CN116023491A - 抗cd26抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与人CD26结合的抗体及其抗原结合片段，及它们在制备治疗高表达CD26肿瘤的药物中的应用。本发明一方面提供了一种CD26鼠源抗体及抗原结合片段，其显示出比其他鼠抗更好的肿瘤细胞杀伤活性。本发明还提供了以上述鼠抗为亲本抗体获得的嵌合抗体或人源化抗体，它们显示出更好的抗原亲和力及良好的安全性、有效性。本发明的另一个方面提供了靶向CD26的双特异性T细胞接合器，相比现有CD26单克隆全长抗体在保证安全性的基础上，药效显著提高，在疾病治疗中有进一步降低给药剂量，降低不良反应发生率的可能。

Description

抗CD26抗体及其应用
技术领域
本发明涉及与人CD26结合的抗体及其抗原结合片段，及其在制备治疗高表达CD26肿瘤的药物中的应用。
背景技术
CD26是一种多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，也可以以溶解形式存在于血浆中。 CD26常以同源二聚体形式存在，其单体含766个氨基酸，相对分子质量约110kDa。 CD26氨基酸残基从内向外分为5个部分：胞内区(1～6)、跨膜区(7～28)、高度糖基化区(29～323)、富含半胱氨酸区(324～551)和C端催化结构域(552～766)，其分子三维结构与功能密切相关。CD26(DPP4)抑制剂在临床上用于Ⅱ型糖尿病的治疗已有数十年的历史。CD26在多种肿瘤细胞表面的表达量明显升高，例如，如恶性间皮瘤，肾癌，前列腺癌，肺癌等，对于这类型CD26表达量较高的肿瘤，CD26是一种具有重要价值的作用靶点(CD26/DPP4-a potential biomarkerand target for cancer therapy,Pharmacology&Therapeutics(2019),198: 135-159)。
目前以人CD26为靶点的靶向性抗癌药物研究进展最快的是Y’S Therapeutics 公司的单克隆抗体YS110，已完成了I/Ⅱ期临床实验。但根据已有文献资料分析可知，YS110的临床前研究已存在体内外活性均较低的问题，如在文献“A humanized anti-CD26monoclonal antibody inhibits cell growth of malignant mesothelioma viaretarded G2/M cell cycle transition,Cancer Cell Int(2016)16:35”中，在YS110的浓度为250ug/ml，作用48h以后，对肿瘤细胞株生长的抑制率为18.3％，则IC50值远远高于250ug/ml，足见其体外的活性较低；又如在专利“抗CD26抗体及其使用方法(申请号：CN200680034937.4)”中，展示了YS110对多种CD26高表达细胞株的小鼠肿瘤模型的治疗，YS110仅能一定程度缩小肿瘤体积，缓解肿瘤生长，并不能完全抑制肿瘤生长实现肿瘤的治愈，可见其在动物模型中的活性仍然不理想。 YS110已经完成的临床二期研究结果显示，YS110具有较好的耐受性，但疾病控制率未达到预期，这与YS110在临床前研究中所表现出来的低活性相对应。
尽管在文献资料中有报道CD26的广泛分布，但YS110的使用仍然具有较好的安全性，足见其在临床使用中的安全性有较好的保障。在接受实验的31例患者中，未出现患者死亡，所表现出来的副作用主要为，16.1％的患者有输液不良反应，9.7％的患者出现呃逆，6.5％的患者出现腹泻等。(Phase 2 Study of YS110,a Recombinant Humanized Anti-CD26 Monoclonal Antibody,in Japanese Patients With Advanced Malignant PleuralMesothelioma,JTO Clinincal and Research Reports(2021),2(6))
综上所述，尽管CD26靶点的安全性已在临床试验中得到验证，但以CD26为治疗靶点的抗体对肿瘤治疗难以取得较好的治疗效果。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种更有效、更安全的CD26 抗体或抗原结合片段。
本发明提供的与人CD26特异性结合的抗体或抗原结合片段，包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的 HCDR3；以及包含SEQ ID NO:4所示的LCDR1、SEQ ID NO:5所示的LCDR2 和SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
所述抗体或抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的重链可变区，以及包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
所述抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 9或SEQID NO:10内的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
所述抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:9的重链可变区和包含SEQ ID NO:10的轻链可变区。
本发明的第二个目的在于提供一种含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)。
本发明含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，由两个具有抗原特异性的单链可变片断(scFv)通过接头连接而成，其中一个scFv 靶向识别CD26，另一个scFv靶向识别CD3。所述靶向识别CD26的scFv由CD26抗体重链可变区和CD26抗体轻链可变区通过接头连接而成。
所述靶向识别CD26的scFv包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2 所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及包含SEQ ID NO:4所示的 LCDR1、SEQ ID NO:5所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
所述靶向识别CD26的scFv包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的重链可变区，以及包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示至少90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
所述靶向识别CD26的scFv，其中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 9或SEQID NO:10内的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
所述靶向识别CD26的scFv，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:9的重链可变区和包含SEQ ID NO:10 的轻链可变区。
所述靶向识别CD3的scFv源自OKT-3、L2K、TR66、UCHT1、SP34、IORT3、Catumaxomab、Blinatumomab、Solitomab等本领域已知的CD3抗体序列。比如 SEQ ID NO:11所示的抗CD3重链可变区，SEQ ID NO:12所示的抗CD3轻链可变区。
所述scFv中接头选用本领域常用的接头，如KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSTSGGGSGGGSGGGGSS、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、(GGGGS)n，其中n为1-5的整数，优选n为1-3的整数，优选n为3，如SEQ ID NO： 13所示。
所述连接两个scFv的接头选用本领域常用的接头，如(GGGGS)n，其中n为 1-5的整数，优选n为1-3的整数，优选n为1，如SEQ ID NO:14所示。
作为优选，含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器，其氨基酸序列如SEQ ID NO:15(18G272 BITE氨基酸序列)或SEQ ID NO:16 (19G294 BITE氨基酸序列)所示。
本发明还涉及编码所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还涉及包含所述核酸的载体、包含所述核酸的宿主细胞。
本发明还涉及用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞，从培养物中回收抗体或抗原结合片段。
本发明还涉及包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
本发明还涉及一种治疗肿瘤的方法，其包括向患者给予有效量的所述抗体或抗原结合片段；所述肿瘤高表达CD26，包括但不限于肾癌、间皮瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌等。所述抗体或抗原结合片段单独给予，或者与其它抗癌剂联合给予。
本申请相比现有技术具有如下优势：
第一个方面，本申请筛选的鼠源抗体优势明显。
本申请筛选的鼠源抗体对人源肿瘤细胞的裂解强度远远高于其他鼠源抗体。进一步的，理论上成功的人源化抗体与人源细胞的亲和力远超亲本鼠源抗体，对该肿瘤细胞也会有更强的裂解，而本申请筛选的鼠抗对人源肿瘤细胞的杀伤已经与完成临床二期的人源化抗体YS110相当，更充分证明了62号鼠抗的优势。
此外，本申请筛选到的鼠抗来源的嵌合抗体或人源化抗体相比其他鼠抗来源的相应抗体点杂交活性更好、与抗原的亲和力更佳。
更进一步地，相比其他鼠抗来源BITE，本申请鼠抗来源的BITE，显示出更好的安全性、有效性。
第二个方面，本申请靶向CD26的双特异性T细胞接合器相比现有CD26单克隆全长抗体或现有CD26抗体来源的BITE更有效、更安全。
有效性方面，在体外比较BITE介导的PBMC对不同靶细胞的细胞毒性作用时，源于62号鼠单克隆抗体的不同CD26人源化BITE对多种肿瘤细胞的杀伤均优于CD26抗体序列来源于YS110的BITE。在动物实验中本申请BITE在多种模型中均能显著抑制肿瘤生长，部分模型能完全抑制肿瘤生长，显著优于CD26 抗体序列来源于YS110的BITE。
安全性方面，在本发明BITE未到达肿瘤部位时，不会引起明显的T细胞活化；抗体与肿瘤细胞结合后，才会引起肿瘤组织周围的T细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞。同时本发明的BITE不会介导PBMC对PBMC细胞产生细胞毒效应。并且在同等条件下，相比YS110来源的BITE，本申请鼠抗来源BITE具有诱导 T细胞分泌的细胞因子量更低，细胞因子风暴相对较低时会具有更高的安全性。在动物实验中本申请BITE耐受性好，相比模型组能明显提高动物存活率。
说明书附图
图1：人源化双特异抗体点杂交活性检测
其中图1a是人源化双特异抗体18G272与18G278点杂交活性检测，图1b人源化双特异抗体19G294点杂交活性检测
图2：流式细胞术检测抗体与靶细胞抗原结合的特异性
图3：人源化双特异性抗体介导的PBMC细胞对PBMC细胞的细胞毒效应
图4：18G272、19G294在PC-3细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化
图5：18G272、19G294在PC-3细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物体重变化
图6：18G272在NCI-H596细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化
图7：19G294在A498细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化
图8：17G29、19G292在OS-RC-2细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图9：18G272组、19G292在OS-RC-2细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积
图10：18G272组、19G292在OS-RC-2细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物存活率
图11：18G272在OS-RC-2细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化
图12：19G294在OS-RC-2细胞NOD-SCID小鼠皮下移植模型中的动物肿瘤体积变化
具体实施方式
除非在本文中明确定义，否则本文使用的技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
单数形式词语如“一个(a、an)”“所述(the)”包括它们对应的复数指示物。
术语“或”意指“和/或”，并可与“和/或”互换使用。
术语“CD26”又称二肽基肽酶(DPP4，dipeptidyl peptidase 4)，人CD26氨基酸序列能以登录号NP_001926.2在Genbank中找到，其cDNA序列能以登录号 NM_001935.3在Genbank中找到。
术语“保守氨基酸取代”意指用新的氨基酸取代原始氨基酸，新的氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能特性，例如其对CD26的结合亲和力。氨基酸的常见保守取代是本领域熟知的，例如Ala可被保守取代为Gly、Ser； Arg可被保守取代为Lys、His；Asn可被保守取代为Gln、His等。术语“亲和力”是指抗体与抗原之间相互作用的强度。抗体可变区通过非共价力与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。
术语“抗体”是指可以非共价地、可逆地且以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白家族。例如，天然存在的IgG抗体是四聚体，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重链和两条轻链。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL可以进一步细分为具有高变性的互补决定区(CDR，又称高变区)，以及更保守的框架区(FR)。每个 VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列： FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。HCDR1、HCDR2、HCDR3为三个重链互补决定区，LCDR1、LCDR2、LCDR3为三个轻链链互补决定区。CDR 和框架区的位置可以使用各种本领域熟知的编号系统来确定，例如Kabat、Chothia、IMGT等，本申请采用IMGT确定。重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)负责抗原识别，尤其是其中的互补决定区(CDR)，通常对抗原的不同表位具有特异性。恒定区主要负责效应子功能。
术语“单克隆抗体”意指基本上同质的抗体群体，即除了少量存在的可能天然发生的突变，群体中包含的抗体分子的氨基酸序列是相同的。相比之下，多克隆抗体通常包括在其可变结构域(特别是其互补决定区)中具有不同氨基酸序列的多种不同抗体。单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法获得。参见例如Kohler等人,Nature 1975 256:495-497；美国专利号4,376,110；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY1992；Harlow等人,ANTIBODIES:ALABORATORY MANUAL,Coldspring Harbor Laboratory1988；以及Colligan等人,CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY 1993。本公开文本采用杂交瘤技术获得单克隆抗体，该方法是获得单克隆抗体已知的众多方法之一。
术语“鼠源抗体”指仅包含大鼠或小鼠免疫球蛋白序列的的抗体。
术语“嵌合抗体”的可变区来自非人(例如，鼠)抗体序列，其余部分来自人抗体序列。
术语“人源化抗体”CDR区来自非人(例如，鼠)抗体序列，其余部分来自人抗体序列。非人抗体的人源化形式通常包含亲本非人抗体相同的CDR序列，尽管可以包括某些氨基酸取代以增加亲和力、提高人源化抗体的稳定性、去除翻译后修饰或者出于其他原因。
术语“双特异性抗体”，是拥有两种相同或不同的特异性抗原结合位点的抗体。
术语“BITE”是一种双特异性抗体，全称“双特异性T细胞接合器”，由两个具有抗原特异性的单链可变片断(single chain variable fragment，scFv)通过接头连接而成，其中一个scFv靶向识别肿瘤相关表面抗原，另一个scFv靶向识别T细胞表面CD3。单链可变片断(scFv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过接头连接而成。“接头”是用于将不同蛋白片段连接起来的氨基酸序列，针对接头的设计和选择已有诸多相关研究。在BITE中，接头连接一个重链可变区与一个轻链可变区组成scFv，也串联两个scFv并允许它们自由旋转，一般由GGGGS 重复结构组成(S代表丝氨酸，G代表甘氨酸)，甘氨酸分子量小、侧链短可增加侧链的柔韧性，丝氨酸较强的亲水性可增加肽链的亲水性。优化重复结构的数目不仅可以帮助scFv中轻链与重链以正确构象缔合，并可以通过影响两个 scFv之间的距离以促进T细胞和靶细胞在免疫突触中的最佳交互作用(周冲等. 双特异性单链抗体BITE的研究进展[J].生物学杂志,2018”)。在scFv中连接重链可变区与轻链可变区的接头常用KESGSVSSEQLAQFRSLD、 EGKSSGSGSESKST、GSTSGGGSGGGSGGGGSS(US20180326032)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(Preclinical Development of Bivalent Chimeric AntigenReceptors Targeting Both CD19 and CD22)等。在本申请具体的实施例中，连接一个重链与一个轻链组成scFv的柔性接头由3个GGGGS重复结构组成，串联两个scFv的柔性接头为GGGGS，本领域技术人员可以依据已有技术的教导，通过常规实验方法和有限次试验从已知接头中选择确定，可以对两种柔性结构中GGGGS的重复数量进行优化，也可以采用除GGGGS外的其他柔性接头。
CD3是T细胞信号传导的组成部分。当BITE分子同时与T细胞和肿瘤细胞结合时，T细胞被激活，促进CD8+T细胞直接分泌穿孔素和颗粒酶，CD4+T细胞分泌细胞因子进一步招募活化杀伤性T细胞，从而杀伤肿瘤细胞。CD3抗体序列可选自OKT-3、L2K、TR66、UCHT1、SP34、IORT3、Catumaxomab、Blinatumomab、 Solitomab等本领域已知的CD3抗体序列。在本申请具体的实施例中采用 Solitomab中CD3抗体序列，本领域技术人员可以通过常规实验方法和有限次试验从其他已知CD3抗体中选择确定，而不局限于本申请具体实施例中特定的CD3抗体序列。
