KR20180083874A - Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체 Download PDF

Info

Publication number
KR20180083874A
KR20180083874A KR1020187015769A KR20187015769A KR20180083874A KR 20180083874 A KR20180083874 A KR 20180083874A KR 1020187015769 A KR1020187015769 A KR 1020187015769A KR 20187015769 A KR20187015769 A KR 20187015769A KR 20180083874 A KR20180083874 A KR 20180083874A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gly
leu
ser
pro
thr
Prior art date
Application number
KR1020187015769A
Other languages
English (en)
Inventor
사울 제이. 프라이스맨
스티븐 제이. 포먼
크리스틴 이. 브라운
Original Assignee
사울 제이. 프라이스맨
크리스틴 이. 브라운
스티븐 제이. 포먼
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사울 제이. 프라이스맨, 크리스틴 이. 브라운, 스티븐 제이. 포먼 filed Critical 사울 제이. 프라이스맨
Publication of KR20180083874A publication Critical patent/KR20180083874A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/812—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/17—Hinge-spacer domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/21—Transmembrane domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/22—Intracellular domain
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/47—Brain; Nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

HER2에 대해 표적화된 세포외 도메인, 막횡단 영역, 공동자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 막횡단 면역수용체 (CAR)가 기재된다.

Description

HER2를 표적화하는 키메라 항원 수용체
조작된 T 세포를 사용하는 요법을 포함한 종양-특이적 T 세포 기반 면역요법은 항종양 치료를 위해 조사되어 왔다. 일부 경우에, 이러한 요법에서 사용되는 T 세포는 생체내에서 충분히 긴 기간 동안 활성으로 유지되지 못한다. 일부 경우에, T 세포의 종양-특이성은, 부분적으로 고형 종양의 이종 속성 및 자기 항원을 표적화하는 경우 비-암성 세포에 대한 오프-타겟 효과에 대한 잠재력으로 인해, 상대적으로 낮다. 따라서, 개선된 항종양 특이성 및 기능을 갖는 종양-특이적 암 요법에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)는 세포외 종양 인식/표적화 도메인, 세포외 링커/스페이서, 막횡단 도메인, 및 세포내 T 세포-활성화 및 공동-자극 신호전달 도메인으로 구성된다. 인식/표적화 도메인의 설계는 유해한 오프-타겟 효과를 피하는 것이 중요하다. 대부분의 CAR 종양 표적화 도메인은 특정한 항원에 결합하는 항체의 특이성을 이용한, 항체 서열로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. IL-13 수용체, IL13Rα2를 발현하는 세포를 표적화하는 통상의 수용체 리간드, 예컨대 IL-13 시토카인 CAR로부터 유래된 CAR 종양 표적화 도메인의 예가 또한 존재한다.
CAR을 발현하는 조작된 T 세포를 사용하는 입양 T 세포 요법 (ACT)은 CD 19+ B-세포 악성종양을 갖는 환자에서 강건하고 지속적인 임상 효능을 입증한 바 있다 (Priceman et al. 2015 Curr Opin Oncol; Maus et al. 2014 Blood 123: 2625- 2635). 혈액 질환에서의 조기 성공에 따라, 이러한 접근법의 고형 종양으로의 보다 광범위한 적용이 현재 집중적으로 조사되고 있다.
국립 암 연구소 감시, 역학 및 최종 결과 프로그램 (SEER) 데이터에 따르면, 2014년 유방암으로 인한 사망이 40,000건으로 추정되고, 이는 주로 전이성 질환으로 인한 것이었다. 유방암 환자의 대략 25-30%는 특히 불량한 예후를 부여하는 HER2 유전자의 증폭을 보유한다. 표적화 요법을 포함한 보다 새로운 작용제의 출현에도 불구하고, IV기 질환의 전체 사망률에서 단지 보통의 개선만이 존재하였다. 예를 들어, HER2-양성 유방암 환자에 의한 무작위화 시험에서, 2종의 HER2-표적화된 항체, 트라스투주맙 및 페르투주맙, 플러스 도세탁셀의 가장 유망한 치료 조합물이 56.5개월의 중앙 전체 생존 및 트라스투주맙 및 도세탁셀 단독보다 단지 6.3개월의 무진행 생존 연장을 발생시켰다.
본원은 세포외 도메인, 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 막횡단 면역수용체 (키메라 항원 수용체 또는 "CAR")를 기재한다. 세포외 도메인은 HER2에 대해 표적화된 scFv, 및, 임의로, 예를 들어 인간 Fc 도메인의 부분을 포함하는 스페이서를 포함한다. 막횡단 부분은, 예를 들어, CD4 막횡단 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 CD3 막횡단 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄 (CD3ξ)로부터의 신호전달 도메인 및 1개 이상의 공동자극 도메인, 예를 들어, 4-IBB 또는 CD28 공동자극 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 CAR이, T 세포의 표면 상에서 발현된 경우에, T 세포 활성을 HER2를 발현하는 세포로 향하게 할 수 있다. 이러한 세포는 특정 유방암 세포 및 특정 뇌암 세포를 포함한다. 세포내 영역의 CD3ξ와 연속하여 공동자극 도메인, 예컨대 4-IBB (CD137) 공동자극 도메인을 포함하는 것은 T 세포가 공동-자극 신호를 수신하게 할 수 있다. T 세포, 예를 들어, 환자-특이적, 자가 T 세포는 본원에 기재된 CAR을 발현하도록 조작될 수 있고, 조작된 세포는 확장되고, ACT에서 사용될 수 있다. 알파 베타 T 세포 및 감마 델타 T 세포 둘 다를 포함한 다양한 T 세포 하위세트가 사용될 수 있다. 또한, CAR은 다른 면역 세포, 예컨대 NK 세포에서 발현될 수 있다. 환자가 본원에 기재된 CAR을 발현하는 면역 세포로 치료되는 경우에, 세포는 자가 T 세포 또는 동종 T 세포일 수 있다. 일부 경우에, 사용되는 세포는 CD62L+, CCR7+, CD45RO+, 및 CD45RA-인 CD4+ 및 CD8+ 중앙 기억 T 세포 (TCM) 둘 다를 포함하는 세포 집단이거나, 또는 사용되는 세포는 CD4+ 및 CD8+ TCM 세포, 줄기 중앙 기억 T 세포 및 나이브 T 세포를 포함하는 세포 집단 (즉, TCM/SCM/N 세포의 집단)이다. TCM /SCM/N 세포의 집단은 CD62L+, CCR7+이고, CD45RA+ 및 CD45RO+ 세포 둘 다 뿐만 아니라 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포 둘 다를 포함한다. 이러한 세포의 사용은 다른 유형의 환자-특이적 T 세포의 사용과 비교하여 입양 전달 후 세포의 장기 지속성을 개선시킬 수 있다.
본원은 HER2에 대해 표적화된 scFv (예를 들어, DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS; 서열식별번호(SEQ ID NO): 1) 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ξ 막횡단 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인, 예를 들어, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; 또는 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; 또는 CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 및 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 둘 다; 및 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 기재한다.
다양한 실시양태에서: 공동자극 도메인은 CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체가 존재한다. 일부 실시양태에서 2개의 공동자극 도메인, 예를 들어 CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 및 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체가 존재한다. 다양한 실시양태에서 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형은 치환이다.
일부 경우에, 공동자극 도메인과 CD3ξ 신호전달 도메인 사이 및/또는 2개의 공동자극 도메인 사이에 1-6개의 아미노산 (예를 들어 GGG)의 짧은 서열이 존재한다.
CAR의 추가의 실시양태는 하기를 포함한다: HER2에 대해 표적화된 scFv; CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 OX40 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 상이한 공동자극 도메인; HER2 scFv 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ξ 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인, 예를 들어, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; 또는 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; 또는 CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 및 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 둘 다; 및 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체; HER2 scFv 또는 그의 변이체와 막횡단 도메인 사이에 위치하는 스페이서 영역 (예를 들어, 스페이서 영역은 서열식별번호: 2-12 및 42 (표 3) 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함); IgG 힌지 영역을 포함하는 스페이서; 1-150개의 아미노산을 포함하는 스페이서 영역; 어떠한 스페이서도 존재하지 않음; 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 4-l BB 신호전달 도메인, 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CD3ξ 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인과 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 그의 변이체 사이에 위치하는 3 내지 15개의 아미노산의 링커. 2개의 공동자극 도메인이 존재하는 특정 실시양태에서, 하나는 4-l BB 공동자극 도메인이고, 다른 것은 CD28 및 CD28gg로부터 선택된 공동자극 도메인이다. 다양한 실시양태에서 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형은 치환, 예를 들어 보존적 치환이다.
일부 실시양태에서: 핵산 분자는 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하고; 키메라 항원 수용체는 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
또한, HER2에 대해 표적화된 scFv; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 변형) (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 변형) (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 변형) (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ξ 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 변형) (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; 공동자극 도메인, 예를 들어, CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; 또는 4-l BB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체; 또는 CD28 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 및 4-lBB 공동자극 도메인 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체 둘 다; 및 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 변형) (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단이 개시된다. 다양한 실시양태에서: 인간 T 세포의 집단은 서열식별번호: 26-41 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형 (예를 들어, 1 또는 2개의 아미노산 변형) (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터를 포함하고; 인간 T 세포의 집단은 중앙 기억 T 세포 (TCM 세포)를 포함하고, 예를 들어, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%가 TCM 세포이거나, 또는 T 세포의 집단은 중앙 기억 T 세포, 나이브 T 세포 및 줄기 중앙 기억 세포의 조합 (TCM /SCM/N 세포)을 포함하고, 예를 들어, 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%가 TCM /SCM/N 세포이다. 어느 하나의 경우에, T 세포의 집단은 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포 둘 다를 포함한다 (예를 들어, CD3+ T 세포의 적어도 20%는 CD4+이고, CD3+ T 세포의 적어도 3%는 CD8+이고, 적어도 70, 80 또는 90%는 CD4+ 또는 CD8+임; CD3+ 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%는 CD4+이고, CD3+ 세포의 적어도 4%, 5%, 8%, 10%, 20은 CD8+ 세포임).
