JP2023026758A - 中枢神経系のがんの治療のための組換えt細胞の投与 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書は、T細胞(例えば、CAR T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(tumor infiltrating lymphocytes)(「TIL」)、TCR組換えT細胞、又はT細胞クローン)を含む組成物を患者の脳脊髄液(「CSF」)に投与することによって中枢神経系の悪性腫瘍を治療する方法に関する。
組換えT細胞及びex vivoで増殖又は選択されたT細胞を用いる治療方法を含む、腫瘍特異的T細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について研究される。このような療法に用いられるT細胞は、十分長い期間、インビボで活性を維持しない場合がある。T細胞の腫瘍特異性は比較的低い場合がある。組換えT細胞は腫瘍へのアクセスが不十分である場合がある。従って、当業界ではより効果的な抗腫瘍機能がある腫瘍特異的がん治療が要望される。
中枢神経系のがんの治療は、特に難題であってよい。例えば、未分化星状細胞腫(AA-グレードIII)及び多形グリア芽腫(GBMグレードIV)を包含する高グレードの悪性グリオーマ(malignant glioma)(MG)の治療は、依然として重要な治療上の課題がある。現在利用可能な治療選択肢は治癒能が限定されており、最初の診断後5年を超えて生存する患者の生存率はわずか5%未満である。
中枢神経系のがんの治療は、特に難題であってよい。例えば、未分化星状細胞腫(AA-グレードIII)及び多形グリア芽腫(GBMグレードIV)を包含する高グレードの悪性グリオーマ(malignant glioma)(MG)の治療は、依然として重要な治療上の課題がある。現在利用可能な治療選択肢は治癒能が限定されており、最初の診断後5年を超えて生存する患者の生存率はわずか5%未満である。
本明細書に記載されるのは、T細胞(例えば、CAR T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(tumor infiltrating lymphocytes)(「TIL」)、TCR組換えT細胞、又はT細胞クローン)を含む組成物を患者の脳脊髄液(「CSF」)に投与することによって中枢神経系の悪性腫瘍を治療する方法である。T細胞には、例えば、所望の受容体を発現する核酸分子の導入により、単離された若しくは遺伝子修飾されたT細胞をex vivoで増殖させて、又は患者若しくはドナーから得られたT細胞のサブセットのex vivo選択により、又はこれらの技術を2つ以上組み合わせた、組換えT細胞が含まれる。CNSへの投与は、例えば、脳室系(ventricular system)又は脊柱の中心空洞への投与によって達成することができる。当該用語が本明細書中で用いられる場合、CNSへの投与は、腫瘍内投与(腫瘍自体への注射又は注入)及び腫瘍の切除によって作製された空腔への投与とは異なる。しかし、本明細書に記載のCNS投与方法は、腫瘍内(intraturmoral)投与及び/又は切除後の腔内投与と併用できる。
本明細書に記載のCNS投与は、T細胞を含む比較的体積の大きい組成物、例えば、1回の注入で1ml~2ml以上を注入しうる。したがって、数百万のT細胞を一回の注入で投与することができる。
したがって、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、有効量のT細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の解剖学的コンパートメントに注入することを含み、前記解剖学的コンパートメントは脳脊髄液(CSF)を収容する、方法が開示される。当該方法は、例えば、組成物を脳室系又は脊髄の中心管の部分に注入することを包含する。開示された方法の一実施形態では、中枢神経系の悪性腫瘍は、脳、脊柱などの部分を包含する、中枢神経系のいずれかに見られる原発性腫瘍又は転移性腫瘍を包含する。好ましくは、前記解剖学的コンパートメントは、少なくとも約50,100、又は150mLの脳脊髄液の連続した体積を収容する。
本明細書に記載の方法で注入された組換えT細胞は、腫瘍抗原、例えば表面タンパク質及び細胞内タンパク質を標的とする。治療される悪性腫瘍は、原発性腫瘍又は身体の他の場所から発症するがんに起因する続発性腫瘍であってよい。脳脊髄液への投与により、局所的な注射部位を越えた領域へT細胞をアクセスさせうるため、本明細書に記載の方法は、注射部位から離れているが、CNS内である腫瘍の大きさを攻撃し、縮小させるために用いることができる。TCR組換えT細胞は、T細胞へのTCRαβ遺伝子の導入(例えば自己T細胞)、その後、T細胞のex vivoにおける増殖により、調製され、かつ、患者へ当該T細胞が注入される。TCR組換えT細胞の注入は、腫瘍が適当な抗原及びHLA制限要素を発現する患者に、腫瘍反応性を付与する。TCRは、例えば、T細胞1(MART-1)、によって認識されるメラノーマ関連抗原、糖タンパク質(gp)100、がん胎児性抗原(CEA)、p53、メラノーマ関連抗原(MAGE-A3)、及びニューヨーク式食道扁平上皮がん抗原(New York esophageal squamous cell carcinoma antigen)(NYESO)を包含する様々な腫瘍抗原のいずれかを標的とすることができる。
本明細書に記載されるのは、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、前記患者の脳脊髄液(CSF)に有効量のT細胞を含む組成物を導入することを含む。
様々な実施形態では、以下の:
前記T細胞は自己又は同種異系T細胞である;
前記T細胞が、組換え核酸分子による増殖(expansion)、分画(fractionation)、又はトランスフェクションの1つ以上によってex vivoで組換えられる;
前記T細胞が、腫瘍細胞抗原に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞を含む;
前記ポリペプチドがキメラ抗原受容体である;
前記組成物が脳室内に(intraventricularly)投与される;
前記組成物が脊髄の中心管に投与される;
前記投与が、左脳室(ventrical)又は右脳室(ventrical)への投与である;
前記組成物が少なくとも1×106個の細胞を含む;
T細胞を含む前記組成物が少なくとも2回投与される;
前記投与が、投与されたT細胞の総数が異なる;
前記投与が用量を段階的に増大する(escalate);
前記投与が用量を段階的に縮小する(de-escalate);
前記T細胞がCAR T細胞を含む;
前記T細胞が自己腫瘍浸潤リンパ球を含む;
前記T細胞がTCR組換えT細胞を含む;
前記悪性腫瘍が、びまん性の浸潤性腫瘍である;
前記悪性腫瘍が原発性脳腫瘍である;
1つ以上の腫瘍病巣のサイズが少なくとも25%減少する;
前記悪性腫瘍が、乳がん、肺がん、頭頸部がん、及び黒色腫から選択される原発がんから生じる;
当該方法が腫瘍切除後に行われる;
T細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む;
前記悪性腫瘍が続発性脳腫瘍である;
グリア芽細胞腫細胞の表面上に発現されるタンパク質に結合するキメラ抗原受容体を発現する治療用T細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む;
前記患者が、以前に腫瘍病変の切除を受けている;
前記腫瘍抗原が、IL13Rα2、HER2、PSCA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、NY-ESO-1、及びCD19からなる群から選択される;
前記T細胞が、CD4+細胞及びCD8+細胞の両方を含む;
前記T細胞がex vivoでの増殖を受けた;
前記T細胞が少なくとも10%のTCM細胞を含む;
前記注入された細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%又はそれ以上がCD4+である;
前記注入された細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%又はそれ以上が前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する(例えばIL13Rα2);及び、
細胞の用量は、前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する注入された細胞の数に基づく(例えばIL13Rα2)
である。
前記T細胞は自己又は同種異系T細胞である;
前記T細胞が、組換え核酸分子による増殖(expansion)、分画(fractionation)、又はトランスフェクションの1つ以上によってex vivoで組換えられる;
前記T細胞が、腫瘍細胞抗原に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞を含む;
前記ポリペプチドがキメラ抗原受容体である;
前記組成物が脳室内に(intraventricularly)投与される;
前記組成物が脊髄の中心管に投与される;
前記投与が、左脳室(ventrical)又は右脳室(ventrical)への投与である;
前記組成物が少なくとも1×106個の細胞を含む;
T細胞を含む前記組成物が少なくとも2回投与される;
前記投与が、投与されたT細胞の総数が異なる;
前記投与が用量を段階的に増大する(escalate);
前記投与が用量を段階的に縮小する(de-escalate);
前記T細胞がCAR T細胞を含む;
前記T細胞が自己腫瘍浸潤リンパ球を含む;
前記T細胞がTCR組換えT細胞を含む;
前記悪性腫瘍が、びまん性の浸潤性腫瘍である;
前記悪性腫瘍が原発性脳腫瘍である;
1つ以上の腫瘍病巣のサイズが少なくとも25%減少する;
前記悪性腫瘍が、乳がん、肺がん、頭頸部がん、及び黒色腫から選択される原発がんから生じる;
当該方法が腫瘍切除後に行われる;
T細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む;
前記悪性腫瘍が続発性脳腫瘍である;
グリア芽細胞腫細胞の表面上に発現されるタンパク質に結合するキメラ抗原受容体を発現する治療用T細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む;
前記患者が、以前に腫瘍病変の切除を受けている;
前記腫瘍抗原が、IL13Rα2、HER2、PSCA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、NY-ESO-1、及びCD19からなる群から選択される;
前記T細胞が、CD4+細胞及びCD8+細胞の両方を含む;
前記T細胞がex vivoでの増殖を受けた;
前記T細胞が少なくとも10%のTCM細胞を含む;
前記注入された細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%又はそれ以上がCD4+である;
前記注入された細胞の少なくとも40%、50%、60%、70%又はそれ以上が前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する(例えばIL13Rα2);及び、
細胞の用量は、前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する注入された細胞の数に基づく(例えばIL13Rα2)
である。
ある実施形態では、
前記CAR T細胞がIL13Rα2を標的とし、かつ、
ヒトIL-13又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸分子;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
少なくとも1つの共刺激(costimulatory)ドメイン;及び
1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。ある実施形態では、
前記共刺激ドメインが、CD28共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される;
ヒトIL-13の前記変異体が、IL13Rα2対IL13Rα1の結合特異性を高める1~10個のアミノ酸修飾がある;
前記ヒトIL-13又はその変異体が、1~5個のアミノ酸修飾がある配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-13変異体であり、ただし、配列番号3の11位はE以外である;
前記キメラ抗原受容体が、CD28共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメインを含む;
前記キメラ抗原受容体が、CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメインを含む;
前記キメラ抗原受容体が、
ヒトIL-13又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む;
前記CARが、前記IL-13又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む;
前記スペーサー領域が、配列番号4,14~20,50及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む;
前記キメラ抗原受容体が、配列番号10及び31~48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
前記CAR T細胞がIL13Rα2を標的とし、かつ、
ヒトIL-13又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸分子;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
少なくとも1つの共刺激(costimulatory)ドメイン;及び
1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。ある実施形態では、
前記共刺激ドメインが、CD28共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される;
ヒトIL-13の前記変異体が、IL13Rα2対IL13Rα1の結合特異性を高める1~10個のアミノ酸修飾がある;
前記ヒトIL-13又はその変異体が、1~5個のアミノ酸修飾がある配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-13変異体であり、ただし、配列番号3の11位はE以外である;
前記キメラ抗原受容体が、CD28共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメインを含む;
前記キメラ抗原受容体が、CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメインを含む;
前記キメラ抗原受容体が、
ヒトIL-13又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む;
前記CARが、前記IL-13又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む;
前記スペーサー領域が、配列番号4,14~20,50及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む;
前記キメラ抗原受容体が、配列番号10及び31~48からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、T細胞は、HER2に結合するキメラ抗原受容体を発現し、
HER2標的化ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸分子;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3sの膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
CD28共刺激ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体及び4-1BB共刺激ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体から選択される共刺激ドメイン;及び
1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3sシグナル伝達ドメイン;
を含む。特定の実施形態では、
前記HER2標的化ドメインがHER2 scFvである;
前記HER2 scFvはアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(配列番号49)
又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体を含む;
前記キメラ抗原受容体が、
HER2標的化配列;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3sの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体及び4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体から選択される共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3sシグナル伝達ドメイン;
前記核酸分子が、配列番号26及び27から選択されるアミノ酸配列又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体を含むポリペプチドを発現する。
HER2標的化ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸分子;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3sの膜貫通ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
CD28共刺激ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体及び4-1BB共刺激ドメイン又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体から選択される共刺激ドメイン;及び
1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3sシグナル伝達ドメイン;
を含む。特定の実施形態では、
前記HER2標的化ドメインがHER2 scFvである;
前記HER2 scFvはアミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(配列番号49)
又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体を含む;
前記キメラ抗原受容体が、
HER2標的化配列;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3sの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体及び4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体から選択される共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3sシグナル伝達ドメイン;
前記核酸分子が、配列番号26及び27から選択されるアミノ酸配列又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体を含むポリペプチドを発現する。
また本明細書に記載されるのは、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、有効量のT細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の解剖学的コンパートメントに注入することを含み、前記解剖学的コンパートメントは脳脊髄液(CSF)を収容する、方法である。様々な実施形態では、
前記解剖学的コンパートメントが脳室系の部分を含む;
前記解剖学的コンパートメントが脊髄の中心管の部分を含む;
前記中枢神経系の前記悪性腫瘍が脳腫瘍を包含する;
前記中枢神経系の前記悪性腫瘍が転移した腫瘍を包含する;
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約50mLの連続体積を収容する;
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約100mLの連続体積を収容する;
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約150mLの連続体積を収容する。
前記解剖学的コンパートメントが脳室系の部分を含む;
前記解剖学的コンパートメントが脊髄の中心管の部分を含む;
前記中枢神経系の前記悪性腫瘍が脳腫瘍を包含する;
前記中枢神経系の前記悪性腫瘍が転移した腫瘍を包含する;
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約50mLの連続体積を収容する;
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約100mLの連続体積を収容する;
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約150mLの連続体積を収容する。
本明細書に記載の方法によって治療することができるがんとしては、
腫瘍は、以下の:原発性CNS悪性腫瘍及び他の場所にあるがんに起因する続発性悪性腫瘍、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質がん、AIDS関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形性/ラブドイド腫瘍、中枢神経系、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系癌、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、大腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、胚性腫瘍、中枢神経系、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、骨の繊維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢がん、胃(gastric, stomach)がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、軟部組織肉腫、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛状細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞(肝臓)がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝細胞がん(原発性)、膵臓がん(原発性)、上皮内小葉がん(LCIS)、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳がん、骨悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、NUT遺伝子関与の原発性中線管がんを伴う転移性扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成腫瘍/骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫(神経芽腫)、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔(oral)がん、口腔(oral cavity)がん、中咽頭がん、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽腫(松果体芽細胞腫)、小脳テント上皮型原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳がん、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞(腎臓)がん、腎盂尿管がん、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平細胞がん、扁平上皮がん、扁平上皮頸部がん、胃(stamach, gastric)がん、小脳テント上室性原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、皮膚がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂尿管がんの移行上皮がん、絨毛腫瘍、尿管がん、腎盂がん、尿道がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍、からなる群から選択されるがんがあげられる。