术语“嵌合BITE双特异性抗体”在本文中指鼠源CD26 scFv通过接头连接人源化CD3 scFv。
术语“给予”(“administration”、“administering”)、“治疗”(“treating”和“treatment”)指外源性药剂、治疗剂、诊断剂与受试者的组织、器官、细胞或生物流体的接触。“治疗”指减缓或阻止疾病临床症状的发展，或者指缓解或改善至少一种物理参数，或者指预防疾病的进展。
实施例1.抗人CD26杂交瘤细胞株的制备与筛选
步骤1：动物免疫
根据GenBank已公开的CD26的cDNA序列(GenBank登录号：NM_001935.3)设计rCD26表达载体，在密码子5’端引入组氨酸标签，进行全基因合成，连接到 pCHO1.0质粒中，CHO-S宿主细胞表达、纯化。将制备的重组CD26靶蛋白按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。
步骤2：细胞融合
(1).脾脏细胞的制备
将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡 10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
(2).饲养细胞的制备
取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；
取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。
(3).细胞融合
选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与2×107个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10 分钟后弃上清，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640 HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。
将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％ 1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。
步骤3：抗CD26特异性杂交瘤细胞株筛选
(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组CD26靶蛋白至1μg/ml，包被 96孔ELISA酶标板，100μl/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％BSA的 PBST缓冲液封闭(200μl/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。
(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μl/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔稀释后HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μl的2MH2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。
步骤4：CD26鼠单抗体活性评价
在786-0细胞反应体系中，786-0细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，每组设置3个复孔，在相应样品孔的反应孔中分别加入50ul终浓度为100ng/ml的CD26鼠源抗体，在空白对照孔中加入50ul培养基对照，在阳性对照孔中加入50ul终浓度为1％TritonX-100，37℃培养箱中孵育30min，再按E/T为10:1的比例加入浓度为6×106cells/ml的PBMC细胞(外周血单个核细胞)，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。细胞裂解率用公式为：Vsample-Vvehicle control/VTritonX-100-Vvehicle control×100％。(其中Vsample为药物处理组在激发光波长和发射光波长条件下测得的荧光信号读数的平均值，Vvehicle control为空白对照组在激发光波长和发射光波长条件下测得的荧光信号读数的平均值， VTritonX-100为阳性对照组在激发光波长和发射光波长条件下测得的荧光信号读数的平均值。)
表1鼠源抗体介导的PBMC对靶细胞786-0的细胞毒效应检测
鼠源抗体编号 72 160 62 51 212 YS110
细胞裂解率 8.6％ 13.0％ 53.1％ 12.3％ 11.3％ 56.6％ 
从上述结果可知，在抗体浓度为100ng/ml，作用5h的条件下，62号鼠抗介导的PBMC对靶细胞786-0的细胞裂解率为53.1％，对靶细胞786-0的裂解强度远远高于其它鼠源单克隆抗体72、160、51、212，已与人源化抗体YS110接近。
786-0是人源肿瘤细胞，理论上成功的人源化抗体与人源细胞的亲和力远超亲本鼠源抗体，对该肿瘤细胞也会有更强的裂解。本申请筛选到的62号鼠抗对人源肿瘤细胞的杀伤已经与完成临床二期的人源化抗体YS110相当，证明了62 号鼠抗的优势。本领域技术人员可以合理预期，以62号鼠抗为亲本抗体的人源化抗体对人源肿瘤细胞的杀伤将优于62号鼠抗本身，也优于YS110，这在实施例11中也得到了验证。
实施例2.杂交瘤细胞株可变区序列测序筛选
步骤1.CD26杂交瘤细胞总RNA的提取
将杂交瘤细胞株传代至T75培养瓶中培养，至细胞汇合至90％左右消化、离心收集细胞，使用RNA提取试剂盒(购自Roche)对单克隆杂交瘤细胞株进行总RNA提取。然后分别以总RNA为模板，使用cDNA反转录试剂盒(购自 Thermo)逆转录扩增其cDNA第一链，反应产物存放于-20℃，长期储存，需要储存于-70℃。
步骤2.PCR扩增重、轻链可变区基因
分别以杂交瘤细胞cDNA第一链为模板，在50μl反应体系中，分别加入 cDNA 1μl，10×PCR缓冲液5μl，上游及下游引物各1μl(25pmo1)，dNTP1μl， 25mmol/L MgCl2 1μl，H2O39μl，95℃预变性10min，加Taq酶1μl，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为94℃。变性1min，58℃。退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，然后72℃保温10min。取5μl PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。
步骤3.重链及轻链可变区基因的克隆和序列测定
按照pGM-T Fast连接试剂盒说明书(北京天根生化科技有限公司，VT207- 02)，将重、轻链可变区基因分别与pGM-T载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞中，蓝白斑筛选，37℃培养12-16h。
将得到的白色菌落接种含有终浓度为100μl的氨苄青霉素1-5ml LB培养基中，37℃摇床振荡3-4h后，PCR筛选插入正确序列克隆。同时将PCR筛选阳性克隆测序，测定结果通过计算机网络基因库IMGT比较分析获得抗体的重链、轻链可变区、CDR区的氨基酸序列。
其中62号鼠抗包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的 HCDR2、SEQ IDNO:3所示的HCDR3；SEQ ID NO:4所示的LCDR1、SEQ ID NO:5所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3。其重链可变区如SEQ ID NO:32所示、轻链可变区如SEQ ID NO:33所示。
实施例3.嵌合BITE双特异性抗体设计
根据实施例1获得的鼠源单克隆抗体72、160、62、51经实施例2中的方法测序得到的重轻链序列，设计出同时靶向CD26与CD3的双特异性抗体：
靶向第一抗原CD26轻链可变区以连接短肽(如SEQ ID NO:13)连接CD26 重链可变区进行融合成CD26单链抗体区，分别为源于72号鼠抗的单链抗体(如 SEQ ID NO:17)，源于160号鼠抗的单链抗体(如SEQ ID NO:18)，源于62号鼠抗的单链抗体(如SEQ ID NO:19)，源于51号鼠抗的单链抗体(如SEQ ID NO:20)。
靶向第二抗原CD3蛋白的单链抗体序列由重链可变区(如SEQ ID NO:11)与轻链可变区(如SEQ ID NO:12)通过连接短肽(如SEQ ID NO:13)连接形成。
四种第一识别区序列与1种第二识别区序列以连接短肽(如SEQ ID NO:14)融合形成BITE结构双特异性抗体，形成四种BITE序列，分别为源于72号鼠抗的17G105(如SEQ IDNO:21)，源于160号鼠抗的17G108(如SEQ ID NO:22)，源于62号鼠抗的17G61(如SEQ ID NO:23)，源于51号鼠抗的17G131(如 SEQ ID NO:24)。
实施例4.抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体的表达质粒构建、表达及纯化
将上述CD26单链抗体氨基酸序列(SEQ ID NO:17-20)的上游添加鼠(Musmusculus)IgG k信号肽序列(如SEQ ID NO:25)并按照哺乳动物细胞CHO 密码子偏爱性进行优化，得到优化后的CD26单链抗体基因序列(SEQ ID NO： 26-29)并在上游引入AvrII酶切位点和kozak序列。将Solitomab CD3单链抗体氨基酸序列进行密码子优化得到优化后基因序列(SEQ ID NO:30)，并在该基因上游添加连接短肽基因(如SEQ ID NO:31)，在基因下游添加终止密码子和BstZ17I酶切位点。即将上述优化后AvrII酶切位点、kozak序列、信号肽、CD26单链抗体序列分别与CD3单链抗体、终止密码子和BstZ17I酶切位点通过连接肽基因融合，形成4种嵌合BITE基因，合成上述基因，构建至pUC57质粒中，形成多个长期保存质粒分别命名为pUC57-17G105，pUC57-17G108,pUC57-17G61,pUC57-17G131。
扩增目的基因，1％琼脂糖电泳回收PCR产物，对所得最终目的基因使用 AvrII和BstZ17I双酶切PCR回收产物和pZHK 2.0载体，骨架载体pCHO 1.0购自Invitrogen公司，使用SfiI酶切去除“表达框1”后用T4连接酶环化，形成 pZHK2.0载体。
T4连接酶连接双酶切PCR产物至pZHK 2.0载体中，并转化到Top10感受态细胞中，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中37℃过夜培养。第二天筛选阳性克隆菌，并测序比对，与预期序列完全一致。
将含有高表达CD26-CD3嵌合BiTE双特异性抗体稳定表达哺乳动物细胞株接种于Dynamis培养基(A2617501，购自Thermo Fisher公司)中，37℃，8％CO2， 130rpm进行分批补料流加培养。取上清培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，0.45μm收集滤膜过滤即得处理后培养液上清，进行层析纯化。得到目的产物大小约为55kDa，大小正确。
实施例5.抗CD26-CD3嵌合双特异性抗体与CD26蛋白、CD3蛋白的亲和力检测
采用Fortebio分子间相互作用Octet QKe仪检测嵌合抗体与抗原蛋白CD26 的亲和力。首先将氨基偶联生物传感器AR2G用EDC/s-NHS活化，活化后的生物传感器AR2G置于用10mM乙酸钠(pH 5.0)溶液稀释的CD26蛋白溶液中固化；将固定好CD26蛋白的生物传感器置于1M乙醇胺(pH8.5)溶液中淬灭；再置于1×动力学溶液中平衡；平衡后与人源化双特异性抗体溶液结合；置于1×动力学溶液中解离；用Fortebio Data Analysis 8.0软件进行数据分析，计算解离常数值(KD)，结合速率常数值(kon)和解离速率常数值(kdis)。Response值表示能与抗原发生结合的抗体分子的数量；kon表示抗体与相应受体的结合速率； kdis表示抗体与相应受体的解离速率；NA表示无有效的数据。
表2嵌合抗体与CD26蛋白的亲和力检测
样品编号 检测浓度(nM) Response KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
17G61 181.8 0.8493 1.73E-08 1.91E+04 3.31E-04
17G105 181.8 0.4979 3.93E-08 3.20E+04 1.26E-03
17G131 181.8 0.1496 4.36E-08 1.90E+04 8.29E-04
17G108 181.8 0.0395 NA NA NA 
从上述数据可知，嵌合抗体能与CD26蛋白发生结合和解离。17G61(源于 62号鼠抗的嵌合抗体)与CD26蛋白具有最高的响应值(response)，代表了在相同的浓度条件下，有更多的17G61分子与CD26蛋白发生了结合，17G105(源于72号鼠抗的嵌合抗体)、17G131(源于51号鼠抗的嵌合抗体)与CD26蛋白结合后，响应值较均明显低于17G61。17G61与CD26的KD值更小，故17G61 与CD26蛋白的亲和力更强。
采用Fortebio分子间相互作用Octet QKe仪检测嵌合抗体与抗原蛋白CD3的亲和力。首先将氨基偶联生物传感器AR2G用EDC/s-NHS活化，活化后的生物传感器AR2G置于用10mM乙酸钠(pH 5.0)溶液稀释的CD3蛋白溶液中固化；将固定好CD3蛋白的生物传感器置于1M乙醇胺(pH8.5)溶液中淬灭；再置于 1×动力学溶液中平衡；平衡后与人源化双特异性抗体溶液结合；置于1×动力学溶液中解离；用Fortebio Data Analysis 8.0软件进行数据分析，计算亲和力常数值(KD)。
表3嵌合抗体与CD3蛋白的亲和力检测
样品编号 检测浓度(nM) Response KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
17G61 181.8 0.2591 8.87E-09 1.79E+05 1.59E-03
17G105 181.8 0.1357 2.18E-09 3.09E+05 6.72E-04 
从上述数据可知，17G61与CD3蛋白具有最高的响应值，代表了在相同的浓度条件下，有更多的17G61分子与CD3蛋白发生了结合；17G105与CD3蛋白结合后，响应值低于17G61。以上研究结果表明17G61能与CD3蛋白发生较好的结合和解离。
实施例6.抗CD26鼠抗人源化
根据实施例1中具有高CD26亲和力与对CD26高表达肿瘤细胞有强杀伤活性的候选62与212号鼠源抗体序列进行人源化设计。对62号鼠抗重链(如SEQ ID NO：32所示)轻链(如SEQ ID NO：33所示)可变区，及212号鼠抗重链(如SEQ ID NO：34所示)轻链(如SEQ ID NO：35所示)可变区进行人源化分析。经计算预测，每个抗体各得到多对人源化重轻链组合，62号鼠抗人源化后得到四组不同重轻链氨基酸序列：18G272-VL(SEQ ID NO：8)，18G272-VH(SEQ ID NO：7)，19G292-VL(SEQ ID NO：36)，19G292-VH(SEQ ID NO：37)， 19G293-VL(SEQID NO：38)，19G293-VH(SEQ ID NO：39),19G294-VL(SEQ ID NO：10)，19G294-VH(SEQ IDNO：9)；
212号人源化后得到四组不同重轻链氨基酸序列：18G278-VL(SEQ ID NO： 40)，18G278-VH(SEQ ID NO：41)，19G295-VL(SEQ ID NO：42)，19G295- VH(SEQ ID NO：43)，19G296-VL(SEQ ID NO：44)，19G296-VH(SEQ ID NO：45)，19G297-VL(SEQ ID NO：46)，19G297-VH(SEQ ID NO：47)。
人源化的YS110抗体为阳性对照，其重轻链代号及序列如下所示，YS110- VL(SEQID NO：48),YS110-VH(SEQ ID NO：49)。
实施例7.人源化双特异性抗体的表达质粒构建、稳定表达及纯化
将上述每组人源化后的CD26抗体(18G272、19G292、19G293、19G294、 18G278、19G295、19G296、19G297)的轻链与重链各自通过一段连接短肽(SEQ ID NO：13)相连，下游添加连接短肽(SEQ ID NO：14)，并按照哺乳动物细胞 CHO密码子偏爱性进行优化，得到优化后的CD26单链抗体基因序列(SEQ ID NO： 50-57)，并在上游引入AvrII酶切位点和kozak序列，下游添加CD3单链抗体基因(SEQ ID NO：30)、终止密码子和BstZ17I酶切位点。得到人源化CD26-CD3 BITE 基因序列，直接合成并构建至pUC57质粒中，命名为pUC57-18G272、pUC57- 19G292、pUC57-19G293、pUC57-19G294、pUC57-18G278、pUC57-19G295、pUC57-19G296、pUC57-19G297。
同时将YS110抗体的轻链与重链也通过一段连接短肽(SEQ ID NO：13)相连，下游添加连接短肽(SEQ ID NO：14)，并在上游引入AvrII酶切位点和kozak 序列，下游添加CD3单链抗体基因(SEQ ID NO：30)、终止密码子和BstZ17I酶切位点。得到人源化CD26-CD3BITE基因序列，直接合成并构建至pUC57质粒中，命名为pUC-17G29。
扩增目的基因，1％琼脂糖电泳回收PCR产物，并用AvrII和BstZ17I双酶切PCR 回收产物和pZHK2.0载体，T4连接酶连接双酶切产物至pZHK2.0载体中，并转化到Top10感受态细胞中，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中37℃过夜培养。第二天筛选阳性克隆菌，并测序比对，与预期序列完全一致，即得到了人源化CD26- CD3 BiTE双特异性抗体表达质粒。
将含有高表达CD26-CD3人源化BiTE双特异性抗体稳定表达哺乳动物细胞株接种于Dynamis培养基中，37℃，8％CO2，130rpm进行分批补料流加培养。收获上清培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，0.45μm收集滤膜过滤即得处理后培养液上清，进行层析纯化。得到目的产物大小均约为55kDa。
实施例8.人源化双特异性抗体纯化样品的点杂交检测
