WO2022092277A1 - Ｃｘｃｌ１２受容体発現キメラ抗原受容体（ｃａｒ）－ｔ細胞 - Google Patents

Ｃｘｃｌ１２受容体発現キメラ抗原受容体（ｃａｒ）－ｔ細胞 Download PDF

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頼子 齊藤
亜里 伊藤
レオナルド ディー シュルツ
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    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to an improved chimeric antigen receptor (CAR) -T cell therapy. More specifically, the present invention relates to modified cells co-expressing a chimeric antigen receptor and a CXCL12 receptor protein, and a drug and pharmaceutical composition having antitumor activity containing the cells. The invention further relates to a method of treating neoplastic disease with modified cells co-expressing a chimeric antigen receptor and a CXCL12 receptor protein.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Chimeric antigen receptor (CAR) -T cell therapy is an adopted immunotherapy using T cells (CAR-T cells) that express CAR that targets specific antigens that are expressed on the surface of cells such as tumor cells.
  • CAR-T cells are designed to recognize the target antigen and thereby attack the cells expressing the target antigen.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 Non-Patent Documents 1 to 3).
  • CAR-T cell therapy can be applied to other hematological malignancies and solid tumors.
  • AML acute myeloid leukemia
  • CD33 Non-Patent Document 4
  • CD123 Non-Patent
  • CAR-T cells targeting molecules such as Document 5
  • TAA-LeY tumor-related antigen Lewis-Y
  • CD33 is a molecule expressed in hematopoietic stem / progenitor cells (HSPC) and neutrophils.
  • HSPC hematopoietic stem / progenitor cells
  • neutrophils Possible adverse effects on normal bone marrow cells such as neutrophils can cause potentially fatal febrile neutropenia and opportunistic infections by fungi and bacteria.
  • CD19 is expressed in all B-ALL cells of B-ALL patients, but the expression of cell surface molecules in AML is very heterogeneous both between and within patients.
  • the present inventors have global transcrip using leukemia-initiating cells (LIC), normal CD34 + CD38-CD45RA-hematopoietic stem cells (HSC), and neutrophils in clinically highly invasive AML patients.
  • LIC leukemia-initiating cells
  • HSC normal CD34 + CD38-CD45RA-hematopoietic stem cells
  • neutrophils in clinically highly invasive AML patients.
  • Tome analysis was performed, and gene expression in patient-derived AML-initiated cells demonstrating the ability to generate AML in vivo in the NOD / SCID / Il2rgKO (NSG) heterologous transplantation assay was also analyzed.
  • NSG NOD / SCID / Il2rgKO
  • CD25 IL-2 receptor ⁇ chain, IL2RA
  • AML AML-associated multilinear leukemia
  • CD25 / IL2RA has been reported as a poor prognosis marker for AML (Gonen et al blood 2012) and also in other hematological malignancies such as chronic myelogenous leukemia (CML), adult T-cell leukemia / lymphoma, and Hodgkin lymphoma. It is expressed.
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • CD25 expression is also observed in subpopulations of regulatory T cells and activated T cells, it is not easy to evaluate whether CD25 / IL2RA is appropriate as a target molecule in CAR-T cell therapy.
  • the present inventors prepared a lentiviral vector containing a TCR-signal sequence and a Fab antigen recognition site of a human CD25 / IL2RA antigen in order to develop a CAR-T cell therapy for poor prognosis AML.
  • CD25-CAR lentivirus particles were introduced into umbilical cord blood-derived human T cells, and an increase in 2 ⁇ 10 7 or more CD25 CAR-T cells was achieved in vitro.
  • CXCR4 known as a homing receptor
  • CD25 CAR-T cells expressing CXCR4 were in more than CD25 CAR-T cells expressing CXCR4. It has been shown to grow more efficiently in vivo. CD25 CAR-T cells expressing CXCR4 were able to eradicate human AML cells in peripheral blood, spleen, bone marrow, and liver, consistent with their high frequency and number. In long-term observational experiments, CD25 CAR-T cells expressing human CXCR4 remained in the bone marrow of treated mice for more than 4 months, preventing recurrence of AML in recipient mice.
  • the aspects of the present invention are as follows. 1.
  • the CXCL12 receptor is CXCR4.
  • 3. The cell according to 1 or 2 above, wherein the chimeric antigen receptor (CAR) protein targets a cell surface antigen selected from CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD19 and CD7.
  • CD25 IL-2 receptor ⁇ chain
  • CD19 CD19
  • CD7 CD7
  • chimeric antigen receptor (CAR) protein targets a cell surface antigen selected from CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD19 and CD7.
  • the first polynucleotide and the second polynucleotide are introduced into the cell by the same or separate vectors.
  • Neoplasticity in a subject including the step of administering to the subject a cell that co-expresses the chimeric antigen receptor (CAR) protein targeting CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain) and the CXCL12 receptor protein on the cell membrane. Methods for treating and / or preventing recurrence of the disease. 13. 12.
  • Neoplastic diseases are acute myeloid leukemia (AML), adult T-cell leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL), T-cell acute lymphocytic leukemia (T-ALL), mixed trait acute leukemia (MPAL), 12.
  • the method according to 12 or 13 above which is selected from the group consisting of chronic myeloid leukemia (CML), Hodgkin's lymphoma, and non-Hojikin's lymphoma. 15. The method according to any one of 12 to 14, wherein the cells are administered as a single dose. 16.
  • the method according to any of 12 to 15 above wherein the cells in the range of 10 4 to 10 9 cells are administered per 1 kg of the body weight of the subject. 17.
  • the method according to any of 12 to 16 above further comprising the step of measuring the expression level of the target cell surface antigen in the tumor cells of the subject prior to administration of the cells. 18.
  • the method according to any of 12 to 17 above further comprising the step of evaluating the therapeutic effect after administration of the cells. 19.
  • the therapeutic effects in the subject were (i) reduction of tumor cells in blood, (ii) reduction of tumor cells in bone marrow, (iii) reduction of tumor cells in spleen, and (iv) reduction of tumor cells to the liver.
  • the method according to 18 above which is evaluated by one or more indicators selected from suppression of infiltration.
  • the above cancers are acute myeloid leukemia (AML), adult T-cell leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL), T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), mixed trait acute leukemia (MPAL), and chronic.
  • 20 or 21 above which is a neoplastic disease selected from the group consisting of myeloid leukemia (CML), Hodgkin's lymphoma, and non-Hojikin's lymphoma.
  • CML myeloid leukemia
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma
  • non-Hojikin's lymphoma The cell according to any one of 20 to 22 above, which is a T cell.
  • CXCR4-expressing CAR-T cell therapy is a promising therapeutic strategy for neoplastic diseases with poor prognosis.
  • A The ratio of CD25-expressing cells in the bone marrow of PDX (Patient-Derived Xenograft) mice transplanted with AML cells derived from three patients with different CD25 expression into immunodeficient mice is shown. From the left, CD25 negative, moderate expression, high expression. The reference chart shows the survival curves of CD25-negative and CD25-positive AML patients reported in 2012, respectively. CD25 expression has been reported to be associated with a poor prognosis for AML (Gonen et al., Blood 2012).
  • B The positive rate of CD25 in 84 AML patients measured by flow cytometry. Approximately 30% of AML patients with high and moderate expression are CD25 positive.
  • CD25 is a marker for regulatory T cells, and expression of CD25 was observed in some of the activated T cells. In contrast, normal monocytes (CD14 +), granulocytes (CD15 +) and CD34 + CD38 - stem cells do not express CD25.
  • A An example of a CAR-T construct targeting CD25 is shown.
  • CAR-T cells Shows the in vitro cytotoxic activity of CD25 CAR-T cells against CD25-positive AML cells (U390, U346) and CD25-negative ALL cells (U328).
  • CAR-T cells targeted CD25-expressing AML cells (U390 and U346), but not CD25-negative leukemia cells (U328), showing CD25-dependent cytotoxic activity.
  • mice transplanted with human AML cells were administered 5 ⁇ 10 6 CD25 CAR-T, and peripheral blood was collected every week for 4 weeks to collect human CD45-positive cells.
  • the results of analysis with a flow cytometer using the expression of CD33 and CD3 as an index are shown. All mice showed an increase in T cells (CD3 +) and a decrease in AML cells (CD33 +), but it was found that AML cells remained in the peripheral blood even after 4 weeks.
  • a good therapeutic response was observed in mouse # 2, it was found that the effect of CAR-T cell treatment targeting CD25 varied.
  • PDX mice transplanted with AML cells were administered 5 ⁇ 10 6 CD25 CAR-T cells, dissected 4 weeks later, and HE-stained bone marrow sections are shown.
  • Various types of cells such as granulocytes and myelocytes are observed in the bone marrow of immunodeficient mice (normal NSG), but in the bone marrow of AML PDX mice, leukemic blasts are filled in the bone marrow. was confirmed, and it was found that the therapeutic effect of CD25 CAR-T cells was not sufficient.
  • Left side low enlargement
  • right side high enlargement.
  • CD25 CAR-T cells When CD25 CAR-T cells are administered, almost all of the human cells remain leukemia cells, whereas when CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells are administered, CD33-positive leukemia (AML) cells are completely eliminated. It had disappeared.
  • AML human leukemia
  • the results of flow cytometry of CD45-positive cells in peripheral blood 4 months after administration of CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells to PDX mice transplanted with human AML cells (U390) are shown. No AML cells were detected in peripheral blood, and the effect of eliminating target AML cells 4 weeks after administration was maintained for 4 months or longer. After the disappearance of target cells, the frequency and absolute number of CXCR4CD25CAR-T cells gradually decreased, and mouse CD45-positive cells accounted for the majority of peripheral blood.
  • AML cells The frequency (percentage) of AML cells, mouse leukocytes, and CAR-T cells in the peripheral blood cells of PDX mice transplanted with human AML cells is shown.
  • CAR-T cells were not administered (2 animals)
  • most of the cells in the peripheral blood were human AML cells from immediately after transplantation of AML cells to 4 weeks later, but when CD25 CAR-T cells were injected (2 animals).
  • CD25 CAR-T cells were injected (2 animals.
  • two one mouse showed a decrease in AML cells and a corresponding increase in CAR-T cells, but the other mouse did not show a decrease in AML cells.
  • mice 3 mice to which CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells were administered
  • the number of AML cells was significantly reduced, and 3 weeks after the administration of CAR-T cells, the cells derived from AML cells were completely removed from the circulating blood. I was able to make it disappear.
  • the proportion of CAR-T cells increased during the survival of AML cells, but then gradually decreased.
  • normal mouse leukocytes increased, and 14 weeks after CAR-T cell administration, more than 90% of peripheral blood was mouse leukocytes. It is a photograph of the mouse spleen and bone marrow with and without CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells administered to PDX mice transplanted with human AML cells (untreated).
  • mice Splenomegaly and whitening of bone marrow were observed in untreated mice, whereas in mice treated with CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells, decreased spleen size and red blood marrow red blood cells were observed, indicating AML. A remarkable therapeutic effect on splenomegaly was confirmed.
  • the results of HE staining of bone marrow tissue of mice (U390 transplanted PDX mice) 4 weeks after CXCR4 expression CD25 CAR-T cell administration are shown. After eradication of AML cells by CAR-T cells, it was confirmed that normal leukocytes, erythrocytes, and megakaryocytes that make platelets were all restored in the mice.
  • the left is a weak enlargement and the right is a strong enlargement.
  • the results of flow cytometric analysis of bone marrow cells with and without CD25 CAR-T cells or CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells (untreated) in PDX mice transplanted with human AML cells (U390) are shown. ..
  • the untreated and CD25 CAR-T cell-administered samples are the results 4 weeks after administration, and the CXCR4-expressing CD25 CAR-T cell-administered samples are the results 4 months after administration.
  • the results of flow cytometric analysis of bone marrow cells with and without CD25 CAR-T cells or CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells (untreated) in PDX mice transplanted with human AML cells (U390) are shown. ..
  • the untreated and CD25 CAR-T cell-administered samples are the results 4 weeks after administration, and the CXCR4-expressing CD25 CAR-T cell-administered samples are the results 4 months after administration. Only when CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells were administered, complete disappearance of AML cells and recovery of normal mouse leukocytes (mCD45) were observed.
  • AML-transplanted mice (right side) to which CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells were administered once and mice not administered (left side) were sacrificed 150 days after administration, and myeloid tissue was stained with HE or anti-CD34 monoclonal antibody. The result of doing is shown.
  • the eradication effect of AML cells was maintained 5 months after CAR-T cell injection.
  • Several weeks after administration of CD25CAR-T or CXCR4-expressing CD25CAR-T cells to PDX mice prepared by transplanting 4 cases of AML-derived cells the mice were sacrificed and spleen cells and bone marrow cells. , And the results of examining the percentage of leukemia cells (% chimerism) for liver cells are shown.
  • One dot indicates one recipient mouse.
  • leukemic cells can be killed in significant recipient mice when administered with CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells.
  • CAR-T CD25CAR-T
  • CXCR4CAR-T CXCR4-expressing CD25CAR-T cells
  • Leukemia cells can be killed with a probability of.
  • NT No administration. Results of flow cytometric analysis of bone marrow cells at the expense of mice several weeks after administration of CD25CAR-T or CXCR4-expressing CD25CAR-T cells to PDX mice prepared by transplanting AML-derived cells. Is shown.
  • PDX mice transplanted with CD19-positive B-cell mixed trait acute leukemia (MPAL, B / myeloid, U211) cells were treated with a small-molecular-weight therapeutic agent, and then CXCR4-expressing CD19 CAR-T cells were administered.
  • MPAL B-cell mixed trait acute leukemia
  • CXCR4-expressing CD19 CAR-T cells were administered after administration of a small molecule therapeutic drug, the remaining MPAL cells on the 10th day after administration decreased to 0.4% on the 23rd day, and on the 32nd and 39th days. Then it disappeared completely.
  • CXCR4 expression CD19 CAR-T (CXCR4 CD19 CAR-T) treatment in xenograft model mice using TL1, which is a cell line of Burkitt lymphoma, is shown.