腫瘍は、以下の:原発性CNS悪性腫瘍及び他の場所にあるがんに起因する続発性悪性腫瘍、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質がん、AIDS関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形性/ラブドイド腫瘍、中枢神経系、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系癌、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、大腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、胚性腫瘍、中枢神経系、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、骨の繊維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢がん、胃(gastric, stomach)がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、軟部組織肉腫、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛状細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞(肝臓)がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝細胞がん(原発性)、膵臓がん(原発性)、上皮内小葉がん(LCIS)、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳がん、骨悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、NUT遺伝子関与の原発性中線管がんを伴う転移性扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成腫瘍/骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫(神経芽腫)、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔(oral)がん、口腔(oral cavity)がん、中咽頭がん、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽腫(松果体芽細胞腫)、小脳テント上皮型原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳がん、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞(腎臓)がん、腎盂尿管がん、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平細胞がん、扁平上皮がん、扁平上皮頸部がん、胃(stamach, gastric)がん、小脳テント上室性原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、皮膚がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂尿管がんの移行上皮がん、絨毛腫瘍、尿管がん、腎盂がん、尿道がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍、からなる群から選択されるがんがあげられる。
ある実施形態では、開示された方法により治療される前記悪性腫瘍が腫瘍を含む。ある実施形態では、治療が、腫瘍体積の少なくとも50%の減少、腫瘍体積の少なくとも60%の減少、腫瘍体積の少なくとも70%の減少、腫瘍体積の少なくとも80%の減少、腫瘍体積の少なくとも90%の減少をもたらす。及びある実施形態では、前記治療が前記悪性腫瘍の排除をもたらす。
ある実施形態では、前記患者がグレード3以上の毒性を経験しない。
ある実施形態では、有効量のT細胞を含む前記組成物で処置する前に、前記患者にステロイドのレジメン(regimen)を投与した。及びある実施形態では、前記ステロイドのレジメンが、前記治療の後により低い用量に低減される。
ある実施形態では、前記患者が、放射線療法、小分子薬物療法、抗体療法、又はそれらの組み合わせを包含する、標準治療を受けている患者と比較して平均余命が長い。ある実施形態では、標準治療(standard of care)(「SOC」)処置を受けている前記患者は、初期診断から約15ヶ月生存することを期待することができ(全生存期間又はOS)、前記開示された治療を受けた患者は15,20,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36カ月又はそれ以上のOSを期待できる。ある実施形態では、前記請求された治療を受ける患者は、42,48,54,60,66,72,78,84,90カ月以上のOSを期待できる。
ある実施形態では、前記組成物は少なくとも2×106個のT細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する2×106個のT細胞を含む一方、ある実施形態では、前記組成物は少なくとも1×106個のT細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する1×106個のT細胞を含む。ある実施形態では、前記組成物は少なくとも5×106個のT細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する5×106個のT細胞を含む一方、ある実施形態では、前記組成物は少なくとも10×106個のT細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現する10×106個のT細胞を含む。ある実施形態では、前記開示された方法は、前記組成物の反復投与、例えば、前記組成物の少なくとも5回投与を反復すること、前記組成物の少なくとも10回投与を反復すること、又は前記患者が少なくとも90×106個のT細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現するT細胞の全用量を受けるまでの投与を反復すること、を含んだ。ある実施形態では、前記投与は1週間に1回又は2週間に1回繰り返される。ある実施形態では、前記反復投与は15週間にわたって継続される。
また本明細書に開示されるのは、患者の脳脊髄液(CSF)における少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインのレベルを高める方法であって、
有効量のT細胞を含む組成物を中枢神経系の悪性腫瘍がある患者の前記CSFに投与することを含み、
前記CSF中の少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のT細胞を含む前記組成物の投与後に高まる、方法である。
有効量のT細胞を含む組成物を中枢神経系の悪性腫瘍がある患者の前記CSFに投与することを含み、
前記CSF中の少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のT細胞を含む前記組成物の投与後に高まる、方法である。
開示された方法のある実施形態では、前記投与後の前記CSF中の前記少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインのレベルが、前記ベースラインレベルと比較して10倍又は5倍高まる。
ある実施形態では、少なくとも5つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも5つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のT細胞を含む前記組成物の投与後に高まる。ある実施形態では、前記少なくとも1つのサイトカイン又はケモカインがEGF、エオタキシン、FGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IFN-α、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Rα、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIG、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-α、又はVEGFを含む。ある実施形態では、サイトカインもしくはケモカイン発現で高まるのは局所的増加(即ち、前記CSFに特異的)である。
また本明細書に開示されるのは、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の脳脊髄液(CSF)において観察されるベースライン数と比較して、少なくとも約5日間、T細胞数の増加したままで持続させる方法であって、
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者のCSFへの有効量のT細胞を注入するステップを含み、
前記注入ステップの前に観察されたベースライン数と比較して観察されたT細胞数の
増加数が少なくとも約5日間持続する、方法である。
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者のCSFへの有効量のT細胞を注入するステップを含み、
前記注入ステップの前に観察されたベースライン数と比較して観察されたT細胞数の
増加数が少なくとも約5日間持続する、方法である。
ある実施形態では、有効量のT細胞(又は前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面受容体を発現するT細胞)が、約1×106個の細胞から約100×106個の細胞の範囲である。及びある実施形態では、有効量のT細胞が、約2×106個の細胞から約50×106個の細胞の範囲である。
ある実施形態では、観察されたT細胞数の前記増加数が、少なくとも約6日間持続する、又は観察されたT細胞数が約7日間、前記ベースライン数に戻らない。
ある実施形態では、前記観察されたT細胞が、注入された(infused)T細胞(例えばCAR発現T細胞)を包含する。及びある実施形態では、前記観察されたT細胞が内因性T細胞を包含する。
また本明細書に開示されるのは、患者の脳脊髄液(CSF)におけるT細胞の数を高める方法であって、
有効量のT細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍がある患者の前記CSFに投与するステップを含み、
前記CSF中で検出可能なT細胞の数は、前投与(pre-administration)レベルと比較して高まる、方法である。
有効量のT細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍がある患者の前記CSFに投与するステップを含み、
前記CSF中で検出可能なT細胞の数は、前投与(pre-administration)レベルと比較して高まる、方法である。
ある実施形態では、前記CSF中で検出可能なT細胞の数が、投与後7日間までの間、前投与(pre-administration)レベルと比較して高い。ある実施形態では、前記CSFにおいて検出可能な前記T細胞が、内因性T細胞及びCAR発現T細胞、及び/又は1型T細胞、及び/又は2型T細胞を含む。
ある実施形態では、前記CSFにおいて検出可能な前記T細胞は、CD3+ T細胞を含む。及びある実施形態では、前記CSFにおいて検出可能な前記T細胞は、CD14+ CD11b+ HLA-DR+成熟骨髄集団を含む。ある実施形態では、CD19+ B細胞及びCD11b+ CD15+顆粒球が、前記組成物の投与後に前記CSFにおいて検出することができる。
ある実施形態では、反応性リンパ球、単球、及びマクロファージが、前記組成物の投与後に前記CSFにおいて検出することができる。
また本明細書に開示されるのは、IL-13Rα2特異的CAR T細胞における治療のための悪性腫瘍と診断された患者の適合性を決定する方法であって、前記患者由来の試料に起因するスコアが所定の閾値を上回るIL-13Rα2発現を示すかどうかを決定することを含む方法である。
ある実施形態では、前記IL-13Rα2のマーカーで免疫組織化学的に染色し、前記染色強度を分析し、及び、前記染色強度に基づくスコアを計算することにより、悪性腫瘍と診断された患者由来の切除腫瘍試料の免疫反応性を決定することにより、前記試料に起因する前記スコアが計算され、
前記試料中の中程度から強い染色強度に対応するスコアは、IL-13Rα2特異的CAR T細胞における治療が前記患者に適していることを示す。ある実施形態では、前記スコアが、弱い、中程度の、又は強い染色強度がある細胞の数をカウントすること、各強度に重みを割り当てることを含む(Hスコア、免疫組織化学的結果を定量する方法は、以下の式:
(3×強い染色の細胞のパーセンテージ)+(2×中程度の染色の細胞のパーセンテージ)+(1×弱い染色の細胞のパーセンテージ)、
に基づき、0~300の範囲になる)。前記患者は、関連する腫瘍関連抗原について、50を超える,50~100、100を超える,100~200、200を超える,100~300、又は250を超えるHスコアがある場合がある。ある実施形態では、試料中のKi67の発現も、免疫組織化学染色によって決定される。
前記試料中の中程度から強い染色強度に対応するスコアは、IL-13Rα2特異的CAR T細胞における治療が前記患者に適していることを示す。ある実施形態では、前記スコアが、弱い、中程度の、又は強い染色強度がある細胞の数をカウントすること、各強度に重みを割り当てることを含む(Hスコア、免疫組織化学的結果を定量する方法は、以下の式:
(3×強い染色の細胞のパーセンテージ)+(2×中程度の染色の細胞のパーセンテージ)+(1×弱い染色の細胞のパーセンテージ)、
に基づき、0~300の範囲になる)。前記患者は、関連する腫瘍関連抗原について、50を超える,50~100、100を超える,100~200、200を超える,100~300、又は250を超えるHスコアがある場合がある。ある実施形態では、試料中のKi67の発現も、免疫組織化学染色によって決定される。
また本明細書に開示されるのは、悪性腫瘍と診断された患者に、IL-13Rα2特異的CAR T細胞の有効量を含む組成物を投与することを含む、悪性腫瘍患者を治療する方法であって、前記患者が所定の閾値を上回るIL-13Rα2を発現する工程を含む方法である。
ある実施形態では、IL-13Rα2発現の前記所定の閾値が、IL-13Rα2特異的CAR T細胞療法を含む治療に好適であるとして以前に同定された。
TILは、患者又はドナーから単離し、ex vivoで増殖させ、それが必要な患者に再注入することができる腫瘍浸潤リンパ球である。
CAR T細胞は、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラT細胞受容体を発現する。前記細胞外ドメインは、標的細胞に結合する部分、及び場合により例えばヒトFcドメインの部分を含むスペーサーを包含する。前記膜貫通部分は、適当な膜貫通ドメイン、例えば、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD3膜貫通ドメイン又は4IBB膜貫通ドメインを包含する。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメイン(CD3ζ)及び1つ以上の共刺激ドメイン、例えば、4-1BB共刺激ドメインを包含する。細胞外ドメインの前記標的細胞結合部分(例えば、scFv又はリガンド)は、前記CARが、T細胞の表面上に発現された場合、標的細胞表面分子を発現する細胞、例えばHER2又はIL13Rα2、悪性神経膠腫細胞を包含する腫瘍細胞の表面に発現する受容体、にT細胞活性を指向させることができる。
様々な異なるT細胞、例えば患者特異的な自己T細胞は、TCR又はCARを発現するように組換えることができる。様々なT細胞サブセットを用いることができる。さらに、CARは、NK細胞などの他の免疫細胞で発現されることができる。患者がCAR又はTCRを発現する免疫細胞で治療される場合、その細胞は自己又は同種異系T細胞であってよい。いくつかの場合、用いられる細胞は、CD45RO+ CD62L+であるCD4+及びCD8+セントラルメモリーT細胞(TCM)であり、そのような細胞の使用は、他のタイプの患者特異的T細胞の使用と比較して、養子移植後の当該細胞の長期持続性を改善することができる。前記TCM細胞は、CD4+細胞及びCD8+細胞を包含することができる。
本明細書に記載の方法において有用なCARの中には、IL13Rα2を標的とするものがある。そのようなCARは、結合特異性を高めるアミノ酸修飾(例えば、E13Y突然変異)があるIL13を包含し得る。
本明細書に記載の方法で用いられるT細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子を含有することができる。その場合、前記キメラ抗原受容体は、
ヒトIL-13又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。
ヒトIL-13又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。
共刺激ドメインの包含(the inclusion)、例えば細胞内領域のCD3ζと直列の4-1BB(CD137)又はCD28補助刺激ドメインにより、T細胞が共刺激シグナルを受け取ることができる。したがって、様々な実施形態では、前記共刺激ドメインは、CD28共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体が存在する。
本方法のさらなる実施形態では、
前記T細胞によって発現される前記CARは、IL13Rα2対IL13Rα1の結合特異性を高める1~10個のアミノ酸修飾があるヒトIL-13の変異体を含む;
前記ヒトIL-13又はその変異体が、1~5個のアミノ酸修飾がある配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-13変異体であり、ただし、配列番号3の11位はE以外である;
CD28共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
前記キメラ抗原受容体が、CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
ヒトIL-13又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
前記IL-13又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域(前記スペーサー領域が、配列番号4,14~20,50及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む);
前記スペーサーはIgGヒンジ領域を含む;
前記スペーサー領域は10~150個のアミノ酸を含む;
前記4-1BBシグナル伝達ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;
前記CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含む;及び
前記共刺激ドメインとC前記D3ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する3~15個のアミノ酸のリンカー。2つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は4-1BB共刺激ドメインであり、他方はCD28及びCD28ggから選択される共刺激ドメインである。
前記T細胞によって発現される前記CARは、IL13Rα2対IL13Rα1の結合特異性を高める1~10個のアミノ酸修飾があるヒトIL-13の変異体を含む;
前記ヒトIL-13又はその変異体が、1~5個のアミノ酸修飾がある配列番号3のアミノ酸配列を含むIL-13変異体であり、ただし、配列番号3の11位はE以外である;
CD28共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
前記キメラ抗原受容体が、CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
ヒトIL-13又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
前記IL-13又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域(前記スペーサー領域が、配列番号4,14~20,50及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む);
前記スペーサーはIgGヒンジ領域を含む;
前記スペーサー領域は10~150個のアミノ酸を含む;
前記4-1BBシグナル伝達ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;
前記CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含む;及び
前記共刺激ドメインとC前記D3ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する3~15個のアミノ酸のリンカー。2つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は4-1BB共刺激ドメインであり、他方はCD28及びCD28ggから選択される共刺激ドメインである。
本明細書に記載の方法のある実施形態では、
T細胞は、配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する核酸分子が内部にある;
前記キメラ抗原受容体は、
配列番号11のアミノ酸を含むIL-13/IgG4/CD4t/41-BB領域と、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインとを含む;
前記キメラ抗原受容体は、配列番号10及び31~48のアミノ酸配列を含む。
T細胞は、配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する核酸分子が内部にある;
前記キメラ抗原受容体は、
配列番号11のアミノ酸を含むIL-13/IgG4/CD4t/41-BB領域と、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むCD3ζシグナル伝達ドメインとを含む;
前記キメラ抗原受容体は、配列番号10及び31~48のアミノ酸配列を含む。
また開示されるのは、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトT細胞の集団の脳室内投与を含む方法である。キメラ抗原受容体が、
ヒトIL-13又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。様々な実施形態では、ヒトT細胞の前記集団は、
配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含む;
ヒトT細胞の前記集団は、セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)を含む(例えば、前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM細胞であり;前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%又は35%がCD4+であり、前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%又は35%がCD8+細胞である)。
ヒトIL-13又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。様々な実施形態では、ヒトT細胞の前記集団は、
配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含む;
ヒトT細胞の前記集団は、セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)を含む(例えば、前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM細胞であり;前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%又は35%がCD4+であり、前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%又は35%がCD8+細胞である)。
また記載されるのは、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトT細胞の集団(例えば、TCM細胞を含む自己又は同種異系T細胞;前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM細胞である;前記TCM細胞の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%がCD4+であり、前記TCM細胞の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%がCD8+細胞である)のCNS投与を含む患者のがんを治療する方法であって、キメラ抗原受容体が、配列番号10及び31~48から選択される選択されたアミノ酸配列を含む、方法である。様々な実施形態では、
ヒトT細胞の前記集団はセントラルメモリーT細胞を含む;
前記がんはグリア芽腫である;及び
前記患者からT細胞を取得すること、セントラルメモリーT細胞を単離するため前記T細胞を処置すること、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを、前記セントラルメモリー細胞の少なくとも部分に形質導入すること、を含む方法であって、キメラ抗原受容体が配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列を含む、方法によって調製される場合、前記形質導入されたヒトT細胞
である。
ヒトT細胞の前記集団はセントラルメモリーT細胞を含む;
前記がんはグリア芽腫である;及び
前記患者からT細胞を取得すること、セントラルメモリーT細胞を単離するため前記T細胞を処置すること、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを、前記セントラルメモリー細胞の少なくとも部分に形質導入すること、を含む方法であって、キメラ抗原受容体が配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列を含む、方法によって調製される場合、前記形質導入されたヒトT細胞
である。
また記載されるのは方法である。前記患者に投与された前記T細胞が、