将纯化样品稀释成不同浓度梯度，取2ul稀释好的样品点在NC膜上，阳性对照样品为17G29，待吸收完全，用5％脱脂奶粉封闭液，室温水平摇床封闭1 小时，用TBST洗3次，每次5min。按1:1000将CD3-HRP蛋白加入到2.5％脱脂奶粉封闭液中(配制的50mL 2.5％脱脂奶粉封闭液中加入50ul CD3-HRP)，室温水平摇床1小时，用TBST洗3次，每次5min。按1:1000将CD26-HRP蛋白加入到2.5％脱脂奶粉封闭液中(配制的50ml 2.5％脱脂奶粉封闭液中加入50uL CD26-HRP)，室温水平摇床1小时，用TBST洗3次，每次5min。将膜上的TBST 溶液用擦手纸吸干，加显色液(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate)，显色1min，用擦手纸吸干显色液，置于凝胶成像系统曝光，选择连续曝光程序，设置为15s/张，连续曝光12张。对18G272及18G278进行点杂交检测，发现 18G272在不同浓度下对CD26及CD3结合活性均接近阳性对照17G29，显著高于18G278(图1a)。对19G292-19G297共计6个样品进行点杂交检测，发现19G292-19G297均具有对CD26与CD3的结合活性，19G292-19G296与CD26 的结合活性与阳性对照17G29接近，甚至优于阳性对照(图1b)。因此判断CD26 抗体人源化及抗体表达纯化成功，且62鼠抗来源的人源化抗体相比212鼠抗来源的人源化抗体及YS110人源化抗体显示出更高的CD26结合活性。
实施例9人源化双特异性抗体与靶细胞抗原结合的特异性研究
1、CD26阳性和CD26阴性细胞的筛选
用T75细胞培养瓶培养靶细胞，待细胞融合到80％以上时，胰蛋白酶消化细胞并收集，用PBS清洗一次，血球计数板进行计数，分为5×105个细胞每份；用抗CD26单克隆抗体作为一抗，与靶细胞于室温共孵育约40min，孵育结束后，离心弃上清，细胞沉淀用PBS重悬，再次离心弃上清，收集细胞沉淀；再用相应的抗体Alexa Fluor 488鼠抗人IgG1做为二抗，重悬细胞沉淀，于室温避光孵育约 30min，孵育结束后，用PBS清洗两次，离心弃上清，收集细胞沉淀；用约200ul 的PBS溶液将细胞沉淀重悬，在1h内用流式细胞仪进行检测并分析CD26阳性率。
经流式细胞仪鉴定，CD26阳性的细胞株有786-0、OS-RC-2、A498、NCI- H226、NCI-H596、HCC 827、Huh-7、PC-3，CD26阴性的细胞株有G401、A-375。其阳性率如表4所示。CD26阳性细胞株与参考文献一致(中国专利申请号 CN200680034937.4，CD26/DPP4-a potentialbiomarker and target for cancer therapy, Pharmacology&Therapeutics(2019),198:135-159)。
表4靶细胞的CD26阳性率
Figure BDA0003320158830000181
2、FITC标记抗体：
称取荧光素FITC，用DMSO溶液溶解至终浓度为1mg/ml，另取500ul 18G272 抗体，调整至终浓度为1mg/ml，并加入1/10体积1M Na2CO3溶液混匀，并加入 15ul FITC溶液，混合均匀，于室温避光孵育3.5h，结束后用截留直径为10KDa 的超滤浓缩管离心，彻底去除未与18G272结合的FITC，收集浓缩管中的溶液。
3、流式细胞仪检测：
将于T75细胞培养瓶中培养至80％左右的细胞，用胰蛋白酶消化并收集；用适量PBS重悬，并用血球计数板计数，每份5×105cells，离心收集细胞沉淀；用FITC标记的18G272重悬靶细胞，至于混匀仪上，于室温避光孵育30min；孵育结束后，用PBS重悬，离心弃上清，并重复操作一次；用500ul PBS溶液重悬细胞沉淀。阴性对照的设置：在另一份样品中，标记过程不加入抗体样品，其余步骤均与上述过程平行操作，所得的溶液为FITC标记的阴性对照。采用BD Accuri C6流式细胞仪进行检测，分析FITC标记的阳性率。
结果显示，人源化双特异性抗体18G272与CD26阳性的786-0细胞，NCI- H226细胞，PC-3细胞，HCC 827细胞均发生结合，而与CD26阴性的A375细胞无结合。其与CD26靶点的结合具有特异性。
采用相同方法检测人源化双特异性抗体19G294与靶细胞抗原结合的特异性，19G294与CD26阳性的786-0细胞，NCI-H226细胞，PC-3细胞，HCC 827细胞均发生结合，而与CD26阴性的G401细胞无结合。人源化双特异性抗体19G294 与CD26阳性的细胞结合，与CD26阴性的细胞不结合，与CD26抗原靶点的结合具有特异性。
流式细胞术检测抗体与靶细胞抗原结合的特异性代表性附图见图2，详细数据见表5，表6。
表5流式细胞术检测抗体18G272与靶细胞抗原结合的特异性
细胞名称 786-0 NCI-H226 PC-3 HCC 827 A375
特异性结合比例 74.6％ 80.7％ 64.9％ 41.7％ 0.1％ 
表6流式细胞术检测抗体19G294与靶细胞抗原结合的特异性
细胞名称 786-0 NCI-H226 PC-3 OS-RC-2 G401
特异性结合比例 79.0％ 79.5％ 50.6％ 91.6％ 0.0％ 
本发明其他人源化双特异性抗体也与CD26阳性细胞结合，与CD26阴性细胞不结合，与CD26抗原靶点的结合具有特异性。
实施例10人源化双特异性抗体与CD26蛋白、CD3蛋白的亲和力分析 1、与CD26蛋白的亲和力研究
首先将CD26蛋白用生物素EZ-link NHS-PEG12-Biotin进行生物素化；用 SA生物传感器固定生物素化的CD26蛋白；置于1×Kinetics溶液中平衡；与待检测抗体分子溶液结合，待检测分子的浓度梯度为31.3nM，62.5nM，125nM， 250nM，500nM；置于1×Kinetics溶液中解离；用Fortebio Data Analysis 8.0软件进行数据分析，计算亲和力常数值。
表7人源化双特异性抗体18G272、19G294等与CD26蛋白的亲和力
样品名称 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
18G272 1.27E-09 7.59E+04 9.64E-05
19G294 0.914E-09 9.24E+04 8.45E-05
19G292 <1.0E-12 6.58E+04 不解离
19G293 <1.0E-12 5.46E+04 不解离
17G29 1.18E-09 1.83E+05 2.16E-04 
从上述数据可知，18G272与CD26蛋白的亲和力常数为1.27nM，19G294 与CD26蛋白的亲和力常数为0.914nM，能与CD26蛋白发生结合和解离；19G292，19G293与CD26亲和力常数<1.0E-12，与CD26蛋白结合后不解离。CD26为癌细胞表面的靶点，在抗体药物进行实体瘤治疗的过程中，太强的亲和力可能会导致大分子抗体只能在实体瘤血管附近聚集，从而影响抗体在实体瘤部位的扩散和积蓄，导致药效的降低(Influence of affinity andantigen internalization on the uptake and penetration of anti-HER2 antibodiesin solid tumors,Cancer Research,2011,71(6): 2550.)，基于此种考虑，与CD26蛋白具有一定的结合强度且能解离的抗体 18G272，19G294是更具有优势的组合，与17G29比较，动力学参数基本一致。 2、抗体与CD3蛋白的亲和力研究
首先将CD3蛋白用生物素EZ-link NHS-PEG12-Biotin进行生物素化；用SA 生物传感器固定生物素化的CD3蛋白；置于1×Kinetics溶液中平衡；与人源化双特异性抗体溶液结合，人源化双特异性抗体的检测浓度梯度为200nM，400nM， 800nM，1600nM；置于1×Kinetics溶液中解离；用Fortebio Data Analysis 8.0软件进行数据分析，计算亲和力常数值
表8人源化双特异性抗体18G272、19G294等与CD3蛋白的亲和力
样品名称 KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
18G272 25.9E-09 5.39E+03 1.40E-04
19G294 0.751E-09 2.38E+05 1.78E-04
19G292 0.568E-09 1.88E+05 1.07E-04
19G293 1.73E-09 3.31E+05 5.71E-04
17G29 12.2E-09 9.08E+04 5.01E-05 
在此轮实验中，18G272与CD3蛋白的亲和力常数为25.9nM，19G294与 CD3蛋白的亲和力常数为0.751nM。人源化双特异性抗体19G294、19G292、19G293与CD3蛋白的亲和力明显高于17G29与CD3蛋白的亲和力。
结合上述抗体与CD26蛋白的亲和力数据(表7)，与CD3蛋白的亲和力数据(表8)，双特异性抗体19G294的组合方式是更具有优势的双特异性抗体分子组合方式，优于17G29。
实施例11人源化双特异性抗体介导PBMC对靶细胞的细胞毒性评价1、人肾癌细胞786-0细胞模型
在786-0细胞反应体系中，786-0细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、 1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为6×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl 上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
2、人肾癌细胞OS-RC-2细胞模型
在OS-RC-2细胞反应体系中，OS-RC-2细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，OS-RC-2细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、 10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1 的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
3、人肺鳞癌NCI-H226细胞模型
在NCI-H226细胞反应体系中，OS-RC-2细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，OS-RC-2细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、 10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1 的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
4、人前列腺癌PC-3细胞模型
在PC-3细胞反应体系中，PC-3细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，PC-3细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、 1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl 上清置于黑色96孔板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
5、人非小细胞肺癌HCC 827细胞模型
在HCC 827细胞反应体系中，HCC 827细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，HCC 827细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、 10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体19G294，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为10:1 的比例加入50μl浓度为6×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm 的发射波波长的条件下进行检测。
6、实验结果
细胞裂解率用公式为：Vsample-Vvehicle control/VTritonX-100-Vvehicle control×100％。(其中 Vsample为药物处理组的荧光信号读数，Vvehicle control为溶剂对照组荧光信号读数的平均值，VTriton-100为阳性对照组荧光信号读数的平均值。)
将细胞裂解率和样品浓度值用GraphPad Prism 7.00软件计算样品所介导的PBMC对靶细胞的IC50值。
表9不同人源化双特异性抗体介导的PBMC对不同靶细胞的细胞毒效应的 IC50值(pg/ml)
细胞名称 18G272 19G292 19G293 19G294 19G295 19G296 19G297 17G29 YS110
786-0 2275 805.5 974 260.0 无活性 无活性 无活性 1034 ＞100ng/ml
OS-RC-2 283.7 1043 2246 544.9 无活性 无活性 无活性 958.1 ＞100ng/ml
NCI-H226 142.8 1102 404.6 752.3 无活性 无活性 无活性 917.6 ＞100ng/ml
PC-3 378.8 339.2 564.9 219.6 无活性 无活性 无活性 1140 ＞100ng/ml
HCC 827 — — — 546.4 — — — — — 
—：代表未检测该项数据。
62号鼠抗来源的不同人源化双特异性抗体如18G272、19G292、19G293、 19G294均可介导PBMC细胞对多种CD26阳性肿瘤细胞的细胞毒效应，在体外试验中具有杀伤活性。212号鼠抗来源的不同人源化双特异性抗体如19G295、 19G296、19G297均不能介导PBMC细胞对CD26阳性肿瘤细胞产生细胞毒效应。由此可见，以62号鼠源抗体为亲本抗体，以它的高变区为基础，在此基础上所做的人源化改造所获得的抗体序列对CD26阳性肿瘤有杀伤作用。且18G272、 19G292、19G293、19G294对多种类型肿瘤细胞的杀伤能力，均优于17G29， YS110，尤其是19G294，其对不同类型肿瘤细胞的杀伤能力，均优于17G29， YS110。
实施例12人源化双特异性抗体在介导PBMC对靶细胞细胞毒效应过程中对 PBMC细胞的激活
PBMC细胞+双抗体体系：收集PBMC细胞，计数，重悬至1×106cells/ml， 200ul每孔加入到12孔细胞培养板中，抗体稀释到终浓度为1ng/ml，共孵育24h。 PBMC细胞+双抗体+OS-RC-2细胞体系中：收集PBMC细胞，计数，重悬至6 ×105cells/ml，100ul/孔加入到12孔细胞培养板中，抗体稀释到终浓度为1ng/ml， OS-RC-2细胞稀释到9×106cells/ml，100ul/孔加入到相应的12孔细胞培养板中，共孵育24h。
孵育结束后，离心收集细胞沉淀，用PBS重悬，加入anti-CD25抗体、anti- CD69抗体，于4℃冰箱孵育10min，结束后用PBS清洗两次，用PBS重悬后， BD ACCURI C6流式细胞仪检测。
在“PBMC细胞+双特异性抗体”体系中，双特异性抗体没有诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调；在“PBMC细胞+双特异性抗体+OS-RC-2细胞”体系中，双特异性抗体诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调，促进了 PBMC细胞的活化；在“PBMC细胞+YS110+OS-RC-2细胞”体系中，YS110不能诱导PBMC细胞的CD25，CD69表达水平上调。见表10。
表10流式细胞术检测抗体在介导的PBMC对靶细胞细胞毒效应过程中 PBMC细胞的CD25、CD69的表达
Figure BDA0003320158830000241
在786-0等其他CD26阳性肿瘤细胞中也观察到相同现象，即在“PBMC细胞+双特异性抗体”体系中，双特异性抗体没有诱导PBMC细胞的CD25，CD69 的表达上调；在“PBMC细胞+双特异性抗体+其他CD26阳性肿瘤(786-0等)细胞”中诱导PBMC细胞的CD25，CD69的表达上调。
CD25，CD69是T细胞活化时的重要标志物，上述结果证明了YS110不能有效诱导T细胞的激活，CD26-CD3双特异性抗体在未到达肿瘤部位时，不会引起明显的T细胞活化，抗体与肿瘤细胞结合后，才会引起肿瘤组织周围的T细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞，提高了作用的安全性。
实施例13人源化双特异性抗体在介导PBMC对靶细胞细胞毒效应过程中的细胞因子检测
将OS-RC-2细胞重悬为6×105cells/ml，每孔100μl加入到12孔板中，将单独供体来源PBMC细胞收集，重悬为9×106cells/ml，每孔加入100μl，在分别加入0ng/ml，3ng/ml的19G294、18G272、17G29样品各100μl，终体积300μl，将反应体系置37℃培养下中共孵育2h，4h，6h，21h后，收集培养上清，离心后取上清进行ELISA检测。采用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ，TNF-α，L-4， IL-10。
ELISA试剂盒检测各样品的细胞因子含量如下表所示。
表11 ELISA检测IFN-γ含量(pg/ml)
  2h 4h 6h 21h
0ng/ml -7.65 143.7 -58.3 37.7
18G272 116.7 667.7 964.7 1181.7
19G294 91.7 337.7 303.7 398.7
17G29 341.7 1395.7 1777.7 2368.7 
表12 ELISA检测TNF-α含量(pg/ml)
  2h 4h 6h 21h
0ng/ml 16.01 19.55 17.56 10.33
18G272 161.3 ＞1000 192.51 158.73
19G294 111.88 166.88 111.79 47.22
17G29 165.43 182.13 183.73 180.33 
表13 ELISA检测IL-10含量(pg/ml)
  2h 4h 6h 21h
0ng/ml 8.4 16.5 19.3 28.9
18G272 15.9 53.7 86.2 190.6
19G294 9.9 32.3 47.3 65.9
17G29 22.8 113.1 90.2 200.4 
表14 ELISA检测IL-4含量(pg/ml)
  2h 4h 6h 21h
0ng/ml 3.56 4.08 3.44 3.05
18G272 7.67 19.21 21.64 6.64
19G294 3.69 10.74 11.38 3.69
17G29 23.82 58.69 57.79 43.44 
综上所述，对于TH1型和TH2型细胞因子，在人源化双特异性抗体介导的PBMC对靶细胞的杀伤过程中，在相同的使用剂量条件下，人源化双特异性抗体 19G294引起的PBMC细胞分泌的细胞因子在各个时间点含量均最低。这类型靶向于CD3并激活T细胞的分子结构，所引起的T细胞分泌细胞因子导致的细胞因子风暴相对较低时会具有更高的安全性(A FADoncology analysis of CD3 bispecific constructs and first-in-human doseselection(2017),Regulatory Toxicology and Pharmacology,90:144-152.)，在具有相同的CD3序列识别区的前提下，在同等条件下与17G29比较，本申请的双特异性抗体19G294具有诱导T细胞分泌的细胞因子量更低的优势，与其CDR区识别的CD26抗原表位与17G29不同有关，从而也降低了细胞因子风暴的风险，提高了安全性。
实施例14人源化双特异性抗体介导PBMC对PBMC的毒性
1、786-0细胞模型
