental de genes hospedadores.
Ejemplo 3: Producción de vectores para la transducción de linfocitos T del paciente
Se pueden preparar vectores para la transducción de linfocitos T del paciente del siguiente modo. Para cada plásmido, el plásmido que expresa el CAR y, opcionalmente, un marcador tal como CD19 truncado; 2) pCgp; 3) pCMV-G; y 4) pCMV-Rev2), se genera un banco de semillas, que se usa para inocular el fermentador para producir cantidades suficientes de ADN de plásmido. El ADN de plásmido se prueba para identidad, esterilidad y endotoxina antes de su uso en la producción de vector lentivírico.
Brevemente, se expanden células de la célula de trabajo (WCB) 293T, que se ha probado para confirmar la esterilidad y la ausencia de contaminación vírica. Se descongela un vial de células 293T del WCB de 293T. Las células se cultivan y se expanden hasta que existen números suficientes de células para sembrar un número apropiado de fábricas de células (CF) de 10 capas para la producción de vector y el mantenimiento de trenes de células. Se puede usar un único tren de células para la producción.
El vector lentivírico se produce en sublotes de hasta 10 CF. Se pueden producir dos sublotes en la misma semana que conducen a la producción de aproximadamente 20 l de sobrenadante lentivírico/semana. El material producido de todos los sublotes se reúne durante la fase de procesamiento aguas abajo, para producir un lote de producto. Se siembran células 293T en CF en medio 293T (DMEM con 10 % de FBS). Las fábricas se ponen en una estufa de incubación a 37 °C y se nivelan horizontalmente para conseguir una distribución homogénea de las células en todas las capas de la CF. Dos días después, las células se transfectan con los cuatro plásmidos lentivíricos descritos anteriormente usando el método de CaPQ4, que implica una mezcla de Tris:EDTA, CaCh 2M, 2X HBS, y los cuatro plásmidos de ADN. El día 3 después de la transfección, se recoge el sobrenadante que contiene los vectores lentivíricos secretados, se purifica y se concentra. Después de que el sobrenadante se retire de las CF, se recogen las células del final de la producción de cada CF. Las células se tripsinan de cada fábrica y se recogen por centrifugación. Las células se resuspenden en medio de congelación y se crioconservan. Estas células se usan después para la prueba de lentivirus competentes en la replicación (RCL).
Para purificar y formular vectores, el sobrenadante en bruto se clarifica por filtración en membrana para retirar el residuo celular. El ADN de células hospedadoras y el ADN de plásmido residual se degradan por digestión con endonucleasa (Benzonase®). El sobrenadante vírico se clarifica del residuo celular usando un filtro de 0,45 pm. El sobrenadante clarificado se recoge en un recipiente previamente pesado en el que se añade Benzonase® (concentración final 50 U/ml). La digestión con endonucleasa para ADN de plásmido residual y ADN genómico de hospedador se realiza a 37 °C durante 6 h. La concentración inicial por ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) del sobrenadante tratado con endonucleasa se usa para retirar componentes residuales de bajo peso molecular del sobrenadante en bruto, mientras que concentra el virus ~ 20 veces. El sobrenadante vírico clarificado tratado con endonucleasa se hace circular a través de un cartucho de fibra hueco con un NMWCO de 500 kD a un caudal diseñado para mantener la velocidad de cizallamiento a ~4.000 s-1 o menos, mientras que se maximiza la tasa de flujo. La diafiltración del sobrenadante tratado con nucleasa se inicia durante el proceso de concentración para mantener el
rendimiento del cartucho. Se establece una tasa de sustitución del permeado del 80 %, usando 4 % de lactosa en PBS como tampón de diafiltración. El sobrenadante vírico se lleva al volumen diana, que representa una concentración de 20 veces del sobrenadante en bruto, y la diafiltración continúa durante 4 volúmenes de intercambio adicionales, con la tasa de sustitución del permeado al 100 %.
La concentración adicional del producto vírico se lleva a cabo usando una técnica de centrifugación de alta velocidad. Cada sublote del lentivirus se sedimenta usando una centrífuga Sorvall RC-26 Plus a 6000 rpm (6.088 RCF) a 6 °C durante 16-20 h. El sedimento vírico de cada sublote se reconstituye entonces en un volumen de 50 ml con 4 % de lactosa en PBS. El sedimento reconstituido en este tampón representa la formulación final para la preparación de virus. Todo el proceso de concentración de vector produce una reducción del volumen de 200 veces, aproximadamente. Después de la finalización de todos los sublotes, el material se pone entonces a -80 °C, mientras que las muestras de cada sublote se prueban para su esterilidad. Tras la confirmación de la esterilidad de las muestras, los sublotes se descongelan rápidamente a 37 °C con agitación frecuente. El material se reúne entonces y se divide manualmente en alícuotas en una cabina de seguridad biológica de clase II tipo A/B3. Se usa una configuración de llenado de 1 ml del lentivirus concentrado en crioviales de junta tórica roscados externamente, estériles, USP clase 6.