配列番号10及び配列番号10及び31~48から選択さ
れるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号10及び配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;及び
2個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号10及び配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
が内部にある。
配列番号10及び配列番号10及び31~48から選択さ
れるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号10及び配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;及び
2個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号10及び配列番号10及び31~48から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
が内部にある。
本明細書に記載されるのは、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸分子が内部にあるT細胞のCSF投与によって患者を治療する方法である。前記キメラ抗原受容体は、
HER2を標的とするscFv(例えば、アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS; 配列番号49を含む)又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体;
スペーサー領域;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。
HER2を標的とするscFv(例えば、アミノ酸配列:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS; 配列番号49を含む)又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体;
スペーサー領域;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。
様々な実施形態では、前記共刺激ドメインは、CD28共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、OX40共刺激ドメイン又は1~10(例えば1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体が存在する。
追加の実施形態では、患者に投与されたT細胞は、CARを発現し、前記CARは、
HER2を標的とするscFv(例えば、ヒト化scFv);
CD28共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
ヒトIL-13又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
前記IL-13又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域(例えば、前記スペーサー領域は配列番号4,14~20,50及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む);
前記スペーサーはIgGヒンジ領域を含む;
前記スペーサー領域は10~150個のアミノ酸を含む;
前記4-1BBシグナル伝達ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;
前記CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含む;
前記共刺激ドメインと前記CD3ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する3~15個のアミノ酸のリンカー;
を含む。2つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は4-1BB共刺激ドメインであり、他方はCD28及びCD28ggから選択される共刺激ドメインである。
HER2を標的とするscFv(例えば、ヒト化scFv);
CD28共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1~10(例えば、1又は2)個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
CD28共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、4-1BB共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びOX40共刺激ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体からなる群から選択される2つの異なる共刺激ドメイン;
ヒトIL-13又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
共刺激ドメイン;及び
1~2個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
前記IL-13又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域(例えば、前記スペーサー領域は配列番号4,14~20,50及び52からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む);
前記スペーサーはIgGヒンジ領域を含む;
前記スペーサー領域は10~150個のアミノ酸を含む;
前記4-1BBシグナル伝達ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む;
前記CD3ζシグナル伝達ドメインは、配列番号7のアミノ酸配列を含む;
前記共刺激ドメインと前記CD3ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する3~15個のアミノ酸のリンカー;
を含む。2つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は4-1BB共刺激ドメインであり、他方はCD28及びCD28ggから選択される共刺激ドメインである。
ある実施形態では、患者に投与されたT細胞は、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する核酸分子が内部にある。
また開示されるのは、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトT細胞の集団の脳室内投与を含む方法であり、
HER2を標的とするscFv;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
補助刺激ドメイン;及び
1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。様々な実施形態では、ヒトT細胞の前記集団は、
配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含む;
ヒトT細胞の前記集団は、セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)を含む(例えば、前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM細胞であり;前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%がCD4+であり、及び/又は前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%がCD8+細胞である)。
HER2を標的とするscFv;
CD4の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28の膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζの膜貫通ドメイン又は1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体、から選択される膜貫通ドメイン;
補助刺激ドメイン;及び
1~10個のアミノ酸修飾があるその変異体のCD3ζシグナル伝達ドメイン;
を含む。様々な実施形態では、ヒトT細胞の前記集団は、
配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含む;
ヒトT細胞の前記集団は、セントラルメモリーT細胞(TCM細胞)を含む(例えば、前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%がTCM細胞であり;前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%がCD4+であり、及び/又は前記T細胞又は前記TCM細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%がCD8+細胞である)。
また記載されるのは、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトT細胞の集団(例えば、TCM細胞を
含む自己又は同種異系T細胞;例えば、前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%はTCM細胞である;前記TCM細胞の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%がCD4+であり、及び/又は前記TCM細胞の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%がCD8+細胞である)の脳室内投与を含む患者のがんを治療する方法であって、キメラ抗原受容体が配列番号53~56から選択されたアミノ酸配列を含む、方法である。様々な実施形態では、
ヒトT細胞の前記集団はセントラルメモリーT細胞を含む;
前記がんはグリア芽腫である;及び
前記患者からT細胞を取得すること、セントラルメモリーT細胞を単離するため前記T細胞を処置すること、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを、前記セントラルメモリー細胞の少なくとも部分に形質導入すること、を含む方法であって、キメラ抗原受容体が配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列を含む、方法によって調製される場合、前記形質導入されたヒトT細胞。
含む自己又は同種異系T細胞;例えば、前記細胞の少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%はTCM細胞である;前記TCM細胞の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%がCD4+であり、及び/又は前記TCM細胞の少なくとも15%、20%、25%、30%、35%がCD8+細胞である)の脳室内投与を含む患者のがんを治療する方法であって、キメラ抗原受容体が配列番号53~56から選択されたアミノ酸配列を含む、方法である。様々な実施形態では、
ヒトT細胞の前記集団はセントラルメモリーT細胞を含む;
前記がんはグリア芽腫である;及び
前記患者からT細胞を取得すること、セントラルメモリーT細胞を単離するため前記T細胞を処置すること、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを、前記セントラルメモリー細胞の少なくとも部分に形質導入すること、を含む方法であって、キメラ抗原受容体が配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列を含む、方法によって調製される場合、前記形質導入されたヒトT細胞。
また記載されるのは、自己又は同種異系のヒトT細胞の集団の脳死内投与を含む患者のがんを治療する方法である。(例えば、TCM細胞を含む自己又は同種異系T細胞は、
配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;及び
2個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
が内部にある。
配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
5個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;及び
2個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号53~56から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
が内部にある。
本明細書中に記載される特定のCAR、例えばIL13(EQ)BBζCAR及びIL13(EQ)CD28-BBζCARは、特定の他のIL13標的化CARと比較してある有益な特徴がある。例えば、それらはIL13Rαに対する改善された選択性を有し、低いTh2サイトカイン産生、特にI低いL13産生を誘発する(elicit)。
IL13Rα2を標的とするCARを発現するT細胞は、膠芽腫などのがん、並びにIL13Rα2を発現する他のがんの治療に有用であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載のCARを発現するT細胞を用いてがんを治療するための方法を包含する。
HER2を標的とするCARを発現するT細胞は、膠芽腫などのがん、並びにHER2を発現する他のがん、例えば中枢神経系に広がっている乳がんの治療に有用であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載のCARを発現するT細胞を用いてがんを治療するための方法を包含する。
本明細書に記載のCARは、前記標的化ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を包含することができる。様々な異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかは、ヒトFc領域の少なくとも部分、例えばヒトFc領域のヒンジ部分又はCH3ドメイン又はその変異体を包含する。以下の表1は、本明細書に記載されるCARにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)ヒンジ領域の全部又は部分、すなわち免疫グロブリンのCH1及びCH2ドメイン間に該当する配列、例えばIgG4 Fcヒンジ又はCD8ヒンジ、を包含する。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンCH3ドメイン又はCH3ドメイン及びCH2ドメインの両方を包含する。免疫グロブリン由来の配列は、1つ以上のアミノ酸修飾、例えば1,2,3,4又は5個の置換、例えばオフターゲット結合を減少させる置換を包含することができる。
「アミノ酸修飾」とは、アミノ酸置換、挿入、及び/又は欠失をいう。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、特定の位置でのアミノ酸の置換をいい、「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の一におけるアミノ酸を、別のアミノ酸で置換することをいう。得られたタンパク質のアミノ酸を非保存的に(すなわち、特定のサイズ又は特徴があるアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸にコドンを変化させることによって)、又は保存的に(すなわち、特定のサイズ又は特徴があるアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって)変化させるために置換することができる。このような保存的変化では、一般に、得られるタンパク質の構造及び機能の変化はより少ない。以下は、アミノ酸の様々なグループの例である:
1)非極性R基があるアミノ酸: アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン;
2)非荷電極性R基があるアミノ酸: グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン;
3)荷電した極性R基があるアミノ酸(pH6.0で負に荷電した):アスパラギン酸、グルタミン酸; 4)塩基性アミノ酸(pH6.0で正に帯電):アスパラギン酸、グルタミン酸;
4)塩基性アミノ酸(pH6.0で正に帯電):リシン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0で)。
別のグループは、フェニル基があるアミノ酸であってよい:フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン。
1)非極性R基があるアミノ酸: アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン;
2)非荷電極性R基があるアミノ酸: グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン;
3)荷電した極性R基があるアミノ酸(pH6.0で負に荷電した):アスパラギン酸、グルタミン酸; 4)塩基性アミノ酸(pH6.0で正に帯電):アスパラギン酸、グルタミン酸;
4)塩基性アミノ酸(pH6.0で正に帯電):リシン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0で)。
別のグループは、フェニル基があるアミノ酸であってよい:フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン。
本明細書に記載の方法で用いられる細胞によって発現されるCARが、様々な膜貫通ドメインで用いられてよい。表2は、適当な膜貫通ドメインの例を包含する。スペーサー領域が存在する場合、前記膜貫通領域は前記スペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
本明細書に記載の方法で用いられる細胞によって発現されるCARの多くは、1つ以上(例えば、2つ)の共刺激ドメインを含む。前記共刺激ドメイン(複数可)は、前記膜貫通ドメインと前記CD3ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表3は、前記CD3ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適当な共刺激ドメインの例を包含する。
以下に、様々なCAR T細胞の構造、構築及び特徴付け、及び中枢神経系のがんの治療におけるそれらの使用について説明する。キメラ抗原受容体(CAR)は、最低でも、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいずれの分子に限定される。例えば、CARは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを包含することができる。細胞外認識ドメイン(細胞外ドメイン又は単にそれが含有する認識要素ともいう)は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は膜中にCARを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、必要に応じて1つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。CARは、MHC制限とは両方とも無関係に、抗原に結合し、かつ、T細胞活性化を形質導入することができる。したがって、CARは、そのHLA遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍がある患者集団を治療することができる「普遍的な(universal)」免疫受容体である。腫瘍特異的CARを発現するTリンパ球を用いた養子免疫療法は、がん治療のための強力な治療戦略となり得る。
本明細書に記載のCARは、CARオープンリーディングフレームの後、T2Aリボソームスキップ配列及び細胞質シグナル伝達尾部がない(アミノ酸323で切断された)切断型CD19(CD19t)が続く、ベクターを用いて作製することができる場合がある。この装置(arrangement)により、CD19tの同時発現によって、遺伝子修飾細胞を正確に測定でき、かつ、遺伝子修飾細胞をポジティブに選択できる不活性で非免疫原性の表面マーカーを、並びに、養子移植後の、効率的な細胞追跡及び/又はインビボでの治療用T細胞のイメージングを提供する。CD19tの同時発現は、治療細胞を選択的に除去するため、臨床的に利用可能な抗体及び/又は免疫毒素試薬をインビボで用いて、形質導入細胞の免疫学的標的化のための、及びそれによって自殺スイッチとして機能するマーカーを提供する。
CAR T細胞を用いた開示された治療方法は、様々な用量で、そして様々な時間枠にわたって実施することができる。例えば、CAR T細胞(例えば、IL-13Rα2特異的CAR T細胞)の注入、投与又は注射を受けている患者は、1×106~15×106個の細胞を含む単一用量を受け得る。言い換えれば、開示された方法で用いるための単一用量は、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、10×106、11×106、12×106、13×106、14×106、又は15×106個の細胞を含むことができる。全治療期間にわたって、患者は、20×106~150×106個のT細胞の累積又は総用量の細胞を受け取ることができる。例えば、前記患者は、治療期間にわたって、約20×106、約25×106、約30×106、約35×106、約40×106、約45×106、約50×106、約55×106、約60×106、約65×106、約70×106、約75×106、約80×106、約85×106、約90×106、約95×106、約100×106、約105×106、約110×106、約115×106、約120×106、約125×106、約130×106、約140×106、約145×106、又は約150×106個以上のT細胞を受けることができる。ある実施形態では、患者は、少なくとも90×106個のT細胞の総用量を受け取ることができる。一実施形態では、患者は、94×106個のT細胞の総用量を受けることができる。
さらに、用量は、異なるレジメン及び時間表に従って投与され得る。例えば、開示された方法は、注入、投与、又は注射を、1日1回、2日に1回、3日に1回、4日に1回、5日に1回、6日に1回、1週間、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、1ヶ月に1回、隔月に1回、3ヶ月に1回、又は6ヶ月に1回、含むことができる。ある実施形態では、開示された方法は、例えば着用可能なポンプからの連続注入を含むことができる。同様に、治療の全時間経過は、約5週間、約10週間、約15週間、約20週間、約25週間、約30週間、約35週間、約40週間、約45週間、約50週間、約55週間、約60週間、約65週間、約70週間、約75週間、又はそれ以上であってよい。前記患者は、開示された方法による処置の過程にわたるT細胞の注入、投与、又は注射投与を、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19、又は20回以上受けてもよい。例えば、一実施形態では、患者は15週間にわたって11回のT細胞注入を受けることができる。
開示された方法に従って、がん、より具体的には神経膠芽腫のような神経膠腫を治療することにより、多数の治療効果をもたらされうる。例えば、開示されたCAR T細胞による治療は、開示された方法に従って治療される患者のCSF中のサイトカイン及びケモカインのレベルを高めることができる。サイトカイン及び/又はケモカインの発現は、サイトカイン及び/又はケモカインの発現が、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは少なくとも100%だけ増加し得るか、又はサイトカイン及び/又はケモカイン発現は、CARを含む組成物での処置前に測定したベースラインレベルと比較して、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、又は少なくとも10倍だけ増加し得る。この発現の増加は、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14、又は15以上のサイトカイン又はケモカインで観察され得る。
特に、EGF、エオタキシン、FGF、G-CSF、GM-CSF、HGF、IFN-α、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-1Rα、IL-1β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IP-10、MCP-1、MIG、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TNF-α、及びVEGFのうちの少なくとも1つの発現は、本明細書に開示するCAR T細胞における処置の結果として増加し得る。さらに、サイトカイン及び/又はケモカイン発現の増加は局所的であってよい(すなわち、CNS及びCFSにおいて増加が観察されるに過ぎず、サイトカイン及びケモカインの血清レベルは不変である)。
開示された方法による治療はまた、CSFにおいて検出可能なT細胞を高めうる。治療後にCSF中で検出可能なT細胞の少なくともいくつかはCAR発現T細胞である可能性が高いが、CSFに動員される(recruited)内因性T細胞の増加もありうる。理論に縛られることは望まないが、内因性T細胞の増加は、局所サイトカインレベルの増加に起因する1型及び2型Tヘルパー細胞の動員の結果であってよい。さらに、検出可能なT細胞は、CD3+ T細胞、並びにCD14+ CD11b+ HLA-DR+成熟骨髄集団、CD19+ B細胞及びCD11b+ CD15+顆粒球、及び/又は反応性リンパ球、単球及びマクロファージを含むことができる。