PBMC细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，786-0细胞以 6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01 ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体，在阳性对照孔中加入50μl终浓度为 1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为10:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml 的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
2、OS-RC-2细胞模型
PBMC细胞采用荧光染料Calcein-AM标记上绿色荧光信号，OS-RC-2细胞以6×105cells/ml的细胞浓度，每孔50μl接种到U-型96孔细胞培养板中，在相应的反应孔中分别加入50μl终浓度为100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、 0.01ng/ml、0.001ng/ml的人源化双特异性抗体18G272，在阳性对照孔中加入 50μl终浓度为1％TritonX-100为阳性对照，再按E/T为15:1的比例加入50μl浓度为9×106cells/ml的PBMC细胞，将反应体系置37℃二氧化碳培养下孵育5h，反应结束后，离心取上清置于一块新的96孔板中，再次离心后，取80μl上清置于黑色96孔酶板中，用酶标仪在470nm激发光波长和515nm的发射波波长的条件下进行检测。
3、结果分析
细胞裂解率用公式为：Vsample-Vvehicle control/VTritonX-100-Vvehicle control×100％。(其中Vsample为药物处理组的荧光信号读数，Vvehicle control为溶剂对照组荧光信号读数的平均值， VTriton-100为阳性对照组荧光信号读数的平均值。)将细胞裂解率和样品浓度值用GraphPad Prism 7.00软件计算各样品所介导的PBMC细胞对PBMC细胞的IC50值。
在抗体18G272介导的PBMC对靶细胞786-0进行杀伤的过程中，介导PBMC 对PBMC细胞发生杀伤的能力极低。抗体18G272介导的PBMC(4#)对PBMC (4#)细胞的细胞毒效应IC50值约为99730000pg/ml；抗体18G272介导的PBMC (6#)对PBMC(6#)细胞无细胞毒效应。结果如图3所示。
在抗体18G272介导的PBMC对靶细胞OS-RC-2进行杀伤的过程中，不会介导PBMC对PBMC细胞发生杀伤。抗体18G272介导的PBMC(1#)对PBMC (1#)细胞无细胞毒效应；抗体18G272介导的PBMC(3#)对PBMC(3#)细胞无细胞毒效应。
在抗体19G294介导的PBMC对靶细胞786-0进行杀伤的过程中，介导PBMC 对PBMC细胞发生杀伤的能力极低。抗体19G294介导的PBMC(2#)对PBMC (2#)细胞的细胞毒效应IC50值约为1915313pg/ml；抗体19G294介导的PBMC (3#)对PBMC(3#)细胞的细胞毒效应IC50值约为1947224pg/ml。
在抗体19G294介导的PBMC对靶细胞OS-RC-2进行杀伤的过程中，介导 PBMC对PBMC细胞发生杀伤的能力极低。抗体19G294介导的PBMC(2#)对 PBMC(2#)细胞的细胞毒效应IC50值约为47920315pg/ml；抗体19G294介导的 PBMC(3#)对PBMC(3#)细胞的细胞毒效应IC50值约为1406115138pg/ml。
综上所述，CD26-CD3人源化双特异性抗体能准确识别PBMC，尽管有文献报道了T细胞表达CD26，但本申请的双特异性抗体18G272，19G294不会介导 PBMC细胞对PBMC细胞产生明显的细胞毒效应，证明其具有较好安全性。
实施例15人源化双特异性抗体18G272、19G294在荷有PC-3(前列腺癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中的药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，将5×106cells/0.1 mlPC-3细胞悬液与1×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD-SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组、19G294组、18G272组，每组6只动物。Model组和各治疗组静脉注射给药，接种当天开始给药，连续给药五日。停药两天后，进行第二疗程的给药。首次给药时间为小鼠皮下接种细胞1h后，即第一疗程为D1、 D2、D3、D4、D5；第二疗程为D8、D9、D10、D11、D12。给药频率为1天/次。
结论：本试验通过NOD-SCID小鼠皮下注射PC-3和PBMC细胞混合液，建立人前列腺癌小鼠异种移植模型。在该模型的基础上，在30μg/只的剂量下， 18G272可以抑制PC-3人前列腺癌模型小鼠的肿瘤增长，19G294可以完全抑制PC-3人前列腺癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图4、表15所示。
供试品19G294、18G272在30μg/只的剂量下，动物没有出现体重下降，与模型组动物体重相当，治疗期间耐受良好，结果如图5、表15所示。
表15 PC-3细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
Figure BDA0003320158830000281
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组
与专利CN200680034937.4实施例6～11相比，YS110单独使用时未表现出完全抑制肿瘤生长的作用，本申请的双特异性抗体19G294单独使用，已达到了完全抑制肿瘤生长的效果，治疗效果有显著的提升，明显优于YS110在动物模型中的治疗效果。
实施例16人源化双特异性抗体18G272在荷有NCI-H596(肺癌)异种移植瘤 NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，将8×106cells/0.1 mlNCI-H596细胞悬液与1.6×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组(5只/组)、18G272组(5只/组)。Model组和各治疗组静脉注射给药，接种当天开始给药，连续给药五日。停药两天后，进行第二疗程的给药。首次给药时间为小鼠皮下接种细胞1h后，即第一疗程为D1、 D2、D3、D4、D5；第二疗程为D8、D9、D10、D11、D12，给药频率为1天/次。
结论：本试验通过NOD-SCID小鼠皮下注射NCI-H596和PBMC细胞混合液，建立人肺腺鳞癌小鼠异种移植模型。在该模型的基础上，供试品18G272在 30μg/只的剂量下，可显著抑制人肺腺鳞癌模型小鼠的肿瘤增长；供试品18G272 在30μg/只的剂量下，动物体重呈上升趋势，治疗期间耐受良好。结果如图6、表16所示。
表16 NCI-H596细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
组别 D72肿瘤体积(mm3) D1体重(g) D72体重(g)
Model组 560.84±70.19 19.22±0.54 23.95±0.74
18G272组 298.46±34.56* 19.14±0.33 24.52±0.48 
注：*：P＜0.05，vs Model组
实施例17人源化双特异性抗体19G294在荷有A498(肾癌)异种移植瘤 NOD/SCID小鼠中药效
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，将1×107cells/0.1 mlA498细胞悬液与1×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD-SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组、19G294组，每组6只动物。Model组和各治疗组静脉注射给药，接种当天开始给药，连续给药五日。停药两天后，进行第二疗程的给药。首次给药时间为小鼠皮下接种细胞1h后，即第一疗程为D1、D2、 D3、D4、D5；第二疗程为D8、D9、D10、D11、D12。给药频率为1天/次。
结论：本试验通过NOD-SCID小鼠皮下注射A498和PBMC细胞混合液，建立人肾癌小鼠异种移植模型。在该模型的基础上，供试品19G294在30μg/只的剂量下，可完全抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图7、表17所示；供试品19G294在30μg/只的剂量下，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好。
表17 A498细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
Figure BDA0003320158830000301
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组
实施例18人源化双特异性抗体18G272、19G294等在荷有OS-RC-2(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠中药效
实验一：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，5×106cells/0.1 mlOS-RC-2细胞悬液与1×107cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD-SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成3组，分别是Model组、17G29组、19G292组；每组5只动物。Model 组和各治疗组静脉注射给药，17G29组、19G292组于D1开始给药，给药频率为 1天/次，连续给药10天。
结论：17G29、19G292在15μg/只的剂量下，在D15时均可以显著抑制肿瘤增长；彼此无显著性差异，见图8。此外，OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，而17G29、19G292在15μg/只的剂量下，均可提高小鼠的中位生存期，两者之间无统计学差异。
表18 OS-RC-2细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重统计
Figure BDA0003320158830000302
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组
实验二：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，4×106cells/0.1 mlOS-RC-2细胞悬液与8×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD-SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成3组，分别是Model组、18G272组、19G292组；每组6只动物。Model 组和各治疗组静脉注射给药，18G272组、19G292组于D1开始给药，给药频率为1天/次，连续给药10天。
结论：相比模型组，18G272组、19G292组在30μg/只的剂量下，D15时均可以显著抑制小鼠的肿瘤增长；D30时18G272组对肿瘤仍有很好的抑制作用，具有极显著差异，而19G292组有抑制肿瘤的趋势，但与模型组相比无显著性差异，见图9、表19。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，而供试品 19G292、18G272在30μg/只的剂量下，可显著提高小鼠的中位生存期(MST)，降低动物死亡率，且18G272没有动物死亡，见图10、表19。综上，18G272抗肿瘤作用优于19G292。
表19 OS-RC-2细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、生存统计
Figure BDA0003320158830000311
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组
实验三：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，3×106cells/0.1 mlOS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD-SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组、18G272组；每组6只动物。Model组于D1开始给于PBS，18G272组于D1开始给药，30μg/只，给药频率为1天/次，连续给药10天。
结论：18G272在30μg/只的剂量下，D1开始给药可显著抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图11、表20所示。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，在本试验条件下，18G272于D1天开始给药可降低动物死亡率，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好，结果如表20所示。
表20 OS-RC-2细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
Figure BDA0003320158830000321
实验四：
方法：选取体重18～22g，大约5～7周龄的NOD-SCID小鼠，3×106cells/0.1 mlOS-RC-2细胞悬液与6×106cells/0.1ml PBMC细胞悬液按照1:1(体积比)的比例充分混合后接种于NOD-SCID小鼠皮下，每只接种0.2ml。按照体重将动物随机分成2组，分别是Model组、19G294组；每组5只动物。Model组于D1开始给于PBS，19G294组于D1开始给药，30μg/只，给药频率为1天/次，连续给药10天。
结论：19G294在30μg/只的剂量下，D1开始给药能完全显著抑制人肾癌模型小鼠的肿瘤增长，结果如图12、表21所示。OS-RC-2人肾癌模型在试验期间会导致动物死亡，在本试验条件下，19G294于D1天开始给药可降低动物死亡率，动物没有出现体重下降，治疗期间耐受良好，结果如表21所示。
表20 OS-RC-2细胞小鼠皮下移植模型中的肿瘤生长、体重、生存率统计
Figure BDA0003320158830000322
注：*：P＜0.05，vs Model组；**：P＜0.01，vs Model组
结合上述四个实验结果，在荷有OS-RC-2(肾癌)异种移植瘤NOD/SCID小鼠模型中，药效方面：17G29与19G292相当，19G292不及18G272，19G294与 18G272相当都能显著抑制甚至完全抑制肿瘤生长；安全性方面：17G29与19G292 相当，19G292不及18G272，19G294与18G272相当。由此可见18G272，19G294 具有比17G29更优的体内药效及安全性。
序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 抗CD26抗体及其应用
<130> 2021.10.15
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
1               5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr
1               5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Ser Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr
1               5                   10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Arg Met Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Phe Gln Gln Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Leu Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Ser Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Phe Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met
            20                  25                  30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210> 15
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Ser Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
            180                 185                 190
Gly Arg Leu Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
        195                 200                 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
    210                 215                 220
Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu
                245                 250                 255
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
            260                 265                 270
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp
        275                 280                 285
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
    290                 295                 300
Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
305                 310                 315                 320
Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
                325                 330                 335
