TW202417618A

TW202417618A - 具有實體腫瘤靶向主鏈之細胞及其用途

Info

Publication number: TW202417618A
Application number: TW112116797A
Authority: TW
Inventors: Ｂ瓦拉莫河; 彤李; 馬丁霍斯金; 伊根普羅塔; ＣＷ常
Original assignee: 美商菲特治療公司
Priority date: 2022-10-20
Filing date: 2023-05-05
Publication date: 2024-05-01

Abstract

提供用於獲得功能增強之衍生性效應細胞之方法及組成物，該等衍生性效應細胞自經基因工程改造之iPSC之導向分化而獲得。亦提供具有遞送改善或增強之治療效果之穩定及功能性基因體編輯之衍生性細胞。進一步提供治療組成物及其用途，該等治療組成物僅包含功能增強之衍生性效應細胞，或者在組合療法中與抗體或檢查點抑制劑一起包含。

Description

具有實體腫瘤靶向主鏈之細胞及其用途

相關申請案之交互參照

本申請案主張2022年10月20日申請之美國臨時專利申請案第63/380,378號之優先權及2023年4月7日申請之國際專利申請案第PCT/US2023/065550號之優先權，其揭露内容特此以引用方式全文併入本文中。 以引用方式併入序列表

標題為184143-641601_SL.xml之序列表創建於2023年3月15日且大小為192,945字節，特此以引用方式全文併入本文中。

本揭露廣泛地關於現成免疫細胞產物之領域。更特定言之，本揭露係關於用於開發能夠在體內遞送治療相關特性之多功能效應細胞之策略。根據本揭露開發之細胞產品解決了患者來源之細胞療法之關鍵限制。

過繼細胞療法領域目前集中于使用患者及供體來源的細胞，此使得達成癌症免疫療法之一致製造及向可能從中受益之所有患者遞送療法特別困難。亦需要改善過繼轉移之淋巴球之效力及持久性，以促進良好的患者結果。淋巴球諸如T細胞及自然殺手(NK)細胞係在先天免疫及適應性免疫中發揮重要作用之強效的抗腫瘤效應物。然而，將此等免疫細胞用於過繼細胞療法仍然具有挑戰性，且具有未滿足的改善需求。因此，在過繼免疫療法中，仍存在利用T細胞及NK細胞或其他免疫效應細胞之全部潛能之重要機會。

需要在功能上改善之效應細胞，該等效應細胞解決了自反應速率、細胞耗竭、所輸注細胞之損失（存活及/或持久性）、藉由標靶損失或譜系轉換之腫瘤逃逸、腫瘤靶向精度、脫靶毒性、腫瘤外效應、至針對實體腫瘤之功效（即，腫瘤微環境及相關免疫抑制、募集、運輸、及滲透）之問題。

本發明實施例之目的係提供產生衍生性非多潛能細胞之方法及組成物，該等衍生性非多潛能細胞自單細胞衍生之iPSC（誘導性多潛能幹細胞）無性繁殖系分化，該iPSC系在其基因體中包含一或若干種基因修飾。在一些實施例中，該一或若干種基因修飾包括DNA插入、缺失、及取代中之一或多者，且此等修飾在分化、擴增、傳代、及/或移植後在隨後衍生之細胞中保留並保持功能。

本申請案之iPSC衍生之非多潛能細胞包括但不限於CD34 ⁺細胞、造血內皮細胞、HSC（造血幹細胞及前驅細胞）、造血多潛能前驅細胞、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、及B細胞。本申請案之iPSC衍生之非多潛能細胞藉由自包含相同基因修飾之iPSC之分化，在其基因體中包含一或若干種基因修飾。在一些實施例中，用於獲得經基因工程改造之衍生性細胞之經工程改造之無性繁殖iPSC分化策略受益於iPSC在導向分化中之發育潛能，該導向分化不會受iPSC中經工程改造形式之顯著不利影響，且經工程改造形式在衍生性細胞中按照預期起作用。此外，該策略克服工程改造原代淋巴球（諸如自周邊血液獲得之T細胞或NK細胞）中之現有障礙，因為此種細胞難以工程改造，此種細胞之工程改造通常缺乏可重複性及均一性，導致細胞表現出差的細胞持久性，且具有高細胞死亡及低細胞擴增。此外，此種策略避免異源效應細胞群體之產生，而異源效應細胞群體係使用異源原代細胞來源開始而獲得。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種細胞或其群體，其中：(i)該細胞係(a)免疫細胞；(b)誘導性多潛能細胞(induced pluripotent cell, iPSC)；或(c)獲自分化該iPSC之衍生性效應細胞；(ii)該細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，其包含以下中之二或更多者：(a)編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸；(b)編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及(c)編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸。在一些實施例中，ADR對4-1BB特異。在一些實施例中，與不具有該實體腫瘤靶向主鏈之對應細胞相比，該細胞在實體腫瘤中具有改善之運輸、腫瘤微環境(TME)抗性、及/或同種異體反應性抗性。在該細胞或其群體之各種實施例中，該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含：(i) CD38剔除；(ii)編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及(iii)編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞進一步包含以下中之一或多者：(i)嵌合抗原受體(CAR)；(ii) HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏；(iii)引入HLA-G或不可切割之HLA-G，或剔除CD58及CD54中之一或二者；(iv)破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之至少一者；(v)引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者；或(vi)表4中所列基因型中之至少一者。

在該細胞或其群體之一些實施例中，該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。在該細胞或其群體之一些實施例中，該TGFβ-SRR進一步包含細胞介素受體之胞內域(ICD)之部分或完整肽，該細胞介素受體包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合。在該細胞或其群體之一些實施例中，(a)該細胞介素受體係IL2Rβ，從而形成TGFβR2-IL2Rβ重導向物受體，且IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11 (NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV)所示之胺基酸序列；或(b)該細胞介素受體係IL12Rβ，從而形成TGFβR2-IL12Rβ重導向物受體，且IL12Rβ之胞內域(ICD)包含(i) SEQ ID NO: 12 (HYFQQKVFVLLAALRPQWCSREIPDPANSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLIDWPTPEDPEPLVISEVLHQVTPVFRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLYKVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQHISLSVFPSSSLHPLTFSCGDKLTLDQLKMRCDSLML)或(ii) SEQ ID NO: 13 (SDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ)所示之胺基酸序列；或(c)該細胞介素受體係IL18Rβ，從而形成TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體，且IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14 (YRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES)所示之胺基酸序列；或(d)該細胞介素受體係IL21R，從而形成TGFβR2-IL21R重導向物受體，且IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15 (SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS)所示之胺基酸序列；或(e)TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10 (TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ)所示之胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞介素受體係IL2Rβ之片段，形成TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，該重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16 (TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ)所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列，其中包含在SEQ ID NO: 16中之由SEQ ID NO: 17 (VTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVN)所示之胺基酸序列可以變化。

在該細胞或其群體之各種實施例中，該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸插入內源性CD38基因座以剔除CD38。在該細胞或其群體之一些實施例中，編碼該外源性CD16或其變體之該多核苷酸及該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸在三順反子構築體中共表現。在該細胞或其群體之一些實施例中，該外源性CD16或其變體包含以下中之至少一者：(a)高親和力不可切割之CD16 (hnCD16)；(b) CD16胞外域中之F176V及S197P；(c)源自CD64之完整或部分胞外域；(d)非天然（或非CD16）跨膜域；(e)非天然（或非CD16）胞內域；(f)非天然（或非CD16）信號傳導域；(g)非天然刺激域；及(h)並非源自CD16，而是源自相同或不同多肽之跨膜域、信號傳導域、及刺激域。

在該細胞或其群體之各種實施例中，該細胞進一步包含細胞介素信號傳導錯合物，該細胞介素信號傳導錯合物包含：(a)表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽，其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、或其各別受體中之至少一者；或(b)以下中之至少一者：(i) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現；(ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白；(iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短；(iv) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白；(v) IL15及IL15Rβ之融合蛋白；(vi) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及(vii) IL15Rβ之同二聚體；可選地其中(b) (i)至(vii)中之任一者可以在單獨構築體或雙順反子構築體中與CAR共表現；或(c)以下中之至少一者：(i) IL7及IL7Rα之融合蛋白；(ii) IL7及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及(iii) IL7Rβ之同二聚體，可選地其中(c) (i)至(iii)中之任一者可選地在單獨構築體中或在雙順反子表現匣(expression cassette)中與CAR共表現；且可選地，(d)暫時表現。

在該細胞或其群體之各種實施例中，該細胞進一步包含CAR，其中該CAR係：(i) T細胞特異性的或NK細胞特異性的；(ii)雙特異性抗原結合CAR；(iii)可切換CAR；(iv)二聚CAR；(v)分離CAR；(vi)多鏈CAR；(vii)可誘導性CAR；(viii)與另一CAR共表現；(ix)在雙順反子構築體中與該細胞介素信號傳導錯合物共表現；(x)可選地在單獨構築體或雙順反子構築體中與檢查點抑制劑共表現；(xi)對至少一種腫瘤相關抗原特異，其包含CD19、B7H3、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、CD79b、CD52、EGFR、EGP2/EpCAM、GD2、GPRC5D、HER2、KLK2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA、及PDL1；及/或(xii)對至少一種腫瘤相關抗原特異，其包含ADGRE2、碳酸酐酶IX (CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、上皮細胞黏著分子(EpCAM)、EGFRvIII、受體酪胺酸-蛋白激酶erb- B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合蛋白(FBP)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、葉酸受體-α、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂G3 (GD3)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、介白素-13受體次單元α-2 (IL13Rα2)、κ輕鏈、激酶插入域受體(KDR)、路易士A (CA19.9)、路易士Y (LeY)、L1細胞黏著分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1 (MAGE-A1)、MICA/B、黏蛋白1 (Muc-1)、黏蛋白16 (Muc-16)、間皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配體、c-Met、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特異性膜抗原(PSMA)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管內皮生長因子R2 (VEGF-R2)、Wilms腫瘤蛋白(WT-1)、及病原體抗原；且可選地，其中(i)至(xii)中任一者之該CAR被插入在TCR基因座處，且/或藉由該TCR之內源性啟動子而驅動，且/或該TCR藉由CAR插入而被剔除。在該細胞或其群體之一些實施例中，該TCR基因座係TCRα及/或TCRβ之恆定區，且可選地，其中該CAR可操作地連接至TCR之內源性啟動子。

在該細胞或其群體之一些實施例中，該CAR包含：(a)包含對腫瘤相關抗原特異之抗原結合域之胞外域；(b)跨膜域；及(c)包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與該腫瘤相關抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。在該細胞或其群體之一些實施例中，該至少一個信號傳導域包含：(a)以下中之任一者：2B4（自然殺手細胞受體2B4）、4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）、CD28（T細胞特異性表面醣蛋白CD28）、CD3ζ（T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈）、DAP10（造血細胞信號轉換器）、DAP12（TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白）、DNAM1（CD226抗原）、FcERIγ（高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ）、IL21R（介白素-21受體）、IL2Rβ/IL15Rβ（介白素-2受體次單元β）、IL2Rγ（細胞介素受體共同次單元γ）、IL7R（介白素-7受體次單元α）、KIR2DS2（殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2）、NKG2D（NKG2-D II型整合膜蛋白）、NKp30（天然細胞毒性觸發受體3）、NKp44（天然細胞毒性觸發受體2）、NKp46（天然細胞毒性觸發受體1）、CS1（SLAM家族成員7）、及CD8（T細胞表面醣蛋白CD8α鏈）；(b)與分別由SEQ ID NO: 54-76所示之2B4、41BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL2Rγ、IL7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列；及/或(c)與2B4、CD28、CD3ζ、DAP10、NKG2D、CD3ζ、CD3ζ1XX、DNAM1、CS1、或其組合之細胞質域或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該胞內域包含兩個不同的信號傳導域，且其中該胞內域包含以下形式中任一者之融合細胞質域或其部分：CD28-CD3ζ、CD28-CD3ζ1XX、41BB-CD3ζ、41BB-CD3ζ1XX、2B4-CD3ζ、及2B4-CD3ζ1XX。在該細胞或其群體之一些實施例中，該跨膜域包含與CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1、或T細胞受體多肽之跨膜區或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該跨膜域包含與分別由SEQ ID NO: 32-53所示之2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之跨膜區或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質或不同蛋白質。

在該細胞或其群體之各種實施例中，該腫瘤相關抗原包含HER2，且其中該CAR包含：(a)包含辨識HER2（人類表皮生長因子受體2）抗原之抗原結合域的胞外域，其中該抗原結合域包含：(i)重鏈可變(VH)域，其包含包含SEQ ID NO: 103 (NYGMS)之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104 (TINNNGGGTYYPDSVKG)之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105 (PGLLWDA)之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地(ii)輕鏈可變(VL)域，其包含包含SEQ ID NO: 106 (KSSQSLLDSDGRTYLN)之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107 (LVSKLDS)之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108 (WQGTHFPQT)之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)；(b)跨膜域；及(c)包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。在該細胞或其群體之一些實施例中，該CAR之該抗原結合域：(a)包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域；(b)包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域；(c)包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，並且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111-114具有至少80%序列同一性；(d)包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；且/或(e)經人源化。在該細胞或其群體之一些實施例中，該胞外域包含以下中之一或多者：(a)信號肽；及/或(b)間隔子/鉸鏈。在一些實施例中，該間隔子/鉸鏈包含：(a) IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、CH3間隔子、CH2/CH3間隔子、或其任何組合；(b)約10至約80個胺基酸之短間隔子；大於80至約180個胺基酸之中等間隔子；或大於180個胺基酸之長間隔子；及/或(c)與SEQ ID NO: 96-100中之任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，該間隔子/鉸鏈包含中等間隔子，其中該間隔子包含與SEQ ID NO: 99具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。

在該細胞或其群體之各種實施例中，該CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，其中該CAR之該至少一個信號傳導域對CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應，該癌細胞為乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、唾液腺癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、或頭頸癌細胞。

在該細胞或其群體之各種實施例中，(i)該iPSC係無性繁殖iPSC、單細胞解離iPSC、iPSC細胞系細胞、或iPSC主細胞庫(MCB)細胞；或(ii)該衍生性細胞包含衍生性CD34 ⁺細胞、衍生性造血幹細胞及前驅細胞、衍生性造血多潛能前驅細胞、衍生性T細胞前驅細胞、衍生性NK細胞前驅細胞、衍生性T譜系細胞、衍生NKT譜系細胞、衍生性NK譜系細胞、或衍生性B譜系細胞；或(iii)該衍生性細胞包含衍生性效應細胞，其具有在對應之原代T細胞、NK細胞、NKT細胞、及/或B細胞中不存在之一或多種功能特徵。在一些實施例中，與自周邊血液、臍帶血、或沒有相同基因編輯之任何其他供體組織獲得之對應原代細胞相比，該衍生性細胞具有包含以下中之一或多者的治療性質：(i)細胞毒性增加；(ii)持久性及/或存活率改善；(iii)遷移及/或活化或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力增強；(iv)腫瘤浸潤改善；(v)降低腫瘤免疫抑制之能力增強；(vi)挽救腫瘤抗原逃逸之能力改善；(vii)細胞凋亡得以控制；(viii)增強或獲得ADCC；及(ix)避免誤殺之能力。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞係NK譜系細胞或T譜系細胞，其中：(i)該NK譜系細胞或該T譜系細胞在腫瘤位點處具有改善之浸潤及/或滯留；(ii)該NK譜系細胞能夠募集及/或遷移T細胞至腫瘤位點；或(iii)該NK譜系細胞或該T譜系細胞能夠在一或多種檢查點抑制劑存在之情況下降低腫瘤免疫抑制。

在另一態樣中，本發明提供一種細胞或其群體，其中(i)該細胞係(a)免疫細胞；(b)誘導性多潛能細胞(induced pluripotent cell, iPSC)；或(c)獲自分化該iPSC之衍生性效應細胞；(ii)該細胞包含嵌合抗原受體(CAR)，其包含：(a)包含辨識HER2（人類表皮生長因子受體2）抗原之抗原結合域的胞外域，其中該抗原結合域包含：(1)重鏈可變(VH)域，其包含包含SEQ ID NO: 103 (NYGMS)之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104 (TINNNGGGTYYPDSVKG)之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105 (PGLLWDA)之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及(2)輕鏈可變(VL)域，其包含包含SEQ ID NO: 106 (KSSQSLLDSDGRTYLN)之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107 (LVSKLDS)之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108 (WQGTHFPQT)之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)；(b)跨膜域；及(c)包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。在該細胞或其群體之一些實施例中，該抗原結合域：(a)包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域；(b)包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域；(c)包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，並且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111-114具有至少80%序列同一性；(d)包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；且/或(e)經人源化。在該細胞或其群體之一些實施例中，該至少一個信號傳導域包含：(a)以下中之任一者：2B4（自然殺手細胞受體2B4）、4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）、CD16（IgG Fc區受體III-A）、CD2（T細胞表面抗原CD2）、CD28（T細胞特異性表面醣蛋白CD28）、CD28H（含跨膜及免疫球蛋白域之蛋白2）、CD3ζ（T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈）、DAP10（造血細胞信號轉換器）、DAP12（TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白）、DNAM1（CD226抗原）、FcERIγ（高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ）、IL21R（介白素-21受體）、IL2Rβ/IL15Rβ（介白素-2受體次單元β）、IL2Rγ（細胞介素受體共同次單元γ）、IL7R（介白素-7受體次單元α）、KIR2DS2（殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2）、NKG2D（NKG2-D II型整合膜蛋白）、NKp30（天然細胞毒性觸發受體3）、NKp44（天然細胞毒性觸發受體2）、NKp46（天然細胞毒性觸發受體1）、CS1（SLAM家族成員7）、及CD8（T細胞表面醣蛋白CD8α鏈）；(b)與分別由SEQ ID NO: 54-76所示之2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL2Rγ、IL7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列；及/或(c)與2B4、CD28、CD3ζ、DAP10、NKG2D、CD3ζ1xx、DNAM1、CS1或其組合之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%同一性的胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該胞內域包含兩個不同的信號傳導域，且其中該胞內域包含以下形式中任一者之融合細胞質域或其部分：2B4-CD3ζ/1XX、2B4-DNAM1、2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28-CD3ζ/1XX、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4、或NKp46-2B4。

在該細胞或其群體之一些實施例中，該跨膜域包含與以下各項之跨膜區或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列：(a)CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T細胞受體多肽；(b)2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8；或(c)2B4、CD28、CD28H、DAP10、DNAM1、KIR2DS2、及NKG2D。在該細胞或其群體之一些實施例中，該跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質或不同蛋白質。在該細胞或其群體之一些實施例中，該胞外域包含以下中之一或多者：(a)信號肽；及/或(b)間隔子/鉸鏈。在一些實施例中，該間隔子/鉸鏈包含：(a) IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、CH3間隔子、CH2/CH3間隔子、或其任何組合；(b)約10至約80個胺基酸之短間隔子；大於80至約180個胺基酸之中等間隔子；或大於180個胺基酸之長間隔子；及/或(c)與SEQ ID NO: 96-100中之任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一個實施例中，該間隔子/鉸鏈包含中等間隔子，其中該間隔子包含與SEQ ID NO: 99具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。

在該細胞或其群體之一些實施例中，該CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞進一步包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含以下中之至少一者：(a)編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸；(b)編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及(c)編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸；可選地，其中與不具有該實體腫瘤靶向主鏈之對應細胞相比，該細胞在實體腫瘤中具有改善之運輸、腫瘤微環境(TME)抗性、及/或同種異體反應性抗性。在一些實施例中，ADR對4-1BB特異。在該細胞或其群體之一些實施例中，該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含：(i) CD38剔除；(ii)編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及(iii)編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞進一步包含以下中之一或多者：(i) HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏；(ii)引入HLA-G或不可切割之HLA-G，或剔除CD58及CD54中之一或二者；(iii)破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之至少一者；(iv)引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者；或(v)表4中所列基因型中之至少一者。

在該細胞或其群體之一些實施例中，該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。在該細胞或其群體之一些實施例中，該TGFβ-SRR進一步包含細胞介素受體之胞內域(ICD)之部分或完整肽，該細胞介素受體包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合。在該細胞或其群體之一些實施例中，(a)該細胞介素受體係IL2Rβ，從而形成TGFβR2-IL2Rβ重導向物受體，且IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11 (NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV)所示之胺基酸序列；或(b)該細胞介素受體係IL12Rβ，從而形成TGFβR2-IL12Rβ重導向物受體，且IL12Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 12 (HYFQQKVFVLLAALRPQWCSREIPDPANSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLIDWPTPEDPEPLVISEVLHQVTPVFRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLYKVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQHISLSVFPSSSLHPLTFSCGDKLTLDQLKMRCDSLML)或SEQ ID NO: 13 (SDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ)所示之胺基酸序列；或(c)該細胞介素受體係IL18Rβ，從而形成TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體，且IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14 (YRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES)所示之胺基酸序列；或(d)該細胞介素受體係IL21R，從而形成TGFβR2-IL21R重導向物受體，且IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15 (SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS)所示之胺基酸序列；或(e)TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10 (TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ)所示之胺基酸序列。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞介素受體係IL2Rβ之片段，從而形成TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，該重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16 (TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ)所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列，其中包含在SEQ ID NO: 16中之由SEQ ID NO: 17 (VTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVN)所示之胺基酸序列可以變化。

在該細胞或其群體之一些實施例中，該實體腫瘤靶向主鏈之該一或多個多核苷酸插入內源性CD38基因座以剔除CD38。在一些實施例中，編碼該外源性CD16或其變體之該多核苷酸及該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸在三順反子構築體中共表現。在一些實施例中，該外源性CD16或其變體包含以下中之至少一者：(a)高親和力不可切割之CD16 (hnCD16)；(b) CD16胞外域中之F176V及S197P；(c)源自CD64之完整或部分胞外域；(d)非天然（或非CD16）跨膜域；(e)非天然（或非CD16）胞內域；(f)非天然（或非CD16）信號傳導域；(g)非天然刺激域；及(h)並非源自CD16，而是源自相同或不同多肽之跨膜域、信號傳導域、及刺激域。在該細胞或其群體之一些實施例中，該細胞進一步包含細胞介素信號傳導錯合物，該細胞介素信號傳導錯合物包含：(a)表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽，其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、或其各別受體中之至少一者；或(b)以下中之至少一者：(i) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現；(ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白；(iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短；(iv) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白；(v) IL15及IL15Rβ之融合蛋白；(vi) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及(vii) IL15Rβ之同二聚體；其中(b) (i)至(vii)中之任一者可以在單獨構築體或雙順反子(bi-cistronic)構築體中與CAR共表現；或(c)以下中之至少一者：(i) IL7及IL7Rα之融合蛋白；(ii) IL7及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及(iii) IL7Rβ之同二聚體，其中(c) (i)至(iii)中之任一者可選地在單獨構築體中或在雙順反子表現匣中與CAR共表現；且可選地，(d)暫時表現。在一些實施例中，(i)該CAR在雙順反子構築體中與細胞介素信號傳導錯合物共表現；及/或(ii)其中該CAR被插入TCR基因座處，並且可選地可操作地連接至該TCR之內源性啟動子。在一些實施例中，(i)該TCR基因座係TCRα及/或TCRβ之恆定區；及/或(ii)該TCR藉由CAR插入而被剔除。

在一些實施例中，其中該CAR之該至少一個信號傳導域對CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應，該癌細胞為乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、唾液腺癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、或頭頸癌細胞。

在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之細胞或其群體之組成物。在該組成物之各種實施例中，該組成物進一步包含一或多種治療劑。在該組成物之一些實施例中，該一或多種治療劑包含肽、細胞介素、檢查點抑制劑、有絲分裂促進劑、生長因子、小RNA、dsRNA（雙股RNA）、單核血球、餵養細胞、餵養細胞組分或其替代因子、包含一或多種關注之多核苷酸之載體、抗體、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)。在該組成物之一些實施例中，其中該治療劑係檢查點抑制劑，該檢查點抑制劑包含：(a)檢查點分子之一或多種拮抗劑，其包含PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A _2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara（視黃酸受體α）、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、或抑制性KIR；(b)阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、派姆單抗、及其衍生物或功能等效物中之一或多者；或(c)阿特珠單抗、納武單抗、及派姆單抗中之至少一者。在該組成物之一些實施例中，其中該治療劑係抗體，該抗體包含(a)抗CD20抗體、抗HER2抗體、抗CD52抗體、抗EGFR抗體、抗CD123抗體、抗GD2抗體、抗PDL1抗體、或抗CD38抗體；或(b)利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、阿侖單抗、西妥昔單抗、地妥昔單抗、阿維魯單抗、達利珠單抗、巴利昔單抗、M-A251、2A3、BC69、24204、22722、24212、MAB23591、FN50、298614、AF2359、CY1G4、DF1513、比伐珠單抗、RG7356、G44-26、7G3、CSL362、埃羅妥珠單抗、達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、MOR202、及其人源化或Fc修飾之變體或片段以及其功能等效物、及其生物相似藥中之一或多者。在該組成物之一些實施例中，其中該治療劑係接合物，該接合物包含：(i)雙特異性T細胞接合物(BiTE)；(ii)雙特異性殺手細胞接合物(BiKE)；或(iii)三特異性殺手細胞接合物(TriKE)；或該接合物包含：(a)辨識細胞或旁觀者免疫效應細胞之CD3、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、或其任何功能變體之胞外部分之第一結合域；及(b)對抗原特異之第二結合域，該抗原包含以下中之任一者：B7H3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD52、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、Muc1、Muc16、PDL1、PSMA、PAMA、P-鈣黏蛋白、ROR1、或VEGF-R2。

在另一態樣中，本發明提供本文所提供之組成物之治療用途，其藉由將該組成物引入至需要過繼細胞療法之對象來進行，其中該對象患有自體免疫疾病、血液惡性腫瘤、實體腫瘤、癌症、或病毒感染。在另一態樣中，本發明提供一種包含本文提供之無性繁殖iPSC之主細胞庫(MCB)。

在另一態樣中，本發明提供一種製造本文提供之衍生性細胞之方法，其中該衍生性細胞係免疫效應細胞，且該方法包含：(i)獲得經基因工程改造之iPSC，其中該iPSC包含實體腫瘤靶向主鏈，其包含以下中之二或更多者：(a)編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸；(b)編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及(c)編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸；(ii)將該經基因工程改造之iPSC分化為衍生性CD34 ⁺細胞；及(iii)將該衍生性CD34 ⁺細胞分化為免疫效應細胞，其中該免疫效應細胞保留該實體腫瘤靶向主鏈。在一些實施例中，ADR對4-1BB特異。在該製造方法之一些實施例中，獲得包含該實體腫瘤靶向主鏈之該經基因工程改造之iPSC包含：(a)整合二或更多個多核苷酸以用於在內源性CD38基因座處共表現並剔除CD38；其中用於共表現之該二或更多個多核苷酸在順反子構築體中；且其中該多核苷酸編碼以下中之至少兩者：(i) C-X-C模體趨化因子受體；(ii) TGFβ-SSR；及(iii)異體免疫防禦受體(ADR)。在該製造方法之一些實施例中，(i)該順反子構築體進一步包含編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；(ii)該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3；(iii)該TGFβ-SRR包含TGFβR2-IL2Rβ、TGFβR2-IL12Rβ、TGFβR2-IL18Rβ、或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體；或(iv)該ADR係對4-1BB或對CD38特異。

在該製造方法之各種實施例中，該方法進一步包含藉由在TCR基因座處整合編碼嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸來對包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC進行基因工程改造，可選地其中(i)該CAR可操作地連接至該TCR之內源性啟動子，及/或(ii)該TCR藉由CAR插入而被剔除。在一些實施例中，該CAR在雙順反子構築體中與細胞介素信號傳導錯合物共表現；或其中該TCR基因座係TCRα或TCRβ之恆定區。在一些實施例中，該細胞介素信號傳導錯合物包含以下中之至少一者：(i) IL7及IL7Rα之融合蛋白；(ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白；及(iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短。

在該製造方法之一些實施例中，該CAR係：(i)對腫瘤相關抗原特異；(ii)對實體腫瘤相關抗原特異；(iii)對泛腫瘤抗原特異；或(iv)對B7H3、BCMA、CD19、CD38、CD79b、EGP2/EpCAM、GPRC5D、HER2、KLK2、MICA/B、及MR1中之一者特異。在一些實施例中，對癌細胞上表現之HER2抗原特異之該CAR包含抗原結合域，該抗原結合域包含：(i)重鏈可變(VH)域，其包含包含SEQ ID NO: 103 (NYGMS)之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104 (TINNNGGGTYYPDSVKG)之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105 (PGLLWDA)之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地(ii)輕鏈可變(VL)域，其包含包含SEQ ID NO: 106 (KSSQSLLDSDGRTYLN)之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107 (LVSKLDS)之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108 (WQGTHFPQT)之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)。在該製造方法之一些實施例中，該抗原結合域：(a)包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域；(b)包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域；(c)包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，並且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111-114具有至少80%序列同一性；(d)包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；且/或(e)經人源化。

在該製造方法之一些實施例中，該方法進一步包含藉由以下中之一或多者對包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC進行基因工程改造：(a)引入HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏；(b)缺失或破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之一或多者；及(c)引入HLA-G、HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者。在一些實施例中，該基因工程改造包含靶向編輯。在一些實施例中，該靶向編輯藉由CRISPR、ZFN、TALEN、歸巢核酸酶、同源重組、或該等方法之任何其他功能變型來進行。

在另一態樣中，本發明提供一種治療需要過繼細胞療法之對象之方法，其中該方法包含向該對象輸注效應細胞，其中該等效應細胞包含如本文提供之衍生性細胞或其群體。在該治療方法之一些實施例中，該效應細胞包含對癌細胞上表現之HER2抗原特異之CAR，其中該CAR包含：(i)重鏈可變(VH)域，其包含包含SEQ ID NO: 103 (NYGMS)之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104 (TINNNGGGTYYPDSVKG)之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105 (PGLLWDA)之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地(ii)輕鏈可變(VL)域，其包含包含SEQ ID NO: 106 (KSSQSLLDSDGRTYLN)之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107 (LVSKLDS)之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108 (WQGTHFPQT)之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)；其中該CAR位於TRAC基因座處，並且CAR表現藉由內源性TCR啟動子來驅動；且其中需要過繼細胞治療之該對象患有乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、食道癌、唾液腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸直腸癌、或頭頸癌。

在該治療方法之一些實施例中，該效應細胞進一步包含實體腫瘤靶向主鏈，且其中該效應細胞包含：(i)在CD38基因座處，以下中之二或更多者：(a)編碼CXCR2之多核苷酸；(b)編碼TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體之多核苷酸；及(c)編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸；(ii)在CD38基因座處，編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；(iii)在TRAC基因座處，編碼IL7及IL7Rα之融合蛋白之多核苷酸；及(iv) CD38剔除及TCR剔除。在一些實施例中，ADR對4-1BB特異。在該治療方法之一些實施例中，該方法進一步包含向該對象投予一或多種治療劑，其中該一或多種治療劑包含：(i)細胞介素、抗體、接合物、檢查點抑制劑、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)；(ii)包含達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、或MOR202之抗CD38抗體；(iii)包含BiTE（雙特異性T細胞接合物）或TriKE（三特異性殺手細胞接合物）之接合物；(iv)包含阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、或派姆單抗之檢查點抑制劑；及/或(v)包含環磷醯胺及氟達拉濱之化學治療劑(Cy/Flu)。在該治療方法之一些實施例中，該效應細胞包含CD38剔除及TCR剔除，以及可選地對4-1BB特異之ADR，其中該方法包含向該對象投予抗CD38抗體，且其中該方法不需要或需要最少的淋巴球清除，其包含向該對象投予Cy/Flu。在該治療方法之一些實施例中，該等效應細胞係同種異體的，且其中向該對象輸注效應細胞係在門診環境中進行。

在另一態樣中，本發明提供一種在治療患有實體腫瘤之對象中改善過繼細胞療法之方法，其中該方法包含投予本文提供之衍生性細胞群體，且可選地，其中與不具有實體腫瘤靶向主鏈之對應細胞相比，該等衍生性細胞在實體腫瘤中具有改善之運輸、腫瘤微環境(TME)抗性、及/或同種異體反應性抗性。

在另一態樣中，本發明提供一種改善抗HER2單株抗體(mAb)治療之方法，其包含：向需要該治療之對象引入包含效應細胞之組成物，該等效應細胞包含編碼CasMab250-CAR之多核苷酸、編碼CXCR2之多核苷酸、編碼TGFβ-SRR之多核苷酸、及編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及向該對象引入抗HER2 mAb。在各種實施例中，該抗HER2 mAb係曲妥珠單抗(Herceptin(賀癌平) ^™)。

在一個態樣中，本發明提供一種選擇包含關注之轉殖基因之NK細胞的方法。在一些實施例中，該方法包含：(i)獲得經工程改造之NK細胞，該等細胞包含共表現該關注之轉殖基因及表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽之構築體，該細胞介素或其受體包含IL15或其各別受體中之至少一者；或(1)至(7)中之至少一者：(1) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現；(2) IL15及IL15Rα之融合蛋白；(3) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短；(4) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白；(5) IL15及IL15Rβ之融合蛋白；(6) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及(7) IL15Rβ之同二聚體；(ii)在不向該等細胞提供外源性IL15細胞介素之情況下培養該等經工程改造之NK細胞；及(iii)收集在沒有外源性IL15細胞介素之情況下擴增之NK細胞，從而選擇包含該關注之轉殖基因之經工程改造之NK細胞。

從結合隨附圖式之以下描述中，如本文所提供之組成物及方法之各種目標及優點將變得顯而易見，該等隨附圖式中藉助於說明及實例闡述本發明之某些實施例。

iPSC（誘導性多潛能幹細胞）之基因體修飾可包括多核苷酸插入、缺失、及取代中之一或多者。在經基因體工程改造之iPSC中之外源性基因表現經常遇到問題，諸如在原始經基因體工程改造之iPSC之長期無性繁殖系擴增後、在細胞分化後、及在衍生自經基因體工程改造之iPSC之細胞之去分化細胞類型中，基因緘默或基因表現減少。另一方面來說，原代免疫細胞諸如T細胞或NK細胞之直接工程改造具有挑戰性，並對用於過繼細胞療法之經工程改造之免疫細胞之製備及遞送造成障礙。在各種實施例中，本發明提供一種有效、可靠、及靶向之方法，用於將一或多種外源性基因，包括自殺基因及其他功能模式，穩定整合至iPSC衍生性細胞中，該外源性基因提供與植入、運輸、歸巢、遷移、細胞毒性、生存力、維持、擴增、壽命、自我更新、持久性、及/或存活相關之改善之治療性質，該等iPSC衍生性細胞包括但不限於HSC（造血幹細胞及前驅細胞）、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、T譜系細胞、NKT譜系細胞、及NK譜系細胞。定義

除非本文中另外定義，否則與本申請案結合使用之科學及技術用語應具有所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。进一步言之，除非上下文另有需要，否則單數用語應包括複數且複數用語應包括單數。

應理解，本發明不限於本文所述之特定方法、協定及試劑等，且因此可變化。本文中所使用之用語僅出於描述特定實施例之目的，且無意限制本發明之範疇，本發明之範疇僅受隨附申請專利範圍限制。

如本文中所使用，本文中使用之冠詞「一(a/an)」及「該(the)」係指冠詞之一或多於一個（即，至少一個）文法賓語。舉實例而言，「一元件(an element)」意指一個元件或大於一個元件。

替代地（例如，「或(or)」）之使用應理解為意指替代方案中之一者、兩者或其任何組合。

用語「及/或(and/or)」應理解為意指替代方案中之一者或兩者。

如本文中所使用，用語「約(about)」或「大致(approximately)」係指與參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度相比變化多達15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度。在一個實施例中，用語「約」或「近似」係指參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度之± 15%、± 10%、± 9%、± 8%、± 7%、± 6%、± 5%、± 4%、± 3%、± 2%、或± 1%之數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度之範圍。

如本文中所使用，用語「實質上(substantially)」或「基本上(essentially)」係指與參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度相比約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%或更高的數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或、長度。在一個實施例中，用語「基本上相同(essentially the same)」或「實質上相同(substantially the same)」係指與參考數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度約相同的數量、水平、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量、或長度範圍。

如本文中所使用，用語「實質上不含(substantially free of)」及「基本上不含(essentially free of)」可互換使用，且當用以描述諸如細胞群體或培養基之組成物，則係指不含特定物質或其來源之組成物，諸如95%不含、96%不含、97%不含、98%不含、99%不含特定物質或其來源，或指習知方法無法偵測之組成物。組成物中用語「不含(free of)」或「基本上不含(essentially free of)」特定成分或物質亦意指(1)在該組成物中不包含任何濃度之此類成分或物質，或(2)以功能惰性、低濃度包含於該組成物中。類似的含義可應用於用語「不存在(absence of)」，指的是組合物不存在特定物質或其來源。

在本說明書各處，除非上下文另有需要，否則字詞「包含(comprise、comprises及comprising)」應理解為暗指包括一陳述步驟或元件或步驟或元件之群組，但不排除任何其他步驟或元件或步驟或元件之群組。在特定實施例中，用語「包括(include)」、「具有(has)」、「含有(contain)」及「包含(comprise)」係同義地使用。

「由……組成(consisting of)」意指包括且限於片語「由……組成(consisting of)」後之任何者。因此，片語「由……組成」指示所列元件是需要的或強制性的，且不可存在其他元件。

所謂「基本上由……組成(consisting essentially of)」意指包括在片語後列出的任何元件，並且限於不干擾或促成所列元件之揭示內容中指定之活動或動作的其他元件。因此，片語「基本上由……組成」指示所列元件是需要的或強制性的，但沒有其他元件係可選的，且取決於其等是否影響所列元件之活動或動作而可能存在或可能不存在。

在本說明書各處參考「一個實施例(one embodiment)」、「一實施例(a embodiment)」、「一特定實施例(a particular embodiment)」、「一相關實施例(a related embodiment)」、「某一實施例(a certain embodiment)」、「一額外實施例(an additional embodiment)」、或「另一實施例(a further embodiment)」或其組合意指結合實施例描述之特定特徵、結構或特性包含在本發明之至少一個實施例中。因此，在本說明書各不同處出現前述片語不一定皆指相同實施例。此外，在一或多個實施例中，特定特徵、結構或特性可以任何適當方式組合。

用語「離體( ex vivo)」通常係指在生物體外部發生的活動，諸如在生物體外之人為環境中（較佳在對自然條件的最小改變的情況下）在活組織內或在活組織上進行的實驗或量測。在特定實施例中，「離體」程序涉及通常在無菌條件下取自生物體並在實驗室設備中培養的活細胞或組織，並且一般培養數小時或最多約24小時，但是取決於環境包括多達48或72小時或更長時間。在某些實施例中，可收集與冷凍，然後解凍此種組織或細胞用於離體治療。使用活細胞或組織持續超過數天之組織培養實驗或程序一般被認為是「體外」的，儘管在某些實施例中，此用語可與離體互換使用。

用語「體內( in vivo)」通常係指在生物體內部發生的活動。

如本文中所使用，用語「重新程式化(reprogramming)」或「去分化(dedifferentiation)」或「增加細胞潛能(increasing cell potency)」或「增加發育潛能(increasing developmental potency)」係指增加細胞潛能或將細胞去分化至較低分化狀態之方法。例如，與處於非重新程式化狀態之相同細胞相比，具有增加之細胞潛能之細胞具有更多發育可塑性（即，可以分化為更多細胞類型）。換言之，重新程式化之細胞係處於比處於未重新程式化狀態之相同細胞更低分化狀態之細胞。

如本文中所使用，用語「分化(differentiation)」係一種過程，藉由該過程，未特化（「未定型(uncommitted)」）或較少特化之細胞獲得特化細胞（諸如，例如血球或肌細胞）之特徵。分化之或分化誘導之細胞係在細胞譜系中佔據更特化（「定型(committed)」）位置之細胞。當用於分化過程時，用語「定型」係指細胞已經在分化途徑中進行至某一點，在該點，在正常情形下，它將繼續分化為特定細胞類型或細胞類型之子集，並且在正常情形下，不能分化為不同細胞類型或回復至較低分化之細胞類型。如本文中所使用，用語「多潛能(pluripotent)」係指細胞形成本體或體細胞（即胚體）所有譜系之能力。例如，胚胎幹細胞係一種多潛能幹細胞，其能夠自外胚層、中胚層、及內胚層此三個胚層中之每一層形成細胞。多潛能性係發育潛能之連續體，其範圍自不能產生完整生物體之不完全或部分多潛能細胞（例如，外胚層幹細胞或EpiSC）至能夠產生完整生物體之更原始、更多潛能之細胞（例如，胚胎幹細胞）。

如本文中所使用，用語「誘導性多潛能幹細胞(induced pluripotent stem cell)」或「iPSC」係指在體外由分化的成人、新生兒、或胎兒細胞產生之幹細胞，該分化的成人、新生兒、或胎兒細胞已被誘導或改變，即被重新程式化為能夠分化為所有三個胚層或真皮層：中胚層、內胚層、及外胚層之組織之細胞。在一些實施例中，重新程式化過程使用重新程式化因子及/或小分子化學驅動方法。產生之iPSC並非指在自然界中發現之細胞。

如本文中所使用，用語「胚胎幹細胞(embryonic stem cell)」係指胚胎胚胞之內細胞團之天然存在之多潛能幹細胞。胚胎幹細胞係多潛能的，並在發育過程中產生三個原始胚層：外胚層、內胚層、及中胚層之所有衍生物。它們對胚胎外膜或胎盤沒有貢獻（即，並非全潛能的）。

如本文中所使用，用語「多潛能幹細胞(multipotent stem cell)」係指具有分化為一或多個胚層（即，外胚層、中胚層及、內胚層）但非所有三個胚層之發育潛能之細胞。因此，多潛能細胞亦可被稱為「部分分化細胞(partially differentiated cell)」。多潛能細胞係本領域已知的，且多潛能細胞之實例包括成體幹細胞，諸如例如造血幹細胞及神經幹細胞。「多潛能(multipotent)」指示一個細胞可以在給定譜系中形成許多類型之細胞，但不形成其他譜系之細胞。例如，多潛能造血細胞可形成許多不同類型之血球（紅血球、白血球、血小板等），但它不能形成神經元。因此，用語「多潛能性(multipotency)」係指細胞具有低於全潛能及多潛能之發育潛能程度之狀態。

可部分地藉由評估細胞之多潛能性特性來確定多潛能性。多潛能性特性包括但不限於：(i)多潛能幹細胞形態；(ii)無限自我更新之潛能；(iii)多潛能幹細胞標記之表現，包括但不限於SSEA1（僅小鼠）、SSEA3/4、SSEA5、TRA1-60/81、TRA1-85、TRA2-54、GCTM-2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/prominin、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30、及/或CD50；(iv)分化為所有三種體細胞譜系（外胚層、中胚層、及內胚層）之能力；(v)由三種體細胞譜系組成之畸胎瘤形成；及(vi)由來自三種體細胞譜系之細胞組成之胚狀體之形成。

先前已描述了兩種類型之多潛能性：類似於晚期胚胞之外胚層幹細胞（EpiSC）之多潛能性之「致敏(primed)」或「亞穩定(metastable)」狀態，及類似於早期/植入前胚胞之內細胞團之多潛能性之「原始(naïve)」或「基礎(ground)」狀態。雖然兩種多潛能狀態皆表現出上述特性，但原始狀態或基礎狀態進一步表現：(i)女性細胞中X染色體之預失活或再活化；(ii)單細胞培養過程中選殖能力及存活率之改善；(iii) DNA甲基化之整體減少；(iv)發育調控基因啟動子上H3K27me3抑制性染色質標記沉積之減少；及(v)相對於致敏狀態之多潛能細胞，分化標記之表現減少。細胞重新程式化之標準方法通常被視為具有多潛能性之致敏狀態之特性，在該等方法中，外源性多潛能性基因被引入體細胞中，表現，且然後緘默或自所得多潛能細胞中去除。在標準多潛能細胞培養條件下，此種細胞保持在致敏狀態，除非維持外源性轉殖基因表現，其中觀察到基礎狀態之特性。

如本文中所使用，用語「多潛能幹細胞形態(pluripotent stem cell morphology)」係指胚胎幹細胞之經典形態學特徵。正常胚胎幹細胞形態之特徵係圓形及小形狀，具有高核質比，明顯存在核仁及典型細胞間間距。

如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指任何動物，較佳地人類患者、家禽家畜、或其他馴養動物。

「多潛能性因子(pluripotency factor)」或「重新程式化因子(reprogramming factor)」係指能夠單獨或與其他藥劑組合增加細胞之發育潛能之藥劑。多潛能性因子包括但不限於能夠增加細胞之發育潛能之多核苷酸、多肽、及小分子。例示性多潛能性因子包括例如轉錄因子及小分子重新程式化藥劑。

「培養(culture)」或「細胞培養(cell culture)」係指細胞在體外環境中之維持、生長、及/或分化。「細胞培養基(cell culture media)」、「培養基(culture media)」（在每種情況下為單數「培養基(medium)」）、「補充物(supplement)」、及「培養基補充物(media supplement)」係指培養細胞培養物之營養組成物。

「培養(cultivate)」或「維持(maintain)」係指在組織或身體外，例如在無菌塑膠（或塗層塑膠）細胞培養皿或燒瓶中，維持、繁殖（生長）、及/或分化細胞。「培養(cultivation)」或「維持(maintaining)」可利用培養基作為營養物、激素、及/或有助於繁殖及/或維持細胞之其他因子之來源。

如本文中所使用，用語「中胚層(mesoderm)」係指該三個胚層中之一者，其在早期胚胎發生期間出現且產生各種特化細胞類型，包括循環系統、肌肉、心臟、真皮、骨骼、及其他支持及結締組織之血球。

如本文中所使用，用語「確定性生血內皮(definitive hemogenic endothelium)」(HE)或「多潛能幹細胞衍生之確定性生血內皮(pluripotent stem cell-derived definitive hemogenic endothelium)」(iHE)係指在稱為內皮至造血轉變之過程中產生造血幹細胞及前驅細胞之內皮細胞子集。胚胎中造血細胞之發育依次自側板中胚層開始，經過成血管細胞，至確定性生血內皮及造血前驅細胞。

用語「造血幹細胞及前驅細胞(hematopoietic stem and progenitor cell)」、「造血幹細胞(hematopoietic stem cell)」、「造血前驅細胞(hematopoietic progenitor cells)」、或「造血前驅物細胞(hematopoietic precursor cell)」係指定型為造血譜系但能夠進一步造血分化，且包括多潛能造血幹細胞（成血細胞）、骨髓前驅細胞、巨核細胞前驅細胞、紅血球前驅細胞、及淋巴樣前驅細胞之細胞。造血幹細胞及前驅細胞(HSC)係多潛能幹細胞，其產生所有血球類型，包括骨髓細胞（單核球及巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、紅血球、巨核細胞/血小板、樹突細胞）及淋巴樣譜系（T細胞、B細胞、NK細胞）。如本文中所使用，用語「確定性造血幹細胞(definitive hematopoietic stem cell)」係指能夠產生成熟髓樣及淋巴樣細胞類型二者之CD34 ⁺造血細胞，包括T譜系細胞、NK譜系細胞、及B譜系細胞。造血細胞亦包括產生原始紅血球、巨核細胞、及巨噬細胞之原始造血細胞之各種子集。

如本文中所使用，用語「T淋巴球(T lymphocyte)」及「T細胞(T cell)」可互換使用，且係指一種主要類型之白血球，其在胸腺中完成成熟，並在免疫系統中具有多種作用，包括鑑別體內特異性外來抗原，以及以MHC I類限制性方式活化及滅活其他免疫細胞。T細胞可為任何T細胞，諸如經培養之T細胞，例如原代T細胞，或來自經培養之T細胞系之T細胞，例如Jurkat、SupT1等，或自哺乳動物獲得之T細胞。T細胞可為CD3 ⁺細胞。T細胞可為任何類型之T細胞，並且可為任何發育階段，包括但不限於CD4 ⁺/CD8 ⁺雙陽性T細胞、CD4 ⁺輔助T細胞（例如，Th1細胞及Th2細胞）、CD8 ⁺T細胞（例如，細胞毒性T細胞）、周邊血液單核細胞(PBMC)、周邊血液白血球(PBL)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、記憶T細胞、初始T細胞、調控T細胞、γδ T細胞（γδ T細胞）等。額外類型之輔助T細胞包括諸如Th3 (Treg)、Th17、Th9、或Tfh細胞等細胞。額外類型之記憶T細胞包括諸如中樞記憶T細胞（Tcm細胞）、效應記憶T細胞（Tem細胞及TEMRA細胞）等細胞。用語「T細胞」亦可指經基因工程改造之T細胞，諸如經修飾以表現T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。T細胞或T細胞樣效應細胞亦可以自幹細胞或前驅細胞分化而來（「衍生性T細胞」或「衍生之T細胞樣效應細胞」，或統稱為「衍生性T譜系細胞」）。衍生之T細胞樣效應細胞在一些方面可能具有T細胞譜系，但同時具有一或多種原代T細胞中不存在之功能特徵。在本申請案中，T細胞、T細胞樣效應細胞、衍生之T細胞、衍生之T細胞樣效應細胞、或衍生性T譜系細胞被統稱為「T譜系細胞」。

「CD4 ⁺T細胞」係指在其表面上表現CD4並與細胞介導之免疫反應相關聯之T細胞子集。它們以刺激後之分泌譜為特徵，其可包括細胞介素諸如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4、及IL10之分泌。「CD4」分子係55-kD醣蛋白，其最初被定義為T淋巴球上之分化抗原，但亦在包括單核細胞/巨噬細胞在內之其他細胞上發現。CD4抗原係免疫球蛋白超基因家族之成員，且在MHC（主要組織相容性複合體）II類限制性免疫反應中作為聯合辨識要件。在T淋巴球上，它們定義輔助/誘導子集。

「CD8 ⁺T細胞」係指在其表面上表現CD8，且係MHC I類限制性的並用作細胞毒性T細胞之T細胞子集。「CD8」分子係在胸腺細胞以及細胞毒性及抑制性T淋巴球上發現之分化抗原。CD8抗原係免疫球蛋白超基因家族之成員，且在主要組織相容性複合體I類限制性相互作用中係聯合辨識要件。

如本文中所使用，用語「NK細胞(NK cell)」或「自然殺手細胞(Natural Killer cell)」係指藉由CD56或CD16之表現及T細胞受體(CD3)之缺乏而定義之周邊血液淋巴球之子集。NK細胞可為任何NK細胞，諸如經培養之NK細胞（例如原代NK細胞），或來自經培養或經擴增之NK細胞或細胞系NK細胞之NK細胞（例如NK-92），或獲自健康或具有疾病病況之哺乳動物之NK細胞。如本文中所使用，用語「適應性NK細胞(adaptive NK cell)」及「記憶NK細胞(memory NK cell)」可互換，且指在表型上為CD3 ^-及CD56 ⁺之NK細胞子集，表現NKG2C及CD57以及可選地CD16中之至少一者，但不表現以下中之一或多者：PLZF、SYK、FceRɣ、及EAT-2。在一些實施例中，單離之CD56 ⁺NK細胞子群體包含CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配體、NKp30、NKp40、NKp46、活化及抑制性KIR、NKG2A、及/或DNAM-1之表現。CD56 ⁺可為暗淡或明亮之表現。NK細胞或NK細胞樣效應細胞可以自幹細胞或前驅細胞分化而來（「衍生性NK細胞」或「衍生之NK細胞樣效應細胞」，或統稱為「衍生性NK譜系細胞」）。衍生性NK細胞樣效應細胞在一些方面可能具有NK細胞譜系，但同時具有一或多種原代NK細胞中不存在之功能特徵。在本申請案中，NK細胞、NK細胞樣效應細胞、衍生之NK細胞、衍生之NK細胞樣效應細胞、或衍生性NK譜系細胞被統稱為「NK譜系細胞」。

如本文中所使用，用語「NKT細胞(NKT cell)」或「自然殺手T細胞(natural killer T cell)」或「NKT譜系細胞(NKT lineage cell)」係指表現T細胞受體(TCR)之CD1d限制性T細胞。與偵測由習知主要組織相容性(MHC)分子呈遞之肽抗原之習知T細胞不同，NKT細胞辨識由CD1d（非經典的MHC分子）呈遞之脂質抗原。辨識兩種類型之NKT細胞。不變的或I型NKT細胞表現非常有限的TCR庫-與有限的β鏈譜（人類之Vβ11）相關聯之規範的α鏈（人類之Vα24-Jα18）。NKT細胞之第二群體，稱為非經典或非不變的II型NKT細胞，顯示出更異質性之TCR αβ利用。I型NKT細胞被視為適合於免疫療法。適應性或不變的（I型）NKT細胞可以藉由下列標記中一或多者之表現來鑑別：TCR Va24-Ja18、Vb11、CD1d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD161、及CD56。

用語「效應細胞(effector cell)」通常適用於免疫系統中回應於刺激及/或活化而執行比活性之某些細胞，或適用於活化後實現特定功能之細胞。如本文中所使用，用語「效應細胞」包括免疫細胞、「分化之免疫細胞」、及經編輯及/或調節以回應於刺激及/或活化而執行比活性之原代或分化之細胞，並且在某些情況下可以互換。效應細胞之非限制性實例包括原始來源或iPSC衍生之T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、巨噬細胞、及嗜中性球。

如本文中所使用，用語「經單離(isolated)」或類似用語係指已經與其原始環境分離之細胞或細胞群體，即經單離細胞之環境實質上不含在「未單離」參考細胞存在之環境中發現之至少一種組分。該用語包括自其自然環境中發現之一些或所有組分中取出之細胞，例如自組織或活檢樣本中單離之細胞。該用語亦包括自至少一種、一些、或所有組分中取出之細胞，如在非天然存在之環境中發現之細胞，例如自細胞培養物或細胞懸浮液中單離之細胞。因此，「經單離細胞(isolated cell)」與至少一種組分部分或完全分離，該組分包括其他物質、細胞、或細胞群體，如其在自然界中發現，或者如其在非天然存在之環境中生長、儲存、或存活。經單離細胞之具體實例包括部分純的細胞組成物、實質上純的細胞組成物、及在非天然存在之培養基中培養之細胞。經單離細胞可以藉由自環境中之其他物質或細胞中分離出期望之細胞或其群體，或者藉由自環境中去除一或多種其他細胞群體或子群體來獲得。

如本文中所使用，用語「純化(purify)」或類似用語係指增加純度。例如，純度可以增加至至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%。

如本文中所使用，用語「編碼」係指多核苷酸中核苷酸之特定序列的固有特性，諸如基因、cDNA或mRNA，以用作在具有定義之核苷酸序列（即rRNA、tRNA及mRNA）或定義之胺基酸序列的生物製程中合成其他聚合物及巨分子的模板，以及由此產生的生物學特性。因此，若對應於該基因之mRNA的轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。其核苷酸序列與mRNA序列相同且通常在序列表中提供之編碼鏈及用作基因或cDNA轉錄模板之非編碼鏈二者皆可被稱為「編碼」該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。

「構築體(construct)」係指包含體外或體內待遞送至宿主細胞之多核苷酸的巨分子或分子錯合物。如本文中所使用，「載體(vector)」係指能夠指導外來基因物質遞送或轉移至目標細胞之任何核酸構築體，在目標細胞中構築體可複製及/或表現。因此，用語「載體」包含待遞送之構築體。載體可為直鏈或圓形分子。載體可為整合或非整合。主要類型之載體包括但不限於質體、附加體載體、病毒載體、黏質體及人工染色體。病毒載體包括但不限於腺病毒載體、腺相關聯病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、仙台病毒載體、及類似載體。

如在整個申請案中時常所使用，「TRAC_[構築體]」之表現（其中「[構築體]」係可變表現構築體，其具有在給定上下文中指定之組分及其排列）意指表現構築體插入TRAC基因座處以剔除TCR，並且表現構築體之（多種）組分在內源性TCR啟動子之控制下表現或共表現。

如在整個申請案中時常所使用，「CD38_[構築體]」之表現（其中「[構築體]」係可變表現構築體，其具有在給定上下文中指定之組分及其排列）意指表現構築體插入CD38基因座處以剔除CD38，並且無論在內源性CD38啟動子之控制下還是在構築體中之外源性啟動子之控制下，表現構築體之（多種）組分皆被表現或共表現。

所謂「整合(integration)」係指構築體之一或多個核苷酸穩定地插入細胞基因體中，即與細胞染色體DNA內之核酸序列共價連接。所謂「靶向整合(targeted integration)」係指構築體之（多個）核苷酸在預先選擇之位點或「整合位點(integration site)」處插入細胞之染色體或粒線體DNA。如本文中所使用之用語「整合(integration)」進一步指涉及在整合位點處缺失或不缺失內源序列或核苷酸之情況下，插入構築體之一或多個外源序列或核苷酸的製程。在插入位點處存在缺失之情況下，「整合」可進一步包含用一或多個插入之核苷酸替換內源性序列或缺失之核苷酸。

如本文中所使用，用語「外源性(exogenous)」旨在意指所參考分子或所參考活性被引入宿主細胞，或者對於宿主細胞為非天然的。該分子可例如藉由將編碼核酸引入宿主基因物質中來引入，諸如藉由整合至宿主染色體中或整合作為非染色體基因物質，諸如質體。因此，如其在提及表現編碼核酸時使用之用語係指將可表現形式之編碼核酸引入細胞中。用語「內源(endogenous)」係指存在於宿主細胞中之參考分子或活性。類似地，當用於提及編碼核酸之表現時，該用語係指包含在細胞內且未外源引入的編碼核酸之表現。

如本文中所使用，「所關注之基因(gene of interest)」或「所關注之多核苷酸序列(a polynucleotide sequence of interest)」係在適當調控序列控制下放置時，在體內轉錄成RNA並且在一些情況下轉譯成多肽的DNA序列。所關注之基因或多核苷酸可包括但不限於原核序列、來自真核mRNA之cDNA、來自真核（例如，哺乳動物）DNA之基因體DNA序列及合成DNA序列。例如，所關注之基因可編碼miRNA、shRNA、天然多肽（即，在自然界中發現之多肽）或其片段；變異多肽（即，與天然多肽具有小於100%序列同一性之天然多肽的突變體）或其片段；工程設計之多肽或肽片段、治療性肽或多肽、成像標記、選擇性標記等。

如本文中所使用，用語「多核苷酸(polynucleotide)」係指任何長度之核苷酸的聚合形式，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸之序列由四個核苷酸鹼基組成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；且當多核苷酸為RNA時，胸腺嘧啶之尿嘧啶(U)。多核苷酸可包括基因或基因片段（例如探針、引子、EST、或SAGE標籤）、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列之分離DNA、任何序列之分離RNA、核酸探針、及引子。「多核苷酸」亦指雙股及單股分子。

如本文中所使用，用語「肽(peptide)」、「多肽(polypeptide)」及「蛋白質(protein)」可互換使用，且指具有藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基的分子。多肽必須含有至少兩個胺基酸，且對多肽之胺基酸之最大數目無限制。如本文中所使用，例如，該等用語即指所屬技術領域中亦通常稱為肽、寡肽及寡聚物之短鏈，亦指通常稱為多肽或蛋白質的較長鏈。「多肽」包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽變體、經修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重組多肽、合成多肽或其組合。

如本文中所使用，用語「次單元(subunit)」係指蛋白質錯合物之每條單獨的多肽鏈，其中每條單獨的多肽鏈可自身形成穩定的折疊結構。許多蛋白質分子由大於一個次單元組成，其中各次單元之胺基酸序列可相同、或類似或完全不同。例如，CD3錯合物包含CD3α、CD3ε、CD3δ、CD3γ、及CD3ζ次單元，其形成CD3ε/CD3γ、CD3ε/CD3δ、及CD3ζ/CD3ζ二聚體。在單個次單元中，多肽鏈之連續部分頻繁地摺疊成稱為「域」的緊湊、局部、半獨立單元。許多蛋白質域可進一步包含亦稱為子域之獨立「結構次單元(structural subunit)」，其促成域的共同功能。因此，如本文中所使用之用語「子域」係指較大域內之蛋白質域，例如在細胞表面受體之胞外域內的結合域；或細胞表面受體之胞內域的刺激域或信號傳導域。

「可操作地連接(operably linked)」或「操作性地連接(operationally linked)」可與「可操作地連接(operably connected)」或「操作性地連接(operatively connected)」互換，係指單核酸片段（或多肽中具有多個域之胺基酸）上之核酸序列之關聯，使得一者之功能受另一者影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列或功能RNA之表現時（亦即編碼序列或功能RNA受啟動子之轉錄控制），該啟動子與該編碼序列或功能RNA可操作地連接。編碼序列可在有義或反義定向上可操作地連接至調控序列。作為另一實例，受體結合域可操作性地連接至細胞內信號傳導域，使得受體與配體之結合轉導回應於所述結合之信號。

如本文中所使用，「融合蛋白(fusion proteins)」或「嵌合蛋白(chimeric proteins)」係透過基因工程設計加入二或更多個編碼單獨蛋白質之部分或全多核苷酸編碼序列而產生的蛋白質，且此等加入之多核苷酸之表現導致具有衍生自其原始蛋白質或其片段之各者之功能特性的單肽或多個多肽。在融合蛋白中不同來源之兩個相鄰多肽之間，可添加連接子（或間隔子）肽。