CSF中のT細胞の数の増加は、開示された方法による処置後の特定の期間、検出可能であってよい。CSF中のT細胞の検出可能な増加は、T細胞を含む組成物の投与後、1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29、又は30日以上の間、持続するか、又は持続し得る。例えば、CSF中に観察されるT細胞の数の増加は、約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29、又は30日の間、ベースラインレベル(すなわち、治療前に検出可能なT細胞の数)に戻らない可能性がある。CSF中で検出可能なT細胞の数は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、もしくは少なくとも100%だけ、又は、CAR T細胞を含む組成物での処置前に測定した、ベースラインレベルと比較して少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、少なくとも12倍、少なくとも13倍、少なくとも14倍、少なくとも15倍、もしくは少なくとも15倍だけ、増加し得る。
CAR T細胞の調製及び処置の時間経過を図31に示す。製造プロセスと同時に、研究参加者は腫瘍切除され、続いてRickhamカテーテルの配置及びベースラインイメージングを受けた。
患者UPN097は腫瘍切除を受け、第1サイクルにて2×106個の細胞で、第2サイクルにて10×106個の細胞で処置した。第1及び第2サイクルともに、細胞を切除によって残存する腔に投与した。第2サイクル後、急速な腫瘍進行のために患者UPN097が研究から離脱した。
患者UPN109を、第1サイクルにて2×106個の細胞で、第2サイクル及び3において10×106個の細胞で処置した。休息期間後、患者UPN109を第4,5及び6サイクルにおいて10×106個の細胞で処置した。第1~6サイクルでは、細胞を腫瘍内に投与した。第7サイクルでは、前記患者を2×106個の細胞で処置した。第8及び9サイクルでは、前記患者を10×106個の細胞で処置した。第7~10サイクルでは、投与は脳室内で行った。
本明細書で用いる用語「脳室内」は、脳室系の内部の空間、具体的に脳室をいう。したがって、用語「脳室内(intraventricular)」及び「脳室内(intracerebroventiricular)」は、本開示を通じて交換可能に用いられる。したがって、「脳室内投与」又は「脳室内注射」は、脳の脳室(ventricals)(すなわち、脳室(cerebral ventricles))への組成物の送達をいう。脳室は、前脳及び脳幹の中核に位置する一連の相互接続された流体充填空間である。このシステムは、4つの脳室、すなわち左右の側脳室(そのうちの1つは脳の各半球に見られる)、第3の脳室及び第4の脳室、を含む。
開示される方法は、T細胞を含む組成物を投与する様々な経路を含む。例えば、ある実施形態では、開示された組成物は、脳室内に送達又は投与され得る。ある実施形態では、開示された組成物は、脊柱管内に送達又は投与され得る(すなわち、髄腔内送達)。ある実施形態では、開示された組成物は、脊髄硬膜外腔内に送達又は投与され得る(すなわち、硬膜外送達)。ある実施形態では、開示された組成物を腫瘍に直接送達又は投与することができる(すなわち、腫瘍内送達)。ある実施形態では、開示される組成物は、腫瘍組織の切除によって形成された空洞に送達又は投与され得る(すなわち、空洞内送達)。さらに、ある実施形態では、開示される方法は、前述の投与経路の組み合わせを含み得る。例えば、患者は、腔内送達を介してT細胞を含む組成物の少なくとも1回の投与を受け、続いて脳室内送達を介して組成物の少なくとも1回の投与量を受け得る。
図32Aは、CD19によってモニターされるCAR T細胞持続性の分析を示す。この分析は、第2サイクルの8日後に良好なT細胞持続性を示す。図32Bは、IL13Rα2発現によってモニターされるGBM細胞の減少した存在を示す。
図33A及び図33Bは、腫瘍内投与のために用いられるカテーテルの領域における患者UPN097の画像化結果を示す。図33Aでは、CD3+又はCD8+ T細胞のほとんどが処置前に存在しない(few)ことが分かる。左前頭腫瘍腔壁から採取した治療後16日目の試料である図33Bは、壊死性腫瘍の大きな領域及びCD3+及びCD8+細胞の有意な存在を示す。
神経膠腫(gliomas,グリオーマ)は、IL13受容体、及び特に高親和性IL13受容体を発現する。しかしながら、IL13受容体とは異なり、神経膠腫細胞は、IL4Rβ又はγc44の必要条件とは無関係にIL13に結合することができるユニークなIL13Rα2鎖を過剰発現する。そのホモログIL4と同様に、IL13はCNSの外側に多面的な免疫調節活性がある。IL13及びIL4の両方は、Bリンパ球によるIgE産生を刺激し、マクロファージによる炎症促進性のサイトカイン産生を抑制する。放射性標識されたIL13によるオートラジオグラフィーを用いた詳細な研究は、研究されたほとんどすべての悪性神経膠腫組織に豊富なIL13結合を示した。この結合は、腫瘍切片内で及び単一細胞分析において非常に均一である。しかしながら、IL13Rα2mRNAに特異的な分子プローブ分析は、正常な脳要素による神経膠腫特異的受容体の発現を検出せず、かつ、放射性標識IL13によるオートラジオグラフィーも、正常なCNSにおける特異的IL13結合を検出できなかった。これらの研究は、共有されたIL13Rα1/IL4β/γc受容体が正常なCNSにおいて検出可能に発現されないことを示唆している。したがって、IL13Rα2は神経膠腫に対して高度に特異的な細胞表面標的であり、神経膠腫の治療のために設計されたCARに対して好適な標的である。
開示された治療方法を受けるためには、特定の患者が他の患者よりも適当であってよい。例えば、IL-13Rα2を高度に発現する悪性腫瘍がある患者は、開示されたCAR T細胞による治療から特に利益を得ることができる。患者の適合性は、IL-13Rα2の発現量を決定するために患者から切除された腫瘍試料を染色することによって決定することができる。前記試料は、弱い、中程度の、又は強い染色強度を示す細胞の数に基づいてスコアリングすることができる。Ki67の発現レベルを決定することはまた、疾患の攻撃性を決定するために有益であってよい。患者が開示されたCAR T細胞を受けるのに適していると決定されると、開示された方法に従って前記患者を治療することができる。
しかしながら、広く発現されるIL13Rα1/IL4β/γc受容体複合体へのIL13ベースの治療分子の結合は、CNS外の正常組織への望ましくない毒性を媒介する可能性を有し、及びしたがって、これらの薬剤(agents)の全身投与を制限する。ネイティブの(native)グルタミン酸に対するチロシンのアミノ酸13におけるIL13アルファヘリックスAにおけるアミノ酸置換は、IL13Rα1/IL4β/γc受容体に対するIL13の親和性を選択的に減少させる。しかしながら、この突然変異体(IL13(E13Y)という)のIL13Rα2への結合は、野生型IL13と比較して増加した。したがって、この修飾が最小限であるIL13類似体は、グリオーマ細胞に対するIL13の特異性及び親和性を同時に高める。従って、本明細書に記載されるCARは、アミノ酸13(Debinski et al. 1999 Clin Cancer Res 5:3143sのナンバリングによる)において突然変異(EからY、又はEから他のアミノ酸、例えばKもしくはRもしくはLもしくはV)を含有するIL13を包含する。しかしながら、天然の配列があるIL13も用いることができ、特に、修飾T細胞を腫瘍塊に直接注射するなどの局所的に投与する場合に有用であってよい。
さらに、神経膠腫は、一般に患者の予後が不良であることが知られている。例えば、多形性グリア芽細胞腫(GBM)は、CNSの一般的な悪性がんである。GBMに対する1年及び2年の相対生存率は、それぞれ29.6%及び9.0%である。GBM診断を受けた患者のわずか3.4%が5年以上生存する。さらに、外科的切除及び/又は他の従来の治療方法による処置後の再発が一般的である。現行の従来の治療には、放射線療法、小分子(例えば、テモゾロミド、イリノテカン、メシル酸イマチニブ、エルロチニブ、及びヒドロキシ尿素)、及び抗体(例えば、ベバシズマブ)などの生物製剤が含まれるが、これらに限定されない。
開示された治療方法は、現行の基準と比較して患者における臨床予後を改善する。例えば、開示された方法は、1年、2年及び5年の生存率を高めることができる。ある実施形態では、開示された方法に従って治療される患者の1年生存率は、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は少なくとも100%であってよい。ある実施形態では、開示される方法に従って治療される患者の2年生存率は、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は少なくとも100%であってよい。ある実施形態では、開示される方法に従って治療される患者の5年生存率は、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は少なくとも100%であってよい。
ある実施形態では、開示された方法はまた、放射線療法、小分子薬物療法、治療抗体のような治療用生物製剤、又はそれらの組み合わせを包含する、従来の治療又はSOC治療を受けている別の患者と比較して患者の平均余命を高める。SOC治療を受けている患者が初期診断から約15ヶ月生存することを期待できるある実施形態では(全生存(overall survival)即ちOS)、開示された治療を受けた患者は、25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36カ月又はそれ以上のOSを期待することができる。ある実施形態では、特許請求された治療を受けている患者は、42,48,54,60,66,72,78,84,90カ月以上のOSを期待することができる。
開示された方法は、様々な臨床成績を通じて患者の予後を改善することができる。例えば、開示された方法により、T細胞を含む組成物で処置される患者における腫瘍体積が減少されうる。ある実施形態では、開示された治療方法により、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は少なくとも100%の腫瘍体積が減少されうる。ある実施形態では、患者の腫瘍を完全に排除することができ、かつ、患者は悪性腫瘍を治癒することができる。
さらに、開示された方法は安全であり、十分な耐性がある。開示された方法により治療される患者は、重大な副作用を経験しない場合があり、さらに、補助薬剤の投与を中止することができる場合がある。例えば、ある実施形態では、開示された方法は、NCI共通毒性基準(Common Toxicity Criteria)(CTC)に従うグレード3以上の毒性をもたらさない。CTCは0~5の定量可能な尺度を提供する。0は有害事象なしを意味し、1は軽度を、2は中等度を、3は重度及び望ましくない、を、4は生命の脅威又は無能力を、5は死亡を意味する。したがって、副作用及び/又は毒性には、軽度又は中程度の頭痛、疲労、筋肉痛及び嗅覚性前兆等の軽度の神経系障害が含まれ得るが、高悪性度の毒性は回避される。
デキサメタゾンのようなステロイドは、脳浮腫のような神経学的副作用を予防するために、神経膠腫の臨床管理において一般に使用される。開示された治療方法は、そのような補助治療の必要性を減少させることができる。例えば、開示された方法による治療の前に患者がステロイド(例えば、デキサメタゾン)のレジメンを受けている場合、前記患者は、臨床的に有害な効果を経験することなくステロイドレジメンの用量を減らすか、ステロイドレジメンを完全に中止することができる。
乳がんの脳転移は、HER2を発現することができる。悪性神経膠腫の治療に有用な本明細書に記載のCARの特定のものは、HER2を標的とする。
本明細書中に記載されるCARは、当技術分野で公知のいずれの手段によって製造することができるが、好ましくは組換えDNA技術を用いて製造される。キメラ抗原受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の、手頃な(as is convenient)標準的な分子クローニング技術(ゲノムライブラリースクリーニング、PCR、プライマーアシストライゲーション、部位特異的突然変異誘発等)によって完全なコード配列に調製され、組み立てられ得る。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞株、好ましくはTリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Tリンパ球細胞株を形質転換するために用いられる。
非選択性PBMC又は富化CD3 T細胞又は豊富なCD3又はメモリーT細胞サブセットを包含する、患者から単離された様々なT細胞サブセットは、CAR発現のためのベクターで形質導入され得る。セントラルメモリーT細胞は、1つの有用なT細胞サブセットである。セントラルメモリーT細胞は、所望の受容体を発現する細胞を免疫学的に選択するために、例えばCliniMACS(登録商標)装置を用いて、CD45RO+/CD62L+細胞を選択することにより末梢血単核細胞(PBMC)から単離することができる。セントラルメモリーT細胞が富化された細胞は、例えばCARの発現を指示するSINレンチウイルスベクター、並びに短縮型ヒトCD19(CD19t)、インビボ検出及び潜在的なex vivo選択の両方のための非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗CD3/CD28で活性化することができる。活性化/遺伝子修飾されたセントラルメモリーT細胞は、IL-2/IL-15でインビトロで増殖され、次いで凍結保存され得る。
実施例1: IL13Rα2特異的CARの構築及び構造
有用なIL13Rα2特異的CARの構造を以下に記載する。コドン最適化CAR配列は、IL13Rα1、Fc受容体媒介認識モデルを大きく減少させる2つの突然変異(L235E; N297Q)を含有するIgG4 Fcスペーサー、CD4膜貫通ドメイン、共刺激4-1BB細胞質シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、への潜在的結合を低減するために、単部分位(E13Y)で突然変異した膜テザード(tethered)IL-13リガンド、を含有する。T2Aリボソームスキップ配列は、このIL13(EQ)BBζCAR配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出/選択マーカーであるCD19tから分離する。このT2A結合は、単一の転写産物からのIL13(EQ)BBζ及びCD19tの両方の同調発現をもたらす。図1Aは、IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t構築物をコードする2670ヌクレオチドのオープンリーディングフレームの概略図である。この図において、前記IL13(EQ)BBZ CARの、IL13Rα2特異的リガンドIL13(E13Y)、IgG4(EQ)Fc、CD4膜貫通、4-1BB細胞質シグナル伝達、3-グリシンリンカー、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにT2Aリボソームスキップ及び短縮型CD19配列はすべて示される。ヒトGM-CSF受容体α、及びIL13(EQ)BBZ CAR及びCD19tの表面発現を駆動するCD19シグナル配列も示される。従って、IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t構築物は、IL13Rα2特異的ヒンジ最適化共刺激キメラ免疫受容体配列(IL13(EQ)BBZと呼ばれる)、リボソームスキップT2A配列及びCD19t配列を包含する。
有用なIL13Rα2特異的CARの構造を以下に記載する。コドン最適化CAR配列は、IL13Rα1、Fc受容体媒介認識モデルを大きく減少させる2つの突然変異(L235E; N297Q)を含有するIgG4 Fcスペーサー、CD4膜貫通ドメイン、共刺激4-1BB細胞質シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、への潜在的結合を低減するために、単部分位(E13Y)で突然変異した膜テザード(tethered)IL-13リガンド、を含有する。T2Aリボソームスキップ配列は、このIL13(EQ)BBζCAR配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出/選択マーカーであるCD19tから分離する。このT2A結合は、単一の転写産物からのIL13(EQ)BBζ及びCD19tの両方の同調発現をもたらす。図1Aは、IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t構築物をコードする2670ヌクレオチドのオープンリーディングフレームの概略図である。この図において、前記IL13(EQ)BBZ CARの、IL13Rα2特異的リガンドIL13(E13Y)、IgG4(EQ)Fc、CD4膜貫通、4-1BB細胞質シグナル伝達、3-グリシンリンカー、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにT2Aリボソームスキップ及び短縮型CD19配列はすべて示される。ヒトGM-CSF受容体α、及びIL13(EQ)BBZ CAR及びCD19tの表面発現を駆動するCD19シグナル配列も示される。従って、IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t構築物は、IL13Rα2特異的ヒンジ最適化共刺激キメラ免疫受容体配列(IL13(EQ)BBZと呼ばれる)、リボソームスキップT2A配列及びCD19t配列を包含する。
ヒトGM-CSF受容体αリーダーペプチドと、IL13(E13Y)リガンド5L235E/N297Q修飾IgG4 Fcヒンジ(二重突然変異がFcR認識を妨害する)、CD4膜貫通、4-1BB細胞質シグナル伝達ドメイン、及びCD3ζ細胞質シグナル伝達ドメイン配列との融合によりIL13(EQ)BBZ配列を生成した。この配列は、コドン最適化後に新規に(de novo)合成された。T2A配列は、T2A含有プラスミドの消化から得た。CD19t配列は、CD19含有プラスミドの膜貫通成分(すなわち、塩基対1-972)までリーダーペプチド配列にまたがるもの(spanning)から得られた。全部で3つの断片、1)IL13(EQ)BBZ、2)T2A、及び3)CD19tを、epHIV7レンチウイルスベクターの多重クローニング部位にクローニングした。適当な細胞にトランスフェクトされると、ベクターは図1Bに模式的に示された配列を宿主細胞ゲノムに組み込む。図1Cは、9515塩基対IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7プラスミドそれ自体の模式図を提供する。
図2に模式的に示すように、IL13(EQ)BBZ CARは、IL13(E13Y)-ゼータカインと呼ばれる前述のIL13Rα2特異的CARといくつかの重要な点で異なる(Brown et al. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199)。IL13(E13Y)-ゼータカインは、示されるように、IL13Rα2特異的ヒトIL-13ムテイン(huIL-13(E13Y))、ヒトIgG4 Fcスペーサー(huγ4Fc)、ヒトCD4膜貫通(huCD4 tm)及びヒトCD3ζ鎖細胞質(huCD3ζ cyt)部分から構成される。対照的に、IL13(EQ)BBζ)は、IgG4スペーサーのCH2ドメインに位置する2つの点突然変異、L235E及びN297Q、及び共刺激4-1BB細胞質ドメイン(4-1BB cyt)がある。
実施例2: IL13Rα2特異的CARの発現に用いられるepHIV7の構築及び構造
pHIV7プラスミドは親プラスミドである。当該親プラスミドから、臨床ベクターIL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7がCity of Hope(COH)のT細胞治療研究所(TCTRL)において得られたCARの発現に用いたepHIV7ベクターは、pHIV7ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、CARの発現を駆動するためヒトEF1プロモーターを用いる。ベクターの5’及び3’配列は、以前はHXBc2プロウイルス由来のpv653RSN由来であった。ポリプリントラクトDNAフラップ配列(cPPT)は、NIH AIDS Reagent RepositoryからのHIV-1 pNL4-3株由来であった。ウッドチャック転写後調節要素(WPRE)配列は以前に記載される。
pHIV7プラスミドは親プラスミドである。当該親プラスミドから、臨床ベクターIL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7がCity of Hope(COH)のT細胞治療研究所(TCTRL)において得られたCARの発現に用いたepHIV7ベクターは、pHIV7ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、CARの発現を駆動するためヒトEF1プロモーターを用いる。ベクターの5’及び3’配列は、以前はHXBc2プロウイルス由来のpv653RSN由来であった。ポリプリントラクトDNAフラップ配列(cPPT)は、NIH AIDS Reagent RepositoryからのHIV-1 pNL4-3株由来であった。ウッドチャック転写後調節要素(WPRE)配列は以前に記載される。
pHIV7の構築を図3に概略的に示す。簡単に説明すると、介在するSL3-ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Neo)があるgag-polプラス5’及び3’長末端反復配列(LTR)由来の653bpを含有するpv653RSNは、以下のようにpBluescriptにサブクローニングされた。:
ステップ1では、5’LTRからrev応答要素(RRE)までの配列がp5’HIV-1 51を作成し、次いで前記5’LTRが、TATAボックスの上流の配列を除去することによって修飾され、及び最初にCMVエンハンサーに、次いでSV40複製起点にライゲーションした(p5’HIV-2)。ステップ2では、p3’HIV-1を作製するため3’LTRをpBluescriptにクローニングした後、HIV U3中のcis調節要素を除去し、p3’HIV-2を形成するため、3’LTRエンハンサー/プロモーターにおける400bpの欠失を行った。ステップ3では、pHIV-3を作成するため、p5’HIV-3及びp3’HIV-2から単離された断片をライゲーションした。ステップ4では、前記p3’HIV-3を生成するために、余分な上流のHIV配列を除去することによりp3’HIV-2をさらに修飾し、p3’HIV-4を作成するため、WPREを含有する600bpのBamHI-SalIフラグメントをp3’-3に添加した。ステップ5では、pHIV-3RREをPCRによりサイズを減少させ、及び、pHIV-6を作製するため、pHIV-3由来の5’断片に(図示せず)、及びp3’HIV-4にライゲーションした。ステップ6では、HIV-1 pNL4-3(55)由来のcPPT DNAフラップ配列を含有する190bpのBglII-BamHI断片をpNL4-3から増幅し、pHIV-7を作製するため、pHIV6におけるRRE配列とWPRE配列との間に配置した。この親プラスミドpHIV7-GFP(GFP、グリーン蛍光タンパク質(green fluorescent protein))は4-プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングするのに用いた。
ステップ1では、5’LTRからrev応答要素(RRE)までの配列がp5’HIV-1 51を作成し、次いで前記5’LTRが、TATAボックスの上流の配列を除去することによって修飾され、及び最初にCMVエンハンサーに、次いでSV40複製起点にライゲーションした(p5’HIV-2)。ステップ2では、p3’HIV-1を作製するため3’LTRをpBluescriptにクローニングした後、HIV U3中のcis調節要素を除去し、p3’HIV-2を形成するため、3’LTRエンハンサー/プロモーターにおける400bpの欠失を行った。ステップ3では、pHIV-3を作成するため、p5’HIV-3及びp3’HIV-2から単離された断片をライゲーションした。ステップ4では、前記p3’HIV-3を生成するために、余分な上流のHIV配列を除去することによりp3’HIV-2をさらに修飾し、p3’HIV-4を作成するため、WPREを含有する600bpのBamHI-SalIフラグメントをp3’-3に添加した。ステップ5では、pHIV-3RREをPCRによりサイズを減少させ、及び、pHIV-6を作製するため、pHIV-3由来の5’断片に(図示せず)、及びp3’HIV-4にライゲーションした。ステップ6では、HIV-1 pNL4-3(55)由来のcPPT DNAフラップ配列を含有する190bpのBglII-BamHI断片をpNL4-3から増幅し、pHIV-7を作製するため、pHIV6におけるRRE配列とWPRE配列との間に配置した。この親プラスミドpHIV7-GFP(GFP、グリーン蛍光タンパク質(green fluorescent protein))は4-プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングするのに用いた。
ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナルpsiΨが必要とされる。RRE及びWPREは、RNA転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、WPREと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証される。
