JP2024515920A - 固形腫瘍標的化骨格を有する細胞及びその使用 - Google Patents

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Abstract

ゲノム操作されたｉＰＳＣの指向性分化から得られる機能的に増強された派生エフェクター細胞を取得するための方法及び組成物が提供される。改善又は増強された治療効果をもたらす安定した機能的なゲノム編集を備えている派生細胞も提供される。更に、機能的に増強された派生エフェクター細胞を単独で、又は併用療法において抗体若しくはチェックポイント阻害剤とともに含む、治療組成物及びその使用が提供される。

Description

（関連出願）
本出願は、２０２２年４月８日に出願された米国特許仮出願第６３／３２９，３６４号、及び２０２２年１０月２０日に出願された米国特許仮出願第６３／３８０，３７８号の優先権を主張し、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
（配列表の参照による組み込み）
１８４１４３－６４１６０１＿ＳＬ．ｘｍｌというタイトルの配列表は、２０２３年３月１５日に作成され、サイズが１９２，９４５バイトであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本開示は、既製の免疫細胞製品の分野に広く関する。より具体的には、本開示は、インビボで治療に適切な特性をもたらすことができる多機能エフェクター細胞を開発するための戦略に関する。本開示の下で開発された細胞製品は、患者由来の細胞療法の重大な限界に対処する。
養子細胞療法の分野は現在、患者由来及びドナー由来の細胞を使用することに焦点が当てられているため、がん免疫療法の一貫した製造を達成することと、それから恩恵を受ける可能性のある全ての患者に療法を提供することとが特に困難なものとなっている。養子移入されたリンパ球の有効性及び持続性を改善して、患者の良好な転帰を促進する必要もある。Ｔ細胞及びナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞などのリンパ球は、自然免疫及び適応免疫に重要な役割を果たす強力な抗腫瘍エフェクターである。しかしながら、養子細胞療法のためにこれらの免疫細胞を使用することは、依然として困難であり、改善に対する満たされていない必要性が存在する。したがって、養子免疫療法においてＴ細胞及びＮＫ細胞、又は他の免疫エフェクター細胞の可能性を最大限に活用するための大きなチャンスがまだ残っている。
応答率、細胞の消耗、輸注された細胞の損失（生存率及び／又は持続性）、標的の喪失又は系統転換による腫瘍エスケープ、腫瘍の標的化の精度、標的外毒性、腫瘍外効果、固形腫瘍に対する有効性、すなわち腫瘍微小環境及び関連する免疫抑制、動員、輸送、及び浸潤など、様々な問題に対処する機能的に改善されたエフェクター細胞が必要である。
本発明の実施形態の目的は、単一細胞由来のｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）クローン株から分化した派生非多能性細胞を生成する方法及び組成物を提供することであり、このｉＰＳＣ株はそのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ又はいくつかの遺伝子改変には、ＤＮＡ挿入、欠失、及び置換のうちの１つ以上が含まれ、これらの改変は、分化、増殖、継代及び／又は移植の後、その後の由来細胞において保持され、機能し続ける。
本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞には、ＣＤ３４＋細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（造血幹細胞及び前駆細胞）、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞が含まれるが、これらに限定されない。本出願のｉＰＳＣ由来の非多能性細胞は、同一の遺伝子改変を含むｉＰＳＣからの分化を通じて、それらのゲノムに１つ又はいくつかの遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された派生細胞を取得するための操作されたクローンｉＰＳＣ分化戦略は、指示された分化におけるｉＰＳＣの発生の可能性がｉＰＳＣの操作されたモダリティによって重大な悪影響を受けないこと、及び操作されたモダリティが派生細胞で意図したとおりに機能することから利益を得る。更に、この戦略は、末梢血から取得されたＴ細胞又はＮＫ細胞などの初代リンパ球を操作する際の現在の障壁、すなわち、そのような細胞はしばしば、再現性と均一性を欠き、高い細胞死と低い細胞増殖を伴う不十分な細胞の持続性を呈する細胞をもたらし、そのような細胞を操作することが困難であることに起因する障壁を克服する。更に、この戦略は、最初は不均質である初代細胞源を使用して別の方法で得られる不均質のエフェクター細胞集団の生成を回避する。
したがって、一態様では、本発明は、細胞又はその集団であって、（ｉ）細胞が、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工多能性細胞（induced pluripotent cell、ｉＰＳＣ）、又は（ｃ）ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、（ｉｉ）細胞が、固形腫瘍標的化骨格を含み、固形腫瘍標的化骨格が、（ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（transforming growth factor beta receptor、ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（signaling redirector receptor、ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）同種免疫防御受容体（allo-immune defense receptor、ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上を含む、細胞又はその集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＲは、４－１ＢＢに特異的である。いくつかの実施形態では、細胞は、固形腫瘍標的化骨格を含まない対応する細胞と比較して、固形腫瘍における改善された輸送、腫瘍微小環境（tumor microenvironment、ＴＭＥ）耐性、及び／又はアロ反応性耐性を有する。細胞又はその集団の様々な実施形態では、固形腫瘍標的化骨格は、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウトと、（ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドと、を更に含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉの欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｉｖ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの最も少ない１つの破壊、（ｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（chimeric fusion receptor、ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、（ｖｉ）表４に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上を更に含む。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、ＴＧＦβ－ＳＲＲは、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＩＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを更に含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、（ａ）サイトカイン受容体がＩＬ２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１１（ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＬＱＱＤＫＶＰＥＰＡＳＬＳＳＮＨＳＬＴＳＣＦＴＮＱＧＹＦＦＦＨＬＰＤＡＬＥＩＥＡＣＱＶＹＦＴＹＤＰＹＳＥＥＤＰＤＥＧＶＡＧＡＰＴＧＳＳＰＱＰＬＱＰＬＳＧＥＤＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｂ）サイトカイン受容体はＩＬ１２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、（ｉ）配列番号１２（ＨＹＦＱＱＫＶＦＶＬＬＡＡＬＲＰＱＷＣＳＲＥＩＰＤＰＡＮＳＴＣＡＫＫＹＰＩＡＥＥＫＴＱＬＰＬＤＲＬＬＩＤＷＰＴＰＥＤＰＥＰＬＶＩＳＥＶＬＨＱＶＴＰＶＦＲＨＰＰＣＳＮＷＰＱＲＥＫＧＩＱＧＨＱＡＳＥＫＤＭＭＨＳＡＳＳＰＰＰＰＲＡＬＱＡＥＳＲＱＬＶＤＬＹＫＶＬＥＳＲＧＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱＨＩＳＬＳＶＦＰＳＳＳＬＨＰＬＴＦＳＣＧＤＫＬＴＬＤＱＬＫＭＲＣＤＳＬＭＬ）若しくは（ｉｉ）配列番号１３（ＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｃ）サイトカイン受容体はＩＬ１８Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１４（ＹＲＶＤＬＶＬＦＹＲＨＬＴＲＲＤＥＴＬＴＤＧＫＴＹＤＡＦＶＳＹＬＫＥＣＲＰＥＮＧＥＥＨＴＦＡＶＥＩＬＰＲＶＬＥＫＨＦＧＹＫＬＣＩＦＥＲＤＶＶＰＧＧＡＶＶＤＥＩＨＳＬＩＥＫＳＲＲＬＩＩＶＬＳＫＳＹＭＳＮＥＶＲＹＥＬＥＳＧＬＨＥＡＬＶＥＲＫＩＫＩＩＬＩＥＦＴＰＶＴＤＦＴＦＬＰＱＳＬＫＬＬＫＳＨＲＶＬＫＷＫＡＤＫＳＬＳＹＮＳＲＦＷＫＮＬＬＹＬＭＰＡＫＴＶＫＰＧＲＤＥＰＥＶＬＰＶＬＳＥＳ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｄ）サイトカイン受容体はＩＬ２１Ｒであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１５（ＳＬＫＴＨＰＬＷＲＬＷＫＫＩＷＡＶＰＳＰＥＲＦＦＭＰＬＹＫＧＣＳＧＤＦＫＫＷＶＧＡＰＦＴＧＳＳＬＥＬＧＰＷＳＰＥＶＰＳＴＬＥＶＹＳＣＨＰＰＲＳＰＡＫＲＬＱＬＴＥＬＱＥＰＡＥＬＶＥＳＤＧＶＰＫＰＳＦＷＰＴＡＱＮＳＧＧＳＡＹＳＥＥＲＤＲＰＹＧＬＶＳＩＤＴＶＴＶＬＤＡＥＧＰＣＴＷＰＣＳＣＥＤＤＧＹＰＡＬＤＬＤＡＧＬＥＰＳＰＧＬＥＤＰＬＬＤＡＧＴＴＶＬＳＣＧＣＶＳＡＧＳＰＧＬＧＧＰＬＧＳＬＬＤＲＬＫＰＰＬＡＤＧＥＤＷＡＧＧＬＰＷＧＧＲＳＰＧＧＶＳＥＳＥＡＧＳＰＬＡＧＬＤＭＤＴＦＤＳＧＦＶＧＳＤＣＳＳＰＶＥＣＤＦＴＳＰＧＤＥＧＰＰＲＳＹＬＲＱＷＶＶＩＰＰＰＬＳＳＰＧＰＱＡＳ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｅ）ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１０（ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ）によって表されるアミノ酸配列を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、配列番号１６（ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱ）によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成するＩＬ２Ｒβの断片であり、配列番号１６に含まれる配列番号１７（ＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮ）によって表されるアミノ酸配列は、可変であり得る。
細胞又はその集団の様々な実施形態では、固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドは、ＣＤ３８をノックアウトするために内因性ＣＤ３８遺伝子座に挿入される。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、及び固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドは、トリシストロン性構築物内で共発現される。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントは、（ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（high affinity non-cleavable CD16、ｈｎＣＤ１６）、（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、同じ若しくは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
細胞又はその集団の様々な実施形態では、細胞は、サイトカインシグナル伝達複合体を更に含み、サイトカインシグナル伝達複合体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、若しくはそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか、若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、任意選択で、（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現され得る、少なくとも１つ、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、任意選択で、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現される、少なくとも１つ、を含み、任意選択で、（ｄ）一過的に発現される。
細胞又はその集団の様々な実施形態では、細胞は、ＣＡＲを更に含み、ＣＡＲは、（ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、（ｖ）スプリットＣＡＲ、（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、（ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲ、（ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、（ｉｘ）バイシストロン性構築物内で、サイトカインシグナル伝達複合体と共発現されたもの、（ｘ）必要に応じて別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、（ｘｉ）ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１を含む少なくとも１つの腫瘍関連抗原に特異的なもの、並びに／又は（ｘｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（carbonic anhydrase IX、ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（epithelial glycoprotein-2、ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（epithelial glycoprotein-40、ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（epithelial cell adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（folate-binding protein、ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（fetal acetylcholine receptor、ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（Ganglioside G2、ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（Ganglioside G3、ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（human Epidermal Growth Factor Receptor 2、ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase、ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（Interleukin-13 receptor subunit alpha-2、ＩＬ１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kinase insert domain receptor、ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（Lewis Y、ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（L1 cell adhesion molecule、Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（melanoma antigen family A1、ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Mucin1、Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Mucin16、Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（Mesothelin、ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（prostate stem cell antigen、ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（prostate-specific membrane antigen、ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（tumor-associated glycoprotein72、ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（vascular endothelial growth factor R2、ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（Wilms tumor protein、ＷＴ－１）、及び病原体抗原を含む少なくとも１つの腫瘍関連抗原に特異的なもの、であり、任意選択で、（ｉ）～（ｘｉｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲは、ＴＣＲ遺伝子座に挿入されている、及び／又はＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいはＴＣＲは、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域であり、任意選択で、ＣＡＲは、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結されている。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）腫瘍関連抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む外部ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、腫瘍関連抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ１５Ｒβ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内因性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、（ｂ）それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、内部ドメインは、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、当該内部ドメインドメインは、以下の形態：ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ、４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、４１ＢＢ－ＣＤ３ζ１ＸＸ、２Ｂ４－ＣＤ３ζ、及び２Ｂ４－ＣＤ３ζ１ＸＸのうちのいずれか１つの融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその一部分を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、それぞれ配列番号３２～５３によって表される、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインは、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である。
細胞又はその集団の様々な実施形態では、腫瘍関連抗原がＨＥＲ２を含み、ＣＡＲは、（ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１０３（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（heavy chain complementary determining region 1、Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（heavy chain complementary determining region 2、Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（heavy chain complementary determining region 3、Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（heavy chain variable、ＶＨ）ドメイン、並びに、任意選択で、（ｉｉ）配列番号１０６（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（light chain complementary determining region 1、Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（light chain complementary determining region 2、Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（light chain complementary determining region3、Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（light chain variable、ＶＬ）ドメイン、を含む、外部ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、（ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（single chain variable fragment、ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、リンカーは、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、（ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は（ｅ）ヒト化されている。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、外部ドメインは、（ａ）シグナルペプチド、及び／又は、（ｂ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態は、スペーサー／ヒンジは、（ａ）ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、ＣＨ３スペーサー、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサー、若しくはそれらの任意の組み合わせ、（ｂ）約１０個～約８０個のアミノ酸の短いスペーサー、８０個超～約１８０個のアミノ酸の中程度のスペーサー、若しくは１８０個超のアミノ酸の長いスペーサー、及び／又は（ｃ）配列番号９６～１００のうちのいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー／ヒンジは、中程度のスペーサーを含み、スペーサーは、配列番号９９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。
細胞又はその集団の様々な実施形態ではＣＡＲは、配列番号１１７と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成し、がん細胞は、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である。
様々な実施形態では、（ｉ）ｉＰＳＣは、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、又はｉＰＳＣマスター細胞バンク（master cell bank、ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）派生細胞は、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、又は派生Ｂ系統細胞を含むか、あるいは、（ｉｉｉ）派生細胞は、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、派生細胞は、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、（ｉ）増加された細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、及び（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力のうちの１つ以上を含む治療特性を有する。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では細胞は、ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞であり、（ｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞は、腫瘍部位における改善された浸潤及び／又は保持を有するか、（ｉｉ）ＮＫ系統細胞は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、かつ／又は遊走させることができるか、あるいは（ｉｉｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる。
別の態様では、本発明は、細胞又はその集団であって、（ｉ）細胞が、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又は（ｃ）ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、（ｉｉ）細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、（ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、抗原結合ドメインが、（１）配列番号１０３（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに（２）配列番号１０６（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、を含む、外部ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、細胞又はその集団を提供する。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、（ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、リンカーは、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、（ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、かつ／又は（ｅ）ヒト化されている。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ１５Ｒβ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、（ｂ）それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、内部ドメインは、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、当該内部ドメインドメインが、以下の形態：２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、若しくはＮＫｐ４６－２Ｂ４のうちのいずれか１つの融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、（ａ）ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチド、（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄ、の膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインは、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、外部ドメインは、（ａ）シグナルペプチド、及び／又は、（ｂ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態は、スペーサー／ヒンジは、（ａ）ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、ＣＨ３スペーサー、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサー、若しくはそれらの任意の組み合わせ、（ｂ）約１０個～約８０個のアミノ酸の短いスペーサー、８０個超～約１８０個のアミノ酸の中程度のスペーサー、若しくは１８０個超のアミノ酸の長いスペーサー、及び／又は（ｃ）配列番号９６～１００のうちのいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、スペーサー／ヒンジは、中程度のスペーサーを含み、スペーサーは、配列番号９９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１７と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、（ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの少なくとも１つを含む固形腫瘍標的化骨格を更に含み、任意選択で、細胞は、固形腫瘍標的化骨格を含まない対応する細胞と比較して、固形腫瘍における改善された輸送、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）耐性、及び／又はアロ反応性耐性を有する。いくつかの実施形態では、ＡＤＲは、４－１ＢＢに特異的である。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、固形腫瘍標的化骨格は、（ｉ）ＣＤ３８ノックアウトと、（ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドと、を更に含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウト、（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの最も少ない１つの破壊、（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、（ｖ）表４に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上を更に含む。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、ＴＧＦβ－ＳＲＲは、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを更に含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、（ａ）サイトカイン受容体がＩＬ２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１１（ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＬＱＱＤＫＶＰＥＰＡＳＬＳＳＮＨＳＬＴＳＣＦＴＮＱＧＹＦＦＦＨＬＰＤＡＬＥＩＥＡＣＱＶＹＦＴＹＤＰＹＳＥＥＤＰＤＥＧＶＡＧＡＰＴＧＳＳＰＱＰＬＱＰＬＳＧＥＤＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｂ）サイトカイン受容体はＩＬ１２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメインは、配列番号１２（ＨＹＦＱＱＫＶＦＶＬＬＡＡＬＲＰＱＷＣＳＲＥＩＰＤＰＡＮＳＴＣＡＫＫＹＰＩＡＥＥＫＴＱＬＰＬＤＲＬＬＩＤＷＰＴＰＥＤＰＥＰＬＶＩＳＥＶＬＨＱＶＴＰＶＦＲＨＰＰＣＳＮＷＰＱＲＥＫＧＩＱＧＨＱＡＳＥＫＤＭＭＨＳＡＳＳＰＰＰＰＲＡＬＱＡＥＳＲＱＬＶＤＬＹＫＶＬＥＳＲＧＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱＨＩＳＬＳＶＦＰＳＳＳＬＨＰＬＴＦＳＣＧＤＫＬＴＬＤＱＬＫＭＲＣＤＳＬＭＬ）若しくは配列番号１３（ＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｃ）サイトカイン受容体はＩＬ１８Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１４（ＹＲＶＤＬＶＬＦＹＲＨＬＴＲＲＤＥＴＬＴＤＧＫＴＹＤＡＦＶＳＹＬＫＥＣＲＰＥＮＧＥＥＨＴＦＡＶＥＩＬＰＲＶＬＥＫＨＦＧＹＫＬＣＩＦＥＲＤＶＶＰＧＧＡＶＶＤＥＩＨＳＬＩＥＫＳＲＲＬＩＩＶＬＳＫＳＹＭＳＮＥＶＲＹＥＬＥＳＧＬＨＥＡＬＶＥＲＫＩＫＩＩＬＩＥＦＴＰＶＴＤＦＴＦＬＰＱＳＬＫＬＬＫＳＨＲＶＬＫＷＫＡＤＫＳＬＳＹＮＳＲＦＷＫＮＬＬＹＬＭＰＡＫＴＶＫＰＧＲＤＥＰＥＶＬＰＶＬＳＥＳ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｄ）サイトカイン受容体はＩＬ２１Ｒであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１５（ＳＬＫＴＨＰＬＷＲＬＷＫＫＩＷＡＶＰＳＰＥＲＦＦＭＰＬＹＫＧＣＳＧＤＦＫＫＷＶＧＡＰＦＴＧＳＳＬＥＬＧＰＷＳＰＥＶＰＳＴＬＥＶＹＳＣＨＰＰＲＳＰＡＫＲＬＱＬＴＥＬＱＥＰＡＥＬＶＥＳＤＧＶＰＫＰＳＦＷＰＴＡＱＮＳＧＧＳＡＹＳＥＥＲＤＲＰＹＧＬＶＳＩＤＴＶＴＶＬＤＡＥＧＰＣＴＷＰＣＳＣＥＤＤＧＹＰＡＬＤＬＤＡＧＬＥＰＳＰＧＬＥＤＰＬＬＤＡＧＴＴＶＬＳＣＧＣＶＳＡＧＳＰＧＬＧＧＰＬＧＳＬＬＤＲＬＫＰＰＬＡＤＧＥＤＷＡＧＧＬＰＷＧＧＲＳＰＧＧＶＳＥＳＥＡＧＳＰＬＡＧＬＤＭＤＴＦＤＳＧＦＶＧＳＤＣＳＳＰＶＥＣＤＦＴＳＰＧＤＥＧＰＰＲＳＹＬＲＱＷＶＶＩＰＰＰＬＳＳＰＧＰＱＡＳ）によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は（ｅ）ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１０（ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ）によって表されるアミノ酸配列を含む。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、サイトカイン受容体はＩＬ２Ｒβの断片であり、それによって、配列番号１６（ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱ）によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、配列番号１６に含まれる配列番号１７（ＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮ）によって表されるアミノ酸配列は、可変であり得る。
細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、固形腫瘍標的化骨格の１つ以上のポリヌクレオチドは、ＣＤ３８をノックアウトするために内因性ＣＤ３８遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、及び固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドは、トリシストロン性構築物内で共発現される。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントは、（ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、同じ若しくは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含んでもよい。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では、細胞は、サイトカインシグナル伝達複合体を更に含み、サイトカインシグナル伝達複合体は、（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、若しくはそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は（ｂ）（ｉ）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか、若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現され得る、少なくとも１つ、又は（ｃ）（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現される、少なくとも１つ、を含み、任意選択で、（ｄ）一過的に発現される。いくつかの実施形態では、（ｉ）ＣＡＲは、バイシストロン性構築物内でサイトカインシグナル伝達複合体と共発現される、かつ／あるいは（ｉｉ）ＣＡＲは、ＴＣＲ遺伝子座に挿入され、任意選択で、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、（ｉ）ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファ及び／若しくはＴＣＲベータの定常領域であり、かつ／あるいは（ｉｉ）ＴＣＲは、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成し、がん細胞は、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である。
様々な実施形態では、（ｉ）ｉＰＳＣは、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、又はｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）派生細胞は、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、又は派生Ｂ系統細胞を含むか、あるいは、（ｉｉｉ）派生細胞は、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む。いくつかの実施形態では、派生細胞は、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、（ｉ）増加された細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、及び（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力のうちの１つ以上を含む治療特性を有する。細胞又はその集団のいくつかの実施形態では細胞は、ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞であり、（ｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞は、腫瘍部位における改善された浸潤及び／又は保持を有するか、（ｉｉ）ＮＫ系統細胞は、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、かつ／又は遊走させることができるか、あるいは（ｉｉｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞は、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される細胞又はその集団を含む、組成物を提供する。組成物の様々な実施形態では、組成物は、１つ以上の治療剤を更に含む。組成物のいくつかの実施形態では、１つ以上の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（immunomodulatory drug、ＩＭｉＤ）を含む。治療剤がチェックポイント阻害剤である組成物のいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含む１つ以上のアンタゴニストチェックポイント分子、（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、又は（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペンブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含む。治療剤が抗体である組成物のいくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＰＤＬ１抗体、若しくは抗ＣＤ３８抗体、又は（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、Ｍ－Ａ２５１、２Ａ３、ＢＣ６９、２４２０４、２２７２２、２４２１２、ＭＡＢ２３５９１、ＦＮ５０、２９８６１４、ＡＦ２３５９、ＣＹ１Ｇ４、ＤＦ１５１３、ビバツズマブ、ＲＧ７３５６、Ｇ４４－２６、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、並びにそれらのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント若しくは断片及びそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、を含む。治療剤がエンゲージャである組成物の実施形態では、エンゲージャは、（ｉ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（bi-specific T cell engager、ＢｉＴＥ）、（ｉｉ）二重特異性キラー細胞エンゲージャ（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、若しくは（ｉｉｉ）三重特異性キラー細胞エンゲージャ（tri-specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）を含み得るか、又はエンゲージャは、（ａ）細胞又はバイスタンダー免疫エフェクター細胞のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメイン、及び（ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＲ１、若しくはＶＥＧＦ－Ｒ２のうちのいずれか１つを含む抗原に特異的な第２の結合ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される組成物を養子細胞療法を必要とする対象に導入することによる組成物の治療的使用であって、対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用を提供する。別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるクローンｉＰＳＣを含む、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される派生細胞を製造する方法であって、派生細胞が、免疫エフェクター細胞であり、方法が、（ｉ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを取得することであって、ｉＰＳＣが、（ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上を含む固形腫瘍標的化骨格を含む、取得することと、（ｉｉ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを派生ＣＤ３４＋細胞に分化させることと、（ｉｉｉ）派生ＣＤ３４＋細胞を免疫エフェクター細胞に分化させることであって、免疫エフェクター細胞が固形腫瘍標的化骨格を保持する、分化させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＤＲは、４－１ＢＢに特異的である。製造方法のいくつかの実施形態では、固形腫瘍標的化骨格を含む遺伝子操作されたｉＰＳＣを取得することは、（ａ）内因性（endogensous）ＣＤ３８遺伝子座における共発現のために２つ以上のポリヌクレオチドを組み込むことと、ＣＤ３８をノックアウトすることと、を含み、共発現のための２つ以上のポリヌクレオチドは、シストロン性構築物内にあり、ポリヌクレオチドは、（ｉ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体、（ｉｉ）ＴＧＦβ－ＳＳＲ、及び（ｉｉｉ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）、のうちの少なくとも２つをコードする。製造方法のいくつかの実施形態では、（ｉ）シストロン性構築物は、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを更に含むか、（ｉｉ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含むか、（ｉｉｉ）ＴＧＦβ－ＳＲＲは、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβ、又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を含むか、あるいは（ｉｖ）ＡＤＲは、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である。
製造方法の様々な実施形態では、方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをＴＣＲ遺伝子座に組み込むことによって、固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣを遺伝子操作することを更に含み、任意選択で、（ｉ）ＣＡＲは、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結され、かつ／あるいは（ｉｉ）ＴＣＲは、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、バイシストロン性構築物内でサイトカインシグナル伝達複合体と共発現されるか、あるいは、ＴＣＲ遺伝子座は、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達複合体は、（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、及び（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、のうちの少なくとも１つを含む。
製造方法のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）腫瘍関連抗原に特異的であるか、（ｉｉ）固形腫瘍関連抗原に特異的であるか、（ｉｉｉ）汎腫瘍抗原に特異的であるか、又は（ｉｖ）Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、及びＭＲ１のうちの１つに特異的である。いくつかの実施形態では、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原に特異的なＣＡＲは、（ｉ）配列番号１０３（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、及び任意選択で（ｉｉ）配列番号１０６（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、を含む抗原結合ドメインを含む。製造方法のいくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、（ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、（ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、（ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一であるアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は（ｅ）ヒト化されている。
製造方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損の導入、（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、Ｔａｐａｓｉｎ、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの１つ以上の欠失又は破壊、並びに／あるいは（ｃ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上によって、腫瘍固形標的化骨格を含むｉＰＳＣを遺伝子操作することを更に含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作は、標的化された編集を含む。いくつかの実施形態では、標的化された編集は、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の他の任意の機能的バリエーションによって実行される。
別の態様では、本発明は、養子細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、対象にエフェクター細胞を注入することを含み、エフェクター細胞が、本明細書において提供される派生細胞又はその集団を含む、方法を提供する。治療方法のいくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原に特異的なＣＡＲを含み、ＣＡＲが、（ｉ）配列番号１０３（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに、任意選択で、（ｉｉ）配列番号１０６（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、を含み、ＣＡＲは、ＴＲＡＣ遺伝子座にあり、ＣＡＲ発現は、内因性ＴＣＲプロモータによって駆動され、養子細胞療法を必要とする対象は、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、肺がん、食道がん、唾液腺がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、又は頭頸部がんを有する。
治療方法のいくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、固形腫瘍標的化骨格を更に含み、エフェクター細胞は、（ｉ）ＣＤ３８遺伝子座に、（ａ）ＣＸＣＲ２をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体をコードするポリヌクレオチド、及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上と、（ｉｉ）ＣＤ３８遺伝子座に、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子座に、ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｖ）ＣＤ３８ノックアウト及びＴＣＲノックアウトと、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＲは、４－１ＢＢに特異的である。治療方法のいくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の治療剤を対象に投与することを更に含み、１つ以上の治療剤は、（ｉ）サイトカイン、抗体、エンゲージャ、チェックポイント阻害剤、化学療法剤若しくは放射性部分、若しくは免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、（ｉｉ）ダラツムマブ、イサツキシマブ、又はＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体，（ｉｉｉ）ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）若しくはＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）を含むエンゲージャ、（ｉｖ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ（lirimumab）、モナリズマブ、ニボルマブ、若しくはペムブロリズマブを含むチェックポイント阻害剤、並びに／又は（ｖ）シクロホスファミド及びフルダラビン（Ｃｙ／Ｆｌｕ）を含む化学療法剤、を含む。治療方法のいくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、ＣＤ３８ノックアウト及びＴＣＲノックアウトと、任意選択で４－１ＢＢに特異的なＡＤＲと、を含み、方法は、対象に抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み、方法は、Ｃｙ／Ｆｌｕを対象に投与することを含むリンパ球枯渇を必要としないか、最小限しか必要としない。治療方法のいくつかの実施形態では、エフェクター細胞は同種異系であり、対象にエフェクター細胞を注入することは、外来患者設定（out-patient setting）で行われる。
別の態様では、本発明は、固形腫瘍を有する対象の治療における養子細胞療法を改善する方法であって、本明細書で提供される派生細胞の集団を投与することを含み、任意選択で、派生細胞が、固形腫瘍標的化骨格を含まない対応する細胞と比較して、固形腫瘍における改善された輸送、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）耐性、及び／又はアロ反応性耐性を有する、方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）治療を改善する方法であって、ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＸＣＲ２をコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβ－ＳＲＲをコードするポリヌクレオチド、及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むエフェクター細胞を含む組成物を、治療を必要とする対象に導入することと、対象に抗ＨＥＲ２ ｍＡｂを導入することと、を含む、方法を提供する。様々な実施形態では、抗ＨＥＲ２ ｍＡｂはトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））である。
一態様では、本発明は、目的の導入遺伝子を含むＮＫ細胞を選択する方法を提供する。いくつかの実施形態は、（ｉ）目的の導入遺伝子と、ＩＬ１５若しくはそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は以下の（１）～（７）：（１）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、（２）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、（３）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、（４）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、（５）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、（６）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び（７）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つとを共発現する構築物を含む操作されたＮＫ細胞を取得することと、（ｉｉ）操作されたＮＫ細胞に外因性ＩＬ１５サイトカインを供給することなく、細胞を培養することと、（ｉｉｉ）外因性ＩＬ１５サイトカインを伴わずに増殖するＮＫ細胞を収集し、それによって、目的の導入遺伝子を含む操作されたＮＫ細胞を選択することと、を含む。
本明細書で提供される組成物及び方法の様々な目的及び利点は、例示及び例として本発明の特定の実施形態が示される添付の図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
バイシストロン性発現ＣＡＲ－ｉＴ細胞の操作及び分化を示す。図１Ａは、本発明のいくつかの実施形態に従ってエフェクター細胞を調製するために使用される、遺伝子操作されたｉＰＳＣ分化プロセスの概要を示す。 バイシストロン性発現ＣＡＲ－ｉＴ細胞の操作及び分化を示す。図１Ｂは、フローサイトメトリーを介してＣＤ４５及びＣＤ７発現を評価することによる、固形腫瘍骨格設計の１つ以上の成分とのＣＡＲ－ｉＴ細胞のリンパ系コミットメントの評価を示す。 バイシストロン性発現ＣＡＲ－ｉＴ細胞の操作及び分化を示す。図１Ｃは、操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞の例示的な群による高い導入遺伝子発現を示す。 バイシストロン性発現ＣＡＲ－ｉＴ細胞の操作及び分化を示す。図１Ｄは、ＣＤ３８遺伝子座挿入及びＣＤ３８ノックアウトのための例示的なトリシストロン性構築物を示す。 バイシストロン性発現ＣＡＲ－ｉＴ細胞の操作及び分化を示す。図１Ｅは、親非操作Ｔ細胞と比較したトリシストロン操作ＣＡＲ－ｉＴ細胞の高発現レベルを示す。 ＣＸＣＲ２を発現するように操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ評価のための例示的な実験計画を示す。 ＣＸＣＲ２シグナル伝達の状況におけるパクリタキセルプレコンディショニングを伴う及び伴わないＣＡＲ－Ｔ細胞療法に供された腫瘍を有するマウスにおける４５日目の腫瘍成長（図２Ｂ）及び腫瘍成長阻害（図２Ｃ）を示す。 ＣＸＣＲ２シグナル伝達の状況におけるパクリタキセルプレコンディショニングを伴う及び伴わないＣＡＲ－Ｔ細胞療法に供された腫瘍を有するマウスにおける４５日目の腫瘍成長（図２Ｂ）及び腫瘍成長阻害（図２Ｃ）を示す。 パクリタキセルプレコンディショニングを伴う及び伴わない腫瘍内のそれぞれの示されたＣＡＲ－Ｔ細胞群の４５日目の浸潤及び保持を示す。 ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２の両方で操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦで操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞のケモカイン受容体発現を示す。 ＣＸＣＲ２操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞の遊走が、ＣＸＣＲ２リガンドの様々な希釈に対して用量応答的に改善されたが、ＣＣＲ１リガンド及びＣＸＣＲ３リガンドに対するＣＸＣＲ２＋ＣＡＲ－ｉＴ細胞の感受性は影響を受けなかったことを示す。 ＴＧＦβリダイレクタ構築物におけるサイトカイン受容体内部ドメインの機能性を示す。 ドミナントネガティブＴＧＦβを使用することによるＴＧＦβシグナル伝達単独の遮断よりも改善されたシグナルリダイレクタ受容体の機能性を示す。 ＴＧＦβリダイレクタ受容体を発現するＣＡＲ－ｉＴ細胞の集団を生成及び試験するための例示的な戦略の概略図を示す。 操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞によって発現されるＴＧＦβリダイレクタ受容体のフローサイトメトリー検出を示す。 ＴＧＦβリダイレクタ受容体を発現するＣＡＲ－ｉＴ細胞を、バルク操作ｉＰＳＣ集団から首尾よく分化させることができることを示す。 （パートＡ及びパートＢ）ＴＧＦβリダイレクタ受容体を発現するＣＡＲ－ｉＴ細胞が、エフェクター機能のＴＧＦβ媒介性抑制に抵抗し、ＴＧＦβの存在下でエフェクター機能を維持することができることを示す。 ＴＧＦβリダイレクタ受容体導入遺伝子の発現が、ＴＧＦβの存在下での標的細胞による複数ラウンドの刺激後にＣＡＲ－ｉＴ細胞において維持されることを示す。 ＴＧＦβリダイレクタ受容体導入遺伝子で操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞が、対照ＣＡＲ－ｉＴ細胞と比較して、ＴＧＦβの存在下で増強された活性化プロファイルを示したことを示す。 連続刺激アッセイにおける、ＴＧＦβの存在下でのＴＧＦβリダイレクタ受容体で操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞によるサイトカイン分泌産生の増強を示す。 連続刺激アッセイにおける、ＴＧＦβの存在下でのＴＧＦβＲ－ＩＬ１８Ｒリダイレクタ受容体で操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞の増殖の改善を示す。 ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞のフェンタイピックプロファイルを示す。 ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、ＴＧＦβの存在下で、ｄｎＴＧＦβＲ形質導入ｉＮＫ細胞よりも強い持続性及び増殖を示すことを示す。 所望の表現型プロファイル及びＴＧＦβの存在下でのより活性化されたプロファイルを有するＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞の割合の増加を示す。 ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫ細胞が、ｄｎＴＧＦβＲ２を発現するｉＮＫ細胞及び親ｉＮＫ細胞と比較して、標的細胞に対して頑強な自然殺傷能力を示すことを示す。 ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫ細胞が、標的細胞による３ラウンドの再刺激にわたって、ｄｎＴＧＦβＲ２を発現するｉＮＫ細胞及び親ｉＮＫ細胞と比較して増大した増殖を示すことを示す。 ｄｎＴＧＦβＲ２を発現するｉＮＫ細胞及び親ｉＮＫ細胞（対照）と比較した、表現型マーカー及び活性化マーカーを有するＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ発現ｉＮＫ細胞の割合の増加を示す。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共培養したＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ発現ｉＮＫによって分泌されたサイトカインＴＮＦ、ＩＦＮγ、及びＧＭＣＳＦの定量を、同じ標的に対する親ｉＮＫのサイトカイン分泌と比較して示す。 ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、ｄｎＴＧＦβＲを発現する細胞と比較して、乳がん細胞株との初回ラウンドの共培養において、増強されたＡＤＣＣ及びＴＧＦβ媒介性抑制に対する耐性を示すことを示す。 ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、ｄｎＴＧＦβＲを発現する細胞と比較して、乳がん細胞株との初回ラウンドの共培養において、増強されたＡＤＣＣ及びＴＧＦβ媒介性抑制に対する耐性を示すことを示す。 刺激ラウンド１の終了時の残存エフェクター細胞の数（図１４Ａ）及び導入遺伝子発現（図１４Ｂ）を実証することによって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１標的細胞との第１ラウンドの共培養後、ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、ｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫ細胞よりも持続的であることを示す。 刺激ラウンド１の終了時の残存エフェクター細胞の数（図１４Ａ）及び導入遺伝子発現（図１４Ｂ）を実証することによって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１標的細胞との第１ラウンドの共培養後、ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、ｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫ細胞よりも持続的であることを示す。 ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、複数の対照細胞群と比較して、標的細胞との第２ラウンドの共培養において優れた抗腫瘍ＡＤＣＣ活性を示すことを示す。 ＴＧＦβＲ－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体で操作されたｉＮＫ細胞が、複数の対照細胞群と比較して、標的細胞との第２ラウンドの共培養において優れた抗腫瘍ＡＤＣＣ活性を示すことを示す。 ＴＧＦβＲ－ＳＳＲで操作されたｉＮＫ細胞が、ＴＧＦβの抑制性シグナル伝達の存在下で、種々の固形がん細胞株にわたってＡＤＣＣ細胞溶解の増強を示すことを示す。 ｈｎＣＤ１６ａ＋／ＣＤ３８－ＣＡＲ－ｉＴ細胞がダラツムマブの存在下で枯渇の影響を受けにくかったことを示す。 ダラツムマブ及びＣＡＲ－ｉＴ細胞の組み合わせが、同種異系Ｔ及びＮＫ細胞がダラツムマブ依存的及びＣＡＲ－ｉＴ依存的の両方の様式で枯渇するという点で、アロ反応性Ｔ及びｐｂＮＫ細胞増殖を強力に抑制することを示す。 ＰＢＭＣのＣＤ３８＋Ｔ及びｐｂＮＫ細胞区画がダラツムマブの存在下で選択的に枯渇することを示す。 ＰＢＭＣのＣＤ３８＋Ｔ及びｐｂＮＫ細胞区画がダラツムマブの存在下で選択的に枯渇することを示す。 ＰＢＭＣのＣＤ３８＋Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞がダラツムマブ依存的に枯渇することを示す。 ＰＢＭＣのＣＤ３８＋Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞がダラツムマブ依存的に枯渇することを示す。 ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣに対するｉＮＫ細胞を定量するためのゲーティング図を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞が、混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction、ＭＬＲ）における活性化同種異系ＰＢＭＣ攻撃に対して増強された機能的持続性を示すことを示す。 ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞がアロ反応性Ｔ及びＮＫ細胞の増殖を抑制したことを示す。図２１Ａは、示されたｉＮＫ細胞との９日間の共培養後のＣＤ３＋Ｔ及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞のゲーティング概略を示す代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞がアロ反応性Ｔ及びＮＫ細胞の増殖を抑制したことを示す。図２１Ｂは、２：１のｉＮＫ細胞対ＰＢＭＣ比でＣＡＲ－ｉＮＫ±ＡＤＲと共培養したＴ細胞数及びＮＫ細胞数の定量を示す。 ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋アロ反応性Ｔ細胞サブセットの両方を選択的に標的とすることを示す。図２２Ａは、ｉＮＫ細胞との９日間の共培養後のＴ細胞の代表的なＦＡＣＳプロットを示し、図２に示されるようなＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ３８及び４－１ＢＢの発現について分析した。 ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋アロ反応性Ｔ細胞サブセットの両方を選択的に標的とすることを示す。図２２Ｂは、ＣＡＲ－ｉＮＫ±ＡＤＲ共培養におけるドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞間の％ＣＤ３８及び％４－１ＢＢ発現の編集（compilation）を示す。 ＴＲＡＣによって駆動されるＣＡＲ及びＡＤＲ導入遺伝子を保有するように操作されたｉＰＳＣが、細胞内ＣＤ３発現を伴い、かつＣＡＲとＡＤＲとの頑強な共発現を伴うＴ細胞に首尾よく分化され得ることを示す。 ｉＰＳＣ由来ｉＴ細胞のＡＤＲ発現が、プライミング同種異系Ｔ細胞拒絶からの保護を提供し、同種異系Ｔ細胞を枯渇させることを示す。 ＡＤＲ＋エフェクター細胞が、ＡＤＲ－対照細胞に対するアロラクティブＴ細胞の効果と比較して、宿主アロ反応性Ｔ細胞の存在において損なわれていない腫瘍制御をインビボで示すことを示す。 ＡＤＲ＋エフェクター細胞が、ＡＤＲ－対照細胞に対するアロラクティブＴ細胞の効果と比較して、宿主アロ反応性Ｔ細胞の存在において損なわれていない腫瘍制御をインビボで示すことを示す。 示されたゲノム操作された成分を有するエフェクター細胞の同様の細胞溶解有効性を示す。 ＩＬ７ＲＦが、ＣＡＲ－ｉＴ減少を実質的に制限し、かつ活性化後のエフェクター細胞持続性を増強することを示す。 ＳＫＯＶ３腫瘍細胞上のＰＤＬ１及びＨＥＲ２の表面発現を示す。 抗ＰＤＬ１又は抗ＨＥＲ２のいずれかによるｈｎＣＤ１６活性化が、ｈｎＣＤ１６＋ＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を特異的に増強したことを示す。 ＩＦＮγ、ＩＬ２、及びＣＤ１０７ａ発現（脱顆粒マーカー）の発現を示し、ｈｎＣＤ１６がＣＡＲ ｉＴ細胞のＣＡＲベースの有効性を補完及び増強することを実証する。 ｈｎＣＤ１６がエフェクター細胞の細胞溶解及びサイトカイン産生を補完することを示す。 ＣＡＲ－ｉＴ細胞のｈｎＣＤ１６及びＣＡＲの同時活性化が、複数ラウンドの腫瘍チャレンジにわたって、ｈｎＣＤ１６＋ＣＡＲ－ｉＴ細胞の実質的により大きな増殖をもたらすことを示す。 同じＨＥＲ２－ＣＡＲを有するが、固形腫瘍標的化骨格を含まない初代ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した、示された固形腫瘍標的化骨格構成を含むエフェクター細胞の頑強かつ増強された抗ＨＥＲ２有効性を示す。 ４Ｄ５ベースのＨＥＲ２－ＣＡＲと比較した、腫瘍関連ＨＥＲ２抗原に対するＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲの有効性及び選択性が、記載されるような固形腫瘍標的化骨格構成で操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞において維持されることを示す。 高く均一なＣＡＲ、ｈｎＣＤ１６、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及びＣＸＣＲ２発現とともに、リンパ系コミットメント（ＣＤ４５高ＣＤ７高）を実証する代表的なフローサイトメトリープロットを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、複数の適応症及び抗原レベルにわたって頑強なＣＡＲ依存性抗腫瘍有効性を実証することを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、低抗原発現腫瘍標的の低いＥ：Ｔ比でのＣＡＲ機能性のｈｎＣＤ１６相補性を実証することを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞のＣＡＲ媒介性抗腫瘍有効性が、複数ラウンドの腫瘍チャレンジにわたって、ｈｎＣＤ１６活性化及び治療抗体で増強されることを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、複数ラウンドの腫瘍チャレンジにわたって、ＴＧＦβ－ＳＲＲを介したＴＧＦβ媒介性エフェクター抑制に対する抵抗性を示すことを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞によるＣＸＣＲ２発現が、腫瘍へのＣＸＣＬ８特異的遊走を可能にすることを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、攻撃的卵巣異種移植モデルにおいてＣＡＲ及びＣＡＲ／ｈｎＣＤ１６相補性によって増強された抗腫瘍有効性をインビボで実証することを示す。 最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞が、攻撃的卵巣異種移植モデルにおいてＣＡＲ及びＣＡＲ／ｈｎＣＤ１６相補性によって増強された抗腫瘍有効性をインビボで実証することを示す。
ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）のゲノム改変には、ポリヌクレオチドの挿入、欠失、置換のうちの１つ以上が含まれ得る。ゲノム操作されたｉＰＳＣでの外因性遺伝子発現は、元のゲノム操作されたｉＰＳＣの長期のクローン増殖後、細胞分化後、及びゲノム操作されたｉＰＳＣに由来する細胞からの脱分化細胞型において、遺伝子サイレンシング、又は低下した遺伝子発現などの問題にしばしば遭遇する。一方、Ｔ細胞又はＮＫ細胞などの初代免疫細胞を直接操作することは困難であり、養子細胞療法のための操作された免疫細胞の調製及び送達に障害をもたらす。様々な実施形態では、本発明は、自殺遺伝子及び他の機能的モダリティを含む１つ以上の外因性遺伝子を安定的に組み込むための効率的で信頼できる標的化アプローチを提供し、これは生着、輸送、ホーミング、遊走、細胞傷害性、生存能力、維持、増殖、寿命、自己複製、持続性、及び／又は生存率に関する改善された治療的特性を、ＨＳＣ（造血幹細胞及び前駆細胞）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、及びＮＫ系統細胞を含むが、これらに限定されないｉＰＳＣ派生細胞にもたらす。
定義
本明細書で特に定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図しない。
本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１又は１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
代替（例えば、「又は」）の使用は、代替の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
「及び／又は」という用語は、代替の一方又は両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」又は「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％もの量で変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用されるとき、「実質的に」又は「本質的に」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」又は「本質的に同じ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さとほぼ同一である、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」及び「本質的に含まない」という用語は互換可能に使用され、細胞集団又は培養培地などの組成物を記載するために使用されるとき、例えば、特定の物質又はその供給源の、９５％を含まない、９６％を含まない、９７％を含まない、９８％を含まない、９９％を含まないなど、又は従来の手段で測定して検出できないなどのように、特定の物質又はその供給源を含まない組成物を指す。組成物中の特定の成分又は物質を「含まない」又は「本質的に含まない」という用語はまた、そのような成分又は物質が（１）任意の濃度で組成物に含まれない、又は（２）機能的に不活性な低い濃度で組成物に含まれることも意味する。同様の意味が、「存在しない」という用語に適用され得、組成物の特定の物質又はその供給源が存在しないことを指す。
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含むこと（comprising）」は、述べられたステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、若しくは要素、又はステップ若しくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるであろう。特定の実施形態では、「含む（include）」、「有する」、「含む（contain）」、及び「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用される。
「～からなる（consisting of）」とは、「～からなる」という語句に続く全てのものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。
「～から本質的になる（consisting essentially of）」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指定された活性又は動作を妨害しないか、又はそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であることを示すが、他の要素は必要に応じたものではなく、列挙された要素の活性又は動作に影響するか否かに応じて存在し得るか、又は存在し得ないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、若しくは「更なる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して記載された特定の特質、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を参照しているとは限らない。更に、特定の特質、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせることができる。
「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件の変化を最小限に抑えて、生体外の人工環境内の生体組織内又は生体組織上で行われる実験又は測定など、生体外で行われる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手順は、生体から採取され、通常無菌条件下で、典型的には数時間又は約２４時間まで、しかしながら状況に応じて最大４８時間若しくは７２時間以上を含む、実験装置で培養される生細胞又は組織を含む。特定の実施形態では、そのような組織又は細胞は、収集及び凍結され得、エクスビボ処理のために後に解凍され得る。生細胞又は組織を使用して数日より長く続く組織培養実験又は手順は、典型的には「インビトロ」であると考えられるが、特定の実施形態では、この用語はエクスビボと互換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、概して、生体内部で起こる活動を指す。
本明細書で使用する場合、「リプログラミング」又は「脱分化」又は「細胞能力の増加」又は「発生能力の増加」という用語は、細胞の能力を増加させるか、又は細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、細胞能力が増加した細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生可塑性を有する（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えると、リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされていない状態の同じ細胞よりも分化が進んでいない状態の細胞である。
本明細書で使用されるとき、「分化」という用語は、特殊化していない（「コミットされていない」）又はあまり特殊化していない細胞が、例えば、血液細胞又は筋細胞などの特殊化細胞の特質を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化された（「コミットされた」）位置を呈する細胞である。「コミットされた」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続ける位置まで分化経路を進み、通常の状況下では、異なる細胞型に分化し、分化度の低い細胞型に戻ることのできない細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「多能性」という用語は、生体又は体細胞の全ての系統を形成する細胞（すなわち、胚そのもの）の能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない不完全な又は部分的な多能性細胞（例えば、エピブラスト幹細胞又はＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）までの範囲に及ぶ一連の発生能である。
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」又はｉＰＳＣという用語は、誘導又は変更された、分化した成人、新生児又は胎児細胞からインビトロで産生された、すなわち、３つの全ての胚葉又は真皮層：中胚葉、内胚葉、及び外胚葉の全ての組織に分化できる細胞にリプログラミングされた幹細胞を指す。いくつかの実施形態は、リプログラミングプロセスは、リプログラミング因子及び／又は小分子化学駆動法を使用する。産生されたｉＰＳＣは、天然に存在する細胞を指していない。
本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然に存在する多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発生時に３つの一次胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全ての誘導体を発生させる。それらは、胚体外膜又は胎盤に寄与しない（すなわち、全能性ではない）。
本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞」という用語は、１つ以上の胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞に分化するが、３つ全てには分化しない発生能を有する細胞を指す。したがって、多能性細胞はまた、「部分的に分化した細胞」と呼ぶこともできる。多能性細胞は当該技術分野で知られており、多能性細胞の例には、例えば造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多能性」は、細胞が所与の系統での多くの型の細胞を形成し得るが、他の系統の細胞は形成しないことを示す。例えば、多能性造血細胞は多くの異なる型の血液細胞（赤、白、血小板など）を形成することができるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性及び多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
多能性は、細胞の多能性特徴を評価することにより、部分的に決定することができる。多能性の特徴としては、（ｉ）多能性幹細胞形態、（ｉｉ）無制限自己再生の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０及び／又はＣＤ５０を含むが、これらに限定されない、多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つ全ての体細胞系統（外胚葉、中胚葉及び内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫形成、並びに（ｖｉ）３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成が挙げられるが、これらに限定されない。
これまでに２つのタイプの多能性が説明されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に類似した「プライミング」又は「準安定」状態の多能性と、多能性初期／着床前の胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」又は「基底」状態である。両方の多能性状態が上記のような特徴を示す一方で、ナイーブ状態又は基底状態は、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の前不活性化又は再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性及び生存率の改善、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発生調節遺伝子プロモータ上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の低減、並びに（ｖ）プライミング状態多能性細胞と比較しての分化マーカーの発現低下を更に示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、得られる多能性細胞からサイレンシングされるか又は除去されるかのいずれかである細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、多能性のプライミング状態の特徴を有するようである。標準的な多能性細胞培養条件下で、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限り、プライミング状態に留まり、基底状態の特徴が観察される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特質を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、高い核対細胞質比を有し、核小体が顕著に存在し、典型的な細胞間間隔がある、形状が丸くて小さいことを特徴とする。
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、又は他の飼育動物を指す。
「多能性因子」又は「リプログラミング因子」は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤を指す。多能性因子には、細胞の発生能を増加させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子及び小分子リプログラミング剤が含まれる。
「培養」又は「細胞培養」は、インビトロ環境における細胞の維持、増殖及び／又は分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（各場合で単数は「培地（medium）」）、「補充成分」及び「培地補充成分」は、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」又は「維持する（maintain）」とは、例えば滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）細胞培養皿又はフラスコ内で、組織又は体外の細胞を維持（sustaining）、増殖（propagating）（増殖（growing））、及び／又は分化させることを指す。「培養」又は「維持すること」は、細胞の増殖及び／又は維持に役立つ栄養素、ホルモン、及び／又は他の因子の供給源として培地を利用することができる。
本明細書で使用されるとき、「中胚葉」という用語は、初期胚発生中に出現し、循環系の血液細胞、筋肉、心臓、真皮、骨格、その他の支持組織と結合組織を含む様々な特殊化された細胞型を生じさせる、３つの胚葉のうちの１つを指す。
本明細書で使用される場合、「決定的な造血内皮」（hemogenic endothelium、ＨＥ）又は「多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮」（pluripotent stem cell-derived definitive hemogenic endothelium、ｉＨＥ）という用語は、内皮造血転換と呼ばれるプロセスにおいて造血幹細胞及び前駆細胞を生じさせる内皮細胞のサブセットを指す。胚における造血細胞の発生は、側板中胚葉から血管芽細胞を経て決定的な造血内皮細胞及び造血前駆体へと順次進行する。
「造血幹細胞及び前駆細胞」、「造血幹細胞」、「造血前駆細胞」、又は「造血前駆体細胞」という用語は、造血系統にコミットしているが、更なる造血分化が可能であり、多能性造血幹細胞（血球）、骨髄前駆体、巨核球前駆体、赤血球前駆体、及びリンパ球前駆体を含む細胞を指す。造血幹細胞及び前駆細胞（progenitor cell、ＨＳＣ）は、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞型を生じる多能性幹細胞である。本明細書で使用されるとき、「二次造血幹細胞」という用語は、Ｔ系統細胞、ＮＫ系統細胞、及びＢ系統細胞を含む成熟骨髄性とリンパ性細胞型の両方を生じさせることができるＣＤ３４＋造血細胞を指す。造血細胞はまた、原始赤血球、巨核球、及びマクロファージを生じさせる原始造血細胞の様々なサブセットを含む。