如本文中所使用，用語「基因印記(genetic imprint)」係指基因或表觀基因資訊，其有助於源細胞或iPSC中之優先治療屬性，並可保留在源細胞衍生之iPSC及/或iPSC衍生之造血譜系細胞中。如本文中所使用，「源細胞(source cell)」係可用於藉由重新程式化產生iPSC之非多潛能細胞，並且源細胞衍生之iPSC可進一步分化為特定細胞類型，包括任何造血譜系細胞。源細胞衍生之iPSC及由其分化之細胞有時根據上下文而被統稱為「衍生之」或「衍生性」細胞。例如，本申請案通篇使用之衍生性效應細胞或衍生性NK細胞或衍生性T細胞係自iPSC分化之細胞，與自其自天然/本地來源諸如周邊血液、臍帶血、或其他供體組織獲得之主要對應物相比。如本文中所使用，賦予優先治療屬性之（多個）基因印記藉由對供體特異性、疾病特異性、或治療反應特異性之所選之源細胞進行重新程式化，或藉由使用基因體編輯將經基因修飾之形式引入iPSC而被結合至iPSC中。就自特定選擇之供體、疾病、或治療環境中獲得之源細胞而言，有助於優先治療屬性之基因印記可包括任何環境特異性基因或表觀基因修飾，其表現出可保留的表型，即優先治療屬性，其傳遞給所選之源細胞之衍生性細胞，而無論潛在分子事件是否被鑑別出。供體特異性、疾病特異性、或治療反應特異性源細胞可包含可保留在iPSC及衍生之造血譜系細胞中之基因印記，該等基因印記包括但不限於預先安排之單特異性TCR，例如來自病毒特異性T細胞或不變自然殺手T (iNKT)細胞；可追蹤及所欲之基因多態性，例如，對於在所選之供體中編碼高親和力CD16受體之點突變係純合的；及預定HLA要求，即所選之HLA匹配之供體細胞表現出具有增加之群體之單倍型。如本文中所使用，優先治療屬性包括改善之植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、免疫反應調控及調節、存活、及衍生之細胞之細胞毒性。優先治療屬性亦可能與抗原靶向受體表現；HLA呈遞或其缺乏；對腫瘤微環境之抗性；旁觀者免疫細胞之誘導及免疫調節；具有降低的腫瘤外效應之改善之靶向特異性；及/或對治療諸如化學療法之抗性有關。當具有一或多種治療屬性之衍生性細胞藉由分化具有（多個）基因印記（賦予結合於其中之優先治療屬性）之iPSC而獲得時，此種衍生性細胞亦被稱為「合成細胞(synthetic cell)」。一般而言，合成細胞與其最接近之對應原代細胞相比，具有一或多種非天然細胞功能，無論該合成細胞係自經工程改造之多潛能細胞分化而來，還是藉由工程改造來自天然/本地來源（諸如周邊血液、臍帶血、或其他供體組織）之原代細胞而獲得。例如，本申請案通篇使用之合成效應細胞或合成NK細胞或合成T細胞係自經基因體修飾之iPSC分化之細胞，與自其自天然/本地來源諸如周邊血液、臍帶血、或其他供體組織獲得之主要對應物相比。在一些實施例中，合成細胞與其最接近之對應原代細胞相比，具有一或多種非天然細胞功能。

如本文中所使用，用語「增強的治療性質(enhanced therapeutic property)」係指與相同一般細胞類型之典型免疫細胞相比，得到增強之細胞之治療性質。例如，與典型、未經修飾、及/或天然存在之NK細胞相比，具有「增強的治療性質」之NK細胞將具有增強的、改善的、及/或增加的治療性質。免疫細胞之治療性質可包括但不限於細胞植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、免疫反應調控及調節、存活、及細胞毒性。免疫細胞之治療性質亦藉由抗原靶向受體表現；HLA呈遞或其缺乏；對腫瘤微環境之抗性；旁觀者免疫細胞之誘導及免疫調節；具有降低的腫瘤外效應之改善之靶向特異性；及/或對治療諸如化學療法之抗性證明。

如本文中所使用，用語「接合物(engager)」係指能夠在免疫細胞（例如，T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、巨噬細胞、嗜中性球）與腫瘤細胞之間形成連接；並活化該免疫細胞之分子，例如，融合多肽。接合物之實例包括但不限於雙特異性T細胞接合物(BiTE)、雙特異性殺手細胞接合物(BiKE)、三特異性殺手細胞接合物(TriKE)、或多特異性殺手細胞接合物，或與多種免疫細胞類型相容之通用接合物。

如本文中所使用，用語「表面觸發受體(surface triggering receptor)」係指能夠觸發或起始免疫反應（例如，細胞毒性反應）之受體。表面觸發受體可被工程改造，並可在效應細胞（例如，T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、巨噬細胞、或嗜中性球）上表現。在一些實施例中，表面觸發受體促進效應細胞與特異性目標細胞（例如，腫瘤細胞）之間之雙特異性或多特異性抗體結合，而不依賴於效應細胞之天然受體及細胞類型。使用此種方法，可以產生包含通用表面觸發受體之iPSC，然後將此種iPSC分化為表現通用表面觸發受體之各種效應細胞類型之群體。「通用(universal)」係指表面觸發受體可以在任何效應細胞中表現並活化，而無論細胞類型如何，並且表現通用受體之所有效應細胞可以偶合或連接至可藉由表面觸發受體辨識之接合物，而無論接合物之腫瘤結合特異性如何。在一些實施例中，具有相同腫瘤靶向特異性之接合物用於與通用表面觸發受體偶合。在一些實施例中，具有不同腫瘤靶向特異性之接合物用於與通用表面觸發受體偶合。因此，在一些情況下，一或多種效應細胞類型可經接合以殺滅一種特定類型之腫瘤細胞，而在其他情況下，殺滅二或更多種類型之腫瘤。表面觸發受體通常包含用於效應細胞活化之共刺激域及對接合物之表位特異之抗表位。雙特異性接合物在一端對表面觸發受體之抗表位特異，而在另一端對腫瘤抗原特異。

如本文中所使用，用語「安全開關蛋白(safety switch protein)」係指經設計以預防細胞療法之潛在毒性或其他副作用之經工程改造之蛋白質。在一些情況下，安全開關蛋白之表現被有條件地控制，以解決已將編碼安全開關蛋白之基因永久性地結合至其基因體中之經移植經工程改造之細胞之安全性問題。此種條件性調控可有所變化，並且可能包括藉由小分子介導之翻譯後活化及組織特異性及/或時間轉錄調控之控制。安全開關蛋白可以介導細胞凋亡之誘導、蛋白質合成之抑制、DNA複製、生長停滯、轉錄及轉錄後基因調控、及/或抗體介導之耗竭。在一些情況下，安全開關蛋白藉由外源性分子（例如，前藥）活化，當被活化時，觸發治療性細胞之細胞凋亡及/或細胞死亡。安全開關蛋白之實例包括但不限於自殺基因，諸如凋亡蛋白酶9（或凋亡蛋白酶3或7）、胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶、B細胞CD20、經修飾之EGFR、及其任何組合。在此種策略中，在發生不良事件時投予之前藥藉由自殺基因產物活化，並殺滅所轉導之細胞。

如本文中所使用，用語「醫藥活性蛋白或肽(pharmaceutically active protein or peptide)」係指能夠對生物體達成生物及/或醫藥效果之蛋白質或肽。醫藥活性蛋白具有治癒、可治癒、或緩解疾病之特性，且可被投予以改善、緩解、減輕、逆轉、或減低疾病之嚴重程度。醫藥活性蛋白亦具有疾病預防特性，且用於預防疾病之發作或當疾病或病理病況出現時減低其嚴重程度。「醫藥活性蛋白」包括完整的蛋白質或肽或其醫藥活性片段。該用語亦包括蛋白或肽之醫藥活性類似物或者蛋白質或肽片段之類似物。用語醫藥活性蛋白亦係指合作或協同作用以提供治療益處之複數種蛋白質或肽。醫藥活性蛋白或肽之實例包括但不限於受體、結合蛋白、轉錄及翻譯因子、腫瘤生長抑制蛋白、抗體或其片段、生長因子、及/或細胞介素。

如本文中所使用，用語「信號傳導分子(signaling molecule)」係指調變、參與、抑制、活化、減少或增加細胞信號轉導之任何分子。「信號轉導(signal transduction)」係指藉由沿着最終觸發細胞中之生化事件的路徑募集蛋白質錯合物，以化學修飾形式傳輸分子信號。實例信號轉導路徑之實例在所屬技術領域中是眾所周知的，且包括但不限於G蛋白偶聯受體信號傳導、酪胺酸激酶受體信號傳導、整合素信號傳導、toll閘信號傳導、配體閘控離子通道信號傳導、ERK/MAPK信號傳導路徑、Wnt信號傳導路徑、cAMP依賴性路徑、及IP3/DAG信號傳導路徑。

如本文中所使用，用語「靶向模式(targeting modality)」係指分子（例如，多肽），其基因結合至細胞中以促進抗原及/或表位特異性，該特異性包括但不限於i)抗原特異性，因為其涉及獨特的嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，ii)接合物特異性，因為其涉及單株抗體或雙特異性接合物，iii)轉化細胞之靶向，iv)癌症幹細胞之靶向，及v)在特異性抗原或表面分子不存在之情況下之其他靶向策略。

如本文中所使用，用語「特異性(specific/specificity)」可用於指與非特異性或非選擇性結合相比，分子（例如受體或銜接器）選擇性結合至目標分子之能力。

如本文中所使用，用語「過繼細胞療法(adoptive cell therapy)」係指基於細胞之免疫療法，其涉及自體或同種異體淋巴球之輸注，無論免疫細胞係自人類供體單離，還是自多潛能細胞之體外分化而獲得之效應細胞單離；無論其是否經基因修飾；或者無論它們係原代供體細胞還是自供體單離後離體傳代、擴增、或永生化之細胞。

如本文中所使用，「輻射(radiation)」係指以波或粒子之形式發射或傳輸能量。輻射之例示性形式包括但不限於電磁輻射（例如，無線電波、微波、紅外線、可見光、紫外線、x射線、及伽馬輻射）、粒子輻射（例如，α輻射、β輻射、質子輻射、及中子輻射）、及聲輻射（例如，超聲波、聲波、及地震波）。在各種實施例中，輻射量被測量為Gray (Gy)，其被定義為每千克物質吸收一焦耳之輻射能量。在輻射療法中，施加之輻射量根據被治療之癌症之類型及階段而變化。對於治癒病例，實體上皮腫瘤之典型劑量範圍為60至80 Gy，而淋巴瘤一般用20至40 Gy治療。預防（輔助）劑量一般約為45–60 Gy，分1.8–2 Gy份（例如，用於乳癌、頭癌、及頸癌）。在各種實施例中，輻射可用作如本文所揭示之敏化劑。

如本文中所使用，「輻射療法(radiation therapy)」或「放射療法(radiotherapy)」可互換使用，係指一種類型之癌症治療，其涉及使用輻射藉由破壞控制細胞生長及分裂之基因物質來損傷細胞。儘管健康細胞及癌細胞二者皆被輻射療法破壞，但輻射療法之目標係盡可能少地破壞正常、健康的細胞。用語「輻射療法」通常指外粒子束輻射療法，其中高能束（例如，x射線、伽馬射線、光子、質子、中子、離子、及可應用於此種治療之能量之任何其他形式）由被治療對象外部之機器產生，並且瞄準對象身體上之精確點。然而，用語「輻射療法」亦包括近接療法，其中含有或以其他方式連接至輻射源之種子、帶狀物、或膠囊被放置在對象體內之腫瘤或癌細胞中或附近。近接療法包括低劑量率植入、高劑量率植入、及永久植入。用語「輻射療法」亦包括全身性輻射療法，其中放射性藥物（例如，放射性醫藥或放射性核素，包括放射性肽）口服或靜脈內給於對象，並在對象體內腫瘤或癌細胞所在區域處收集。類似於抗體-藥物候選物，其中結合腫瘤抗原之抗體連接至毒性藥物，放射性醫藥結合與特異性結合至腫瘤抗原之靶向分子（諸如抗體）連接之放射性化合物。用於放射性醫藥之放射性化合物之實例包括但不限於鈣-47、碳-11、碳-14、鉻-51、鈷-57、鈷-58、鉺-169、氟-18、鎵-67、鎵-68、氫-3、銦-111、碘-123、碘-125、碘-131、鐵-59、氪-81m、鑥-177、氮-13、氧-15、磷-32、鐳-223、銣-82、釤-153、硒-75、鈉-22、鈉-24、鍶-89、鍀-99m、鉈-201、氙-133、及釔-90。在各種實施例中，輻射療法可用作如本文所揭示之敏化劑。

如本文中所使用，「淋巴球清除(lymphodepletion)」及「淋巴球調理(lympho-conditioning)」可互換使用，係指淋巴球及T細胞之破壞，一般在免疫療法之前。在投予過繼細胞療法之前進行淋巴球調理之目的係促進效應細胞之穩態增殖，以及消除調控性免疫細胞及免疫系統中競爭平衡性細胞介素之其他競爭性要件。因此，淋巴球調理一般藉由在過繼細胞療法之第一劑之前向對象投予一或多種化學治療劑來完成。在各種實施例中，淋巴球調理先於過繼細胞療法之第一劑幾小時至幾天。用於淋巴球調理之例示性化學治療劑包括但不限於環磷醯胺(CY)、氟達拉濱(FLU)、及下述彼等。然而，藉由抗CD38 mAb進行充分的淋巴球清除可為本發明之iNK細胞療法提供一種替代調理過程，而不需要或需要最少之基於CY/FLU之淋巴球調理程序，如本文進一步所述的。

如本文中所使用，「歸巢(homing)」或「運輸(trafficking)」係指細胞主動導航（遷移）至標靶位點（例如，細胞、組織（例如，腫瘤）/或器官）。「歸巢分子(homing molecule)」係指將細胞導向至標靶位點之分子。在一些實施例中，歸巢分子用於辨識及/或起始細胞與標靶位點之相互作用。在一些實施例中，歸巢分子係趨化因子受體。如本文中所使用，「趨化因子受體(chemokine receptor)」指結合至趨化因子之細胞表面分子。趨化因子受體可包含天然存在或重組的趨化因子受體或其變體。例示性趨化因子受體包括但不限於CXC趨化因子受體（例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、或CXCR7）、CC趨化因子受體（例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11）、CX3C趨化因子受體（例如，CX3CR1）、XC趨化因子受體（例如，XCR1）、或其變體。

如本文中所使用，「治療足夠量(therapeutically sufficient amount)」在其含義內包括無毒但足夠及/或有效量之具體治療劑及/或醫藥組成物，其涉及提供期望之治療效果。所需之確切量因對象而異，此取決於諸如患者之總體健康狀況、患者之年齡、及所治療病況之階段及嚴重程度等因素。在具體實施例中，「治療足夠量」足以及/或有效地改善、減輕、及/或改善與接受治療之對象之疾病或病況相關聯之至少一種症狀。

多潛能幹細胞之分化需要改變培養系統，諸如改變培養基中之刺激劑或細胞之物理狀態。最習知策略係利用胚狀體(EB)之形成作為起始譜系特異性分化之常見及關鍵中間物。「胚狀體(embryoid body)」係已被證明模擬胚胎發育之三維簇，因為它們在其三維區域內產生許多譜系。在分化過程中，一般幾個小時至幾天，簡單的EB（例如，被誘導分化之聚集之多潛能幹細胞）繼續成熟並發育成囊性EB，此時，一般幾天至幾周，它們被進一步加工以繼續分化。EB之形成係藉由使多潛能幹細胞在三維多層細胞簇中彼此緊密接近來起始。一般而言，此係藉由若干種方法中之一者來達成，包括使多潛能細胞沉澱在液滴中，將細胞沉澱至「U」形底孔板中，或藉由機械攪拌。為了促進EB發育，多潛能幹細胞聚集體需要進一步分化線索，因為在多潛能培養維持培養基中維持之聚集體不會形成合適的EB。因此，需要將多潛能幹細胞聚集體轉移至分化培養基中，該分化培養基為所選之譜系提供誘導線索。基於EB之多潛能幹細胞培養一般導致分化細胞群體（即外胚層、中胚層、及內胚層）之產生，在EB細胞簇內具有適度增殖。儘管已經證明EB有利於細胞分化，然而由於三維結構中之細胞不一致地暴露於環境內的分化線索，EB會產生處於可變分化狀態之異質細胞。此外，創建及維護EB耗時費力。此外，藉由EB形成進行之細胞分化伴隨著適度的細胞擴增，此亦導致低分化效率。

相比之下，不同於「EB形成(EB formation)」之「聚集體形成(aggregate formation)」可用於擴增多潛能幹細胞衍生之細胞之群體。例如，在基於聚集體之多潛能幹細胞擴增過程中，選擇培養基以維持增殖及多潛能性。細胞增殖通常增加聚集體之大小，形成較大的聚集體，該等聚集體可被機械或酶促解離成較小的聚集體，以維持培養物內之細胞增殖並增加細胞數目。與EB培養不同，在維持培養基之聚集體內培養之細胞保持多潛能性之標記。多潛能幹細胞聚集體需要進一步分化線索來誘導分化。

如本文中所使用，「單層分化(monolayer differentiation)」係指不同於藉由三維多層式細胞簇分化進行之分化方法，即「EB形成」的用語。除了本文揭露之其他優點之外，單層分化避免需要EB形成來起始分化。由於單層培養不模擬胚胎發育，諸如EB形成之情況，與EB形成中之所有三個胚層分化相比，向特異性譜系之分化被視為最小的。

如本文中所使用，「解離細胞(dissociated cell)」或「單個解離細胞(single dissociated cell)」係指已自其他細胞或自表面（例如，培養板表面）實質上分離或純化之細胞。例如，可以藉由機械或酶促方法自動物或組織中解離細胞。替代地，體外聚集之細胞可以藉由酶促或機械方式彼此解離，諸如藉由解離成簇、單細胞、或單細胞及簇之混合物之懸浮液。在再另一替代實施例中，黏附細胞可以自培養板或其他表面解離。因此，解離可能涉及破壞細胞與胞外基質(ECM)及受質（例如，培養物表面）之相互作用，或破壞細胞間之ECM。

如本文中所使用，「主細胞庫(master cell bank)」或「MCB」係指無性繁殖系主經工程改造之iPSC系，其為iPSC之無性繁殖系群體，該等iPSC已經工程改造以包含一或多種治療屬性，已被表徵、測試、資格鑑定、及擴增，且已顯示可靠地充當起始細胞材料，用於在製造環境中藉由定向分化產生基於細胞之治療。在各種實施例中，將MCB保持、儲存、及/或冷凍保存在多個容器中，以藉由減少及/或消除iPS細胞系在製造過程中傳代、解凍、或處理之總次數來預防基因變異及/或潛在污染。

如本文中所使用，「餵養細胞(feeder cell)」或「餵養物(feeder)」係描述一種類型之細胞與第二種類型之細胞共培養以提供第二種類型之細胞可生長、擴增、或分化之環境之用語，因為餵養細胞提供刺激、生長因子、及營養物以支持第二種細胞類型。餵養細胞可選地來自與其支持之細胞不同之物種。例如，某些類型之人類細胞（包括幹細胞）可由小鼠胚胎成纖維細胞之原代培養物或永生化之小鼠胚胎成纖維細胞支持。在另一實例中，周邊血液衍生之細胞或轉化之白血病細胞支持自然殺手細胞之擴增及成熟。當餵養細胞與其他細胞共培養時，一般可以藉由輻照或用抗有絲分裂劑諸如絲裂黴素處理來滅活餵養細胞，以預防它們生長超過它們所支持之細胞。餵養細胞可以包括內皮細胞、基質細胞（例如，上皮細胞或成纖維細胞）及白血病細胞。不限制前述內容，一種特定之餵養細胞類型可為人餵養細胞，諸如人皮膚成纖維細胞。另一種餵養細胞類型可為小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)。一般而言，可部分地使用各種餵養細胞來維持多潛能性，朝某一譜系導向分化，增強增殖能力並促進成熟為特化細胞類型，諸如效應細胞。

如本文中所使用，「無餵養物(feeder-free)」(FF)環境係指諸如培養條件、細胞培養物、或培養基等環境，其基本上不含餵養物或基質細胞，及/或其未藉由餵養細胞之培養進行預調理。「預調理之(pre-conditioned)」培養基係指餵養細胞在培養基內培養一段時間（諸如至少一天）后收穫之培養基。預調理之培養基含有許多介質物質，包括由培養基中培養之餵養細胞所分泌之生長因子及細胞介素。在一些實施例中，無餵養物環境不含餵養物或基質細胞，且亦不藉由培養餵養細胞進行預調理。

在基因體編輯或修飾iPSC及自其分化之衍生之非多潛能細胞，或基因體編輯或修飾非多潛能細胞及自其重新程式化之衍生之iPSC之上下文中使用之「功能性(functional)」係指(1)在基因水平上-成功嵌入、剔除、減弱之基因表現，轉殖基因或受控基因表現，諸如在期望之細胞發育階段處之可誘導性或暫時性表現，其藉由直接基因體編輯或修飾，或藉由經由自最初經基因體工程改造之起始細胞分化或重新程式化而進行之「傳遞(passing-on)」來達成；或(2)在細胞水平上-成功去除、添加、或更改細胞功能/特性，其經由以下方式來進行：(i)藉由直接基因體編輯在該細胞中獲得之基因表現修飾，(ii)藉由經由自最初經基因體工程改造之起始細胞分化或重新程式化而進行之「傳遞」在該細胞中維持之基因表現修飾；(iii)作為基因表現修飾之結果，該細胞中之下游基因調控，其僅出現在該細胞之早期發育階段，或僅出現在經由分化或重新程式化而產生該細胞之起始細胞中；或(iv)在成熟細胞產物中展示之增強的或新獲得的細胞功能或屬性，最初衍生自在iPSC、前驅細胞、或去分化細胞來源進行之基因體編輯或修飾。

「HLA缺乏」（包括HLA I類缺乏、HLA II類缺乏、或兩者）係指缺乏或不再維持或具有降低之完整MHC錯合物表面表現水平之細胞，該錯合物包含HLA I類蛋白異二聚體及/或HLA II類異二聚體，使得減低或降低之水平低於其他細胞或合成方法天然可偵測之水平。

如本文中所使用，「經修飾之HLA缺乏iPSC(modified HLA deficient iPSC)」係指藉由引入表現蛋白質之基因而進一步修飾之HLA缺乏iPSC，其涉及但不限於改善之分化潛能、抗原靶向、抗原呈遞、抗體辨識、持久性、免疫逃避、抑制抗性、增殖、共刺激、細胞介素刺激、細胞介素產生（自分泌或旁分泌）、趨化性、及細胞毒性，諸如非經典HLA I類蛋白（例如，HLA-E及HLA-G）、嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)、CD16 Fc受體、BCL11b、NOTCH、RUNX1、IL15、4-1BB、DAP10、DAP12、CD24、CD3ζ、4-1BBL、CD47、CD113、及PDL1。「經修飾之HLA缺乏」細胞亦包括除iPSC以外之細胞。

用語「配體(ligand)」係指與目標分子形成錯合物以藉由結合至目標上之位點產生信號的物質。配體可為能夠特異性結合至目標的天然或人為物質。配體可呈蛋白質、肽、抗體、抗體錯合物、接合物、核酸、脂質、多醣、單醣、小分子、奈米粒子、離子、神經傳輸體、或能夠特異性結合至目標之任何其他分子實體之形式。配體所結合之目標可為蛋白質、核酸、抗原、受體、蛋白質錯合物、或細胞。結合至目標且改變其功能並觸發信號傳導回應之配體稱為「促效(agonistic)」或「促效劑(an agonist)」。結合至目標且阻斷或減少信號傳導回應之配體係「拮抗(antagonistic)」或「拮抗劑(an antagonist)」。

用語「抗體(antibody)」在本文中以最廣泛的意義使用，且通常指含有特異性結合至標靶之至少一個結合位點之免疫反應產生分子，其中該標靶可為抗原或能夠與某些抗體相互作用之受體。例如，NK細胞可藉由將抗體或抗體之Fc區結合至其Fcγ受體(FcγR)而被活化，從而觸發ADCC（抗體依賴性細胞毒性）介導之效應細胞活化。抗體所結合之抗原或受體或一般言之目標的具體片段或部分被稱為表位或抗原決定位。用語「抗體」包括但不限於天然抗體及其變體、天然抗體之片段及其變體、肽抗體及其變體、以及模擬抗體或其指定片段或部分之結構及/或功能之抗體模擬物，包括單鏈抗體及其片段。抗體可為鼠抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝IgG、單可變新抗原受體(VNAR)、鯊魚重鏈抗體(Ig-NAR)、嵌合抗體、重組抗體、單域抗體(dAb)、抗獨特型抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、或多聚體抗體、或其抗體片段。抗獨特型抗體特異性地結合至另一抗體之獨特型，其中該獨特型係抗體之抗原決定簇。雙特異性抗體可為BiTE（雙特異性T細胞接合物）或BiKE（雙特異性殺手細胞接合物），且多特異性抗體可為TriKE（三特異性殺手細胞接合物）。抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、Fabc、pFc、Fd、單鏈片段變體(scFv)、串聯scFv (scFv)2、單鏈Fab (scFab)、二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、微型體、雙體、三體、四體、單域抗原結合片段(sdAb)、駱駝科重鏈IgG及Nanobody ^®片段、重組僅重鏈抗體(VHH)、及維持抗體之結合特異性的其他抗體片段。

「Fc受體(Fc receptor)」（縮寫為FcR）基於其所辨識之抗體類型進行分類。例如，結合最常見類別之抗體IgG之彼等被稱為Fcγ受體(FcγR)，結合IgA之彼等被稱為Fcα受體(FcαR)，且結合IgE之彼等被稱為Fcε受體(FcεR)。FcR之類別亦藉由表現它們之細胞（巨噬細胞、顆粒球、自然殺手細胞、T細胞、及B細胞）及每個受體之傳訊特性來區分。Fc-γ受體(FcγR)包括若干成員，FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32)、FcγRIIB (CD32)、FcγRIIIA (CD16a)、及FcγRIIIB (CD16b)，由於它們不同的分子結構，它們的抗體親和力不同。

「嵌合受體(chimeric receptor)」係用於描述經工程改造、人工、或混成之受體蛋白分子之通用用語，其包含源自至少兩種不同蛋白質之胺基酸序列之二或更多個部分。嵌合受體蛋白已經工程改造以賦予細胞在將促效配體結合至受體時起始信號轉導及執行下游功能之能力。例示性「嵌合受體」包括但不限於嵌合抗原受體(CAR)、嵌合融合受體(CFR)、嵌合Fc受體(CFcR)、以及二或更多種受體之融合體。

「嵌合Fc受體(chimeric Fc receptor)」（縮寫為CFcR）係用於描述其天然跨膜及/或胞內信號傳導域經非天然跨膜及/或胞內信號傳導域修飾或取代之經工程改造之Fc受體之用語。在嵌合Fc受體之一些實施例中，除了具有非天然之跨膜域及信號傳導域之一或兩者之外，亦可將一或多個刺激域引入經工程改造之Fc受體之胞內部分，以在觸發受體時增強細胞活化、擴增、及功能。與含有至標靶抗原之抗原結合域之嵌合抗原受體(CAR)不同，嵌合Fc受體結合至Fc片段、或抗體之Fc區、或包含在接合物或結合分子中之Fc區，並在使或不使目標細胞靠近之情況下活化細胞功能。例如，Fcγ受體可經工程改造以在胞內區域中包含所選之跨膜域、刺激域、及/或信號傳導域，其對在胞外域處結合IgG做出反應，從而產生CFcR。在一個實例中，CFcR係藉由工程改造CD16（Fcγ受體）、藉由置換其跨膜域及/或胞內域而產生。為進一步改善基於CD16之CFcR之結合親和力，可結合CD64之胞外域或CD16之高親和力變體（例如，F176V）。在涉及高親和力CD16胞外域之CFcR之一些實施例中，在位置197處包含絲胺酸之蛋白水解切割位點被消除或置換，使得受體之胞外域不可切割，即不易於脫落，從而獲得基於hnCD16之CFcR。

已鑑別CD16（FcγR受體）具有兩種異構體，Fc受體FcγRIIIa (CD16a)及FcγRIIIb (CD16b)。CD16a係一種藉由NK細胞表現之跨膜蛋白，其結合附接至目標細胞之單體IgG，以活化NK細胞，並促進抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。如本文中所使用，「高親和力CD16(high affinity CD16)」、「不可切割之CD16(non-cleavable CD16)」、或「高親和力不可切割之CD16(high affinity non-cleavable CD16)」（縮寫為hnCD16）係指CD16之天然或非天然變體。野生型CD16具有低的親和力，且易發生胞外域脫落，即蛋白水解切割過程，其在NK細胞活化時調控白血球上各種細胞表面分子之細胞表面密度。F176V及F158V係具有高親和力之例示性CD16多態性變體。在近膜區（位置189-212）具有改變或消除之切割位點（位置195-198）之CD16變體不會脫落。切割位點及近膜區在WO2015/148926中有詳細描述，其完整揭露內容以引用方式併入本文中。CD16 S197P變體係CD16之經工程改造之不可切割之版本。包含F158V及S197P二者之CD16變體具有高親和力且不可切割。另一例示性高親和力且不可切割之CD16 (hnCD16)變體係經工程改造之CD16，其包含源自CD64胞外域之3個外顯子中之一或多者之胞外域。

在一些實施例中，本文提供包含一組經工程改造之組分之細胞，其在一般治療腫瘤且具體針對實體腫瘤微環境之上下文中共同彼此互補（且在一些情況下彼此協同）以增強效應細胞之活性。所選之一組經工程改造之組分在本文中被稱為「主鏈」；因為它與將在效應細胞中表現之任何腫瘤抗原結合分子相容，包括但不限於CAR、抗體、雙特異性抗體、及TCR。然而，用語「主鏈(backbone)」並不要求該組之各個組分或者它們在細胞內之位置之間有任何具體的物理關係；儘管某些關聯及/或排列（例如，各個組分中二或更多者之共表現構築體中之順序）可以針對更高的表現水平或加工之容易性以及製造環境中之其他考慮因素而進行優化。例如，主鏈可包含兩個表現匣之整合，每個表現匣位於細胞基因體之不同位置處。在一些實施例中，主鏈包含複數個基因體修飾，諸如插入一或多個多核苷酸及/或用以剔除一或多個基因之修飾。可同時或依序進行修飾。可藉由主鏈之修飾而增加之效應細胞功能之非限制性實例包括以下中之一或多者：在體外或體內無需接觸額外提供之可溶細胞介素而自主改善細胞生長、增殖、擴增、及/或效應細胞功能，以及增強同種異體反應性宿主免疫細胞之歸巢、運輸、耗竭、或減少，及在腫瘤位點處之滯留，其中腫瘤細胞可經敏化以與提供給效應細胞之功能特徵協同作用。本揭露之實體腫瘤靶向主鏈在包含該主鏈之iPSC之上下文中可能特別有益，諸如藉由提供主細胞庫來提供起始細胞之來源，該等起始細胞來源可以藉由簡單地添加用於待治療之適應症之腫瘤抗原結合分子來修飾，然後用作用於分化增強之效應細胞之來源，該來源具有用於一或多種預期腫瘤適應症之治療性質。 I. 可用於過繼細胞療法之具有增強特性之細胞及組成物

本文提供系統性地工程改造無性繁殖iPSC之調控電路系統而不影響iPSC及其衍生性細胞之分化潛能及細胞發育生物學，同時增強自iPSC分化之衍生性細胞之治療性質之策略。iPSC衍生之細胞在功能上得到改善，並且在藉由基因體工程改造在iPSC水平上將選擇性模式之組合引入細胞後，適合過繼細胞療法。先前尚不清楚包含一或多個提供之基因編輯之經改變之iPSC是否仍然具有進入細胞發育及/或成熟並產生功能性分化細胞，同時保留經修改之活性及/或特性之能力。在自iPSC定向細胞分化過程中之意外失敗歸因於以下態樣，包括但不限於發育階段特異性基因表現或其缺乏、對HLA錯合物呈遞之要求、引入之表面表現模式之蛋白質脫落、及對能夠使細胞發生表型及/或功能變化之分化協定進行重新配置之需要。本申請案已經表明，本文提供之一或多種所選之基因體修飾不會負面影響iPSC分化潛能，並且源自經工程改造之iPSC之功能性效應細胞具有增強及/或獲得之治療性質，此歸因於iPSC分化後效應細胞中保留之單獨或組合之基因體修飾。此外，可在iPSC及iPSC衍生之效應細胞之上下文中描述之所有基因體修飾及其組合適用於原代來源之細胞，包括原代免疫細胞諸如T細胞、NK細胞、或免疫調控細胞，無論是培養的還是擴增的，其修飾產生可用於過繼細胞療法之經工程改造之免疫細胞。

此外，儘管已顯示CAR-T細胞在治療若干種血液惡性腫瘤中係有效且強效的，但經工程改造之T細胞療法在解決實體腫瘤方面之成功有限。與均勻表現之抗原係可接近的並且可被有效靶向之液體腫瘤不同，腫瘤通路、缺乏腫瘤特異性抗原標靶、及抗原異質性係實體腫瘤中CAR-T細胞成功發育之顯著障礙。此外，在患者及供體衍生之免疫細胞中所見之固有基因工程改造可變性限制了CAR-T細胞療法之廣泛應用。本申請案提供以實體腫瘤靶向主鏈形式之基因體工程改造形式，以及其他基因模式，以在使用衍生自經工程改造之iPSC之效應細胞之現成過繼細胞療法環境中改善靶向特異性，同時降低腫瘤外效應，以避免同種異體排斥，以及克服抑制性腫瘤微環境，尤其係實體腫瘤之高度挑戰。 1. C-X-C模體趨化因子受體過表現

趨化因子係約7至約16 kDa之均質血清蛋白家族，其最初以其誘導白血球遷移之能力為特徵。大多數趨化因子具有四個特徵性半胱胺酸(Cy)，且根據前兩個半胱胺酸顯示之模體分類為C-X-C（或α，CXC）、C-C（或β）、C（或γ）、及CX3C（或δ）趨化因子類別。根據第一個半胱胺酸前ELR模體(Glu-Leu-Arg)之存在，C-X-C（或α，CXC）次家族進一步分類為兩組：ELR-CXC趨化因子及非ELR-CXC趨化因子。

CXC趨化因子受體2 (CXCR2)，亦稱為CD128、介白素8受體β(IL8Rβ)、或L8受體B型，係主要由嗜中性球、肥大細胞、單核球、及巨噬細胞表現之趨化因子受體。已知CD56 dim NK細胞表現CXCR2，然而其表現可在NK細胞活化時下調。T細胞一般不表現CXCR2。iPSC及iPSC衍生之T細胞不表現CXCR2，且不轉導編碼CXCR2之外源性多核苷酸，如本申請案中所揭示的。趨化因子IL8（亦稱為CXCL8）由單核巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、T淋巴球、上皮細胞、及成纖維細胞分泌，並藉由將嗜中性球引導至感染位點而起趨化因子之作用。CXCL8亦由腫瘤細胞分泌，並促進腫瘤遷移、侵襲、血管生成、及轉移。CXCL8係多種CXC趨化因子受體（包括CXCR1及CXCR2）之配體中之一者。已知結合至CXCR2之額外趨化因子包括但不限於CXCL1、GROβ (CXCL2)、CXCL3、CXCL5、CXCL6、及CXCL7。

CXC趨化因子受體3 (CXCR3)，亦稱為G蛋白偶聯受體9 (GPR9)及CD183，係一種結合至趨化因子CXCL9、CXCL10、及CXCL11之G蛋白偶聯受體。CXCR3主要在經活化之T輔助細胞1型(Th1)淋巴球中表現，但亦存在於自然殺手細胞、巨噬細胞、樹突細胞、及B淋巴球子集中。CXCR3與其配體之相互作用涉及將受體攜帶細胞引導至身體之特定部位，特別係發炎、免疫損傷、及免疫功能障礙之位點。

在各種實施例中，本申請案提供效應細胞或iPSC，其經基因工程改造以包含，除了本文設想及描述之其他編輯外，實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含除其他基因模式外之C-X-C模體趨化因子受體。在各種實施例中，C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3，或其變體。人CXCR2之胺基酸序列之非限制性實例係註冊為UniProtKB No: P25025者。在一個實施例中，CXCR2包含與SEQ ID NO: 1具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2包含與SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含由SEQ ID NO: 2、3、4、5、或6表示之CXCR2異構體。在一些實施例中，CXCR2之變體包含與SSEQ ID NO: 2、3、4、5、及6中之任一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、及6中之任一者具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含與SEQ ID NO: 2、3、4、5、及6中之任一者具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR2之變體包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。如本文及整個申請案中所使用的，兩個序列之間之同一性百分比係序列共有之相同位置數目的函數（即，同一性% =相同位置之#/位置之總# × 100），考慮了缺口數目及每個缺口之長度，其需要被引入用於兩個序列之最佳比對。可使用所屬技術領域公認的數學算法完成序列之比較及兩個序列之間之同一性百分比之決定。 SEQ ID NO: 1 MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL (360 a.a. CXCR2; UniProtKB No: P25025) SEQ ID NO: 2 MEDFNMESDSFEDFW （15 a.a. CXCR2異構體1（CXCR2之殘基1-15）；UniProtKB No: Q6LCZ7） SEQ ID NO: 3 MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFL LSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCK VVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPV LLFRRTVYSSNVSPACYEDM （200 a.a. CXCR2異構體2（CXCR2之殘基1-200）；UniProtKB No: C9JW47） SEQ ID NO: 4 MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFL LSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCK VVSLLKEVNFYSGIL （135 a.a. CXCR2異構體3（CXCR2之殘基1-135）；UniProtKB No: C9JG19） SEQ ID NO: 5 MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFL LSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCK VVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGL （172 a.a. CXCR2異構體4（CXCR2之殘基1-172）；UniProtKB No: C9J1J7） SEQ ID NO: 6 MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFL LSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCK VVSLLKEVNFYSGILLLA （138 a.a. CXCR2異構體5（CXCR2之殘基1-138）；UniProtKB No: C9J2F9）

人CXCR3之胺基酸序列之非限制性實例係註冊為UniProtKB No: P49682者。在一個實施例中，CXCR3包含與SEQ ID NO: 7具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3包含與SEQ ID NO: 7具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3之變體包含由SEQ ID NO: 8或9表示之CXCR3異構體。在一些實施例中，CXCR3之變體包含與SEQ ID NO: 8或9具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3之變體包含與SEQ ID NO: 8或9具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3之變體包含與SEQ ID NO: 8或9具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3之變體包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。在一些實施例中，CXCR3之變體包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列 SEQ ID NO: 7 MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSCCTSPPCPQDFSLNFDRAFLPALYSLLFLLGLLGNGAVAAVLLSRRTALSSTDTFLLHLAVADTLLVLTLPLWAVDAAVQWVFGSGLCKVAGALFNINFYAGALLLACISFDRYLNIVHATQLYRRGPPARVTLTCLAVWGLCLLFALPDFIFLSAHHDERLNATHCQYNFPQVGRTALRVLQLVAGFLLPLLVMAYCYAHILAVLLVSRGQRRLRAMRLVVVVVVAFALCWTPYHLVVLVDILMDLGALARNCGRESRVDVAKSVTSGLGYMHCCLNPLLYAFVGVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETSEASYSGL (368 a.a. CXCR3; UniProtKB No: P49682) SEQ ID NO: 8 MELRKYGPGRLAGTVIGGAAQSKSQTKSDSITKEFLPGLYTAPSSPFPPSQVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSCCTSPPCPQDFSLNFDRAFLPALYSLLFLLGLLGNGAVAAVLLSRRTALSSTDTFLLHLAVADTLLVLTLPLWAVDAAVQWVFGSGLCKVAGALFNINFYAGALLLACISFDRYLNIVHATQLYRRGPPARVTLTCLAVWGLCLLFALPDFIFLSAHHDERLNATHCQYNFPQVGRTALRVLQLVAGFLLPLLVMAYCYAHILAVLLVSRGQRRLRAMRLVVVVVVAFALCWTPYHLVVLVDILMDLGALARNCGRESRVDVAKSVTSGLGYMHCCLNPLLYAFVGVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETSEASYSGL （415 a.a. CXCR3異構體2；UniProtKB No: P49682-2） SEQ ID NO: 9 MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSCCTSPPCPQDFSLNFDRAFLPALYSLLFLLGLLGNGAVAAVLLSRRTALSSTDTFLLHLAVADTLLVLTLPLWAVDAAVQWVFGSGLCKVAGALFNINFYAGALLLACISFDRYLNIVHATQLYRRGPPARVTLTCLAVWGLCLLFALPDFIFLSAHHDERLNATHCQYNFPQGSSSGSGCGCCSCAWAAPTREGSRGSHRLPAGIHPGLRPQRPPTRACEAGIRAPLSPI （267 a.a. CXCR3異構體3；UniProtKB No: P49682-3）

在各種實施例中，將編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸插入原代來源之效應細胞或iPSC之所選之基因座中，用於藉由定向分化衍生包含相同基因編輯之功能性效應細胞。在一些實施例中，用於插入C-X-C模體趨化因子受體之所選之基因座包含安全港基因座、旨在被破壞或剔除之基因座、提供內源性啟動子之基因座，該內源性啟動子提供對外源性基因表現之空間控制及/或時間控制。在一些實施例中，用於C-X-C模體趨化因子受體插入之所選之基因座包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD44、CD58、CD54、CD56、CD71、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT。在一個實施例中，C-X-C模體趨化因子受體插入之所選之基因座係TCR基因座。在一個實施例中，C-X-C模體趨化因子受體插入之所選之基因座係CD38基因座。

在一些實施例中，C-X-C模體趨化因子受體藉由單獨的表現構築體或單一雙順反子或三順反子表現匣與編碼關注多肽之一或多個外源性多核苷酸共表現。在一些實施例中，包含C-X-C模體趨化因子受體及編碼關注多肽之一或多個外源性多核苷酸之單一雙順反子或三順反子表現匣包含2A序列，使得C-X-C模體趨化因子受體及（多個）額外多核苷酸位於單一開讀框(ORF)中。雙順反子設計允許多個多核苷酸在時間及數量兩個方面上之協調表現，並且在相同的控制機制下，該控制機制可經選擇以結合例如用於單一ORF表現之可誘導性啟動子。自切割肽見於小核糖核酸病毒科之成員中，包括口蹄疫病毒屬，諸如口蹄疫病毒(FMDV)、馬鼻炎A病毒(ERAV)、明脈扁刺蛾病毒(TaV)、及豬捷申病毒- 1 (PTV-I)（Donnelly, ML，等人， J. Gen. Virol, 82, 1027-101 (2001)；Ryan, MD，等人， J.Gen.Virol., 72, 2727-2732 (2001)），及心臟病毒，諸如泰勒病毒（例如，泰勒氏鼠腦脊髓炎）及腦心肌炎病毒。衍生自FMDV、ERAV、PTV-I、及TaV之2A肽有時亦被分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」、及「T2A」。在一些實施例中，可與C-X-C模體趨化因子受體共表現之外源性多核苷酸編碼一或多個多肽，包含CAR、CD16或其變體、細胞介素、細胞介素受體、細胞介素信號傳導錯合物、嵌合融合受體、嵌合Fc受體、接合物、檢查點抑制劑、Fc受體、或抗體或其功能變體或片段。在一個實施例中，在雙順反子匣中與C-X-C模體趨化因子受體共表現之外源性多核苷酸不編碼CAR。在一個實施例中，在雙順反子匣中與C-X-C模體趨化因子受體共表現之至少一個外源性多核苷酸編碼外源性CD16。在一些實施例中，包含C-X-C模體趨化因子受體或其變體之原代來源或衍生之效應細胞係T譜系細胞。在一些實施例中，包含C-X-C模體趨化因子受體或其變體之原代來源或衍生之效應細胞係NK譜系細胞。

本申請案中額外提供包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有本文提供之至少一種修飾或表型，包括但不限於C-X-C模體趨化因子受體或其變體，其中該細胞庫提供用於額外工程改造之無性繁殖系經工程改造之iPSC及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品包括但不限於衍生性NK細胞及T細胞，其在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 2.外源性引入之 TGFβ重導向物受體

轉化生長因子β (TGFβ)係在腫瘤發生中具有複雜作用之多潛能免疫抑制細胞介素，包括上皮向間質轉變、血管生成、腫瘤細胞運動性及轉移、癌症相關成纖維細胞(CAF)增殖、及免疫抑制。TGFβ以其潛在形式存在於腫瘤微環境中，且已知部分地藉由Smad介導之標靶基因顆粒酶、穿孔素、及幹擾素之下調來抑制T細胞效應子之功能。此外，TGFβ基因表現簽字之偵測與自腫瘤中排除T細胞及對免疫療法之抗性相關。本申請案之一個態樣提供一種多要件實體腫瘤靶向主鏈設計，其結合合成轉化生長因子β受體(TGFβR)信號傳導重導向物受體，以及本文所設想及描述之其他編輯，以裝備同種異體效應細胞，包括衍生自經基因工程改造之iPSC之彼等細胞，從而在一般腫瘤中且特別在實體腫瘤中具有更好的功效。一般而言，「傳訊（或信號）重導向物受體」或「SRR」藉由將第一受體（例如，TGFβ受體）之胞外域及不同受體（例如，細胞介素受體）之胞內域連接起來，重導向來自該第一受體之胞外域之傳訊通過來自該不同受體之胞內域。在TGFβR之上下文中，在本申請案通篇中，信號傳導重導向物受體可被稱為「TGFβR重導向物」或「TGFβR重導向物受體」或「TGFβ信號重導向物受體」或「TGFβ-SRR」。

在一些實施例中，iPSC及其衍生性細胞包含編碼TGFβ重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸，其包含TGFβR之胞外域(ECD)之部分或完整肽。在一些實施例中，TGFβ重導向物受體包含：(i)轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域或其片段；及(ii)包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合之細胞介素受體之胞內域(ICD)或其片段。

在一些實施例中，包含上述ECD及ICD之TGFβ重導向物受體進一步包含跨膜域(TM)。在各種實施例中，TGFβ重導向物受體之跨膜(TM)域可：(i)來源於提供胞內域之相同分子，(ii)來源於提供胞外域之相同分子，或者(iii)可以被任何其他膜結合蛋白之跨膜域修飾或置換。在一些實施例中，提供TGFβ重導向物受體之胞內域或其片段之細胞介素受體包含IL2R、IL4R、IL6R、IL7R、IL9R、IL10R、IL11R、IL12R、IL15R、IL18R、及IL21R中之至少一者。

在一些實施例中，TGFβR之胞外域(ECD)包含與SEQ ID NO: 10具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβR之胞外域(ECD)包含與SEQ ID NO: 10具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβR之胞外域(ECD)包含與SEQ ID NO: 10具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在一些實施例中，IL2Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 11具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL2Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 11具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL2Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 11具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 12具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 12具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 12具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域之片段包含與SEQ ID NO: 13具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域之片段包含與SEQ ID NO: 13具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域之片段包含與SEQ ID NO: 13具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL12Rβ之胞內域之片段包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列。在一些實施例中，IL18Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 14具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL18Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 14具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL18Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 14具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。在一些實施例中，IL21Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 15具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL21Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 15具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL21Rβ之胞內域(ICD)包含與SEQ ID NO: 15具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 10 TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ （TGFβR之ECD） SEQ ID NO: 11 NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV （IL2Rβ之ICD） SEQ ID NO: 12 HYFQQKVFVLLAALRPQWCSREIPDPANSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLIDWPTPEDPEPLVISEVLHQVTPVFRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLYKVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQHISLSVFPSSSLHPLTFSCGDKLTLDQLKMRCDSLML （IL12Rβ之ICD） SEQ ID NO: 13 SDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ （IL12Rβ之ICD片段） SEQ ID NO: 14 YRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES （IL8Rβ之ICD） SEQ ID NO: 15 SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS （IL21Rβ之ICD）

在一些實施例中，傳訊受體包含TGFβR之胞外域或其片段以及細胞介素受體IL2Rβ之胞內域或其片段，從而形成TGFβR2-IL2Rβ信號傳導重導向物受體。在一些實施例中，傳訊受體包含TGFβR之胞外域或其片段以及細胞介素受體IL12Rβ之胞內域或其片段，從而形成TGFβR2-IL12Rβ信號傳導重導向物受體。在一些實施例中，傳訊受體包含TGFβR之胞外域或其片段以及細胞介素受體IL18Rβ之胞內域或其片段，從而形成TGFβR2-IL18Rβ信號傳導重導向物受體。在一些實施例中，傳訊受體包含TGFβR之胞外域或其片段以及細胞介素受體IL21R之胞內域或其片段，從而形成TGFβR2-IL21R信號傳導重導向物受體。

在一些實施例中，TGFβR2-IL12Rβ信號傳導重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16所示之序列（在申請案通篇中具體稱為TGFβR2-trIL12Rβ）具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβR2-IL12Rβ信號傳導重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβR2-IL12Rβ信號傳導重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16具有至少95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβR2-IL12Rβ信號傳導重導向物受體包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在一些實施例中，包含在SEQ ID NO: 16內之由SEQ ID NO: 17所示之跨膜域(TM)序列可以在序列或長度上有所變化，或者甚至可以被另一跨膜蛋白之跨膜域置換。 SEQ ID NO: 16 TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ VTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVN SDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ (TGFβR2- TM -trIL12Rβ) SEQ ID NO: 17 VTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVN （TGFβR2-trIL12Rβ之例示性及可變部分）

因此，在各種實施例中，本文提供之TGFβ-SRR中之任一者可使用上述構築體設計中之一或多者引入至iPSC中，並在iPSC分化後引入至其衍生性細胞中。除了誘導性多潛能細胞(iPSC)，亦提供包含本文揭示之至少一種經工程改造模式之無性繁殖iPSC、無性繁殖iPS細胞系、或iPSC衍生之細胞。亦提供一種包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有如本部分所述之至少一TGFβ-SRR，其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。

因此，在一些實施例中，本發明提供免疫細胞、iPSC、及iPSC衍生之細胞，其包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含除其他基因模式外之編碼TGFβ重導向物受體（表4中之「TGFβ-SRR」）之多核苷酸，其中該等細胞（諸如衍生性T細胞及NK細胞）可用於克服或減少與腫瘤且特別地與實體腫瘤相關聯之腫瘤微環境抑制。在一些實施例中，iPSC及其衍生性細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含以下中之二或更多者：編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸、編碼TGFβ重導向物受體之多核苷酸、及/或本文所述之一或多種額外基因體編輯，而不會不利地影響iPSC之分化潛能及衍生之效應細胞諸如衍生性T細胞及NK細胞之功能。

亦提供一種包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有編碼TGFβ重導向物受體之至少一外源性引入之多核苷酸及可選地編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸，其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 3.異體免疫防禦受體 (ADR)表現

T細胞及NK細胞之非所要活化通常會促進異體免疫反應，從而導致移植物抗宿主疾病(GvHD)之發生。儘管可採取一些步驟來降低受領者個體中同種異體細胞之反應性，但此類細胞仍然會被受領者之免疫系統（主要係T細胞及NK細胞）所靶向，該免疫系統會將它們辨識為外來物，從而導致排斥並限制治療益處。另一方面來說，調節宿主免疫系統以減少異體免疫反應，例如，藉由使用化學療法（諸如Cy/Flu（環磷醯胺/氟達拉濱））之淋巴球調理，通常會導致相關聯的血液學毒性，包括對嚴重感染之易感性增加，此歸因於不可識別之淋巴球清除及由此導致之嚴重受損之免疫系統。為了控制由於免疫系統之非所要活化而導致之致病病況，在各種實施例中，本申請案提供一種實體腫瘤靶向主鏈，其包含異體免疫防禦受體(ADR)以及其他組分。本申請案之另一態樣提供免疫細胞、iPSC、及iPSC衍生之效應細胞，其經基因工程改造以包含除了本文所設想及描述之其他編輯之外，用於效應細胞增強以及具有上調之4-1BB及/或CD38表現之同種異體反應性宿主NK細胞及T細胞之選擇性耗竭之4-1BB或CD38特異性異體免疫防禦受體(ADR)，後者包括致病性T細胞及調控T細胞，同時保留受領者中之靜息細胞。

在對4-1BB（CD137，亦稱為「41BB」）特異之ADR之一些實施例中，ADR包含當被活化時，靶向在宿主T細胞或NK細胞上被上調之4-1BB之胞外域及促進效應細胞活化之信號傳導域。例如，41BB-ADR胞外域可包含4-1BB之任何合適的配體，包括4-1BBL、靶向4-1BB之抗體（或其功能片段）、Fc與4-1BBL之融合體、或其功能性衍生物或片段。在一些實施例中，41BB-ADR胞外域包含有效結合4-1BB之4-1BBL或其片段。在一些實施例中，41BB-ADR胞外域包含與SEQ ID NO: 145具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR胞外域包含與SEQ ID NO: 145具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR胞外域包含與SEQ ID NO: 145具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR胞外域包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 145 GLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE

在CD38特異性ADR之一個實施例中，CD38-ADR包含包含CD38結合域或其片段之胞外域。在一些實施例中，CD38結合域或其片段來自抗CD38抗體。在一些實施例中，抗CD38抗體包含鼠抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝Ig、單一可變新抗原受體(VNAR)、鯊魚純重鏈抗體(Ig NAR)、嵌合抗體、重組抗體、或其抗體片段。抗體結合域或其片段之非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、單鏈抗原結合片段(scFv)、(scFv)2、二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單域抗原結合片段（sdAb，奈米抗體）、重組純重鏈抗體(VHH)、及保持整個抗體之結合特異性之其他抗體片段。

在一些實施例中，包含在CD38-ADR中之CD38結合域或其片段包含由胺基酸序列表示之重鏈之可變區及/或輕鏈之可變區，該胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 146及147、分別與SEQ ID NO: 148及149、分別與SEQ ID NO: 150及151、分別與SEQ ID NO: 152及153、分別與SEQ ID NO: 154及155、分別與SEQ ID NO: 156及157、分別與SEQ ID NO: 158及159、分別與SEQ ID NO: 160及161、分別與SEQ ID NO: 162及163、分別與SEQ ID NO: 164及165、分別與SEQ ID NO: 166及167、分別與SEQ ID NO: 168及169、分別與SEQ ID NO: 170及171、分別與SEQ ID NO: 172及173、分別與SEQ ID NO: 174及175、分別與SEQ ID NO: 176及177、分別與SEQ ID NO: 178及179、分別與SEQ ID NO: 180及181、分別與SEQ ID NO: 182及183、分別與SEQ ID NO: 184及185、分別與SEQ ID NO: 186及187、或分別與SEQ ID NO: 188及189具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、及/或至少約80%的同一性。例示性CD38結合域之所選之VH及VL序列在表1A中以編號對1-23提供。在一些實施例中，CD38-ADR胞外域包含與表1A中對1-23中任一對之VH及/或VL序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD38-ADR胞外域包含與表1A中對1-23中任一對之VH及/或VL序列具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD38-ADR胞外域包含1A表中對1-23中任一對之VH及/或VL序列之胺基酸序列。［表1A］

	VH	VL
1	QVQLKQSGPSLVQPSQRLSITCTVSGFSLISYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGSTDYNAAFMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYFCAKTLITTGYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 146)	DIQLTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 147)
2	QVELVESGGSLKLSCAASGFDFSRSWMNWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTTSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMTKVRSEDTALYYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 148)	DILMTQSQKIMPTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYDSYPLTFGAGTKLDLK (SEQ ID NO: 149)
3	QVQLKQSGPGLVHPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQSPGKGLEWLGVMWRGGSTDYNAAFMSRLNITKDNSKRQVFFKMNSLQADDTAIYYCAKSMITTGFVMDSWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 150)	DIQLTQSPSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLTWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSNPYTFGGGTKLEIR (SEQ ID NO: 151)
4	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 152)	DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 153)
5	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYSINWVRQAPGQGLEWMGYIDPNRGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREYIYFIHGMLDFWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 154)	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLFIDGNNYLNWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYSSKSATFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 155)
6	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVSNIRSDGSWTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRYWSKSHASVTDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 156)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISAFLNWYQQKPGKAPKLLIYKVSNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSGSITFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 157)
7	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSDISWNGGKTHYVDSVKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSLFHDSSGFYFGHWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 158)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGDNYVSWYQQLPGTAPKLLIYRDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 159)
8	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYDMTWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSDKDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVYYYGFSGPSMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 160)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSDSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCQSYDSSLSGSRVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 161)
10	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMNWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSNYDFWSGYYYGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 162)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSKTVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSYAARSTNIIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 163)
11	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVSRINSDGSSTSYADSMKGQFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGYYYYAMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 164)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGGSSNIGYKTVNWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLNGLVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 165)
12	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTLTSYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTATYFCVRRGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 166)	NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEIYGNGFMNWFQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTEFTLTIDPVEADDVATYYCQQINEDPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 167)
13	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNSGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASSAYLQISNLKNEDTATYFCARRGFVYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 168)	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVAIYGNSFLKWFQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEADDVATYYCQQINEDPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 169)
14	QVQLQQSGAELARPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFKGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 170)	DIVMAQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPKRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 171)
15	NVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSNFGMHWVRQAPEKGLEWVAYIRSGSGTIYYSDTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARSYYDFGAWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 172)	DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQHKPGQSPKIMIYSASSRYSGVPDRFTGSGSGTLFTLTINNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 173)
16	QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTFTDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLASEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 174)	DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVSTVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSPPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 175)
17	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 176)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 177)
18	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAFGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIRFLGIANYAQKFQGRVTLIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGEPGERDPDAVDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 178)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 179)
19	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPHDSDARYSPSFQGQVTFSADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVGWGSRYWYFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 180)	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 181)
20	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAFSWVRQAPGQGLEWMGRVIPFLGIANSAQKFQGRVTITADKSTSTAYMDLSSLRSEDTAVYYCARDDIAALGPFDYWGQGTLVTVSSAS (SEQ ID NO: 182)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 183)
21	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAFGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIRFLGKTNHAQKFQGRVTLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGEPGDRDPDAVDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 184)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 185)
22	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGGTFRSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIVFLGKVNYAQRFQGRVTLTADKSTTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTGEPGARDPDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 186)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 187)
23	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAFGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIRFLGIANYAQKFQGRVTLIADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGEPGERDPDAVDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 188)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 189)

在一些實施例中，41BB-ADR或CD38-ADR之胞外域可可操作地連接至一或多個信號傳導域，該一或多個信號傳導域在分別結合至同種異體反應性宿主免疫細胞之4-1BB或CD38後效應細胞活化時介導下游傳訊。在具體實施例中，ADR包含CD3ζ，其由與SEQ ID NO: 60具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列或其功能性片段表示，或包含CD3ζ衍生物（例如，CD3ζ1XX，其由與SEQ ID NO: 61具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列或其功能性片段表示）。在一些實施例中，CD3ζ包含與SEQ ID NO: 60具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3ζ包含與SEQ ID NO: 60具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3ζ包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3ζ衍生物包含與SEQ ID NO: 61具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3ζ衍生物包含與SEQ ID NO: 61具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD3ζ衍生物包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列。CD3ζ在效應T細胞或NK細胞活化過程中介導下游ITAM衍生之傳訊。其他含ITAM之信號傳導域可包括衍生自DAP12、Fc受體、及其他CD3次單元之彼等域。 SEQ ID NO: 60 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (CD3ζ) SEQ ID NO: 61 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR （ITAM1中含CD3ζ1XX之2個突變）

在一些實施例中，包含信號傳導域之ADR之胞內域進一步包含一、二、三或更多個共刺激域，該等共刺激域增強自表現ADR之效應細胞產生細胞介素。共刺激域可衍生自共刺激蛋白之胞內信號傳導域，包括但不限於CD28、CD27、4-1BB、OX40、ICOS、CD30、HVEM、CD40等。在一些實施例中，包含CD3ζ之ADR進一步包含衍生自4-1BB胞內域之共刺激域。在一些實施例中，胞內域由與SEQ ID NO: 190具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列或其功能性片段表示。在一些實施例中，胞內域包含與SEQ ID NO: 190具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞內域包含與SEQ ID NO: 190具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞內域包含SEQ ID NO: 190之胺基酸序列。在一個實施例中，當ADR在其胞外域中包含4-1BBL時，ADR之共刺激域不衍生自4-1BB。 SEQ ID NO: 190 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR （41BB胞內域-CD3ζ）

ADR之胞內域可經由跨膜域非共價連接至ADR之胞外域。在一些實施例中，ADR包含可係任何種類之跨膜域，只要它允許ADR之CD3ζ組分位於細胞內，並且允許靶向4-1BB或CD38之胞外域位於細胞外即可。在其他情況下，ADR係可溶蛋白，其可結合至經活化T細胞上之各別配體，並藉由交聯TCR（例如，ADR-CD3 T細胞接合蛋白）來促進細胞毒性。在其中胞外域來自具有跨膜域之表面蛋白（例如，CD40）之情況下，ADR可包含來自對應內源性分子之跨膜域。在其中ADR分子包含一或多個共刺激域之一些實施例中，跨膜域(TM)可來自具有共刺激域之相同內源性分子。TM之非限制性實例包括來自CD3、CD8a、CD27、CD28、4-1BB、OX40、及CD4之彼等。

在一些實施例中，ADR包含胞外蛋白質與跨膜域之間之間隔子。在一些實施例中，間隔子可包含相對於ADR可能具有之任何功能而言係惰性的或實質上貢獻很小或沒有貢獻之序列；而在其他情況下，間隔子包含增強ADR之功能及/或使其可偵測及/或能夠被靶向進行抑制之序列。在特定實施例中，間隔子包含有利於偵測表現ADR之細胞之經編碼之蛋白質序列。例如，間隔子可編碼Fc區或其片段，此將允許對表現ADR之細胞進行表面偵測，諸如藉由使用抗Fc抗體。在具體實施例中，間隔子提供結合胞外域之配體與膜之間之分離，以避免潛在的立體障礙。如所屬技術領域中具有通常知識者所理解的，間隔子在序列及/或長度上可有所變化，無論是否預期除了物理分離之外之功能。可包括在ADR中之例示性間隔子係所屬技術領域公知的，包括但不限於IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、或大於一種間隔子之組合。間隔子之長度亦可變化，從約15個胺基酸(a.a.)至約300個a.a或更多。非限制性的例示性間隔肽包括由與SEQ ID NO: 140或141具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列所表示之彼等間隔肽。在一些實施例中，間隔肽包含與SEQ ID NO: 140或141具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔肽包含與SEQ ID NO: 140或141具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔肽包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔肽包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 140 ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL (88 a.a.) SEQ ID NO: 141 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGKKDPK （123 a.a. IgG4鉸鏈-IgG1 CH3）

在4-1BB特異性ADR之一個實施例中，41BB-ADR由與SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 142-144具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，41BB-ADR包含與SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 142-144具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR包含與SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 142-144具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列。在一些實施例中，41BB-ADR包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 18 MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGKKDPK FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR信號肽-41BBL- 間隔子- CD28(TM)- CD3z（信號肽、間隔子、及TM/跨膜域可有所變化） SEQ ID NO: 142 MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGKKDPK FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 信號肽-41BBL- 間隔子- CD28(TM)-CD28(ICD)- CD3z （信號肽、間隔子、及TM/跨膜域可有所變化） SEQ ID NO: 143 MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGKKDPK FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR信號肽-41BBL- 間隔子- CD28(TM)- CD3z1xx（信號肽、間隔子、及TM/跨膜域可有所變化） SEQ ID NO: 144 MEFGLSWLFLVAILKGVQCGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGKKDPK FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR 信號肽-41BBL- 間隔子- CD28(TM)-CD28(ICD)- CD3z1xx （信號肽、間隔子、及TM/跨膜域可有所變化）