또한, 자가 또는 동종 인간 T 세포 (예를 들어, 중앙 기억 T 세포를 포함하거나 (TCM 세포) 또는 중앙 기억 T 세포, 나이브 T 세포 및 줄기 중앙 기억 세포의 조합을 포함하는 (즉, T 세포가 TCM /SCM/N 세포임, 예를 들어 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%가 TCM/SCM/N 세포임) 자가 또는 동종 T 세포)의 집단을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법이 기재된다. 어느 하나의 경우에, T 세포의 집단은 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포 둘 다를 포함한다 (예를 들어, CD3+ T 세포의 적어도 20%는 CD4+이고, CD3+ T 세포의 적어도 3%는 CD8+이고, 적어도 70, 80 또는 90%는 CD4+ 또는 CD8+임; CD3+ 세포의 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%는 CD4+이고, CD3+ 세포의 적어도 4%, 5%, 8%, 10%, 20은 CD8+ 세포임). 다양한 실시양태에서: 암은 뇌암, 예를 들어, 유방암으로부터 전이된 HER2-발현 뇌암이고; 형질도입된 인간 T 세포는 환자로부터 T 세포를 수득하는 단계, T 세포를 처리하여 중앙 기억 T 세포를 단리하는 단계, 및 중앙 기억 세포의 적어도 일부를 서열식별번호: 26 또는 27로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5 (예를 들어, 1 또는 2)개의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 일부 경우에 CAR T 세포는 뇌 종양으로 직접 투여되지 않고, 대신 환자의 뇌 내의 뇌실내 공간으로 투여된다.
또한, 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 5개 이하의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입의 존재를 제외하고 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 5개 이하의 아미노산 치환의 존재를 제외하고 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 2개 이하의 아미노산 치환의 존재를 제외하고 서열식별번호: 26-41로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 기재된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 CAR 중 임의의 것을 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, CAR 중 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터) 및 본원에 기재된 CAR 중 임의의 것을 발현하는 단리된 T 림프구를 포함한다.
본원에 기재된 CAR은 HER2 결합 도메인 (예를 들어, HER2 scFv)과 막횡단 도메인 사이에 위치한 스페이서 영역을 포함할 수 있다. 다양한 상이한 스페이서가 사용될 수 있다. 그 중 일부는 인간 Fc 영역의 적어도 일부, 예를 들어, 인간 Fc 영역의 힌지 일부 또는 CH3 도메인 또는 그의 변이체를 포함한다. 하기 표 1은 본원에 기재된 CAR에 사용될 수 있는 다양한 스페이서를 제공한다.
표 1: 스페이서의 예
Figure pct00001
일부 스페이서 영역은 이뮤노글로불린 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 힌지 영역의 모두 또는 일부, 즉, 이뮤노글로불린의 CHI와 CH2 도메인 사이에 속하는 서열, 예를 들어, IgG4 Fc 힌지 또는 CD8 힌지를 포함한다. 일부 스페이서 영역은 이뮤노글로불린 CH3 도메인, 또는 CH3 도메인 및 CH2 도메인 둘 다를 포함한다. 이뮤노글로불린 유래 서열은 1개 이상의 아미노산 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환, 예를 들어, 오프-타겟 결합을 감소시키는 치환을 포함할 수 있다.
"아미노산 변형"은 단백질 또는 펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 지칭한다. "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 펩티드 또는 단백질 서열 내의 특정한 위치에 있는 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 대체를 지칭한다. 치환은 생성된 단백질 내의 아미노산을 비-보존적 방식으로 (즉, 특정한 크기 또는 특징을 갖는 아미노산 군에 속하는 아미노산으로부터 또 다른 군에 속하는 아미노산으로 코돈을 변화시킴으로써), 또는 보존적 방식으로 (즉, 특정한 크기 또는 특징을 갖는 아미노산 군에 속하는 아미노산으로부터 동일한 군에 속하는 아미노산으로 코돈을 변화시킴으로써) 변화시킬 수 있다. 이러한 보존적 변화는 일반적으로, 생성된 단백질의 구조 및 기능을 덜 변화시킨다. 하기는 아미노산의 다양한 군의 예이다: 1) 비극성 R 기를 갖는 아미노산: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌; 2) 비하전된 극성 R 기를 갖는 아미노산: 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민; 3) 하전된 극성 R 기를 갖는 아미노산 (pH 6.0에서 음으로 하전된 것): 아스파르트산, 글루탐산; 4) 염기성 아미노산 (pH 6.0에서 양으로 하전된 것): 리신, 아르기닌, 히스티딘 (pH 6.0). 또 다른 군은 페닐 기를 갖는 아미노산: 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신일 수 있다.
특정 실시양태에서, 스페이서는 비변형된 스페이서에 존재하는 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환된 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다. 1개 이상의 치환된 아미노산 잔기는 위치 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, 또는 그의 조합에서의 1개 이상의 아미노산 잔기로부터 선택되나, 이에 제한되지는 않는다. 하기에서 보다 상세하게 기재되는 이러한 넘버링 스킴에서, 표 1의 IgG4(L235E,N297Q) 스페이서에서 제1 아미노산은 219이고, 표 1의 IgG4(HL-CH3) 스페이서에서 제1 아미노산은 219이며, 이는 표 1의 IgG 힌지 서열 및 IgG4 힌지 링커 (HL) 서열에서 제1 아미노산이기 때문이다.
일부 실시양태에서, 변형된 스페이서는 하기 아미노산 잔기 치환: C220S, C226S, S228P, C229S, P230S, E233P, V234A, L234V, L234F, L234A, L235A, L235E, G236A, G237A, P238S, S239D, F243L, P247I, S267E, H268Q, S280H, K290S, K290E, K290N, R292P, N297A, N297Q, S298A, S298G, S298D, S298V, T299A, Y300L, V305I, V309L, E318A, K326A, K326W, K326E, L328F, A330L, A330S, A331S, P331S, I332E, E333A, E333S, E333S, K334A, A339D, A339Q, P396L, 또는 그의 조합 중 1개 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래된 것이다.
특정 실시양태에서, 변형된 스페이서는 비변형된 영역에 존재하는 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환된 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, IgG4 영역으로부터 유래된 것이다. 1개 이상의 치환된 아미노산 잔기는 위치 220, 226, 228, 229, 230, 233, 234, 235, 234, 237, 238, 239, 243, 247, 267, 268, 280, 290, 292, 297, 298, 299, 300, 305, 309, 218, 326, 330, 331, 332, 333, 334, 336, 339, 또는 그의 조합에서의 1개 이상의 아미노산 잔기로부터 선택되나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 변형된 스페이서는 하기 아미노산 잔기 치환: 220S, 226S, 228P, 229S, 230S, 233P, 234A, 234V, 234F, 234A, 235A, 235E, 236A, 237A, 238S, 239D, 243L, 247I, 267E, 268Q, 280H, 290S, 290E, 290N, 292P, 297A, 297Q, 298A, 298G, 298D, 298V, 299A, 300L, 305I, 309L, 318A, 326A, 326W, 326E, 328F, 330L, 330S, 331S, 331S, 332E, 333A, 333S, 333S, 334A, 339D, 339Q, 396L, 또는 그의 조합 중 1개 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는, IgG4 영역으로부터 유래된 것이며, 여기서 비변형된 스페이서 내의 아미노산은 표시된 위치에서 상기 확인된 아미노산으로 치환된다.
본원에서 논의되는 이뮤노글로불린 내의 아미노산 위치의 경우에, 넘버링은 EU 인덱스 또는 EU 넘버링 스킴에 따른다 (Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 전체가 본원에 참조로 포함됨). EU 인덱스 또는 카바트(Kabat)에서와 같은 EU 인덱스 또는 EU 넘버링 스킴은 EU 항체의 넘버링을 지칭한다 (Edelman et al. 1969 Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85).
다양한 막횡단 도메인이 사용될 수 있다. 표 2는 적합한 막횡단 도메인의 예를 포함한다. 스페이서 도메인이 존재하는 경우에, 막횡단 도메인은 스페이서 도메인의 카르복시 말단에 위치한다.
표 2: 막횡단 도메인의 예
Figure pct00002
본원에 기재된 많은 CAR은 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 공동자극 도메인을 포함한다. 공동자극 도메인(들)은 막횡단 도메인과 CD3ξ 신호전달 도메인 사이에 위치한다. 표 3은 CD3ξ 신호전달 도메인의 서열과 함께 적합한 공동자극 도메인의 예를 포함한다.
표 3: CD3 도메인 및 공동자극 도메인의 예
Figure pct00003
도 1은 Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-CD19t의 아미노산 서열을 도시한다. 다양한 도메인이 서열 아래에 순서대로 열거되고, 밑줄표시 및 비-밑줄표시로 교대로 표시된다. 성숙 CAR 서열 (서열식별번호: 26)은 GMCSFRa 신호 펩티드, T2A 스킵 서열 또는 말단절단된 CD19를 포함하지 않는다.