組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させるため、ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能を3つの別々のプラスミドに分けた。:
1)pCgpはウイルスベクター構築に必要なgag/polタンパク質をコードする;
2)pCMV-Rev2は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにRRE配列に作用するRevタンパク質をコードする;
3)pCMV-Gは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性口内炎ウイルス(vesiculo-stomatitis virus)(VSV)の糖タンパク質をコードする。
1)pCgpはウイルスベクター構築に必要なgag/polタンパク質をコードする;
2)pCMV-Rev2は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにRRE配列に作用するRevタンパク質をコードする;
3)pCMV-Gは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性口内炎ウイルス(vesiculo-stomatitis virus)(VSV)の糖タンパク質をコードする。
pHIV7にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のDNA配列相同性が存在する。相同性領域は、
pCgpヘルパープラスミドのgag/pol配列中に位置する約600ヌクレオチド
のパッケージングシグナル領域;
全部で3つのヘルパープラスミド中のCMVプロモーター配列;及び
ヘルパープラスミドpCgp中のRRE配列;
を包含する。複数の組換え事象を必要とするため、これらの領域における相同性に起因して複製能のある組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。さらに、得られたいずれの組換え体は、レンチウイルス複製に必要な機能的LTR及びtat配列を欠いているであろう。
pCgpヘルパープラスミドのgag/pol配列中に位置する約600ヌクレオチド
のパッケージングシグナル領域;
全部で3つのヘルパープラスミド中のCMVプロモーター配列;及び
ヘルパープラスミドpCgp中のRRE配列;
を包含する。複数の組換え事象を必要とするため、これらの領域における相同性に起因して複製能のある組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。さらに、得られたいずれの組換え体は、レンチウイルス複製に必要な機能的LTR及びtat配列を欠いているであろう。
CMVプロモーターをEF1α-HTLVプロモーター(EF1p)で置換し、その新しいプラスミドをepHIV7と命名した(図4)。EF1pは563bpがある。そして、前記EF1pは、CMVプロモーターを切除した後、NruI及びNheIを用いてepHIV7に導入した。
野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の増殖性感染に必要なgag/pol及びrevを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれる。さらに、IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7ベクター構築物はインタクトな3’LTRプロモーターを含有しないので、結果として生じる、標的細胞における発現及び逆転写DNAプロウイルスゲノムは、不活性LTRがあるであろう。この設計の結果、HIV-1由来配列はプロウイルスから転写されず、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現される。SINベクターにおけるLTRプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させることが期待される。表4は、IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7に存在する様々なレギュレーター要素をまとめたものである。
実施例3:患者T細胞の形質導入のためのベクターの作製
各プラスミド(IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7;pCgp;pCMV-G;及びpCMV-Rev2)について、十分な量のプラスミドDNAを産生するために発酵槽に接種するために用いられるシードバンクが生成される。プラスミドDNAは、レンチウイルスベクターの産生に用いる前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
各プラスミド(IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7;pCgp;pCMV-G;及びpCMV-Rev2)について、十分な量のプラスミドDNAを産生するために発酵槽に接種するために用いられるシードバンクが生成される。プラスミドDNAは、レンチウイルスベクターの産生に用いる前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
簡潔には、無菌性及びウイルス汚染の存在を確認するために試験された293T作業細胞(WCB)から細胞を増殖させた。293T WCB由来の293T細胞のバイアルを
解凍した。ベクター産生及び細胞列(cell train)の維持のために10層細胞工場(cell factories)(CF)の適当な数をプレートするため、十分な数の細胞が存在するまで、細胞を成長させ、増殖させた。細胞の単一列を生産に用いることができる。
解凍した。ベクター産生及び細胞列(cell train)の維持のために10層細胞工場(cell factories)(CF)の適当な数をプレートするため、十分な数の細胞が存在するまで、細胞を成長させ、増殖させた。細胞の単一列を生産に用いることができる。
レンチウイルスベクターは、10CFまでのサブバッチで産生された。同じ週に2つのサブバッチを作製することができ、1週間に約20Lのレンチウイルス上清の産生をもたらす。1つのロットの製品を製造するために、すべてのサブバッチから製造された材料を下流の処理段階でプールした。293T細胞を293T培地中でCF中に播種した(10%FBSを含むDMEM)。ファクトリーを37℃のインキュベーターに置き、CFの全層に細胞を均一に分布させるため水平にレベリングした(leveled)。2日後、Tris:EDTA、2M CaCl2、2X HBS、及び4つのDNAプラスミドの混合物を含むCaPO4法を用いて、上記の4つのレンチウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの3日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清を回収し、精製し、濃縮した。上清をCFから除去した後、各CFから生産終了細胞を回収した。細胞を各工場からトリプシン処理し、遠心分離により回収した。細胞を凍結培地に再懸濁し、凍結保存した。これらの細胞は、その後、複製能があるレンチウイルス(RCL)試験に使用された。
ベクターを精製及び製剤化するために、細胞の破片を除去するために膜濾過によって粗上清を清澄化した。宿主細胞DNA及び残留プラスミドDNAは、エンドヌクレアーゼ消化(Benzonase(登録商標))によって分解された。ウイルス上清を0.45μmのフィルターを用いて細胞破片から清澄化した。清澄化した上清を予め秤量した容器に採取し、その中にBenzonase(登録商標)を加えた(最終濃度50U/mL)。残留プラスミドDNA及び宿主ゲノムDNAのエンドヌクレアーゼ消化は、37℃で6時間行った。エンドヌクレアーゼ処理した上清の最初の接線流限外濾過(TFF)濃度を、ウイルスを約20倍濃縮しながら、粗上清から残留低分子量成分を除去するのに使用した。清澄化したエンドヌクレアーゼ処理したウイルス上清を、流速を最大にしながら、せん断速度を約4,000秒-1以下に維持するように設計された流速で、500kDのNMWCOがある中空繊維カートリッジに循環させた。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始された。ダイアフィルトレーション緩衝液としてPBS中に4%ラクトースを用いて、80%透過物置換率を確立した。ウイルス上清を標的体積にもたらした。これは粗上清の20倍の濃度に相当する。透析液交換率を100%として4回の追加交換容量についてダイアフィルトレーションを続けた。
ウイルス産物のさらなる濃縮は、高速遠心分離技術を用いることによって達成された。レンチウイルスの各サブバッチを、Sorvall RC-26プラス6000RPM(6,088RCF)、6℃、16~20時間の遠心分離を用いてペレット化した。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットをPBS中の4%ラクトースを含む50mL体積に再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤を表す。ベクター濃縮プロセス全体は約200倍の体積減少をもたらした。全てのサブバッチの完了後、各部分バッチからの試料を無菌性について試験しながら、材料を次に-80℃に置いた。試料の無菌性を確認した後、サブバッチを、頻繁に撹拌しながら37℃で急速に解凍した。次いで、この物質をプールし、クラスIIタイプA/B3バイオセーフティーキャビネットでウイルスベクターセット(suite)に手動で分注した。滅菌USPクラス6、雄ネジ(externally threaded)Oリングクリオバイアル中の濃縮レンチウイルス1mLの充填構成を使用した。COHの応用技術開発センター(CATS)の品質システム(QS)は、CBGのためのポリシーと標準的な運用手順に従い、現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス(cGMPs)に従ってすべての資料をリリースした。
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残留宿主DNA混入物、及び残留宿主及びプラスミドDNAの移入について試験した。他の試験の中でも、正しいベクターが存在することを確実にするために、RT-PCRによってベクター同一性を評価した。すべての放出基準は、この研究での使用を意図したベクターについて満たされた。
実施例4: ACTでの使用に適したT細胞の調製
Tリンパ球は、白血球フェレーシス(leukopheresis)によって患者から得られる。適当な同種異系又は自己T細胞サブセット、例えばセントラルメモリーT細胞(TCM)は、CARを発現するように遺伝的に修飾され、次いで、抗がん治療を達成するために、臨床上許容されるいずれ手段により前記患者に戻るように投与される。
Tリンパ球は、白血球フェレーシス(leukopheresis)によって患者から得られる。適当な同種異系又は自己T細胞サブセット、例えばセントラルメモリーT細胞(TCM)は、CARを発現するように遺伝的に修飾され、次いで、抗がん治療を達成するために、臨床上許容されるいずれ手段により前記患者に戻るように投与される。
適当なTCMは以下のように調製することができる。合意された研究参加者から得られたアフェレーシス生成物を、フィコール処理し(ficolled)、洗浄し、一晩インキュベートする。GMPグレードの抗CD14、抗CD25及び抗CD45RA試薬(Miltenyi Biotec)及びCliniMACS(商標)分離装置を用いて、単球、調節性T細胞及びナイーブT細胞集団を細胞から除去する。枯渇後、CliniMACS(商標)分離装置でDREG56-ビオチン(COH臨床グレード)及び抗ビオチンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を用いて、CD62L+ TCM細胞について陰性画分細胞を濃縮する。
富化後、TCM細胞を、完全なX-Vivo15プラス50IU/mLのIL-2及び0.5ng/mLのIL-15中に配合し、Teflon(登録商標)細胞培養バッグに移す。前記TCM細胞(they)はDynal ClinEx(登録商標)Vivo CD3/CD28ビーズで刺激される。刺激後の5日までに、IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7レンチウイルスベクターを用いて感染多重度(MOI)1.0~0.3で細胞に形質導入する。細胞増殖のために必要な完全なX-Vivo15及びIL-2及びIL-15サイトカインを添加して培養物を42日までの間維持する(細胞密度を3×105~2×106生存細胞/mLに、及びサイトカイン補充を培養の月曜日、水曜日、金曜日毎に維持する)。細胞は、典型的には、21日以内にこれらの条件下で約109細胞に増殖する。培養期間の終わりに、細胞を採取し、2回洗浄し、臨床グレードの凍結保存培地中に配合する(Cryostore CS5、BioLife Solutions)。
T細胞注入の日(複数可)に、低温保存及び放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために配合される。放出された細胞産物を含有する低温保存バイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、PBS/2%ヒト血清アルブミン(HSA)洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を保存料なし遊離生理食塩水(PFNS)/2%HSA輸液希釈液に再懸濁する。品質管理試験のために試料を取り除く。
健康なドナーから調達された細胞に対する2回の適格性評価試験(qualification runs)を、上記の製造プラットフォームを用いて行った。各前臨床適格性評価試験製品には、ヒトドナー(HD)番号HD006.5及びHD187.1が割り当てられた。重要なことに、表5に示すように、これらの適格性評価試験は28日以内に>80倍に増殖し、増殖した細胞はIL13(EQ)BBγ/CD19t導入遺伝子を発現した。
実施例5: IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCMにおける表面導入遺伝子及びT細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析
実施例4に記載される2つの前臨床的適格性評価試験製品は、以下に記載するように、前臨床研究において用いられた。図6A~Cは、表面導入遺伝子及びT細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。IL-13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5及びHD187.1を、CD8+ CAR+及びCD4+(すなわちCD8陰性)CAR+細胞を検出するため、抗IL-13-PE及び抗CD8-FITCで同時染色した(図6A)。又はCD4+ CD19t+及びCD8+(すなわち、CD4陰性)CAR+細胞を検出するため、抗CD19-PE及び抗CD4-FITCで同時染色した(図6B)。IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5及びHD187.1を、蛍光色素結合抗CD3、TCR、CD4、CD8、CD62L及びCD28(グレーのヒストグラム)又はアイソタイプ対照(controls)(黒いヒストグラム)で染色した。(図6C)。図6A~Cのそれぞれにおいて、示されたパーセンテージは、アイソタイプ上に染色された生存リンパ球(DAPI陰性)に基づく。
実施例4に記載される2つの前臨床的適格性評価試験製品は、以下に記載するように、前臨床研究において用いられた。図6A~Cは、表面導入遺伝子及びT細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。IL-13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5及びHD187.1を、CD8+ CAR+及びCD4+(すなわちCD8陰性)CAR+細胞を検出するため、抗IL-13-PE及び抗CD8-FITCで同時染色した(図6A)。又はCD4+ CD19t+及びCD8+(すなわち、CD4陰性)CAR+細胞を検出するため、抗CD19-PE及び抗CD4-FITCで同時染色した(図6B)。IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5及びHD187.1を、蛍光色素結合抗CD3、TCR、CD4、CD8、CD62L及びCD28(グレーのヒストグラム)又はアイソタイプ対照(controls)(黒いヒストグラム)で染色した。(図6C)。図6A~Cのそれぞれにおいて、示されたパーセンテージは、アイソタイプ上に染色された生存リンパ球(DAPI陰性)に基づく。
実施例6: 大きなTS開始PBT腫瘍の治療のためのCAR T細胞送達経路の比較
以下は、侵襲性原発性PBT系に対する抗腫瘍活性について、送達経路、静脈内(i.v.)又は頭蓋内(i.c.)、を比較する調査である。パイロット研究(データは示されていない)において、意外にも、i.v.投与されたIL13(EQ)BBζ+ TCMは、小さい(5日目の)PBT030-2 EGFP:ffLuc腫瘍の治療のためにPBSと比較して治療上の有益性をもたらさなかったことが観察された。これは、i.c.投与CAR+ T細胞で観察された頑健な治療効果とは対照的である。PBT030-2腫瘍は5日目に末梢から治療用T細胞を動員するには小さすぎる可能性があると推測し、大きな19日目のPBT030-2 EGFP:ffLuc腫瘍に対するi.v.送達とi.c.送達との比較を行った。これらの研究のために、PBT030-2移植マウスを、IL13(EQ)BBZ+ TCMの又は模擬TCM(CARなし)の、2回のi.v.注入(5×106 CAR+ TCM;19日目及び26日目)又は4回のi.c.注入(1×106 CAR+ TCM;19日目、22日目、26日目及び29日目)のいずれかで処置した。ここでも、i.v.投与されたCAR+ T細胞についてのXenogenイメージング又はKaplan-Meier生存分析によって、治療上の利益はモニタリングされない(図7A及び7B)。対照的に、強力な抗腫瘍活性が、i.c.投与されたIL13(EQ)BBζ+ TCMについて観察された(図7A~B)。次に、T細胞注射の7日後のマウスコホートからの脳を採取し、IHCによってCD3+ヒトT細胞について評価した。驚くべきことに、モックTCM又はIL13(EQ)BBζ TCMのいずれかでi.v.処置したマウスでは、腫瘍において、又はヒトT細胞が典型的に存在する、他のマウス脳領域において(すなわち軟髄膜)、検出可能なCD3+ヒトT細胞はなかった(図7C)。腫瘍指向性の欠損を示唆している。これは、i.c.治療マウスで検出された有意な数のT細胞とは対照的である(図7D)。
以下は、侵襲性原発性PBT系に対する抗腫瘍活性について、送達経路、静脈内(i.v.)又は頭蓋内(i.c.)、を比較する調査である。パイロット研究(データは示されていない)において、意外にも、i.v.投与されたIL13(EQ)BBζ+ TCMは、小さい(5日目の)PBT030-2 EGFP:ffLuc腫瘍の治療のためにPBSと比較して治療上の有益性をもたらさなかったことが観察された。これは、i.c.投与CAR+ T細胞で観察された頑健な治療効果とは対照的である。PBT030-2腫瘍は5日目に末梢から治療用T細胞を動員するには小さすぎる可能性があると推測し、大きな19日目のPBT030-2 EGFP:ffLuc腫瘍に対するi.v.送達とi.c.送達との比較を行った。これらの研究のために、PBT030-2移植マウスを、IL13(EQ)BBZ+ TCMの又は模擬TCM(CARなし)の、2回のi.v.注入(5×106 CAR+ TCM;19日目及び26日目)又は4回のi.c.注入(1×106 CAR+ TCM;19日目、22日目、26日目及び29日目)のいずれかで処置した。ここでも、i.v.投与されたCAR+ T細胞についてのXenogenイメージング又はKaplan-Meier生存分析によって、治療上の利益はモニタリングされない(図7A及び7B)。対照的に、強力な抗腫瘍活性が、i.c.投与されたIL13(EQ)BBζ+ TCMについて観察された(図7A~B)。次に、T細胞注射の7日後のマウスコホートからの脳を採取し、IHCによってCD3+ヒトT細胞について評価した。驚くべきことに、モックTCM又はIL13(EQ)BBζ TCMのいずれかでi.v.処置したマウスでは、腫瘍において、又はヒトT細胞が典型的に存在する、他のマウス脳領域において(すなわち軟髄膜)、検出可能なCD3+ヒトT細胞はなかった(図7C)。腫瘍指向性の欠損を示唆している。これは、i.c.治療マウスで検出された有意な数のT細胞とは対照的である(図7D)。
腫瘍由来サイトカイン、特にMCP-1/CCL2は、T細胞を腫瘍に動員する際に重要である。従って、PBT030-2腫瘍細胞を評価したところ、この系統は、i.c.移植腫瘍にi.v.投与されたエフェクターCD8+ T細胞を誘引することが以前に示された神経膠腫株であるU251T細胞に匹敵する高レベルのMCP-1/CCL2を産生することが分かった(データは示していない)。悪性グリオーマは高度に浸潤性の腫瘍であり、しばしば提示において多巣性である。上記の研究は、IL13BBZ TCMが浸潤した腫瘍、例えばPBT030-2などを排除し、長期耐久性抗腫瘍活性を媒介することができることを確立している。多巣性疾患への通行(traffic)への頭蓋内送達CAR T細胞の能力もまた調べた。この研究のために、PBT030-2 EGFP:ffLuc TSを、左半球及び右半球の両方に移植し(図8A)、CAR+ T細胞を右の腫瘍部位にのみ注射した。励ますように、私たちは、評価した全てのマウス(n=3)について、注射部位(すなわち右腫瘍)、さらに左半球の腫瘍内の両方においてT細胞注入後7日目のCD3 IHCによってT細胞を検出した(図8B)。これらの知見は、CAR+ T細胞が遠隔部位で腫瘍病巣に辿り着き、かつ、浸潤することができるという証拠を提供する。U251T神経膠腫細胞株を用いた第2の腫瘍モデルにおいても同様の発見が観察された(データは示されていない)。
実施例7: IL13(EQ)BBζ/CD19tのアミノ酸配列
IL13(EQ)BBζ/CD19tの完全アミノ酸配列を図9に示す。全配列(配列番号1)は、
22アミノ酸のGMCSFシグナルペプチド(配列番号2)、
112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字のアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4膜貫通配列(配列番号5);
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
3アミノ酸のGlyリンカー;
112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7);
24アミノ酸のT2A配列(配列番号8);及び
323アミノ酸のCD19t配列(配列番号9);
を包含する。
IL13(EQ)BBζ/CD19tの完全アミノ酸配列を図9に示す。全配列(配列番号1)は、
22アミノ酸のGMCSFシグナルペプチド(配列番号2)、
112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字のアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4膜貫通配列(配列番号5);
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
3アミノ酸のGlyリンカー;
112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7);
24アミノ酸のT2A配列(配列番号8);及び
323アミノ酸のCD19t配列(配列番号9);
を包含する。
成熟キメラ抗原受容体配列(配列番号10)は、
112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字で示すアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4配列(配列番号5);
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
3アミノ酸のGlyリンカー;及び
112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7);
を包含する。このCAR配列(配列番号10)内には、IL-13/IgG4/CD4t/41-BB配列(配列番号11)が存在し、これは、
112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換
E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字のアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4配列(配列番号5);及び
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
を包含する。IL13/IgG4/CD4t/4-1BB配列(配列番号11)は、Gly Gly Glyリンカーなどのリンカーによって112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7)に連結することができる。CAR配列(配列番号10)の前に22アミノ酸のGMCSFシグナルペプチド(配列番号2)を配置することができる。
112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字で示すアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4配列(配列番号5);
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
3アミノ酸のGlyリンカー;及び
112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7);