Para garantizar la pureza de la preparación de vector lentivírico, se prueba para contaminantes de ADN del hospedador residual, y la transferencia de ADN del hospedador y de plásmido residual. Entre otras pruebas, se evalúa por RT-PCR la identidad del vector para garantizar que esté presente el vector correcto.
Ejemplo 4: Preparación de linfocitos T adecuados para su uso en ACT
Si se van a usar TCM para expresar el CAR, se pueden preparar células adecuadas del paciente del siguiente modo. Primero, se obtienen linfocitos T de un paciente por leucoféresis, y se altera genéticamente el subconjunto apropiado de linfocitos T alógenos o autólogos, por ejemplo, linfocitos T de memoria central (Tcm), para expresar el CAR, luego se administra de nuevo al paciente por cualquier medio clínicamente aceptable, para lograr la terapia contra el cáncer.
Se pueden generar Tcm adecuados como sigue. Los productos de aféresis obtenidos de participantes que ha dado su consentimiento para la investigación se separan con Ficoll, se lavan y se incuban durante la noche. Entonces las células se reducen en poblaciones de monocitos, linfocitos T reguladores y linfocitos T indiferenciados usando reactivos anti-CD14, anti-CD25 y anti-CD45RA de calidad GMP (Miltenyi Biotec) y el dispositivo de separación CliniMACS™. Tras la reducción, las células de fracción negativa se enriquecen en células Tcm CD62L+ usando DREG56-biotina (calidad clínica para COH) y microperlas anti-biotina (Miltenyi Biotec) en el dispositivo de separación CliniMACS™.
Tras el enriquecimiento, las células Tcm se formulan en X-Vivo15 completo más 50 UI/ml de IL-2 y 0,5 ng/ml de IL-15 y se transfieren a una bolsa de cultivo celular de teflón, donde se estimulan con perlas CD3/CD28 Dynal ClinEx™ Vivo. Hasta cinco días después de la estimulación, las células se transducen con vector lentivírico que expresa el CAR deseado a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,0 a 0,3. Los cultivos se mantienen durante hasta 42 días con adición de X-Vivo15 completo y citocina IL-2 e IL-15 según se requiera para la expansión de células (manteniendo la densidad celular entre 3x105 y 2x106 células viables/ml, y suplementación de citocina cada lunes, miércoles y viernes de cultivo). Las células se expanden normalmente hasta aproximadamente 109 células bajo estas condiciones en 21 días. Al final del periodo de cultivo, las células se recogen, se lavan dos veces y se formulan en medio de crioconservación de calidad clínica (Cryostore CS5, BioLife Solutions).
El (Los) día(s) de infusión de linfocitos T, el producto crioconservado y liberado se descongela, se lava y se formula para su reinfusión. Los viales crioconservados que contienen el producto celular liberado se sacan del almacenamiento de nitrógeno líquido, se descongelan, se enfrían y se lavan con tampón de lavado de PBS/2 % de albúmina de suero humano (HSA). Después de la centrifugación, el sobrenadante se retira y las células se resuspendieron en un diluyente para infusión de solución salina normal libre de conservante (PFNS)/2 % de HSA. Se toman muestras para las pruebas de control de calidad.
Ejemplo 5: Expresión de CAR dirigido a HER2
La Figura 3A es un diagrama esquemático de dos construcciones de CAR específicas de HER2 representadas en la Figura 1 y la Figura 2. En HER2(EQ)28^, scFv se une a la membrana por un conector de Fc de IgG4 modificado (mutante doble, L235E; N297Q), que contiene un dominio transmembranario CD28, un dominio estimulante CD28 intracelular y un dominio CD3^ citolítico. La secuencia de salto de T2A separa el CAR de una proteína CD19 truncada (CD19t) empleada para el seguimiento celular. HER2(EQ)BB^ es similar, excepto que el dominio coestimulante es 4-1BB en vez de CD28 y el dominio transmembranario es un dominio transmembranario CD8 en vez de un dominio transmembranario CD28. Las células de memoria central (TCM) humanas se transfectaron con un vector lentivírico que expresaba o HER2(EQ)28^ o HER2(EQ)BB^. La Figura 3B representa datos representativos de FACS del fenotipo de la superficie de TCM humanos. La Figura 3C representa los resultados de ensayos para la expresión de CD19 y proteína L en TCM transfectadas con un vector lentivírico que expresa o HER2(EQ)28^ o HER2(EQ)BB^. Como se puede apreciar de estos resultados, la eficiencia de transfección como se evalúa por la expresión de CD19 fue similar para ambos CAR. Sin embargo, la expresión de la proteína L fue más baja para HER2(EQ)BB^ que para
HER2(EQ)28^, lo que sugiere que el CAR de HER2(EQ)BB^ es menos estable que HER2(EQ)BB^. El análisis de la expansión de células (Figura 3D) muestra que ningún CAR interfiere con la expansión de linfocitos T.