도 2는 Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-제타-T2A-CD19t의 아미노산 서열을 도시한다. 다양한 도메인이 서열 아래에 순서대로 열거되고, 밑줄표시 및 비-밑줄표시로 교대로 표시된다. 성숙 CAR 서열 (서열식별번호: 27)은 GMCSFRa 신호 펩티드, T2A 스킵 서열 또는 말단절단된 CD19를 포함하지 않는다.
도 3a-d는 HER2-특이적 CAR 구축물 및 CAR T 세포 확장 데이터를 도시한다.
도 4a-d는 유방암 세포주에 대한 HER2-CAR T 세포의 시험관내 특징화를 도시한다.
도 5a-5f는 HER2-CAR T 세포의 시험관내 종양 활성에 대한 연구의 결과를 도시한다.
도 6a-6i는 국부 종양내로-전달된 HER2-CAR T 세포의 생체내 항종양 효능에 대한 연구의 결과를 도시한다.
도 7a-7d는 인간 동소 BBM 이종이식편 모델에서 HER2-CAR T 세포의 국부 전달에 대한 연구의 결과를 도시한다.
도 8a-8d는 HER2-CAR T 세포의 뇌실내 전달에 대한 연구의 결과를 도시한다.
도 9-14는 HER2에 대해 표적화된 추가의 CAR을 도시한다.
도 15a-15c는 다양한 스페이서를 갖는 특정의 추가의 CAR을 특징화한 연구의 결과를 도시한다. IgG3(EQ)은 도 2에 도시되고; DeltaCh2는 도 11에 도시되고; CD8h는 도 9에 도시되고; HL은 도 10에 도시되고; L은 도 14에 도시된다.
도 16a-16c는 다양한 CAR을 발현하는 TCM을 HER2를 발현하지 않는 세포 (MDA-MB-468), 낮은 HER2를 발현하는 세포 (231BR), 낮은 HER2를 발현하는 세포 (231BRHER2LO) 또는 높은 HER2를 발현하는 세포 (231BRHER2HI)에 노출시켰을 때 생산된 CD107a 및 INF 감마를 검사한 연구의 결과를 보여준다.
도 17a-17d는 도 2 (HER2(EQ)BBζ) 또는 도 14 (HER2(L)BB ζ)의 CAR에 의한 다양한 세포주에서의 PD-1 생산 및 종양 세포 사멸을 검사한 연구의 결과를 보여준다.
도 18a-18b는 다양한 CAR을 발현하는 TCM을 HER2를 발현하지 않는 세포 (MDA-MB-468), 낮은 HER2를 발현하는 세포 (231BR), 낮은 HER2를 발현하는 세포 (231BRHER2LO) 또는 높은 HER2를 발현하는 세포 (231BRHER2HI)에 노출시켰을 때 생산된 CD107a 및 INF 감마를 검사한 연구의 결과를 보여준다.
HER2를 표적화하고, HER2-발현 유방암 뿐만 아니라 유방에서 뇌로의 전이를 치료하는데 유용한, 다양한 키메라 항원 수용체의 구조, 구축 및 특징화가 하기 기재된다. 중요한 것으로, 본원에 기재된 CAR은 뇌실내 또는 종양내 전달에 의해 뇌 내 HER2 발현 종양을 치료하기 위해 ACT에 사용될 수 있다.
키메라 항원 (CAR)은, 최소한, 세포외 인식 도메인, 막횡단 영역, 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 재조합 생체분자이다. 따라서, 용어 "항원"은 항체에 결합하는 분자로 제한되지 않고, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자로 제한된다. 예를 들어, CAR은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 세포외 인식 도메인 (또한 세포외 도메인으로서, 또는 간단히 그것이 함유하는 인식 요소로 지칭됨)은 표적 세포의 세포 표면 상에 존재하는 분자에 특이적으로 결합하는 인식 요소를 포함한다. 막횡단 영역은 CAR을 막에 고정시킨다. 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 복합체의 제타 쇄로부터의 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. CAR은 MHC 제한에 비의존적으로 항원에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 T 세포 활성화를 변환시킬 수 있다. 따라서, CAR은 그의 HLA 유전자형과는 상관 없이 항원-양성 종양을 갖는 환자의 집단을 치료할 수 있는 "범용" 면역수용체이다. 종양-특이적 CAR을 발현하는 T 림프구를 사용하는 입양 면역요법은 암의 치료를 위한 강력한 치료 전략일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 CAR은 CAR 오픈 리딩 프레임에 이어 T2A 리보솜 스킵 서열, 및 세포질 신호전달 꼬리가 결여된 말단절단된 CD19 (CD19t) (아미노산 323에서 말단절단됨)가 이어지는 벡터를 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 배열에서, CD19t의 공동-발현은 유전자 변형된 세포의 정확한 측정을 가능하게 하고, 유전자 변형된 세포의 양성 선택 뿐만 아니라 입양 전달 후 생체내 치료 T 세포의 효율적 세포 추적 및/또는 영상화를 가능하게 하는, 불활성, 비-면역원성 표면 마커를 제공한다. CD19t의 공동-발현은 임상적으로 이용가능한 항체 및/또는 면역독소 시약을 사용한 생체내 형질도입된 세포의 면역학적 표적화를 위한 마커를 제공하여, 치료 세포를 선택적으로 제거하고, 그에 의해 자살 스위치로서 기능한다.
본원에 기재된 CAR은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있지만, 바람직하게는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된다. 키메라 수용체의 여러 영역을 코딩하는 핵산은 제조되어 관련 기술분야에 공지된 편리한 분자 클로닝의 표준 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-보조 라이게이션, 부위-지정 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 코딩 서열로 어셈블리될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 바람직하게는 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 발현 숙주 세포주, 바람직하게는 T 림프구 세포주, 가장 바람직하게는 자가 T 림프구 세포주를 형질전환시키는데 사용된다.
비선택된 PBMC 또는 풍부화된 CD3 T 세포 또는 풍부화된 CD3 또는 기억 T 세포 하위세트 또는 TCM 또는 TCM /SCM/N을 포함한, 환자로부터 단리된 다양한 T 세포 하위세트가 CAR 발현을 위한 벡터로 형질도입될 수 있다. 중앙 기억 T 세포는 1종의 유용한 T 세포 하위세트이다. 중앙 기억 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터, 예를 들어 목적하는 수용체를 발현하는 세포를 면역자기적으로 선택하기 위한 클리니MACS(CliniMACS)® 장치를 사용하여 CD45RO+/CD62L+ 세포를 풍부화함으로써 단리될 수 있다. 중앙 기억 T 세포가 풍부화된 세포는 항-CD3/CD28에 의해 활성화될 수 있고, CAR 뿐만 아니라 생체내 검출 및 잠재적 생체외 선택 둘 다를 위한 비-면역원성 표면 마커인 말단절단된 인간 CD19 (CD19t)의 발현을 지시하는, 예를 들어, SIN 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입될 수 있다. 활성화된/유전자 변형된 중앙 기억 T 세포는 시험관내에서 IL-2/IL-15에 의해 확장될 수 있고, 이어서, 동결보존될 수 있다.
실시예 1: 2개의 HER2-CAR의 구조
본원에 기재된 HER2 scFv를 포함하는 1개의 CAR은 Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-제타-T2A-CD19t로 지칭된다. 이러한 CAR은 HER2에 대해 표적화된 scFv; Fc 수용체 (FcR)에 의한 결합을 감소시키는 방식으로 CH2 영역 내의 2개의 부위 (L235E; N297Q)에서 돌연변이된 IgG4 Fc 영역; CD28 막횡단 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 및 CD3ξ 활성화 도메인을 포함한, 다양한 중요한 특색을 포함한다. 도 1은 CAR 발현을 모니터링하는데 사용되는 말단절단된 CD19 서열, 및 CAR이 말단절단된 CD19 서열의 융합 없이 생산되게 하는 T2A 리보솜 스킵 서열의 서열을 포함하는, 이러한 CAR의 아미노산 서열을 제시한다. 도 2에 제시된 바와 같이, 미성숙 CAR은 GMCSFR 신호 펩티드, HER2 scFv, 스페이서로서 작용하는 IgG4, CD8 막횡단 도메인, LL에서 GG 서열 변경을 포함하는 4-IBB 공동-자극 도메인, 3개의 Gly 서열, CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 전사체는 또한 CAR 단백질 서열의 일부가 아닌 T2A 리보솜 서열 및 말단절단된 CD19 서열을 코딩한다. 성숙 CAR은 미성숙 CAR과 동일하지만, GMCSF 신호 펩티드가 결여되어 있다.