本明細書で使用されるとき、「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は互換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内の特定の外来抗原の同定、並びにＭＨＣクラスＩ拘束性での他の免疫細胞の活性化及び不活性化を含む免疫系における様々な役割を有する主要なタイプの白血球を指す。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞、又は哺乳動物から取得されたＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell、ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（peripheral blood leukocyte、ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltrating lymphocyte、ＴＩＬ）、メモリＴ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（gamma delta T cell、γδＴ細胞）、などを含むが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞であることができ、任意の発生段階のものであることができる。追加のタイプのヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、又はＴｆｈ細胞などの細胞が含まれる。追加のタイプのメモリＴ細胞には、セントラルメモリＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリＴ細胞（Ｔｅｍ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）などの細胞が含まれる。「Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞などの遺伝子操作されたＴ細胞を指すこともできる。Ｔ細胞又はＴ細胞様エフェクター細胞はまた、幹細胞又は前駆細胞（「派生Ｔ細胞」若しくは「派生Ｔ細胞様エフェクター細胞」、又は集合的に「派生Ｔ系統細胞」）から分化され得る。由来Ｔ細胞様エフェクター細胞は、いくつかの点でＴ細胞系統を有し得るが、同時に、初代Ｔ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する。本出願において、Ｔ細胞、Ｔ細胞様エフェクター細胞、派生Ｔ細胞、派生Ｔ細胞様エフェクター細胞、又は派生Ｔ系統細胞は、集合的に「Ｔ系統細胞」と呼ばれる。
「ＣＤ４＋細胞」は、それらの表面でＣＤ４を発現し、細胞性免疫応答と関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルによって特徴付けられ、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ２、ＩＬ４、及びＩＬ１０などのサイトカインの分泌が含まれ得る。「ＣＤ４」分子は、もともとＴリンパ球の分化抗原として定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見出される。ＣＤ４抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ拘束性免疫応答の関連認識要素として関与している。Ｔリンパ球では、ヘルパー／インデューサのサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋細胞」は、それらの表面上でＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ拘束性であり、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞と細胞傷害性及びサプレッサＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束性相互作用の関連認識要素である。
本明細書で使用されるとき、「ＮＫ細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６又はＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の不在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。ＮＫ細胞は、任意のＮＫ細胞、例えば、培養ＮＫ細胞（例えば、初代ＮＫ細胞）、又は培養若しくは増殖されたＮＫ細胞由来のＮＫ細胞、又は細胞株ＮＫ細胞（例えば、ＮＫ－９２）、又は健常若しくは疾患状態を有する哺乳動物から得られたＮＫ細胞であり得る。本明細書で使用されるとき、「適応ＮＫ細胞」及び「メモリＮＫ細胞」という用語は互換可能であり、表現型的にＣＤ３－及びＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２Ｃ及びＣＤ５７のうちの少なくとも１つ、並びに任意選択でＣＤ１６を発現するが、ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、及びＥＡＴ－２のうちの１つ以上の発現を欠く、ＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化及び抑制性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、並びに／又はＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は、弱陽性（ｄｉｍ）又は強陽性（ｂｒｉｇｈｔ）発現であり得る。ＮＫ細胞又はＮＫ細胞様エフェクター細胞は、幹細胞又は前駆細胞（「派生ＮＫ細胞」若しくは「派生ＮＫ細胞様エフェクター細胞」、又は集合的に「派生ＮＫ系統細胞」）から分化され得る。派生ＮＫ細胞様エフェクター細胞は、いくつかの点でＮＫ細胞系統を有し得るが、同時に、初代ＮＫ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する。本出願において、ＮＫ細胞、ＮＫ細胞様エフェクター細胞、派生ＮＫ細胞、派生ＮＫ細胞様エフェクター細胞、又は派生ＮＫ系統細胞は、集合的に「ＮＫ系統細胞」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「ＮＫＴ細胞」又は「ナチュラルキラーＴ細胞」又は「ＮＫＴ系統細胞」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞を指す。従来の主要組織適合性（major histocompatibility、ＭＨＣ）分子によって提示されるペプチド抗原を検出する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、非古典的ＭＨＣ分子であるＣＤ１ｄによって提示される脂質抗原を認識する。２つのタイプのＮＫＴ細胞が認識される。インバリアント又はＩ型ＮＫＴ細胞は、非常に限られたＴＣＲレパートリ－限定された範囲のβ鎖（ヒトではＶβ１１）と関連する正規のα鎖（ヒトではＶα２４－Ｊα１８）を発現する。非古典的又は非インバリアントのタイプＩＩ ＮＫＴ細胞と呼ばれるＮＫＴ細胞の第２の集団は、より不均一なＴＣＲαβの使用を提示する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は免疫療法に好適であると考えられている。適応又はインバリアント（Ｉ型）ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲ Ｖａ２４－Ｊａ１８、Ｖｂ１１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ａＧａｌＣｅｒ、ＣＤ１６１、及びＣＤ５６のマーカーのうちの１つ以上の発現によって識別できる。
「エフェクター細胞」という用語は、概して、刺激及び／又は活性化に応答して特定の活性を実行する免疫系における特定の細胞、又は活性化の際に特異的機能をもたらす細胞に適用される。本明細書で使用されるとき、「エフェクター細胞」という用語は、免疫細胞、「分化した免疫細胞」、並びに刺激及び／又は活性化に応答して特定の活性を実行するように編集及び／又は調節された初代細胞又は分化した細胞を含み、いくつかの文脈ではそれらと交換可能である。エフェクター細胞の非限定的な例としては、初代由来又はｉＰＳＣ由来のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び好中球が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、「単離された」などの用語は、元の環境から分離された細胞、又は細胞の集団を指し、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境に見出される少なくとも１つの成分を実質的に含まない。この用語は、例えば、組織又は生検試料から単離された、その天然環境で見出されるようないくつか又は全ての成分から取り出された細胞を含む。この用語はまた、細胞が非天然環境、例えば、細胞培養物又は細胞懸濁液から単離された環境で見出されるため、少なくとも１つ、いくつか、又は全ての成分から取り出された細胞を含む。したがって、「単離された細胞」は、天然で見出される場合、又は非天然の環境で増殖、保管、又は存続する場合、他の物質、細胞、又は細胞集団を含む少なくとも１つの成分から部分的又は完全に分離される。単離された細胞の具体例には、部分的に純粋な細胞組成物、実質的に純粋な細胞組成物、及び天然に存在しない培地で培養された細胞が含まれる。単離された細胞は、所望の細胞若しくはその集団を、環境中の他の物質若しくは細胞から分離することによって、又は環境から１つ以上の他の細胞集団若しくは亜集団を取り除くことによって得ることができる。
本明細書中で使用されるとき、「精製する」などの用語は、純度を増加することをいう。例えば、純度は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％に増加させることができる。
本明細書で使用されるとき、「コードすること」という用語は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）の定義された配列又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物を「コードしている」ということができる。
「構築物」は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、外来遺伝物質の標的細胞への送達又は移入を誘導することができ、標的細胞で複製及び／又は発現することができる任意の核酸構築物を指す。したがって、「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状又は環状分子であり得る。ベクターは、組み込まれてもよく、又は組み込まれなくてもよい。ベクターの主なタイプには、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
本出願を通して時々使用される場合、「ＴＲＡＣ＿［構築物］」という表現（「［構築物］」は、所与の文脈において特定される成分及びそれらの配置を有する可変発現構築物である）は、発現構築物がＴＣＲをノックアウトするためにＴＲＡＣ遺伝子座に挿入され、発現構築物の成分が内因性ＴＣＲプロモータの制御下で発現又は共発現されることを意味する。
本出願を通して時々使用される場合、「ＣＤ３８＿［構築物］」という表現（「［構築物］」は、所与の文脈において特定される成分及びそれらの配置を有する可変発現構築物である）は、発現構築物がＣＤ３８をノックアウトするためにＣＤ３８遺伝子座に挿入され、発現構築物の成分が、構築物中の内因性ＣＤ３８プロモータの制御下であろうと外因性プロモータ下であろうと、発現又は共発現されることを意味する。
「組み込み」とは、構築物の１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入される、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化組み込み」とは、構築物のヌクレオチドが、予め選択された部位又は「組み込み部位」で細胞の染色体又はミトコンドリアＤＮＡに挿入されることを意味する。本明細書で使用されるとき、「組み込み」という用語は、組み込み部位での内因性配列又はヌクレオチドの欠失を伴うか又は伴わない、構築物の１つ以上の外因性配列又はヌクレオチドの挿入を含むプロセスを更に指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、内因性配列又は１つ以上の挿入されたヌクレオチドで欠失されたヌクレオチドの置換を更に含み得る。
本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、参照分子又は参照活性が宿主細胞に導入されるか、又は宿主細胞に対して非天然であることを意味することを意図している。分子は、例えば、コード核酸を宿主の遺伝物質に導入することにより、例えば、宿主の染色体に組み込むことにより、又は非染色体の遺伝物質、例えば、プラスミドとして導入することができる。したがって、コード核酸の発現に関して使用される用語は、コード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。「内因性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子又は活性を指す。同様に、この用語は、コード核酸の発現に関して使用されるとき、細胞内に含まれ、外因的に導入されていないコード核酸の発現を指す。
本明細書で使用されるとき、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれると、ＲＮＡに転写され、場合によってはインビボでポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子又はポリヌクレオチドは、原核生物配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然ポリペプチド（すなわち、天然に見出されるポリペプチド）又はその断片、バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドとの１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの突然変異体）又はその断片、操作されたポリペプチド又はペプチド断片、治療用ペプチド又はポリペプチド、造影用マーカー、選択マーカーなどをコードし得る。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（adenine、Ａ）、シトシン（cytosine、Ｃ）、グアニン（guanine、Ｇ）、チミン（thymine、Ｔ）から構成され、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンはウラシル（uracil、Ｕ）である。ポリヌクレオチドには、遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ、又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、トランスファＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが含まれ得る。「ポリヌクレオチド」はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、ポリペプチドのアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用されるとき、これらの用語は、例えば、当該技術分野では概してペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも称される短い鎖と、概して当該技術分野でポリペプチド又はタンパク質と称される長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドは、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、合成ポリペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。
本明細書で使用されるとき、「サブユニット」という用語は、タンパク質複合体の各別個のポリペプチド鎖を指し、各別個のポリペプチド鎖は、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。多くのタンパク質分子は、２つ以上のサブユニットから構成され、ここで、アミノ酸配列は、各サブユニットについて同一であるか、又は類似しているか、又は完全に異なるかのいずれかであり得る。例えば、ＣＤ３複合体は、ＣＤ３α、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、及びＣＤ３ζサブユニットから構成され、これらはＣＤ３ε／ＣＤ３γ、ＣＤ３ε／ＣＤ３δ、及びＣＤ３ζ／ＣＤ３ζ二量体を形成する。単一のサブユニット内で、ポリペプチド鎖の連続した部分は、「ドメイン」と呼ばれるコンパクトで局所的な半独立単位に折り畳まれることが多い。多くのタンパク質ドメインは、ドメインの共通機能に寄与する、サブドメインとも呼ばれる独立した「構造サブユニット」を更に含み得る。したがって、本明細書で使用されるとき、「サブドメイン」という用語は、より大きなドメインの内側のタンパク質ドメイン、例えば、細胞表面受容体の外部ドメイン内の結合ドメイン、又は細胞表面受容体の内部ドメインの刺激ドメイン若しくはシグナル伝達ドメインを指す。
「作動可能に連結された（operably-linked）」又は「作動可能に連結された（operatively linked）」は、「作動可能に接続された（operably connected）」又は「作動可能に接続された（operatively connected）」と交換可能であり、一方の機能が他方によって影響を受けるような、単一の核酸断片上の核酸配列（又は複数のドメインを有するポリペプチド中のアミノ酸）の会合を指す。例えば、プロモータは、そのコード配列又は機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合、コード配列又は機能的ＲＮＡと作動可能に連結している（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センス又はアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。更なる例として、受容体結合ドメインは、リガンドへの受容体の結合が当該結合に応答するシグナルを変換するように、細胞内シグナル伝達ドメインに作動可能に接続され得る。
「融合タンパク質」又は「キメラタンパク質」は、本明細書で使用されるとき、別々のタンパク質をコードする配列をコードする２つ以上の部分的又は完全なポリヌクレオチドを接合するための遺伝子操作を介して作製されるタンパク質であり、これらの接合されたポリヌクレオチドの発現は、元のタンパク質又はその断片の各々に由来する機能的特性を有する単一のペプチド又は複数のポリペプチドを生じる。融合タンパク質における異なる供給源の２つの隣接するポリペプチド間に、リンカー（又はスペーサー）ペプチドを付加することができる。
本明細書で使用されるとき、「遺伝的インプリント」という用語は、ソース細胞又はｉＰＳＣの優先的な治療特性に寄与し、ソース細胞由来ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣ由来造血系統細胞で保持可能な遺伝的又はエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用されるとき、「ソース細胞」は、リプログラミングを通じてｉＰＳＣを生成するために使用され得る非多能性細胞であり、ソース細胞由来ｉＰＳＣは、任意の造血系統細胞を含む特定の細胞型に更に分化し得る。ソース細胞由来ｉＰＳＣ、及びそれから分化した細胞は、文脈に応じて、「由来（derived）」細胞又は「派生（derivative）」細胞と総称され得る。例えば、本出願全体で使用される派生エフェクター細胞、又は派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞は、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然（natural）／天然（native）供給源から取得されたそれらの主要な対応物と比較するとき、ｉＰＳＣから分化した細胞である。本明細書で使用されるとき、優先的な治療特性を付与する遺伝的インプリントは、ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である選択されたソース細胞をリプログラミングすることにより、又はゲノム編集を使用してｉＰＳＣに遺伝子組換えモダリティを導入することにより、ｉＰＳＣに組み込まれる。特異的に選択されたドナー、疾患、又は治療状況から取得されたソース細胞の態様では、優先的な治療特性に寄与する遺伝的インプリントには、根本的な分子事象が同定されているかどうかに関係なく、選択されたソース細胞の派生細胞に渡される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療特性を表す、状況特異的な遺伝的又はエピジェネティックな改変を含み得る。ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的であるソース細胞は、ｉＰＳＣ及び由来造血系統細胞において保持可能な遺伝的インプリントを含んでいてもよく、この遺伝的インプリントには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（invariant natural killer T、ｉＮＫＴ）細胞からの、予め配置された単一特異的ＴＣＲ、追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーにおける高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点突然変異のホモ接合、及び所定のＨＬＡ要件、すなわち、増加した集団でハプロタイプを示す選択されたＨＬＡ適合ドナー細胞が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、優先的な治療特性には、由来細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と修飾、生存率、及び細胞傷害性が含まれる。優先的な治療特性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、腫瘍外効果の減少を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに／又は化学療法などの治療に対する耐性にも関連し得る。優先的な治療特性を付与する遺伝的インプリントが組み込まれているｉＰＳＣを分化させることから、１つ以上の治療特性を有する派生細胞が得られる場合、そのような派生細胞はまた「合成細胞」とも呼ばれる。概して、合成細胞は、その最も近い対応する初代細胞と比較した場合、合成細胞が、操作された多能性細胞から分化されるか、又は末梢血、臍帯血、若しくは他のドナー組織などの天然／天然供給源由来の初代細胞を操作することによって取得されるかにかかわらず、１つ以上の非天然細胞機能を有する。例えば、本出願全体で使用される合成エフェクター細胞、又は合成ＮＫ細胞若しくは合成Ｔ細胞は、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然（natural）／天然（native）供給源から取得されたそれらの初代対応物と比較して、ゲノム改変されたｉＰＳＣから分化した細胞である。いくつかの実施形態では、合成細胞は、その最も近い対応する初代細胞と比較した場合に、１つ以上の非天然細胞機能を有する。
本明細書で使用されるとき、「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な免疫細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な未改変及び／又は天然に存在するＮＫ細胞と比較して、増強され、改善され、及び／又は増加された治療特性を有する。免疫細胞の治療特性には、細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答の調節と修飾、生存率、及び細胞傷害性が含まれ得るが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性はまた、抗原標的化受容体発現、ＨＬＡ提示又はその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞及び免疫修飾の誘導、腫瘍外効果の減少を伴う改善されたオンターゲット特異性、並びに／又は化学療法などの治療に対する耐性によっても明らかにされる。
本明細書で使用される場合、「エンゲージャ」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球）と、腫瘍細胞との間の連結を形成することができ、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば、融合ポリペプチドを指す。エンゲージャの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（bi-specific T cell engager、ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（bi-specific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャ（tri-specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、若しくは多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば、細胞傷害性応答を誘発又は開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体を操作することができ、エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、又は好中球で発現させることができる。いくつかの実施形態では、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体及び細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特異的な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）との間の二重特異性抗体又は多重特異性抗体の結合を促進する。このアプローチを使用すると、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣをユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、表面トリガー受容体が細胞型に関係なく任意のエフェクター細胞で発現及び活性化することができることを意味し、ユニバーサル受容体を発現する全てのエフェクター細胞は、エンゲージャの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体によって認識できるエンゲージャに結合又は連結され得る。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍標的化特異性を有するエンゲージャを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合する。したがって、１つ以上のエフェクター細胞型を使用して、１つの特異的な型の腫瘍細胞を殺傷する場合もあれば、２つ以上の型の腫瘍を殺傷する場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞の活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャのエピトープに特異的な抗エピトープとを含む。二重特異性エンゲージャは、一方の端の表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、もう一方の端の腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用されるとき、「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の可能性のある毒性又はその他の有害作用を防止するように設計された操作されたタンパク質を指す。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質の発現は条件付きで制御され、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに永久的に組み込んだ移植された操作された細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は変動する可能性があり、小分子を介した翻訳後活性化及び組織特異的及び／又は一過性の転写調節による制御が含まれる可能性がある。安全スイッチタンパク質は、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、増殖停止、転写及び転写後の遺伝子調節及び／又は抗体媒介性枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例において、安全スイッチタンパク質は、外因性分子、例えば、プロドラッグによって活性化され、活性化されると、治療用細胞のアポトーシス及び／又は細胞死を誘発する。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、改変ＥＧＦＲ、及びこれらの任意の組み合わせなどの自殺遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグが自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入された細胞を殺傷する。
本明細書で使用されるとき、「薬学的に活性なタンパク質又はペプチド」という用語は、生物に対して生物学的及び／又は薬学的効果を達成することができるタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、疾患に対する治癒的又は緩和的特性を有し、疾患の重症度を改善、軽減（relieve）、緩和、逆転又は軽減（lessen）するために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質はまた、予防特性を有し、疾患の発症を予防するために、又はそれが出現した場合にそのような疾患又は病的状態の重症度を軽減するために使用される。「薬学的に活性なタンパク質」には、タンパク質若しくはペプチド全体又はその薬学的に活性な断片が含まれる。この用語はまた、タンパク質若しくはペプチドの薬学的に活性な類似体又はタンパク質若しくはペプチドの断片の類似体を含む。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、協調的又は相乗的に作用して治療効果をもたらす複数のタンパク質又はペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質又はペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写及び翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体又はその断片、増殖因子、及び／又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を改変、関与、阻害、活性化、低減、又は増大させる任意の分子を指す。「シグナル伝達」とは、細胞内で最終的に生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学改変の形での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路の例は当該技術分野で知られており、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存経路、及びＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「標的化モダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて、ｉ）固有のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連するときの抗原特異性、ｉｉ）モノクローナル抗体又は二重特異性エンゲージャに関連するときのエンゲージャ特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞の標的化、ｉｖ）癌幹細胞の標的化、及びｖ）特異的な抗原又は表面分子の不在下でのその他の標的化戦略を含むがこれらに限定されない、抗原及び／又はエピトープの特異性を促進する分子、例えば、ポリペプチドを指す。
本明細書で使用されるとき、「特異的」又は「特異性」という用語は、非特異的又は非選択的な結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体又はエンゲージャの能力を指すために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「養子細胞療法」という用語は、免疫細胞がヒトドナーから単離されるか、又は多能性細胞のインビトロ分化から得られるエフェクター細胞であるか否か、それらが遺伝子改変されているか否か、あるいは、それらがドナーから単離された後にエクスビボで継代されたか、増殖されたか、若しくは不死化された初代ドナー細胞であるか否か、にかかわらず、自己又は同種異系リンパ球の輸注に関する細胞ベースの免疫療法を指す。
本明細書で使用される場合、「放射線」とは、波又は粒子の形態でのエネルギーの放出又は伝達を指す。放射線の例示的な形態としては、電磁放射線（例えば、電波、マイクロ波、赤外線、可視光線、紫外線、Ｘ線、及びガンマ線）、粒子放射線（例えば、アルファ線、ベータ線、陽子放射線、及び中性子放射線）、並びに音響放射線（例えば、超音波、音波、及び地震波）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、放射線の量は、グレイ（Gray、Ｇｙ）として測定され、これは、物質１キログラム当たり１ジュールの放射線エネルギーの吸収として定義される。放射線療法において、適用される放射線の量は、処置されるがんのタイプ及びステージに依存して変化する。治癒症例では、固形上皮性腫瘍の典型的な用量は６０～８０Ｇｙの範囲であるが、リンパ腫は典型的には２０～４０Ｇｙで処置される。予防（アジュバント）用量は、典型的には、約４５～６０Ｇｙを１．８～２Ｇｙに分割したものである（例えば、乳がん、頭部がん及び頸部がんの場合）。様々な実施形態では、放射線は、本明細書に開示されるような感作物質として使用され得る。
本明細書で使用される場合、「放射線療法（radiation therapy）」又は「放射線治療（radiotherapy）」は、細胞がどのように成長及び分裂するかを制御する遺伝物質を破壊することによって、細胞を損傷するための放射線の使用を伴うがん治療の種類を指すために互換的に使用される。健常な細胞とがん細胞の両方が放射線療法によって損傷を受けるが、放射線療法の目標は、正常で健常な細胞をできるだけ破壊しないようにすることである。「放射線療法」という用語は、多くの場合、外部ビーム放射線療法を指し、高エネルギービーム（例えば、Ｘ線、ガンマ線、光子、陽子、中性子、イオン、及びそのような治療に適用可能な任意の他の形態のエネルギー）が、治療される対象の外部の機械によって生成され、対象の身体上の正確な点に向けられる。しかしながら、「放射線療法」という用語はまた、放射線源を含むか、さもなければそれに連結されたシード、リボン、又はカプセルが、対象の体内の腫瘍又はがん細胞の中又はその近くに配置される近接照射療法を含む。小線源治療には、低線量率インプラント、高線量率インプラント、及び永久インプラントが含まれる。「放射線療法」という用語には、放射性薬物（例えば、放射性ペプチドを含む放射性医薬品又は放射性核種）が対象に経口又は静脈内投与され、対象の体内の腫瘍又はがん細胞が位置する領域に集まる全身放射線療法も含まれる。腫瘍抗原に結合する抗体が毒性薬物に連結されている抗体－薬物候補と同様に、放射性医薬品は、腫瘍抗原に特異的に結合する標的化分子（抗体など）に連結された放射性化合物を組み込む。放射性医薬品に有用な放射性化合物の例としては、カルシウム－４７、炭素－１１、炭素－１４、クロム－５１、コバルト－５７、コバルト－５８、エルビウム－１６９、フッ素－１８、ガリウム－６７、ガリウム－６８、水素－３、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、インジウム－５９、クリプトン－８１ｍ、ルテチウム－１７７、窒素－１３、酸素－１５、リン－３２、ラジウム－２２３、ルビジウム－８２、サマリウム－１５３、セレン－７５、ナトリウム－２２、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テクネチウム－９９ｍ、タリウム－２０１、キセノン－１３３、及びイットリウム－９０が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、放射線療法は、本明細書に開示されるような感作物質として使用され得る。
本明細書中で使用される場合、「リンパ球枯渇」及び「リンパコンディショニング」は、典型的には免疫療法の前の、リンパ球及びＴ細胞の破壊を指すために交換可能に使用される。養子細胞療法の投与前のリンパコンディショニングの目的は、エフェクター細胞の恒常性増殖を促進すること、並びに調節性免疫細胞及び恒常性サイトカインについて競合する免疫系の他の競合要素を排除することである。従って、リンパコンディショニングは、典型的には、養子細胞療法の最初の投薬の前に、１つ以上の化学療法剤を対象に投与することによって達成される。様々な実施形態では、リンパコンディショニングは、養子細胞療法の最初の投薬の数時間～数日前に行う。リンパコンディショニングに有用な例示的な化学療法剤としては、シクロホスファミド（cyclophosphamide、ＣＹ）、フルダラビン（fludarabine、ＦＬＵ）、及び以下に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。しかし、抗ＣＤ３８ｍＡｂによる十分なリンパ球枯渇は、本明細書中で更に記載されるように、ＣＹ／ＦＬＵベースのリンパコンディショニング手順を必要とせずに、又は最小限必要として、本ｉＮＫ細胞療法のための代替的なコンディショニングプロセスを提供し得る。
本明細書で使用される場合、「ホーミング」又は「輸送」とは、標的部位（例えば、細胞、組織（例えば、腫瘍）、又は臓器）への細胞の能動的ナビゲーション（遊走）を指す。「ホーミング分子」とは、細胞を標的部位に指向する分子を指す。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、細胞の標的部位への相互作用を認識及び／又は開始するように機能する。いくつかの実施形態では、ホーミング分子は、ケモカイン受容体である。本明細書中で使用される場合、「ケモカイン受容体」とは、ケモカインに結合する細胞表面分子を指す。ケモカイン受容体は、天然に存在するケモカイン受容体若しくは組換えケモカイン受容体又はそれらのバリアントを含み得る。例示的なケモカイン受容体としては、ＣＸＣケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、又はＣＸＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、又はＣＣＲ１１）、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＸ３ＣＲ１）、ＸＣケモカイン受容体（例えば、ＸＣＲ１）、又はそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「治療上十分な量」は、その意味の範囲内で、それが参照する特定の治療剤及び／又は医薬組成物の非毒性であるが十分かつ／又は有効な量を含み、所望の治療効果を提供する。必要とされる正確な量は、患者の全体的な健康状態、患者の年齢、並びに治療される状態のステージ及び重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特定の実施形態では、「治療上十分な量」は、治療されている対象の疾患又は状態に関連する少なくとも１つの症状を寛解、軽減、かつ／若しくは改善するのに十分かつ／又は有効である。
多能性幹細胞の分化には、培養液中の刺激剤及び細胞の物理的状態の変化など、培養系の変化が必要とされる。最も一般的な戦略は、系統特異的な分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体（embryoid body、ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」とは、胚の発生を模倣することが示されている三次元のクラスターであり、三次元領域内で多数の系統を発生させる。典型的には数時間から数日である分化プロセスを通じて、単純なＥＢ（例えば、分化を誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢにまで成長し、典型的には数日から数週間であるこのとき、それらは、更に分化を続けるように処理される。ＥＢ形成は、細胞の三次元多層クラスターにおいて多能性幹細胞を互いに近接させることによって開始される。典型的には、これは、多能性細胞を液滴中で沈降させること、細胞を「Ｕ」底ウェルプレート中に沈降させることを含むいくつかの方法のうちの１つによって、又は機械的撹拌によって達成される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢの成長を促進するために、多能性幹細胞の凝集体には更に分化の手掛かりが必要である。そのため、多能性幹細胞の凝集体は、選択した系統へのキュー誘発を提供する分化培地に移す必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養は、典型的には、ＥＢ細胞クラスター内の中程度の増殖の分化した細胞集団（すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の胚葉）を生成する。ＥＢは、細胞分化を促進することが証明されているが、環境内の分化のキューに対する三次元構造の細胞の露出に一貫性がないため、様々な分化状態の異種細胞を生じさせる。加えて、ＥＢは作成及び維持することが面倒である。更に、ＥＢ形成による細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、分化効率の低下にもつながる。
対照的に、「凝集体形成」は、「ＥＢ形成」とは異なり、多能性幹細胞由来細胞の集団を増殖させるために使用することができる。例えば、凝集体に基づく多能性幹細胞の増殖中、培養培地は、増殖及び多能性を維持するように選択される。細胞増殖は一般に、より大きな凝集体を形成する凝集体のサイズを増加させ、この凝集体は、機械的又は酵素的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。ＥＢ培養とは異なり、維持培養培地内の凝集体内で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するために更なる分化のキューを必要とする。
本明細書で使用されるとき、「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターにわたる分化、すなわち「ＥＢ形成」とは異なる分化方法を指す用語である。単層分化は、本明細書に開示される他の利点の中でも特に、ＥＢ形成が分化を開始する必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成の場合でなどの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢ形成での３つ全ての胚葉分化と比較して最小限であるとみなされる。
本明細書で使用されるとき、「解離した細胞」又は「単一の解離した細胞」は、他の細胞から又は表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離又は精製された細胞をいう。例えば、細胞は、機械的又は酵素的方法によって動物又は組織から解離され得る。代替的に、インビトロで凝集する細胞は、例えば、クラスターの懸濁液、単一の細胞又は単一の細胞とクラスターの混合物への解離によって、互いに酵素的又は機械的に解離され得る。更に別の代替的な実施形態では、付着細胞は培養プレート又は他の表面から解離され得る。したがって、解離には、細胞外マトリックス（extracellular matrix、ＥＣＭ）及び基質（培養面など）との細胞相互作用を破壊すること、又は細胞間のＥＣＭを破壊することが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「マスター細胞バンク」又は「ＭＣＢ」は、１つ以上の治療特性を含むように操作されており、特徴付けられ、試験され、適格化され、拡大されており、かつ製造環境における指向性分化による細胞ベースの治療剤の産生のための出発細胞材料として確実に役立つことが示されているｉＰＳＣのクローン集団であるクローンマスター操作ｉＰＳＣ株を指す。様々な実施形態では、ＭＣＢは、製造プロセス中にｉＰＳ細胞株が継代され、解凍され、又は取り扱われる合計回数を低減及び／又は排除することによって、遺伝的変異及び／又は汚染可能性を防止するために、複数の容器中で維持、貯蔵、及び／又は凍結保存される。
本明細書で使用されるとき、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」は、第２の型の細胞と共培養されて、第２の型の細胞が増殖、増殖、又は分化することができる環境を提供する、１つの型の細胞を表す用語であり、フィーダー細胞は刺激、増殖因子、栄養素を提供し、第２の細胞型を支持する。フィーダー細胞は、それらが支持している細胞とは異なる種に由来してもよい。例えば、幹細胞を含む特定の型のヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞又は不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によって支持することができる。別の例では、末梢血由来細胞又は形質転換白血病細胞は、ナチュラルキラー細胞の増殖及び成熟を支持する。フィーダー細胞は、他の細胞と共培養されるときに、それらが支持している細胞よりも増殖するのを防ぐために、照射又はマイトマイシンなどの抗有糸分裂剤での処理によって、典型的には不活性化され得る。フィーダー細胞は、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞又は線維芽細胞）、及び白血病細胞を含み得る。前述を限定することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast、ＭＥＦ）であり得る。概して、様々なフィーダー細胞を一部使用して、多能性を維持し、特定の系統に分化を指示し、増殖能力を高め、エフェクター細胞などの特殊化した細胞型への成熟を促進することができる。
本明細書で使用されるとき、「フィーダーフリー」（feeder-free、ＦＦ）環境とは、フィーダー又は間質細胞を本質的に含まない、及び／又はフィーダー細胞の培養によって前処理されていない、培養条件、細胞培養又は培養培地などの環境を指す。「前処理された」培地とは、フィーダー細胞が培地内で少なくとも１日などの期間培養された後に採取された培地を指す。前処理された培地には、培地で培養されたフィーダー細胞から分泌された増殖因子及びサイトカインを含む、多くのメディエータ物質が含まれる。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、フィーダー細胞又は間質細胞の両方を含まず、フィーダー細胞の培養によって前処理もされていない。
ｉＰＳＣ及びそれから分化した派生非多能性細胞のゲノム編集若しくは改変、又は非多能性細胞及びそれからリプログラミングされた由来ｉＰＳＣのゲノム編集若しくは改変との関連で使用される「機能的」とは、（１）遺伝子レベルでは、ノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、直接ゲノム編集若しくは改変によって、又は最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」によって達成される、所望の細胞発生段階での誘導性若しくは一時的発現などのトランスジェニック若しくは制御された遺伝子発現の成功、又は（２）細胞レベルでの－（ｉ）直接ゲノム編集を通じて当該細胞において得られる遺伝子発現改変；（ｉｉ）最初にゲノム操作された出発細胞からの分化若しくはリプログラミングを介した「継代」を通じて当該細胞において維持される遺伝子発現改変；（ｉｉｉ）当該細胞のより初期の発生段階においてのみ出現するか、又は分化若しくはリプログラミングを介して当該細胞を生じる出発細胞においてのみ出現する遺伝子発現改変の結果としての、当該細胞における下流遺伝子調節、又は（ｉｖ）ｉＰＳＣ、前駆体若しくは脱分化した細胞起源で行われたゲノム編集若しくは改変に最初に由来する成熟細胞産物内に示される、増強された若しくは新たに達成された細胞機能若しくは属性による、細胞機能／特徴の除去、付加又は改変の成功を指す。
ＨＬＡクラスＩ欠損、ＨＬＡクラスＩＩ欠損、又はその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロ二量体及び／又はＨＬＡクラスＩＩヘテロ二量体を含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現のレベルが不足している、又はもはや維持されていない、又は低減している細胞を指し、減少又は低減したレベルが、他の細胞又は合成方法によって自然に検出可能なレベルよりも低くなっている。
本明細書で使用されるとき、「改変されたＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原標的化、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、抑制に対する耐性、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリン又はパラクリン）、走化性、及び細胞傷害性、例えば、非古典的ＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ－Ｅ及びＨＬＡ－Ｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４－１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ζ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、及びＰＤＬ１に関連するがこれらに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによって更に改変されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「改変されたＨＬＡ欠損」の細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。
「リガンド」という用語は、標的分子と複合体を形成して、標的上の部位に結合することによってシグナルを生成する物質を指す。リガンドは、標的に特異的に結合することができる天然又は人工物質であってもよい。リガンドは、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体複合体、コンジュゲート、核酸、脂質、多糖、単糖、小分子、ナノ粒子、イオン、神経伝達物質、又は標的に特異的に結合することができる任意の他の分子実体の形態であってもよい。リガンドが結合する標的は、タンパク質、核酸、抗原、受容体、タンパク質複合体、又は細胞であり得る。標的に結合してその機能を変化させ、シグナル伝達応答を誘発するリガンドは、「アゴニスト（agonistic）」又は「アゴニスト（agonist）」と呼ばれる。標的に結合し、シグナル伝達応答を遮断又は低減するリガンドは、「アンタゴニスト性」又は「アンタゴニスト」である。
「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、概して、標的に特異的に結合する少なくとも１つの結合部位を含有する免疫応答生成分子を指し、標的は、抗原、又はある特定の抗体と相互作用することができる受容体であり得る。例えば、ＮＫ細胞は、抗体又は抗体のＦｃ領域のそのＦｃ－ガンマ受容体（Fc-gamma receptor、ＦｃγＲ）への結合によって活性化され、それによって、ＡＤＣＣ（antibody-dependent cellular cytotoxicity、抗体依存性細胞傷害）媒介性エフェクター細胞活性化を誘発することができる。抗体が結合する抗原若しくは受容体の特定の断片若しくは部分、又は概して標的は、エピトープ又は抗原決定基として知られている。「抗体」という用語は、天然抗体及びそのバリアント、天然抗体及びそのバリアントの断片、ペプチボディ及びそのバリアント、並びに一本鎖抗体及びその断片を含む、抗体又はその特定の断片若しくは部分の構造及び／又は機能を模倣する抗体模倣体を含むが、これらに限定されない。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇＧ、単一可変新規抗原受容体（single variable new antigen receptor、ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオトープへの結合に特異的であり、イディオトープは、抗体の抗原決定基である。二重特異性抗体は、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）又はＢｉＫＥ（二重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよく、多重特異性抗体は、ＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、一本鎖Ｆａｂ（single chain Fab、ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（disulfide stabilized Fv、ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（single-domain antigen binding fragment、ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（heavy-chain-only antibody、ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。
「Ｆｃ受容体」はＦｃＲと略され、認識される抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体ＩｇＧに結合するものはＦｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ－アルファ受容体（Fc-alpha receptor、ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ－イプシロン受容体（Fc-epsilon receptor、ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、Ｔ及びＢ細胞）と各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）など、分子構造が異なるために抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。
「キメラ受容体」は、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するアミノ酸配列の２つ以上の部分を含むように作製される、操作された人工又はハイブリッド受容体タンパク質分子を記載するために使用される一般用語である。キメラ受容体タンパク質は、シグナル伝達を開始し、受容体へのアゴニストリガンドの結合時に下流機能を実施する能力を細胞に与えるように操作されている。例示的な「キメラ受容体」としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）、並びに２つ以上の受容体の融合体が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＦｃＲと略される「キメラＦｃ受容体」は、天然の膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞内シグナル伝達ドメインが改変されたか、又は非天然の膜貫通ドメイン及び／若しくは細胞内シグナル伝達ドメインで置き換えられた操作されたＦｃ受容体を記載するために使用される用語である。キメラＦｃ受容体のいくつかの実施形態では、膜貫通及びシグナル伝達ドメインの一方又は両方が非天然であることに加えて、１つ以上の刺激ドメインを操作されたＦｃ受容体の細胞内部分に導入して、受容体の誘発による細胞活性化、増殖、及び機能を増強することができる。標的抗原への抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは異なり、キメラＦｃ受容体は、Ｆｃ断片、若しくは抗体のＦｃ領域、若しくはエンゲージャ若しくは結合分子に含まれるＦｃ領域に結合し、標的細胞を近傍に近づけるか、又は近づけなくとも、分子に結合して細胞機能を活性化する。例えば、Ｆｃγ受容体は、細胞外ドメインでのＩｇＧの結合に応答し、それによりＣＦｃＲを生成する細胞内領域において選択された膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及び／又はシグナル伝達ドメインを含むように操作され得る。一例では、ＣＦｃＲは、その膜貫通ドメイン及び／又は細胞内ドメインを置き換えることにより、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を操作することによって産生される。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの結合親和性を更に改善させるために、ＣＤ６４の細胞外ドメイン又はＣＤ１６の高親和性バリアント（例えば、Ｆ１７６Ｖ）を組み込むことができる。高親和性ＣＤ１６細胞外ドメインが含まれるＣＦｃＲのいくつかの実施形態では、１９７位にセリンを含むタンパク質分解性切断部位が除去されているか、又は受容体の細胞外ドメインが非切断性であるように置き換えられて、すなわち、シェディングされないようになり、これにより、ｈｎＣＤ１６ベースのＣＦｃＲが取得される。
ＦｃγＲ受容体であるＣＤ１６には、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）とＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームがあることが確認されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性の非切断性ＣＤ１６」（ｈｎＣＤ１６と略される）は、ＣＤ１６の天然又は非天然バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６Ｖ及びＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントである。膜近位領域（１８９位～２１２位）における切断部位（１９５位～１９８位）が変更又は排除されたＣＤ１６バリアントは、脱落しない。切断部位及び膜近位領域は、国際公開第２０１５／１４８９２６号に詳細に記載されており、その完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ１６のＳ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の非切断性バージョンである。Ｆ１５８Ｖ及びＳ１９７Ｐの両方を含むＣＤ１６バリアントは親和性が高く、非切断性である。別の例示的な高親和性非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）バリアントは、ＣＤ６４外部ドメインの３つのエクソンの１つ以上に由来する外部ドメインを含む操作されたＣＤ１６である。
いくつかの実施形態では、一般に腫瘍を処置する状況において、及び固形腫瘍微小環境について、エフェクター細胞の活性を増強するために、集合的に互いに補完する（場合によっては相乗作用する）操作された成分のセットを含む細胞が、本明細書で提供される。操作された成分の選択されたセットは、ＣＡＲ、抗体、二重特異性抗体、及びＴＣＲを含むが、これらに限定されない、エフェクター細胞において発現される任意の腫瘍抗原結合分子とのその適合性のために、本明細書では「骨格」と呼ばれる。しかしながら、「骨格」という用語は、セットの個々の成分間のいかなる特定の物理的関係も、細胞内でのいかなる特定のそれらの位置も必要としないが、ある特定の会合及び／又は配置（例えば、個々の成分のうちの２つ以上の共発現構築物における順序）は、製造設定における他の考慮事項の中でも、より高い発現レベル又は処理の容易さのために最適化され得る。例えば、骨格は、各々が細胞のゲノム中の異なる位置にある２つの発現カセットの組み込みを含み得る。いくつかの実施形態では、骨格は、１つ以上のポリヌクレオチドの挿入及び／又は１つ以上の遺伝子をノックアウトするための改変などの複数のゲノム改変を含む。改変は同時に行っても逐次的に行ってもよい。骨格の改変によって増大され得るエフェクター細胞機能の非限定的な例としては、追加的に供給される可溶性サイトカインとインビトロ又はインビボで接触することなく自律的に細胞成長、増殖（proliferation）、増殖（expansion）及び／又はエフェクター機能を改善すること、並びにアロ反応性宿主免疫細胞のホーミング、輸送、枯渇又は減少の増強、並びに腫瘍部位での保持、のうちの１つ以上が挙げられ、腫瘍細胞は、エフェクター細胞に提供される機能的特質と相乗作用するように感作され得る。本開示の固形腫瘍標的化骨格は、例えば、治療されることが意図される適応症のための腫瘍抗原結合分子の単純な添加によって改変され得る出発細胞の供給源を提供するマスター細胞バンクを提供し、次いで、１つ以上の意図される腫瘍適応症のための治療特性を有する増強されたエフェクター細胞を分化させるための供給源として使用されることによって、骨格を含むｉＰＳＣの状況において特に有益であり得る。
Ｉ．増強された特性を持つ養子細胞療法に有用な細胞及び組成物
本明細書で提供されるのは、ｉＰＳＣから分化した派生細胞の治療特性を増強しながら、ｉＰＳＣ及びその派生細胞の分化能及び細胞発生生物学に影響を与えることなくクローンｉＰＳＣの調節回路を体系的に操作する戦略である。ｉＰＳＣ由来細胞は機能的に改善されており、選択的モダリティの組み合わせがゲノム操作を通じてｉＰＳＣレベルで細胞に導入された後の養子細胞療法に好適である。以前には、提供された１つ以上の遺伝子編集を含む改変されたｉＰＳＣが改変された活性及び／若しくは特性を保持しながら依然として細胞発生に入る能力、並びに／又は成熟して機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。ｉＰＳＣから指示された細胞分化中の予期しない失敗は、発生段階の特定の遺伝子発現又はその欠如、ＨＬＡ複合体提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質シェディング、及び細胞の表現型及び／又は機能の変化を可能にする分化プロトコルの再構成の必要性を含むがこれらに限定されない側面に起因する。本出願は、本明細書で提供される１つ以上の選択されたゲノム改変がｉＰＳＣ分化能に悪影響を及ぼさないこと、並びに操作されたｉＰＳＣに由来する機能エフェクター細胞が、ｉＰＳＣ分化後にエフェクター細胞に保持される、個々の又は組み合わせたゲノム改変に起因する増強及び／又は獲得した治療特性を有することを示した。更に、ｉＰＳＣ及びｉＰＳＣ由来エフェクター細胞の文脈において記載され得る全てのゲノム改変及びそれらの組み合わせは、培養されているか増殖されているかにかかわらず、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は免疫調節細胞などの初代免疫細胞を含む初代由来細胞に適用可能であり、その改変は、養子細胞療法に有用な操作された免疫細胞をもたらす。
更に、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、いくつかの血液悪性腫瘍を処置する際に有効かつ強力であることが示されているが、操作されたＴ細胞療法は、固形腫瘍に対処する際に限られた成功しか収めていない。均一に発現された抗原が接近可能であり、効果的に標的化され得る液体腫瘍とは異なり、腫瘍接近、腫瘍専用の抗原標的の欠如、及び抗原不均一性は、固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の発達の成功に対する有意な障壁である。加えて、患者及びドナー由来免疫細胞で見られる固有の遺伝子操作変動性は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の広範な適用を制限する。本出願は、操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞を使用する既製の養子細胞療法設定においてオフ腫瘍効果の低減とともにオンターゲット特異性を改善するため、同種拒絶反応を回避するため、並びに抑制腫瘍微小環境、特に固形腫瘍で高まる課題を克服するための、固形腫瘍標的化骨格の形態のゲノム操作態様、並びに他の遺伝子モダリティを提供する。
１．Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体の過剰発現
ケモカインは、白血球遊走を誘導する能力によって本来特徴付けられる約７～約１６ｋＤａの均質な血清タンパク質のファミリーである。ほとんどのケモカインは、４つの特徴的なシステイン（Ｃｙｓ）を有し、最初の２つのシステインによって示されるモチーフに従って、Ｃ－Ｘ－Ｃ（又はアルファ、ＣＸＣ）、Ｃ－Ｃ（又はベータ）、Ｃ（又はガンマ）、及びＣＸ３Ｃ（又はデルタ）ケモカインクラスに分類される。Ｃ－Ｘ－Ｃ（又はアルファ、ＣＸＣ）のサブファミリーは、第１のシステインに先行するＥＬＲモチーフ（Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ）の存在に従って、２つの群：ＥＬＲ－ＣＸＣケモカイン及び非ＥＬＲ－ＣＸＣケモカインに更に分類される。
ＣＸＣケモカイン受容体２（CXC chemokine receptor 2、ＣＸＣＲ２）は、ＣＤ１２８、インターロイキン８受容体ベータ（interleukin8 receptor beta、ＩＬ８Ｒβ）、又はＬ８受容体Ｂ型としても知られており、好中球、肥満細胞、単球、及びマクロファージによって主に発現されるケモカイン受容体である。ＣＤ５６ ｄｉｍ ＮＫ細胞はＣＸＣＲ２を発現することが知られているが、その発現はＮＫ細胞活性化の際に下方制御され得る。Ｔ細胞は典型的にはＣＸＣＲ２を発現しない。ｉＰＳＣ及びｉＰＳＣ由来Ｔ細胞は、本出願に開示されるようなＣＸＣＲ２をコードする外因性ポリヌクレオチドを形質導入しなければ、ＣＸＣＲ２を発現しない。ケモカインＩＬ８（ＣＸＣＬ８としても知られる）は、単核マクロファージ、好中球、好酸球、Ｔリンパ球、上皮細胞、及び線維芽細胞によって分泌され、好中球を感染部位に誘導することによって走化性因子として機能する。ＣＸＣＬ８はまた、腫瘍細胞によって分泌され、腫瘍遊走、浸潤、血管新生及び転移を促進する。ＣＸＣＬ８は、ＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２を含む複数のＣＸＣケモカイン受容体に対するリガンドのうちの１つである。ＣＸＣＲ２に結合することが公知の更なるケモカインとしては、ＣＸＣＬ１、ＧＲＯβ（ＣＸＣＬ２）、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、及びＣＸＣＬ７が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＸＣケモカイン受容体３（CXC chemokine receptor 3、ＣＸＣＲ３）は、Ｇタンパク質共役受容体９（G Protein-coupled Receptor 9、ＧＰＲ９）及びＣＤ１８３としても知られており、ケモカインＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１に結合するＧタンパク質共役受容体である。ＣＸＣＲ３は、主に活性化Ｔヘルパー１型（T-helper type 1、Ｔｈ１）リンパ球において発現されるが、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、及びＢリンパ球サブセットにも存在する。ＣＸＣＲ３とそのリガンドとの相互作用は、受容体保有細胞を身体の特定の部分、特に炎症、免疫障害、及び免疫機能不全の部位に誘導することに関与する。
様々な実施形態では、本出願は、本明細書で企図され記載される他の編集の中でも、他の遺伝子モダリティの中でもＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体を含む固形腫瘍標的化骨格を含むように遺伝子操作されたエフェクター細胞又はｉＰＳＣを提供する。様々な実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ２若しくはＣＸＣＲ３、又はそのバリアントを含む。ヒトＣＸＣＲ２のアミノ酸配列の非限定的な例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ２５０２５として登録されているものである。一実施形態では、ＣＸＣＲ２は、配列番号１に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２は、配列番号１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２は、配列番号１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号２、３、４、５、又は６によって表されるＣＸＣＲ２アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号２、３、４、５、及び６のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号２、３、４、５、及び６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号２、３、４、５、及び６のうちのいずれか１つに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ２のバリアントは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。本明細書及び本出願全体で使用されるように、２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較と２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当該技術分野で認識されている数学的アルゴリズムを使用して実行され得る。
配列番号１
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷＫＧＥＤＬＳＮＹＳＹＳＳＴＬＰＰＦＬＬＤＡＡＰＣＥＰＥＳＬＥＩＮＫＹＦＶＶＩＩＹＡＬＶＦＬＬＳＬＬＧＮＳＬＶＭＬＶＩＬＹＳＲＶＧＲＳＶＴＤＶＹＬＬＮＬＡＬＡＤＬＬＦＡＬＴＬＰＩＷＡＡＳＫＶＮＧＷＩＦＧＴＦＬＣＫＶＶＳＬＬＫＥＶＮＦＹＳＧＩＬＬＬＡＣＩＳＶＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＲＴＬＴＱＫＲＹＬＶＫＦＩＣＬＳＩＷＧＬＳＬＬＬＡＬＰＶＬＬＦＲＲＴＶＹＳＳＮＶＳＰＡＣＹＥＤＭＧＮＮＴＡＮＷＲＭＬＬＲＩＬＰＱＳＦＧＦＩＶＰＬＬＩＭＬＦＣＹＧＦＴＬＲＴＬＦＫＡＨＭＧＱＫＨＲＡＭＲＶＩＦＡＶＶＬＩＦＬＬＣＷＬＰＹＮＬＶＬＬＡＤＴＬＭＲＴＱＶＩＱＥＴＣＥＲＲＮＨＩＤＲＡＬＤＡＴＥＩＬＧＩＬＨＳＣＬＮＰＬＩＹＡＦＩＧＱＫＦＲＨＧＬＬＫＩＬＡＩＨＧＬＩＳＫＤＳＬＰＫＤＳＲＰＳＦＶＧＳＳＳＧＨＴＳＴＴＬ
（３６０アミノ酸のＣＸＣＲ２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ２５０２５）
配列番号２
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷ
（１５アミノ酸のＣＸＣＲ２アイソフォーム１（ＣＸＣＲ２の残基１～１５）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｑ６ＬＣＺ７）
配列番号３
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷＫＧＥＤＬＳＮＹＳＹＳＳＴＬＰＰＦＬＬＤＡＡＰＣＥＰＥＳＬＥＩＮＫＹＦＶＶＩＩＹＡＬＶＦＬ
ＬＳＬＬＧＮＳＬＶＭＬＶＩＬＹＳＲＶＧＲＳＶＴＤＶＹＬＬＮＬＡＬＡＤＬＬＦＡＬＴＬＰＩＷＡＡＳＫＶＮＧＷＩＦＧＴＦＬＣＫ
ＶＶＳＬＬＫＥＶＮＦＹＳＧＩＬＬＬＡＣＩＳＶＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＲＴＬＴＱＫＲＹＬＶＫＦＩＣＬＳＩＷＧＬＳＬＬＬＡＬＰＶ
ＬＬＦＲＲＴＶＹＳＳＮＶＳＰＡＣＹＥＤＭ
（２００アミノ酸のＣＸＣＲ２アイソフォーム２（ＣＸＣＲ２の残基１～２００）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｃ９ＪＷ４７）
配列番号４
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷＫＧＥＤＬＳＮＹＳＹＳＳＴＬＰＰＦＬＬＤＡＡＰＣＥＰＥＳＬＥＩＮＫＹＦＶＶＩＩＹＡＬＶＦＬ
ＬＳＬＬＧＮＳＬＶＭＬＶＩＬＹＳＲＶＧＲＳＶＴＤＶＹＬＬＮＬＡＬＡＤＬＬＦＡＬＴＬＰＩＷＡＡＳＫＶＮＧＷＩＦＧＴＦＬＣＫ
ＶＶＳＬＬＫＥＶＮＦＹＳＧＩＬ
（１３５アミノ酸のＣＸＣＲ２アイソフォーム３（ＣＸＣＲ２の残基１～１３５）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｃ９ＪＧ１９）
配列番号５
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷＫＧＥＤＬＳＮＹＳＹＳＳＴＬＰＰＦＬＬＤＡＡＰＣＥＰＥＳＬＥＩＮＫＹＦＶＶＩＩＹＡＬＶＦＬ
ＬＳＬＬＧＮＳＬＶＭＬＶＩＬＹＳＲＶＧＲＳＶＴＤＶＹＬＬＮＬＡＬＡＤＬＬＦＡＬＴＬＰＩＷＡＡＳＫＶＮＧＷＩＦＧＴＦＬＣＫ
ＶＶＳＬＬＫＥＶＮＦＹＳＧＩＬＬＬＡＣＩＳＶＤＲＹＬＡＩＶＨＡＴＲＴＬＴＱＫＲＹＬＶＫＦＩＣＬＳＩＷＧＬ
（１７２アミノ酸のＣＸＣＲ２アイソフォーム４（ＣＸＣＲ２の残基１～１７２）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｃ９Ｊ１Ｊ７）
配列番号６
ＭＥＤＦＮＭＥＳＤＳＦＥＤＦＷＫＧＥＤＬＳＮＹＳＹＳＳＴＬＰＰＦＬＬＤＡＡＰＣＥＰＥＳＬＥＩＮＫＹＦＶＶＩＩＹＡＬＶＦＬ
ＬＳＬＬＧＮＳＬＶＭＬＶＩＬＹＳＲＶＧＲＳＶＴＤＶＹＬＬＮＬＡＬＡＤＬＬＦＡＬＴＬＰＩＷＡＡＳＫＶＮＧＷＩＦＧＴＦＬＣＫ
ＶＶＳＬＬＫＥＶＮＦＹＳＧＩＬＬＬＡ
（１３８アミノ酸のＣＸＣＲ２アイソフォーム５（ＣＸＣＲ２の残基１～１３８）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｃ９Ｊ２Ｆ９）
ヒトＣＸＣＲ３のアミノ酸配列の非限定的な例は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ４９６８２として登録されているものである。一実施形態では、ＣＸＣＲ３は、配列番号７に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３は、配列番号７に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３は、配列番号７に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３のバリアントは、配列番号８又は９によって表されるＣＸＣＲ３アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３のバリアントは、配列番号８又は９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３のバリアントは、配列番号８又は９に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３のバリアントは、配列番号８又は９に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＣＸＣＲ３のバリアントは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ３のバリアントは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
配列番号７
ＭＶＬＥＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥＶＡＡＬＬＥＮＦＳＳＳＹＤＹＧＥＮＥＳＤＳＣＣＴＳＰＰＣＰＱＤＦＳＬＮＦＤＲＡＦＬＰＡＬＹＳＬＬＦＬＬＧＬＬＧＮＧＡＶＡＡＶＬＬＳＲＲＴＡＬＳＳＴＤＴＦＬＬＨＬＡＶＡＤＴＬＬＶＬＴＬＰＬＷＡＶＤＡＡＶＱＷＶＦＧＳＧＬＣＫＶＡＧＡＬＦＮＩＮＦＹＡＧＡＬＬＬＡＣＩＳＦＤＲＹＬＮＩＶＨＡＴＱＬＹＲＲＧＰＰＡＲＶＴＬＴＣＬＡＶＷＧＬＣＬＬＦＡＬＰＤＦＩＦＬＳＡＨＨＤＥＲＬＮＡＴＨＣＱＹＮＦＰＱＶＧＲＴＡＬＲＶＬＱＬＶＡＧＦＬＬＰＬＬＶＭＡＹＣＹＡＨＩＬＡＶＬＬＶＳＲＧＱＲＲＬＲＡＭＲＬＶＶＶＶＶＶＡＦＡＬＣＷＴＰＹＨＬＶＶＬＶＤＩＬＭＤＬＧＡＬＡＲＮＣＧＲＥＳＲＶＤＶＡＫＳＶＴＳＧＬＧＹＭＨＣＣＬＮＰＬＬＹＡＦＶＧＶＫＦＲＥＲＭＷＭＬＬＬＲＬＧＣＰＮＱＲＧＬＱＲＱＰＳＳＳＲＲＤＳＳＷＳＥＴＳＥＡＳＹＳＧＬ
（３６８アミノ酸のＣＸＣＲ３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ４９６８２）
配列番号８
ＭＥＬＲＫＹＧＰＧＲＬＡＧＴＶＩＧＧＡＡＱＳＫＳＱＴＫＳＤＳＩＴＫＥＦＬＰＧＬＹＴＡＰＳＳＰＦＰＰＳＱＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥＶＡＡＬＬＥＮＦＳＳＳＹＤＹＧＥＮＥＳＤＳＣＣＴＳＰＰＣＰＱＤＦＳＬＮＦＤＲＡＦＬＰＡＬＹＳＬＬＦＬＬＧＬＬＧＮＧＡＶＡＡＶＬＬＳＲＲＴＡＬＳＳＴＤＴＦＬＬＨＬＡＶＡＤＴＬＬＶＬＴＬＰＬＷＡＶＤＡＡＶＱＷＶＦＧＳＧＬＣＫＶＡＧＡＬＦＮＩＮＦＹＡＧＡＬＬＬＡＣＩＳＦＤＲＹＬＮＩＶＨＡＴＱＬＹＲＲＧＰＰＡＲＶＴＬＴＣＬＡＶＷＧＬＣＬＬＦＡＬＰＤＦＩＦＬＳＡＨＨＤＥＲＬＮＡＴＨＣＱＹＮＦＰＱＶＧＲＴＡＬＲＶＬＱＬＶＡＧＦＬＬＰＬＬＶＭＡＹＣＹＡＨＩＬＡＶＬＬＶＳＲＧＱＲＲＬＲＡＭＲＬＶＶＶＶＶＶＡＦＡＬＣＷＴＰＹＨＬＶＶＬＶＤＩＬＭＤＬＧＡＬＡＲＮＣＧＲＥＳＲＶＤＶＡＫＳＶＴＳＧＬＧＹＭＨＣＣＬＮＰＬＬＹＡＦＶＧＶＫＦＲＥＲＭＷＭＬＬＬＲＬＧＣＰＮＱＲＧＬＱＲＱＰＳＳＳＲＲＤＳＳＷＳＥＴＳＥＡＳＹＳＧＬ
（４１５アミノ酸のＣＸＣＲ３アイソフォーム２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ４９６８２－２）
配列番号９
ＭＶＬＥＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥＶＡＡＬＬＥＮＦＳＳＳＹＤＹＧＥＮＥＳＤＳＣＣＴＳＰＰＣＰＱＤＦＳＬＮＦＤＲＡＦＬＰＡＬＹＳＬＬＦＬＬＧＬＬＧＮＧＡＶＡＡＶＬＬＳＲＲＴＡＬＳＳＴＤＴＦＬＬＨＬＡＶＡＤＴＬＬＶＬＴＬＰＬＷＡＶＤＡＡＶＱＷＶＦＧＳＧＬＣＫＶＡＧＡＬＦＮＩＮＦＹＡＧＡＬＬＬＡＣＩＳＦＤＲＹＬＮＩＶＨＡＴＱＬＹＲＲＧＰＰＡＲＶＴＬＴＣＬＡＶＷＧＬＣＬＬＦＡＬＰＤＦＩＦＬＳＡＨＨＤＥＲＬＮＡＴＨＣＱＹＮＦＰＱＧＳＳＳＧＳＧＣＧＣＣＳＣＡＷＡＡＰＴＲＥＧＳＲＧＳＨＲＬＰＡＧＩＨＰＧＬＲＰＱＲＰＰＴＲＡＣＥＡＧＩＲＡＰＬＳＰＩ
（２６７アミノ酸のＣＸＣＲ３アイソフォーム３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ４９６８２－３）
様々な実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドは、指向性分化を介して同じ遺伝子編集を含む機能的エフェクター細胞を誘導するために、初代由来エフェクター細胞又はｉＰＳＣの選択された遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体挿入のための選択された遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座、破壊又はノックアウトされていることが意図される遺伝子座、外因性遺伝子発現の空間的及び／又は時間的制御を提供する内因性プロモータを提供する遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体挿入のための選択された遺伝子座は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。一実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体挿入のための選択された遺伝子座は、ＴＣＲ遺伝子座である。一実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体挿入のための選択された遺伝子座は、ＣＤ３８遺伝子座である。
いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体は、別個の発現構築物又は単一のバイシストロン性若しくはトリシストロン性発現カセットを介して、目的のポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドと共発現される。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体及び目的のポリペプチドをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む単一のバイシストロン性又はトリシストロン性発現カセットは、２Ａ配列を含み、その結果、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体及び更なるポリヌクレオチドは、単一のオープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）中にある。バイシストロン性設計により、タイミングと数量の両方で、例えば、単一のＯＲＦの発現のための誘導性プロモータなどを組み込むために選択され得る同一の制御メカニズムの下で、複数のポリヌクレオチドの協調された発現を可能にする。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus、ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（equine rhinitis A virus、ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Thosea asigna virus、ＴａＶ）、及びブタテシオウイルス１（porcine tescho virus-1、ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）；Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））などのアフトウイルス属、並びにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）及び脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルス属を含む、ピコルナウイルス科のメンバーで見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶに由来する２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と呼ばれることもある。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体と共発現され得る外因性ポリヌクレオチドは、ＣＡＲ、ＣＤ１６若しくはそのバリアント、サイトカイン、サイトカイン受容体、サイトカインシグナル伝達複合体、キメラ融合受容体、キメラＦｃ受容体、エンゲージャ、チェックポイント阻害剤、Ｆｃ受容体、又は抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片を含む１つ以上のポリペプチドをコードする。一実施形態では、バイシストロン性カセットにおいてＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体と共発現される外因性ポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードしない。一実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体とともにバイシストロン性カセット中で共発現される少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドは、外因性ＣＤ１６をコードする。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントを含む初代由来又は由来エフェクター細胞は、Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントを含む初代由来又は由来エフェクター細胞は、ＮＫ系統細胞である。
本出願において更に提供されるのは、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントを含むがこれに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも１つの改変又は表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なる操作のためのクローンの操作されたｉＰＳＣと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
２．外因的に導入されたＴＧＦβリダイレクタ受容体
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）は、上皮間葉転換、血管新生、腫瘍細胞運動性及び転移、がん関連線維芽細胞（cancer associated fibroblast、ＣＡＦ）増殖、並びに免疫抑制を含む腫瘍形成において複雑な役割を有する多能性免疫抑制サイトカインである。ＴＧＦβは、腫瘍微小環境においてその潜在形態で存在し、標的遺伝子グランザイム、パーフォリン、及びインターフェロンのＳｍａｄ媒介性下方制御を部分的に介して、Ｔ細胞エフェクター機能を抑制することが知られている。更に、ＴＧＦβ遺伝子発現シグネチャーの検出は、腫瘍からのＴ細胞排除及び免疫療法に対する耐性と相関する。本出願の一態様は、合成形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）シグナル伝達リダイレクタ受容体を組み込む多要素固形腫瘍標的化骨格設計を提供し、これは、本明細書において企図及び記載される他の編集の中でもとりわけ、一般的に腫瘍における、及び特に固形腫瘍におけるより良好な有効性のために、遺伝子操作されたｉＰＳＣに由来するものを含む同種異系エフェクター細胞を備える。一般に、「シグナル伝達（又はシグナル）リダイレクタ受容体」又は「ＳＲＲ」は、第１の受容体の細胞外ドメインと異なる受容体の細胞内ドメインとを接合することによって、第１の受容体（例えば、ＴＧＦβ受容体）からの細胞外ドメインのシグナル伝達を、異なる受容体（例えば、サイトカイン受容体）からの細胞内ドメインを介してリダイレクトする。ＴＧＦβＲに関連して、シグナル伝達リダイレクタ受容体は、本出願全体を通して「ＴＧＦβＲリダイレクタ」又は「ＴＧＦβＲリダイレクタ受容体」又は「ＴＧＦβシグナルリダイレクタ受容体」又は「ＴＧＦβ－ＳＲＲ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞は、ＴＧＦβリダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチドを含み、これは、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβリダイレクタ受容体は、（ｉ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン又はその断片と、（ｉｉ）ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、又はその断片と、を含む。
いくつかの実施形態では、上記のＥＣＤ及びＩＣＤを含むＴＧＦβリダイレクタ受容体は、膜貫通ドメイン（transmembrane domain、ＴＭ）を更に含む。様々な実施形態では、ＴＧＦβリダイレクタ受容体の膜貫通（ＴＭ）ドメインは、（ｉ）細胞内ドメインを提供する同じ分子に由来するか、（ｉｉ）細胞外ドメインを提供する同じ分子に由来するか、又は（ｉｉｉ）任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで修飾若しくは置換され得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβリダイレクタ受容体の細胞内ドメイン又はその断片を提供するサイトカイン受容体は、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１１Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、及びＩＬ２１Ｒのうちの少なくとも１つを含む。
一実施形態では、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１０に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１０に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１１に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１１に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１２に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１２に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメインの断片は、配列番号１３に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメインの断片は、配列番号１３に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメインの断片は、配列番号１３に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメインの断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１４に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１４に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１５に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１５に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
配列番号１０
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ
（ＴＧＦβＲのＥＣＤ）
配列番号１１
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＬＱＱＤＫＶＰＥＰＡＳＬＳＳＮＨＳＬＴＳＣＦＴＮＱＧＹＦＦＦＨＬＰＤＡＬＥＩＥＡＣＱＶＹＦＴＹＤＰＹＳＥＥＤＰＤＥＧＶＡＧＡＰＴＧＳＳＰＱＰＬＱＰＬＳＧＥＤＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ
（ＩＬ２ＲβのＩＣＤ）
配列番号１２
ＨＹＦＱＱＫＶＦＶＬＬＡＡＬＲＰＱＷＣＳＲＥＩＰＤＰＡＮＳＴＣＡＫＫＹＰＩＡＥＥＫＴＱＬＰＬＤＲＬＬＩＤＷＰＴＰＥＤＰＥＰＬＶＩＳＥＶＬＨＱＶＴＰＶＦＲＨＰＰＣＳＮＷＰＱＲＥＫＧＩＱＧＨＱＡＳＥＫＤＭＭＨＳＡＳＳＰＰＰＰＲＡＬＱＡＥＳＲＱＬＶＤＬＹＫＶＬＥＳＲＧＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱＨＩＳＬＳＶＦＰＳＳＳＬＨＰＬＴＦＳＣＧＤＫＬＴＬＤＱＬＫＭＲＣＤＳＬＭＬ
（ＩＬ１２ＲβのＩＣＤ）
配列番号１３
ＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱ
（ＩＬ１２ＲβのＩＣＤ断片）
配列番号１４
ＹＲＶＤＬＶＬＦＹＲＨＬＴＲＲＤＥＴＬＴＤＧＫＴＹＤＡＦＶＳＹＬＫＥＣＲＰＥＮＧＥＥＨＴＦＡＶＥＩＬＰＲＶＬＥＫＨＦＧＹＫＬＣＩＦＥＲＤＶＶＰＧＧＡＶＶＤＥＩＨＳＬＩＥＫＳＲＲＬＩＩＶＬＳＫＳＹＭＳＮＥＶＲＹＥＬＥＳＧＬＨＥＡＬＶＥＲＫＩＫＩＩＬＩＥＦＴＰＶＴＤＦＴＦＬＰＱＳＬＫＬＬＫＳＨＲＶＬＫＷＫＡＤＫＳＬＳＹＮＳＲＦＷＫＮＬＬＹＬＭＰＡＫＴＶＫＰＧＲＤＥＰＥＶＬＰＶＬＳＥＳ
（ＩＬ８ＲβのＩＣＤ）
配列番号１５
ＳＬＫＴＨＰＬＷＲＬＷＫＫＩＷＡＶＰＳＰＥＲＦＦＭＰＬＹＫＧＣＳＧＤＦＫＫＷＶＧＡＰＦＴＧＳＳＬＥＬＧＰＷＳＰＥＶＰＳＴＬＥＶＹＳＣＨＰＰＲＳＰＡＫＲＬＱＬＴＥＬＱＥＰＡＥＬＶＥＳＤＧＶＰＫＰＳＦＷＰＴＡＱＮＳＧＧＳＡＹＳＥＥＲＤＲＰＹＧＬＶＳＩＤＴＶＴＶＬＤＡＥＧＰＣＴＷＰＣＳＣＥＤＤＧＹＰＡＬＤＬＤＡＧＬＥＰＳＰＧＬＥＤＰＬＬＤＡＧＴＴＶＬＳＣＧＣＶＳＡＧＳＰＧＬＧＧＰＬＧＳＬＬＤＲＬＫＰＰＬＡＤＧＥＤＷＡＧＧＬＰＷＧＧＲＳＰＧＧＶＳＥＳＥＡＧＳＰＬＡＧＬＤＭＤＴＦＤＳＧＦＶＧＳＤＣＳＳＰＶＥＣＤＦＴＳＰＧＤＥＧＰＰＲＳＹＬＲＱＷＶＶＩＰＰＰＬＳＳＰＧＰＱＡＳ
（ＩＬ２１ＲβのＩＣＤ）
いくつかの実施形態では、シグナル伝達受容体は、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン又はその断片、及びサイトカイン受容体ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン又はその断片を含み、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体を形成する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達受容体は、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン又はその断片、及びサイトカイン受容体ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン又はその断片を含み、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体を形成する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達受容体は、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン又はその断片、及びサイトカイン受容体ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン又はその断片を含み、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体を形成する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達受容体は、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン又はその断片、及びサイトカイン受容体ＩＬ２１Ｒの細胞内ドメイン又はその断片を含み、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒシグナル伝達リダイレクタ受容体を形成する。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体は、配列番号１６によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（本出願を通して具体的にＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβと称される）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体は、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体は、配列番号１６に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβシグナル伝達リダイレクタ受容体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１６内に含まれる配列番号１７によって表される膜貫通ドメイン（ＴＭ）配列は、配列若しくは長さが変化していてもよく、又は別の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインで置き換えられていてもよい。
Figure 2024515920000001
 （ＴＧＦβＲ２－ＴＭ－ｔｒＩＬ１２Ｒβ）
配列番号１７
ＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮ
（ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβの例示的な可変部分）
したがって、様々な実施形態では、本明細書で提供されるＴＧＦβ－ＳＲＲのうちのいずれかは、上記の構築物設計のうちの１つ以上を使用してｉＰＳＣに導入されてもよく、ｉＰＳＣ分化時にそれらの派生細胞に導入されてもよい。人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）に加えて、本明細書に開示される少なくとも１つの操作されたモダリティを含むクローンｉＰＳＣ、クローンｉＰＳ細胞株、又はｉＰＳＣ由来細胞が提供される。また、提供されるのは、本セクションに記載されるようなＴＧＦβ－ＳＲＲを少なくとも有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源とを提供する。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、他の遺伝子モダリティの中でもとりわけ、ＴＧＦβリダイレクタ受容体（表４の「ＴＧＦβ－ＳＲＲ」）をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含む免疫細胞、ｉＰＳＣ、及びｉＰＳＣ由来細胞を提供し、派生Ｔ細胞及び派生ＮＫ細胞などの細胞は、腫瘍、特に固形腫瘍に関連する腫瘍微小環境抑制を克服又は低減するのに有用である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ｉＰＳＣの分化能並びに派生Ｔ細胞及び派生ＮＫ細胞などの派生エフェクター細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβリダイレクタ受容体をコードするポリヌクレオチド、及び／又は本明細書に記載の１つ以上の追加のゲノム編集のうちの２つ以上を含む固形腫瘍標的化骨格を含む。
また、提供されるのは、ＴＧＦβリダイレクタ受容体をコードする外因的に導入されたポリヌクレオチド、及び任意選択でＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを少なくとも有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式で大規模に大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
３．同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）発現
Ｔ細胞及びＮＫ細胞の望ましくない活性化は、しばしば、移植片対宿主病（graft-versus-host disease、ＧｖＨＤ）の発症をもたらす同種免疫反応を促進する。レシピエント個体における同種異系細胞の反応性を減少させるためにいくつかのステップがとられ得るが、このような細胞は、レシピエントの免疫系（主にＴ細胞及びＮＫ細胞）によってなお標的化され得、これらを異物として認識し、拒絶反応を導き、治療的利益を制限する。一方、例えば、Ｃｙ／Ｆｌｕ（シクロホスファミド／フルダラビン）などの化学治療を使用するリンパコンディショニングによって、同種免疫反応を低減するために宿主免疫系を調節することにより、無差別の（indiscrimitive）リンパ球枯渇及び結果としての重度に損なわれた免疫系に起因する、重度の感染に対する感受性の増加を含む、関連する血液毒性がしばしばもたらされる。免疫系の望ましくない活性化に起因する病原性状態を制御するために、様々な実施形態では、本出願は、他の成分の中でもとりわけ、同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）を含む固形腫瘍標的化骨格を提供する。本出願の別の態様は、レシピエントにおける休止細胞を温存しつつ、本明細書において企図され、記載される他の編集の中でもとりわけ、エフェクター細胞増強、並びにアロ反応性宿主ＮＫ細胞並びに４－１ＢＢ及び／又はＣＤ３８発現が上方制御されたＴ細胞（後者には病原性Ｔ細胞及び調節性Ｔ細胞が含まれる）の選択的枯渇のために４－１ＢＢ又はＣＤ３８特異的同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）を含むように遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ、及びｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を提供する。
４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、「４１ＢＢ」とも呼ばれる）に特異的なＡＤＲのいくつかの実施形態では、ＡＤＲは、活性化されたときに宿主Ｔ細胞又はＮＫ細胞上で上方制御される４－１ＢＢを標的とする細胞外ドメインと、エフェクター細胞活性化を促進するシグナル伝達ドメインと、を含む。例えば、４１ＢＢ－ＡＤＲ細胞外ドメインは、４－１ＢＢＬを含む４－１ＢＢに対する任意の好適なリガンド、４－１ＢＢを標的とする抗体（若しくはその機能的断片）、Ｆｃと４－１ＢＢＬとの融合物、又はそれらの機能的誘導体若しくは断片を含み得る。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲ細胞外ドメインは、４－１ＢＢＬ、又は４－１ＢＢを結合するのに有効なその断片を含む。別の実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲ細胞外ドメインは、配列番号１４５に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲ細胞外ドメインは、配列番号１４５に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲ細胞外ドメインは、配列番号１４５に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲ細胞外ドメインは、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。
配列番号１４５
ＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ
ＣＤ３８特異的ＡＤＲの一実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲは、ＣＤ３８結合ドメイン又はその断片を含む細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８結合ドメイン又はその断片は、抗ＣＤ３８抗体由来である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（Ｉｇ ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はその抗体断片を含む。抗体結合ドメイン又はその断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲに含まれるＣＤ３８結合ドメイン又はその断片は、それぞれ配列番号１４６及び１４７、それぞれ配列番号１４８及び１４９、それぞれ配列番号１５０及び１５１、それぞれ配列番号１５２及び１５３、それぞれ配列番号１５４及び１５５、それぞれ配列番号１５６及び１５７、それぞれ配列番号１５８及び１５９、それぞれ配列番号１６０及び１６１、それぞれ配列番号１６２及び１６３、それぞれ配列番号１６４及び１６５、それぞれ配列番号１６６及び１６７、それぞれ配列番号１６８及び１６９、それぞれ配列番号１７０及び１７１、それぞれ配列番号１７２及び１７３、それぞれ配列番号１７４及び１７５、それぞれ配列番号１７６及び１７７、それぞれ配列番号１７８及び１７９、それぞれ配列番号１８０及び１８１、それぞれ配列番号１８２及び１８３、それぞれ配列番号１８４及び１８５、それぞれ配列番号１８６及び１８７、又はそれぞれ配列番号１８８及び１８９に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、及び／又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む。例示的なＣＤ３８結合ドメインの選択されたＶＨ及びＶＬ配列は、表１Ａにおいて、番号付けされた対１～２３として提供される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲ細胞外ドメインは、表１Ａの対１～２３のうちのいずれかのＶＨ及び／又はＶＬ配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲ細胞外ドメインは、表１Ａの対１～２３のうちのいずれかのＶＨ及び／又はＶＬ配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲ細胞外ドメインは、表１Ａ中の対１～２３のうちのいずれかのＶＨ及び／又はＶＬ配列のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲ又はＣＤ３８－ＡＤＲの細胞外ドメインは、アロ反応性宿主免疫細胞の、それぞれ４－１ＢＢ又はＣＤ３８への結合時のエフェクター細胞活性化時に下流シグナル伝達を媒介する１つ以上のシグナル伝達ドメインに機能的に連結されていてもよい。特定の実施形態では、ＡＤＲは、配列番号６０若しくはその機能的断片に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の配列同一性のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζを含むか、又はＣＤ３ζ誘導体（例えば、配列番号６１若しくはその機能的断片に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の配列同一性のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζ１ＸＸ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号６０に対して少なくとも約９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号６０に対して少なくとも約９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号６０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ誘導体は、配列番号６１に対して少なくとも約９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ誘導体は、配列番号６１に対して少なくとも約９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ誘導体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。ＣＤ３ζは、エフェクターＴ又はＮＫ細胞活性化の間に下流のＩＴＡＭ由来シグナル伝達を媒介する。他のＩＴＡＭ含有シグナル伝達ドメインには、ＤＡＰ１２、Ｆｃ受容体、及び他のＣＤ３サブユニットに由来するものが含まれ得る。
配列番号６０
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
（ＣＤ３ζ）
配列番号６１
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
（ＩＴＡＭ１中に２つの変異を含有するＣＤ３ζ１ＸＸ）
いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインを含むＡＤＲの細胞内ドメインは、ＡＤＲを発現するエフェクター細胞からのサイトカイン産生を増強する１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の共刺激ドメインを更に含む。共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０などを含むがこれらに限定されない共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζを含むＡＤＲは、４－１ＢＢ内部ドメインに由来する共刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、配列番号１９０若しくはその機能的断片に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性のアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、配列番号１９０に対して少なくとも約９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、配列番号１９０に対して少なくとも約９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、配列番号１９０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＡＤＲがその細胞外ドメインに４－１ＢＢＬを含む場合、ＡＤＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢに由来しない。
Figure 2024515920000004
 （４１ＢＢ内部－ＣＤ３ζ）
ＡＤＲの細胞内ドメインは、膜貫通ドメインを介してＡＤＲの細胞外ドメインに非共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＤＲは、ＡＤＲのＣＤ３ζ成分が細胞内に位置し、４－１ＢＢ又はＣＤ３８を標的とする細胞外ドメインが細胞外に位置することを可能にする限り、任意の種類のものであり得る膜貫通ドメインを含む。他の事例では、ＡＤＲは、活性化Ｔ細胞上のそれぞれのリガンドに結合し、ＴＣＲ（例えば、ＡＤＲ－ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャタンパク質）を架橋することによって細胞傷害性を促進することができる可溶性タンパク質である。細胞外ドメインが膜貫通ドメインを有する表面タンパク質（例えば、ＣＤ４０）由来である場合、ＡＤＲは、その対応する内因性分子由来の膜貫通ドメインを含み得る。ＡＤＲ分子が１つ以上の共刺激ドメインを含むいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、共刺激ドメインを有する同じ内因性分子に由来してもよい。ＴＭの非限定的な例としては、ＣＤ３、ＣＤ８ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ４由来のものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＡＤＲは、細胞外タンパク質と膜貫通ドメインとの間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、不活性であるか、又はＡＤＲが有し得る任意の機能に関して実質的にほとんど若しくは全く寄与しない配列を含み得る。一方、他の場合には、スペーサーは、ＡＤＲの機能を増強し、かつ／又はそれを検出可能にし、かつ／又は阻害のために標的とすることができる配列を含む。特定の実施形態では、スペーサーは、ＡＤＲを発現する細胞の検出を容易にするコードされたタンパク質配列を含む。例えば、スペーサーは、抗Ｆｃ抗体を使用することなどによって、ＡＤＲを発現する細胞の表面検出を可能にするＦｃ領域又はその断片をコードし得る。特定の実施形態では、スペーサーは、潜在的な立体障害を回避するために、リガンド結合細胞外ドメインと膜との間の分離を提供する。当業者によって理解されるように、スペーサーは、物理的分離であること以外の機能が意図されるか否かにかかわらず、配列及び／又は長さが異なり得る。ＡＤＲに含まれ得る例示的なスペーサーは、当該技術分野において一般的に既知であり、ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、又は２つ以上のスペーサーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。スペーサーの長さもまた、約１５アミノ酸（amino acid、ａ．ａ．）から約３００アミノ酸以上まで変化し得る。非限定的な例示的スペーサーペプチドとしては、配列番号１４０又は１４１に対して少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号１４０又は１４１に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号１４０又は１４１に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号１４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号１４１のアミノ酸配列を含む。
配列番号１４０
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
（８８アミノ酸）
配列番号１４１
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＫＤＰＫ
（１２３アミノ酸のＩｇＧ４ヒンジ－ＩｇＧ１ ＣＨ３）
４－１ＢＢ特異的ＡＤＲの一実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１８又は配列番号１４２～１４４に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性のアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１８又は配列番号１４２～１４４に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１８又は配列番号１４２～１４４に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１４２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４１ＢＢ－ＡＤＲは、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000005
 シグナルペプチド－４１ＢＢＬ－スペーサー－ＣＤ２８（ＴＭ）－ＣＤ３ｚ（シグナルペプチド、スペーサー及びＴＭ／膜貫通ドメインは変化し得る。）
Figure 2024515920000006
 シグナルペプチド－４１ＢＢＬ－スペーサー－ＣＤ２８（ＴＭ）－ＣＤ２８（ＩＣＤ）－ＣＤ３ｚ（シグナルペプチド、スペーサー及びＴＭ／膜貫通ドメインは変化し得る。）
Figure 2024515920000007
 シグナルペプチド－４１ＢＢＬ－スペーサー－ＣＤ２８（ＴＭ）－ＣＤ３ｚ１ｘｘ（シグナルペプチド、スペーサー及びＴＭ／膜貫通ドメインは変化し得る。）
Figure 2024515920000008
 シグナルペプチド－４１ＢＢＬ－スペーサー－ＣＤ２８（ＴＭ）－ＣＤ２８（ＩＣＤ）－ＣＤ３ｚ１ｘｘ（シグナルペプチド、スペーサー及びＴＭ／膜貫通ドメインは変化し得る。）
ＣＤ３８特異的ＡＤＲの一実施形態では、ＣＤ３８特異的ＡＤＲは、配列番号１９１に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性のアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲは、配列番号１９１に対して少なくとも約９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲは、配列番号１９１に対して少なくとも約９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８－ＡＤＲは、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000009
 シグナルペプチド－抗ＣＤ３８ＶＨ－リンカー－抗ＣＤ３８ＶＬ－ＣＤ８（ＴＭ）－４１ＢＢ（内）－ＣＤ３ｚ（内）（シグナルペプチド、リンカー、及びＴＭ／膜貫通ドメインは変化し得る。）
したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、腫瘍環境での増殖の増加により、エフェクター細胞を増強させながら、活性化宿主免疫細胞を選択的に枯渇させる能力を同種異系エフェクター細胞に付与するために、骨格の他の成分の中でもとりわけ、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的なＡＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を提供する。他の選択された成分の中でも特に、４－１ＢＢ特異的ＡＤＲ又はＣＤ３８特異的ＡＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含む免疫細胞、ｉＰＳＣ、及びｉＰＳＣ由来エフェクター細胞も本出願において提供され、遺伝子操作されたＴ細胞及びＮＫ細胞を含むエフェクター細胞は、患者における腫瘍及び感染性疾患の治療のためのエフェクター細胞の同種異系使用に関連する宿主免疫系に対するアロ反応性耐性を有する。
４．ＣＤ３８ノックアウト
細胞表面分子ＣＤ３８は、多発性骨髄腫及びＣＤ２０陰性Ｂ細胞性悪性腫瘍を含む、リンパ系と骨髄系の両方に由来する多発性血液系悪性腫瘍で高度に上方制御されており、これによりがん細胞を枯渇させる抗体治療の魅力的なターゲットとなっている。抗体を介したがん細胞の枯渇は、通常、直接的な細胞アポトーシスの誘導とＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などの免疫エフェクターメカニズムの活性化との組み合わせに起因する。ＡＤＣＣに加えて、治療用抗体と連携した免疫エフェクター機構には、抗体依存性細胞媒介性食作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis、ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（complement-dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）も含まれ得る。
ＣＤ３８はまた、悪性細胞で高度に発現する以外に、形質細胞並びにＮＫ細胞、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞にも発現する。造血中、ＣＤ３８は、ＣＤ３４＋幹細胞と、リンパ系、赤血球系、及び骨髄系の系統にコミットした前駆細胞、並びに形質細胞期まで続く成熟の最終段階で発現する。タイプＩＩ膜貫通型糖タンパク質であるＣＤ３８は、受容体及びヌクレオチド代謝産物の生産に関与する多機能酵素の両方として細胞機能を果たす。酵素として、ＣＤ３８は、合成とＮＡＤ＋からＡＤＰ－リボースへの反応の加水分解を触媒し、これによって、カルシウム依存性の細胞接着プロセスに重要である、小胞体及びリソソームからのカルシウムの放出を刺激する二次メッセンジャーＣＡＤＰＲ及びＮＡＡＤＰを生成する。ＣＤ３８は受容体としてＣＤ３１を認識し、活性化されたＮＫ細胞のサイトカイン放出と細胞傷害性を調節する。ＣＤ３８は、脂質ラフトの細胞表面タンパク質と会合し、細胞質のＣａ２＋フラックスを調節し、リンパ系及び骨髄系細胞のシグナル伝達を媒介することも報告されている。
悪性腫瘍の治療では、ＣＤ３８抗原結合受容体で形質導入されたＴ細胞を全身的に使用すると、ＣＤ３４＋造血前駆細胞、単球、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞のＣＤ３８＋画分が溶解し、レシピエントの免疫エフェクター細胞機能が損なわれるため、治療応答が不完全になり、有効性が低下又は排除される。更に、ＣＤ３８特異的抗体であるダラツムマブで治療された多発性骨髄腫患者では、骨髄と末梢血の両方でＮＫ細胞の減少が観察されたが、Ｔ細胞やＢ細胞などの他の免疫細胞型は、ＣＤ３８の発現にもかかわらず影響を受けなかった（Ｃａｓｎｅｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖａｎｃｅｓ．２０１７；１（２３）：２１０５－２１１４）。
理論に束縛されるものではないが、本出願は、エフェクター細胞におけるＣＤ３８をノックアウトすることによってＣＤ３８標的化がん治療の潜在能力を最大限に活用し、それによって、フラトリサイドを通じたＣＤ３８特異的抗体及び／又はＣＤ３８抗原結合ドメインが誘導するエフェクター細胞の枯渇又は減少を克服する戦略を提供する。更に、ＣＤ３８は、Ｔ細胞やＢ細胞などの活性化リンパ球で上方制御されるため、同種異系エフェクター細胞のレシピエントでダラツムマブなどのＣＤ３８特異的抗体を使用してこれらのレシピエントリンパ球の活性化を抑制することにより、これらのエフェクター細胞に対する宿主同種拒絶反応を減少させる、かつ／又は防ぎ、それによって、エフェクター細胞の生存率と持続性を増加させる。したがって、レシピエントＴ、Ｔｒｅｇ、ＮＫ、及び／又はＢ細胞の活性化に対するＣＤ３８特異的抗体、分泌型ＣＤ３８特異的エンゲージャ、又はＣＤ３８－ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、養子細胞移入の前に、Ｃｙ／Ｆｌｕ（シクロホスファミド／フルダラビン）などの化学療法を使用するリンパ球枯渇の代替として使用することができる。
加えて、抗ＣＤ３８抗体又はＣＤ３８阻害剤の存在下でＣＤ３８－エフェクター細胞を使用してＣＤ３８＋Ｔ及びｐｂＮＫ細胞を標的とする場合、ＣＤ３８＋アロ反応性細胞の枯渇は、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＣＤ３８の基質）利用可能性を増加させ、ＮＡＤ＋消費関連細胞死を減少させ、これは、他の利点の中でもとりわけ、免疫抑制性腫瘍微小環境におけるエフェクター細胞応答をブーストし、老化、変性又は炎症性疾患における細胞若返りを支持する。
更に、本明細書で提供される戦略、すなわち、ＣＤ３８ノックアウトは、本出願において開示される固形腫瘍標的化骨格を確立するために企図される他の構成要素及びプロセスと適合性であり、それによって、追加の骨格編集を有するＣＤ３８ノックアウトを含む免疫細胞、ｉＰＳＣ及びそれから分化したエフェクター細胞を提供する。本明細書に開示されるように、様々な実施形態では、ｉＰＳＣ株又はその誘導体に含まれる固形腫瘍標的化骨格は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの少なくとも２つと、ＣＤ３８ノックアウトと、を含む。いくつかの実施形態では、提供されるＣＤ３８陰ｉＰＳＣ株は、任意選択で、本明細書に記載され、表４に示されるような１つ以上の追加の操作されたモダリティを含む。したがって、固形腫瘍標的化骨格を含むこれらのＣＤ３８陰誘導体エフェクター細胞は、ＣＤ３８標的化治療部分がエフェクター細胞とともに使用される場合、改善された代謝適応性、酸化ストレスに対する増加した耐性、並びに細胞活性化及びエフェクター機能を強化するエフェクター細胞におけるタンパク質発現プログラムの誘導を含む他の利点の中でもとりわけ、フラトリサイド及び同種拒絶反応から保護される。加えて、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体療法は、患者の造血幹細胞区画に悪影響を及ぼすことなく、患者の活性化免疫系を有意に枯渇させる。ＣＤ３８陰派生細胞は、ＣＤ３８抗体媒介性枯渇に抵抗する能力を有し、毒性コンディショニング剤を使用せずに抗ＣＤ３８抗体又はＣＤ３８－ＣＡＲと組み合わせて有効に投与することができ、したがって化学療法に基づくリンパ球枯渇を低減する、かつ／又は置換することができる。
本明細書で提供される一実施形態では、ｉＰＳＣ株におけるＣＤ３８ノックアウトは、二対立遺伝子ノックアウトである。別の実施形態では、本明細書で提供されるＣ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体若しくはそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び／又は４－１ＢＢ若しくはＣＤ３８に特異的なＡＤＲを含む１つ以上の導入遺伝子を、ＣＤ３８中の選択された位置に挿入するのと同時にＣＤ３８をノックアウトすることは、例えば、ＣＤ３８標的化ノックイン／ノックアウト（CD38-targeted knock-in/knockout、ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ）構築物によって達成され得る。構築物のいくつかの実施形態では、構築物は、ＣＤ３８遺伝子座内への位置選択的挿入のための一対のＣＤ３８標的化ホモロジーアームを含む。いくつかの実施形態では、事前に選択された標的化部位は、ＣＤ３８のエクソン内にある。本明細書で提供されるＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物は、導入遺伝子が、構築物に含まれるＣＤ３８内因性プロモータ下又は外因性プロモータ下のいずれかで発現することを可能にする。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２Ａリンカー又はＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶに由来する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と呼ばれる）をコードし、単一の翻訳から別々のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子及び／又は外因性プロモータサイレンシングのリスクを低減するために、構築物にインスレータが含まれる。ＣＤ３８－ＫＩ／ＫＯ構築物に含まれる外因性プロモータは、ＣＡＧ、又はＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモータであり得る。
様々な実施形態では、当該ｉＰＳＣは、指示された分化をして、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４＋造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆細胞（multipotent progenitor、ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージを含むがこれらに限定されない機能的な誘導造血細胞を産生することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８陰性エフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＮＫ系統細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３８陰性エフェクター細胞は、ｉＰＳＣに由来するＴ系統細胞である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ３８陰と、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβ－ＳＲＲをコードするポリヌクレオチド、及び４１ＢＢ－ＡＤＲをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つと、を含む固形腫瘍標的化骨格を含み、任意選択で、本明細書に記載の１つ以上の追加のゲノム編集を含む。
５．ＣＤ１６ノックイン
ＣＤ１６は、２つのアイソフォーム、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ；ＮＭ＿０００５６９．６）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ；ＮＭ＿０００５７０．４）として同定されている。ＣＤ１６ａは、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する、ＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。ＣＤ１６ｂはヒト好中球によって排他的に発現する。本明細書で使用されるとき、「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、又は「高親和性の非切断性ＣＤ１６」（ｈｎＣＤ１６と略される）は、様々なＣＤ１６バリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞が活性化されると、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を調節するタンパク質分解切断プロセスである外部ドメインシェディングに供される。Ｆ１７６Ｖ（いくつかの刊行物ではＦ１５８Ｖとも呼ばれる）は、高親和性を有する例示的なＣＤ１６多型バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の遺伝子操作された非切断性バージョンの一例である。Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含む操作されたＣＤ１６バリアントは、高い親和性を有し、非切断性であり、これは、国際公開第２０１５／１４８９２６号により詳細に記載されており、その完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＣＤ１６の外部ドメインがＣＤ６４の外部ドメインの少なくとも一部分で本質的に置き換えられたキメラＣＤ１６受容体は、ＡＤＣＣを実行することができるＣＤ１６受容体の望ましい高親和性及び切断不可能という特質も実現することができる。いくつかの実施形態では、キメラＣＤ１６の置換外部ドメインは、ＣＤ６４（ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ＿Ｐ１２３１４又はそのアイソフォーム又は多型バリアント）のＥＣ１、ＥＣ２、及びＥＣ３エクソンのうちの１つ以上を含む。
したがって、細胞に導入された外因性ＣＤ１６の様々な実施形態は、機能的ＣＤ１６バリアント及びそのキメラ受容体を含む。いくつかの実施形態では、機能的ＣＤ１６バリアントは、高親和性の非切断性ＣＤ１６受容体（ｈｎＣＤ１６）である。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、Ｆ１７６ＶとＳ１９７Ｐの両方を含み、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖを含み、切断領域が排除されている。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、例示的な配列である配列番号１９、２０、及び２１（各々がＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部分を含む）のうちのいずれかと比較されるとき、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、配列番号１９～２１のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列と、任意選択で、Ｆ１７６Ｖ、Ｓ１９７Ｐ、及びＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部分のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、配列番号１９～２１のうちのいずれかに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列と、任意選択で、Ｆ１７６Ｖ、Ｓ１９７Ｐ、及びＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部分のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｈｎＣＤ１６は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000010
 （３４０アミノ酸のＣＤ６４ドメインベースのコンストラクション；ＣＤ１６ＴＭ；ＣＤ１６ＩＣＤ）
Figure 2024515920000011
 （３３６アミノ酸のＣＤ６４エクソンベースのコンストラクション；ＣＤ１６ＴＭ；ＣＤ１６ＩＣＤ）
Figure 2024515920000012
 （３３５アミノ酸のＣＤ６４エクソンベースのコンストラクション；ＣＤ１６ＴＭ；ＣＤ１６ＩＣＤ）
したがって、本明細書において企図され、記載される他の編集の中でもとりわけ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む固形腫瘍標的化骨格を含むように遺伝子操作されたエフェクター細胞又はｉＰＳＣが本明細書において提供され、エフェクター細胞は、初代供給源由来の細胞であるか、若しくはｉＰＳＣ分化に由来する細胞であるか、又は遺伝子操作されたｉＰＳＣは、ｉＰＳＣに導入された外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む派生エフェクター細胞に分化することができる。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４外部ドメインの少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６に由来しない膜貫通ドメイン、刺激性ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインを含むＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（chimeric Fc receptor、ＣＦｃＲ）の形態である。
いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む初代由来又は由来エフェクター細胞は、ＮＫ系統細胞である。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む初代由来又は由来エフェクター細胞は、Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ又はエフェクター細胞に含まれる外因性ＣＤ１６又はその機能的バリアントは、結合時に下流シグナル伝達を誘発するリガンドへのこのような結合において高い親和性を有する。外因性ＣＤ１６又はその機能的バリアントに結合するリガンドの非限定例は、ＡＤＣＣ抗体又はその断片だけでなく、当該外因性ＣＤ１６のＣＤ１６又はＣＤ６４の細胞外結合ドメインを認識する二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダを含む。二重特異性、三重特異性、又は多重特異性のエンゲージャ又はバインダの例については、本出願で以下で更に説明する。このように、本出願の態様のうちの少なくとも１つは、本出願で更に詳述する状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量で、固形腫瘍標的化骨格を含む派生エフェクター細胞上で発現する外因性ＣＤ１６を介して１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、派生エフェクター細胞又はその細胞集団を提供し、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ６４の、又はＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを有するＣＤ１６の細胞外結合ドメインを含む。
いくつかの他の実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６又はそのバリアントをベースとするＣＦｃＲを含む。キメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）は、天然ＣＤ１６膜貫通及び／又は細胞内ドメインを改変又は置換することによって、非天然膜貫通ドメイン、非天然刺激ドメイン及び／又は非天然シグナル伝達ドメインを含むように産生される。本明細書で使用される「非天然」という用語は、膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインが、細胞外ドメインを提供する受容体以外の異なる受容体から派生することを意味する。本明細書での例示では、ＣＤ１６又はそのバリアントをベースとするＣＦｃＲは、ＣＤ１６に由来する膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、又はシグナル伝達ドメインを有しない。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＴ細胞受容体ポリペプチドに由来する非天然の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ４、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然の刺激／阻害ドメインを含む。いくつかの実施形態では、外因性のＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄポリペプチドに由来する非天然のシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲの一実施形態では、提供されるキメラＦｃ受容体は、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、及びＮＫＧ２Ｄポリペプチドのうちの１つに両方が由来する膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の一実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の別の例示的な実施形態は、ＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含み、ＣＦｃＲの細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含む。
上述のようなＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の様々な実施形態は、抗体又はその断片のＦｃ領域に、又は、二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャ若しくはバインダに、高い親和性で結合することができる。結合すると、キメラ受容体の刺激ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインは、エフェクター細胞の活性化及びサイトカイン分泌、並びに抗体が、又は腫瘍抗原結合成分及びＦｃ領域を有する二重特異性、三重特異性、若しくは多重特異性のエンゲージャ若しくはバインダが標的とする腫瘍細胞の殺傷を可能にする。理論に制限されることなく、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体の、非天然の膜貫通、刺激及び／若しくはシグナル伝達ドメインを通じて、又は外部ドメインへのエンゲージャの結合を通じて、ＣＦｃＲはエフェクター細胞の殺傷能力に寄与し得、エフェクター細胞の増殖及び／又は増殖の可能性を増加させる。抗体及びエンゲージャは、抗原を発現している腫瘍細胞とＣＦｃＲを発現しているエフェクター細胞を近接させることができ、これも増強された腫瘍細胞の殺傷に寄与する。二重特異性、三重特異性、多重特異性エンゲージャ又はバインダのための例示的な腫瘍抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍細胞を攻撃する際にＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを発現するエフェクター細胞を結合させるのに好適ないくつかの非限定的な例示的な二重特異性、三重特異性、多重特異性のエンゲージャ又はバインダには、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＣＤ３０、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＢＣＭＡ、ＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ、及びＣＤ１６（又はＣＤ６４）－ＩＬ１５－ＣＤ３３が含まれる。
ＮＫ細胞活性化に続いて細胞表面から切断される初代ＮＫ細胞によって発現される内因性ＣＤ１６とは異なり、派生ＮＫ細胞の様々な非切断性バージョンのＣＤ１６は、ＣＤ１６の脱落を回避し、一定の発現を維持する。誘導ＮＫ細胞では、非切断性ＣＤ１６は、改善した細胞機能の指標であるＴＮＦα及びＣＤ１０７ａの発現を増加させる。非切断性ＣＤ１６はまた、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び二重、三重、又は多重特異的エンゲージャの結合も増強する。ＡＤＣＣは、抗体でコーティングされた標的細胞へのＣＤ１６の結合を介したＮＫ細胞媒介性溶解のメカニズムである。由来ＮＫ細胞に導入されたｈｎＣＤ１６の追加の高親和性特性により、細胞療法を必要とする対象に細胞を投与する前に、ｈｎＣＤ１６を介したＡＤＣＣ抗体のＮＫ細胞へのインビトロ負荷も可能になる。本明細書において提示されるように、ｈｎＣＤ１６は、いくつかの実施形態では、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含み得、又は配列番号１９、２０、若しくは２１によって例示されるようにＣＤ６４に由来する全長又は部分長の外部ドメインを含み得、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン、及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。開示されるように、本出願はまた、本出願で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、固形腫瘍標的化骨格を含む派生ＮＫ細胞又はその細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、予めロードされたＣＤ３８抗体はダラツムマブである。いくつかの実施形態では、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む固形腫瘍標的化骨格を含む誘導ＮＫ細胞は、本明細書で提供される、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの少なくとも２つを更に含む。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの少なくとも２つを含む固形腫瘍標的化骨格、並びに外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む誘導ＮＫ細胞は、ＣＡＲを更に含む。いくつかの実施形態では、当該誘導ＮＫ細胞に、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ）、又は抗ＰＤＬ１抗体（例えば、アベルマブ）のうちの１つ以上を予めロードする。
初代ＮＫ細胞とは異なり、初代供給源（すなわち、末梢血、臍帯血、又は他のドナー組織などの天然／天然源）由来の成熟Ｔ細胞はＣＤ１６を発現しない。発現した外因性の非切断性ＣＤ１６を含むｉＰＳＣが、Ｔ系統細胞の発生生物学を損なうことなく、外因性ＣＤ１６を発現するだけでなく、獲得したＡＤＣＣメカニズムを通じて機能を実行することができる機能的な派生Ｔ細胞に分化することができることは、以前は予想外であった。派生Ｔ系統細胞で獲得したこのＡＤＣＣは、二重標的化、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法でよく発生する、低減若しくは消失したＣＡＲ－Ｔ標的抗原の発現、若しくはＣＡＲ（キメラ抗原受容体）による認識を回避する変異抗原を伴って腫瘍が再燃する、抗原エスケープを救済するためのアプローチとして更に使用され得る。当該誘導Ｔ系統細胞が、外因性ＣＤ１６（機能的バリアント及びＣＤ１６ベースのＣＦｃＲを含む）発現を介して獲得したＡＤＣＣを含み、抗体が、ＣＡＲが標的とする腫瘍抗原とは異なる腫瘍抗原を標的とする場合、抗体を使用してＣＡＲ－Ｔ抗原エスケープを救済し、ＣＡＲ－Ｔ治療でよく見られる標的腫瘍の再発又は再発を軽減又は防止できる。二重標的化を達成しながら抗原エスケープを低減及び／又は防止するこのような戦略は、１つ以上のＣＡＲを発現するＮＫ細胞にも同様に適用可能である。
したがって、本出願は、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む固形腫瘍標的化骨格を含む、派生Ｔ系統細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で得られるＴ系統細胞に含まれる固形腫瘍標的化骨格誘導体は、外因性ＣＤ１６と、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの少なくとも２つと、を含む。他の実施形態では、本明細書で得られる派生Ｔ系統細胞は、固形腫瘍標的化骨格に加えてＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、派生Ｔ系統細胞に含まれる固形腫瘍標的化骨格に含まれる外因性ＣＤ１６は、Ｆ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの他の実施形態では、固形腫瘍標的化骨格に含まれるｈｎＣＤ１６は、配列番号１９、２０又は２１によって例示されるような、ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメインを含むか、又は非天然の膜貫通ドメイン、刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つを更に含み得る。本明細書で説明されているように、そのような派生Ｔ系統細胞は、抗体の治療効果を高めるためにＡＤＣＣによって媒介されたモノクローナル抗体で腫瘍を標的とする獲得されたメカニズムを有する。開示されるように、本出願はまた、以下で更に詳しく説明するように、状態、疾患、又は感染症の治療における治療的使用に十分な量の１つ以上の予め選択されたＡＤＣＣ抗体が予めロードされた、固形腫瘍標的化骨格を含む派生Ｔ系統細胞又はその細胞集団を提供する。
更に提供されるように、固形腫瘍標的化骨格と、任意選択でＣＡＲと、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント（表４中の「ＣＤ１６外」）と、を含む細胞又はその集団は、本明細書に記載される、及び／又は表４に示される１つ以上の追加の操作されたモダリティを更に含み得る。本出願において更に提供されるのは、他の遺伝子モダリティの中でもとりわけ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含む固形腫瘍標的化骨格を含むが、これに限定されない、本明細書で提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
６．外因的に導入されたサイトカインシグナル伝達複合体
臨床的に適切なサイトカインの全身的高用量投与を回避することにより、そのような行為による用量制限毒性のリスクが減少し、サイトカイン媒介性細胞自律性が確立される。可溶性サイトカインを追加投与する必要なしにリンパ球自律性を達成するために、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はそれらの対応する受容体のうちの１つ以上の部分長又は全長ペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体が固形腫瘍標的化骨格の一部として細胞に導入されて、サイトカイン自体の発現を伴って又は伴わずに、サイトカインのシグナル伝達を可能にし、それによって、サイトカインの毒性のリスクを低減して、細胞成長（growth）、増殖（proliferation）、増殖（expansion）、及び／又はエフェクター機能を維持又は改善し得る。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達のための導入されたサイトカイン及び／又はそのそれぞれの天然又は改変された受容体（シグナル伝達複合体）は、細胞表面上で発現する。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は誘導可能である。いくつかの実施形態では、サイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン／サイトカイン受容体の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、又はｍＲＮＡを含むＲＮＡが保有する発現構築物を介する。
ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８及びＩＬ２１を含むが、これらに限定されない、１つ、２つ、又はそれ以上のサイトカインのシグナル伝達のためのタンパク質複合体を細胞に導入するための様々な構築物設計が、本明細書で提供される。例えば、シグナル伝達複合体がＩＬ１５に対するものである実施形態では、膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ１５受容体に対してネイティブであり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換され得る。様々な実施形態では、サイトカインシグナル伝達複合体は、ＩＬ１５の全長又は部分長、及びＩＬ１５受容体の全長又は部分長（IL15 receptor、ＩＬ１５Ｒ）を含むＩＬ１５受容体融合体（IL15 receptor fusion、ＩＬ１５ＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のトランス提示を模倣する自己切断ペプチドを使用して、ＩＬ１５のシス提示を排除することなく共発現される。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαはリンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合されており、ＩＬ１５のシス提示を排除することなくトランス提示を模倣し、ＩＬ１５が膜結合されることを確保する。他の実施形態では、短縮された細胞内ドメインを持つＩＬ１５Ｒαは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、ＩＬ１５のトランス提示を模倣し、ＩＬ１５の膜結合を維持し、シス提示及び／又はその細胞内ドメインを介した正常ＩＬ１５Ｒによって媒介される他の可能性のあるシグナル伝達経路を排除する。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαは、国際公開第２０１９／１９１４９５号及び同第２０１９／１２６７４８号（各々の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、細胞内ドメインを含まないＩＬ１５（ＩＬ１５Δ）に融合される。
様々な実施形態では、短縮された構築物は、配列番号２２に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、配列番号２２に対して少なくとも９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαの一実施形態では、構築物は、配列番号２２の最後の４アミノ酸残基（ＫＳＲＱ）を含まず、配列番号２３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、配列番号２３に対して少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、配列番号２３に対して少なくとも９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒαは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000013
 （３７９アミノ酸；シグナル及びリンカーペプチドに下線を付す）
Figure 2024515920000014
 （３７５アミノ酸；シグナル及びリンカーペプチドに下線を付す）
更に他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒαの細胞質ドメインは、ＩＬ１５を備えたエフェクター細胞の自律的特質に悪影響を与えることなく省略することができる。他の実施形態では、ＩＬ１５Ｒα全体が除去されるが、一端でＩＬ１５と融合し、他で膜貫通ドメインと融合し（ｍｂ－Ｓｕｓｈｉ）、任意選択で、Ｓｕｓｈｉドメインと膜貫通ドメインとの間にリンカーがあるＳｕｓｈｉドメインは例外である。融合したＩＬ１５／ｍｂ－Ｓｕｓｈｉは、膜結合タンパク質の膜貫通ドメインを介して細胞表面に発現する。ＩＬ１５の望ましいトランス提示のみが保持されている場合、シス提示を含む、ＩＬ１５Ｒαを介した不要なシグナル伝達が排除される。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む成分は、配列番号２４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む成分は、配列番号２４に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む成分は、配列番号２４に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｕｓｈｉドメインと融合したＩＬ１５を含む成分は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000015
 （２４２アミノ酸；シグナル及びリンカーペプチドに下線を付す）
他の実施形態では、天然又は改変されたＩＬ１５Ｒβは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合され、構成的シグナル伝達を可能にし、ＩＬ１５膜結合及びトランス提示を維持する。他の実施形態では、天然又は改変された共通受容体γＣは、サイトカインの構成的シグナル伝達及び膜結合トランス提示のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ１５に融合される。共通受容体γＣはまた、共通ガンマ鎖又はＣＤ１３２とも呼ばれ、ＩＬ２受容体サブユニットガンマ又はＩＬ２ＲＧとしても知られている。γＣは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５及びＩＬ２１受容体を含むが、これらに限定されない、多くのインターロイキン受容体の受容体複合体に共通するサイトカイン受容体サブユニットである。他の実施形態では、ＩＬ１５の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ１５Ｒβは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのに有用である。
他の様々な実施形態では、サイトカインシグナル伝達複合体は、ＩＬ７の全長又は部分長、及びＩＬ７受容体の全長又は部分長を含むＩＬ７受容体融合体（ＩＬ７ＲＦ）を含む。膜貫通（ＴＭ）ドメインは、ＩＬ７受容体に対して天然であり得るか、又は任意の他の膜結合タンパク質の膜貫通ドメインで改変若しくは置換されてもよい。一実施形態では、天然（又は野生型）又は改変ＩＬ７Ｒは、リンカーを介してＣ末端でＩＬ７に融合されてもよく、構成的シグナル伝達を可能にし、膜結合ＩＬ７を維持する。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号２５に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％同一のアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメイン、シグナルペプチド及びリンカーは柔軟であり、長さ及び／又は配列は様々である。いくつかの実施形態では、ＩＬ７構築物は、配列番号２５に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメイン、シグナルペプチド及びリンカーは柔軟であり、長さ及び／又は配列は様々である。いくつかの実施形態では、ＩＬ７構築物は、配列番号２５に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメイン、シグナルペプチド及びリンカーは柔軟であり、長さ及び／又は配列は様々である。いくつかの実施形態では、ＩＬ７は、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000016
 （シグナルペプチド－ＩＬ７－リンカー－ＩＬ７Ｒ；膜貫通ドメイン（ＴＭ）、シグナルペプチド及びリンカーは、長さ及び配列は様々であり得る）
別の実施形態では、天然又は改変された共通受容体γＣは、構成的及び膜結合サイトカインシグナル伝達複合体のために、リンカーを介してＣ末端でＩＬ７に融合される。更に、ＩＬ７の不在下でホモ二量体を形成する操作されたＩＬ７Ｒは、サイトカインの構成的シグナル伝達を生成するのにも有用である。
当業者は、上述のシグナルペプチド及びリンカー配列が例示であり、シグナルペプチド又はリンカーとしての使用に好適なそれらのバリエーションを決して限定しないことを理解するであろう。当業者には既知であり利用可能な多くの好適なシグナルペプチド又はリンカー配列が存在する。当業者は、シグナルペプチド及び／又はリンカー配列が、シグナルペプチドによって導かれるか、又はリンカーによって連結される機能性ペプチドの活性を変えることなく、別の配列で置換され得ることを理解する。
ＣＡＲと外因性サイトカイン及び／又はサイトカイン受容体シグナル伝達（サイトカインシグナル伝達複合体、又は「ＩＬ」）の両方を含むｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞では、ＣＡＲとＩＬは別々の構築物で発現され得るか、ＣＡＲとＩＬの両方を含むバイシストロン性構築物で共発現され得る。いくつかの更なる実施形態において、シグナル伝達複合体は、自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現構築物の５’末端又は３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、ＩＬシグナル伝達複合体（例えば、ＩＬ７シグナル伝達複合体）及びＣＡＲは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内にあってもよい。一実施形態では、シグナル伝達複合体は、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲ構築物に含まれる。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲが発現される場合、自己切断性２Ａペプチドは、発現されたＣＡＲ及びＩＬが解離することを可能にし、次いで、解離したＩＬは、膜貫通ドメインが細胞膜に固定された状態で細胞表面に提示され得る。ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲのバイシストロン性設計により、タイミングと数量の両方で、例えば、単一のＯＲＦの発現のための誘導性プロモータ又は時間的若しくは空間的特異性を持つプロモータなどの、組み込むために選択され得る同一の制御メカニズムの下で、ＣＡＲとＩＬのシグナル伝達複合体の協調された発現を可能にする。自己切断ペプチドは、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus、ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（equine rhinitis A virus、ＥＲＡＶ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Thosea asigna virus、ＴａＶ）、及びブタテシオウイルス１（porcine tescho virus-1、ＰＴＶ－Ｉ）（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ＭＬ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８２，１０２７－１０１（２００１）；Ｒｙａｎ，ＭＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，２７２７－２７３２（２００１））などのアフトウイルス属、並びにタイロウイルス（例えば、タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス）及び脳心筋炎ウイルスなどのカルジオウイルス属を含む、ピコルナウイルス科のメンバーで見出される。ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、及びＴａＶに由来する２Ａペプチドは、それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と呼ばれることもある。
本明細書に開示されるバイシストロン性ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲは、本明細書において提供される任意の他のサイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１の発現も企図される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ又はＩＬ－２Ａ－ＣＡＲは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５及びＩＬ２１のうちの１つ以上の発現のためのものである。
いくつかの実施形態では、表４の遺伝子型のうちのいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの破壊、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、抗体、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含み得る。
したがって、様々な実施形態では、サイトカインＩＬ１５若しくはＩＬ７及び／又はそれらの受容体は、上記の構築物設計のうちの１つ以上を使用してｉＰＳＣに導入されてもよく、ｉＰＳＣ分化時にそれらの派生細胞に導入されてもよい。更に、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４１ＢＢ－ＡＤＲをコードするポリヌクレオチド、並びに任意選択で、サイトカインシグナル伝達複合体及び／又は本明細書中に開示されるような１つ以上の操作されたモダリティをコードするポリヌクレオチドのうちの２つ以上を含む固形腫瘍標的化骨格を含む、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、クローンｉＰＳＣ、クローンｉＰＳ細胞株、又はｉＰＳＣ由来細胞が、本明細書中に提供される。また、提供されるのは、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβ－ＳＲＲ及び４１ＢＢ－ＡＤＲをコードするポリヌクレオチド、並びに任意選択でサイトカインシグナル伝達複合体及び／又は１つ以上の操作されたモダリティをコードするポリヌクレオチドのうちの２つ以上を含む固形腫瘍標的化骨格を有するソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、サイトカインシグナル伝達複合体は、本セクションで説明するように、細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含み、細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
７．ＨＬＡ－Ｉ－及びＨＬＡ－ＩＩ－の欠損
同種拒絶の問題を回避するために、複数のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩタンパク質は、同種異系レシピエントの組織適合性のために一致している必要がある。本明細書で提供されるのは、ＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩタンパク質の発現が排除又は実質的に減少したｉＰＳＣ細胞株及びそれから分化したその派生細胞である。ＨＬＡクラスＩ欠損は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、又はベータ２ミクログロブリン（beta-2 microglobulin、Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、及びタパシンを含むが、これらに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の欠失若しくは破壊によって達成できる。例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子は、全てのＨＬＡクラスＩヘテロ二量体の細胞表面発現に不可欠な共通のサブユニットをコードする。Ｂ２Ｍ陰性細胞はＨＬＡ－Ｉ欠損である。ＨＬＡクラスＩＩ欠損は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、及びＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡクラスＩＩ関連遺伝子の機能的欠失又は破壊によって達成され得る。ＣＩＩＴＡは転写コアクチベータであり、クラスＩＩタンパク質の発現に必要な転写因子ＲＦＸ５の活性化を通じて機能する。ＣＩＩＴＡ陰性細胞はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。したがって、本出願は、例えば、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡ発現の欠如によって、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損を含むｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞を提供し、取得された派生エフェクター細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）適合の必要性を排除して宿主の（同種異系）Ｔ細胞による認識と殺傷を回避することによって、同種異系細胞治療を可能にする。
更に、ＨＬＡクラスＩ発現の欠如が、宿主ＮＫ細胞による溶解を引き起こす。したがって、活性化されたＣＤ３８発現宿主ＮＫ細胞を除去するためのＣＤ３８コンディショニングの上述のアプローチに加えて、この「自己喪失」応答を克服するために、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ又は他の非古典的ＨＬＡ－Ｉタンパク質を任意選択でノックインして、ＮＫ細胞認識及び操作されたｉＰＳＣ由来のＨＬＡ－Ｉ欠損エフェクター細胞の死滅を回避することができる。一実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＨＬＡ－Ｇノックインを更に含む。
代替的に、一実施形態では、提供されるＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、ＣＤ５８ノックアウト及びＣＤ５４ノックアウトの一方又は両方を更に含む。ＣＤ５８（又はＬＦＡ－３）及びＣＤ５４（又はＩＣＡＭ－１）は、シグナル依存性細胞相互作用を開始し、免疫細胞を含む、細胞の遊走を促進する接着タンパク質である。ＣＤ５８及び／又はＣＤ５４破壊が、同種異系ＮＫ細胞殺傷に対するＨＬＡ－Ｉ欠損ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞の感受性を効果的に低下させることが以前に示された。ＣＤ５８ノックアウトは、ＣＤ５４ノックアウトよりも同種異系ＮＫ細胞活性化の低減においてより高い効率をもたらし、ＣＤ５８及びＣＤ５４の両方の二重ノックアウトは、ＮＫ細胞活性化の最も増強された低減をもたらすことが示された。いくつかの観察において、ＣＤ５８及びＣＤ５４二重ノックアウトは、「自己喪失」効果を克服することにおいて、ＨＬＡ－Ｉ欠損細胞に対するＨＬＡ－Ｇ過剰発現よりも更に効果的である。
本明細書で提供されるように、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４１ＢＢ－ＡＤＲのうちの２つ以上を含む固形腫瘍標的化骨格を含み、当該細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。いくつかの実施形態では、当該ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５８陰性である。いくつかの他の実施形態では、当該ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５４陰性である。更にいくつかの他の実施形態では、当該ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生細胞は、ＣＤ５４陰性及びＣＤ５８陰性である。更に、本明細書に記載される固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣ及びその派生細胞のいくつかの実施形態では、当該細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを有する。本明細書に記載される固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣ及びその派生細胞のいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５４陰性である。本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格、並びに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、及びＣＡＲを含むｉＰＳＣ及びその派生細胞の更にいくつかの他の実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ欠損であり、ＣＤ５８陰性及びＣＤ５４陰性の両方である。
いくつかの実施形態では、活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御された表面タンパク質を標的とする不活性化ＣＡＲを発現させることによって、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩの欠損のための操作をバイパスするか又はインタクトなままにして、同種拒絶反応を回避することができる。いくつかの実施形態では、活性化されたレシピエント免疫細胞において上方制御される表面タンパク質には、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、又はＣＤ４０Ｌが含まれるが、これらに限定されない。細胞がそのような不活性化ＣＡＲを発現する場合、細胞は、ＣＡＲによって標的化される同じ表面タンパク質を発現しないか、又はそのノックアウトを有することが好ましい。いくつかの実施形態では、不活性化ＣＡＲは、ＣＤ３８－ＣＡＲ、ＣＤ２５－ＣＡＲ、ＣＤ６９－ＣＡＲ、ＣＤ４４－ＣＡＲ、４－１ＢＢ－ＣＡＲ、ＯＸ４０－ＣＡＲ、及びＣＤ４０Ｌ－ＣＡＲのうちの少なくとも１つを含む。
本出願において更に提供されるのは、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格及びＨＬＡ修飾（表４の「ＨＬＡ」：ＨＬＡ－Ｅ又はＨＬＡ－Ｇノックインを伴う若しくは伴わない、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトを伴うＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損）を含むがこれらに限定されない、本明細書において提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、派生ＮＫ及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供する。
８．細胞表面キメラ融合受容体（ＣＦＲ）
ＣＦＲを発現するように操作されたエフェクター細胞は、エフェクター細胞が治療特性を増強するために選択されたアゴニストとのＣＦＲ結合を介して適切なシグナル伝達カスケードを開始することを可能にする。このような増強されたエフェクター細胞治療特性としては、増加された活性化及び細胞傷害性、獲得された二重標的化能力、延長された持続性、改善された輸送及び腫瘍浸潤、腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞をプライミングする、活性化させる又は動員する増強された能力、免疫抑制に抵抗する増強された能力、腫瘍抗原エスケープをレスキューする改善された能力、並びに／又は制御された細胞シグナル伝達フィードバック、代謝及びアポトーシスが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、いくつかの実施形態では、本出願は、他の編集の中でもとりわけ、外部ドメインと、膜貫通ドメインと、内部ドメインと、を含む、ＣＦＲであって、当該外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインがいかなる小胞体（endoplasmic reticulum、ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない、ＣＦＲを含む、ｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞を提供する。ＣＦＲの外部ドメインは、エンゲージャに結合するとシグナル伝達を開始するためのものであり、膜貫通ドメインは、ＣＦＲの膜固定のためのものであり、内部ドメインは、腫瘍殺傷、持続性、移動性、分化、ＴＭＥの打ち消し、及び／又は制御されたアポトーシスを含むがこれらに限定されない細胞治療特性を増強するために選択されるシグナル伝達経路を調節する（すなわち、活性化又は不活性化させる）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＦＲからのＥＲ保持シグナルの排除は、発現された場合に、それ自体によるＣＦＲ細胞表面提示を可能にし、ＣＦＲからのエンドサイトーシスシグナルの排除は、ＣＦＲ内在化及び表面下方制御を減少させる。ＥＲ保持もエンドサイトーシスシグナルも有しないドメイン成分を選択するか、又は分子工学ツールを用いてＣＦＲの選択された成分からＥＲ保持若しくはエンドサイトーシスシグナルを除去することが重要である。加えて、本明細書におけるいくつかの実施形態によって提供されるＣＦＲのドメインはモジュール式であり、これは、ＣＦＲの所与の内部ドメインについては、ＣＦＲの外部ドメインが、当該ＣＦＲとともに使用される選択されたアゴニスト、例えば抗体、ＢｉＴＥ、ＴＲｉｋＥ、又は任意の他のタイプのエンゲージャの結合特異性に応じて切り替え可能であり、所与の外部ドメイン及び特異性適合アゴニストについては、内部ドメインが、活性化される所望のシグナル伝達経路に応じて切り替え可能であることを意味する。加えて、いくつかの実施形態による膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインが小胞体（ＥＲ）保持シグナルもエンドサイトーシスシグナルも含まない限り、所与の外部ドメイン及び／又は所与の内部ドメインについて切り替え可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞に適用可能なＣＦＲの外部ドメインは、細胞－細胞シグナル伝達又は相互作用に関与するタンパク質の細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアント、若しくは組み合わせ及びキメラの細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、少なくともアゴニスト、例えば、当該ＣＦＲの外部ドメインに含まれるエピトープに特異的な結合ドメインを含む抗体又はエンゲージャ（例えば、ＢｉＴＥ、ＢｉＫＥ又はＴｒｉＫＥ）によって認識される。いくつかの実施形態では、ＣＦＲ発現細胞とともに使用される抗体又はエンゲージャは、当該ＣＦＲの少なくとも１つの細胞外エピトープに結合し、ＣＦＲは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせた／キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャは、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、若しくはＲＯＲ１を含む少なくとも１つの腫瘍抗原を認識する。ＣＦＲ外部ドメインのいくつかの実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してＣＦＲ外部ドメインから除去若しくは排除される。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ３ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的ＣＤ３ベースのアゴニストは、ＣＤ３×ＣＤ１９、ＣＤ３×ＣＤ２０、ＣＤ３×ＣＤ３３、ブリナツモマブ、カツマキソマブ、エルツマキソマブ、ＲＯ６９５８６８８、ＡＦＭ１１、ＭＴ１１０／ＡＭＧ１１０、ＭＴ１１１／ＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ－５６５、ＡＭＧ３３０、ＭＴ１１２／ＢＡＹ２０１０１１２、ＭＯＲ２０９／ＥＳ４１４、ＭＧＤ００６／Ｓ８０８８０、ＭＧＤ００７、及び／又はＦＢＴＡ０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＮＫＧ２Ｃベースのアゴニストを利用するために、ＮＫＧ２Ｃ若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なＮＫＧ２Ｃベースのアゴニストは、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３、ＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ１９、及び／又はＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ２０三重特異性エンゲージャを含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ２８ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ２８若しくはその任意の機能的バリアントの細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なＣＤ２８ベースのアゴニストは、１５Ｅ８、ＣＤ２８．２、ＣＤ２８．６、ＹＴＨ９１３．１２、３７．５１、９Ｄ７（ＴＧＮ１４１２）、５．１１Ａ１、ＡＮＣ２８．１／５Ｄ１０、及び／又は３７４０７のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＦＲの外部ドメインは、ＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストを利用するために、ＣＤ１６、ＣＤ６４、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態の細胞外部分の全長又は部分長を含む。抗体又はエンゲージャを含むがこれらに限定されない非限定的な例示的なＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニストは、ＩｇＧ抗体、又はＣＤ１６若しくはＣＤ６４ベースのエンゲージャを含む。ＩｇＧ抗体のＦｃ部分がＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのＣＦＲに結合すると、それは、ＣＦＲの内部ドメインに含まれるシグナル伝達ドメインによって付与される他の増強された治療特性とともに、ＣＦＲ発現細胞における抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化させる。非限定的な例示的なＣＤ１６又はＣＤ６４ベースのアゴニスト（抗体又はエンゲージャが挙げられるが、これらに限定されない）は、ＣＤ１６×ＣＤ３０、ＣＤ６４×ＣＤ３０、ＣＤ１６×ＢＣＭＡ、ＣＤ６４×ＢＣＭＡ、ＣＤ１６－ＩＬ－ＥＰＣＡＭ若しくはＣＤ６４－ＩＬ－ＥＰＣＡＭ、ＣＤ１６－ＩＬ－ＣＤ３３、又はＣＤ６４－ＩＬ－ＣＤ３３のうちの少なくとも１つを含み、ＴｒｉＫＥにおける「ＩＬ」は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、又はそれらの任意の機能的バリアント若しくは組み合わせ／キメラ形態を含む少なくとも１つのサイトカインの全部又は一部分を含む。