  • the left side shows the results of flow cytometry in bone marrow and liver of mice not treated with CAR-T cells.
  • Most of the human CD45-positive cells are CD19-positive, which is a B cell marker, and lymphoma cells occupy most of the bone marrow and liver.
  • CXCR4CD19CAR-T was administered (right side)
  • most of the human CD45-positive cells were CAR-T cells (CD3-positive) in both bone marrow and liver, and lymphoma cells almost disappeared. You can see that it is doing.
  • the present invention provides, in one embodiment, a cell that co-expresses a chimeric antigen receptor (CAR) protein and a CXCL12 receptor protein on a cell membrane.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CAR Chimeric antigen receptor
  • the cells to which the target specificity is transplanted by CAR are not limited, but for example, T cells can be preferably used.
  • T cells for example, naive T cells, central memory T cells, effector memory T cells, or a combination thereof can be used.
  • the T cells may be inflammatory T lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes, or helper T lymphocytes.
  • cytotoxic T lymphocytes can be used.
  • T cells are selected from CD4 + T lymphocytes and CD8 + T lymphocytes.
  • the T cells modified according to the invention are human T cells.
  • T cells can be obtained from a subject, eg, a human patient, by a variety of non-limiting methods prior to cell proliferation and recombination of the invention.
  • T cells are obtained from a number of non-limiting sources including peripheral blood mononuclear cells, bone marrow, lymph node tissue, cord blood, thymic tissue, tissue from the site of infection, ascites, pleural effusion, spleen tissue, and tumors. be able to.
  • any number of T cell lines available and known to those of skill in the art can be used.
  • the cells may be obtained from a healthy donor or from a patient diagnosed with cancer.
  • the cells are part of a mixed population of cells exhibiting different phenotypic characteristics.
  • CAR-T cells cells modified to express the chimeric antigen receptor
  • the structure of the chimeric antigen receptor (CAR) protein is well known in the art, and the CAR used in the present invention can also utilize the structure of the commonly used CAR.
  • the CAR used in the present invention has a target binding domain that specifically binds to a target molecule, a transmembrane domain, and an intracellular signal transduction domain.
  • the "domain” refers to a region within a polypeptide that is folded into a specific structure independently of other regions.
  • the molecules targeted by CAR in the present invention are antigens expressed on the surface of tumor cells, such as differentiation cluster molecules, such as CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123, CD138, tumor-related surface antigens such as ErbB2 (HER2 / neu), cancer fetal antigen (CEA), Lewis-Y (TAA-LeY), epithelial cell adhesion molecule (EpCAM), epithelial growth factor receptor (EGFR), EGFR Variant III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, disialoganglioside GD2, ductal epithelial mutin, gp36, TAG-72, spingoglycolipid, glioma-related antigen, ⁇ -human villous gonadotropin, ⁇ -fetoprotein ( AFP), lectin-reactive AFP, tyroglobulin, RAGE-1, MN-CAI
  • the molecule targeted by CAR in the present invention is an antigen that is significantly or significantly expressed in tumor cells as compared to other cells, and is not limited to, for example, CD7, CD19, CD20, etc.
  • GD2, CD22, CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD30, CD33, CD44, CD96, CD123, CD180, CEA, Her2 / neu, MUC1, MUC4, MUC6, EGFR, PRAME, VEGFR2, GM-CSFR, IL -11R ⁇ , IL-13 ⁇ 2, Lewis-Y (TAA-LeY) and the like can be mentioned.
  • the molecule targeted by CAR in the present invention is an antigen whose significant or significant expression is observed in a specific hematological tumor cell as compared with other cells, and is not limited to, but is not limited to, for example, CD7.
  • CD19, CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD33, CD123, tumor-related antigen Lewis-Y (TAA-LeY) and the like can be mentioned.
  • CD7, CD25, CD96, CD123, PRAME, and CD180 can be targeted for treatment and / or prevention of recurrence of acute myeloid leukemia (AML).
  • AML acute myeloid leukemia
  • CD19, CD20, CD32, and CD180 can be targeted for treatment and / or prevention of recurrence of B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) and mixed trait acute leukemia (MPAL).
  • B-ALL B-cell acute lymphoblastic leukemia
  • MPAL mixed trait acute leukemia
  • CD7 can be targeted for treatment and / or prevention of recurrence of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), MPAL and chronic myelogenous leukemia (CML).
  • one molecule may be selected as the target molecule of CAR, but in order to target a plurality of molecules, a plurality of CAR-T cells targeting each molecule may also be used. .. It is also possible to introduce CAR for each molecule into the same cell in order to target multiple molecules.
  • CAR targets a cell surface antigen selected from CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD19 and CD7, which are expressed in hematological malignancies.
  • CD25 IL-2 receptor ⁇ chain
  • CD19 CD19
  • CD7 CD7
  • CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain) has been previously reported as a marker of poor prognosis in AML. CD25 has been reported to be overexpressed in AML-initiated cells compared to normal D34 + CD38-hematopoietic stem / progenitor cells (HSPC) (Saito et al., Science Translational Medicine 2010).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • CD19 is expressed in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), follicular lymphoma, B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), and in non-hematopoietic cells, myeloid cells, erythrocyte cells, and T cells. It is known not to.
  • the present inventors confirmed the expression of CD19 in B-cell mixed trait acute leukemia (MPAL).
  • Gene ID: 930 Information such as the gene sequence of CD19 is listed as Gene ID: 930 in a database such as NCBI, and can be obtained as needed.
  • CD7 is a 40 kDa type I transmembrane glycoprotein expressed on thymocytes and mature T cells, and is also used as a marker for T cell acute lymphocytic leukemia (T-ALL).
  • T-ALL T cell acute lymphocytic leukemia
  • MPAL T-cell mixed trait acute leukemia
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • Gene ID: 924 Information such as the gene sequence of CD7 is listed as Gene ID: 924 in a database such as NCBI, and can be obtained as needed.
  • the target binding domain of the CAR protein is, for example, a single chain antibody (scFv) fragment containing a heavy chain (H chain) variable region and a light chain (L chain) variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to the target molecule as described above.
  • scFv single chain antibody
  • H chain heavy chain
  • L chain light chain
  • a person skilled in the art can easily prepare a monoclonal antibody against a specific antigen and a scFv fragment that can be used for CAR, and commercially available ones can also be used.
  • a target binding domain that can be suitably used in the present invention may be an scFv fragment that specifically binds to CD25, CD19 or CD7.
  • a ligand that specifically binds to the target molecule such as Affibody, a ligand binding domain derived from a natural receptor, for example, a lytic protein / peptide ligand of a receptor on a tumor cell, a peptide, etc. is used. You may.
  • the CAR protein can contain an "extracellular spacer domain" between the target binding domain existing outside the cell and the membrane binding domain.
  • the extracellular spacer domain is preferably a sequence that promotes the binding of CAR to the target molecule and enhances intracellular signal transduction.
  • an Fc fragment of an antibody, or a fragment or derivative thereof, a hinge region of an antibody, or a fragment or derivative thereof, a CH2 region of an antibody, a CH3 region of an antibody, an artificial spacer sequence, or a combination thereof can be used.
  • the CAR protein includes an extracellular domain containing a target binding domain and optionally an extracellular spacer domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain including an intracellular signaling domain and optionally a costimulatory domain.
  • the "transmembrane domain” is a domain having an affinity for the lipid bilayer constituting the cell membrane, whereas the extracellular domain and the intracellular domain are both hydrophilic domains.
  • the transmembrane domain is not particularly limited as long as the CAR protein can be present on the cell membrane and does not impair the functions of the target binding domain and the intracellular signal transduction domain, but is a polypeptide derived from the same protein as the costimulatory domain described later. May also function as a transmembrane domain.
  • a transmembrane domain such as CD28, CD3 ⁇ , CD8 ⁇ , CD3, CD4 or 4-1BB can be used.
  • CAR protein can contain a "co-stimulation domain" in some cases.
  • the co-stimulatory domain specifically binds to the co-stimulatory ligand, thereby allowing, but not limited to, cell co-stimulation responses such as CAR-T cell proliferation, cytokine production, functional differentiation, and cell death of target cells. Is mediated.
  • Examples of co-stimulation domains include CD27, CD28, 4-1BB (CD137), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, CD30, CD40, PD-1, ICAM-1, LFA-1 (CD11a /). CD18), TNFR-1, TNFR-II, Fas, Lck can be used.
  • human 4-1BB GenBank: U03397.1
  • human 4-1BB GenBank: U03397.1
  • the CAR protein contains "intracellular signal transduction domain".
  • the intracellular signal transduction domain transmits signals necessary for exerting the effector function of immune cells.
  • a human CD3 ⁇ chain, Fc ⁇ RIII, Fc ⁇ RI, a cytoplasmic terminal of an Fc receptor, a cytoplasmic receptor having an immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM), or a combination thereof can be used.
  • the intracellular signaling domain can use the human CD3 ⁇ chain (eg, nucleotide 299-637 of NCBI Accession No. NM_000734.3).
  • CAR which is called the first generation
  • the signal transduction domain was derived from the cytoplasmic region of the CD3 ⁇ or Fc receptor ⁇ chain.
  • First-generation CARs have been shown to direct the cytotoxicity of T cells, but have been poor for long-term growth and antitumor activity in vivo.
  • FIG. 2A shows an example of a CAR construct that can be suitably used in the present invention.
  • the target binding domain is an scFV fragment that targets CD25.
  • the target binding domain of CAR can be a scFV fragment that targets CD19.
  • the target binding domain of CAR can be an scFV fragment targeting CD7.
  • a method for obtaining a monoclonal antibody against a target is known in the art, and a person skilled in the art can obtain a monoclonal antibody using the selected target as an antigen, and a commercially available product can also be obtained as the monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies or scFV fragments thereof can be synthesized based on the common general technical knowledge in the art, and genes encoding these can also be obtained and synthesized based on their base sequences.
  • the cells of the present invention are characterized by expressing CAR on the cell surface and expressing the CXCL12 receptor protein.
  • CXC chemokine ligand 12 is a low-molecular-weight protein of 89 amino acids, also called SDF (Stromal Cell-Derived Factor) -1, and belongs to the chemokine CXC family.
  • SDF Stromal Cell-Derived Factor
  • CXCL12 is a strong chemoattractant for lymphocytes, and it has been suggested that it plays an important role in angiogenesis by mobilizing endothelial progenitor cells from bone marrow.
  • CXC motif chemokine receptor type 4 (CXCR4, Fusin, CD184), known as the CXCL12 receptor, is a 7-transmembrane G protein-conjugated receptor, neutrophils, monospheres, dendritic cells, NK cells, It is known to be expressed on B cells, T cells, and platelets.
  • CXCL12 / SDF1 is one of the chemokine ligands that promotes homing and migration of human and mouse hematopoietic cells or immune cells to multiple organs including bone marrow and liver.
  • CXCL12 receptor such as CXCR4
  • CAR-T cells are more efficiently homing to the bone marrow compared to CAR-T cells that do not express CXCR4. It is thought to get.
  • a CXCL12 receptor that can be suitably used in the present invention is CXCR4.
  • Human CXCR4 is a protein consisting of 360 amino acids encoded by the CXCR4 gene. It is listed as No: CAA12166, and genes and proteins can be obtained based on this information.
  • CAR-T cells expressing the CXCL12 receptor protein have significantly superior cytotoxic activity against target cells as compared to CAR-T cells expressing the CXCL12 receptor protein.
  • Expression of a CXCL12 receptor protein on cells, such as CXCR4 may be the entire CXCL12 receptor protein, but can specifically bind to CXCL12 and improve the cytotoxic activity of CAR-T cells. If it is, it may be the expression of a part of the protein which is such a functional fragment.
  • CXCR4 CD25 CAR-T CAR-T cells that express CXCR4 and target CD25
  • AML anti-acute myeloid leukemia
  • one aspect of the cell of the present invention is a cell that co-expresses CXCR4 and CAR that targets CD25.
  • CXCR4 CD19 CAR-T CAR-T cells that express CXCR4 and target CD19
  • ALL CD19-positive acute lymphoblastic leukemia
  • B-ALL B-cell mixed trait acute leukemia
  • MPAL B-cell mixed trait acute leukemia
  • Berkit lymphoma one aspect of the cell of the present invention is a cell that co-expresses CXCR4 and CAR that targets CD19.
  • ALL is treated with small molecule therapeutics such as BIRC inhibitors (eg AZD5582), BCL-2 inhibitors (eg Venetoclax), and steroids alone or in combination, but only with such small molecule therapeutics. It may not be cured.
  • small molecule therapeutics such as BIRC inhibitors (eg AZD5582), BCL-2 inhibitors (eg Venetoclax), and steroids alone or in combination, but only with such small molecule therapeutics. It may not be cured.
  • small molecule therapeutics such as BIRC inhibitors (eg AZD5582), BCL-2 inhibitors (eg Venetoclax), and steroids alone or in combination, but only with such small molecule therapeutics. It may not be cured.
  • the present inventors appear that leukemia cells disappeared from the peripheral blood when the mice transplanted with human ALL cells were treated with only a small molecule therapeutic agent, but in reality, the bone marrow It was confirmed that leukemia cells remained in the cells and could cause recurrence
  • CXCR4 CD7 CAR-T cells that express CXCR4 and target CD7 are CD7-positive T cell acute lymphocytic leukemia (T-ALL), It shows remarkable therapeutic effects on T-cell mixed trait acute leukemia (MPAL) and chronic myelogenous leukemia (CML). Therefore, one aspect of the cell of the present invention is a cell that co-expresses CXCR4 and CAR that targets CD7.
  • the present invention also provides an agent exhibiting antitumor activity against tumor cells, which comprises the above-mentioned cells of the present invention.
  • the disease targeted for treatment / recurrence prevention of the drug of the present invention is a neoplastic disease, particularly a hematological neoplastic disease.
  • Hematological neoplastic diseases include, but are not limited to, leukemia and malignant lymphoma.