실시예 2: HER2-특이적 CAR T 세포의 발현을 위해 사용된 epHIV7의 구축 및 구조
epHIV7 벡터는 HER2-특이적 CAR의 발현에 사용될 수 있는 벡터이다. 이는 pHIV7 벡터로부터 생산되었다. 중요한 것으로, 이러한 벡터는 CAR의 발현을 구동시키기 위해 인간 EFI 프로모터를 사용한다. 벡터의 5' 및 3' 서열 둘 다는, 이전에 HXBc2 프로바이러스로부터 유래된 바와 같이 pv653RSN으로부터 유래되었다. 폴리퓨린 트랙 DNA 플랩 서열 (cPPT)은 NIH AIDS 시약 저장소로부터의 HIV-I 균주 pNL4-3으로부터 유래되었다. 우드척 전사-후 조절 요소 (WPRE) 서열은 이전에 기재되었다.
pHIV7의 구축을 하기와 같이 수행하였다. 간략하게, 개재 SL3-네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (Neo)와 함께 gag-pol 플러스 5' 및 3' 긴-말단 반복부 (LTR)로부터의 653 bp를 함유하는 pv653RSN을 하기와 같이 pBluescript 내로 서브클로닝하였다: 단계 I에서, 5' LTR로부터 rev-반응성 요소 (RRE)까지의 서열로 p5'HIV-I 5 I를 제조하였고, 이어서 TATA 박스의 상류 서열을 제거하여 5' LTR을 변형시키고, 먼저 CMV 인핸서에, 이어서, SV40 복제 기점에 라이게이션시켰다 (p5'HIV-2). 단계 2에서, 3' LTR을 pBluescript 내로 클로닝하여 p3'HIV-1을 제조한 후, 3' LTR 인핸서/프로모터에서 400-bp를 결실시켜 HIV U3 내의 시스-조절 요소를 제거하고, p3'HIV-2를 형성하였다. 단계 3에서, p5'HIV-3 및 p3'HIV-2로부터 단리된 단편을 라이게이션시켜 pHIV-3을 제조하였다. 단계 4에서, 추가의 상류 HIV 서열을 제거하여 p3'HIV-2를 추가로 변형시킴으로써 p3'HIV-3을 생성하고, WPRE를 함유하는 600-bp BamHI-SalI 단편을 p3'HIV-3에 부가하여 p3'HIV-4를 제조하였다. 단계 5에서, PCR에 의해 pHIV-3 RRE의 크기를 감소시키고, pHIV-3으로부터의 5' 단편 (제시되지 않음) 및 p3'HIV-4에 라이게이션시켜 pHIV-6을 제조하였다. 단계 6에서, HIV-I pNL4-3 (55)으로부터의 cPPT DNA 플랩 서열을 함유하는 190-bp BglII-BamHI 단편을 pNL4-3으로부터 증폭시키고, pHIV 6 내의 RRE와 WPRE 서열 사이에 배치하여 pHIV-7을 제조하였다. 이러한 모 플라스미드 pHIV7-GFP (GFP, 녹색 형광 단백질)를 사용하여, 4-플라스미드 시스템을 사용하여 모 벡터를 패키징하였다.
패키징 신호, 프사이 (ψ)는 바이러스 게놈의 벡터 내로의 효율적 패키징을 위해 필요하다. RRE 및 WPRE는 RNA 전사체 수송 및 트랜스진의 발현을 증진시킨다. WPRE와 조합된 플랩 서열은 표유동물 세포에서 렌티바이러스 벡터의 형질도입 효율을 증진시키는 것으로 입증된 바 있다.
바이러스 벡터의 생산에 필요한 헬퍼 기능은 재조합을 통한 복제 적격 렌티바이러스의 생성 가능성을 감소시키기 위해 3개의 별개의 플라스미드로 나누어진다: 1) pCgp는 바이러스 벡터 어셈블리에 필요한 gag/pol 단백질을 코딩하고; 2) pCMV-Rev2는 효율적인 패키징을 위한 바이러스 게놈의 수송을 보조하기 위해 RRE 서열에 대해 작용하는 Rev 단백질을 코딩하고; 3) pCMV-G는 바이러스 벡터의 감염성에 필요한 수포성-구내염 바이러스 (VSV)의 당단백질을 코딩한다.
pHIV7 코딩 벡터 게놈과 헬퍼 플라스미드 사이에는 최소 DNA 서열 상동성이 존재한다. 상동성 영역은 pCgp 헬퍼 플라스미드의 gag/pol 서열에 위치하는, 대략 600개의 뉴클레오티드의 패키징 신호 영역; 모든 3개의 헬퍼 플라스미드 내의 CMV 프로모터 서열; 및 헬퍼 플라스미드 pCgp 내의 RRE 서열을 포함한다. 이들 영역에서의 상동성으로 인해 복제 적격 재조합 바이러스가 생성될 수 있는 가능성은 매우 낮은데, 이는 다중 재조합 이벤트를 필요로 할 것이기 때문이다. 추가적으로, 임의의 생성된 재조합체는 렌티바이러스 복제에 필요한 기능성 LTR 및 tat 서열을 누락하게 될 것이다.
CMV 프로모터를 EFlα-HTLV 프로모터 (EFIp)로 대체하였고, 새로운 플라스미드를 epHIV7로 명명하였다. EFlp는 563 bp를 가지며, CMV 프로모터를 잘라낸 후, NruI 및 NheI를 사용하여 epHIV7 내로 도입하였다.
야생형 바이러스의 병원성을 위해 필요하고 표적 세포의 증식성 감염에 요구되는 gag/pol 및 rev가 배제된 렌티바이러스 게놈을 이러한 시스템으로부터 제거하였다. 또한, 벡터 구축물은 무손상 3'LTR 프로모터를 함유하지 않고, 따라서 표적화된 세포에서 생성되는 발현되고 역전사된 DNA 프로바이러스 게놈은 불활성 LTR을 갖게 될 것이다. 이러한 설계의 결과로서, 어떠한 HIV-I 유래 서열도 프로바이러스로부터 전사되지 않을 것이고, 오직 치료 서열만이 그의 각각의 프로모터로부터 발현될 것이다. SIN 벡터에서 LTR 프로모터 활성의 제거는 숙주 유전자의 비의도적 활성화의 가능성을 유의하게 감소시킬 것으로 예상된다.
실시예 3: 환자 T 세포의 형질도입을 위한 벡터의 생산
환자 T 세포의 형질도입을 위한 벡터는 하기와 같이 제조할 수 있다. 각각의 플라스미드 (CAR 및, 임의로, 마커 예컨대 말단절단된 CD19를 발현하는 플라스미드; 2) pCgp; 3) pCMV-G; 및 4) pCMV-Rev2)에 대해 시드 뱅크를 생성하고, 이를 사용하여 발효기에 접종하여 충분한 양의 플라스미드 DNA를 생산하였다. 플라스미드 DNA를 렌티바이러스 벡터를 생산하는데 사용하기 전에, 아이덴티티, 멸균성 및 내독소에 대해 시험하였다.
간략하게, 멸균성 및 바이러스 오염의 부재를 확인하기 위해 시험한 293T 작업 세포 (WCB)로부터 세포를 확장시켰다. 293T WCB로부터의 293T 세포의 바이알을 해동시켰다. 벡터 생산 및 세포주 유지를 위해 적절한 수의 10층 세포 공장 (CF)을 플레이팅하기 위해, 충분한 수의 세포가 존재할 때까지 세포를 성장시키고 확장시켰다. 단일 세포주가 생산에 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 최대 10 CF의 하위-배치에서 생산하였다. 2개의 하위-배치를 동일한 주에 생산하여 대략 20 L의 렌티바이러스 상청액/주로 생산할 수 있다. 1 로트의 생성물을 생산하기 위해, 하류 프로세싱 단계 동안 모든 하위-배치로부터 생산된 물질을 풀링하였다. 293T 세포를 293T 배지 (10% FBS를 포함하는 DMEM) 중 CF에 플레이팅하였다. 공장을 37℃ 인큐베이터 내에 넣고, CF의 모든 층 상에서 세포가 균등하게 분포하도록 수평으로 평평하게 하였다. 2일 후, 트리스:EDTA, 2M CaCl2, 2X HBS, 및 4종의 DNA 플라스미드의 혼합물을 수반하는 CaPO4 방법을 사용하여, 상기 기재된 4종의 렌티바이러스 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 제3일에, 분비된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 수집하고, 정제하고, 농축시켰다. CF로부터 상청액을 제거한 후, 각각의 CF로부터 생산-종료 세포를 수집하였다. 세포를 각각의 공장으로부터 트립신처리하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 냉동 배지 중에 재현탁시키고, 동결보존하였다. 이들 세포를 추후에 복제-적격 렌티바이러스 (RCL) 검사에 사용하였다.
벡터를 정제하고 제제화하기 위해, 막 여과에 의해 조 상청액을 정화하여 세포 파편을 제거하였다. 숙주 세포 DNA 및 잔류 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 소화 (벤조나제(Benzonase)®)에 의해 분해하였다. 0.45 μm 필터를 사용하여 세포 파편으로부터 바이러스 상청액을 정화하였다. 정화된 상청액을 벤조나제®가 첨가되어 있는 (최종 농도 50 U/mL) 사전-칭량된 용기 내로 수집하였다. 잔류 플라스미드 DNA 및 숙주 게놈 DNA에 대한 엔도뉴클레아제 소화를 37℃에서 6시간 동안 수행하였다. 엔도뉴클레아제-처리된 상청액의 초기 접선 흐름 한외여과 (TFF) 농축을 사용하여 조 상청액으로부터 잔류 저분자량 성분을 제거하는 한편, 바이러스를 ~20배 농축시켰다. 정화된 엔도뉴클레아제-처리된 바이러스 상청액을 500 kD의 NMWCO를 갖는 중공 섬유 카트리지를 통해, 전단 속도는 ~4,000 sec-1 이하로 유지하면서 유동 속도는 최대화하도록 설계된 유량으로 순환시켰다. 카트리지 성능을 지속시키기 위해 농축 프로세스 동안 뉴클레아제-처리된 상청액의 투석여과를 개시하였다. 투석여과 완충제로서 PBS 중 4% 락토스를 사용하여 80%의 투과물 교체율을 확립하였다. 바이러스 상청액을 조 상청액의 20-배 농도를 나타내는 표적 부피로 만들었고, 4회 추가의 교환 부피를 위해 투석여과를 계속하였고, 투과물 교체율은 100%였다.