在CD38特異性ADR之一個實施例中，CD38-ADR由與SEQ ID NO: 191具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，CD38-ADR包含與SEQ ID NO: 191具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD38-ADR包含與SEQ ID NO: 191具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CD38-ADR包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 191 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPLTFGGGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGGTFRSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIVFLGKVNYAQRFQGRVTLTADKSTTTAYMELSSLRSEDTAVYYCTGEPGARDPDAFDIWGQGTMVTVSS TSTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 信號肽-抗CD38VH- 連接子-抗CD38VL- CD8(TM)-41BB（胞內域）- CD3z （胞內域） （信號肽、連接子、及TM/跨膜域可有所變化）

因此，在一些實施例中，本申請案提供一種實體腫瘤靶向主鏈，其包含編碼對4-1BB或CD38以及主鏈之其他組分特異之ADR之多核苷酸，以使同種異體效應細胞具有選擇性耗竭經活化之宿主免疫細胞之能力，同時藉由腫瘤環境中增加之擴增來增強效應細胞。本申請案亦提供包含實體腫瘤靶向主鏈之免疫細胞、iPSC、及iPSC衍生之效應細胞，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼4-1BB特異性ADR或CD38特異性ADR以及其他所選之組分之多核苷酸，其中該等效應細胞（包括經基因工程改造之T細胞及NK細胞）對宿主免疫系統具有同種異體反應性抗性，該同種異體反應性抗性與用於治療患者中之腫瘤及感染性疾病之效應細胞之同種異體用途相關聯。 4. CD38 剔除

細胞表面分子CD38在衍生自淋巴樣及髓樣譜系之多種血液惡性腫瘤（包括多發性骨髓瘤及CD20陰性B細胞惡性腫瘤）中高度上調，此使其成為抗體療法耗竭癌細胞之有吸引力之標靶。抗體介導之癌細胞耗竭通常歸因於直接細胞凋亡誘導及免疫效應機制諸如ADCC（抗體依賴性細胞介導之細胞毒性）之活化之組合。除了ADCC，與治療性抗體協同之免疫效應機制亦可包括抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。

除了在惡性細胞上高度表現外，CD38亦在漿細胞以及NK細胞及經活化之T細胞及B細胞上表現。在造血過程中，CD38在CD34 ⁺幹細胞以及淋巴樣、紅血球樣、及髓樣之譜系定型之前驅細胞上表現，且在成熟之最後階段其持續至漿細胞階段。作為一種II型跨膜醣蛋白，CD38發揮受體及參與核苷酸代謝產物產生之多功能酶二者之細胞功能。作為酶，CD38催化自NAD ⁺至ADP-核糖之反應之合成及水解，從而產生第二信使CADPR及NAADP，它們刺激鈣自內質網及溶酶體中釋放，此對於細胞黏著之鈣依賴性過程至關重要。作為受體，CD38辨識CD31並調控經活化之NK細胞中之細胞介素釋放及細胞毒性。據報導，CD38亦與脂膜筏中之細胞表面蛋白締合，調控細胞質Ca ²⁺流量，並介導淋巴樣細胞及骨髓細胞中之信號轉導。

在惡性腫瘤治療中，已顯示全身性地使用CD38抗原結合受體轉導之T細胞裂解CD34 ⁺造血前驅細胞、單核球、NK細胞、T細胞、及B細胞之CD38 ⁺部分，從而導致不完全的治療反應，並由於受領者免疫效應細胞功能受損而降低或消除功效。此外，在用達雷木單，一種抗CD38特異性抗體，治療之多發性骨髓瘤患者中，觀察到骨髓及周邊血液中之NK細胞皆減少，然而其他免疫細胞類型諸如T細胞及B細胞不受影響，儘管它們表現CD38（Casneuf等人， Blood Advances. 2017; 1(23):2105-2114）。

不受理論之限制，本申請案包括藉由剔除效應細胞中之CD38來利用CD38靶向癌症治療之全部潛能之策略，從而克服CD38特異性抗體及/或CD38抗原結合域藉由誤殺誘導之效應細胞耗竭或減少。此外，由於CD38在經活化之淋巴球諸如T細胞或B細胞上被上調，因此藉由在同種異體效應細胞之受領者中使用CD38特異性抗體諸如達雷木單抗抑制此等受領者淋巴球之活化，將減少及/或預防針對此等效應細胞之宿主同種異體排斥，從而增加效應細胞之存活及持久性。因此，對抗受領者T細胞、Treg細胞、NK細胞、及/或B細胞活化之CD38特異性抗體、分泌之CD38特異性接合物、或CD38-CAR（嵌合抗原受體）可在過繼細胞轉移前用作使用化學療法諸如Cy/Flu（環磷醯胺/氟達拉濱）進行淋巴球清除之替代物。

此外，當在存在抗CD38抗體或CD38抑制劑之情況下使用CD38 ^-效應細胞靶向CD38 ⁺T細胞及pbNK細胞時，CD38 ⁺同種異體反應性細胞之耗竭增加NAD ⁺（菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸，CD38之受質）之可用性，並減少與NAD ⁺消耗相關之細胞死亡，除其他優點外，此還增強免疫抑制腫瘤微環境中之效應細胞反應，並支持衰老、變性、或發炎疾病中之細胞再生。

此外，本文提供之策略，即CD38剔除，與經設想用於建立本申請案中所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之其他組分及過程相容，從而提供免疫細胞、iPSC、及自其分化之效應細胞，其包含具有額外主鏈編輯之CD38剔除。如本文所揭示的，在各種實施例中，iPSC系或其衍生物中包含之實體腫瘤靶向主鏈包含C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之至少兩者；及CD38剔除。在一些實施例中，所提供之CD38 ^negiPSC系可選地包含本文所述且如表4所示之一或多種額外經工程改造之模式。因此，當CD38靶向治療部分與效應細胞一起使用時，包含實體腫瘤靶向主鏈之此等CD38 ^neg衍生性效應細胞被保護免於誤殺及同種異體排斥，以及其他優點，包括改善之代謝適能、增加之對氧化應激之抗性、及在效應細胞中誘導增強細胞活化及效應子功能之蛋白表現程式。此外，抗CD38單株抗體療法顯著耗竭患者之經活化之免疫系統，而不會對患者之造血幹細胞隔室產生不利影響。CD38 ^neg衍生性細胞具有抵抗CD38抗體介導之耗竭之能力，並且可以與抗CD38抗體或CD38-CAR組合有效投予，而不使用毒性調理劑，從而減少及/或置換基於化學療法之淋巴球清除。

在本文提供之一個實施例中，iPSC系中之CD38剔除係雙等位基因剔除。在另一實施例中，剔除CD38，同時在CD38中之所選之位置處插入一或多個轉殖基因（包括C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及/或本文提供之對4-1BB或CD38特異之ADR）可藉由例如CD38靶向嵌入/剔除(CD38-KI/KO)構築體來達成。在構築體之一些實施例中，構築體包含一對CD38靶向同源臂，用於CD38基因座內之位置選擇性插入。在一些實施例中，預選之靶向位點位於CD38之外顯子內。本文提供之CD38-KI/KO構築體允許（多個）轉殖基因在構築體中包含之CD38內源性啟動子或外源性啟動子下表現。當二或更多個轉殖基因被插入CD38基因座中之所選之位置處時，連接子序列，例如2A連接子或IRES，被置於任何兩個轉殖基因之間。2A連接子編碼衍生自FMDV、ERAV、PTV-I、及TaV之自切割肽（分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」、及「T2A」)，允許自單一翻譯產生單獨的蛋白質。在一些實施例中，構築體中包括絕緣體以降低轉殖基因及/或外源性啟動子緘默之風險。包含在CD38-KI/KO構築體中之外源性啟動子可為CAG，或其他構成性、可誘導性、時間型、組織型、或細胞型特異性啟動子，包括但不限於CMV、EF1α、PGK、及UBC。

在各種實施例中，該iPSC能夠定向分化以產生功能性衍生性造血細胞，包括但不限於具有確定性生血內皮(HE)潛能之中胚層細胞、確定性HE、CD34 ⁺造血細胞、造血幹細胞及前驅細胞、造血多潛能前驅細胞(MPP)、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、骨髓細胞、嗜中性球前驅細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、嗜中性球、樹突細胞、及巨噬細胞。在一些實施例中，CD38陰性效應細胞係衍生自iPSC之NK譜系細胞。在一些實施例中，CD38陰性效應細胞係衍生自iPSC之T譜系細胞。在一些實施例中，iPSC及其衍生性細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含CD38 ^neg及以下中之至少兩者：編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸、編碼TGFβ-SRR之多核苷酸、及編碼41BB-ADR之多核苷酸，並且可選地包括如本文所述之一或多個額外基因體編輯。 5. CD16 嵌入

CD16被鑑別為兩種異構體，Fc受體FcγRIIIa (CD16a; NM_000569.6)及FcγRIIIb (CD16b; NM_000570.4)。CD16a係一種藉由NK細胞表現之跨膜蛋白，其結合附接至目標細胞之單體IgG，以活化NK細胞，並促進抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。CD16b僅由人嗜中性球表現。如本文中所使用，「高親和力CD16」、「不可切割之CD16」、或「高親和力不可切割之CD16」（縮寫為hnCD16）係指各種CD16變體。野生型CD16具有低的親和力，且易發生胞外域脫落，即蛋白水解切割過程，其在NK細胞活化時調控白血球上各種細胞表面分子之細胞表面密度。F176V（在一些出版物中亦稱為F158V）係具有高親和力之例示性CD16多態性變體；而S197P變體係CD16之經基因工程改造之不可切割之版本之實例。包含F176V及S197P二者之經工程改造之CD16變體具有高親和力且不可切割，此在WO2015/148926中更詳細地描述，該出版物之完整揭露內容以引用方式併入本文中。此外，CD16之胞外域基本上由CD64胞外域之至少一部分置換之嵌合CD16受體亦可獲得能夠進行ADCC之CD16受體之期望之高親和力及不可切割特徵。在一些實施例中，嵌合CD16之置換胞外域包含CD64（UniPRotKB_P12314或其異構體或多態性變體）之EC1、EC2、及EC3外顯子中之一或多者。

因此，被引入細胞之外源性CD16之各種實施例包括功能性CD16變體及其嵌合受體。在一些實施例中，功能性CD16變體係高親和力不可切割之CD16受體(hnCD16)。在一些實施例中，hnCD16包含F176V及S197P二者；並且在一些實施例中，包含F176V並且切割區被消除。在一些實施例中，當與例示性序列SEQ ID NO. 19、20、及21中之任一者比較時，hnCD16包含具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、或其間任何百分比之同一性之序列，並且各自包含CD64胞外域之至少一部分。在一些實施例中，hnCD16包含與SEQ ID No. 19-21中之任一者具有至少90%同一性、及可選地F176V、S197P中之一或多者、以及CD64胞外域之至少一部分之胺基酸序列。在一些實施例中，hnCD16包含與SEQ ID No. 19-21中之任一者具有至少95%同一性、及可選地F176V、S197P中之一或多者、以及CD64胞外域之至少一部分之胺基酸序列。在一些實施例中，hnCD16包含SEQ ID NO 19之胺基酸序列。在一些實施例中，hnCD16包含SEQ ID NO 20之胺基酸序列。在一些實施例中，hnCD16包含SEQ ID NO 21之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 19 MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLQLPTPVWFHYQ VSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK （340 a.a. 基於CD64 域之構築； CD16TM； CD16ICD ） SEQ ID NO: 20 MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGLFFPPGYQ VSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK （336 a.a. 基於CD64 外顯子之構築； CD16TM； CD16ICD ） SEQ ID NO: 21 MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYYRNGKAFKFFHWNSNLTILKTNISHNGTYHCSGMGKHRYTSAGISVTVKELFPAPVLNASVTSPLLEGNLVTLSCETKLLLQRPGLQLYFSFYMGSKTLRGRNTSSEYQILTARREDSGLYWCEAATEDGNVLKRSPELELQVLGFFPPGYQ VSFCLVMVLLFAVDTGLYFSV KTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK （335 a.a. 基於CD64 外顯子之構築； CD16TM； CD16ICD ）

因此，本文提供經基因工程改造以包含實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞或iPSC，除本文所設想及描述之其他編輯外，該實體腫瘤靶向主鏈包含外源性CD16或其變體，其中該等效應細胞係來自原代來源或衍生自iPSC分化之細胞，或其中經基因工程改造之iPSC能夠分化為包含引入至iPSC之外源性CD16或其變體之衍生之效應細胞。在一些實施例中，外源性CD16係高親和力不可切割之CD16受體(hnCD16)。在一些實施例中，外源性CD16包含CD64胞外域之至少一部分。在一些實施例中，外源性CD16係基於CD16之嵌合Fc受體(CFcR)之形式，其包含跨膜域、刺激域、及/或並非衍生自CD16之信號傳導域。

在一些實施例中，包含外源性CD16或其變體之原代來源或衍生之效應細胞係NK譜系細胞。在一些實施例中，包含外源性CD16或其變體之原代來源或衍生之效應細胞係T譜系細胞。在一些實施例中，iPSC或效應細胞中包含之外源性CD16或其功能變體在與配體結合時具有高親和力，該配體在此種結合時觸發下游傳訊。結合至外源性CD16或其功能變體之配體之非限制性實例不僅包括ADCC抗體或其片段，而且亦包括辨識CD16或外源性CD16之CD64胞外結合域之雙特異性、三特異性、或多特異性接合物或黏合劑。雙特異性、三特異性、或多特異性接合物或黏合劑之實例在本申請案之下文中進一步描述。因此，本申請案之態樣中之至少一者提供一種包含實體腫瘤靶向主鏈之衍生性效應細胞或其細胞群體，其藉由在衍生性效應細胞上表現之外源性CD16以足以用於治療本申請案中進一步詳述之病況、疾病、或感染之治療性用途之量預載有一或多種預選之ADCC抗體，其中外源性CD16包含CD64或具有F176V及S197P之CD16之胞外結合域。

在一些其他實施例中，外源性CD16包含基於CD16或其變體之CFcR。藉由修飾或置換天然CD16跨膜域及/或胞內域，產生嵌合Fc受體(CFcR)以包含非天然跨膜域、非天然刺激域、及/或非天然信號傳導域。如本文中所使用，用語「非天然(non-native)」意指跨膜域、刺激域、或信號傳導域衍生自除提供胞外域之受體外之不同的受體。在本文之說明中，基於CD16或其變體之CFcR不具有衍生自CD16之跨膜域、刺激域、或信號傳導域。在一些實施例中，外源性基於CD16之CFcR包含衍生自CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、或T細胞受體多肽之非天然跨膜域。在一些實施例中，外源性基於CD16之CFcR包含衍生自CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA4、或NKG2D多肽之非天然刺激/抑制域。在一些實施例中，外源性基於CD16之CFcR包含衍生自CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137 (4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、或NKG2D多肽之非天然信號傳導域。在基於CD16之CFcR之一個實施例中，所提供之嵌合Fc受體包含跨膜域及信號傳導域，二者皆衍生自IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、及NKG2D多肽中之一者。基於CD16之嵌合Fc受體之一個實施例包含NKG2D之跨膜域、2B4之刺激域、及CD3ζ之信號傳導域；其中CFcR之胞外域係衍生自CD64或CD16之胞外域之全長或部分序列，且其中CD16之胞外域包含F176V及S197P。基於CD16之嵌合Fc受體之另一例示性實施例包含CD3ζ之跨膜域及信號傳導域；其中CFcR之胞外域係衍生自CD64或CD16之胞外域之全長或部分序列，其中CD16之胞外域包含F176V及S197P。

如上所述之基於CD16之嵌合Fc受體之各種實施例能夠以高親和力結合至抗體或其片段之Fc區；或結合至雙特異性、三特異性、或多特異性接合物或黏合劑。結合後，嵌合受體之刺激及/或信號傳導域能夠活化效應細胞及分泌細胞介素，並殺滅由抗體或具有腫瘤抗原結合組分以及Fc區之雙特異性、三特異性、或多特異性接合物或黏合劑所靶向之腫瘤細胞。不受理論限制，藉由基於CD16之嵌合Fc受體之非天然跨膜域、刺激域、及/或信號傳導域，或者藉由與胞外域結合之接合物，CFcR可有助於效應細胞之殺滅能力，同時增加效應細胞之增殖及/或擴增潛能。抗體及接合物可以使表現抗原之腫瘤細胞與表現CFcR之效應細胞非常接近，此亦有助於增強對腫瘤細胞之殺滅。雙特異性、三特異性、多特異性接合物或黏合劑之例示性腫瘤抗原包括但不限於B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-鈣黏蛋白、及ROR1。適用於在攻擊腫瘤細胞中接合表現基於CD16之CFcR之效應細胞之一些非限制性例示性雙特異性、三特異性、多特異性接合物或黏合劑包括CD16（或CD64）-CD30、CD16（或CD64）-BCMA、CD16（或CD64）-IL15-EPCAM、及CD16（或CD64）-IL15-CD33。

與在NK細胞活化後自細胞表面切割之由原代NK細胞所表現之內源性CD16不同，衍生性NK細胞中CD16之各種不可切割版本避免CD16脫落並保持恆定表現。在衍生性NK細胞中，不可切割之CD16增加TNFα及CD107a之表現，指示細胞功能性之改善。不可切割之CD16亦增強抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，以及雙特異性、三特異性、或多特異性接合物之結合。ADCC係藉由將CD16結合至抗體塗佈之目標細胞進行之NK細胞介導之裂解機制。在衍生之NK細胞中引入之hnCD16之額外高親和力特性亦使得在將細胞投予需要細胞療法之對象之前，能夠藉由hnCD16將ADCC抗體體外加載至NK細胞。如本文所提供的，在一些實施例中，hnCD16可包含F176V及S197P，或可包含來源於CD64之完整或部分胞外域，如SEQ ID NO: 19、20、或21所例示，或可進一步包含非天然跨膜域、刺激域、及信號傳導域中之至少一者。如所揭示的，本申請案亦提供一種包含實體腫瘤靶向主鏈之衍生性NK細胞或其細胞群體，其以足以用於治療如本申請案中進一步詳述之病況、疾病、或感染之治療用途之量預載有一或多種預選之ADCC抗體。在一些實施例中，預載之CD38抗體係達雷木單抗。在一些實施例中，包含包含外源性CD16或其變體之實體腫瘤靶向主鏈之衍生之NK細胞進一步包含C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之至少兩者，如本文所提供的。在一些實施例中，包含包含C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之至少兩者、以及外源性CD16或其變體之實體腫瘤靶向主鏈之衍生之NK細胞進一步包含CAR。在一些實施例中，該衍生之NK細胞預載有抗HER2抗體（例如，曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）、抗EGFR抗體（例如，西妥昔單抗）、或抗PDL1抗體（例如，阿維魯單抗）中之一或多者。

與原代NK細胞不同，來自原代來源（即，天然/本地來源，諸如周邊血液、臍帶血、或其他供體組織）之成熟T細胞不表現CD16。先前未預料到，包含表現之外源性不可切割之CD16之iPSC不損害T細胞發育生物學，並且能夠分化為功能性衍生性T譜系細胞，其不僅表現外源性CD16，而且亦能夠藉由獲得性ADCC機制執行功能。衍生性T譜系細胞中之此種獲得性ADCC可額外用作雙重靶向及/或拯救在CAR-T細胞療法之情況下經常發生之抗原逃逸之方法，其中腫瘤復發，CAR-T靶向之抗原表現或突變抗原之表現減少或喪失，以避免被CAR（嵌合抗原受體）所辨識。當衍生性T譜系細胞包含藉由外源性CD16獲得之ADCC（包括功能變體及基於CD16之CFcR表現）時並且當抗體靶向與CAR所靶向之腫瘤抗原不同之腫瘤抗原時，該抗體可用於拯救CAR-T抗原逃逸，並減少或預防在CAR-T治療中常見之所靶向腫瘤之復發或再發。此種減少及/或預防抗原逃逸同時達成雙重靶向之策略同樣適用於表現一或多種CAR之NK細胞。

因此，本申請案提供包含實體腫瘤靶向主鏈之衍生性T譜系細胞，該實體腫瘤靶向主鏈包含外源性CD16或其變體。在一些實施例中，本文獲得之T譜系細胞中包含之實體腫瘤靶向主鏈衍生物包含外源性CD16、及C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之至少兩者。在其他實施例中，本文獲得之衍生性T譜系細胞除實體腫瘤靶向主鏈之外還包含CAR。在一些實施例中，包含在衍生性T譜系細胞中之實體腫瘤靶向主鏈中所包含之外源性CD16係包含F176V及S197P之hnCD16。在一些其他實施例中，包含在實體腫瘤靶向主鏈中之hnCD16包含來源於CD64之完整或部分胞外域，如SEQ ID NO: 19、20、或21所例示；或者可以進一步包含非天然跨膜域、刺激域、及信號傳導域中之至少一者。如本文所解釋的，此種衍生性T譜系細胞具有獲得性機制，以用ADCC介導之單株抗體靶向腫瘤，以增強抗體之治療效果。如所揭示的，本申請案亦提供一種包含實體腫瘤靶向主鏈之衍生性T譜系細胞或其細胞群體，其以足以用於治療如下文進一步詳述之病況、疾病、或感染之治療用途之量預載有一或多種預選之ADCC抗體。

如進一步提供的，包含實體腫瘤靶向主鏈及可選地CAR以及外源性CD16或其變體（表4中之「CD16 ^exo」）之細胞或其群體可進一步包含本文描述及/或表4中所示之一或多種額外經工程改造之模式。本申請案中額外提供包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有本文提供之至少一種表型，包括但不限於實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含除其他基因模式外之外源性CD16或其變體，其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品包括但不限於衍生性NK細胞及T細胞，其在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 6.外源性引入之細胞介素信號傳導錯合物

藉由避免臨床相關細胞介素之全身性高劑量投予，在建立細胞介素介導之細胞自主性之同時，降低由於此種做法導致之劑量限制性毒性之風險。為了達成淋巴球自主性而無需額外投予可溶細胞介素，可將包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、及/或其各別受體中之一或多者之部分或全長肽之細胞介素信號傳導錯合物作為實體腫瘤靶向主鏈之一部分引入至細胞，以在表現或不表現細胞介素本身之情況下達成細胞介素信號傳導，從而維持或改善細胞生長、增殖、擴增、及/或效應子功能，同時降低細胞介素毒性之風險。在一些實施例中，所引入之細胞介素及/或其各別用於細胞介素信號傳導之天然或經修飾之受體（信號傳導錯合物）在細胞表面上表現。在一些實施例中，細胞介素信號傳導係構成性地活化。在一些實施例中，細胞介素信號傳導之活化係可誘導的。在一些實施例中，細胞介素信號傳導之活化係瞬時的及/或暫時的。在一些實施例中，細胞表面細胞介素/細胞介素受體之瞬時/暫時表現係藉由反轉錄病毒、仙台病毒、腺病毒、附加體、微環、或包括mRNA之RNA所攜帶之表現構築體進行。

本文提供用於將用於一、二或更多種細胞介素（包括但不限於IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、及IL21）之傳訊之蛋白質錯合物引入細胞之各種構築體設計。例如，在其中信號傳導錯合物係用於IL15之實施例中，跨膜(TM)域可為IL15受體天然的，或者可以被任何其他膜結合蛋白之跨膜域修飾或置換。在各種實施例中，細胞介素信號傳導錯合物包含IL15受體融合體(IL15RF)，其包含全長或部分長度之IL15及全長或部分長度之IL15受體(IL15R)。在一些實施例中，IL15及IL15Rα藉由使用自切割肽來共表現，模擬IL15之反式呈遞，而不消除IL15之順式呈遞。在其他實施例中，IL15Rα藉由連接子在C末端處與IL15融合，模擬反式呈遞而不消除IL15之順式呈遞，並確保IL15係膜結合的。在其他實施例中，具有截短胞內域之IL15Rα藉由連接子在C末端處與IL15融合，模擬IL15之反式呈遞，保持IL15膜結合，並額外消除順式呈遞及/或由正常IL15R藉由其胞內域介導之任何其他潛在的信號轉導途徑。在其他實施例中，IL15Rα與IL15融合而沒有胞內域(IL15∆)，如國際公開案第WO 2019/191495號及第WO 2019/126748號所描述，其中每一公開案之全部揭露內容以引用方式併入本文中。

在各種實施例中，此種截短之構築體包含與SEQ ID NO: 22具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL15/IL15Rα包含與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL15/IL15Rα包含與SEQ ID NO: 22具有至少95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL15/IL15Rα包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。在截短之IL15/IL15Rα之一個實施例中，構築體不包含SEQ ID NO: 22之最後4個胺基酸殘基(KSRQ)，並且包含與SEQ ID NO: 23具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL15/IL15Rα包含與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL15/IL15Rα包含與SEQ ID NO: 23具有至少95%序列同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL15/IL15Rα包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 22 MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQ （379 a.a.；信號及連接子肽係加有底線） SEQ ID NO: 23 MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYL （375 a.a.；信號及連接子肽係加有底線）

在再其他實施例中，可省略IL15Rα之細胞質域，而不會對配備有IL15之效應細胞之自主特徵產生不利影響。在其他實施例中，基本上除去了整個IL15Rα，除了在一端處與IL15融合之Sushi域及在另一端上之跨膜域(mb-Sushi)，可選地在Sushi域與跨膜域之間具有連接子。經融合之IL15/mb-Sushi藉由任何膜結合蛋白之跨膜域在細胞表面處表現。因此，當僅保留IL15之所欲反式呈遞時，藉由IL15Rα之非必要傳訊（包括順式呈遞）被消除。在一些實施例中，包含與Sushi域融合之IL15之組分包含與SEQ ID NO: 24具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，包含與Sushi域融合之IL15之組分包含與SEQ ID NO: 24具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，包含與Sushi域融合之IL15之組分包含與SEQ ID NO: 24具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，包含與Sushi域融合之IL15之組分包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 24 MDWTWILFLVAAATRVHSGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR （242 a.a.；信號及連接子肽係加有底線）

在其他實施例中，天然或經修飾之IL15Rβ藉由連接子在C末端處與IL15融合，從而能夠進行構成性傳訊並維持IL15膜結合及反式表現。在其他實施例中，天然或經修飾之共同受體γC藉由連接子在C末端處與IL15融合，用於細胞介素之構成性傳訊及膜結合反式呈遞。共同受體γC亦被稱為共同γ鏈或CD132，其亦被稱為IL2受體次單元γ或IL2RG。γC係許多介白素受體（包括但不限於IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、及IL21受體）之受體錯合物所共同之細胞介素受體次單元。在其他實施例中，在IL15不存在之情況下形成同二聚體之經工程改造之IL15Rβ可用於產生細胞介素之構成性傳訊。

在其他各種實施例中，細胞介素信號傳導錯合物包含IL7受體融合體(IL7RF)，其包含全長或部分長度之IL7及全長或部分長度之IL7受體。跨膜(TM)域可為IL7受體天然的，或者可以被任何其他膜結合蛋白之跨膜域修飾或置換。在一個實施例中，天然（或野生型）或經修飾之IL7R可以藉由連接子在C末端處與IL7融合，能夠進行構成性傳訊並維持膜結合之IL7。在一些實施例中，此種構築體包含與SEQ ID NO: 25具有至少75%、80%、85%、90%、95%、或99%同一性之胺基酸序列，跨膜域、信號肽、及連接子係可撓的，並且在長度及/或序列上有所變化。在一些實施例中，IL7構築體包含與SEQ ID NO: 25具有至少90%同一性之胺基酸序列，跨膜域、信號肽、及連接子係可撓的，並且在長度及/或序列上有所變化。在一些實施例中，IL7構築體包含與SEQ ID NO: 25具有至少95%同一性之胺基酸序列，跨膜域、信號肽、及連接子係可撓的，並且在長度及/或序列上有所變化。在一些實施例中，IL7構築體包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 25 MDWTWILFLVAAATRVHS DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHS GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMD PILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ （信號肽- IL7- 連接子-IL7R；跨膜域( TM)、信號肽、及連接子在長度及序列上可有所變化）

在另一實施例中，天然或經修飾之共同受體γC藉由連接子在C末端處與IL7融合，用於構成性及膜結合之細胞介素信號傳導錯合物。此外，在IL7不存在之情況下形成同二聚體之經工程改造之IL7R亦可用於產生細胞介素之構成性傳訊。

所屬技術領域中具有通常知識者將理解，上述信號肽及連接子序列係說明性的，並且決不限制它們適於用作信號肽或連接子之變型。所屬技術領域中具有通常知識者已知並可獲得許多合適的信號肽或連接子序列。所屬技術領域中具有通常知識者理解，信號肽及/或連接子序列可被另一序列取代，而不改變由信號肽引導或由連接子連接之功能肽之活性。

在包含CAR及外源性細胞介素及/或細胞介素受體傳訊（細胞介素信號傳導錯合物或「IL」）二者之iPSC及其衍生性細胞中，CAR及IL可在單獨的構築體中表現，或可在包含CAR及IL二者之雙順反子構築體中共表現。在一些進一步的實施例中，信號傳導錯合物可以藉由自切割2A編碼序列連接至CAR表現構築體之5'末端或3'末端。因此，IL信號傳導錯合物（例如，IL7信號傳導錯合物）及CAR可位於單一開讀框(ORF)中。在一個實施例中，信號傳導錯合物包含在CAR-2A-IL或IL-2A-CAR構築體中。當表現CAR-2A-IL或IL-2A-CAR時，自切割之2A肽允許所表現之CAR及IL解離，且然後可將經解離之IL呈遞在細胞表面處，跨膜區錨定在細胞膜中。CAR-2A-IL或IL-2A-CAR雙順反子設計允許CAR及IL信號傳導錯合物在時間及數量二者上協調表現，並且在相同的控制機制下，該控制機制可經選擇以結合例如可誘導性啟動子或對單一ORF之表現具有時間或空間特異性之啟動子。自切割肽見於小核糖核酸病毒科之成員中，包括口蹄疫病毒屬，諸如口蹄疫病毒(FMDV)、馬鼻炎A病毒(ERAV)、明脈扁刺蛾病毒(TaV)、及豬捷申病毒- 1 (PTV-I)（Donnelly, ML，等人， J.Gen.Virol, 82, 1027-101 (2001)；Ryan, MD，等人， J.Gen.Virol., 72, 2727-2732 (2001)），及心臟病毒，諸如泰勒病毒（例如，泰勒氏鼠腦脊髓炎）及腦心肌炎病毒。衍生自FMDV、ERAV、PTV-I、及TaV之2A肽有時亦被分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」、及「T2A」。

本文所揭示之雙順反子CAR-2A-IL或IL-2A-CAR實施例亦設想到用於表現本文提供之任何其他細胞介素或細胞介素信號傳導錯合物，例如，IL2、IL4、IL6、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18、及IL21。在一些實施例中，雙順反子CAR-2A-IL或IL-2A-CAR用於表現IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、及IL21中之一或多者。

在一些實施例中，包含表4中之基因型中任一者之iPSC及其衍生性效應細胞可額外包含破壞TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及染色體6p21區中之任一基因中之至少一者；或者引入HLA-E、4-1BBL、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、TCR、Fc受體、抗體、及表面觸發受體中之至少一者，用於與雙特異性、多特異性、或通用接合物偶合。

因此，在各種實施例中，細胞介素IL15或IL7及/或其受體可使用上述構築體設計中之一或多者被引入至iPSC中，並在iPSC分化後引入至其衍生性細胞中。此外，本文提供一種誘導性多潛能細胞(iPSC)、無性繁殖iPSC、無性繁殖iPS細胞系、或iPSC衍生之細胞，其包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸、編碼TGFβ-SRR之多核苷酸、及41BB-ADR中之二或更多者，以及可選地編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸及/或本文所揭示之一或多種經工程改造之模式。亦提供一種包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸、編碼TGFβ-SRR之多核苷酸、及41BB-ADR中之二或更多者，以及可選地編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸及/或一或多種經工程改造之模式，其中該細胞介素信號傳導錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽，如本部分所述，其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成的、經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品在組成上係定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 7. HLA-I 缺乏及 HLA-II 缺乏

多種HLA I類及II類蛋白在同種異體受領者中之組織相容性必須匹配，以避免同種異體排斥問題。本文提供iPSC細胞系及其自其分化之衍生性細胞，其HLA I類蛋白及/或HLA II類蛋白之表現被消除或實質上降低。HLA I類缺乏可藉由HLA I類基因座（染色體6p21）之任何區之功能性缺失，或HLA I類相關聯基因（包括但不限於β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP1基因、TAP2基因、及Tapasin）之缺失或破壞來達成。例如，B2M基因編碼所有HLA I類異二聚體之細胞表面表現所必需之共同次單元。B2M陰性細胞係HLA-I缺乏。HLA II類缺乏可藉由HLA II類相關聯基因（包括但不限於RFXANK、CIITA、RFX5、及RFXAP）之功能性缺失或破壞來達成。CIITA係轉錄共活化劑，藉由活化II類蛋白表現所需之轉錄因子RFX5來發揮作用。CIITA陰性細胞係HLA-II缺乏。因此，本申請案提供iPSC及其衍生性細胞，其包含HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏，例如藉由缺乏B2M及/或CIITA表現，其中所獲得之衍生性效應細胞藉由消除對MHC（主要組織相容性複合體）匹配之需要且避免被宿主（同種異體）T細胞辨識及殺滅，來達成同種異體細胞療法。

此外，缺乏HLA I類表現導致被宿主NK細胞裂解。因此，除了上述CD38調理以去除經活化之表現CD38之宿主NK細胞之方法外，為了克服此種「自身缺失」反應，可以可選地嵌入HLA-E、HLA-G、或其他非經典HLA-I蛋白，以避免NK細胞辨識及殺滅衍生自經工程改造之iPSC之HLA-I缺乏效應細胞。在一個實施例中，所提供之HLA-I缺乏iPSC及其衍生性細胞進一步包含HLA-G嵌入。

替代地，在一個實施例中，所提供之HLA-I缺乏iPSC及其衍生性細胞進一步包含CD58剔除及CD54剔除中之一或兩者。CD58（或LFA-3）及CD54（或ICAM-1）係起始信號依賴性細胞相互作用，並促進細胞（包括免疫細胞）遷移之黏附蛋白。先前之研究表明，CD58及/或CD54之破壞有效地降低HLA-I缺乏iPSC衍生之效應細胞對同種異體NK細胞殺滅之易感性。儘管已顯示CD58剔除比CD54剔除在減少同種異體NK細胞活化方面具有更高的效率，但CD58及CD54之雙重剔除經證明提供之NK細胞活化減少方面之增強最多。在一些觀察中，對於HLA-I缺乏細胞，CD58及CD54雙重剔除甚至比HLA-G過表現更有效地克服「自我缺失」效應。

如本文所提供，在一些實施例中，iPSC及其衍生性細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含以下中之二或更多者：C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及41BB-ADR，該等細胞係HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏。在一些實施例中，該HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏iPSC及其衍生性細胞係CD58陰性的。在一些其他實施例中，該HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏iPSC及其衍生性細胞係CD54陰性的。在再一些其他實施例中，該HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏iPSC及其衍生性細胞係CD54陰性的及CD58陰性的。此外，在包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之iPSC及其衍生性細胞之一些實施例中，該等細胞係HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏，並且具有編碼HLA-G之外源性多核苷酸。在包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之iPSC及其衍生性細胞之一些實施例中，該等細胞係HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏，且係CD54陰性的。在包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及可選地CD38剔除、外源性CD16或其變體、及CAR之iPSC及其衍生細胞之再一些其他實施例中，該等細胞係HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏，且係CD58陰性的及CD54陰性的。

在一些實施例中，藉由在經活化之受領者免疫細胞中表現靶向上調之表面蛋白之失活CAR以避免同種異體排斥，可繞過針對HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏之工程改造或保持其完整。在一些實施例中，經活化之受領者免疫細胞中上調之表面蛋白包括但不限於CD38、CD25、CD69、CD44、4-1BB、OX40、或CD40L。當細胞表現此種失活CAR時，較佳地該細胞不表現或已剔除CAR所靶向之相同表面蛋白。在一些實施例中，失活CAR包含CD38-CAR、CD25-CAR、CD69-CAR、CD44-CAR、4-1BB-CAR、OX40-CAR、及CD40L-CAR中之至少一者。

本申請案中額外提供包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有本文提供之至少一種表型，包括但不限於本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及HLA修飾（表4中之「HLA」：HLA-I缺乏及/或HLA-I缺乏，具有或沒有HLA-E或HLA-G嵌入，或具有CD58及CD54中一或兩者之剔除），其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成的、經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品包括但不限於衍生性NK細胞及T細胞，其在組成上係定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 8. 細胞表面嵌合融合受體 (CFR)

經工程改造以表現CFR之效應細胞使效應細胞能夠藉由CFR與所選之促效劑結合來起始適當的信號轉導級聯，以增強治療性質。此種增強的效應細胞治療性質包括但不限於增強的活化及細胞毒性、獲得的雙重靶向能力、延長的持久性、改善的運輸及腫瘤浸潤、增強的致敏、活化、或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力、增強的抵抗免疫抑制之能力、改善的拯救腫瘤抗原逃逸之能力、及/或受控的細胞傳訊反饋、代謝、及凋亡。

因此，在一些實施例中，本申請案提供除其他編輯外包含CFR之iPSC及其衍生性細胞，該CFR包含胞外域、跨膜域、及胞內域，其中該胞外域、跨膜域、及胞內域不包含任何內質網(ER)滯留信號或內吞信號。CFR之胞外域用於在與接合物結合時起始信號轉導；跨膜域用於CFR之膜錨定；並且胞內域包含調控（即，活化或失活）所選之傳訊途徑之至少一個信號傳導域，用於增強細胞治療性質，包括但不限於腫瘤殺滅、持久性、遷移性、分化、TME抵消、及/或受控之細胞凋亡。來自CFR之ER滯留信號之消除允許在表現時自身進行CFR細胞表面呈遞，且來自CFR之內吞信號之消除減少CFR內化及表面下調。重要的是選擇既沒有ER滯留亦沒有內吞信號之域組分，或者使用分子工程改造工具自CFR之所選之組分中去除ER滯留信號或內吞信號。此外，本文一些實施例提供之CFR之域係模塊化的，此意味著對於CFR之給定胞內域，CFR之胞外域係可切換的，此取決於待與該CFR一起使用之所選之促效劑（諸如抗體、BiTE、TriKE、或任何其他類型之接合物）之結合特異性。並且對於給定之胞外域及特異性匹配促效劑，胞內域係可切換的，此取決於待活化之期望傳訊途徑。額外地，根據一些實施例之跨膜域對於給定之胞外域及/或給定之胞內域係可切換的，只要跨膜域不包含任何內質網(ER)滯留信號或內吞信號即可。

在一些實施例中，適用於本文所述細胞之CFR之胞外域包含參與細胞間傳訊或相互作用之蛋白質之胞外部分之全長或部分長度。在一些實施例中，CFR之胞外域包含CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、或其任何功能變體或組合及嵌合體之胞外部分之全長或部分長度。在一些實施例中，CFR之胞外域被至少一種促效劑（例如，抗體或接合物（例如，BiTE、BiKE、或TriKE））所辨識，其包含對該CFR之胞外域中包含之表位特異之結合域。在一些實施例中，與表現CFR之細胞一起使用之抗體或接合物結合至該CFR之至少一個胞外表位，其中CFR包含CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、或其任何功能變體或組合/嵌合形式之胞外部分之全長或部分長度。在一些實施例中，接合物辨識至少一種腫瘤抗原，其包含B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-鈣黏蛋白、或ROR1。在CFR胞外域之一些實施例中，ER滯留信號及內吞信號不存在，或者使用基因工程改造方法自CFR胞外域中去除或消除。

在一些實施例中，CFR之胞外域包含CD3ε、CD3γ、CD3δ、或其任何功能變體或組合/嵌合形式之胞外部分之全長或部分長度，以利用基於CD3之促效劑。非限制性例示性基於CD3之促效劑（包括但不限於抗體或接合物）包含CD3×CD19、CD3×CD20、CD3×CD33、博納吐單抗、卡妥索單抗、厄妥索單抗、RO6958688、AFM11、MT110/AMG 110、MT111/AMG211/MEDI-565、AMG330、MT112/BAY2010112、MOR209/ES414、MGD006/S80880、MGD007、及/或FBTA05。在一些實施例中，CFR之胞外域包含NKG2C或其任何功能變體之胞外部分之全長或部分長度，以利用基於NKG2C之促效劑。非限制性例示性基於NKG2C之促效劑（包括但不限於抗體或接合物）包含NKG2C-IL15-CD33、NKG2C-IL15-CD19、及/或NKG2C-IL15-CD20三特異性接合物。在一些其他實施例中，CFR之胞外域包含CD28或其任何功能變體胞外部分之全長或部分長度，以利用基於CD28之促效劑。非限制性例示性基於CD28之促效劑（包括但不限於抗體或接合物）包含15E8、CD28.2、CD28.6、YTH913.12、37.51、9D7 (TGN1412)、5.11A1、ANC28.1/5D10、及/或37407中之至少一者。

在一些實施例中，CFR之胞外域包含CD16、CD64或其任何功能變體或組合/嵌合形式之胞外部分之全長或部分長度，以利用基於CD16或CD64之促效劑。非限制性例示性基於CD16或CD64之促效劑（包括但不限於抗體或接合物）包含IgG抗體，或基於CD16或CD64之接合物。當IgG抗體之Fc部分結合基於CD16或CD64之CFR時，它活化表現CFR之細胞中之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)以及由CFR之胞內域中包含之信號傳導域所賦予之其他增強之治療性質。非限制性例示性基於CD16或CD64之促效劑（包括但不限於抗體或接合物）包含CD16×CD30、CD64×CD30、CD16×BCMA、CD64×BCMA、CD16-IL-EPCAM、或CD64-IL-EPCAM、CD16-IL-CD33、或CD64-IL-CD33中之至少一者，其中TriKE中之「IL」包含包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21之至少一種細胞介素、或其任何功能變體或組合/嵌合形式之全部或一部分。

一般言之，跨膜域係三維蛋白結構，其在膜（諸如生物膜（例如細胞或細胞囊泡之膜）之磷脂雙層）中為熱性穩定的。因此，在一些實施例中，本發明之CFR之跨膜域包含單個α螺旋、若干跨膜α螺旋之穩定錯合物、跨膜β筒、短桿菌素A之β-螺旋或其任何組合。在各種實施例中，CFR之跨膜域包含在膜內之「跨膜蛋白(transmembrane protein)」或「膜蛋白(membrane protein)」之全部或一部分。如本文中所使用，「跨膜蛋白」或「膜蛋白」係位於膜及/或膜內之蛋白質。根據本發明之一些實施例，適於提供包含在CFR中之跨膜域之跨膜蛋白之實例包括但不限於受體、配體、免疫球蛋白、血型醣蛋白、或其組合。在一些實施例中，CFR中包含之跨膜域包含CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD27、CD28、CD40、CD84、CD137、CD166、FcεRIγ、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、CD16、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、T細胞受體（諸如TCRα及/或TCRβ）、菸鹼性乙醯膽鹼受體、GABA受體、或其組合。在一些實施例中，跨膜域包含IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、或其組合之跨膜域之全部或一部分。在一些實施例中，跨膜域包含血型醣蛋白A、血型醣蛋白D、或其組合之跨膜域之全部或一部分。在CFR跨膜域之一些實施例中，ER滯留信號及內吞信號二者皆不存在或使用基因工程改造來去除。在各種實施例中，ER滯留信號及內吞信號二者皆不存在或使用基因工程改造方法自CFR跨膜域中去除或消除。在一些實施例中，跨膜域包含CD3ε、CD28、CD27、CD8、ICOS、或CD4之跨膜域之全部或一部分。

在一些實施例中，本文所述之CFR之胞內域包含活化所選之胞內傳訊途徑之至少一個信號傳導域。在CFR胞內域之各種實施例中，ER滯留信號及內吞信號二者皆不存在或使用基因工程改造方法自其中除去或消除。在一些實施例中，胞內域包含至少一個細胞毒性域。在一些其他實施例中，除了細胞毒性域之外，胞內域可以可選地包含共刺激域、持久性信號傳導域、死亡誘導信號傳導域、腫瘤細胞控制信號傳導域、或其任何組合中之一或多者。在一些實施例中，CFR之細胞毒性域包含CD3ζ、2B4、DAP10、DAP12、DNAM1、CD137 (4-1BB)、IL21、IL7、IL12、IL15、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、或NKG2D之多肽之至少全長或一部分。在一個實施例中，CFR之細胞毒性域包含與CD3ζ之至少一個ITAM（免疫受體酪胺酸活化模體）具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一個實施例中，CFR之細胞毒性域包含經修飾之CD3ζ，其由與SEQ ID NO: 26具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，CFR之細胞毒性域包含與SEQ ID NO: 26具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CFR之細胞毒性域包含與SEQ ID NO: 26具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CFR之細胞毒性域包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 26 MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSAD APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR RGRDPEMGGK PRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR (… ITAM1 … ITAM2 … ITAM3 … )

在一些實施例中，CFR包含胞內域，除了細胞毒性信號傳導域之外，該胞內域進一步包含共刺激域。適用於CFR之共刺激域包括但不限於CD2、CD27、CD28、CD40L、4-1BB、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、2B4、BTLA、DAP10、DAP12、CTLA-4、或NKG2D、或其任何組合之多肽之全長或至少一部分。在CFR之一些實施例中，其共刺激域包含CD28、4-1BB、CD27、CD40L、ICOS、CD2、或其組合之多肽之全長或至少一部分。在一些實施例中，CFR包含胞內域，該胞內域包含CD28之共刺激域及CD3ζ之細胞毒性域（亦稱為「28ζ」）。在一些實施例中，CFR之胞內域之-CD28-CD3ζ部分由與SEQ ID NO: 27具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，CFR之胞內域之-CD28-CD3ζ部分包含與SEQ ID NO: 27具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CFR之胞內域之-CD28-CD3ζ部分包含與SEQ ID NO: 27具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CFR之胞內域之-CD28-CD3ζ部分包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 27 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGE RRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR （153 a.a.CD28共刺激域+ CD3ζITAM）

在一些實施例中，該CFR包含胞內域，除了細胞毒性信號傳導域及/或共刺激域之外，該胞內域進一步包含持久性信號傳導域。適用於CFR之持久性信號傳導域包括但不限於細胞介素受體（諸如IL2R、IL7R、IL15R、IL18R、IL12R、IL23R、或其組合）之胞內域之全部或一部分。此外，受體酪胺酸激酶(RTK)諸如EGFR之胞內域提供腫瘤細胞控制，或腫瘤壞死因子受體(TNFR)諸如FAS提供受控之細胞死亡。

在一些例示性設計中，CFR包含一個CD3次單元之胞外域，在一些其他設計中，CFR包含單鏈異二聚體胞外域，其包含與CD3δ或CD3γ（分別為SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO: 29）之胞外域連接之CD3ε之胞外域。單鏈異二聚體胞外域中之連接子類型及長度可有所變化。在一些實施例中，胞外域包含與SEQ ID NO: 28或29具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外域包含與SEQ ID NO: 28或29具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外域包含與SEQ ID NO: 28或29具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外域包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。在一些實施例中，胞外域包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 28 DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS FKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVA （3ε- 連接子 -3δ；連接子序列及長度可有所變化） SEQ ID NO: 29 DGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMD GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS QSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATIS （3ε- 連接子 -3γ；連接子序列及長度可有所變化）

在本文所述之各種構造中，表現細胞表面之CFR（包括基於CD3之CFR，亦稱為cs-CD3）可充當細胞表面觸發受體，用於與具有所選之結合特異性之分子結合，該等分子包括抗體、接合物、及/或CAR（嵌合抗原受體）。如本文所述，在一些實施例中，包含實體腫瘤靶向主鏈之細胞可選地包含編碼一或多種CFR之多核苷酸，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者。該細胞可為任何類型之細胞，包括人類細胞及非人細胞、多潛能細胞或非多潛能細胞、免疫細胞或免疫調控細胞、APC（抗原呈遞細胞）或餵養細胞、來自原代來源（例如，PMBC）之細胞、或來自經培養或經工程改造之細胞（例如，細胞系、細胞、及/或自iPSC分化之衍生性細胞）之細胞。在一些實施例中，包含如本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及可選地CD38剔除、外源性CD16或其變體、HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏、及一或多種CFR之細胞包含原代或衍生性CD34細胞、造血幹細胞及前驅細胞、造血多潛能前驅細胞、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、T譜系細胞、NKT譜系細胞、NK譜系細胞、或B譜系細胞。在一些實施例中，包含編碼本文所述之一或多種基因模式之多核苷酸之衍生性細胞係藉由分化包含編碼本文所述之一或多種基因模式之多核苷酸之iPSC而獲得之效應細胞。

本申請案中額外提供包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有本文提供之至少一種表型，包括但不限於本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及CFR，其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品包括但不限於衍生性NK細胞及T細胞，其在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 9. 嵌合抗原受體 (CAR) 表現

適用於經基因經工程改造之免疫細胞、iPSC、及其衍生性效應細胞可為所屬技術領域中已知之任何CAR設計。CAR係融合蛋白，其通常包括胞外域、跨膜域、及胞內域，該胞外域包含標靶結合區（例如，抗原辨識域）。在一些實施例中，胞外域可進一步包括信號肽或前導序列及/或間隔子。在一些實施例中，胞內域可進一步包含活化表現CAR之效應細胞之傳訊肽。在一些實施例中，胞內域（或胞內域）之傳訊肽包含2B4、CD2、CD3ζ、CD3ζ1XX、CD8、CD28、CD28H、CD137 (4-1BB)、CS1、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL2Rγ、IL7R、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL21、IL7、IL12、IL15、IL21、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、或NKG2D之多肽之全長或至少一部分。在一個實施例中，CAR之傳訊肽包含與CD3ζ之至少一個ITAM（免疫受體酪胺酸活化模體）具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。例示性N末端信號肽包括MALPVTALLLPLALLLHA (SEQ ID NO: 30; CD8asp)或MDFQVQIFSFLLISASVIMSR (SEQ ID NO: 31; IgKsp)或所屬技術領域中已知之任何信號肽序列或其功能變體。

在一些實施例中，抗原辨識域可特異性結合抗原。在一些實施例中，CAR適於活化表現該CAR之T細胞、NK細胞、或NKT細胞。在一些實施例中，CAR係NK細胞特異的，用於包含NK特異性傳訊組分。在一些實施例中，CAR係NKT細胞特異的，用於包含NKT特異性傳訊組分。在某些實施例中，該T細胞衍生自表現iPSC之CAR，該等iPSC包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈，並且衍生性T細胞可包含T輔助細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調控T細胞、自然殺手T細胞、αβ T細胞、γδ T細胞、或其組合。在某些實施例中，該NK細胞衍生自表現iPSC之CAR，該等iPSC包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈。在某些實施例中，該NKT細胞衍生自表現iPSC之CAR，該等iPSC包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈。

在各種實施例中，抗原辨識區包含鼠抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝Ig、單可變新抗原受體(VNAR)、鯊魚重鏈抗體(Ig-NAR)、嵌合抗體、重組抗體、單域抗體(dAb)、抗獨特型抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、或多聚體抗體、或其抗體片段。抗獨特型抗體特異性地結合至另一抗體之獨特型，其中該獨特型係抗體之抗原決定簇。雙特異性抗體可為BiTE（雙特異性T細胞接合物）或BiKE（雙特異性殺手細胞接合物），且多特異性抗體可為TriKE（三特異性殺手細胞接合物）。抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、Fabc、pFc、Fd、單鏈片段可變區(scFv)、串聯scFv (scFv)2、單鏈Fab (scFab)、二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單域抗原結合片段(sdAb)、駱駝重鏈IgG及Nanobody ^®片段、重組純重鏈抗體(VHH)、及保持抗體之結合特異性之其他抗體片段。在一些實施例中，CAR之抗原結合域包含抗體或其片段之重鏈之CDR1、CDR2、及CDR3 (H-CDR)。在一些實施例中，包含抗體之H-CDR之CAR之抗原結合域進一步包含抗體之輕鏈之CDR (L-CDR)。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性地結合與疾病或病原體相關聯之抗原。在一些實施例中，疾病相關聯之抗原係腫瘤抗原，其中腫瘤可為液態或實體腫瘤。在CAR之一些實施例中，CAR靶向血液惡性腫瘤之抗原，該等血液惡性腫瘤包括但不限於急性及慢性白血病（急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病、多發性骨髓瘤、及骨髓增生不良症候群。

在靶向實體癌抗原之CAR之一些實施例中，該等抗原與肉瘤及腫瘤癌相關聯。在一些實施例中，適於CAR靶向之實體癌包括但不限於膀胱癌、骨癌、腦/CNS癌、乳癌、乳肺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、頭頸癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、轉移癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、皮膚癌、睾丸腫瘤、甲狀腺瘤、尿路上皮癌、及子宮/子宮內膜癌。更具體地，在一些實施例中，CAR靶向與以下疾病相關聯之抗原：腺癌、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、支氣管癌、膽管癌、軟骨肉瘤、絨毛膜癌、結腸癌、尤文氏瘤、纖維肉瘤、膽囊癌、肝細胞癌、肝癌、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴樣惡性腫瘤、髓樣癌、甲狀腺髓樣癌、黑色素瘤、間皮瘤、黏液肉瘤、非小細胞肺癌、骨肉瘤、乳頭狀腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀甲狀腺癌、皮脂腺嗜鉻細胞瘤、腹膜癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤、精原細胞瘤、鱗狀細胞癌、汗腺癌、滑膜肉瘤、滑膜瘤、及腎母細胞瘤。在一些實施例中，CAR靶向CNS腫瘤之抗原，包括但不限於聽神經瘤、星形細胞瘤、CNS淋巴瘤、室管膜瘤、成血管細胞瘤、生殖細胞瘤、神經膠質瘤（包括腦幹神經膠質瘤及混合神經膠質瘤）、膠質母細胞瘤（亦稱為多形性膠質母細胞瘤）、髓母細胞瘤、menangioma、神經母細胞瘤、少突膠質細胞瘤、松果體瘤、視網膜母細胞瘤、神經鞘瘤顱咽管瘤、及腦轉移瘤。

可被CAR靶向之抗原之非限制性實例包括癌胚胎抗原(h5T4)、8H9、9D7、ACPP、α肌動蛋白-4 (ACTN4)、ADAM12、ADRB3、ADGRE2/EMR2、AFP、AKAP-4、ALK、ALPP、ALPPL2、雄激素受體、ASGR1（去唾液酸醣蛋白受體1）、ASGR2（去唾液酸醣蛋白受體2）、AXL、B7H3、B7H6、BAGE、β-連環蛋白、BCR、BCR-ABL、Bigh3、BING-4、BORIS、BRCA1/2、BST2、碳酸酐酶IX (CAIX/CA9)、CA125、C-C模體趨化因子受體1 (CCR1)、CCR4、癌胚抗原(CEA/CECAM5)、鈣活化之氯離子通道2 (CLCA4)、碳水化合物(Le)、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD44v7/8、CD47、CD49f、CD52、CD56、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD97、CD99、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD207、CD269 (BCMA)、CD300LF、CDCl 27、CDH3（p-鈣黏蛋白）、CDH6、鈣黏蛋白19 (CDH19)、CDK4、CFC1、CLCA1、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、CLL-1、c-MET、CML66、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原（例如，細胞表面抗原）、CR1L、CS-1、CSPG4、CXCR2、CXCR5、CXORF61、細胞週期蛋白B1 (CCNB1)、CYP1B1、DLL3、EFNA4、EGFR（或erbB-1）、EGFRvIII、EGF1R、上皮細胞黏附分子/上皮醣蛋白-2(EpCAM/EGP2)、上皮醣蛋白-40(EGFP40)、ELF2M、ENPP3、EphA2、EphA3、EphB2、ERBB2（或HER2/neu）、ERBB3、ERBB4、ERG（TMPRSS2 ETS融合基因）、ETA、ETV6-AML、FAP、葉酸結合蛋白(FBP)、FCAR、FCRL5、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、纖連蛋白、FLT3、葉酸受體-α、(FR-α/FOLR1)、葉酸受體β (FR-β/FOLR2)、FOLR3、Fos相關抗原1 (FOSL1)、FRcc、FZD10、GAGE、神經節苷脂（GM1、FucGM1、GM2、GM3、GD2、o-乙醯基-GD2、GD3）、GloboH、GpA33、Gp75、Gp100、磷脂醯肌醇蛋白聚醣-1 (GPC1)、磷脂醯肌醇蛋白聚醣-2 (GPC2)、磷脂醯肌醇蛋白聚醣-3 (GPC3)、GPNMB、GPR20、GPR27、GPR35、GPR119、GPRC5D、鳥苷酸環化酶C (GC-C)、GUCY2C、HAVCR1、HERV包膜蛋白、HLA-A1、HM1.24、HMWMAA、HPV E6、HPV E7、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、IGFr/IGF1R、IGLL1 (CD179b)、IL11Rα、介白素-13受體次單元α-2 (IL13Rα2)、IL13Rcc2、未成熟層黏連蛋白受體(iLRP)、整合素αVβ3、整合素α5β、整合素B7、細胞間黏附分子1 (ICAM1)、腸羧基酯酶(iCE)、κ-輕鏈、激酶插入域受體(KDR)、KIT、KISS1R、LAIR1、LAGE-1a、LAMP-1、LCK、legumain、Lewis A (CA19.9)、Lewis Y (LeY)、L1細胞黏附分子(L1-CAM)、LILRA2、LILRB2、LIV-1、LMP2、LRRC15、LY6K、LY75、LYPD3、MAD-CT-1、MAD-CT-2、黑色素瘤抗原家族A1 (MAGE-A1)、MC1R、MelanA/MART1、MART2、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣(MCSP)、c-Met、MICA/B、間皮瘤(MSLN)、ML-IAP、MR1、多藥耐藥相關蛋白3 (MRP3)、MS4A12、黏蛋白1 (MUC1, tMUC1)、MUC2、MUC5A、MUC12、MUC16、MUC17、MUC21、Mud、MUM1、MUM2、MUM3、mut hsp70-2、MYCN、NA17、NA88-1、NCAM、Nectin4、NKCSI、NKG2D配體、NPM、NY-BR-1、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、OA1、OGT、OR51E2、OY-TES1、p53、p53突變體、PANX3、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1/半乳醣凝集素8、PDGFR-β、PDL1、骨膜蛋白、PLAC1、PRAME、PRLR、前列腺酶(KLK2, KLK4)、前列腺特異性蛋白(P501S)、PRSS21、聚唾液酸(PSA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PSC1、PRAME前列腺特異性膜抗原(PSMA/FOLH1)、PTK7、QRFPR、RAGE-1、RANKL、Ras、Ras突變體、RCC、RhoC、Ron激酶、ROR1、RU1、RU2、SAGE、SAP1、肉瘤易位斷點、SART3、SIGLEC-15、Sialo-表位CA6、SLC6A3、SLC12A3、SLC13A5、SLC22A1、SLC22A7、SLC30A4、SLC30A8、SLC34A2、SLC45A3、sLe、SLITRK6、SPARC、精子蛋白17 (SP17)、SSEA-4、SSTR1、SSX2、STEAP、sTN、生存蛋白、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、TARP、TEM1/CD248、TEM7R、TEMs、端粒酶、TGF-B受體、TGS5、Tie 2、組織因子(TF)、TIM-3、TMEFF2 (TENB2)、TMEM238、TMPRSS11B、TMPRSS11E、Tn Ag、TNC、TP-3、TRAILR1、TRAILR2、TRBC1、TRBC2、TRF2、TRG、TROP2、TRP1、TRP2、TSHR、TSTA、酪胺酸酶、UGT1A1、UPK1B、UPK2、VEGF、VEGFR、血管內皮生長因子R2 (VEGF-R2)、VTCN1 (B7H4)、腎母細胞瘤蛋白(WT1)、XAGE1、及所屬技術領域中已知之各種病原體抗原。病原體之非限制性實例包括能夠引起疾病之病毒、細菌、真菌、寄生蟲、及原生動物。