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr
            340                 345                 350
Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
        355                 360                 365
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    370                 375                 380
Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
                405                 410                 415
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp
            420                 425                 430
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
        435                 440                 445
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
    450                 455                 460
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
465                 470                 475                 480
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                485                 490
<210> 16
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
            180                 185                 190
Gly Arg Phe Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
        195                 200                 205
Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
    210                 215                 220
Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu
                245                 250                 255
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
            260                 265                 270
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp
        275                 280                 285
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
    290                 295                 300
Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
305                 310                 315                 320
Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
                325                 330                 335
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr
            340                 345                 350
Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
        355                 360                 365
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    370                 375                 380
Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
                405                 410                 415
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp
            420                 425                 430
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
        435                 440                 445
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
    450                 455                 460
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
465                 470                 475                 480
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                485                 490
<210> 17
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
            20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Val
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
                85                  90                  95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val
    130                 135                 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ile
145                 150                 155                 160
Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
                165                 170                 175
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Ser Asn Tyr His Glu Asn Phe Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Gln
        195                 200                 205
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
    210                 215                 220
Glu Arg Tyr Tyr Gly Ser Lys Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
225                 230                 235                 240
Thr Val Thr Val Ser Ser
                245
<210> 18
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Pro Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
            180                 185                 190
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu
        195                 200                 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
    210                 215                 220
Arg Trp Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val
225                 230                 235                 240
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210> 19
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Arg Val
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
            180                 185                 190
Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu
        195                 200                 205
His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ser
    210                 215                 220
Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
                245
<210> 20
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gln Leu Gln Gln
        115                 120                 125
Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys
    130                 135                 140
Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Phe Trp Ile Glu Trp Val Val
145                 150                 155                 160
Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Phe
            180                 185                 190
Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu
        195                 200                 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Phe Tyr
    210                 215                 220
Gly Ser Lys Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser
<210> 21
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 21
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
            20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Val
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
                85                  90                  95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val
    130                 135                 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ile
145                 150                 155                 160
Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
                165                 170                 175
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Ser Asn Tyr His Glu Asn Phe Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met Gln
        195                 200                 205
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
    210                 215                 220
Glu Arg Tyr Tyr Gly Ser Lys Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
225                 230                 235                 240
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val
                245                 250                 255
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
            260                 265                 270
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val
        275                 280                 285
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro
    290                 295                 300
Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
305                 310                 315                 320
Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
                325                 330                 335
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp
            340                 345                 350
Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
        355                 360                 365
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
    370                 375                 380
Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
385                 390                 395                 400
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr
                405                 410                 415
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile
            420                 425                 430
Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
        435                 440                 445
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
    450                 455                 460
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu
465                 470                 475                 480
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                485                 490
<210> 22
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Ser Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Pro Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