바이러스 생성물의 추가의 농축은 고속 원심분리 기술을 사용하여 달성하였다. 6000 RPM (6,088 RCF)에서의 소르발(Sorvall) RC-26 플러스 원심분리를 6℃에서 16-20시간 동안 사용하여 렌티바이러스의 각각의 하위-배치를 펠릿화하였다. 이어서 각각의 하위-배치로부터의 바이러스 펠릿을 PBS 중 4% 락토스에 의해 50 mL 부피로 재구성하였다. 이러한 완충제 중에 재구성된 펠릿은 바이러스 제조를 위한 최종 제제를 나타낸다. 전체 벡터 농축 프로세스는 대략 200-배 부피 감소를 발생시켰다. 모든 하위-배치의 완료 후, 이어서 물질을 -80℃에 두는 한편, 각각의 하위-배치로부터의 샘플을 멸균성에 대해 시험하였다. 샘플 멸균성을 확인한 후, 하위-배치를 37℃에서 빈번한 교반 하에 신속하게 해동시켰다. 이어서, 물질을 풀링하고, 클래스 II 유형 A/B3 생물안전 캐비넷으로 수동으로 분취하였다. 0-링 크리오바이알이 외부 장착된 멸균 USP 클래스 6 내의 농축된 렌티바이러스의 1 mL 충전 구성을 사용하였다.
렌티바이러스 벡터 제제의 순도를 확실하게 하기 위해, 잔류 숙주 DNA 오염물, 및 잔류 숙주 및 플라스미드 DNA의 전달에 대해 시험하였다. 다른 시험들 중에서, RT-PCR에 의해 벡터 아이덴티티를 평가하여 올바른 벡터가 존재하는지 확실하게 하였다.
실시예 4: ACT에서의 사용에 적합한 T 세포의 제조
TCM을 사용하여 CAR을 발현시키고자 하는 경우에, 적합한 환자 세포는 하기와 같이 제조할 수 있다. 먼저 T 림프구를 환자로부터 백혈구분리반출술에 의해 수득하고, 적절한 동종 또는 자가 T 세포 하위세트, 예를 들어, 중앙 기억 T 세포 (TCM)를 CAR을 발현하도록 유전자 변경한 다음, 임의의 임상적으로 허용되는 수단에 의해 환자에게 다시 투여하여 항암 요법을 달성한다.
적합한 TcM은 하기와 같이 생성될 수 있다. 동의한 연구 참가자로부터 수득한 분리반출술 생성물을 피콜화하고, 세척하고, 밤새 인큐베이션하였다. 이어서 GMP 등급 항-CD14, 항-CD25 및 항-CD45RA 시약 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)) 및 클리니MACS(CliniMACS)™ 분리 장치를 사용하여 세포에서 단핵구, 조절 T 세포 및 나이브 T 세포 집단을 고갈시켰다. 고갈 후, 클리니MACS™ 분리 장치 상에서 DREG56-비오틴 (COH 임상 등급) 및 항-비오틴 마이크로비드 (밀테니 바이오텍)를 사용하여 음성 분획 세포를 CD62L+ TCM 세포에 대해 풍부화하였다.
풍부화 후, TCM 세포를 완전 엑스-비보15(X-Vivo15) 플러스 50 IU/mL IL-2 및 0.5 ng/mL IL-15 중에 제제화하고, 테플론 세포 배양 백으로 옮겨, 여기서 디날 클린Ex™ 비보(Dynal ClinEx™ Vivo) CD3/CD28 비드로 이를 자극하였다. 자극 후 최대 5일째에, 목적하는 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 1.0 내지 0.3의 감염 다중도 (MOI)로 세포를 형질도입하였다. 세포 확장을 위해 필요에 따라 완전 엑스-비보15 및 IL-2 및 IL-15 시토카인을 첨가하면서 최대 42일 동안 배양을 유지시켰다 (세포 밀도를 3x105 및 2x106개 생존 세포/mL로 유지시키고, 배양의 월요일, 수요일, 및 금요일마다 시토카인 보충). 세포는 전형적으로 이들 조건 하에 21일 내에 대략 109개 세포로 확장되었다. 배양 기간 말미에 세포를 수거하고, 2회 세척하고, 임상 등급 동결보존 배지 (크리오스토어 CS5(Cryostore CS5), 바이오라이프 솔루션즈(BioLife Solutions)) 중에 제제화하였다.
T 세포 주입일(들)에, 동결보존되고 출시된 생성물을 재-주입을 위해 해동하고, 세척하고, 제제화하였다. 출시된 세포 생성물을 함유하는 동결보존된 바이알을 액체 질소 보관에서 꺼내어, 해동하고, 냉각시키고, PBS/2% 인간 혈청 알부민 (HSA) 세척 완충제로 세척하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고, 세포를 보존제-무함유 생리 염수 (PFNS)/2% HSA 주입 희석제 중에 재현탁시켰다. 샘플을 품질 관리 검사를 위해 꺼내었다.
실시예 5: HER2에 대해 표적화된 CAR의 발현
도 3a는 도 1 및 도 2에 도시된 2개의 HER2-특이적 CAR 구축물의 개략적 다이어그램이다. CD28 막횡단 도메인, 세포내 CD28 공동-자극 도메인 및 세포용해 CD3ξ 도메인을 함유하는 HER2(EQ)28ξ에서, scFv는 변형된 IgG4 Fc 링커 (이중 돌연변이체, L235E; N297Q)에 의해 막에 테더링된다. T2A 스킵 서열은 CAR을 세포 추적에 사용되는 말단절단된 CD19 (CD19t) 단백질로부터 분리한다. HER2(EQ)BBξ는 공동자극 도메인이 CD28이 아닌 4-l BB이고 막횡단 도메인이 CD28 막횡단 도메인이 아닌 CD8 막횡단 도메인인 것을 제외하고 유사하다. 인간 중앙 기억 (TCM) 세포를 HER2(EQ)28ξ 또는 HER2(EQ)BBξ를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 도 3b는 인간 TCM 표면 표현형의 대표적인 FACS 데이터를 도시한다. 도 3c는 HER2(EQ)28ξ 또는 HER2(EQ)BBξ를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 TCM에서의 CD19 및 단백질 L 발현에 대한 검정 결과를 도시한다. 이들 결과로부터 관찰할 수 있는 바와 같이, CD19 발현에 의해 평가된 바와 같은 형질감염 효율은 둘 다의 CAR에 대해 유사하였다. 그러나, 단백질 L 발현은 HER2(EQ)28ξ의 경우보다 HER2(EQ)BBξ의 경우에 더 낮았고, 이는 HER2(EQ)BBξ CAR이 HER2(EQ)BBξ보다 덜 안정하다는 것을 시사한다. 세포 확장의 분석 (도 3d)은 어떠한 CAR도 T 세포 확장을 방해하지 않는다는 것을 보여준다.
실시예 6: 다양한 유방암 세포주에 대한 HER2-CAR T 세포의 시험관내 특징화
HER2-음성 세포주 (LCL 림프종, MDA-MB-468, U87 신경교종), 낮은-HER2 발현 세포주 (MDA-MB-361, 231BR) 및 높은-HER2 발현 세포주 (SKBR3, BT474, BBM l)를 포함한 다양한 유방암 세포주를 사용하여 HER2(EQ)28 및 HER2(EQ) BBξ를 특징화하였다. 도 4a는 이들 세포주 각각의 HER2 발현 수준을 도시한다. 유동 세포측정법 (CAR+ T 세포에 대해 게이팅됨)을 사용하여 모의 (비형질도입됨), HER2(EQ)28ξ 또는 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포에서 MDA-MB-361 종양 세포 (낮은 HER2 발현) 또는 BBM l 종양 세포 (높은 HER2 발현)와의 5시간 공동-배양 후 CD107a 탈과립화 및 IFNy 생산을 특징화하였다. 이러한 분석의 결과를 도 4b에 제시한다. 다른 유방암 세포주를 사용하여 유사한 연구를 수행하였고, 결과를 도 4c에 요약한다. 재조합 HER2 단백질 또는 종양 표적과의 24시간 배양 후 HER2-CAR T 세포에 의한 IFNγ 생산을 ELISA에 의해 측정하였고, 이러한 분석의 결과를 도 4d에 제시한다.
실시예 7: 시험관내 항종양 활성
유동 세포측정법을 사용하여 모의 (비형질도입됨), HER2(EQ)28ξ 또는 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포의 종양 표적과의 72시간 공동-배양 후 종양 세포 사멸을 평가하였다. 이러한 분석의 결과를 도 5a에 제시한다. HER2-음성 MDA-MB-468 또는 HER2-양성 BBM l 세포와의 72시간 공동-배양 후 총 CAR T 세포에서의 PD-1 및 LAG-3 유도를 측정하고, 이러한 분석의 결과를 도 5b에 제시한다. HER2-음성 (LCL 림프종, MDA-MB-468, U87 신경교종), 낮은-HER2 발현 (MDA-MB-361, 231BR) 또는 높은-HER2 발현 (SKBR3, BT474, BBM 1 ) 종양 표적과의 72시간 공동-배양 후 CD8+ CAR T 세포에서의 PD-1 유도를 측정하고, 이러한 분석의 결과를 도 5c에 제시한다. 이들 연구는 HER2(EQ)BBξ가 HER2(EQ)28ξ보다 더 낮은 PD-1 유도를 유발한다는 것을 시사한다. 0.25:1 내지 2:1 범위의 이펙터:종양 (E:T) 비에 의한 종양 세포 사멸을 HER2(EQ)28ξ 또는 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포 둘 다에 대해 측정하였다. 이러한 분석의 결과를 도 5d에 제시하며, 이는 HER2(EQ)28ξ 및 HER2(EQ)BBξ가 둘 다 시험관내 종양 세포 사멸에 효과적이라는 것을 보여준다. MDA-MB-468 또는 BBM I 세포와의 72시간 공동-배양 후 HER2-CAR T 세포의 CFSE 증식을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 이러한 분석의 결과를 도 5e에 제시하며, 이는 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포가 HER2(EQ)28ξ CAR T 세포보다 더 증식된다는 것을 보여준다.