可被CAR靶向之實體腫瘤抗原之非限制性實例包括h5T4、8H9、9D7、ACPP、ACTN4、ADAM12、ADRB3、AFP、AKAP-4、ALK、ALPP、ALPPL2、雄激素受體、ASGR1、ASGR2、AXL、B7H3、B7H6、BAGE、β-連環蛋白、BCMA (CD269)、BCR、BCR-ABL、Bigh3、BING-4、BORIS、BRCA1/2、BST2、CAIX/CA9、CA19.9、CA125、CCR1、CCR4、碳水化合物(Le)、CCNB1、CD3、CD4、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD47、CD49f、CD56、CD70、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD97、CD99、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD207、CD300LF、CDCl 27、CDH3、CDH6、CDH19、CDK4、CEA/CECAM5、CFC1、CLCA1、CLCA4、CLDN6、CLDN18.2、CLEC12A、CLL-1、c-MET、CML66、CR1L、CS-1、CSPG4、CXCR2、CXCR5、CXORF61、CYP1B1、DLL3、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、EGP2/EpCAM、EGP40、ELF2M、EMR2、ENPP3、EphA2、EphA3、EphB2、ERBB2 (HER2/neu)、ERBB3、ERBB4、骨膜蛋白、ERG（TMPRSS2 ETS融合基因）、ETA、ETV6-AML、FAP、FBP、FCAR、FCRL5、胎兒AchR、纖連蛋白、FLT3、FR-α/FOLR1、FR-β/FOLR2、FOLR3、FOSL1、FRcc、FZD10、GAGE、神經節苷脂（GM1、FucGM1、GM2、GM3、GD2、o-乙醯基-GD2、GD3）、GloboH、GpA33、Gp75、Gp100、GPC1、GPC2、GPC3、GPNMB、GPR20、GPR27、GPR35、GPR119、GPRC5D、GC-C、GUCY2C、HAVCR1、HER2、HERV-包膜蛋白、HLA-A1、HM1.24、HMWMAA、HPV E6、HPV E7、hTERT、iCE、ICAM1、IGFr/IGF1R、IGLL1 (CD179b)、IL-11Rα、IL13-Rα2、IL-13Rcc2、iLRP、整合素αVβ3、整合素α5β、KDR、KIT、KISS1R、KLK2、KLK4、LAIR1、LAGE-1a、LAMP-1、LCK、豆莢蛋白、LeY、L1-CAM、LILRA2、LIV-1、LILRB2、LMP2、LRRC15、LY6K、LY75、LYPD3、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE-A1、MC1R、MelanA/MART1、MART2、MCSP、MICA/B、ML-IAP、MR1、MRP3、MS4A12、MSLN、MUC1、tMUC1、MUC2、MUC5A、MUC12、MUC16、MUC17、MUC21、Mud、MUM1、MUM2、MUM3、mut hsp70-2、MYCN、NA17、NA88-1、NCAM、Nectin4、NKG2D配體、NPM、NY-BR-1、NY-ESO-1、OA1、OGT、OR51E2、OY-TES1、p53、p53突變體、PANX3、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1/半乳凝集素8、PDGFR-β、PDL1、PLAC1、PRAME、PRLR、P501S、PRSS21、PSA、PSCA、PSC1、PSMA/FOLH1、PTK7、QRFPR、RAGE-1、RANKL、Ras、Ras突變體、RCC、RhoC、Ron激酶、ROR1、RU1、RU2、SAGE、SAP1、肉瘤易位斷點、SART3、SIGLEC-15、Sialo-表位CA6、SLC6A3、SLC12A3、SLC13A5、SLC22A1、SLC22A7、SLC30A4、SLC30A8、SLC34A2、SLC45A3、sLe、SLITRK6、SPARC、SP17、SSEA-4、SSTR1、SSX2、STEAP、sTN、生存蛋白、TAG72、TARP、TEM1/CD248、TEM7R、TEMs、端粒酶、TGF-B受體、TGS5、Tie 2、組織因子(TF)、TIM-3、TMEFF2 (TENB2)、TMEM238、TMPRSS11B、TMPRSS11E、Tn Ag、TNC、TP-3、TRAILR1、TRAILR2、TRF2、TRG、TROP2、TRP1、TRP2、TSHR、TSTA、酪胺酸酶、UGT1A1、UPK1B、UPK2、VEGF、VEGFR、VEGFR-II、VTCN1 (B7H4)、WT1、及XAGE1。

表1B中提供具有對應腫瘤抗原之實體癌之非限制性實例。 ［表1B ］- 例示性實體腫瘤及實體腫瘤相關抗原

癌症類型	抗原	抗體
膀胱癌	HER2、MICA/B、CD207、EFNA4、LY6K、LYPD3、Nectin4、PTK7、SLITRK6、TIM-3、TNC、UPK1B、UPK2	恩諾單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、SLITRK6
骨癌	MICA/B、ADAM12、CCR1、CD99、CD248、EPHA2、GPNMB、LRRC15、TP-3	huM25、DS-8895a變體1、DS-8895a變體2、格巴妥木單抗
腦癌	MICA/B、CD133、DLL3、EGFRvIII、TNC	AMG595、ABT806、洛伐妥珠單抗、迪妥昔珠單抗
乳癌	HER2、MICA/B、ADAM12、ADGRE2/EMR2、CCR4、CD49f、CD133、CDH3（p-鈣黏蛋白）、CLDN6、c-MET、CXCR2、EFNA4、EGFR、EPCAM/EGP2、EPHA2、GPNMB、ICAM1、LAMP-1、LIV-1、LILRB2、LRRC15、LYPD3、MUC1、tMUC1、PRLR、PTK7、Sialo-表位CA6、TNC、TROP2	曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、沙西妥珠單抗、緯拉妥珠單抗、huLiv1-14、Liv1-1.7A4、huLiv1-22、huDS6、格巴妥木單抗、PF-0664720、MEDI-547、DS-8895a變體1、DS-08895a變體2
乳肺癌	HER2、MICA/B、ADGRE2/EMR2、EPCAM/EGP2、ROR1
子宮頸癌	MICA/B、EFNA4、LY6K、MUC1、MUC16、LYPD3、PTK7、SLC12A3、SSTR1	PF-0664720、阿德木單抗、4H11、4H5、huDS6、索非妥珠單抗
膽管癌	MICA/B、tMUC1
結腸直腸癌	HER2、MICA/B、ADAM12、CA19.9、CD3、CD49f、CD133、CEA/CECAM5、CLCA1、c-MET、EFNA4、EPHB2、GPA33、GPR35、GUCY2C、ICAM1、LGR5/GPR49、LRRC15、MS4A12、MUC12、MUC17、TIM-3、TMEM238	huM25、PR1A3、人源化PR1A3、帕尼單抗、西妥昔單抗、尼妥珠單抗、扎蘆木單抗
食道癌	HER2、MICA/B、CA19.9、CD10、CEA/CECAM5、EFNA4、EPHB2、MUC21、TMEM238、TMPRSS11B、TMPRSS11E
膽囊癌	EPCAM/EGP2
胃（胃部）癌	HER2、MICA/B、CEA/CECAM5、CLDN18.2、c-MET、CR1L、EFNA4、EPHB2、LGR5/GPR49、MUC17、PSCA、TIM-3、TMEM238	索非妥珠單抗、阿奈妥單抗、帕妥珠單抗、曲妥珠單抗、人源化PR1A3
神經膠質瘤	MICA/B、ADGRE2/EMR2、CD49f、CD133、EGFR、EGFRvIII、EPHA2、HM1.24、IL13-Rα2
頭頸癌	HER2、MICA/B、ADAM12、CD3、c-MET、EFNA4、LRRC15、LY6K、LYPD3、PTK7、TNC	西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、PF-0664720、帕尼單抗、西妥昔單抗、尼妥珠單抗、扎蘆木單抗
腎臟癌	MICA/B、CD70、CDH6、c-MET、ENPP3、HAVCR1	AGS-16M8F、AGS-16C3、CDX-014之抗體、奧那妥珠單抗
肝癌	MICA/B、ASGR1、ASGR2、C9 (CAIX)、CA19.9、CEA/CECAM5、CCR1、CD3、CD133、EPCAM/EGP2、GPC3、ICAM1、LGR5/GPR49、SLC13A5、SLC22A1、SLC22A7、TIM-3、TRF2、UGT1A1	考曲妥珠單抗、奧普珠單抗、人源化PR1A3
肺癌	HER2、MICA/B、ADAM12、ADGRE2/EMR2、CCR1、CCR4、CD56、CD133、CEA/CECAM5、CXCR2、DLL3、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、FOLR1、GPC3、HM1.24、ICAM1、LILRB2、LRRC15、LY6K、LYPD3、MSLN、MUC1、MUC16、PDL1、PTK7、SLC34A2、TIM-3	帕尼單抗、西妥昔單抗、派姆單抗、納武單抗、阿特珠單抗、及尼妥珠單抗、利法妥珠單抗、阿奈妥單抗、PF-0664720、伐妥珠單抗、洛伐妥珠單抗、利法妥珠單抗、索非妥珠單抗、huDS6、ABT806、AMG595、huM25
間皮瘤	MICA/B、FAP、MSLN
轉移性癌	MICA/B、MSLN、VEGFR-II
神經母細胞瘤	MICA/B、GD2
非小細胞肺癌(NSCLC)	MICA/B、c-MET、EGFR
卵巢癌	HER2、MICA/B、CCR1、CD3、CD133、CLDN6、c-MET、EFNA4、EPCAM/EGP2、FAP、FOLR1、FOLR3、FR-α、FZD10、GPR27、GPR119、LRRC15、MSLN、MUC1、MUC16、PTK7、SLC34A2、sTN、TMEM238、VTCN1	索非妥珠單抗、4H11、4H5、huDS6、伐妥珠單抗、阿奈妥單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、PF-0664720、西羅珠單抗、huM25、利法妥珠單抗
胰臟癌	MICA/B、ADAM12、CA19.9、CFC1、EFNA4、EPCAM/EGP2、ICAM1、LILRB2、LRRC15、MSLN、MUC1、tMUC1、MUC5A、MUC16、MUC17、PSCA、PTK7、SLC30A8	PF-0664720、克利妥珠單抗、4H11、4H5、阿德木單抗、huDS6、索非妥珠單抗、huM25、RG7841
腹膜癌	FOLR3
前列腺癌	MICA/B、ACPP、CD10、CD49f、CD133、EFNA4、OR51E2、PSCA、PSMA/FOLH1、PTK7、SLC30A4、SLC45A3、STEAP、TIM-3、TMEFF2 (TENB2)	米妥昔單抗、J591變體1、J591變體2
腎癌	MICA/B、CD3、CD70、ICAM1、KISS1R、LILRB2、QRFPR、SLC6A3、TIM-3
肉瘤	MICA/B、LRRC15
唾液腺癌	HER2、MICA/B
皮膚癌	CCR4、CD3、CD10、ICAM1
滑膜肉瘤（軟組織癌）	CD99
甲狀腺瘤	MICA/B、CD10、c-MET、PTK7、TSHR
尿路上皮癌	MICA/B、CLDN6、EPCAM/EGP2、SIGLEC-15、TIM-3、UPK2
子宮/子宮內膜癌	HER2、MICA/B、ALPP、ALPPL2、CCR1、CLDN6、EFNA4、EPHB2、FOLR1、LILRB2、LY6K、LYPD3、MUC1、MUC16、PTK7	PF-0664720、阿德木單抗、4H11、4H5、huDS6、索非妥珠單抗、伐妥珠單抗

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域包含對腫瘤抗原特異之抗體之結合域之重鏈CDR (H-CDR)、重鏈及輕鏈CDR（H-CDR及L-CDR）、重鏈可變區(VH)、或重鏈及輕鏈可變區（VH及VL）之單鏈，包括本申請案中例示之彼等。在一些實施例中，CAR係基於包含以下之抗體之結合域來設計：曲妥珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗、奧法木單抗、貝利單抗、伊匹單抗、帕妥珠單抗、曲美木單抗、納武單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、MDX-1105、達西組單抗、烏瑞蘆單抗、MPDL3280A、拉立珠單抗、博納吐單抗、尼妥珠單抗、扎蘆木單抗、奧那妥珠單抗、帕曲妥單抗、克利妥珠單抗、索非妥珠單抗、依決洛單抗、阿德木單抗、阿奈妥單抗、huDS6、利法妥珠單抗、沙西妥珠單抗、PR1A3、人源化PR1A3、人源化Ab2-3、claudiximab、AMG595、ABT806、西羅珠單抗、DS-8895a變體1、DS-8895a變體2、MEDI-547、那吶妥單抗、RG7841、伐妥珠單抗、米妥昔單抗、J591變體1、J591變體2、洛伐妥珠單抗、PF-06647020、緯拉妥珠單抗、西妥珠單抗、緯拉妥珠單抗、huLiv1-14、Liv1-1.7A4、huLiv1-22、4H11、4H5、格巴妥木單抗、奧普珠單抗、恩諾單抗、迪妥昔珠單抗、或考曲妥珠單抗。

因此，在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至膀胱癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向膀胱癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、CD207、EFNA4、LY6K、LYPD3、Nectin4、PTK7、SLITRK6、TIM-3、TNC、UPK1B、或UPK2。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含恩諾單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、或SLITRK6。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至骨癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向骨癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、ADAM12、CCR1、CD99、CD248、EPHA2、GPNMB、LRRC15、或TP-3。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含huM25、DS-8895a變體1、DS-8895a變體2、或格巴妥木單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腦癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向腦癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、CD133、DLL3、EGFRvIII、或TNC。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含AMG595、ABT806、洛伐妥珠單抗、或迪妥昔珠單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至乳癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向乳癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、ADAM12、ADGRE2/EMR2、CCR4、CD49f、CD133、CDH3（p-鈣黏蛋白）、CLDN6、c-MET、CXCR2、EFNA4、EGFR、EPCAM/EGP2、EPHA2、GPNMB、ICAM1、LAMP-1、LIV-1、LILRB2、LRRC15、LYPD3、MUC1、tMUC1、PRLR、PTK7、Sialo-表位CA6、TNC、或TROP2。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、沙西妥珠單抗、緯拉妥珠單抗、huLiv1-14、Liv1-1.7A4、huLiv1-22、huDS6、格巴妥木單抗、PF-0664720、MEDI-547、DS-8895a變體1、或DS-08895a變體2。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至乳肺癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向乳肺癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、ADGRE2/EMR2、EPCAM/EGP2、或ROR1。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至子宮頸/子宮/子宮內膜癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向子宮頸/子宮/子宮內膜癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、EFNA4、LY6K、MUC1、MUC16、LYPD3、PTK7、SLC12A3、或SSTR1。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含PF-0664720、阿德木單抗、4H11、4H5、huDS6、或索非妥珠單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至膽管癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向膽管癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B或tMUC1。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至結腸直腸癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向結腸直腸癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、ADAM12、CA19.9、CD3、CD49f、CD133、CEA/CECAM5、CLCA1、c-MET、EFNA4、EPHB2、GPA33、GPR35、GUCY2C、ICAM1、LGR5/GPR49、LRRC15、MS4A12、MUC12、MUC17、TIM-3、或TMEM238。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含huM25、PR1A3、人源化PR1A3、帕尼單抗、西妥昔單抗、尼妥珠單抗、或扎蘆木單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至食道癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向食道癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、CA19.9、CD10、CEA/CECAM5、EFNA4、EPHB2、MUC21、TMEM238、TMPRSS11B、或TMPRSS11E。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至膽囊癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向膽囊癌相關抗原之CAR特異性結合至EPCAM/EGP2。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至胃/胃部癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向胃/胃部癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、CEA/CECAM5、CLDN18.2、c-MET、CR1L、EFNA4、EPHB2、LGR5/GPR49、MUC17、PSCA、TIM-3、或TMEM238。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含索非妥珠單抗、阿奈妥單抗、帕妥珠單抗、曲妥珠單抗、或人源化PR1A3。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至神經膠質瘤癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向神經膠質瘤癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、ADGRE2/EMR2、CD49f、CD133、EGFR、EGFRvIII、EPHA2、HM1.24、或IL13-Rα2。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至頭頸癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向頭頸癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、ADAM12、CD3、c-MET、EFNA4、LRRC15、LY6K、LYPD3、PTK7、或TNC。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含西妥昔單抗、帕尼單抗、尼妥珠單抗、PF-0664720、帕尼單抗、西妥昔單抗、尼妥珠單抗、或扎蘆木單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腎臟癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向腎臟癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、CD70、CDH6、c-MET、ENPP3、或HAVCR1。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含AGS-16M8F、AGS-16C3、CDX-014之抗體、或奧那妥珠單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至肝癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向肝癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、ASGR1、ASGR2、C9 (CAIX)、CA19.9、CEA/CECAM5、CCR1、CD3、CD133、EPCAM/EGP2、GPC3、ICAM1、LGR5/GPR49、SLC13A5、SLC22A1、SLC22A7、TIM-3、TRF2、或UGT1A1。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含考曲妥珠單抗、奧普珠單抗、或人源化PR1A3。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至肺癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向肺癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、ADAM12、ADGRE2/EMR2、CCR1、CCR4、CD56、CD133、CEA/CECAM5、CXCR2、DLL3、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、FOLR1、GPC3、HM1.24、ICAM1、LILRB2、LRRC15、LY6K、LYPD3、MSLN、MUC1、MUC16、PDL1、PTK7、SLC34A2、或TIM-3。在一些此種實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含帕尼單抗、西妥昔單抗、派姆單抗、納武單抗、阿特珠單抗、及尼妥珠單抗、利法妥珠單抗、阿奈妥單抗、PF-0664720、伐妥珠單抗、洛伐妥珠單抗、利法妥珠單抗、索非妥珠單抗、huDS6、ABT806、AMG595、或huM25。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至間皮瘤細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向間皮瘤相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、FAP、或MSLN。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至轉移癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向轉移癌細胞相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、MSLN、或VEGFR-II。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至神經母細胞瘤細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向神經母細胞瘤相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B或GD2。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至非小細胞肺癌(NSCLC)細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向非小細胞肺癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、c-MET、或EGFR。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至卵巢癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向卵巢癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、CCR1、CD3、CD133、CLDN6、c-MET、EFNA4、EPCAM/EGP2、FAP、FOLR1、FOLR3、FR-α、FZD10、GPR27、GPR119、LRRC15、MSLN、MUC1、MUC16、PTK7、SLC34A2、sTN、TMEM238、或VTCN1。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含索非妥珠單抗、4H11、4H5、huDS6、伐妥珠單抗、阿奈妥單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、PF-0664720、西羅珠單抗、huM25、或利法妥珠單抗。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至胰臟癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向胰臟癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、ADAM12、CA19.9、CFC1、EFNA4、EPCAM/EGP2、ICAM1、LILRB2、LRRC15、MSLN、MUC1、tMUC1、MUC5A、MUC16、MUC17、PSCA、PTK7、或SLC30A8。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含PF-0664720、克利妥珠單抗、4H11、4H5、阿德木單抗、huDS6、索非妥珠單抗、huM25、或RG7841。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腹膜癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向腹膜癌相關抗原之CAR特異性結合至FOLR3。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至前列腺癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向前列腺癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、ACPP、CD10、CD49f、CD133、EFNA4、OR51E2、PSCA、PSMA/FOLH1、PTK7、SLC30A4、SLC45A3、STEAP、TIM-3、或TMEFF2/TENB2。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含米妥昔單抗、或J591變體1或2。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腎癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向腎癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、CD3、CD70、ICAM1、KISS1R、LILRB2、QRFPR、SLC6A3、或TIM-3。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至肉瘤上存在之抗原。在一些實施例中，靶向肉瘤相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B或LRRC15。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至唾液腺癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向唾液腺癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2或MICA/B。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至皮膚癌上存在之抗原。在一些實施例中，靶向皮膚癌相關抗原之CAR特異性結合至CCR4、CD3、CD10、或ICAM1。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至滑膜肉瘤上存在之抗原。在一些實施例中，靶向滑膜肉瘤相關抗原之CAR特異性結合至CD99。

在一些實施例中，抗體特異性結合至甲狀腺癌/腫瘤細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向甲狀腺癌/腫瘤相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、CD10、c-MET、PTK7、或TSHR。

在一些實施例中，抗體特異性結合至尿路上皮癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向尿路上皮癌相關抗原之CAR特異性結合至MICA/B、CLDN6、EPCAM/EGP2、SIGLEC-15、TIM-3、或UPK2。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至子宮/子宮內膜癌細胞上存在之抗原。在一些實施例中，靶向子宮/子宮內膜癌相關抗原之CAR特異性結合至HER2、MICA/B、ALPP、ALPPL2、CCR1、CLDN6、EFNA4、EPHB2、FOLR1、LILRB2、LY6K、LYPD3、MUC1、MUC16、或PTK7。在一些實施例中，該CAR之抗原辨識域包含抗體之H-CDR、H-CDR及L-CDR、VH、或VH及VL之單鏈，該抗體包含PF-0664720、伐妥珠單抗、索非妥珠單抗、4H11、或4H5。

在各種實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至已知與三或更多種癌症類型相關聯之腫瘤抗原（有時稱為「泛腫瘤抗原(pan-tumor antigen)」）。此類泛腫瘤抗原之非限制性集合至少包含ADAM12、ADGRE2/EMR2、CA19.9、CCR1、CCR4、CD3、CD10、CD49f、CD133、CEA/CECAM5、CLDN6、c-MET、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、EPHA2、EPHB2、FOLR1、HER2、ICAM1、LILRB2、LRRC15、LY6K、LYPD3、MICA/B、MSLN、MUC1、tMUC1、MUC16、MUC17、PSCA、PTK7、TIM-3、TMEM238、及TNC，如表2中所例示。 ［表2 ］- 例示性泛腫瘤抗原及相關癌症

抗原	相關癌症
ADAM12	骨癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸癌、肺癌、胰臟癌
ADGRE2/EMR2	乳癌、乳肺癌、神經膠質瘤、肺癌
CA19.9	結腸直腸癌、食道癌、肝癌、胰臟癌
CCR1	骨癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、子宮/子宮內膜癌
CCR4	乳癌、肺癌、皮膚癌
CD3	結腸直腸癌、頭頸癌、肝癌、卵巢癌、腎癌、皮膚癌
CD10	食道癌、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺瘤
CD49f	乳癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、前列腺癌
CD133	腦癌、乳癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌
CEA/CECAM5	結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、肝癌、肺癌
CLDN6	乳癌、卵巢癌、尿路上皮癌、子宮/子宮內膜癌
c-MET	乳癌、結腸直腸癌、胃/胃部癌、頭頸癌、腎臟癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、甲狀腺瘤
EFNA4	膀胱癌、乳癌、子宮癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、子宮/子宮內膜癌
EGFR	乳癌、神經膠質瘤、肺癌、非小細胞肺癌、神經母細胞瘤
EGFRvIII	腦癌、神經膠質瘤、肺癌
EPCAM/EGP2	乳癌、乳肺癌、膽囊癌、肝癌、卵巢癌、尿路上皮癌
EPHA2	骨癌、乳癌、神經膠質瘤
EPHB2	結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、子宮/子宮內膜癌
FOLR1	肺癌、卵巢癌、子宮/子宮內膜癌
HER2	膀胱癌、乳癌、乳肺癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、唾液腺癌
ICAM1	乳癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、腎癌、皮膚癌
LILRB2	乳癌、肺癌、胰臟癌、腎癌、子宮/子宮內膜癌
LRRC15	骨癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、腎癌
LY6K	膀胱癌、子宮頸癌、頭頸癌、肺癌、子宮/子宮內膜癌
LYPD3	膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、肺癌、子宮/子宮內膜癌
MICA/B	膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、乳肺癌、子宮頸癌、膽管癌、結腸直腸癌、食道癌、胃（胃部）癌、神經膠質瘤、頭頸癌、腎臟癌、肝癌、肺癌、間皮瘤、轉移癌、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤、唾液腺癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌、子宮/子宮內膜癌
MSLN	肺癌、轉移癌、間皮瘤、卵巢癌、胰臟癌
MUC1	乳癌、子宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮/子宮內膜癌
tMUC1	乳癌、膽管癌、胰臟癌
MUC16	子宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮/子宮內膜癌
MUC17	結腸直腸癌、胃（胃部）癌、胰臟癌
PSCA	胃（胃部）癌、胰臟癌、前列腺癌
PTK7	膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、甲狀腺瘤、子宮/子宮內膜癌
TIM-3	膀胱癌、結腸直腸癌、胃（胃部）癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、尿路上皮癌
TMEM238	結腸直腸癌、食道癌、胃（胃部）癌、卵巢癌
TNC	膀胱癌、腦癌、乳癌、頭頸癌

因此，在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關ADAM12，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含骨癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸癌、肺癌、或胰臟癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關ADGRE2/EMR2，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、乳肺癌、神經膠質瘤、或肺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CA19.9，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含結腸直腸癌、食道癌、肝癌、或胰臟癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CCR1，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含骨癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CCR4，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、肺癌、或皮膚癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CD3，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含結腸直腸癌、頭頸癌、肝癌、卵巢癌、腎癌、或皮膚癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CD10，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含食道癌、前列腺癌、皮膚癌、或甲狀腺瘤。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CD49f，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、或前列腺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CD133，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含腦癌、乳癌、結腸直腸癌、神經膠質瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、或前列腺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CEA/CECAM5，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、肝癌、或肺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關CLDN6，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、卵巢癌、尿路上皮癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關c-MET，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、結腸直腸癌、胃/胃部癌、頭頸癌、腎臟癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、或甲狀腺瘤。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關EFNA4，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關EGFR，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、神經膠質瘤、肺癌、非小細胞肺癌、或神經母細胞瘤。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關EGFRvIII，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含腦癌、神經膠質瘤、或肺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關EPCAM/EGP2，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、乳肺癌、膽囊癌、肝癌、卵巢癌、或尿路上皮癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關EPHA2，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含骨癌、乳癌、或神經膠質瘤。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關EPHB2，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關FOLR1，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含肺癌、卵巢癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關HER2，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、乳癌、乳肺癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、或唾液腺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關ICAM1，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、結腸直腸癌、肝癌、肺癌、胰臟癌、腎癌、或皮膚癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關LILRB2，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、肺癌、胰臟癌、腎癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關LRRC15，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含骨癌、乳癌、結腸直腸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、或腎癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關LY6K，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、子宮頸癌、頭頸癌、肺癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關LYPD3，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、肺癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關MICA/B，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、骨癌、腦癌、乳癌、乳肺癌、子宮頸癌、膽管癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、神經膠質瘤、頭頸癌、腎臟癌、肝癌、肺癌、間皮瘤、轉移癌、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌、肉瘤、唾液腺癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關MSLN，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含肺癌、轉移癌、間皮瘤、卵巢癌、或胰臟癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關MUC1，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、子宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關tMUC1，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含乳癌、膽管癌、或胰臟癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關MUC16，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含子宮頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關MUC17，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含結腸直腸癌、胃/胃部癌、或胰臟癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關PSCA，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含胃/胃部癌、胰臟癌、或前列腺癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關PTK7，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、甲狀腺瘤、或子宮/子宮內膜癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關TIM-3，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、結腸直腸癌、胃/胃部癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、腎癌、或尿路上皮癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關TMEM238，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、或卵巢癌。

在一些實施例中，CAR之抗原辨識域特異性結合至腫瘤相關TNC，其中包含該CAR及所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞可用於治療一或多種癌症，其至少包含膀胱癌、腦癌、乳癌、或頭頸癌。

在各種實施例中，適用於本文所述細胞之CAR至少包括胞外域、跨膜域、及胞內域。在一些實施例中，CAR之胞內域包含在抗原結合時活化之至少一個信號傳導域。在CAR胞內域之一些實施例中，進一步包括一或多個共刺激域（通常稱為「（多個）額外信號傳導域(additional signaling domain(s))」）以用於最佳化功能。適用於CAR設計之例示性信號轉導蛋白包括但不限於2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ/1XX（即，CD3ζ或CD3ζ1XX）、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL-2Rβ (IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、及CD8。例示性信號轉導蛋白之描述（包括蛋白質之跨膜序列及細胞質序列）在下文提供，並進一步在表3A中提供。［表3A］：

	蛋白質名稱	UniProtKB 登記號	跨膜序列	細胞質序列
2B4	自然殺手細胞受體2B4	Q9BZW8	FLVIIVILSALFLGTLACFCV (SEQ ID NO: 32)	WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS (SEQ ID NO: 54)
4-1BB	腫瘤壞死因子受體超家族成員9	Q07011	IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV (SEQ ID NO: 33)	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 55)
CD16	IgG Fc區受體III-A	P08637	VSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRD (SEQ ID NO: 34)	WKDHKFKWRKDPQDK (SEQ ID NO: 56)
CD2	T細胞表面抗原CD2	P06729	IYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQ (SEQ ID NO: 35)	HQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN (SEQ ID NO: 57)
CD28	T細胞特異性表面醣蛋白CD28	P10747	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 36)	RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 58)
CD28H	含跨膜及免疫球蛋白域之蛋白2	Q96BF3	FLFVLLGVGSMGVAAIVWGAW (SEQ ID NO: 37)	FWGRRSCQQRDSGNSPGNAFYSNVLYRPRGAPKKSEDCSGEGKDQRGQSIYSTSFPQPAPRQPHLASRPCPSPRPCPSPRPGHPVSMVRVSPRPSPTQQPRPKGFPKVGEE (SEQ ID NO: 59)
CD3ζ/1XX	T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈	P20963	LCYLLDGILFIYGVILTALFL (SEQ ID NO: 38)	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 60; CD3ζ) 或 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR （SEQ ID NO: 61；在ITAM1中含2個突變；CD3ζ1XX）
DAP10	造血細胞信號轉導子	Q9UBK5	LLAGLVAADAVASLLIVGAVF (SEQ ID NO: 39)	LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 62)
DAP12	TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白	O43914	GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV (SEQ ID NO: 40)	YFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 63)
DNAM1	CD226抗原	Q15762	GGTVLLLLFVISITTIIVIFL (SEQ ID NO: 41)	NRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV (SEQ ID NO: 64)
FcERIγ	高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ	P30273	CYILDAILFLYGIVLTLLYC (SEQ ID NO: 42)	RLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ (SEQ ID NO: 65)
IL-21R	介白素-21受體	Q9HBE5	GWNPHLLLLLLLVIVFIPAFW (SEQ ID NO: 43)	SLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS (SEQ ID NO: 66)
IL-2Rβ (IL-15Rβ)	介白素-2受體次單元β	P14784	IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI (SEQ ID NO: 44)	NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV (SEQ ID NO: 67)
IL-2Rγ	細胞介素受體共同次單元γ	P31785	VVISVGSMGLIISLLCVYFWL (SEQ ID NO: 45)	ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET (SEQ ID NO: 68)
IL-7R	介白素-7受體次單元α	P16871	PILLTISILSFFSVALLVILACVLW (SEQ ID NO: 46)	KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 69)
KIR2DS2	殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2	P43631	VLIGTSVVKIPFTILLFFLL (SEQ ID NO: 47)	HRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA (SEQ ID NO: 70)
NKG2D	NKG2-D II型整合膜蛋白	P26718	PFFFCCFIAVAMGIRFIIMVA (SEQ ID NO: 48)	IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV (SEQ ID NO: 71)
NKp30	自然細胞毒性觸發受體3	O14931	AGTVLLLRAGFYAVSFLSVAV (SEQ ID NO: 49)	GSTVYYQGKCLTWKGPRRQLPAVVPAPLPPPCGSSAHLLPPVPGG (SEQ ID NO: 72)
NKp44	自然細胞毒性觸發受體2	O95944	LVPVFCGLLVAKSLVLSALLV (SEQ ID NO: 50)	WWGDIWWKTMMELRSLDTQKATCHLQQVTDLPWTSVSSPVEREILYHTVARTKISDDDDEHTL (SEQ ID NO: 73)
NKp46	自然細胞毒性觸發受體1	O76036	GLAFLVLVALVWFLVEDWLS (SEQ ID NO: 51)	RKRTRERASRASTWEGRRRLNTQTL (SEQ ID NO: 74)
CS1	SLAM家族成員7	Q9NQ25	VLLCLLLVPLLLSLFVLGLFL (SEQ ID NO: 52)	WFLKRERQEEYIEEKKRVDICRETPNICPHSGENTEYDTIPHTNRTILKEDPANTVYSTVEIPKKMENPHSLLTMPDTPRLFAYENVI (SEQ ID NO: 75)
CD8	T細胞表面醣蛋白CD8α鏈	P01732	IYIWAPLAGTC (SEQ ID NO: 53)	GVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVVKSGDKPSLSARYV (SEQ ID NO: 76)

在適用於本文所提供之細胞之CAR的一些實施例中，CAR之胞內域包含至少第一信號傳導域，其具有與分別由SEQ ID NO: 54-76所示之2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL-2Rβ (IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一信號傳導域包含與SEQ ID NO: 54-76中之任一者具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一信號傳導域包含與SEQ ID NO: 54-76中之任一者具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一信號傳導域包含SEQ ID NO: 54-76中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR之信號傳導域僅包含2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL-2Rβ (IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域之一部分。在一些實施例中，為CAR信號傳導域選擇之細胞質域之部分包含與ITAM（基於免疫受體酪胺酸之活化模體）、YxxM模體、TxYxxV/I模體、FcRγ、半-ITAM及/或ITT樣模體具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%同一性的胺基酸序列。

在如所提供之CAR之一些實施例中，包含第一信號傳導域之CAR之胞內域進一步包含第二信號傳導域，其包含與分別由SEQ ID NO: 54-76所示之2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL-2Rβ (IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列，其中第二信號傳導域不同於第一信號傳導域。在一些實施例中，第二信號傳導域包含與SEQ ID NO: 54-76中之任一者具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第二信號傳導域包含與SEQ ID NO: 54-76中之任一者具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第二信號傳導域包含SEQ ID NO: 54-76中之任一者之胺基酸序列。

在如所提供之CAR之一些實施例中，包含第一信號傳導域及第二信號傳導域之CAR之胞內域進一步包含第三信號傳導域，其包含與分別由SEQ ID NO: 54-76所示之2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL-2Rβ (IL-15Rβ)、IL-2Rγ、IL-7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列，其中第三信號傳導域不同於第一信號傳導域及第二信號傳導域。在一些實施例中，第三信號傳導域包含與SEQ ID NO: 54-76中之任一者具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第三信號傳導域包含與SEQ ID NO: 54-76中之任一者具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，第三信號傳導域包含SEQ ID NO: 54-76中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，適用於設計CAR胞內域之信號傳導域之信號轉導蛋白進一步包含CD27、OX40、ICOS、PD-1、LAG-3、BTLA或CTLA-4。

在具有僅包含一個信號傳導域之胞內域的CAR之一些例示性實施例中，所述胞內域包含與包括但不限於DNAM1、CD28H、KIR2DS2、DAP12或DAP10之蛋白質的細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%同一性的胺基酸序列。

在具有僅包含兩個不同信號傳導域之胞內域的CAR之一些例示性實施例中，所述胞內域包含以下形式（包括但不限於）的融合細胞質域或其部分：2B4-CD3ζ/1XX（即2B4-CD3ζ或2B4-CD3ζ1XX；下文相同）、2B4-DNAM1, 2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28-CD3ζ/1XX、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4、或NKp46-2B4。

在具有包含三種不同信號傳導域之胞內域的CAR之一些例示性實施例中，所述胞內域包含以下形式（包括但不限於）的融合細胞質域或其部分：2B4-DAP10-CD3ζ/1XX、2B4-IL21R-DAP10、2B4-IL2RB-DAP10、2B4-IL2RB-CD3ζ/1XX、2B4-41BB-DAP10、CD16-2B4-DAP10、或KIR2DS2-2B4-CD3ζ/1XX。

在一些實施例中，CAR之跨膜域包含與CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1、或T細胞受體多肽之跨膜區之全長或一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。在一些其他實施例中，CAR之跨膜域包含與以下之跨膜區之全長或一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列：(a)分別由SEQ ID NO: 32、34-42、47-53所示之2B4、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8；或(b) 2B4、CD28、CD28H、DAP10、DNAM1、KIR2DS2、及NKG2D。在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 32、34-42、47-53中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含與SEQ ID NO: 32、34-42、47-53中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 32、34-42、47-53中之任一者之胺基酸序列。在CAR之一些實施例中，跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質。在CAR之一些其他實施例中，跨膜域及緊接之信號傳導域係來自不同蛋白質。

包含跨膜域(TM)及胞內域之CAR構築體之非限制性實例（標記為： TM-（胞內域））示於表3B中。一般言之，所繪示之CAR構築體各包含跨膜域，及包含衍生自一或多個信號轉導蛋白之細胞質區之一或多個信號傳導域的胞內域。一般言之，跨膜域係三維蛋白結構，其在膜（諸如生物膜（例如細胞或細胞囊泡之膜）之磷脂雙層）中為熱性穩定的。因此，在一些實施例中，適用於本文提供之細胞之CAR之跨膜域包含單一α螺旋、若干跨膜α螺旋之穩定錯合物、跨膜β桶、短桿菌肽A之β螺旋、或其任何組合。在各種實施例中，CAR之跨膜域包含在膜內之「跨膜蛋白(transmembrane protein)」或「膜蛋白(membrane protein)」之全部或一部分。如本文中所使用，「跨膜蛋白」或「膜蛋白」係位於膜及/或膜內之蛋白質。根據本發明之一些實施例，適於提供包含在CAR中之跨膜域之跨膜蛋白之實例包括但不限於受體、配體、免疫球蛋白、血型醣蛋白、或其任何組合。在一些實施例中，包含於CAR中之跨膜域包含2B4、4-1BB、BTLA、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、CS1、CTLA-4、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、ICOS、ICAM-1、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、LAG3、PD1、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、OX40、T細胞受體多肽（諸如TCRα及/或TCRβ）、菸鹼性乙醯膽鹼受體或其任何組合的跨膜域之全部或一部分。

在一些實施例中，包含於CAR胞內域中之一或多個信號傳導域衍生自衍生TM之相同或不同蛋白質。如表3B所示，表示CAR之跨膜域之部分加有底線，胞內域中包含之域出現在括號「()」中，TM及信號傳導域之各者由衍生域序列之信號轉導蛋白之名稱指定。在實施例中，各TM或信號傳導域之胺基酸序列可與指定信號轉導蛋白之對應跨膜或細胞質區之全長或一部分具有約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%同一性。包含如本文所提供之跨膜域及胞內域之例示性CAR構築體包括但不限於： NKG2D-(2B4-IL2RB-CD3ζ)、 CD8-(41BB-CD3ζ1XX)、 CD28-(CD28-2B4-CD3ζ)、 CD28-(CD28-CD3 ζ 1XX)、 CD28H-(CD28H-CD3ζ)、 DNAM1-(DNAM1-CD3ζ)、 DAP10-(DAP10-CD3ζ)、 KIR2DS2-(KIR2DS2-CD3ζ)、 KIR2DS2-(KIR2DS2-DAP10)、 KIR2DS2-(KIR2DS2-2B4)、 CD16-(CD16-2B4-DAP10)、 CD16-(CD16-DNAM1)、 NKp46-(NKp46-2B4)、 NKp46-(NKp46-2B4-CD3ζ)、 NKp46-(NKp46-CD2-DAP10)、 CD2-(CD2-CD3ζ)、 2B4-(2B4-CD3ζ)、 2B4-(2B4-FcERIγ)、及 CS1-(CS1-CD3ζ)。在一些實施例中，上述包含跨膜域及胞內域之例示性CAR構築體之各者包含與表3B中SEQ ID NO: 77-95之各者所示之序列具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或100%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 77-95中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 77-95中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 77-95中之任一者之胺基酸序列。表3B中提供之每個構築體之說明性序列具有格式化之文字，以匹配序列左側之說明中對應區之格式（即，加底線、標準、或粗體文字）。對於表3B之大多數說明性構築體，TM係第一序列區；然而，構築體可包括TM之前之胞外域（參見，例如，表3B中之構築體7），並且可來自與TM相同或不同之蛋白質。在一些實施例中，包含於CAR胞內域中之二或更多個信號傳導域可被一或多個額外序列分開，諸如間隔子或連接子。［表3B］：

構築體	序列域TM-（胞內域）	說明性序列	SEQ ID NO:
1	NKG2D-( 2B4-IL2Rβ- CD3 ζ )	SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPS WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	77
2	CD8-( 41BB- CD3 ζ1XX)	IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR	78
3	CD28-(CD28- 2B4-CD3 ζ)	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	79
4	CD28-(CD28- CD3ζ1XX)	FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR	80
5	CD28H-(CD28H- CD3ζ)	FLFVLLGVGSMGVAAIVWGAWFWGRRSCQQRDSGNSPGNAFYSNVLYRPRGAPKKSEDCSGEGKDQRGQSIYSTSFPQPAPRQPHLASRPCPSPRPCPSPRPGHPVSMVRVSPRPSPTQQPRPKGFPKVGEE RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	81
6	DNAM1-(DNAM1- CD3ζ)	GGTVLLLLFVISITTIIVIFLNRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	82
7	DAP10-(DAP10- CD3ζ)	TTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP LLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	83
8	KIR2DS2-(KIR2DS2- CD3ζ)	VLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	84
9	KIR2DS2-(KIR2DS2- DAP10)	VLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG	85
10	KIR2DS2-(KIR2DS2- 2B4)	VLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQEPAGNRTVNSEDSDEQDHQEVSYA WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS	86
11	CD16-(CD16- 2B4-DAP10)	VSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG	87
12	CD16-(CD16- DNAM1)	VSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK NRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV	88
13	NKp46-(NKp46- 2B4)	MGLAFLVLVALVWFLVEDWLSRKRTRERASRASTWEGRRRLNTQTL WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS	89
14	NKp46-(NKp46- 2B4-CD3 ζ)	MGLAFLVLVALVWFLVEDWLSRKRTRERASRASTWEGRRRLNTQTL WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	90
15	NKp46-(NKp46- CD2-DAP10)	MGLAFLVLVALVWFLVEDWLSRKRTRERASRASTWEGRRRLNTQTL KRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG	91
16	CD2-(CD2- CD3ζ)	IYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSN RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	92
17	2B4-(2B4- CD3ζ)	FLVIIVILSALFLGTLACFCVWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	93
18	2B4-(2B4- FcERIγ)	FLVIIVILSALFLGTLACFCVWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS RLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQ	94
19	CS1-(CS1- CD3ζ)	VLLCLLLVPLLLSLFVLGLFLWFLKRERQEEYIEEKKRVDICRETPNICPHSGENTEYDTIPHTNRTILKEDPANTVYSTVEIPKKMENPHSLLTMPDTPRLFAYENVI RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	95

在一些實施例中，胞外域可進一步包括信號肽或前導序列及/或間隔子/鉸鏈。在一些實施例中，在抗原辨識區/域與CAR之跨膜區之間存在間隔子/鉸鏈，然而在一些其他實施例中不需要此種間隔子/鉸鏈。可包括在CAR或ADR中之例示性間隔子係所屬技術領域公知的，包括但不限於IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、或大於一種間隔子之組合。間隔子之長度亦可變化，從約15個胺基酸(a.a.)至約300個a.a或更多。在本申請案中，為了便於描述，小於約80個a.a之間隔子，例如10至80個a.a被認為是短的；約80至180個a.a之間隔子被認為是中等的；且大於180個a.a之間隔子被認為是長的。非限制性的例示性間隔肽包括由與SEQ ID NO: 96-100中之任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列所示之彼等間隔肽。在一些實施例中，間隔肽包含與SEQ ID NO: 96-100中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔肽包含與SEQ ID NO: 96-100中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，間隔肽包含SEQ ID NO: 96-100中之任一者之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 96 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP (39 a.a.) SEQ ID NO: 97 ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL (88 a.a.) SEQ ID NO: 98 ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLT (89 a.a.) SEQ ID NO: 99 ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (129 a.a.) SEQ ID NO: 100 ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (229 a.a.)

在一個實施例中，本文提供之CAR包含衍生自CD28之共刺激域及包含CD3ζ之天然或經修飾之ITAM1之信號傳導域，其由與SEQ ID NO: 80具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，信號傳導域包含與SEQ ID NO: 80具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，信號傳導域包含與SEQ ID NO: 80具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，信號傳導域包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列。在另一實施例中，CAR包含衍生自CD28之共刺激域，並且CD3ζ之天然或經修飾之ITAM1亦包含鉸鏈域（或「間隔子」）及衍生自CD28之跨膜域，其中scFv可藉由鉸鏈連接至跨膜域，並且CAR包含與SEQ ID NO: 101具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列，其中間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 101具有至少80%同一性之胺基酸序列，其中間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 101具有至少90%同一性之胺基酸序列，其中間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 101具有至少95%同一性之胺基酸序列，其中間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 101 ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR （間隔子-CD28 TM-CD28 Costim-CD3ζ1XX 活化）

在另一實施例中，適用於本文提供之細胞之CAR包含衍生自NKG2D之跨膜域、衍生自2B4之共刺激域、及包含天然或經修飾之CD3ζ之信號傳導域，其由與SEQ ID NO: 102具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 102具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 102具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 102之胺基酸序列。包含衍生自NKG2D之跨膜域、衍生自2B4之共刺激域、及包含天然或經修飾之CD3ζ之信號傳導域的所述CAR可進一步包含鉸鏈。 SEQ ID NO: 102 SNLFVASWIAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(263 a.a NKG2D TM-2B4- CD3ζ)

在一個實例中，經基因工程改造之免疫細胞、iPSC、及衍生性效應細胞包含本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈及CAR，該CAR包含對腫瘤細胞表面HER2抗原特異之抗原辨識區。除非另有說明，否則本申請案中HER2-CAR之抗原結合域基於CasMab250（HER2癌症特異性單株抗體(CasMab)）之CDR，並且該基於CasMab250之HER2-CAR在本申請案中有時亦稱為「CasMab250-CAR」。在一些實施例中，HER2-CAR之胞外域之抗原辨識域包含重鏈可變(VH)域，其包含包含SEQ ID NO: 103 (NYGMS)之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104 (TINNNGGGTYYPDSVKG)之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105 (PGLLWDA)之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及輕鏈可變(VL)域，其包含包含SEQ ID NO: 106 (KSSQSLLDSDGRTYLN)之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107 (LVSKLDS)之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108 (WQGTHFPQT)之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)。

在一些實施例中，當與SEQ ID NO: 109所示之例示性序列相比時，CAR之抗原結合域包含具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、或其間任何百分比之序列同一性之VH域。在一些實施例中，VH域包含與SEQ ID NO: 109具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含與SEQ ID NO: 109具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，VH域包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列。在一些實施例中，當與SEQ ID NO: 110所示之例示性序列相比時，CAR之抗原結合域包含具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、或其間任何百分比之序列同一性之VL域。在一些實施例中，VL域含與SEQ ID NO: 110具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域包含與SEQ ID NO: 110具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，VL域含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 109 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDRRLELVATINNNGGGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTSPGLLWDAWGAGTTVTVSS SEQ ID NO: 110 DVVMTQTPLTLSVSIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGAPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK

在一些實施例中，CAR之抗原結合域包含具有N至C端定向之單鏈可變片段(scFV)，scFV包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中連接子在長度及序列上有所變化。在一些實施例中，當與SEQ ID NO: 111-114所示之例示性序列相比時，連接子具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、或其間任何百分比之序列同一性。在一些實施例中，連接子包含與SEQ ID NO: 111-114中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子包含與SEQ ID NO: 111-114中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 111-114中之任一者之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 111 GSTSGGGSGGGSGGGGSS SEQ ID NO: 112 GSTSGSGKPGSGEGSTKG SEQ ID NO: 113 SSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 114 GGGGSGGGGSGGGGS

在一些實施例中，CAR之抗原結合域包含單鏈可變片段(scFV)，當與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116所示之例示性序列相比時，其具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、或其間任何百分比之序列同一性，其中SEQ ID NO: 115及116之各者包含在長度及/或序列上可有所變化之連接子。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 115或116具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 115或116具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 115 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDRRLELVATINNNGGGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTSPGLLWDAWGAGTTVTVSSGSTSGGGSGGGSGGGGSSDVVMTQTPLTLSVSIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGAPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 116 DVVMTQTPLTLSVSIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGAPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDRRLELVATINNNGGGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTSPGLLWDAWGAGTTVTVSS

在一個實施例中，本文提供之CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列，其中胞外域中之連接子及胞外域與跨膜域之間之間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%同一性之胺基酸序列，其中胞外域中之連接子及胞外域與跨膜域之間之間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約95%同一性之胺基酸序列，其中胞外域中之連接子及胞外域與跨膜域之間之間隔子在長度及序列上可有所變化。在一些實施例中，CAR包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列。在一些實施例中，本文所提供之CAR辨識對實體腫瘤之細胞具特異性的HER2抗原。在一些實施例中，本文所提供之CAR辨識腫瘤之HER2抗原，包含乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、食道癌、唾液腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸直腸癌、或頭頸癌。在又一些其他實施例中，本文所提供之CAR辨識腫瘤之HER2抗原，且不對非癌細胞或正常細胞上表現之HER2作出回應或具有低水平之回應。 SEQ ID NO: 117 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSNYGMSWVRQTPDRRLELVATINNNGGGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTSPGLLWDAWGAGTTVTVSS GSTSGGGSGGGSGGGGSSDVVMTQTPLTLSVSIGQPASISCKSSQSLLDSDGRTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGAPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR （抗 -HER2 scFV[ 連接子] -間隔子-CD28 TM- CD28 Costim-CD3ζ1XX 活化）

在另一實例中，經基因工程改造之免疫細胞、iPSC、及衍生性效應細胞包含本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈及CAR，該CAR包含靶向腫瘤抗原MICA及MICB (MICA/B)之抗原辨識區。在MICA/B靶向CAR之一些實施例中，抗原辨識區係特異性結合至MICA及MICB之保守α3域之scFV。在一個實施例中，scFV包含由與SEQ ID NO: 118具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示之重鏈可變區，及由與SEQ ID NO: 119具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示之輕鏈可變區。在一些實施例中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 118具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 118具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 119具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 119具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 119之胺基酸序列。在MICA/B scFV之一個實施例中，scFV由與SEQ ID NO: 120具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 120具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 120具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列。在MICA/B scFV之另一實施例中，scFV由與SEQ ID NO: 121具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 121具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 121具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 118 QIQLVQSGPELKKPGETVKVSCKASGYMFTNYAMNWVKQAPEKGLKWMGWINTHTGDPTYADDFKGRIAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRTYGNYAMDYWGQGTSVTVSS （118AA. MICA/B scFV重鏈(HC)） SEQ ID NO: 119 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSILHLGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPRTFGGGTTLEIK （107AA. MICA/B scFV輕鏈(LC)） SEQ ID NO: 120 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRQIQLVQSGPELKKPGETVKVSCKASGYMFTNYAMNWVKQAPEKGLKWMGWINTHTGDPTYADDFKGRIAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRTYGNYAMDYWGQGTSVTVSS GGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSILHLGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPRTFGGGTTLEIK （MICA/B scFV；HC- 連接子-LC；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的） SEQ ID NO: 121 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYDTSILHLGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPRTFGGGTTLEIK GGGGSGGGGSGGGGS QIQLVQSGPELKKPGETVKVSCKASGYMFTNYAMNWVKQAPEKGLKWMGWINTHTGDPTYADDFKGRIAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRTYGNYAMDYWGQGTSVTVSS （MICA/B scFV；LC- 連接子-HC；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的）

在另一實例中，經基因工程改造之iPSC及其衍生性細胞包含本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈及靶向腫瘤抗原BCMA（B細胞成熟抗原）之CAR。在BCMA靶向CAR之一些實施例中，抗原辨識區係特異性結合至CD269胞外域之scFV。在一個實施例中，scFV包含由與SEQ ID NO: 122、124、及126中之任一者具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示之重鏈可變區(V _H)，及由與SEQ ID NO: 123、125、及127中之任一者具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示之輕鏈可變區(V _L)。在用於CAR構建之BCMA scFV之一個實施例中，scFV包含V _H及V _L，其由分別與SEQ ID NO: 122及SEQ ID NO: 123；或分別與SEQ ID NO: 124及SEQ ID NO: 125、或SEQ ID NO: 126及SEQ ID NO: 127具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示。

在一些實施例中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 122、124、或126中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 122、124、或126中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，重鏈可變區包含SEQ ID NO: 122、124、或126中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 123、125、或127中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 123、125、或127中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 123、125、或127中之任一者之胺基酸序列。在BCMA scFV之一個實施例中，scFV由與SEQ ID NO: 128、129、130、131、132、或133中之任一者具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列表示。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 128-133中之任一者具有至少90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含與SEQ ID NO: 128-133中之任一者具有至少95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列。在一些實施例中，scFV包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列。本說明書之一個態樣提供經基因經工程改造之iPSC及其衍生性細胞，其中該細胞包含編碼至少一BCMA-CAR之外源性多核苷酸。在一些實施例中，包含編碼至少一BCMA-CAR之外源性多核苷酸之iPSC衍生之效應細胞係T細胞。在一些實施例中，包含編碼至少一BCMA-CAR之外源性多核苷酸之iPSC衍生之效應細胞係NK細胞。在一些其他實施例中，包含編碼至少一BCMA-CAR之外源性多核苷酸之iPSC衍生之效應細胞係NKT細胞。在一些其他實施例中，包含編碼至少一BCMA-CAR之外源性多核苷酸之iPSC衍生之效應細胞具有在T細胞、NK細胞、或NKT細胞、或任何其他天然來源之免疫細胞中不存在或不典型之功能性或結構特徵。在一個實例中，本說明書提供包含靶向腫瘤抗原BCMA之抗原辨識區之CAR。 SEQ ID NO: 122 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS （BCMA scFV重鏈-1 (VH)） SEQ ID NO: 123 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK （BCMA scFV輕鏈-1 (VL)） SEQ ID NO: 124 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS （BCMA scFV重鏈-2 (VH)） SEQ ID NO: 125 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK （BCMA scFV輕鏈-2 (VL)） SEQ ID NO: 126 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS （BCMA scFV重鏈-3 (VH)） SEQ ID NO: 127 DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK （BCMA scFV輕鏈-3 (VL)） SEQ ID NO: 128 mdfqvqifsfllisasvimsrEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS gstsgsgkpgsgegstkg EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK （BCMA scFV-1；VH- 連接子-VL；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的） SEQ ID NO: 129 mdfqvqifsfllisasvimsrEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVESNVAWYQQKPGQAPRALIYSASLRFSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNYPLTFGAGTKLELK GGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWFSWVRQAPGKGLVWVGEINPSSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAYDYWGQGTLVTVSS （BCMA scFV-2；VL- 連接子-VH；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的） SEQ ID NO: 130 mdfqvqifsfllisasvimsrQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS gstsgsgkpgsgegstkg DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK （BCMA scFV-3；VH- 連接子-VL；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的） SEQ ID NO: 131 mdfqvqifsfllisasvimsrDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCSQSSIYPWTFGQGTKLEIK gstsgsgkpgsgegstkg QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS （BCMA scFV-4；VL- 連接子-VH；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的） SEQ ID NO: 132 mdfqvqifsfllisasvimsrQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS gstsgsgkpgsgegstkg DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK （BCMA scFV-5；VH- 連接子-VL；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的） SEQ ID NO: 133 mdfqvqifsfllisasvimsrDIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCKSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGADFTLKISRVEAEDVGVYYCAETSHVPWTFGQGTKLEIK gstsgsgkpgsgegstkg QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFPDYYINWVRQAPGQGLEWMGWIYFASGNSEYNQKFTGRVTMTRDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASLYDYDWYFDVWGQGTMVTVSS （BCMA scFV-6；VL- 連接子-VH；信號肽 / 前導肽-其他信號肽亦係可能的；連接子-其他連接子亦係可能的）

在再另一實例中，經基因工程改造之iPSC及其衍生性細胞包含本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈及靶向腫瘤抗原B7H3 (CD276)之CAR。在靶向B7H3腫瘤抗原之CAR之各種實施例中，CAR包含特異性結合至B7H3之重組純重鏈抗體(VHH)。在一個實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含與SEQ ID NO: 134具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含與SEQ ID NO: 135具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含與SEQ ID NO: 136具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含與SEQ ID NO: 137具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含與SEQ ID NO: 138具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含與SEQ ID NO: 139具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或至少約80%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，結合域包含與SEQ ID NO: 134-139中之任一者具有至少約90%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，結合域包含與SEQ ID NO: 134-139中之任一者具有至少約95%同一性之胺基酸序列。在一些實施例中，結合域包含SEQ ID NO: 134之序列。在一些實施例中，結合域包含SEQ ID NO: 135之序列。在一些實施例中，結合域包含SEQ ID NO: 136之序列。在一些實施例中，結合域包含SEQ ID NO: 137之序列。在一些實施例中，結合域包含SEQ ID NO: 138之序列。在一些實施例中，結合域包含SEQ ID NO: 139之序列。

在某些實施例中，CAR包含結合域，該結合域包含SEQ ID NO: 134之變體，且其中該變體在包含SEQ ID NO: 134之1、40、46、79、87、88、89、97、98、及117之位置處具有一或多個突變。在其他實施例中，CAR包含由SEQ ID NO: 134之變體所示之胺基酸序列，其中根據SEQ ID NO: 134，該變體具有包含Q1E、T40A、E46V、G79L、K87R、P88A、D89E、V97A、S98R、及Q117L之一或多個取代。在其他實施例中，CAR包含由SEQ ID NO: 134、135、136、137、138、及139中之任一者所示之胺基酸序列。 SEQ ID NO: 134 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQTPGKGLEWVSTINRDGSATWYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLKPDDTAVYYCVSDPDNYSSDEMVPYWGQGTQVTVSS （122 a.a. VHH駱駝B7H3） SEQ ID NO: 135 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLVWVSTINRDGSATWYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPDNYSSDEMVPYWGQGTLVTVSS (122 a.a. VHH1) SEQ ID NO: 136 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLVWVSTINRDGSATWYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSDPDNYSSDEMVPYWGQGTLVTVSS (122 a.a. VHH2) SEQ ID NO: 137 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQTPGKGLVWVSTINRDGSATWYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSDPDNYSSDEMVPYWGQGTLVTVSS (122 a.a. VHH3) SEQ ID NO: 138 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQAPGKGLEWVSTINRDGSATWYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVSDPDNYSSDEMVPYWGQGTLVTVSS (122 a.a. VHH4) SEQ ID NO: 139 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMYWVRQTPGKGLEWVSTINRDGSATWYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLRPEDTAVYYCVSDPDNYSSDEMVPYWGQGTLVTVSS (122AA. VHH5)

非限制性CAR策略進一步包括藉由一對胞內域之二聚化之異二聚體、條件性活化之CAR（參見例如，美國專利第9,587,020號）；分裂CAR，其中抗原結合域、鉸鏈域、及胞內域之同源重組產生CAR（參見例如，美國公開案第2017/0183407號）；多鏈CAR，其允許分別連接至抗原結合域及信號傳導域之兩個跨膜域之間之非共價連接（參見例如，美國公開案第2014/0134142號）；具有雙特異性抗原結合域之CAR（參見例如，美國專利第9,447,194號），或具有辨識相同或不同抗原或表位之一對抗原結合域（參見例如，美國專利第8,409,577號）之CAR，或串聯CAR（參見例如，Hegde等人， J Clin Invest. 2016;126(8):3036-3052）；可誘導CAR（參見例如美國公開案第2016/0046700號、第2016/0058857號、及第2017/0166877號）；可切換CAR（參見例如美國公開案第2014/0219975號）；及所屬技術領域中已知之任何其他設計。

在一些實施例中，編碼如所揭示之CAR之多核苷酸操作性地連接至外源啟動子。啟動子可為誘導或組成性，且可為時間、組織或細胞類型特異性的。用於本文所揭示之方法之適合的組成型啟動子包括但不限於細胞巨大病毒(CMV)、延長因子1α (EF1α)、磷酸甘油酯激酶(PGK)、混合CMV增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)及泛素C (UBC)啟動子。在一個實施例中，外源啟動子係CAG。

如本文所述，在一些實施例中，包含實體腫瘤靶向主鏈之細胞可選地包含編碼本文提供之CAR及/或一或多種額外經修飾之模式之多核苷酸，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者。在包含外源性細胞介素信號傳導錯合物（表4中之「IL」）及CAR之iPSC及其衍生性細胞中，IL及CAR可以在單獨的構築體中表現，或者可以在包含IL及CAR二者之雙順反子構築體中共表現。本申請案中額外提供包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系經工程改造之iPSC之主細胞庫，該等iPSC具有本文提供之至少一種表型，包括但不限於本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及CAR，其中該細胞庫提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品包括但不限於衍生性NK細胞及T細胞，其在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。 9. 本文所提供之經基因工程改造之 iPSC 系及衍生性細胞

鑒於上述內容，本申請案提供免疫細胞、iPSC、iPS細胞系細胞、或其群體，以及藉由分化iPSC獲得之衍生性功能細胞，其中每個細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者之多核苷酸，以及可選地包含CAR及/或如本申請案中所述之一或多種額外基因修飾，其中該細胞係真核細胞、動物細胞、人細胞、誘導性多潛能細胞(iPSC)、iPSC衍生之效應細胞、免疫細胞、或餵養細胞。該等細胞適於將效應子歸巢或遷移至腫瘤位點，用於CAR靶向腫瘤殺滅。在一些實施例中，腫瘤位點處之腫瘤細胞分泌或過表現與C-X-C-模體趨化因子受體或其變體結合之趨化因子。在一些實施例中，C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。在一些實施例中，腫瘤細胞在腫瘤位點處分泌或過表現之趨化因子包含IL8 (CXCL8)。在一些實施例中，功能衍生性細胞係造血細胞，包括但不限於具有確定性生血內皮(he)潛能之中胚層細胞、確定性HE、CD34 ⁺造血細胞、造血幹細胞及前驅細胞、造血多潛能前驅細胞(MPP)、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、骨髓細胞、嗜中性球前驅細胞、T譜系細胞、NKT譜系細胞、NK譜系細胞、B譜系細胞、嗜中性球、樹突細胞、及巨噬細胞。在一些實施例中，功能衍生性造血細胞包含具有一或多種功能特徵之效應細胞，該一或多種功能特徵不存在於對應的原代T細胞、NK細胞、NKT細胞、及/或B細胞中。

本文進一步提供iPSC、iPS細胞系細胞、或其無性繁殖系群體，以及藉由分化iPSC獲得之衍生性功能細胞，其中每個細胞包含如本文所述之實體腫瘤靶向主鏈、CAR、及編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸，其中iPSC能夠定向分化以產生功能衍生性造血細胞。該等效應細胞具有改善之歸巢或遷移並停留在包括實體腫瘤在內之腫瘤位點之能力，並提供腫瘤抗原雙重靶向機制以解決腫瘤抗原異質性及腫瘤抗原逃逸。藉由CAR結合及CD16介導之ADCC之雙重靶向進一步增加腫瘤靶向精度，從而增強腫瘤殺滅並最小化腫瘤抗原逃逸之影響。

在一些進一步實施例中，該iPSC、iPS細胞系細胞、或其無性繁殖系群體、及/或其衍生性效應細胞包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈、CAR、及外源性CD16或其變體，其中該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含CD38剔除，且該等細胞適用於經歷過繼細胞療法之對象。在某些實施例中，對象可額外接受腫瘤敏化程序（例如，投予敏化劑，諸如化學治療劑、輻射、或輻射治療劑）以上調腫瘤細胞趨化因子表現，包括但不限於CXCL8過表現，以進一步增強過表現C-X-C模體趨化因子受體之效應細胞歸巢、運輸、及滯留，以及腫瘤位點處之細胞毒性。在一些實施例中，該等效應細胞包含T譜系細胞。在一些其他實施例中，該等效應細胞包含NK譜系細胞。

在衍生性效應細胞之一些實施例中，iPSC及其衍生性細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之至少兩者之多核苷酸，以及可選地CAR、CD38剔除、外源性CD16或其變體、HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏、及一或多種CFR中之一或多者，該等細胞具有插入在TCR恆定區（TRAC或TRBC）中之CAR，導致TCR剔除，並可選地將CAR表現置於內源性TCR啟動子的控制之下。TCRα或TCRβ（TRAC或TRBC）之恆定區之破壞產生TCR ^neg細胞。此外，在自iPSC分化之NK譜系效應細胞中，TCR之表現亦係陰性的。TCR ^neg細胞不需要HLA匹配，具有降低的同種異體反應性，且當用於同種異體過繼細胞療法時，能夠預防GvHD（移植物抗宿主病）。CAR之額外插入位點包括但不限於AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD58、CD54、CD56、CD69、CD71、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT。在另一實施例中，本文所述之效應細胞、iPSC、及其衍生性NK細胞包含CAR，其中CAR被插入在NKG2A基因座或NKG2D基因座中，導致NKG2A或NKG2D剔除，從而將CAR表現置於內源性NKG2A或NKG2D啟動子的控制之下。