            180                 185                 190
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu
        195                 200                 205
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
    210                 215                 220
Arg Trp Ile Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Glu Trp Tyr Phe Asp Val
225                 230                 235                 240
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
                245                 250                 255
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
            260                 265                 270
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
        275                 280                 285
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
    290                 295                 300
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
305                 310                 315                 320
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
                325                 330                 335
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
            340                 345                 350
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        355                 360                 365
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
    370                 375                 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
385                 390                 395                 400
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
                405                 410                 415
Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
            420                 425                 430
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro
        435                 440                 445
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
    450                 455                 460
Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
465                 470                 475                 480
Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                485                 490                 495
<210> 23
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Arg Val
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
    130                 135                 140
Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
                165                 170                 175
Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
            180                 185                 190
Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu
        195                 200                 205
His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ser
    210                 215                 220
Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu
                245                 250                 255
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
            260                 265                 270
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp
        275                 280                 285
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
    290                 295                 300
Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
305                 310                 315                 320
Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser
                325                 330                 335
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr
            340                 345                 350
Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
        355                 360                 365
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    370                 375                 380
Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
                405                 410                 415
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp
            420                 425                 430
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
        435                 440                 445
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu
    450                 455                 460
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
465                 470                 475                 480
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                485                 490
<210> 24
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
        35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Thr Glu Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Gln Leu Gln Gln
        115                 120                 125
Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys
    130                 135                 140
Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Phe Trp Ile Glu Trp Val Val
145                 150                 155                 160
Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Phe
            180                 185                 190
Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Ser Leu
        195                 200                 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Phe Tyr
    210                 215                 220
Gly Ser Lys Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
                245                 250                 255
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
            260                 265                 270
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
        275                 280                 285
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
    290                 295                 300
Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp
305                 310                 315                 320
Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
                325                 330                 335
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
            340                 345                 350
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
        355                 360                 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
    370                 375                 380
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
385                 390                 395                 400
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
                405                 410                 415
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
            420                 425                 430
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
        435                 440                 445
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
    450                 455                 460
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
465                 470                 475                 480
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
                485
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly
            20
<210> 26
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg atccaccggc 60
gacatcgtgc tgacacagtc ccctgctagc ctggctgtga gcctgggcca gagagccaca 120
atctcttgcc gcgctagcga gtctgtggag tactatggca ccagcctgat gcagtggtat 180
cagcagaagc ctggccagcc ccctaagctg ctgatctaca cagcctctaa cgtggagtcc 240
ggcgtgccag tgagattctc cggcagcggc tctggcaccg acttttccct gaatatccac 300
cccgtggagg aggacgacat cgccatgtac ttctgccagc agagccgcaa ggtgccttat 360
acctttggcg gcggcacaaa gctggagatc aagggcggcg gcggctctgg aggaggagga 420
tccggaggag gaggaagcca ggtgcagctg cagcagtctg gaccagagct gatgaagcca 480
ggagctagcg tgaagatctc ttgtaaggct accggctatt ccttcagcgg cttttggatc 540
gagtgggtga agcagaggcc aggacacgga ctggagtgga tcggagagat cctgccagga 600
tctggagctt ccaactatca tgagaatttc aagggcaggg ccaccatcac agctgacacc 660
agcgccaaca cagcttacat gcagctgcgg agcctgacat ctgaggattc cgccgtgtac 720
tattgcgcta gggagcggta ctatggctct aagtactttg acgtgtgggg agctggaacc 780
acagtgaccg tgtccagc 798
<210> 27
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgcctgg ctctaccggc 60
gacatcgtga tgacacaggc tgctccatcc gtgcctgtga caccaggcga gagcgtgtct 120
atctcctgca gatccagcaa gtctctgctg cactccaacg gcaataccta tctgtactgg 180
ttcctgcaga ggccaggaca gagccctcag ctgctgatct ctcagatgtc caacctggcc 240
tctggcatcc ccgaccggtt cagcggatct ggatccggca ccgcctttac actgaggatc 300
agccgggtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgca tgcagcatct ggagtaccct 360
ttcacctttg gctctggcac aaagctggag atcaagggag gaggaggatc cggaggagga 420
ggaagcggtg gcggcggctc tgaggtgcag ctgcagcagt ccggagctga gctggtgaag 480
ccaggagcta gcgtgaagct gtcttgtacc gcctccggct tcaacatcaa ggacaactac 540