概して、膜貫通ドメインは、生体膜（例えば、細胞又は細胞小胞の膜）のリン脂質二重層などの膜において熱力学的に安定である三次元タンパク質構造である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＣＦＲの膜貫通ドメインは、単一のアルファヘリックス、いくつかの膜貫通アルファヘリックスの安定な複合体、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータヘリックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、ＣＦＲの膜貫通ドメインは、膜内にある「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」の全て又は一部分を含む。本明細書で使用されるとき、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、膜に及び／又は膜内に位置するタンパク質である。本発明のいくつかの実施形態によるＣＦＲに含まれる膜貫通ドメインを提供するのに好適な膜貫通タンパク質の例としては、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＦＲに含まれる膜貫通ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１３７、ＣＤ１６６、ＦｃεＲＩγ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔ細胞受容体（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、グリコホリンＡ、グリコホリンＤ、又はそれらの組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。ＣＦＲ膜貫通ドメインのいくつかの実施形態では、ＥＲ保持及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作を使用して除去される。様々な実施形態では、ＥＲ保持シグナル及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してＣＦＲ膜貫通ドメインから除去若しくは排除される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ８、ＩＣＯＳ、又はＣＤ４の膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＦＲの内部ドメインは、選択された細胞内シグナル伝達経路を活性化する少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＦＲ内部ドメインの様々な実施形態では、ＥＲ保持及びエンドサイトーシスシグナルの両方が存在しないか、又は遺伝子操作法を使用してそれから除去若しくは排除される。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、少なくとも細胞傷害性ドメインを含む。いくつかの他の実施形態では、内部ドメインは、任意選択で細胞傷害性ドメインに加えて、共刺激ドメイン、持続性シグナル伝達ドメイン、死誘導シグナル伝達ドメイン、腫瘍細胞制御シグナル伝達ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、ＣＤ３ζ、２Ｂ４、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの少なくとも全長又は一部分を含む。一実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、配列番号２６に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される改変ＣＤ３ζを含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、配列番号２６に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、配列番号２６に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの細胞傷害性ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000017
 （．．．ＩＴＡＭ１．．．ＩＴＡＭ２．．．ＩＴＡＭ３．．．）
いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、細胞傷害性シグナル伝達ドメインに加えて共刺激ドメインを更に含む内部ドメインを含む。ＣＦＲでの使用に好適な共刺激ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＴＬＡ－４、若しくはＮＫＧ２Ｄ、又はそれらの任意の組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含むが、これらに限定されない。ＣＦＲのいくつかの実施形態では、その共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、若しくはそれらの組み合わせのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲは、ＣＤ２８の共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ（「２８ζ」とも称される）の細胞傷害性ドメインと、を含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインの－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ部分は、配列番号２７に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインの－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ部分は、配列番号２７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインの－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ部分は、配列番号２７に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＦＲの内部ドメインの－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ部分は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。
配列番号２７
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱ
ＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＦＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＦＳＥＩＧＭＫＧＥ
ＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＦＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＦＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
（１５３アミノ酸のＣＤ２８共刺激＋ＣＤ３ζＩＴＡＭ）
いくつかの実施形態において、ＣＦＲは、細胞傷害性シグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインに加えて、持続性シグナル伝達ドメインを更に含む内部ドメインを含む。ＣＦＲでの使用に好適な持続性シグナル伝達ドメインとしては、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、又はそれらの組み合わせなどのサイトカイン受容体の内部ドメインの全部又は一部が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ＥＧＦＲなどの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の内部ドメインは、腫瘍細胞制御を提供するか、又はＦＡＳなどの腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）は、制御された細胞死を提供する。
いくつかの例示的な設計では、ＣＦＲは、１つのＣＤ３サブユニットの外部ドメインを含み、いくつかの他の設計では、ＣＦＲは、ＣＤ３δ又はＣＤ３γ（それぞれ、配列番号２８又は配列番号２９）の外部ドメインと連結されたＣＤ３εの外部ドメインを含む単鎖ヘテロ二量体外部ドメインを含む。単鎖ヘテロ二量体外部ドメインにおけるリンカーのタイプ及び長さは、様々であり得る。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、配列番号２８又は２９に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、配列番号２８又は２９に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、配列番号２８又は２９に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000018
 （３ε－リンカー－３δ；リンカー配列及び長さは様々であり得る）
Figure 2024515920000019
 （３ε－リンカー－３γ；リンカー配列及び長さは様々であり得る）
本明細書に記載される様々な構築物中の細胞表面発現ＣＦＲ（ＣＤ３ベースのＣＦＲを含み、ｃｓ－ＣＤ３とも呼ばれる）は、選択された結合特異性を有する分子と結合するための細胞表面トリガー受容体として機能することができ、この分子には、抗体、エンゲージャ、及び／又はＣＡＲ（キメラ抗原受容体）が含まれる。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含む細胞は、任意選択で、１つ以上のＣＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む。当該細胞は、ヒト細胞及び非ヒト細胞、多能性細胞若しくは非多能性細胞、免疫細胞若しくは免疫調節細胞、ＡＰＣ（antigen presenting cell、抗原提示細胞）若しくはフィーダー細胞、初代供給源（例えば、ＰＭＢＣ）由来の細胞、又は培養若しくは操作された細胞（例えば、細胞株、細胞、及び／又はｉＰＳＣから分化した派生細胞）由来の細胞を含む、任意のタイプの細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格、並びに任意選択でＣＤ３８ノックアウト、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、及び１つ以上のＣＦＲを含む細胞は、初代若しくは派生ＣＤ３４細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、又はＢ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の遺伝子モダリティをコードするポリヌクレオチドを含む派生細胞は、本明細書に記載の１つ以上の遺伝子モダリティをコードするポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣを分化させることによって得られるエフェクター細胞である。
本出願において更に提供されるのは、他の遺伝子モダリティの中でもとりわけ、本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格及びＣＦＲを含むが、これに限定されない、本明細書で提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
９．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現
遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞に適用可能なものは、当該技術分野で知られている任意のＣＡＲの設計であり得る。ＣＡＲは、概して、標的結合領域（例えば、抗原認識ドメイン）、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを含む外部ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び／又はスペーサーを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメインは、ＣＡＲを発現するエフェクター細胞を活性化するシグナル伝達ペプチドを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ドメイン（又は細胞内ドメイン）のシグナル伝達ペプチドは、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＳ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、又はＮＫＧ２Ｄのポリペプチドの全長又は少なくとも一部分を含む。一実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ペプチドは、ＣＤ３ζの少なくとも１つのＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的なＮ末端シグナルペプチドとしては、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ（配列番号３０、ＣＤ８ａｓｐ）若しくはＭＤＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲ（配列番号３１、ＩｇＫｓｐ）、又は当該技術分野で公知の任意のシグナルペプチド配列若しくはその機能的バリアントが挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗原認識ドメインは、抗原に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、当該ＣＡＲを発現するＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞を活性化するのに適している。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ特異的シグナル伝達成分を含むＮＫ細胞特異的である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫＴ特異的シグナル伝達成分を含むＮＫＴ細胞特異的である。特定の実施形態では、当該Ｔ細胞は、本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格を含むＣＡＲ発現ｉＰＳＣから派生し、派生Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。ある実施形態では、当該ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格を含むＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。ある実施形態では、当該ＮＫＴ細胞は、本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格を含むＣＡＲ発現ｉＰＳＣに由来する。
様々な実施形態では、抗原認識領域は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇＧ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖抗体（Ｉｇ－ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性、多重特異性、若しくは多量体抗体、又はその断片であってもよい。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体のイディオトープへの結合に特異的であり、イディオトープは、抗体の抗原決定基である。二重特異性抗体は、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）又はＢｉＫＥ（二重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよく、多重特異性抗体は、ＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）であってもよい。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、Ｆａｂｃ、ｐＦｃ、Ｆｄ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）２、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ）、ラクダ重鎖ＩｇＧ及びＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）断片、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持する他の抗体断片が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体又はその断片の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３（Ｈ－ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体のＨ－ＣＤＲを含むＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖のＣＤＲ（Ｌ－ＣＤＲ）を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、疾患又は病原体と関連する抗原を特異的に結合する。いくつかの実施形態では、疾患関連抗原は腫瘍抗原であり、腫瘍は液体腫瘍又は固形腫瘍であってよい。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、急性及び慢性白血病（急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia、ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia、ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin lymphoma、ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない、血液悪性腫瘍の抗原を標的とする。
固形がん抗原を標的とするＣＡＲのいくつかの実施形態では、抗原は、肉腫及びがん腫に関連する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ標的化に適した固形がんは、限定されないが、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、乳がん、乳肺がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃（gastric）／胃（stomach）がん、頭頸部がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、転移性がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、唾液腺がん、皮膚がん、精巣腫瘍、甲状腺腫瘍、尿路上皮がん、及び子宮／子宮内膜がんを含む。より詳細には、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腺がん、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、気管支原性がん、胆管がん、軟骨肉腫、絨毛がん、結腸がん、ユーイング腫瘍、線維肉腫、胆嚢がん、肝細胞がん、肝がん、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ性悪性疾患、髄様がん、髄様甲状腺がん、メラノーマ、中皮腫、粘液肉腫、非小細胞肺がん、骨肉種、乳頭腺がん、乳頭がん、乳頭甲状腺がん、褐色細胞腫皮脂腺がん、腹膜がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、肉腫、精上皮腫、扁平上皮がん、汗腺がん、滑膜肉腫、滑膜腫、及びウィルムス腫瘍に関連する抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、聴神経鞘腫、星状膠細胞腫、ＣＮＳリンパ種、上衣腫、血管芽腫、胚細胞腫、膠腫（脳幹膠腫及び混合膠腫を含む）、神経膠芽細胞腫（多形性神経膠芽細胞腫としても知られる）、髄芽細胞腫、髄膜種（menangioma）、神経芽細胞種、乏突起神経膠腫、松果体腫、網膜芽腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫、及び脳転移を含むが、これらに限定されないＣＮＳ腫瘍の抗原を標的とする。
ＣＡＲによって標的化され得る抗原の非限定的な例としては、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、８Ｈ９、９Ｄ７、ＡＣＰＰ、αアクチニン－４（actinin-4、ＡＣＴＮ４）、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＲＢ３、ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ－４、ＡＬＫ、ＡＬＰＰ、ＡＬＰＰＬ２、アンドロゲン受容体、ＡＳＧＲ１（アシアロ糖タンパク質受容体１）、ＡＳＧＲ２（アシアロ糖タンパク質受容体２）、ＡＸＬ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＢＡＧＥ、β－カテニン、ＢＣＲ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂｉｇｈ３、ＢＩＮＧ－４、ＢＯＲＩＳ、ＢＲＣＡ１／２、ＢＳＴ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ／ＣＡ９）、ＣＡ１２５、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体１（ＣＣＲ１）、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５）、カルシウム活性化塩素チャネル２（ＣＬＣＡ４）、炭水化物（Ｌｅ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２０７、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＤＣｌ２７、ＣＤＨ３（ｐ－カドヘリン）、ＣＤＨ６、カドヘリン１９（ＣＤＨ１９）、ＣＤＫ４、ＣＦＣ１、ＣＬＣＡ１、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１、ｃ－ＭＥＴ、ＣＭＬ６６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、ＣＲ１Ｌ、ＣＳ－１、ＣＳＰＧ４、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ５、ＣＸＯＲＦ６１、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＬＬ３、ＥＦＮＡ４、ＥＧＦＲ（又はｅｒｂＢ－１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦ１Ｒ、上皮細胞接着分子／上皮糖タンパク質－２（ＥｐＣＡＭ／ＥＧＰ２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ４０）、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＥＲＢＢ２（又はＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＥＴＡ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＦＡＰ、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＦＣＡＲ、ＦＣＲＬ５、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、フィブロネクチン、ＦＬＴ３、葉酸受容体－α（ＦＲ－α／ＦＯＬＲ１）、葉酸受容体ベータ（ＦＲ－β／ＦＯＬＲ２）、ＦＯＬＲ３、Ｆｏｓ関連抗原１（ＦＯＳＬ１）、ＦＲｃｃ、ＦＺＤ１０、ＧＡＧＥ、ガングリオシド（ＧＭ１、ＦｕｃＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ｏ－アセチル－ＧＤ２、ＧＤ３）、ＧｌｏｂｏＨ、ＧｐＡ３３、Ｇｐ７５、Ｇｐ１００、グリピカン－１（Glypican-1、ＧＰＣ１）、グリピカン－２（Glypican-2、GPC2）、グリピカン－３（Glypican-3、ＧＰＣ３）、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ１１９、ＧＰＲＣ５Ｄ、グアニル酸シクラーゼＣ（guanylate cyclase C、ＧＣ－Ｃ）、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＨＡＶＣＲ１、ＨＥＲＶエンベロープタンパク質、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＭ１．２４、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＧＦｒ／ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＬＬ１（ＣＤ１７９ｂ）、ＩＬ１１Ｒα、インターロイキン１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ１３Ｒα２）、ＩＬ１３Ｒｃｃ２、未熟ラミニン受容体（Immature laminin receptor、ｉＬＲＰ）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β、インテグリンＢ７、細胞間接着分子１（intercellular adhesion molecule 1、ＩＣＡＭ１）、腸管カルボキシルエステラーゼ（intestinal carboxyl esterase、ｉＣＥ）、κ軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ＫＩＴ、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＬＡＩＲ１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＬＡＭＰ－１、ＬＣＫ、レグマイン、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＶ－１、ＬＭＰ２、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６Ｋ、ＬＹ７５、ＬＹＰＤ３、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＣ１Ｒ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan、ＭＣＳＰ）、ｃ－Ｍｅｔ、ＭＩＣＡ／Ｂ、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＲ１、多剤耐性－関連タンパク質３（multidrug resistance-associated protein 3、ＭＲＰ３）、ＭＳ４Ａ１２、ムチン１（ＭＵＣ１、ｔＭＵＣ１）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５Ａ、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ２１、Ｍｕｄ、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＭＹＣＮ、ＮＡ１７、ＮＡ８８－１、ＮＣＡＭ、ネクチン４、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＰＭ、ＮＹ－ＢＲ－１、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＲ５１Ｅ２、ＯＹ－ＴＥＳ１、ｐ５３、ｐ５３変異体、ＰＡＮＸ３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＰＤＬ１、ペリオスチン、ＰＬＡＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＬＲ、プロスターゼ（ＫＬＫ２、ＫＬＫ４）、プロステイン（Ｐ５０１Ｓ）、ＰＲＳＳ２１、ポリシアル酸（Polysialic acid、ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＳＣ１、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ／ＦＯＬＨ１）、ＰＴＫ７、ＱＲＦＰＲ、ＲＡＧＥ－１、ＲＡＮＫＬ、Ｒａｓ、Ｒａｓ変異体、ＲＣＣ、ＲｈｏＣ、ロンキナーゼ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＰ１、肉腫転座ブレークポイント、ＳＡＲＴ３、ＳＩＧＬＥＣ－１５、シアロエピトープＣＡ６、ＳＬＣ６Ａ３、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ２２Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ７、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ｓＬｅ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＰＡＲＣ、精子タンパク質１７（Sperm protein 17、ＳＰ１７）、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＴＲ１、ＳＳＸ２、ＳＴＲＡＰ、ｓＴＮ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＴＡＲＰ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＥＭ、テロメラーゼ、ＴＧＦ－Ｂ受容体、ＴＧＳ５、Ｔｉｅ２、組織因子（Tissue Factor、ＴＦ）、ＴＩＭ－３、ＴＭＥＦＦ２（ＴＥＮＢ２）、ＴＭＥＭ２３８、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、Ｔｎ Ａｇ、ＴＮＣ、ＴＰ－３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＦ２、ＴＲＧ、ＴＲＯＰ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＳＨＲ、ＴＳＴＡ、チロシナーゼ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ＶＴＣＮ１（Ｂ７Ｈ４）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ＸＡＧＥ１、及び当技術分野で知られている様々な病原体抗原が挙げられる。病原体の非限定的な例には、疾患を引き起こす可能性のある、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び原生動物が含まれる。
ＣＡＲによって標的化され得る固形腫瘍抗原の非限定的な例としては、ｈ５Ｔ４、８Ｈ９、９Ｄ７、ＡＣＰＰ、ＡＣＴＮ４、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＲＢ３、ＡＦＰ、ＡＫＡＰ－４、ＡＬＫ、ＡＬＰＰ、ＡＬＰＰＬ２、アンドロゲン受容体、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、ＡＸＬ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ６、ＢＡＧＥ、β－カテニン、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＢＣＲ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｂｉｇｈ３、ＢＩＮＧ－４、ＢＯＲＩＳ、ＢＲＣＡ１／２、ＢＳＴ２、ＣＡＩＸ／ＣＡ９、ＣＡ１９．９、ＣＡ１２５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、炭水化物（Ｌｅ）、ＣＣＮＢ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９７、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２０７、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＤＣｌ２７、ＣＤＨ３、ＣＤＨ６、ＣＤＨ１９、ＣＤＫ４、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＣＦＣ１、ＣＬＣＡ１、ＣＬＣＡ４、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１、ｃ－ＭＥＴ、ＣＭＬ６６、ＣＲ１Ｌ、ＣＳ－１、ＣＳＰＧ４、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ５、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＤＬＬ３、ＥＦＮＡ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＥＧＰ４０、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＲ２、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ペリオスチン、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＥＴＡ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、ＦＣＡＲ、ＦＣＲＬ５、胎児ＡｃｈＲ、フィブロネクチン、ＦＬＴ３、ＦＲ－α／ＦＯＬＲ１、ＦＲ－β／ＦＯＬＲ２、ＦＯＬＲ３、ＦＯＳＬ１、ＦＲｃｃ、ＦＺＤ１０、ＧＡＧＥ、ガングリオシドＧＭ１、ＦｕｃＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ２、ｏ－アセチル－ＧＤ２、ＧＤ３）、ＧｌｏｂｏＨ、ＧｐＡ３３、Ｇｐ７５、Ｇｐ１００、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ１１９、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＣ－Ｃ、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＨＡＶＣＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲＶエンベロープタンパク質、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＭ１．２４、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＣＡＭ１、ＩＧＦｒ／ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＬＬ１ ＣＤ１７９ｂ）、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ１３－Ｒα２、ＩＬ－１３Ｒｃｃ２、ｉＬＲＰ、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＫＬＫ２、ＫＬＫ４、ＬＡＩＲ１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＬＡＭＰ－１、ＬＣＫ、レグマイン、ＬｅＹ、Ｌ１－ＣＡＭ、ＬＩＬＲＡ２、ＬＩＶ－１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＭＰ２、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６Ｋ、ＬＹ７５、ＬＹＰＤ３、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＣ１Ｒ、メランＡ／ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＲ１、ＭＲＰ３、ＭＳ４Ａ１２、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ｔＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ５Ａ、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ２１、Ｍｕｄ、ＭＵＭ１、ＭＵＭ２、ＭＵＭ３、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＭＹＣＮ、ＮＡ１７、ＮＡ８８－１、ＮＣＡＭ、ネクチン４、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＰＭ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＯＡ１、ＯＧＴ、ＯＲ５１Ｅ２、ＯＹ－ＴＥＳ１、ｐ５３、ｐ５３変異体、ＰＡＮＸ３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＰＤＧＦＲ－β、ＰＤＬ１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＬＲ、Ｐ５０１Ｓ、ＰＲＳＳ２１、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ／ＦＯＬＨ１、ＰＴＫ７、ＱＲＦＰＲ、ＲＡＧＥ－１、ＲＡＮＫＬ、Ｒａｓ、Ｒａｓ変異体、ＲＣＣ、ＲｈｏＣ、ロンキナーゼ、ＲＯＲ１、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＰ１、肉腫転座ブレークポイント、ＳＡＲＴ３、ＳＩＧＬＥＣ－１５、シアロエピトープＣＡ６、ＳＬＣ６Ａ３、ＳＬＣ１２Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ２２Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ７、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ８、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ｓＬｅ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＰＡＲＣ、ＳＰ１７、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＴＲ１、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ、ｓＴＮ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＴＡＧ７２、ＴＡＲＰ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＥＭ、テロメラーゼ、ＴＧＦ－Ｂ受容体、ＴＧＳ５、Ｔｉｅ２、組織因子ＴＦ）、ＴＩＭ－３、ＴＭＥＦＦ２ ＴＥＮＢ２）、ＴＭＥＭ２３８、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｅ、Ｔｎ Ａｇ、ＴＮＣ、ＴＰ－３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＦ２、ＴＲＧ、ＴＲＯＰ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＳＨＲ、ＴＳＴＡ、チロシナーゼ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ－ＩＩ、ＶＴＣＮ１（Ｂ７Ｈ４）、ＷＴ１、及びＸＡＧＥ１が挙げられる。
対応する腫瘍抗原を有する固形がんの非限定的な例を表１Ｂに提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、本出願において例示されるものを含む、腫瘍抗原に特異的な抗体の結合ドメインの重鎖のＣＤＲ（Ｈ－ＣＤＲ）、重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ（Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ）、重鎖の可変領域（ＶＨ）、又は重鎖及び軽鎖の両方の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）の単鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、ＭＤＸ－１１０５、ダセツズマブ、ウレルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ランブロリズマブ、ブリナツモマブ、ニモツズマブ、ザルツムマブ、オナルツズマブ、パトリツマブ、クリバツズマブ、ソフィツズマブ、エドレコロマブ、アデカツムマブ、アネツマブ、ｈｕＤＳ６、リファスツズマブ、サシツズマブ、ＰＲ１Ａ３、ヒト化ＰＲ１Ａ３、ヒト化Ａｂ２－３、クローディキシマブ（claudiximab）、ＡＭＧ５９５、ＡＢＴ８０６、シブロツズマブ、ＤＳ－８８９５ａバリアント１、ＤＳ－８８９５ａバリアント２、ＭＥＤＩ－５４７、ナルナツマブ、ＲＧ７８４１、ファルレツズマブ、ミルベツキシマブ、Ｊ５９１バリアント１、Ｊ５９１バリアント２、ロバルピツズマブ、ＰＦ－０６６４７０２０、ラディラツズマブ、シルムツズマブ、ラディラツズマブ、ｈｕＬｉｖ１－１４、Ｌｉｖ１－１．７Ａ４、ｈｕＬｉｖ１－２２、４Ｈ１１、４Ｈ５、グレムバツムマブ、オポルツズマブ、エンホルツマブ、デパツキシズマブ、又はコドリツズマブを含む抗体の結合ドメインに基づいて設計される。
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、膀胱がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、膀胱がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ２０７、ＥＦＮＡ４、ＬＹ６Ｋ、ＬＹＰＤ３、ネクチン４、ＰＴＫ７、ＳＬＩＴＲＫ６、ＴＩＭ－３、ＴＮＣ、ＵＰＫ１Ｂ又はＵＰＫ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態は、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、エンホルツマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、又はＳＬＩＴＲＫ６を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、骨がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、骨がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＡＭ１２、ＣＣＲ１、ＣＤ９９、ＣＤ２４８、ＥＰＨＡ２、ＧＰＮＭＢ、ＬＲＲＣ１５、又はＴＰ－３に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ｈｕＭ２５、ＤＳ－８８９５ａバリアント１、ＤＳ－８８９５ａバリアント２、又はグレムバツマブを含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、脳がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、脳がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ１３３、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、又はＴＮＣに特異的に結合する。いくつかの実施形態は、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ＡＭＧ５９５、ＡＢＴ８０６、ロバルピツズマブ又はデパツキシズマブを含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、乳がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２、ＣＣＲ４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３、ＣＤＨ３（ｐ－カドヘリン）、ＣＬＤＮ６、ｃ－ＭＥＴ、ＣＸＣＲ２、ＥＦＮＡ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２、ＥＰＨＡ２、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ１、ＬＡＭＰ－１、ＬＩＶ－１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＲＲＣ１５、ＬＹＰＤ３、ＭＵＣ１、ｔＭＵＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＴＫ７、シアロ－エピトープＣＡ６、ＴＮＣ、又はＴＲＯＰ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、トラスツズマブ、ペルツズマブ、サシツズマブ、ラディラツズマブ、ｈｕＬｉｖ１－１４、Ｌｉｖ１－１．７Ａ４、ｈｕＬｉｖ１－２２、ｈｕＤＳ６、グレムバツムマブ、ＰＦ－０６６４７２０、ＭＥＤＩ－５４７、ＤＳ－８８９５ａバリアント１、又はＤＳ－０８８９５ａバリアント２を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、乳肺がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、乳肺がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２、又はＲＯＲ１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、子宮頸部／子宮／子宮内膜がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、子宮頸部／子宮／子宮内膜がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＥＦＮＡ４、ＬＹ６Ｋ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＬＹＰＤ３、ＰＴＫ７、ＳＬＣ１２Ａ３、又はＳＳＴＲ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ＰＦ－０６６４７２０、アネツムマブ、４Ｈ１１、４Ｈ５、ｈｕＤＳ６又はソフィツズマブを含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、胆管がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、胆管がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ又はｔＭＵＣ１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、結腸直腸がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、結腸直腸がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＡＭ１２、ＣＡ１９．９、ＣＤ３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＣＬＣＡ１、ｃ－ＭＥＴ、ＥＦＮＡ４、ＥＰＨＢ２、ＧＰＡ３３、ＧＰＲ３５、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＩＣＡＭ１、ＬＧＲ５／ＧＰＲ４９、ＬＲＲＣ１５、ＭＳ４Ａ１２、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１７、ＴＩＭ－３、又はＴＭＥＭ２３８に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ｈｕＭ２５、ＰＲ１Ａ３、ヒト化ＰＲ１Ａ３、パンツムマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、又はザルツムマブを含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、食道がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、食道がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＡ１９．９、ＣＤ１０、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＥＦＮＡ４、ＥＰＨＢ２、ＭＵＣ２１、ＴＭＥＭ２３８、ＴＭＰＲＳＳ１１Ｂ又はＴＭＰＲＳＳ１１Ｅに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、胆嚢がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、胆嚢がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、胃／胃がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、胃／胃がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ｃ－ＭＥＴ、ＣＲ１Ｌ、ＥＦＮＡ４、ＥＰＨＢ２、ＬＧＲ５／ＧＰＲ４９、ＭＵＣ１７、ＰＳＣＡ、ＴＩＭ－３、又はＴＭＥＭ２３８に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ソフィツズマブ、アネツマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、又はヒト化ＰＲ１Ａ３を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、膠腫がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、膠腫がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＨＭ１．２４、又はＩＬ１３－Ｒα２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、頭頸部がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、頭頸部がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＡＭ１２、ＣＤ３、ｃ－ＭＥＴ、ＥＦＮＡ４、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６Ｋ、ＬＹＰＤ３、ＰＴＫ７、又はＴＮＣに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、セツキシマブ、パニツムマブ、ニムツズマブ、ＰＦ－０６６４７２０、パンツムマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、又はザルツムマブを含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腎臓がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腎臓がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ７０、ＣＤＨ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＮＰＰ３、又はＨＡＶＣＲ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ＡＧＳ－１６Ｍ８Ｆ、ＡＧＳ－１６Ｃ３、ＣＤＸ－０１４、又はオナルツズマブのＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、肝臓がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、肝臓がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＳＧＲ１、ＡＳＧＲ２、Ｃ９（ＣＡＩＸ）、ＣＡ１９．９、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＣＣＲ１、ＣＤ３、ＣＤ１３３、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２、ＧＰＣ３、ＩＣＡＭ１、ＬＧＲ５／ＧＰＲ４９、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ２２Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ７、ＴＩＭ－３、ＴＲＦ２、又はＵＧＴ１Ａ１に特異的に結合する。いくつかの形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、コドリツズマブ、オポルツズマブ、又はヒト化ＰＲ１Ａ３を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、肺がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、肺がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＤ５６、ＣＤ１３３、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＣＸＣＲ２、ＤＬＬ３、ＥＦＮＡ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＦＯＬＲ１、ＧＰＣ３、ＨＭ１．２４、ＩＣＡＭ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６Ｋ、ＬＹＰＤ３、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＤＬ１、ＰＴＫ７、ＳＬＣ３４Ａ２、又はＴＩＭ－３に特異的に結合する。いくつかのそのような実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、パニツムマブ、セツキシマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、及びニモツズマブ、リファツズマブ、アネツマブ、ＰＦ－０６６４７２０、ファルレツズマブ、ロバルピツズマブ、リファツズマブ、ソフィツズマブ、ｈｕＤＳ６、ＡＢＴ８０６、ＡＭＧ５９５、又はｈｕＭ２５を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、中皮腫細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、中皮腫関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＦＡＰ、又はＭＳＬＮに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、転移性がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、転移性がん細胞関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、又はＶＥＧＦＲ－ＩＩに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、神経芽細胞腫細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、神経芽細胞腫関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ又はＧＤ２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、非小細胞肺がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ｃ－ＭＥＴ、又はＥＧＦＲに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、卵巣がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、卵巣がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＣＲ１、ＣＤ３、ＣＤ１３３、ＣＬＤＮ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＦＮＡ４、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２、ＦＡＰ、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＦＲ－α、ＦＺＤ１０、ＧＰＲ２７、ＧＰＲ１１９、ＬＲＲＣ１５、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＴＫ７、ＳＬＣ３４Ａ２、ｓＴｎＴＭＥＭ２３８、又はＶＴＣＮ１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ソフィツズマブ、４Ｈ１１、４Ｈ５、ｈｕＤＳ６、ファルレツズマブ、アネツマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＰＦ－０６６４７２０、シブロツズマブ、ｈｕＭ２５、又はリファツズマブを含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、膵臓がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、膵臓がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＤＡＭ１２、ＣＡ１９．９、ＣＦＣ１、ＥＦＮＡ４、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２、ＩＣＡＭ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＲＲＣ１５、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ｔＭＵＣ１、ＭＵＣ５Ａ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７又はＳＬＣ３０Ａ８に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ＰＦ－０６６４７２０、クリバツズマブ、４Ｈ１１、４Ｈ５、アネツムマブ、ｈｕＤＳ６、ソフィツズマブ、ｈｕＭ２５、又はＲＧ７８４１を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腹膜がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腹膜がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＦＯＬＲ３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、前立腺がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、前立腺がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＣＰＰ、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３、ＥＦＮＡ４、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬＨ１、ＰＴＫ７、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＩＭ－３又はＴＭＥＦＦ２／ＴＥＮＢ２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ミルベツキシマブ又はＪ５９１バリアント１若しくは２を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腎臓がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腎臓がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ７０、ＩＣＡＭ１、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＬＩＬＲＢ２、ＱＲＦＰＲ、ＳＬＣ６Ａ３、又はＴＩＭ－３に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、肉腫上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、肉腫関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ又はＬＲＲＣ１５に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、唾液腺がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、唾液腺がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２又はＭＩＣＡ／Ｂに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、皮膚がん上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、皮膚がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１０、又はＩＣＡＭ１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、滑膜肉腫上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、滑膜肉腫関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＣＤ９９に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体は、甲状腺がん／腫瘍細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、甲状腺がん／腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＤ１０、ｃ－ＭＥＴ、ＰＴＫ７、又はＴＳＨＲに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体は、尿路上皮がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、尿路上皮がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＣＬＤＮ６、ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２、ＳＩＧＬＥＣ－１５、ＴＩＭ－３、又はＵＰＫ２に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、子宮／子宮内膜がん細胞上に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、子宮／子宮内膜がん関連抗原を標的とするＣＡＲは、ＨＥＲ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＡＬＰＰ、ＡＬＰＰＬ２、ＣＣＲ１、ＣＬＤＮ６、ＥＦＮＡ４、ＥＰＨＢ２、ＦＯＬＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＹ６Ｋ、ＬＹＰＤ３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、又はＰＴＫ７に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、当該ＣＡＲの抗原認識ドメインは、ＰＦ－０６６４７２０、ファルレツズマブ、ソフィツズマブ、４Ｈ１１、又は４Ｈ５を含む抗体のＨ－ＣＤＲ、Ｈ－及びＬ－ＣＤＲ、ＶＨ、又はＶＨ及びＶＬの単鎖を含む。
様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、３つ以上のがんタイプに関連することが知られている腫瘍抗原（「汎腫瘍抗原」と呼ばれることもある）に特異的に結合する。このような汎腫瘍抗原の非限定的なセットは、少なくとも、表２に例示されるようなＡＤＡＭ１２、ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２、ＣＡ１９．９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３、ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５、ＣＬＤＮ６、ｃ－ＭＥＴ、ＥＦＮＡ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、ＩＣＡＭ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６Ｋ、ＬＹＰＤ３、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１、ｔＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＰＳＣＡ、ＰＴＫ７、ＴＩＭ－３、ＴＭＥＭ２３８、及びＴＮＣを含む。
したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＡＤＡＭ１２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも骨がん、乳がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がん又は膵臓がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＡＤＧＲＥ２／ＥＭＲ２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示されている固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、乳肺がん、膠腫、又は肺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＡ１９．９に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも結腸直腸がん、食道がん、肝臓がん、又は膵臓がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＣＲ１に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも骨がん、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＣＲ４に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、肺がん、又は皮膚がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＤ３に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも結腸直腸がん、頭頸部がん、肝臓がん、卵巣がん、腎臓がん、又は皮膚がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＤ１０に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも食道がん、前立腺がん、皮膚がん、又は甲状腺腫瘍を含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＤ４９ｆに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、結腸直腸がん、膠腫、又は前立腺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＤ１３３に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも脳がん、乳がん、結腸直腸がん、膠腫、肝臓がん、肺がん、卵巣がん、又は前立腺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＥＡ／ＣＥＣＡＭ５に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、肝臓がん、又は肺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＣＬＤＮ６に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示されている固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、卵巣がん、尿路上皮がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ｃ－ＭＥＴに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、結腸直腸がん、胃／胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、又は甲状腺腫瘍を含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＥＦＮＡ４に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＥＧＦＲに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、膠腫、肺がん、非小細胞肺がん、又は神経芽細胞腫を含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示されている固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも脳がん、膠腫、又は肺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＥＰＣＡＭ／ＥＧＰ２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、乳肺がん、胆嚢がん、肝臓がん、卵巣がん、又は尿路上皮がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＥＰＨＡ２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも骨がん、乳がん、又は膠腫を含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＥＰＨＢ２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示される固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＦＯＬＲ１に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示されている固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも肺がん、卵巣がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＨＥＲ２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示するような固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、乳がん、胸部肺がん、結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、又は唾液腺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＩＣＡＭ１に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、又は皮膚がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＬＩＬＲＢ２に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＬＲＲＣ１５に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも骨がん、乳がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、又は腎臓がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＬＹ６Ｋに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＬＹＰＤ３に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＭＩＣＡ／Ｂに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示される固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、乳肺がん、子宮頸がん、胆管がん、結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、膠腫、頭頸部がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、転移性がん、神経芽細胞種、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、肉腫、唾液腺がん、甲状腺がん、尿路上皮がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＭＳＬＮに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも肺がん、転移性がん、中皮腫、卵巣がん、又は膵臓がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＭＵＣ１に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、子宮頸がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ｔＭＵＣ１に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも乳がん、胆管がん、又は膵臓がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＭＵＣ１６に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも子宮頸がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＭＵＣ１７に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも結腸直腸がん、胃／胃がん、又は膵臓がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＰＳＣＡに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも胃／胃がん、膵臓がん、又は前立腺がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＰＴＫ７に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示されるような固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、甲状腺腫瘍、又は子宮／子宮内膜がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＴＩＭ－３に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、結腸直腸がん、胃がん、肝臓がん、肺がん、前立腺がん、腎臓がん、又は尿路上皮がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＴＭＥＭ２３８に特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、又は卵巣がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識ドメインは、腫瘍関連ＴＮＣに特異的に結合し、当該ＣＡＲ及び開示する固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞は、少なくとも膀胱がん、脳がん、乳がん、又は頭頸部がんを含む１つ以上のがんを治療するのに有用である。
様々な実施形態では、本明細書に記載される細胞に適用可能なＣＡＲは、少なくとも外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの内部ドメインは、抗原結合時に活性化される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ内部ドメインのいくつかの実施形態では、最適化された機能性のために、１つ以上の共刺激ドメイン（しばしば「追加のシグナル伝達ドメイン」と呼ばれる）が更に含まれる。ＣＡＲ設計に適した例示的なシグナル伝達タンパク質としては、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、ＣＤ３ζ又はＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１及びＣＤ８が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なシグナル伝達タンパク質（タンパク質の膜貫通配列及び細胞質配列を含む）の記載は、以下に提供され、そして更に表３Ａに提供される。
本明細書で提供される細胞に適用可能なＣＡＲのいくつかの実施形態では、ＣＡＲの内部ドメインは、それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、又はＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも第１のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメインの一部分のみを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲシグナル伝達ドメインのために選択される細胞質ドメインの部分は、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン活性化モチーフ）、ＹｘｘＭモチーフ、ＴｘＹｘｘＶ／Ｉモチーフ、ＦｃＲγ、ヘミ－ＩＴＡＭ、及び／又はＩＴＴ様モチーフに対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、第１のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの内部ドメインは、それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のシグナル伝達ドメインを更に含み、第２のシグナル伝達ドメインは第１のシグナル伝達ドメインと異なる。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
提供されるＣＡＲのいくつかの実施形態では、第１及び第２のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの内部ドメインは、それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－１５Ｒβ）、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第３のシグナル伝達ドメインを更に含み、第３のシグナル伝達ドメインは第１及び第２のシグナル伝達ドメインと異なる。いくつかの実施形態では、第３のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第３のシグナル伝達ドメインは、配列番号５４～７６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内部ドメインのシグナル伝達ドメインを設計するのに適したシグナル伝達タンパク質は、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、又はＣＴＬＡ－４を更に含む。
１つのシグナル伝達ドメインのみからなる内部ドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、当該内部ドメインは、ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８Ｈ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＤＡＰ１２又はＤＡＰ１０を含むがこれらに限定されないタンパク質の細胞質ドメイン又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
２つの異なるシグナル伝達ドメインから構成される内部ドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、当該内部ドメインは、２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ（すなわち、２Ｂ４－ＣＤ３ζ又は２Ｂ４－ＣＤ３ζ１ＸＸ、以下同様）、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、又はＮＫｐ４６－２Ｂ４を含むが、これらに限定されない形態の融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。
３つの異なるシグナル伝達ドメインから構成される内部ドメインを有するＣＡＲのいくつかの例示的な実施形態では、当該内部ドメインは、２Ｂ４－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＩＬ２１Ｒ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＤＡＰ１０、２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－４１ＢＢ－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０、又はＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸを含むが、これらに限定されない形態の融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域の全長又は一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、（ａ）それぞれ配列番号３２、３４～４２、４７～５３によって表される２Ｂ４、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄ、の膜貫通領域の全長又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３２、３４～４２、４７～５３のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３２、３４～４２、４７～５３のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３２、３４～４２、４７～５３のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む。ＣＡＲのいくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインは、同じタンパク質に由来する。ＣＡＲのいくつかの他の実施形態では、膜貫通ドメイン及び直接連結されるシグナル伝達ドメインは、異なるタンパク質に由来する。
膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び内部ドメインを含むＣＡＲ構築物（ＴＭ－（内部ドメイン）と表示）の非限定的な例を表３Ｂに示す。一般に、図示されたＣＡＲ構築物はそれぞれ、膜貫通ドメインと、１つ以上のシグナル伝達タンパク質の細胞質領域に由来する１つ以上のシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含む。概して、膜貫通ドメインは、生体膜（例えば、細胞又は細胞小胞の膜）のリン脂質二重層などの膜において熱力学的に安定である三次元タンパク質構造である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞に適用可能なＣＡＲの膜貫通ドメインは、単一のアルファヘリックス、いくつかの膜貫通アルファヘリックスの安定な複合体、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータヘリックス、又はそれらの任意の組み合わせを含む。様々な実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜内にある「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」の全て又は一部分を含む。本明細書で使用されるとき、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、膜に及び／又は膜内に位置するタンパク質である。本発明のいくつかの実施形態によるＣＡＲに含まれる膜貫通ドメインを提供するのに好適な膜貫通タンパク質の例としては、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＡＲに含まれる膜貫通ドメインは、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＢＴＬＡ、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＳ１、ＣＴＬＡ－４、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＬＡＧ３、ＰＤ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、Ｔ細胞受容体ポリペプチド（例えば、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、又はそれらの任意の組み合わせの膜貫通ドメインの全部又は一部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内部ドメインに含まれる１つ以上のシグナル伝達ドメインは、ＴＭが由来する同じ又は異なるタンパク質に由来する。表３Ｂに示されるように、ＣＡＲの膜貫通ドメインを表す部分に下線が引かれ、内部ドメインに含まれるドメインは括弧「（）」内に示され、ＴＭ及びシグナル伝達ドメインの各々は、ドメイン配列が由来するシグナル伝達タンパク質の名称によって指定される。実施形態では、各ＴＭドメイン又はシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、指定されたシグナル伝達タンパク質の対応する膜貫通領域又は細胞質領域の全長又は一部分に対して約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であってもよい。本明細書で提供される膜貫通ドメイン及び内部ドメインを含む例示的なＣＡＲ構築物としては、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ－（２Ｂ４－ＩＬ２ＲＢ－ＣＤ３ζ）、ＣＤ８－（４１ＢＢ－ＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＤ２８－（ＣＤ２８－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＣＤ２８－（ＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ）、ＣＤ２８Ｈ－（ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ）、ＤＮＡＭ１－（ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ）、ＤＡＰ１０－（ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０）、ＫＩＲ２ＤＳ２－（ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－２Ｂ４－ＤＡＰ１０）、ＣＤ１６－（ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、ＮＫｐ４６－（ＮＫｐ４６－ＣＤ２－ＤＡＰ１０）、ＣＤ２－（ＣＤ２－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＣＤ３ζ）、２Ｂ４－（２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ）、及びＣＳ１－（ＣＳ１－ＣＤ３ζ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及び内部ドメインを含む上記の例示的なＣＡＲ構築物の各々は、表３Ｂ中の配列番号７７～９５の各々によって表される配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７７～９５のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７７～９５のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７７～９５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。表３Ｂに提供される各構築物についての例示的な配列は、配列の左側の図中の対応する領域のフォーマッティングに適合するようにフォーマットされたテキスト（すなわち、下線付き、正常、又は太字のテキスト）を有する。表３Ｂの例示的な構築物のほとんどについて、ＴＭは第１の配列領域である。しかしながら、構築物は、ＴＭの前に細胞外ドメインを含んでもよく（例えば、表３Ｂの構築物７を参照されたい）、ＴＭと同じ又は異なるタンパク質に由来してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ内部ドメインに含まれる２つ以上のシグナル伝達ドメインは、スペーサー又はリンカーなどの１つ以上の更なる配列によって隔てられていてもよい。
いくつかの実施形態では、外部ドメインは、シグナルペプチド若しくはリーダー配列及び／又はスペーサー／ヒンジを更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原認識領域／ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサー／ヒンジが存在するが、いくつかの他の実施形態では、そのようなスペーサー／ヒンジは必要とされない。ＣＡＲ又はＡＤＲに含まれ得る例示的なスペーサーは、当該技術分野において一般的に既知であり、ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、又は２つ以上のスペーサーの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。スペーサーの長さもまた、約１５アミノ酸（ａ．ａ．）から約３００アミノ酸以上まで変化し得る。本出願では、説明を容易にするために、約８０アミノ酸未満、例えば１０～８０アミノ酸のスペーサーは短いと考えられる。約８０～１８０アミノ酸のスペーサーは中程度と考えられ、１８０アミノ酸を超えるスペーサーは長いと考えられる。非限定的な例示的スペーサーペプチドとしては、配列番号９６～１００のいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号９６～１００のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号９６～１００のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーペプチドは、配列番号９６～１００のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
配列番号９６
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ
（３９アミノ酸）
配列番号９７
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬ
（８８アミノ酸）
配列番号９８
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ
（８９アミノ酸）
配列番号９９
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（１２９アミノ酸）
配列番号１００
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
（２２９アミノ酸）
一実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、ＣＤ２８から派生する共刺激ドメイン、及び配列番号８０と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表されるＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号８０に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号８０に対して少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。更なる実施形態では、ＣＤ２８に由来する共刺激ドメイン及びＣＤ３ζの天然又は改変ＩＴＡＭ１を含むＣＡＲはまた、ＣＤ２８に由来するヒンジドメイン（又は「スペーサー」）及び膜貫通ドメインを含み、ｓｃＦｖはヒンジを介して膜貫通ドメインに接続され得、ＣＡＲは、配列番号１０１に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含み、スペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列を含み、スペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列を含み、スペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０１に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列を含み、スペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
Figure 2024515920000030
 （スペーサー－ＣＤ２８ＴＭ－ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍ－ＣＤ３ζ１ＸＸ活性化）
別の実施形態では、本明細書において提供される細胞に適用可能なＣＡＲは、ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメイン、２Ｂ４に由来する共刺激ドメイン、及び配列番号１０２と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列によって表される天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０２に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０２に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。ＮＫＧ２Ｄに由来する膜貫通ドメイン、２Ｂ４に由来する共刺激ドメイン、及び天然又は改変ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインを含む当該ＣＡＲは、ヒンジを更に含み得る。
Figure 2024515920000031
 （２６３アミノ酸のＮＫＧ２Ｄ ＴＭ－２Ｂ４－ＣＤ３ζ）
一例では、遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ、及び派生エフェクター細胞は、本明細書に開示される固形腫瘍標的化骨格と、腫瘍細胞表面ＨＥＲ２抗原に特異的な抗原認識領域を含むＣＡＲと、を含む。別段の指定がない限り、本出願におけるＨＥＲ２－ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＨＥＲ２がん特異的モノクローナル抗体（ＣａｓＭａｂ）であるＣａｓＭａｂ２５０のＣＤＲに基づき、このＣａｓＭａｂ２５０ベースのＨＥＲ２－ＣＡＲは、本出願において時々「ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲ」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２－ＣＡＲの外部ドメインの抗原認識ドメインは、配列番号１０３（ＮＹＧＭＳ）を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧ）を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５（ＰＧＬＬＷＤＡ）を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、配列番号１０６（ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮ）を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７（ＬＶＳＫＬＤＳ）を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８（ＷＱＧＴＨＦＰＱＴ）を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１０９によって表される例示的な配列と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有するＶＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１０９に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１０９に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１０９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１１０によって表される例示的な配列と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有するＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１１０に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１１０に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。
配列番号１０９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１１０
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む、Ｎ末端からＣ末端への配向を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは長さ及び配列が異なる。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１１１～１１４によって表される例示的配列と比較した場合、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１１１～１１４のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１１１～１１４のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１１１～１１４のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
配列番号１１１
ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ
配列番号１１２
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ
配列番号１１３
ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号１１４
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１１５又は配列番号１１６によって表される例示的な配列と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はその間の任意のパーセンテージの配列同一性を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び／又は配列が異なり得るリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１１５又は１１６に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１１５又は１１６に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む。
配列番号１１５
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号１１６
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＡＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＱＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＰＤＲＲＬＥＬＶＡＴＩＮＮＮＧＧＧＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＳＰＧＬＬＷＤＡＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳ
一実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、配列番号１１７に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一のアミノ酸配列を含み、外部ドメインにおけるリンカー及び外部ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１７に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、外部ドメイン中のリンカー及び外部ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１７に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含み、外部ドメイン中のリンカー及び外部ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサーは、長さ及び配列が異なり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、固形腫瘍の細胞に特異的なＨＥＲ２抗原を認識する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、肺がん、食道がん、唾液腺がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、又は頭頸部がんを含む腫瘍のＨＥＲ２抗原を認識する。更にいくつかの他の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲは、腫瘍のＨＥＲ２抗原を認識し、かつ非がん細胞又は正常細胞上で発現されるＨＥＲ２に応答しないか、又は低レベルの応答を有する。
Figure 2024515920000032
 （抗ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ［リンカー］－スペーサー－ＣＤ２８ ＴＭ－ＣＤ２８ Ｃｏｓｔｉｍ－ＣＤ３ζ１ＸＸ活性化）
別の例では、遺伝子操作された免疫細胞、ｉＰＳＣ、及び派生エフェクター細胞は、本明細書に開示される固形腫瘍標的化骨格と、腫瘍抗原ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ（ＭＩＣＡ／Ｂ）を標的とする抗原認識領域を含むＣＡＲと、を含む。ＭＩＣＡ／Ｂ標的化ＣＡＲのいくつかの実施形態では、抗原認識領域は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの保存されたα３ドメインに特異的に結合するｓｃＦＶである。一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１１８に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される重鎖の可変領域、及び配列番号１１９に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される軽鎖の可変領域を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１８に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１８に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１９に対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１９に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む。ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶの一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２０と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２０に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２０に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶの別の実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２１と少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２１に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２１に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。
配列番号１１８
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＭＦＴＮＹＡＭＮＷＶＫＱＡＰＥＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＨＴＧＤＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＩＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＶＲＴＹＧＮＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
（１１８ＡＡ．ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ重鎖（ＨＣ））
配列番号１１９
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＤＴＳＩＬＨＬＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＫＦＰＲＴＦＧＧＧＴＴＬＥＩＫ
（１０７ＡＡ．ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ軽鎖（ＬＣ））
Figure 2024515920000033
 （ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ；ＨＣ－リンカー－ＬＣ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
Figure 2024515920000034
 （ＭＩＣＡ／Ｂ ｓｃＦＶ；ＬＣ－リンカー－ＨＣ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
別の例では、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、本明細書に開示される固形腫瘍標的化骨格と、腫瘍抗原ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）を標的とするＣＡＲと、を含む。ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲのいくつかの実施形態では、抗原認識領域は、ＣＤ２６９の細胞外ドメインに特異的に結合するｓｃＦＶである。一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２２、１２４及び１２６のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２３、１２５及び１２７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む。ＣＡＲ構築のためのＢＣＭＡ ｓｃＦＶの一実施形態では、ｓｃＦＶは、それぞれ配列番号１２２及び配列番号１２３、又はそれぞれ配列番号１２４及び配列番号１２５、若しくは配列番号１２６及び配列番号１２７に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一性であるアミノ酸配列によって表されるＶＨ及びＶＬを含む。
いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１２２、１２４、又は１２６のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１２２、１２４、又は１２６のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号１２２、１２４、又は１２６のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１２３、１２５、又は１２７のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１２３、１２５、又は１２７のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１２３、１２５、又は１２７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。ＢＣＭＡ ｓｃＦＶの一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２８、１２９、１３０、１３１、１３２又は１３３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列によって表される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２８～１３３のうちのいずれかに対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２８～１３３のうちのいずれかに対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態ではｓｃＦＶは、配列番号１２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１３３のアミノ酸配列を含む。本明細書の一態様は、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生細胞を提供し、細胞は、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの他の実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、ＮＫＴ細胞である。いくつかの他の実施形態では、少なくともＢＣＭＡ－ＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、Ｔ、ＮＫ、若しくはＮＫＴ細胞、又は天然源の任意の他の免疫細胞には存在しない又は典型的でない機能的又は構造的特徴を有する。一例では、本明細書は、腫瘍抗原ＢＣＭＡを標的とする抗原認識領域を含むＣＡＲを提供する。
配列番号１２２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＲＹＷＦＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＧＥＩＮＰＳＳＳＴＩＮＹＡＰＳＬＫＤＫＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＬＹＹＤＹＧＤＡＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ重鎖－１（ＶＨ））
配列番号１２３
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＫＡＳＱＳＶＥＳＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＡＬＩＹＳＡＳＬＲＦＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ軽鎖－１（ＶＬ））
配列番号１２４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＰＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ重鎖－２（ＶＨ））
配列番号１２５
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＩＹＹＣＳＱＳＳＩＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ軽鎖－２（ＶＬ））
配列番号１２６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＰＤＹＹＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＦＡＳＧＮＳＥＹＮＱＫＦＴＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＳＬＹＤＹＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ重鎖－３（ＶＨ））
配列番号１２７
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＡＥＴＳＨＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
（ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ軽鎖－３（ＶＬ））
Figure 2024515920000035
 （ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－１；ＶＨ－リンカー－ＶＬ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
Figure 2024515920000036
 （ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－２；ＶＬ－リンカー－ＶＨ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
Figure 2024515920000037
 （ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－３；ＶＨ－リンカー－ＶＬ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
Figure 2024515920000038
 （ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－４；ＶＬ－リンカー－ＶＨ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
Figure 2024515920000039
 （ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－５；ＶＨ－リンカー－ＶＬ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
Figure 2024515920000040
 （ＢＣＭＡ ｓｃＦＶ－６；ＶＬ－リンカー－ＶＨ；シグナルペプチド／リーダー－他のシグナルペプチドも可能である；リンカー－他のリンカーも可能である）
更に別の例では、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、本明細書に開示される固形腫瘍標的化骨格と、腫瘍抗原Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）を標的とするＣＡＲと、を含む。Ｂ７Ｈ３腫瘍抗原を標的とするＣＡＲの様々な実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ７Ｈ３に特異的に結合する組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）を含む。一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３４に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３５に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３７に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３８に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３９に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、又は少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３４～１３９のうちのいずれかに対して少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３４～１３９のうちのいずれかに対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３４の配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３５の配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３６の配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３７の配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３８の配列を含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、配列番号１３９の配列を含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３４のバリアントを含む結合ドメインを含み、バリアントは、配列番号１３４の１、４０、４６、７９、８７、８８、８９、９７、９８、及び１１７を含む位置に１つ以上の突然変異を有する。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３４のバリアントによって表されるアミノ酸配列を含み、バリアントは、配列番号１３４に従いＱ１Ｅ、Ｔ４０Ａ、Ｅ４６Ｖ、Ｇ７９Ｌ、Ｋ８７Ｒ、Ｐ８８Ａ、Ｄ８９Ｅ、Ｖ９７Ａ、Ｓ９８Ｒ、及びＱ１１７Ｌを含む１つ以上の置換を有する。他の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、及び１３９のうちのいずれかによって表されるアミノ酸配列を含む。
配列番号１３４
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＧＹＬＱＭＮＳＬＫＰＤＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨラクダＢ７Ｈ３）
配列番号１３５
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ１）
配列番号１３６
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ２）
配列番号１３７
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＶＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ３）
配列番号１３８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２アミノ酸のＶＨＨ４）
配列番号１３９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＹＷＶＲＱＴＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＲＤＧＳＡＴＷＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＧＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＤＰＤＮＹＳＳＤＥＭＶＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（１２２ＡＡ．ＶＨＨ５）
非限定的なＣＡＲ戦略としては、一対の細胞内ドメインの二量体化によるヘテロ二量体条件的活性化ＣＡＲ（例えば、米国特許第９，５８７，０２０号を参照されたい）；スプリットＣＡＲ（ＣＡＲを生成するための抗原結合、ヒンジ、及び内部ドメインの相同組換え（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０１８３４０７号を参照されたい）；それぞれ抗原結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインに接続された２つの膜貫通ドメイン間の非共有結合を可能にする多重鎖ＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１３４１４２号を参照されたい）；二重特異性抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第９，４４７，１９４号を参照されたい）、又は同じ若しくは異なる抗原若しくはエピトープを認識する一対の抗原結合ドメインを有するＣＡＲ（例えば、米国特許第８，４０９，５７７号を参照されたい）、又はタンデムＣＡＲ（例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（８）：３０３６－３０５２）；誘導性ＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００４６７００号、同第２０１６／００５８８５７号、及び同第２０１７／０１６６８７７号を参照されたい）；スイッチ可能なＣＡＲ（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２１９９７５号を参照されたい）；並びに当該技術分野で既知の任意の他の設計が更に含まれる。
いくつかの実施形態では、開示されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、外因性プロモータに機能的に連結されている。プロモータは誘導性又は構成的であり得、時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的であり得る。本明細書に開示される方法に好適な構成的プロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（elongation factor 1α、ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（phosphoglycerate kinase、ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサ／ニワトリβ－アクチン（enhancer/chicken β-actin、ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ubiquitin C、ＵＢＣ）プロモータが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモータはＣＡＧである。
本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含む細胞は、任意選択で、ＣＡＲ及び／又は本明細書において提供される１つ以上の追加の改変モダリティをコードするポリヌクレオチドを含む。外因性サイトカインシグナル伝達複合体（表４の「ＩＬ」）とＣＡＲとの両方を含むｉＰＳＣ及びそれからの派生細胞では、ＩＬとＣＡＲは別々の構築物内で発現され得るか、ＩＬとＣＡＲとの両方を含むバイシストロン性構築物内で共発現され得る。本出願において更に提供されるのは、他の遺伝子モダリティの中でもとりわけ、本明細書に記載されるような固形腫瘍標的化骨格及びＣＡＲを含むが、これに限定されない、本明細書で提供されるような少なくとも１つの表現型を有する、ソーティングされた単一細胞及び増殖されたクローンの操作されたｉＰＳＣを含むマスター細胞バンクであり、この細胞バンクは、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォームと、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる、誘導ＮＫ細胞及びＴ細胞を含むがこれに限定されない、既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源と、を提供する。
９．本明細書で提供される遺伝子操作されたｉＰＳＣ株及び派生細胞
上記に照らして、本出願は、免疫細胞、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそれらの集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる派生機能性細胞を提供し、各細胞は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上、並びに任意選択でＣＡＲ及び／又は本出願に記載の１つ以上の追加の遺伝子改変をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含み、細胞は、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞、免疫細胞、又はフィーダー細胞である。当該細胞は、ＣＡＲ標的化腫瘍殺傷のための腫瘍部位へのエフェクターのホーミング又は遊走に適している。いくつかの実施形態では、腫瘍部位の腫瘍細胞は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアントに結合するケモカインを分泌又は過剰発現する。いくつかの実施形態では、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍部位で腫瘍細胞によって分泌又は過剰発現されるケモカインは、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）を含む。いくつかの実施形態では、機能的派生細胞は造血細胞であり、決定的な造血内皮（ＨＥ）の可能性を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４＋造血細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、造血多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、骨髄細胞、好中球前駆細胞、Ｔ系統細胞、ＮＫＴ系統細胞、ＮＫ系統細胞、Ｂ系統細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージを含むがこれらに限定されない。他の実施形態では、機能的派生造血細胞は、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有するエフェクター細胞を含む。
本明細書で更に提供されるのは、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、又はそのクローン集団、及びｉＰＳＣを分化させることから得られる派生機能性細胞であり、各細胞は、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格と、ＣＡＲと、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、を含み、ｉＰＳＣは、機能的派生造血細胞を産生するように分化を誘導することができる。当該エフェクター細胞は、固形腫瘍を含む腫瘍部位にホーミング又は移動し、そこに留まる改善された能力を有し、腫瘍抗原不均一性及び腫瘍抗原エスケープに取り組むための腫瘍抗原二重標的化機構を提供する。ＣＡＲ結合及びＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣによる二重標的化は、腫瘍標的化精度を更に増加させ、腫瘍死滅を増強し、腫瘍抗原エスケープの影響を最小化する。
いくつかの更なる実施形態では、ｉＰＳＣ、ｉＰＳ細胞株細胞、若しくはそれらのクローン集団、及び／又はそれらに由来するエフェクター細胞は、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格、ＣＡＲ、及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントを含み、固形腫瘍標的化骨格は、ＣＤ３８ノックアウトを更に含み、当該細胞は、養子細胞療法を受ける対象に適している。特定の実施形態形態では、対象は、ＣＸＣＬ８過剰発現を含むがこれに限定されない腫瘍細胞ケモカイン発現を上方制御し、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体過剰発現エフェクター細胞ホーミング、輸送及び保持、並びに腫瘍部位での細胞傷害性を更に増強するために、腫瘍感作手順（例えば、化学療法剤、放射線、又は放射線療法剤などの感作物質の投与）を更に受けてもよい。いくつかの実施形態では、当該エフェクター細胞は、Ｔ系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、当該エフェクター細胞は、ＮＫ系統細胞を含む。
Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの少なくとも２つ、並びに任意選択で、ＣＡＲ、ＣＤ３８ノックアウト、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、及び１つ以上のＣＦＲのうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含む派生エフェクター細胞、ｉＰＳＣ及びそれらの派生細胞のいくつかの実施形態では、当該細胞は、ＴＣＲ定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）に挿入されたＣＡＲを有し、ＴＣＲノックアウトをもたらし、任意選択で、ＣＡＲ発現を内因性ＴＣＲプロモータの制御下に置く。ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常領域（ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣ）の破壊は、ＴＣＲ陰細胞を産生する。加えて、ＴＣＲの発現は、ｉＰＳＣから分化したＮＫ系統エフェクター細胞においても陰性である。ＴＣＲ陰は、ＨＬＡ適合を必要とせず、同種異系養子細胞療法において使用される場合、アロ反応性が減少し、ＧｖＨＤ（移植片対宿主病）を予防することができる。ＣＡＲの追加の挿入部位には、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書に記載されるエフェクター細胞、ｉＰＳＣ及びその派生ＮＫ細胞はＣＡＲを含み、ＣＡＲをＮＫＧ２Ａ遺伝子座又はＮＫＧ２Ｄ遺伝子座に挿入する場合、ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄノックアウトをもたらし、それにより、ＣＡＲ発現を内因性ＮＫＧ２Ａ又はＮＫＧ２Ｄプロモータの制御下に置く。
加えて、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの少なくとも２つをコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含み、ＣＡＲ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＣＤ３８ノックアウト、並びに細胞の生存、持続及び／又は増殖に寄与するサイトカインシグナル伝達を可能にする全長若しくは部分長のサイトカイン及び／又は全長若しくは部分長のサイトカイン受容体を含むインターロイキン（ＩＬ）サイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドを更に含むｉＰＳＣであって、ｉＰＳＣ株が改善された生存、持続、増殖、及びエフェクター細胞機能、並びにホーミング、輸送、腫瘍部位保持及び細胞傷害性を有する機能的派生造血細胞を産生するために分化を誘導することができる、ｉＰＳＣが提供される。様々な実施形態では、外因的に導入されたＩＬサイトカインシグナル伝達は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のいずれか１つ、２つ、又はそれ以上のシグナル伝達を含む。いくつかの実施形態は、導入されるＩＬサイトカインシグナル伝達複合体は、細胞におけるＩＬ１５シグナル伝達のためのものであり、細胞は、任意選択で、ＮＫ系統細胞である。いくつかの他の具体的な実施形態では、導入されるＩＬサイトカインシグナル伝達複合体は、細胞におけるＩＬ７シグナル伝達のためのものであり、細胞は、任意選択で、Ｔ系統細胞である。いくつかの実施形態では、導入されたＩＬサイトカインシグナル伝達複合体は、細胞表面上に発現される。いくつかの実施形態では、ＩＬサイトカインシグナル伝達は構成的に活性化される。いくつかの実施形態では、ＩＬサイトカインシグナル伝達の活性化は誘導性である。いくつかの実施形態では、ＩＬサイトカインシグナル伝達の活性化は、一過性及び／又は一時的である。いくつかの実施形態では、細胞表面サイトカイン／サイトカイン受容体の一過性／一時的発現は、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、又はｍＲＮＡを含むＲＮＡを介する。Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上、並びにＣＡＲ、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＩＬサイトカインシグナル伝達複合体、並びに任意選択で表４及び本出願を通して提供される１つ以上の追加の遺伝子改変をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞、は、追加的に供給される可溶性サイトカインにインビトロ又はインビボで接触することなく自律的に細胞成長、増殖（proliferation）、増殖（expansion）、及び／又はエフェクター機能を維持又は改善することができ、かつ腫瘍部位におけるホーミング、輸送、及び保持を増強することができ、腫瘍細胞は、初代由来免疫細胞又はクローンｉＰＳＣの合理的設計及び精密工学によってエフェクター細胞に提供される機能的特質と相乗作用するように感作され得る。
本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格と、ＣＡＲと、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントと、ＣＡＲと、Ｂ２Ｍノックアウト及び／又はＣＩＩＴＡノックアウトと、任意選択で、ＨＬＡ－Ｇ過剰発現、ＣＤ５８ノックアウト及びＣＤ５４ノックアウトのうちの１つと、を含むｉＰＳＣであって、分化を誘導して機能的派生造血細胞を産生することができる、ｉＰＳＣも提供される。様々な実施形態では、固形腫瘍標的化骨格を含む当該ｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損である。更なる実施形態では、固形腫瘍標的化骨格を含むＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損ｉＰＳＣ並びにその派生エフェクター細胞はまた、ＣＤ３８陰性であり、エフェクター細胞排除を引き起こすことなくＡＤＣＣを誘導するために抗ＣＤ３８抗体とともに使用することができ、それによって、ｉＰＳＣ及びそのエフェクター細胞の持続性及び／又は生存を増加させる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、増加したインビボでの持続性及び／又は生存率を有する。
したがって、本出願は、表４の以下の遺伝子型のいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びそれらの機能的派生造血細胞を提供する。表４に提供されるように、「ＩＬ」は、どの特定のサイトカイン／受容体又は組み合わせ発現が選択されるかに応じて、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、及びＩＬ２１のうちの１つを表すＩＬサイトカインシグナル伝達複合体を表す。更に、「ＩＬ」はまた、ＩＬ１５Δ実施形態を包含し、これは、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒαの短縮型融合タンパク質として上に詳述されるが、細胞内ドメインを含まない。更に、ｉＰＳＣとその機能的派生造血細胞がＣＡＲとＩＬの両方を含む遺伝子型を有する場合、ＣＡＲとＩＬは２Ａ配列を含むバイシストロン性又はトリシストロン性発現カセットに含まれ得る。対照的に、いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲ及びＩＬは、ｉＰＳＣ及びそれらの機能的派生造血細胞に含まれる別々の発現カセット中にある。一実施形態では、ｉＰＳＣ及びそれらの機能的派生エフェクター細胞はＣＡＲとＩＬの両方を含み、ＩＬはＩＬ１５であり、ＩＬ１５構築物はＣＡＲとともに、又はＣＡＲとは別に、発現カセットに含まれる。
１０．追加の改変
いくつかの実施形態では、遺伝子組換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答調節及び修飾、並びに／若しくは生存率を促進するタンパク質、のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表４に列挙された遺伝子型を含む。いくつかの実施形態では、表４の遺伝子型のうちのいずれか１つを含むｉＰＳＣ及びその派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの破壊、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、エンゲージャ、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含み得る。
エンゲージャは、異なる抗体の２つ以上の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる融合タンパク質であり、エフェクター細胞表面分子又は表面トリガー受容体に結合する少なくとも１つの及び標的細胞特異的表面分子を介して標的細胞に結合する少なくとも別の１つを有する。エンゲージャの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）、多重特異性キラー細胞エンゲージャ、又は複数の免疫細胞型と適合し得るユニバーサルエンゲージャが含まれるが、これらに限定されない。したがって、エンゲージャは、二重特異性又は多重特異性であり得る。このような二重特異性又は多重特異性エンゲージャは、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／又は好中球）を腫瘍細胞に誘導し、免疫エフェクター細胞を活性化することができ、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の利益を最大化する大きな可能性を示している。
いくつかの実施形態では、エンゲージャは、同時又は連続投与によって、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞の集団と組み合わせて使用され、エフェクター細胞は、エンゲージャによって認識される表面分子又は表面トリガー受容体を含む。いくつかの他の実施形態では、エンゲージャは、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣの遺伝子操作及び操作されたｉＰＳＣの分化誘導を通じて派生エフェクター細胞によって発現される二重特異性抗体である。二重特異性若しくは多重特異性エンゲージャ認識、又はカップリングに使用できる例示的なエフェクター細胞表面分子又は表面トリガー受容体には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、及び本明細書に開示されるキメラＦｃ受容体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のために派生エフェクター細胞の表面に発現する外因性ＣＤ１６は、本明細書に記載されるような、ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む）又はＣＤ６４細胞外ドメイン、並びに天然又は非天然の膜貫通、刺激及び／又はシグナル伝達ドメインを含むｈｎＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、エンゲージャ認識のためにエフェクター細胞の表面に発現する外因性ＣＤ１６は、ＣＤ１６ベースのキメラＦｃ受容体（ＣＦｃＲ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ベースのＣＦｃＲは、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通ドメイン、２Ｂ４の刺激ドメイン、及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み、外因性ＣＤ１６の細胞外ドメインは、ＣＤ６４又はＣＤ１６の細胞外ドメインの全長又は部分配列に由来し、ＣＤ１６の細胞外ドメインは、Ｆ１７６Ｖ及び任意選択でＳ１９７Ｐを含む。
いくつかの実施形態では、エンゲージャのための標的細胞は、腫瘍細胞である。二重特異性又は多重特異性エンゲージャ認識のための例示的な腫瘍細胞表面分子には、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、及びＲＯＲ１が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、二重特異性エンゲージャは、ＣＤ３及びＣＤ１９に特異的な二重特異性抗体（ＣＤ３－ＣＤ１９）である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＣＤ３０又はＣＤ６４－ＣＤ３０である。別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ１６－ＢＣＭＡ又はＣＤ６４－ＢＣＭＡである。更に別の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３－ＣＤ３３である。
更に別の実施形態では、二重特異性抗体は、エフェクター細胞と腫瘍細胞抗原結合ドメインとの間のリンカーを更に含む。例えば、改変されたＩＬ１５が、エフェクター細胞増殖を促進するエフェクターＮＫ細胞のためのリンカーとして使用され得る（いくつかの刊行物では、ＴｒｉＫＥ、又は三重特異性キラーエンゲージャと呼ばれる）。一実施形態では、ＴｒｉＫＥはＣＤ１６－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭ又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＥＰＣＡＭである。別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＣＤ１６－ＩＬ１５－ＣＤ３３又はＣＤ６４－ＩＬ１５－ＣＤ３３である。更に別の実施形態では、ＴｒｉＫＥはＮＫＧ２Ｃ－ＩＬ１５－ＣＤ３３（「２Ｃ１５３３」）である。ＩＬ１５に加えて、ＴｒｉＫＥに含めるのに適したサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１８、及びＩＬ２１が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、二重特異性又は多重特異性のエンゲージャのための表面トリガー受容体は、ときには細胞型に応じて、エフェクター細胞に対して内因性であり得る。他のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物を使用して、すなわち、表４に列挙された遺伝子型を含むｉＰＳＣを更に操作し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はソースｉＰＳＣと同一の遺伝子型と表面トリガー受容体を含むその他のエフェクター細胞へのｉＰＳＣの分化を指示し、１つ以上の外因性表面トリガー受容体をエフェクター細胞に導入することができる。
１１．免疫療法のための抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格を含むゲノム操作されたエフェクター細胞に加えて、状態、疾患、又は指標に関連する抗原を標的とする抗体又は抗体断片を含む追加の治療剤をこれらのエフェクター細胞とともに併用療法にて使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、対象への同時又は連続投与によって、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞の集団と組み合わせて使用される。他の実施形態では、そのような抗体又はその断片は、当該抗体又はその断片をコードする外因性ポリヌクレオチド配列を使用してｉＰＳＣを遺伝子操作すること、及び操作されたｉＰＳＣの分化を指示することにより、エフェクター細胞によって発現され得る。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は外因性ＣＤ１６バリアントを発現し、エフェクター細胞の細胞傷害性は、ＡＤＣＣを介して抗体によって増強される。
いくつかの実施形態では、治療用抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、治療用抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、治療用抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、併用治療に適した治療用抗体は、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ、ペルツズマブ）、抗ＣＤ５２抗体（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ抗体（セツキシマブ）、抗ＧＤ２抗体（ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１抗体（アベルマブ）、抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３抗体（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、並びにそれらのヒト化又はＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物及びバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に好適な抗体は、標的細胞上の２つ以上の抗原若しくはエピトープを標的とするか、又は標的細胞を標的としながらエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、若しくはマクロファージ細胞）を標的細胞に向けて動員する、二重特異性抗体又は多重特異性抗体を更に含む。このような二重特異性又は多重特異性抗体は、エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、及び／又は好中球）を腫瘍細胞に誘導し、免疫エフェクター細胞を活性化することができるエンゲージャとして機能し、抗体療法の利益を最大化する大きな可能性を示している。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表４に列挙された遺伝子型を含む造血系統細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表４に列挙された遺伝子型を含むＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、表４に列挙された遺伝子型を含むＴ細胞を含む。
液性腫瘍又は固形腫瘍を治療するのに有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上、並びに任意選択で表４に提供されるような１つ以上の追加の遺伝子改変をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞又はｉＰＳＣ由来Ｔ細胞と、上記のような治療用抗体と、を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍を治療するのに有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格、並びに任意選択で、ＴＣＲノックアウト、ＣＡＲ、サイトカインシグナル伝達複合体、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、及びＣＤ３８ノックアウトを含むｉＰＳＣ由来ＮＫ又はＴ細胞と、上記のような治療用抗体と、を含む。液性腫瘍又は固形腫瘍を治療するのに有用な組み合わせのいくつかの実施形態では、組み合わせは、本明細書に記載の固形腫瘍標的化骨格、並びに任意選択で、ＴＣＲノックアウト、ＣＡＲ、ＩＬサイトカインシグナル伝達複合体、外因性ＣＤ１６又はそのバリアント、ＣＤ３８ノックアウト、及びＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損を含むｉＰＳＣ由来ＮＫ又はＴ細胞と、上記のような治療用抗体と、を含む。当該組み合わせの様々な実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載の固形腫瘍抗原を標的とする。様々な実施形態では、外因性ＣＤ１６は、ｈｎＣＤ１６である。理論によって束縛されるものではないが、ｈｎＣＤ１６は、モノクローナル抗体の増強されたＡＤＣＣを提供するが、ＣＡＲは、特異的腫瘍抗原を標的化するだけでなく、異なる腫瘍抗原を標的化するモノクローナル抗体と組み合わせた二重標的化戦略を使用して腫瘍抗原エスケープも防止する。
１２．チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子である。腫瘍が特定の免疫チェックポイント経路を、特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして選択していることが明らかになっている。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、チェックポイント遺伝子の発現又は遺伝子産物を減少させるか、又はチェックポイント分子の活性を低下させ、それによって、阻害性チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させることができるアンタゴニストである。ＰＤ１／ＰＤＬ１又はＣＴＬＡ４を標的化するチェックポイント阻害剤の開発により、腫瘍学の展望が変わり、これらの薬剤は複数の適応症で長期の寛解をもたらした。しかしながら、多くの腫瘍サブタイプはチェックポイント遮断療法に耐性があり、再発は依然として重大な懸念事項である。したがって、本出願の一態様は、ＣＩとの併用療法に、本明細書で提供されるようなゲノム操作された機能性ｉＰＳＣ由来細胞を含めることにより、ＣＩ耐性を克服するための治療アプローチを提供する。本明細書に記載の併用療法の一実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、ＮＫ細胞である。本明細書に記載の併用療法の別の実施形態では、ｉＰＳＣ由来細胞は、Ｔ細胞である。直接的な抗腫瘍能力を示すことに加えて、本明細書において提供される派生ＮＫ細胞は、ＰＤＬ１－ＰＤ１媒介阻害に抵抗し、Ｔ細胞遊走を増強し、Ｔ細胞を腫瘍微小環境に動員し、腫瘍部位でのＴ細胞活性化を増強する能力を有することが示されている。したがって、機能的に強力なゲノム操作された派生ＮＫ細胞によって促進されるＴ細胞の腫瘍浸潤は、当該ＮＫ細胞がチェックポイント阻害剤を含むＴ細胞標的免疫療法と相乗作用して、局所免疫抑制を緩和し、腫瘍量を低減することができることを示している。
併用療法のいくつかの実施形態では、チェックポイント阻害剤は、対象へのその同時投与又は連続投与によって、本明細書に記載される固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞の集団と組み合わせて使用される。いくつかの他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、当該チェックポイント阻害剤又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を使用してｉＰＳＣを遺伝子操作すること、及び操作されたｉＰＳＣの分化を指示することにより、エフェクター細胞によって発現される。本明細書に記載される固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞との併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的とするための少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、エフェクター細胞は、表４に列挙された遺伝子型を有する。
一実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のためのｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上、並びに任意選択で、表４に提供される１つ以上の追加の遺伝子改変をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含む。一実施形態では、チェックポイント阻害剤併用療法のためのｉＰＳＣ由来エフェクター細胞は、本明細書において提供される固形腫瘍標的化骨格と、任意選択で、ＣＡＲ、外因性ＣＤ１６発現、ＣＦＲ発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＣＤ３８ノックアウト、並びにサイトカインシグナル伝達複合体発現のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上と、を含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトが任意選択で含まれる。いくつかの実施形態では、派生ＮＫ細胞は、表４に列挙された遺伝子型のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される固形腫瘍標的化骨格を含む上記の派生エフェクター細胞は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失、破壊、又は発現低下、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含む。
様々な実施形態では、派生エフェクター細胞は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上、並びに任意選択で、ＣＡＲ発現、ＣＦＲ発現、外因性ＣＤ１６発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損、ＣＤ３８ノックアウト、及びサイトカインシグナル伝達複合体発現のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣクローン株を分化させることから得られ、Ｂ２Ｍがノックアウトされている場合、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチド、又はＣＤ５８及びＣＤ５４の一方若しくは両方のノックアウトが任意選択で導入される。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される固形腫瘍標的化骨格を含む上記のｉＰＳＣクローン株は、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＡＧ１、及び染色体６ｐ２１領域内の任意の遺伝子のうちの少なくとも１つの欠失、破壊、又は発現低下、又はＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、Ｆｃ受容体、及び二重特異性、多重特異性、若しくはユニバーサルエンゲージャとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、を更に含む。
本明細書で提供される派生ＮＫ又はＴ細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（retinoic acid receptor alpha、Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、及び３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（Ｉｇ ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はこれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用することができ、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ又は３つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、アベルマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、デュルバルマブ（抗ＰＤＬ１ｍＡｂ）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ）、ＩＰＨ４１０２（抗ＫＩＲ抗体）、ＩＰＨ４３（抗ＭＩＣＡ抗体）、ＩＰＨ３３（抗ＴＬＲ３抗体）、リリムマブ（抗ＫＩＲ抗体）、モナリズマブ（抗ＮＫＧ２Ａ抗体）、ニボルマブ（抗－ＰＤ１ｍＡｂ）、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ１ｍＡｂ）、及びそれらの派生体、機能的同等物、又はそれらのバイオシミラーの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、多くのｍｉＲＮＡが免疫チェックポイントの発現を制御する調節因子として見出されるため、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストはマイクロＲＮＡベースである（Ｄｒａｇｏｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２０１８，１５（２）：１０３－１１５）。いくつかの実施形態では、チェックポイント拮抗ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ－２８、ｍｉＲ－１５／１６、ｍｉＲ－１３８、ｍｉＲ－３４２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１３０ｂ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１９７、ｍｉＲ－２００ｃ、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－５７０、ｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５１３、及びｍｉＲ－２９ｃを含むがこれらに限定されない。
提供されるｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのチェックポイント分子を標的化する少なくとも１つのチェックポイント阻害剤を含み、ｉＰＳＣ由来細胞は、表４に列挙された遺伝子型を有する。提供される派生エフェクター細胞との組み合わせ療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。少なくとも４つのチェックポイント阻害剤及び表１に列挙された遺伝子型を有するｉＰＳＣ由来細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態では、当該チェックポイント阻害剤は、抗体、又はヒト化若しくはＦｃ改変バリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーであり、当該チェックポイント阻害剤は、当該抗体、又はその断片若しくはバリアントをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を発現することにより、ｉＰＳＣ由来細胞により産生される。いくつかの実施形態では、抗体をコードする外因性ポリヌクレオチド配列、又はチェックポイントを阻害するその断片若しくはバリアントは、別個の構築物内、又はＣＡＲと抗体若しくはその断片をコードする配列の両方を含むバイシストロン性若しくはトリシストロン性構築物内のいずれかで、ＣＡＲと共発現される。いくつかの更なる実施形態では、抗体又はその断片をコードする配列は、例えば、ＣＡＲ－２Ａ－ＣＩ又はＣＩ－２Ａ－ＣＡＲのように例示される自己切断２Ａコード配列を介してＣＡＲ発現構築物の５’又は３’末端のいずれかに連結され得る。したがって、チェックポイント阻害剤とＣＡＲのコード配列は、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にあり得る。チェックポイント阻害剤が送達され、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に浸潤することができる派生エフェクター細胞によってペイロードとして発現及び分泌されると、それは、ＴＭＥに結合すると阻害性チェックポイント分子を打ち消し、ＣＡＲなどのモダリティを活性化するか、又は受容体を活性化することによって、エフェクター細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、チェックポイント分子、ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、又は抑制性ＫＩＲのうちの少なくとも１つを阻害する。いくつかの実施形態では、表４に列挙される遺伝子型を有する派生細胞においてＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。いくつかの他の実施形態では、ＣＡＲと共発現するチェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ、又はそのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片又はそれらの機能的同等物又はバイオシミラーである。
本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣ由来細胞及びチェックポイント分子を阻害する少なくとも４つの抗体を含む併用療法のいくつかの他の実施形態では、当該抗体は、ｉＰＳＣ由来細胞によって、又はｉＰＳＣ由来細胞内で産生されず、表１に列挙されている遺伝子型を持つ派生細胞の投与の前、それと同時、又はその後に更に投与される。いくつかの実施形態では、提供される派生エフェクター細胞との組み合わせ療法における１つ、２つ、３つ以上のチェックポイント阻害剤の投与は、同時又は逐次的である。表４に列挙された遺伝子型を有する誘導ＮＫ細胞又は誘導Ｔ細胞を含む組み合わせ治療の一実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、及びそれらのヒト化、又はＦｃ改変バリアント、断片、及びそれらの機能的同等物又はバイオシミラーのうちの１つ以上である。表４に列挙された遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表４に列挙された遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。表４に列挙された遺伝子型を有する派生ＮＫ細胞又は派生Ｔ細胞を含む組み合わせ治療のいくつかの実施形態では、治療に含まれるチェックポイント阻害剤は、ペムブロリズマブ、又はそのヒト化若しくはＦｃ改変バリアント、断片及びその機能的同等物若しくはバイオシミラーである。
ＩＩ．ｉＰＳＣの選択された遺伝子座における標的化ゲノム編集のための方法
本明細書で互換可能に使用されるゲノム編集、又はゲノム編集、又は遺伝子編集は、標的細胞のゲノムにＤＮＡが挿入、欠失、及び／又は置換される一種の遺伝子工学である。標的化ゲノム編集（「標的化ゲノム編集」又は「標的化遺伝子編集」と互換可能である）は、ゲノム内の事前に選択された部位での挿入、欠失、置換を可能にする。標的化編集中に挿入部位で内因性配列が欠失すると、影響を受けた配列を含む内因性遺伝子は、配列欠失によりノックアウト又はノックダウンされる可能性がある。したがって、標的化編集を使用して、内因性遺伝子発現を正確に破壊することもできる。本明細書で同様に使用される用語「標的化組み込み」は、挿入部位での内因性配列の欠失を伴うか又は伴わない、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。対照的に、ランダムに組み込まれた遺伝子は位置効果とサイレンシングの影響を受けやすく、その発現は信頼できず、予測できない。例えば、セントロメア及びサブテロメア領域は、特に導入遺伝子サイレンシングを起こしやすい。相互に新しく組み込まれた遺伝子は、周囲の内因性遺伝子とクロマチンに影響を与え、細胞の挙動を変え、又は細胞の形質転換を促進する可能性がある。したがって、セーフハーバー遺伝子座やゲノムセーフハーバー（genomic safe harbor、ＧＳＨ）などの事前に選択された遺伝子座に外来性ＤＮＡを挿入することは、安全性、効率、コピー数制御、及び信頼性の高い遺伝子応答制御にとって重要である。
標的化編集は、ヌクレアーゼに依存しないアプローチ、又はヌクレアーゼに依存するアプローチのいずれかによって実現され得る。ヌクレアーゼに依存しない標的化編集アプローチでは、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して、挿入される外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって導かれる。
代替的に、特異的なレアカットエンドヌクレアーゼによる二本鎖切断（double strand break、ＤＳＢ）の特異的な導入により、より高い頻度で標的化編集を実現することができる。このようなヌクレアーゼ依存の標的化編集は、ＤＳＢに応答して発生する非相同末端結合（non-homologous end joining、ＮＨＥＪ）を含むＤＮＡ修復メカニズムを利用する。外因性の遺伝物質を含むドナーベクターがない場合、ＮＨＥＪは少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）をしばしば引き起こす。対照的に、一対のホモロジーアームと隣接する外因性遺伝物質を含むドナーベクターが存在する場合、相同組換えによる相同指向性修復（homology directed repair、ＨＤＲ）中に外因性遺伝物質がゲノムに導入され得、「標的化組み込み」がもたらされる。いくつかの状況において、標的化組み込み部位は、選択された遺伝子のコード領域内にあることが意図され、したがって、標的化組み込みは、遺伝子発現を破壊し、１つの単一編集ステップにおいて同時ノックイン及びノックアウト（ＫＩ／ＫＯ）をもたらし得る。
目的の遺伝子座（gene locus of interest、ＧＯＩ）における選択位置に１つ以上の導入遺伝子を挿入して、同時に遺伝子をノックアウトすることを達成することができる。同時ノックイン及びノックアウト（knock-in and knockout、ＫＩ／ＫＯ）に好適な遺伝子座には、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４４、ＣＤ５８、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴが含まれるが、これらに限定されない。位置選択的挿入のためのそれぞれの部位特異的標的化ホモロジーアームにより、導入遺伝子が、部位の内因性プロモータ下又は構築物に含まれる外因性プロモータ下のいずれかで発現されることが可能になる。２つ以上の導入遺伝子がＣＤ３８遺伝子座の選択された位置に挿入される場合、リンカー配列、例えば２Ａリンカー又はＩＲＥＳは、任意の２つの導入遺伝子の間に配置される。２Ａリンカーは、例えば、ＦＭＤＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ－Ｉ、又はＴａＶに由来する自己切断ペプチド（それぞれ「Ｆ２Ａ」、「Ｅ２Ａ」、「Ｐ２Ａ」、及び「Ｔ２Ａ」と呼ばれる）をコードし、単一の翻訳から別々のタンパク質を産生できるようにする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子及び／又は外因性プロモータサイレンシングのリスクを低減するために、構築物にインスレータが含まれる。種々の実施形態では、外因性プロモータは、ＣＡＧ、又はＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、及びＵＢＣを含むがこれらに限定されない他の構成的、誘導性、時間特異的、組織特異的、若しくは細胞型特異的プロモータであり得る。
特異的な標的化ＤＳＢを導入することができる利用可能なエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガヌクレアーゼ（zinc-finger nucleases、ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nucleases、ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats、クラスター化等間隔短鎖回分リピート）システムが含まれるが、これらに限定されない。更に、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（デュアルインテグラーゼカセット交換）システムも、標的化組み込みのための有望なツールである。
ＺＦＮは、ジンクフィンガＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「ジンクフィンガＤＮＡ結合ドメイン」又は「zinc finger DNA binding domain、ＺＦＢＤ」とは、１つ以上のジンクフィンガを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインを意味する。ジンクフィンガは、亜鉛イオンの配位により構造が安定化されるジンクフィンガ結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガの例には、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガ、Ｃ３Ｈジンクフィンガ、及びＣ４ジンクフィンガが含まれるが、これらに限定されない。「設計された」ジンクフィンガドメインは、天然に存在しないドメインであり、その設計／構成は主に合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計と結合データの情報を格納するデータベースの情報を処理するための置換ルールとコンピュータ化アルゴリズムの適用に起因する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号を参照されたい、国際公開第９８／５３０５８号、同第９８／５３０５９号、同第９８／５３０６０号、同第０２／０１６５３６号及び同第０３／０１６４９６号も参照されたい。「選択された」ジンクフィンガドメインは、その生産が主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、又はハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる天然では見られないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号及び同第７，９７２，８５４号で詳細に説明されており、それらの完全な開示は参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＺＦＮの例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガＤＮＡ結合ドメインとの融合である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインを意味する。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、感染中にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原体によって分泌される。これらのタンパク質は植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、トランス活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、反復可変残基（repeat variable-diresidue、ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置に多型を含む不完全な３４アミノ酸リピートのエフェクター可変数に依存する。ＴＡＬＥＮについては、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号により詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。当該技術分野で最も認識されているＴＡＬＥＮの例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインへのＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
本発明の方法で使用される標的化ヌクレアーゼの別の例は、標的化Ｓｐｏ１１ヌクレアーゼ、目的のＤＮＡ配列に特異性を有するＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインなどに融合したヌクレアーゼ活性を有するＳｐｏ１１ポリペプチドを含むポリペプチドである。
本発明の実施形態に適した標的化ヌクレアーゼの更なる例には、個別に又は組み合わせて使用されるかどうかにかかわらず、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が含まれるが、これらに限定されない。
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例には、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、ｃａｓ、ｃｐｆ、ｃｓｅ、ｃｓｙ、ｃｓｎ、ｃｓｄ、ｃｓｔ、ｃｓｈ、ｃｓａ、ｃｓｍ、及びｃｍｒを含むファミリーからのＣＲＩＳＰＲ関連のヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。
一例としてＣａｓ９を使用すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、２つの主要な成分：（１）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと（２）ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体とを必要とする。共発現すると、２つの成分が複合体を形成し、ＰＡＭ及びＰＡＭ近位のシーディング領域（seeding region）を含む標的ＤＮＡ配列に動員される。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせてキメラガイドＲＮＡ（guide RNA、ｇＲＮＡ）を形成し、Ｃａｓ９を選択した配列を標的に導くことができる。次いで、これら２つの成分は、トランスフェクション又は形質導入を介して哺乳動物細胞に送達できる。
ＤＩＣＥを介した挿入は、例えば、ｐｈｉＣ３１とＢｘｂ１などのリコンビナーゼの対を使用して、各酵素自体の小さなａｔｔＢ及びａｔｔＰ認識部位に厳しく制限されている外因性ＤＮＡの一方向の組み込みを提供する。これらの標的化ａｔｔ部位は哺乳類のゲノムには天然に存在しないため、最初に所望の組み込み部位のゲノムに導入する必要がある。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１４０６６５号（その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本発明の一態様は、標的化されたゲノム組み込みのための１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、所望の組み込み部位に特異的な一対の相同アームを更に含み、標的化組み込みの方法は、構築物を細胞に導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入してＺＦＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入してＴＡＬＥＮを介した挿入を可能にすることと、を含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、Ｃａｓ９発現カセット及び所望の組み込み部位に特異的なガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入してＣａｓ９を介した挿入を可能にすることと、を含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、一対のＤＩＣＥリコンビナーゼの１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を細胞内の所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥリコンビナーゼ用の発現カセットを導入し、ＤＩＣＥを介した標的化組み込みを可能にすることと、を含む。
標的化組み込みのための有望な部位には、ヒトのゲノムの遺伝子内又は遺伝子外領域であり、理論的には、宿主細胞又は生物に悪影響を与えることなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現に対応できる、セーフハーバー遺伝子座、又はゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。有用なセーフハーバーは、ベクターにコードされたタンパク質又は非コードＲＮＡの望ましいレベルを生成するために十分な導入遺伝子発現を可能にする必要がある。セーフハーバーはまた、細胞を悪性形質転換しやすくしたり、細胞機能を変化させたりするものであってはならない。組み込み部位が、可能性のあるセーフハーバー遺伝子座であるためには、理想的には、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たす必要がある：配列アノテーションによって判断されるような、調節エレメント又は遺伝子の破壊が存在しないこと、遺伝子密集領域内の遺伝子間領域、又は反対方向に転写された２つの遺伝子の間の収束位置であること、ベクターにコードされた転写活性化因子と、隣接する遺伝子、特にがん関連遺伝子及びマイクロＲＮＡ遺伝子のプロモータとの間の長距離相互作用の可能性を最小限にする距離を保つこと、並びに遍在的な転写活性を示す、広範な空間的及び時間的発現配列タグ（expressed sequence tag、ＥＳＴ）発現パターンによって反映されるような、明らかに遍在的な転写活性を有すること。この後者の特質は幹細胞で特に重要であり、幹細胞では、分化中にクロマチンのリモデリングが通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシングと他の遺伝子座の活性化の可能性をもたらす。外因性挿入に好適な領域内では、挿入のために選択された正確な遺伝子座は、反復要素と保存された配列を欠き、ホモロジーアームの増幅用のプライマーを簡単に設計することができるはずである。
ヒトゲノム編集、又は具体的には標的化組み込みに好適な部位には、アデノ随伴ウイルス部位１（adeno-associated virus site 1、ＡＡＶＳ１）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（chemokine(CC motif)receptor 5、ＣＣＲ５）遺伝子座、及びマウスＲＯＳＡ２６遺伝子座のヒトのオルソログが含まれるが、これらに限定されない。加えて、マウスＨ１１遺伝子座のヒトオルソログはまた、本明細書に開示される標的化組み込みの組成物及び方法を使用して挿入するための好適な部位であり得る。更に、コラーゲンとＨＴＲＰ遺伝子座は、標的化組み込みのためのセーフハーバーとしても使用され得る。しかしながら、選択した各部位の検証は、特定の組み込み事象のために特に幹細胞で必要であることが示されており、プロモータの選択、外因性遺伝子の配列と配置、構築物の設計などの挿入戦略の最適化がしばしば必要である。
標的化されたインデルのために、編集部位はしばしばその発現及び／又は機能が破壊されることが意図されている内因性遺伝子に含まれている。いくつかの実施形態では、標的化されたインデルを含む内因性遺伝子は、免疫応答の調節及び修飾に関連する。いくつかの他の実施形態では、標的化インデルを含む内因性遺伝子は、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬物標的候補、免疫応答調節及び修飾、あるいは幹細胞及び／又は前駆細胞、並びにそれらに由来する細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を抑制するタンパク質と関連する。
したがって、本発明の別の態様は、ゲノムセーフハーバーを含む選択された遺伝子座、又は本明細書において提供されるような、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＴＲＡＣ、若しくはＣＤ３８遺伝子座などの継続的又は一時的な遺伝子発現について安全かつ十分に調節されていることが既知の若しくは証明された事前に選択された遺伝子座における標的化組み込みの方法を提供する。一実施形態では、標的化組み込みの方法のためのゲノムセーフハーバーは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい組み込み部位を含む。一実施形態では、細胞への標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的な相同アームのペア及び１つ以上の外因性配列を含む構築物を細胞に導入して、細胞宿主酵素機構による部位特異的相同組換えを可能にすることと、を含み、望ましい組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む。更なる組み込み部位は、破壊、例えば減少又はノックアウトのために意図される内因性遺伝子座を含み、これは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。