실시예 8: 생체내 항종양 활성
종양내로 전달된 HER2 CAR T 세포의 활성을 환자-유래 유방에서-뇌 전이 모델에서 평가하였다. 도 6a-6c는 종양의 H&E 염색이다. 마우스를 모의 (비형질도입됨) 또는 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포로의 종양 내 직접 주사에 의해 처리하였다. 도 6d-6f는 종양의 광학 영상화의 결과를 도시하고, 도 6g-6i는 종양 주사 후 제3일, 제8일 또는 제14일에 국부로 처리된 마우스에 대한 카플란-마이어 생존 곡선이다. 이들 연구는 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포가 종양 내로 직접 주사된 경우에 생체내에서 강력한 항종양 효능을 갖는다는 것을 보여준다.
유방에서-뇌 전이의 인간 이종이식편 모델에서 항종양 효능을 평가하기 위해, BBM1 세포 (0.2M) 또는 BT474 (0.15M)를 NSG 마우스에 두개내로 주사하였다. 종양 주사 후 제8일에, HER2(EQ)28ξ 또는 HER2(EQ)BBξ, 또는 모의 (비형질도입됨) T 세포 (IM)를 종양내로 주사하였다. BBM I (도 7a) 및 BT474 (도 7b) 종양을 루시페라제-기반 광학 영상화에 의해 모니터링하였다. 카플란 마이어 곡선을 도 7c 및 도 7d에 제시한다.
유방에서-뇌 전이의 인간 환자-유래 동소 이종이식편 모델을 사용하여 또한 HER2(EQ)28ξ 및 HER2(EQ)BBξ CAR T 세포를 평가하였다. 도 8a는 BBM l 세포 (0.2M)의 정위 주사에 의한 종양 이식 영역, 및 뇌실내 T 세포 전달을 예시한다. 종양의 염색을 도 8b에 도시한다. 종양 주사 후 제14일에, HER2(EQ)28ξ, HER2(EQ)BBξ, 또는 모의 (비형질도입됨) T 세포 (0.5M)를 종양내로 주사하였다. 종양 성장을 루시페라제-기반 광학 영상화에 의해 모니터링하였다. 도 8c는 각각의 처리 군에 대한 유동 평균을 제시하고, 도 8d는 각각의 처리 군에 대한 카플란 마이어 생존 곡선을 제시한다.
실시예 9: HER2에 대해 표적화된 추가의 CAR
도 9-14는 상이한 링커를 갖는 다양한 CAR의 아미노산 서열을 도시한다. 구체적으로, CAR은 HER2 표적화된 scFv 및 막횡단 도메인 사이 부분의 서열 및 길이에서 상이하다. 막횡단 도메인은 CD8, CD28 또는 CD28gg이다. 공동-자극 도메인은 4-1BB 또는 CD28이다. 모두 CD3ζ 자극 도메인을 갖는다. 각각의 경우에 T2A 스킵 서열은 CAR을 세포 추적에 사용되는 말단절단된 CD19 (CD19t) 단백질로부터 분리한다.
도 15a는 HER2 scFv 및 CD8 막횡단 도메인 사이 부분의 서열 및 길이를 제외하고 동일한 다양한 HER2 CAR을 개략적으로 도시한다. 모두 4-1BB 공동-자극 도메인에 이어 CD3ζ 자극 도메인을 포함한다. 도 15b는 표시된 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질감염된 TCM에서의 CD19 및 단백질 L 발현에 대한 검정의 결과를 도시한다. 이들 결과로부터 관찰할 수 있는 바와 같이, CD19 발현에 의해 평가된 바와 같은 형질감염 효율은 둘 다의 CAR에 대해 유사하였다. 그러나, 단백질 L 발현은 HER2(EQ)28ζ의 경우보다 HER2(EQ)BBζ의 경우에 더 낮았고, 이는 HER2(EQ)BBζ CAR이 HER2(EQ)BBζ보다 덜 안정하다는 것을 시사한다. 세포 확장의 분석 (도 15c)은 CAR 중 어떠한 것도 T 세포 확장을 방해하지 않는다는 것을 보여준다. 도 16-18은 매우 짧은 스페이서를 갖는 CAR (도 14)이 높은 수준의 HER2를 발현하는 CAR을 위해 상대적으로 선택적이라는 것을 보여주는 추가의 연구 결과를 보여준다. 이러한 CAR은 암성 세포보다 더 낮은 수준의 HER2를 발현하는 세포에 해를 끼치지 않는 것이 바람직한 경우의 HER2 발현 암을 치료하는데 유용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Priceman, Saul J. Forman, Stephen J. Brown, Christine E. <120> Chimeric Antigen Receptors Targeting HER2 <130> 40056-0021WO1 <140> PCT/US2016/060724 <141> 2016-11-04 <150> US 62/251,052 <151> 2015-11-04 <160> 42 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)..(245) <223> scEv targeted to HER2 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 2 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated IgG4 hinge region <400> 3 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (1)..(12) <400> 4 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric IgG4 mutated hinge and linker <400> 5 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly 20 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro 35 <210> 7 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 20 25 30 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 8 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 9 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric IgG4 hinge + <400> 9 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 20 25 30 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 35 40 45 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 50 55 60 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 65 70 75 80 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 85 90 95 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 100 105 110 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 115 120 125 Lys <210> 10 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated IgG4 <400> 10 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Gly Lys 225 <210> 11 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated IgG4 <400> 11 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu 1 5 10 15 Thr Ala Leu Phe Leu 20 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 16 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ile Phe Phe 20 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 20 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val 20 25 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 22 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 23 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated human <400> 23 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 24 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 25 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His 1 5 10 15 Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln 20 25 30 Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile 35 40 <210> 26 <211> 1027 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t <400> 26 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser 275 280 285 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 290 295 300 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 305 310 315 320 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 325 330 335 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 355 360 365 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 485 490 495 Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 500 505 510 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 515 520 525 Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 530 535 540 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 545 550 555 560 Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 565 570 575 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 580 585 590 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 595 600 605 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 610 615 620 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 625 630 635 640 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 645 650 655 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 660 665 670 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg 675 680 685 Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 690 695 700 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 705 710 715 720 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 725 730 735 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 740 745 750 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 755 760 765 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 770 775 780 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 785 790 795 800 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 805 810 815 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 820 825 830 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 835 840 845 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 850 855 860 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro 865 870 875 880 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 885 890 895 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 900 905 910 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 915 920 925 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 930 935 940 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 945 950 955 960 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 965 970 975 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly 980 985 990 Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 995 1000 1005 Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu 1010 1015 1020 Arg Arg Lys Arg 1025 <210> 27 <211> 1021 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t <400> 27 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser 275 280 285 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 290 295 300 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 305 310 315 320 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 325 330 335 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val 340 345 350 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 355 360 365 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 370 375 380 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 385 390 395 400 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 405 410 415 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 420 425 430 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 435 440 445 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 450 455 460 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 465 470 475 480 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 485 490 495 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 500 505 510 Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 515 520 525 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 530 535 540 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly 545 550 555 560 Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 565 570 575 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 580 585 590 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 595 600 605 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 610 615 620 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 625 630 635 640 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 645 650 655 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 660 665 670 Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 675 680 685 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu 690 695 700 Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu 705 710 715 720 Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys 725 730 735 Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg 740 745 750 Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly 755 760 765 Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn 770 775 780 Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro 785 790 795 800 Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser 805 810 815 Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys 820 825 830 Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys 835 840 845 Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile 850 855 860 Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln 865 870 875 880 Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu 885 890 895 Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp 900 905 910 Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu 915 920 925 Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu 930 935 940 Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His 945 950 955 960 Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro 965 970 975 Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala 980 985 990 Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile 995 1000 1005 Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 1010 1015 1020 <210> 28 <211> 843 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-CD8hinge-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t <400> 28 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Pro Thr Thr 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 275 280 285 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 290 295 300 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 305 310 315 320 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 325 330 335 Gly Gly Gly Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 340 345 350 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 355 360 365 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly 370 375 380 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 385 390 395 400 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 420 425 430 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 435 440 445 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 450 455 460 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 465 470 475 480 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 495 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 500 505 510 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe 515 520 525 Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu 530 535 540 Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys 545 550 555 560 Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser 565 570 575 Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly 580 585 590 Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser 595 600 605 Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu 610 615 620 Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu 625 630 635 640 Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu 645 650 655 Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met 660 665 670 Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu 675 680 685 Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu 690 695 700 Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys 705 710 715 720 Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His 725 730 735 Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp 740 745 750 Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu 755 760 765 Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly 770 775 780 Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu 785 790 795 800 Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr 805 810 815 Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His 820 825 830 Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 835 840 <210> 29 <211> 814 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-Hinge-Linker-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t <400> 29 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu 290 295 300 Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 305 310 315 320 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 325 330 335 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 340 345 350 Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 355 360 365 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 370 375 380 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 385 390 395 400 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 405 410 415 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 420 425 430 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 435 440 445 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 450 455 460 Pro Pro Arg Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys 465 470 475 480 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Leu Met Pro Pro Pro Arg 485 490 495 Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu 500 505 510 Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln 515 520 525 Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser 530 535 540 Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro 545 550 555 560 Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe 565 570 575 Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro 580 585 590 Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly 595 600 605 Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly 610 615 620 Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly 625 630 635 640 Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu 645 650 655 Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn 660 665 670 Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp 675 680 685 Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser 690 695 700 Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu 705 710 715 720 Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly 725 730 735 Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys 740 745 750 His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg 755 760 765 Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser 770 775 780 Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly 785 790 795 800 Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 805 810 <210> 30 <211> 921 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t <400> 30 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 290 295 300 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 305 310 315 320 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 325 330 335 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 340 345 350 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 355 360 365 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 370 375 380 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp 385 390 395 400 Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile 405 410 415 Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe 420 425 430 Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg 435 440 445 Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val 450 455 460 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 465 470 475 480 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 485 490 495 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 500 505 510 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 515 520 525 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 530 535 540 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 545 550 555 560 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu 565 570 575 Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 580 585 590 Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu 595 600 605 Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val 610 615 620 Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr 625 630 635 640 Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu 645 650 655 Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His 660 665 670 Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln 675 680 685 Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala 690 695 700 Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe 705 710 715 720 Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn 725 730 735 Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro 740 745 750 Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu 755 760 765 Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln 770 775 780 Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val 785 790 795 800 Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His 805 810 815 Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg 820 825 830 Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg 835 840 845 Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu 850 855 860 Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His 865 870 875 880 Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala 885 890 895 Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln 900 905 910 Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 915 920 <210> 31 <211> 927 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t <400> 31 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly 260 265 270 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 290 295 300 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 305 310 315 320 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 325 330 335 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 340 345 350 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 