を包含する。このCAR配列(配列番号10)内には、IL-13/IgG4/CD4t/41-BB配列(配列番号11)が存在し、これは、
112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換
E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字のアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4配列(配列番号5);及び
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
を包含する。IL13/IgG4/CD4t/4-1BB配列(配列番号11)は、Gly Gly Glyリンカーなどのリンカーによって112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7)に連結することができる。CAR配列(配列番号10)の前に22アミノ酸のGMCSFシグナルペプチド(配列番号2)を配置することができる。
図10は、IL13(EQ)41BBζ[IL13(EQ)41BBζ T2A-CD19t_epHIV7;pF02630](配列番号12)及びCD19Rop_epHIV7(pJ01683)(配列番号13)の配列の比較を示す。
実施例8: IL13Rα2を標的とする追加のCARのアミノ酸配列
図11~18は、IL13Rα2に対して向けられた追加のCARのアミノ酸配列を示す。各場合において、様々なドメインは、特定の細胞内ドメインの間に位置するGlyGlyGlyスペーサーを除いて標識される。それぞれは、ヒトIL13及びGluからTyrまでを包含する(配列番号3;強調されたアミノ酸置換E13Y)。これらのCARを発現するために用いられる発現ベクターにおいて、発現されるアミノ酸配列は、
24アミノ酸のT2A配列(配列番号8);及び
CAR発現細胞の表面上の短縮型CD19配列の協調発現を可能にする323アミノ酸のCD19t配列(配列番号9);
を包含することができる。
図11~18は、IL13Rα2に対して向けられた追加のCARのアミノ酸配列を示す。各場合において、様々なドメインは、特定の細胞内ドメインの間に位置するGlyGlyGlyスペーサーを除いて標識される。それぞれは、ヒトIL13及びGluからTyrまでを包含する(配列番号3;強調されたアミノ酸置換E13Y)。これらのCARを発現するために用いられる発現ベクターにおいて、発現されるアミノ酸配列は、
24アミノ酸のT2A配列(配列番号8);及び
CAR発現細胞の表面上の短縮型CD19配列の協調発現を可能にする323アミノ酸のCD19t配列(配列番号9);
を包含することができる。
ヒトIL13(E13Y)ドメイン、CD28tmドメイン、CD28gg共刺激ドメイン、4-1BB共刺激ドメイン、及びCD3ζドメインCAR骨格を含み、かつ、HL(22アミノ酸)スペーサー、CD8ヒンジ(48アミノ酸)スペーサー、IgG4-HL-CH3(129アミノ酸)スペーサー又はIgG4(EQ)(229アミノ酸)スペーサーのいずれかを包含するCARのパネルを、72時間共培養アッセイで評価したIL13Ra2特異的死滅を媒介するそれらの能力について試験した。この系においてCAR発現が低いと思われるHL(22アミノ酸)を除いて、全てが活性であった。
実施例9: 2つのHER2-CARの構造
本明細書に記載のHER2 scFvを含む1つのCARは、Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19tと呼ばれる。このCARは、以下のもの:
HER2を標的とするscFv;
Fc受容体(FcR)による結合を減少させる様式でCH2領域(L235E;N297Q)内の2つの部位で突然変異されたIgG4 Fc領域;
CD28膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、及びCD3ζ活性化ドメイン;
を包含する様々な重要な特徴を包含する。図20は、CAR発現をモニターするために用いられる切断型CD19配列の配列及び切断型CD19配列の融合なしでCARが産生されることを可能にするT2Aリボソームスキップ配列を包含する、このCARのアミノ酸配列を示す。図21に示すように、未成熟CARは、GMCSFRシグナルペプチド、HER2 scFv、スペーサーとして作用するIgG4、CD8膜貫通ドメイン、LL-GG配列修飾を包含する4-1BB共刺激ドメイン、3つのG
ly配列、CD3ゼータ刺激ドメイン、を包含する。転写物はまた、CARタンパク質配列の部分ではないT2Aリボソーム配列及び切断型CD19配列をコードする。成熟CARは、未成熟CARと同一であるが、GMCSFシグナルペプチドを欠いている。
本明細書に記載のHER2 scFvを含む1つのCARは、Her2scFv-IgG4(L235E,N297Q)-CD28tm-CD28gg-Zeta-T2A-CD19tと呼ばれる。このCARは、以下のもの:
HER2を標的とするscFv;
Fc受容体(FcR)による結合を減少させる様式でCH2領域(L235E;N297Q)内の2つの部位で突然変異されたIgG4 Fc領域;
CD28膜貫通ドメイン、CD28共刺激ドメイン、及びCD3ζ活性化ドメイン;
を包含する様々な重要な特徴を包含する。図20は、CAR発現をモニターするために用いられる切断型CD19配列の配列及び切断型CD19配列の融合なしでCARが産生されることを可能にするT2Aリボソームスキップ配列を包含する、このCARのアミノ酸配列を示す。図21に示すように、未成熟CARは、GMCSFRシグナルペプチド、HER2 scFv、スペーサーとして作用するIgG4、CD8膜貫通ドメイン、LL-GG配列修飾を包含する4-1BB共刺激ドメイン、3つのG
ly配列、CD3ゼータ刺激ドメイン、を包含する。転写物はまた、CARタンパク質配列の部分ではないT2Aリボソーム配列及び切断型CD19配列をコードする。成熟CARは、未成熟CARと同一であるが、GMCSFシグナルペプチドを欠いている。
実施例10: HER2を標的とするCARの発現
図22Aは、図20及び図21に示される2つのHER2特異的CAR構築物の概略図である。HER2(EQ)28ζにおいて、scFvは、CD28膜貫通ドメイン、細胞内CD28共刺激ドメイン及び細胞溶解性CD3ζドメインを含有する修飾IgG4 Fcリンカー(二重変異体、L235E;N297Q)によって膜に繋がれている。T2Aスキップ配列は、細胞トラッキングのために用いられる切断されたCD19(CD19t)タンパク質からCARを分離する。HER2(EQ)BBζは、共刺激ドメインがCD28ではなく4-1BBであり、かつ、膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインではなくCD8膜貫通ドメインであることを除いて同様である。ヒトセントラルメモリー(TCM)細胞を、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζのいずれかを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。図22Bは、ヒトTCM表面表現型の代表的なFACSデータを示す。図22Cは、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζのいずれかを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェクトしたTCMにおけるCD19及びプロテインL発現についてのアッセイの結果を示す。これらの結果からわかるように、CD19発現によって評価したトランスフェクション効率は、両方のCARについて同様であった。しかし、タンパク質L発現は、HER2(EQ)BBζのほうがHER2(EQ)BBζより低かったが、HER2(EQ)BBζCARはHER2(EQ)BBζより安定性が低いことが示唆された。細胞増殖の分析(図22D)は、CARはどちらもT細胞増殖を妨害しないことを示す。
図22Aは、図20及び図21に示される2つのHER2特異的CAR構築物の概略図である。HER2(EQ)28ζにおいて、scFvは、CD28膜貫通ドメイン、細胞内CD28共刺激ドメイン及び細胞溶解性CD3ζドメインを含有する修飾IgG4 Fcリンカー(二重変異体、L235E;N297Q)によって膜に繋がれている。T2Aスキップ配列は、細胞トラッキングのために用いられる切断されたCD19(CD19t)タンパク質からCARを分離する。HER2(EQ)BBζは、共刺激ドメインがCD28ではなく4-1BBであり、かつ、膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインではなくCD8膜貫通ドメインであることを除いて同様である。ヒトセントラルメモリー(TCM)細胞を、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζのいずれかを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。図22Bは、ヒトTCM表面表現型の代表的なFACSデータを示す。図22Cは、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζのいずれかを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェクトしたTCMにおけるCD19及びプロテインL発現についてのアッセイの結果を示す。これらの結果からわかるように、CD19発現によって評価したトランスフェクション効率は、両方のCARについて同様であった。しかし、タンパク質L発現は、HER2(EQ)BBζのほうがHER2(EQ)BBζより低かったが、HER2(EQ)BBζCARはHER2(EQ)BBζより安定性が低いことが示唆された。細胞増殖の分析(図22D)は、CARはどちらもT細胞増殖を妨害しないことを示す。
実施例11: HER2標的化CARのインビトロ特性決定
HER2陰性系統(LCLリンパ腫、MDA-MB-468、U87グリオーマ)、低HER2発現系統(MDA-MB-361,231BR)及び高HER2発現系統(SKBR3、BT474、BBM1)を包含する様々な乳がん細胞株が、HER2(EQ)28ζ及びHER2(EQ)BBζの特徴付けに使用された。図23Aは、これらの系統の各々のHER2発現レベルを示す。MDA-MB-361腫瘍細胞(低HER2発現)又はBBM1腫瘍細胞(高HER2発現)のいずれかと5時間の同時培養後に、フローサイトメトリー(ゲートオンした(gated on)CAR+ T細胞)を、Mock(非形質導入)、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞におけるCD107a脱顆粒及びIFNγ産生を特徴付けるために用いた。この分析の結果を図23Bに示す。他の乳がん細胞株についても同様の研究を行い、その結果を図23Cに要約する。組換えHER2タンパク質又は腫瘍標的による24時間培養後のHER2-CAR T細胞によるIFNγ産生の産生をELISAによって測定し、この分析の結果を図23Dに示す。
HER2陰性系統(LCLリンパ腫、MDA-MB-468、U87グリオーマ)、低HER2発現系統(MDA-MB-361,231BR)及び高HER2発現系統(SKBR3、BT474、BBM1)を包含する様々な乳がん細胞株が、HER2(EQ)28ζ及びHER2(EQ)BBζの特徴付けに使用された。図23Aは、これらの系統の各々のHER2発現レベルを示す。MDA-MB-361腫瘍細胞(低HER2発現)又はBBM1腫瘍細胞(高HER2発現)のいずれかと5時間の同時培養後に、フローサイトメトリー(ゲートオンした(gated on)CAR+ T細胞)を、Mock(非形質導入)、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞におけるCD107a脱顆粒及びIFNγ産生を特徴付けるために用いた。この分析の結果を図23Bに示す。他の乳がん細胞株についても同様の研究を行い、その結果を図23Cに要約する。組換えHER2タンパク質又は腫瘍標的による24時間培養後のHER2-CAR T細胞によるIFNγ産生の産生をELISAによって測定し、この分析の結果を図23Dに示す。
実施例12: HER2標的化CARのインビトロ抗腫瘍活性
Mock(非形質導入)、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞を腫瘍標的と72時間共培養した後の腫瘍細胞死滅を評価するのに、フローサイトメトリーを用いた。この分析の結果を図24Aに示す。HER2陰性MDA-MB-468又はHER2陽性BBM1細胞との72時間の同時培養後、総CAR T細胞におけるPD-1及びLAG-3誘導を測定した。この分析の結果を図24Bに示す。HER2陰性(LCLリンパ腫、MDA-MB-468、U87グリオーマ)、低HER2発現(MDA-MB-361,231BR)又は高HER2発現(SKBR3、BT474、BBM1)である腫瘍標的との72時間の共培養後のCD8+ CAR T細胞におけるPD-1誘導を測定した。この分析の結果を図24Cに示す。これらの研究は、HER2(
EQ)BBζが、HER2(EQ)28ζを起こすよりも低いPD-1誘導を生じることを示唆している。エフェクター:腫瘍(E:T)比が0.25:1~2:1の範囲の腫瘍細胞死滅を、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞について測定した。この分析の結果は、図24Dに示される。図24Dは、HER2(EQ)28ζ及びHER2(EQ)BBζの両方がインビトロでの腫瘍細胞死滅に有効であることを示す。MDA-MB-468又はBBM1細胞との72時間の同時培養後のHER2-CAR T細胞のCFSE増殖を、フローサイトメトリーによって測定した。この分析の結果は、図24Eに示される。図24Eは、HER2(EQ)BBζCAR T細胞がHER2(EQ)28ζCAR T細胞よりも増殖することを示す。
Mock(非形質導入)、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞を腫瘍標的と72時間共培養した後の腫瘍細胞死滅を評価するのに、フローサイトメトリーを用いた。この分析の結果を図24Aに示す。HER2陰性MDA-MB-468又はHER2陽性BBM1細胞との72時間の同時培養後、総CAR T細胞におけるPD-1及びLAG-3誘導を測定した。この分析の結果を図24Bに示す。HER2陰性(LCLリンパ腫、MDA-MB-468、U87グリオーマ)、低HER2発現(MDA-MB-361,231BR)又は高HER2発現(SKBR3、BT474、BBM1)である腫瘍標的との72時間の共培養後のCD8+ CAR T細胞におけるPD-1誘導を測定した。この分析の結果を図24Cに示す。これらの研究は、HER2(
EQ)BBζが、HER2(EQ)28ζを起こすよりも低いPD-1誘導を生じることを示唆している。エフェクター:腫瘍(E:T)比が0.25:1~2:1の範囲の腫瘍細胞死滅を、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞について測定した。この分析の結果は、図24Dに示される。図24Dは、HER2(EQ)28ζ及びHER2(EQ)BBζの両方がインビトロでの腫瘍細胞死滅に有効であることを示す。MDA-MB-468又はBBM1細胞との72時間の同時培養後のHER2-CAR T細胞のCFSE増殖を、フローサイトメトリーによって測定した。この分析の結果は、図24Eに示される。図24Eは、HER2(EQ)BBζCAR T細胞がHER2(EQ)28ζCAR T細胞よりも増殖することを示す。
実施例13: HER2標的化CARのインビボ抗腫瘍活性
腫瘍内に送達されたHER2 CAR T細胞の活性を、患者由来の乳房から脳への転移モデルで評価した。図25A~25Cは、腫瘍のH&E染色である。Mock(非形質導入)又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞を用いて腫瘍に直接注射してマウスを処置した。図25D~25Fは、腫瘍の光学イメージングの結果を示し、図25G~25Iは、腫瘍注射後3日目、8日目又は14日目のいずれかで局所的に処置したマウスのKaplan-Meier生存曲線である。これらの研究は、HER2(EQ)BBζCAR T細胞が、腫瘍に直接注射された場合、インビボで強力な抗腫瘍効果があることを示している。
腫瘍内に送達されたHER2 CAR T細胞の活性を、患者由来の乳房から脳への転移モデルで評価した。図25A~25Cは、腫瘍のH&E染色である。Mock(非形質導入)又はHER2(EQ)BBζCAR T細胞を用いて腫瘍に直接注射してマウスを処置した。図25D~25Fは、腫瘍の光学イメージングの結果を示し、図25G~25Iは、腫瘍注射後3日目、8日目又は14日目のいずれかで局所的に処置したマウスのKaplan-Meier生存曲線である。これらの研究は、HER2(EQ)BBζCAR T細胞が、腫瘍に直接注射された場合、インビボで強力な抗腫瘍効果があることを示している。
乳房-脳転移のヒト異種移植モデルにおける抗腫瘍効果を評価するために、BBM1細胞(0.2M)又はBT474(0.15M)をNSGマウスに頭蓋内注射した。腫瘍注射後8日目に、HER2(EQ)28ζ又はHER2(EQ)BBζ、又はMock(非形質導入)T細胞(1M)を腫瘍内に注射した。BBM1(図26A)及びBT474(図26B)腫瘍を、ルシフェラーゼベースの光学イメージングによってモニターした。Kaplan Meier曲線を図26C及び図26Dに示す。
HER2(EQ)28ζ及びHER2(EQ)BBζCAR T細胞を評価するために、胸部-脳転移のヒト患者由来正常位の異種移植モデルも使用した。図27Aは、BBM1細胞(0.2M)の定位的注入による腫瘍移植の領域、及び脳室内T細胞送達を示す。腫瘍の染色を図27Bに示す。腫瘍注射後14日目に、HER2(EQ)28ζ、HER2(EQ)BBζ、又はMock(非形質導入)T細胞(0.5M)を腫瘍内に注射した。腫瘍増殖は、ルシフェラーゼベースの光学イメージングによってモニターした。図27Cは、各治療群についてのフラックス平均を示し、図27Dは、各治療群についてのKaplan Meier生存曲線を示す。
実施例14: IL13Ra2を標的とするCARを発現するTCMの頭蓋内及び腫瘍内投与の比較
2つの異なる頭蓋内(ic)送達経路、即ち腫瘍内(ict)及び脳室内(icv)を、IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7レンチウイルスベクターで形質導入され、かつ、グリア芽腫(GBM)の臨床的処置のために提案されたようにインビトロで増殖された、TCMに富んだ細胞株から生成されたCAR T細胞のインビボ安全性、輸送(trafficking)及び有効性のための神経膠芽腫のネズミモデルで評価した。ict又はicvのいずれかで投与されたこれらの細胞のインビボ安全性及び機能的効力を、ホタルルシフェラーゼ(ffLuc)レポーター遺伝子を発現するように組換えられた、IL13Rα2+原発性低継代(low-passage)GBMの腫瘍様塊(tumor sphere)系統PBT030-2を用いて、免疫不全NSGマウスにおいて調べた。
2つの異なる頭蓋内(ic)送達経路、即ち腫瘍内(ict)及び脳室内(icv)を、IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7レンチウイルスベクターで形質導入され、かつ、グリア芽腫(GBM)の臨床的処置のために提案されたようにインビトロで増殖された、TCMに富んだ細胞株から生成されたCAR T細胞のインビボ安全性、輸送(trafficking)及び有効性のための神経膠芽腫のネズミモデルで評価した。ict又はicvのいずれかで投与されたこれらの細胞のインビボ安全性及び機能的効力を、ホタルルシフェラーゼ(ffLuc)レポーター遺伝子を発現するように組換えられた、IL13Rα2+原発性低継代(low-passage)GBMの腫瘍様塊(tumor sphere)系統PBT030-2を用いて、免疫不全NSGマウスにおいて調べた。
CliniMACS(商標)/AutoMACS選択によってPBMCから富化されたTCM細胞株を、IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7レンチウ
イルスでレンチ形質導入し、増殖させ、次いで上記と同様の方法を用いて凍結保存した。次に、ict又は脳内icvのいずれかで投与された新鮮解凍CAR T細胞を、潜在的な毒性、多巣性GBM腫瘍へのそれらの輸送能、及びic移植IL13Rα2+ GBM系PBT030-2細胞のインビボ増殖を制御する能力について評価した。一般的な毒性を評価するために、体重及び機敏性(alertness)を包含する全般的な健康状態についてマウスを毎日観察した。Xenogenイメージングによって測定した腫瘍負荷を調べた。腫瘍のT細胞動員/浸潤を検出するための免疫組織化学(IHC)も、マウスのサブセットに対し実施した。
イルスでレンチ形質導入し、増殖させ、次いで上記と同様の方法を用いて凍結保存した。次に、ict又は脳内icvのいずれかで投与された新鮮解凍CAR T細胞を、潜在的な毒性、多巣性GBM腫瘍へのそれらの輸送能、及びic移植IL13Rα2+ GBM系PBT030-2細胞のインビボ増殖を制御する能力について評価した。一般的な毒性を評価するために、体重及び機敏性(alertness)を包含する全般的な健康状態についてマウスを毎日観察した。Xenogenイメージングによって測定した腫瘍負荷を調べた。腫瘍のT細胞動員/浸潤を検出するための免疫組織化学(IHC)も、マウスのサブセットに対し実施した。
雄NSGマウス(10~12週齢)に、0日目に左右の対側半球の両方に1×105 ffLuc+ PBT030-2細胞を、定位的にic注射し、6日間生着させた。次いで、マウス1匹につき等しい腫瘍サイズ分布について、Xenogenイメージングによって決定した腫瘍サイズに基づいてグループ分けした。次いで、マウス群を未処置(n=4)のままにするか、又は、1×106CAR+ IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCMでict(右半球、n=8)もしくはicv(n=8)のいずれかで処置した(図28)。PBT030-2腫瘍増殖を、Xenogenイメージング及びffLucフラックス(flux)(光子/秒)の定量化によって経時的にモニターした。異なる時点で、各群のマウスを安楽死させ、それらの脳を採取し、パラフィンに包埋し、ヒトCD3発現細胞(すなわち、ヒトT細胞)の存在を評価するために免疫組織化学(IHC)を行った。具体的には、T細胞投与の1週間後、各CAR T細胞処置群から3匹のマウスを安楽死させたので(実験の13日目)、これらのマウスは図29のXenogenイメージング分析に含まれなかった。次いで、T細胞投与の2週間後に、マウス群の各々において2匹のマウスを安楽死させた(実験の21日目)。
これは生存研究ではなかったので、及びしたがって、脳のT細胞輸送を評価するため、マウスは特定の時点ですべて安楽死させた(後述)。苦痛又は一般毒性の明白な徴候について前記マウスを毎日モニターした。ict又はicvレジメンのいずれかで処置したマウスは、体重減少を示さず、実験を通して聡明で(bright)、注意深く、反応性であった。したがって、T細胞投与の経路にかかわらず、治療に関連した副作用の兆候はなかった。したがって、T細胞投与の経路にかかわらず、いずれの治療に関連した副作用の兆候はなかった。
図29A~Cに示すように、IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCMのict送達は、予想通り、PBT030-2腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示した。しかし、IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCMのicv送達は、ic移植PBT030-2腫瘍に対して、特に対側(左)半球における腫瘍病変に対して、ict投与で観察されるものよりも、大きな治療効果を提供するようであった。
投与経路が腫瘍部位に移動するT細胞の能力に影響を及ぼすかどうかを決定するために、T細胞投与の1週間後及び2週間後に各群からのマウスの脳に対してCD3+ T細胞のIHC分析を行った。図30に示すように、ヒトCD3+ T細胞は、ict又はicv投与T細胞のいずれかを受けたマウスの左右の腫瘍部位の両方に見出された。これらのデータは、T細胞投与後1週間で各群3匹のマウスを代表し、T細胞投与2週間後で各群2匹を代表する。
この研究は、T細胞の腫瘍内及び脳室内投与の両方がこのNSGマウスモデルにおいて耐容性が高かった(well-tolerated)ことを実証している。さらに、IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7ベクターで形質導入されたTCM適格性評価試験細胞のict送達及びicv送達の両方で、腫瘍部位におけるT細胞のインビボ多巣性抗腫瘍効果及びIHC検出を観察することができる。この研究はさらに、icv送
達されたT細胞が、ict送達されたT細胞よりも高い有効性を有し得ることを示唆する。
達されたT細胞が、ict送達されたT細胞よりも高い有効性を有し得ることを示唆する。
実施例15: グリア芽細胞腫の治療のためのIL-13Rα2CAR T細胞を評価する第1相臨床試験