額外提供一種iPSC，其包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之至少兩者之多核苷酸，且進一步包含CAR、外源性CD16或其變體、CD38剔除、及編碼介白素(IL)細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該錯合物包含全長或部分長度之細胞介素及/或全長或部分長度之細胞介素受體，以使細胞介素信號傳導有助於細胞存活、持久性、及/或擴增，其中iPSC系能夠定向分化以產生具有改善之存活、持久性、擴增、及效應細胞功能以及歸巢、運輸、腫瘤位點滯留、及細胞毒性之功能衍生性造血細胞。在各種實施例中，外源性引入之（多個）IL細胞介素信號傳導包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、及IL21中之任何一、二或更多者之傳訊。在一些實施例中，經引入之IL細胞介素信號傳導錯合物用於細胞中之IL15傳訊，並且細胞可選地係NK譜系細胞。在一些其他特定實施例中，經引入之IL細胞介素信號傳導錯合物用於細胞中之IL7傳訊，並且細胞可選地係T譜系細胞。在一些實施例中，經引入之IL細胞介素信號傳導錯合物在細胞表面上表現。在一些實施例中，IL細胞介素信號傳導係構成性地活化。在一些實施例中，IL細胞介素信號傳導之活化係可誘導的。在一些實施例中，IL細胞介素信號傳導之活化係瞬時的及/或暫時的。在一些實施例中，細胞表面細胞介素/細胞介素受體之瞬時/暫時表現係藉由反轉錄病毒、仙台病毒、腺病毒、附加體、微環、或包括mRNA之RNA來進行。效應細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者之多核苷酸，以及CAR、外源性CD16或其變體、IL細胞介素信號傳導錯合物，以及可選地如表4及整個申請案中所提供之一或多種額外基因修飾，該等效應細胞能夠在體外或體內無需接觸額外提供之可溶細胞介素而自主維持或改善細胞生長、增殖、擴增、及/或效應子功能，並且能夠增強腫瘤位點處之歸巢、運輸、及滯留，其中腫瘤細胞可經敏化以藉由對原代來源之免疫細胞或無性繁殖iPSC之合理設計及精確工程改造，與提供給效應細胞之功能特徵協同作用。

亦提供一種iPSC，其包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈、CAR、及外源性CD16或其變體，以及CAR、B2M剔除、及/或CIITA剔除，及可選地HLA-G過表現、CD58剔除、及CD54剔除中之一者，其中iPSC能夠定向分化以產生功能衍生性造血細胞。在各種實施例中，包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC及其衍生性效應細胞係HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏。在一進一步實施例中，HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏iPSC及其包含實體腫瘤靶向主鏈之衍生性效應細胞亦係CD38陰性的，並且可以與抗CD38抗體一起使用以誘導ADCC而不引起效應細胞消除，從而增加iPSC及其效應細胞之持久性及/或存活。在一些實施例中，效應細胞在體內具有增加之持久性及/或存活。

因此，本申請案提供iPSC及其功能衍生性造血細胞，其包含表4中之以下基因型中之任一者。表4中提供之「IL」表示IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、及IL21中一者之IL細胞介素信號傳導錯合物，此取決於所選之特定細胞介素/受體表現。此外，「IL」亦囊括IL15Δ實施例，其在上文中詳細描述為IL15及IL15Rα之截短融合蛋白，但沒有胞內域。此外，當iPSC及其功能衍生性造血細胞具有包含CAR及IL二者之基因型時，CAR及IL可包含在包含2A序列之雙順反子或三順反子表現匣中。作為比較，在一些其他實施例中，CAR及IL在iPSC及其功能衍生性造血細胞中包含之單獨表現匣中。在一個實施例中，iPSC及其功能衍生性效應細胞包含CAR及IL二者，IL係IL15，其中IL15構築體與CAR一起或分開包含在表現匣中。［表4］：所提供細胞之適用的例示性基因型：

C-X-C- 模體	TGFβ-SRR (TGFβR)	ADR	CD38 ^-/-	CD16 ^exo	IL	HLA-I/II 缺乏	CFR	CAR 及TCR ^-/-	基因型
√	√								1. C-X-C TGFβR
√		√							2. C-X-C ADR
	√	√							3. TGFβR ADR
√	√	√							4. C-X-C TGFβR ADR
√	√		√						5. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-
√	√			√					6. C-X-C TGFβR CD16 ^exo
√	√				√				7. C-X-C TGFβR IL
√	√					√			8. C-X-C TGFβR HLA-I/II
√	√						√		9. C-X-C TGFβR CFR
√	√							√	10. C-X-C TGFβR CAR
√		√	√						11. C-X-C ADR CD38 ^-/-
√		√		√					12. C-X-C ADR CD16 ^exo
√		√			√				13. C-X-C ADR IL
√		√				√			14. C-X-C ADR HLA-I/II
√		√					√		15. C-X-C ADR CFR
√		√						√	16. C-X-C ADR CAR
	√	√	√						17. TGFβR ADR CD38 ^-/-
	√	√		√					18. TGFβR ADR CD16 ^exo
	√	√			√				19. TGFβR ADR IL
	√	√				√			20. TGFβR ADR HLA-I/II
	√	√					√		21. TGFβR ADR CFR
	√	√						√	22. TGFβR ADR CAR
√	√	√	√						23. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-
√	√	√		√					24. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exo
√	√	√			√				25. C-X-C TGFβR ADR IL
√	√	√				√			26. C-X-C TGFβR ADR HLA-I/II
√	√	√					√		27. C-X-C TGFβR ADR CFR
√	√	√						√	28. C-X-C TGFβR ADR CAR
√	√		√	√					29. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exo
√	√		√		√				30. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL
√	√		√			√			31. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-HLA-I/II
√	√		√				√		32. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CFR
√	√		√					√	33. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CAR
√	√			√	√				34. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL
√	√			√		√			35. C-X-C TGFβR CD16 ^exoHLA-I/II
√	√			√			√		36. C-X-C TGFβR CD16 ^exoCFR
√	√			√				√	37. C-X-C TGFβR CD16 ^exoCAR
√	√				√	√			38. C-X-C TGFβR IL HLA-I/II
√	√				√		√		39. C-X-C TGFβR IL CFR
√	√				√			√	40. C-X-C TGFβR IL CAR
√	√					√	√		41. C-X-C TGFβR HLA-I/II CFR
√	√					√		√	42. C-X-C TGFβR HLA-I/II CAR
√	√						√	√	43. C-X-C TGFβR CFR CAR
√		√	√	√					44. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exo
√		√	√		√				45. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL
√		√	√			√			46. C-X-C ADR CD38 ^-/-HLA-I/II
√		√	√				√		47. C-X-C ADR CD38 ^-/-CFR
√		√	√					√	48. C-X-C ADR CD38 ^-/-CAR
√		√		√	√				49. C-X-C ADR CD16 ^exoIL
√		√		√		√			50. C-X-C ADR CD16 ^exoHLA-I/II
√		√		√			√		51. C-X-C ADR CD16 ^exoCFR
√		√		√				√	52. C-X-C ADR CD16 ^exoCAR
√		√			√	√			53. C-X-C ADR IL HLA-I/II
√		√			√		√		54. C-X-C ADR IL CFR
√		√			√			√	55. C-X-C ADR IL CAR
√		√				√	√		56. C-X-C ADR HLA-I/II CFR
√		√				√		√	57. C-X-C ADR HLA-I/II CAR
√		√					√	√	58. C-X-C ADR CFR CAR
	√	√	√	√					59. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exo
	√	√	√		√				60. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL
	√	√	√			√			61. TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II
	√	√	√				√		62. TGFβR ADR CD38 ^-/-CFR
	√	√	√					√	63. TGFβR ADR CD38 ^-/-CAR
	√	√		√	√				64. TGFβR ADR CD16 ^exoIL
	√	√		√		√			65. TGFβR ADR CD16 ^exoHLA-I/II
	√	√		√			√		66. TGFβR ADR CD16 ^exoCFR
	√	√		√				√	67. TGFβR ADR CD16 ^exoCAR
	√	√			√	√			68. TGFβR ADR IL HLA-I/II
	√	√			√		√		69. TGFβR ADR IL CFR
	√	√			√			√	70. TGFβR ADR IL CAR
	√	√				√	√		71. TGFβR ADR HLA-I/II CFR
	√	√				√		√	72. TGFβR ADR HLA-I/II CAR
	√	√					√	√	73. TGFβR ADR CFR CAR
√	√	√	√	√					74. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exo
√	√	√	√		√				75. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL
√	√	√	√			√			76. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II
√	√	√	√				√		77. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CFR
√	√	√	√					√	78. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CAR
√	√	√		√	√				79. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL
√	√	√		√		√			80. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoHLA-I/II
√	√	√		√			√		81. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoCFR
√	√	√		√				√	82. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoCAR
√	√	√			√	√			83. C-X-C TGFβR ADR IL HLA-I/II
√	√	√			√		√		84. C-X-C TGFβR ADR IL CFR
√	√	√			√			√	85. C-X-C TGFβR ADR IL CAR
√	√	√				√	√		86. C-X-C TGFβR ADR HLA-I/II CFR
√	√	√				√		√	87. C-X-C TGFβR ADR HLA-I/II CAR
√	√	√					√	√	88. C-X-C TGFβR ADR CFR CAR
√	√		√	√	√				89. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL
√	√		√	√		√			90. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II
√	√		√	√			√		91. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoCFR
√	√		√	√				√	92. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoCAR
√	√			√	√	√			93. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL HLA-I/II
√	√			√	√		√		94. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL CFR
√	√			√	√			√	95. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL CAR
√	√				√	√	√		96. C-X-C TGFβR IL HLA-I/II CFR
√	√				√	√		√	97. C-X-C TGFβR IL HLA-I/II CAR
√	√					√	√	√	98. C-X-C TGFβR HLA-I/II CFR CAR
√	√		√		√	√			99. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL HLA-I/II
√	√		√		√		√		100. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL CFR
√	√		√		√			√	101. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL CAR
√	√		√			√	√		102. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR
√	√		√			√		√	103. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-HLA-I/II CAR
√	√		√				√	√	104. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CFR CAR
√		√	√	√	√				105. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL
√		√	√	√		√			106. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II
√		√	√	√			√		107. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoCFR
√		√	√	√				√	108. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoCAR
√		√		√	√	√			109. C-X-C ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II
√		√		√	√		√		110. C-X-C ADR CD16 ^exoIL CFR
√		√		√	√			√	111. C-X-C ADR CD16 ^exoIL CAR
√		√			√	√	√		112. C-X-C ADR IL HLA-I/II CFR
√		√			√	√		√	113. C-X-C ADR IL HLA-I/II CAR
√		√				√	√	√	114. C-X-C ADR HLA-I/II CFR CAR
√		√	√		√	√			115. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II
√		√	√		√		√		116. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL CFR
√		√	√		√			√	117. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL CAR
√		√	√			√	√		118. C-X-C ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR
√		√	√			√		√	119. C-X-C ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CAR
√		√	√				√	√	120. C-X-C ADR CD38 ^-/-CFR CAR
	√	√	√	√	√				121. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL
	√	√	√	√		√			122. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II
	√	√	√	√			√		123. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoCFR
	√	√	√	√				√	124. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoCAR
	√	√		√	√	√			125. TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II
	√	√		√	√		√		126. TGFβR ADR CD16 ^exoIL CFR
	√	√		√	√			√	127. TGFβR ADR CD16 ^exoIL CAR
	√	√			√	√	√		128. TGFβR ADR IL HLA-I/II CFR
	√	√			√	√		√	129. TGFβR ADR IL HLA-I/II CAR
	√	√				√	√	√	130. TGFβR ADR HLA-I/II CFR CAR
	√	√	√		√	√			131. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II
	√	√	√		√		√		132. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL CFR
	√	√	√		√			√	133. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL CAR
	√	√	√			√	√		134. TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR
	√	√	√			√		√	135. TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CAR
	√	√	√				√	√	136. TGFβR ADR CD38 ^-/-CFR CAR
√	√	√	√	√	√				137. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL
√	√	√	√	√		√			138. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II
√	√	√	√	√			√		139. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoCFR
√	√	√	√	√				√	140. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoCAR
√	√	√		√	√	√			141. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II
√	√	√		√	√		√		142. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL CFR
√	√	√		√	√			√	143. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL CAR
√	√	√			√	√	√		144. C-X-C TGFβR ADR IL HLA-I/II CFR
√	√	√			√	√		√	145. C-X-C TGFβR ADR IL HLA-I/II CAR
√	√	√				√	√	√	146. C-X-C TGFβR ADR HLA-I/II CFR CAR
√	√	√	√		√	√			147. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II
√	√	√	√		√		√		148. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL CFR
√	√	√	√		√			√	149. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL CAR
√	√	√	√			√	√		150. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR
√	√	√	√			√		√	151. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CAR
√	√	√	√				√	√	152. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CFR CAR
√	√		√	√	√	√			153. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II
√	√		√	√	√		√		154. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR
√	√		√	√	√			√	155. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CAR
√	√		√	√			√	√	156. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CFR CAR
√	√			√	√	√	√		157. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
√	√			√	√	√		√	158. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
√	√			√		√	√	√	159. C-X-C TGFβR CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
√	√			√	√		√	√	160. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL CFR CAR
√	√				√	√	√	√	161. C-X-C TGFβR IL HLA-I/II CFR CAR
√	√		√		√	√	√		162. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR
√	√		√		√	√		√	163. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CAR
√	√		√			√	√	√	164. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR CAR
√		√	√	√	√	√			165. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II
√		√	√	√	√		√		166. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR
√		√	√	√	√			√	167. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CAR
√		√	√	√			√	√	168. C-X-C ADR CD38 ^-/-CFR CAR
√		√		√	√	√	√		169. C-X-C ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
√		√		√	√	√		√	170. C-X-C ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
√		√		√		√	√	√	171. C-X-C ADR CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
√		√		√	√		√	√	172. C-X-C ADR CD16 ^exoIL CFR CAR
√		√			√	√	√	√	173. C-X-C ADR IL HLA-I/II CFR CAR
√		√	√		√	√	√		174. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR
√		√	√		√	√		√	175. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CAR
√		√	√			√	√	√	176. C-X-C ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR CAR
	√	√	√	√	√	√			177. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II
	√	√	√	√	√		√		178. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR
	√	√	√	√	√			√	179. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CAR
	√	√	√	√			√	√	180. TGFβR ADR CD38 ^-/-CFR CAR
	√	√		√	√	√	√		181. TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
	√	√		√	√	√		√	182. TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
	√	√		√		√	√	√	183. TGFβR ADR CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
	√	√		√	√		√	√	184. TGFβR ADR CD16 ^exoIL CFR CAR
	√	√			√	√	√	√	185. TGFβR ADR IL HLA-I/II CFR CAR
	√	√	√		√	√	√		186. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR
	√	√	√		√	√		√	187. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CAR
	√	√	√			√	√	√	188. TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR CAR
√	√	√	√	√	√	√			189. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II
√	√	√	√	√	√		√		190. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR
√	√	√	√	√	√			√	191. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CAR
√	√	√	√	√			√	√	192. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CFR CAR
√	√	√		√	√	√	√		193. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
√	√	√		√	√	√		√	194. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
√	√	√		√		√	√	√	195. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
√	√	√		√	√		√	√	196. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL CFR CAR
√	√	√			√	√	√	√	197. C-X-C TGFβR ADR IL HLA-I/II CFR CAR
√	√	√	√		√	√	√		198. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR
√	√	√	√		√	√		√	199. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CAR
√	√	√	√			√	√	√	200. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-HLA-I/II CFR CAR
√	√		√	√	√	√	√		201. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
√	√		√	√	√	√		√	202. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
√	√		√	√	√		√	√	203. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR CAR
√	√		√	√		√	√	√	204. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
√	√		√		√	√	√	√	205. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR CAR
√	√			√	√	√	√	√	206. C-X-C TGFβR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR
√		√	√	√	√	√	√		207. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
√		√	√	√	√	√		√	208. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
√		√	√	√	√		√	√	209. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR CAR
√		√	√	√		√	√	√	210. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
√		√	√		√	√	√	√	211. C-X-C ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR CAR
√		√		√	√	√	√	√	212. C-X-C ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR
	√	√	√	√	√	√	√		213. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
	√	√	√	√	√	√		√	214. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
	√	√	√	√	√		√	√	215. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR CAR
	√	√	√	√		√	√	√	216. TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
	√	√	√		√	√	√	√	217. TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR CAR
	√	√		√	√	√	√	√	218. TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR
√	√	√	√	√	√	√	√		219. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR
√	√	√	√	√	√	√		√	220. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CAR
√	√	√	√	√	√		√	√	221. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL CFR CAR
√	√	√	√	√		√	√	√	222. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoHLA-I/II CFR CAR
√	√	√	√		√	√	√	√	223. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-IL HLA-I/II CFR CAR
√	√	√		√	√	√	√	√	224. C-X-C TGFβR ADR CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR
√	√		√	√	√	√	√	√	225. C-X-C TGFβR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR
√		√	√	√	√	√	√	√	226. C-X-C ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR
√	√	√	√	√	√	√	√	√	227. C-X-C TGFβR ADR CD38 ^-/-CD16 ^exoIL HLA-I/II CFR CAR

10.額外修飾

在一些實施例中，該經基因修飾之模式進一步包含以下中之一或多者：安全開關蛋白、靶向模式、受體、傳訊分子、轉錄因子、醫藥活性蛋白及肽、藥物標靶候選物；或促進iPSC或其衍生性細胞之植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、免疫反應調控及調節、及/或存活之蛋白質。在一些實施例中，經基因修飾之iPSC及其衍生行細胞包含表4中所列之基因型。在一些實施例中，包含表4中之基因型中任一者之iPSC及其衍生性效應細胞可額外包含破壞TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、及染色體6p21區中之任一基因中之至少一者；或者引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、Fc受體、接合物、及表面觸發受體中之至少一者，用於與雙特異性、多特異性、或通用接合物偶合。

接合物係由不同抗體之二或更多個單鏈可變片段(scFv)組成之融合蛋白，其中至少一個scFv結合至效應細胞表面分子或表面觸發受體，且至少另一scFv經由目標細胞特異性表面分子結合至目標細胞。接合物之實例包括但不限於雙特異性T細胞接合物(BiTE)、雙特異性殺手細胞接合物(BiKE)、三特異性殺手細胞接合物(TriKE)、多特異性殺手細胞接合物，或與多種免疫細胞類型相容之通用接合物。因此，接合物可為雙特異性的或多特異性的。此種雙特異性或多特異性接合物能夠將效應細胞（例如，T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、巨噬細胞、及/或嗜中性球）導向至腫瘤細胞並活化免疫效應細胞，並且已經顯示出最大化CAR-T細胞療法益處之巨大潛能。

在一些實施例中，藉由同時或連續投予，接合物與包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞之群體組合使用，其中效應細胞包含由接合物辨識之表面分子或表面觸發受體。在一些其他實施例中，接合物係由衍生性效應細胞藉由基因工程改造包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之iPSC以及經工程改造之iPSC之定向分化而表現之雙特異性抗體。可用於雙特異性或多特異性接合物辨識或耦合之例示性效應細胞表面分子或表面觸發受體包括但不限於CD3、CD28、CD5、CD16、NKG2D、CD64、CD32、CD89、NKG2C、及本文所揭示之嵌合Fc受體。如本文所述，在一些實施例中，在用於接合物辨識之衍生性效應細胞之表面上表現之外源性CD16係hnCD16，包含CD16（含有F176V及可選地S197P）或CD64胞外域，以及本文所述之天然或非天然跨膜域、刺激域、及/或信號傳導域。在一些實施例中，在用於接合物辨識之效應細胞之表面上表現之外源性CD16係基於CD16之嵌合Fc受體(CFcR)。在一些實施例中，基於CD16之CFcR包含NKG2D之跨膜域、2B4之刺激域、及CD3ζ之信號傳導域；其中外源性CD16之胞外域衍生自CD64或CD16之胞外域之全長或部分序列；且其中CD16之胞外域包含F176V及可選地S197P。

在一些實施例中，接合物之目標細胞係腫瘤細胞。用於雙特異性或多特異性接合物辨識之例示性腫瘤細胞表面分子包括但不限於B7H3、BCMA、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EPCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、PSMA、PAMA、P-鈣黏蛋白、及ROR1。在一個實施例中，雙特異性接合物係對CD3及CD19特異之雙特異性抗體(CD3-CD19)。在另一實施例中，雙特異性抗體係CD16-CD30或CD64-CD30。在另一實施例中，雙特異性抗體係CD16-BCMA或CD64-BCMA。在又另一實施例中，雙特異性抗體係CD3-CD33。

在再另一實施例中，雙特異性抗體進一步包含效應細胞與腫瘤細胞抗原結合域之間之連接子。例如，經修飾之IL15可用作效應NK細胞之連接子，以促進效應細胞擴增（在一些出版物中稱為TriKE或三特異性殺手接合物）。在一個實施例中，TriKE係CD16-IL15-EPCAM或CD64-IL15-EPCAM。在另一實施例中，TriKE係CD16-IL15-CD33或CD64-IL15-CD33。在再另一實施例中，TriKE係NKG2C-IL15-CD33 (「2C1533」)。除IL15之外，適用於包括在TriKE中之細胞介素包括但不限於IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL18、及IL21。

在一些實施例中，雙特異性或多特異性接合物之表面觸發受體可為效應細胞內源性的，有時取決於細胞類型。在一些其他實施例中，可以使用本文提供之方法及組成物將一或多種外源性表面觸發受體引入至效應細胞，即，藉由額外工程改造包含表4中所列基因型之iPSC，然後導向iPSC分化為T細胞、NK細胞、或包含與源iPSC相同基因型及表面觸發受體之任何其他效應細胞。 11. 用於免疫療法之抗體

在一些實施例中，除包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈之經基因工程改造之效應細胞之外，可在組合療法中與此等效應細胞一起使用額外之治療劑，該額外之治療劑包含靶向與病況、疾病、或適應症相關聯之抗原之抗體或抗體片段。在一些實施例中，藉由向對象同時或連續投予，將抗體與包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞之群體組合使用。在其他實施例中，藉由使用編碼此種抗體或其片段之外源性多核苷酸序列基因工程改造iPSC，並導向經工程改造之iPSC之分化，該抗體或其片段可由效應細胞來表現。在一些實施例中，效應細胞表現外源性CD16變體，其中抗體經由ADCC增強效應細胞之細胞毒性。

在一些實施例中，治療性抗體係單株抗體。在一些實施例中，治療性抗體係人源化抗體、人源化單株抗體、或嵌合抗體。在一些實施例中，治療性抗體或抗體片段特異性結合至病毒抗原。在其他實施例中，抗體或抗體片段特異性結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤特異性或病毒特異性抗原活化經投予之iPSC衍生之效應細胞以增強其殺滅能力。在一些實施例中，適於作為經投予之iPSC衍生之效應細胞之額外治療劑進行組合治療之治療性抗體包括但不限於抗CD20抗體（利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗）、抗HER2抗體（曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）、抗CD52抗體（阿侖單抗）、抗EGFR抗體（西妥昔單抗）、抗GD2抗體（地妥昔單抗）、抗PDL1抗體（阿維魯單抗）、抗CD38抗體（達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、MOR202）、抗CD123抗體（7G3、CSL362）、抗SLAMF7抗體（埃羅妥珠單抗）、抗MICA/B抗體(7C6, 6F11, 1C2)、及其人源化或Fc修飾之變體或片段、或其功能等效物及生物類似物。在一些實施例中，適於作為經投予之iPSC衍生之效應細胞之額外治療劑進行組合治療之抗體進一步包括雙特異性或多特異性抗體，其靶向目標細胞上之大於一種抗原或表位，或在靶向目標細胞之同時向目標細胞募集效應細胞（例如，T細胞、NK細胞、或巨噬細胞）。此種雙特異性或多特異性抗體用作將效應細胞（例如，T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、巨噬細胞、及/或嗜中性球）導向至腫瘤細胞並活化免疫效應細胞之接合物，並且已經顯示出最大化抗體療法益處之巨大潛能。

在一些實施例中，iPSC衍生之效應細胞包含造血譜系細胞，其包含表4中所列之基因型。在一些實施例中，iPSC衍生之效應細胞包含NK細胞，其包含表4中所列之基因型。在一些實施例中，iPSC衍生之效應細胞包含T細胞，其包含表4中所列之基因型。

在用於治療液體腫瘤或實體腫瘤之組合之一些實施例中，該組合包含iPSC衍生之NK細胞或T細胞，該等細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C-模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者之多核苷酸，以及可選地表4中提供之一或多種額外基因修飾；及如上文所述之治療性抗體。在用於治療液體腫瘤或實體腫瘤之組合之一些實施例中，該組合包含iPSC衍生之NK細胞或T細胞，其包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及可選地TCR剔除、CAR、細胞介素信號傳導錯合物、外源性CD16或其變體、及CD38剔除；及如上文所述之治療性抗體。在用於治療液體或實體腫瘤之組合之一些實施例中，該組合包含iPSC衍生之NK細胞或T細胞，其包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈及可選地TCR剔除、CAR、IL細胞介素信號傳導錯合物、外源性CD16或其變體、CD38剔除、及HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏；及如上文所述之治療性抗體。在該組合之各種實施例中，CAR靶向本文所述之實體腫瘤抗原。在該組合之各種實施例中，外源性CD16係hnCD16。不受理論之限制，hnCD16提供單株抗體之增強之ADCC，而CAR不僅靶向特異性腫瘤抗原，而且使用與靶向不同腫瘤抗原之單株抗體組合之雙重靶向策略來預防腫瘤抗原逃逸。 12. 檢查點抑制劑

檢查點係細胞分子，通常係細胞表面分子，能夠抑制或下調未被抑制之免疫反應。現在很清楚，腫瘤利用某些免疫檢查點途徑作為免疫抗性，具體地針對腫瘤抗原特異之T細胞之免疫抗性之主要機制。檢查點抑制劑(CI)係能夠減少檢查點基因表現或基因產物，或降低檢查點分子活性之拮抗劑，從而阻斷抑制性檢查點，並恢復免疫系統功能。靶向PD1/PDL1或CTLA4之檢查點抑制劑之開發已經改變了腫瘤學之前景，此等藥劑在多種適應症中提供長期緩解。然而，許多腫瘤亞型對檢查點阻斷療法具有抗性，且復發仍然係一個重要的問題。因此，本申請案之一個態樣提供一種藉由在與CI之組合療法中包括如本文所提供之經基因工程改造之功能性iPSC衍生之細胞來克服CI抗性之治療方法。在本文描述之組合療法之一個實施例中，iPSC衍生之細胞係NK細胞。在本文描述之組合療法之另一實施例中，iPSC衍生之細胞係T細胞。除了表現出直接抗腫瘤能力外，本文提供之衍生性NK細胞已經顯示出抵抗PDL1-PD1介導之抑制，並具有增強T細胞遷移、將T細胞募集至腫瘤微環境中、及增強腫瘤位點處T細胞活化之能力。因此，由功能強效之經基因工程改造之衍生性NK細胞促進之T細胞之腫瘤浸潤表明，該等NK細胞能夠與T細胞靶向免疫療法（包括檢查點抑制劑）協同作用，以減輕局部免疫抑制並減少腫瘤負擔。

在組合療法之一些實施例中，藉由向對象同時或連續投予，將檢查點抑制劑與包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞之群體組合使用。在一些其他實施例中，藉由使用編碼檢查點抑制劑之外源性多核苷酸序列或其片段或變體基因工程改造iPSC，並導向經工程改造之iPSC之分化，由效應細胞表現該檢查點抑制劑。具有包含本文所述之實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞之組合療法之一些實施例包含靶向至少一個檢查點分子之至少一種檢查點抑制劑；其中效應細胞具有表4中所列之基因型。

在一個實施例中，用於檢查點抑制劑組合療法之iPSC衍生之效應細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者之多核苷酸，以及可選地表4中提供之一或多種額外基因修飾。在一些實施例中，用於檢查點抑制劑組合療法之iPSC衍生之效應細胞包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈，以及可選地以下中之一、二、三、四、五、或更多者：CAR、外源性CD16表現、CFR表現、HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏、CD38剔除、及細胞介素信號傳導錯合物表現；其中當B2M被剔除時，可選地包括編碼HLA-G之多核苷酸或CD58及CD54中之一或兩者之剔除。在一些實施例中，衍生性NK細胞包含表4中所列之基因型中之任一者。在一些實施例中，包含如本文提供之實體腫瘤靶向主鏈之上述衍生性效應細胞額外包含TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及染色體6p21區中之任何基因中之至少一者之缺失、破壞、或表現降低；或者引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、CAR、Fc受體、及表面觸發受體中之至少一者，用於與雙特異性、多特異性、或通用接合物耦合。

在各種實施例中，衍生性效應細胞藉由分化iPSC無性繁殖系而獲得，該iPSC無性繁殖系包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者之多核苷酸，以及可選地下列中之一、二、三、四、五、或更多者：CAR表現、CFR表現、外源性CD16表現、HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏、CD38剔除、及細胞介素信號傳導錯合物表現；其中當B2M被剔除時，可選地引入編碼HLA-G之多核苷酸或CD58及CD54中之一或兩者之剔除。在一些實施例中，包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈之上述iPSC無性繁殖系進一步包含TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、PD1、LAG3、TIM3、RFXANK、RFX5、RFXAP、RAG1、及染色體6p21區中之任何基因中之至少一者之缺失、破壞、或表現降低；或者引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、CAR、Fc受體、及表面觸發受體中之至少一者，用於與雙特異性、多特異性、或通用接合物耦合。

用於與本文提供之衍生性NK細胞或T細胞之組合療法之合適檢查點抑制劑包括但不限於PD1 (Pdcdl, CD279)、PDL-1 (CD274)、TIM3 (Havcr2)、TIGIT（WUCAM及Vstm3）、LAG3 (CD223)、CTLA4 (CD152)、2B4 (CD244)、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、A _2AR、BATE、BTLA、CD39 (Entpdl)、CD47、CD73 (NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2 (Pou2f2)、視黃酸受體α (Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及抑制性KIR（例如，2DL1、2DL2、2DL3、3DL1、及3DL2）之拮抗劑。

在一些實施例中，抑制任何上述檢查點分子之拮抗劑係抗體。在一些實施例中，檢查點抑制抗體可為鼠抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝Ig、單一可變新抗原受體(VNAR)、鯊魚純重鏈抗體(Ig NAR)、嵌合抗體、重組抗體、或其抗體片段。抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、單鏈抗原結合片段(scFv)、(scFv)2、二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單域抗原結合片段（sdAb，奈米抗體）、重組純重鏈抗體(VHH)、及保持整個抗體之結合特異性之其他抗體片段，此等抗體片段之生產成本更低、更容易使用、或比整個抗體更靈敏。在一些實施例中，一、或二、或三、或更多種檢查點抑制劑包含以下中之至少一者：阿特珠單抗（抗PDL1 mAb）、阿維魯單抗（抗PDL1 mAb）、德瓦魯單抗（抗PDL1 mAb）、曲美木單抗（抗CTLA4 mAb）、伊匹單抗（抗CTLA4 mAb）、IPH4102（抗KIR抗體）、IPH43（抗MICA抗體）、IPH33（抗TLR3抗體）、利瑞魯單抗（抗KIR抗體）、莫那利珠單抗（抗NKG2A抗體）、納武單抗（抗PD1 mAb）、派姆單抗（抗PD1 mAb）、及其任何衍生物、功能等效物、或生物類似物。

在一些實施例中，抑制任何上述檢查點分子之拮抗劑係基於微型RNA的，因為許多miRNA被發現作為控制免疫檢查點表現之調節劑（Dragomir等人， Cancer Biol Med. 2018, 15(2):103-115）。在一些實施例中，檢查點拮抗miRNA包括但不限於miR-28、miR-15/16、miR-138、miR-342、miR-20b、miR-21、miR-130b、miR-34a、miR-197、miR-200c、miR-200、miR-17-5p、miR-570、miR-424、miR-155、miR-574-3p、miR-513、及miR-29c。

具有所提供之iPSC衍生之效應細胞之組合療法之一些實施例包含靶向至少一個檢驗點分子之至少一種檢驗點抑制劑；其中iPSC衍生之細胞具有表4中所列之基因型。具有所提供之衍生性效應細胞之組合療法之一些其他實施例包含二、三、或更多種檢查點抑制劑，使得靶向二、三、或更多個檢查點分子。在包含至少一種檢查點抑制劑及具有表4中所列之基因型之iPSC衍生之細胞之組合療法之一些實施例中，該檢查點抑制劑係抗體，或人源化或Fc修飾之變體或片段，或其功能性等同物或生物類似物，並且該檢查點抑制劑由iPSC衍生之細胞藉由表現編碼該抗體或其片段或變體之外源性多核苷酸序列來產生。在一些實施例中，編碼抗體之外源性多核苷酸序列或其抑制檢查點之片段或變體與CAR，或者在單獨的構築體中，或者在包含CAR及編碼抗體之序列或其片段二者之雙順反子或三順反子構築體中共表現。在一些進一步實施例中，編碼抗體之序列或其片段可藉由自切割2A編碼序列（示出為，例如，CAR-2A-CI或CI-2A-CAR）連接至CAR表現構築體之5'末端或3'末端。因此，檢查點抑制劑及CAR之編碼序列可在單個開讀框(ORF)中。當檢查點抑制劑作為酬載被能夠浸潤腫瘤微環境(TME)之衍生性效應細胞遞送、表現、及分泌時，它在接合TME時抵消抑制性檢查點分子，從而允許藉由活化諸如CAR之模式或活化受體來活化效應細胞。在一些實施例中，與CAR共表現之檢查點抑制劑抑制以下檢查點分子中之至少一者：PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A _2AR、BATE、BTLA、CD39 (Entpdl)、CD47、CD73 (NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2 (Pou2f2)、視黃酸受體α (Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及抑制性KIR。在一些實施例中，在具有表4中所列之基因型之衍生性細胞中與CAR共表現之檢查點抑制劑包含阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、曲美木單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、派姆單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、及其功能等效物或生物類似物。在一些實施例中，與CAR共表現之檢查點抑制劑係阿特珠單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、或其功能等效物或生物類似物。在一些其他實施例中，與CAR共表現之檢查點抑制劑係納武單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、或其功能等效物或生物類似物。在一些其他實施例中，與CAR共表現之檢查點抑制劑係派姆單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、或其功能等效物或生物類似物。

在包含包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈之iPSC衍生之細胞及抑制檢查點分子之至少一種抗體之組合療法之一些其他實施例中，該抗體不由iPSC衍生之細胞產生或在iPSC衍生之細胞中產生，並且在投予具有表4中所列之基因型之衍生性細胞之前、之中、或之後額外投予。在一些實施例中，在與所提供之衍生性效應細胞之組合療法中，一、二、三、或更多種檢查點抑制劑之投予係同時或依序進行。在包含具有表4中所列之基因型之衍生之NK細胞或T細胞之組合療法之一個實施例中，治療中包括之檢查點抑制劑係阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、曲美木單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、派姆單抗、及其人源化或Fc修飾之變體、片段、及其功能等效物或生物類似物中之一或多者。在包含具有表4中所列之基因型之衍生之NK細胞或T細胞之組合療法之一些實施例中，治療中包括之檢查點抑制劑係阿特珠單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、及其功能等效物或生物類似物。在包含具有表4中所列之基因型之衍生之NK細胞或T細胞之組合療法之一些實施例中，治療中包括之檢查點抑制劑係納武單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、及其功能等效物或生物類似物。在包含具有表4中所列之基因型之衍生之NK細胞或T細胞之組合療法之一些實施例中，治療中包括之檢查點抑制劑係派姆單抗，或其人源化或Fc修飾之變體、片段、及其功能等效物或生物類似物。 II. 用於在iPSC 中所選之基因座處進行靶向基因體編輯之方法

如本文中可互換使用，基因體編輯或基因體編輯或基因編輯係一種類型之基因工程改造，其中在目標細胞之基因體中插入、缺失、及/或置換DNA。靶向基因體編輯（可與「靶向基因體編輯」或「靶向基因編輯」互換）能夠在基因體中預先選擇之位點處進行插入、缺失、及/或取代。當內源性序列在靶向編輯過程中在插入位點處缺失時，包含受影響序列之內源性基因可能由於序列缺失而被剔除或減弱。因此，靶向編輯亦可用於精確破壞內源性基因表現。本文中類似使用之用語係「靶向整合」，意指涉及插入一或多個外源性序列，在插入位點處缺失或不缺失內源性序列之過程。相比之下，隨機整合之基因受位置效應及緘默影響，使其表現不可靠及不可預測。例如，著絲粒區及亞端粒區特別容易發生轉殖基因緘默。相互地，新整合之基因可能影響周圍之內源性基因及染色質，潛在地改變細胞行為或有利於細胞轉化。因此，將外源性DNA插入預選基因座諸如安全港基因座或基因體安全港(GSH)中對於安全性、效率、拷貝數控制、及可靠的基因反應控制係重要的。

靶向編輯可藉由不依賴於核酸酶之方法或藉由依賴於核酸酶之方法來達成。在不依賴於核酸酶之靶向編輯方法中，藉由宿主細胞之酶促機制，同源重組由將要插入之外源性多核苷酸側翼之同源序列指導。

替代地，藉由特異性稀有切割核酸內切酶特異性引入雙鏈斷裂(DSB)，可以更高的頻率達成靶向編輯。此種依賴於核酸酶之靶向編輯利用DNA修復機制，包括非同源末端連接(NHEJ)，其回應於DSB而發生。在沒有含有外源性基因物質之供體載體之情況下，NHEJ通常會導致少量內源性核苷酸之隨機插入或缺失(in/del)。相比之下，當存在含有側翼為一對同源臂之外源性基因物質之供體載體時，外源性基因物質可藉由同源重組在同源定向修復(HDR)過程中被引入至基因體中，從而導致「靶向整合」。在一些情況下，靶向整合位點旨在位於所選之基因之編碼區內，且因此靶向整合可破壞基因表現，從而導致在一個單一編輯步驟中同時嵌入及剔除(KI/KO)。

可達成在關注之基因座(GOI)中之所選之位置處插入一或多個轉殖基因，以同時剔除該基因。適用於同時嵌入及剔除(KI/KO)之基因座包括但不限於B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD58、CD54、CD56、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT。藉由用於位置選擇性插入之各別位點特異性靶向同源臂，允許（多個）轉殖基因在該位點處之內源性啟動子下或包含在構築體中之外源性啟動子下表現。當二或更多個轉殖基因被插入CD38基因座中之所選之位置處時，連接子序列（例如，2A連接子或IRES）被置於任何兩個轉殖基因之間。2A連接子編碼衍生自例如FMDV、ERAV、PTV-I、或TaV之自切割肽（分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」、及「T2A」)，允許自單一翻譯產生單獨的蛋白質。在一些實施例中，構築體中包括絕緣體以降低轉殖基因及/或外源性啟動子緘默之風險。在各種實施例中，外源性啟動子可為CAG，或其他構成性、可誘導性、時間型、組織型、或細胞類型特異性啟動子，包括但不限於CMV、EF1α、PGK、及UBC。

能夠引入特異性及靶向DSB之可用核酸內切酶包括但不限於鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)、RNA引導之CRISPR（成簇之規則間隔短回文重複序列）系統。額外地，利用phiC31及Bxb1整合酶之DICE（雙整合酶匣交換）系統亦係用於靶向整合之有前途的工具。

ZFN係靶向核酸酶，其包含與鋅指DNA結合域融合之核酸酶。「鋅指DNA結合域」或「ZFBD」係指藉由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之多肽域。鋅指係鋅指結合域內約30個胺基酸之域，其結構藉由鋅離子之配位而穩定。鋅指之實例包括但不限於C ₂H ₂鋅指、C ₃H鋅指、及C ₄鋅指。「經設計之」鋅指域係自然界中不存在之域，其設計/組成主要來自合理的標準，例如應用取代規則及計算機化演算法來處理存儲現有ZFP設計及結合資料資訊之資料庫中之資訊。參見，例如，美國專利第6,140,081號；第6,453,242號；及第6,534,261號；亦參見WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536、及WO 03/016496。「所選之」鋅指域係自然界中未發現之域，其產生主要來自經驗過程，諸如噬菌體展示、相互作用陷阱、或混成選擇。ZFN更詳細地描述於美國專利第7,888,121號及美國專利第7,972,854號中，其全部揭露內容以引用方式併入本文中。所屬技術領域中最公認之ZFN之實例係FokI核酸酶與鋅指DNA結合域之融合。

TALEN係靶向核酸酶，其包含與TAL效應子DNA結合域融合之核酸酶。「轉錄活化因子樣效應子DNA結合域」、「TAL效應子DNA結合域」、或「TALE DNA結合域」係指負責TAL效應子蛋白與DNA結合之TAL效應子蛋白之多肽域。TAL效應子蛋白由黃單胞菌屬之植物病原體在感染過程中分泌。此等蛋白質進入植物細胞核，經由其DNA結合域結合效應子特異性DNA序列，並經由其反式活化域活化此等序列處之基因轉錄。TAL效應子DNA結合域特異性依賴於不完全的34個胺基酸重複之效應子可變數目，其包含在選擇重複位置處之多態性，稱為重複可變雙胺基酸殘基(RVD)。TALEN更詳細描述於美國公開案第2011/0145940號中，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中最公認之TALEN實例係FokI核酸酶與TAL效應子DNA結合域之融合多肽。

發現用於本發明方法中之靶向核酸酶之另一實例係靶向Spo11核酸酶，包含與DNA結合域（例如，鋅指DNA結合域、TAL效應子DNA結合域等）融合之具有核酸酶活性之Spo11多肽之多肽，該多肽對關注之DNA序列具有特異性。

適用於本發明實施例之靶向核酸酶之額外實例包括但不限於Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1、及Wβ/SPBc/TP901-1，無論單獨使用還是組合使用。

靶向核酸酶之其他非限制性實例包括天然存在之及重組之核酸酶；來自包括cas、cpf、cse、csy、csn、csd、cst、csh、csa、csm、及cmr之家族之CRISPR相關核酸酶；限制性核酸內切酶；大核酸酶；歸巢核酸內切酶等。

以Cas9為例，CRISPR/Cas9需要兩種主要組分：(1) Cas9核酸內切酶及(2) crRNA-tracrRNA錯合物。當共表現時，該兩種組分形成錯合物，該錯合物被募集至包含PAM及PAM附近之播種區之標靶DNA序列。crRNA及tracrRNA可經組合以形成嵌合引導RNA (gRNA)，以引導Cas9靶向所選之序列。然後，該兩種組分可以經由轉染或轉導被遞送至哺乳動物細胞。

DICE介導之插入使用一對重組酶（例如，phiC31及Bxb1），以提供外源性DNA之單向整合，其被嚴格限制於每種酶自身之小attB及attP辨識位點。由於此等標靶att位點並非天然存在於哺乳動物基因體中，因此它們必須首先被引入至期望整合位點處之基因體中。參見例如美國公開案第2015/0140665號，其揭露內容以引用方式併入本文中。

本發明之一個態樣提供一種包含用於靶向基因體整合之一或多種外源性多核苷酸之構築體。在一個實施例中，該構築體進一步包含對期望整合位點特異之一對同源臂，並且靶向整合之方法包含將該構築體引入至細胞中，以藉由細胞宿主酶機制實現位點特異性同源重組。在另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多種外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，並將包含對期望整合位點特異之DNA結合域之ZFN表現匣引入至細胞中，以實現ZFN介導之插入。在再另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多種外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，並將包含對期望整合位點特異之DNA結合域之TALEN表現匣引入至細胞中，以實現TALEN介導之插入。在另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多種外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，將Cas9表現匣及包含對期望整合位點特異之引導序列之gRNA引入至細胞中，以實現Cas9介導之插入。在又另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一對DICE重組酶之一或多個att位點之構築體引入至細胞中之期望整合位點，將包含一個或多個外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，以及引入用於DICE重組酶之表現匣，以實現DICE介導之靶向整合。

靶向整合之有希望的位點包括但不限於安全港基因座或基因體安全港(GSH)，其為人類基因體之基因內或基因外區，理論上，該等區能夠適應新整合之DNA之可預測表現，而對宿主細胞或生物體沒有不利影響。有用之安全港必須允許足夠的轉殖基因表現，以產生載體編碼之蛋白質或非編碼RNA之期望水平。安全港亦不能使細胞傾向於惡性轉化，亦不能改變細胞功能。對於作為潛在安全港基因座之整合位點，它理想地需要滿足以下標準，該等標準包括但不限於：如藉由序列注釋所判斷，調控要件或基因沒有被破壞；係基因密集區域中之基因間區域，或者係以相對方向轉錄之兩個基因之間匯合處之位置；保持距離，以最小化載體編碼之轉錄活化因子與相鄰基因（具體地癌症相關基因及微型RNA基因）之啟動子之間之長距離相互作用之可能性；並且具有明顯普遍存在的轉錄活性，如廣泛的空間及時間表現序列標簽(EST)表現模式所反映的，表明普遍存在的轉錄活性。後一個特徵在幹細胞中尤其重要，其中在分化過程中，染色質重塑一般導致一些基因座之緘默及其他基因座之潛在活化。在適於外源性插入之區內，選擇用於插入之精確基因座應沒有重複要件及保守序列，並且可以容易地設計用於擴增同源臂之引物。

用於人類基因體編輯或特別地靶向整合之合適位點包括但不限於腺相關病毒位點1 (AAVS1)、趨化因子（CC模體）受體5 ( CCR5)基因座、及小鼠ROSA26基因座之人類直系同源物。額外地，小鼠H11基因座之人類直系同源物亦可以係使用本文所揭示之靶向整合之組成物及方法進行插入之合適位點。此外，膠原蛋白及HTRP基因座亦可用作靶向整合之安全港。然而，對每個所選之位點之驗證已被證明特別地在幹細胞中對於特定整合事件係必要的，並且通常需要將插入策略（包括啟動子選擇、外源性基因序列、及排列）以及構築體設計最佳化。

對於靶向in/del，編輯位點通常包含在其表現及/或功能將被破壞之內源性基因中。在一些實施例中，包含靶向in/del之內源性基因與免疫反應調控及調節相關聯。在一些其他實施例中，包含靶向in/del之內源性基因與靶向模式、受體、傳訊分子、轉錄因子、藥物標靶候選物、免疫反應調控及調節、或抑制幹細胞及/或前驅細胞及其衍生之細胞之植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、及/或存活之蛋白質相關聯。

因此，本發明之另一態樣提供一種在所選之基因座中靶向整合之方法，該基因座包括基因體安全港或已知或被證明係安全且對連續或暫時基因表現調控良好之預選基因座，諸如本文提供之B2M、TAP1、TAP2、Tapasin、TRAC、或CD38基因座。在一個實施例中，用於靶向整合方法之基因體安全港包含一或多個期望整合位點，該一或多個整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR、或RUNX1，或滿足基因體安全港標準之其他基因座。在一個實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多個外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，並引入包含對期望整合位點特異之一對同源臂及一或多種外源性序列之構築體，以藉由細胞宿主酶機制實現位點特異性同源重組，其中期望整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、TCR、或RUNX1，或滿足基因體安全港標準之其他基因座。額外之整合位點包括意在用於破壞（諸如減少或剔除）之內源性基因座，其包含B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD54、CD56、CD58、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT。

在另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多個外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，並將包含對期望整合位點特異之DNA結合域之ZFN表現匣引入至細胞中，以實現ZFN介導之插入，其中期望整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT。在再另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多個外源性聚期望核苷酸之構築體引入至細胞中，並將包含對整合位點特異之DNA結合域之TALEN表現匣引入至細胞中，以實現TALEN介導之插入，其中期望整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT。在另一實施例中，在細胞中靶向整合之方法包含將包含一或多個外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，並將Cas9表現匣及包含對期望整合位點特異之gRNA引入至細胞中，以實現Cas9介導之插入，其中期望整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT。在又另一實施例中，細胞中靶向整合之方法包含將包含一對DICE重組酶之一或多個att位點之構築體引入至細胞中之期望整合位點，將包含一或多個外源性多核苷酸之構築體引入至細胞中，並引入用於DICE重組酶之表現匣，以實現DICE介導之靶向整合，其中期望整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT。

此外，如本文所提供的，上述用於在安全港中靶向整合之方法用於插入任何關注之多核苷酸，例如，編碼安全開關蛋白、靶向模式、受體、傳訊分子、轉錄因子、醫藥活性蛋白及肽、藥物標靶候選物、及促進幹細胞及/或前驅細胞之植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、及/或存活之蛋白質之多核苷酸。在一些其他實施例中，包含一或多個外源性多核苷酸之構築體進一步包含一或多種標記基因。在一個實施例中，本發明構築體中之外源性多核苷酸係編碼安全開關蛋白之自殺基因。用於經誘導之細胞死亡之合適自殺基因系統包括但不限於凋亡蛋白酶9（或凋亡蛋白酶3或凋亡蛋白酶7）及AP1903；胸苷激酶(TK)及更昔洛韋(GCV)；胞嘧啶脫胺酶(CD)、及5-氟胞嘧啶(5-FC)。額外地，一些自殺基因系統係細胞類型特異性的，例如，用B細胞分子CD20基因修飾T淋巴球允許在投予mAb利妥昔單抗後消除它們。此外，當細胞暴露於西妥昔單抗時，含有被西妥昔單抗辨識之表位之經修飾之EGFR可用於耗竭經基因工程改造之細胞。因此，本發明之一個態樣提供一種靶向整合編碼安全開關蛋白之一或多個自殺基因之方法，該等安全開關蛋白選自凋亡蛋白酶9（凋亡蛋白酶3或凋亡蛋白酶7）、胸苷激酶、胞嘧啶脫胺酶、經修飾之EGFR、及B細胞CD20。

在一些實施例中，藉由本文所述方法整合之一或多個外源性多核苷酸由包含在用於靶向整合之構築體中之可操作連接之外源性啟動子驅動。啟動子可以係可誘導性或構成性的，並且可以係時間特異性、組織特異性、或細胞類型特異性的。用於本發明方法之合適之構成性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)、延伸因子1α (EF1α)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、混成CMV增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)、及泛素C (UBC)啟動子。在一個實施例中，外源啟動子係CAG。

藉由本文所述方法整合之外源性多核苷酸可由宿主基因體中整合位點處之內源性啟動子驅動。在一個實施例中，本文描述之方法用於對細胞基因體中AAVS1基因座處之一或多個外源性多核苷酸進行靶向整合。在一個實施例中，至少一個經整合之多核苷酸由內源性AAVS1啟動子驅動。在另一實施例中，本文描述之方法用於在細胞基因體中ROSA26基因座處進行靶向整合。在一個實施例中，至少一個經整合之多核苷酸由內源性ROSA26啟動子驅動。在另一實施例中，本文描述之方法用於在細胞基因體中H11基因座處進行靶向整合。在一個實施例中，至少一個經整合之多核苷酸由內源性H11啟動子驅動。在另一實施例中，本文描述之方法用於在細胞基因體中膠原蛋白基因座處進行靶向整合。在一個實施例中，至少一個經整合之多核苷酸由內源性膠原蛋白啟動子驅動。在另一實施例中，本文描述之方法用於在細胞基因體中HTRP基因座處進行靶向整合。在一個實施例中，至少一個經整合之多核苷酸由內源性HTRP啟動子驅動。理論上，僅期望位置處之正確插入將能實現內源性啟動子驅動之外源性基因之基因表現。

在一些實施例中，用於靶向整合方法之構築體中包含之一或多個外源性多核苷酸由一個啟動子驅動。在一些實施例中，該構築體在由相同啟動子驅動之兩個相鄰多核苷酸之間包含一或多個連接子序列，以在該部分之間提供更大的物理分離，並最大化對酶機制之可及性。連接子序列之連接子肽可由胺基酸組成，其根據相關功能經選擇以使各部分（外源性多核苷酸及/或由其編碼之蛋白質或肽）之間之物理分離更具可撓性或更具剛性。連接子序列可被蛋白酶切割或化學切割以產生單獨的部分。連接子中酶切割位點之實例包括供蛋白水解酶諸如腸激酶、因子Xa、胰蛋白酶、膠原酶、及凝血酶之切割之位點。在一些實施例中，蛋白酶係由宿主天然產生者，或者係外源性引入。替代地，連接子中之切割位點可以係在暴露於所選之化學物質（例如，溴化氰、羥胺、或低pH）時能夠被切割之位點。可選的連接子序列可用於除提供切割位點之外之目的。連接子序列應允許該部分相對於另一相鄰部分進行有效定位，以便該部分正確發揮功能。連接子亦可為足夠長之簡單胺基酸序列，以預防各部分之間之任何立體阻礙。此外，連接子序列可提供翻譯後修飾，包括但不限於，例如磷酸化位點、生物素化位點、硫酸化位點、γ-羧基化位點等。在一些實施例中，連接子序列係可撓性的，使得不會將生物活性肽保持在單一非期望構象中。連接子可主要包含具有小側鏈之胺基酸，諸如甘胺酸、丙胺酸、及絲胺酸，以提供可撓性。在一些實施例中，約百分之80至90或更多之連接子序列包含甘胺酸、丙胺酸、或絲胺酸殘基，具體地甘胺酸及絲胺酸殘基。在若干實施例中，G4S連接子肽將融合蛋白之末端處理域與核酸內切酶域分開。在其他實施例中，2A連接子序列允許自單一翻譯中產生兩種獨立的蛋白質。合適之連接子序列可憑經驗容易地鑑別。額外地，連接子序列之合適大小及序列亦可以藉由習知電腦模擬技術來判定。在一個實施例中，連接子序列編碼自切割肽。在一個實施例中，自切割肽係2A。在一些其他實施例中，連接子序列提供內部核糖體進入序列(IRES)。在一些實施例中，任何兩個連續連接子序列皆係不同。

將包含用於靶向整合之外源性多核苷酸之構築體引入細胞之方法可使用本身已知之將基因轉移至細胞之方法來達成。在一個實施例中，構築體包含病毒載體之主鏈，諸如腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、或仙台病毒載體。在一些實施例中，質體載體用於將外源性多核苷酸遞送及/或表現至目標細胞（例如，pAl- 11、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）等。在一些其他實施例中，附加型載體用於將外源性多核苷酸遞送至目標細胞。在一些實施例中，重組腺相關病毒(rAAV)可用於基因工程改造，以藉由同源重組引入插入、缺失、或取代。與慢病毒不同，rAAV不整合至宿主基因體中。此外，與習知靶向質體之轉染相比，附加型rAAV載體以高得多的速率介導同源定向基因靶向。在一些實施例中，AAV6或AAV2載體用於在iPSC基因體之標靶位點中引入插入、缺失、或取代。在一些實施例中，使用本文描述之方法及組成物獲得之基因體修飾之iPSC及其衍生性細胞包含表4中所列之至少一種基因型。 III. 獲得及維持經基因體工程改造之iPSC 之方法

在各種實施例中，本發明亦提供一種獲得及維持經基因體工程改造之iPSC之方法，該等iPSC包含在一或多個期望位點處之一或多個靶向編輯（例如，多重工程改造），其中該一或多個靶向編輯在經擴增之基因體工程改造之iPSC或iPSC衍生之非多潛能細胞中在各別所選之編輯位點處保持完整及功能。靶向編輯將插入、缺失、及/或取代引入至iPSC及其衍生性細胞之基因體中（即，在所選之位點處之靶向整合及/或in/del）。與患者來源的、周邊血液來源的原代效應細胞之直接工程改造相比，藉由編輯及分化本文提供之iPSC獲得經基因工程改造之衍生性細胞之許多益處包括但不限於：用於經工程改造之效應細胞之無限來源；不需要重複操縱效應細胞，尤其當涉及多種經工程改造之模式時；所獲得之效應細胞經再生，具有延長之端粒並經歷較少之衰竭；效應細胞群體在編輯位點、拷貝數方面係均質的，並且沒有等位基因變異、隨機突變、及表現變異，此主要導因於本文提供之經工程改造之iPSC中啟用之無性繁殖系選擇。

在一些實施例中，在一或多個所選之位點處包含一或多個靶向編輯之經基因體工程改造之iPSC在細胞維持培養基(FMM)中作為單細胞維持、傳代、及擴增一延長之時間段，其中iPSC在（多個）所選之位點處保留靶向編輯及功能修飾。在FMM中培養之iPSC已經顯示出繼續保持其未分化之、及基礎或原始之特徵；提供基因體穩定性，無需進行培養物清洗或選擇；並且容易產生所有三種體細胞譜系，其經由胚狀體或單層進行體外分化（不形成胚狀體）；以及藉由經由畸胎瘤形成進行體內分化。參見例如國際公開案第WO2015/134652號，其揭露內容以引用方式併入本文中。

在一些實施例中，包含一或多個靶向整合及/或in/del之經基因體工程改造之iPSC在包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、及ROCK抑制劑且不含或基本不含TGFβ受體/ALK5抑制劑之培養基(FMM)中維持、傳代、及擴增，其中iPSC在所選之位點處保留完整的及功能性靶向編輯。

本發明之另一態樣提供一種藉由以下方式來產生經基因體工程改造之iPSC之方法：藉由iPSC之靶向編輯；或藉由靶向編輯首先產生經基因體工程改造之非多潛能細胞，且隨後將所選之/經單離之經基因體工程改造之非多潛能細胞重新程式化以獲得包含與非多潛能細胞相同之靶向編輯之iPSC。本發明之一進一步態樣提供基因體工程改造非多潛能細胞，其藉由將靶向整合及/或靶向in/del引入至細胞中而同時進行重新程式化，其中接觸之非多潛能細胞處於用於重新程式化之充分條件下，且其中用於重新程式化之條件包含將非多潛能細胞與一或多種重新程式化因子及小分子接觸。在用於同時進行基因體工程改造及重新程式化之方法之各種實施例中，可以在藉由使非多潛能細胞與一或多種重新程式化因子及可選地一或多個小分子接觸來起始重新程式化之前，或基本上與之同時，將靶向整合及/或靶向in/del引入至非多潛能細胞中。

在一些實施例中，為了同時對非多潛能細胞進行基因體工程改造及重新程式化，在藉由使非多潛能細胞與一或多種重新程式化因子及小分子接觸而起始重新程式化之多日過程之後，亦可將靶向整合及/或in/del引入至非多潛能細胞中，且其中在重新程式化細胞呈現一或多種內源性多潛能基因（包括但不限於SSEA4、Tra181、及CD30）之穩定表現之前引入攜帶構築體之載體。

在一些實施例中，藉由使非多潛能細胞與至少一種重新程式化因子及可選地TGFβ受體/ALK抑制劑、MEK抑制劑、GSK3抑制劑、及ROCK抑制劑之組合接觸來起始重新程式化。在一些實施例中，使用包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、及ROCK抑制劑之組合之混合物進一步維持及擴增藉由上述任何方法產生之經基因體工程改造之iPSC。

在產生經基因體工程改造之iPSC之方法之一些實施例中，該方法包含：藉由將一或多個靶向整合及/或in/del引入至iPSC中來對iPSC進行基因體經工程改造，以獲得具有本文提供之基因型之經基因體工程改造之iPSC。替代地，產生經基因體工程改造之iPSC之方法包含：(a)將一或多種靶向編輯引入至非多潛能細胞中，以獲得在所選之位點處包含靶向整合及/或in/del之經基因體工程改造之非多潛能細胞，及(b)將經基因體工程改造之非多潛能細胞與一或多種重新程式化因子及可選地包含TGFβ受體/ALK抑制劑、MEK抑制劑、GSK3抑制劑、及/或ROCK抑制劑之小分子組成物接觸，以獲得在所選之位點處包含靶向整合及/或in/del之經基因體工程改造之iPSC。替代地，產生經基因體工程改造之iPSC之方法包含：(a)使非多潛能細胞與一或多種重新程式化因子及可選地包含TGFβ受體/ALK抑制劑、MEK抑制劑、GSK3抑制劑、及/或ROCK抑制劑之小分子組成物接觸，以起始非多潛能細胞之重新程式化；(b)使一或多個靶向整合及/或in/del引入至重新程式化非多潛能細胞中，用於基因體工程改造；及(c)獲得在所選之位點處包含靶向整合及/或in/del之無性繁殖系基因體工程改造之iPSC。上述方法中之任一者可進一步包含經基因體工程改造之iPSC之單細胞分選以獲得無性繁殖iPSC，及/或在經基因體工程改造之iPSC中篩選脫靶編輯及異常核型。藉由經基因體工程改造之iPSC之無性繁殖系擴增，產生包含單細胞分選及擴增之無性繁殖系工程改造之iPSC之主細胞庫，該等無性繁殖系工程改造之iPSC具有本文提供之至少一種表型。隨後冷凍保存該主細胞庫，提供用於額外iPSC工程改造之平台及用於製造現成經工程改造之均質細胞療法產品之可再生來源，該等產品在組成上定義明確且均勻，並且可以成本有效方式大規模生產。

重新程式化因子選自由OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28, C-MYC, ECAT1、UTF1、ESRRB、SV40LT、HESRG、CDH1、TDGF1、DPPA4、DNMT3B、ZIC3、L1TD1、及其任何組合組成之群組，如國際公開案第WO2015/134652號及第WO 2017/066634號中所揭示，其揭露內容以引用方式併入本文中。一或多種重新程式化因子可為多肽之形式。重新程式化因子亦可為編碼重新程式化因子之多核苷酸之形式，且因此可藉由載體諸如反轉錄病毒、仙台病毒、腺病毒、附加體、質體、及微環被引入至非多潛能細胞中。在一些實施例中，編碼至少一種重新程式化因子之一或多種多核苷酸藉由慢病毒載體被引入。在一些實施例中，一或多個多核苷酸藉由附加型載體被引入。在各種其他實施例中，一或多個多核苷酸藉由仙台病毒載體被引入。在一些實施例中，一或多個多核苷酸藉由質體組合被引入。參見例如國際公開案第WO2019/075057A1號，其揭露內容以引用方式併入本文中。