別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＺＦＮ発現カセットを細胞に導入して、ＺＦＮ媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むＴＡＬＥＮ発現カセットを細胞に導入して、ＴＡＬＥＮ媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、所望の組み込み部位に特異的なＣａｓ９発現カセット、及びガイド配列を含むｇＲＮＡを細胞に導入して、Ｃａｓ９媒介挿入を可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。更に別の実施形態では、細胞における標的化組み込みの方法は、ＤＩＣＥレコンビナーゼの対の１つ以上のａｔｔ部位を含む構築物を細胞における所望の組み込み部位に導入することと、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入することと、ＤＩＣＥレコンビナーゼの発現カセットを導入して、ＤＩＣＥ媒介標的化組み込みを可能にすることと、を含み、所望の組み込み部位は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、又はＴＩＧＩＴを含む。
更に、本明細書で提供されるように、セーフハーバーでの標的化組み込みのための上述の方法は、目的のポリヌクレオチド、例えば、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、及び幹細胞及び／又は前駆細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するために使用される。いくつかの他の実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む構築物は、１つ以上のマーカー遺伝子を更に含む。一実施形態では、本発明の構築物中の外因性ポリヌクレオチドは、安全スイッチタンパク質をコードする自殺遺伝子である。誘導された細胞死のための好適な自殺遺伝子系としては、カスパーゼ９（又はカスパーゼ３若しくは７）及びＡＰ１９０３、チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）及びガンシクロビル（ganciclovir、ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼ（cytosine deaminase、ＣＤ）及び５－フルオロシトシン（5-fluorocytosine、５－ＦＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、一部の自殺遺伝子系は細胞型に特異的であり、例えば、Ｂ細胞分子ＣＤ２０によるＴリンパ球の遺伝子改変は、ｍＡｂリツキシマブの投与時にそれらを排除することができる。更に、セツキシマブによって認識されるエピトープを含む改変されたＥＧＦＲは、細胞がセツキシマブに曝露されたときに遺伝子操作された細胞を枯渇させるために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、カスパーゼ９（カスパーゼ３又は７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、改変ＥＧＦＲ、及びＢ細胞ＣＤ２０から選択される安全スイッチタンパク質をコードする１つ以上の自殺遺伝子の標的化組み込みの方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって組み込まれた１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的化組み込みのための構築物に含まれる作動可能に連結された外因性プロモータによって駆動される。プロモータは誘導性又は構成的であり得、そして時間特異的、組織特異的又は細胞型特異的であり得る。本発明の方法に適した構成的プロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、伸長因子１α（ＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサ／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモータが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、外因性プロモータはＣＡＧである。
本明細書に記載される方法によって組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、組み込み部位において、宿主ゲノム中の内因性プロモータによって駆動され得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞のゲノムにおけるＡＡＶＳ１遺伝子座における１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＡＡＶＳ１プロモータによって駆動される。別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞のゲノムにおけるＲＯＳＡ２６遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＲＯＳＡ２６プロモータによって駆動される。更に別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞のゲノムにおけるＨ１１遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性Ｈ１１プロモータによって駆動される。別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞のゲノムにおけるコラーゲン遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性コラーゲンプロモータによって駆動される。更に別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞のゲノムにおけるＨＴＲＰ遺伝子座での標的化組み込みのために使用される。一実施形態では、少なくとも１つの組み込まれたポリヌクレオチドは、内因性ＨＴＲＰプロモータによって駆動される。理論的には、所望の位置での正しい挿入のみが、内因性プロモータによって駆動される外因性遺伝子の遺伝子発現を可能にするであろう。
いくつかの実施形態では、標的化組み込みの方法のための構築物に含まれる１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つのプロモータによって駆動される。いくつかの実施形態では、構築物は、同じプロモータによって駆動される２つの隣接するポリヌクレオチド間に１つ以上のリンカー配列を含み、部分間の物理的分離を高め、酵素機構へのアクセスを最大にする。リンカー配列のリンカーペプチドは、関連する機能に応じて、部分（外因性ポリヌクレオチド、及び／又はそこからコードされるタンパク質又はペプチド）間の物理的分離をより柔軟又はより堅くするように選択されたアミノ酸からなり得る。リンカー配列は、プロテアーゼにより切断可能であり得るか、又は化学的に切断可能であり、別個の部分を生じ得る。リンカーにおける酵素的切断部位の例には、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼ、及びトロンビンなどのタンパク質分解酵素による切断のための部位が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるものであるか、又は外因的に導入される。代替的に、リンカー中の切断部位は、選択された化学物質、例えば臭化シアン、ヒドロキシルアミン、又は低ｐＨへの曝露時に切断され得る部位であり得る。必要に応じたリンカー配列は、切断部位の提供以外の目的を果たし得る。リンカー配列は、部分が適切に機能するために、別の隣接部分に対する部分の効果的な配置を可能にするべきである。リンカーはまた、部分間のいずれかの立体障害を防ぐのに十分な長さの単純なアミノ酸配列であってもよい。加えて、リンカー配列は、例えば、リン酸化部位、ビオチン化部位、硫酸化部位、γ－カルボキシル化部位などを含むがこれらに限定されない翻訳後改変を提供することができる。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、生物学的に活性なペプチドを単一の望ましくない立体配座に保持しないように柔軟である。リンカーは、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、及びセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸から主になっていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカー配列の約８０～９０パーセント以上が、グリシン、アラニン、又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ４Ｓリンカーペプチドは、融合タンパク質の末端プロセシング及びエンドヌクレアーゼドメインを分離する。他の実施形態では、２Ａリンカー配列は、２つの別個のタンパク質が単一の翻訳から産生されることを可能にする。好適なリンカー配列は、経験的に容易に同定することができる。加えて、リンカー配列の好適なサイズ及び配列はまた、従来のコンピュータモデリング技術によって決定され得る。一実施形態では、リンカー配列は、自己切断ペプチドをコードする。一実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａである。いくつかの他の実施形態では、リンカー配列は、配列内リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Sequence、ＩＲＥＳ）を提供する。いくつかの実施形態では、任意の２つの連続するリンカー配列は異なる。
標的化組み込みのための外因性ポリヌクレオチドを含む構築物を細胞に導入する方法は、それ自体既知の細胞への遺伝子移入の方法を使用して達成することができる。一実施形態では、構築物は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターの骨格を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞（例えば、ｐＡｌ－１１、ｐＸＴｌ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などに送達及び／又は発現するために使用される。いくつかの他の実施形態では、エピソームベクターは、外因性ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するために使用される。いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を遺伝子操作に使用して、相同組換えを介して挿入、欠失、又は置換を導入することができる。レンチウイルスとは異なり、ｒＡＡＶは宿主ゲノムに組み込まれない。加えて、エピソームｒＡＡＶベクターは、従来の標的化プラスミドのトランスフェクションと比較して、相同指向性遺伝子標的化をはるかに高い割合で仲介する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ６又はＡＡＶ２ベクターを使用して、ｉＰＳＣのゲノム中の標的部位に挿入、欠失、又は置換を導入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物を使用して取得されたゲノム改変されたｉＰＳＣ及びそれらの派生細胞は、表４に列挙された少なくとも１つの遺伝子型を含む。
ＩＩＩ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを取得及び維持する方法
様々な実施形態では、本発明はまた、１つ以上の所望の部位での１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得及び維持する方法も提供し、１つ以上の標的化編集（例えば、多重操作）は、増殖されたゲノム操作されたｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ由来非多能性細胞において、それぞれの選択した編集部位で無傷で機能的であり続ける。標的化編集は、ｉＰＳＣとその派生細胞のゲノムに、挿入、欠失、及び／又は置換（すなわち、選択した部位での標的化組み込み及び／又はインデル）を導入する。患者由来の末梢血由来一次エフェクター細胞の直接操作と比較して、本明細書で提供されるｉＰＳＣの編集及び分化を通じて由来するゲノム操作された派生細胞を取得することの多くの利点としては、操作されたエフェクター細胞の供給源が無制限であること、特に複数の操作された様式が関与する場合、エフェクター細胞の反復操作の必要がないこと、得られたエフェクター細胞が、伸長したテロメアを有し、消耗が少ないために若返っていること、エフェクター細胞集団は、編集部位、コピー数、並びに対立遺伝子変異、ランダム突然変異及び発現多様性（variegation）の欠如に関して均質であり、これは主に、本明細書において提供される操作されたｉＰＳＣにおけるクローン選択が可能であることに起因する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の選択された部位に１つ以上の標的化編集を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、細胞維持培養培地（ＦＭＭ）内で長期間単一細胞として維持、継代、及び増殖され、ｉＰＳＣは、選択された部位で標的化編集と機能改変を保持する。ＦＭＭ中で培養されたｉＰＳＣは、それらの未分化プロファイル及び基底プロファイル又はナイーブプロファイルを維持し続け；培養洗浄又は選択を必要としないゲノム安定性を提供し；並びに３つの体細胞系統全て、胚様体又は単層（胚様体を形成しない）を介したインビトロ分化、及びテラトーマ形成によるインビボ分化を容易に生じることが示されている。例えば、国際公開第２０１５／１３４６５２号（その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地（ＦＭＭ）中で維持され、継代され、増殖され、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まないか、又は本質的に含まず、ｉＰＳＣは、選択された部位において無傷で機能的な標的化編集を保持する。
本発明の別の態様は、ｉＰＳＣの標的化編集を通じて、あるいは最初に標的化編集によりゲノム操作非多能性細胞を生成し、次に選択／分離されたゲノム操作非多能性細胞をリプログラミングして非多能性細胞と同じ標的化編集を含むｉＰＳＣを取得することを通じて、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法を提供する。本発明の更なる態様は、標的化組み込み及び／又は標的化インデルを細胞に導入することによって同時にリプログラミングを受けているゲノム操作非多能性細胞を提供し、接触した非多能性細胞はリプログラミングに十分な条件下にあり、リプログラミングの条件は、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることを含む。同時のゲノム操作及びリプログラミングのための方法の様々な実施形態では、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び任意選択で１つ以上の小分子と接触させることによりリプログラミングを開始する前に、又は本質的に同時に、非多能性細胞に標的化組み込み及び／又は標的化インデルを導入することができる。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞を同時にゲノム操作及びリプログラミングするために、標的化組み込み及び／又はインデルはまた、非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子及び小分子と接触させることによりリプログラミングの複数日のプロセスが開始された後に非多能性細胞に導入され得、リプログラミング細胞がＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１及びＣＤ３０を含むがこれらに限定されない１つ以上の内因性多能性遺伝子の安定した発現を示す前に、構築物を担持するベクターが導入される。
いくつかの実施形態では、リプログラミングは、非多能性細胞を少なくとも１つのリプログラミング因子、及び任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせと接触させることにより開始される。いくつかの実施形態では、上述の任意の方法によって産生されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む混合物を使用して更に維持及び増殖される。
ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ｉＰＳＣに１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを導入してｉＰＳＣをゲノム操作し、本明細書において提供される遺伝子型を有するゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することを含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）１つ以上の標的化編集を非多能性細胞に導入して、選択した部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作された非多能性細胞を取得することと、（ｂ）ゲノム操作された非多能性細胞を１つ以上のリプログラミング因子、並びに必要に応じてＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、選択された部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得することと、を含む。代替的に、ゲノム操作されたｉＰＳＣを生成する方法は、（ａ）非多能性細胞を、１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択で、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子組成物と接触させて、非多能性細胞のリプログラミングを開始することと、（ｂ）ゲノム操作のためにリプログラミング非多能性細胞に１つ以上の標的化組み込み及び／又はインデルを導入することと、（ｃ）選択された部位に標的組み込み及び／又はインデルを含むクローンのゲノム操作されたｉＰＳＣを得ることと、を含む。上記方法のうちのいずれかは、クローンｉＰＳＣを取得するためのゲノム操作されたｉＰＳＣのシングルセルソーティング、並びに／又はゲノム操作ｉＰＳＣにおけるオフターゲット編集及び異常な核型についてのスクリーニングを更に含み得る。ゲノム操作されたｉＰＳＣのクローン増殖を通じて、本明細書で提供されるような少なくとも１つの表現型を有する単一細胞ソーティング及び増殖されたクローン操作ｉＰＳＣを含むようにマスター細胞バンクが生成される。マスター細胞バンクは、続いて凍結保存され、更なるｉＰＳＣ操作のためのプラットフォーム、及び既製の操作された均質な細胞療法製品を製造するための再生可能な供給源を提供し、これらの製品は、組成が明確かつ均一であり、費用効果の高い様式でかなりの規模で大量生産することができる。
リプログラミング因子は、国際公開第２０１５／１３４６５２号及び同第２０１７／０６６６３４号に開示されているような、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＳＶ４０ＬＴ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、Ｌ１ＴＤ１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１つ以上のリプログラミング因子は、ポリペプチドの形態であり得る。リプログラミング因子はまた、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドの形態であり得、したがって、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、プラスミド、及びミニサークルなどのベクターによって非多能性細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターによって導入される。様々な他の実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、センダイウイルスベクターによって導入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、プラスミドの組み合わせによって導入される。例えば、国際公開第２０１９／０７５０５７（Ａ１）号（その開示が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、非多能性細胞は、同一の又は異なる選択された部位での標的化組み込みのための複数のベクターによって、異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモータを含む複数の構築物でトランスフェクトされる。これらの外因性ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、又は標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／又は生存率を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンス核酸を含むがこれらに限定されないＲＮＡをコードする。これらの外因性ポリヌクレオチドは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、時間特異的プロモータ、及び組織特異的又は細胞型特異的プロモータからなる群から選択される１つ以上のプロモータによって駆動され得る。したがって、ポリヌクレオチドは、プロモータを活性化する条件下で、例えば、誘導剤の存在下で、又は特定の分化した細胞型で発現可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｉＰＳＣ及び／又はｉＰＳＣから分化した細胞で発現される。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子は、構成的プロモータにより駆動され、例えば、ＣＡＧにより駆動されるキャパーゼ－９である。異なる外因性ポリヌクレオチド及び／又は異なるプロモータを含むこれらの構築物は、同時又は連続的に非多能性細胞にトランスフェクトすることができる。複数の構築物の標的化組み込みに供される非多能性細胞は、１つ以上のリプログラミング因子に同時に接触させて、ゲノム操作と同時にリプログラミングを開始でき、これにより、同じ細胞のプールに複数の標的化組み込みを含むゲノム操作されたｉＰＳＣを取得できる。このように、この堅牢な方法により、同時のリプログラミングと操作戦略により、選択された１つ以上の標的部位内に組み込まれた複数のモダリティを持つクローンゲノム操作されたｉＰＳＣを誘導できる。
ＩＶ．ゲノム操作されたｉＰＳＣを分化させることにより遺伝子操作されたエフェクター細胞を取得する方法
本発明の更なる態様は、奇形腫形成によるゲノム操作されたｉＰＳＣのインビボ分化の方法を提供し、ゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、所望の部位で標的化組み込み及び／又はインデルを含む無傷で機能的な標的化編集を保持する。いくつかの実施形態では、奇形腫形成を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＣＤ３８、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲ、若しくはＲＵＮＸ１、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の望ましい部位に組み込まれた１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、奇形腫形成を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、標的化モダリティをコードするポリヌクレオチド、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む奇形腫形成を介してゲノム操作されたｉＰＳＣからインビボで誘導された分化細胞は、免疫応答の調節及び媒介に関連する内因性遺伝子の１つ以上のインデルを更に含む。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、１つ以上の内因性ＭＨＣクラスＩサプレッサ遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要組織適合性複合体と関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα又はβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴを含むが、これらに限定されない、１つ以上の内因性遺伝子に含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１つ以上の遺伝子改変を含むゲノム操作されたｉＰＳＣは、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をインビトロで誘導するために使用され、誘導された非多能性細胞は、選択された部位で標的化編集を含む機能的遺伝子改変を保持する。いくつかの実施形態では、造血細胞系統又は他の特定の細胞型をインビトロで誘導するために使用されるゲノム操作されたｉＰＳＣは、凍結保存され、それらの使用直前に解凍される、マスター細胞バンク細胞である。一実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ派生細胞は、決定的な造血内皮（ＨＥ）能を有する中胚葉細胞、決定的なＨＥ、ＣＤ３４＋造血細胞、造血幹前駆細胞、造血多能性前駆体（ＭＰＰ）、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、骨髄細胞、好中球前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、好中球、樹状細胞、及びマクロファージを含むがこれらに限定されず、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来する細胞は、所望の部位で標的化編集を含む機能的な遺伝子改変を保持する。
ｉＰＳＣ由来造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法及び組成物には、例えば、国際公開第２０１７／０７８８０７号に示されるものが含まれ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法と組成物は、無血清、フィーダーを含まない、及び／又は間質を含まない条件下で、スケーラブルで単層のＥＢ形成を必要としない培養プラットフォームにおいて、ｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する決定的な造血内皮（ＨＥ）を介する。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞及び分化転換細胞にコミットした前駆細胞、及び多能性中間体を経由せずに造血運命に直接移行した様々な系統の細胞にまで及ぶ。同様に、幹細胞を分化させることによって産生される細胞は、多能性幹細胞又は前駆細胞から、最終分化細胞まで、及び全ての介在する造血細胞系統にまで及ぶ。
単層培養において造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化及び増殖させる方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、及び任意選択でｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が得られ、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく増殖される。次いで、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＷＮＴ経路活性化因子との接触に供して、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、決定的な造血内皮（ＨＥ）能を有する増殖中胚葉細胞を取得する。その後のｂＦＧＦとの接触、及び任意選択でＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＷＮＴ経路活性化因子との接触により、決定的なＨＥ能を有する中胚葉細胞は、同様に分化中に増殖される、決定的なＨＥ細胞に分化する。
本明細書で提供される造血系統の細胞を得るための方法はＥＢ媒介の多能性幹細胞分化より優れているが、これは、ＥＢ形成が適度な増殖から最小限の細胞増殖をもたらし、均一な増殖を必要とする多くの用途で重要な単層培養、及び集団内の細胞の均一な分化を可能にせず、骨が折れ、効率が低くなるためである。
提供されている単層分化プラットフォームは、造血幹細胞及びＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、及びＮＫ細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす決定的な造血内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、増強された分化効率と大規模な増殖を組み合わせ、種々の治療用途のための多能性幹細胞由来造血細胞の治療上適切な数の送達を可能にする。更に、本明細書で提供される方法を使用した単層培養は、インビトロ分化、インビボ修飾、及びインビボ長期造血自己複製、再構成及び生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されているように、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞には、決定的な造血内皮、造血多能性前駆細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、Ｔ細胞前駆体、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに好中球が含まれるがこれらに限定されない。
したがって、種々の実施形態では、決定的な造血系統の細胞への多能性幹細胞の分化を指示するための方法は、（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子、及び必要に応じてｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞からの中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることと、（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む組成物と接触させて、中胚葉細胞からの決定的なＨＥの可能性を有する中胚葉細胞の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、ことと、（ｉｉｉ）決定的なＨＥ能を有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、及びＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに任意選択でＷｎｔ経路活性化因子を含む組成物と接触させて、決定的な造血内皮能を有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞からの決定的な造血内皮の分化及び増殖を開始させることであって、組成物は、任意選択でＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない、ことと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞を、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させ、多能性幹細胞を播種及び増殖させることを更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、又はナイーブｉＰＳＣ、又は１つ以上の遺伝的インプリントを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝的インプリントは、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。
上述の方法のいくつかの実施形態では、取得された多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、取得された決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４－ＣＤ７３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ９３－である。いくつかの実施形態では、決定的な造血内皮細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９３－である。
上述の方法のいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインと、任意選択でＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆体への決定的な造血内皮の分化を開始させることと、任意選択で、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない組成物と接触させて、Ｔ細胞前駆体又はＴ細胞へのプレＴ細胞前駆体の分化を開始させることと、を更に含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来Ｔ細胞前駆体は、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。
多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための上記方法の更にいくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）多能性幹細胞由来の決定的な造血内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤；ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカイン、並びに必要に応じてＢＭＰ活性化因子を含む組成物と接触させ、決定的な造血内皮のプレＮＫ細胞前駆体への分化を開始することと、必要に応じて（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆体を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の増殖因子及びサイトカインを含む組成物と接触させ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子、及びＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まない培地は、プレＮＫ細胞前駆体からＮＫ細胞前駆体又はＮＫ細胞への分化を開始することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ前駆体は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋であり、必要に応じて、ＮＫｐ４６＋、ＣＤ５７＋及びＣＤ１６＋であることによって更に規定される。
いくつかの実施形態では、上記の方法から得られるゲノム操作ｉＰＳＣ由来細胞は、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ＧＡＰＤＨ、ＲＵＮＸ１、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはβ定常領域、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴ、又はゲノムセーフハーバーの基準を満たす他の遺伝子座を含む、１つ以上の所望の組み込み部位で組み込まれる１つ以上の誘導性自殺遺伝子を含む。いくつかの他の実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又は幹細胞及び／若しくは前駆細胞の輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、及び／若しくは生存率を促進するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、チェックポイント遺伝子、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子、及びＭＨＣクラスＩサプレッサ遺伝子を含むがこれに限定されない、免疫応答調節及び媒介と関連する１つ以上の内因性遺伝子に含まれる１つ以上のインデルを更に含む。一実施形態では、１つ以上の自殺遺伝子を含むゲノム操作されたｉＰＳＣ由来細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子にインデルを更に含み、Ｂ２Ｍがノックアウトされている。
加えて、第１の運命のゲノム操作造血細胞から第２の運命のゲノム操作造血細胞を取得するための適用可能な脱分化方法及び組成物は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２０１１／１５９７２６号に示されているものを含む。その中で提供される方法及び組成物は、リプログラミング中に内因性Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を制限することによって、開始非多能性細胞を非多能性中間細胞に部分的にリプログラミングすることを可能にし、非多能性中間細胞を、中間細胞を所望の細胞型に分化させるための条件に供する。
Ｖ．遺伝子操作されたｉＰＳＣから分化した機能的モダリティを有する派生免疫細胞の治療的使用
本発明は、いくつかの実施形態では、開示される方法及び組成物を使用してゲノム操作されたｉＰＳＣから分化された機能的に増強された派生免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本組成物のｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に保持可能な本明細書で開示される１つ以上の標的化遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣ及びその派生細胞は、細胞ベースの養子療法に適している。一実施形態では、本組成物の遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来ＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来プロＴ細胞又はＴ細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来プロＮＫ細胞又はＮＫ細胞を含む。一実施形態では、組成物の遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ｉＰＳＣ由来免疫調節細胞又は骨髄由来のサプレッサ細胞（myeloid derived suppressor cell、ＭＤＳＣ）を含む。
組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来遺伝子操作エフェクター細胞は、改善された治療の可能性のために、エクスビボで更に調節される。本組成物の一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリＴ細胞及び／若しくはセントラルメモリＴ細胞の数又は比率の増加を含む。本組成物の一実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたエフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞の数又は比率の増加を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作エフェクター細胞の単離された集団又は亜集団は、適応ＮＫ細胞の数又は比率の増加を含む。本組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、若しくは骨髄由来サプレッサ細胞の単離された集団又は亜集団は、同種異系である。組成物のいくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣに由来する遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はＭＤＳＣの単離された集団又は亜集団は自家性である。
組成物のいくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、由来エフェクター細胞において望ましい治療特性を伝えるために選択された遺伝子インプリントを含み、分化中の細胞発生生物学が破壊されず、当該ｉＰＳＣ由来分化造血細胞において遺伝子インプリントが保持され、機能的であることを条件とする。
組成物のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的インプリントは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングする間若しくはその後に、多能性細胞のゲノムにおけるゲノム挿入、欠失若しくは置換を通じて得られる１つ以上の遺伝子組換えモダリティ、又は（ｉｉ）ドナー、疾患、若しくは治療応答に特異的である、供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療特性を含み、多能性細胞は、供給源特異的免疫細胞からリプログラミングされ、ｉＰＳＣは、供給源治療特性を保持し、供給源治療特性はまた、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞にも含まれている。
組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子組換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、標的化モダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質及びペプチド、薬物標的候補、又はｉＰＳＣ若しくはその派生細胞の生着、輸送、ホーミング、生存能力、自己複製、持続性、免疫応答調節及び修飾、並びに／若しくは生存率を促進するタンパク質、のうちの１つ以上を含む。組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子改変ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、表４に列挙された遺伝子型を含む。組成物のいくつかの他の実施形態では、表４に列挙される遺伝子型を含む遺伝子改変ｉＰＳＣ及びその派生細胞は、（１）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲα若しくはＴＣＲβ定常領域（ＴＲＡＣ若しくはＴＲＢＣ）、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、若しくはＴＩＧＩＴの欠失若しくは破壊、及び／又は（２）二重特異性若しくはユニバーサルエンゲージャとのカップリングのためのＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、若しくは表面トリガー受容体の導入を含む追加の遺伝子組換えモダリティを更に含む。
組成物の更にいくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞は、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、（ｉ）増加された細胞傷害性、（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、（ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、及び（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力のうちの１つ以上に関連する供給源特異的免疫細胞の治療特性を含む。組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞は、腫瘍部位におけるエフェクター細胞のホーミング又は輸送及び保持を促進するという治療特性を更に含む。
組成物のいくつかの実施形態では、表４に列挙される遺伝子型を含むｉＰＳＣ由来造血細胞は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、若しくはＩＬ２１の全て若しくは一部分を含む少なくとも１つのサイトカインシグナル伝達複合体、又はそれらの任意の改変タンパク質を発現し、少なくとも本発明に記載されるＣＡＲを発現する。組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格を含み、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５、及びＩＬ２１を含む少なくとも１つのサイトカインシグナル伝達複合体を発現する。組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格を含み、ＩＬ７又はＩＬ１５を含む少なくとも１つのサイトカインシグナル伝達複合体を発現する。本組成物のいくつかの実施形態では、サイトカイン（複数可）及びＣＡＲ（複数可）の操作された発現は、ＮＫ細胞特異的である。組成物のいくつかの他の実施形態では、サイトカイン及びＣＡＲの操作された発現は、Ｔ細胞特異的である。組成物のいくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血エフェクター細胞は、抗原特異的である。組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、液体腫瘍を標的とする。組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的派生エフェクター細胞は、固形腫瘍を標的とする。組成物のいくつかの実施形態では、抗原特異的ｉＰＳＣ由来造血エフェクター細胞は、腫瘍抗原エスケープを救済することができる。更に、本出願は、適合するケモカインの腫瘍細胞発現を上方制御して、エフェクター細胞腫瘍部位ホーミング、輸送及び保持を増大させる腫瘍感作手順と相乗作用することができる合理的に設計されたエフェクター細胞を提供することによって、併用治療アプローチを可能にし、これは、エフェクター細胞の細胞傷害性及び持続性の増大に寄与する。
本明細書で提供されるように、腫瘍細胞を感作物質（例えば、放射線）に曝露することは、腫瘍細胞による、ケモカインＩＬ８を含むがこれに限定されないストレスリガンドの分泌及び／又は表面発現を上昇させる。従って、本明細書中に記載されるような感作による腫瘍プレコンディショニングは、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントを過剰発現するエフェクター細胞の治療有効性を更に増強するための更なる戦略を提供する。理論に制限されることなく、腫瘍感作は、潜在的な腫瘍形成機構（細胞周期進行、炎症、増殖、アポトーシス、浸潤、灌流、転移、及び血管新生を含むが、これらに限定されない）を調節して、腫瘍細胞を、本明細書に記載される所望の操作された治療特性を有する同種異系エフェクター細胞などの別の選択的薬物の活性に対してより感受性にし、それによって、腫瘍を標的とする治療エフェクター細胞の有効性を増強することによって、腫瘍抵抗性を克服するために利用され得る。
理論に束縛されるものではないが、本明細書に開示される組成物及び方法において有用な例示的な感作物質としては、放射線療法、放射性医薬品、又は化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されない。従って、上記で議論した組成物は、上記のような感作物質を更に含み得る。様々な実施形態では、感作物質は、腫瘍細胞との接触時に、腫瘍細胞によるＣＸＣＬ８を含むケモカインの分泌及び／又は表面発現を増加させる。
放射線療法の実施形態としては、高エネルギービーム（例えば、Ｘ線、ガンマ線、光子、陽子、中性子、イオン、及びそのような治療に適用可能な任意の他の形態のエネルギー）が機械によって生成され、腫瘍に向けられる、外部ビーム放射線療法；放射線源／粒子を含有するか、さもなければそれに連結されたシード、リボン、又はカプセルが、腫瘍又はがん細胞内又はその近くに配置される、近接照射療法を含むが、これらに限定されない。放射性薬物（例えば、放射性ペプチドを含む放射性医薬品又は放射性核種）の実施形態は、標的化分子（例えば、抗体コンジュゲート）に連結された放射性化合物を含む。
様々な実施形態では、がん又は腫瘍細胞に曝露されるか、又は接触する放射線剤の量は、約０．０００１Ｇｙ～約８０Ｇｙの範囲である。したがって、いくつかのいくつかの実施形態では、対象に提供される、及び／又は本明細書で提供される組成物に含まれる感作物質の量は、少なくとも約０．０００１Ｇｙ、少なくとも約０．０００５Ｇｙ、少なくとも約０．００１Ｇｙ、少なくとも約０．００１５Ｇｙ、少なくとも約０．０１Ｇｙ、少なくとも約０．０１５Ｇｙ、少なくとも約０．１Ｇｙ、少なくとも約０．１５Ｇｙ、少なくとも約１．０Ｇｙ、少なくとも約１．５Ｇｙ、少なくとも約１０．０Ｇｙ、少なくとも約１５Ｇｙ、少なくとも約２０．０Ｇｙ、少なくとも約２５．０Ｇｙ、少なくとも約３０．０Ｇｙ、少なくとも約３５．０Ｇｙ、少なくとも約４０．０Ｇｙ、少なくとも約４５．０Ｇｙ、少なくとも約５０．０Ｇｙ、少なくとも約５５．０Ｇｙ、少なくとも約６０．０Ｇｙ、少なくとも約６５．０Ｇｙ、少なくとも約７０．０Ｇｙ、少なくとも約７５．０Ｇｙ、少なくとも約８０．０Ｇｙ、又はその間の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、感作物質の量は、約２５．０Ｇｙである。
放射性医薬品として有用な放射性化合物の例としては、カルシウム－４７、炭素－１１、炭素－１４、クロム－５１、コバルト－５７、コバルト－５８、エルビウム－１６９、フッ素－１８、ガリウム－６７、ガリウム－６８、水素－３、インジウム－１１１、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、インジウム－５９、クリプトン－８１ｍ、ルテチウム－１７７、窒素－１３、酸素－１５、リン－３２、ラジウム－２２３、ルビジウム－８２、サマリウム－１５３、セレン－７５、ナトリウム－２２、ナトリウム－２４、ストロンチウム－８９、テクネチウム－９９ｍ、タリウム－２０１、キセノン－１３３、及びイットリウム－９０が挙げられるが、これらに限定されない。
腫瘍細胞感作に使用できる可能性のある例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンＤ）、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、並びにアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。他の好適な化学療法剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師や腫瘍学者の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）のいずれかを参照でき、どちらも随時更新される。
本明細書に開示される派生エフェクター細胞及び／又は組成物を養子細胞療法に好適な対象に導入することにより、種々の疾患を改善することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｉＰＳＣ由来造血細胞又は組成物は、同種異系養子細胞療法のためのものである。加えて、本発明は、いくつかの実施形態において、養子細胞療法に好適な対象に細胞又は組成物を導入することによる、上記免疫細胞及び／又は治療用組成物及び／又は併用療法の治療的使用であって、対象が自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、又はＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、若しくはＢＫポリオーマウイルスと関連する感染を有する、治療的使用を提供する。血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性白血病（急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia、ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia、ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia、ＣＭＬ）、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin lymphoma、ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。固形がんの例としては、限定されないが、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、乳がん、乳肺がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、胃／胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、転移性がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、唾液腺がん、皮膚がん、精巣腫瘍、甲状腺腫瘍、尿路上皮がん、及び子宮／子宮内膜がんが挙げられる。様々な自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、類天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、リウマチ様関節炎、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が含まれるが、これらに限定されない。ウイルス感染症の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルス－関連疾患が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示されている実施形態の由来造血系統細胞又は本明細書で提供される組成物を使用する治療は、症状の提示に基づいて又は再燃防止のために行うことができる。「治療すること」、「治療」などの用語は、本明細書では、概して、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を取得することを意味するために使用される。効果は、疾患を完全に若しくは部分的に予防することに関して予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用の部分的若しくは完全な治癒に関して治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患のあらゆる介入を網羅し、以下を含む：疾患にかかりやすいが、まだそれを有していると診断されていない対象において疾患が生じることを予防すること、疾患を阻害する、すなわちその発症を阻止すること、又は疾患を緩和する、すなわち疾患を後退させること。治療剤及び／又は組成物は、疾患又は傷害の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化又は軽減させる進行中の疾患の治療もまた、特に重要である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも１つの関連する症状を抑制、改善、及び／又は改善することができる疾患、状態、及び／又は傷害を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄又は幹細胞移植の候補、化学療法又は放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害又はがん、例えば、造血系の過剰増殖性障害又はがんを有するか又は有するリスクがある対象、腫瘍、例えば、固形腫瘍を有するか又は発症するリスクがある対象、ウイルス感染又はウイルス感染と関連する疾患を有するか又は有するリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
本明細書に開示された実施形態の由来造血系統細胞を含む治療に対する応答性を評価するとき、応答は、臨床的利益率、死亡までの生存率、病理学的完全奏功、病理学的応答の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存、無転移生存、無病生存、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答、及びＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors））基準、のうちの少なくとも１つによって測定できる。
本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含む治療用組成物は、上記のように、がん又は腫瘍細胞の感作を含む他の処置の前、間、及び／又は後に対象に投与することができる。したがって、併用療法の方法は、１つ以上の追加の治療剤の使用前、使用中、及び／又は使用後のｉＰＳＣ由来エフェクター細胞の投与又は調製を含み得る。上述のように、１つ以上の追加の治療剤は、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、マイトジェン、増殖因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分又はその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤又は放射性部分、又は免疫修飾薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与は、追加の治療剤の投与から、時間、日、又は週単位によって時間的に分離することができる。追加的又は代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤又はモダリティと組み合わせることができる。
組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、治療的組み合わせは、本明細書で提供されるｉＰＳＣ由来エフェクター細胞及び抗体又はその断片である追加の治療剤を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、又はキメラ抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体又は抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍又はウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来造血系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されたｉＰＳＣ由来エフェクター細胞に対する追加の治療剤として、併用治療に適した治療用抗体は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ）、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ）、抗ＧＤ２抗体（例えば、ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１抗体（例えば、アベルマブ）、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３抗体（例えば、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体（エロツズマブ）、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（７Ｃ６、６Ｆ１１、１Ｃ２）、並びにそれらのヒト化又はＦｃ改変されたバリアント若しくは断片、又はそれらの機能的同等物若しくはバイオシミラーを含むがそれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明は、表４に列挙され、本明細書で提供される遺伝子型を有するｉＰＳＣ由来造血系統細胞を含むエフェクター細胞と、上記の抗体又は抗体断片である追加の治療剤と、を含む治療用組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、１つ以上のチェックポイント阻害剤を含む。チェックポイントは、阻害されていない場合に免疫応答を抑制又は下方制御することができる細胞分子、しばしば細胞表面分子を指す。チェックポイント阻害剤は、チェックポイントの遺伝子発現又は遺伝子産物を減少させるか、又はチェックポイント分子の活性を低下させることができるアンタゴニストである。派生エフェクター細胞との併用療法に好適なチェックポイント阻害剤には、ＰＤ１（Ｐｄｃｄｌ、ＣＤ２７９）、ＰＤＬ－１（ＣＤ２７４）、ＴＩＭ３（Ｈａｖｃｒ２）、ＴＩＧＩＴ（ＷＵＣＡＭ及びＶｓｔｍ３）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄｌ）、ＣＤ４７、ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐｌ、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２（Ｐｏｕ２ｆ２）、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、及び阻害性ＫＩＲ（例えば、２ＤＬ１、２ＤＬ２、２ＤＬ３、３ＤＬ１、及び３ＤＬ２）のアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
提供される派生エフェクター細胞を含む併用療法のいくつかの実施形態は、チェックポイント分子を標的化する少なくとも１つの阻害剤を更に含む。提供される派生エフェクター細胞との併用療法のいくつかの他の実施形態は、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント分子が標的とされるように、２つ、３つ、又はそれ以上の阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、提供されるような派生ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の併用療法のためのエフェクター細胞は、派生Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、併用療法のための派生ＮＫ細胞又はＴ細胞は、本明細書で提供されるように機能的に増強されている。いくつかの実施形態では、２つ、３つ、又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、派生エフェクター細胞の投与と同時、前、又は後に併用療法で投与することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のチェックポイント阻害剤は、同時に、又は一度に１つ（逐次的に）投与される。いくつかの実施形態では、本発明は、表４に列挙される遺伝子型を有するｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含むエフェクター細胞と、上記のような１つ以上のチェックポイント阻害剤と、を含む治療用組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、上述のチェックポイント分子のいずれかを阻害するアンタゴニストは抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻害抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダＩｇ、単一可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）、サメ重鎖のみ抗体（Ｉｇ ＮＡＲ）、キメラ抗体、組換え抗体、又はこれらの抗体断片であり得る。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、Ｆｖ、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗原結合断片（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、組換え重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、及び抗体全体の結合特異性を維持するその他の抗体断片が含まれ、それらは、抗体全体よりも、製造するのに費用対効果が高く、より簡単に使用することができ、又は感度が高くあり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ又は３つ又はそれ以上のチェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体又は機能的同等物のうちの少なくとも１つを含む。
本明細書に記載の派生エフェクター細胞及び１つ以上のチェック阻害剤を含む併用療法は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、菌状息肉症、パジェット様細網症、セザリー症候群、肉芽腫様弛緩皮膚、リンパ腫様丘疹症、慢性苔癬状粃糠疹、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＣＤ３０＋皮膚Ｔ細胞リンパ腫、二次皮膚ＣＤ３０＋大細胞リンパ腫、非菌状息肉症ＣＤ３０皮膚大Ｔ細胞リンパ腫、多形性Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、皮下Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（hodgkins lymphoma、ＨＬ）、頭頸部腫瘍；扁平上皮がん、横紋筋肉腫、ルイス肺がん（Lewis lung carcinoma、ＬＬＣ）、非小細胞肺がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、腎細胞がん（renal cell carcinoma、ＲＣＣ）、結腸直腸がん（colorectal cancer、ＣＲＣ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、乳がん、胃がん、前立腺小細胞神経内分泌がん（prostatic small cell neuroendocrine carcinoma、ＳＣＮＣ）、肝臓がん、膠芽腫、肝臓がん、口腔扁平上皮がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、肝内胆管細胞がん、肝細胞がん、骨がん、転移、及び鼻咽頭がんを含むがこれらに限定されない、液性及び固形がんの治療に適用できる。
本明細書において提供されるような派生エフェクター細胞以外のいくつかの実施形態では、治療的使用のための組み合わせは、化学療法剤又は放射性部分を含む１つ以上の追加の治療剤を含む。「化学療法剤」とは、細胞傷害性抗腫瘍剤、すなわち、腫瘍細胞を優先的に殺傷するか、又は急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊するか、又は幹がん細胞を根絶することが見出され、腫瘍性細胞の増殖を防止又は低減するために治療的に使用される化学剤を指す。化学療法剤はまた、抗腫瘍性又は細胞傷害性の薬物又は薬剤と称されることもあり、その例は当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、スルホン酸アルキル、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有薬剤、インターフェロン、及びインターロイキンを含む。例示的な化学療法剤には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、代謝拮抗剤（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６－メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、及びテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアントレン、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、及びグラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、メイタンシン、並びにアムサクリンが含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンジフチトクス、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、及びゾレドロネートが含まれる。他の好適な薬剤は、化学療法剤又は放射線療法剤として承認され、当該技術分野で知られているものを含む、ヒトへの使用が承認されているものである。そのような薬剤は、多くの標準的な医師や腫瘍学者の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）又はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）のいずれかを参照でき、どちらも随時更新される。
サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方を刺激する。本明細書において提供されるように、ＩＭｉＤは、がん治療のためにｉＰＳＣ派生治療用免疫細胞とともに使用され得る。
治療組成物に含まれるｉＰＳＣ誘導造血系統細胞の単離された集団以外に、対象／患者への投与に適した組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加物）及び／若しくは希釈剤（例えば、薬学的に許容される媒体、例えば細胞培養培地）、又は他の薬学的に許容される成分を更に含むことができる。薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、部分的には、投与される特定の組成物によって、並びに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の実施形態の治療用組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５を参照されたい）。
一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ由来Ｔ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製されたｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＨＳＣを含む。一実施形態では、治療用組成物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって作製された多能性細胞由来ＭＤＳＣを含む。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来造血系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、又は気管投与方法によって個別に、又は他の好適な化合物と組み合わせて投与して、所望の治療目標に影響を与えることができる。
これらの薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は、治療用組成物のｐＨを約３～約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。このように、緩衝液は、全組成物の重量対重量ベースで約５％もの多さであり得る。限定されないが、塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの電解質もまた、治療用組成物に含まれ得る。一態様では、治療用組成物のｐＨは、約４～約１０の範囲である。代替的に、治療用組成物のｐＨは、約５～約９、約６～約９、又は約６．５～約８の範囲である。別の実施形態では、治療用組成物は、当該ｐＨ範囲のうちの１つのｐＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は、約７のｐＨを有する。代替的に、治療用組成物は、約６．８～約７．４の範囲のｐＨを有する。更に別の実施形態では、治療用組成物は、約７．４のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、本発明はまた、部分的に、本明細書に開示される特定の組成物及び／又は培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来エフェクター細胞の維持、増殖、及び／又は健康を支持する任意の培地は、医薬細胞培養培地としての使用に適している。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清及び／又はフィーダーを含まない培地である。様々な実施形態では、無血清培地は動物成分を含まず、任意選択で無タンパク質であり得る。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含み得る。動物成分を含まない培地は、成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成、植物、又は微生物の供給源から取得される。対照的に、無タンパク質培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上述の培地の例は例示であり、本発明での使用に好適な培地の配合を決して限定するものではなく、当業者に既知であり利用可能な多くの好適な培地があることを理解するであろう。
様々な実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、又は間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来造血系統細胞は、約９５％～約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞治療を必要とする対象を治療するための、約９５％のＴ細胞、ＮＫ細胞、プロＴ細胞、プロＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、又は骨髄由来サプレッサ細胞（ＭＤＳＣ）の単離された集団を有する組成物などの、精製Ｔ細胞又はＮＫ細胞を有する治療用組成物を提供する。
本出願の一態様は、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体又はそのバリアント、ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び４－１ＢＢに特異的なＡＤＲのうちの２つ以上、並びに任意選択で、ＣＡＲ発現、ＣＦＲ発現、外因性ＣＤ１６発現、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ改変、ＣＤ３８ノックアウト、ＴＣＲ陰及び外因性サイトカインシグナル伝達複合体のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む固形腫瘍標的化骨格を含むエフェクター細胞の１以上の治療用量を投与することによって、必要とする対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、そのような接触／曝露の前のケモカイン分泌及び／又は表面発現と比較して、Ｃ－Ｘ－Ｃ－モチーフケモカイン受容体に対するリガンドである１つ以上のケモカインの分泌及び／又は表面発現を増加又は増強するために、対象におけるがん又は腫瘍細胞を最初に感作することによって、がん又は腫瘍を有する対象を治療する方法を提供する。がん又は腫瘍細胞の感作後、上記のようなエフェクター細胞又はその集団が対象に与えられ／投与され、エフェクター細胞は、本明細書に提供されるような固形腫瘍標的化骨格、及び任意選択で本明細書に記載される１つ以上の追加の編集を含むか、又はエフェクター細胞は、表４に列挙される遺伝子型を含む。様々な態様では、エフェクター細胞又はその集団は、上記のような１つ以上の更なる治療剤の前に、又はそれと同時に提供されてもよい。
本出願の別の態様は、併用細胞療法を使用して、必要とする対象を治療する方法を提供する。組み合わせ細胞療法のいくつかの実施形態では、必要とする対象を治療する方法は、本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格、及び任意で本明細書に記載される１つ以上の他の編集、又は表４に列挙される遺伝子型を含むエフェクター細胞、並びにペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血液細胞、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分若しくはその置換因子、目的の１つ以上のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む１つ以上の治療剤の１以上の治療用量を投与することと、任意で感作物質を投与することによって対象において腫瘍細胞をプレコンディショニングすることと、を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせ細胞療法又はそれに使用される組成物は、ゲノム操作されたｉＰＳＣに由来するエフェクター細胞の集団及び１つ以上の治療剤を含み、操作されたｉＰＳＣ及び由来エフェクター細胞は、本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格、及び任意選択で本明細書に記載される１つ以上の他の編集、又は表４に列挙される遺伝子型を含む。併用細胞療法の方法のいくつかの実施形態では、方法は、感作物質を投与することによって対象における腫瘍細胞をプレコンディショニングすることを含み、感作物質は、本明細書で提供される放射線療法、放射性医薬品、又は化学療法剤を含む。様々な態様では、対象における腫瘍細胞のプレコンディショニングは、本明細書に記載のエフェクター細胞の１以上の治療用量を投与する前に、又はそれと同時に行われる。
当業者が理解するように、本明細書において提供される方法及び組成物に基づくｉＰＳＣから派生する自己と同種異系の造血系統細胞の両方は、上述のような細胞療法で使用することができる。自家移植の場合、派生造血系統細胞の単離された集団は、患者と完全又は部分的にＨＬＡ適合する。別の実施形態では、派生造血系統細胞は、対象とＨＬＡ適合せず、派生造血系統細胞は、ＨＬＡ Ｉ及び／又はＨＬＡ ＩＩ欠損を有するＮＫ細胞又はＴ細胞である。
いくつかの実施形態では、治療組成物中の派生造血系統細胞の数は、用量当たり、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも５×１０７細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも５×１０８細胞、少なくとも１×１０９細胞、又は少なくとも５×１０９細胞である。いくつかの実施形態では、治療用組成物中の派生造血系統細胞の数は、１用量当たり、約０．１×１０５細胞～約１×１０６細胞、１用量当たり、約０．５×１０６細胞～約１×１０７細胞、１用量当たり、約０．５×１０７細胞～約１×１０８細胞、１用量当たり、約０．５×１０８細胞～約１×１０９細胞、１用量当たり、約１×１０９細胞～約５×１０９細胞、１用量当たり、約０．５×１０９細胞～約８×１０９細胞、１用量当たり、約３×１０９細胞～約３×１０１０細胞、又はその間の任意の範囲である。一般に、６０ｋｇの患者／対象の場合、１×１０８細胞／用量は１．６７×１０６細胞／ｋｇに変換される。
一実施形態では、治療組成物中の派生造血系統細胞の数は、血液の部分的又は単一の臍帯中の免疫細胞の数であるか、又は少なくとも０．１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５×１０６細胞／体ｋｇ体重、少なくとも１．２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１．７５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２０×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも３０×１０６細胞／ｋｇ体重、１×１０８細胞／ｋｇ体重、５×１０８細胞／ｋｇ体重、又は１×１０９細胞／ｋｇ体重である。
一実施形態では、ある用量の派生造血系統細胞が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、又は少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、又は約１０×１０６細胞／ｋｇ、又はそれ以上の細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、約２×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ～約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇ、又は６×１０６細胞／ｋｇ～約８×１０６細胞／ｋｇであり、介在する全ての細胞用量を含む。
いくつかの実施形態では、派生造血系統細胞の治療的使用は、単回投与治療である。いくつかの実施形態では、派生造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、５０日ごとの１回の投与、又はその間の任意の日数の任意の回数の投与である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、３回、４回、又は５回の週１回用量を含む。３回、４回、又は５回を含む複数回投与治療のいくつかの実施形態では、週１回用量は、追加の単回用量又は複数回用量が必要かどうかを決定するための観察期間を更に含む。
本発明の実施形態の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌であり得、ヒト患者／対象への投与に好適であり、すぐに投与され得る（すなわち、更なる処置を伴わずに投与され得る）。すぐに投与される細胞ベースの組成物は、組成物が、対象への移植又は投与の前に、いずれかの更なる処理又は操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、小化学分子を含む１つ以上の薬剤の投与前に増殖及び／又は調整される、派生造血系統細胞の単離された集団を提供する。ｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を含む免疫細胞を調節するための組成物及び方法は、例えば、国際公開第２０１７／１２７７５５号（その関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。組換えＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞については、細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号に記載されている方法を使用して活性化及び増殖させることができる。
特定の実施形態では、由来造血系統細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供することができる。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合することができる。表面に結合される場合、薬剤は、同じ表面に（すなわち、「シス」形成で）又は別個の表面に（すなわち、「トランス」形成で）結合され得る。代替的に、一方の薬剤を表面に結合させ、他方の薬剤を溶液中に存在させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は、細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、又は表面に結合される。特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は、可溶性形態であり得、次いで、本発明の実施形態におけるＴリンパ球の活性化及び増殖における使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、米国特許出願公開第２００４／０１０１５１９号及び同第２００６／００３４８１０号に開示されるもののような、Ｆｃ受容体を発現する細胞又は抗体若しくは薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋されてもよい。
投与量、頻度、及びプロトコルのいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に対しての適切な用量、頻度及びプロトコルを決定する。
例示的な実施形態
本開示は、以下の例示的な実施形態を提供する。
実施形態１：細胞又はその集団であって、
（ｉ）細胞が、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又は（ｃ）ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、
（ｉｉ）細胞が、固形腫瘍標的化骨格を含み、固形腫瘍標的化骨格が、
（ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、
及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上を含む、細胞又はその集団。
実施形態２：細胞が、固形腫瘍標的化骨格を含まない対応する細胞と比較して、固形腫瘍における改善された輸送、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）耐性、及び／又はアロ反応性耐性を有する、実施形態１の細胞又はその集団。
実施形態３：固形腫瘍標的化骨格が、
（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
（ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドと、を更に含む、実施形態１又は２の細胞又はその集団。
実施形態４：細胞は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、
（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、
（ｉｖ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの最も少ない１つの破壊、
（ｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、又は
（ｖｉ）表４に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上を更に含む、実施形態１～３のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態５：Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む、実施形態１～４のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態６：ＴＧＦβ－ＳＲＲが、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを更に含む、実施形態１～５のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態７：
（ａ）サイトカイン受容体がＩＬ２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１１によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｂ）サイトカイン受容体がＩＬ１２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が、配列番号１２若しくは配列番号１３によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｃ）サイトカイン受容体がＩＬ１８Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１４によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｄ）サイトカイン受容体がＩＬ２１Ｒであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｅ）ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を含む、実施形態６の細胞又はその集団。
実施形態８：サイトカイン受容体が、配列番号１６によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成するＩＬ２Ｒβの断片であり、配列番号１６に含まれる配列番号１７によって表されるアミノ酸配列が、可変である、実施形態６の細胞又はその集団。
実施形態９：ＡＤＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である、実施形態１～８のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態１０：固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドが、ＣＤ３８をノックアウトするために内因性ＣＤ３８遺伝子座に挿入される、実施形態１～９のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態１１：外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、及び固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドが、トリシストロン性構築物内で共発現される、実施形態３の細胞又はその集団。
実施形態１２：外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
（ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態３又は１１細胞又はその集団。
実施形態１３：細胞が、サイトカインシグナル伝達複合体を更に含み、サイトカインシグナル伝達複合体が、
（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、若しくはそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は