この実施例は、再発性IL13Rα2+ GBMがある患者における自己IL13BBζ Tcmの毎週の頭蓋内注入の安全性、実現可能性及び生物活性を評価する臨床試験の初期知見を記載する。以下にさらに詳細に説明するように、登録患者は自己PBMCを採取するために白血球アフェレーシス(leukapheresis)を受け、かつ、IL13BBζ+ Tcmの製造と同時に、リザーバ/カテーテル装置を配置して腫瘍生検又は切除を行う。ベースラインのMR及びPETイメージング及び手術からの回復に続いて、患者は、IL13BBζ+ Tcmの3週間の頭蓋内注入、続いて毒性及び疾患評価のための1週間の休憩からなる4週間の治療レジメンで治療される。現在までの、3名の切除患者のこの第1の低用量コホートについての結果は、IL13BBζ Tcmの外科的切除後の局所送達は安全であり、かつ、観察された治療に起因するグレード3以上の毒性がなく耐容性が高いことを示唆し、かつ、重要なことに、CAR T細胞投与後の抗腫瘍活性の早期証拠を示す。試料が入手可能であった全ての患者について、CAR T細胞は、処置後少なくとも7日間、フローサイトメトリーによって腫瘍嚢胞液又は脳脊髄液(CSF)中に検出された。特に興味深い1人の患者は、再発性多巣性GBM(脊椎の1つの転移部位及び広範な軟膜疾患を包含する)を呈した。この患者は、最初にプロトコルごとに、後頭側頭-後頭部領域における最も大きな再発腫瘍病巣(focus)の切除腔内への、IL13BBζ Tcmの6回の局所注入によって、治療された。促進するように(Encouragingly)、このCAR T細胞注射部位は、7週間以上にわたり疾患再発の証拠なく安定したままであったが、前記CAR T細胞注射部位から離れた他の病巣は進行し続けた。次いでこの患者を、IL13BBζ Tcmの5週間の(five weekly)脳室内注入を用いて、他の治療的介入なしに特例使用プロトコルで処置した。最終的な脳室内CAR T細胞注入の1週間後、全ての頭蓋内腫瘍及び脊髄腫瘍は退縮し、大部分が75体積%を超えて減少し、この患者はCAR T細胞治療の開始後4ヶ月で臨床的に安定したままであった。
この実施例は、再発性IL13Rα2+ GBMがある患者における自己IL13BBζ Tcmの毎週の頭蓋内注入の安全性、実現可能性及び生物活性を評価する臨床試験の初期知見を記載する。以下にさらに詳細に説明するように、登録患者は自己PBMCを採取するために白血球アフェレーシス(leukapheresis)を受け、かつ、IL13BBζ+ Tcmの製造と同時に、リザーバ/カテーテル装置を配置して腫瘍生検又は切除を行う。ベースラインのMR及びPETイメージング及び手術からの回復に続いて、患者は、IL13BBζ+ Tcmの3週間の頭蓋内注入、続いて毒性及び疾患評価のための1週間の休憩からなる4週間の治療レジメンで治療される。現在までの、3名の切除患者のこの第1の低用量コホートについての結果は、IL13BBζ Tcmの外科的切除後の局所送達は安全であり、かつ、観察された治療に起因するグレード3以上の毒性がなく耐容性が高いことを示唆し、かつ、重要なことに、CAR T細胞投与後の抗腫瘍活性の早期証拠を示す。試料が入手可能であった全ての患者について、CAR T細胞は、処置後少なくとも7日間、フローサイトメトリーによって腫瘍嚢胞液又は脳脊髄液(CSF)中に検出された。特に興味深い1人の患者は、再発性多巣性GBM(脊椎の1つの転移部位及び広範な軟膜疾患を包含する)を呈した。この患者は、最初にプロトコルごとに、後頭側頭-後頭部領域における最も大きな再発腫瘍病巣(focus)の切除腔内への、IL13BBζ Tcmの6回の局所注入によって、治療された。促進するように(Encouragingly)、このCAR T細胞注射部位は、7週間以上にわたり疾患再発の証拠なく安定したままであったが、前記CAR T細胞注射部位から離れた他の病巣は進行し続けた。次いでこの患者を、IL13BBζ Tcmの5週間の(five weekly)脳室内注入を用いて、他の治療的介入なしに特例使用プロトコルで処置した。最終的な脳室内CAR T細胞注入の1週間後、全ての頭蓋内腫瘍及び脊髄腫瘍は退縮し、大部分が75体積%を超えて減少し、この患者はCAR T細胞治療の開始後4ヶ月で臨床的に安定したままであった。
この研究で用いられるCAR、IL13(EQ)BBζは、上記に記載される。CD19tマーカーを包含する未成熟CARの配列を図9に示す。未成熟配列全体(配列番号1)は、
22アミノ酸のGMCSFシグナルペプチド(配列番号2)、112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字で示すアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4膜貫通配列(配列番号5);
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
3アミノ酸のGlyリンカー;
112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7);
24アミノ酸のT2A配列(配列番号8);及び
323アミノ酸のCD19t配列(配列番号9);
を包含する。
22アミノ酸のGMCSFシグナルペプチド(配列番号2)、112アミノ酸のIL-13配列(配列番号3;太字で示すアミノ酸置換E13Y);
229アミノ酸のIgG4配列(太字で示すアミノ酸置換L235E及びN297Qがある配列番号4);
22アミノ酸のCD4膜貫通配列(配列番号5);
42アミノ酸の4-1BB配列(配列番号6);
3アミノ酸のGlyリンカー;
112アミノ酸のCD3ζ配列(配列番号7);
24アミノ酸のT2A配列(配列番号8);及び
323アミノ酸のCD19t配列(配列番号9);
を包含する。
CD8+ CD4+ TCM細胞を調製するため、各患者由来の自己細胞を使用した。次いでIL13(EQ)BBζを発現する上記のレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。簡潔に述べると、TCMは、CD45RO+/CD62L+ TCMを免疫学的に選択するために、CliniMACS(登録商標)装置を用いて末梢血単核細胞(PBMC)から富化された。これらの細胞を抗CD3/CD28 Dynalビーズで活性
化し、IL13(EQ)BBζCARの発現を指示するSINレンチウイルスベクターで形質導入した。活性化/遺伝子修飾IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM細胞をIL-2/IL-15でインビトロで増殖させ、次いで凍結保存した。
化し、IL13(EQ)BBζCARの発現を指示するSINレンチウイルスベクターで形質導入した。活性化/遺伝子修飾IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM細胞をIL-2/IL-15でインビトロで増殖させ、次いで凍結保存した。
療法とも再発性/難治性GBMに罹患している2人の患者の治療は、以下に記載される。CAR T細胞の腔内投与は、Rickhamカテーテルを介して約5~10分かけて手作業で行い、対流増強送達(CED)により0.5ml/時間で送達された保存料を含まない正常生理食塩水(PFNS)フラッシュを1.0mLまで行った。CAR T細胞の脳室内投与は、側脳室内に配置されたRickhamカテーテルを通して手動で約5~10分かけて実施した。これに続いて、手動のプッシュ技術により5-10分間にわたって送達された防腐剤を含まない正常生理食塩水(PFNS)フラッシュ0.5mLまでが続いた。PFNSフラッシュは、投与ラインをクリアすること、及び残りのCAR T細胞をカテーテルを通してプッシュすることを意味する。
CAR T細胞の調製及び処置の時間経過を図31に示す。製造プロセスと同時に、研究参加者は彼らの腫瘍の切除を受け、続いてRickhamカテーテル及びベースライン画像の配置を受けた。
患者UPN097は腫瘍切除を受け、第1サイクルにて2×106個の細胞で処置し、第2サイクルでは10×106個の細胞で処置した。第1及び第2サイクルともに、細胞を切除残存腔に投与した。第2サイクル後、患者UPN097は、急速な腫瘍進行のために研究から外した。
患者UPN109を第1サイクルにて2×106個の細胞で、第2及び第3サイクルにて10×106個の細胞で処置した。休息期間後、患者UPN109を第4,5及び6サイクルにて10×106個の細胞で処置した。第1~6サイクルにて、細胞を投与した。第7サイクルにて、患者を2×106個の細胞で処置した。第8及び9サイクルにて、患者を10×106個の細胞で処置した。第7~10サイクルにて、投与は脳室内で行った。
図32Aは、CD19によってモニターされるCAR T細胞の持続性の分析を示す。この分析は、第2サイクルの8日後に良好なT細胞持続性を示す。図32Bは、細胞上のIL13Rα2発現によってモニターされるGBM細胞の存在の減少を示す。
図33A及び図33Bは、腫瘍内投与のために用いられるカテーテルの領域における患者UPN097のイメージング結果を示す。図33Aでは、処置前においてCD3+又はCD8+ T細胞がほとんど存在しないことが分かる。左前頭腫瘍腔壁から採取した治療後16日目の試料である図33Bは、壊死性腫瘍の大きな領域及びCD3+及びCD8+細胞の有意な存在を示す。
図34A~Dに示すように、IL-13のレベルは有意に変化しなかった(Th2サイトカイン)が、処置の2つのサイクルにわたってIFN-γの増加があった(Th1サイトカイン)(図34A及び図34B)。腫瘍関連サイトカインであるIL-6は、第1サイクルの間に減少し、第2サイクルの間、より低いレベルであった(図34C)。別の腫瘍関連サイトカインであるIL-8は、第1サイクルの間に減少したが、第2サイクルの間、その前の第1サイクルレベルに向かって増加した(図34D)。
患者UPN109は、脊髄に1つの転移部位及び広範な軟膜疾患を包含する再発性多巣性GBMを提示した。上記のように、この患者は、最も大きな再発腫瘍病巣焦点の切除腔内への、IL13BBζ Tcmの6回の局所注入により、治療された。CAR T細胞注射部位は、7週間以上にわたり疾患再発の証拠なしに安定したままであったが、CAR T細胞注射部位から離れた他の病巣は進行し続けた(データは示さず)。次いで、この患者は、上記のように、IL13BBζ Tcmの5週間の(five weekly)の脳室内注入を受けた。図35A~Bは、横断脳切片(図35A)及び矢状脳切片(図35B)のMRI及び/又はPET画像を示す。図35Cは、脳室内治療の前(左)及び1週間後(右)の脊柱の横(最上部)及び前頭(最低部)断面を示す。腫瘍病変部位は各画像において赤い矢印で示される。
実施例16: 脳室内投与の症例報告
50歳の男性は、最初に大発作を呈した後、右頭葉に低悪性度脳腫瘍と診断された。4カ月間のモニタリング後、この右側頭腫瘍はMRIによる増強を示した。前記患者は腫瘍切除を受け、WHOグレードIV神経膠腫(GBM)の診断を確定した。次いで前記患者は、同時のテモゾロミド(毎日140mg)と合わせて59.4コバルトGy相当量の総線量まで、標準治療アジュバント陽子線照射を、続いて、Novocure装置(NovoTTF-100A)を併用してテモゾロミド4サイクルを3ヶ月間受けた。原発性腫瘍切除術後6ヵ月後、PET及びMRI画像は疾患の進行の証拠を示した。
50歳の男性は、最初に大発作を呈した後、右頭葉に低悪性度脳腫瘍と診断された。4カ月間のモニタリング後、この右側頭腫瘍はMRIによる増強を示した。前記患者は腫瘍切除を受け、WHOグレードIV神経膠腫(GBM)の診断を確定した。次いで前記患者は、同時のテモゾロミド(毎日140mg)と合わせて59.4コバルトGy相当量の総線量まで、標準治療アジュバント陽子線照射を、続いて、Novocure装置(NovoTTF-100A)を併用してテモゾロミド4サイクルを3ヶ月間受けた。原発性腫瘍切除術後6ヵ月後、PET及びMRI画像は疾患の進行の証拠を示した。
次に、IHCによる原発性右側頭葉腫瘍におけるIL13Rα2発現の確認後に、自己IL13Rα2標的化CAR T細胞で患者を処置し(図36)、Hスコア100を得た(図37)。次いで、白血球アフェレーシス(leukapheresis)により、続いて、前述のように、2ステップデプレッション(depletion)選択法を介したCD4+ CD8+ TCMの濃縮により、末梢血単核細胞(PBMC)が回収された。IL13BBζ TCMの製造中、前記患者は線維芽細胞成長因子阻害剤(NCT01975701)を評価する別の臨床プロトコルで治療され、頭痛、混乱及び増大する見当識障害の症状を伴う治療によって進行した。さらに、前記患者はT細胞注射の前に先細(tapered off)ステロイドであった。
原発性腫瘍切除後10ヶ月後、前記患者は、リザーバ/カテーテル装置が配置された右後頭側-後頭部領域(T1)における最大病変部を包含する5つの同定された進行性GBM病変のうちの3つ(図)38、及び右前頭葉における2つの病変(T2、T3)について、別の外科的切除を受けた。左の側頭領域における2つのさらなる腫瘍は外科的に除去されなかった(T4、T5)。外科的切除後6日目、患者は、2回の4週間の治療レジメンを受けた。各レジメンは、IL13BBζ TCMの3週間の(three weekly)腔内(ICT)注入、続いて、毒性評価及び疾患評価のための1週間からなる。この患者を低用量の2×106 CAR+ T細胞から開始し、続いて10×106 CAR+ T細胞の5回の注入で治療した(図39)。これらの6回のICT注入の後、特例使用プロトコルの下で、前記患者がIL13BBζ TCMのさらなる5回の脳室内(ICV)治療サイクル受けられ、再び、2×106 CAR T細胞の低用量で開始し、10×106 CAR T細胞の4回の注入が続く、第2のカテーテルを右側脳室内に配置した(図40)。
限定された治療用生成物に起因して、わずか5回のICV注入サイクルが実現可能であった。全体的に、患者は94×106のCAR+ T細胞の総用量について11回の細胞注入を受けた。治療コースは、3回目のサイクルごとに、及び最後の2回のICV注入後に、毒性及び疾患評価(すなわち、MRI及びPETイメージング)が行われるための評価週を含む、15週を包含した。前記患者はこのCAR T細胞治療コース中に他の治療的介入を受けなかった。11回の注入サイクルを包含する190日間の評価期間までの所見がここに報告される。続いて、第2のIL13BBζ TCM産物が製造された。192日目に開始して、この患者はこの第2の産物のICV注入を約3週間おきに続けた。
実施例17: 研究デザイン
特例使用プロトコルを包含するこれらの研究は、施設の審査委員会によって承認された。患者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。適格性は、現在再発しているIL13Rα2+グレードIV神経膠腫の組織学的に確認された診断、カルノフスキーのパフォーマンスステータス(KPS)>60がある年齢>18歳、適当な心肺機能、及び生存期待>4週間、を包含した。患者は、参加前少なくとも12週間に初期放射線治療を完了していなければならず、いずれの他の活動性悪性腫瘍、感染症又は間接性疾患を有してはならない。又は、他の治験薬を受けていなければならず、又は、T細胞療法中に2mg TID(3x/day)より多いデキサメタゾンを必要とする。
特例使用プロトコルを包含するこれらの研究は、施設の審査委員会によって承認された。患者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。適格性は、現在再発しているIL13Rα2+グレードIV神経膠腫の組織学的に確認された診断、カルノフスキーのパフォーマンスステータス(KPS)>60がある年齢>18歳、適当な心肺機能、及び生存期待>4週間、を包含した。患者は、参加前少なくとも12週間に初期放射線治療を完了していなければならず、いずれの他の活動性悪性腫瘍、感染症又は間接性疾患を有してはならない。又は、他の治験薬を受けていなければならず、又は、T細胞療法中に2mg TID(3x/day)より多いデキサメタゾンを必要とする。
この患者は、再発性/難治性IL13Rα2+高悪性度(high-grade)グリオーマ(WHOグレードIII及びIV)と診断された患者における自己IL13Rα2標的化CAR T細胞(IL13BBζ TCM)の毎週の頭蓋内注入の安全性及び実行可能性を評価するために、我々の進行中の第I相試験(NCT02208362)の下、最初に治療された。これは、T細胞を腫瘍内に直接的に(層1=腫瘍内)又は腫瘍切除腔内に(層2=腔内に)のいずれかで投与した2アーム研究である。6つの腔内(ICT)注入サイクルを完了した後、この患者を次に、IL13BBζ TCMの脳室内(ICV)送達を可能にする別々の特例使用プロトコルの下で治療した。
実施例18: 細胞製品の製造及び注入
4-1BB共刺激性、IL13Rα2標的化CAR、IL13BBζをコードするレンチウイルスベクターは本明細書に詳述される。簡潔には、コドン最適化されたCAR配列は、IL13Rα1、Fc受容体仲介認識を妨げる2つの突然変異(L235E;N297Q)を含有するヒトIgG4 Fcスペーサー、ヒトCD4膜貫通ドメイン、ヒト共刺激4-1BB細胞質シグナル伝達ドメイン、及びヒトCD3ζ細胞質シグナル伝達への潜在的結合を減少させるため、単部分位(E13Y)で突然変異した膜係留ヒトIL-13リガンドを含有する。次いで、T2Aリボソームスキップ配列は、このIL13BBζCAR配列を、不活性非免疫原性細胞表面マーカーである短縮型ヒトCD19配列(CD19t)から分離する。
4-1BB共刺激性、IL13Rα2標的化CAR、IL13BBζをコードするレンチウイルスベクターは本明細書に詳述される。簡潔には、コドン最適化されたCAR配列は、IL13Rα1、Fc受容体仲介認識を妨げる2つの突然変異(L235E;N297Q)を含有するヒトIgG4 Fcスペーサー、ヒトCD4膜貫通ドメイン、ヒト共刺激4-1BB細胞質シグナル伝達ドメイン、及びヒトCD3ζ細胞質シグナル伝達への潜在的結合を減少させるため、単部分位(E13Y)で突然変異した膜係留ヒトIL-13リガンドを含有する。次いで、T2Aリボソームスキップ配列は、このIL13BBζCAR配列を、不活性非免疫原性細胞表面マーカーである短縮型ヒトCD19配列(CD19t)から分離する。
白血球搬出の日にIL13BBζ TCMを製造するために、PBMCは、Ficoll-Paque(GE Healthcare)上での密度勾配遠心分離、続いてPBS/EDTA中での2回の洗浄によって単離された。次いで、PBMCをPBS中で1回洗浄し、10%ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone)を含有するX Vivo15培地(Bio Whittaker)に再懸濁し、300ccのトランスファーバッグに移し、室温で(RT)一晩3-Dローテーター上に保存した。翌日、5x109 PBMCを、臨床グレードの抗CD14(1.25mL)、抗CD25(2.5mL)及び抗CD45RA(2.5mL)マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を含む300ccトランスファーバッグ中でRTで30分間、10%FCSを含有するX Vivo15中でインキュベートした。CD14+、CD25+、及びCD45RA+細胞は、製造元の指示(Miltenyi Biotec)に従ってCliniMACS(商標)デプレッション(depletion)を用いて直ちに枯渇させた。遠心分離後、細胞の非標識陰性画分を0.5%ヒト血清アルブミン(HSA)(CSL Behring)を含有するCliniMACS(商標)PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec)に再懸濁し、次いで、臨床グレードのビオチン化DREG56mAb(COHNMC CBG)で、RTで30分間、0.6mLにおいて標識化した。次いで、細胞を洗浄し、0.5%HSAを含有する100mLのCliniMACS(商標)PBS/EDTAの最終容量中に再懸濁し、新しい300ccのトランスファーバッグに移した。1.25mLの抗ビオチンマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)と30分間インキュベー
ションした後、CD62L+画分(TCM)をCliniMACS(商標)でのポジティブ選択により、製造者の指示に従って精製し、10%FCSを含有するX Vivo15中に再懸濁した。
ションした後、CD62L+画分(TCM)をCliniMACS(商標)でのポジティブ選択により、製造者の指示に従って精製し、10%FCSを含有するX Vivo15中に再懸濁した。
濃縮2時間以内に、1:3の比(T細胞:ビーズ)でGMP Dynabeads(登録商標)ヒトTエキスパンダCD3/CD28(Invitrogen)を用いて26.9×106 TCMを刺激した。そして、37℃、5%CO2において培養ラック上の水平位置に置かれた32個のVuelife組織培養バッグ(AFC)中に、5μg/mLの硫酸プロタミン(APP Pharmaceutical)、50U/mL rhIL-2及び0.5ng/mL rhIL-15と共に10%FCSを含有する5.5mLのX Vivo15中の0.3のMOIで臨床グレードのIL13BBζ-T2A-CD19t_epHIV7で形質導入した。次いで、細胞密度を4×105~2×106生存細胞/mLに維持するために、必要に応じてX-Vivo15 10%FCSを加えることにより、培養の月曜日、水曜日、及び金曜日ごとに、サイトカイン補充(50U/mL rhIL-2及び0.5ng/mL rhIL-15の最終濃度)により、培養物を維持した。培養物体積に基づいて、T細胞を730個のVuelifeバッグ(AFC)に移した。レンチウイルス形質導入の7日後、CD3/CD28 DynabeadsをDynal ClinEx Vivo磁性粒子濃縮器バッグ磁石を用いて除去した。ビーズを含まないT細胞を新しい730 Vuelifeバッグ内に排出した。培養物をGuava PCAによって決定されるように約4.53×108個の細胞が生成するまで増殖させた。その時点で培養物を回収し、2%HSAを含むIsolyte(Braun)中で洗浄し、次いでMr. Frosty(Nalgene)及びポータブル制御速度フリーザーシステム(Custom Biogenics)を使用した凍結保存のため、Cryostor CS5(BioLife Solutions)中に約1.3×107細胞/mLで再懸濁した。品質管理試験は、生存能力、効力(CD19t発現)、同一性(CD3発現)、トランスジーンコピー数(WPRE qPCR)、複製能のあるウイルス試験(VSV-G qPCR及びインディアナ大学での正式RCL試験)、残存ビーズカウント、及び無菌状態(sterility)を包含した。
上記のように、T2Aリボソームスキップ配列12は、このIL13BBζ配列をCD19t、細胞形質導入をマーキングする不活性非免疫原性細胞表面マーカーから分離する(図39A)。このT2A結合は、単一の転写産物からのIL13BBζ及びCD19tの両方の同調発現をもたらす。
CD62L+ CD45RA-CD4+ CD8+セントラルメモリーT細胞(TCM)、レンチウイルス形質導入及びex vivo増殖の免疫原性富化のための製造方法もここに詳述する。エンドオブプロセス(end-of-process)(EOP)凍結保存された(cryopreserved)IL13BBζ TCM製品は、臨床プロトコルに従って、品質管理放出試験を受けた。各注入について、2%ヒト血清アルブミン(HSA)を含む医薬保存料を含まない生理食塩水(PFNS)中で、T細胞を解凍し、洗浄し、最終容量0.5mLに再定式化した。5~10分間かけて0.5mL体積、続いて1時間当たり0.5mLの対流増強送達(CED)により送達される最大1mLのPFNSフラッシュを送達するため、細胞を21ゲージのバタフライ針を用いてRickhamリザーバに手動で注入した。
実施例19: 臨床イメージング
脳及び脊椎のポストガドリニウムT1加重MRI配列を、Siemens Viro 3 Teslaスキャナー上で獲得した。Multihance(登録商標)の投与後に得られたアキシャルT1 のMPR加重画像上で病変を測定した。GE Discovery DST HP60 PET-CTスキャナー(70cmアキシャル視野、スライス厚3.75mm)を用いて、18-F-フルオロデオキシグルコース(18-F-FDG
)による画像化を行った。最大標準取込値(SUV)は、Vital Images Vitreaバージョン6.7.2ソフトウェアを利用して得た。造影増強腫瘍病巣の領域を、最大腫瘍面積(mm2)の測定のための放射線科医によって概説した。及び腫瘍体積(cm3)を計算した。
脳及び脊椎のポストガドリニウムT1加重MRI配列を、Siemens Viro 3 Teslaスキャナー上で獲得した。Multihance(登録商標)の投与後に得られたアキシャルT1 のMPR加重画像上で病変を測定した。GE Discovery DST HP60 PET-CTスキャナー(70cmアキシャル視野、スライス厚3.75mm)を用いて、18-F-フルオロデオキシグルコース(18-F-FDG
)による画像化を行った。最大標準取込値(SUV)は、Vital Images Vitreaバージョン6.7.2ソフトウェアを利用して得た。造影増強腫瘍病巣の領域を、最大腫瘍面積(mm2)の測定のための放射線科医によって概説した。及び腫瘍体積(cm3)を計算した。
品質管理放出された自己IL13BBζ TCMの凍結保存された細胞バンクを解凍した。そして、2%HSAを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、及び2%HSAを含む医薬保存料を含まない生理食塩水中に再懸濁することにより、再構築された。神経膠腫切除腔(ICT)又は側脳室(ICV)いずれかへの治療用CAR T細胞の送達は、脳室カテーテル(Integra Pudenz)及びスタイレットを備えたHolter(商標)Rickham Ventriculostomy Reservoir(Codman)を用いて達成された。ICT送達のために、腫瘍切除の時点でリザーバ/カテーテル装置を挿入した。内及び腫瘍周囲脳組織内の両方への細胞送達を可能にするため、カテーテルの先端を切除壁に部分的に埋め込んだ。カテーテルの位置及び腫瘍切除の程度を確認するために術後イメージング(CT及びMRI)を得た。
実施例20: IL13BBζ TCMは、セントラルメモリー様のT細胞表現型を示す
濃縮TCM(36×106)をex vivoで刺激し、レンチウイルスで形質導入し、そして17日間で638×106個の全細胞を得るため増殖した。最終的なT細胞の生成物(CD3+及びTCR+)は、CD4(74%)及びCD8(16%)T細胞サブセットからなり、両方の細胞表面タンパク質についての遺伝子修飾共染色と共にIL13BBζとCD19tを発現した(図39A)。CAR T細胞生成物は、CD45RO(97%)、CD62L(57%)、CCR7(28%)、CD28(97%)及びCD27(59%)を発現する、セントラルメモリーT細胞の表現型を示した(図39A)。この製品はまた、TIM-3(65%)及びLAG-3(49%)を包含するが、PD-1及びKLRG1の有意なレベルを包含しない、いくつかの疲弊(exhaustion)マーカーを示した(図39A)。