  • Leukemia includes myeloid leukemia and lymphocytic leukemia, and myeloid leukemia includes acute myeloid leukemia (AML), acute premyelocytic leukemia, chronic myeloid leukemia (CML), myelodystrophy syndrome, and lymphocytic leukemia.
  • Acute lymphocytic leukemia (ALL) eg B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL), T-cell acute lymphocytic leukemia (T-ALL), mixed trait acute leukemia (MPAL)), chronic lymphocytic leukemia (CLL) ), Adult T-cell leukemia lymphoma, etc.
  • Malignant lymphoma includes Hodgkin lymphoma (HL) and non-Hodgkin lymphoma (NHL), and non-Hodgkin lymphoma is classified into B cell type, T cell type, NK cell type, etc.
  • B-cell malignant lymphomas include diffuse large B-cell lymphoma, Berkit lymphoma, chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma, lymphoplasmatocyte lymphoma, splenic marginal zone lymphoma, and mucosal-related lymphoma.
  • T-cell malignant lymphomas include peripheral T-cell lymphoma / non-specific type, enteropathy-related T-cell lymphoma, undifferentiated large-cell lymphoma, hepatic splenic T-cell lymphoma, adult T-cell leukemia / lymphoma, and extranodal NK / T-cell lymphoma / nasal type, vascular immunoblastic T-cell lymphoma T-cell large granule lymphoma-like leukemia, adult T-cell leukemia / lymphoma, mycobacterial sarcoma / cesarly syndrome, primary skin undifferentiated large-cell lymphoma, rapid Examples include progressive NK cell leukemia.
  • Diseases to be treated / prevented by the agent of the present invention include, for example, acute myelogenous leukemia (AML), adult T-cell leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL), and T-cell acute lymphocytic leukemia (T-ALL). ), Mixed trait acute leukemia (MPAL), chronic myelogenous leukemia (CML), Hodgkin's lymphoma, and non-Hodikin's lymphoma.
  • AML acute myelogenous leukemia
  • B-ALL B-cell acute lymphocytic leukemia
  • T-ALL T-cell acute lymphocytic leukemia
  • MPAL Mixed trait acute leukemia
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma
  • non-Hodikin's lymphoma non-Hodikin's lymphoma.
  • the agent of the present invention is an anticancer agent for the above-mentioned neoplastic diseases.
  • the agent of the present invention that is, CAR-T cells, may be used alone, and further different mechanisms may be used depending on various conditions such as the type of cancer to be treated and the progression of symptoms, and at the discretion of the doctor. It may be used in combination with an antitumor agent and / or an antitumor treatment.
  • antitumor agent is not particularly limited, and examples thereof include antimetabolites, platinum-based drugs, microtubule inhibitors, topoisomerase inhibitors, molecular-targeted drugs, steroids, and the like.
  • Antimetabolites include 5-fluorouracil (5-FU), triflulysine, fludarabine (or the active metabolite fludarabine nucleoside), cytarabine, gemcitabine, decitabine, guadecitabine, or azacitidine.
  • Platinum-based agents include cisplatin, oxaliplatin, or carboplatin.
  • the microtubule inhibitor include paclitaxel, docetaxel, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine, eribulin and the like.
  • topoisomerase inhibitors include irinotecan, etoposide and the like.
  • Molecular target drugs include CSF1R inhibitors, TIE2 inhibitors, TRKB inhibitors, ATR inhibitors, Chk1 inhibitors, HSP90 inhibitors, PARP inhibitors, EGFR inhibitors, Her2 inhibitors, VEGFR inhibitors, PDGFR inhibitors, Included are MET inhibitors, AXL inhibitors, RET inhibitors, FLT3 inhibitors, KIT inhibitors, HCK inhibitors, BIRC inhibitors (eg AZD5582), or BCL-2 inhibitors (eg VENCLEXTA).
  • HCK inhibitor and the BCL-2 inhibitor for example, those disclosed in JP-A-2019-529423 may be used.
  • steroids include dexamethasone.
  • other antitumor treatments include surgery and radiation therapy.
  • one aspect of the invention comprises a combination therapy comprising a agent containing CAR-T cells expressing the CXCL12 receptor protein and a BIRC inhibitor and / or a BCL-2 inhibitor.
  • a combination therapy comprising a agent containing CAR-T cells expressing the CXCL12 receptor protein and a BIRC inhibitor and / or a BCL-2 inhibitor.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • cells co-expressing the chimeric antigen receptor (CAR) protein of the invention and the CXCL12 receptor protein on the cell membrane are administered to patients with hematological neoplastic disease in combination with a BIRC inhibitor (eg, AZD5582). be able to.
  • a BIRC inhibitor eg, AZD5582
  • cells co-expressing the chimeric antigen receptor (CAR) protein of the present invention and the CXCL12 receptor protein on the cell membrane can be used in combination with a BCL-2 inhibitor (eg, venetoclax) for patients with hematological neoplastic diseases. Can be administered.
  • a BCL-2 inhibitor eg, venetoclax
  • the agent containing CAR-T cells expressing the CXCL12 receptor protein of the present invention can be administered continuously or separately at the same time as the above-mentioned further antitumor agent and / or antitumor treatment.
  • further administration of an antitumor agent and / or antitumor treatment can be performed at the same time as the administration of the agent of the present invention.
  • further administration of an antitumor agent and / or antitumor treatment can be performed.
  • further administration of an antitumor agent and / or antitumor treatment can be performed prior to administration of the agent of the invention.
  • an antitumor agent and / or antitumor treatment can be performed at the same time as the administration of the agent of the present invention.
  • the agent of the invention can be administered in the event of recurrence after administration of the antitumor agent and / or treatment with antitumor treatment.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing the above-mentioned agent of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may contain the agent of the present invention as an active ingredient alone or in combination with other active ingredients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is intended for the treatment of the above-mentioned neoplastic disease and / or prevention of recurrence.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises acute myelogenous leukemia (AML), adult T-cell leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL), T-cell acute lymphocytic leukemia (T-ALL), mixed traits.
  • neoplastic disease selected from the group consisting of acute leukemia (MPAL), chronic myelogenous leukemia (CML), Hodgkin's lymphoma, and non-Hodikin's lymphoma.
  • MPAL acute leukemia
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma
  • non-Hodikin's lymphoma non-Hodikin's lymphoma
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” is a non-toxic carrier that may or may not be added for the formulation and administration of a pharmaceutical composition without compromising the activity of the active ingredient.
  • a pharmaceutical composition without compromising the activity of the active ingredient.
  • it is an aqueous medium such as water or physiological saline, and can appropriately contain excipients, tonicity agents, buffers, stabilizers, gelling agents and the like.
  • the agent or pharmaceutical composition of the present invention can be administered locally or systemically, and the administration form is not limited, but for example, in the case of treatment of leukemia, intravenous administration is preferable.
  • the dose of the agent of the present invention varies depending on the body weight, age, severity of the disease, etc. of the patient, and is not particularly limited. For example, 10 4 to 10 10 per 1 kg of the body weight of the subject.
  • the above cells may be administered in the range of 10 4 to 10 9 cells.
  • the agent or pharmaceutical composition of the present invention can be administered as a single dose.
  • the drug or pharmaceutical composition of the present invention may be administered once to several times a day, every two days, every three days, one week, every two weeks, every month, every two months, every three months. It is possible.
  • the present invention also comprises introducing into a cell a first polynucleotide encoding a chimeric antigen receptor (CAR) protein and a second polynucleotide encoding a CXCL12 receptor protein, as described above.
  • a method for producing cells of the above is provided.
  • the target polynucleotide can be easily prepared according to a conventional method.
  • the polynucleotide encoding the chimeric antigen receptor (CAR) protein indicates the amino acid sequence of each domain (target binding domain, extracellular spacer domain, transmembrane domain, costimulatory domain, and intracellular signaling domain) NCBI RefSeq ID. It is possible to obtain the base sequence encoding each amino acid sequence from the Accession number of or GenBank, and the polynucleotide encoding each domain is linked using standard molecular biological and / or chemical procedures.
  • the first polynucleotide of the present invention can be prepared.
  • nucleic acids can be synthesized based on these base sequences, and the polynucleotide of the present invention is prepared by combining DNA fragments obtained from a cDNA library using a polymerase chain reaction (PCR). be able to.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the second polynucleotide encoding the CXCL12 receptor protein it is possible to obtain the base sequence encoding the amino acid sequence from the NCBI RefSeq ID indicating the amino acid sequence and the Accession number of GenBank, which is a standard molecular organism.
  • the second polynucleotide of the invention can be made using scientific and / or chemical procedures.
  • the first and second polynucleotides can be introduced into cells, such as T cells, by any suitable method known in the art.
  • Appropriate methods for introducing nucleic acid molecules into cells include, but are not limited to, stable transformation methods in which a polynucleotide is integrated into the cell genome, and transient transformation methods in which a polynucleotide is not integrated into the cell genome.
  • virus-mediated methods are included.
  • it may be introduced into cells by a recombinant viral vector (eg, retrovirus, lentivirus, adenovirus), liposomes and the like.
  • Transient transformation methods include, for example, microinjection, electroporation, or particle bombardment.
  • the polynucleotide introduced into the cell may be DNA or RNA.
  • the nucleic acid molecule introduced is DNA.
  • the nucleic acid molecule introduced into the cell is RNA, particularly mRNA encoding a CAR protein or CXCL12 receptor protein.
  • the chimeric antigen receptor (CAR) protein can target cell surface antigens selected from CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD19 and CD7.
  • the first polynucleotide and the second polynucleotide can be introduced into the cell by a single same vector, or also the first polynucleotide and the second polynucleotide. Can be introduced into cells by separate vectors.
  • the present invention also provides a method for treating a tumor, which comprises administering the above-mentioned agent or pharmaceutical composition of the present invention to a patient in a therapeutically effective amount.
  • the therapeutically effective amount and administration regimen can be appropriately determined in consideration of the type and degree of progression of the target disease, the age of the patient, and the like.
  • the subject (patient) treated by the method of the present invention is a mammal, and examples thereof include mice, rats, dogs, cats, rabbits, cows, horses, sheep, goats, monkeys, and humans.
  • the subject treated by the method of the invention is a human patient.
  • the subject may be a non-human mammal transplanted with human tumor cells or a non-human animal having a neoplastic disease.
  • the method of the present invention comprises the step of administering to a cell co-expressing a chimeric antigen receptor (CAR) protein targeting CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain) and a CXCL12 receptor protein on the cell membrane.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the chimeric antigen receptor (CAR) protein can be, but is not limited to, target a cell surface antigen selected from, for example, CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD19 and CD7.
  • the neoplastic disease targeted for treatment and / or recurrence prevention in the method of the present invention may be any of the above-mentioned neoplastic diseases, for example, acute myelogenous leukemia (AML), adult T-cell leukemia, and B-cell acute.
  • AML acute myelogenous leukemia
  • B-ALL lymphocytic leukemia
  • T-ALL T-cell acute lymphoblastic leukemia
  • MPAL mixed trait acute leukemia
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • Hodgkin's lymphoma Hodgkin's lymphoma
  • non-Hodgkin's lymphoma non-Hodgkin's lymphoma. It can be a disease to be treated.
  • the cells can be administered as a single dose to the subject.
  • the cells can be administered to the subject multiple times.
  • the method of the present invention can be carried out by combining the agent or pharmaceutical composition of the present invention with a further therapeutic agent, for example, a further antitumor agent and / or an antitumor treatment, as described above.
  • the above-mentioned cells in the range of 10 4 to 10 9 cells per 1 kg of the body weight of the subject can be administered once or multiple times.
  • the method of the present invention can further include a step of measuring the expression level of the target cell surface antigen in the tumor cells of the subject, prior to administration of the cells.
  • the method of the invention can include measuring the expression level of CD25 in the tumor cells of interest prior to administration of the CXCR4 expressing CD25 CAR-T cells.
  • the method of the invention can include measuring the expression level of CD19 in the tumor cells of interest prior to administration of the CXCR4 expressing CD19 CAR-T cells.
  • the method of the invention can include measuring the expression level of CD7 in the tumor cells of interest prior to administration of the CXCR4 expressing CD7 CAR-T cells.
  • the method of the present invention can also further include the step of evaluating the therapeutic effect after administration of CXCR4-expressing CAR-T cells.
  • the therapeutic effects are (i) reduction of tumor cells in blood, (ii) reduction of tumor cells in bone marrow, (iii) reduction of tumor cells in spleen, and (iv) reduction of tumor cells in the subject. It can be evaluated by one or more indicators selected from suppression of tumor cell infiltration.
  • the invention also provides cells for use in the treatment of cancer and / or prevention of recurrence, which co-express the chimeric antigen receptor (CAR) protein and the CXCL12 receptor protein on the cell membrane.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • a cell for example, a chimeric antigen receptor (CAR) protein expressed on its surface targets a cell surface antigen selected from CD25 (IL-2 receptor ⁇ chain), CD19 and CD7.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the cancer may be any of the diseases selected from the neoplastic diseases, for example, acute myeloid leukemia (AML), adult T cell leukemia, B cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL), T cell. It is a neoplastic disease selected from the group consisting of acute lymphocytic leukemia (T-ALL), mixed trait acute leukemia (MPAL), chronic myeloid leukemia (CML), Hodgkin's lymphoma, and non-Hodgkin's lymphoma.
  • the cell may be any of the above cells, but is preferably a T cell.
  • the construction of the lentiviral vector was performed as follows. CD25-CAR (pHR_SFFV CD25CAR), mouse CXCR4 (pHR_SFFV mCXCR4), and packaging plasmids (pCMVR, pL2, pMD2.G-) using pHR_SFFV (Addgene plasmid # 79121, donated by Dr. Wendell Lim) as a lentiviral vector.
  • the introduced gene was packaged in a lentiviral vector by transfecting 293T cells with a JetPEI transfection reagent (Polyplus) using VSV-G, pAdV (Promega)) (Cho et al 2018 Cell).
  • the virus supernatant was collected and centrifuged using Vivaspin200 (merck). After centrifuging the concentrated virus supernatant overnight, the supernatant was discarded and the pellet was lysed in T cell medium.