Ejemplo 6: Caracterización in vitro de linfocitos CAR-HER2 T frente a diversas líneas de células de cáncer de mama
Se usó una variedad de líneas de células de cáncer de mama, que incluyen líneas HER2-negativo (linfoma LCL, MDA-MB-468, glioma U87), líneas que expresan HER2 bajo (m DA-MB-361, 231BR) y líneas que expresan HER2 alto (SKBR3, BT474, BBMl) para caracterizar HER2(EQ)28 y HER2(EQ) BB^. La Figura 4A representa el nivel de expresión de HER2 de cada una de estas líneas. Se usó citometría de flujo (dependiente de linfocitos T-CAR+) para caracterizar la desgranulación de CD107a y la producción de IFNy en linfocitos T-CAR Simulados (sin transducir), HER2(EQ)28^ o HER2(EQ)BB^ tras un cocultivo de 5 h con o células tumorales MDA-MB-361 (que expresan HER2 bajo) o células tumorales BBMl (que expresan HER2 alto). Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 4B. Se realizaron estudios similares con las otras líneas de células de cáncer de mama, y los resultados se resumen en la Figura 4C. La producción de la producción de IFNy por linfocitos T CAR-HER2 tras un cultivo de 24 h con proteína HER2 recombinante o dianas tumorales se midió por ELISA y los resultados de este análisis se muestran en la Figura 4D.
Ejemplo 7: Actividad antitumoral in vitro
Se usó citometría de flujo para evaluar la destrucción de células tumorales tras un cocultivo de 72 h de linfocitos T-CAR Simulados (sin transducir), HER2(EQ)28^ o HER2(EQ)BB^ con dianas tumorales. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 5A . Se midió la inducción de PD-1 y LAG-3 en linfocitos T-CAR totales después de un cocultivo de 72 h con células MDA-MB-468 HER2-negativo o BBMl HER2-positivo, y los resultados de este análisis se presentan en la Figura 5B. Se midió la inducción de PD-1 en linfocitos T CD8+ CAR tras un cocultivo de 72 h con dianas de tumor que son HER2-negativo (linfoma LCL, MDA-MB-468, glioma U87), que expresa HER2 bajo (MDA-MB-361, 231BR) o que expresa HER2 alto (SKBR3, BT474, BBMI), y los resultados de este análisis se presentan en la Figura 5C . Estos estudios sugieren que HER2(EQ)BB^ provoca menor inducción de PD-1 que HEP2(EOP)28^. Se midió la destrucción de células tumorales con una relación efectoras:tumorales (E:T) que variaba desde 0,25:1 hasta 2:1 para tanto linfocitos T-CAR HER2(EQ)28^ como HER2(EQ)BB^. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 5D, que muestra que tanto HER2(EQ)285 como HER2(EQ)BB5 son eficaces en la destrucción de células tumorales in vitro. La proliferación en CFSE de linfocitos T CAR-HER2 tras un cocultivo de 72 h con células MDA-MB-468 o BBMI se midió por citometría de flujo. Los resultados de este análisis se presentan en la Figura 5E, que muestra que los linfocitos T-CAR HER2(EQ)BB^ proliferan más que los linfocitos T-CAR HER2(EQ)28^.
Ejemplo 8: Actividad antitumoral in vivo
Se evaluó la actividad de linfocitos T CAR-HER2 administrados por vía intratumoral en un modelo de metástasis de mama al cerebro derivado de paciente. Las Figuras 6A-6C son tinción H&E de tumores. Los ratones se trataron por inyección directamente en el tumor con linfocitos T-CAR simulados (sin transducir) o HER2(EQ)BB^. Las Figuras 6D-6F representan los resultados de la obtención de imágenes ópticas de los tumores y las Figuras 6G-6I son curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para ratones tratados por vía local con cualquiera en el día 3, 8 o 14 después de la inyección del tumor. Estos estudios muestran que los linfocitos T-CAR HER2(EQ)BB^ tienen una potente eficacia antitumoral in vivo cuando se inyectan directamente en el tumor.
Para evaluar la eficacia antitumoral en modelos humanos de xenoinjerto de metástasis de mama al cerebro, se inyectaron por vía intracraneal células BBMI (0,2 M) o BT474 (0,15 M) en ratones NSG. El día 8 después de la inyección del tumor, se inyectaron por vía intratumoral linfocitos T HER2(EQ)28^ o HER2(EQ)BB^, o Simulados (sin transducir) (IM). Los tumores BBMI (Figura 7A) y BT474 (Figura 7B) se monitorizaron por obtención de imágenes ópticas basadas en luciferasa. Las curvas de Kaplan-Meier se presentan en la Figura 7C y Figura 7D .