濃縮TCM(36×106)をex vivoで刺激し、レンチウイルスで形質導入し、そして17日間で638×106個の全細胞を得るため増殖した。最終的なT細胞の生成物(CD3+及びTCR+)は、CD4(74%)及びCD8(16%)T細胞サブセットからなり、両方の細胞表面タンパク質についての遺伝子修飾共染色と共にIL13BBζとCD19tを発現した(図39A)。CAR T細胞生成物は、CD45RO(97%)、CD62L(57%)、CCR7(28%)、CD28(97%)及びCD27(59%)を発現する、セントラルメモリーT細胞の表現型を示した(図39A)。この製品はまた、TIM-3(65%)及びLAG-3(49%)を包含するが、PD-1及びKLRG1の有意なレベルを包含しない、いくつかの疲弊(exhaustion)マーカーを示した(図39A)。
実施例21: IL13BBζ TCMの反復的頭蓋内注入(infustions))の安全性及び耐性
患者は、2つの異なる頭蓋内送達経路、即ち腫瘍切除後の腔内(ICT)送達(第1~6サイクル)及び脳脊髄液(CSF)への脳室内(ICV)送達(第7~11サイクル)である、を介してリザーバ/カテーテル装置を介して投与されたIL13BBζ TCMの毎週の注入によって治療された。10×106 CAR+ T細胞の最大細胞用量での11回の頭蓋内注入は、観察された治療に対する可能性又はそれ以上の帰属を伴う、グレード3以上の毒性(NCI共通毒性基準)なしで良好に耐容された。CAR T細胞注入後に認められる軽度の事象には、以下が含まれる。
患者は、2つの異なる頭蓋内送達経路、即ち腫瘍切除後の腔内(ICT)送達(第1~6サイクル)及び脳脊髄液(CSF)への脳室内(ICV)送達(第7~11サイクル)である、を介してリザーバ/カテーテル装置を介して投与されたIL13BBζ TCMの毎週の注入によって治療された。10×106 CAR+ T細胞の最大細胞用量での11回の頭蓋内注入は、観察された治療に対する可能性又はそれ以上の帰属を伴う、グレード3以上の毒性(NCI共通毒性基準)なしで良好に耐容された。CAR T細胞注入後に認められる軽度の事象には、以下が含まれる。
* T細胞投与に対する可能性のある又はより高い帰属がある事象のみが報告される;全てが一度発生し、NCI共通毒性基準に従ってグレード1-2であり、グレード3以上の事象は観察されなかった。
実施例22: 臨床応答
治療の時点で、患者の腫瘍は、不良な予後特徴がある非常に攻撃的な再発性GBMの特徴を示した。これには、標準治療後の治療から6ヶ月以内の一次診断からの再発の証拠、脊髄病変及び広範囲の軟部腫瘍疾患を包含する、多病巣性腫瘍病変の提示(図38)、脱分化型GBMの組織学的特徴、及び60%を超える細胞がKi67陽性に染色された高い腫瘍増殖率(図37B)が含まれた。切除された腫瘍組織のFFPEに対するIHCによって評価されたIL13Rα2の腫瘍発現は、それぞれ100及び80のHスコアがある原発性腫瘍と再発性腫瘍との間で類似していた(図37)。再発腫瘍の腫瘍内IL13R
α2発現は不均一であった。細胞の10%が高い染色強度(2-3+)を示し、60%が低発現(1+)を示し、細胞の30%がバックグラウンド(0+)よりも染色されなかった。潜在的な関心事の中で、最も高いレベルのIL13Rα2発現は、他のGBM腫瘍について言及された発現パターンである、偽柵構造(pseudopalisading)壊死の腫瘍領域においてしばしば観察された(図37A)。
治療の時点で、患者の腫瘍は、不良な予後特徴がある非常に攻撃的な再発性GBMの特徴を示した。これには、標準治療後の治療から6ヶ月以内の一次診断からの再発の証拠、脊髄病変及び広範囲の軟部腫瘍疾患を包含する、多病巣性腫瘍病変の提示(図38)、脱分化型GBMの組織学的特徴、及び60%を超える細胞がKi67陽性に染色された高い腫瘍増殖率(図37B)が含まれた。切除された腫瘍組織のFFPEに対するIHCによって評価されたIL13Rα2の腫瘍発現は、それぞれ100及び80のHスコアがある原発性腫瘍と再発性腫瘍との間で類似していた(図37)。再発腫瘍の腫瘍内IL13R
α2発現は不均一であった。細胞の10%が高い染色強度(2-3+)を示し、60%が低発現(1+)を示し、細胞の30%がバックグラウンド(0+)よりも染色されなかった。潜在的な関心事の中で、最も高いレベルのIL13Rα2発現は、他のGBM腫瘍について言及された発現パターンである、偽柵構造(pseudopalisading)壊死の腫瘍領域においてしばしば観察された(図37A)。
臨床プロトコルへの登録後、この患者は、5つの再発病変のうちの3つについて外科的切除を受けた(図38)。リザーバ/カテーテル装置は、右後頭側-後頭部領域における最も大きな再発巣(T1)の切除された腔に配置した。この患者は、最初に、CAR+ T細胞(2×106 第1サイクル;10×106 第2~6サイクル)の6週間(six weekly)の腔内(ICT)注入によりプロトコルごとに治療された(図1B)。この期間中、側頭-後頭部腫瘍病変(T1)は、進行性疾患の証拠なしに、手術後45日以上にわたって安定したままであった(図39C)。しかし、MRIは、左側頭葉における他の非切除腫瘍病巣(T4及びT5)並びに腫瘍3に隣接する新たな再発病変(T6)及び嗅覚溝における病変(T7)がこの同じ期間にわたって進行したことを明らかにした(図39C)。さらに、1つの大きな腫瘍(270mm2)及び1より多くの小さな腫瘍病巣(<1cm2)を包含する、脊柱の転移性病変も検出された。これらの結果は、混合しているが、IL13BBζ TCMが切除された後頭側頭-後頭部領域での疾患再発を予防した可能性があることを示唆していることから、奨励された。しかし、これらはまた、局所ICT送達は、注入部位から離れた遠隔地における腫瘍の進行を効果的に制御するのには不十分であったことを示唆した。
これらの知見に基づいて、及び、CAR T細胞のICV送達がNSGマウスモデルにおいて多巣性GBMに輸送され得ることを示す前臨床試験によって支持され(データは示さず)、この患者は、特例使用プロトコルに登録され、かつ、いずれの他の治療的介入なしで、IL13BBζ TCMの5週間(five weekly)のICV注入で治療した(2×106 第7サイクル;10×106 第8~11サイクル)(図40A)。3回のICV注入の1週間後に(9サイクル;133日目)、すべての腫瘍病変が劇的な退行を示した。最終的なICV注入の後(11サイクル;156日目)、大部分の頭蓋内及び脊髄腫瘍は、最大面積及び体積測定の両方によって70%を超えて退縮していた(図40B~E、以下の表7、及び図41)。患者が他の治療的介入を受けなかった最後のICV注入の6週間後の追跡MR及びPETイメージングは(190日目)、疾患の退行を継続して示した。最大面積及び体積の両方の測定によって腫瘍が≧78%減少した(図40B~E、以下の表7及び図41)。この190日目の時点で、疾患対炎症、瘢痕(scaring)及び/又は硬膜増強の残存X線写真の証拠を区別することはできなかった。IL13BBζ TCMのICV送達は、脊柱内のすべての転移性腫瘍のほぼ完全な排除を誘発した。最大の病変の最大面積が97%減少した。ICV治療の前に存在する10以上のうちわずか1つの小さな腫瘍病巣が見える。ICV治療の時間経過及び腫瘍退縮と同時に、システムデキサメタゾン(dexamethosome)を2mg bidから0.5mg qdに減らすことができた。この患者は臨床的に安定したままであり、正常な生活と仕事の活動に戻った。従って、このCAR T細胞媒介性抗腫瘍応答の持続性を支持する。これらの結果は、IL13BBζ TCMによる処置が、厳しいRANO基準に基づいてほぼ完全な応答を媒介することを示している。
*、 第1~6サイクルで発生した新しい病変
太字、 最大%減少と比較した値
NA、 病変は特定できなかった
0、 病変は視覚的に特定されるかもしれないが、値は分析ソフトウェアパラメータの値よりも低かった
ND、 イメージングが行われていない
太字、 最大%減少と比較した値
NA、 病変は特定できなかった
0、 病変は視覚的に特定されるかもしれないが、値は分析ソフトウェアパラメータの値よりも低かった
ND、 イメージングが行われていない
実施例23: CAR T細胞の持続性及びCNS炎症反応
IL3BBζ TCMのICV注入(第6~11サイクル)後に観察された抗腫瘍応答に関連する免疫学的変化を解明するために、CSFを細胞浸潤、CAR+ T細胞持続性、及びサイトカインレベルについて評価した。各ICV注入の直後に(すなわち、第6~11サイクルの第1-2日目)、CSFのmL当たりの細胞数は、プレ注入レベル(各サイクルの0日目)と比較して7.0±3.6倍増加し、かつ、プレICV(C7D0)レベルと比較して153±128倍増加した(図42)。CSF中の総細胞数は、典型的には、7日間の治療サイクルにわたって減少した。C9D2について評価したところ、細胞浸潤物は、CD14+ CD11b+ HLA-DR+成熟骨髄集団と同様に、内因性及びCAR発現性の両方の、CD3+ T細胞の大部分を包含した(図42A)。まれなCD19+ B細胞及びCD11b+ CD15+顆粒球のみが検出された(図42A)。フローサイトメトリーデータと一致して、C11D1についてのCSF細胞病理学は、反応性リンパ球、単球及びマクロファージの存在を報告した。
IL3BBζ TCMのICV注入(第6~11サイクル)後に観察された抗腫瘍応答に関連する免疫学的変化を解明するために、CSFを細胞浸潤、CAR+ T細胞持続性、及びサイトカインレベルについて評価した。各ICV注入の直後に(すなわち、第6~11サイクルの第1-2日目)、CSFのmL当たりの細胞数は、プレ注入レベル(各サイクルの0日目)と比較して7.0±3.6倍増加し、かつ、プレICV(C7D0)レベルと比較して153±128倍増加した(図42)。CSF中の総細胞数は、典型的には、7日間の治療サイクルにわたって減少した。C9D2について評価したところ、細胞浸潤物は、CD14+ CD11b+ HLA-DR+成熟骨髄集団と同様に、内因性及びCAR発現性の両方の、CD3+ T細胞の大部分を包含した(図42A)。まれなCD19+ B細胞及びCD11b+ CD15+顆粒球のみが検出された(図42A)。フローサイトメトリーデータと一致して、C11D1についてのCSF細胞病理学は、反応性リンパ球、単球及びマクロファージの存在を報告した。
CAR-T持続性もまた、ICV処置コースにわたってモニターされた。第7及び8サイクルのCSFにおける細胞回収率が低いため、分析は第9サイクル、並びに第10及び11サイクルの直後の時点を評価することに焦点を当てた。重要なことに、CAR+ T細胞は、第8サイクルの7日後に対応するC9D0を含めて、評価された全時点で検出された(図42B)。したがって注入後少なくとも7~8日間治療細胞の持続性を実証する。しかし、注入後のCSFにおけるCAR Tの数は、腫瘍負荷が有意に減少した後のサイクルで減少した(C10D1及びC11D1)(図40B)。注目すべきことに、第9サイクルでのCSFにおけるCAR T細胞の有意な増殖は検出されなかった。CAR+細胞数は、注入前(C9D0)から2日後に(C9D2)1.6倍に増加し、その後、8日目には(C9D8)2.3倍減少した。
各注入後のCAR+ T細胞を包含する免疫細胞の存在は、CSFにおけるサイトカインレベルの有意な上昇に対応した。測定されたレベル及び測定された30-サイトカインについてのベースラインを超える計算されたfold-changeを以下の表9及び表10に示す。特に、11個のサイトカインがIL3BBζTCM注入の直後、プレICVベースライン(C7D0)から10倍以上増加した。サイトカインIFNγ、TNF、IL-2、IL-10、IL-5、IL-6及びIL-8及びケモカインCXCL9/MIG、CXCL10/IP-10、及びCCR2/MCP-1及び可溶性サイトカイン受容体IL-1Rαを包含する(図3C)。7つの他のサイトカインは、ベースライン(C7D0)から5倍以上の増加を示した。G-CSF、IL-12、IL-2-R、IL-4、IL-7、及びMIP-1bを包含する。プレICV(C7D0)と比較してIL3BBζ TCM注入直後に最も高い倍数増加を示した炎症性サイトカインは、IL-2(C9D2について>90倍)及びIFN-γ誘導性ケモカインCXCL9及びCXCL10(C8D1、C9D2、C10D1及びC11D2について>40倍)であった。これらのサイトカインは、治療サイクルの間に7日間以内にほぼベースラインレベルに戻った。CAR T細胞注入後に有意な増加を示さなかったサイトカインには、IL-13、RANTES及びVEGFが含まれる(表9及び表10)。
OOR<、 範囲外(Out of Range)(未満)
*、 標準範囲を超えて外挿した値
*、 標準範囲を超えて外挿した値
表10からの太字の値、「OOR<」値は、fold changeの計算を可能にするために、そのサイトカインについての測定可能な最低値で置き換えた。
*、 >10倍以上の増加が少なくとも1回観察されたサイトカイン。
*、 >10倍以上の増加が少なくとも1回観察されたサイトカイン。
CSFにおけるこれらの免疫学的変化は局所的であった。サイトカインレベルの有意な変化がなく(表11)、qPCRによる検出可能なCAR+ T細胞及び末梢血中のフローサイトメトリー(データ示さず)は観察されなかったためである。CSFにおける変化は、ICT治療コース中に腔から嚢胞液を得ることができないため、腫瘍病変1(T1)の切除された腔における変化と比較することができなかった。
OOR<、 範囲外(Out of Range)(未満)
*、 標準範囲を超えて外挿した値
*、 標準範囲を超えて外挿した値
実施例24: 患者の試料処置及び分析
腫瘍切除材料を、臨床プロトコルに従って病理学のCOH部門を介して収集した。
腫瘍切除材料を、臨床プロトコルに従って病理学のCOH部門を介して収集した。
IL-13Rα2免疫組織化学(IHC)は、上記のようにホルマリン固定パラフィン包埋標本の5μm切片について実施した。Ki67 IHCは、pH8.0での加熱による抗原回収、及び抗K167(Dako Corp)の1:75希釈を除いて同様に実施した。IL-13Rα2免疫反応性を臨床的神経病理学者によってスコアリングし、弱い(1+)、中程度(2+)、又は強い(3+)強度の細胞質及びゴルジ様染色を示す腫瘍細胞のパーセンテージに基づいて定量した。Hスコアは、式:
(3×強く染色する細胞のパーセンテージ)+(2×中程度に染色する細胞のパーセンテージ)+弱い染色する細胞のパーセンテージ
によって得られ、0~300の範囲を与える。Hスコアは、以下のように、登録基準に記載された強度スコアリングシステムに翻訳することができる。0は負(Hスコア0)を表し、1+は低い(Hスコア1~100)を表し、2+は中程度(Hスコア101~200)を表し、3+は高い(Hスコア201~300)を表す。包含基準は、1+染色強度(>20%、1+)をスコアリングする細胞の少なくとも20%であり、Hスコア20を表した。適当な陽性(精巣)及び陰性(前立腺)対照をIL-13Rα2IHC染色に用いた。「+」記号は、膜状染色の存在を反映する。この試験は、City of Hope National Medical Centerの病理学科で行われ、研究のための治験とみなされる。この検査室は、複雑な臨床検査室の検査を実施する資格があるとして、1988年の臨床検査室改良改正(CLIA)の認定を受けている。
(3×強く染色する細胞のパーセンテージ)+(2×中程度に染色する細胞のパーセンテージ)+弱い染色する細胞のパーセンテージ
によって得られ、0~300の範囲を与える。Hスコアは、以下のように、登録基準に記載された強度スコアリングシステムに翻訳することができる。0は負(Hスコア0)を表し、1+は低い(Hスコア1~100)を表し、2+は中程度(Hスコア101~200)を表し、3+は高い(Hスコア201~300)を表す。包含基準は、1+染色強度(>20%、1+)をスコアリングする細胞の少なくとも20%であり、Hスコア20を表した。適当な陽性(精巣)及び陰性(前立腺)対照をIL-13Rα2IHC染色に用いた。「+」記号は、膜状染色の存在を反映する。この試験は、City of Hope National Medical Centerの病理学科で行われ、研究のための治験とみなされる。この検査室は、複雑な臨床検査室の検査を実施する資格があるとして、1988年の臨床検査室改良改正(CLIA)の認定を受けている。
末梢血試料をバキュテナーチューブ±EDTA中に集めた。EDTAを含む試料は、受領後直ちにフィコール化された。末梢血単核細胞(PBMC)を-80℃でCrystor CS5中で凍結し、次いで長期保存のために液体窒素に移した。EDTAを含まない試料を室温で2~3時間凝固させた。遠心分離によって血清を回収し、100~200μLの単回使用でアリコートに分け、-80℃で保存した。脳脊髄液(CSF)をICVリザーバから3ccシリンジで回収し、スピンダウンし、上清をアリコートに分けて-80℃で保存した。CSF細胞を、直ちにフローサイトメトリー分析のために2%FCS及びアジ化ナトリウムを含むHBSS-/-(Corning CellGro)に再懸濁した。残りの細胞を再懸濁し、-80℃でCryostor CS4中で凍結し、及び次いで、長期保存のために液体窒素に移した。
免疫細胞の細胞表面表現型決定は、CD3、CD4、CD11b、CD14、CD19、CD27、CD28、CD62L、CD45RA、CD45RO、IL-13、TCR-α/β(BD Biosciences)、KLRG1、CD15(BioLegend)、HLA-DR、PD1(eBiosciences)、CD8(Fisher Scientific)、LAG-3(Lifespan Biosciences)、CCR7、又はTIM-3(R&D Systems)に特異的な蛍光色素結合体及びそれらのそれぞれのアイソタイプ対照を用いたフローサイトメトリーによって行った。
研究参加者血清及びCSF試料を、サイトカインビーズアレイによって分析した。アッセイは、ヒトサイトカイン30-Plexパネルキット(Invitrogen)及びFLEXMAP 3D(登録商標)(Luminex)を用いて行った。
Claims (16)
- 有効量のT細胞を含み、前記T細胞は腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含む、中枢神経系の腫瘍と診断された患者を治療するための、前記患者の脳室内に投与するための医薬組成物。
- 有効量のT細胞を含み、前記T細胞は腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体を含む、中枢神経系の腫瘍と診断された患者を治療し、前記患者の脳室内に投与するための医薬組成物であって、前記キメラ抗原受容体は、以下の:
腫瘍標的化ドメイン、
配列番号4、14~20、50~52、又は1~5個のアミノ酸修飾があるそれらの各々の変異体から選択されるスペーサー、
CD4膜貫通ドメイン、又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD8膜貫通ドメイン、又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、CD28膜貫通ドメイン、又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、及びCD3ζ膜貫通ドメイン、又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体から選ばれる膜貫通ドメイン、
CD28共刺激ドメイン、又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体、及び4-1BB共刺激ドメイン、又は1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体から選択される、少なくとも1つの共刺激ドメイン、及び、
CD3zetaドメイン、
を含む、医薬組成物。 - 中枢神経系の腫瘍が神経膠芽腫である、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞が自己由来又は同種異系のT細胞である、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1×106個の細胞を含む、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- 少なくとも2回投与され、場合によっては、投与される前記T細胞の総数が異なるか、又は、投与量が段階的に増大するか若しくは段階的に減量される、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- 中枢神経系の腫瘍は、びまん性浸潤性腫瘍、原発性脳腫瘍、続発性脳腫瘍、又は、乳がん、肺がん、頭頸部がん及びメラノーマから選ばれる原発がん、が原因である、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- キメラ抗原受容体は、神経膠芽腫細胞の表面に発現するタンパク質と結合する、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- 前記T細胞はCD4+細胞及びCD8+細胞をともに含み、並びに/又は、前記T細胞は少なくとも10%のTcm細胞を含む、請求項1又2に記載の医薬組成物。
- 腫瘍標的化ドメインは、腫瘍抗原に標的化されたscFvを含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- scFvは、配列番号49で表されるか、又は配列番号49に1~5個のアミノ酸修飾があるその変異体を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
- 腫瘍標的化ドメインは、ヒトIL-13又はその変異体を含み、ここで前記ヒトのIL-13変異体は、配列番号3の第11位のアミノ酸がE以外であるという条件で、1~5個のアミノ酸修飾がある配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 膜貫通ドメインは、CD4膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、及びCD3ζ膜貫通ドメインから選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- スペーサーが、配列番号4、14~20、50、51、及び52から選択されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 少なくとも1つの共刺激ドメインは、CD28共刺激ドメイン及び4-1BB共刺激ドメインから選択される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 腫瘍は、以下の:原発性CNS悪性腫瘍及び他の場所にあるがんに起因する続発性悪性腫瘍、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質がん、AIDS関連がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形性/ラブドイド腫瘍、中枢神経系、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神グリオーマ、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、中枢神経系癌、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、大腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚T細胞リンパ腫、胚性腫瘍、中枢神経系、子宮内膜がん、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、骨の繊維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢がん、胃(gastric, stomach)がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍(GIST)、軟部組織肉腫、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛状細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞(肝臓)がん、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝細胞がん(原発性)、膵臓がん(原発性)、上皮内小葉がん(LCIS)、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳がん、骨悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞がん、中皮腫、NUT遺伝子関与の原発性中線管がんを伴う転移性扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成腫瘍/骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫(神経芽腫)、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔(oral)がん、口腔(oral cavity)がん、中咽頭がん、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、中間分化型松果体実質腫瘍、松果体芽腫(松果体芽細胞腫)、小脳テント上皮型原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳がん、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞(腎臓)がん、腎盂尿管がん、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平細胞がん、扁平上皮がん、扁平上皮頸部がん、胃(stamach, gastric)がん、小脳テント上室性原始神経外胚葉性腫瘍、T細胞リンパ腫、皮膚がん、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、腎盂尿管がんの移行上皮がん、絨毛腫瘍、尿管がん、腎盂がん、尿道がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍、からなる群から選択されるがんから生じる、請求項1又2に記載の医薬組成物。
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