在一些實施例中，非多潛能細胞藉由多個載體用包含不同外源性多核苷酸及/或不同啟動子之多個構築體轉染，用於在相同或不同所選之位點處進行靶向整合。此等外源性多核苷酸可包含自殺基因，或編碼靶向模式、受體、傳訊分子、轉錄因子、醫藥活性蛋白及肽、藥物標靶候選物之基因，或編碼促進iPSC或其衍生性細胞之植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、及/或存活之蛋白質之基因。在一些實施例中，外源性多核苷酸編碼RNA，包括但不限於siRNA、shRNA、miRNA、及反義核酸。此等外源性多核苷酸可由選自由構成性啟動子、可誘導性啟動子、時間特異性啟動子、及組織或細胞類型特異性啟動子組成之群組之一或多種啟動子驅動。因此，當在活化啟動子之條件下，例如，在誘導劑存在之情況下或在特定分化細胞類型中，多核苷酸係可表現的。在一些實施例中，多核苷酸在iPSC及/或自iPSC分化之細胞中表現。在一個實施例中，一或多個自殺基因由構成性啟動子驅動，例如由CAG驅動之Capase-9。包含不同外源性多核苷酸及/或不同啟動子之此等構築體可以同時或連續轉染至非多潛能細胞中。經受多個構築體之靶向整合之非多潛能細胞可以同時接觸一或多種重新程式化因子，以與基因體工程改造同時起始重新程式化，從而獲得在同一細胞池中包含多個靶向整合之經基因體工程改造之iPSC。因此，此種穩健方法使得能夠進行並行重新程式化及工程改造策略，以得到無性繁殖系基因工程改造之iPSC，其具有整合至一或多個所選之靶位點中之多種模式。 IV. 藉由分化經基因體工程改造之iPSC 來獲得經基因工程改造之效應細胞之方法

本發明之另一態樣提供一種藉由畸胎瘤形成在體內分化經基因體工程改造之iPSC之方法，其中在體內衍生自經基因體工程改造之iPSC之分化細胞保留完整及功能性靶向編輯，包括（多個）期望位點處之（多個）靶向整合及/或in/del。在一些實施例中，經由畸胎瘤形成在體內衍生自經基因體工程改造之iPSC之分化細胞包含整合在一或多個期望位點處之一或多個可誘導性自殺基因，該一或多個期望位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP H11、β-2微球蛋白、CD38、GAPDH、TCR、或RUNX1、或滿足基因體安全港標準之其他基因座。在一些其他實施例中，經由畸胎瘤形成在體內衍生自經基因體工程改造之iPSC之分化細胞包含編碼靶向模式之多核苷酸，或編碼促進幹細胞及/或前驅細胞之運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、及/或存活之蛋白質之多核苷酸。在一些實施例中，經由畸胎瘤形成在體內衍生自經基因體工程改造之iPSC之分化細胞包含一或多種可誘導性自殺基因，其進一步包含與免疫反應調控及介導相關聯之內源性基因中之一或多種in/del。在一些實施例中，in/del包含在一或多個內源性檢查點基因中。在一些實施例中，in/del包含在一或多個內源性T細胞受體基因中。在一些實施例中，in/del包含在一或多個內源性MHC I類抑制基因中。在一些實施例中，in/del包含在與主要組織相容性複合體相關聯之一或多個內源性基因中。在一些實施例中，in/del包含在一或多種內源性基因中，包括但不限於AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT。

在一些實施例中，包含本文提供之一或多種基因修飾之經基因體工程改造之iPSC用於在體外衍生造血細胞譜系或任何其他特定細胞類型，其中衍生之非多潛能細胞保留功能性基因修飾，包括在所選之位點處之靶向編輯。在一些實施例中，用於在體外衍生造血細胞譜系或任何其他特定細胞類型之經基因體工程改造之iPSC係在其使用前冷凍保存及解凍之主細胞庫細胞。在一個實施例中，經基因體工程改造之iPSC衍生之細胞包括但不限於，具有確定性生血內皮(HE)潛能之中胚層細胞、確定性HE、CD34 ⁺造血細胞、造血幹細胞及前驅細胞、造血多潛能前驅細胞(MPP)、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、骨髓細胞、嗜中性球前驅細胞、T細胞、NKT細胞、NK細胞、B細胞、嗜中性球、樹突細胞、及巨噬細胞，其中衍生自經基因體工程改造之iPSC之細胞保留功能性基因修飾，包括在期望位點處之靶向編輯。

用於獲得iPSC衍生之造血細胞譜系之適用分化方法及組成物包括例如在國際公開案第WO2017/078807號中描繪之彼等，其揭露內容以引用方式併入本文中。如所提供的，用於產生造血細胞譜系之方法及組成物係在無血清、無餵養細胞、及/或無基質之條件下，且在不需要EB形成之可擴展之單層培養平台中，藉由衍生自多潛能幹細胞（包括iPSC）之確定性生血內皮(HE)來進行。可根據所提供之方法分化之細胞在自多潛能幹細胞至定型為特定終末分化細胞及轉分化細胞之前驅細胞，以及不經過多潛能中間物直接轉變為造血命運之各種譜系之細胞。類似地，藉由分化幹細胞產生之細胞介於多潛能幹細胞或前驅細胞至終末分化細胞，以及所有介於其間之造血細胞譜系範圍內。

在單層培養中自多潛能幹細胞分化及擴增造血譜系細胞之方法包含使多潛能幹細胞與BMP途徑活化劑及可選地bFGF接觸。如所提供的，獲得並擴增多潛能幹細胞衍生之中胚層細胞，而不自多潛能幹細胞形成胚狀體。然後使中胚層細胞與BMP途徑活化劑、bFGF、及WNT途徑活化劑接觸，以獲得具有確定性生血內皮(HE)潛能之經擴增之中胚層細胞，而不自多潛能幹細胞形成胚狀體。藉由隨後與bFGF及可選地ROCK抑制劑及/或WNT途徑活化劑接觸，具有確定性HE潛能之中胚層細胞分化為確定性HE細胞，其亦在分化期間擴增。

本文提供之用於獲得造血譜系細胞之方法優於EB介導之多潛能幹細胞分化，因為EB形成導致適度至最小的細胞擴增，不允許單層培養，此對於需要群體中細胞之均質擴增及均質分化之許多應用而言係重要的，並且費力且效率低。

所提供之單層分化平台有利於向確定性生血內皮細胞分化，導致造血幹細胞及分化之子代諸如T細胞、B細胞、NKT細胞、及NK細胞之衍生。單層分化策略將增強之分化效率與大規模擴增相結合，並能夠針對各種治療應用遞送治療相關數目之多潛能幹細胞衍生之造血細胞。此外，使用本文提供之方法進行單層培養產生功能性造血譜系細胞，其能夠進行全範圍的體外分化、離體調節、及體內長期造血自我更新、重建、及植入。如所提供的，iPSC衍生之造血譜系細胞包括但不限於確定性生血內皮、造血多潛能前驅細胞、造血幹細胞及前驅細胞、T細胞前驅細胞、NK細胞前驅細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞、巨噬細胞、及嗜中性球。

因此，在各種實施例中，用於導向多潛能幹細胞分化為確定性生造血譜系細胞之方法包含：(i)使多潛能幹細胞與包含BMP活化劑及可選地bFGF之組成物接觸，以起始自多潛能幹細胞分化及擴增中胚層細胞；(ii)使中胚層細胞與包含BMP活化劑、bFGF、及GSK3抑制劑之組成物接觸，其中該組成物可選地不含TGFβ受體/ALK抑制劑，以起始自中胚層細胞分化及擴增具有確定性HE潛能之中胚層細胞；(iii)使具有確定性HE潛能之中胚層細胞與包含ROCK抑制劑；選自由bFGF、VEGF、SCF、IGF、EPO、IL6、及IL11組成之群組之一或多種生長因子及細胞介素；及可選地Wnt途徑活化劑之組成物接觸，其中該組成物可選地不含TGFβ受體/ALK抑制劑，以起始自具有確定性生血內皮潛能之多潛能幹細胞衍生之中胚層細胞分化及擴增確定性生血內皮。

在一些實施例中，該方法進一步包含使多潛能幹細胞與包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、及ROCK抑制劑之組成物（其中該組成物不含TGFβ受體/ALK抑制劑）接觸，以接種及擴增多潛能幹細胞。在一些實施例中，多潛能幹細胞係iPSC，或天然iPSC，或包含一或多種基因印記之iPSC；並且iPSC中包含之一或多種基因印記保留在自其分化之造血細胞中。在用於導向多潛能幹細胞分化為造血譜系細胞之方法之一些實施例中，多潛能幹細胞分化為造血譜系細胞不產生胚狀體，並且係單層培養形式。

在上述方法之一些實施例中，所獲得之多潛能幹細胞衍生之確定性生血內皮細胞係CD34 ⁺。在一些實施例中，所獲得之確定性生血內皮細胞係CD34 ⁺CD43 ^-。在一些實施例中，確定性生血內皮細胞係CD34 ⁺CD43 ^-CXCR4 ^-CD73 ^-。在一些實施例中，確定性生血內皮細胞係CD34 ⁺CXCR4 ^-CD73 ^-。在一些實施例中，確定性生血內皮細胞係CD34 ⁺CD43 ^-CD93 ^-。在一些實施例中，確定性生血內皮細胞係CD34 ⁺CD93 ^-。

在上述方法之一些實施例中，該方法進一步包含(i)使多潛能幹細胞衍生之確定性生血內皮與包含ROCK抑制劑；選自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、及IL7組成之群組之一或多種生長因子及細胞介素；及可選地BMP活化劑之組成物接觸；以起始確定性生血內皮向前T細胞前驅細胞之分化；及可選地，(ii)使前T細胞前驅細胞與包含選自由SCF、Flt3L、及IL7組成之群組之一或多種生長因子及細胞介素，但不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化劑及ROCK抑制劑中之一或多者之組成物接觸，以起始前T細胞前驅細胞向T細胞前驅細胞或T細胞之分化。在該方法之一些實施例中，多潛能幹細胞衍生之T細胞前驅細胞係CD34 ⁺CD45 ⁺CD7 ⁺。在該方法之一些實施例中，多潛能幹細胞衍生之T細胞前驅細胞係CD45 ⁺CD7 ⁺。

在上述用於導向多潛能幹細胞分化為造血譜系細胞之方法之再一些實施例中，該方法進一步包含：(i)使多潛能幹細胞衍生之確定性生血內皮與包含ROCK抑制劑；選自由VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7、及IL15組成之群組之一或多種生長因子及細胞介素；及可選地BMP活化劑之組成物接觸，以起始確定性生血內皮向前NK細胞前驅細胞之分化；及可選地，(ii)使多潛能幹細胞衍生之前NK細胞前驅細胞與包含選自由SCF、Flt3L、IL3、IL7、及IL15組成之群組之一或多種生長因子及細胞介素之組成物接觸，其中該培養基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP活化劑、及ROCK抑制劑中之一或多者，以起始前NK細胞前驅細胞向NK細胞前驅細胞或NK細胞之分化。在一些實施例中，多潛能幹細胞衍生之NK前驅細胞係CD3 ^-CD45 ⁺CD56 ⁺CD7 ⁺。在一些實施例中，多潛能幹細胞衍生之NK細胞係CD3 ^-CD45 ⁺CD56 ⁺，且可選地進一步由NKp46 ⁺、CD57 ⁺、及CD16 ⁺界定。

在一些實施例中，自上述方法獲得之經基因體工程改造之iPSC衍生之細胞包含整合在一或多個期望整合位點處之一或多個可誘導性自殺基因，該期望整合位點包含AAVS1、CCR5、ROSA26、膠原蛋白、HTRP、H11、GAPDH、RUNX1、B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR α或β恆定區、NKG2A、NKG2D、CD25、CD38、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CD71、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT，或滿足基因體安全港標準之其他基因座。在一些其他實施例中，經基因體工程改造之iPSC衍生之細胞包含編碼安全開關蛋白、靶向模式、受體、傳訊分子、轉錄因子、醫藥活性蛋白及肽、藥物標靶候選物，或促進幹細胞及/或前驅細胞之運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、及/或存活之蛋白質之多核苷酸。在一些實施例中，包含一或多種自殺基因之經基因體工程改造之iPSC衍生之細胞進一步包含與免疫反應調控及介導相關聯之一或多種內源性基因中包含之一或多種in/del，該等內源性基因包括但不限於檢查點基因、內源性T細胞受體基因、及MHC I類抑制基因。在一個實施例中，包含一或多種自殺基因之經基因體工程改造之iPSC衍生之細胞進一步包含B2M基因中之in/del，其中該B2M被剔除。

額外地，用於獲得第一命運之經基因體工程改造之造血細胞至第二命運之經基因體工程改造之造血細胞之適用去分化方法及組成物包括例如在國際公開案第WO2011/159726號中描繪之彼等，其揭露內容以引用方式併入本文中。其中提供之方法及組成物藉由在重新程式化期間限制內源性Nanog基因之表現，允許將起始非多潛能細胞部分地重新程式化為非多潛能中間細胞；及使非多潛能性中間細胞經受用於將中間細胞分化為期望細胞類型之條件。 V. 具有自經基因工程改造之iPSC 分化之功能模式之衍生性免疫細胞之治療用途

在一些實施例中，本發明提供一種包含功能增強之衍生性免疫細胞之經單離群體或亞群之組成物，該等衍生性免疫細胞已使用所揭示之方法及組成物自經基因工程改造之iPSC分化。在一些實施例中，組成物之iPSC包含如本文所揭示之一或多種靶向基因編輯，其可保留在iPSC衍生之效應細胞中，其中經基因工程改造之iPSC及其衍生性細胞適用於基於細胞之過繼療法。在一個實施例中，組成物之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含iPSC衍生之CD34 ⁺細胞。在一個實施例中，組成物之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含iPSC衍生之HSC細胞。在一個實施例中，組成物之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含iPSC衍生之proT細胞或T細胞。在一個實施例中，組成物之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含iPSC衍生之proNK細胞或NK細胞。在一個實施例中，組成物之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含iPSC衍生之免疫調控細胞或骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。

在組成物之一些實施例中，iPSC衍生之經基因工程改造之效應細胞被進一步離體調節以改善治療潛能。在組成物之一個實施例中，衍生自iPSC之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含數目或比率增加之天然T細胞、幹細胞記憶T細胞、及/或中樞記憶T細胞。在組成物之一個實施例中，衍生自iPSC之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含數目或比率增加之I型NKT細胞。在組成物之另一實施例中，衍生自iPSC之經基因工程改造之效應細胞之經單離群體或亞群包含數目或比率增加之過繼NK細胞。在組成物之一些實施例中，經基因工程改造之CD34 ⁺細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、或衍生自iPSC之骨髓衍生之抑制細胞之經單離群體或亞群係同種異體的。在組成物之一些其他實施例中，經基因工程改造之CD34 ⁺細胞、HSC細胞、T細胞、NK細胞、或衍生自iPSC之MDSC之經單離群體或亞群係自體的。

在組成物之一些實施例中，用於分化之iPSC包含經選擇以在衍生之效應細胞中傳達所欲治療屬性之基因印記，前提為分化期間之細胞發育生物學不被破壞，且前提為該等基因印記在衍生自該iPSC之分化造血細胞中得以保留且為功能性的。

在組成物之一些實施例中，多潛能幹細胞之基因印記包含(i)在將非多潛能細胞重新程式化為iPSC期間或之後，藉由多潛能細胞基因體中之基因體插入、缺失、或取代而獲得之一或多種基因修飾形式；或(ii)來源特異性免疫細胞之一或多種可保留之治療屬性，其係供體特異性的、疾病特異性的、或治療反應特異性的，且其中多潛能細胞由來源特異性免疫細胞重新程式化得到，其中iPSC保留來源治療屬性，其亦包含在iPSC衍生之造血譜系細胞中。

在組成物之一些實施例中組成，經基因修飾之模式包含以下中之一或多者：安全開關蛋白、靶向模式、受體、傳訊分子、轉錄因子、醫藥活性蛋白及肽、藥物標靶候選物；或促進iPSC或其衍生性細胞之植入、運輸、歸巢、生存力、自我更新、持久性、免疫反應調控及調節、及/或存活之蛋白質。在組成物之一些實施例中，經基因修飾之iPSC及其衍生性細胞包含表4中所列之基因型。在組成物之一些其他實施例中，包含表4中所列基因型之經基因修飾之iPSC及其衍生性細胞進一步包含額外之經基因修飾之形式，其包含(1)缺失或破壞B2M、TAP1、TAP2、tapasin、NLRC5、CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCRα或TCRβ恆定區（TRAC或TRBC）、NKG2A、NKG2D、CD38、CD25、CD69、CD71、CD44、CD54、CD56、CD58、OX40、4-1BB、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、或TIGIT；及/或(2)引入HLA-E、HLA-G、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、CAR、TCR、Fc受體、或用於與雙特異性或多特異性或通用接合物耦合之表面觸發受體。

在組成物之又其他一些實施例中，iPSC衍生之造血譜系細胞包含與以下中之一或多者相關之來源特異性免疫細胞之治療屬性：(i)細胞毒性增加；(ii)持久性及/或存活率改善；(iii)遷移及/或活化或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力增強；(iv)腫瘤浸潤改善；(v)降低腫瘤免疫抑制之能力增強；(vi)挽救腫瘤抗原逃逸之能力改善；(vii)細胞凋亡得以控制；(viii)增強或獲得ADCC；及(ix)避免誤殺之能力。在組成物之一些實施例中，iPSC衍生之造血譜系細胞額外包含促進腫瘤位點處效應細胞之歸巢或運輸及滯留之治療屬性。

在組成物之一些實施例中，包含表4中所列基因型之iPSC衍生之造血細胞表現包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、或IL21、或其任何經修飾之蛋白質之全部或部分之至少一種細胞介素信號傳導錯合物，並表現本文所述之至少一CAR。在組成物之一些實施例中，細胞包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈，並表現包含IL2、IL4、IL7、IL9、IL15、及IL21之至少一種細胞介素信號傳導錯合物。在組成物之一些實施例中，細胞包含本文提供之實體腫瘤靶向主鏈，並表現包含IL7或IL15之至少一種細胞介素信號傳導錯合物。在組成物之一些實施例中，（多種）細胞介素及（多種）CAR之經工程改造之表現係NK細胞特異性的。在組成物之一些其他實施例中，（多種）細胞介素及（多種）CAR之經工程改造之表現係T細胞特異性的。在組成物之一些實施例中，iPSC衍生之造血效應細胞係抗原特異性的。在組成物之一些實施例中，抗原特異性衍生性效應細胞靶向液體腫瘤。在組成物之一些實施例中，抗原特異性衍生性效應細胞靶向實體腫瘤。在組成物之一些實施例中，抗原特異性iPSC衍生之造血效應細胞能夠拯救腫瘤抗原逃逸。額外地，本申請案藉由提供合理設計之效應細胞使組合治療方法成為可能，該等效應細胞能夠與腫瘤敏化程序協同作用，該腫瘤敏化程序上調匹配趨化因子之腫瘤細胞表現以增強效應細胞腫瘤位點歸巢、運輸、及滯留，此有助於增加效應細胞之細胞毒性及持久性。

如本文所提供的，將腫瘤細胞暴露於敏化劑（例如，輻射）提高腫瘤細胞對應力配體（包括但不限於趨化因子IL8）之分泌及/或表面表現。因此，如本文所述，藉由敏化進行之腫瘤預調理提供進一步增強過表現C-X-C模體趨化因子受體或其變體之效應細胞之治療效果之額外策略。不受理論之限制，藉由調節潛在致瘤機制（包括但不限於細胞週期進程、發炎、增殖、細胞凋亡、侵襲、灌注、轉移、及血管生成）使腫瘤細胞對另一選擇性藥物之活性更敏感，諸如具有如本文所述之期望之經工程改造之治療屬性之同種異體效應細胞，從而增強靶向腫瘤之治療性效應細胞之功效，可以利用腫瘤敏化來克服腫瘤抗性。

不受理論約束，本文所揭示之組成物及方法中有用之例示性敏化劑包括但不限於輻射療法、放射性醫藥、或化學治療劑。因此，如上所述，上述組成物可以進一步包含敏化劑。在各種實施例中，敏化劑藉由與腫瘤細胞接觸來增加趨化因子（包括CXCL8）之分泌及/或表面表現。

輻射療法之實施例包括但不限於外粒子束輻射療法，其中高能束（例如，x射線、伽馬射線、光子、質子、中子、離子、及可應用於此種治療之能量之任何其他形式）由機器產生，並且瞄準腫瘤；近接療法，其中包含或以其他方式連接至輻射源/粒子之種子、帶狀物、或膠囊被放置在腫瘤或癌細胞中或附近。放射性藥物（例如，放射性醫藥或放射性核素，包括放射性肽）之實施例包含連接至靶向分子（例如，抗體接合物）之放射性化合物。

在各種實施例中，暴露於或接觸癌症細胞或腫瘤細胞之輻射劑之量介於約0.0001 Gy至約80Gy範圍內。因此，在一些實施例中，提供給對象及/或包括在本文提供之組成物中之敏化劑之量為至少約0.0001 Gy、至少約0.0005 Gy、至少約0.001 Gy、至少約0.0015 Gy、至少約0.01 Gy、至少約0.015 Gy、至少約0.1 Gy、至少約0.15 Gy、至少約1.0 Gy、至少約1.5 Gy、至少約10.0 Gy、至少約15 Gy、至少約20.0 Gy、至少約25.0 Gy、至少約30.0 Gy、至少約35.0 Gy、至少約40.0 Gy、至少約45.0 Gy、至少約50.0 Gy、至少約55.0 Gy、至少約60.0 Gy、至少約65.0 Gy、至少約70.0 Gy、至少約75.0 Gy、至少約80.0 Gy、或其間之任何範圍。在一些實施例中，敏化劑之量為約25.0 Gy。

用作放射性醫藥之放射性化合物之實例包括但不限於鈣-47、碳-11、碳-14、鉻-51、鈷-57、鈷-58、鉺-169、氟-18、鎵-67、鎵-68、氫-3、銦-111、碘-123、碘-125、碘-131、鐵-59、氪-81m、鑥-177、氮-13、氧-15、磷-32、鐳-223、銣-82、釤-153、硒-75、鈉-22、鈉-24、鍶-89、鍀-99m、鉈-201、氙-133、及釔-90。

可潛在用於腫瘤細胞敏化之例示性化學治療劑包括但不限於烷基化劑（環磷醯胺、氮芥、mephalin、苯丁酸氮芥、heamethylmelamine、噻替哌、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀）、代謝物（胺甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁）、長春鹼類（長春新鹼、長春鹼、長春地辛）、表鬼臼毒素（依託泊苷、依託泊苷鄰醌、及替尼泊苷）、抗生素（道諾黴素、阿黴素、米托蒽醌、雙蒽烯、放線菌素D、普卡黴素、嘌呤黴素、及短桿菌肽D）、秋水仙鹼、細胞鬆弛素B、吐根鹼、美登素、及安吖啶。額外藥劑包括胺魯米特、順鉑、卡鉑、絲裂黴素、六甲蜜胺、環磷醯胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(CPT-11)、阿侖單抗、六甲蜜胺、阿那曲唑、L-天冬醯胺酶、阿扎胞苷、貝伐單抗、蓓薩羅丁、博萊黴素、硼替佐米、白消安、卡普睪酮、卡培他濱、塞來昔布、西妥昔單抗、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、達卡巴仁、地尼白介素、己烯雌酚、多西紫杉醇、屈他雄酮、泛艾黴素、埃羅替尼、雌莫司汀、依託泊苷、乙炔雌二醇、依西美坦、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱、氟他米特、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、戈舍瑞林、羥基脲、替伊莫單抗、艾達黴素、異環磷醯胺、伊馬替尼、幹擾素α(2a, 2b)、伊立替康、來曲唑、亞葉酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、鹽酸氮芥、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、胺甲喋呤、甲氧沙林、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、諾非妥莫單抗、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米磷酸二鈉、培美曲塞、培加酶、培門冬酶、噴司他丁、呱泊溴烷、普卡黴素、聚苯丙生、卟菲爾鈉、甲基苄肼、奎納克林、利妥昔單抗、沙格司亭、鏈脲菌素、泰莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾內酯、硫鳥嘌呤、噻替哌、曲妥珠單抗、維甲酸、烏拉莫司汀、戊柔比星、長春瑞濱、及唑來膦酸。其他合適之化學治療劑係經批准用於人類使用之彼等化學治療劑，包括將被批准作為化學治療劑或放射治療劑以及本領域已知之彼等化學治療劑。此等藥劑可以藉由數個標準內科醫生及腫瘤學家之參考文獻中之任一者（例如Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995）或藉由國家癌症研究所的網站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)來參考，二者皆會隨時更新。

藉由將本文所揭示之衍生性效應細胞及/或組成物引入至適於過繼細胞療法之對象，可改善多種疾病。在一些實施例中，本文提供之iPSC衍生之造血細胞或組成物用於同種異體過繼細胞療法。額外地，在一些實施例中，本發明提供上述免疫細胞及/或治療組成物及/或組合療法之治療用途，其藉由將細胞或組成物引入適於過繼細胞療法之對象來進行，其中該對象患有自體免疫疾病；血液惡性腫瘤；實體腫瘤；或與HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒、或BK多瘤病毒相關聯之感染。血液惡性腫瘤之實例包括但不限於急性及慢性白血病（急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病、多發性骨髓瘤、及骨髓增生不良症候群。實體癌之實例包括但不限於膀胱癌、骨癌、腦/CNS癌、乳癌、乳肺癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃/胃部癌、頭頸癌、腎臟癌、喉癌、肝癌、肺癌、轉移癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、唾液腺癌、皮膚癌、睾丸腫瘤、甲狀腺瘤、尿路上皮癌、及子宮/子宮內膜癌。各種自體免疫疾病之實例包括但不限於斑禿、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、皮肌炎、糖尿病（1型）、一些形式之幼年特發性關節炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病、格巴二氏症候群、特發性血小板減少性紫癜、重症肌無力、一些形式之心肌炎、多發性硬化症、天皰瘡/類天皰瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多發性肌炎、原發性膽汁性肝硬化、乾癬、類風濕性關節炎、硬皮病/系統性硬化症、乾燥症候群、全身性紅斑性狼瘡、一些形式之甲狀腺炎、一些形式之葡萄膜炎、白斑、肉芽腫性多血管炎（韋格納病）。病毒感染之實例包括但不限於HIV-（ 人類免疫缺乏病毒）、HSV-（單純皰疹病毒）、KSHV-（卡波西肉瘤相關皰疹病毒）、RSV-（呼吸道合胞病毒）、EBV-（艾司坦-巴爾病毒）、CMV-（巨細胞病毒）、VZV（水痘帶狀疱疹病毒）、腺病毒-相關病症、慢病毒-相關病症、BK多瘤病毒相關病症。

使用本文所揭示之實施例之衍生之造血譜系細胞或本文提供之組成物進行之治療可在出現症狀時進行，或用於預防復發。本文使用之用語「正治療(treating)」、「治療(treatment)」等通常係指獲得期望藥理學及/或生理學效果。就完全或部分預防疾病而言，該效果可為預防性的，及/或就部分或完全治癒疾病及/或由該疾病引起之副作用而言，該效果可為治療性的。本文所用之「治療」涵蓋對一對象中之疾病之任何干預，且包括：預防可能易患該疾病但尚未被診斷為患有該疾病之對象發生該疾病；及抑制疾病，即阻止其發展；或緩解疾病，即引起疾病消退。（多種）治療劑及/或組成物可以在疾病或侵害發作之前、期間、或之後投予。持續性疾病之治療（其中該治療穩定或減少患者之非所欲臨床症狀）亦係特別令人關注的。在一些實施例中，需要治療之對象患有可藉由細胞療法遏制、緩解、及/或改善至少一種相關症狀之疾病、病況、及/或侵害。某些實施例設想到需要細胞療法之對象，包括但不限於骨髓或幹細胞移植之候選者、已接受化學療法或輻照療法之對象、患有或有風險患有過度增生性病症或癌症（例如過度增生性病症或造血系統癌症）之對象、患有或有風險患有腫瘤（例如實體腫瘤）之對象、患有或有風險患有病毒感染或與病毒感染相關聯之疾病之對象。

當評估對包含本文所揭示之實施例之衍生之造血譜系細胞之治療之反應性時，該反應可藉由包含以下中之至少一者之標準來測量：臨床受益率、死亡前之存活、病理完全反應、病理反應之半量化測量、臨床完全緩解、臨床部分緩解、臨床穩定疾病、無復發存活、無轉移存活、無疾病存活、循環腫瘤細胞減少、循環標記反應、及RECIST（實體腫瘤中之反應評估標準）標準。

如本文所揭示之包含iPSC衍生之效應細胞之治療組成物可在其他治療（包括如上所述之癌症細胞或腫瘤細胞之敏化）之前、期間、及/或之後投予對象。因此，組合治療之方法可涉及在使用一或多種額外治療劑之前、期間、及/或之後投予或製備iPSC衍生之效應細胞。如上所提供的，該一或多種額外治療劑包含肽、細胞介素、檢查點抑制劑、接合物、有絲分裂促進劑、生長因子、小RNA、dsRNA（雙股RNA）、單核血球、餵養細胞、餵養細胞組分或其替代因子、包含一或多個關注之多核苷酸之載體、抗體、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)。iPSC衍生之免疫細胞之投予可在時間上與額外治療劑之投予分開數小時、數天、或甚至數周。額外地或替代地，投予可以與其他生物活性劑或模式（諸如但不限於抗贅瘤劑、非藥物療法，諸如外科手術）組合。

在組合細胞療法之一些實施例中，治療組合包含本文提供之iPSC衍生之效應細胞及為抗體或抗體片段之額外治療劑。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體可為人源化抗體、人源化單株抗體、或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體或抗體片段特異性結合至病毒抗原。在其他實施例中，抗體或抗體片段特異性結合至腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤或病毒特異性抗原活化經投予之iPSC衍生之造血譜系細胞以增強其殺滅能力。在一些實施例中，適於作為經投予之iPSC衍生之造血譜系細胞之額外治療劑進行組合治療之抗體包括但不限於抗CD20抗體（例如，利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗）、抗HER2抗體（例如，曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）、抗CD52抗體（例如，阿侖單抗）、抗EGFR抗體（例如，西妥昔單抗）、抗GD2抗體（例如，地妥昔單抗）、抗PDL1抗體（例如，阿維魯單抗）、抗CD38抗體（例如，達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、MOR202）、抗CD123抗體（例如，7G3、CSL362）、抗SLAMF7抗體（埃羅妥珠單抗）、MICA/B抗體(7C6, 6F11, 1C2)、及其人源化或Fc修飾之變體、或片段、或其功能等效物或生物類似物。在一些實施例中，本發明提供包含效應細胞（包括iPSC衍生之造血譜系細胞，具有表4中所列之基因型）及額外治療劑（其係如上所述之抗體或抗體片段）之治療組成物。

在一些實施例中，額外治療劑包含一或多種檢查點抑制劑。檢查點被稱為細胞分子，通常係細胞表面分子，能夠抑制或下調未被抑制之免疫反應。檢查點抑制劑係能夠減少檢查點基因表現或基因產物，或降低檢查點分子活性之拮抗劑。用於與衍生性效應細胞之組合療法之合適檢查點抑制劑包括但不限於PD1 (Pdcdl, CD279)、PDL-1 (CD274)、TIM3 (Havcr2)、TIGIT（WUCAM及Vstm3）、LAG3 (CD223)、CTLA4 (CD152)、2B4 (CD244)、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、A _2AR、BATE、BTLA、CD39 (Entpdl)、CD47、CD73 (NT5E)、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxpl、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2 (Pou2f2)、視黃酸受體α (Rara)、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、及抑制性KIR（例如，2DL1、2DL2、2DL3、3DL1、及3DL2）之拮抗劑。

包含所提供之衍生性效應細胞之組合療法之一些實施例進一步包含靶向檢查點分子之至少一種抑制劑。與所提供之衍生性效應細胞之組合療法之一些其他實施例包含二、三、或更多種抑制劑，使得靶向二、三、或更多個檢查點分子。在一些實施例中，用於本文所述組合療法之效應細胞係所提供之衍生性NK細胞。在一些實施例中，用於本文所述組合療法之效應細胞係衍生性T細胞。在一些實施例中，如本文所提供的，用於組合療法之衍生性NK細胞或T細胞在功能上得到增強。在一些實施例中，二、三、或更多種檢查點抑制劑可以在投予衍生性效應細胞之同時、之前、或之後以組合療法投予。在一些實施例中，二或更多種檢查點抑制劑同時投予，或一次一種（順序）投予。在一些實施例中，本發明提供包含效應細胞（包括iPSC衍生之效應細胞，具有表4中所列之基因型）及一或多種檢查點抑制劑之治療組成物，如上所述。

在一些實施例中，抑制任何上述檢查點分子之拮抗劑係抗體。在一些實施例中，檢查點抑制抗體可為鼠抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝Ig、單一可變新抗原受體(VNAR)、鯊魚純重鏈抗體(Ig NAR)、嵌合抗體、重組抗體、或其抗體片段。抗體片段之非限制性實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')3、Fv、單鏈抗原結合片段(scFv)、(scFv)2、二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、微型抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單域抗原結合片段（sdAb，奈米抗體）、重組純重鏈抗體(VHH)、及保持整個抗體之結合特異性之其他抗體片段，此等抗體片段之生產成本更低、更容易使用、或比整個抗體更靈敏。在一些實施例中，一或二或三或更多種檢查點抑制劑包含阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、派姆單抗、及其衍生物或功能等效物中之至少一者。

包含本文所述之衍生性效應細胞及一或多種檢查抑制劑之組合療法適用於治療液體癌症及實體癌症，包括但不限於皮膚T細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、蕈樣肉芽腫、變形性骨炎網狀細胞增多症、塞紮裡症候群、肉芽腫性皮膚鬆弛、淋巴瘤樣丘疹病、慢性苔蘚樣糠疹、急性痘瘡樣苔蘚樣糠疹、CD30 ⁺皮膚T細胞淋巴瘤、繼發性皮膚CD30 ⁺大細胞淋巴瘤、非蕈樣真菌病CD30皮膚大T細胞淋巴瘤、多形性T細胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、皮下T細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、母細胞性NK細胞淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、頭頸部腫瘤；鱗狀細胞癌、橫紋肌肉瘤、路易士肺癌(LLC)、非小細胞肺癌、食管鱗狀細胞癌、食管腺癌、腎細胞癌(RCC)、結腸直腸癌(CRC)、急性髓樣白血病(AML)、乳癌、胃癌、前列腺小細胞神經內分泌癌(SCNC)、肝癌、膠質母細胞瘤、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、胰臟癌、甲狀腺乳頭狀癌、肝內膽管細胞癌、肝細胞癌、骨癌、轉移癌、及鼻咽癌。

在一些實施例中，除本文提供之衍生性效應細胞外，用於治療用途之組合包含一或多種額外治療劑，該一或多種額外治療劑包含化學治療劑或放射性部分。「化學治療劑」係指細胞毒性抗贅瘤劑，即優先殺滅腫瘤細胞或破壞快速增生細胞之細胞週期之化學劑，或發現能根除幹細胞癌細胞之化學劑，以及用於治療以預防或減少腫瘤細胞生長之化學劑。化學治療劑有時亦被稱為抗贅瘤或細胞毒性藥物或藥劑，其實例係所屬技術領域中已知的。

在一些實施例中，化學治療劑包含蒽環黴素、烷基化劑、烷基磺酸鹽、氮丙啶、乙烯亞胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亞硝基脲、抗生素、抗代謝劑、葉酸類似物、嘌呤類似物、嘧啶類似物、酶、鬼臼毒素、含鉑劑、干擾素、及介白素。例示性化學治療劑包括但不限於烷基化劑（環磷醯胺、氮芥、mephalin、苯丁酸氮芥、heamethylmelamine、噻替哌、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀）、代謝物（胺甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁）、長春鹼類（長春新鹼、長春鹼、長春地辛）、表鬼臼毒素（依託泊苷、依託泊苷鄰醌、及替尼泊苷）、抗生素（道諾黴素、阿黴素、米托蒽醌、雙蒽烯、放線菌素D、普卡黴素、嘌呤黴素、及短桿菌肽D）、太平洋紫杉醇、秋水仙鹼、細胞鬆弛素B、吐根鹼、美登素、及安吖啶。額外藥劑包括胺魯米特、順鉑、卡鉑、絲裂黴素、六甲蜜胺、環磷醯胺、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BCNU)、伊立替康(CPT-11)、阿侖單抗、六甲蜜胺、阿那曲唑、L-天冬醯胺酶、阿扎胞苷、貝伐單抗、蓓薩羅丁、博萊黴素、硼替佐米、白消安、卡普睪酮、卡培他濱、塞來昔布、西妥昔單抗、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷、達卡巴仁、地尼白介素、己烯雌酚、多西紫杉醇、屈他雄酮、泛艾黴素、埃羅替尼、雌莫司汀、依託泊苷、乙炔雌二醇、依西美坦、氟尿苷、5-氟尿嘧啶、氟達拉濱、氟他米特、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、戈舍瑞林、羥基脲、替伊莫單抗、艾達黴素、異環磷醯胺、伊馬替尼、幹擾素α(2a, 2b)、伊立替康、來曲唑、亞葉酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、鹽酸氮芥、甲地孕酮、美法侖、巰嘌呤、胺甲喋呤、甲氧沙林、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、諾非妥莫單抗、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米磷酸二鈉、培美曲塞、培加酶、培門冬酶、噴司他丁、呱泊溴烷、普卡黴素、聚苯丙生、卟菲爾鈉、甲基苄肼、奎納克林、利妥昔單抗、沙格司亭、鏈脲菌素、泰莫西芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睾內酯、硫鳥嘌呤、噻替哌、曲妥珠單抗、維甲酸、烏拉莫司汀、戊柔比星、長春瑞濱、及唑來膦酸。其他合適之藥劑係經批准用於人類使用之彼等化學治療劑，包括將被批准作為化學治療劑或放射治療劑以及本領域已知之彼等化學治療劑。此等藥劑可以藉由數個標準內科醫生及腫瘤學家之參考文獻中之任一者（例如Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995）或藉由國家癌症研究所的網站(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)來參考，二者皆會隨時更新。

免疫調節藥物(IMiD)（諸如沙利度胺、來那度胺、及泊馬度胺）刺激NK細胞及T細胞二者。如本文所提供，可以將IMiD與iPSC衍生之治療性免疫細胞一起用於癌症治療。

除了治療組成物中包括之iPSC衍生之造血譜系細胞之經單離群體之外，適合投予對象/患者之組成物可進一步包括一或多種醫藥上可接受之載劑（添加劑）及/或稀釋劑（例如，醫藥上可接受之培養基，例如，細胞培養基），或其他醫藥上可接受之組分。醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑部分取決於所投予之特定組成物以及用於投予治療組成物之特定方法。因此，本發明實施例之治療組成物存在多種合適配方（參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 ^thed. 1985，其揭露內容以引用方式全文併入本文中）。

在一個實施例中，治療組成物包含藉由本文所揭示之方法及組成物製備之iPSC衍生之T細胞。在一個實施例中，治療組成物包含藉由本文所揭示之方法及組成物製成之多潛能細胞衍生之NK細胞。在一個實施例中，治療組成物包含藉由本文所揭示之方法及組成物製成之iPSC衍生之CD34 ⁺HE細胞。在一個實施例中，治療組成物包含藉由本文所揭示之方法及組成物製成之多潛能細胞衍生之HSC。在一個實施例中，治療組成物包含藉由本文所揭示之方法及組成物製成之多潛能細胞衍生之MDSC。本文所揭示之包含iPSC衍生之造血譜系細胞群體之治療組成物可藉由靜脈內、腹膜內、腸內、或氣管內投予方法單獨投予，或與其他合適之化合物組合投予，以實現期望治療目標。

此等醫藥上可接受之載劑及/或稀釋劑可以足以維持治療組成物之pH在約3與約10之間之量存在。因此，基於總組成物之重量比，緩衝劑可多達約5%。電解質諸如但不限於氯化鈉及氯化鉀亦可以包括在治療組成物中。在一個態樣中，治療組成物之pH在約4至約10之範圍內。替代地，治療組成物之pH在約5至約9、約6至約9、或約6.5至約8之範圍內。在另一實施例中，治療組成物包括pH在該等pH範圍中之一者內之緩衝劑。在另一實施例中，治療組成物具有約7之pH。替代地，治療組成物具有在約6.8至約7.4之範圍內之pH。在又另一實施例中，治療組成物具有約7.4之pH。

在一些實施例中，本發明亦提供醫藥上可接受之細胞培養基在本文所揭示之具體組成物及/或培養物中之用途。此種組成物適合對人類對象投予。一般而言，根據本發明之實施例，支持iPSC衍生之效應細胞之維持、生長、及/或健康之任何培養基皆適合用作醫藥細胞培養基。在一些實施例中，醫藥上可接受之細胞培養基係無血清及/或無餵養細胞之培養基。在各種實施例中，無血清培養基不含動物，並且可以可選地不含蛋白質。可選地，培養基可以含有生物醫藥上可接受之重組蛋白。無動物培養基係指其中組分衍生自非動物來源之培養基。重組蛋白置換無動物培養基中之天然動物蛋白，且營養物自合成、植物、或微生物來源獲得。相比之下，無蛋白質培養基被定義為實質上不含蛋白質。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，上述培養基之實例係說明性的，且決不限制適於本發明之培養基之配方，並且存在所屬技術領域中具有通常知識者已知及可獲得之許多合適之培養基。

在各種實施例中，iPSC衍生之造血譜系細胞可具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、或99%之T細胞、NK細胞、NKT細胞、proT細胞、proNK細胞、CD34 ⁺HE細胞、HSC、B細胞、髓樣衍生之抑制細胞(MDSC)、調控性巨噬細胞、調控性樹突細胞、或間充質基質細胞。在一些實施例中，iPSC衍生之造血譜系細胞具有約95%至約100%之T細胞、NK細胞、proT細胞、proNK細胞、CD34 ⁺HE細胞、或髓樣衍生之抑制細胞(MDSC)。在一些實施例中，本發明提供具有純化之T細胞或NK細胞之治療組成物，諸如具有約95% T細胞、NK細胞、proT細胞、proNK細胞、CD34 ⁺HE細胞、或髓樣衍生之抑制細胞(MDSC)之經單離群體之組成物，以治療需要細胞療法之對象。

本申請案之一個態樣提供一種藉由投予一或多種治療劑量之效應細胞來治療有需要之對象之方法，該等效應細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體、TGFβ-SRR、及對4-1BB特異之ADR中之二或更多者之多核苷酸，以及可選地下列中之一、二、三、四、五、或更多者：CAR表現、CFR表現、外源性CD16表現、HLA-I修飾及/或HLA-II修飾、CD38剔除、TCR ^neg及外源性細胞介素信號傳導錯合物。在一些實施例中，本申請案提供一種治療患有癌症或腫瘤之對象之方法，其藉由首先使對象中之癌症或腫瘤細胞敏化，以與接觸/暴露前之趨化因子分泌及/或表面表現相比，增加或增強一或多種趨化因子之分泌及/或表面表現，該一或多種趨化因子係C-X-C-模體趨化因子受體之配體。在癌症細胞或腫瘤細胞之敏化後，將如上所述之效應細胞或其群體給予/投予對象，其中效應細胞包含如本文所提供之實體腫瘤靶向主鏈以及可選地本文所述之一或多種額外編輯，或者效應細胞包含表4中所列之基因型。在各種實施例中，如上所述，效應細胞或其群體可以在一或多種額外治療劑之前或與之同時提供。

本申請案之另一態樣提供一種使用組合細胞療法治療有需要之對象之方法。在組合細胞療法之一些實施例中，治療有需要之對象之方法包含投予一或多種治療劑量之效應細胞，該等效應細胞包含本文所提供之實體腫瘤靶向主鏈以及可選地本文所述之一或多種其他編輯、或表4中所列之基因型；以及一或多種治療劑，其包含肽、細胞介素、檢查點抑制劑、接合物、有絲分裂促進劑、生長因子、小RNA、dsRNA（雙股RNA）、單核血球、餵養細胞、餵養細胞組分或其替代因子、包含一或多種關注之多核苷酸之載體、抗體、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)，以及可選地藉由投予敏化劑來預調理對象中之腫瘤細胞。在一些實施例中，組合細胞療法或用於其之組成物包含衍生自經基因體工程改造之iPSC及一或多種治療劑之效應細胞群體，其中經工程改造之iPSC及衍生之效應細胞包含如本文提供之實體腫瘤靶向主鏈，及可選地本文所述之一或多種其他編輯，或表4中所列之基因型。在組合細胞治療方法之一些實施例中，該方法包含藉由投予敏化劑預調理對象中之腫瘤細胞，其中敏化劑包含本文提供之輻射療法、放射性醫藥、或化學治療劑。在各種實施例中，對象中腫瘤細胞之預調理發生在投予本文所述之一或多種治療劑量之效應細胞之前或與之同時。

如所屬技術領域中具有通常知識者將理解的，基於本文提供之方法及組成物衍生自iPSC之自體及同種異體造血譜系細胞皆可用於上述細胞療法。對於自體移植，衍生之造血譜系細胞之經單離群體與患者完全或部分HLA匹配。在另一實施例中，衍生之造血譜系細胞與對象係HLA不匹配，其中衍生之造血譜系細胞係具有HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏之NK細胞或T細胞。

在一些實施例中，治療組成物中之衍生之造血譜系細胞之數目為每劑量至少0.1 × 10 ⁵個細胞、至少1 × 10 ⁵個細胞、至少5 × 10 ⁵個細胞、至少1 × 10 ⁶個細胞、至少5 × 10 ⁶個細胞、至少1 × 10 ⁷個細胞、至少5 × 10 ⁷個細胞、至少1 × 10 ⁸個細胞、至少5 × 10 ⁸個細胞、至少1 × 10 ⁹個細胞、或至少5 × 10 ⁹個細胞。在一些實施例中，治療組成物中衍生之造血譜系細胞之數目為每劑量約0.1 × 10 ⁵個細胞至約1 × 10 ⁶個細胞；每劑量約0.5 × 10 ⁶個細胞至約1x 10 ⁷個細胞；每劑量約0.5 × 10 ⁷個細胞至約1 × 10 ⁸個細胞；每劑量約0.5 × 10 ⁸個細胞至約1 × 10 ⁹個細胞；每劑量約1 × 10 ⁹個細胞至約5 × 10 ⁹個細胞；每劑量約0.5 × 10 ⁹個細胞至約8 × 10 ⁹個細胞；每劑量約3 × 10 ⁹個細胞至約3 × 10 ¹⁰個細胞，或其間之任何範圍。通常，對於60 kg之患者/對象，1 × 10 ⁸個細胞/劑量相當於1.67 × 10 ⁶個細胞/kg。

在一個實施例中，治療組成物中衍生之造血譜系細胞之數目為部分或單個臍帶血中免疫細胞之數目，或為至少0.1 × 10 ⁵個細胞/kg體重、至少0.5 × 10 ⁵個細胞/kg體重、至少1 × 10 ⁵個細胞/kg體重、至少5 × 10 ⁵個細胞/kg體重、至少10 × 10 ⁵個細胞/kg體重、至少0.75 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少1.25 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少1.5 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少1.75 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少2 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少2.5 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少3 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少4 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少5 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少10 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少15 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少20 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少25 × 10 ⁶個細胞/kg體重、至少30 × 10 ⁶個細胞/kg體重、1 × 10 ⁸個細胞/kg體重、5 × 10 ⁸個細胞/kg體重、或1 × 10 ⁹個細胞/kg體重。

在一個實施例中，將一定劑量之衍生之造血譜系細胞遞送至對象。在一個說明性實施例中，提供給對象之細胞之有效量為至少2 × 10 ⁶個細胞/kg、至少3 × 10 ⁶個細胞/kg、至少4 × 10 ⁶個細胞/kg、至少5 × 10 ⁶個細胞/kg、至少6 × 10 ⁶個細胞/kg、至少7 × 10 ⁶個細胞/kg、至少8 × 10 ⁶個細胞/kg、至少9 × 10 ⁶個細胞/kg、或至少10 × 10 ⁶個細胞/kg、或更多個細胞/kg，包括所有中間劑量之細胞。

在另一說明性實施例中，提供給對象之細胞之有效量為約2 × 10 ⁶個細胞/kg、約3 × 10 ⁶個細胞/kg、約4 × 10 ⁶個細胞/kg、約5 × 10 ⁶個細胞/kg、約6 × 10 ⁶個細胞/kg、約7 × 10 ⁶個細胞/kg、約8 × 10 ⁶個細胞/kg、約9 × 10 ⁶個細胞/kg、或約10 × 10 ⁶個細胞/kg、或更多個細胞/kg，包括所有中間劑量之細胞。

在另一說明性實施例中，提供給對象之細胞之有效量為約2 × 10 ⁶個細胞/kg至約10 × 10 ⁶個細胞/kg、約3 × 10 ⁶個細胞/kg至約10 × 10 ⁶個細胞/kg、約4 × 10 ⁶個細胞/kg至約10 × 10 ⁶個細胞/kg、約5 × 10 ⁶個細胞/kg至約10 × 10 ⁶個細胞/kg、2 × 10 ⁶個細胞/kg至約6 × 10 ⁶個細胞/kg、2 × 10 ⁶個細胞/kg至約7 × 10 ⁶個細胞/kg、2 × 10 ⁶個細胞/kg至約8 × 10 ⁶個細胞/kg、3 × 10 ⁶個細胞/kg至約6 × 10 ⁶個細胞/kg、3 × 10 ⁶個細胞/kg至約7 × 10 ⁶個細胞/kg、3 × 10 ⁶個細胞/kg至約8 × 10 ⁶個細胞/kg、4 × 10 ⁶個細胞/kg至約6 × 10 ⁶個細胞/kg、4 × 10 ⁶個細胞/kg至約7 × 10 ⁶個細胞/kg、4 × 10 ⁶個細胞/kg至約8 × 10 ⁶個細胞/kg、5 × 10 ⁶個細胞/kg至約6 × 10 ⁶個細胞/kg、5 × 10 ⁶個細胞/kg至約7 × 10 ⁶個細胞/kg、5 × 10 ⁶個細胞/kg至約8 × 10 ⁶個細胞/kg、或6 × 10 ⁶個細胞/kg至約8 × 10 ⁶個細胞/kg，包括所有中間劑量之細胞。

在一些實施例中，衍生之造血譜系細胞之治療用途係單劑量治療。在一些實施例中，衍生之造血譜系細胞之治療用途係多劑量治療。在一些實施例中，多劑量治療係每天一劑、每3天一劑、每7天一劑、每10天一劑、每15天一劑、每20天一劑、每25天一劑、每30天一劑、每35天一劑、每40天一劑、每45天一劑、或每50天一劑、或其間任意天數一劑。在一些實施例中，多劑量治療包括三、四、或五次之每週一次之劑量。在包含三、四、或五次之多劑量治療之一些實施例中，每週一次之劑量進一步包含用於判定是否需要額外之單劑量或多劑量之觀察期。

本發明實施例之包含衍生之造血譜系細胞群體之組成物可為無菌的，且可適用於且準備向人類患者/對象投予（即，可不經任何進一步處理即被投予）。準備投予之基於細胞之組成物係指在移植或投予至對象之前，該組成物不需要任何進一步處理或操縱。在其他實施例中，本發明提供一種衍生之造血譜系細胞之經單離群體，其在投予包括小化學分子之一或多種藥劑之前經擴增及/或調節。用於調節包括iPSC衍生之效應細胞在內之免疫細胞之組成物及方法例如更詳細描述於國際公開案第WO2017/127755號中，其相關揭露內容以引用方式併入本文。對於經基因工程改造以表現重組TCR或CAR之衍生之造血譜系細胞，可使用例如美國專利6,352,694中所述之方法活化及擴增細胞。

在某些實施例中，衍生之造血譜系細胞之主要刺激信號及共刺激信號可藉由不同之協定提供。例如，提供每個信號之藥劑可以在溶液中或耦合至表面。當偶合至表面時，藥劑可以偶合至同一表面（即「順式」形成）或單獨的表面（即「反式」形成）。替代地，一種藥劑可耦合至表面，且另一種試劑在溶液中。在一個實施例中，提供共刺激信號之藥劑可結合至細胞表面，且提供初級活化信號之藥劑在溶液中或耦合至表面。在某些實施例中，兩種藥劑皆可在溶液中。在另一實施例中，藥劑可為可溶形式，然後交聯至表面，諸如表現Fc受體之細胞或抗體或將結合至該等藥劑之其他結合藥劑，諸如在美國專利公開案第2004/0101519號及第2006/0034810號中針對設想用於活化及擴增T淋巴球之人工抗原呈遞細胞(aAPC)所揭示的，其揭露內容以引用方式併入本文中。

根據接受治療之對象之狀況，劑量、頻率、及規程必然會發生一些變化。在任何情況下，負責投予之人員將判定個體對象之適當劑量、頻率、及規程。說明性實施例

本揭露提供以下說明性實施例：實施例1：一種細胞或其群體，其中 (i) 該細胞係(a)免疫細胞；(b)誘導性多潛能細胞(induced pluripotent cell, iPSC)；或(c)獲自分化該iPSC之衍生性效應細胞；及 (ii) 該細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，其包含以下中之二或更多者： (a) 編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸； (b) 編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸。實施例2：如實施例1之細胞或其群體，其中與不具有該實體腫瘤靶向主鏈之對應細胞相比，該細胞在實體腫瘤中具有改善之運輸、腫瘤微環境(TME)抗性、及/或同種異體反應性抗性。實施例3：如實施例1或2之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含： (i) CD38剔除； (ii) 編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及 (iii) 編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該細胞介素信號傳導錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽。實施例4：如實施例1至3中任一項之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含以下中之一或多者： (i) 嵌合抗原受體(CAR)； (ii) HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏； (iii) 引入HLA-G或不可分割之HLA-G； (iv) 破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之至少一者； (v) 引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者；或 (vi) 表4中所列基因型中之至少一者。實施例5：如實施例1至4中任一項之細胞或其群體，其中該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。實施例6：如實施例1至5中任一項之細胞或其群體，其中該TGFβ-SRR進一步包含細胞介素受體之胞內域(ICD)之部分或完整肽，該細胞介素受體包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合。實施例7：如實施例6之細胞或其群體，其中： (a) 該細胞介素受體係IL2Rβ，從而形成TGFβR2-IL2Rβ重導向物受體，且IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列；或 (b) 該細胞介素受體係IL12Rβ，從而形成TGFβR2-IL12Rβ重導向物受體，且IL12Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列；或 (c) 該細胞介素受體係IL18Rβ，從而形成TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體，且IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列；或 (d) 該細胞介素受體係IL21R，從而形成TGFβR2-IL21R重導向物受體，且IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列；或 (e) TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列。實施例8：如實施例6之細胞或其群體，其中該細胞介素受體係IL2Rβ之片段，形成TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，該重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列，其中包含在SEQ ID NO: 16中之由SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列係可變的。實施例9：如實施例1至8中任一項之細胞或其群體，其中該ADR係對4-1BB或對CD38特異。實施例10：如實施例1至9中任一項之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸插入內源性CD38基因座以剔除CD38。實施例11：如實施例3之細胞或其群體，其中編碼該外源性CD16或其變體之該多核苷酸及該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸在三順反子構築體中共表現。實施例12：如實施例3或11之細胞或其群體，其中該外源性CD16或其變體包含以下中之至少一者： (a) 高親和力不可切割之CD16 (hnCD16)； (b) CD16胞外域中之F176V及S197P； (c) 源自CD64之完整或部分胞外域； (d) 非天然（或非CD16）跨膜域； (e) 非天然（或非CD16）胞內域； (f) 非天然（或非CD16）信號傳導域； (g) 非天然刺激域；及 (h) 並非源自CD16，而是源自相同或不同多肽之跨膜域、信號傳導域、及刺激域。實施例13：如實施例3、11、或12中任一項之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含細胞介素信號傳導錯合物，該細胞介素信號傳導錯合物包含： (a) 表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽，其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、或其各別受體中之至少一者；或 (b) 以下中之至少一者： (i) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現； (ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白； (iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短； (iv) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白； (v) IL15及IL15Rβ之融合蛋白； (vi) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (vii) IL15Rβ之同二聚體；其中(b) (i)至(vii)中之任一者可以在單獨構築體或雙順反子(bi-cistronic)構築體中與CAR共表現；或 (c) 以下中之至少一者： (i) IL7及IL7Rα之融合蛋白； (ii) IL7及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (iii) IL7Rβ之同二聚體，其中(c) (i)至(iii)中之任一者可選地在單獨構築體中或在雙順反子表現匣(expression cassette)中與CAR共表現；及可選地， (d) 暫時表現。實施例14：如實施例4之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含CAR，其中該CAR係： (i) T細胞特異性的或NK細胞特異性的； (ii) 雙特異性抗原結合CAR； (iii) 可切換CAR； (iv) 二聚CAR； (v) 分離CAR； (vi) 多鏈CAR； (vii) 可誘導性CAR； (viii) 與另一CAR共表現； (ix) 在雙順反子構築體中與該細胞介素信號傳導錯合物共表現； (x) 可選地在單獨構築體或雙順反子構築體中與檢查點抑制劑共表現； (xi) 對至少一種腫瘤相關抗原特異，其包含CD19、B7H3、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、CD79b、CD52、EGFR、EGP2/EpCAM、GD2、GPRC5D、HER2、KLK2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA、及PDL1；及/或 (xii) 對至少一種腫瘤相關抗原特異，其包含ADGRE2、碳酸酐酶IX (CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、上皮細胞黏著分子(EpCAM)、EGFRvIII、受體酪胺酸-蛋白激酶erb- B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合蛋白(FBP)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、葉酸受體-α、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂G3 (GD3)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、介白素-13受體次單元α-2 (IL-13Rα2)、κ輕鏈、激酶插入域受體(KDR)、路易士A (CA19.9)、路易士Y (LeY)、L1細胞黏著分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1 (MAGE-A1)、MICA/B、黏蛋白1 (Muc-1)、黏蛋白16 (Muc-16)、間皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配體、c-Met、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特異性膜抗原(PSMA)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管內皮生長因子R2 (VEGF-R2)、Wilms腫瘤蛋白(WT-1)、及病原體抗原；及可選地，其中(i)至(xii)中任一者之該CAR被插入在TCR基因座處，且/或藉由該TCR之內源性啟動子而驅動，且/或該TCR藉由CAR插入而被剔除。實施例15：如實施例14之細胞或其群體，其中該TCR基因座係TCRα及/或TCRβ之恆定區，且可選地，其中該CAR可操作地連接至TCR之內源性啟動子。實施例16：如實施例14或15之細胞或其群體，其中該CAR包含： (a) 包含對腫瘤相關抗原特異之抗原結合域之胞外域； (b) 跨膜域；及 (c) 包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與該腫瘤相關抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。實施例17：如實施例16之細胞或其群體，其中該至少一個信號傳導域包含： (a) 以下中之任一者：2B4（自然殺手細胞受體2B4）、4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）、CD28（T細胞特異性表面醣蛋白CD28）、CD3ζ（T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈）、DAP10（造血細胞信號轉換器）、DAP12（TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白）、DNAM1（CD226抗原）、FcERIγ（高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ）、IL21R（介白素-21受體）、IL2Rβ/IL15Rβ（介白素-2受體次單元β）、IL2Rγ（細胞介素受體共同次單元γ）、IL-7R（介白素-7受體次單元α）、KIR2DS2（殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2）、NKG2D（NKG2-D II型整合膜蛋白）、NKp30（天然細胞毒性觸發受體3）、NKp44（天然細胞毒性觸發受體2）、NKp46（天然細胞毒性觸發受體1）、CS1（SLAM家族成員7）、及CD8（T細胞表面醣蛋白CD8α鏈）； (b) 與分別由SEQ ID NO: 54至76所示之2B4、41BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL2Rγ、IL7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列；及/或 (c) 與2B4、CD28、CD3ζ、DAP10、NKG2D、CD3ζ、CD3ζ1XX、DNAM1、CS1、或其組合之細胞質域或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例18：如實施例16或17之細胞或其群體，其中該胞內域包含兩個不同的信號傳導域，且其中該胞內域包含以下形式中任一者之融合細胞質域或其部分：CD28-CD3ζ、CD28-CD3ζ1XX、41BB-CD3ζ、41BB-CD3ζ1XX、2B4-CD3ζ、及2B4-CD3ζ1XX。實施例19：如實施例16至18中任一項之細胞或其群體，其中該跨膜域包含與CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1、或T細胞受體多肽之跨膜區或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例20：如實施例16至18中任一項之細胞或其群體，其中該跨膜域包含與分別由SEQ ID NO: 32-53所示之2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之跨膜區或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例21：如實施例16至20中任一項之細胞或其群體，其中該跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質或不同蛋白質。實施例22：如實施例16至21中任一項之細胞或其群體，其中該腫瘤相關抗原包含HER2，且其中該CAR包含： (a) 包含辨識HER2（人類表皮生長因子受體2）抗原之抗原結合域之胞外域，其中該抗原結合域包含： (i) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地， (ii) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)； (b) 跨膜域；及 (c) 包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。實施例23：如實施例22之細胞或其群體，其中該CAR之該抗原結合域： (a) 包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域； (b) 包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域； (c) 包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111至114具有至少80%序列同一性； (d) 包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；及/或 (e) 係人源化的。實施例24：如實施例22或23之細胞或其群體，其中該胞外域包含以下中之一或多者： (a) 信號肽；及/或 (b) 間隔子/鉸鏈。實施例25：如實施例24之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含： (a) IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、CH3間隔子、CH2/CH3間隔子、或其任何組合； (b) 約10至約80個胺基酸之短間隔子；大於80至約180個胺基酸之中等間隔子；或大於180個胺基酸之長間隔子；及/或 (c) 與SEQ ID NO: 96至100中之任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例26：如實施例25之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含中等間隔子，其中該間隔子包含與SEQ ID NO: 99具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例27：如實施例25之細胞或其群體，其中該CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例28：如實施例22至27中任一項之細胞或其群體，其中該癌細胞為乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、唾液腺癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、或頭頸癌細胞。實施例29：如實施例1至28中任一項之細胞或其群體，其中(i)該iPSC係無性繁殖iPSC、單細胞解離iPSC、iPSC細胞系細胞、或iPSC主細胞庫(MCB)細胞；或(ii)該衍生性細胞包含衍生性CD34 ⁺細胞、衍生性造血幹細胞及前驅細胞、衍生性造血多潛能前驅細胞、衍生性T細胞前驅細胞、衍生性NK細胞前驅細胞、衍生性T譜系細胞、衍生NKT譜系細胞、衍生性NK譜系細胞、或衍生性B譜系細胞；或(iii)該衍生性細胞包含衍生性效應細胞，其具有在對應之原代T細胞、NK細胞、NKT細胞、及/或B細胞中不存在之一或多種功能特徵。實施例30：如實施例29之細胞或其群體，其中與自周邊血液、臍帶血、或沒有相同基因編輯之任何其他供體組織獲得之對應原代細胞相比，該衍生性細胞具有包含以下中之一或多者的治療性質： (i) 細胞毒性增加； (ii) 持久性及/或存活率改善； (iii) 遷移及/或活化或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力增強； (iv) 腫瘤浸潤改善； (v) 降低腫瘤免疫抑制之能力增強； (vi) 挽救腫瘤抗原逃逸之能力改善； (vii) 細胞凋亡得以控制； (viii) 增強或獲得ADCC；及 (ix) 避免誤殺之能力。實施例31：如實施例29或30之細胞或其群體，其中該細胞係NK譜系細胞或T譜系細胞，其中： (i) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞在腫瘤位點處具有改善之浸潤及/或滯留； (ii) 該NK譜系細胞能夠募集及/或遷移T細胞至腫瘤位點；或 (iii) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞能夠在一或多種檢查點抑制劑存在之情況下降低腫瘤免疫抑制。實施例32：一種細胞或其群體，其中 (i) 該細胞係(a)免疫細胞；(b)誘導性多潛能細胞(induced pluripotent cell, iPSC)；或(c)獲自分化該iPSC之衍生性效應細胞； (ii) 該細胞包含嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a) 包含辨識HER2（人類表皮生長因子受體2）抗原之抗原結合域之胞外域，其中該抗原結合域包含： (1) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及 (2) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)； (b) 跨膜域；及 (c) 包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。實施例33：如實施例32之細胞或其群體，其中該抗原結合域： (a) 包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域； (b) 包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域； (c) 包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111至114具有至少80%序列同一性； (d) 包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；及/或 (e) 係人源化的。實施例34：如實施例32或33之細胞或其群體，其中該至少一個信號傳導域包含： (a) 下列中之任一者：2B4（自然殺手細胞受體2B4）、4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）、CD16（IgG Fc區受體III-A）、CD2（T細胞表面抗原CD2）、CD28（T細胞特異性表面醣蛋白CD28）、CD28H（含跨膜及免疫球蛋白域之蛋白2）、CD3ζ（T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈）、DAP10（造血細胞信號轉導子）、DAP12（TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白）、DNAM1（CD226抗原）、FcERIγ（高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ）、IL21R（介白素-21受體）、IL-2Rβ/IL15Rβ（介白素-2受體次單元β）、IL-2Rγ（細胞介素受體共同次單元γ）、IL-7R（介白素-7受體次單元α）、KIR2DS2（殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2）、NKG2D（NKG2-D II型整合膜蛋白）、NKp30（天然細胞毒性觸發受體3）、NKp44（天然細胞毒性觸發受體2）、NKp46（天然細胞毒性觸發受體1）、CS1（SLAM家族成員7）、及CD8（T細胞表面醣蛋白CD8α鏈）； (b) 與分別由SEQ ID NO: 54至76所示之2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL2Rγ、IL7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列；及/或 (c) 與2B4、CD28、CD3ζ、DAP10、NKG2D、CD3ζ1XX、DNAM1、CS1、或其組合之細胞質域或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例35：如實施例34之細胞或其群體，其中該胞內域包含兩個不同的信號傳導域，且其中該胞內域包含以下形式中任一者之融合細胞質域或其部分：2B4-CD3ζ/1XX、2B4-DNAM1、2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28-CD3ζ/1XX、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4、或NKp46-2B4。實施例36：如實施例32至35中任一項之細胞或其群體，其中該跨膜域包含與以下各項之跨膜區或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列： (a) CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T細胞受體多肽； (b) 2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8；或 (c) 2B4、CD28、CD28H、DAP10、DNAM1、KIR2DS2、及NKG2D。實施例37：如實施例32至36中任一項之細胞或其群體，其中該跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質或不同蛋白質。實施例38：如實施例32至37中任一項之細胞或其群體，其中該胞外域包含以下中之一或多者： (a) 信號肽；及/或 (b) 間隔子/鉸鏈。實施例39：如實施例38之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含： (a) IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、CH3間隔子、CH2/CH3間隔子、或其任何組合； (b) 約10至約80個胺基酸之短間隔子；大於80至約180個胺基酸之中等間隔子；或大於180個胺基酸之長間隔子；及/或 (c) 與SEQ ID NO: 96至100中任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例40：如實施例39之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含中等間隔子，其中該間隔子包含與SEQ ID NO: 99具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例41：如實施例32之細胞或其群體，其中該CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。實施例42：如實施例32至41中任一項之細胞或其群體，其進一步包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含以下中之至少一者： (a) 編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸； (b) 編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸。實施例43：如實施例42之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含： (i) CD38剔除； (ii) 編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及 (iii) 編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該細胞介素信號傳導錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽，實施例44：如實施例32至43中任一項之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含以下中之一或多者： (i) HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏； (ii) 引入HLA-G或不可分割之HLA-G； (iii) 破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之至少一者； (iv) 引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者；或 (v) 表4中所列基因型中之至少一者。實施例45：如實施例42至44中任一項之細胞或其群體，其中該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。實施例46：如實施例42至45中任一項之細胞或其群體，其中該TGFβ-SRR進一步包含細胞介素受體之胞內域(ICD)之部分或完整肽，該細胞介素受體包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合。實施例47：如實施例46之細胞或其群體，其中： (a) 該細胞介素受體係IL2Rβ，從而形成TGFβR2-IL2Rβ重導向物受體，且IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列；或 (b) 該細胞介素受體係IL12Rβ，從而形成TGFβR2-IL12Rβ重導向物受體，且IL12Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列；或 (c) 該細胞介素受體係IL18Rβ，從而形成TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體，且IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列；或 (d) 該細胞介素受體係IL21R，從而形成TGFβR2-IL21R重導向物受體，且IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列；或 (e) TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列。實施例48：如實施例46之細胞或其群體，其中該細胞介素受體係IL2Rβ之片段，形成TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，該重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列，其中包含在SEQ ID NO: 16中之由SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列係可變的。實施例49：如實施例42至48中任一項之細胞或其群體，其中該ADR係對4-1BB或對CD38特異。實施例50：如實施例42至49中任一項之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈之一或多個多核苷酸插入內源性CD38基因座以剔除CD38。實施例51：如實施例43之細胞或其群體，其中編碼該外源性CD16或其變體之該多核苷酸及該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸在三順反子構築體中共表現。實施例52：如實施例43或51之細胞或其群體，其中該外源性CD16或其變體包含以下中之至少一者： (a) 高親和力不可切割之CD16 (hnCD16)； (b) CD16胞外域中之F176V及S197P； (c) 源自CD64之完整或部分胞外域； (d) 非天然（或非CD16）跨膜域； (e) 非天然（或非CD16）胞內域； (f) 非天然（或非CD16）信號傳導域； (g) 非天然刺激域；及 (h) 並非源自CD16，而是源自相同或不同多肽之跨膜域、信號傳導域、及刺激域。實施例53：如實施例43、51、或52之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含細胞介素信號傳導錯合物，該細胞介素信號傳導錯合物包含： (a) 表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽，其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、或其各別受體中之至少一者；或 (b) 以下中之至少一者： (i) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現； (ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白； (iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短； (iv) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白； (v) IL15及IL15Rβ之融合蛋白； (vi) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (vii) IL15Rβ之同二聚體；或 (c) 以下中之至少一者： (i) IL7及IL7Rα之融合蛋白； (ii) IL7及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (iii) IL7Rβ之同二聚體；及可選地， (d) 暫時表現。實施例54：如實施例32至53中任一項之細胞或其群體，其中 (i) 該CAR在雙順反子構築體中與細胞介素信號傳導錯合物共表現；及/或 (ii) 其中該CAR被插入TCR基因座處，並且可選地可操作地連接至該TCR之內源性啟動子。實施例55：如實施例54之細胞或其群體，其中 (i) 該TCR基因座係TCRα及/或TCRβ之恆定區；及/或 (ii) 該TCR藉由CAR插入而被剔除。實施例56：如實施例32至55中任一項之細胞或其群體，其中該癌細胞為乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、唾液腺癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、或頭頸癌細胞。實施例57：如實施例32至56中任一項之細胞或其群體，其中(i)該iPSC係無性繁殖iPSC、單細胞解離iPSC、iPSC細胞系細胞、或iPSC主細胞庫(MCB)細胞；或(ii)該衍生性細胞包含衍生性CD34 ⁺細胞、衍生性造血幹細胞及前驅細胞、衍生性造血多潛能前驅細胞、衍生性T細胞前驅細胞、衍生性NK細胞前驅細胞、衍生性T譜系細胞、衍生NKT譜系細胞、衍生性NK譜系細胞、或衍生性B譜系細胞；或(iii)該衍生性細胞包含衍生性效應細胞，其具有在對應之原代T細胞、NK細胞、NKT細胞、及/或B細胞中不存在之一或多種功能特徵。實施例58：如實施例42至58中任一項之細胞或其群體，其中與自周邊血液、臍帶血、或沒有相同基因編輯之任何其他供體組織獲得之對應原代細胞相比，該衍生性細胞具有包含以下中之一或多者的治療性質： (i) 細胞毒性增加； (ii) 持久性及/或存活率改善； (iii) 遷移及/或活化或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力增強； (iv) 腫瘤浸潤改善； (v) 降低腫瘤免疫抑制之能力增強； (vi) 挽救腫瘤抗原逃逸之能力改善； (vii) 細胞凋亡得以控制； (viii) 增強或獲得ADCC；及 (ix) 避免誤殺之能力。實施例59：如實施例58之細胞或其群體，其中該細胞係NK譜系細胞或T譜系細胞，其中： (i) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞在腫瘤位點處具有改善之浸潤及/或滯留； (ii) 該NK譜系細胞能夠募集及/或遷移T細胞至腫瘤位點；或 (iii) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞能夠在一或多種檢查點抑制劑存在之情況下降低腫瘤免疫抑制。實施例60：一種組成物，其包含如實施例1至59中任一項之細胞或其群體。實施例61：如實施例60之組成物，其進一步包含一或多種治療劑。實施例62：如實施例61之組成物，其中該一或多種治療劑包含肽、細胞介素、檢查點抑制劑、有絲分裂促進劑、生長因子、小RNA、dsRNA（雙股RNA）、單核血球、餵養細胞、餵養細胞組分或其替代因子、包含一或多種關注之多核苷酸之載體、抗體、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)。實施例63：如實施例62之組成物，其中該檢查點抑制劑包含： (a) 檢查點分子之一或多種拮抗劑，其包含PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A _2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara（視黃酸受體α）、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、或抑制性KIR； (b) 阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、派姆單抗、及其衍生物或功能等效物中之一或多者；或 (c) 阿特珠單抗、納武單抗、及派姆單抗中之至少一者。實施例64：如實施例62之組成物，其中該抗體包含： (a) 抗CD20抗體、抗HER2抗體、抗CD52抗體、抗EGFR抗體、抗CD123抗體、抗GD2抗體、抗PDL1抗體、或抗CD38抗體；或 (b) 利妥昔單抗、維妥珠單抗、奧法木單抗、烏妥昔單抗、奧卡妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、阿侖單抗、西妥昔單抗、地妥昔單抗、阿維魯單抗、達利珠單抗、巴利昔單抗、M-A251、2A3、BC69、24204、22722、24212、MAB23591、FN50、298614、AF2359、CY1G4、DF1513、比伐珠單抗、RG7356、G44-26、7G3、CSL362、埃羅妥珠單抗、達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、MOR202、及其人源化或Fc修飾之變體或片段以及其功能等效物、及其生物相似藥中之一或多者。實施例65：如實施例62之組成物，其中該接合物包含： (i) 雙特異性T細胞接合物(BiTE)； (ii) 雙特異性殺手細胞接合物(BiKE)；或 (iii) 三特異性殺手細胞接合物(TriKE)；或其中該接合物包含： (a) 辨識細胞或旁觀者免疫效應細胞之CD3、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、或其任何功能變體之胞外部分之第一結合域；及 (b) 對抗原特異之第二結合域，該抗原包含以下中之任一者：B7H3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD52、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、Muc1、Muc16、PDL1、PSMA、PAMA、P-鈣黏蛋白、ROR1、或VEGF-R2。實施例66：如實施例60至65中任一項之組成物之治療用途，其藉由將該組成物引入至需要過繼細胞療法之對象來進行，其中該對象患有自體免疫疾病、血液惡性腫瘤、實體腫瘤、癌症、或病毒感染。實施例67：一種主細胞庫(MCB)，其包含如實施例1至59中任一項之iPSC。實施例68：一種製造如實施例1至31中任一項之衍生性細胞之方法，其中該衍生性細胞係免疫效應細胞，且該方法包含： (i) 獲得經基因工程改造之iPSC，其中該iPSC包含實體腫瘤靶向主鏈，其包含以下中之二或更多者： (a) 編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸； (b) 編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸； (ii) 將該經基因工程改造之iPSC分化為衍生性CD34 ⁺細胞；及 (iii) 將該衍生性CD34 ⁺細胞分化為免疫效應細胞，其中該免疫效應細胞保留該實體腫瘤靶向主鏈。實施例69：如實施例68之方法，其中獲得包含該實體腫瘤靶向主鏈之該經基因工程改造之iPSC包含整合二或更多個多核苷酸以在內源性CD38基因座處共表現並剔除CD38；其中用於共表現之該二或更多個多核苷酸在順反子構築體中；且其中該多核苷酸編碼以下中之至少兩者： (i) C-X-C模體趨化因子受體； (ii) TGFβ-SRR；及 (iii) 異體免疫防禦受體(ADR)。實施例70：如實施例69之方法，其中 (i) 該順反子構築體進一步包含編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸； (ii) 該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3； (iii) 該TGFβ-SRR包含TGFβR2-IL2Rβ、TGFβR2-IL12Rβ、TGFβR2-IL18Rβ、或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體；或 (iv) 該ADR係對4-1BB或對CD38特異。實施例71：如實施例68之方法，其進一步包含藉由在TCR基因座處整合編碼嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸來對包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC進行基因工程改造，可選地其中(i)該CAR可操作地連接至該TCR之內源性啟動子，及/或(ii)該TCR藉由CAR插入而被剔除。實施例72：如實施例71之方法，其中該CAR在雙順反子構築體中與細胞介素信號傳導錯合物共表現；或其中該TCR基因座係TCRα或TCRβ之恆定區。實施例73：如實施例72之方法，其中該細胞介素信號傳導錯合物包含以下中之至少一者： (i) IL7及IL7Rα之融合蛋白； (ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白；及 (iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短。實施例74：如實施例71之方法，其中該CAR係： (i) 對腫瘤相關抗原特異； (ii) 對實體腫瘤相關抗原特異； (iii) 對泛腫瘤抗原特異；或 (iv) 對B7H3、BCMA、CD19、CD38、CD79b、EGP2/EpCAM、GPRC5D、HER2、KLK2、MICA/B、及MR1中之一者特異。實施例75：如實施例71之方法，其中對癌細胞上表現之HER2抗原特異之該CAR包含抗原結合域，該抗原結合域包含： (i) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地 (ii) 輕鏈可變(VL)域，其包含包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)。實施例76：如實施例75之方法，其中該CAR之該抗原結合域： (a) 包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域； (b) 包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域； (c) 包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111至114具有至少80%序列同一性； (d) 包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；及/或 (e) 係人源化的。實施例77：如實施例69之方法，其進一步包含藉由以下中之一或多者對包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC進行基因工程改造： (a) 引入HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏； (b) 缺失或破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之一或多者；及 (c) 引入HLA-G、HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者。實施例78：如實施例68至77中任一項之方法，其中該基因工程改造包含靶向編輯。實施例79：如實施例78之方法，其中該靶向編輯藉由CRISPR、ZFN、TALEN、歸巢核酸酶、同源重組、或該等方法之任何其他功能變型來進行。實施例80：一種治療需要過繼細胞療法之對象之方法，其中該方法包含向該對象輸注效應細胞，其中該等效應細胞包含如實施例1至59中任一項之衍生性細胞或其群體。實施例81：如實施例80之方法，其中該等效應細胞包含對癌細胞上表現之HER2抗原特異之CAR，其中該CAR包含： (i) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地 (ii) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)；其中該CAR位於TRAC基因座處，並且CAR表現藉由內源性TCR啟動子來驅動；及其中需要過繼細胞治療之該對象患有乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、食道癌、唾液腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸直腸癌、或頭頸癌。實施例82：如實施例81之方法，其中該等效應細胞進一步包含實體腫瘤靶向主鏈，且其中該等效應細胞包含： (i) 在CD38基因座處，以下中之二或更多者： (a) 編碼CXCR2之多核苷酸； (b) 編碼TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸； (ii) 在CD38基因座處，編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸； (iii) 在TRAC基因座處，編碼IL7及IL7Rα之融合蛋白之多核苷酸；及 (iv) CD38剔除及TCR剔除。實施例83：如實施例80之方法，其進一步包含向該對象投予一或多種治療劑，其中該一或多種治療劑包含： (i) 細胞介素、抗體、接合物、檢查點抑制劑、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)； (ii) 包含達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、或MOR202之抗CD38抗體； (iii) 包含BiTE（雙特異性T細胞接合物）或TriKE（三特異性殺手細胞接合物）之接合物； (iv) 包含阿特珠單抗、阿維魯單抗、德瓦魯單抗、伊匹單抗、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗、莫那利珠單抗、納武單抗、或派姆單抗之檢查點抑制劑；及/或 (v) 包含環磷醯胺及氟達拉濱之化學治療劑(Cy/Flu)。實施例84：如實施例80之方法，其中該等效應細胞包含CD38剔除及TCR剔除，以及可選地ADR，其中該方法包含向該對象投予抗CD38抗體，且其中該方法不需要或需要最少的淋巴球清除，其包含向該對象投予Cy/Flu。實施例85：如實施例80之方法，其中該等效應細胞係同種異體的，且其中向該對象輸注效應細胞係在門診環境中進行。實施例86：一種在治療患有實體腫瘤之對象中改善過繼細胞療法之方法，該方法包含投予如實施例1至31中任一項之衍生性細胞群體。實施例87：一種改善抗HER2單株抗體(mAb)治療之方法，其包含：向需要該治療之對象引入包含效應細胞之組成物，該等效應細胞包含編碼CasMab250-CAR之多核苷酸、編碼CXCR2之多核苷酸、編碼TGFβ-SRR之多核苷酸、及編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及向該對象引入抗HER2 mAb。實施例88：如實施例87之方法，其中該抗HER2 mAb係曲妥珠單抗。實施例89：一種選擇包含關注轉殖基因之經工程改造之NK細胞之方法，其中該方法包含： (i) 獲得經工程改造之NK細胞，該等細胞包含共表現該關注轉殖基因及表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽之構築體，該細胞介素或其受體包含IL15或其各別受體中之至少一者；或(1)至(7)中之至少一者： (1) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現； (2) IL15及IL15Rα之融合蛋白； (3) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短； (4) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白； (5) IL15及IL15Rβ之融合蛋白； (6) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (7) IL15Rβ之同二聚體； (ii) 在不向該等細胞提供外源性IL15細胞介素之情況下培養該等經工程改造之NK細胞；及 (iii) 收集在沒有外源性IL15細胞介素之情況下擴增之NK細胞，從而選擇包含該關注轉殖基因之經工程改造之NK細胞。實例

以下實例是為了說明而非限制提供。實例1 –材料及方法

為了在多潛能幹細胞之上下文中有效地選擇及測試在各種啟動子控制下之外源性基因控制及調控系統，結合不同的安全港基因座整合策略，使用hiPSC平台進行單細胞傳代及高通量、基於96孔板之流式細胞術分選，以允許工程改造及衍生具有單個或多個基因調節之無性繁殖系hiPSC。

小分子培養物中之 hiPSC 之維持：一旦培養物之融匯度達到75%–90%，hiPSC作為單細胞進行常規傳代。對於單細胞解離，將hiPSC用PBS (Mediatech)洗滌並用Accutase (Millipore)處理。然後將單細胞懸浮液與習知培養基混合，離心，重懸於FMM中，並鋪板在基質膠塗佈之表面上。傳代次數一般為1:6-1:8，且每2-3天喂一次FMM。將細胞培養物保持在設定為37℃及5-10% CO ₂之濕潤培養箱中。

使用 ZFN 、 CRISPR 之人 iPSC 工程改造，用於關注模式之靶向編輯：使用ROSA26靶向插入作為實例，對於ZFN介導之基因體編輯，用2.5 µg ZFN-L、2.5 µg ZFN-R、及5 µg供體構築體之混合物轉染200萬iPSC，用於AAVS1靶向插入。對於CRISPR介導之基因體編輯，用5 µg ROSA26-gRNA/Cas9及5 µg供體構築體之混合物轉染200萬iPSC，用於ROSA26靶向插入。使用Neon轉染系統(Life Technologies)進行轉染。在轉染後第2或3天，若質體含有人工啟動子驅動之GFP及/或RFP表現匣，則使用流式細胞術測量轉染效率。

經基因體編輯之 iPSC 之批量分選及無性繁殖系分選：使用ZFN或CRISPR-Cas9進行基因體靶向編輯之iPSC係GFP ⁺SSEA4 ⁺TRA181 ⁺iPSC之批量分選及無性繁殖系分選。將單細胞解離之靶向iPSC池重懸於新鮮的染色緩衝液中，以獲得最佳效能。將接合之一級抗體，包括SSEA4-PE, TRA181-Alexa Fluor-647 (BD Biosciences)加入細胞溶液中。將溶液在染色緩衝液中洗滌，旋轉並重懸於含有10 µM Thiazovivn之染色緩衝液中，用於流式細胞術分選。分選完成後，孵育96孔板。早在第2天便偵測到菌落形成，並且大多數菌落在分選後之第7至10天之間擴增。在第一次傳代中，將孔用PBS洗滌並用30 µL Accutase解離。將解離之菌落轉移至預先塗有基質膠之96孔板之另一孔中。後續傳代按常規進行。分析每個無性繁殖系細胞系之GFP螢光水平及TRA1-81表現水平。選擇具有接近100% GFP ⁺及TRA1-81 ⁺之無性繁殖系用於進一步篩選及分析，包括但不限於經工程改造之iPSC之脫靶編輯及/或核型，然後將無性繁殖系群體冷凍保存以用作主細胞庫。實例2 –多重基因體工程改造以建立無性繁殖iPSC及iPSC衍生之效應細胞，其具有用於經優化實體腫瘤靶向能力之主鏈結構

如表5所示，設計並製備了一系列雙順反子及三順反子構築體，用於在多個基因座處工程改造細胞，用於內源性基因剔除，且同時以期望之組合及期望之放置插入(KO/KI)多種功能模式，以探索更好地裝備效應細胞用於實體腫瘤免疫療法之功能性主鏈排列。

作為實體腫瘤靶向主鏈構建之一部分，TRAC基因座用於插入實體腫瘤抗原辨識受體，例如CAR或外源性TCR，同時剔除內源性TCR以被動避免細胞之宿主免疫偵測。使用僅含CAR之載體或含CAR及細胞介素信號傳導錯合物之雙順反子載體來比較細胞介素信號傳導錯合物是否適合作為主鏈之一部分摻入，除了其他優點之外，主鏈亦支持效應細胞適應性及/或持久性。例如，為了自經工程改造之iPSC產生效應T細胞，測試IL7信號傳導錯合物；且為了自經工程改造之iPSC產生效應NK細胞，替代測試IL15信號傳導錯合物。

選擇第二基因座CD38用於實體腫瘤靶向主鏈之另一部分。當使用雙順反子或三順反子構築體在CD38處插入CD16、CXCR2、及TGFβR2重導向物(TGFβ-SRR)中之二或更多者以應對實體腫瘤環境之挑戰時，內源性CD38基因被剔除，結果使得抗CD38單株抗體可用於選擇性耗竭表現CD38之經活化宿主免疫細胞。

如表5中所示，首先以用於TRAC基因座KO/KI之載體轉導iPSC之各別組。在該實例中，所用之例示性CAR係靶向HER2腫瘤抗原之CAR，並且包含在本申請案中由SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116表示之scFV序列。在驗證成功之TRAC靶向後，接著靶向CD38基因座以引入hnCD16/CXCR2、hnCD16/TGFβR2重導向物、或hnCD16/CXCR2/TGFβR2重導向物。將經TRAC及CD38工程改造之iPSC分化為CAR iT細胞或CAR iNK細胞，以驗證具有對造血細胞之多重基因體編輯之iPSC之多潛能性，過程如圖1A所示。出於本實驗之目的，TGFβR2重導向物係TGFβR2與IL12Rb、IL18R、IL21R中之一者或其片段之融合蛋白，在本申請案通篇中具體被稱為TGFβR2-IL12Rb、TGFβR2-IL18R、TGFβR2-IL21R，或通常稱為TGFβ-SRR。表5：在特定基因座處含有期望雙順反子及三順反子構築體之細胞群

細胞群	細胞中之插入基因座
TRAC_	CD38_
1	CAR
2	CAR/IL7RF
3	CAR	hnCD16/CXCR2
4	CAR/IL7RF	hnCD16/CXCR2
5	CAR/IL7RF	hnCD16/TGFβR
6	CAR/IL7RF	TGFβ-SRR/hnCD16/CXCR2
7	CAR/IL7RF	TGFβ-SRR/CXCR2/hnCD16

分化後，表現TRAC-_CAR、TRAC-_CAR/IL7RF、CD38_hnCD16/CXCR2、及/或CD38_hnCD16/TGFβ-SRR之TCR及CD38剔除之CAR iT細胞係藉由經由流式細胞術在來自具有指定主鏈構形之每個細胞群之單個無性繁殖系上評估其CD45及CD7表現，來評估其淋巴樣定向性（圖1B）。如圖1B所示，所有評估之無性繁殖系共表現CD45及CD7 (95%)，從而證明(i)成功分化為免疫效應細胞及(ii)關於實體腫瘤靶向主鏈之個體編輯之iPSC工程改造策略與具有修飾之iPSC之效應細胞分化能力之相容性。

經由流式細胞術進一步評估經分化之CAR iT細胞群之CAR、hnCD16、及TGFβ-SRR轉殖基因表現。如圖1C所示，用TRAC_CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2工程改造之完全分化之CAR-iT表現高水平之CAR (99.8%)、hnCD16 (99.9%)、及CXCR2 (62.2%)。額外地，用HER2-CAR/IL7RF及hnCD16/TGFβ-SRR（在顯示之資料中具有IL12Rβ融合）工程改造之完全分化之CAR iT亦表現高水平之CAR (90.8%)、hnCD16 (99.6%)、及TGFβR2-IL12Rβ (96.7%)。

進一步評估對CD38 KO/KI特異之三順反子構築體，其以如圖1D所示之具體構形表現CAG驅動之TGFβR2-IL18R、hnCD16、及CXCR2。在CD38工程改造及選擇表現轉殖基因之iPSC後，經由流式細胞術判定CXCR2及TGFβ-SRR之表現，並與CD38未經工程改造之親代iPSC進行比較。如圖1E所示，具有任一構形之經三順反子工程改造之iPSC表現高水平之TGFβ-SRR (98.4% & 99.3%)及CXCR2 (88.7% & 98.1%)，此證明來自此等三順反子整合之iPSC之成功工程改造及穩健之轉殖基因表現。實施例3 -效應細胞實體腫瘤靶向主鏈結合之CXCR2增強細胞遷移及實體腫瘤浸潤

習知CAR-T療法在實體腫瘤環境中表現出適度的療效。除了腫瘤抗原異質性、免疫抑制腫瘤微環境、及有限之效應子持久性之外，適當的效應子運輸至腫瘤本身可為有效實體腫瘤CAR-T療法之主要障礙。CXCR2由骨髓細胞（諸如嗜中性球及樹突細胞，而非T細胞）表現。CXCR2作為原代或iPSC衍生之CAR-T細胞之實體腫瘤靶向主鏈之一部分，對其表現及功能態樣進行評估。

用於經工程改造以表現CXCR2之原代CAR-T細胞之體內評估之例示性實驗設計示於圖2A中。簡言之，將SKOV3腫瘤細胞皮下注射至NSG小鼠中，且20天后，每天對一半的荷瘤小鼠投予太平洋紫杉醇，直至第23天。CXCR2配體CXCL8 (IL8)在多種腫瘤類型（包括乳癌）中富集，且其在腫瘤細胞中之表現隨著化學療法或放射療法之暴露而增加。使用太平洋紫杉醇進行預調理以增加腫瘤細胞中CXCR2配體水平。在第27天，對預調理小鼠及對照小鼠投予CXCR2 ⁺(~25%+)或CXCR2 ^-原代HER2 CAR-T細胞。監測經處理之小鼠之腫瘤生長（圖2B），並在第45天計算腫瘤生長抑制(TGI)（圖2C）。在沒有預調理之情況下，CXCR2 ⁺原代HER2 CAR-T細胞表現出對~40% (p＜0.01)之SKOV3腫瘤之顯著腫瘤生長抑制。與未經處理之荷瘤小鼠相比，僅預調理確實誘導了~30%之腫瘤生長抑制(p＜0.05)。與僅接受腫瘤之小鼠相比，CXCR2 ⁺CAR-T及化學療法預調理之組合誘導了對腫瘤之最大控制(＞70% p＜0.0001)。在第4、14、及25天（無預調理）或第31天（有預調理），藉由流式細胞術評估預調理及未預調理之CXCR2 ⁺或CXCR2 ^-CAR-T細胞在腫瘤中之浸潤及滯留。如圖2D所示，當CXCR2 ⁺CAR-T細胞與化學療法預調理組合時，CAR-T細胞在腫瘤內之浸潤及滯留顯著增強(p＜0.0001)。

接下來，iPSC衍生之CAR-T細胞經工程改造以表現TRAC_HER2-CAR/IL7RF、及TRAC_HER2-CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2，其中CAR之HER2結合域係基於本文所述之CasMab250。趨化因子受體表現展現出在CD38無效之經工程改造之CAR iT細胞中高水平之CXCR2表現，其中64%之細胞表現高水平之CXCR2，而在親代CAR iT細胞中為0.20%（圖2E，左圖）。注意到CCR1及CXCR3，趨化因子傳訊受體（其對於T細胞浸潤至實體腫瘤中通常係重要的）與其親代CAR iT細胞相比，在CXCR2工程改造之CAR iT細胞中保持不受影響（圖2E，中間圖及右圖；分別為CCR1：94.3%對93.3%；及CXCR3：99.6%對99.7%）。

經工程改造之CXCR2之功能性表現藉由transwell遷移檢定來判定。將經工程改造之CXCR2 ⁺及親代CXCR2 ^-CAR iT細胞鋪板至5 µm transwell插入物中，並將稀釋度有所變化(16pg/ml–50 ng/ml)之趨化因子（CXCL8、CCL5、或CXCL9）加入至底部室中。培養3小時後，計算T細胞之特異性遷移。如圖2F左圖所示，針對稀釋度有所變化之CXCL8（CXCR2配體），CXCR2工程改造之CAR iT細胞以劑量反應方式功能性遷移，而CXCR2 ⁺CAR iT細胞對CCL5（CCR1配體）及CXCL9（CXCR3配體）之敏感性不受影響（圖2F之中間圖及右圖）。此等資料表明，將CXCR2工程改造成原代或iPSC衍生之CAR T細胞能夠使細胞功能性遷移至CXCR2配體，此有助於改善對實體腫瘤之浸潤及滯留，並提高腫瘤清除率。實例4 -結合在效應細胞主鏈中之TGFβ信號重導向物受體改善效應細胞之功能性

在該實驗中，經活化之原代CD8 T細胞群各自用不同之TGFβ-SRR構築體進行慢病毒轉導，該構築體包含來自TGFβR之胞外域及IL2R、IL12R、IL18R、或IL21R之胞內域或其片段。在不含IL2之T細胞培養基中靜置24小時後，將T細胞暴露於指定濃度之TGFβ中。2小時後，收穫細胞並藉由流式細胞術分析經磷酸化STAT5 (pSTAT5)之存在。IL2摻入(spike-in)被用作陽性對照。如圖3A所示，流量資料證明在TGFβ存在之情況下，TGFβ-SRR構築體中IL12R、IL21R、及IL2R之細胞介素受體胞內域之功能性，此表明pSTAT5陽性CD8 T細胞之百分比增加至與摻入IL2時觀察到的水平相似之水平。

在單獨的實驗中，iPSC衍生之CAR-T細胞(CAR-iT)經慢病毒轉導以表現顯性陰性TGFβR2（DN TGFβR2或dnTGFβR2）或TGFβ-SRR構築體。然後在一串列刺激檢定中測試CAR-iT，其中在多輪共培養及20 ng/mL TGFβ存在之情況下，在IncuCyte細胞儀器上測量效應細胞殺滅腫瘤細胞之能力。對於TGFβ-SRR，示出與TGFβR2-IL18R相關之資料。如圖3B所示，與TGFβ-SRR CAR-iT或dnTGFβR2 ⁺CAR-iT相比，在第一輪共培養中，在TGFβ存在之情況下，表現TGFβR2-IL18R之CAR-iT展現出增強之腫瘤殺滅作用（圖3B，左圖）。在四輪共培養及暴露於TGFβ（圖3B，右圖）後，dnTGFβR2 ⁺CAR-iT顯示出與含有未轉導效應子之共培養中非常類似之腫瘤殺滅動力學。重要的是，TGFβR2-IL18R CAR-iT持續顯示增強之腫瘤殺滅能力，因為在此種情況下，TGFβ重導向物係藉由IL18R之胞內域提供額外之細胞介素信號傳導。

在一進一步之實驗中，使用圖4A所示之策略製備了表現TGFβ-SRR之經基因工程改造之CAR-iT群體。具體而言，經由CRISPR酶將雙順反子供體匣插入iPSC群體之CD38基因座中，其中iPSC在TRAC基因座處插入了CAR。將主體工程改造之iPSC分化為CAR-iT細胞，並在TGFβ存在或不存在之情況下在一串列刺激檢定中進行測試。Thy1.2標記及TGFβ-SRR之共表現指示在CAR-iT群體中成功工程改造之細胞之百分比。如圖4B所示，產生了在CAR-iT中表現之TGFβ-SRR之三個實例-TGFβR2-IL12Rβ、TGFβR2-IL18R、及TGFβR2-IL21R。在iT分化過程之末期，當細胞定型為T細胞譜系時，TRAC啟動子變為活性的。如圖4C所示，TGFβ-SRR工程改造之細胞中CAR之表面表現指示成功分化為T細胞。

使用一串列刺激檢定，測試表現TGFβR2-IL18R構築體之CRISPR工程改造之CAR-iT細胞抵抗TGFβ介導之效應子功能抑制之能力。在TGFβ不存在之情況下，對照CAR-iT在五輪共培養中顯示出與TGFβR2-IL18R CAR-iT非常相似之腫瘤殺滅動力學（圖5，A部分，無TGFβ），此表明在TGFβ不存在之情況下，TGFβR2-IL18R CAR-iT將不會表現出不必要之高水平效應子功能。在串列刺激檢定中加入20 ng/mL之TGFβ後，對照CAR-iT細胞在第一輪中表現出與TGFβR2-IL18R CAR-iT相似之細胞裂解能力，表明TGFβ-SRR CAR-iT與TGFβ之急性暴露不可能顯著改變此等細胞之效應子功能（圖5，B部分，加上TGFβ）。然而，自第二輪串列刺激開始，觀察到TGFβR2-IL18R CAR-iT中之腫瘤殺滅活性增加。如圖5之B部分所示，此種效應子功能之增加持續至多五輪之共培養。相比之下，在TGFβ摻入之串列刺激檢定中，對照CAR-iT逐漸失去其殺滅目標細胞之能力。

T細胞之效應子功能及抗腫瘤活性與T細胞活化狀態相關。為了表徵用目標細胞多輪刺激後表現TGFβ-SRR之CAR-iT細胞之活化特徵，在TGFβ存在或不存在之情況下，將對照CAR-iT或TGFβ-SRR CAR-iT與目標細胞進行五輪共培養，且在第5輪結束時，對細胞進行TGFβR2及Thy1.2染色（圖6A）。Thy1.2標記及TGFβR2之共表現指示維持TGFβ-SRR表現之效應細胞之百分比。亦藉由流式細胞術分析在有及沒有TGFβ之五輪共培養結束時之效應細胞之活化標記CD69及CD25之共表現（圖6B）。如圖6B所示，在TGFβ不存在之情況下，對照及TGFβR2-IL18R CAR-iT對CD69及CD25二者皆為~60%陽性。相比之下，在TGFβ存在之情況下，對照CAR-iT顯示出CD69 ⁺CD25 ⁺細胞減少(32.4%)，而61.6%之TGFβR2-IL18R CAR-iT對於CD69及CD25係雙陽性（圖6B）。因此，具有TGFβ-SRR之CAR-iT細胞甚至在用目標細胞進行多輪刺激後仍具有增強之活化特徵。

此外，收集第5輪串列刺激檢定之上清液，並經由MSD檢定測試細胞介素，諸如IFNγ、TNFα、及GM-CSF。如圖7所示，在TGFβ存在之情況下，對照CAR-iT顯示出共培養基中細胞介素之顯著減少。相比之下，在具有TGFβ-SRR CAR-iT之共培養物中發現了更高濃度之所測試細胞介素。即使在TGFβ存在之情況下，在TGFβR2-IL18R CAR-iT之共培養物中測得之細胞介素之量與在無TGFβ摻入之對照CAR-iT之共培養物中發現之量相似。在TGFβ存在之情況下，目標細胞在串列刺激中之細胞介素產生增加，此證明TGFβR2-IL18R CAR-iT即使在TGFβ存在之情況下亦維持效應子功能之能力，實體腫瘤環境中代表性的免疫抑制特徵。

為了測試具有TGFβ-SRR之CAR-iT細胞在實體腫瘤環境中目標細胞刺激後是否能夠擴增，在TGFβ存在或不存在之情況下，將對照或TGFβR2-IL18R CAR-iT與目標細胞進行5輪共培養。在該串列刺激檢定期間，在每輪結束時收穫細胞，且使用計數珠及流式細胞術判定效應細胞之數目。如圖8所示，對照CAR-iT細胞在TGFβ存在下顯示出缺乏擴增，而TGFβR2-IL18R CAR-iT顯示出與在TGFβ不存在之情況下經串列刺激之對照CAR-iT相似之正常擴增曲線。TGFβR2-IL18R CAR-iT在TGFβ不存在之情況下亦表現出穩健之擴增，與對照CAR-iT相比，在第2、3、及4輪中觀察到更高倍數之擴增。因此，包含在本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈中之TGFβ-SRR甚至在多輪目標細胞刺激及TGFβ存在之情況下仍為CAR-iT細胞提供改善之擴增，此係實體腫瘤環境典型的。

進一步設計及測試之TGFβ-SRR係除了包含TGFβR2之胞外域之外，亦包含IL12Rb2之細胞質域之片段者。包含IL12Rb2之截短之細胞質域之片段由SEQ ID NO: 13表示。TGFβR2-trIL12Rb2包含由SEQ ID NO: 16所示之例示性胺基酸序列，所屬技術領域中具有通常知識者理解其跨膜域序列可有所變化或被另一跨膜蛋白之跨膜域置換。 SEQ ID NO: 13 SDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ SEQ ID NO: 16 TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDLLLVIFQ VTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVN SDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSNIDDLPSHEAPLADSLEELEPQ（TGFβR2胞外域- 跨膜域序列 - IL12Rb2胞內域片段）

使用CRISPR酶將包含編碼TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體及hnCD16之多核苷酸之雙順反子供體匣插入iPSC之CD38基因座中。在本實驗中，使用本申請案中描述之方法，將主體工程改造之iPSC分選並分化為iNK細胞。使用流式細胞術偵測自iPSC分化之iNK細胞上所示NK標記之表面表現（圖9）。表現顯性陰性TGFβR2 (dnTGFβR2)或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體之iNK細胞表現出與親代iNK相似之表型特徵。此指示TGFβR2-trIL12Rβ轉殖基因與iPSC發育及iNK分化過程之相容性。正如所預期，在TGFβR2-trIL12Rβ及dnTGFβR2表現iNK中，僅與供體匣相關聯之標記TGFβR2及Thy1.2不同。

然後將親代iNK、dnTGFβR2表現iNK、及TGFβR2-trIL12Rβ表現iNK各自與K562目標細胞以1:1之效應子與靶(E:T)比率共培養。在第0、2、及4天向共培養物中加入20 ng/mL之TGFβ。使用流式細胞術評估共培養第2、4、及7天之效應細胞數目。如圖10A所示，親代iNK及dnTGFβR2 iNK在7天之共培養中皆表現出效應細胞數目之逐漸減少。然而，表現TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體之iNK細胞甚至在檢定之第7天仍顯示出穩健之擴增及持久性（圖10A）。不受理論之限制，與dnTGFβR2 iNK相比，此種增加之效能可能係由於藉由IL12Rb之細胞質域片段將TGFβ信號重導向至IL12傳訊途徑。來自第7天之細胞藉由流式細胞術進一步分析NK表型標記（CD45及CD56）或活化標記（CD25及NKp46）。如圖10B所示，親代iNK及dnTGFβR2 iNK顯示表現所選之表面標記之細胞比例相似，而TGFβR2-trIL12Rβ細胞顯示出保留CD45及CD56表現之細胞比例顯著增加。亦注意，基於表現CD25及NKp46之效應子之百分比，TGFβR2-trIL12Rβ iNK顯示出更活化之特徵（圖10B）。

進一步地，將親代iNK、dnTGFβR2表現iNK、及TGFβR2-trIL12Rβ表現iNK各自與Raji腫瘤目標細胞以1:1之E:T比率共培養。在第0、2、及4天向共培養物中加入20 ng/mL之TGFβ，且藉由流式細胞術在三輪中測量對目標細胞之先天殺滅能力。如圖11A所示，親代iNK及dnTGFβR2 iNK在第一輪刺激後顯示出先天殺滅能力之顯著喪失，而TGFβR2-trIL12Rβ iNK細胞在所有三輪共培養中保持殺滅標靶之能力。在每輪共培養結束時，亦使用流式細胞術來判定效應細胞之擴增。如圖11B所示，與親代iNK及dnTGFβR2 iNK相比，表現TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體之iNK細胞顯示出穩健之擴增，此表明在腫瘤目標細胞存在之情況下，TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體改善效應細胞之擴增。

藉由流式細胞術進一步分析來自第2輪再刺激結束時之細胞之NK表型標記（CD56）及活化標記（CD25、CD69、及NKp44）。如圖11C所示，與親代iNK（對照）及dnTGFβR2 iNK相比，TGFβR2-trIL12Rβ iNK細胞顯示出表現所選之表面活化標記之細胞比例顯著增加。如在先前之實驗中，基於表現活化標記之效應子之百分比，TGFβR2-trIL12Rβ iNK顯示出更活化之特徵（圖11C）。

在20 ng/ml TGFβ及抗PDL1單株抗體(mAb)存在之情況下，將TGFβR2-trIL12Rβ iNK細胞及親代iNK與MDA-MB-231癌細胞以5:1之E:T比率共培養過夜。MDA-MB-231乳癌細胞系過表現PDL1。阿維魯單抗係能夠結合至親代iNK細胞中包含之外源性CD16變體之ADCC感受態單株抗體(mAb)，以供iNK細胞進行ADCC介導之針對目標癌細胞之細胞毒性。在共培養過夜後，收穫上清液，離心，並裝載至多分析藥筒上，以量化細胞介素TNF、IFNγ、及GMCSF之分泌（圖12）。

使用基於xCelligence ^™之ADCC檢定來判定不同iNK效應子之ADCC能力。如圖13A所示，在效應子不存在之情況下，僅添加mAb（10 µg/mL阿維魯單抗）不足以誘導目標細胞之細胞裂解。向培養物中添加效應子（E:T比率為5:1）導致每個測試之iNK細胞系對目標細胞之細胞裂解。親代iNK效應子對MDA-MB-231目標細胞表現出ADCC，但表現dnTGFβR2或TGFβR2-trIL12Rβ之iNK表現出更好的細胞裂解活性。

不受理論之限制，在iNK分化過程中阻斷TGFβ傳訊可產生具有改善之效應子功能之iNK，使得dnTGFβR2及TGFβR2-trIL12Rβ iNK即使在TGFβ不存在之情況下亦顯示出更好之ADCC。如所證明的，當培養基中加入20 ng/mL之TGFβ時，親代iNK之ADCC能力急劇下降，且dnTGFβR2 iNK之總體ADCC活性降低。然而，在檢定結束時摻入TGFβ之情況下，TGFβR2-trIL12Rβ iNK仍然表現出對目標細胞之完全細胞裂解（圖13B）。

此外，在與MDA-MB-231目標細胞之第一輪共培養結束時收穫細胞，並藉由流式細胞術進行分析，以判定剩餘效應細胞之數目及給定時間點之轉殖基因表現。不受理論之限制，與表現dnTGFβR2之iNK相比，表現TGFβR2-trIL12Rβ之iNK之持久性增強可歸因於TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體不僅阻斷TGFβ傳訊，而且亦起始IL12傳訊級聯（圖14A）。額外地，如圖14B所示，TGFβR2-trIL12Rβ構築體似乎更穩定，且在TGFβ存在之情況下在iNK細胞表面上高度表現，此係抑制性實體腫瘤環境之特點。

採用與圖13A相同之設置情況下，在第1輪共培養結束時，將效應細胞轉移至具有MDA-MB-231腫瘤標靶之第二個xCelligence ^™平板中。在添加效應子及阿維魯單抗後，相應地測量第2輪之細胞裂解%。圖15A顯示，即使在TGFβ不存在之情況下，親代iNK亦會失去效應子功能，因為幾乎沒有觀察到對目標細胞之ADCC活性。dnTGFβR2 iNK保留了一些量之ADCC活性，儘管與能夠幾乎完全裂解目標細胞之TGFβR2-trIL12Rβ iNK相比大大降低。不受理論之限制，來自TGFβR2-trIL12Rβ構築體之一定水平之緊張傳訊可導致表現此種轉殖基因之iNK具有穩健之效應子功能，即使在多輪標靶刺激後亦如此。然而，在TGFβ存在之情況下，甚至dnTGFβR2 iNK亦如親代iNK一樣幾乎喪失了其所有裂解目標細胞之能力（圖15B）。且儘管TGFβR2-trIL12Rβ iNK在TGFβ存在之情況下亦顯示出降低之ADCC能力，但存在的明顯益處係在克服TGFβ之抑制作用方面，TGFβR2-trIL12Rβ轉殖基因明顯優於dnTGFβR2轉殖基因。在NK細胞中，TGFβR2-trIL12Rβ之表現導致效應細胞擴增、持久性、及效應子功能增強之此種觀察結果可以在T細胞中預期，因為IL12傳訊途徑被視為在T細胞中與在NK細胞中同樣重要。

為了進一步評估不同iNK效應子之ADCC能力，將檢定擴展至額外實體癌細胞模型，包括SKOV3卵巢細胞腫瘤細胞系及PC-3前列腺癌細胞系。由於SKOV3癌細胞過表現HER2，曲妥珠單抗（商業上稱為Herceptin ^™之抗HER2抗體）被選擇為針對SKOV3標靶之例示性ADCC感受態mAb，而曲妥珠單抗及西妥昔單抗（抗EGFR抗體）見於其表現HER2及EGFR二者而被選為針對PC-3標靶之例示性mAb。如圖16所示，與親代iNK效應子相比，表現TGFβR2-trIL12Rβ之iNK對所有標靶皆顯示出更好的細胞裂解活性。實例5 -由具有實體腫瘤靶向主鏈之CD38陰性CAR-iT細胞實現之同種異體反應性免疫細胞之選擇性耗竭

自體及同種異體細胞療法目前皆依賴于患者之淋巴球調理，其誘導富含細胞介素之環境，用於增強過繼轉移之細胞並調節宿主免疫系統。然而，淋巴球調理與血液學毒性相關聯，包括對嚴重感染之易感性增加。本文所揭示之免疫治療效應細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，其在所選之內源性基因座處策略性地結合選擇性引入之外源性模型，同時作為主鏈設計之一部分剔除（多個）內源性基因。CD38作為兩個所選之內源性基因座中之一者，係本文提供之實體腫瘤靶向主鏈設計所包含之基因剔除策略中之一者，用於尋求顯著降低對基於化學療法之淋巴球調理之需求，同時保持過繼轉移細胞之抗腫瘤活性。

進行混合淋巴球反應(MLR)以評估经抗CD38 mAb（達雷木單抗）處理之CAR-iT細胞抵抗同種異體淋巴球排斥之能力。將hnCD16a ⁺/CD38 ^-CAR-iT細胞與來自健康供體之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC)以1:1之比率在含有及不含有抗CD38抗體達雷木單抗之情況下在補充有IL2之培養基中共培養9天。在共培養期間，進行流式細胞術分析，其中在所示時間點對CAR-iT細胞數目進行計數並作圖（圖17）。將CAR-iT細胞計數正規化為在PBMC不存在之情況下維持之CAR-iT細胞對照培養物。資料顯示，在達雷木單抗不存在之情況下，隨著時間推移，CAR-iT細胞之共培養物易受PBMC介導之耗竭之影響。然而，在經達雷木單抗處理之共培養物中，CAR-iT細胞維持與不含PBMC之對照培養物相似之持久性水平，且甚至隨著時間推移而擴增。此等資料表明，具有如本文所揭示之包含CD38剔除之實體腫瘤靶向主鏈之CAR-iT細胞不容易因達雷木單抗之存在而耗竭。此外，達雷木單抗處理保護CD38 ^-CAR-iT細胞不被同種異體實體腫瘤靶向中之同種異體淋巴球耗竭。

在此等共培養物中，隨時間測量PBMC中之T細胞及pbNK細胞擴增。如圖18所示，在所示時間點繪製絕對T細胞（左圖）及pbNK細胞（右圖）計數。資料指示，當PBMC單獨培養時，T細胞及pbNK細胞二者皆能夠強健地擴增。在分別提供達雷木單抗或CAR-iT細胞之PBMC培養物中，僅觀察到T細胞及pbNK細胞擴增之部分抑制。然而，在PBMC與CAR-iT細胞及達雷木單抗二者共培養之條件下，觀察到T細胞及pbNK細胞之最大抑制。此等資料表明，具有如本文所揭示之包含CD38剔除之實體腫瘤靶向主鏈之CAR-iT細胞可以利用達雷木單抗來抑制同種異體T細胞及pbNK細胞擴增；從而提供CAR-iT細胞可逃避T及pbNK同種異體反應之機制。

在此等共培養物中，亦評估了達雷木單抗選擇性地耗竭CD38 ⁺T及pbNK淋巴球之能力。代表性之流程圖展示出，在具有PBMC之CAR-iT細胞共培養物中，91%之T細胞（圖19A）及74%之pbNK細胞（圖19B）表現CD38。然而，在用達雷木單抗處理之此等相同之共培養物中，觀察到CD38 ⁺T細胞及pbNK細胞之百分比顯著下降（分別下降至圖19A中之52%及圖19B中之16%）。對代表性流程圖中所示之CD38 ⁺T細胞及pbNK細胞之絕對計數進行量化，並繪製成條形圖。來自在達雷木單抗存在之情況下維持之共培養物之CD38 ⁺T細胞計數顯示出，與對照條件相比，可偵測之CD38 ⁺T細胞減少了約15倍（圖19C）。類似地，來自經達雷木單抗處理之共培養物之CD38 ⁺pbNK細胞計數展示出，與對照條件相比，可偵測之CD38 ⁺pbNK細胞減少了約21倍（圖19D）。綜合起來看，此等資料展示出，當細胞用達雷木單抗處理時，將CD38剔除結合至實體腫瘤靶向主鏈中使得抗CD38 mAb CAR-iT細胞或iNK細胞能夠選擇性地耗竭CD38 ⁺T細胞及pbNK細胞，同時保留非同種異體反應性之CD38陰性淋巴球，包括CD38無效CAR-iT細胞或iNK細胞。

此外，觀察到當在達雷木單抗存在之情況下使用hnCD16a ⁺/CD38 ^-iNK細胞及iT細胞靶向CD38 ⁺T細胞及pbNK細胞時，CD38 ⁺細胞之耗竭增加了NAD ⁺（菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸，CD38之受質）之可用性，並減少NAD ⁺消耗相關之細胞死亡，此除其他優點外還會增強效應T細胞及NK細胞反應，並減少免疫抑制性腫瘤微環境中之效應細胞衰老。

亦應注意，僅當必要時，才可利用以抗CD38抗體進行治療以利用CD38剔除，從而提供患者設置之可撓性。實例6 -用靶向4-1BB之異體免疫防禦受體(ADR)裝備之效應細胞

作為解決淋巴球調理相關挑戰之替代或額外方法，開發選擇性靶向宿主免疫細胞並顯著增強過繼轉移細胞之功能活性之異體免疫防禦受體(ADR)。如本文所揭示的，靶向4-1BB之ADR在經活化之效應細胞（包括同種異體反應性NK細胞及T細胞）上被上調，其用作如本文所組態之實體腫瘤靶向主鏈之一部分，以在免疫感受態宿主系統中提供同種異體效應細胞之功能持久性及抗腫瘤活性，同時耗竭宿主免疫細胞子集，而不需要化學療法調理。

在體外混合淋巴球反應(MLR)檢定中，CAR-iNK細胞（有或沒有ADR）及PBMC以8:1之比率共培養。分析第10天之共培養物中CD3 ⁺T細胞中CD38及4-1BB之表現，且經證明所有可偵測之4-1BB表現被限於CD38 ⁺同種異體反應性群體，此指示ADR及CD38調理（即在抗CD38抗體存在之情況下之CD38 ^-效應細胞）之潛在同時使用提供增強之同種異體反應性防禦策略，其可進一步結合至本申請案中所揭示之實體腫瘤靶向主鏈中。最初研究表明，經ADR修飾之CAR-iNK細胞抵抗同種異體排斥，同時引發持久的抗腫瘤反應，該持久的抗腫瘤反應藉由抗CD38 mAb之組合進一步增強。

使用CRISPR核酸酶及包含一或多個預期轉殖基因及用於位置選擇性插入之一對同源臂之構築體，串列或同時工程改造誘導性多潛能幹細胞以獲得CD38 KO、CD19-CAR、41BB-ADR、高親和力不可切割CD16 (hnCD16)及IL15RF之過表現。當插入發生在內源性CD38基因座處時，本文提供之構築體允許（多個）轉殖基因在構築體中包含之CD38內源性啟動子或外源性啟動子下表現。然後根據本文提供之方法將經基因體編輯之無性繁殖iPSC分化為效應細胞，該等效應細胞包含CD19-CAR、CD38 ^-/-、hnCD16、及IL15RF，有或沒有41BB-ADR表現。

進行混合淋巴球反應(MLR)以測試所製備之衍生性效應細胞在同種異體環境中之壽命。在檢定之前，立即用細胞內染料（Celltrace Violet ^™或類似之Incucyte ^™相容試劑）標記iNK細胞群體（有及沒有41BB-ADR）。將CAR-iNK ± ADR細胞以4:1之iNK細胞與PBMC比率共培養，ADR ⁺CAR-iNK細胞展現出增強之功能持久性，如描繪針對HLA-A2 ⁺PBMC之閘控示意圖之代表性FACS曲線圖所示（圖20A）。對來自共培養物之iNK細胞計數在圖20B所示之指示時間點作圖，資料被正規化為不含PBMC培養之iNK細胞。

在單獨之實驗中，將CAR-iNK ± ADR細胞與來自八個供體之PBMC以2:1之iNK細胞與PBMC比率共培養九天。如圖21A所示，與未裝備ADR之CD19-CAR iNK細胞相比，ADR ⁺CAR-iNK細胞抑制同種異體反應性CD3 ⁺T及CD56 ⁺NK細胞之擴增。T細胞及NK細胞計數（正規化為來自在iNK細胞不存在之情況下維持之供體PBMC培養物之T細胞及NK細胞計數）之量化顯示，ADR之表現預防CD3 ⁺CD56 ^-T細胞及CD3 ^-CD56 ⁺NK細胞之擴增（圖21B）。當分析CD3 ⁺T細胞中CD38及4-1BB之表現時，在ADR ⁺CAR-iNK細胞存在之情況下觀察到4-1BB ⁺T細胞之顯著耗竭（圖22A）。如圖22B所示，在CAR-iNK ± ADR共培養物中，來自八個供體之CD4 ⁺及CD8 ⁺T細胞中之CD38%及4-1BB%表現之彙編進一步證明ADR裝備之效應細胞選擇性地靶向及耗竭CD4 ⁺及CD8 ⁺同種異體反應性T細胞子集二者。

此外，經工程改造以嵌入包含在TRAC基因座處之CAR（在本實驗中，MICA/B-CAR係例示性CAR模式）及ADR（41BB-ADR模式，包含如本申請案中所述之CD3ζ或CD3ζ1XX信號傳導域）之雙順反子構築體之iPSC分化為T細胞。隨後藉由流式細胞術分析衍生之T細胞之CAR及胞內CD3表現。如圖所示，經工程改造以表現TRAC驅動之CAR及ADR轉殖基因之iPSC可以分化為定型之T細胞（圖23 (A)），並且在經TRAC工程改造之iPSC衍生之iT細胞中CAR及ADR模式之共表現係穩健的（圖23 (B)）。表現或缺乏ADR模式之iT細胞與同種異體T細胞共培養72h。未裝備ADR之iT細胞在同種異體T細胞存在之情況下不能持續存在並且被耗竭，而表現ADR之iT細胞持續存在（圖24 (A)）。此外，同種異體T細胞在與ADR缺乏iT細胞共培養時擴增，但在表現ADR之iT細胞存在之情況下被耗竭（圖24 (B)）。綜上所述，此等資料顯示出ADR在同種異體環境中亦能保護iT細胞。

總體而言，上述體外資料證明同種異體效應細胞在藉由靶向其上調之4-1BB來抑制經活化之周邊T細胞或NK細胞時進行41BB-ADR表現之能力，從而減少效應細胞受領者中此等經活化之周邊T細胞或NK細胞針對同種異體效應細胞之同種異體排斥。

為了評估體內ADR裝備之效應細胞之有效性，對NSG小鼠靜脈內(IV)注射約20 ×10 ⁶個同種異體反應性T細胞，隨後24小時後（第0天）IV注射1 × 10 ⁵個螢光素化之B2M KO Nalm6細胞。另一24小時後（第1天），給小鼠IV注射約3 × 10 ⁶個CAR-iNK細胞，有或沒有ADR表現，然後在第3天及第6天再次注射。僅接受螢光素化之B2M KO Nalm6細胞或僅接受媒劑之NSG小鼠分別用作陽性對照及陰性對照。同種異體反應性T細胞預先用100 IU/ml IL2及Dynabeads ^™人T-活化劑CD3/CD28在體外擴增10天，如製造商方案所指示。在CAR-iNK ± ADR存在之情況下，測量藉由總通量進行之基於生物發光之腫瘤量化，以監測接受同種異體反應性T細胞之小鼠與未接受同種異體反應性T細胞注射之小鼠相比之腫瘤生長。如圖所示，在同種異體T細胞不存在之情況下，ADR ^-CAR-iNK及ADR ⁺CAR-iNK細胞具有相似之針對Nalm6標靶之抗腫瘤活性（圖25A）。相比之下，在同種異體T細胞存在之情況下，ADR ^-CAR-iNK細胞之排斥導致未裝備效應細胞之抗腫瘤控制之損失（圖25B）。相比之下，ADR ⁺CAR-iNK細胞在同種異體T細胞存在之情況下保持持久的抗腫瘤控制，如在沒有同種異體T細胞攻擊之小鼠中所見。因此，在宿主同種異體反應性T細胞系統存在之情況下，ADR裝備之效應細胞在體內表現出不受損之腫瘤控制。實例7 -結合在實體腫瘤靶向主鏈中之IL7受體融合(IL7RF)減少CAR iT細胞消耗

將包含藉由可撓性連接子共價連接至IL7Rα之IL-7細胞介素之IL7受體融合蛋白(IL7RF)結合至實體腫瘤靶向主鏈中以增強CAR-iT存活及持久性。將表現TRAC_HER2-CAR或表現TRAC_HER2-CAR/IL7RF及CD38_CAG hnCD16/CXCR2之HER2-CAR iT與HER2 ^高SKOV3腫瘤細胞以1:1之E:T比率共培養。然後針對每種CAR-iT構形分析共培養48小時後效應細胞及剩餘CAR-iT細胞之細胞裂解功效，以確定IL7RF對HER2-CAR效應細胞之貢獻。

如圖26A所示，具有兩種構形之CAR-iT細胞（TRAC_HER2-CAR；或TRAC_CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2）展示出針對HER2 ^高腫瘤細胞之類似抗腫瘤功效，達到60-70%之類似峰值細胞裂解功效。共培養後約48小時，收集CAR-iT細胞，並測量剩餘之CAR-iT。如圖26B所示，與實體腫瘤靶向主鏈中不含IL7RF之CAR iT細胞相比，實質上更多之表現IL7RF之CAR-iT保留在檢定中（60%對15%之輸入）。此等資料表明，IL7RF表現限制CAR-iT細胞消耗，並增強標靶實體腫瘤細胞活化後效應細胞之持久性。對於iPSC衍生之NK細胞，CAR-IL15RF用於與CAR共表現。實例8 –結合在實體腫瘤靶向主鏈中之hnCD16補充並支持實體腫瘤相關抗原之CAR靶向

甚至高度表現之實體腫瘤相關抗原(TAA)之異質性係在實體腫瘤中有效應用細胞免疫療法之主要障礙。為了實現實體腫瘤抗原之多抗原靶向，CAR-iT細胞經工程改造以表現高親和力、不可切割形式之CD16a (hnCD16)，並且評估hnCD16介導之ADCC與CAR之相容性及補充，作為本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之一部分，用於實體腫瘤靶向。將包含TRAC_HER2-CAR/IL7RF之CAR-iT細胞及除CD38_hnCD16/CXCR2之外還包含TRAC_HER2-CAR/IL7RF之CAR iT細胞分別與SKOV3腫瘤細胞以及靶向PDL1或HER2之治療性抗體共培養48小時，並經由xCELLigence ^™檢定以1:2之E:T之比率評估效應細胞之細胞裂解功效。