También se usó un modelo de xenoinjerto ortotópico derivado de paciente humano de metástasis de mama al cerebro para evaluar linfocitos T-CAR HER2(Eq )28^ y HER2(EQ)BB^. La Figura 8A ilustra la región de implantación tumoral por inyección estereotáctica de células BBMl (0,2 M) y la administración intraventricular de linfocitos T. La tinción de tumores se representa en la Figura 8B. El día 14 después de la inyección del tumor, se inyectaron por vía intratumoral linfocitos T h Er 2(EQ)28^, HER2(EQ)BB^, o Simulados (sin transducir) (0,5 M). El crecimiento tumoral se monitorizó por obtención de imágenes ópticas basadas en luciferasa. La Figura 8C presenta los promedios de flujo para cada grupo de tratamiento y la Figura 8D presenta la curva de supervivencia de Kaplan-Meier para cada grupo de tratamiento.
Ejemplo 9: CAR adicional dirigido a HER2
Las Figuras 9-14 representan las secuencias de aminoácidos de diversos CAR que tienen diferentes conectores. En concreto, los CAR se diferencian en la secuencia y longitud de la porción entre el scFv dirigido a HER2 y el dominio transmembranario. El dominio transmembranario es CD8, CD28 o CD28gg. El dominio coestimulante es 4-1BB o CD28. Todos tienen un dominio estimulante CD3Z. En cada caso una secuencia de salto de T2A separa el CAR de una proteína CD19 truncada (CD19t) empleada para el seguimiento celular.
La Figura 15A representa esquemáticamente diversos CAR de HER2 que son idénticos, excepto por la secuencia y longitud de la porción entre el scFv de HER2 y el dominio transmembranario CD8. Todos incluyen un dominio coestimulante 4-1BB seguido por un dominio estimulante CD3Z. La Figura 15B representa los resultados de ensayos para la expresión de CD19 y proteína L en Tcm transfectados con un vector lentivírico que expresa el CAR indicado. Como se puede apreciar de estos resultados, la eficiencia de transfección como se evaluó por la expresión de CD19 fue similar para ambos CAR. Sin embargo, la expresión de proteína L fue más baja para HER2(EQ)BBZ que para HER2(EQ)28Z, lo que indica que el CAR h Er 2(eQ)BBZ es menos estable que el de HER2(EQ)BBZ. El análisis de la expansión celular (Figura 15C) muestra que ninguno de los CAR interfiere con la expansión de linfocitos T. Las Figuras 16-18 muestran los resultados de estudios adicionales que muestran que un CAR con un espaciador muy corto (Figura 14) es relativamente selectivo para CAR que expresa altos niveles de HER2. Dichos CAR pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres que expresan HER2 donde es conveniente ahorrar células que expresan un menor nivel de HER2 que las células cancerosas.
Claims (14)
1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor quimérico para el antígeno, en donde la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
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2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
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3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico expresa un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de
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4. Una población de linfocitos T humanos que comprende un vector que expresa un receptor quimérico para el antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
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5. La población de linfocitos T humanos de la reivindicación 4, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de
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6. La población de linfocitos T humanos de la reivindicación 4, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de
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7. La población de linfocitos T humanos de la reivindicación 6, en donde los linfocitos T comprenden una población de linfocitos T de memoria central.
8. Una composición que comprende una población de linfocitos T humanos autólogos o alógenos transducidos por un vector que comprende un casete de expresión que codifica un receptor quimérico para el antígeno, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
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para su uso en el tratamiento de un cáncer cerebral que expresa HER2 en un paciente.
9. La composición para el uso de la reivindicación 8, en donde la población de linfocitos T humanos comprende linfocitos T de memoria CD62L+.
10. La composición para el uso de la reivindicación 8, en donde el cáncer es una metástasis de mama al cerebro.
11. La composición para el uso de la reivindicación 8, en donde los linfocitos T humanos transducidos se prepararon por un método que comprende obtener linfocitos T del paciente, tratar los linfocitos T para aislar linfocitos T de memoria central y transducir al menos una porción de las células de memoria central con un vector vírico que comprende un casete de expresión que codifica un receptor quimérico para el antígeno, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de
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12. La composición para el uso de la reivindicación 8, en donde los linfocitos T se administran por vía intratumoral o intraventricular o por vía intraventricular adyacente a un tumor.
13. La composición para el uso de la reivindicación 8 o la reivindicación 11, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de
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14. La composición para el uso de la reivindicación 8 o la reivindicación 11, en donde el receptor quimérico para el antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de
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