  • Culturing of primary human T cells and lentivirus infection were carried out by the following procedure. Human samples were collected after obtaining informed consent from AML patients. For umbilical cord blood, a healthy donor umbilical cord blood was obtained from the Chubu Cord Blood Bank (Aichi Prefecture).
  • CD34 + cells and CD34 - cells were isolated by autoMACS (Miltenyi) using anti-human CD34 immunomagnetic beads.
  • T cells were enriched from the CD34 - population with the autoMACS with Pan T cells isolation kit (Miltenyi). After T cells were isolated, they were cultured in X-Vivo15 (Lonza), 5% fetal bovine serum, 10 mM N-acetyl-L-cysteine (Sigma-Aldrich # A9165), 55 mM 2-mercaptoethanol (Jang hwan Cho). 2018 Cell).
  • T cells were stimulated with 25 ⁇ l Human T-activator CD3 / CD28 DynaBeades (Thermo Scientific # 11132D) to give 1 ⁇ 10 6 cells in 1 ml of medium. The next day, T cells were sprinkled on 96-well plates at 1 x 10 5 cells / 100 ⁇ l per well for lentivirus infection. 16-100 ⁇ l of CAR lentivirus was added to 100 ⁇ l of T cell suspension using vectofusin-1 (10 ⁇ g / ml, Miltenyi) and cultured for 1 day. Half of the medium containing infected T cells was removed and the same amount of new medium was added.
  • vectofusin-1 10 ⁇ g / ml, Miltenyi
  • infected T cells were analyzed for 25CAR expression with the CD25-FC fusion protein and for mCXCR4 expression with the anti-mCXCR4 antibody. After confirming the expression of surface proteins, CD25 CAR-T cells were injected into AML model mice through the posterior orbital sinus.
  • cells were labeled with monoclonal antibodies (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD33, mouse CD45) and analyzed using FACSAria III or FACSCanto II (BD Biosciences).
  • CD25 (IL-2R ⁇ chain) has been identified as one of the genes expressed differently in AML-affected cells and normal CD34 + CD38 - hematopoietic stem cells / progenitor cells (Saito, et al. 2010 Sci Trans Med).
  • expression of CD25 in AML has also been reported as a poor prognostic factor (Gonen, et al. 2012 Blood, Nguyen et al. Cancer Research 2020).
  • the degree of CD25 expression can vary from case to case.
  • CD25-expressing cells were hematopoietic stem cells / progenitor cells (Saito, et al 2010 Sci Trans Med). It was lower in CD34 + C38- ) and bone marrow-erythroid progenitor cells (CD34 + CD38 + ) (Fig. 1C).
  • CD25 protein expression in monocytes (CD14 + ), granulocytes (CD15 + ), and NK cells (CD56 + ) was less than 5%, and in human T cells (CD3 + ), 8.8% received CD25. It was found to be expressed (Fig. 1C).
  • NSG mice transplanted with patient-derived AML cells were prepared as follows. NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tmlWjl / Sz (NOD-SCID -IL2rg null ) mice were transferred from the Jackson Laboratory to the Il2rg locus of the NOD.Cg-Prkdc scid (NOD-SCID) strain (Shultz et al. 2005 J immunol). We obtained a return mat with a complete null mutation.
  • the whole body of a newborn mouse with NOD-SCID-IL2rg null was irradiated with 150 cGy, and then intravenous injection of human AML cells was performed.
  • 10 3 to 10 5 AML transplant cells were injected into each recipient (Ishikawa et al. 2007 nature biotechnol).
  • To prepare normal human HSC transplant recipients each recipient was injected with 10 4 7AAD-strains (hCD3 / hCD4 / hCD8) -hCD34 + hCD38-CB cells (Ishikawa et al. 2005 Blood). .. Transplantation of human peripheral blood cells was assessed by posterior orbital phlebotomy.
  • the mice were dissected and the bone marrow was stained with HE.
  • the bone marrow (normal NSG) of the immunodeficient mice had granulocytes and granulocytes.
  • myelocytes are found, in the bone marrow of AML PDX mice, most of the bone marrow cells are AML cells even after administration of CD25 CAR-T cells, and erythrocyte cells, macronuclear cells, and normal cells. There were very few red blood cells.
  • Example 1 Effect of CXCR4 expressing CD25 CAR-T cells 1
  • the therapeutic effect of CD25 CAR-T cells in the bone marrow is not optimal, we designed a CAR construct that allows CAR-T cells to better home to the bone marrow.
  • both the pHR_SFFV_mCXCR4 vector and the pHR_SFFV_CD25CAR vector were transfected into 293T cells.
  • CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells completely eliminated CD33-positive leukemia cells in 4 weeks, and the effect was maintained for more than 4 months. After the decrease in leukemia cells, CAR-T cells also decreased, and mouse CD45 cells became the majority of peripheral blood. That is, it was shown that cells co-expressing CXCR4 have a higher effect in the in vivo eradication of human AML cells by CD25 CAR-T cells.
  • Example 2 Effect of CXCR4 expressing CD25 CAR-T cells 2
  • the spleen and bone marrow of PDX mice to which CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells were administered were excised and visually observed as compared with the case where no administration was performed.
  • FIG. 7 in the mice to which CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells were administered, reduction of spleen size to normal level and redness of bone marrow indicating recovery of erythroid cells were observed.
  • FIG. 8 shows the results of HE staining of bone marrow tissue of mice (U390 transplanted PDX mice) 4 weeks after administration of CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells. After eradication of AML cells by CAR-T cells, it was confirmed that normal leukocytes, erythrocytes, and megakaryocytes that make platelets were all restored in the mice.
  • CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells confirmed significantly superior killing of human AML cells.
  • Infiltration of AML cells into the recipient's liver tissue was confirmed in two of the three cases examined, but the liver is an organ showing strong expression of CXCL-12 / SDF1 and is CD25 CAR-T. It was considered that the co-expression of CXCR4 in the cells showed a strong therapeutic effect on human AML cells infiltrated into the liver tissue of the recipient animal.
  • a single injection of 5 ⁇ 10 6 CXCR4-expressing CD25 CAR-T cells may be sufficient to achieve a long-term therapeutic response to CD25-expressing invasive AML.
  • Example 3 Effect of CXCR4 expressing CD19 CAR-T cells 1] BIRC inhibitor AZD5582 0.5 mg / kg / day (intraperitoneal administration), BCL-2 inhibitor for PDX mice transplanted with CD19-positive B-cell mixed trait acute leukemia (MPAL, B / myeloid, U211) cells (Venetoclax) 30 mg / kg / day (oral administration) and dexamethasone (DEX) 30 mg / kg / day (intraperitoneal administration) were treated. As shown in FIG. 13-1, after 10 doses, leukemia cells (MPAL) in peripheral blood decreased (37.8% to 0.9%) compared to before treatment, but leukemia cells still remained.
  • MPAL B / myeloid, U211
  • DEX dexamethasone
  • MPAL cells showing recurrence were present on the 10th day after CAR-T cell administration, but increased to 0.4% on the 23rd day, and on the 32nd and 39th days. The eyes showed that the MPAL cells had completely disappeared.
  • TL1 obtained from the Medical Cell Resources Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University
  • TL1 obtained from the Medical Cell Resources Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University
  • CAR-T CXCR4-expressing CD19 CAR-T
  • FIG. 14 shows the results of flow cytometry in the bone marrow (BM) and liver of mice not administered with CAR-T cells.
  • Most of the human CD45-positive cells are CD19-positive, which is a B cell marker, and it can be seen that lymphoma cells occupy most of the bone marrow and liver.
  • mice treated with CXCR4-expressing CD19 CAR-T cells (right side), most of the human CD45-positive cells were CAR-T cells (CD3-positive) in both the bone marrow and liver, and lymphoma. It turned out that the cells were almost extinct.

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Abstract

本発明は、予後不良な血液腫瘍性疾患の根治のための治療法として、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞、該細胞を含有する抗腫瘍活性を有する薬剤及び医薬組成物を提供する。

Description

ＣＸＣＬ１２受容体発現キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞
　本発明は、改良されたキメラ抗原受容体（CAR）-T細胞療法に関する。より具体的には、本発明は、キメラ抗原受容体とCXCL12受容体タンパク質とを共発現する改変細胞、該細胞を含有する抗腫瘍活性を有する薬剤及び医薬組成物に関する。本発明は更に、キメラ抗原受容体とCXCL12受容体タンパク質とを共発現する改変細胞による腫瘍性疾患の治療方法に関する。
　キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞療法は、腫瘍細胞等の細胞の表面に発現する特定の抗原を標的とするCARを発現させたT細胞（CAR-T細胞）を使用した養子免疫療法である。CAR-T細胞は標的抗原を認識し、それによって標的抗原を発現する細胞を攻撃するように設計されている。
　近年、CD19を標的とするCAR-T細胞が再発性／難治性B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）及びびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫（DLBCL）に対する有望な治療法の選択肢として出現し（非特許文献１～３）、単回投与のみでも高い治療効果をもたらし得ることが知られている。
　その後、CAR-T細胞療法が他の血液悪性腫瘍や固形腫瘍にも適用できるか否かを評価するために、多くの努力がなされてきている。例えば、血液悪性腫瘍の中で、急性骨髄性白血病（AML）は臨床的に治癒が非常に難しい疾患であり、AML患者の生存を伸ばすために、CD33（非特許文献４）、CD123（非特許文献５）、及び腫瘍関連抗原Lewis-Y（TAA-LeY）（非特許文献６）等の分子を標的とするCAR-T細胞が開発され、臨床評価が進行している。
Grupp, S.A., Kalos, M., Barrett, D., Aplenc, R., Porter, D.L., Rheingold, S.R., Teachey, D.T., Chew, A., Hauck, B., Wright, J.F., et al. (2013). Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med 368, 1509-1518. 10.1056/NEJMoa1215134. Lee, D.W., Kochenderfer, J.N., Stetler-Stevenson, M., Cui, Y.K., Delbrook, C., Feldman, S.A., Fry, T.J., Orentas, R., Sabatino, M., Shah, N.N., et al. (2015). T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 385, 517-528. 10.1016/S0140-6736(14)61403-3. Park, J.H., Riviere, I., Gonen, M., Wang, X., Senechal, B., Curran, K.J., Sauter, C., Wang, Y., Santomasso, B., Mead, E., et al. (2018). Long-Term Follow-up of CD19 CAR Therapy in Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med 378, 449-459. 10.1056/NEJMoa1709919. Kenderian, S.S., Rosado, F.G., Sykes, D.B., Hoyer, J.D., and Lacy, M.Q. (2015). Long-term complete clinical and hematological responses of the TEMPI syndrome after autologous stem cell transplantation. Leukemia 29, 2414-2416. 10.1038/leu.2015.298. Mardiros, A., Forman, S.J., and Budde, L.E. (2015). T cells expressing CD123 chimeric antigen receptors for treatment of acute myeloid leukemia. Curr Opin Hematol 22, 484-488. 10.1097/MOH.0000000000000190. Ritchie, D.S., Neeson, P.J., Khot, A., Peinert, S., Tai, T., Tainton, K., Chen, K., Shin, M., Wall, D.M., Honemann, D., et al. (2013). Persistence and efficacy of second generation CAR T cell against the LeY antigen in acute myeloid leukemia. Mol Ther 21, 2122-2129. 10.1038/mt.2013.154.