（ｂ）
（ｉ）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、
（ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現され得る、少なくとも１つ、又は
（ｃ）
（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現される、少なくとも１つ、を含み、
任意選択で、
（ｄ）一過的に発現される、実施形態３、１１又は１２のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態１４：細胞がＣＡＲを更に含み、ＣＡＲが、
（ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、
（ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、
（ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、
（ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、
（ｖ）スプリットＣＡＲ、
（ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、
（ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲ、
（ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、
（ｉｘ）バイシストロン性構築物内で、サイトカインシグナル伝達複合体と共発現されたもの、
（ｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、
（ｘｉ）ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１を含む少なくとも１つの腫瘍関連抗原に特異的なもの、並びに／又は
（ｘｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原を含む少なくとも１つの腫瘍関連抗原に特異的なもの、であり、任意選択で、
（ｉ）～（ｘｉｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲが、ＴＣＲ遺伝子座に挿入されている、及び／又はＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいはＴＣＲが、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、実施形態４の細胞又はその集団。
実施形態１５：ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域であり、任意選択で、ＣＡＲが、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結されている、実施形態１４の細胞又はその集団。
実施形態１６：ＣＡＲが、
（ａ）腫瘍関連抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む外部ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、腫瘍関連抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、実施形態１４又は１５の細胞又はその集団。
実施形態１７：少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、
（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ１５Ｒβ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内因性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、
（ｂ）それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、実施形態１６の細胞又はその集団。
実施形態１８：内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、当該内部ドメインドメインが、以下の形態：ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ、４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、４１ＢＢ－ＣＤ３ζ１ＸＸ、２Ｂ４－ＣＤ３ζ、及び２Ｂ４－ＣＤ３ζ１ＸＸのうちのいずれか１つの融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む、実施形態１６又は１７の細胞又はその集団。
実施形態１９：膜貫通ドメインが、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、又はＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６～１８のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態２０：膜貫通ドメインが、それぞれ配列番号３２～５３によって表される２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の膜貫通領域に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列又はその一部分を含む、実施形態１６～１８のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態２１：膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である、実施形態１６～２０のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態２２：腫瘍関連抗原がＨＥＲ２を含み、ＣＡＲが、
（ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに、任意選択で、
（ｉｉ）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含み、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、実施形態１６～２１のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態２３：ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
（ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
（ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一のアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
（ｅ）ヒト化されている、実施形態２２の細胞又はその集団。
実施形態２４：外部ドメインが、
（ａ）シグナルペプチド、及び／又は、
（ｂ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、実施形態２２又は２３の細胞又はその集団。
実施形態２５：スペーサー／ヒンジが、
（ａ）ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、ＣＨ３スペーサー、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサー、若しくはそれらの任意の組み合わせ、
（ｂ）約１０個～約８０個のアミノ酸の短いスペーサー、８０個超～約１８０個のアミノ酸の中程度のスペーサー、若しくは１８０個超のアミノ酸の長いスペーサー、及び／又は
（ｃ）配列番号９６～１００のうちのいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態２４の細胞又はその集団。
実施形態２６：スペーサー／ヒンジが、中程度のスペーサーを含み、スペーサーが、配列番号９９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態２５の細胞又はその集団。
実施形態２７：ＣＡＲが、配列番号１１７と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態２５の細胞又はその集団。
実施形態２８：がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である、実施形態２２～２７のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態２９：（ｉ）ｉＰＳＣが、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、又はｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、又は派生Ｂ系統細胞を含むか、あるいは、（ｉｉｉ）派生細胞が、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む、実施形態１～２８のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態３０：派生細胞が、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
（ｉ）増加された細胞傷害性、
（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
（ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、
（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
のうちの１つ以上を含む治療特性を有する、実施形態２９の細胞又はその集団。
実施形態３１：細胞が、ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞であり、
（ｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞が、腫瘍部位における改善された浸潤及び／又は保持を有するか、
（ｉｉ）ＮＫ系統細胞が、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、かつ／又は遊走させることができるか、又は
（ｉｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる、実施形態２９又は３０の細胞又はその集団。
実施形態３２：細胞又はその集団であって、
（ｉ）細胞が、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又は（ｃ）ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、
（ｉｉ）細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、
（ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、抗原結合ドメインが、
（１）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに
（２）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、を含む、外部ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原へのＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、細胞又はその集団。
実施形態３３：抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
（ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
（ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一のアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
（ｅ）ヒト化されている、実施形態３２の細胞又はその集団。
実施形態３４：少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、
（ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５Ｒβ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、
（ｂ）それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、実施形態３２又は３３の細胞又はその集団。
実施形態３５：内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、当該内部ドメインドメインが、以下の形態：２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、若しくはＮＫｐ４６－２Ｂ４のうちのいずれか１つの融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む、実施形態３４の細胞又はその集団。
実施形態３６：膜貫通ドメインが、
（ａ）ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチド、
（ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は
（ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄ、の膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態３２～３５のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態３７：膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である、実施形態３２～３６のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態３８：外部ドメインが、
（ａ）シグナルペプチド、及び／又は、
（ｂ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、実施形態３２～３７のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態３９：スペーサー／ヒンジが、
（ａ）ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、ＣＨ３スペーサー、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサー、若しくはそれらの任意の組み合わせ、
（ｂ）約１０個～約８０個のアミノ酸の短いスペーサー、８０個超～約１８０個のアミノ酸の中程度のスペーサー、若しくは１８０個超のアミノ酸の長いスペーサー、及び／又は
（ｃ）配列番号９６～１００のうちのいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態３８の細胞又はその集団。
実施形態４０：スペーサー／ヒンジが、中程度のスペーサーを含み、スペーサーが、配列番号９９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態３９の細胞又はその集団。
実施形態４１：ＣＡＲが、配列番号１１７と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態３２の細胞又はその集団。
実施形態４２：
（ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、
及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの少なくとも１つを含む固形腫瘍標的化骨格を更に含む、実施形態３２～４１のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態４３：固形腫瘍標的化骨格が、
（ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
（ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドと、を更に含む、実施形態４２の細胞又はその集団。
実施形態４４：細胞は、
（ｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、
（ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、
（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの最も少ない１つの破壊、
（ｉｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、又は
（ｖ）表４に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上を更に含む、実施形態３２～４３のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態４５：Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む、実施形態４２～４４のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態４６：ＴＧＦβ－ＳＲＲが、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを更に含む、実施形態４２～４５のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態４７：
（ａ）サイトカイン受容体がＩＬ２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１１によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｂ）サイトカイン受容体がＩＬ１２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が、配列番号１２若しくは配列番号１３によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｃ）サイトカイン受容体がＩＬ１８Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１４によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｄ）サイトカイン受容体がＩＬ２１Ｒであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
（ｅ）ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を含む、実施形態４６の細胞又はその集団。
実施形態４８：サイトカイン受容体が、配列番号１６によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成するＩＬ２Ｒβの断片であり、配列番号１６に含まれる配列番号１７によって表されるアミノ酸配列が、可変である、実施形態４６の細胞又はその集団。
実施形態４９：ＡＤＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である、実施形態４２～４８のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態５０：固形腫瘍標的化骨格の１つ以上のポリヌクレオチドが、ＣＤ３８をノックアウトするために内因性ＣＤ３８遺伝子座に挿入される、実施形態４２～４９のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態５１：外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、及び固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドが、トリシストロン性構築物内で共発現される、実施形態４３の細胞又はその集団。
実施形態５２：外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
（ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
（ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
（ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
（ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
（ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
（ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
（ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
（ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態４３又は５１の細胞又はその集団。
実施形態５３：細胞が、サイトカインシグナル伝達複合体を更に含み、サイトカインシグナル伝達複合体が、
（ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、若しくはそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は
（ｂ）
（ｉ）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
（ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
（ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
（ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが天然であるか、若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに
（ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
又は
（ｃ）
（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
任意選択で、
（ｄ）一過的に発現される、実施形態４３、５１、又は５２の細胞又はその集団。
実施形態５４：
（ｉ）ＣＡＲが、バイシストロン性構築物内でサイトカインシグナル伝達複合体と共発現される、かつ／あるいは
（ｉｉ）ＣＡＲが、ＴＣＲ遺伝子座に挿入されており、任意選択で、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結されている、実施形態３２～５３のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態５５：
ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域である、かつ／あるいは
（ｉｉ）ＴＣＲが、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、実施形態５４の細胞又はその集団。
実施形態５６：がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である、実施形態３２～５５のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態５７：（ｉ）ｉＰＳＣが、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、又はｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、又は派生Ｂ系統細胞を含むか、あるいは、（ｉｉｉ）派生細胞が、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む、実施形態３２～５６のうちのいずれか１つの細胞又はその集団。
実施形態５８：細胞が、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
（ｉ）増加された細胞傷害性、
（ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
（ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
（ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、
（ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
（ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
（ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
（ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
（ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
のうちの１つ以上を含む治療特性を有する、実施形態４２～５８のいずれか一項に記載の細胞又はその集団。
実施形態５９：細胞が、ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞であり、
（ｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞が、腫瘍部位における改善された浸潤及び／又は保持を有するか、
（ｉｉ）ＮＫ系統細胞が、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、かつ／又は遊走させることができるか、又は
（ｉｉ）ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる、実施形態５８の細胞又はその集団。
実施形態６０：実施形態１～５９のうちのいずれか１つの細胞又はその集団を含む、組成物。
実施形態６１：１つ以上の治療剤を更に含む、実施形態６０の組成物。
実施形態６２：１つ以上の治療剤が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、実施形態６１の組成物。
実施形態６３：チェックポイント阻害剤が、
（ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、
（ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、又は
（ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペムブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含む、実施形態６２の組成物。
実施形態６４：抗体が、
（ａ）抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＰＤＬ１抗体、若しくは抗ＣＤ３８抗体、又は
（ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、Ｍ－Ａ２５１、２Ａ３、ＢＣ６９、２４２０４、２２７２２、２４２１２、ＭＡＢ２３５９１、ＦＮ５０、２９８６１４、ＡＦ２３５９、ＣＹ１Ｇ４、ＤＦ１５１３、ビバツズマブ、ＲＧ７３５６、Ｇ４４－２６、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、並びにそれらのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント若しくは断片及びそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、を含む、実施形態６２の組成物。
実施形態６５：エンゲージャが、
（ｉ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、
（ｉｉ）二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）、又は
（ｉｉｉ）三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）を含むか、又は
エンゲージャは、
（ａ）細胞又はバイスタンダー免疫エフェクター細胞のＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメインと、
（ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＰ１、若しくはＶＥＧＦ－Ｒ２のうちのいずれか１つを含む抗原に特異的な第２の結合ドメインと、を含む、実施形態６２の組成物。
実施形態６６：実施形態６０～６５のうちのいずれか１つの組成物を養子細胞療法を必要とする対象に導入することによる組成物の治療的使用であって、対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
実施形態６７：実施形態１～５９のうちのいずれか１つのｉＰＳＣを含む、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）。
実施形態６８：実施形態１～３１のうちのいずれか１つの派生細胞を製造する方法であって、派生細胞が、免疫エフェクター細胞であり、方法が、
（ｉ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを取得することであって、ｉＰＳＣが、
（ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上と、
（ｉｉ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを派生ＣＤ３４＋細胞に分化させることと、
（ｉｉｉ）派生ＣＤ３４＋細胞を免疫エフェクター細胞に分化させることであって、免疫エフェクター細胞が、固形腫瘍標的化骨格を保持する、分化させることと、を含む、方法。
実施形態６９：固形腫瘍標的化骨格を含む遺伝子操作されたｉＰＳＣを取得することが、内因性（endogensous）ＣＤ３８遺伝子座における共発現のために２つ以上のポリヌクレオチドを組み込むことと、ＣＤ３８をノックアウトすることと、を含み、共発現のための２つ以上のポリヌクレオチドが、シストロン性構築物内にあり、ポリヌクレオチドが、
（ｉ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体、
（ｉｉ）ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び
（ｉｉｉ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）、のうちの少なくとも２つをコードする、実施形態６８の方法。
実施形態７０：
（ｉ）シストロン性構築物が、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを更に含むか、
（ｉｉ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含むか、
（ｉｉｉ）ＴＧＦβ－ＳＲＲが、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβ、又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を含むか、又は
（ｉｖ）ＡＤＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である、実施形態６９の方法。
実施形態７１：キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをＴＣＲ遺伝子座に組み込むことによって、固形腫瘍標的化骨格を含むｉＰＳＣを遺伝子操作することを更に含み、任意選択で、（ｉ）ＣＡＲが、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結され、かつ／あるいは（ｉｉ）ＴＣＲが、ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、実施形態６８の方法。
実施形態７２：ＣＡＲが、バイシストロン性構築物内でサイトカインシグナル伝達複合体と共発現されるか、あるいは、ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ又はＴＣＲベータの定常領域である、実施形態７１の方法。
実施形態７３：サイトカインシグナル伝達複合体が、
（ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
（ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、及び
（ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態７２の方法。
実施形態７４：ＣＡＲが、
（ｉ）腫瘍関連抗原に特異的であるか、
（ｉｉ）固形腫瘍関連抗原に特異的であるか、
（ｉｉｉ）汎腫瘍抗原に特異的であるか、又は
（ｉｖ）Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、及びＭＲ１のうちの１つに特異的である、実施形態７１の方法。
実施形態７５：がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原に特異的なＣＡＲが、
（ｉ）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、任意選択で、
（ｉｉ）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む抗原結合ドメインを含む、実施形態７１の方法。
実施形態７６：ＣＡＲの抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
（ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
（ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
（ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一のアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
（ｅ）ヒト化されている、実施形態７５の方法。
実施形態７７：
（ａ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損の導入、
（ｂ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの１つ以上の欠失又は破壊、並びに
（ｃ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上によって、腫瘍固形標的化骨格を含むｉＰＳＣを遺伝子操作することを更に含む、実施形態６９の方法。
実施形態７８：ゲノム操作することが、標的化編集を含む、実施形態６８～７７のうちのいずれか１つの方法。
実施形態７９：標的化編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の他の任意の機能的バリエーションによって実行される、実施形態７８の方法。
実施形態８０：養子細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、対象にエフェクター細胞を注入することを含み、エフェクター細胞が、実施形態１～５９のうちのいずれか１つに記載の派生細胞又はその集団を含む、方法。
実施形態８１：エフェクター細胞が、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原に特異的なＣＡＲを含み、ＣＡＲが、
（ｉ）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、任意選択で、
（ｉｉ）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含み、
ＣＡＲが、ＴＲＡＣ遺伝子座にあり、ＣＡＲ発現が、内因性ＴＣＲプロモータによって駆動され、
養子細胞療法を必要とする対象が、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、肺がん、食道がん、唾液腺がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、又は頭頸部がんを有する、実施形態８０の方法。
実施形態８２：エフェクター細胞が、固形腫瘍標的化骨格を更に含み、エフェクター細胞が、
（ｉ）ＣＤ３８遺伝子座に、
（ａ）ＣＸＣＲ２をコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上と、
（ｉｉ）ＣＤ３８遺伝子座に、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子座に、ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）ＣＤ３８ノックアウト及びＴＣＲノックアウトと、を含む、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３：１つ以上の治療剤を対象に投与することを更に含み、１つ以上の治療剤が、
（ｉ）サイトカイン、抗体、エンゲージャ、チェックポイント阻害剤、化学療法剤若しくは放射性部分、若しくは免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、
（ｉｉ）ダラツムマブ、イサツキシマブ、若しくはＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体、
（ｉｉｉ）ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）若しくはＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）を含むエンゲージャ、
（ｉｖ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ（ｌｉｒｉｍｕｍａｂ）、モナリズマブ、ニボルマブ、若しくはペムブロリズマブを含むチェックポイント阻害剤、並びに／又は
（ｖ）シクロホスファミド及びフルダラビン（Ｃｙ／Ｆｌｕ）を含む化学療法剤、を含む、実施形態８０の方法。
実施形態８４：エフェクター細胞が、ＣＤ３８ノックアウト及びＴＣＲノックアウトと、任意選択でＡＤＲと、を含み、方法が、対象に抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み、方法が、Ｃｙ／Ｆｌｕを対象に投与することを含むリンパ球枯渇を必要としないか、最小限しか必要としない、実施形態８０の方法。
実施形態８５：エフェクター細胞が同種異系であり、対象にエフェクター細胞を注入することが、外来患者設定で行われる、実施形態８０の方法。
実施形態８６：固形腫瘍を有する対象の治療における養子細胞療法を改善する方法であって、実施形態１～３１のうちのいずれか１つの派生細胞の集団を投与することを含む、方法。
実施形態８７：抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療を改善する方法であって、
ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＸＣＲ２をコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβ－ＳＲＲをコードするポリヌクレオチド、及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むエフェクター細胞を含む組成物を、治療を必要とする対象に導入することと、
対象に抗ＨＥＲ２ｍＡｂを導入することと、を含む、方法。
実施形態８８：抗ＨＥＲ２ｍＡｂが、トラスツズマブである、実施形態８７の方法。
実施形態８９：目的の導入遺伝子を含む操作されたＮＫ細胞を選択する方法であって、
（ｉ）目的の導入遺伝子と、ＩＬ１５若しくはそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は以下の（１）～（７）：
（１）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
（２）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
（３）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
（４）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
（５）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
（６）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
（７）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つとを共発現する構築物を含む操作されたＮＫ細胞を取得することと、
（ｉｉ）操作されたＮＫ細胞に外因性ＩＬ１５サイトカインを供給することなく、細胞を培養することと、
（ｉｉｉ）外因性ＩＬ１５サイトカインを伴わずに増殖するＮＫ細胞を収集し、それによって、目的の導入遺伝子を含む操作されたＮＫ細胞を選択することと、を含む、方法。
次の例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。
実施例１－材料及び方法
様々なプロモータの制御下で外来遺伝子の制御及び調節系を効果的に選択し、多能性幹細胞の状況で異なるセーフハーバー遺伝子座組み込み戦略と組み合わせて試験するために、単一又は複数の遺伝子調整によるクローンｈｉＰＳＣの操作及び導出を可能にするべく、ｈｉＰＳＣプラットフォームを使用して、単一細胞の継代と高スループットの９６ウェルプレートベースのフローサイトメトリソーティングを行った。
小分子培養におけるｈｉＰＳＣの維持：ｈｉＰＳＣは、培養のコンフルエンシが７５％～９０％に達すると、単一細胞として日常的に継代された。単一細胞解離のために、ｈｉＰＳＣをＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理した。次いで、単細胞懸濁液を従来の培地と混合し、ＦＭＭに再懸濁し、マトリゲルでコーティングした表面に播種した。継代は典型的には１：６～１：８であり、２～３日毎にＦＭＭを与えた。細胞培養は、３７℃、５～１０％ＣＯ２に設定された加湿インキュベーターで維持された。
ＺＦＮによるヒトのｉＰＳＣ操作、目的のモダリティの標的化編集のためのＣＲＩＳＰＲ：ＲＯＳＡ２６標的化挿入を例として使用して、ＺＦＮを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが、２．５μｇのＺＦＮ－Ｌ、２．５μｇのＺＦＮ－Ｒの混合物及びＡＡＶＳ１標的化挿入用の５μｇのドナー構築物でトランスフェクトされた。ＣＲＩＳＰＲを介したゲノム編集では、２００万個のｉＰＳＣが、５μｇのＲＯＳＡ２６－ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９とＲＯＳＡ２６標的化挿入用の５μｇドナー構築物の混合物でトランスフェクトされた。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクションを行った。トランスフェクション後の２日目又は３日目に、プラスミドに人工プロモータ駆動型ＧＦＰ及び／又はＲＦＰ発現カセットが含まれている場合、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を測定した。
ゲノム編集されたｉＰＳＣの一括ソーティング及びクローンソーティング：ＺＦＮ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用したゲノム標的化編集を含むｉＰＳＣを、ＧＦＰ＋ＳＳＥＡ４＋ＴＲＡ１８１＋ｉＰＳＣの一括ソーティング及びクローンソーティングした。単一細胞解離した標的化ｉＰＳＣプールを、最適性能のために新たに作製した染色緩衝液に再懸濁した。ＳＳＥＡ４－ＰＥ、ＴＲＡ１８１－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６４７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのコンジュゲート一次抗体を細胞溶液に加えた。溶液を染色緩衝液で洗浄し、スピンし、フローサイトメトリーでのソーティングのために１０μＭチアゾビブを含む染色緩衝液に再懸濁した。ソーティングが完了したら、９６ウェルプレートをインキュベートした。コロニー形成は早くも２日目に検出され、ほとんどのコロニーはソーティング後７～１０日の間に増殖した。最初の継代では、ウェルをＰＢＳで洗浄し、３０μＬのアキュターゼで解離させた。解離したコロニーを、予めマトリゲルでコーティングした９６ウェルプレートの別のウェルに移す。その後の継代は日常的に行った。各クローン細胞株をＧＦＰ蛍光レベル及びＴＲＡ１－８１発現レベルについて分析した。クローン集団を凍結保存してマスター細胞バンクとして機能させる前に、ほぼ１００％のＧＦＰ＋及びＴＲＡ１－８１＋を有するクローン株を、操作されたｉＰＳＣのオフターゲット編集及び／又は核型を含むがこれらに限定されない更なるスクリーニング及び分析のために選択した。
実施例２－固形腫瘍標的化能力の最適化のための骨格構造を有するクローンｉＰＳＣ及びｉＰＳＣ由来エフェクター細胞を確立するための多重ゲノム操作
内因性遺伝子ノックアウトのために複数の遺伝子座で細胞を操作し、同時に、固形腫瘍免疫療法のためのエフェクター細胞をより良好に備える機能的骨格配置を探索するために、複数の機能的モダリティを所望の組み合わせ及び所望の配置で挿入（ＫＯ／ＫＩ）するために、一連のバイシストロン性及びトリシストロン性構築物を表５に示されるように設計及び調製した。
固形腫瘍標的化骨格構築の一部として、ＴＲＡＣ遺伝子座は、固形腫瘍抗原認識受容体、例えば、ＣＡＲ又は外因性ＴＣＲを挿入する一方で、内因性ＴＣＲをノックアウトして、細胞の宿主免疫検出を受動的に回避するために利用する。ＣＡＲのみを含有するベクター又はＣＡＲ及びサイトカインシグナル伝達複合体を含有するバイシストロン性ベクターを使用して、サイトカインシグナル伝達複合体が、他の利点の中でもとりわけ、エフェクター細胞適合性及び／又は持続性も支持する骨格の一部として組み込まれるのに好適であるかどうかを比較した。例えば、操作されたｉＰＳＣからエフェクターＴ細胞を生成するために、ＩＬ７シグナル伝達複合体を試験し、操作されたｉＰＳＣからエフェクターＮＫ細胞を生成するために、代わりにＩＬ１５シグナル伝達複合体を試験した。
第２の遺伝子座であるＣＤ３８を、固形腫瘍標的化骨格の別の部分のために選択した。固形腫瘍環境の課題に対処するためにバイシストロン性構築物又はトリシストロン性構築物を使用してＣＤ１６、ＣＸＣＲ２及びＴＧＦβＲ２リダイレクタ（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）のうちの２つ以上をＣＤ３８に挿入する一方で、内因性ＣＤ３８遺伝子は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体がＣＤ３８発現活性化された宿主免疫細胞を選択的に枯渇させるために適用され得るように、結果としてノックアウトされている。
まず、表５に示すように、ＴＲＡＣ遺伝子座ＫＯ／ＫＩのベクターをそれぞれの群のｉＰＳＣに形質導入した。本実施例では、使用した例示的なＣＡＲは、ＨＥＲ２腫瘍抗原を標的とし、本出願における配列番号１１５又は配列番号１１６によって表されるｓｃＦＶ配列を含むものであった。ＴＲＡＣ標的化の成功を確認した後、次に、ＣＤ３８遺伝子座を標的として、ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２、ｈｎＣＤ１６／ＴＧＦβＲ２リダイレクタ、又はｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２／ＴＧＦβＲ２リダイレクタを導入した。ＴＲＡＣ及びＣＤ３８操作ｉＰＳＣをＣＡＲ ｉＴ細胞又はＣＡＲ ｉＮＫ細胞に分化させて、図１Ａに示すプロセスである、多重化ゲノム編集を用いたｉＰＳＣの造血細胞への多能性を検証した。この実験の目的のために、ＴＧＦβＲ２リダイレクタは、ＴＧＦβＲ２と、ＩＬ１２Ｒｂ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はその断片のうちの１つとの融合タンパク質であり、本出願全体を通して、具体的にはＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒｂ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒ、又は一般にＴＧＦβ－ＳＲＲと呼ばれる。
分化に続いて、ＴＲＡＣ－＿ＣＡＲ、ＴＲＡＣ－＿ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ、ＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２、及び／又はＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＴＧＦβ－ＳＲＲを発現するＴＣＲ及びＣＤ３８ノックアウトＣＡＲ ｉＴ細胞を、示された骨格構成を有する各細胞群からの個々のクローンに対するフローサイトメトリーを介してそれらのＣＤ４５及びＣＤ７発現を評価することによって、それらのリンパ系コミットメントについて評価した（図１Ｂ）。図１Ｂに示されるように、全ての評価されたクローンは、ＣＤ４５及びＣＤ７（９５％）を共発現し、（ｉ）免疫エフェクター細胞への分化の成功、及び（ｉｉ）固形腫瘍標的化骨格の個々の編集に関するｉＰＳＣ操作戦略と、改変を有するｉＰＳＣのエフェクター細胞分化能との適合性を実証した。
分化ＣＡＲ ｉＴ細胞群を、フローサイトメトリーを介してＣＡＲ、ｈｎＣＤ１６、及びＴＧＦβ－ＳＲＲ導入遺伝子発現について更に評価した。図１Ｃに示されるように、ＴＲＡＣ＿ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２で操作された完全に分化したＣＡＲ－ｉＴは、高レベルのＣＡＲ（９９．８％）、ｈｎＣＤ１６（９９．９％）、及びＣＸＣＲ２（６２．２％）を発現した。加えて、ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びｈｎＣＤ１６／ＴＧＦβ－ＳＲＲ（示されるデータにおいてＩＬ１２Ｒβ融合を有する）で操作された完全に分化したＣＡＲ ｉＴもまた、高レベルのＣＡＲ（９０．８％）、ｈｎＣＤ１６（９９．６％）、及びＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβ（９６．７％）を発現した。
ＣＤ３８ ＫＯ／ＫＩに特異的であり、図１Ｄに示されるような特定の立体配置でＣＡＧ駆動型ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ、ｈｎＣＤ１６、及びＣＸＣＲ２を発現するトリシストロン性構築物を更に評価した。ＣＤ３８操作及び導入遺伝子発現ｉＰＳＣの選択の後、ＣＸＣＲ２及びＴＧＦβ－ＳＲＲ発現をフローサイトメトリーによって決定し、ＣＤ３８非操作の親ｉＰＳＣと比較した。図１Ｅに示すように、いずれかの構成を有するトリシストロン操作ｉＰＳＣは、高レベルのＴＧＦβ－ＳＲＲ（９８．４％及び９９．３％）及びＣＸＣＲ２（８８．７％及び９８．１％）を発現し、これらのトリシストロン組み込みｉＰＳＣからの操作及び頑強な導入遺伝子発現が首尾よく行われたことを実証した。
実施例３－－エフェクター細胞固形腫瘍標的化骨格組み込みのためのＣＸＣＲ２は、細胞移動及び固形腫瘍浸潤を増強する
従来のＣＡＲ－Ｔ療法は、固形腫瘍設定において中程度の有効性を示している。腫瘍抗原不均一性、免疫抑制性腫瘍微小環境、及び限定されたエフェクター持続性に加えて、腫瘍自体への適切なエフェクター輸送は、有効な固形腫瘍ＣＡＲ－Ｔ療法の主要な障壁であり得る。ＣＸＣＲ２は、Ｔ細胞ではなく、好中球及び樹状細胞などの骨髄細胞によって発現される。初代又はｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍標的化骨格の一部としてのＣＸＣＲ２を、その発現及び機能的態様について評価した。
ＣＸＣＲ２を発現するように操作された初代ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ評価のための例示的な実験設計を図２Ａに示す。簡単に説明すると、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞をＮＳＧマウスに皮下注射し、２０日後、腫瘍を有するマウスの半分にパクリタキセルを２３日目まで毎日投与した。ＣＸＣＲ２リガンドであるＣＸＣＬ８（ＩＬ８）は、乳ガンを含む複数の腫瘍タイプにおいて濃縮され、腫瘍細胞におけるその発現は、化学療法又は放射線療法への曝露後に増加する。パクリタキセルを、腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ２リガンドレベルを増加させるためのプレコンディショニングに使用した。２７日目に、前処置したマウス及び対照マウスに、ＣＸＣＲ２＋（約２５％＋）又はＣＸＣＲ２－初代ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した。処置マウスを腫瘍成長についてモニターし（図２Ｂ）、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を４５日目に計算した（図２Ｃ）。プレコンディショニングがない場合、ＣＸＣＲ２＋初代ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＳＫＯＶ３腫瘍の約４０％（ｐ＜０．０１）の有意な腫瘍成長阻害を実証した。プレコンディショニング単独は、未処置の腫瘍を有するマウスと比較して、約３０％の腫瘍成長阻害（ｐ＜０．０５）を誘導した。ＣＸＣＲ２＋ＣＡＲ－Ｔと化学療法プレコンディショニングとの組み合わせは、腫瘍のみを受けたマウスと比較して、腫瘍の最大の制御を誘導した（＞７０％、ｐ＜０．０００１）。ＣＸＣＲ２＋又はＣＸＣＲ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍への浸潤及び保持も、プレコンディショニングを伴って及び伴わずに、４、１４、及び２５日目（プレコンディショニングなし）又は３１日目（プレコンディショニングあり）にフローサイトメトリーによって評価した。図２Ｄに示すように、腫瘍内へのＣＡＲ－Ｔ細胞の浸潤及び保持は、ＣＸＣＲ２＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を化学療法プレコンディショニングと組み合わせた場合に有意に増強された（ｐ＜０．０００１）。
次に、ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ、並びにＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２を発現するように操作した。ＣＡＲのＨＥＲ２結合ドメインは、本明細書に記載のＣａｓＭａｂ２５０に基づいていた。ケモカイン受容体発現は、親ＣＡＲ ｉＴ細胞における０．２０％と比較して、細胞の６４％が高レベルのＣＸＣＲ２を発現するＣＤ３８ヌル操作ＣＡＲ ｉＴ細胞において、高レベルのＣＸＣＲ２発現を実証した（図２Ｅ、左パネル）。固形腫瘍へのＴ細胞浸潤に重要であることが多いケモカインシグナル伝達受容体であるＣＣＲ１及びＣＸＣＲ３は、それらの親ＣＡＲ ｉＴ細胞と比較して、ＣＸＣＲ２操作ＣＡＲ ｉＴ細胞において影響を受けないままであったことが注目された（図２Ｅ、中央及び右パネル；それぞれＣＣＲ１：９４．３％対９３．３％；及びＣＸＣＲ３：９９．６％対９９．７％）。
操作されたＣＸＣＲ２の機能的発現を、トランスウェル遊走アッセイによって決定した。操作されたＣＸＣＲ２＋及び親ＣＸＣＲ２－ＣＡＲ ｉＴ細胞を５μｍのトランスウェルインサートに播種し、様々な希釈（１６ｐｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ）のケモカイン（ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ５、又はＣＸＣＬ９）を下部チャンバーに添加した。３時間の培養後、Ｔ細胞の特異的遊走を計算した。図２Ｆ、左パネルに示すように、ＣＸＣＲ２操作ＣＡＲ ｉＴ細胞は、ＣＸＣＲ２リガンドであるＣＸＣＬ８の様々な希釈に対して用量応答的に機能的に遊走したが、ＣＣＬ５（ＣＣＲ１リガンド）及びＣＸＣＬ９（ＣＸＣＲ３リガンド）に対するＣＸＣＲ２＋ＣＡＲ ｉＴ細胞の感受性は影響を受けなかった（図２Ｆ、中央及び右パネル）。これらのデータは、初代又はｉＰＳＣ由来ＣＡＲ Ｔ細胞へのＣＸＣＲ２の操作が、ＣＸＣＲ２リガンドへの細胞の機能的遊走を可能にし、固形腫瘍への浸潤及び保持の改善並びに腫瘍クリアランスの増強を容易にすることを実証する。
実施例４－エフェクター細胞骨格に組み込まれたＴＧＦβシグナルリダイレクタ受容体は、エフェクター細胞機能を改善する
この実験では、活性化された初代ＣＤ８ Ｔ細胞の群をそれぞれ、ＴＧＦβＲ由来の細胞外ドメイン及びＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ又はＩＬ２１Ｒの細胞内ドメイン又はその断片を含む異なるＴＧＦβ－ＳＲＲ構築物でレンチウイルス形質導入した。ＩＬ２を含まないＴ細胞培地中で２４時間静置した後、Ｔ細胞を示された濃度のＴＧＦβに曝露した。２時間後、細胞を採取し、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の存在についてフローサイトメトリーによって分析した。ＩＬ２スパイクインを陽性対照として使用した。図３Ａに示されるように、フローデータは、ＴＧＦβの存在下でのＴＧＦβ－ＳＲＲ構築物におけるＩＬ１２Ｒ、ＩＬ２１Ｒ及びＩＬ２Ｒのサイトカイン受容体内部ドメインの機能性を実証し、ｐＳＴＡＴ５陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセントが、ＩＬ２がスパイクインされた場合に観察されたものと同様のレベルまで増加したことを示す。
別の実験において、ｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＡＲ－ｉＴ）をレンチウイルスで形質導入して、ドミナントネガティブＴＧＦβＲ２（ＤＮ ＴＧＦβＲ２若しくはｄｎＴＧＦβＲ２）又はＴＧＦβ－ＳＲＲ構築物のいずれかを発現させた。次いで、ＣＡＲ－ｉＴを連続刺激アッセイで試験し、ここで、腫瘍細胞を死滅させるエフェクター細胞の能力を、複数回の共培養にわたって、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下で、ＩｎｃｕＣｙｔｅ機器で測定した。ＴＧＦβ－ＳＲＲについて、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒに関連するデータを示す。図３Ｂに示されるように、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒを発現するＣＡＲ－ｉＴは、ＴＧＦβ－ＳＲＲ ＣＡＲ－ｉＴ又はｄｎＴＧＦβＲ２＋ＣＡＲ－ｉＴと比較して、第１ラウンドの共培養においてＴＧＦβの存在下で増強された腫瘍殺傷を実証した（図３Ｂ、左プロット）。４ラウンドの共培養及びＴＧＦβへの曝露後（図３Ｂ、右プロット）、ｄｎＴＧＦβＲ２＋ＣＡＲ－ｉＴは、形質導入されていないエフェクターとの共培養と非常に類似した腫瘍殺傷動態を示した。重要なことに、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴは、この場合、ＩＬ１８Ｒの細胞内ドメインを介して、ＴＧＦβリダイレクタによって提供される更なるサイトカインシグナル伝達のために、増強された腫瘍殺傷能力を示し続けた。
更なる実験において、ＴＧＦβ－ＳＲＲを発現する遺伝子操作されたＣＡＲ－ｉＴの集団を、図４Ａに示される戦略を使用して調製した。特に、バイシストロン性ドナーカセットを、ＣＲＩＳＰＲ酵素を介してｉＰＳＣ集団のＣＤ３８遺伝子座に挿入し、ここで、ｉＰＳＣは、ＴＲＡＣ遺伝子座に挿入されたＣＡＲを有する。バルク操作ｉＰＳＣをＣＡＲ－ｉＴ細胞に分化させ、ＴＧＦβの存在下又は不在下での連続刺激アッセイにおいて試験した。Ｔｈｙ１．２マーカー及びＴＧＦβ－ＳＲＲの共発現は、首尾よく操作されたＣＡＲ－ｉＴ集団における細胞のパーセンテージを示す。図４Ｂに示されるように、ＣＡＲ－ｉＴにおいて発現されたＴＧＦβ－ＳＲＲの３つの例－ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ、及びＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒを生成した。ｉＴ分化プロセスの終わりに向かって、細胞がＴ細胞系統にコミットすると、ＴＲＡＣプロモータは活性になる。図４Ｃに示されるように、ＴＧＦβ－ＳＲＲ操作細胞におけるＣＡＲの表面発現は、Ｔ細胞への分化の成功を示す。
連続刺激アッセイを使用して、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ構築物を発現するＣＲＩＳＰＲ操作ＣＡＲ－ｉＴ細胞を、エフェクター機能のＴＧＦβ媒介性抑制に抵抗するそれらの能力について試験した。ＴＧＦβの不在下で、対照ＣＡＲ－ｉＴは、５ラウンドの共培養にわたって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴと非常に類似した腫瘍殺傷動態を示した図５、パートＡ、ＴＧＦβなし）ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴが、ＴＧＦβの不在下で不必要に高いレベルのエフェクター機能を示さないことを実証する。２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを連続刺激アッセイに添加すると、対照ＣＡＲ－ｉＴ細胞は、第１ラウンドにおいてＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴと同様の細胞溶解能力を示し、ＴＧＦβ－ＳＲＲ ＣＡＲ－ｉＴのＴＧＦβとの急性曝露がこれらの細胞のエフェクター機能を劇的に変化させる可能性が低いことが実証された（図５、パートＢ、プラスＴＧＦβ）。しかしながら、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴにおける腫瘍殺傷活性の増加は、連続刺激の第２ラウンドから観察された。図５のパートＢに示されるように、このエフェクター機能の増加は、最大５ラウンドの共培養の間持続した。比較すると、対照ＣＡＲ－ｉＴは、ＴＧＦβスパイクインによる連続刺激アッセイにおいて、標的細胞を死滅させるそれらの能力を次第に喪失した。
Ｔ細胞のエフェクター機能及び抗腫瘍活性は、Ｔ細胞活性化状態に関連している。標的細胞による複数ラウンドの刺激後のＴＧＦβ－ＳＲＲを発現するＣＡＲ－ｉＴ細胞の活性化プロファイルを特徴付けるために、対照ＣＡＲ－ｉＴ又はＴＧＦβ－ＳＲＲ ＣＡＲ－ｉＴを、ＴＧＦβの存在又は不在下で標的細胞との５ラウンドの共培養に供し、ラウンド５の終了時に、細胞をＴＧＦβＲ２及びＴｈｙ１．２について染色した（図６Ａ）。Ｔｈｙ１．２マーカー及びＴＧＦβＲ２の共発現は、ＴＧＦβ－ＳＲＲの発現を維持したエフェクター細胞のパーセントを示す。ＴＧＦβの存在下及び不在下での５ラウンドの共培養の終了時のエフェクター細胞も、活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５の共発現についてフローサイトメトリーによって分析した（図６Ｂ）。図６Ｂに示すように、ＴＧＦβの不在下では、対照及びＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴの両方が、ＣＤ６９及びＣＤ２５の両方に対して約６０％陽性であった。比較すると、ＴＧＦβの存在下では、対照ＣＡＲ－ｉＴは、ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋細胞の減少を示したが（３２．４％）、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴの６１．６％は、ＣＤ６９及びＣＤ２５について二重陽性であった（図６Ｂ）。したがって、ＴＧＦβ－ＳＲＲを有するＣＡＲ－ｉＴ細胞は、標的細胞による複数ラウンドの刺激後であっても、増強された活性化プロファイルを有する。
更に、連続刺激アッセイのラウンド５からの上清を収集し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインについてＭＳＤアッセイによって試験した。図７に示されるように、ＴＧＦβの存在下で、対照ＣＡＲ－ｉＴは、共培養培地中のサイトカインの劇的な減少を示した。対照的に、ＴＧＦβ－ＳＲＲ ＣＡＲ－ｉＴとの共培養物において見出された。ＴＧＦβの存在下でさえ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴの共培養物において測定されたサイトカインは、ＴＧＦβをスパイクインしていない対照ＣＡＲ－ｉＴの共培養物において見出された量と同様の量であった。ＴＧＦβが存在する場合の連続培養シチュレーション（stiulation）におけるサイトカインの産生の増強は、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴが、固形腫瘍環境の代表的な免疫抑制特性であるＴＧＦβが存在する場合であってもエフェクター機能を維持できることを示している。
ＴＧＦβ－ＳＲＲを有するＣＡＲ－ｉＴ細胞が、固形腫瘍環境において標的細胞刺激後に増殖することができるかどうかを試験するために、対照又はＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴを、ＴＧＦβの存在下又は不在下で標的細胞との５ラウンドの共培養に供した。この連続刺激アッセイ中の各ラウンドの終了時に細胞を採取し、カウンティングビーズ及びフローサイトメトリーを使用してエフェクター細胞の数を決定した。図８に示されるように、対照ＣＡＲ－ｉＴ細胞は、ＴＧＦβの存在下で増殖の欠如を示したが、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴは、ＴＧＦβの不在下で連続的に刺激された対照ＣＡＲ－ｉＴと同様の正常な増殖プロファイルを示した。ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒ ＣＡＲ－ｉＴはまた、対照ＣＡＲ－ｉＴと比較して、ラウンド２、３、及び４において観察されたより高い倍率の増殖を伴って、ＴＧＦβの不在下で強い増殖を示した。したがって、本明細書に開示される固形腫瘍標的化骨格に含まれるＴＧＦβ－ＳＲＲは、固形腫瘍環境に典型的な、複数ラウンドの標的細胞刺激及びＴＧＦβの存在下であっても、ＣＡＲ－ｉＴ細胞の増殖が改善される。
更に設計され試験されたＴＧＦβ－ＳＲＲは、ＴＧＦβＲ２の外部ドメインに加えてＩＬ１２Ｒｂ２の細胞質ドメインの断片を含むものである。ＩＬ１２Ｒｂ２の短縮型細胞質ドメインを含む断片は、配列番号１３によって表される。ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒｂ２は、配列番号１６によって表される例示的なアミノ酸配列を含み、その膜貫通ドメイン配列は、変化し得るか、又は別の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインで置換され得ることが当業者によって理解される。
配列番号１３
ＳＤＰＫＰＥＮＰＡＣＰＷＴＶＬＰＡＧＤＬＰＴＨＤＧＹＬＰＳＮＩＤＤＬＰＳＨＥＡＰＬＡＤＳＬＥＥＬＥＰＱ
Figure 2024515920000053
 （ＴＧＦβＲ２外部ドメイン－膜貫通ドメイン配列－ＩＬ１２Ｒｂ２内部ドメイン断片）
ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体及びｈｎＣＤ１６をコードするポリヌクレオチドを含むバイシストロン性ドナーカセットを、ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用してｉＰＳＣのＣＤ３８遺伝子座に挿入した。バルク操作されたｉＰＳＣをソーティングし、本出願に記載される方法を使用して、この実験においてｉＮＫ細胞に分化させた。フローサイトメトリーを使用して、ｉＰＳＣから分化したｉＮＫ細胞上の示されたＮＫマーカーの表面発現を検出した（図９）。ドミナントネガティブＴＧＦβＲ２（ｄｎＴＧＦβＲ２）又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を発現するｉＮＫ細胞は、親ｉＮＫの表現型プロファイルと同様の表現型プロファイルを示した。これは、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ導入遺伝子とｉＰＳＣ発生及びｉＮＫ分化プロセスとの適合性を示す。予想通り、ドナーカセットに関連するマーカー、ＴＧＦβＲ２及びＴｈｙ１．２のみが、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ発現ｉＮＫ及びｄｎＴＧＦβＲ２発現ｉＮＫにおいて異なっている。
次いで、親ｉＮＫ、ｄｎＴＧＦβＲ２発現ｉＮＫ、及びＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ発現ｉＮＫをそれぞれ、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＫ５６２標的細胞と共培養した。２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを、０、２、及び４日目に共培養物に添加した。フローサイトメトリーを使用して、共培養の２日目、４日目及び７日目にエフェクター細胞数を評価した。図１０Ａに示されるように、親ｉＮＫ及びｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫの両方が、７日間の共培養にわたってエフェクター細胞数の進行性の減少を示した。しかしながら、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を発現するｉＮＫ細胞は、アッセイの７日目までであっても強い増殖及び持続を示した（図１０Ａ）。理論によって限定されるものではないが、ｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫを上回るこの性能の向上は、ＩＬ１２Ｒｂの細胞質ドメイン断片を介したＩＬ１２シグナル伝達経路へのＴＧＦβシグナルの再指向によるものであり得る。７日目からの細胞を、ＮＫ表現型マーカー（ＣＤ４５及びＣＤ５６）又は活性化マーカー（ＣＤ２５及びＮＫｐ４６）についてフローサイトメトリーによって更に分析した。図１０Ｂに示すように、親ｉＮＫ及びｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫは、選択された表面マーカーを発現する細胞の同様の割合を示したが、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ５６発現を保持する細胞の割合が有意に増加したことを示した。ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫが、ＣＤ２５及びＮＫｐ４６を発現するエフェクターのパーセンテージに基づいて、より活性化されたプロファイルを示したことにも注目されたい（図１０Ｂ）。
更に、親ｉＮＫ、ｄｎＴＧＦβＲ２発現ｉＮＫ、及びＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ発現ｉＮＫをそれぞれ、Ｅ：Ｔ比１：１でＲａｊｉ腫瘍標的細胞と共培養した。２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを０日目、２日目、及び４日目に共培養物に添加し、標的細胞に対する自然殺傷能力をフローサイトメトリーによって３ラウンドにわたって測定した。図１１Ａに示されるように、親ｉＮＫ及びｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫの両方は、刺激の第１ラウンド後に自然殺傷能力の有意な喪失を示したが、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫ細胞は、共培養の３ラウンド全てにわたって標的を殺傷する能力を維持した。共培養の各ラウンドの終了時に、フローサイトメトリーも使用して、エフェクター細胞の増殖を決定した。図１１Ｂに示すように、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を発現するｉＮＫ細胞は、親ｉＮＫ及びｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫと比較して強い増殖を示し、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体が腫瘍標的細胞の存在下でエフェクター細胞の増殖を改善することを示唆した。
再刺激ラウンド２の終了からの細胞を、ＮＫ表現型マーカー（ＣＤ５６）及び活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９及びＮＫｐ４４）についてフローサイトメトリーによって更に分析した。図１１Ｃに示されるように、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫ細胞は、親ｉＮＫ（対照）及びｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫと比較して、選択された表面活性化マーカーを発現する細胞の割合の有意な増加を示した。先の実験と同様に、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫは、活性化マーカーを発現するエフェクターのパーセンテージに基づいて、より活性化されたプロファイルを示した（図１１Ｃ）。
ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫ細胞及び親ｉＮＫを、２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ及び抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在下で、Ｅ：Ｔ比５：１においてＭＤＡ－ＭＢ－２３１がん細胞と一晩共培養した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳がん細胞株は、ＰＤＬ１を過剰発現する。アベルマブは、親ｉＮＫ細胞に含まれる外因性ＣＤ１６バリアントに結合してｉＮＫ細胞が標的がん細胞に対してＡＤＣＣ媒介性細胞傷害を行うことができるＡＤＣＣコンピテントモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。一晩の共培養後、上清を採取し、遠心分離し、マルチアナライトカートリッジにロードして、サイトカインＴＮＦ、ＩＦＮγ、及びＧＭＣＳＦの分泌を定量した（図１２）。
ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（商標）ベースのＡＤＣＣアッセイを使用して、異なるｉＮＫエフェクターのＡＤＣＣ能力を決定した。図１３Ａに示すように、エフェクターの不在下では、ｍＡｂ単独（１０μｇ／ｍＬアベルマブ）の添加は、標的細胞の細胞溶解を誘導するのに十分ではなかった。培養物にエフェクターを添加する（Ｅ：Ｔ比５：１）ことにより、各試験したｉＮＫ細胞株による標的細胞の細胞溶解が得られた。親ｉＮＫエフェクターは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１標的細胞に対してＡＤＣＣを示したが、ｄｎＴＧＦβＲ２又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβのいずれかを発現するｉＮＫは、はるかに良好な細胞溶解活性を示した。
理論に制限されるものではないが、ｉＮＫ分化プロセス中のＴＧＦβシグナル伝達の遮断は、ｄｎＴＧＦβＲ２及びＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫの両方がＴＧＦβの不在下であってもより良好なＡＤＣＣを示すように、改善されたエフェクター機能を有するｉＮＫをもたらし得る可能性がある。示されるように、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβを培養培地に添加した場合、親ｉＮＫは、ＡＤＣＣ能力の劇的な喪失を有し、ｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫは、全体的なＡＤＣＣ活性が減少した。しかしながら、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫは、アッセイの終わりまでにＴＧＦβスパイクインによる標的細胞の完全な細胞溶解を依然として示した（図１３Ｂ）。
更に、細胞を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１標的細胞との共培養の第１ラウンドの終了時に採取し、フローサイトメトリーによって分析して、残っているエフェクター細胞の数、及び所与の時点での導入遺伝子発現を決定した。理論によって限定されるものではないが、ｄｎＴＧＦβＲ２を発現するｉＮＫと比較したＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ発現ｉＮＫの増強された持続性は、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体がＴＧＦβシグナル伝達を遮断するだけでなく、ＩＬ１２シグナル伝達カスケードも開始することに起因し得る（図１４Ａ）。更に、図１４Ｂに示されるように、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ構築物は、より安定であり、ＴＧＦβの存在下でｉＮＫ細胞の表面上で高度に発現されるようであり、これは固形腫瘍環境の顕著な特徴である。
図１３Ａと同じ設定で、ラウンド１共培養の終わりに、エフェクター細胞を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍標的を有する第２のｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（商標）プレートに移した。エフェクター及びアベルマブの添加後、それに応じてラウンド２の細胞溶解％を測定した。図１５Ａは、ＴＧＦβの不在下であっても、標的細胞に対するＡＤＣＣ活性がほとんど観察されなかったため、親ｉＮＫがエフェクター機能を喪失したことを示す。ｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫは、標的細胞をほぼ完全に溶解することができたＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫと比較した場合に大幅に減少したが、いくらかの量のＡＤＣＣ活性を保持した。理論によって限定されるものではないが、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ構築物からの特定のレベルの持続性シグナル伝達の結果、この導入遺伝子を発現するｉＮＫは、複数ラウンドの標的刺激の後であっても頑強なエフェクター機能を有することができる。しかしながら、ＴＧＦβの存在下では、ｄｎＴＧＦβＲ２ ｉＮＫであっても、親ｉＮＫと全く同様に、標的細胞を溶解するそれらの能力のほとんど全てを喪失した（図１５Ｂ）。また、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ ｉＮＫは、ＴＧＦβの存在下でＡＤＣＣ能力の低下も示すが、ＴＧＦβの抑制効果を克服する際にｄｎＴＧＦβＲ２導入遺伝子よりもＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβ導入遺伝子を有することに明らかな利点があった。ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβの発現が増強されたエフェクター細胞増殖、持続性、及びエフェクター機能をもたらしたＮＫ細胞におけるそのような観察は、ＩＬ１２シグナル伝達経路がＮＫ細胞におけるようにＴ細胞において重要であると考えられるので、Ｔ細胞において予想され得る。
異なるｉＮＫエフェクターのＡＤＣＣ能力を更に評価するために、アッセイを、ＳＫＯＶ３卵巣細胞腫瘍株及びＰＣ－３前立腺がん細胞株を含む更なる固形がん細胞モデルに拡張した。ＳＫＯＶ３がん細胞はＨＥＲ２を過剰発現するので、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）として市販されている抗ＨＥＲ２抗体）を、ＳＫＯＶ３標的に対する例示的なＡＤＣＣコンピテントｍＡｂとして選択し、トラスツズマブ及びセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）を、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲの両方のそれらの発現を考慮して、ＰＣ－３標的に対する例示的なｍＡｂとして選択した。図１６に示すように、ＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβを発現するｉＮＫは、親ｉＮＫエフェクターと比較して、全ての標的に対してはるかに良好な細胞溶解活性を示した。
実施例５－固形腫瘍標的化骨格を有するＣＤ３８陰性ＣＡＲ－ｉＴ細胞によって可能になったアロ反応性免疫細胞の選択的枯渇
自己及び同種異系細胞療法の両方は、現在、養子移入された細胞の増強のためのサイトカインリッチ環境を誘導し、宿主免疫系を調節する、患者のリンパコンディショニングに依存する。しかし、リンパコンディショニングは、重篤な感染に対する感受性の増加を含む血液毒性と関連している。本明細書に開示される免疫治療エフェクター細胞は、選択された内因性遺伝子座に選択的に導入された外因性モデルを戦略的に組み込み、骨格設計の一部と同時に内因性遺伝子（複数可）をノックアウトする固形腫瘍標的化骨格を含む。ＣＤ３８は、２つの選択された内因性遺伝子座のうちの１つとして、養子移入された細胞の抗腫瘍活性を維持しながら、化学療法に基づくリンパコンディショニングの必要性を有意に低減しようとする際に、本明細書で提供される固形腫瘍標的化骨格設計によって包含される遺伝子ノックアウト戦略のうちの１つである。
混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction、ＭＬＲ）を実施して、抗ＣＤ３８ｍＡｂ（ダラツムマブ）処理ＣＡＲ－ｉＴ細胞が同種異系リンパ球による拒絶に抵抗する能力を評価した。ｈｎＣＤ１６ａ＋／ＣＤ３８－ＣＡＲ－ｉＴ細胞を、ＩＬ２を補充した培地中で９日間、抗ＣＤ３８抗体、ダラツムマブの存在下及び不在下で、健常ドナー由来の同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と１：１の比で共培養した。共培養の期間にわたって、フローサイトメトリー分析を実行し、ＣＡＲ－ｉＴ細胞数を計数し、示された時点でプロットした（図１７）。ＣＡＲ－ｉＴ細胞数を、ＰＢＭＣの不在下で維持したＣＡＲ－ｉＴ細胞対照培養物に対して正規化した。データは、ダラツムマブの不在下で、ＣＡＲ－ｉＴ細胞の共培養が、経時的なＰＢＭＣ媒介性枯渇の影響を受けやすかったことを示す。しかしながら、ダラツムマブ処理共培養では、ＣＡＲ－ｉＴ細胞は、ＰＢＭＣを含まない対照培養と同様の持続レベルを維持し、経時的に増殖さえした。これらのデータは、本明細書に開示されるＣＤ３８ノックアウトを含む固形腫瘍標的化骨格を有するＣＡＲ－ｉＴ細胞が、ダラツムマブの存在による枯渇の影響を受けにくいことを実証する。加えて、ダラツムマブ処置は、同種異系固形腫瘍標的化における同種異系リンパ球による枯渇からＣＤ３８－ＣＡＲ－ｉＴ細胞を保護する。
これらの共培養において、ＰＢＭＣ中のＴ及びｐｂＮＫ細胞増殖を経時的に測定した。図１８に示されるように、Ｔ（左パネル）及びｐｂＮＫ細胞（右パネル）の絶対数を、示された時点でプロットした。データは、ＰＢＭＣを単独で培養した場合、Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞の両方が確実に増殖することができたことを示す。ダラツムマブ又はＣＡＲ－ｉＴ細胞のいずれかがそれぞれ提供されたＰＢＭＣ培養において、Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞増殖の部分的な抑制のみが観察された。しかしながら、ＰＢＭＣをＣＡＲ－ｉＴ細胞及びダラツムマブの両方と共培養した条件では、Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞の最大抑制が観察された。これらのデータは、本明細書に開示されるＣＤ３８ノックアウトを含む固形腫瘍標的化骨格を有するＣＡＲ－ｉＴ細胞が、ダラツムマブを利用して、同種異系Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞の増殖を抑制し、それによって、ＣＡＲ－ｉＴ細胞がＴ及びｐｂＮＫアロ反応性を回避することができる機構を提供することができることを実証する。
これらの共培養において、ダラツムマブがＣＤ３８＋Ｔリンパ球及びｐｂＮＫリンパ球を選択的に枯渇させる能力も評価した。代表的なフロープロットは、ＰＢＭＣとのＣＡＲ－ｉＴ細胞共培養において、Ｔ細胞の９１％（図１９Ａ）及びｐｂＮＫ細胞の７４％（図１９Ｂ）がＣＤ３８を発現したことを実証する。しかしながら、ダラツムマブで処理したこれらの同じ共培養物では、ＣＤ３８＋Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞の割合の実質的な減少が観察された（それぞれ、図１９Ａでは５２％まで、図１９Ｂでは１６％まで低下）。代表的なフロープロットに示されるＣＤ３８＋Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞の絶対数を定量し、棒グラフとしてプロットした。ダラツムマブの存在下で維持された共培養物からのＣＤ３８＋Ｔ細胞数は、対照条件と比較して、検出可能なＣＤ３８＋Ｔ細胞のおよそ１５倍の減少を示した（図１９Ｃ）。同様に、ダラツムマブ処理共培養物からのＣＤ３８＋ｐｂＮＫ細胞数は、対照条件と比較して、検出可能なＣＤ３８＋ｐｂＮＫ細胞のおよそ２１倍の減少を示した（図１９Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ３８ノックアウトの固形腫瘍標的化骨格への組み込みが、細胞がダラツムマブで処置される場合、抗ＣＤ３８ｍＡｂ ＣＡＲ－ｉＴ又はｉＮＫ細胞が、ＣＤ３８ヌルＣＡＲ－ｉＴ又はｉＮＫ細胞を含む非アロ反応性のＣＤ３８陰性リンパ球を残しながら、ＣＤ３８＋Ｔ細胞及びｐｂＮＫ細胞を選択的に枯渇させることを可能にすることを実証する。
加えて、ダラツムマブの存在下でｈｎＣＤ１６ａ＋／ＣＤ３８－ｉＮＫ及びｉＴ細胞を使用してＣＤ３８＋Ｔ及びｐｂＮＫ細胞を標的とする場合、ＣＤ３８＋細胞の枯渇は、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ＣＤ３８の基質）利用可能性を増加させ、ＮＡＤ＋消費関連細胞死を減少させ、これは、他の利点の中でもとりわけ、免疫抑制性腫瘍微小環境においてエフェクターＴ及びＮＫ細胞応答をブーストし、エフェクター細胞老化を低減することが観察された。
ＣＤ３８ノックアウトを利用するための抗ＣＤ３８抗体による治療は、必要な場合にのみ利用することができ、患者の状況に柔軟性を提供することにも留意されたい。
実施例６－４－１ＢＢを標的とする同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）を装備したエフェクター細胞
リンパコンディショニングに関連する課題に対処するための代替又は追加のアプローチとして、宿主免疫細胞を選択的に標的とし、養子移入された細胞の機能活性を有意にブーストする同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）が開発された。本明細書に開示されるように、アロ反応性ＮＫ及びＴ細胞を含む活性化エフェクター細胞上で上方制御されるＡＤＲ標的化４－１ＢＢは、化学療法コンディショニングを必要とせずに宿主免疫細胞サブセットを枯渇させながら、免疫適格宿主系において同種異系エフェクター細胞の機能的持続性及び抗腫瘍活性をもたらすために、本明細書に構成されるような固形腫瘍標的化骨格の一部であるように採用された。
インビトロ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞（ＡＤＲあり又はなし）及びＰＢＭＣを８：１の比で共培養した。１０日目の共培養を、ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ３８及び４－１ＢＢの発現について分析し、全ての検出できる４－１ＢＢ発現がＣＤ３８＋アロ反応性集団に限定されることが実証された。これは、ＡＤＲ及びＣＤ３８コンディショニングの潜在的な同時使用（すなわち、抗ＣＤ３８抗体が存在するＣＤ３８－エフェクター細胞）が、本出願に開示されるような固形腫瘍標的化骨格に更に組み込むことができる強化されたアロ反応性防御戦略を提供することを示す。最初の研究は、ＡＤＲ修飾ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞が同種拒絶に抵抗する一方で、抗ＣＤ３８ｍＡｂの組み合わせで更に増強される耐久性のある抗腫瘍応答を誘発することを示唆した。
人工多能性幹細胞を、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ並びに１つ以上の意図された導入遺伝子及び位置選択的挿入のための一対のホモロジーアームを含む構築物を使用して、ＣＤ３８ＫＯ、ＣＤ１９－ＣＡＲ、４１ＢＢ－ＡＤＲ、高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、及びＩＬ１５ＲＦの過剰発現を得るために、連続的又は同時に操作した。挿入が内因性ＣＤ３８遺伝子座で行われる場合、本明細書で提供される構築物は、導入遺伝子が、ＣＤ３８内因性プロモータ下又は構築物に含まれる外因性プロモータ下のいずれかで発現することを可能にする。次いで、ゲノム編集されたクローンｉＰＳＣを、本明細書で提供される方法に従って、４１ＢＢ－ＡＤＲ発現を伴う又は伴わない、ＣＤ１９－ＣＡＲ、ＣＤ３８－／－、ｈｎＣＤ１６及びＩＬ１５ＲＦを含むエフェクター細胞に分化させた。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を実行して、同種異系環境における調製された派生エフェクター細胞の寿命を試験した。ｉＮＫ細胞集団（４１ＢＢ－ＡＤＲを有する及び有しない）は、アッセイの直前に細胞内色素（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（商標）又は類似のＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標）互換試薬）で標識されている。ＣＡＲ－ｉＮＫ±ＡＤＲ細胞を、４：１のｉＮＫ細胞対ＰＢＭＣ比で共培養し、ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣに対するゲーティング図を示す代表的なＦＡＣＳプロットに示されるように、機能的持続性の増強を示した（図２０Ａ）。共培養物からのｉＮＫ細胞数を、図２０Ｂに示される指示された時点でプロットし、データをＰＢＭＣを用いずに培養したｉＮＫ細胞に対して正規化した。