atgaattggg tgaagcagag accagagcag ggactggagt ggatcggaag gatcgaccct 600
gctaacggca atccaaagta cgatcccaag tttcagggca aggccaccat cacagctgac 660
acctcttcca atacagccta tctgcagctg agctctctga cctccgagga tacagccgtg 720
tactattgca caagatggat ctactattac ggcagccgct atgagtggta ctttgacgtg 780
tggggagctg gaaccacagt gaccgtgtcc agc 813
<210> 28
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg aagcaccggc 60
gacatcgtga tgacacaggc tgctccatcc gtgtccgtga caccaggcga gagcgtgtct 120
atctcctgcc gctctgataa gtccctgctg cacagcaacg gcaataccta cctgtattgg 180
ttcctgcaga gacccggcca gtctcctcag gtgctgatct accgcatgtc taacctggcc 240
tccggcgtgc cagataggtt cagcggatct ggatccggaa ccggctttac actgagggtg 300
tctcgggtgg aggctgagga cgtgggcgtg tactattgct tccagcagct ggagtacccc 360
tatacctttg gcggcggcac aaagctggag atcaagggag gaggaggatc cggaggagga 420
ggaagcggtg gcggcggctc tgaggtgcag ctgcagcagt ccggagctga gctggtgaag 480
ccaggagcta gcgtgaagct gtcttgtacc gcctccggct ttaatatcaa ggatacatac 540
atctattggg tgaagcagag gcctggacag ggactggagt ggatcggaag gatcgagccc 600
atgaacggca ataccaagta cgaccctaag ttccagggca aggccaccat gacagctaac 660
acctccagca atacagctta tctgcatctg tcttccctgg cctctgagga caccgccgtg 720
tacttttgct cccgcggagg atggctgctg ctgtacgtga tggattattg gggccagggc 780
accagcgtga cagtgagctc t 801
<210> 29
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg aagcaccggc 60
gacatccaga tgacacagtc tccagcttct ctgtccgcta gcgtgggaga gtccgtgacc 120
atcacatgca gagctagcga gaacatctac tcttatctga cctggtatca gcagaagcag 180
ggcaagtctc cacagctgct ggtgtacaat gccaagaccc tgacagagga tgtgccatcc 240
aggttctctg gatccggaag cggaacccag ttttccctga agatcaacag cctgcagcct 300
gaggacttcg gctcctacta ttgccagcac cattacggaa gcccacggac ctttggcgga 360
ggaacaaagc tggagatcaa gggcggcggc ggctctggag gaggaggatc cggaggagga 420
ggaagccagg cccagctgca gcagagcggc gctgagctga tgaagccagg cgcctccgtg 480
aagatcagct gtaaggctac cggctacaca ttctctaatt tttggatcga gtgggtggtg 540
cagaggcctg gacacggact ggagtggatc ggagagatcc tgccaggaag gggaaccaca 600
aactataatg agaagttccg gggcaaggcc acctttacag ctgacacctc cagcgataca 660
gcctacatcc agctgtcttc cctgacatcc gaggacagcg ccgtgtacta ttgcgctagg 720
gagcggttct acggctctaa gtattttgac gtgtggggcg ctggcaccac agtgaccgtg 780
agctct 786
<210> 30
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
gatgtgcagc tggtgcagag cggagctgag gtgaagaagc caggagcttc tgtgaaggtg 60
tcctgcaaag ccagcggcta caccttcaca agatatacca tgcactgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gcctggaatg gatcggctat atcaatccaa gcagaggcta caccaactat 180
gccgactctg tgaagggccg ctttacaatc accaccgata agtccaccag cacagcttac 240
atggagctga gctctctgag gtccgaggac accgccacat actattgcgc tcggtactat 300
gacgatcatt actgtctgga ttattggggt cagggtacca cagtgaccgt gtcctctggc 360
ggcggcggca gcggcggagg aggctccggt ggcggcggct ccgacatcgt gctgacccag 420
tcccctgcca cactgtctct gtccccagga gagagagcca ccctgagctg cagggctagc 480
cagtccgtgt cctacatgaa ttggtaccag cagaagccag gcaaggctcc caagaggtgg 540
atctatgata catctaaggt ggcctccgga gtgcctgctc ggttcagcgg atctggatcc 600
ggaaccgact acagcctgac aatcaattct ctggaggccg aggatgccgc tacctactat 660
tgtcagcagt ggtcttccaa cccactgacc tttggcggcg gcacaaaggt ggagatcaag 720
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
ggaggaggag gatcc 15
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 32
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Arg Val
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210> 34
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ala Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Phe Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Trp His Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Arg Asn Trp Gly Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Ile Thr Val Ser Ser
        115
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 35
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Gly Tyr Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Ser Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 37
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 37
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Phe Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asp Lys Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gln
                85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Glu Pro Met Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asn Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Gly Gly Trp Leu Leu Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 40
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Val Thr Leu Asn Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Gly Tyr Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Arg Lys Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Phe Leu
65                  70                  75                  80
Glu Leu Arg Ser Val Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Arg Asn Trp Gly Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Ile Thr Val Ser Ser
        115
<210> 42
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 42
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Arg Leu Trp
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Gly Tyr Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 43
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Lys Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Gln Lys Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ser Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Arg Asn Trp Gly Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Ile Thr Val Ser Ser
        115
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 44
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Trp
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Gly Tyr Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 45
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Arg Asn Trp Gly Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 46
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 46
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Thr
            20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Trp
        35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ser Gly Tyr Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 47
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Trp His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Arg Asn Trp Gly Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 48
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ser Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Lys Leu Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 49
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Val Lys Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Arg Thr Asp Tyr Asp Ala Ala Phe Met
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met
                85                  90                  95
Arg Asn Arg His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 50
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 50
atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg atccaccggc 60
gacatcgtga tgacacagag cgcctccagc ctgccagtga cccctggaga gccagcttcc 120
atcagctgca gatctgacaa gtccctgctg cacagcaacg gcaatacata cctgtattgg 180
ttcctgcaga agcccggcca gtctcctcag gtgctgatct acagaatgag caacctggcc 240
tctggagtgc ctgaccgctt ctctggatcc ggaagcggaa ccgacttcac cctgacaatc 300
tctcgcgtgg aggctgagga tgtgggcgtg tactattgct tccagcagct ggagtaccca 360
tatacctttg gccagggcac aaagctggag atcaagggag gaggaggatc cggaggagga 420
ggatctggcg gcggcggctc tcaggtgcag ctggtgcagt ccggagctga ggtggtgaag 480
ccaggagctt ccgtgaagat cagctgtaag gcctctggct tcaatatcaa ggacacctac 540
atctattggg tgaggcagag gacaggacag ggactggagt ggatcggcag gatcgagcca 600
atgaacggca ataccaagta cgatcccaag tttcagggcc ggctgaccat gacagccaac 660
acctccaaga atacagctta tctgcagctg tcttccctga cctctgagga cacagccgtg 720
tactattgtt ccaggggcgg ctggctgctg ctgtacgtga tggattattg gggccagggc 780
accacagtga cagtgagctc tggcggcggc ggcagc 816
<210> 51
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 51
atggagcaca gcaccttcct gtctggcctg gtgctggcca cactgctgtc ccaggtgagc 60
cctgacatcg tgatgaccca gtccgcttcc agcctgcctg tgacacctgg agagtccgtg 120
agcatctctt gccggtctga taagtccctg ctgcatagca acggcaatac ctacctgtat 180
tggtttctgc agaggccagg ccagtctccc caggtgctga tctacaggat gtccaacctg 240
gccagcggag tgccagacag attctccggc agcggctctg gcacagagtt taccctgaca 300
atctctagag tggaggctga ggatgtgggc gtgtactatt gcttccagca gctggagtac 360
ccttatacct ttggcccagg cacaaagctg gagatcaagg gcggcggcgg ctctggagga 420
ggaggatccg gaggaggagg cagccaggtg cagctgctgc agtccggagc tgaggtggtg 480
aagccaggag cttctgtgaa gatctcctgt aaggccagcg gcttcaatat caaggacacc 540
tacatctatt gggtgaagca gccaacagga cagggcctgg agtggatcgg aaggatcgag 600
cccatgaacg gcaataccaa gtacgatcct aagttccagg gcaggtttac catgacagcc 660