　AMLに対するCAR-T細胞の開発においてはいくつかの大きな障害が存在する。先ず、AML細胞と正常な血液幹／前駆細胞とで遺伝子発現が類似しているため、CAR-T細胞のための適切な標的としての細胞表面分子を見出すことが困難である。
　第二に、CD19+ Bリンパ球の除去は静脈内への免疫グロブリン補充によって管理することができるが、例えば、上記のCD33は造血幹細胞／前駆細胞（HSPC）及び好中球で発現する分子であり、好中球などの正常な骨髄細胞に対して起こり得る有害作用によって、場合によっては致死的な発熱性好中球減少症、及び真菌・細菌による日和見感染症を引き起こし得る。
　最後に、CD19はB-ALL患者の全てのB-ALL細胞で発現しているが、AMLにおける細胞表面分子の発現は患者間でも患者内でも非常に不均一である。
　本発明者等は、臨床的に侵襲性の高いAML患者の白血病開始細胞（leukemia-initiating cells、LIC）、正常CD34+CD38-CD45RA- 造血幹細胞（HSC）及び好中球を用いたグローバルトランスクリプトーム解析を実施し、また、NOD/SCID/Il2rgKO（NSG）異種移植アッセイでin vivoでAMLを生じる能力が実証された患者由来AML開始細胞の遺伝子発現も解析した。
　その結果、AMLにおける治療可能性を有する細胞表面分子としてCD25（IL-2受容体α鎖、IL2RA）を同定した（Saito et al., STM 2010）。CD25/IL2RAはAMLの予後不良マーカーとして報告されている（Gonen et al blood 2012）他、慢性骨髄性白血病（CML）、成人T細胞白血病／リンパ腫、及びホジキンリンパ腫等の他の血液悪性腫瘍においても発現している。しかしながら、調節性T細胞及び活性化T細胞の亜集団においてもCD25発現が見られることから、CAR-T細胞療法における標的分子としてCD25/IL2RAが適切であるかどうかの評価は容易ではない。
　本発明者等は、予後不良AMLに対するCAR-T細胞治療を開発するために、TCR-シグナル配列とヒトCD25/IL2RA抗原のFab抗原認識部位とを含むレンチウイルスベクターを作製した。臍帯血由来ヒトT細胞にCD25-CARレンチウイルス粒子を導入し、2×107個以上のCD25 CAR-T細胞の増大をin vitroで達成した。
　予後不良AMLの初代培養細胞に対してCD25 CAR-T細胞のin vitroにおける標的化効率を評価した結果、CD25を発現するAML細胞を標的として用いた場合にのみ細胞毒性が観察され、CD25欠損白血病では観察されなかった。
　CD25 CAR-T細胞の抗原依存性細胞毒性が確認されたため、次いで、NOD/SCID/IL2rgKO（NSG）患者由来異種移植（PDX）動物を用い、AMLについてのin vivo治療実験を組み立てた。AML患者（U390#2）のAML細胞（CD33陽性の血球）を移植した3匹のマウスに5×106個のCD25標的化CAR-T細胞を単回注入したところ、3匹中1匹のPDXマウスの末梢血（PB）で患者由来の白血病細胞が減少した。注入4週間後に3匹のマウスを犠牲にして観察したところ、治療効果はレシピエントマウスの骨髄から侵襲性AML細胞を排除するのに十分ではなかったことが見出された。HE染色から、骨髄細胞の大部分が患者由来AML細胞であることが実証された。
　ヒトAML細胞の根絶が最適ではないという課題を克服するために、本発明者等は、CAR-T細胞を骨髄により効率的に向かわせることを目的として、ホーミング受容体として知られるCXCR4の発現を有するようにヒトT細胞を更に改変することによって、CD25 CAR-T細胞を骨髄に誘導することを検討した。
　その結果、CAR-T細胞を投与したマウスから回収した末梢血の細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、CXCR4を発現するCD25 CAR-T細胞は、CXCR4を発現しないCD25 CAR-T細胞よりもin vivo（生体内）においてより効率的に増殖することが示された。CXCR4を発現するCD25 CAR-T細胞は、その高頻度及び数と合致して、末梢血、脾臓、骨髄、及び肝臓におけるヒトAML細胞を根絶させることができた。長期間の観察実験では、ヒトCXCR4を発現するCD25 CAR-T細胞が、４ヶ月以上処置マウスの骨髄中にとどまり、レシピエントマウスでのAMLの再発を防止した。正常なヒトの先天性及び後天性免疫を有するように移植されたNSGマウスにおいて、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞による正常ヒト免疫細胞に対する深刻な有害作用、例えばCAR-T細胞の予想外の増殖、移植片対宿主病、又は重篤な炎症性応答は観察されなかった。
　上記の知見から更に検討を進めたところ、本発明者等は、CXCR4の共発現によるCAR-T細胞治療効果の向上は、他の標的分子に対するCAR-T細胞の場合ももたらされることを確認し、本発明の完成に至った。
　すなわち、本発明の態様は以下の通りである。
１．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞。
２．　上記CXCL12受容体がCXCR4である、上記１記載の細胞。
３．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、上記１又は２記載の細胞。
４．　T細胞である、上記１～３のいずれか記載の細胞。
５．　上記１～４のいずれか記載の細胞を含有する、抗腫瘍活性を示す薬剤。
６．　更なる抗腫瘍剤及び／又は抗腫瘍治療と組み合わせて用いられる、上記５記載の薬剤。
７．　上記５記載の薬剤と製薬上許容される担体とを含有する医薬組成物。
８．　急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防のための、上記５若しくは６記載の薬剤又は上記７記載の医薬組成物。
９．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、CXCL12受容体タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを細胞内に導入することを含む、上記１～４のいずれか記載の細胞の作製方法。
１０．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、上記９記載の方法。
１１．　上記第１のポリヌクレオチドと、上記第２のポリヌクレオチドとが、同じか又は別個のベクターによって細胞内に導入される、上記９又は１０記載の方法。
１２．　CD25（IL-2受容体α鎖）を標的とするキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞を対象に投与するステップを含む、対象における腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防のための方法。
１３．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、上記１２記載の方法。
１４．　腫瘍性疾患が急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、上記１２又は１３記載の方法。
１５．　上記細胞を対象に単回投与するものである、上記１２～１４のいずれか記載の方法。
１６．　対象の体重1kgあたり104～109個の範囲の上記細胞を投与する、上記１２～１５のいずれか記載の方法。
１７．　細胞の投与の前に上記対象の腫瘍細胞における標的細胞表面抗原の発現レベルを測定するステップを更に含む、上記１２～１６のいずれか記載の方法。
１８．　細胞の投与の後に治療効果を評価するステップを更に含む、上記１２～１７のいずれか記載の方法。
１９．　治療効果を、対象における、（i）血液中の腫瘍細胞の減少、（ii）骨髄中の腫瘍細胞の減少、（iii）脾臓中の腫瘍細胞の減少、及び（iv）肝臓への腫瘍細胞の浸潤の抑制、から選択される１以上の指標によって評価する、上記１８記載の方法。
２０．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する、癌の治療及び／又は再発予防において使用するための細胞。
２１．　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、上記２０記載の細胞。
２２．　上記癌が急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患である、上記２０又は２１記載の細胞。
２３．　T細胞である、上記２０～２２のいずれか記載の細胞。
　本明細書は、本願の優先権の基礎となる、2020年10月29日に出願された米国仮特許出願番号第63/107027号の開示内容を包含する。
　本発明により、予後が不良で完治が困難であった腫瘍性疾患に対して極めて有効な治療及び／又は再発予防の方法を提供することができる。CXCR4発現CAR-T細胞療法は、予後不良の腫瘍性疾患に対する有望な治療戦略である。
Ａ：CD25発現の異なる3名の患者由来のAML細胞を免疫不全マウスに移植したPDX(Patient-Derived Xenograft)マウスの骨髄のAML細胞中のCD25発現細胞の割合を示す。左からCD25陰性、中程度の発現、高発現。参考図は、2012年に報告されたCD25陰性及びCD25陽性AML患者の生存曲線をそれぞれ示す。CD25発現はAMLの予後不良と関連することが報告されている（Gonen et al., Blood 2012）。Ｂ：フローサイトメトリー法により測定した、84名のAML患者におけるCD25の陽性率を示す。高発現及び中程度の発現を合わせて約30％のAML患者がCD25陽性である。Ｃ：免疫不全マウスにさい帯血由来のヒト造血幹細胞を移植したヒト化マウスの骨髄細胞でCD25の発現を評価した結果を示す。CD25は調節性T細胞のマーカーであり、活性化T細胞の一部にCD25の発現が認められた。これに対して、正常な単球 (CD14+)・顆粒球(CD15+)並びにCD34＋CD38－幹細胞ではCD25は発現していない。 Ａ：CD25を標的とするCAR-Tコンストラクトの一例を示す。抗CD25モノクローナル抗体のscFVを標的結合ドメインとし、CD8a由来のリーダー配列、ヒンジ、膜貫通ドメイン、4-1BBとCD3ζ由来の細胞内ドメインを有する第2世代のCARである。Ｂ：CD25陽性AML細胞（U390,U346）及びCD25陰性ALL細胞（U328）に対するCD25 CAR-T細胞のin vitroにおける細胞傷害活性を示す。CAR-T細胞はCD25発現AML細胞（U390及びU346）を標的としたが、CD25陰性白血病細胞（U328）は標的とせず、CD25依存的に細胞傷害活性を示した。 ヒトAML細胞を移植したPDXマウス（#1、#2、#3）に、CD25 CAR-Tを5×106個投与し、1週間毎に4週間、末梢血を採取し、ヒトCD45陽性細胞についてCD33及びCD3の発現を指標としてフローサイトメーターで解析した結果を示す。全てのマウスでT細胞（CD3+）の増加、AML細胞（CD33+）の減少を認めたが、4週間後にも末梢血中にAML細胞が残存していることが見出された。また、マウス#2では良好な治療応答が認められたが、CD25を標的としたCAR-T細胞治療において、効果にばらつきが生じることが判明した。 AML細胞を移植したPDXマウスに、CD25 CAR-T細胞を5×106個投与して4週間後に解剖し、骨髄切片のHE染色を行った結果を示す。免疫不全マウス（正常NSG）の骨髄中には、顆粒球や骨髄球等様々な種類の細胞が観察されるが、AML PDXマウスの骨髄では、白血病性芽球が骨髄内に充満していることが確認され、CD25 CAR-T細胞による治療効果が十分でないことが見出された。左側：低拡大、右側：高拡大。 ヒトAML細胞（U390）を移植したPDXマウスにCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与後2週間経過後の末梢血中のCD45陽性細胞のフローサイトメトリーの結果を、CAR-T細胞投与なし（未処置）及びCD25 CAR-T細胞投与の場合と比較して示す。注入したCXCR4発現CD25 CAR-T細胞はin vivoで増殖した。 ヒトAML細胞（U390）を移植したPDXマウスにCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与後4週間経過後の末梢血中のCD45陽性細胞のフローサイトメトリーの結果を、CAR-T細胞投与なし（未処置）及びCD25 CAR-T細胞投与の場合と比較して示す。CD25 CAR-T細胞投与の場合はヒト細胞中のほぼ全てが残存する白血病細胞であるのに対して、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合、CD33陽性の白血病（AML）細胞が完全に消失していた。 ヒトAML細胞（U390）を移植したPDXマウスにCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与後4ヶ月経過後の末梢血中のCD45陽性細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。AML細胞は末梢血で検出されず、投与後4週間で標的AML細胞を消失させた効果は4ヶ月以上維持された。標的細胞が消失した後、CXCR4 CD25CAR-T細胞の頻度及び絶対数は次第に減少し、マウスCD45陽性細胞が末梢血中の多くを占めていた。 ヒトAML細胞を移植したPDXマウスの末梢血細胞中のAML細胞、マウス白血球、及びCAR-T細胞の頻度（割合）を示す。CAR-T細胞投与をしない場合（2匹）、AML細胞の移植直後から4週間後まで、末梢血中の細胞のほとんどがヒトAML細胞であったが、CD25 CAR-T細胞を注入した場合（2匹）、一匹のマウスではAML細胞の減少が見られ、対応してCAR-T細胞の増加が見られたが、もう一匹のマウスではAML細胞の減少が観察されなかった。これに対してCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与したマウス（3匹）では、AML細胞が顕著に減少し、CAR-T細胞投与後3週間で循環血中からAML細胞由来の細胞を完全に消失させることができた。CAR-T細胞の割合はAML細胞が残存している間は増加したが、その後次第に減少した。一方、正常なマウス白血球が増加し、CAR-T細胞投与後14週間では末梢血中の9割以上がマウス白血球であった。 ヒトAML細胞を移植したPDXマウスにCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合と投与しない場合（未処置）のマウス脾臓及び骨髄の写真である。未処置のマウスでは、脾腫及び骨髄の白色化が観察されたが、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与したマウスでは、脾臓サイズの減少、赤血球の存在を示す骨髄の赤色化が観察され、AMLに対する顕著な治療効果が確認された。 CXCR4発現CD25 CAR-T細胞投与後4週間のマウス（U390移植PDXマウス）骨髄組織をHE染色した結果を示す。CAR-T細胞によるAML細胞根絶後、マウスの正常な白血球、赤血球、血小板を作る巨核球全てが回復していることが確認された。左が弱拡大、右が強拡大。 ヒトAML細胞（U390）を移植したPDXマウスにCD25 CAR-T細胞若しくはCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合と投与しない場合（未処置）の骨髄細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。未処置及びCD25 CAR-T細胞投与サンプルは投与から4週間後、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞投与サンプルは投与から4ヶ月後の結果である。 ヒトAML細胞（U390）を移植したPDXマウスにCD25 CAR-T細胞若しくはCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合と投与しない場合（未処置）の骨髄細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。未処置及びCD25 CAR-T細胞投与サンプルは投与から4週間後、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞投与サンプルは投与から4ヶ月後の結果である。CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合にのみ、AML細胞の完全な消失、及びマウスの正常白血球（mCD45）の回復が見られた。AML細胞の完全な消失、並びにCAR-T細胞の存在は、CAR-T細胞注入から140日間以上維持された。 ヒトAML細胞（U390）を移植したPDXマウスにCD25 CAR-T細胞若しくはCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合と投与しない場合（未処置）の骨髄細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。未処置及びCD25 CAR-T細胞投与サンプルは投与から4週間後、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞投与サンプルは投与から4ヶ月後の結果である。CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合にのみ、マウス赤血球(Ter119)の回復が見られた。 CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を単回投与したAML移植マウス（右側）、及び投与していないマウス（左側）を、投与から150日後に犠牲にし、骨髄組織をHE染色又は抗CD34モノクローナル抗体による染色をした結果を示す。AML細胞の根絶効果はCAR-T細胞注入から5ヶ月経過後も維持されていた。 4症例のAML由来の細胞をそれぞれ移植して作製したPDXマウスに対して、CD25 CAR-Tもしくは、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した数週間後、マウスを犠牲にし、脾臓細胞、骨髄細胞、及び肝臓細胞について白血病細胞の割合（％chimerism）を調べた結果を示す。1つのドットが1匹のレシピエントマウスを示す。脾臓では、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞の投与の場合にかなりのレシピエントマウスで白血病細胞を死滅させることができている。骨髄と肝臓では、CD25 CAR-T（CAR-T）の投与では、多くのマウスで白血病細胞が高頻度に残存するが、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞（CXCR4 CAR-T）の投与では、かなりの確率で白血病細胞を死滅できている。NT：投与なし。 AML由来の細胞を移植して作製したPDXマウスに対して、CD25 CAR-Tもしくは、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した数週間後、マウスを犠牲にし、骨髄細胞をフローサイトメトリー解析した結果を示す。CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合、白血病細胞が消失し、その後、CAR-T細胞が過剰に活性化することなく数が減少し、正常な白血球が多数を占めていた。 ヒトAML細胞（U300）を移植したPDXマウスにCD25 CAR-T細胞若しくはCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合の投与から4週間後の肝臓細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。肝臓においても、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合にT細胞の増加とAML細胞の完全な消失が見られ（5匹中4匹のマウスで確認）、CD25 CAR-T細胞を投与した場合と比較して顕著に強い治療効果を示すことが確認された。 CD19陽性のB細胞性混合形質性急性白血病 (MPAL, B/myeloid、U211）細胞を移植したPDXマウスに対して低分子治療薬による治療を行なった後、CXCR4発現CD19 CAR-T細胞を投与した場合の末梢血中の白血病細胞の割合（左側）を示す。低分子治療薬の投与により、末梢血中からは白血病細胞がほとんど消えたように見えるが、実際には、骨髄中に残存している。 低分子治療薬投与後、CXCR4発現CD19 CAR-T細胞を投与すると、投与後10日目では残存していたMPAL細胞が、23日目には0.4％まで減少し、32日目及び39日目では完全に消失した。 バーキットリンパ腫の細胞株であるTL1を用いた異種移植モデルマウスでの、CXCR4発現CD19 CAR-T(CXCR4 CD19 CAR-T)治療の効果を示す。左側はCAR-T細胞を投与していないマウスの骨髄と肝臓でのフローサイトメトリーの結果を示す。ヒトCD45陽性細胞のうち大部分がB細胞マーカーのCD19陽性であり、骨髄、肝臓ともにリンパ腫細胞が多くを占めている。一方、CXCR4 CD19 CAR-Tを投与したマウス(右側)では、骨髄及び肝臓のいずれにおいても、ヒトCD45陽性細胞のうち、大部分がCAR-T細胞(CD3陽性)であり、リンパ腫細胞はほぼ消滅していることが分かる。
　本発明は、一態様において、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞を提供する。
＜キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質＞
　本明細書において「キメラ抗原受容体（CAR）」とは、標的特異性を細胞に移植することができる改変受容体を指す。以下、本明細書において、キメラ抗原受容体又はキメラ抗原受容体タンパク質を「CAR」と記載する場合がある。
　ここで、CARによって標的特異性を移植される細胞は、限定するものではないが、例えばT細胞を好適に使用することができる。T細胞としては、例えばナイーブT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又はそれらの組み合わせ等のT細胞を使用し得る。また、T細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球でよい。特に細胞傷害性Tリンパ球を使用し得る。一態様において、T細胞はCD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球より選択される。特定の態様において、本発明に従って改変されるT細胞はヒトT細胞である。
　T細胞は、本発明の細胞の増殖および遺伝子組換えの前に、様々な非限定的な方法によって対象、例えば、ヒト患者から取得することができる。T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む多数の非限定的な供給源から得ることができる。一態様では、入手可能であり、かつ当業者に公知の任意の数のT細胞株を使用することができる。別の態様では、前記細胞は健常ドナーから得られるものでもよく、癌と診断された患者から得られてもよい。別の態様では、前記細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部である。本明細書において、キメラ抗原受容体を発現するように改変された細胞を便宜的に「CAR-T細胞」と記載する。
　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質の構造は、当分野において良く知られており、本発明で使用するCARも、通常使用されているCARの構造を利用することができる。具体的には、本発明において使用されるCARは、標的分子に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するものである。ここで、「ドメイン」とは、ポリペプチド内の領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる領域を示す。
　本発明においてCARが標的とする分子は、腫瘍細胞表面に発現している抗原、例えば、分化クラスター分子、例えばCD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、腫瘍関連表面抗原、例えば、ErbB2（HER2/neu）、癌胎児抗原（CEA）、Lewis-Y（TAA-LeY）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、EGFR変種III（EGFRvIII）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシド GD2、管上皮ムチン、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α-フェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン、PSMA、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インシュリン増殖因子（IGF1）-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインA（EDA）およびエクストラドメインB（EDB）、ならびにテネイシン-CのA1ドメイン （TnC A1）および線維芽細胞関連タンパク質（fap）；細胞系列特異的抗原または組織特異的抗原、例えば、CD3、CD4、CD7、CD8、CD24、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD32、CD33、CD34、CD123、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD180、GM-CSF、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子、リンパ芽球性白血病抗原、例えばTNFRSF17（UNIPROT Q02223）、SLAMF7、GPRC5D、FKBP11、KAMP3、ITGA8、PRAME、およびFCRL5等から適宜選択することができる。
　好ましくは、本発明においてCARが標的とする分子は、腫瘍細胞において他の細胞と比較して有意又は顕著な発現が認められる抗原であり、限定するものではないが、例えばCD7、CD19、CD20、GD2、CD22、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD30、CD33、CD44、CD96、CD123、CD180、CEA、Her2/neu、MUC1、MUC4、MUC6、EGFR、PRAME、VEGFR2、GM-CSFR、IL-11Rα、IL-13α2、Lewis-Y（TAA-LeY）等が挙げられる。
　より好ましくは、本発明においてCARが標的とする分子は、特定の血液腫瘍細胞において他の細胞と比較して有意又は顕著な発現が認められる抗原であり、限定するものではないが、例えばCD7、CD19、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD33、CD123、腫瘍関連抗原Lewis-Y（TAA-LeY）等が挙げられる。
　例えば、急性骨髄性白血病（AML）に対する治療及び／又は再発予防のためには、CD7、CD25、CD96、CD123、PRAME、及びCD180を標的とすることができる。例えば、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）及び混合形質性急性白血病（MPAL）に対する治療及び／又は再発予防のためには、CD19、CD20、CD32、及びCD180を標的とすることができる。例えば、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、MPAL及び慢性骨髄性白血病（CML）に対する治療及び／又は再発予防のためには、CD7を標的とすることができる。
　本発明においてCARが標的とする分子としては、1種を選択しても良いが、複数の分子を標的とするために、それぞれの分子を標的とする複数のCAR-T細胞を用いることもできる。また、複数の分子を標的とするために、それぞれの分子に対するCARを同じ細胞に導入することもできる。
　特に好ましくは、本発明においてCARは、血液腫瘍細胞において発現が認められるCD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とするものである。
　CD25（IL-2受容体α鎖）は、以前よりAMLにおける予後不良のマーカーとして報告されていた。CD25は、正常なD34+CD38-造血幹細胞／前駆細胞（HSPC）と比較して、AML開始細胞で過剰に発現していることが報告されている（Saito et al., Science Translational Medicine 2010）。
　CD25の遺伝子配列等の情報は、例えばアメリカ国立生物工学情報センター（NCBI）等のデータベースにおいてGene ID: 3559として収載されており、必要に応じて入手することができる。
　CD19は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、濾胞性リンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）において発現し、非造血細胞、骨髄系細胞、赤血球細胞、及びT細胞では発現しないことが知られている。本発明者等は、B細胞性の混合形質性急性白血病（MPAL）でもCD19の発現を確認した。
　CD19の遺伝子配列等の情報は、例えばNCBI等のデータベースにおいてGene ID: 930として収載されており、必要に応じて入手することができる。
　CD7は、胸腺細胞及び成熟T細胞上で発現される40kDaのI型膜貫通糖タンパク質であり、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）のマーカーとしても用いられている。本発明者等は、T細胞性の混合形質性急性白血病（MPAL）及び慢性骨髄性白血病（CML）でもCD7の発現を確認した。
　CD7の遺伝子配列等の情報は、例えばNCBI等のデータベースにおいてGene ID: 924として収載されており、必要に応じて入手することができる。
　CARタンパク質の標的結合ドメインは、例えば上記のような標的分子に特異的に結合するモノクローナル抗体の重鎖（H鎖）可変領域及び軽鎖（L鎖）可変領域を含む単鎖抗体（scFv）断片を含むものとすることができる。当業者であれば、特定の抗原に対するモノクローナル抗体及びCARに使用可能なscFv断片を容易に作製することができ、また市販のものを利用することもできる。例えば、本発明において好適に利用できる標的結合ドメインとして、CD25、CD19又はCD7に対して特異的に結合するscFv断片を挙げることができる。
　標的結合ドメインとしてはまた、標的分子に特異的に結合するリガンド、例えばアフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、例えば腫瘍細胞上の受容体の溶解性タンパク質/ペプチドリガンド、ペプチド等を使用しても良い。
　CARタンパク質は、場合によって、細胞外に存在する標的結合ドメインと膜結合ドメインとの間に「細胞外スペーサードメイン」を含むことができる。細胞外スペーサードメインは、CARと標的分子の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが望ましい。例えば、抗体のFcフラグメント、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを用いることができる。
　CARタンパク質は、標的結合ドメイン及び任意に細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン及び任意に共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。
　「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインがいずれも親水性ドメインであるのに対して、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有するドメインである。膜貫通ドメインは、CARタンパク質が細胞膜上に存在でき、標的結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの機能を損なわない限り、特に限定するものではないが、後述する共刺激ドメインと同じタンパク質由来のポリペプチドが膜貫通ドメインとしての機能を果たす場合もあり得る。膜貫通ドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。
　CARタンパク質は、場合によって「共刺激ドメイン」を含むことができる。共刺激ドメインは共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが、CAR-T細胞の増殖、サイトカイン産生、機能分化、標的細胞の細胞死のような、細胞による共刺激応答が媒介される。共刺激ドメインとしては、例えば、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lckを用いることができる。例えば、共刺激ドメインは、ヒト4-1BB（GenBank：U03397.1）等を使用することができる。
　CARタンパク質は「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ヒトCD3ζ鎖、FcγRIII、FcεRI、Fc受容体の細胞質末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体又はそれらの組み合わせを用いることができる。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ鎖（例えばNCBI Accession No. NM＿000734.3のヌクレオチド299-637）を使用することができる。
　第1世代と呼ばれるCARにおいては、シグナル伝達ドメインはCD3ζまたはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来するものであった。第1世代CARはT細胞の細胞傷害性を方向付けできることが示されているが、インビボでの長期増殖および抗腫瘍活性においては不十分とされていた。CAR-T細胞の生存率を向上させ、増殖を増やすために、CD28、OX-40（CD134）、及び4-1BB（CD137）等の共刺激分子に由来するシグナル伝達ドメインが単独で（第2世代）または組み合わせて（第3世代）用いられるようになっている。
　図２Ａに、本発明において好適に使用できるCARコンストラクトの一例を示している。この例では、標的結合ドメインは、CD25を標的とするscFV断片である。本発明において、CARの標的結合ドメインは、CD19を標的とするscFV断片であり得る。また、本発明において、CARの標的結合ドメインは、CD7を標的とするscFV断片であり得る。
　標的に対するモノクローナル抗体の取得方法は当分野において公知であり、当業者であれば選択した標的を抗原とするモノクローナル抗体を取得することができ、モノクローナル抗体は、市販品を入手することもできる。モノクローナル抗体又はそのscFV断片は、当分野における技術常識に基いて合成することができ、これらをコードする遺伝子についてもその塩基配列を取得して合成することができる。
＜CXCL12受容体タンパク質＞
　本発明の細胞は、細胞表面にCARを発現すると共に、CXCL12受容体タンパク質を発現することを特徴とする。
　CXCケモカインリガンド12（CXCL12）は、SDF（Stromal Cell-Derived Factor、ストローマ細胞由来因子）-1とも呼ばれる89アミノ酸の低分子タンパク質であり、ケモカインCXCファミリーに属している。CXCL12はリンパ球の強力な化学誘引因子であり、骨髄から内皮前駆細胞を動員すること等により、血管新生において重要な役割を果たすことが示唆されている。CXCL12の受容体として知られるCXCモチーフケモカイン受容体タイプ4（CXCR4、Fusin、CD184）は、7回膜貫通型Gタンパク質共役受容体であり、好中球、単球、樹状細胞、NK細胞、B細胞、T細胞、血小板での発現が知られている。
　CXCL12/SDF1は、ヒト及びマウス造血細胞又は免疫細胞が骨髄及び肝臓を含む複数の器官にホーミング及び移動するのを促進するケモカインリガンドの一つである。理論に拘束されるものではないが、CXCL12受容体、例えばCXCR4を共発現させることにより、CAR-T細胞は、CXCR4を発現しないCAR-T細胞と比較して、より効率的に骨髄にホーミングし得ると考えられる。本発明において好適に使用できるCXCL12受容体は、CXCR4である。
　ヒトCXCR4は、CXCR4遺伝子によってコードされる360アミノ酸からなるタンパク質であり、その遺伝子の塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列は、例えばアメリカ国立生物工学情報センター（NCBI）等のデータベースにおいてGene ID: 7852、Accession No:CAA12166として収載されており、これらの情報に基づいて遺伝子及びタンパク質を入手することができる。
　本発明者等は、CXCL12受容体タンパク質を発現するCAR-T細胞が、CXCL12受容体タンパク質を発現しないCAR-T細胞と比較して、標的となる細胞に対して顕著に優れた細胞傷害活性を示すことを見出した。細胞上でのCXCL12受容体タンパク質、例えばCXCR4の発現は、CXCL12受容体タンパク質の全部であっても良いが、CXCL12と特異的に結合し、CAR-T細胞の細胞傷害活性を向上させることができるものであれば、そのような機能的断片であるタンパク質の一部の発現であっても良い。
　例えば、CXCR4を発現し、CD25を標的とするCAR-T細胞（以下、本明細書においてCXCR4 CD25 CAR-Tと記載することがある）は、急性骨髄性白血病（AML）に対して優れた抗腫瘍活性を示した。従って、本発明の細胞の一態様は、CXCR4と、CD25を標的とするCARとを共発現する細胞である。
　また、CXCR4を発現し、CD19を標的とするCAR-T細胞（以下、本明細書においてCXCR4 CD19 CAR-Tと記載することがある）は、CD19陽性の急性リンパ性白血病（ALL）、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、B細胞性混合形質性急性白血病（MPAL）やバーキットリンパ腫に対して優れた抗腫瘍活性を示した。従って、本発明の細胞の一態様は、CXCR4と、CD19を標的とするCARとを共発現する細胞である。
　現在、ALLはBIRC阻害剤（例えばAZD5582）、BCL-2阻害剤（例えばベネトクラクス）、ステロイド剤等の低分子治療薬を単独又は組み合わせて治療されているが、このような低分子治療薬のみでは根治できない場合がある。本発明者等は、ヒトALL細胞を移植したマウスに対して低分子治療薬のみでの治療を行った場合に、末梢血中からは白血病細胞が消えたように見えるが、実際には、骨髄中に白血病細胞が残存しており、再発を引き起こす可能性があるものを確認した。これに対して、CXCR4発現CD19 CAR-T細胞を投与すると、低分子治療後に増加（再発）を示していたALL細胞を完全に消失させることができた。
　CXCR4を発現し、CD7を標的とするCAR-T細胞（以下、本明細書においてCXCR4 CD7 CAR-Tと記載することがある）は、CD7陽性のT細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、T細胞性混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）について、顕著な治療効果を示す。従って、本発明の細胞の一態様は、CXCR4と、CD7を標的とするCARとを共発現する細胞である。
　上記の通り、CXCL12受容体タンパク質を発現するCAR-T細胞は、腫瘍細胞に対して優れた治療及び／又は再発予防効果を有する。従って、本発明はまた、上記の本発明の細胞を含有する、腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を示す薬剤を提供する。
　本発明の薬剤の治療／再発予防対象となる疾患は、腫瘍性疾患であり、特に血液腫瘍性疾患である。血液腫瘍性疾患として、限定するものではないが、白血病及び悪性リンパ腫が挙げられる。
　白血病には骨髄性白血病とリンパ性白血病があり、骨髄性白血病には急性骨髄性白血病（AML）、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄異形成症候群、リンパ性白血病には急性リンパ性白血病（ALL）（例えばB細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL））、慢性リンパ性白血病（CLL）、成人T細胞白血病リンパ腫等がある。
　悪性リンパ腫にはホジキンリンパ腫（HL）と非ホジキンリンパ腫（NHL）があり、非ホジキンリンパ腫は、B細胞性、T細胞性、NK細胞性等に分類されている。B細胞性の悪性リンパ腫としては、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫（MALTリンパ腫）、節性辺縁帯リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫等が挙げられる。T細胞性の悪性リンパ腫としては、末梢性T細胞リンパ腫・非特定型、腸症関連T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、肝脾T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫、節外性NK/T細胞リンパ腫・鼻型、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫T細胞大型顆粒リンパ球性白血病、成人T細胞白血病/リンパ腫、菌状息肉症/セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、急速進行性NK細胞白血病等が挙げられる。
　本発明の薬剤の治療／予防対象となる疾患は、例えば急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患である。
　本発明の薬剤は、上記腫瘍性疾患に対する抗癌剤である。本発明の薬剤、すなわちCAR-T細胞は、単独で用いても良く、治療対象のがんの種類及び症状の進行等の種々の状態に応じて、また医師の判断により、異なるメカニズムの更なる抗腫瘍剤及び／又は抗腫瘍治療と組み合わせて用いても良い。
　更なる抗腫瘍剤としては、特に制限するものではないが、例えば、代謝拮抗剤、プラチナ系薬剤、微小管阻害薬、トポイソメラーゼ阻害薬、分子標的薬、ステロイド剤等が挙げられる。
　代謝拮抗剤としては、5-フルオロウラシル（5-FU）、トリフルリジン、フルダラビン（又は活性代謝物であるフルダラビンヌクレオシド）、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、グアデシタビン、又はアザシチジンが挙げられる。プラチナ系薬剤としては、シスプラチン、オキサリプラチン、又はカルボプラチンが挙げられる。微小管阻害薬としては、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エリブリン等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害薬としては、イリノテカン、エトポシド等が挙げられる。
　分子標的薬としては、CSF1R阻害剤、TIE2阻害剤、TRKB阻害剤、ATR阻害剤、Chk1阻害剤、HSP90阻害剤、PARP阻害剤、EGFR阻害剤、Her2阻害剤、VEGFR阻害剤、PDGFR阻害剤、MET阻害剤、AXL阻害剤、RET阻害剤、FLT3阻害剤、KIT阻害剤、HCK阻害剤、BIRC阻害剤（例えばAZD5582）、又はBCL-2阻害剤（例えばベネトクラクス）が挙げられる。HCK阻害剤及びBCL-2阻害剤は、例えば特開2019-529423号に開示されたものを使用しても良い。
　ステロイド剤としては、例えばデキサメタゾンが挙げられる。
　一方、他の抗腫瘍治療としては外科的手術や放射線治療等が挙げられる。
　限定するものではないが、本発明の薬剤は、BIRC阻害剤及び／又はBCL-2阻害剤と組み合わせることで白血病に対する治療効果をより強固に発揮することができることが確認されている。従って、本発明の一態様は、CXCL12受容体タンパク質を発現するCAR-T細胞を含有する薬剤と、BIRC阻害剤及び／又はBCL-2阻害剤とを含む組合せ治療を含む。例えば、本発明のキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞は、BIRC阻害剤（例えばAZD5582）と組み合わせて血液腫瘍性疾患を有する患者に投与することができる。また、本発明のキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞は、BCL-2阻害剤（例えばベネトクラクス）と組み合わせて血液腫瘍性疾患を有する患者に投与することができる。
　本発明のCXCL12受容体タンパク質を発現するCAR-T細胞を含有する薬剤は、上記した更なる抗腫瘍剤及び／又は抗腫瘍治療と同時に、連続して、又は別個に投与することができる。一態様では、本発明の薬剤の投与と同時に、更なる抗腫瘍剤の投与及び／又は抗腫瘍治療を行うことができる。一態様では、本発明の薬剤の投与後に、更なる抗腫瘍剤の投与及び／又は抗腫瘍治療を行うことができる。一態様では、本発明の薬剤の投与前に、更なる抗腫瘍剤の投与及び／又は抗腫瘍治療を行うことができる。一態様では、本発明の薬剤の投与と同時に、更なる抗腫瘍剤の投与及び／又は抗腫瘍治療を行うことができる。別の一態様では、抗腫瘍剤の投与及び／又は抗腫瘍治療による治療後に再発した場合に、本発明の薬剤を投与することができる。
　本発明はまた、上記の本発明の薬剤と製薬上許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、有効成分として本発明の薬剤を単独で、又は他の有効成分と組み合わせて含有し得る。本発明の医薬組成物は、上記した腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防を目的とする。例えば、本発明の医薬組成物は、急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防のためのものであり得る。
　本明細書において使用する用語「製薬上許容される担体」とは、有効成分の活性を損なうことなく、医薬組成物の製剤化及び投与のために添加することが必要若しくは好適な非毒性の担体をいう。例えば、水、生理食塩水等の水性媒体であり、賦形剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、ゲル化剤等を適宜含めることができる。
　本発明の薬剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば白血病の治療の場合には、静脈内投与とすることが好ましい。本発明の薬剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば、対象の体重1kgあたり104～1010個、又は104～109個の範囲の上記細胞を投与するものとすることができる。本発明の薬剤又は医薬組成物は、単回投与とすることができる。あるいは、本発明の薬剤又は医薬組成物は、１日１回～数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に複数回投与することが可能である。
＜細胞の作製方法＞
　本発明はまた、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、CXCL12受容体タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを細胞内に導入することを含む、上記の本発明の細胞の作製方法を提供する。
　目的とするポリヌクレオチドは常法に従い、容易に作製することができる。キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、各ドメイン（標的結合ドメイン、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメイン）のアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からそれぞれのアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、それぞれのドメインをコードするポリヌクレオチドを標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて連結して本発明の第１のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
　CXCL12受容体タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドについても、そのアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて本発明の第２のポリヌクレオチドを作製することができる。
　上記第１及び第２のポリヌクレオチドは、当分野において公知の任意の適切な方法によって細胞、例えばT細胞に導入することができる。核酸分子を細胞内に導入する適切な方法には、限定するものではないが、ポリヌクレオチドが細胞ゲノムに組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチドが細胞ゲノムに組み込まれない一過的形質転換法、及びウイルスを介した方法が含まれる。例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入されてもよい。一過的形質転換法には、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはパーティクルボンバードメントが含まれる。
　細胞に導入されるポリヌクレオチドはDNAでもよくRNAでもよい。一態様において、導入される核酸分子はDNAである。一態様において、細胞に導入される核酸分子はRNA、特にCARタンパク質又はCXCL12受容体タンパク質をコードするmRNAである。
　例えば、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質は、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とするものであり得る。
　上記第１のポリヌクレオチドと、上記第２のポリヌクレオチドとは、単一の同じベクターによって細胞内に導入することができる、あるいはまた、上記第１のポリヌクレオチドと、上記第２のポリヌクレオチドとは、別個のベクターによってそれぞれ細胞内に導入することができる。
＜治療方法＞
　本発明はまた、上記の本発明の薬剤又は医薬組成物を患者に治療的有効量で投与することを含む、腫瘍の治療方法を提供する。治療的有効量及び投与レジメンは、対象疾患の種類及び進行度、患者の年齢等を考慮して適宜決定することができる。本発明の方法によって治療される対象（患者）は、哺乳動物であり、例えばマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくは、本発明の方法によって治療される対象はヒト患者である。また、対象は、ヒト腫瘍細胞を移植された非ヒト哺乳動物、又は腫瘍性疾患を有する非ヒト動物であり得る。
　本発明の方法は、CD25（IL-2受容体α鎖）を標的とするキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞を対象に投与するステップを含む、対象における腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防のための方法である。
　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質は、限定するものではないが、例えばCD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とするものであり得る。
　本発明の方法における治療及び／又は再発予防の対象となる腫瘍性疾患は、上記の腫瘍性疾患のいずれであっても良く、例えば急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される疾患であり得る。
　本発明の方法では、上記細胞を対象に単回投与するものとすることができる。あるいはまた、本発明の方法では、上記細胞を対象に複数回投与するものとすることができる。また、本発明の方法は、本発明の薬剤又は医薬組成物を、上記した通り、更なる治療剤、例えば更なる抗腫瘍剤及び／又は抗腫瘍治療と組み合わせて実施することができる。
　本発明の方法では、対象の体重1kgあたり104～109個の範囲の上記細胞を単回投与又は複数回投与することができる。
　また、本発明の方法は、細胞の投与の前に上記対象の腫瘍細胞における標的細胞表面抗原の発現レベルを測定するステップを更に含むことができる。例えば、一態様において、本発明の方法は、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞の投与の前に、対象となる腫瘍細胞でのCD25の発現レベルを測定するステップを含むことができる。別の一態様において、本発明の方法は、CXCR4発現CD19 CAR-T細胞の投与の前に、対象となる腫瘍細胞でのCD19の発現レベルを測定するステップを含むことができる。更に別の一態様において、本発明の方法は、CXCR4発現CD7 CAR-T細胞の投与の前に、対象となる腫瘍細胞でのCD7の発現レベルを測定するステップを含むことができる。
　本発明の方法はまた、CXCR4発現CAR-T細胞の投与の後に治療効果を評価するステップを更に含むことができる。ここで、治療効果は、対象における、（i）血液中の腫瘍細胞の減少、（ii）骨髄中の腫瘍細胞の減少、（iii）脾臓中の腫瘍細胞の減少、及び（iv）肝臓への腫瘍細胞の浸潤の抑制、から選択される１以上の指標によって評価することができる。
＜癌の治療及び／又は再発予防における使用＞
　本発明はまた、キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する、癌の治療及び／又は再発予防において使用するための細胞を提供する。
　細胞は、例えばその表面上に発現したキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とするものである。
　上記癌は、上記の腫瘍性疾患から選択される疾患のいずれであっても良く、例えば急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患である。細胞は、上記の細胞のいずれであっても良いが、好ましくはT細胞である。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
　レンチウイルスベクターの構築は以下のようにして行った。
　レンチウイルスベクターとしてpHR_SFFV（Addgene plasmid # 79121、Wendell Lim博士からご供与）を用い、CD25-CAR（pHR_SFFV CD25CAR）、及びマウスCXCR4（pHR_SFFV mCXCR4）、並びにパッケージングプラスミド（pCMVR, pL2, pMD2.G-VSV-G, pAdV（Promega））を用い（Cho et al 2018 Cell）、JetPEIトランスフェクション試薬（Polyplus）によって293T細胞をトランスフェクトすることにより導入遺伝子をレンチウイルスベクター中にパッケージングした。
　トランスフェクション4日後、ウイルス上清を回収し、Vivaspin200（merck）を使用して遠心分離した。濃縮したウイルス上清を一晩遠心分離した後、上清を廃棄し、ペレットをT細胞用培地で溶解させた。
　初代ヒトT細胞の培養及びレンチウイルス感染は以下の手順で実施した。
　ヒトサンプルは、AML患者からインフォームドコンセントを得た上で採取した。臍帯血は中部さい帯血バンク（愛知県）から健康なドナーの臍帯血を入手した。
　AML患者の骨髄単核球及び臍帯血中の単核球は密度勾配遠心分離によって単離した。CD34＋細胞及びCD34－細胞は、autoMACS（Miltenyi）によって抗ヒトCD34免疫磁気ビーズを用いて分離した。T細胞は、autoMACS with Pan T cells isolation kit（Miltenyi）によってCD34－集団から濃縮した。T細胞を分離した後、X-Vivo15（Lonza）、5％ウシ胎児血清、10mM N-アセチル-L-システイン（Sigma-Aldrich#A9165）、55 mM 2-メルカプトエタノール中で培養した（Jang hwan Cho 2018 Cell）。
　T細胞を25μlのHuman T-activator CD3/CD28 DynaBeades（Thermo Scientific #11132D）で刺激し、培地1ml中に1×106個の細胞とした。翌日、レンチウイルス感染のためにT細胞を96ウェルプレートにウェルあたり1×105個／100μlでまいた。100μlのT細胞懸濁液中に16-100μlのCARレンチウイルスをvectofusin-1（10μg/ml、Miltenyi）を用いて添加し、1日間培養した。感染させたT細胞を含む培地の半分を除去し、同量の新しい培地を添加した。感染2日後、感染したT細胞をCD25-FC融合タンパク質で25CARの発現について、抗mCXCR4抗体でmCXCR4の発現について、分析した。表面タンパク質の発現を確認した後、CD25 CAR-T細胞をAMLモデルマウスに後眼窩洞から注入した。
　フローサイトメトリーは、細胞をモノクローナル抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD33、マウスCD45)で標識し、FACSAriaIII又はFACSCanto II（BD Biosciences）を使用して解析した。
［参考例１　正常及び悪性ヒト造血細胞表面上のCD25/IL2RAの発現］
　CD25（IL-2Rα鎖）は、AML発症細胞及び正常CD34＋CD38－造血幹細胞／前駆細胞で異なって発現する遺伝子の1種として同定されている（Saito, et al. 2010 Sci Trans Med）。更に、AMLにおけるCD25の発現は予後不良因子としても報告されている（Gonen,et al. 2012 Blood, Nguyen et al. Cancer Research 2020）。多様な遺伝的異常を有するAMLでは、症例によってCD25発現の程度が様々であり得る。
　AML患者の細胞におけるCD25発現の不均一性について調べるために、84症例のAML由来のCD33＋白血病芽球におけるCD25の細胞表面発現をフローサイトメトリーを用いて解析した。
　その結果、57症例がCD25陰性、14症例がCD25の中程度の発現、13症例がCD25の高発現であり、84症例中の27症例（32.2％）の患者由来AML細胞でCD25が様々な程度で発現していた（図１Ａ及び１Ｂ）。
　更に、未成熟及び成熟ヒト造血細胞におけるCD25の発現を解析したところ、我々の以前の報告（Saito, et al 2010 Sci Trans Med）と一致して、CD25発現細胞の頻度は造血幹細胞／前駆細胞（CD34＋C38－）及び骨髄－赤血球系前駆細胞（CD34＋CD38＋）で低かった（図１Ｃ）。また、単球（CD14＋）、顆粒球（CD15＋）、及びNK細胞（CD56＋）でのCD25タンパク質発現はいずれも5％未満であり、ヒトT細胞（CD3＋）では8.8％がCD25を発現していることが見出された（図１Ｃ）。
［参考例２　CD25を標的としたCAR-T細胞の細胞傷害活性］
　CD25抗原を標的とするCAR-T細胞を作製するために、抗IL2RA/CD25タンパク質単鎖可変フラグメント（scFv）及び細胞内CD3z及びCD137（4-1BB）シグナル伝達ドメインを有するレンチウイルスベクターを設計した（図２Ａ）（Michael C. Milone, et al. 2009 Mol Therapy 17(8): 1453-64）。
　次いで、種々の程度のCD25発現を有する患者白血病細胞に対するCAR-T細胞のin vitroでの殺傷効果を評価した。この目的で、CD25発現を有する又は有さない患者AMLサンプルを使用してin vitroでのT細胞媒介細胞傷害性アッセイを組み立てた。
　CD25CAR-T細胞と共に3日間培養した場合、CD25陽性初代AML細胞（U390、U346）の生存は顕著に損なわれ、AML細胞の絶対数が減少したが、非特異的活性化T細胞（U328）ではそのような変化は見られなかった（図２Ｂ）。標的としてのCD25陰性AML細胞、又はエフェクターとしてCARを導入していない活性化T細胞を用いてAML細胞死が起こらないことから、AML細胞死がCAR-T細胞によるCD25の認識を介して生じていることが示された。
［参考例３　CD25 CAR-Tは、生体内でCD25陽性AMLを駆逐することができない］
　CD25発現患者AMLに対するCAR-T細胞の抗原特異的細胞傷害性がin vitroで観察されたため、CAR-T細胞のin vivoにおける治療効果を評価した。
　患者由来のAML細胞を移植したNSGマウスを以下のようにして作製した。NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjl/Sz（NOD-SCID -IL2rgnull）マウスは、Jackson LaboratoryからNOD.Cg-Prkdcscid（NOD-SCID）株（Shultz et al. 2005 J immunol）のIl2rg遺伝子座に戻し交配で完全なヌル変異を入れたものを入手した。
　NOD-SCID-IL2rgnullのマウス新生児の全身に150 cGyの放射線を照射した後に、ヒトAML細胞の静脈注入を行った。AML移植レシピエントの作製のためには、各レシピエントに103～105個のAML移植細胞を注入した（Ishikawa et al. 2007 nature biotechnol）。正常ヒトHSC移植レシピエントの作製のためには、各レシピエントに104個の7AAD-系統(hCD3/hCD4/hCD8)-hCD34+hCD38-のCB細胞を注入した（Ishikawa et al. 2005 Blood）。ヒト末梢血細胞の移植は後眼窩瀉血によって評価した。
　AML細胞を移植したNSGマウスの末梢血中にAML細胞が存在することを確かめた後、CD25 CAR-T細胞5×106個を単回投与して、1週間毎に4週間末梢血を採取してフローサイトメーターで解析した。その結果、図３に示すように、全てのマウスでヒトCD45の中のCAR-T細胞（CD3+）の割合の増加、AML（hCD45+CD33+CD25+）の割合の減少を認めたが、4週間後でもhCD45＋hCD33＋AML芽球が残っていた。また、マウス#2のように、効果が強い場合と、マウス#1と#3のように、効果が弱い場合があり、効果にばらつきが見られた。
　また、CD25 CAR-T細胞の投与4週間後にマウスを解剖して、骨髄のHE染色を行ったところ、図４に示すように、免疫不全マウスの骨髄（正常NSG)には、顆粒球や、骨髄球など様々な種類の細胞が見られるが、AML PDXマウスの骨髄では、CD25 CAR-T細胞を投与した後も骨髄細胞の大半がAML細胞であり、赤血球系の細胞、巨核球、及び正常な白血球は非常にわずかであった。
［実施例１　CXCR4発現CD25 CAR-T細胞の効果１］
　骨髄におけるCD25 CAR-T細胞の治療効果が最適ではないため、CAR-T細胞が骨髄により良くホーミングすることを可能とするCAR構築物を設計した。CXCR4発現CD25 CAR-Tを作製するために、pHR_SFFV_mCXCR4ベクター及びpHR_SFFV_CD25CARベクターの双方を293T細胞にトランスフェクトした。
　AML細胞を移植したPDXマウスにCD25 CAR-T細胞又はCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した後、1週間ごとに末梢血を採取し、フローサイトメトリーによって細胞を分離し、AML細胞、マウス白血球、CAR-T細胞の割合を調べた。その結果、4週間の観察期間の間の経時的なヒトAML細胞の安定的な減少と、注入4週間後のヒトAMLの完全な排除が見出された（図５－１～図５－３、図６）。
　CXCR4発現CD25 CAR-T細胞で治療すると、4週間で完全にCD33陽性の白血病細胞が消失し、その効果は４ヶ月以上にわたって維持された。白血病細胞の減少後、CAR-T細胞も減少しており、マウスCD45細胞が末梢血中の多くを占めるようになった。すなわち、CD25 CAR-T細胞によるヒトAML細胞のin vivoでの根絶において、CXCR4を共発現する細胞がより高い効果をもたらすことが示された。
［実施例２　CXCR4発現CD25 CAR-T細胞の効果２］
　実施例１においてCXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与したPDXマウスの脾臓及び骨髄を摘出し、投与しなかった場合と比較して目視観察した。その結果、図７に示すように、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞投与を行ったマウスでは、脾臓サイズの正常レベルへの縮小、赤血球系細胞の回復を示す骨髄の赤色化が観察された。
　図８は、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞投与後4週間のマウス（U390移植PDXマウス）骨髄組織をHE染色した結果を示す。CAR-T細胞によるAML細胞根絶後、マウスの正常な白血球、赤血球、血小板を作る巨核球全てが回復していることが確認された。
　また、骨髄細胞をフローサイトメトリー解析した結果、上記の結果と一致して、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合にのみ、白血病細胞の完全な消失、マウス赤血球(Ter119)や白血球（mCD45）などの正常細胞の回復が見られた（図９－１～図９－３）。
　CXCR4発現CD25 CAR-T細胞による骨髄中のAML細胞の根絶効果はCAR-T細胞注入から5ヶ月経過後も維持されていた（図１０）。
　肝臓においても、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与した場合にのみ、T細胞の増加と白血病細胞の完全な消失が見られ、CD25 CAR-T細胞を投与した場合と比較して顕著に強い治療効果を示すことが確認された（図１１－１～図１１－２、図１２）。
　更に、組織学的検討から、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞を投与したマウスの肝臓、腸、及び皮膚において、GVHDあるいは他の病理学的炎症がないことが確認された（データは示さない）。2つの更なる症例において、CXCR4発現CD25 CAR-T細胞で、ヒトAML細胞の有意に優れた死滅を確認した。検討した3つの症例中の2つにおいて、レシピエントの肝臓組織へのAML細胞の浸潤を確認していたが、肝臓は、CXCL-12/SDF1の強い発現を示す臓器であり、CD25 CAR-T細胞におけるCXCR4の共発現が、レシピエント動物の肝臓組織に浸潤したヒトAML細胞に対して強力な治療効果を示したものと考えられた。
　以上のように、5×106個のCXCR4発現CD25 CAR-T細胞の単回注入は、CD25を発現する侵襲性AMLに対する長期の治療応答を達成するのに十分であり得る。
［実施例３　CXCR4発現CD19 CAR-T細胞の効果１］
　CD19陽性のB細胞性混合形質性急性白血病(MPAL、B/myeloid、U211)細胞を移植したPDXマウスに対してBIRC阻害剤AZD5582 0.5 mg/kg/day (腹腔内投与)、BCL-2阻害剤(ベネトクラクス) 30 mg/kg/day (経口投与)とデキサメタゾン(DEX) 30mg/kg/day (腹腔内投与)による治療を行なった。図１３－１に示すように、10回投薬後、末梢血中の白血病細胞（MPAL）は治療前と比べ減少（37.8％から0.9％）したが、依然として白血病細胞が残存していた。末梢血中だけでなく、骨髄中でも確認された（データは示さない）。
　残存白血球の存在は再発を引き起こし得るため、分子標的薬による治療後にCXCR4発現CD19 CAR-T細胞5×106個を投与した。
　その結果、図１３－２に示すように、CAR-T細胞投与から10日目には再発を示すMPAL細胞が存在していたが、23日目には0.4％となり、32日目、39日目では、MPAL細胞が完全に消失していることがわかった。
［実施例４　CXCR4発現CD19 CAR-T細胞の効果２］
　B細胞性の高悪性度リンパ腫であるバーキットリンパ腫は、多剤化学療法により治療が行われているが、治療抵抗性を示す症例や再発を来す症例では、自家造血幹細胞移植併用大量化学療法や同種造血幹細胞移植を行なっても、5年生存率が50％以下との報告があり、予後不良である(J Oncol Pract. 2018 Nov;14(11):665-671)。
　本実施例では、バーキットリンパ腫の細胞株であるTL1（東北大学加齢医学研究所　医用細胞資源センターより入手）を用い、実施例１と同様にして異種移植バーキットリンパ腫モデルマウスを作製し、CXCR4を発現し、CD19に対する結合特異性を有するCAR-T(CXCR4発現CD19 CAR-T)細胞5×106個投与の効果を検討した。
　図１４の左側はCAR-T細胞を投与していないマウスの骨髄（BM）と肝臓でのフローサイトメトリーの結果を示している。ヒトCD45陽性細胞のうち大部分がB細胞マーカーのCD19陽性であり、骨髄、肝臓ともにリンパ腫細胞が多くを占めていることが分かる。
　これに対して、CXCR4発現CD19 CAR-T細胞を投与したマウス(右側)では、骨髄と肝臓いずれにおいても、ヒトCD45陽性細胞のうち、大部分がCAR-T細胞(CD3陽性)であり、リンパ腫細胞はほぼ消滅していることが分かった。
　本発明により、予後が不良で完治が困難であった腫瘍性疾患に対して極めて有効な治療及び／又は再発予防の方法を提供することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (23)

  1. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞。
  2. 　上記CXCL12受容体がCXCR4である、請求項１記載の細胞。
  3. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、請求項１又は２記載の細胞。
  4. 　T細胞である、請求項１～３のいずれか１項記載の細胞。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項記載の細胞を含有する、抗腫瘍活性を示す薬剤。
  6. 　更なる抗腫瘍剤及び／又は抗腫瘍治療と組み合わせて用いられる、請求項５記載の薬剤。
  7. 　請求項５記載の薬剤と製薬上許容される担体とを含有する医薬組成物。
  8. 　急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防のための、請求項５若しくは６記載の薬剤又は請求項７記載の医薬組成物。
  9. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、CXCL12受容体タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを細胞内に導入することを含む、請求項１～４のいずれか１項記載の細胞の作製方法。
  10. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、請求項９記載の方法。
  11. 　上記第１のポリヌクレオチドと、上記第２のポリヌクレオチドとが、同じか又は別個のベクターによって細胞内に導入される、請求項９又は１０記載の方法。
  12. 　CD25（IL-2受容体α鎖）を標的とするキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する細胞を対象に投与するステップを含む、対象における腫瘍性疾患の治療及び／又は再発予防のための方法。
  13. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、請求項１２記載の方法。
  14. 　腫瘍性疾患が急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. 　上記細胞を対象に単回投与するものである、請求項１２～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. 　対象の体重1kgあたり104～109個の範囲の上記細胞を投与する、請求項１２～１５のいずれか１項記載の方法。
  17. 　細胞の投与の前に上記対象の腫瘍細胞における標的細胞表面抗原の発現レベルを測定するステップを更に含む、請求項１２～１６のいずれか１項記載の方法。
  18. 　細胞の投与の後に治療効果を評価するステップを更に含む、請求項１２～１７のいずれか１項記載の方法。
  19. 　治療効果を、対象における、（i）血液中の腫瘍細胞の減少、（ii）骨髄中の腫瘍細胞の減少、（iii）脾臓中の腫瘍細胞の減少、及び（iv）肝臓への腫瘍細胞の浸潤の抑制、から選択される１以上の指標によって評価する、請求項１８記載の方法。
  20. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質と、CXCL12受容体タンパク質とを細胞膜上に共発現する、癌の治療及び／又は再発予防において使用するための細胞。
  21. 　キメラ抗原受容体（CAR）タンパク質が、CD25（IL-2受容体α鎖）、CD19及びCD7から選択される細胞表面抗原を標的とする、請求項２０記載の細胞。
  22. 　上記癌が急性骨髄性白血病（AML）、成人T細胞白血病、B細胞急性リンパ性白血病（B-ALL）、T細胞急性リンパ性白血病（T-ALL）、混合形質性急性白血病（MPAL）、慢性骨髄性白血病（CML）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される腫瘍性疾患である、請求項２０又は２１記載の細胞。
  23. 　T細胞である、請求項２０～２２のいずれか１項記載の細胞。
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