別の実験において、ＣＡＲ－ｉＮＫ±ＡＤＲ細胞を、８人のドナーからのＰＢＭＣと、２：１のｉＮＫ細胞対ＰＢＭＣ比で９日間共培養した。図２１Ａに示すように、ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞は、ＡＤＲで装備していないＣＤ１９－ＣＡＲ ｉＮＫ細胞と比較して、アロ反応性ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖を阻害した。Ｔ細胞及びＮＫ細胞数の定量（ｉＮＫ細胞の不在下で維持されたドナーＰＢＭＣの培養物からのＴ細胞及びＮＫ細胞数に対して正規化）は、ＡＤＲの発現がＣＤ３＋ＣＤ５６－Ｔ細胞及びＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖を防止したことを示す（図２１Ｂ）。ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ３８及び４－１ＢＢの発現について分析した場合、４－１ＢＢ＋Ｔ細胞の有意な枯渇が、ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞の存在下で観察された（図２２Ａ）。図２２Ｂに示されるように、ＣＡＲ－ｉＮＫ±ＡＤＲ共培養における８人のドナー由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞間のＣＤ３８発現％及び４－１ＢＢ発現％の編集は、ＡＤＲ装備エフェクター細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋アロ反応性Ｔ細胞サブセットの両方を選択的に標的とし、枯渇させることを更に実証する。
更に、ＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲ（この実験では、ＭＩＣＡ／Ｂ－ＣＡＲが例示的なＣＡＲモダリティである）及びＡＤＲ（本出願に記載されるようなＣＤ３ζ又はＣＤ３ζ１ＸＸシグナル伝達ドメインのいずれかを含む４１ＢＢ－ＡＤＲモダリティ）を含むバイシストロイック（bicistroic）構築物をノックインするように操作されたｉＰＳＣをＴ細胞に分化させた。続いて、得られたＴ細胞を、ＣＡＲ及び細胞内ＣＤ３発現についてフローサイトメトリーによって分析した。示されるように、ＴＲＡＣによって駆動されるＣＡＲ及びＡＤＲ導入遺伝子を発現するように操作されたｉＰＳＣは、コミットされたＴ細胞に分化することができ（図２３（Ａ））、ＴＲＡＣによって操作されたｉＰＳＣ由来ｉＴ細胞におけるＣＡＲモダリティ及びＡＤＲモダリティの共発現は頑強である（図２３（Ｂ））。ＡＤＲモダリティを発現するか又は欠くｉＴ細胞を、同種異系Ｔ細胞と７２時間共培養した。ＡＤＲで装備していないｉＴ細胞は持続せず、同種異系Ｔ細胞の存在下で枯渇したが、ＡＤＲ発現ｉＴ細胞は持続した（図２４（Ａ））。加えて、同種異系Ｔ細胞は、ＡＤＲ欠損ｉＴ細胞と共培養した場合に増殖したが、ＡＤＲ発現ｉＴ細胞の存在下では枯渇した（図２４（Ｂ））。まとめると、これらのデータは、ＡＤＲが同種異系環境においてもｉＴ細胞を保護し得ることを示す。
まとめると、上記インビトロデータは、活性化された末梢Ｔ細胞又はＮＫ細胞を、それらの上方制御された４－１ＢＢを標的とすることによって抑制し、それによって、エフェクター細胞のレシピエントにおけるこれらの活性化された末梢Ｔ細胞又はＮＫ細胞による同種異系エフェクター細胞に対する同種拒絶反応を減少させる、同種異系エフェクター細胞による４１ＢＢ－ＡＤＲ発現の能力を実証する。
ＡＤＲアーム化エフェクター細胞の有効性をインビトロで評価するために、ＮＳＧマウスに約２０×１０６個のアロ反応性Ｔ細胞を静脈内（ＩＶ）注射し、続いて２４時間後（０日目）に１×１０５個のルシフェラーゼ化Ｂ２Ｍ ＫＯ Ｎａｌｍ６細胞のＩＶ注射を行った。更に２４時間後（１日目）、マウスに、ＡＤＲ発現を伴う又は伴わない約３×１０６個のＣＡＲ－ｉＮＫ細胞をＩＶ注射し、次いで３日目及び６日目に再び注射した。ルシフェラーゼＢ２Ｍ ＫＯ Ｎａｌｍ６細胞のみ又はビヒクルのみを受けたＮＳＧマウスを、それぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。アロ反応性Ｔ細胞を、製造業者のプロトコルによって示されるように、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２及びＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて１０日間にわたって事前にインビトロで増殖させた。総フラックスによる生物発光ベースの腫瘍定量を測定して、ＣＡＲ－ｉＮＫ±ＡＤＲの存在下でアロ反応性Ｔ細胞注射を受けなかったマウスと比較して、アロ反応性Ｔ細胞を受けたマウスにおける腫瘍成長をモニターした。示されるように、同種異系Ｔ細胞の不在下で、ＡＤＲ－ＣＡＲ－ｉＮＫ及びＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞は、Ｎａｌｍ６標的に対して同様の抗腫瘍活性を有する（図２５Ａ）。同種異系Ｔ細胞の存在と比較して、ＡＤＲ－ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞の拒絶は、非装備エフェクター細胞の抗腫瘍制御の喪失をもたらす（図２５Ｂ）。対照的に、ＡＤＲ＋ＣＡＲ－ｉＮＫ細胞は、同種異系Ｔ細胞チャレンジを伴わないマウスにおいて見られるように、同種異系Ｔ細胞の存在下で永続的な抗腫瘍制御を維持した。したがって、ＡＤＲ装備エフェクター細胞は、宿主アロ反応性Ｔ細胞系の存在下で、損なわれていない腫瘍制御をインビボで示す。
実施例７－固形腫瘍標的化骨格に組み込まれたＩＬ７受容体融合物（ＩＬ７ＲＦ）は、ＣＡＲ ｉＴ細胞の減少を低減する
柔軟なリンカーを用いてＩＬ７Ｒαに共有結合したＩＬ－７サイトカインを含むＩＬ７受容体融合タンパク質（ＩＬ７ＲＦ）を、ＣＡＲ－ｉＴの生存及び持続性を増強するために、固形腫瘍標的化骨格に組み込んだ。ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲを発現するか、又はＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ＣＡＧ ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２を発現するかのいずれかのＨＥＲ２－ＣＡＲ ｉＴを、ＨＥＲ２高ＳＫＯＶ３腫瘍細胞と、Ｅ：Ｔ比１：１で共培養した。次いで、４８時間の共培養後のエフェクター細胞及び残りのＣＡＲ－ｉＴ細胞の細胞溶解有効性を、各ＣＡＲ－ｉＴ構成について分析して、ＨＥＲ２－ＣＡＲエフェクター細胞へのＩＬ７ＲＦの寄与を確認（ａｃｃｅｒｔａｉｎ）した。
図２６Ａに示すように、両方の構成を有するＣＡＲ－ｉＴ細胞（ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ；又はＴＲＡＣ＿ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２）は、ＨＥＲ２高腫瘍細胞に対して同様の抗腫瘍有効性を示し、６０～７０％の同様のピーク細胞溶解有効性に達した。共培養の約４８時間後、ＣＡＲ－ｉＴ細胞を収集し、残りのＣＡＲ－ｉＴを測定した。図２６Ｂに示されるように、固形腫瘍標的化骨格中にＩＬ７ＲＦを含まないＣＡＲ ｉＴ細胞と比較して、実質的により多くのＩＬ７ＲＦ発現ＣＡＲ－ｉＴがアッセイ中に残った（インプットの１５％に対して６０％）。これらのデータは、ＩＬ７ＲＦ発現がＣＡＲ－ｉＴ細胞の減少を制限し、標的固形腫瘍細胞による活性化後のエフェクター細胞の持続性を増強することを実証する。ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞については、ＣＡＲとの共発現のためにＣＡＲ－ＩＬ１５ＲＦを使用した。
実施例８－固形腫瘍標的化骨格に組み込まれたｈｎＣＤ１６は、固形腫瘍関連抗原のＣＡＲ標的化を相補及び支持する
高度に発現された固形腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の不均一性さえも、固形腫瘍における細胞免疫療法の有効な適用のための主要な障壁である。固形腫瘍抗原の多抗原標的化を可能にするために、ＣＡＲ－ｉＴ細胞を、高親和性の非切断性バージョンのＣＤ１６ａ（ｈｎＣＤ１６）を発現するように操作し、本明細書に開示されるような固形腫瘍標的化骨格の一部としての、ｈｎＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣとＣＡＲとの適合性及び補充を、固形腫瘍標的化について評価した。ＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２に加えて、ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦを含むＣＡＲ－ｉＴ細胞及びＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦを含むＣＡＲ－ｉＴ細胞をそれぞれ、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞と、ＰＤＬ１又はＨＥＲ２を標的とする治療用抗体とともに４８時間共培養し、エフェクター細胞の細胞溶解有効性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイによってＥ：Ｔ比１：２で評価した。
ＳＫＯＶ３腫瘍細胞上のＰＤＬ１及びＨＥＲ２の表面発現を、定量的フローサイトメトリーによって決定し、アッセイしたＳＫＯＶ３腫瘍細胞は、ＰＤＬ１低及びＨＥＲ２高であった（図２７Ａ）。図２７Ｂに示されるように、抗ＰＤＬ１（中央パネル、６９％最大細胞溶解）又は抗ＨＥＲ２（右パネル、９５％最大細胞溶解）のいずれかによるｈｎＣＤ１６活性化は、培地単独（左パネル、４６％最大細胞溶解）又はｈｎＣＤ１６陰性ＣＡＲ－ｉＴ細胞（１６～２５％最大細胞溶解）と比較して、ｈｎＣＤ１６＋ＣＡＲ－ｉＴ細胞の有効性を特異的に増強した。重要なことに、細胞溶解に対するｈｎＣＤ１６補充の大きさは、ＰＤＬ１又はＨＥＲ２のいずれかの発現レベルと直接相関する。更に、図２７Ｃに示すように、抗ＰＤＬ１抗体又は抗ＨＥＲ２抗体の存在下及び不在下でＳＫＯＶ３腫瘍細胞上で一晩活性化したｈｎＣＤ１６＋ＣＡＲ－ｉＴによるＩＦＮγ、ＩＬ２、及びＣＤ１０７ａ発現（脱顆粒マーカー）は、ｈｎＣＤ１６同時活性化が抗原発現依存的にＣＡＲ－ｉＴ細胞のエフェクター機能を増強することを更に実証した（ＳＫＯＶ３＋ｈｎＣＤ１６ ＣＡＲ－ｉＴ：１２．８％ＩＦＮγ＋ＣＤ１０７ａ＋；ＳＫＯＶ３＋ｈｎＣＤ１６ ＣＡＲ－ｉＴ＋抗ＰＤＬ１：３５．０％ＩＦＮγ＋ＣＤ１０７ａ＋；ＳＫＯＶ３＋ｈｎＣＤ１６ ＣＡＲ－ｉＴ＋抗ＨＥＲ２：５１．０％ＩＦＮγ＋ＣＤ１０７ａ＋）。
ｈｎＣＤ１６媒介性ＡＤＣＣは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性ＪＩＭＴ１（ＨＥＲ２＋ＰＤＬ１高）及びＨＥＲ２低ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＥＲ２低ＰＤＬ１高）腫瘍株に対するＨＥＲ２－ＣＡＲ ｉＴの細胞溶解有効性を更に増強した（図２８）。ＳＫＯＶ３腫瘍細胞で観察されたように、ｈｎＣＤ１６活性化によるＣＡＲ有効性の相対的増強は、標的化された二次ＴＡＡに比例した。例えば、ＪＩＭＴ１及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞では、ＣＡＲ ｉＴ単独（それぞれ４７％及び１９％）と比較して、抗ＰＤＬ１及びＣＡＲ ｉＴで最大細胞溶解有効性（両方とも１００％）が観察された。
次に、ｈｎＣＤ１６／ＣＡＲ相補性を反復抗原刺激アッセイにおいて評価した。簡潔に述べると、ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ又はＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２を発現するＨＥＲ２－ＣＡＲ ｉＴを、抗ＨＥＲ２抗体を伴う又は伴わないＩＬ２の存在下で、ＨＥＲ２高ＳＫＯＶ３腫瘍細胞とＥ：Ｔ比１：１で共培養した。３日間の共培養後、ＣＡＲ－ｉＴを収集し、計数した後、新鮮な腫瘍標的をＥ：Ｔ比１：１で再播種した。ＣＡＲ－ｉＴ増殖及び細胞溶解有効性を、ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイによって決定した。図２９に示されるように、ＣＡＲ－ｉＴ細胞のｈｎＣＤ１６及びＣＡＲの同時活性化は、複数ラウンドの腫瘍チャレンジにわたって、ｈｎＣＤ１６＋ＣＡＲ－ｉＴ細胞の実質的により大きな増殖をもたらし、抗ＨＥＲ２抗体を用いたｈｎＣＤ１６同時活性化の不在下でのｈｎＣＤ１６＋ＣＡＲ－ｉＴについての９倍の増殖、及び抗ＨＥＲ２抗体を含む及び含まないｈｎＣＤ１６－ＣＡＲ－ｉＴ細胞についての５～７倍の増殖と比較して、４ラウンドの腫瘍チャレンジ後に＞４０倍の増殖に達する。注目すべきことに、ｈｎＣＤ１６及びＣＡＲで同時活性化されたＣＡＲ－ｉＴ細胞の細胞溶解有効性は、４ラウンドの腫瘍チャレンジの全てにわたって最大であった。要約すると、これらのデータは、本明細書に開示されるような固形腫瘍標的化骨格の構成要素として、ＣＡＲ及びｈｎＣＤ１６活性化が、エフェクター細胞増殖及び細胞傷害性を駆動すること、並びに複数の抗原密度及び腫瘍型にわたる固形腫瘍不均一性を支持する多抗原標的化に取り組むことにおける相乗効果を伴って、適合性かつ相補的であることを実証する。
実施例９－ＣａｓＭａｂベースのＨＥＲ２－ＣＡＲは、固形腫瘍標的化骨格を有するエフェクター細胞において腫瘍に対して有効かつ選択的である
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、液性腫瘍において顕著な有効性を示しているが、固形腫瘍へのそのより広い適用は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）不均一性、腫瘍への非効率的なＣＡＲ－Ｔ細胞輸送、及び腫瘍微小環境に固有の免疫抑制によって妨げられている。更に、これらの障害に対処するために必要な高度に編集された（例えば、＞２の導入遺伝子）初代ドナー由来ＣＡＲ－Ｔ細胞の、多くの場合機能不全で不均一な収率が、それらの有効性及びより広範な臨床研究を制限してきた。したがって、任意の固形腫瘍標的化モダリティ（例えば、抗原特異的ＣＡＲ、ＡＤＣＣ適合性ｍＡｂ、ＢｉＴＥ、ＴＲｉｋＥ）と適合性である最適化された骨格を含む多重操作ＣＡＲ－ｉＴ細胞産物の実証は、固形腫瘍適応症におけるその広範な適用のために特に重要である。本明細書で提供される最適化された骨格を含む多重操作ＣＡＲ－ｉＴ細胞産物は、腫瘍に優先的に輸送する能力、腫瘍微小環境抵抗性を促進する能力、並びにインビトロ及びインビボの両方の設定において強力かつ増強された抗腫瘍活性を誘発する能力を含む、固形腫瘍において観察される一般的な障壁を克服するように特異的に設計及び調整される。加えて、そのような製品は、既製で入手可能であるように製造され得ることも実証される。
ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＨＥＲ２－ＣＡＲを発現するｉＴ細胞を、ＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２又はＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβのいずれかを発現するように操作されたＴｉＰＳＣｓから生成し、ＣＡＲ標的化の有効性及び特異性を各構成について評価した。簡潔に述べると、ＣＡＲ－ｉＴを、ＨＥＲ２高（ＳＫＯＶ３）、ＨＥＲ２＋（ＪＩＭＴ１）、又はＨＥＲ２低（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）腫瘍細胞と、Ｅ：Ｔ比２：１で共培養し、細胞溶解有効性を、上記のようにｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイによって決定した。図３０に示すように、ＣＸＣＲ２（上の列）及びＴＧＦβＲ２（ＩＬ１２ＲＢ）（下の列）の両方のＣＡＲ－ｉＴ構成は、（ｉ）各特定の腫瘍標的株のＨＥＲ２抗原レベルと密接に相関し、（ｉｉ）同じＣＡＲを発現した初代ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して増強された頑強な抗ＨＥＲ２有効性を実証し、固形腫瘍標的化骨格のエフェクター細胞有効性への寄与を強調した。
次に、各々のセル構成におけるＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲの抗腫瘍特異性対正常ＨＥＲ２特異性を評価した。ＴＲＡＣ＿ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦ及びＣＤ３８＿ｈｎＣＤ１６／ＣＸＣＲ２を発現するＨＥＲ２－ＣＡＲ ｉＴ、並びにＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（４Ｄ５）由来のＨＥＲ２－ＣＡＲを発現する初代ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＨＥＲ２＋正常非腫瘍形成性細胞株ＭＣＦ１０ａ（Ｂｒｅａｓｔ）、Ｍｅｔ５ａ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、及びＨａＣａＴ（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）と１：１のＥ：Ｔ比で培養し、細胞溶解有効性をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイによってモニターした。図３１に示すように、４Ｄ５ベースの初代ＣＡＲ－Ｔは、アッセイした全てのＨＥＲ２＋正常細胞株を容易に標的とした。一方、ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ ｉＴは、ＭＣＦ１０ａ及びＭｅｔ５ａ細胞株に対して反応性を示さず、ＨａＣａＴ標的に対して限定された反応性を示した。したがって、ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＨＥＲ２－ＣＡＲを担持する初代ＣＡＲ－Ｔ及びＴＲＡＣ＿ＨＥＲ２－ＣＡＲ ｉＴは、正常ＨＥＲ２＋細胞ではなくＨＥＲ２＋腫瘍細胞に特異的であることが確認された。これらのデータはまた、腫瘍関連ＨＥＲ２抗原に対するＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ有効性及び選択性が、４Ｄ５をベースとするＨＥＲ２－ＣＡＲと比較して、主に非腫瘍ＨＥＲ２抗原に対して、本明細書に開示されるような固形腫瘍標的化骨格で高度に操作されたＣＡＲ－ｉＴ細胞において維持され、この骨格は更に、一般に腫瘍細胞に対する全体的なエフェクター細胞有効性に寄与し、特に固形腫瘍に対する更なる利点を有することを実証する。
実施例２に記載されるように、完全に装備された分化ＣＡＲ－ｉＴ細胞を、ＣＡＲ（例示的なＣａｓＭａｂベースのＨＥＲ２標的化ＣＡＲを使用する）、ＴＲＡＣノックアウト及びＣＤ３８ノックアウトに加えて、４つの固形腫瘍標的化骨格機能モダリティ（すなわち、ＴＧＦβリダイレクタ、ＣＸＣＲ２、ｈｎＣＤ１６、及びＩＬ７ＲＦ）を有する、ＴＲＡＣ＿ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ７ＲＦ（ＣＡＲ－ｉＴ）及びＣＤ３８＿ＴＧＦβＲ２（ＩＬ１８Ｒ）－２Ａ－ｈｎＣＤ１６－２Ａ－ＣＸＣＲ２を発現するように逐次操作されたｉＰＳＣから生成した（以下、「最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞」と呼ぶ）。リンパ系コミットメント（ＣＤ４５高ＣＤ７高）、並びに高度かつ均質なＣＡＲ、ｈｎＣＤ１６、ＴＧＦβ－ＳＲＲ（ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒリダイレクタ受容体をこのアッセイで使用した）、及び最適化ＣＡＲ－ｉＴのＣＸＣＲ２発現を実証するフローサイトメトリーを図３２に示した。
導入遺伝子の機能、適合性、相補性及び増強を実証するために、以下のアッセイを、対照としてＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦのＴＲＡＣ操作のみを有するＣＡＲ－ｉＴと比較して、最適化ＣＡＲ－ｉＴを用いて行った。ＣＡＲ－ｉＴ中のＣＡＲは、ＣａｓＭａｂベースのＨＥＲ２－ＣＡＲである。ＣａｓＭａｂ２５０ベースのＣＡＲ抗腫瘍細胞溶解有効性を、ＨＥＲ２高（ＯＶＣＡ、高発現卵巣上皮卵巣がん細胞株）、ＨＥＲ２中（ＢＲＣＡ；中発現乳がん細胞株）、ＨＥＲ２低（ＰＣＡ；低発現前立腺がん細胞株）、及びＨＥＲ２低（ＢＲＣＡ；エフェクター：低発現乳がん細胞株）腫瘍細胞について、ＨＥＲ２依存性腫瘍クリアランスを実証するためのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイによりエフェクター：標的比２：１で評価した。図３３に示されるように、最適化ＣＡＲ－ｉＴは、複数の固形腫瘍適応症及び多様な抗原レベルの腫瘍細胞にわたって頑強なＣＡＲ依存性抗腫瘍有効性を実証した。
図３４に示されるように、最適化ＣＡＲ－ｉＴにおけるＣＡＲ機能性のｈｎＣＤ１６相補性を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイにより、抗ＥＧＦＲ（上の列）又は抗ＰＤＬ１抗体（下の列）を用いて及び用いずに、低Ｅ：Ｔ比（１：１（上の列）；１：２（下の列））においてＨＥＲ２低（ＰＣＡ）及びＨＥＲ２低（ＢＲＣＡ）腫瘍標的並びにＨＥＲ２－ＣＡＲ ｉＴを用いて評価した。最適化ＣＡＲ－ｉＴは、ＣＡＲ標的化及びｈｎＣＤ１６媒介二次ＴＡＡ依存性細胞溶解と同時活性化された場合に、細胞溶解有効性の増強を実証した。ＯＶＣＡ腫瘍標的（ＨＥＲ２高）をＥ：Ｔ比１：１で使用する連続再刺激Ｉｎｃｕｃｙｔｅアッセイにおいて、ＣＡＲ－ｉＴ及び最適化ＣＡＲ－ｉＴの細胞溶解有効性を、抗ＨＥＲ２抗体の存在下及び不在下で評価した。再刺激ラウンド毎に、エフェクター：標的比を、新鮮な腫瘍標的を用いてリセットした。図３５に示すように、ＣＡＲ媒介性抗腫瘍有効性は、固形腫瘍に対して最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞において各ラウンドでｈｎＣＤ１６活性化及び治療抗体によって増強される。ラウンド４まで、最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞のみが細胞溶解有効性を維持し、これは抗ＨＥＲ２抗体の存在により更に増強された。
最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞におけるＴＧＦβ－ＳＲＲによるＴＧＦβシグナル伝達リダイレクションを、ＴＧＦβの存在下又は不在下での反復ＨＥＲ２高腫瘍標的チャレンジを用いて評価した。ＣＡＲ－ｉＴ（上段）及び最適化ＣＡＲ－ｉＴ（下段）細胞の細胞溶解有効性を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）アッセイにより、複数ラウンドの腫瘍チャレンジのために、Ｅ：Ｔ比２．５：１においてＯＶＣＡ腫瘍標的細胞と共培養することによって分析した。図３６に示されるように、最適化ＣＡＲ－ｉＴは、ＣＡＲ／ＩＬ７ＲＦのＴＲＡＣ操作のみを有するＣＡＲ－ｉＴと比較して、持続的な細胞溶解有効性を有するエフェクター機能のＴＧＦβ媒介性抑制に対する抵抗性を示す。
更に、組換えヒトＣＸＣＬ８の連続希釈を用いたトランスウェルアッセイにおいて、最適化ＣＡＲ－ｉＴのＣＸＣＲ２機能性をインビトロで評価した。図３７に示されるように、最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞は、アッセイの全期間にわたって用量依存的にＣＸＣＬ８への機能的かつ特異的な遊走を示した。
最後に、最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞の抗腫瘍有効性を、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて又は用いずに、侵襲性卵巣異種移植モデルにおいてインビボで評価した。確立された卵巣異種移植片を有するＮＳＧマウスを、示されるように、腫瘍移植後８日目に単回用量（８ｍｇ／ｋｇ）のｍＡｂで、並びに／又は８、１１及び１４日目に３回用量（各１ｅ７）の最適化ＣＡＲ－ｉＴ細胞で処置した（図３８Ａ）。腫瘍体積を記録し、各個々のレシピエントについて示した。腫瘍成長阻害を、腫瘍接種後３９日目に全ての群について計算した（図３８Ｂ）。示されるように、最適化ＣＡＲ－ｉＴは、ｍＡｂ処置なしのＣＡＲ－ｉＴ又はｍＡｂのみの処置と比較して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの存在下で腫瘍体積の頑強な減少及びほぼ１００％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を実証した（図３８Ａ及び３８Ｂ）。データは、ＨＥＲ２－ＣＡＲを含む最適化されたエフェクター細胞がＨｅｒｃｅｐｔｉｎと適合性であること、すなわち、おそらく別個のＨＥＲ２抗原を標的とすることによる立体障害を介した明らかな競合を有しないことを実証することに留意されたい。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、転移性ＨＥＲ２＋がん治療の現在の標準治療である。しかしながら、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは、抗原遮蔽、抗原下方制御、内在化の欠如、及び二量体化に対する非感受性を含むがこれらに限定されない、その関連する腫瘍耐性機構で知られている。本明細書に示されるＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲと抗ＨＥＲ２抗体との適合性は、本出願に開示される多くの他のものの中でも特に、ＥＧＦＲ、ＭＩＣＡ／Ｂなどの異なる種類の液体又は固形腫瘍抗原を標的とするＡＤＣＣ抗体を利用する二重標的化に加えて、ＨＥＲ２関連のがん及び疾患のための処置選択肢を更に提供する。
実施例１０－固形腫瘍標的化骨格のインテリジェント設計は更に、効率的なその後のＣＡＲ／導入遺伝子挿入及びスクリーニングのためのサイトカインシグナルに基づく選択を提供する
一例として、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞について、ＣＡＲ－ＩＬ１５ＲＦを使用して、ＣＡＲと共発現させた。ＩＬ１５ＲＦによって送達される自律的サイトカインシグナル伝達は、持続性をインビボで改善するだけでなく、細胞がサイトカイン支持とは独立してインビトロで増殖することを可能にすることも実証されている。サイトカイン支持とは独立して増殖する能力を、改変されていない細胞が不活性のままである間に改変された細胞が増殖することを可能にする選択のモデルとして更に利用した。
本出願の固形腫瘍標的化骨格は、ＣＤ３８遺伝子座にｈｎＣＤ１６－ＩＬ１５ＲＦをノックインすることによって、サイトカインシグナル伝達複合体をｈｎＣＤ１６と共発現させる代わりに、選択された遺伝子座においてＣＡＲをＩＬ１５ＲＦ（又はｉＴ細胞についてはＩＬ７ＲＦ）と共発現するように意識的に設計された。骨格におけるエレメントのこの配置は、サイトカインシグナルに基づく遺伝子編集の選択系を提供して、オフターゲット操作を排除しながら、導入遺伝子の選択における操作効率を改善する。
ＣＤ３８＿（ＴＧＦｂＲリダイレクタ、ＣＸＣＲ２及びＡＤＲのうちの２つ以上）－ｈｎＣＤ１６で操作されたｉＰＳＣのマスター細胞バンク（ＭＣＢ）が確立され、検証され、凍結保存される場合、操作されたＭＣＢ ｉＰＳＣは、例えば、バイシストロン性構築物内で付着したＩＬ１５ＲＦを有するＣＡＲを含む任意の標的化モダリティを後に挿入するための資源及び出発点として繰り返し使用することができる。ＣＡＲ挿入についてのスクリーニングにおいて、培養においてセレクターとして作用するＩＬ１５ＲＦを用いて、サイトカイン非依存性は、導入遺伝子陽性細胞の増殖をもたらす。培養中の改変された細胞のこのような増殖は、ソーティングの必要性を軽減し、これは、予め組み立てられた腫瘍標的化骨格を有する多数のＣＡＲ陽性細胞についてのスクリーニングスループット及び規模を増加させ、各ＣＡＲ及びＣＡＲ細胞産物は、１つ又はセットの腫瘍適応症に関連する抗原に対する異なる結合特異性を有する。
トランスジーン－２Ａ－ＩＬ１５ＲＦ、特に、増殖及び／又は生存を駆動することが知られている様々なアルファ鎖から設計された融合受容体に加えて、共通のＩＬ２ベータ及びガンマ鎖を介して作用するサイトカイン受容体サブユニットの融合受容体の観察及び適用に基づいて、サイトカインを使用しない生存差の拡大を介して改変された細胞の選択を可能にする他の受容体融合設計も考えられる。
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、及び製品が例示的な実施形態の代表であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換及び修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本開示が関係する当業者の技術水準を示している。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に記載された本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つ又は複数の要素、限定又は複数の限定がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用において、示され説明された特徴又はその一部のいずれかの同等物を除外する意図はなく、そうではなくて特許請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であると認識される。したがって、本開示は、好ましい実施形態及び任意選択の特質によって具体的に開示されているが、本明細書で開示される概念の修正及び変形は、当業者によって想到されてもよく、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内である。

Claims (89)

  1. 細胞又はその集団であって、
    （ｉ）前記細胞が、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又は（ｃ）前記ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、
    （ｉｉ）前記細胞が、固形腫瘍標的化骨格を含み、前記固形腫瘍標的化骨格が、
    （ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、
    及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上を含む、細胞又はその集団。
  2. 前記細胞が、前記固形腫瘍標的化骨格を含まない対応する細胞と比較して、固形腫瘍における改善された輸送、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）耐性、及び／又はアロ反応性耐性を有する、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  3. 前記固形腫瘍標的化骨格が、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウトと、
    （ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、
    （ｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドと、を更に含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  4. 前記細胞が、
    （ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、
    （ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、
    （ｉｖ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの最も少ない１つの破壊、
    （ｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、又は
    （ｖｉ）表４に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上を更に含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  5. 前記Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  6. 前記ＴＧＦβ－ＳＲＲが、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを更に含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  7. （ａ）前記サイトカイン受容体がＩＬ２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１１によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｂ）前記サイトカイン受容体がＩＬ１２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が、配列番号１２若しくは配列番号１３によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｃ）前記サイトカイン受容体がＩＬ１８Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１４によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｄ）前記サイトカイン受容体がＩＬ２１Ｒであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｅ）ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の細胞又はその集団。
  8. 前記サイトカイン受容体が、配列番号１６によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成するＩＬ２Ｒβの断片であり、配列番号１６に含まれる配列番号１７によって表されるアミノ酸配列が、可変である、請求項６に記載の細胞又はその集団。
  9. 前記ＡＤＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  10. 前記固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドが、ＣＤ３８をノックアウトするために内因性ＣＤ３８遺伝子座に挿入される、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  11. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードする前記ポリヌクレオチド、及び前記固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドが、トリシストロン性構築物内で共発現される、請求項３に記載の細胞又はその集団。
  12. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
    （ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
    （ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
    （ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
    （ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
    （ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
    （ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
    （ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
    （ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の細胞又はその集団。
  13. 前記細胞が、前記サイトカインシグナル伝達複合体を更に含み、前記サイトカインシグナル伝達複合体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、若しくはそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、
    （ｂ）（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つが、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、ＣＡＲと共発現され得る、少なくとも１つ、又は
    （ｃ）
    （ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つであって、（ｃ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか１つが、任意選択で、別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性発現カセット内で、ＣＡＲと共発現される、少なくとも１つ、を含み、
    任意選択で、
    （ｄ）一過的に発現される、請求項３に記載の細胞又はその集団。
  14. 前記細胞がＣＡＲを更に含み、前記ＣＡＲが、
    （ｉ）Ｔ細胞特異的若しくはＮＫ細胞特異的なもの、
    （ｉｉ）二重特異性抗原結合ＣＡＲ、
    （ｉｉｉ）切り替え可能なＣＡＲ、
    （ｉｖ）二量体化されたＣＡＲ、
    （ｖ）スプリットＣＡＲ、
    （ｖｉ）多重鎖ＣＡＲ、
    （ｖｉｉ）誘導性ＣＡＲ、
    （ｖｉｉｉ）別のＣＡＲと共発現されたもの、
    （ｉｘ）バイシストロン性構築物内で、前記サイトカインシグナル伝達複合体と共発現されたもの、
    （ｘ）任意選択で別個の構築物内で、若しくはバイシストロン性構築物内で、チェックポイント阻害剤と共発現されたもの、
    （ｘｉ）ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＳＬＮ、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＰＳＭＡ、及びＰＤＬ１を含む少なくとも１つの腫瘍関連抗原に特異的なもの、並びに／又は
    （ｘｉｉ）ＡＤＧＲＥ２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｖ６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ９９、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＳ、ＣＬＥＣ１２Ａ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＥＧＦＩＲ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＥＲＢＢ葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児のアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＩＣＡＭ－１、インテグリンＢ７、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ－軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＡ（ＣＡ１９．９）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＩＬＲＢ２、黒色腫抗原ファミリーＡ１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＭＩＣＡ／Ｂ、ムチン１（Ｍｕｃ－１）、ムチン１６（Ｍｕｃ－１６）、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ＮＫＣＳＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ｃ－Ｍｅｔ、がん－精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＲＡＭＥ、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＡＭＥ前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、ＴＩＭ－３、ＴＲＢＣＩ、ＴＲＢＣ２、血管内皮成長因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、及び病原体抗原を含む少なくとも１つの腫瘍関連抗原に特異的なもの、であり、任意選択で、
    前記（ｉ）～（ｘｉｉ）のうちのいずれか１つのＣＡＲが、ＴＣＲ遺伝子座に挿入されている、及び／又は前記ＴＣＲの内因性プロモータによって駆動されている、かつ／あるいは前記ＴＣＲが、前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項４に記載の細胞又はその集団。
  15. 前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域であり、任意選択で、前記ＣＡＲが、ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結されている、請求項１４に記載の細胞又はその集団。
  16. 前記ＣＡＲが、
    （ａ）腫瘍関連抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む外部ドメインと、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
    前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、前記腫瘍関連抗原への前記ＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、請求項１４に記載の細胞又はその集団。
  17. 前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、
    （ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ２Ｒβ／ＩＬ１５Ｒβ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内因性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、
    （ｂ）それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は
    （ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの前記細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、請求項１６に記載の細胞又はその集団。
  18. 前記内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、前記内部ドメインドメインが、以下の形態：ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ１ＸＸ、４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、４１ＢＢ－ＣＤ３ζ１ＸＸ、２Ｂ４－ＣＤ３ζ、及び２Ｂ４－ＣＤ３ζ１ＸＸのうちのいずれか１つの融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む、請求項１６に記載の細胞又はその集団。
  19. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、又はＴ細胞受容体ポリペプチドの膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の細胞又はその集団。
  20. 前記膜貫通ドメインが、それぞれ配列番号３２～５３によって表される２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、請求項１６に記載の細胞又はその集団。
  21. 前記膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である、請求項１６に記載の細胞又はその集団。
  22. 前記腫瘍関連抗原がＨＥＲ２を含み、前記ＣＡＲが、
    （ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、前記抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに、任意選択で、
    （ｉｉ）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、を含む、外部ドメインと、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
    前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原への前記ＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、請求項１６に記載の細胞又はその集団。
  23. 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
    （ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
    （ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、前記リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、前記リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
    （ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一のアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
    （ｅ）ヒト化されている、請求項２２に記載の細胞又はその集団。
  24. 前記外部ドメインが、
    （ａ）シグナルペプチド、及び／又は、
    （ｂ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の細胞又はその集団。
  25. 前記スペーサー／ヒンジが、
    （ａ）ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、ＣＨ３スペーサー、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサー、若しくはそれらの任意の組み合わせ、
    （ｂ）約１０個～約８０個のアミノ酸の短いスペーサー、８０個超～約１８０個のアミノ酸の中程度のスペーサー、若しくは１８０個超のアミノ酸の長いスペーサー、及び／又は
    （ｃ）配列番号９６～１００のうちのいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の細胞又はその集団。
  26. 前記スペーサー／ヒンジが、中程度のスペーサーを含み、前記スペーサーが、配列番号９９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の細胞又はその集団。
  27. 前記ＣＡＲが、配列番号１１７と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の細胞又はその集団。
  28. 前記がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である、請求項２２に記載の細胞又はその集団。
  29. （ｉ）前記ｉＰＳＣが、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、又はｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、又は派生Ｂ系統細胞を含むか、あるいは、（ｉｉｉ）前記派生細胞が、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項１に記載の細胞又はその集団。
  30. 前記派生細胞が、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）増加された細胞傷害性、
    （ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
    （ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
    （ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、
    （ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
    （ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
    （ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
    （ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
    （ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    のうちの１つ以上を含む治療特性を有する、請求項２９に記載の細胞又はその集団。
  31. 前記細胞が、ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞であり、
    （ｉ）前記ＮＫ系統細胞又は前記Ｔ系統細胞が、腫瘍部位における改善された浸潤及び／又は保持を有するか、
    （ｉｉ）前記ＮＫ系統細胞が、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、かつ／又は遊走させることができるか、又は
    （ｉｉｉ）前記ＮＫ系統細胞又は前記Ｔ系統細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる、請求項２９に記載の細胞又はその集団。
  32. 細胞又はその集団であって、
    （ｉ）前記細胞が、（ａ）免疫細胞、（ｂ）人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、又は（ｃ）前記ｉＰＳＣを分化させることから得られた派生エフェクター細胞であり、
    （ｉｉ）前記細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、
    （ａ）ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）抗原を認識する抗原結合ドメインを含む外部ドメインであって、前記抗原結合ドメインが、
    （１）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに
    （２）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン、を含む、外部ドメインと、
    （ｂ）膜貫通ドメインと、
    （ｃ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインと、を含み、
    前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原への前記ＣＡＲの結合に特異的に応答し、それによって、がん抗原特異的応答を生成する、細胞又はその集団。
  33. 前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
    （ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
    （ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、前記リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、前記リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
    （ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一のアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
    （ｅ）ヒト化されている、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  34. 前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが、
    （ａ）２Ｂ４（ナチュラルキラー細胞受容体２Ｂ４）、４－１ＢＢ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９）、ＣＤ１６（ＩｇＧ Ｆｃ領域受容体ＩＩＩ－Ａ）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２）、ＣＤ２８（Ｔ細胞特異的表面糖タンパク質ＣＤ２８）、ＣＤ２８Ｈ（膜貫通及び免疫グロブリンドメイン含有タンパク質２）、ＣＤ３ζ（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖）、ＤＡＰ１０（造血細胞シグナル伝達物質）、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６抗原）、ＦｃＥＲＩγ（高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ）、ＩＬ２１Ｒ（インターロイキン－２１受容体）、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－１５Ｒβ（インターロイキン－２受容体サブユニットベータ）、ＩＬ－２Ｒγ（サイトカイン受容体共通サブユニットガンマ）、ＩＬ－７Ｒ（インターロイキン－７受容体サブユニットアルファ）、ＫＩＲ２ＤＳ２（キラー細胞免疫グロブリン様受容体２ＤＳ２）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫＧ２－Ｄ ＩＩ型内在性膜タンパク質）、ＮＫｐ３０（天然細胞傷害トリガー受容体３）、ＮＫｐ４４（天然細胞傷害トリガー受容体２）、ＮＫｐ４６（天然細胞傷害トリガー受容体１）、ＣＳ１（ＳＬＡＭファミリーメンバー７）、及びＣＤ８（Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖）のうちのいずれか１つ、
    （ｂ）それぞれ配列番号５４～７６によって表される、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２Ｒβ（ＩＬ１５Ｒβ）、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８の細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、並びに／又は
    （ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３ζ１ＸＸ、ＤＮＡＭ１、ＣＳ１、若しくはそれらの組み合わせの前記細胞質ドメイン若しくはその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  35. 前記内部ドメインが、２つの異なるシグナル伝達ドメインを含み、前記内部ドメインドメインが、以下の形態：２Ｂ４－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、２Ｂ４－ＤＮＡＭ１、２Ｂ４－ＦｃＥＲＩγ、２Ｂ４－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＮＡＭ１、ＣＤ１６－ＤＡＰ１０、ＣＤ１６－ＤＡＰ１２、ＣＤ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＮＡＭ１、ＣＤ２８－ＦｃＥＲＩγ、ＣＤ２８－ＤＡＰ１０、ＣＤ２８－ＤＡＰ１２、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＣＤ２８Ｈ－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１０－ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＤＡＰ１２－ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＣＤ３ζ／１ＸＸ、ＫＩＲ２ＤＳ２－ＤＡＰ１０、ＫＩＲ２ＤＳ２－２Ｂ４、若しくはＮＫｐ４６－２Ｂ４のうちのいずれか１つの融合細胞質ドメイン又はその一部分を含む、請求項３４に記載の細胞又はその集団。
  36. 前記膜貫通ドメインが、
    （ａ）ＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＤＮＡＭ１、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＥＲＩγ、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、若しくはＴ細胞受容体ポリペプチド、
    （ｂ）２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１、ＦｃＥＲＩγ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＳ１、若しくはＣＤ８、又は
    （ｃ）２Ｂ４、ＣＤ２８、ＣＤ２８Ｈ、ＤＡＰ１０、ＤＮＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＮＫＧ２Ｄ、の膜貫通領域又はその一部分に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  37. 前記膜貫通ドメイン及びその直接連結されたシグナル伝達ドメインが、同じタンパク質由来又は異なるタンパク質由来である、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  38. 前記外部ドメインが、
    （ａ）シグナルペプチド、及び／又は、
    （ｂ）スペーサー／ヒンジ、のうちの１つ以上を含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  39. 前記スペーサー／ヒンジが、
    （ａ）ＩｇＧ４スペーサー、ＣＤ２８スペーサー、ＣＤ８スペーサー、ＣＨ３スペーサー、ＣＨ２／ＣＨ３スペーサー、若しくはそれらの任意の組み合わせ、
    （ｂ）約１０個～約８０個のアミノ酸の短いスペーサー、８０個超～約１８０個のアミノ酸の中程度のスペーサー、若しくは１８０個超のアミノ酸の長いスペーサー、及び／又は
    （ｃ）配列番号９６～１００のうちのいずれかと少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の細胞又はその集団。
  40. 前記スペーサー／ヒンジが、中程度のスペーサーを含み、前記スペーサーが、配列番号９９と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の細胞又はその集団。
  41. 前記ＣＡＲが、配列番号１１７と少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  42. （ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、
    及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの少なくとも１つを含む固形腫瘍標的化骨格を更に含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  43. 前記固形腫瘍標的化骨格が、
    （ｉ）ＣＤ３８ノックアウト、
    （ｉｉ）外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、
    （ｉｉｉ）細胞表面発現外因性サイトカイン及び／又はその受容体の部分的な又は完全なペプチドを含むサイトカインシグナル伝達複合体をコードするポリヌクレオチドと、を更に含む、請求項４２に記載の細胞又はその集団、
  44. 前記細胞が、
    （ｉ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／若しくはＨＬＡ－ＩＩ欠損、
    （ｉｉ）ＨＬＡ－Ｇ若しくは非切断性ＨＬＡ－Ｇの導入、
    （ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの最も少ない１つの破壊、
    （ｉｖ）ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体若しくはその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、又は
    （ｖ）表４に列挙された遺伝子型のうちの少なくとも１つ、のうちの１つ以上を更に含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  45. 前記Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含む、請求項４２に記載の細胞又はその集団。
  46. 前記ＴＧＦβ－ＳＲＲが、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１８Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、又はそれらの任意の組み合わせを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを更に含む、請求項４２に記載の細胞又はその集団。
  47. （ａ）前記サイトカイン受容体がＩＬ２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１１によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｂ）前記サイトカイン受容体がＩＬ１２Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１２Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が、配列番号１２若しくは配列番号１３によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｃ）前記サイトカイン受容体がＩＬ１８Ｒβであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ１８Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１４によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｄ）前記サイトカイン受容体がＩＬ２１Ｒであり、それによって、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２１Ｒリダイレクタ受容体を形成し、ＩＬ２１Ｒβの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が配列番号１５によって表されるアミノ酸配列を含むか、又は
    （ｅ）ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の細胞又はその集団。
  48. 前記サイトカイン受容体が、配列番号１６によって表される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を形成するＩＬ２Ｒβの断片であり、配列番号１６に含まれる配列番号１７によって表されるアミノ酸配列が、可変である、請求項４６に記載の細胞又はその集団。
  49. 前記ＡＤＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である、請求項４２に記載の細胞又はその集団。
  50. 前記固形腫瘍標的化骨格の１つ以上のポリヌクレオチドが、ＣＤ３８をノックアウトするために内因性ＣＤ３８遺伝子座に挿入される、請求項４２に記載の細胞又はその集団。
  51. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードする前記ポリヌクレオチド、及び前記固形腫瘍標的化骨格の２つ以上のポリヌクレオチドが、トリシストロン性構築物内で共発現される、請求項４３に記載の細胞又はその集団。
  52. 前記外因性ＣＤ１６又はそのバリアントが、
    （ａ）高親和性の非切断性ＣＤ１６（ｈｎＣＤ１６）、
    （ｂ）ＣＤ１６の外部ドメインにおけるＦ１７６Ｖ及びＳ１９７Ｐ、
    （ｃ）ＣＤ６４に由来する完全な又は部分的な外部ドメイン、
    （ｄ）非天然（又は非ＣＤ１６）の膜貫通ドメイン、
    （ｅ）非天然（又は非ＣＤ１６）の細胞内ドメイン、
    （ｆ）非天然（又は非ＣＤ１６）のシグナル伝達ドメイン、
    （ｇ）非天然の刺激ドメイン、並びに
    （ｈ）ＣＤ１６に由来せず、かつ同じ又は異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、シグナル伝達ドメイン、及び刺激ドメイン、のうちの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の方法。
  53. 前記細胞が、前記サイトカインシグナル伝達複合体を更に含み、前記サイトカインシグナル伝達複合体が、
    （ａ）ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１、若しくはそれらのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は
    （ｂ）
    （ｉ）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （ｉｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （ｖ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （ｖｉ）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが天然であるか、若しくは改変されている、融合タンパク質、並びに
    （ｖｉｉ）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
    又は
    （ｃ）
    （ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉ）ＩＬ７と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）ＩＬ７Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つを含み、
    任意選択で、
    （ｄ）一過的に発現される、請求項４３に記載の方法。
  54. （ｉ）前記ＣＡＲが、バイシストロン性構築物内でサイトカインシグナル伝達複合体と共発現される、かつ／あるいは
    （ｉｉ）前記ＣＡＲが、ＴＣＲ遺伝子座に挿入されており、任意選択で、前記ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結されている、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  55. 前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ及び／又はＴＣＲベータの定常領域である、かつ／あるいは
    （ｉｉ）前記ＴＣＲが、前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項５４に記載の細胞又はその集団。
  56. 前記がん細胞が、乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜がん細胞、肺がん細胞、食道がん細胞、唾液腺がん細胞、膀胱がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、又は頭頸部がん細胞である、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  57. （ｉ）前記ｉＰＳＣが、クローンｉＰＳＣ、単一細胞解離ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ細胞株細胞、又はｉＰＳＣマスター細胞バンク（ＭＣＢ）細胞であるか、あるいは、（ｉｉ）前記派生細胞が、派生ＣＤ３４＋細胞、派生造血幹前駆細胞、派生造血多能性前駆細胞、派生Ｔ細胞前駆体、派生ＮＫ細胞前駆体、派生Ｔ系統細胞、派生ＮＫＴ系統細胞、派生ＮＫ系統細胞、又は派生Ｂ系統細胞を含むか、あるいは、（ｉｉｉ）前記派生細胞が、対応する初代Ｔ、ＮＫ、ＮＫＴ、及び／又はＢ細胞には存在しない１つ以上の機能的特質を有する派生エフェクター細胞を含む、請求項３２に記載の細胞又はその集団。
  58. 前記細胞が、同じ遺伝子編集を備えていない末梢血、臍帯血、又は任意の他のドナー組織から得られたその対応する初代細胞と比較して、
    （ｉ）増加された細胞傷害性、
    （ｉｉ）改善された持続性及び／又は生存率、
    （ｉｉｉ）腫瘍部位にバイスタンダー免疫細胞を遊走させる、及び／又は活性化させる、若しくは動員する増強された能力、
    （ｉｖ）改善された腫瘍浸潤、
    （ｖ）腫瘍免疫抑制を低下させる増強された能力、
    （ｖｉ）腫瘍抗原エスケープを救済する改善された能力、
    （ｖｉｉ）制御されたアポトーシス、
    （ｖｉｉｉ）増強又は獲得されたＡＤＣＣ、並びに
    （ｉｘ）フラトリサイドを回避する能力、
    のうちの１つ以上を含む治療特性を有する、請求項４２に記載の細胞又はその集団。
  59. 前記細胞が、ＮＫ系統細胞又はＴ系統細胞であり、
    （ｉ）前記ＮＫ系統細胞又は前記Ｔ系統細胞が、腫瘍部位における改善された浸潤及び／又は保持を有するか、
    （ｉｉ）前記ＮＫ系統細胞が、Ｔ細胞を腫瘍部位に動員し、かつ／又は遊走させることができるか、又は
    （ｉｉ）前記ＮＫ系統細胞又は前記Ｔ系統細胞が、１つ以上のチェックポイント阻害剤の存在下で腫瘍免疫抑制を低減することができる、請求項５８に記載の細胞又はその集団。
  60. 請求項１～５９のいずれか一項に記載の細胞又はその集団を含む、組成物。
  61. １つ以上の治療剤を更に含む、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記１つ以上の治療剤が、ペプチド、サイトカイン、チェックポイント阻害剤、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分若しくはその補充因子、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法剤若しくは放射性部分、又は免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む、請求項６１に記載の組成物。
  63. 前記チェックポイント阻害剤が、
    （ａ）ＰＤ－１、ＰＤＬ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、Ａ２ＡＲ、ＢＡＴＥ、ＢＴＬＡ、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＣＤ７３、ＣＤ９４、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＳＦ－１Ｒ、Ｆｏｘｐ１、ＧＡＲＰ、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ、ＥＤＯ、ＴＤＯ、ＬＡＩＲ－１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ－２、Ｒａｒａ（レチノイン酸受容体アルファ）、ＴＬＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＮＫＧ２Ａ／ＨＬＡ－Ｅ、若しくは抑制性ＫＩＲを含むチェックポイント分子に対する１つ以上のアンタゴニスト、
    （ｂ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ、モナリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びそれらの誘導体若しくは機能的同等物のうちの１つ以上、又は
    （ｃ）アテゾリズマブ、ニボルマブ、及びペムブロリズマブのうちの少なくとも１つ、を含む、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記抗体が、
    （ａ）抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＧＤ２抗体、抗ＰＤＬ１抗体、若しくは抗ＣＤ３８抗体、又は
    （ｂ）リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ジヌツキシマブ、アベルマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、Ｍ－Ａ２５１、２Ａ３、ＢＣ６９、２４２０４、２２７２２、２４２１２、ＭＡＢ２３５９１、ＦＮ５０、２９８６１４、ＡＦ２３５９、ＣＹ１Ｇ４、ＤＦ１５１３、ビバツズマブ、ＲＧ７３５６、Ｇ４４－２６、７Ｇ３、ＣＳＬ３６２、エロツズマブ、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、並びにそれらのヒト化若しくはＦｃ修飾されたバリアント若しくは断片及びそれらの機能的同等物及びバイオシミラーのうちの１つ以上、を含む、請求項６２に記載の組成物。
  65. 前記エンゲージャが、
    （ｉ）二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）、
    （ｉｉ）二重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＢｉＫＥ）、又は
    （ｉｉｉ）三重特異性キラー細胞エンゲージャ（ＴｒｉＫＥ）を含むか、又は
    前記エンゲージャは、
    （ａ）ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ８９、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ若しくはそれらの任意の機能的バリアントの細胞外部分を認識する第１の結合ドメイン若しくはバイスタンダー免疫エフェクター細胞と、
    （ｂ）Ｂ７Ｈ３、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９ｂ、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＳ－１、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＦＬＴ－３、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ３、ＧＤ２、ｇｐＡ３３、ＨＥＲ２、ＨＭ１．２４、ＬＧＲ５、ＭＳＬＮ、ＭＣＳＰ、ＭＩＣＡ／Ｂ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＰＤＬ１、ＰＳＭＡ、ＰＡＭＡ、Ｐ－カドヘリン、ＲＯＰ１、若しくはＶＥＧＦ－Ｒ２のうちのいずれか１つを含む抗原に特異的な第２の結合ドメインと、を含む、請求項６２に記載の組成物。
  66. 請求項６０～６５のいずれか一項に記載の組成物を養子細胞療法を必要とする対象に導入することによる前記組成物の治療的使用であって、前記対象が、自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、がん、又はウイルス感染を有する、治療的使用。
  67. 請求項１～５９のいずれか一項に記載のｉＰＳＣを含む、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）。
  68. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の派生細胞を製造する方法であって、前記派生細胞が、免疫エフェクター細胞であり、前記方法が、
    （ｉ）遺伝子操作されたｉＰＳＣを取得することであって、前記ｉＰＳＣが、
    （ａ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）形質転換成長因子ベータ受容体（ＴＧＦβＲ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分的な又は完全なペプチドを含むＴＧＦβシグナル伝達リダイレクタ受容体（ＴＧＦβ－ＳＲＲ）をコードするポリヌクレオチド、
    及び（ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上を含む固形腫瘍標的化骨格を含む、取得することと、
    （ｉｉ）前記遺伝子操作されたｉＰＳＣを派生ＣＤ３４＋細胞に分化させることと、
    （ｉｉｉ）前記派生ＣＤ３４＋細胞を免疫エフェクター細胞に分化させることであって、前記免疫エフェクター細胞が、前記固形腫瘍標的化骨格を保持する、分化させることと、を含む、方法。
  69. 前記固形腫瘍標的化骨格を含む前記遺伝子操作されたｉＰＳＣを取得することが、内因性（endogensous）ＣＤ３８遺伝子座における共発現のために２つ以上のポリヌクレオチドを組み込むことと、ＣＤ３８をノックアウトすることと、を含み、共発現のための前記２つ以上のポリヌクレオチドが、シストロン性構築物内にあり、前記ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体、
    （ｉｉ）ＴＧＦβ－ＳＲＲ、及び
    （ｉｉｉ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）、のうちの少なくとも２つをコードする、請求項６８に記載の方法。
  70. （ｉ）前記シストロン性構築物が、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを更に含むか、
    （ｉｉ）前記Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体が、ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ３を含むか、
    （ｉｉｉ）前記ＴＧＦβ－ＳＲＲが、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１２Ｒβ、ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβ、又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体を含むか、あるいは
    （ｉｖ）前記ＡＤＲが、４－１ＢＢ又はＣＤ３８に特異的である、請求項６９に記載の方法。
  71. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをＴＣＲ遺伝子座に組み込むことによって、固形腫瘍標的化骨格を含む前記ｉＰＳＣを遺伝子操作することを更に含み、任意選択で、（ｉ）前記ＣＡＲが、前記ＴＣＲの内因性プロモータに作動可能に連結され、かつ／あるいは（ｉｉ）前記ＴＣＲが、前記ＣＡＲ挿入によってノックアウトされている、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記ＣＡＲが、バイシストロン性構築物内でサイトカインシグナル伝達複合体と共発現されるか、あるいは、前記ＴＣＲ遺伝子座が、ＴＣＲアルファ又はＴＣＲベータの定常領域である、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記サイトカインシグナル伝達複合体が、
    （ｉ）ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質、
    （ｉｉ）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、及び
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、のうちの少なくとも１つを含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記ＣＡＲが、
    （ｉ）腫瘍関連抗原に特異的であるか、
    （ｉｉ）固形腫瘍関連抗原に特異的であるか、
    （ｉｉｉ）汎腫瘍抗原に特異的であるか、又は
    （ｉｖ）Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ７９ｂ、ＥＧＰ２／ＥｐＣＡＭ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、及びＭＲ１のうちの１つに特異的である、請求項７１に記載の方法。
  75. がん細胞上に発現される前記ＨＥＲ２抗原に特異的な前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、任意選択で、
    （ｉｉ）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含む抗原結合ドメインを含む、請求項７１に記載の方法。
  76. 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号１０９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む、
    （ｂ）配列番号１１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む、
    （ｃ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含み、前記リンカーは、長さ及び配列が異なり、任意選択で、前記リンカーが、配列番号１１１～１１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、
    （ｄ）配列番号１１５若しくは配列番号１１６に対して少なくとも約９９％、約９８％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、若しくは約８０％同一のアミノ酸配列によって表されるｓｃＦＶを含み、配列番号１１５及び１１６の各々は、長さ及び配列が異なるリンカーを含む、並びに／又は
    （ｅ）ヒト化されている、請求項７５に記載の方法。
  77. （ａ）ＨＬＡ－Ｉ欠損及び／又はＨＬＡ－ＩＩ欠損の導入、
    （ｂ）Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＩＳ、ＣＢＬ－Ｂ、ＳＯＣＳ２、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＴＩＧＩＴのうちの１つ以上の欠失又は破壊、並びに
    （ｃ）ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、抗原特異的ＴＣＲ、キメラ融合受容体（ＣＦＲ）、Ｆｃ受容体、抗体又はその機能的バリアント若しくは断片、チェックポイント阻害剤、エンゲージャ、及びアゴニストとカップリングするための表面トリガー受容体のうちの少なくとも１つの導入、のうちの１つ以上によって、腫瘍固形標的化骨格を含む前記ｉＰＳＣを遺伝子操作することを更に含む、請求項６９に記載の方法。
  78. 前記ゲノム操作することが、標的化編集を含む、請求項６８～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記標的化編集が、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ホーミングヌクレアーゼ、相同組換え、又はこれらの方法の他の任意の機能的バリエーションによって実行される、請求項７８に記載の方法。
  80. 養子細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象にエフェクター細胞を注入することを含み、前記エフェクター細胞が、請求項１～５９のいずれか一項に記載の派生細胞又はその集団を含む、方法。
  81. 前記エフェクター細胞が、がん細胞上に発現されるＨＥＲ２抗原に特異的なＣＡＲを含み、前記ＣＡＲが、
    （ｉ）配列番号１０３を含む重鎖相補性決定領域１（Ｈ－ＣＤＲ１）、配列番号１０４を含む重鎖相補性決定領域２（Ｈ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０５を含む重鎖相補性決定領域３（Ｈ－ＣＤＲ３）を含む重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、任意選択で、
    （ｉｉ）配列番号１０６を含む軽鎖相補性決定領域１（Ｌ－ＣＤＲ１）、配列番号１０７を含む軽鎖相補性決定領域２（Ｌ－ＣＤＲ２）、及び配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域３（Ｌ－ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、を含み、
    前記ＣＡＲが、ＴＲＡＣ遺伝子座にあり、前記ＣＡＲ発現が、内因性ＴＣＲプロモータによって駆動され、
    前記養子細胞療法を必要とする前記対象が、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、肺がん、食道がん、唾液腺がん、膀胱がん、胃がん、結腸直腸がん、又は頭頸部がんを有する、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記エフェクター細胞が、固形腫瘍標的化骨格を更に含み、前記エフェクター細胞が、
    （ｉ）ＣＤ３８遺伝子座に、
    （ａ）ＣＸＣＲ２をコードするポリヌクレオチド、
    （ｂ）ＴＧＦβＲ２－ＩＬ１８Ｒβリダイレクタ受容体又はＴＧＦβＲ２－ｔｒＩＬ１２Ｒβリダイレクタ受容体をコードするポリヌクレオチド、及び
    （ｃ）同種免疫防御受容体（ＡＤＲ）をコードするポリヌクレオチド、のうちの２つ以上と、
    （ｉｉ）ＣＤ３８遺伝子座に、外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、
    （ｉｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子座に、ＩＬ７とＩＬ７Ｒαとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
    （ｉｖ）ＣＤ３８ノックアウト及びＴＣＲノックアウトと、を含む、請求項８１に記載の方法。
  83. １つ以上の治療剤を前記対象に投与することを更に含み、前記１つ以上の治療剤が、
    （ｉ）サイトカイン、抗体、エンゲージャ、チェックポイント阻害剤、化学療法剤若しくは放射性部分、若しくは免疫調節薬（ＩＭｉＤ）、
    （ｉｉ）ダラツムマブ、イサツキシマブ、若しくはＭＯＲ２０２を含む抗ＣＤ３８抗体、
    （ｉｉｉ）ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ）若しくはＴｒｉＫＥ（三重特異性キラー細胞エンゲージャ）を含むエンゲージャ、
    （ｉｖ）アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、ＩＰＨ４１０２、ＩＰＨ４３、ＩＰＨ３３、リリムマブ（lirimumab）、モナリズマブ、ニボルマブ、若しくはペムブロリズマブを含むチェックポイント阻害剤、並びに／又は
    （ｖ）シクロホスファミド及びフルダラビン（Ｃｙ／Ｆｌｕ）を含む化学療法剤、を含む、請求項８０に記載の方法。
  84. 前記エフェクター細胞が、ＣＤ３８ノックアウト及びＴＣＲノックアウトと、任意選択でＡＤＲと、を含み、前記方法が、前記対象に抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み、前記方法が、Ｃｙ／Ｆｌｕを前記対象に投与することを含むリンパ球枯渇を必要としないか、最小限しか必要としない、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記エフェクター細胞が同種異系であり、前記対象にエフェクター細胞を注入することが、外来患者設定（out-patient setting）で行われる、請求項８０に記載の方法。
  86. 固形腫瘍を有する対象の治療における養子細胞療法を改善する方法であって、請求項１～３１のいずれか一項に記載の派生細胞の集団を投与することを含む、方法。
  87. 抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療を改善する方法であって、
    ＣａｓＭａｂ２５０－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＸＣＲ２をコードするポリヌクレオチド、ＴＧＦβ－ＳＲＲをコードするポリヌクレオチド、及び外因性ＣＤ１６又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むエフェクター細胞を含む組成物を、前記治療を必要とする対象に導入することと、
    前記対象に抗ＨＥＲ２ｍＡｂを導入することと、を含む、方法。
  88. 前記抗ＨＥＲ２ｍＡｂが、トラスツズマブである、請求項８７に記載の方法。
  89. 目的の導入遺伝子を含む操作されたＮＫ細胞を選択する方法であって、
    （ｉ）前記目的の導入遺伝子と、ＩＬ１５若しくはそのそれぞれの受容体のうちの少なくとも１つを含む細胞表面発現外因性サイトカイン若しくはその受容体の部分的な若しくは完全なペプチド、又は以下の（１）～（７）：
    （１）自己切断ペプチドを間に挟んだＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの共発現、
    （２）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαとの融合タンパク質、
    （３）ＩＬ１５Ｒαの細胞内ドメインが短縮されたＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質、
    （４）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒαの膜結合Ｓｕｓｈｉドメインとの融合タンパク質、
    （５）ＩＬ１５とＩＬ１５Ｒβとの融合タンパク質、
    （６）ＩＬ１５と共通受容体γＣとの融合タンパク質であって、前記共通受容体γＣが、天然であるか若しくは改変されている、融合タンパク質、及び
    （７）ＩＬ１５Ｒβのホモ二量体、のうちの少なくとも１つとを共発現する構築物を含む操作されたＮＫ細胞を取得することと、
    （ｉｉ）前記操作されたＮＫ細胞に外因性ＩＬ１５サイトカインを供給することなく、前記細胞を培養することと、
    （ｉｉｉ）前記外因性ＩＬ１５サイトカインを伴わずに増殖するＮＫ細胞を収集し、それによって、前記目的の導入遺伝子を含む操作されたＮＫ細胞を選択することと、を含む、方法。
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