aacacctcca tcaatacagc ttatctgcag ctgtcttccc tgacctctga ggacacagcc 720
gtgtactatt gttcccgcgg aggatggctg ctgctgtacg tgatggatta ttggggccag 780
ggcaccacag tgaccgtgag ctctggcggc ggcggcagc 819
<210> 52
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 52
atggagcact ccaccttcct gagcggcctg gtgctggcca cactgctgtc tcaggtgtcc 60
cctgacatcg tgatgaccca gtccccactg agcctgtctg tgacacccgg cgagcctgct 120
tccatcagct gcagaagcga taagtctctg ctgcattcca acggcaatac ctacctgtat 180
tggtttctgc agaagccagg ccagagcccc caggtgctga tctacaggat gtctaacctg 240
gcctccggag tgcctgaccg gttctctgga tccggaagcg gaaccgactt caccctgaag 300
atctccaggg tggaggctga ggacgtgggc gtgtactatt gcttccagca gctggagtac 360
ccatatacct ttggccaggg cacaaagctg gagatcaagg gaggaggagg aagcggagga 420
ggaggatctg gcggcggcgg ctcccaggtg cagctggtgc agtctggagc tgagctggtg 480
aagccaggag ctagcgtgaa gctgtcttgt aaggcctccg gcttcaatat caaggacacc 540
tacatctatt gggtgaggca ggctccagga cagggcctgg agtggatcgg aaggatcgag 600
cccatgaacg gcaatacaaa gtacgatcct aagtttcagg gcagggtgac catgacagcc 660
aacacctcta tcaatacagc ttatctggag ctgtccagcc tgagaagcga ggacaccgcc 720
gtgtactatt gttctcgcgg cggctggctg ctgctgtacg tgatggatta ttggggccag 780
ggcaccctgg tgacagtgtc ttccggagga ggaggatcc 819
<210> 53
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 53
atggagcact ccaccttcct gagcggcctg gtgctggcca cactgctgtc tcaggtgtcc 60
cccgacatcg tgatgaccca gagcccatcc agcctgtctg tgacaccagg agagagggtg 120
tccatcagct gccggagcga taagtctctg ctgcattcta acggcaatac ctacctgtat 180
tggtttctgc agaagcccgg ccagtcccct caggtgctga tctacagaat gtctaacctg 240
gcctccggag tgccagaccg cttctctgga tccggaagcg gcacagactt caccctgaca 300
atctccaggg tggaggctga ggacgtgggc gtgtactatt gcttccagca gctggagtac 360
ccctatacct ttggccaggg cacaaagctg gagatcaagg gaggaggagg atccggagga 420
ggaggaagcg gcggcggcgg ctctgaggtg cagctggtgc agtccggagc tgagctggtg 480
aagccaggag ctagcgtgaa gctgtcttgt gccgcttccg gcttcaatat caaggacacc 540
tacatctatt gggtgagaca ggctcctgga cagggcctgg agtgggtggg ccgcatcgag 600
cctatgaacg gcaatacaaa gtacgatcca aagttccagg gcaggtttac catgacagcc 660
aacaccagca agaatacagc ttatctgcag ctgtcttccc tgaggtccga ggacaccgcc 720
gtgtactatt gtagccgggg aggatggctg ctgctgtacg tgatggatta ttggggccag 780
ggcaccctgg tgacagtgag ctctggagga ggaggatct 819
<210> 54
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 54
atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg aagcaccgga 60
gagaacgtgc tgacccagtc tcctgccaca ctgagcgtgt ctcccggcga gcctgtgacc 120
ctgaattgca gggcttccag ctctgtgatc agcacatatc tgcactggta ccagcagaag 180
ccaggacagg ctcccaggct gtggatctat tccaccagca acctggcctc tggcatccct 240
gctcggttct ctggatccgg aagcggcaca gagtacaccc tgacaatctc cagcgtggag 300
tccgaggatg tggccgtgta ctattgccag cagttcagcg gctacccata tacctttggc 360
cagggcacaa agctggagat caagggagga ggaggaagcg gaggaggagg atctggcggc 420
ggcggctccc aggtgcagct gcaggagtcc ggacctgagc tggtgaagcc atcccagacc 480
ctgagcctga cctgtaaggt gtctggcgac tccatcacca gcggctactg gcattggatc 540
aggcagtttc caggccggaa gctggagtgg gtgggctaca tcaactatag cggctacaca 600
tactataatc cctctctgaa gtccagactg accatctcca gggacacatc caagaaccag 660
tatttcctgg agctgagaag cgtgacctct gacgatacag ccgtgtacta ttgtacctct 720
gagcgcaatt ggggcgcctt tgcttactgg ggccagggca ccctgatcac agtgtctagc 780
ggcggcggcg gctcc 795
<210> 55
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 55
atggagcact ccaccttcct gagcggcctg gtgctggcca cactgctgtc ccaggtgagc 60
cctgagaacg tgctgaccca gtctcctgct agcctgtccg tgtccccagg agagagagtg 120
accctgaatt gccgcgcttc cagctctgtg atctccacat acctgcattg gtatcagcag 180
aagccaggca agccacccag gctgtggatc tacagcacct ctaacctggc ctctggcatc 240
cctgctcggt tctccggaag cggatctggc acagagtaca ccctgacaat ctccagcgtg 300
gagtccgagg actttgccgt gtactattgc cagcagttca gcggctaccc atataccttt 360
ggccagggca caaagctgga gatcaaggga ggaggaggat ccggaggagg aggaagcggc 420
ggcggcggct ctcaggtgca gctgcaggag tccggcccag agctggtgaa gccctctgag 480
acactgtccc tgacctgtaa ggtgtctggc gactccatca ccagcggcta ctggcactgg 540
atcaggcagt ttccaggcca gaagctggag tacatgggct atatcaacta cagcggctat 600
acatactata atccctctct gaagtccagg ctgaccatca gccgggatac atctaagaac 660
cagtacttcc tgaagctgag aagcgtgacc tctgacgata cagccctgta ctattgtacc 720
agcgagcgca attggggcgc ctttgcttat tggggccagg gcaccctgat cacagtgtct 780
tccggcggcg gcggctctga tgtgcagctg gtgcag 816
<210> 56
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 56
atggagcact ccaccttcct gagcggcctg gtgctggcca cactgctgtc tcaggtgtcc 60
cctgagaacg tgctgaccca gtctccagcc acactgtccg cctctcctgg agagagagcc 120
accctgtcct gcagggcttc cagctctgtg atcagcacat atctgcattg gtaccagcag 180
aagccaggcc aggcccccaa gctgtggatc tattccacca gcaatctggc cagcggcgtg 240
ccagctaggt tctctggctc cggcagcggc acagactaca ccctgacaat ctccagcgtg 300
gagccagagg attttgccgt gtactattgc cagcagttct ctggctaccc ctataccttt 360
ggccagggca caaagctgga gatcaaggga ggaggaggat ccggaggagg aggaagcggc 420
ggcggcggct ctcaggtgca gctgcaggag tccggacctg gcctggtgaa gccatctgag 480
acactgtccc tgacctgtac agtgagcggc gactctatca catccggcta ttggcactgg 540
atcaggcagc cacctggcaa gggcctggag tggatcggct acatcaacta tagcggctac 600
acctactata atcccagcct gaagtctagg ttcaccatca gccgggacac atctaagaac 660
cagtactatc tgcagctgaa ttctgtgacc gccgaggata cagccgtgta ctattgtacc 720
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tccggaggag gaggatccga tgtgcagctg gtgcag 816
<210> 57
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 57
atggagcaca gcaccttcct gtctggcctg gtgctggcca cactgctgtc ccaggtgagc 60
cctgagaacg tgctgaccca gtcccctgct agcctgtctg cttccccagg agagagagtg 120
accatcacat gccgcgcctc cagctctgtg atcagcacct atctgcattg gtaccagcag 180
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ccagctaggt tctccggaag cggatctgga accgactaca ccctgacaat ctccagcgtg 300
gagcccgagg attttgctac atactattgc cagcagttct ccggctaccc ttataccttt 360
ggccagggca caaagctgga gatcaaggga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctggc 420
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acatactata atccctctct gaagtccagg ttcaccatct ctcgggacac atccaagaac 660
cagtactatc tgcagctgaa tagcgtgacc gccgaggata cagccgtgta ctattgtacc 720
tctgagagaa actggggcgc ctttgcttac tggggccagg gcaccctggt gacagtgtct 780
tccggaggag gaggatcc 798

Claims (17)

1.与人CD26特异性结合的抗体或抗原结合片段，包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及包含SEQ ID NO:4所示的LCDR1、SEQID NO:5所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
2.权利要求1所述抗体或抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的重链可变区，以及包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
3.权利要求2所述抗体或抗原结合片段，其中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10内的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸已被插入、缺失或取代，所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
4.权利要求2所述抗体或抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区和包含SEQID NO:8的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:9的重链可变区和包含SEQ ID NO:10的轻链可变区。
5.含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，由两个具有抗原特异性的单链可变片断(scFv)通过接头连接而成，其中一个scFv靶向识别CD26，另一个scFv靶向识别CD3，所述靶向识别CD26的scFv由CD26抗体重链可变区和CD26抗体轻链可变区通过接头连接而成，
所述靶向识别CD26的scFv包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3；以及包含SEQ ID NO:4所示的LCDR1、SEQ ID NO:5所示的LCDR2和SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
6.权利要求5所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，所述靶向识别CD26的scFv包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的重链可变区，以及包含与SEQID NO:8或SEQ ID NO:10所示至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的轻链可变区。
7.权利要求6所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，所述靶向识别CD26的scFv，其中SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10内的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸已被插入、缺失或取代，所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
8.权利要求6所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，所述靶向识别CD26的scFv，其包含SEQ ID NO:7的重链可变区和包含SEQ ID NO:8的轻链可变区；或包含SEQ ID NO:9的重链可变区和包含SEQ ID NO:10的轻链可变区。
9.权利要求5所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，所述靶向识别CD3的scFv的氨基酸序列源自OKT-3、L2K、TR66、UCHT1、SP34、IORT3、Catumaxomab、Blinatumomab、Solitomab。
10.权利要求5所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，所述scFv中接头选用本领域常用的接头，KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST、GSTSGGGSGGGSGGGGSS、GSTSGSGKPGSGEGSTKG或(GGGGS)n，其中n为1-5的整数。
11.权利要求5所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，所述连接两个scFv的接头选用本领域常用的接头，如(GGGGS)n，其中n为1-5的整数，优选n为1-3的整数，优选n为1，如SEQ ID NO：14所示。
12.权利要求5所述含有CD26抗体或抗原结合片段序列的双特异性T细胞接合器(BITE)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：15或16所示。
13.编码权利要求1-12任一项所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。
14.包含权利要求13所述核苷酸序列的载体。
15.包含权利要求13所述载体的宿主细胞。
16.包含权利要求1-12任一项所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。
17.治疗高表达CD26肿瘤的方法，其包括向患者给予有效量的权利要求1-12任一项所述抗体或抗原结合片段；所述肿瘤包括但不限于肾癌、间皮瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌。
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