355 360 365 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 370 375 380 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val 385 390 395 400 Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr 405 410 415 Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly 420 425 430 His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg 435 440 445 Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 465 470 475 480 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 485 490 495 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 500 505 510 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 515 520 525 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 530 535 540 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 545 550 555 560 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 565 570 575 Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu 580 585 590 Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro 595 600 605 Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro 610 615 620 Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu 625 630 635 640 Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp 645 650 655 Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu 660 665 670 Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile 675 680 685 Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly 690 695 700 Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu 705 710 715 720 Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu 725 730 735 Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser 740 745 750 Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro 755 760 765 Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu 770 775 780 Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu 785 790 795 800 Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu 805 810 815 Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu 820 825 830 Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr 835 840 845 Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr 850 855 860 Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala 865 870 875 880 Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val 885 890 895 Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val 900 905 910 Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 915 920 925 <210> 32 <211> 808 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-Linker-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t <400> 32 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val 275 280 285 Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp 290 295 300 Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met 305 310 315 320 Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala 325 330 335 Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys 340 345 350 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 355 360 365 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 370 375 380 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 385 390 395 400 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 405 410 415 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 420 425 430 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 435 440 445 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly 450 455 460 Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu 465 470 475 480 Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu 485 490 495 Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys 500 505 510 Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser 515 520 525 Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys 530 535 540 Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met 545 550 555 560 Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met 565 570 575 Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp 580 585 590 Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg 595 600 605 Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg 610 615 620 Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys 625 630 635 640 Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro 645 650 655 Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp 660 665 670 Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro 675 680 685 Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro 690 695 700 Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro 705 710 715 720 Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala 725 730 735 Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr 740 745 750 Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp 755 760 765 Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr 770 775 780 Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg 785 790 795 800 Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 805 <210> 33 <211> 802 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-Linker-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t <400> 33 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 165 170 175 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 180 185 190 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 195 200 205 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 210 215 220 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 225 230 235 240 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 275 280 285 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys 290 295 300 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 305 310 315 320 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 325 330 335 Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 340 345 350 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 355 360 365 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 370 375 380 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 385 390 395 400 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 405 410 415 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 420 425 430 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 435 440 445 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly 450 455 460 Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met 465 470 475 480 Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu 485 490 495 Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn 500 505 510 Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln 515 520 525 Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser 530 535 540 Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp 545 550 555 560 Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys 565 570 575 Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val 580 585 590 Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu 595 600 605 Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser 610 615 620 Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys 625 630 635 640 Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg 645 650 655 Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly 660 665 670 Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg 675 680 685 Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu 690 695 700 Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val 705 710 715 720 Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly 725 730 735 Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu 740 745 750 Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly 755 760 765 Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys 770 775 780 Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg 785 790 795 800 Lys Arg <210> 34 <211> 658 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(L235E, N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val 465 470 475 480 Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala 485 490 495 Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser 500 505 510 Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His 515 520 525 Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly 530 535 540 Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 545 550 555 560 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 565 570 575 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 580 585 590 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 595 600 605 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 610 615 620 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 625 630 635 640 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 645 650 655 Pro Arg <210> 35 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 465 470 475 480 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys 485 490 495 Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg 500 505 510 Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro 515 520 525 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe 530 535 540 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 545 550 555 560 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 565 570 575 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 580 585 590 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 595 600 605 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 610 615 620 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 625 630 635 640 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 650 <210> 36 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-CD8hinge-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 245 250 255 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 260 265 270 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 275 280 285 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 290 295 300 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Gly Gly Gly Lys Arg Gly 305 310 315 320 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 325 330 335 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 340 345 350 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg 355 360 365 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 370 375 380 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 385 390 395 400 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 405 410 415 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 420 425 430 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 435 440 445 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 450 455 460 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 37 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-Hinge-Linker-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ile Tyr Ile Trp Ala 260 265 270 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 275 280 285 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 290 295 300 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 305 310 315 320 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys 325 330 335 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 340 345 350 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 355 360 365 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 370 375 380 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 385 390 395 400 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 405 410 415 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 420 425 430 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 445 <210> 38 <211> 552 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu 260 265 270 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 275 280 285 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 290 295 300 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 305 310 315 320 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 325 330 335 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 340 345 350 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 355 360 365 Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 370 375 380 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys 385 390 395 400 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 405 410 415 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 420 425 430 Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 435 440 445 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 450 455 460 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 465 470 475 480 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 485 490 495 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 500 505 510 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 515 520 525 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 530 535 540 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 545 550 <210> 39 <211> 558 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-IgG4(HL-CH3)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu 260 265 270 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 275 280 285 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 290 295 300 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 305 310 315 320 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 325 330 335 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 340 345 350 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 355 360 365 Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 370 375 380 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 385 390 395 400 Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn 405 410 415 Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr 420 425 430 Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val 435 440 445 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 450 455 460 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 465 470 475 480 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 485 490 495 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 500 505 510 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 515 520 525 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 530 535 540 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 545 550 555 <210> 40 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-Linker-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Met 245 250 255 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 260 265 270 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 275 280 285 Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 290 295 300 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 305 310 315 320 Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 325 330 335 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 340 345 350 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 355 360 365 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 370 375 380 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 385 390 395 400 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 405 410 415 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 420 425 430 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 <210> 41 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric Her2scFv-Linker-CD8tm-41BB-Zeta-T2A-CD19t minus leader, TSA or CD19t <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile 165 170 175 Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp 210 215 220 Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ile 245 250 255 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 260 265 270 Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 275 280 285 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 290 295 300 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly 305 310 315 320 Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 325 330 335 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 340 345 350 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 355 360 365 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 370 375 380 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 385 390 395 400 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 405 410 415 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 420 425 430 Arg <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge-linker domain <400> 42 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Ser Gly 20

Claims (32)

  1. HER2 표적화 서열; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ξ 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, HER2 표적화 도메인이 HER2 scFv인 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, HER2 scFv가 아미노산 서열:
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS
    또는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 HER2 표적화 서열; CD4 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ξ 막횡단 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 1-2개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, HER2 표적화 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치하는 스페이서 영역을 포함하는 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 스페이서 영역이 5-300개의 아미노산을 포함하는 것인 핵산 분자.
  7. 제5항에 있어서, 스페이서 영역이 서열식별번호: 2-12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서, 스페이서가 IgG 힌지 영역을 포함하는 것인 핵산 분자.
  9. 제6항에 있어서, 스페이서가 10-50개의 아미노산을 포함하는 것인 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 공동자극 도메인이 서열식별번호: 24의 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 4-l BB 공동자극 도메인인 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서, CD3ξ 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  12. 제1항에 있어서, 3 내지 15개의 아미노산의 링커가 공동자극 도메인 또는 그의 변이체와 CD3 ξ 신호전달 도메인 또는 그의 변이체 사이에 위치하는 것인 핵산 분자.
  13. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 분자.
  14. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 4-l BB 공동자극 도메인 및 서열식별번호: 2-12 중 어느 것의 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 스페이서 영역을 포함하는 것인 핵산 분자.
  15. 제1항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  16. 제1항에 있어서, 1-5개의 아미노산 변형이 1 또는 2개의 아미노산 변형인 핵산 분자.
  17. 제1항에 있어서, 1-5개의 아미노산 변형이 1-5개의 아미노산 치환인 핵산 분자.
  18. HER2 표적화 서열; CD4 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD8 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, CD28 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체, 및 CD3ξ 막횡단 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 막횡단 도메인; CD28 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체 및 4-IBB 공동자극 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체로부터 선택된 공동자극 도메인; 및 CD3ξ 신호전달 도메인 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 인간 T 세포의 집단.
  19. 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터를 포함하는 인간 T 세포의 집단.
  20. 제19항에 있어서, T 세포가 중앙 기억 T 세포의 집단으로 구성된 것인 인간 T 세포의 집단.
  21. 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 자가 또는 동종 인간 T 세포의 집단을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 HER2 발현 뇌암을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 인간 T 세포의 집단이 CD62L+ 기억 T 세포를 포함하는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 암이 유방에서 뇌로의 전이인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 형질도입된 인간 T 세포가, 환자로부터 T 세포를 수득하는 단계, T 세포를 처리하여 중앙 기억 T 세포를 단리하는 단계, 및 중앙 기억 세포의 적어도 일부를 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 방법.