藉由定量流式細胞術判定SKOV3腫瘤細胞上PDL1及HER2之表面表現，並且經檢定之SKOV3腫瘤細胞為PDL1 ^低及HER2 ^高（圖27A）。如圖27B所示，與僅培養基（左圖，46%之最大細胞裂解）或hnCD16陰性CAR-iT細胞（16-25%之最大細胞裂解）相比，用抗PDL1（中間圖，69%之最大細胞裂解）或抗HER2（右圖，95%之最大細胞裂解）活化hnCD16特別增強了hnCD16 ⁺CAR-iT細胞之功效。重要地，hnCD16對細胞裂解之補充程度與PDL1或HER2之表現水平直接相關。額外地，如圖27C所示，在有及沒有抗PDL1或抗HER2抗體之情況下，hnCD16 ⁺CAR-iT在SKOV3腫瘤細胞上活化過夜之IFNγ、IL2、及CD107a表現（脫粒標記）進一步證明hnCD16共活化以抗原表現依賴性方式增強CAR-iT細胞之效應子功能（SKOV3 + hnCD16 CAR-iT：12.8% IFNγ ⁺CD107a ⁺；SKOV3 + hnCD16 CAR-iT +抗PDL1：35.0% IFNγ ⁺CD107a ⁺；SKOV3 + hnCD16 CAR-iT +抗HER2：51.0% IFNγ ⁺CD107a ⁺）。

hnCD16介導之ADCC進一步增強HER2-CAR iT對賀癌平抗性JIMT1（HER2 ⁺PDL1 ^高）及HER2 ^低MDA-MB-231（HER2 ^低PDL1 ^高）腫瘤細胞系之細胞裂解功效（圖28）。如在SKOV3腫瘤細胞情況下所觀察的，hnCD16活化情況下CAR功效之相對增強與所靶向之次級TAA成比例。例如，在JIMT1及MDA-MB-231腫瘤細胞上，與僅CAR iT（分別為47%及19%）相比，在抗PDL1及CAR iT情況下觀察到最大細胞裂解功效（二者皆為100%）。

接下來，在重複抗原刺激檢定中評估hnCD16/CAR互補。簡言之，將表現TRAC_HER2-CAR/IL7RF或TRAC_HER2-CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2之HER2-CAR iT與HER2 ^高SKOV3腫瘤細胞以1:1之E:T比率在有或沒有抗HER2抗體之IL2存在之情況下共培養。在共培養三天后，在以1:1之E:T比率用新鮮腫瘤標靶重新接種之前，收集CAR-iT並進行計數。經由incucyte檢定來判定CAR-iT擴增及細胞裂解功效。如圖29所示，在多輪腫瘤攻擊中，CAR-iT細胞之hnCD16及CAR共活化導致hnCD16 ⁺CAR-iT細胞實質上更大之擴增，在四輪腫瘤攻擊後達到＞40倍之擴增，相比之下，在沒有hnCD16與抗HER2抗體共活化之情況下，hnCD16 ⁺CAR-iT細胞擴增9倍，且在有及沒有抗HER2抗體之情況下，hnCD16 ^-CAR-iT細胞擴增5至7倍。值得注意的是，在所有四輪腫瘤攻擊中，hnCD16及CAR共活化之CAR-iT細胞之細胞裂解功效最大。總之，此等資料表明，作為本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈之組分，CAR及hnCD16活化係相容及互補的，在驅動效應細胞擴增及細胞毒性以及解決實體腫瘤異質性方面具有協同益處-支持跨多種抗原密度及腫瘤類型之多抗原靶向。實例9 -基於CasMab之HER2-CAR對具有實體腫瘤靶向主鏈之效應細胞中之腫瘤係有效的且具有選擇性

儘管嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法在液體腫瘤中顯示出顯著療效，但其對實體腫瘤之更廣泛應用受腫瘤相關抗原(TAA)異質性、CAR-T細胞向腫瘤之低效運輸、及腫瘤微環境固有之免疫抑制之阻礙。此外，解決此等障礙所需之高度編輯（例如＞2個轉殖基因）之原代供體衍生之CAR-T細胞之通常功能障礙及異源產率限制了其功效及更廣泛之臨床研究。因此，展現包含與任何實體腫瘤靶向模式（諸如抗原特異性CAR、ADCC相容之mAb、BiTE、TRikE）相容之優化主鏈之多重工程改造之CAR-iT細胞產物，對於其在實體腫瘤適應症中之廣泛應用尤其重要。包含本文提供之優化主鏈之多重工程改造之CAR-iT細胞產物經特別設計及定制以克服在實體腫瘤中觀察到之常見障礙，包括優先運輸至腫瘤、促進腫瘤微環境抗性、及在體外及體內環境中引發強效及增強之抗腫瘤活性之能力。此外，亦展現出此類產物可製造成現成可用的。

自TiPSC產生表現基於CasMab250之HER2-CAR之iT細胞，該TiPSC已經工程改造以表現TRAC_HER2-CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2或TRAC_ HER2-CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/TGFβR2-IL12Rβ，且針對每種構形評估CAR靶向之功效及特異性。簡言之，將CAR-iT與HER2 ^高(SKOV3)、HER2 ⁺(JIMT1)、或HER2 ^低(MDA-MB-231)腫瘤細胞以2:1之E:T比率共培養，並經由如上所述之xCELLigence ^™檢定來判定細胞裂解功效。如圖30所示，CXCR2（頂列）及TGFβR2(IL12RB)（底列）CAR-iT構形結展示出穩健之抗HER2功效，其(i)與每個具體腫瘤標靶系之HER2抗原水平密切相關，並且(ii)相對於表現相同CAR之原代CAR-T細胞而言增強，從而突出實體腫瘤靶向主鏈對效應細胞功效之貢獻。

接下來，評估細胞構形各者中CasMab250-CAR之抗腫瘤特異性與正常HER2特異性。將表現TRAC_CasMab250-CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2之HER2-CAR iT及表現衍生自賀癌平之HER2-CAR之原代CAR-T細胞(4D5)與HER2 ⁺正常、非致瘤性細胞系MCF10a（乳腺）、Met5a（間皮素）、及HaCaT（角化細胞）以1:1之E:T比率培養，並經由xCELLigence ^™檢定來監測細胞裂解功效。如圖31所示，基於4D5之原代CAR-T容易靶向所有檢定之HER2 ⁺正常細胞系。另一方面來說，基於CasMab250之CAR iT對MCF10a及Met5a細胞系沒有反應性，且對HaCaT標靶之反應性有限。因此，證實了攜帶基於CasMab250之HER2-CAR之原代CAR-T及TRAC_HER2-CAR iT對HER2 ⁺腫瘤細胞而非正常HER2 ⁺細胞係特異的。此等資料亦展示出，與基於4D5之HER2-CAR相比，基於CasMab250之CAR對腫瘤相關HER2抗原同時主要針對非腫瘤細胞HER2抗原之功效及選擇性在用本文所揭示之實體腫瘤靶向主鏈高度工程改造之CAR-iT細胞中得以維持，該主鏈通常進一步有助於總體效應細胞對腫瘤細胞之功效，且特別地對實體腫瘤具有額外優點。

如實例2中所述，自iPSC產生完全裝備之分化的CAR-iT細胞，該等iPSC經依序工程改造以表現TRAC_CasMab250-CAR-2A-IL7RF (CAR-iT)及CD38_TGFβR2(IL18R)-2A-hnCD16-2A-CXCR2，除了CAR（使用例示性基於CasMab之靶向HER2之CAR）、TRAC剔除、及CD38剔除外，其還具有四種實體腫瘤靶向主鏈功能模式（即，TGFβ重導向物、CXCR2、hnCD16、及IL7RF）（以下被稱為「優化的CAR-iT細胞」）。圖32中示出了流式細胞術，其展現出淋巴樣定型（CD45 ^高CD7 ^高）及高且同質的CAR、hnCD16、TGFβ-SRR（在本檢定中使用了TGFβR2-IL18R重導向物受體）以及優化的CAR-iT之CXCR2表現。

為證明轉殖基因功能、相容性、互補、及增強，使用優化的CAR-iT與僅使用CAR/IL7RF之TRAC工程改造作為對照之CAR-iT相比進行了以下檢定。CAR-iT中之CAR係基於CasMab之HER2-CAR。在HER2 ^高（OVCA，高表現上皮卵巢癌細胞系）、HER2 ^中等（BRCA，中等表現乳癌細胞系）、HER2 ^低（PCA；低表現前列腺癌細胞系）及HER2 ^低（BRCA；低表現乳癌細胞系）腫瘤細胞上，以2:1之效應子：標靶比率，經由xCELLigence ^™檢定來評估基於CasMab250之CAR抗腫瘤細胞裂解功效，以展現HER2依賴性腫瘤清除。如圖33所示，優化的CAR-iT在多種實體腫瘤適應症及不同抗原水平之腫瘤細胞中展現出穩健之CAR依賴性抗腫瘤功效。

如圖34所示，用HER2 ^低(PCA)及HER2 ^低(BRCA)腫瘤標靶及HER2-CAR iT以低E:T比率（1:1，頂列；1:2，底列），在有及沒有抗EGFR（頂列）或抗PDL1抗體（底列）之情況下，經由xCELLigence ^™檢定來評估優化的CAR-iT中CAR功能性之hnCD16互補。當與CAR靶向及hnCD16介導之次級TAA依賴性細胞裂解共活化時，優化的CAR-iT展現出增強之細胞裂解功效。在以1:1之E:T比率使用OVCA腫瘤標靶（HER2 ^高）之串列再刺激Incucyte檢定中，在抗HER2抗體存在及不存在之情況下評估CAR-iT及優化的CAR-iT之細胞裂解功效。在每一輪再刺激中，使用新的腫瘤標靶重新設定效應子：標靶比率。如圖35所示，在針對實體腫瘤優化之CAR-iT細胞中之每一輪中，藉由hnCD16活化及治療性抗體增強CAR介導之抗腫瘤功效。至第4輪時，僅優化的CAR-iT細胞保持細胞裂解功效，此在抗HER2抗體存在之情況下得到進一步增強。

在TGFβ存在或不存在之情況下，藉由重複的HER2 ^高腫瘤標靶攻擊，評估優化的CAR-iT細胞中藉由TGFβ-SRR進行之TGFβ傳訊重導向。CAR-iT（頂列）及優化的CAR-iT（底列）細胞之細胞裂解功效藉由與OVCA腫瘤目標細胞以2.5:1之E:T比率共培養，針對多輪腫瘤攻擊，經由xCELLigence ^™檢定進行分析。如圖36所示，與僅具有CAR/IL7RF之TRAC工程改造之CAR-iT相比，優化的CAR-iT展現出對TGFβ介導之效應子功能抑制之抗性，且具有持續之細胞裂解功效。

此外，用重組人CXCL8之串列稀釋液在transwell檢定中體外評估優化的CAR-iT之CXCR2功能性。如圖37所示，優化的CAR-iT細胞在檢定之整個持續時間內展現出以劑量依賴性方式向CXCL8之功能性及特異性遷移。

最後，在具有或不具有抗HER2單株抗體(mAb)曲妥珠單抗(Herceptin ^™)之侵襲性卵巢異種移植模型中，體內評估優化的CAR-iT細胞之抗腫瘤功效。如（圖38A）所示，在腫瘤移植後第8天，用單劑量(8 mg/kg)之mAb及/或在第8、11、及14天用三劑量（每次1e7）之優化的CAR-iT細胞處理具有確立之卵巢異種移植物之NSG小鼠。記錄並顯示每個單獨受領者之腫瘤體積。在腫瘤接種後39天，計算所有群組之腫瘤生長抑制（圖38B）。如圖所示，與不具有mAb處理之CAR-iT或僅mAb處理之CAR-iT相比，在賀癌平存在之情況下，優化的CAR-iT展現出腫瘤體積之穩健減小及接近100%之腫瘤生長抑制(TGI)（圖38A及圖38B）。值得注意的是，資料展現出包含HER2-CAR之優化的效應細胞可能藉由靶向單獨的HER2抗原與賀癌平相容，即沒有經由立體阻礙之明顯競爭。賀癌平係用於轉移性HER2 ⁺癌症治療之當前注意標準。然而，已知賀癌平具有相關之腫瘤抗性機制，包括但不限於抗原屏蔽、抗原下調、缺乏內化、及對二聚化不敏感。此處顯示之CasMab250-CAR與抗HER2抗體之相容性，除了利用靶向不同種類之液體或實體腫瘤抗原之ADCC抗體（諸如EGFR、MICA/B，以及本申請案中所揭示之許多其他抗原）之雙重靶向之外，還為HER2相關之癌症及疾病提供治療選擇。實例10 -實體腫瘤靶向主鏈之智慧型設計額外提供基於細胞介素信號之選擇，用於隨後有效之CAR/轉殖基因插入及篩選

作為一個實例，對於iPSC衍生之NK細胞，CAR-IL15RF用於與CAR共表現。由IL15RF傳遞之自主細胞介素信號傳導已證明不僅改善體內持久性，而且亦會使細胞在體外獨立於細胞介素支持而擴增。獨立於細胞介素支持之擴增能力被進一步用作選擇模型，其允許經修飾之細胞擴增，而未修飾之細胞保持無活性。

本申請案之實體腫瘤靶向主鏈並非藉由將hnCD16-IL15RF嵌入CD38基因座而使細胞介素信號傳導錯合物與hnCD16共表現，而是有意識地設計成在所選之基因座處與IL15RF（或用於iT細胞之IL7RF）共表現CAR。主鏈中要件之此種排列提供基於細胞介素信號之基因編輯選擇系統，以改善轉殖基因選擇之工程改造效率，同時消除脫靶工程改造。

當用CD38_（TGFbR重導向物、CXCR2、及ADR中之2或更多種）-hnCD16工程改造之iPSC之主細胞庫(MCB)被建立、驗證、並冷凍保存時，經工程改造之MCB iPSC可被重複用作資源及起始點，以隨後插入任何靶向模式，包括CAR，其具有例如附接於雙順反子構築體中之IL15RF。在篩選CAR插入時，用IL15RF作為培養物中之選擇劑，細胞介素之非依賴性導致轉殖基因陽性細胞之生長。培養期間經修飾之細胞之此種生長減少對分選之需要，此增加對大量CAR陽性細胞之篩選通量及規模，該CAR陽性細胞具有預先組裝之腫瘤靶向主鏈，每種CAR及CAR細胞產物對與一種或一組（多個）腫瘤適應症相關聯之抗原具有不同結合特異性。

基於對轉殖基因-2A-IL15RF之觀察及應用，允許藉由差異存活之無細胞介素擴增來選擇經修飾之細胞之其他受體融合設計亦可設想到，尤其除了自已知驅動增生及/或存活之各種α鏈設計之融合受體之外，藉由共同之IL2β及γ鏈起作用之細胞介素受體次單元之融合受體。

所屬技術領域中具有通常知識者將容易明白，本文所述之方法、組成物及產物代表例示性實施例，且無意作為本發明之範疇之限制。所屬技術領域中具有通常知識者將顯而易見的是，不脫離本發明之範疇及精神的情況下，可對本文中所揭示之本揭露進行不同的替換及修改。

本說明書中所提及之所有專利案及公開案指示本揭露所屬技術領域中具有通常知識者的水準。所有專利案及公開案均以引用方式併入本文中，宛如各個別公開案具體且個別地指示為以引用方式併入本文中般。

本文中說明性地描述之本揭露可在不存在本文未具體揭示之任何一或多個元件、一或多個限制的情況下實踐。因此，例如，在本文之各個例中，任何用語「包含(comprising)」、「基本上由……組成(consisting essentially of)」及「由……組成(consisting)」可以其他兩個用語中任一者置換。已採用之用語及表述用作描述用語而非限制用語，且無意在使用此類用語及表述時排除所示且描述之特徵之任何等效物或其部分，但應明白，在要求保護之本揭露之範疇內，各種修改係可行的。因此，應理解，儘管本揭露已由較佳實施例及可選之特徵具體揭示，但是所屬技術領域中具有通常知識者可利用本文中所揭示之概念之修改及變化，且此類修改及變化被視為在如由隨附申請專利範圍所定義之本發明之範疇內。

無

[圖1A]至[圖1E]顯示雙順反子表現CAR-iT細胞之工程改造及分化。圖1A顯示根據本發明之一些實施例之用於製備效應細胞之經基因工程改造之iPSC分化過程之概述。圖1B顯示藉由經由流式細胞術評估CD45及CD7表現，用實體腫瘤主鏈設計之多種組分中之一者評估CAR-iT細胞之淋巴樣定型。圖1C顯示經工程改造之CAR-iT細胞之例示性組之高轉殖基因表現。圖1D顯示用於CD38基因座插入及CD38剔除之例示性三順反子構築體。圖1E顯示與親代未經工程改造之T細胞相比，三順子經工程改造之CAR-iT細胞之高表現水平。 [圖2A]顯示用於經工程改造以表現CXCR2之CAR-T細胞之體內評估之例示性實驗設計。[圖2B]及[圖2C]顯示在CXCR2信號傳導之上下文中，在有及沒有太平洋紫杉醇預調理之情況下，經受CAR-T細胞療法之荷瘤小鼠中第45天之腫瘤生長（圖2B）及腫瘤生長抑制（圖2C）。[圖2D]顯示在有及沒有太平洋紫杉醇預調理之情況下，第45天每個指示之CAR-T細胞組在腫瘤內之浸潤及滯留。[圖2E]顯示與用TRAC_HER2-CAR/IL7RF及CD38_hnCD16/CXCR2二者工程改造之CAR-T細胞相比，用TRAC_HER2-CAR/IL7RF工程改造之CAR-T細胞之趨化因子受體表現。[圖2F]顯示針對稀釋有所變化之CXCR2配體，CXCR2-工程改造之CAR-iT細胞以劑量反應方式之遷移改善，而CXCR2 ⁺CAR-iT細胞對CCR1配體及CXCR3配體之敏感性不受影響。 [圖3A]顯示TGFβ重導向物構築體中細胞介素受體胞內域之功能性。[圖3B]顯示藉由使用顯性陰性TGFβ，信號重導向物受體之功能性相比於單獨阻斷TGFβ信號傳導之改善。 [圖4A]顯示用於產生及測試表現TGFβ重導向物受體之CAR-iT細胞群體之例示性策略之示意圖。[圖4B]顯示經工程改造之CAR-iT細胞表現之TGFβ重導向物受體之流式細胞術偵測。[圖4C]顯示表現TGFβ重導向物受體之CAR-iT細胞可以自主體工程改造之iPSC群體中成功分化。 [圖5]（部分A及部分B）顯示表現TGFβ重導向物受體之CAR-iT細胞能夠抵抗TGFβ介導之效應子功能抑制，並在TGFβ存在之情況下維持效應子功能。 [圖6A]顯示在TGFβ存在之情況下，用目標細胞進行多輪刺激後，在CAR-iT細胞中保持TGFβ重導向物受體轉殖基因之表現。[圖6B]顯示與對照CAR-iT細胞相比，用TGFβ重導向物受體轉殖基因工程改造之CAR-iT細胞在TGFβ存在之情況下表現出增強之活化特徵。 [圖7]顯示在一串列刺激檢定中，在TGFβ存在之情況下，用TGFβ重導向物受體工程改造之CAR-iT細胞之細胞介素分泌產量增加。 [圖8]顯示在一串列刺激檢定中，在TGFβ存在之情況下，用TGFβR-IL18R重導向物受體工程改造之CAR-iT細胞之擴增改善。 [圖9]顯示用TGFβR-trIL12Rβ重導向物受體工程改造之iNK細胞之表型特徵。 [圖10A]顯示在TGFβ存在之情況下，用TGFβR-trIL12Rβ重導向物受體工程改造之iNK細胞相比於dnTGFβR轉導之iNK細胞表現出穩健的持久性及擴增。[圖10B]顯示用TGFβR-trIL12Rβ重導向物受體工程改造之iNK細胞之比例增加，其具有期望之表型特徵及在TGFβ存在之情況下更活化之特徵。 [圖11A]顯示與表現dnTGFβR2之iNK細胞及親代iNK細胞相比，TGFβR2-trIL12Rβ iNK細胞表現出對目標細胞之穩健的先天殺滅能力。[圖11B]顯示與表現dnTGFβR2之iNK細胞及親代iNK細胞相比，TGFβR2-trIL12Rβ iNK細胞在用目標細胞進行三輪再刺激後表現出擴增增加。[圖11C]顯示與表現dnTGFβR2之iNK細胞及親代iNK細胞（對照）相比，具有表型及活化標記之表現TGFβR2-trIL12Rβ之iNK細胞之比例增加。 [圖12]顯示與針對相同標靶之親代iNK之細胞介素分泌相比，與MDA-MB-231細胞共培養之表現TGFβR2-trIL12Rβ之iNK所分泌之細胞介素TNF、IFNγ、及GMCSF之量化。 [圖13A]及[圖13B]顯示與表現dnTGFβR之細胞相比，在與乳癌細胞系之第一輪共培養中，用TGFβR-trIL12Rβ重導向物受體工程改造之iNK細胞表現出增強的ADCC及對TGFβ介導之抑制之抗性。 [圖14A]及[圖14B]顯示在與MDA-MB-231目標細胞之第一輪共培養後，用TGFβR-trIL12Rβ重導向物受體工程改造之iNK細胞比dnTGFβR2 iNK細胞更持久，此藉由證明在第1輪刺激結束時剩餘之效應細胞之數目（圖14A）及轉殖基因表現（圖14B）來達成。 [圖15A]及[圖15B]顯示與多個對照細胞組相比，用TGFβR-trIL12Rβ重導向物受體工程改造之iNK細胞在與目標細胞之第二輪共培養中表現出優異的抗腫瘤ADCC活性。 [圖16]顯示在TGFβ之抑制性信號傳導存在之情況下，用TGFβR-SSR工程改造之iNK細胞在各種實體癌細胞系中表現出增強的ADCC細胞裂解。 [圖17]顯示hnCD16a ⁺/CD38 ^-CAR-iT細胞在達雷木單抗存在之情況下不易於耗竭。 [圖18]顯示達雷木單抗與CAR-iT細胞之組合有效抑制同種異體反應性T及pbNK細胞擴增，因為同種異體T及NK細胞以達雷木單抗及CAR-iT二者依賴性方式被耗竭。 [圖19A]及[圖19B]顯示在達雷木單抗存在之情況下，PBMC之CD38 ⁺T及pbNK細胞隔室被選擇性地耗竭。[圖19C]及[圖19D]顯示PBMC之CD38 ⁺T及pbNK細胞以達雷木單抗依賴性方式被耗竭。 [圖20A]顯示代表性FACS圖，其描繪針對HLA-A2 ⁺PBMC量化iNK細胞之閘控示意圖，且[圖20B]顯示ADR ⁺CAR-iNK細胞證明在混合淋巴球反應(MLR)中針對經活化之同種異體PBMC攻擊具有增強的功能持久性。 [圖21A]及[圖21B]顯示ADR ⁺CAR-iNK細胞抑制同種異體反應性T及NK細胞之擴增。圖21A顯示代表性FACS圖，其描繪CD3 ⁺T及CD56 ⁺NK細胞在與所示iNK細胞共培養九天后之閘控示意圖。圖21B顯示以2:1的iNK細胞與PBMC比率與CAR-iNK ± ADR共培養之T及NK細胞計數之量化。 [圖22A]及[圖22B]顯示ADR ⁺CAR-iNK細胞選擇性地靶向CD4 ⁺及CD8 ⁺二者的同種異體反應性T細胞子集。圖22A顯示與iNK細胞共培養九天后T細胞之代表性FACS圖，並分析CD3 ⁺T細胞中CD38及4-1BB之表現，如圖2所示。圖22B顯示CAR-iNK ± ADR共培養物中供體CD4 ⁺及CD8 ⁺T細胞中CD38%及4-1BB%表現之彙編。 [圖23]顯示經工程改造以攜帶TRAC驅動之CAR及ADR轉殖基因之iPSC可成功分化為T細胞，其具有胞內CD3表現，且具有CAR及ADR之穩健共表現。 [圖24]顯示iPSC衍生之iT細胞之ADR表現提供針對致敏同種異體T細胞排斥之保護，並耗竭同種異體T細胞。 [圖25A]及[圖25B]顯示與同種異體反應性T細胞對ADR ^-對照細胞之作用相比，在宿主同種異體反應性T細胞存在之情況下，ADR ⁺效應細胞在體內表現出不妥協之腫瘤控制。 [圖26A]顯示具有所示基因工程改造之組分之效應細胞之類似細胞裂解功效。[圖26B]顯示IL7RF實質上限制CAR-iT磨損，並增強活化後效應細胞之持久性。 [圖27A]顯示SKOV3腫瘤細胞上PDL1及HER2之表面表現。[圖27B]顯示用抗PDL1或抗HER2活化hnCD16特異性增強hnCD16 ⁺CAR-iT細胞之功效。[圖27C]顯示IFNγ之表現、IL2、及CD107a之表現（脫粒標記），證明hnCD16補充並增強CAR iT細胞之基於CAR之功效。 [圖28]顯示hnCD16補充效應細胞細胞裂解及細胞介素產生。 [圖29]顯示在多輪腫瘤攻擊中，CAR-iT細胞之hnCD16及CAR共活化導致hnCD16 ⁺CAR-iT細胞實質上更大之擴增。 [圖30]顯示與具有相同HER2-CAR但沒有實體腫瘤靶向主鏈之原代CAR-T細胞相比，包含所示實體腫瘤靶向主鏈構形之效應細胞之穩健且增強之抗HER2功效。 [圖31]顯示與基於4D5之HER2-CAR相比，基於CasMab250之CAR對腫瘤相關HER2抗原之功效及選擇性在用所述實體腫瘤靶向主鏈構形工程改造之CAR-iT細胞中得以保持。 [圖32]顯示代表性流式細胞術圖，其證明淋巴樣定型(CD45 ^HighCD7 ^High)以及高且均質之CAR、hnCD16、TGFβ-SRR、及CXCR2表現。 [圖33]顯示經最佳化之CAR-iT細胞證明在多種適應症及抗原水平上具有穩健的CAR依賴性抗腫瘤功效。 [圖34]顯示經最佳化之CAR-iT細胞證明在低抗原表現腫瘤標靶之低E:T比率下CAR功能性之hnCD16互補。 [圖35]顯示在多輪腫瘤攻擊中，用hnCD16活化及治療性抗體增強經最佳化之CAR-iT細胞之CAR介導之抗腫瘤功效。 [圖36]顯示經最佳化之CAR-iT細胞證明在多輪腫瘤攻擊中經由TGFβ-SRR對TGFβ介導之效應子抑制之抗性。 [圖37]顯示藉由經最佳化之CAR-iT細胞表現CXCR2使得CXCL8特異性地向腫瘤遷移。 [圖38A]及[圖38B]顯示經最佳化之CAR-iT細胞藉由在侵襲性卵巢異種移植物模型中之CAR及CAR/hnCD16互補而證明增強的體內抗腫瘤功效。

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Claims

一種細胞或其群體，其中 (i) 該細胞係(a)免疫細胞；(b)誘導性多潛能細胞(induced pluripotent cell, iPSC)；或(c)獲自分化該iPSC之衍生性效應細胞；且 (ii) 該細胞包含實體腫瘤靶向主鏈，其包含以下中之二或更多者： (a) 編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸； (b) 編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸。
如請求項1之細胞或其群體，其中與不具有該實體腫瘤靶向主鏈之對應細胞相比，該細胞在實體腫瘤中具有改善之運輸、腫瘤微環境(TME)抗性、及/或同種異體反應性抗性。
如請求項1之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含： (i) CD38剔除； (ii) 編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及 (iii) 編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該細胞介素信號傳導錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽。
如請求項1之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含以下中之一或多者： (i) 嵌合抗原受體(CAR)； (ii) HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏； (iii) 引入HLA-G或不可分割之HLA-G； (iv) 破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之至少一者； (v) 引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者；或 (vi) 表4中所列基因型中之至少一者。
如請求項1之細胞或其群體，其中該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。
如請求項1之細胞或其群體，其中該TGFβ-SRR進一步包含細胞介素受體之胞內域(ICD)之部分或完整肽，該細胞介素受體包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合。
如請求項6之細胞或其群體，其中： (a) 該細胞介素受體係IL2Rβ，從而形成TGFβR2-IL2Rβ重導向物受體，且IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列；或 (b) 該細胞介素受體係IL12Rβ，從而形成TGFβR2-IL12Rβ重導向物受體，且IL12Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列；或 (c) 該細胞介素受體係IL18Rβ，從而形成TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體，且IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列；或 (d) 該細胞介素受體係IL21R，從而形成TGFβR2-IL21R重導向物受體，且IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列；或 (e) TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列。
如請求項6之細胞或其群體，其中該細胞介素受體係IL2Rβ之片段，形成TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，該重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列，其中包含在SEQ ID NO: 16中之由SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列係可變的。
如請求項1之細胞或其群體，其中該ADR係對4-1BB或對CD38特異。
如請求項1之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸插入內源性CD38基因座以剔除CD38。
如請求項3之細胞或其群體，其中編碼該外源性CD16或其變體之該多核苷酸及該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸在三順反子(tri-cistronic)構築體中共表現。
如請求項3之細胞或其群體，其中該外源性CD16或其變體包含以下中之至少一者： (a) 高親和力不可切割之CD16 (hnCD16)； (b) CD16胞外域中之F176V及S197P； (c) 源自CD64之完整或部分胞外域； (d) 非天然（或非CD16）跨膜域； (e) 非天然（或非CD16）胞內域； (f) 非天然（或非CD16）信號傳導域； (g) 非天然刺激域；及 (h) 並非源自CD16，而是源自相同或不同多肽之跨膜域、信號傳導域、及刺激域。
如請求項3之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含細胞介素信號傳導錯合物，該細胞介素信號傳導錯合物包含： (a) 表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽，其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、或其各別受體中之至少一者；或 (b) 以下中之至少一者： (i) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現； (ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白； (iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短； (iv) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白； (v) IL15及IL15Rβ之融合蛋白； (vi) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (vii) IL15Rβ之同二聚體；其中(b) (i)至(vii)中之任一者可以在單獨構築體或雙順反子(bi-cistronic)構築體中與CAR共表現；或 (c) 以下中之至少一者： (i) IL7及IL7Rα之融合蛋白； (ii) IL7及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (iii) IL7Rβ之同二聚體，其中(c) (i)至(iii)中之任一者可選地在單獨構築體中或在雙順反子表現匣(expression cassette)中與CAR共表現；及可選地， (d) 暫時表現。
如請求項4之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含CAR，其中該CAR係： (i) T細胞特異性的或NK細胞特異性的； (ii) 雙特異性抗原結合CAR； (iii) 可切換CAR； (iv) 二聚CAR； (v) 分離CAR； (vi) 多鏈CAR； (vii) 可誘導性CAR； (viii) 與另一CAR共表現； (ix) 在雙順反子構築體中與該細胞介素信號傳導錯合物共表現； (x) 可選地在單獨構築體或雙順反子構築體中與檢查點抑制劑共表現； (xi) 對至少一種腫瘤相關抗原特異，其包含CD19、B7H3、BCMA、CD20、CD22、CD38、CD123、CD79b、CD52、EGFR、EGP2/EpCAM、GD2、GPRC5D、HER2、KLK2、MICA/B、MSLN、VEGF-R2、PSMA、及PDL1；及/或 (xii) 對至少一種腫瘤相關抗原特異，其包含ADGRE2、碳酸酐酶IX (CAIX)、CCR1、CCR4、癌胚抗原(CEA)、CD3、CD5、CD7、CD8、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD44V6、CD49f、CD56、CD70、CD74、CD99、CD123、CD133、CD138、CDS、CLEC12A、巨細胞病毒(CMV)感染細胞之抗原、上皮醣蛋白-2 (EGP-2)、上皮醣蛋白-40 (EGP-40)、上皮細胞黏著分子(EpCAM)、EGFRvIII、受體酪胺酸-蛋白激酶erb- B2,3,4、EGFIR、EGFR-VIII、ERBB葉酸結合蛋白(FBP)、胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)、葉酸受體-α、神經節苷脂G2 (GD2)、神經節苷脂G3 (GD3)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)、ICAM-1、整合素B7、介白素-13受體次單元α-2 (IL-13Rα2)、κ輕鏈、激酶插入域受體(KDR)、路易士A (CA19.9)、路易士Y (LeY)、L1細胞黏著分子(L1-CAM)、LILRB2、黑色素瘤抗原家族A 1 (MAGE-A1)、MICA/B、黏蛋白1 (Muc-1)、黏蛋白16 (Muc-16)、間皮素(MSLN)、NKCSI、NKG2D配體、c-Met、癌-睾丸抗原NY-ESO-1、癌胚胎抗原(h5T4)、PRAME、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、PRAME前列腺特異性膜抗原(PSMA)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG-72)、TIM-3、TRBCI、TRBC2、血管內皮生長因子R2 (VEGF-R2)、Wilms腫瘤蛋白(WT-1)、及病原體抗原；及可選地，其中(i)至(xii)中任一者之該CAR被插入在TCR基因座處，且/或藉由該TCR之內源性啟動子而驅動，且/或該TCR藉由CAR插入而被剔除。
如請求項14之細胞或其群體，其中該TCR基因座係TCRα及/或TCRβ之恆定區，且可選地，其中該CAR可操作地連接至TCR之內源性啟動子。
如請求項14之細胞或其群體，其中該CAR包含： (a) 包含對腫瘤相關抗原特異之抗原結合域之胞外域； (b) 跨膜域；及 (c) 包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與該腫瘤相關抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。
如請求項16之細胞或其群體，其中該至少一個信號傳導域包含： (a) 以下中之任一者：2B4（自然殺手細胞受體2B4）、4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）、CD28（T細胞特異性表面醣蛋白CD28）、CD3ζ（T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈）、DAP10（造血細胞信號轉換器）、DAP12（TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白）、DNAM1（CD226抗原）、FcERIγ（高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ）、IL21R（介白素-21受體）、IL2Rβ/IL15Rβ（介白素-2受體次單元β）、IL2Rγ（細胞介素受體共同次單元γ）、IL-7R（介白素-7受體次單元α）、KIR2DS2（殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2）、NKG2D（NKG2-D II型整合膜蛋白）、NKp30（天然細胞毒性觸發受體3）、NKp44（天然細胞毒性觸發受體2）、NKp46（天然細胞毒性觸發受體1）、CS1（SLAM家族成員7）、及CD8（T細胞表面醣蛋白CD8α鏈）； (b) 與分別由SEQ ID NO: 54至76所示之2B4、41BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL2Rγ、IL7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD3ζ1XX、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列；及/或 (c) 與2B4、CD28、CD3ζ、DAP10、NKG2D、CD3ζ、CD3ζ1XX、DNAM1、CS1、或其組合之細胞質域或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項16之細胞或其群體，其中該胞內域包含兩個不同的信號傳導域，且其中該胞內域包含以下形式中任一者之融合細胞質域或其部分：CD28-CD3ζ、CD28-CD3ζ1XX、41BB-CD3ζ、41BB-CD3ζ1XX、2B4-CD3ζ、及2B4-CD3ζ1XX。
如請求項16之細胞或其群體，其中該跨膜域包含與CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1、或T細胞受體多肽之跨膜區或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項16之細胞或其群體，其中該跨膜域包含與分別由SEQ ID NO: 32至53所示之2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之跨膜區或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項16之細胞或其群體，其中該跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質或不同蛋白質。
如請求項16之細胞或其群體，其中該腫瘤相關抗原包含HER2，且其中該CAR包含： (a) 包含辨識HER2（人類表皮生長因子受體2）抗原之抗原結合域之胞外域，其中該抗原結合域包含： (i) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地， (ii) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)； (b) 跨膜域；及 (c) 包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。
如請求項22之細胞或其群體，其中該CAR之該抗原結合域： (a) 包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域； (b) 包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域； (c) 包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111至114具有至少80%序列同一性； (d) 包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；及/或 (e) 係人源化的。
如請求項22之細胞或其群體，其中該胞外域包含以下中之一或多者： (a) 信號肽；及/或 (b) 間隔子/鉸鏈。
如請求項24之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含： (a) IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、CH3間隔子、CH2/CH3間隔子、或其任何組合； (b) 約10至約80個胺基酸之短間隔子；大於80至約180個胺基酸之中等間隔子；或大於180個胺基酸之長間隔子；及/或 (c) 與SEQ ID NO: 96至100中之任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項25之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含中等間隔子，其中該間隔子包含與SEQ ID NO: 99具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項25之細胞或其群體，其中該CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項22之細胞或其群體，其中該癌細胞為乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、唾液腺癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、或頭頸癌細胞。
如請求項1之細胞或其群體，其中(i)該iPSC係無性繁殖iPSC、單細胞解離iPSC、iPSC細胞系細胞、或iPSC主細胞庫(MCB)細胞；或(ii)該衍生性細胞包含衍生性CD34 ⁺細胞、衍生性造血幹細胞及前驅細胞、衍生性造血多潛能前驅細胞、衍生性T細胞前驅細胞、衍生性NK細胞前驅細胞、衍生性T譜系細胞、衍生NKT譜系細胞、衍生性NK譜系細胞、或衍生性B譜系細胞；或(iii)該衍生性細胞包含衍生性效應細胞，其具有在對應之原代T細胞、NK細胞、NKT細胞、及/或B細胞中不存在之一或多種功能特徵。
如請求項29之細胞或其群體，其中與自周邊血液、臍帶血、或沒有相同基因編輯之任何其他供體組織獲得之對應原代細胞相比，該衍生性細胞具有包含以下中之一或多者的治療性質： (i) 細胞毒性增加； (ii) 持久性及/或存活率改善； (iii) 遷移及/或活化或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力增強； (iv) 腫瘤浸潤改善； (v) 降低腫瘤免疫抑制之能力增強； (vi) 挽救腫瘤抗原逃逸之能力改善； (vii) 細胞凋亡得以控制； (viii) 增強或獲得ADCC；及 (ix) 避免誤殺之能力。
如請求項29之細胞或其群體，其中該細胞係NK譜系細胞或T譜系細胞，其中： (i) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞在腫瘤位點處具有改善之浸潤及/或滯留； (ii) 該NK譜系細胞能夠募集及/或遷移T細胞至腫瘤位點；或 (iii) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞能夠在一或多種檢查點抑制劑存在之情況下降低腫瘤免疫抑制。
一種細胞或其群體，其中 (i) 該細胞係(a)免疫細胞；(b)誘導性多潛能細胞(induced pluripotent cell, iPSC)；或(c)獲自分化該iPSC之衍生性效應細胞； (ii) 該細胞包含嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a) 包含辨識HER2（人類表皮生長因子受體2）抗原之抗原結合域之胞外域，其中該抗原結合域包含： (1) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及 (2) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)； (b) 跨膜域；及 (c) 包含至少一個信號傳導域之胞內域；其中該至少一個信號傳導域對該CAR與癌細胞上表現之HER2抗原之結合產生特異性反應，從而產生癌症抗原特異性反應。
如請求項32之細胞或其群體，其中該抗原結合域： (a) 包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域； (b) 包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域； (c) 包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111至114具有至少80%序列同一性； (d) 包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；及/或 (e) 係人源化的。
如請求項32之細胞或其群體，其中該至少一個信號傳導域包含： (a) 下列中之任一者：2B4（自然殺手細胞受體2B4）、4-1BB（腫瘤壞死因子受體超家族成員9）、CD16（IgG Fc區受體III-A）、CD2（T細胞表面抗原CD2）、CD28（T細胞特異性表面醣蛋白CD28）、CD28H（含跨膜及免疫球蛋白域之蛋白2）、CD3ζ（T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈）、DAP10（造血細胞信號轉導子）、DAP12（TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白）、DNAM1（CD226抗原）、FcERIγ（高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ）、IL21R（介白素-21受體）、IL-2Rβ/IL15Rβ（介白素-2受體次單元β）、IL-2Rγ（細胞介素受體共同次單元γ）、IL-7R（介白素-7受體次單元α）、KIR2DS2（殺手細胞免疫球蛋白樣受體2DS2）、NKG2D（NKG2-D II型整合膜蛋白）、NKp30（天然細胞毒性觸發受體3）、NKp44（天然細胞毒性觸發受體2）、NKp46（天然細胞毒性觸發受體1）、CS1（SLAM家族成員7）、及CD8（T細胞表面醣蛋白CD8α鏈）； (b) 與分別由SEQ ID NO: 54至76所示之2B4、4-1BB、CD16、CD2、CD28、CD28H、CD3ζ、CD3ζ1XX、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、IL21R、IL2Rβ (IL15Rβ)、IL2Rγ、IL7R、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8之細胞質域或其一部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列；及/或 (c) 與2B4、CD28、CD3ζ、DAP10、NKG2D、CD3ζ1XX、DNAM1、CS1、或其組合之細胞質域或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項34之細胞或其群體，其中該胞內域包含兩個不同信號傳導域，且其中該胞內域域包含以下形式中之任一者的融合細胞質域或其部分：2B4-CD3ζ/1XX、2B4-DNAM1、2B4-FcERIγ、2B4-DAP10、CD16-DNAM1、CD16-DAP10、CD16-DAP12、CD2-CD3ζ/1XX、CD2-DNAM1、CD2-FcERIγ、CD2-DAP10、CD28-DNAM1、CD28-FcERIγ、CD28-DAP10、CD28-DAP12、CD28-CD3ζ/1XX、CD28H-CD3ζ/1XX、DAP10-CD3ζ/1XX、DAP10-DAP12、DAP12-CD3ζ/1XX、DAP12-DAP10、DNAM1-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-CD3ζ/1XX、KIR2DS2-DAP10、KIR2DS2-2B4、或NKp46-2B4。
如請求項32之細胞或其群體，其中該跨膜域包含與以下各項之跨膜區或其部分具有至少約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列： (a) CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD8、CD8a、CD8b、CD16、CD27、CD28、CD28H、CD40、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA4、PD1、LAG3、2B4、BTLA、DNAM1、DAP10、DAP12、FcERIγ、IL7、IL12、IL15、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2C、NKG2D、CS1或T細胞受體多肽； (b) 2B4、CD2、CD16、CD28、CD28H、CD3ζ、DAP10、DAP12、DNAM1、FcERIγ、KIR2DS2、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CS1、或CD8；或 (c) 2B4、CD28、CD28H、DAP10、DNAM1、KIR2DS2、及NKG2D。
如請求項32之細胞或其群體，其中該跨膜域及其緊接之信號傳導域係來自相同蛋白質或不同蛋白質。
如請求項32之細胞或其群體，其中該胞外域包含以下中之一或多者： (a) 信號肽；及/或 (b) 間隔子/鉸鏈。
如請求項38之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含： (a) IgG4間隔子、CD28間隔子、CD8間隔子、CH3間隔子、CH2/CH3間隔子、或其任何組合； (b) 約10至約80個胺基酸之短間隔子；大於80至約180個胺基酸之中等間隔子；或大於180個胺基酸之長間隔子；及/或 (c) 與SEQ ID NO: 96至100中任一者具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項39之細胞或其群體，其中該間隔子/鉸鏈包含中等間隔子，其中該間隔子包含與SEQ ID NO: 99具有至少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項32之細胞或其群體，其中該CAR包含與SEQ ID NO: 117具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%同一性之胺基酸序列。
如請求項32之細胞或其群體，其進一步包含實體腫瘤靶向主鏈，該實體腫瘤靶向主鏈包含以下中之至少一者： (a) 編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸； (b) 編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸。
如請求項42之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈進一步包含： (i) CD38剔除； (ii) 編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及 (iii) 編碼細胞介素信號傳導錯合物之多核苷酸，該細胞介素信號傳導錯合物包含表現細胞表面之外源性細胞介素及/或其受體之部分或完整肽，
如請求項32之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含以下中之一或多者： (i) HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏； (ii) 引入HLA-G或不可分割之HLA-G； (iii) 破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之至少一者； (iv) 引入HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者；或 (v) 表4中所列基因型中之至少一者。
如請求項42之細胞或其群體，其中該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3。
如請求項42之細胞或其群體，其中該TGFβ-SRR進一步包含細胞介素受體之胞內域(ICD)之部分或完整肽，該細胞介素受體包含IL2R、IL12R、IL18R、IL21R、或其任何組合。
如請求項46之細胞或其群體，其中： (a) 該細胞介素受體係IL2Rβ，從而形成TGFβR2-IL2Rβ重導向物受體，且IL2Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 11所示之胺基酸序列；或 (b) 該細胞介素受體係IL12Rβ，從而形成TGFβR2-IL12Rβ重導向物受體，且IL12Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列；或 (c) 該細胞介素受體係IL18Rβ，從而形成TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體，且IL18Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列；或 (d) 該細胞介素受體係IL21R，從而形成TGFβR2-IL21R重導向物受體，且IL21Rβ之胞內域(ICD)包含SEQ ID NO: 15所示之胺基酸序列；或 (e) TGFβR之胞外域(ECD)包含SEQ ID NO: 10所示之胺基酸序列。
如請求項46之細胞或其群體，其中該細胞介素受體係IL2Rβ之片段，形成TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，該重導向物受體包含與SEQ ID NO: 16所示之序列具有至少80%、85%、90%、95%、或97%、98%、或99%序列同一性之胺基酸序列，其中包含在SEQ ID NO: 16中之由SEQ ID NO: 17所示之胺基酸序列係可變的。
如請求項42之細胞或其群體，其中該ADR係對4-1BB或對CD38特異。
如請求項42之細胞或其群體，其中該實體腫瘤靶向主鏈之一或多個多核苷酸插入內源性CD38基因座以剔除CD38。
如請求項43之細胞或其群體，其中編碼該外源性CD16或其變體之該多核苷酸及該實體腫瘤靶向主鏈之二或更多個多核苷酸在三順反子(tri-cistronic)構築體中共表現。
如請求項43之細胞或其群體，其中該外源性CD16或其變體包含以下中之至少一者： (a) 高親和力不可切割之CD16 (hnCD16)； (b) CD16胞外域中之F176V及S197P； (c) 源自CD64之完整或部分胞外域； (d) 非天然（或非CD16）跨膜域； (e) 非天然（或非CD16）胞內域； (f) 非天然（或非CD16）信號傳導域； (g) 非天然刺激域；及 (h) 並非源自CD16，而是源自相同或不同多肽之跨膜域、信號傳導域、及刺激域。
如請求項43之細胞或其群體，其中該細胞進一步包含細胞介素信號傳導錯合物，該細胞介素信號傳導錯合物包含： (a) 表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽，其包含IL2、IL4、IL6、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12、IL15、IL18、IL21、或其各別受體中之至少一者；或 (b) 以下中之至少一者： (i) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現； (ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白； (iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短； (iv) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白； (v) IL15及IL15Rβ之融合蛋白； (vi) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (vii) IL15Rβ之同二聚體；或 (c) 以下中之至少一者： (i) IL7及IL7Rα之融合蛋白； (ii) IL7及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (iii) IL7Rβ之同二聚體；及可選地， (d) 暫時表現。
如請求項32之細胞或其群體，其中： (i) 該CAR在雙順反子構築體中與細胞介素信號傳導錯合物共表現；及/或 (ii) 其中該CAR被插入TCR基因座處，並且可選地可操作地連接至該TCR之內源性啟動子。
如請求項54之細胞或其群體，其中： (i) 該TCR基因座係TCRα及/或TCRβ之恆定區；及/或 (ii) 該TCR藉由CAR插入而被剔除。
如請求項32之細胞或其群體，其中該癌細胞為乳癌細胞、卵巢癌細胞、子宮內膜癌細胞、肺癌細胞、食道癌細胞、唾液腺癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、結腸直腸癌細胞、或頭頸癌細胞。
如請求項32之細胞或其群體，其中(i)該iPSC係無性繁殖iPSC、單細胞解離iPSC、iPSC細胞系細胞、或iPSC主細胞庫(MCB)細胞；或(ii)該衍生性細胞包含衍生性CD34 ⁺細胞、衍生性造血幹細胞及前驅細胞、衍生性造血多潛能前驅細胞、衍生性T細胞前驅細胞、衍生性NK細胞前驅細胞、衍生性T譜系細胞、衍生NKT譜系細胞、衍生性NK譜系細胞、或衍生性B譜系細胞；或(iii)該衍生性細胞包含衍生性效應細胞，其具有在對應之原代T細胞、NK細胞、NKT細胞、及/或B細胞中不存在之一或多種功能特徵。
如請求項42之細胞或其群體，其中與自周邊血液、臍帶血、或沒有相同基因編輯之任何其他供體組織獲得之對應原代細胞相比，該細胞具有包含以下中之一或多者的治療性質： (i) 細胞毒性增加； (ii) 持久性及/或存活率改善； (iii) 遷移及/或活化或募集旁觀者免疫細胞至腫瘤位點之能力增強； (iv) 腫瘤浸潤改善； (v) 降低腫瘤免疫抑制之能力增強； (vi) 挽救腫瘤抗原逃逸之能力改善； (vii) 細胞凋亡得以控制； (viii) 增強或獲得ADCC；及 (ix) 避免誤殺之能力。
如請求項58之細胞或其群體，其中該細胞係NK譜系細胞或T譜系細胞，其中： (i) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞在腫瘤位點處具有改善之浸潤及/或滯留； (ii) 該NK譜系細胞能夠募集及/或遷移T細胞至腫瘤位點；或 (iii) 該NK譜系細胞或該T譜系細胞能夠在一或多種檢查點抑制劑存在之情況下降低腫瘤免疫抑制。
一種組成物，其包含如請求項1至59中任一項之細胞或其群體。
如請求項60之組成物，其進一步包含一或多種治療劑。
如請求項61之組成物，其中該一或多種治療劑包含肽、細胞介素、檢查點抑制劑、有絲分裂促進劑(mitogen)、生長因子、小RNA、dsRNA（雙股RNA）、單核血球、餵養細胞、餵養細胞組分或其替代因子、包含一或多種關注之多核苷酸之載體、抗體、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)。
如請求項62之組成物，其中該檢查點抑制劑包含： (a) 檢查點分子之一或多種拮抗劑，其包含PD-1、PDL-1、TIM-3、TIGIT、LAG-3、CTLA-4、2B4、4-1BB、4-1BBL、A _2AR、BATE、BTLA、CD39、CD47、CD73、CD94、CD96、CD160、CD200、CD200R、CD274、CEACAM1、CSF-1R、Foxp1、GARP、HVEM、IDO、EDO、TDO、LAIR-1、MICA/B、NR4A2、MAFB、OCT-2、Rara（視黃酸受體α）、TLR3、VISTA、NKG2A/HLA-E、或抑制性KIR； (b) 阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗(lirimumab)、莫那利珠單抗(monalizumab)、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、及其衍生物或功能等效物中之一或多者；或 (c) 阿特珠單抗、納武單抗、及派姆單抗中之至少一者。
如請求項62之組成物，其中該抗體包含： (a) 抗CD20抗體、抗HER2抗體、抗CD52抗體、抗EGFR抗體、抗CD123抗體、抗GD2抗體、抗PDL1抗體、或抗CD38抗體；或 (b) 利妥昔單抗(rituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、地妥昔單抗(dinutuximab)、阿維魯單抗(avelumab)、達利珠單抗(daclizumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、M-A251、2A3、BC69、24204、22722、24212、MAB23591、FN50、298614、AF2359、CY1G4、DF1513、比伐珠單抗(bivatuzumab)、RG7356、G44-26、7G3、CSL362、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)、艾薩妥昔單抗(isatuximab)、MOR202、及其人源化或Fc修飾之變體或片段以及其功能等效物、及其生物相似藥中之一或多者。
如請求項62之組成物，其中該接合物包含： (i) 雙特異性T細胞接合物(BiTE)； (ii) 雙特異性殺手細胞接合物(BiKE)；或 (iii) 三特異性殺手細胞接合物(TriKE)；或其中該接合物包含： (a) 辨識細胞或旁觀者免疫效應細胞之CD3、CD28、CD5、CD16、CD64、CD32、CD33、CD89、NKG2C、NKG2D、或其任何功能變體之胞外部分之第一結合域；及 (b) 對抗原特異之第二結合域，該抗原包含以下中之任一者：B7H3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD44、CD52、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD179b、CEA、CLEC12A、CS-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT-3、FOLR1、FOLR3、GD2、gpA33、HER2、HM1.24、LGR5、MSLN、MCSP、MICA/B、Muc1、Muc16、PDL1、PSMA、PAMA、P-鈣黏蛋白、ROR1、或VEGF-R2。
一種如請求項60至65中任一項之組成物之治療用途，其藉由將該組成物引入至需要過繼細胞療法之對象來進行，其中該對象患有自體免疫疾病、血液惡性腫瘤、實體腫瘤、癌症、或病毒感染。
一種主細胞庫(MCB)，其包含如請求項1至59中任一項之iPSC。
一種製造如請求項1至31中任一項之衍生性細胞之方法，其中該衍生性細胞係免疫效應細胞，且該方法包含： (i) 獲得經基因工程改造之iPSC，其中該iPSC包含實體腫瘤靶向主鏈，其包含以下中之二或更多者： (a) 編碼C-X-C模體趨化因子受體或其變體之多核苷酸； (b) 編碼包含轉化生長因子β受體(TGFβR)之胞外域(ECD)之部分或完整肽之TGFβ信號傳導重導向物受體(TGFβ-SRR)之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸； (ii) 將該經基因工程改造之iPSC分化為衍生性CD34 ⁺細胞；及 (iii) 將該衍生性CD34 ⁺細胞分化為免疫效應細胞，其中該免疫效應細胞保留該實體腫瘤靶向主鏈。
如請求項68之方法，其中獲得包含該實體腫瘤靶向主鏈之該經基因工程改造之iPSC包含整合二或更多個多核苷酸以在內源性CD38基因座處共表現並剔除CD38；其中用於共表現之該二或更多個多核苷酸係在順反子構築體中；且其中該等多核苷酸編碼以下中之至少兩者： (i) C-X-C模體趨化因子受體； (ii) TGFβ-SRR；及 (iii) 異體免疫防禦受體(ADR)。
如請求項69之方法，其中 (i) 該順反子構築體進一步包含編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸； (ii) 該C-X-C模體趨化因子受體包含CXCR2或CXCR3； (iii) 該TGFβ-SRR包含TGFβR2-IL2Rβ、TGFβR2-IL12Rβ、TGFβR2-IL18Rβ、或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體，或 (iv) 該ADR係對4-1BB或對CD38特異。
如請求項68之方法，其進一步包含藉由在TCR基因座處整合編碼嵌合抗原受體(CAR)之多核苷酸來對包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC進行基因工程改造，可選地其中(i)該CAR可操作地連接至該TCR之內源性啟動子，及/或(ii)該TCR藉由CAR插入而被剔除。
如請求項71之方法，其中該CAR在雙順反子構築體中與細胞介素信號傳導錯合物共表現；或其中該TCR基因座係TCRα或TCRβ之恆定區。
如請求項72之方法，其中該細胞介素信號傳導錯合物包含以下中之至少一者： (i) IL7及IL7Rα之融合蛋白； (ii) IL15及IL15Rα之融合蛋白；及 (iii) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短。
如請求項71之方法，其中該CAR係： (i) 對腫瘤相關抗原特異； (ii) 對實體腫瘤相關抗原特異； (iii) 對泛腫瘤抗原特異；或 (iv) 對B7H3、BCMA、CD19、CD38、CD79b、EGP2/EpCAM、GPRC5D、HER2、KLK2、MICA/B、及MR1中之一者特異。
如請求項71之方法，其中對癌細胞上表現之HER2抗原特異之該CAR包含抗原結合域，該抗原結合域包含： (i) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地 (ii) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)。
如請求項75之方法，其中該CAR之該抗原結合域： (a) 包含與SEQ ID NO: 109具有至少80%序列同一性之VH域； (b) 包含與SEQ ID NO: 110具有至少80%序列同一性之VL域； (c) 包含單鏈可變片段(scFV)，其包含VH-連接子-VL或VL-連接子-VH，其中該連接子在長度及序列上有所變化，且可選地其中該連接子與SEQ ID NO: 111至114具有至少80%序列同一性； (d) 包含由與SEQ ID NO: 115或SEQ ID NO: 116具有至少約99%、約98%、約96%、約95%、約90%、約85%、或約80%同一性之胺基酸序列所示之scFV，其中SEQ ID NO: 115及SEQ ID NO: 116之各者包含在長度及序列上有所變化之連接子；及/或 (e) 係人源化的。
如請求項69之方法，其進一步包含藉由以下中之一或多者對包含實體腫瘤靶向主鏈之該iPSC進行基因工程改造： (a) 引入HLA-I缺乏及/或HLA-II缺乏； (b) 缺失或破壞B2M、CIITA、TAP1、TAP2、Tapasin、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP、TCR、NKG2A、NKG2D、CD25、CD44、CD54、CD56、CD58、CD69、CIS、CBL-B、SOCS2、PD1、CTLA4、LAG3、TIM3、及TIGIT中之一或多者；及 (c) 引入HLA-G、HLA-E、4-1BBL、CD3、CD4、CD8、CD16、CD47、CD113、CD131、CD137、CD80、PDL1、A _2AR、抗原特異性TCR、嵌合融合受體(CFR)、Fc受體、抗體或其功能變體或片段、檢查點抑制劑、接合物、及用於與促效劑偶合之表面觸發受體中之至少一者。
如請求項68至77中任一項之方法，其中該基因工程改造包含靶向編輯。
如請求項78之方法，其中該靶向編輯藉由CRISPR、ZFN、TALEN、歸巢核酸酶(homing nuclease)、同源重組、或此等方法之任何其他功能變型來進行。
一種治療需要過繼細胞療法之對象之方法，其中該方法包含向該對象輸注效應細胞，其中該等效應細胞包含如請求項1至59中任一項之衍生性細胞或其群體。
如請求項80之方法，其中該等效應細胞包含對癌細胞上表現之HER2抗原特異之CAR，其中該CAR包含： (i) 重鏈可變(VH)域，其包含：包含SEQ ID NO: 103之重鏈互補決定區1 (H-CDR1)、包含SEQ ID NO: 104之重鏈互補決定區2 (H-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 105之重鏈互補決定區3 (H-CDR3)；及可選地 (ii) 輕鏈可變(VL)域，其包含：包含SEQ ID NO: 106之輕鏈互補決定區1 (L-CDR1)、包含SEQ ID NO: 107之輕鏈互補決定區2 (L-CDR2)、及包含SEQ ID NO: 108之輕鏈互補決定區3 (L-CDR3)；其中該CAR位於TRAC基因座處，並且CAR表現藉由內源性TCR啟動子來驅動；且其中需要過繼細胞治療之該對象患有乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、食道癌、唾液腺癌、膀胱癌、胃癌、結腸直腸癌、或頭頸癌。
如請求項81之方法，其中該等效應細胞進一步包含實體腫瘤靶向主鏈，且其中該等效應細胞包含： (i) 在CD38基因座處，以下中之二或更多者： (a) 編碼CXCR2之多核苷酸； (b) 編碼TGFβR2-IL18Rβ重導向物受體或TGFβR2-trIL12Rβ重導向物受體之多核苷酸；及 (c) 編碼異體免疫防禦受體(ADR)之多核苷酸； (ii) 在CD38基因座處，編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸； (iii) 在TRAC基因座處，編碼IL7及IL7Rα之融合蛋白之多核苷酸；及 (iv) CD38剔除及TCR剔除。
如請求項80之方法，其進一步包含向該對象投予一或多種治療劑，其中該一或多種治療劑包含： (i) 細胞介素、抗體、接合物、檢查點抑制劑、化學治療劑或放射性部分、或免疫調節藥物(IMiD)； (ii) 包含達雷木單抗(daratumumab)、艾薩妥昔單抗(isatuximab)、或MOR202之抗CD38抗體； (iii) 包含BiTE（雙特異性T細胞接合物）或TriKE（三特異性殺手細胞接合物）之接合物； (iv) 包含阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、IPH4102、IPH43、IPH33、利瑞魯單抗(lirimumab)、莫那利珠單抗(monalizumab)、納武單抗(nivolumab)、或派姆單抗(pembrolizumab)之檢查點抑制劑；及/或 (v) 包含環磷醯胺及氟達拉濱(fludarabine)之化學治療劑(Cy/Flu)。
如請求項80之方法，其中該等效應細胞包含CD38剔除及TCR剔除，以及可選地ADR，其中該方法包含向該對象投予抗CD38抗體，且其中該方法不需要或需要最少的淋巴球清除，其包含向該對象投予Cy/Flu。
如請求項80之方法，其中該等效應細胞係同種異體的(allogeneic)，且其中向該對象輸注效應細胞係在門診環境中進行。
一種在治療患有實體腫瘤之對象中改善過繼細胞療法之方法，該方法包含投予如請求項1至31中任一項之衍生性細胞群體。
一種改善抗HER2單株抗體(mAb)治療之方法，其包含：向需要該治療之對象引入包含效應細胞之組成物，該等效應細胞包含編碼CasMab250-CAR之多核苷酸、編碼CXCR2之多核苷酸、編碼TGFβ-SRR之多核苷酸、及編碼外源性CD16或其變體之多核苷酸；及向該對象引入抗HER2 mAb。
如請求項87之方法，其中該抗HER2 mAb係曲妥珠單抗(trastuzumab)。
一種選擇包含關注之轉殖基因之經工程改造之NK細胞之方法，其中該方法包含： (i) 獲得經工程改造之NK細胞，該等細胞包含共表現該關注之轉殖基因及表現細胞表面之外源性細胞介素或其受體之部分或完整肽之構築體，該細胞介素或其受體包含IL15或其各別受體中之至少一者；或(1)至(7)中之至少一者： (1) IL15及IL15Rα與其間之自切割肽的共表現； (2) IL15及IL15Rα之融合蛋白； (3) IL15/IL15Rα融合蛋白，其中IL15Rα之胞內域被截短； (4) IL15及IL15Rα之膜結合Sushi域之融合蛋白； (5) IL15及IL15Rβ之融合蛋白； (6) IL15及共同受體γC之融合蛋白，其中該共同受體γC係天然的或經修飾的；及 (7) IL15Rβ之同二聚體； (ii) 在不向該等細胞提供外源性IL15細胞介素之情況下培養該等經工程改造之NK細胞；及 (iii) 收集在沒有該外源性IL15細胞介素之情況下擴增之NK細胞，從而選擇包含該關注之轉殖基因之經工程改造之NK細胞。