  25. 제21항에 있어서, T 세포가 종양내로 투여되는 것인 방법.
  26. 제21항에 있어서, T 세포가 뇌실내로 투여되는 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, T 세포가 종양에 인접한 뇌실내로 투여되는 것인 방법.
  28. 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  29. 서열식별번호: 26 및 27로부터 선택된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열 또는 1-5개의 아미노산 변형을 갖는 그의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 T 세포.
  30. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 26-41 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  31. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체가 HER2 표적화 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치하는 스페이서 영역을 포함하는 것인 핵산 분자.
  32. 제31항에 있어서, 스페이서 영역이 서열식별번호: 9, 7, 3 및 2 중 어느 것의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 3에 이어 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산 분자.
KR1020187015769A 2015-11-04 2016-11-04 Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체 KR20180083874A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562251052P 2015-11-04 2015-11-04
US62/251,052 2015-11-04
PCT/US2016/060724 WO2017079694A2 (en) 2015-11-04 2016-11-04 Chimeric antigen receptors targeting her2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20180083874A true KR20180083874A (ko) 2018-07-23

Family

ID=58662864

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187015769A KR20180083874A (ko) 2015-11-04 2016-11-04 Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11197919B2 (ko)
EP (2) EP3371227B8 (ko)
JP (3) JP6932709B2 (ko)
KR (1) KR20180083874A (ko)
CN (2) CN116063574A (ko)
AU (2) AU2016349722A1 (ko)
BR (1) BR112018009129A2 (ko)
CA (1) CA3004306A1 (ko)
ES (1) ES2909973T3 (ko)
IL (2) IL259120B (ko)
MX (2) MX2018005674A (ko)
RU (1) RU2753695C2 (ko)
WO (1) WO2017079694A2 (ko)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015259877B2 (en) 2014-05-15 2021-02-25 National University Of Singapore Modified natural killer cells and uses thereof
ES2909973T3 (es) * 2015-11-04 2022-05-10 Hope City Receptores quiméricos para el antígeno que se dirigen a HER2
IL287889B2 (en) * 2016-02-05 2024-03-01 Hope City Administration of transgenic T cells for the treatment of central nervous system cancer
CN110944651A (zh) 2017-02-08 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途
CA3235295A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CN117384929A (zh) 2017-03-27 2024-01-12 新加坡国立大学 一种编码由细胞表达的嵌合受体的多核苷酸
WO2018182511A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 National University Of Singapore Stimulatory cell lines for ex vivo expansion and activation of natural killer cells
US12116417B2 (en) 2017-11-14 2024-10-15 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
US11649294B2 (en) * 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
CN109608547B (zh) * 2017-12-29 2022-03-15 郑州大学第一附属医院 表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
US11884733B2 (en) 2018-02-08 2024-01-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
US20210054409A1 (en) * 2018-02-09 2021-02-25 National University Of Singapore Adhesion Receptor Constructs and Uses Thereof in Natural Killer Cell Immunotherapy
MX2020008287A (es) * 2018-02-11 2021-01-08 Univ California Células t con receptor de antígeno quimérico (car-t) y enfermedades autoinmunes.
SG10201801219VA (en) * 2018-02-13 2019-09-27 Agency Science Tech & Res Anti-HER2 Antibodies
US20210252058A1 (en) * 2018-05-17 2021-08-19 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric antigen receptors with myd88 and cd40 costimulatory domains
EA202091888A1 (ru) * 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
WO2020191336A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Yamaguchi, Yukiko Composition and method for reducing expression of checkpoint inhibitors in t cells expressing a car or ctl
WO2021151119A1 (en) * 2020-01-23 2021-07-29 Exuma Biotech Corp. Chimeric antigen receptors to her2 and methods of use thereof
KR20230024911A (ko) * 2020-05-22 2023-02-21 주식회사 지씨셀 항-her2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
CN112481284B (zh) * 2020-12-07 2023-07-25 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用
US20240226297A9 (en) * 2021-03-02 2024-07-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting t regulatory cells to islet cells to stall or reverse type 1 diabetes
JP2024514308A (ja) 2021-03-30 2024-04-01 シティ・オブ・ホープ ＣＡＲ Ｔ細胞療法及びＩＦＮγ
WO2023274385A1 (zh) * 2021-07-01 2023-01-05 宁波茂行生物医药科技有限公司 靶向her2的通用型car-t细胞及其制备方法
EP4376859A2 (en) 2021-07-29 2024-06-05 Sonoma Biotherapeutics, Inc. Synovial extracellular matrix-specific chimeric antigen receptor for targeting regulatory t cells to treat autoimmune diseases
CN116023491A (zh) 2021-10-25 2023-04-28 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗cd26抗体及其应用
WO2023172514A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
AU2023232168A1 (en) 2022-03-10 2024-09-19 City Of Hope Membrane-bound il-12 for cellular immunotherapy
MX2024008227A (es) * 2022-04-08 2024-07-19 Fate Therapeutics Inc Celulas que tienen cadena principal dirigida a tumores solidos y uso de estas.
CN114805584B (zh) * 2022-06-30 2022-09-09 上海优替济生生物医药有限公司 抗原结合蛋白及其用途

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1171468E (pt) * 1999-04-09 2008-10-08 Univ Zuerich Processo para a estabilização de imunoglobulinas quiméricas ou fragmentos de imunoglobulinas quiméricas e um fragmento de scfv anti-gep-2 estabilizado
SI1771482T1 (sl) * 2004-07-22 2014-12-31 Genentech, Inc. Sestavek HER2 protitelesa
BRPI0811857A2 (pt) * 2007-05-14 2014-10-21 Biogen Idec Inc Regiões fc (scfc) de cadeia simples, polipeptídeos de aglutinação que as compreendem e métodos relacionados.
JP5956342B2 (ja) 2009-11-03 2016-07-27 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 形質導入Ｔ細胞選択のためのトランケート上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）
WO2011137245A2 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Lytic-peptide-her2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) ligand conjugates and methods of use
US8491908B2 (en) * 2010-06-01 2013-07-23 Canon Kabushiki Kaisha Composite particle, contrast agent for photoacoustic imaging, and method for producing the composite particle
WO2012050374A2 (en) * 2010-10-13 2012-04-19 Innocell, Inc. Immunotherapy for solid tumors
MX359513B (es) 2011-03-23 2018-10-01 Hutchinson Fred Cancer Res Metodo y composiciones para inmunoterapia celular.
RU2616881C2 (ru) * 2011-06-06 2017-04-18 Ново Нордиск А/С Терапевтические антитела
RS61345B1 (sr) 2012-08-20 2021-02-26 Hutchinson Fred Cancer Res Postupak i kompozicije za ćelijsku imunoterapiju
US9096840B2 (en) * 2012-10-04 2015-08-04 Research Development Foundation Serine protease molecules and therapies
US10117896B2 (en) * 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
KR102460297B1 (ko) 2012-10-30 2022-10-28 에스퍼란스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 항체/약물 컨쥬게이트 및 이의 사용 방법
AU2013204922B2 (en) * 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
US9657105B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
EP3039040B1 (en) 2013-08-26 2021-12-22 Hinrich Abken Anti cd30 chimeric antigen receptor and its use
CN107074957B (zh) 2014-01-13 2021-05-07 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
EP3134437A1 (en) * 2014-04-23 2017-03-01 Board of Regents, The University of Texas System Chimeric antigen receptors (car) for use in therapy and methods for making the same
ES2909973T3 (es) * 2015-11-04 2022-05-10 Hope City Receptores quiméricos para el antígeno que se dirigen a HER2

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017079694A2 (en) 2017-05-11
MX2018005674A (es) 2019-01-10
CA3004306A1 (en) 2017-05-11
CN108779174A (zh) 2018-11-09
JP2023100653A (ja) 2023-07-19
AU2016349722A1 (en) 2018-05-24
MX2022013498A (es) 2022-11-16
EP3371227A2 (en) 2018-09-12
IL259120B (en) 2022-05-01
CN108779174B (zh) 2022-11-29
IL259120A (en) 2018-06-28
EP3371227B8 (en) 2022-04-06
WO2017079694A3 (en) 2017-07-20
JP2019500894A (ja) 2019-01-17
CN116063574A (zh) 2023-05-05
EP4074731A1 (en) 2022-10-19
JP6932709B2 (ja) 2021-09-08
JP2021192617A (ja) 2021-12-23
ES2909973T3 (es) 2022-05-10
EP3371227B1 (en) 2022-02-23
RU2018118817A3 (ko) 2020-03-11
RU2753695C2 (ru) 2021-08-19
AU2022200116A1 (en) 2022-02-10
IL292222A (en) 2022-06-01
US11197919B2 (en) 2021-12-14
RU2018118817A (ru) 2019-12-05
US20220265796A1 (en) 2022-08-25
JP7264954B2 (ja) 2023-04-25
BR112018009129A2 (pt) 2019-02-26
EP3371227A4 (en) 2018-09-12
US20180326032A1 (en) 2018-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7264954B2 (ja) Ｈｅｒ２を標的とするキメラ抗原受容体
AU2021200122B2 (en) CS1 Targeted Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells
JP7297854B2 (ja) Ｐｓｃａを標的とするキメラ抗原受容体
US20220177528A1 (en) Chimeric antigen receptors containing a chlorotoxin domain
CA2961654A1 (en) Costimulatory chimeric antigen receptor t cells targeting il13r.alpha.2

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal