BR112019017008A2 - anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, imunoconjugado multifuncional, receptor de antígeno quimérico, vírus, célula imune modificada pelo receptor do antígeno quimérico, composição farmacêutica, kit, e, uso do anticorpo. - Google Patents

anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, imunoconjugado multifuncional, receptor de antígeno quimérico, vírus, célula imune modificada pelo receptor do antígeno quimérico, composição farmacêutica, kit, e, uso do anticorpo. Download PDF

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Abstract

é provido um anticorpo para identificar especificamente il-13ra2, que pode ser utilizado para preparar dum medicamento antitumoral direcionado e um medicamento para diagnosticar um tumor.

Description

ANTICORPO, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, IMUNOCONJUGADO MULTIFUNCIONAL, RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO, VÍRUS, CÉLULA IMUNE MODIFICADA PELO RECEPTOR DO ANTÍGENO QUIMÉRICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, E, USO DO ANTICORPO
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A invenção se refere ao campo da imunoterapia ou diagnóstico de tumores, e mais particularmente a um anticorpo para identificar especificamente a IL-13RA2 e o uso da mesma.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Existem 20.000 novos casos de gliomas malignos (MG), incluindo glioblastoma pleomórfico e glioblastoma, todos os anos nos Estados Unidos da América. Segundo dados estatísticos da American Brain Oncology Association, em 2010, 140.000 pessoas nos Estados Unidos da América tinham tumores malignos no cérebro. Embora o MG seja uma doença rara, sua malignidade e mortalidade são muito altas. Os meios de tratamento padrão atuais têm efeitos muito limitados, e a taxa de sobrevida em cinco anos após a cirurgia e a radioterapia também é muito baixa. Para pacientes que tiveram recaída após a cirurgia, existem muito poucas opções de tratamento. Portanto, o desenvolvimento de novas metas e novos meios de tratamento são necessidades urgentes da maioria dos pacientes.
[003] A subunidade alfa 2 do receptor da interleucina-13 (IL13RA2) é um marcador específico de tumor que é altamente expresso especificamente na superfície de uma célula tumoral maligna como o glioma humano (Dehinski et al., (1995) Clin.Cancer Res.l 1253 a 1258) ou semelhante. A IL-13RA2 humana como alvo de tratamento para gliomas humanos atraiu a atenção do FDA dos EUA desde 1988, e a organização preparou o medicamento IL-13-PE38 para IL-13RA2 humana como alvo de tratamento e um anticorpo de cadeia única de molécula de fusão scFv-PE para
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IL-13RA2 humana sucessivamente. Embora a IL-13-PE38 tenha alcançado eficácia no tratamento de tumores malignos como glioma, tumor de cabeça e pescoço, câncer de ovário e rim, e tenha sido aprovada pelo FDA dos EUA para tratamento clínico; no entanto, no processo de tratamento, a IL-13-PE38 não só se liga à IL-13RA2 humana expressa especificamente na superfície da célula tumoral, mas também se liga à IL13-RA1 expressa na superfície celular normal do tecido, danificando tecidos e células normais. A aplicação adicional de IL-13-PE38 é limitada devido à falta de direcionamento estrito.
[004] A invenção tem como objetivo encontrar um anticorpo específico para IL-13RA2 e desenvolver uma célula efetora imunológica direcionada a IL-13RA2.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [005] E um objetivo da invenção prover um anticorpo contra IL13RA2 e o uso da mesma.
[006] Em um primeiro aspecto, a invenção provê um anticorpo para identificar especificamente IL-13RA2, em que a afinidade de ligação relativa EC50 do anticorpo às células U251 que expressam IL-13RA2 endogenamente não é maior que 100 nM, de um modo preferido não maior que 10 nM, de um modo mais preferido 0,01 a 10 nM.
[007] Em um exemplo preferido, o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc) é usado no processamento dos dados de afinidade relativa.
[008] Em uma modalidade específica, o anticorpo é selecionado dentre qualquer um de:
(1) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1 mostrado nas SEQ ID NOs: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 ou 64 e/ou HCDR2 mostrado nas SEQ ID NOs: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 ou 66 e/ou HCDR3 mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 11 ou 12;
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3/77 (2) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13 e/ou LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e/ou LCDR3 mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15 ou 16;
(3) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de (1) e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de (2); e (4) um anticorpo que é uma variante do anticorpo em conformidade com qualquer um de (1) a (3) e tem atividade idêntica ou semelhante ao anticorpo em conformidade com qualquer um de (1) a (3).
[009] Em uma modalidade específica, o anticorpo é selecionado dentre qualquer um de:
(1) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 8;
(2) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada com uma sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 ou 61 ou uma variante da sequência;
(3) um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de (1) e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de (2).
[0010] Em uma modalidade específica, a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16.
[0011] Em uma modalidade específica, a região variável de cadeia leve do anticorpo tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou 8, ou tem uma sequência com pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%,
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93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de semelhança com qualquer uma das sequências acima.
[0012] Em uma modalidade específica, a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1 mostrado nas SEQ ID NOs: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 ou 64, HCDR2 mostrado nas SEQ ID NOs: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 ou 66 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
[0013] Em uma modalidade específica, a região variável de cadeia pesada do anticorpo tem uma sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 ou 61 ou tem uma sequência com pelo menos 80%, de um modo mais preferido 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de semelhança com qualquer uma das sequências acima.
[0014] Em uma modalidade específica, as regiões CDR da região variável de cadeia leve e as regiões CDR da região variável de cadeia pesada têm as seguintes sequências opcionais ou variantes das mesmas:
(1) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 10 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11;
(2) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 16; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 10 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 12;
(3) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 16; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 64, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 66 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 12;
(4) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na
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SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 45, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 52 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11;
(5) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 16; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 63, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 65 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 12;
(6) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 50, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 56 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11;
(7) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 46, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 52 e HCDR3 mostrado naSEQ ID NO: 11;
(8) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 48, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 54 e HCDR3 mostrado naSEQ ID NO: 11;
(9) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 47, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 53 e HCDR3 mostrado naSEQ ID NO: 11;
(10) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 49, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 55 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11;
(11) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado
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6/77 na SEQ ID NO: 51, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 57 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11; on (12) LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 49, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 58 e HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11.
[0015] Em uma modalidade específica, (1) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(2) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(3) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 61 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(4) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 29 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(5) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 59 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(6) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a
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(7) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(8) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 35 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(9) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(10) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 37 ou uma sequência de uma variante da mesma;
(11) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 41 ou uma sequência de uma variante da mesma; ou (12) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma, e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 43 ou uma sequência de uma variante da mesma.
[0016] Em um segundo aspecto, a invenção provê um anticorpo para identificar especificamente IL-13RA2, em que o anticorpo reconhece o mesmo determinante antigênico que o anticorpo do primeiro aspecto.
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8/77 [0017] Em um terceiro aspecto, a invenção provê um anticorpo para identificar especificamente a IL-13RA2, em que o anticorpo se liga competitivamente à IL-13RA2 com o anticorpo do primeiro aspecto.
[0018] Em um quarto aspecto, a invenção provê um ácido nucleico que codifica o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto.
[0019] Em um quinto aspecto, a invenção provê um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico do quarto aspecto.
[0020] Em um sexto aspecto, a invenção provê uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão do quinto aspecto ou que tem o ácido nucleico do quarto aspecto integrado no genoma.
[0021] Em um sétimo aspecto, a invenção provê um imunoconjugado multifuncional compreendendo:
o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto; e [0022] uma molécula funcional ligada ao mesmo; a molécula funcional sendo selecionada a partir de uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral, uma molécula que inibe um tumor, uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície da célula imune ou um rótulo detectável.
[0023] Em uma modalidade específica, a molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral é um anticorpo ou ligando que se liga a um marcador de superfície tumoral diferente de IL-13RA2; ou [0024] a molécula que inibe um tumor é uma citocina antitumoral ou uma toxina antitumoral; de preferência, a citocina é selecionada a partir de IL-12, IE-15, interferon tipo I e TNF-alfa.
[0025] Em uma modalidade específica, a molécula que tem como alvo um marcador de superfície celular imune é um anticorpo que se liga a um marcador de superfície celular imune, de um modo preferido, o marcador de superfície celular imune é selecionado dentre CD3, CD 16 e CD28 e, de um modo mais preferido, o anticorpo que se liga ao marcador de superfície
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9/77 celular imune é um anticorpo anti-CD3.
[0026] Em uma modalidade específica, a molécula que tem como alvo o marcador da superfície da célula imune é um anticorpo que se liga a um marcador da superfície da célula T e forma um anticorpo bifuncional com o anticorpo de qualquer um dos primeiro a terceiro aspectos nos quais as células T estão envolvidas.
[0027] Em uma modalidade específica, o imunoconjugado multifuncional é um polipeptídeo de fusão que compreende adicionalmente um peptideo ligando entre o anticorpo de qualquer um dos primeiro a terceiro aspectos e a molécula funcional ligada ao mesmo.
[0028] Em um oitavo aspecto, a invenção provê um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado multifuncional do sétimo aspecto.
[0029] Em um nono aspecto, a invenção provê o receptor de antígeno quimérico do primeiro ao terceiro aspecto, em que o receptor de antígeno quimérico compreende o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto, uma região transmembranar e uma região de sinalização intracelular conectada sequencialmente.
[0030] Em uma modalidade específica, a região de sinalização intracelular é selecionada a partir de domínios de sinalização funcional das proteínas ΰϋ3ζ, CD3y, CD3ó, CD3s, FcRy (FCER1G), FcRP (FcsRlb), CD79a, CD79b, FcyRIIa, DAP10 e DAP12 ou uma combinação dos mesmos.
[0031] Em uma modalidade específica, a região de sinalização intracelular tem adicionalmente um domínio de sinalização coestimulatório e o domínio de sinalização coestimulatório compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada dentre: CD27, CD28, 41BB (CD137), 0X40, CD30, CD40, PD -1, ICOS, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligando que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8a, CD8p,
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IL2Rp, IL2Ry, IL7Ra, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CDlld, IT115 CD103, ITGAL, CDlla, LFA-1, ITGAM, CDllb, ITGAX, CDllc, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CREAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, LylO8), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46 e NKG2D ou uma combinação dos mesmos.
[0032] Em uma modalidade específica, o receptor de antígeno quimérico compreende um anticorpo, uma região transmembranar e uma região de sinalização intracelular conectada sequencialmente da seguinte maneira:
o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto, CD8 e Οϋ3ζ;
o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto, CD8, CD 137 e Εϋ3ζ; ou o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto, a região transmembranar de molécula CD28, a região de sinalização intracelular de molécula CD28 e CD3ζ; ou o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto, a região transmembranar de molécula CD28, a região de sinalização intracelular de molécula CD28, CD137 e CD3Ç.
[0033] Em um décimo aspecto, a invenção provê um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico do nono aspecto.
[0034] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção provê um vetor de expressão que compreende o ácido nucleico do décimo aspecto.
[0035] Em um décimo segundo aspecto, a invenção provê um vírus que compreende o vetor do décimo primeiro aspecto.
[0036] Em um décimo terceiro aspecto, a invenção provê uma célula
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11/77 imune modificada pelo receptor de antígeno quimérico, em que a célula imune é transduzida com o ácido nucleico do décimo aspecto, ou o vetor de expressão do décimo primeiro aspecto ou o vírus do décimo segundo aspecto; ou expressa o receptor de antígeno quimérico do nono aspecto na superfície; de um modo preferido, a célula imune é: um linfócito T, uma célula NK ou um linfócito NKT.
[0037] Em uma modalidade específica, a célula imune porta adicionalmente uma sequência de codificação de uma citocina exógena; ou a célula imune expressa adicionalmente outro receptor de antígeno quimérico que não contém CD3Ç; ou a célula imune expressa adicionalmente um receptor de quimiocina; de um modo preferido, o receptor de quimiocina compreende CCR; ou a célula imune expressa adicionalmente um siRNA que reduz a expressão de PD-1 ou uma proteína que bloqueia PD-L1; ou PD-1 endógeno na célula imune é eliminado pela tecnologia de edição de genes; ou a célula imunológica expressa adicionalmente um interruptor de segurança.
[0038] Em um décimo quarto aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica, compreendendo:
o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto ou um ácido nucleico que codifica o anticorpo; ou o imunoconjugado do sétimo aspecto ou um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado; ou o receptor de antígeno quimérico do nono aspecto ou um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico; ou a célula imune modificada pelo receptor de antígeno quimérico do décimo terceiro aspecto;
e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 18/107 /77 [0039] Em um décimo quinto aspecto, a invenção provê um kit, compreendendo:
um recipiente e a composição farmacêutica do décimo quarto aspecto no recipiente; ou um recipiente e o anticorpo do primeiro ao terceiro aspecto ou um ácido nucleico que codifica o anticorpo no recipiente; ou o imunoconjugado do sétimo aspecto ou um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado; ou o receptor de antígeno quimérico do nono aspecto ou um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico; ou a célula imune modificada pelo receptor de antígeno quimérico do décimo terceiro aspecto.
[0040] Em um décimo sexto aspecto, a invenção provê o uso do anticorpo dos primeiro ao terceiro aspectos ou de um ácido nucleico que codifica o anticorpo; ou o imunoconjugado do sétimo aspecto ou um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado; ou o receptor de antígeno quimérico do nono aspecto ou um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico; ou o uso da célula imune modificada por receptor de antígeno quimérico do décimo terceiro aspecto para o tratamento de um tumor que expressa IL-13RA2, de um modo preferido, o tumor que expressa IL-13RA2 é câncer cerebral, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer renal, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer intestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireóide, câncer de próstata e sarcoma de Kaposi. De um modo mais preferido, o câncer cerebral é selecionado dentre astrocitoma, meningioma, oligodendroglioma e glioma.
[0041] Deve ser entendido que todos os vários recursos técnicos descritos acima e especificamente descritos a seguir (como exemplos) podem ser combinados entre si dentro do escopo da invenção, de modo a formar soluções técnicas novas ou preferidas. Devido a limitações de espaço, elas
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13/77 não estão mais esgotadas uma a uma.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0042] A Figura 1 mostra um eletroferograma de SDS (condições de redução) de IL-13RA2_huFc e IL13RAl_huFc.
[0043] A Figura 2 mostra a detecção da ligação de 31C2 e 32H4 a IL13RA2 e IL13Ral por ELISA.
[0044] A Figura 3 mostra a detecção da ligação dos anticorpos 31C2 e 32H4 à IL-13RA2 murina por ELISA.
[0045] A Figura 4 mostra a detecção da ligação dos anticorpos 31C2 e 32H4 a células U251 (positivas para IL-13RA2) e 293T (negativas para IL13RA2) por FACs.
[0046] A Figura 5 mostra a detecção da afinidade dos anticorpos 31C2 e 32H4 (scFv_Fc) por Biacore.
[0047] A Figura 6 mostra a detecção de EC50 da ligação dos anticorpos 31C2 e 32H4 às células U215 por FACs.
[0048] A Figura 7 mostra informações do primer para maturação por afinidade.
[0049] A Figura 8 mostra a constante de dissociação Kd de 10 clones rastreados após maturação por afinidade.
[0050] A Figura 9A mostra o alinhamento da sequência de cadeia pesada dos clones amadurecidos por afinidade de 31C2, a Figura 9B mostra as sequências de HCDR1 e HCDR2 dos clones amadurecidos por afinidade de 31C2, a Figura 9C mostra o alinhamento da sequência de cadeia pesada dos clones amadurecidos por afinidade de 32H4 e a Figura 9D mostra sequências de HCDR1 e HCDR2 de clones amadurecidos por afinidade de 32H4.
[0051] A Figura 10A mostra as constantes de associação e dissociação de anticorpos amadurecidos por afinidade; e a Figura 10B mostra os resultados de identificação específicos dos anticorpos 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3elBll.
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 20/107 /77 [0052] A Figura 11A mostra os resultados dos rendimentos das formas scFv_Fc dos anticorpos em sistemas de expressão de 30 ml e o ensaio de grau de agregação de produtos purificados após maturação por afinidade; as Figuras 11B a G mostram a afinidade das formas scFv_Fc dos anticorpos; e a Figura 11H mostra os resultados das constantes de associação e dissociação dos anticorpos.
[0053] A Figura 12 mostra EC50 de ligação de formas scFv_Fc dos anticorpos 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 e 1B11 a células U251.
[0054] A Figura 13 mostra a atividade de morte in vitro de diferentes células CAR-T.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0055] Os inventores obtêm anticorpos que reconhecem especificamente IL-13RA2, compreendendo anticorpos de cadeia única e anticorpos humanizados, por intensa pesquisa e triagem. O anticorpo da invenção pode ser utilizado para preparar vários medicamentos antitumorais direcionados, bem como medicamentos para diagnosticar um tumor.
[0056] Para facilitar a compreensão da invenção, alguns termos são definidos primeiro.
[0057] O termo “IL-13RA2”, também referido aqui como CD213A2, é uma subunidade do complexo receptor de interleucina-13. É uma proteína transmembranar que consiste em 380 resíduos de aminoácidos (Sequência de Referência NCBI: NP_000631.1). É semelhante à IL-13RA1 (Sequência de Referência NCBI: NP_001551.1) e se liga fortemente à IL-13, mas não tem domínio de sinalização intracelular.
[0058] O termo “anticorpo” aqui se refere a uma proteína de ligação ao antígeno de um sistema imunológico; e compreende um anticorpo intacto de comprimento total com uma região de ligação ao antígeno e também um fragmento com uma “porção de ligação ao antígeno” ou uma “região de ligação ao antígeno”, ou uma cadeia única do mesmo, como um fragmento
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15/77 variável de cadeia única (scFv), também como uma variante do anticorpo aqui provido. O fragmento de anticorpo inclui, mas não está limitado a: (i) um fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI e inclui Fab’ e Fab’-SH, (ii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI , (iii) um fragmento Fv consistindo em domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) um fragmento de dAb consistindo em uma única região variável (Ward et al., 1989, Nature 341: 544 a 546); (v) um fragmento F(ab’) 2 que é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados; (vi) um local de ligação ao antígeno da molécula Fv de cadeia única; (vii) um dímero Fv biespecífico de cadeia única (PCI7US92/09965); (viii) “diacorpo” ou “triacorpo”, um fragmento multivalente ou multiespecífico construído por fusão genética; e (ix) um scFv fundido geneticamente ao mesmo ou a um anticorpo diferente.
[0059] O termo “Fc” ou “região Fc” neste documento compreende um polipeptídeo que compreende uma região constante de anticorpo diferente do primeiro domínio de imunoglobulina da região constante. Assim, Fc se refere aos dois últimos domínios de imunoglobulina da região constante de IgA, IgD e IgG, os três últimos domínios de imunoglobulina da região constante de IgE e IgM e dobradiças flexíveis nos terminais N desses domínios. Para IgA e IgM, Fc pode compreender a cadeia J. Para IgG, Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cy2 e Cy3, e uma articulação entre Cyl e Cy2. Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida como compreendendo o resíduo C226 ou P230 em seu terminal carboxi, em que a numeração é baseada no índice da UE de Kabat. Para IgGl humana, Fc é aqui definido para compreender o resíduo P232 ao seu terminal carboxi, em que a numeração é baseada no índice da UE de Kabat. Fc pode se referir a uma região isolada ou a uma região em um ambiente de polipeptídeo Fc (como um anticorpo). A “dobradiça” acima mencionada compreende um polipeptídeo flexível contendo aminoácidos
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 22/107 /77 entre o primeiro e o segundo domínios constantes do anticorpo. Estruturalmente, o domínio IgG CHI termina na posição EU220 e o domínio IgG CH2 começa no resíduo EU237. Assim, para IgG, a dobradiça de anticorpo aqui definida é definida para compreender as posições 221 (D221 de IgGl) a 231 (A231 de IgGl), em que a numeração é baseada no índice da UE de Kabat.
[0060] O termo “variante” se refere a um ou mais polipeptídeos ativos que têm substancialmente a mesma sequência de aminoácidos, ou são codificados por substancialmente a mesma sequência de nucleotídeos, como a sequência do anticorpo provida no presente pedido. A variante tem a mesma atividade ou similar ao anticorpo provido nos exemplos do presente pedido.
[0061] Uma variante tem pelo menos uma modificação de aminoácido em comparação com um anticorpo parental. Em uma modalidade específica, a sequência variante aqui de um modo preferido tem pelo menos cerca de 80%, de um modo mais preferido pelo menos cerca de 90%, de um modo mais preferido pelo menos cerca de 95%, de um modo mais preferido pelo menos cerca de 98% e de um modo mais preferido pelo menos cerca de 99% de identidade da sequência de aminoácido com a sequência do anticorpo parental. A variante pode se referir ao próprio anticorpo e também pode se referir a uma composição compreendendo um anticorpo parental. O termo “modificação de aminoácidos” compreende substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos, uma “substituição de aminoácidos” significa uma substituição de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental por outro aminoácido, uma “inserção de aminoácidos” significa uma adição de um aminoácido em uma posição específica em uma sequência polipeptídica parental, e uma “exclusão de aminoácido” ou “exclusão” significa remoção de um aminoácido em uma posição específica na sequência polipeptídica parental.
[0062] Uma “modificação de aminoácido” pode ser introduzida no
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17/77 anticorpo da invenção por técnicas padrão conhecidas na técnica, como mutagênese dirigida ao local e mutagênese mediada por PCR. Uma substituição conservadora de aminoácidos é uma substituição na qual um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias compreendem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), com cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), com cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, serina, treonina, tirosina, cisteína e triptofano), com cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina e metionina), com cadeias laterais ramificadas β (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e com cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos nas regiões CDR ou nas regiões estruturais do anticorpo da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos pertencentes às mesmas famílias de cadeias laterais, e a função retida pelo anticorpo alterado (anticorpo variante) pode ser testada. [0063] O termo “anticorpo parental”, como mencionado acima, refere-se a um anticorpo provido pelo presente pedido ou a um anticorpo obtido por mutação, maturação por afinidade ou outros meios de processamento com base no anticorpo provido pelo presente pedido e, de um modo preferido, refere-se aos anticorpos mostrados nos exemplos. O anticorpo parental pode ser um anticorpo que ocorre naturalmente ou uma versão variante ou modificada de um anticorpo que ocorre naturalmente. Um anticorpo parental pode se referir ao próprio anticorpo, uma composição que compreende o anticorpo parental ou a sequência de aminoácidos codificadora do anticorpo parental.
[0064] O termo “determinante antigênico”, conforme usado aqui,
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18/77 também referido como epítopo antigênico, pode ser composto por uma sequência contígua da sequência da proteína IL-13RA2 ou pode ser composto por uma estrutura tridimensional não contígua da sequência de proteína IL-13RA2.
Anticorpo anti-IL-13RA2 [0065] Na presente divulgação, uma proteína de ligação ao antígeno, incluindo um anticorpo, tendo uma região de ligação ao antígeno com base no scFv, é descrita. O scFv foi selecionado a partir da biblioteca de exibição de fagos de scFv humano usando IL-13RA2 recombinante. Essas moléculas exibem especificidade fina. Por exemplo, o anticorpo reconhece apenas IL13RA2 e não reconhece IL-13RA1. Na invenção, IL-13RA2 se refere a IL13RA2 humana, a menos que especificado de outra forma.
[0066] Em algumas modalidades, a invenção abrange um anticorpo com uma sequência de scFv fundida com uma ou mais regiões constantes da cadeia pesada para formar um anticorpo com uma região Fc de imunoglobulina humana para produzir uma proteína bivalente, aumentando assim a afinidade e estabilidade gerais do anticorpo. Além disso, a porção Fc permite a conjugação direta de outras moléculas (incluindo, entre outros, corantes fluorescentes, citotoxinas, radioisótopos, etc.) a, por exemplo, anticorpos utilizados no estudo de quantificação de antígenos, a fim de imobilizar os anticorpos para medição de afinidade, para entrega direcionada de um agente terapêutico, para detecção de citotoxicidade mediada por Fc usando células efetoras imunológicas e muitas outras aplicações.
[0067] Os resultados aqui apresentados destacam a especificidade, sensibilidade e utilidade do anticorpo da invenção no direcionamento para IL-13RA2.
[0068] A molécula da invenção é baseada em um fragmento variável de cadeia única (scFv) identificado e selecionado usando a exibição de fagos, a sequência de aminoácidos do fragmento variável de cadeia única confere
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[0069] Em uma modalidade em que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo de comprimento total, as cadeias pesada e leve do anticorpo da invenção podem ser de comprimento total (por exemplo, o anticorpo pode compreender pelo menos uma, de um modo preferido duas, cadeias pesadas intactas e pelo menos uma, de um modo preferido, duas cadeias leves intactas); ou uma fração de ligação ao antígeno (Fab, F(ab’)2, Fv ou scFv) pode estar abrangida. Em outras modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é selecionada dentre, por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgD e IgE. A escolha do tipo de anticorpo dependerá da função efetiva do sistema imunológico que o anticorpo projetado pretende provocar. Sequências de aminoácidos adequadas para as regiões constantes de vários isotipos de imunoglobulina e métodos para a produção de uma ampla variedade de anticorpos na construção de imunoglobulinas recombinantes são conhecidas pelos especialistas na técnica.
[0070] Em um primeiro aspecto, a invenção provê um anticorpo para identificar especificamente IL-13RA2, que tem uma afinidade de ligação relativa EC50 menor que 100 nM, de um modo preferido menor que 10 nM, de um modo mais preferido 0,1 a 1 nM e de um modo mais preferido 0,3 a 0,6 nM, para células U251 transfectadas estavelmente com IL-13RA2
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20/77 humana.
[0071] Em uma modalidade preferida, o anticorpo de IL-13RA2 provido pela invenção compreende: uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou 12. Em outra modalidade preferida, o anticorpo que se liga à IL-13RA2 provido pela invenção compreende: uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 16. Em outra modalidade preferida, a invenção provê um anticorpo que se liga a IL-13RA2 compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e/ou uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e/ou uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou 12, e uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e/ou uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 e/ou uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou 16. De um modo preferido, o anticorpo que se liga à IL-13RA2 compreende HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 10, HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 11, LCDR1 mostrado na SEQ ID NO : 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 15; ou compreende HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 10, HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 12, LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 16.
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21/77 [0072] De um modo mais preferido, o anticorpo que se liga a IL13RA2 compreende HCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 10, HCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 12, LCDR1 mostrado na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrado na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrado na SEQ ID NO: 16.
[0073] Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo que se liga a IL-13RA2, e a região variável de cadeia pesada do anticorpo é selecionada a partir de uma sequência da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de uma variante de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6.
[0074] Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga à IL-13RA2, compreendendo uma sequência de região variável de cadeia leve selecionada a partir da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 8.
[0075] Dado que essas sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem se ligar à IL-13RA2 individualmente, as sequências das regiões variáveis das cadeias pesada e leve podem ser “misturadas e combinadas” para produzir a molécula de ligação anti-IL-13RA2 da invenção. [0076] Em outro aspecto, a invenção provê uma variante de um anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga à IL-13RA2. Assim, a invenção provê um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo uma região variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve que é pelo menos 80% idêntica a uma sequência de região variável de cadeia pesada ou leve. De um modo preferido, a identidade da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada e/ou leve é de pelo menos 85%, de um modo mais preferido pelo menos 90%, de um modo mais preferido pelo menos 95%, particularmente 96%, mais particularmente 97%, ainda mais particularmente 98%, mais particularmente 99%, incluindo, por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100%. A variante pode ser obtida por rastreamento da biblioteca de leveduras,
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22/77 rastreamento da biblioteca de fagos, mutação pontual e outros meios, utilizando o anticorpo no presente pedido como um anticorpo parental.
[0077] Em outro aspecto, a invenção provê um anticorpo para identificar o mesmo determinante antigênico que o anticorpo anti-IL-13RA2 descrito acima.
Propriedades do anticorpo anti-IL-13RA2 [0078] Os ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de um anticorpo, como um anticorpo contra IL-13RA2, são conhecidos na técnica e compreendem, por exemplo, análises por ELISA, biacore, Western blot e citometria de fluxo. Ensaios adequados são descritos em detalhes nos exemplos.
Ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras [0079] A invenção provê adicionalmente um ácido nucleico e um vetor que codifica um anticorpo e fragmento do mesmo que se liga à IL13RA2; e uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o vetor. O ácido nucleico pode estar localizado em uma célula intacta e em um lisado celular, ou presente em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente purificada.
[0080] O ácido nucleico da invenção pode ser obtido usando técnicas padrão de biologia molecular, por exemplo, por técnicas padrão de amplificação por PCR ou clonagem de cDNA para obter cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada ou os segmentos VH e VL do anticorpo. Para um anticorpo obtido a partir de bibliotecas de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando a tecnologia de exibição de fagos), um ou mais ácidos nucleicos que codificam o anticorpo podem ser recuperados da biblioteca. Um método para introduzir um ácido nucleico exógeno em uma célula hospedeira é bem conhecido na técnica e pode variar com a célula hospedeira utilizada.
[0081] Moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são aquelas que codificam uma região variável de cadeia leve selecionada dentre
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SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 7 e/ou uma região variável de cadeia pesada selecionada dentre SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. Mais preferida é uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de cadeia pesada de SEQ ID NO: 5 e uma sequência de cadeia leve de SEQ ID NO: 7.
[0082] Para expressão de uma proteína, um ácido nucleico que codifica o anticorpo da invenção pode ser integrado em um vetor de expressão. Uma variedade de vetores de expressão está disponível para expressão de proteínas. Os vetores de expressão podem compreender vetores extra-cromossômicos auto-replicantes ou vetores integrados ao genoma do hospedeiro. Os vetores de expressão para uso na invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles que permitem a expressão de proteínas em células de mamíferos, bactérias, células de insetos, leveduras e sistemas in vitro. Como é conhecido na técnica, uma variedade de vetores de expressão está disponível comercialmente ou é obtida de outras maneiras, e pode ser utilizada na invenção para expressar anticorpos.
Imunoconjugados [0083] A invenção provê adicionalmente um imunoconjugado multifuncional que compreende o anticorpo aqui descrito e que compreende adicionalmente pelo menos outro tipo de molécula funcional. A molécula funcional é selecionada a partir de, mas não se limita a, uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral, uma molécula que inibe um tumor, uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície celular imune ou um marcador detectável. O anticorpo e a molécula funcional podem constituir um conjugado por ligação covalente, acoplamento, ligação, reticulação e semelhantes.
[0084] Em um modo preferido, o imunoconjugado pode compreender: um anticorpo da invenção e pelo menos uma molécula que tem como alvo um
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24/77 marcador de superfície tumoral ou uma molécula que inibe um tumor. A molécula que inibe um tumor pode ser uma citocina antitumoral ou uma toxina antitumoral; de um modo preferido, a citocina inclui, mas não está limitada a IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN tipo I e TNF-alfa. Em uma modalidade específica, a molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral é uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície do mesmo tumor para o qual o anticorpo da invenção é direcionado. Por exemplo, a molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral pode ser um anticorpo ou ligando que se liga a um marcador de superfície tumoral, por exemplo, essa molécula pode cooperar com o anticorpo da invenção para atingir mais precisamente as células tumorais. Opcionalmente, [0085] Como uma modalidade preferida, o imunoconjugado pode compreender: um anticorpo da invenção e um marcador detectável. O marcador detectável inclui, mas não está limitado a, um marcador fluorescente, um marcador cromogênico; tal como uma enzima, um grupo protético, um material fluorescente, um material luminescente, um material bioluminescente, um material radioativo, um metal emissor de positron e um íon metálico paramagnético não radioativo. Mais de um marcador também pode ser incluído. O marcador usado para marcar o anticorpo para fins de detecção e/ou análise e/ou diagnóstico depende das técnicas particulares de detecção/análise/diagnóstico e/ou métodos utilizados, como coloração imunohistoquímica de amostras de tecidos, citometria de fluxo e similares. Marcadores adequados para técnicas de detecção/análise/diagnóstico e/ou métodos conhecidos na técnica são bem conhecidos das pessoas versadas na técnica.
[0086] Como um modo preferido, o imunoconjugado pode compreender: um anticorpo da invenção e uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície celular imune. A molécula que tem como alvo um
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25/77 marcador de superfície celular imune pode ser um anticorpo ou um ligando que se liga a um marcador de superfície celular imune, e essa molécula é capaz de reconhecer a célula imune, transportando desse modo o anticorpo da invenção para a célula imune, então o anticorpo da invenção pode direcionar a célula imune para células tumorais, induzindo assim a morte de tumores específicos para células imunes. O marcador de superfície da célula imune pode ser selecionado a partir de CD3, CD16 e CD28 e, de um modo mais preferido, um anticorpo que se liga ao marcador de superfície da célula imune é um anticorpo anti-CD3. A célula imune pode ser selecionada dentre uma célula T, uma célula NK e uma célula NKT.
[0087] Por meio da produção química de um imunoconjugado por conjugação direta ou indireta (por exemplo, através de um ligando), o imunoconjugado pode ser produzido como uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo da invenção e outra proteína adequada. A proteína de fusão pode ser produzida por um método conhecido na técnica, por exemplo, produzido de forma recombinante, construindo e expressando subsequentemente uma molécula de ácido nucleico, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo em conformidade com a estrutura de leitura e uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador adequado.
[0088] Outro aspecto da invenção provê uma molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos um anticorpo, uma variante funcional ou um imunoconjugado da mesma da invenção. Uma vez obtida a sequência relevante, o método de recombinação pode ser utilizado para obter a sequência relevante em grandes quantidades. Isso geralmente é feito clonando a sequência em um vetor, transferindo-a para uma célula e depois isolando a sequência relevante da célula hospedeira proliferada por métodos convencionais.
[0089] Em outro aspecto, a invenção provê um receptor de antígeno
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26/77 quimérico compreendendo um domínio de ligação extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracelular. O termo “receptor de antígeno quimérico (CAR)” usado aqui se refere a um domínio de ligação a antígeno tumoral fundido a um domínio de transdução de sinal intracelular, que pode ativar células T. Tipicamente, o domínio de ligação extracelular do CAR é derivado de um camundongo ou anticorpo monoclonal humanizado ou humano.
[0090] O domínio de ligação extracelular é um anticorpo da invenção e exemplos não limitativos compreendem um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno (Fab) selecionado a partir de uma biblioteca, um fragmento de domínio único ou um ligando natural que se envolve com o receptor homólogo. Em algumas modalidades, a região de ligação ao antígeno extracelular pode compreender um scFv, Fab ou um ligando natural, bem como qualquer derivado do mesmo. A região de ligação ao antígeno extracelular pode se referir a uma molécula que não seja um anticorpo intacto, que pode compreender uma porção do anticorpo intacto e pode se ligar a um antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo podem incluir, mas não estão limitados a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; um anticorpo bifuncional, um anticorpo linear; uma molécula de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e um anticorpo multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticorpo.
[0091] A região de ligação ao antígeno extracelular, como scFv, Fab ou um ligando natural, pode ser parte de um CAR que determina a especificidade do antígeno. A região de ligação ao antígeno extracelular pode se ligar a qualquer alvo complementar. A região de ligação ao antígeno extracelular pode ser derivada de um anticorpo da sequência de região variável conhecida. A região de ligação ao antígeno extracelular pode ser obtida a partir de uma sequência de anticorpos obtida a partir de um
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27/77 hibridoma de camundongo disponível. Altemativamente, a região de ligação ao antígeno extracelular pode ser obtida a partir de toda a sequência de clivagem externa para uma célula tumoral ou uma célula primária, como um linfócito infiltrante de tumor (TIL).
[0092] Em algumas modalidades, a especificidade de ligação da região de ligação ao antígeno extracelular pode ser determinada por uma região determinante de complementaridade ou CDR, como uma CDR de cadeia leve ou uma CDR de cadeia pesada. Em muitos casos, a especificidade de ligação pode ser determinada pela CDR da cadeia leve e pela CDR da cadeia pesada. Uma combinação de uma determinada CDR da cadeia pesada e uma CDR da cadeia leve pode prover uma bolsa de ligação que pode conferir maior afinidade e/ou especificidade para um antígeno do que outros antígenos de referência.
[0093] Em certos aspectos de qualquer uma das modalidades divulgadas neste documento, a região de ligação ao antígeno extracelular, por exemplo, scFv, pode compreender uma CDR de cadeia leve específica para um antígeno. A CDR da cadeia leve pode ser uma região determinante de complementaridade de uma cadeia leve de scFv de um anticorpo, como um CAR. A CDR da cadeia leve pode compreender uma sequência contígua de resíduos de aminoácidos, ou duas ou mais sequências contíguas de resíduos de aminoácidos separadas por uma região determinante de não complementaridade (por exemplo, uma região estrutural). Em algumas modalidades, uma CDR da cadeia leve pode compreender duas ou mais CDRs da cadeia leve, que podem ser referidas como CDR-1, CDR-2 da cadeia leve e similares. Em algumas modalidades, a CDR da cadeia leve pode compreender três CDRs da cadeia leve, que podem ser referidas como CDR-1 da cadeia leve, CDR-2 da cadeia leve e CDR-3 da cadeia leve, respectivamente. Em alguns exemplos, um conjunto de CDRs presentes em uma cadeia leve comum pode ser coletivamente referido como CDR de cadeia leve.
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28/77 [0094] Em certos aspectos de qualquer uma das modalidades divulgadas neste documento, a região de ligação ao antígeno extracelular, por exemplo, scFv, pode compreender uma CDR de cadeia pesada que é específica para um antígeno. A CDR da cadeia pesada pode ser uma região determinante da complementaridade da cadeia pesada de um anticorpo, como um scFv. A CDR da cadeia pesada pode compreender uma sequência contígua de resíduos de aminoácidos, ou duas ou mais sequências contíguas de resíduos de aminoácidos separadas por uma região determinante de não complementaridade (por exemplo, uma região estrutural). Em algumas modalidades, a CDR da cadeia pesada pode compreender duas ou mais CDRs da cadeia pesada, que podem ser chamadas de CDR-1, CDR-2 da cadeia pesada e similares. Em algumas modalidades, a CDR da cadeia pesada pode compreender três CDRs da cadeia pesada, que podem ser referidas como CDR-1 da cadeia pesada, CDR-2 da cadeia pesada e CDR-3 da cadeia pesada, respectivamente. Em algumas modalidades, um conjunto de CDRs presentes em uma cadeia pesada comum pode ser coletivamente referido como uma CDR de cadeia pesada.
[0095] A região de ligação ao antígeno extracelular pode ser modificada de várias maneiras por engenharia genética. Em algumas modalidades, a região de ligação ao antígeno extracelular pode ser mutada, de modo que a região de ligação ao antígeno extracelular possa ser selecionada para ter uma maior afinidade para seu alvo. Em algumas modalidades, a afinidade da região de ligação ao antígeno extracelular para seu alvo pode ser otimizada para o alvo que pode ser expresso em um nível baixo em um tecido normal. Essa otimização pode ser realizada para minimizar a potencial toxicidade. Em outros casos, os clones da região de ligação ao antígeno extracelular com uma afinidade mais alta para uma forma ligada à membrana de um alvo podem ser preferidos em relação à contraparte de uma forma solúvel do alvo. Esta modificação pode ser feita porque diferentes níveis de
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29/77 uma forma solúvel do alvo também podem ser detectados e o direcionamento para essa forma pode causar toxicidade indesejável.
[0096] Em algumas modalidades, a região de ligação ao antígeno extracelular compreende uma dobradiça ou um espaçador. Os termos dobradiça e espaçador são usados de forma intercambiável. A dobradiça pode ser considerada como parte do CAR para conferir flexibilidade à região de ligação ao antígeno extracelular. Em algumas modalidades, a dobradiça pode ser usada para detectar um CAR na superfície celular de uma célula, particularmente quando um anticorpo para detectar a região de ligação ao antígeno extracelular é ineficaz ou não está disponível. Por exemplo, o comprimento da dobradiça derivada de uma imunoglobulina pode precisar ser otimizado, dependendo da localização de um epítopo em um alvo que é direcionado pela região de ligação ao antígeno extracelular.
[0097] Em algumas modalidades, a dobradiça pode não pertencer a uma imunoglobulina, mas pertencer a outra molécula, como uma dobradiça nativa de uma molécula de CD8oc. A dobradiça CD8oc pode conter resíduos de cisteína e prolina conhecidos por desempenhar um papel na interação do correceptor CD8 e da molécula MHC. Os resíduos de cisteína e prolina podem afetar o desempenho do CAR.
[0098] A dobradiça do CAR pode ser ajustável em tamanho. Essa morfologia de uma sinapse imunológica entre uma célula de resposta imune e uma célula alvo também define uma distância que não pode ser funcionalmente interligada pelo CAR devido a um epítopo da membrana distai em uma molécula alvo da superfície celular, caso em que até o uso de um CAR de dobradiça curta não permite que a distância sináptica atinja um valor aproximado no qual a sinalização pode ser realizada. Da mesma forma, para o epítopo antigênico alvo de CAR proximal da membrana, a saída de sinal é observada apenas no contexto de um CAR de dobradiça longa. A dobradiça pode ser ajustada dependendo da região de ligação ao antígeno
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30/77 extracelular usada. A dobradiça pode ter qualquer comprimento.
[0099] O domínio transmembranar pode ancorar um CAR na membrana plasmática da célula. A porção transmembranar natural do CD28 pode ser usada para um CAR. Em outros casos, a porção transmembranar natural de CD8oc também pode ser usada no CAR. “CD8” pode ser uma proteína com pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com 0 número de referência NCBI: NP_001759 ou um fragmento do mesmo com atividade estimulante. Uma “molécula de ácido nucleico CD8” pode ser um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CD8 e, em certos casos, a região transmembranar pode ser uma porção transmembranar natural de CD28, e “CD28” pode se referir a uma proteína com pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com 0 número de referência NCBI: NP_006130 ou um fragmento do mesmo com atividade estimulante. Uma “molécula de ácido nucleico CD28” pode ser um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo CD28. Em algumas modalidades, a porção transmembranar pode compreender uma região CD8oc. [00100] A região de sinalização intracelular de um CAR pode ser responsável por ativar pelo menos uma das funções efetoras das células de resposta imune nas quais 0 CAR foi colocado. Um CAR pode induzir funções efetoras das células T, por exemplo, a função efetora é a atividade citolítica ou atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Assim, 0 termo região de sinalização intracelular se refere a uma porção de uma proteína que transduz um sinal de função efetora e direciona a célula para desempenhar uma função específica. Embora geralmente toda a região de sinalização intracelular possa ser usada, em muitos casos não é necessário usar toda a cadeia do domínio de sinalização. Em algumas modalidades, uma porção truncada de uma região de sinalização intracelular é usada. Em algumas modalidades, 0 termo região de sinalização intracelular se destina a incluir qualquer porção truncada de uma região de sinalização intracelular suficiente
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 37/107 /77 para transduzir um sinal de função efetora.
[00101] Exemplos preferidos de um domínio de sinalização para uso em um CAR podem incluir uma sequência citoplasmática de um receptor de célula T (TCR) e um correceptor que age sinergicamente para iniciar a transdução de sinal após a ligação ao receptor alvo, bem como qualquer sequência derivada ou variante de ambos e de qualquer sequência sintética dessas sequências que tenham a mesma funcionalidade.
[00102] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular pode conter um motivo de sinal conhecido de um motivo de ativação de tirosina imunorreceptora (ITAM). Exemplos de ITAMs contendo sequências de sinalização citoplasmáticas incluem aqueles derivados de TCRÇ, FcRy, FcRp, CD3y, CD3ó, CD3e, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. No entanto, em uma modalidade preferida, o domínio de sinalização intracelular é derivado de uma cadeia ϋϋ3ζ.
[00103] Um exemplo de um domínio de sinalização de células T contendo um ou mais motivos ITAM é o domínio Εϋ3ζ, também conhecido como cadeia do receptor de células T Τ3ζ ou CD247. Esse domínio faz parte de um complexo receptor de células T-CD3 e desempenha um papel importante na combinação do reconhecimento de antígenos de várias vias de transdução de sinal intracelular com a principal ativação efetora de células T. Como aqui utilizado, Εϋ3ζ se refere principalmente a CD3Ç humano e suas isoformas, como conhecido a partir da entrada Swissprot P20963, incluindo uma proteína que tem substancialmente a mesma sequência. Como parte do receptor de antígeno quimérico, é reiterado que a cadeia Τ3ζ do receptor de célula T completa não é necessária e que qualquer derivado compreendendo o domínio de sinalização da cadeia Τ3ζ do receptor de célula T é adequado, incluindo qualquer equivalente funcional do mesmo.
[00104] O domínio de sinalização intracelular pode ser selecionado a partir de qualquer um dos domínios da Tabela 1. Em algumas modalidades, o
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32/77 domínio pode ser modificado para que a identidade do domínio de referência possa variar de cerca de 50% a cerca de 100%. Qualquer domínio da Tabela 1 pode ser modificado para que a forma modificada possa compreender cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou até cerca de 100% de identidade.
[00105] Uma região de sinalização intracelular de um CAR pode adicionalmente compreender um ou mais domínios coestimulatórios. A região de sinalização intracelular pode compreender um único domínio coestimulador, como uma cadeia ζ (CAR de primeira geração) ou mais CD28 ou 4-1BB (CAR de segunda geração). Em outros exemplos, a região de sinalização intracelular pode compreender dois domínios coestimulatórios, como CD28/OX40 ou CD28/4-1BB (terceira geração).
[00106] Juntamente com os domínios de sinalização intracelular, como o CD8, esses domínios coestimulatórios podem gerar ativação a jusante das vias da quinase, suportando assim a transcrição de genes e respostas celulares funcionais. Os domínios coestimulatórios dos CARs podem ativar as proteínas de sinal proximal associadas à ativação da via CD28 (fosfatidilinositol-4,5-difosfato 3-quinase) ou da via 4-1BB/OX40 (adaptador de fator associado ao receptor de TNF), bem como MAPK e Akt.
[00107] Em certos casos, os sinais gerados pelo CAR podem ser combinados com sinais auxiliares ou coestimulatórios. Para domínios de sinalização coestimulatórios, complexos quiméricos do tipo receptor de antígeno podem ser projetados para conter vários domínios de sinalização coestimulatórios possíveis. Como bem conhecido na técnica, em células T naive, o envolvimento individual de receptores de células T não é suficiente para induzir a ativação completa de células T em células T citotóxicas. Um segundo sinal coestimulatório é necessário para a ativação produtiva completa das células T. Foi relatado que vários receptores proveem coestimulação para a ativação de células T, incluindo, entre outros, CD28, 0X40, CD27, CD2,
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CD5, ICAM-1, LFA-1 (CDlla/CD18), 4-1BBL, MyD88 e 4-1BB. As vias de sinalização usadas por essas moléculas coestimulatórias podem atuar sinergicamente com o principal sinal de ativação do receptor de células T. Os sinais providos por essas regiões de sinalização coestimulatórias podem atuar sinergicamente com os principais sinais de ativação efetor derivados de um ou mais motivos ITAM (por exemplo, o domínio de transdução de sinal CD3zeta) e podem atender aos requisitos para a ativação de células T.
[00108] Em algumas modalidades, a adição de um domínio coestimulatório a um complexo do tipo quimérico de receptor de antígeno pode melhorar a eficácia e a durabilidade das células manipuladas. Em algumas outras modalidades, o domínio de sinalização de células T e o domínio coestimulatório são fundidos um ao outro para formar uma região de sinalização.
Tabela 4. Domínios coestimulatórios
Marcador genético Abreviação Nome
CD27 CD27, T14, S152, Tp55, TNFRSF7, S152. LPFS2 Molécula de CD27
CD28 Γρ44, CD28, antígeno de CD28 Molécula de CD28
TNFRSF9 ILA, 4-1BB, CD137, CDwl37 Membro da superfamília 9 de receptores de fator de necrose tumoral
TNFRSF4 0X40, ACT35, CD134, IMD16, TXGPÍL Membro da superfamília 4 de receptores de fator de necrose tumoral
TNFRSF8 CD30, Ki-1, D1S166E Membro da superfamília 8 de receptores de fator de necrose tumoral
CD40LG IGM, IMD3, TRAP, gp39, CD 154, CD40L, HIGM1, T-BAM, TNFSF5, hCD40L Ligando de CD40
ICOS AILIM, CD278, CVID1 Indução coestimulatória de células T
ITGB2 LAD, CD18, MF17, MFI7, LCAMB, LFA-1, MAC-1 Integrina β2 (componente complementar 3 receptor 3 e 4 subunidades)
CD2 Til, SRBC, LFA-2 Molécula de CD2
CD7 GP40, TP41, Tp40, LEU-9 Molécula de CD7
KLRC2 NKG2C, CD 159c, NKG2-C Subfamília C do receptor semelhante a lecitina de células assassinas, membro 2
TNFRSF18 AITR, GITR, CD357, GITR-D Membro da superfamília 18 de receptores de fator de necrose tumoral
TNFRSF14 TR2, ATAR, HVEA, HVEM, CD270, LIGHTR Membro da superfamília 14 de receptores de fator de necrose tumoral
HAVCR1 TIM, KIMI, TIM1, CD365, HAVCR, KIM-1, TIM-1, TIMD1, TIMD-1, HAVCR-1 Receptor celular do vírus da hepatite A 1
LGALS9 HUAT, LGALS9A, Galectina-9 Lecitina, ligante ao galactosídeo, solúvel, 9
CD83 BL11, HB15 Molécula de CD83
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 40/107 /77 [00109] Um receptor de antígeno quimérico se liga a um antígeno alvo. Quando a ativação das células T é medida in vitro ou ex vivo, o antígeno alvo pode ser obtido ou isolado de várias fontes. Um antígeno alvo como aqui utilizado é um antígeno ou um epítopo antigênico no antígeno que é crítico em mamíferos para reconhecimento imunológico e eliminação ou controle final de fatores patogênicos ou estados de doença. O reconhecimento imunológico pode ser reconhecimento imunológico celular e/ou humoral. No caso de patógenos intracelulares e câncer, o reconhecimento imunológico pode ser, por exemplo, uma reação de linfócitos T.
[00110] Em algumas modalidades, um antígeno alvo compreende um antígeno associado a um estado pré-canceroso ou proliferativo. Um antígeno alvo também pode estar associado ou ser causado por câncer. Por exemplo, em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimérico da invenção reconhece e se liga a um antígeno tumoral compreendendo IL-13RA2, como descrito anteriormente.
[00111] Em algumas modalidades, quando um receptor de antígeno quimérico está presente na membrana plasmática de uma célula, se liga ao seu alvo e é ativado, a célula que expressa o receptor de antígeno quimérico pode provocar citotoxicidade na célula que leva o alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, quando o receptor de antígeno quimérico está presente em uma célula citotóxica, como uma célula NK ou uma célula T citotóxica, e ativada pelo alvo, a toxicidade da célula citotóxica para a célula alvo pode ser aumentada. Em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimérico neste documento pode aumentar o efeito de células imunorreativas em células que expressam IL-13RA2, como células tumorais. Em algumas modalidades, uma célula que expressa o receptor de antígeno quimérico aqui descrito aumenta o efeito citotóxico em células que expressam IL-13RA2 em pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, em pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos
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50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, em pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 1 vez, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes ou pelo menos 10 vezes do que um célula que não expressa aqui o receptor de antígeno quimérico.
[00112] Um transgene que codifica um receptor de ligação ao antígeno de interesse ou um CAR pode ser incorporado em uma célula. Por exemplo, o transgene pode ser incorporado em uma célula de resposta imune, como uma célula T. Quando inserido em uma célula, o transgene pode ser um fragmento de DNA complementar (cDNA) que é uma cópia de um RNA mensageiro (mRNA); ou o próprio gene (com ou sem introns) localizado na região original do seu DNA genômico.
[00113] Um ácido nucleico que codifica a sequência do transgene, como um DNA, pode ser inserido aleatoriamente no cromossomo da célula. A integração aleatória pode ser produzida por qualquer método que introduz um ácido nucleico, como um DNA, em uma célula. Por exemplo, o método pode incluir, mas não está limitado a, eletroporação, ultrassom, uso de uma pistola de genes, lipofecção, transfecção de fosfato de cálcio, uso de dendrímeros, microinjeção e uso de vetores virais, incluindo adenovirus, AAV e vetores retrovirais, e/ou ribozima do tipo II.
[00114] O DNA que codifica o transgene também pode ser projetado para compreender um gene repórter, de modo que a presença do transgene ou seu produto de expressão possa ser detectada pela ativação do gene repórter. Qualquer gene repórter pode ser usado, como os descritos acima. As células que contêm o transgene podem ser selecionadas selecionando células na cultura de células na qual o gene repórter foi ativado.
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36/77 [00115] A expressão de um CAR pode ser verificada por ensaios de expressão como qPCR ou medindo o nível de RNAs. O nível de expressão também pode indicar o número de cópias. Por exemplo, se o nível de expressão for muito alto, isso pode indicar que mais de uma cópia do CAR está integrada ao genoma. Alternativamente, alta expressão pode indicar que o transgene está integrado em uma região de alta transcrição, como próximo a um promotor de alta expressão. A expressão também pode ser verificada medindo os níveis de proteína, por exemplo, por Western blotting.
[00116] Em algumas modalidades, a célula de resposta imune da invenção pode compreender um ou mais transgenes. O um ou mais transgenes podem expressar uma proteína CAR que reconhece e se liga a pelo menos um epítopo em um antígeno ou se liga a um epítopo mutante no antígeno. O CAR pode ser um CAR funcional. Em algumas modalidades, as células de resposta imune da invenção podem compreender um ou mais CARs, ou podem compreender um único CAR e um receptor de engenharia secundário.
[00117] Em algumas modalidades, o transgene pode codificar um gene suicida. Como evidenciado por muitos tratamentos eficazes para pacientes com câncer, as células de resposta imune do CAR causam regressão tumoral, mas podem ser acompanhadas de toxicidade. Em algumas modalidades, quando um antígeno alvo existe tanto em tecidos normais quanto em células tumorais, as células de resposta imune do CAR podem não ser capazes de distinguir entre tumores e tecidos normais (“toxicidade no alvo/fora do alvo”). Em alguns outros casos, pode ocorrer um distúrbio sistêmico do sistema imunológico, chamado síndrome de liberação de citocinas (CRS). A CRS pode compreender uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica ou uma tempestade de citocinas, que pode ser uma consequência da rápida expansão das células de resposta imune do CAR in vivo. A CRS é um distúrbio distinguido por febre e hipotensão, que pode levar à falência de múltiplos órgãos em um caso sério. Na maioria dos casos, a toxicidade está associada à
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37/77 expansão in vivo de células de resposta imune infundidas com CAR, o que pode causar uma perturbação geral do sistema imunológico, bem como a liberação de altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como TNFoc e IL-6. O gene suicida pode induzir a eliminação de células imunorreativas ao CAR. O gene suicida pode ser qualquer gene que induza apoptose nas células imunorreativas para CAR. O gene suicida pode ser codificado no vetor viral juntamente com o receptor de ligação ao antígeno. A codificação do gene suicida permite a mitigação ou o término completo da toxicidade causada pela expansão in vivo das células de resposta imune CAR infundidas sob condições específicas.
[00118] Em algumas modalidades, as células imunorreativas ao CAR para antígenos que estão presentes nos tecidos normais podem ser produzidas de modo que expressem transitoriamente o CAR, por exemplo, após a introdução do mRNA que codifica o receptor por eletroporação. Além disso, um grande esforço para fortalecer adicionalmente mais as células imunorreativas ao CAR, incluindo uma chave de segurança, pode eliminar bastante as células imunorreativas ao CAR no caso de toxicidade alvo grave.
[00119] Em algumas modalidades, um vetor que codifica o CAR pode ser combinado com, por exemplo, um gene induzível da caspase-9 (ativado por um indutor químico dimérico) ou uma forma truncada do receptor de EGF R (ativado pelo anticorpo monoclonal cetuximab) ou interruptor de segurança RQR8.
[00120] Um ou mais dos transgenes aqui utilizados podem ser de espécies diferentes. Por exemplo, um ou mais dos transgenes podem compreender um gene humano, um gene de camundongo, um gene de rato, um gene porcino, um gene bovino, um gene de cachorro, um gene de gato, um gene de macaco, um gene de chimpanzé ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, um transgene pode ser de um humano com uma sequência genética humana. Um ou mais dos transgenes podem compreender
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38/77 um gene humano. Em certos casos, um ou mais dos transgenes não são genes adenovirais.
[00121] Como descrito acima, o transgene pode ser inserido no genoma da célula imunorreativa de maneira aleatória ou específica do local. Por exemplo, o transgene pode ser inserido no genoma de uma célula imune em um local aleatório. O transgene pode ser funcional, por exemplo, totalmente funcional quando inserido em qualquer local do genoma. Por exemplo, um transgene pode codificar seu próprio promotor ou pode ser inserido em uma posição controlada por um promotor endógeno. Alternativamente, o transgene pode ser inserido em um gene, como em um íntron ou um éxon, um promotor ou uma região não codificante do gene. O transgene pode ser inserido para interromper um gene, como um ponto de verificação imune endógeno, por inserção.
[00122] Em algumas modalidades, uma ou mais cópias do transgene podem ser inseridas no genoma em vários locais aleatórios. Por exemplo, várias cópias podem ser inseridas no genoma em locais aleatórios. Isso pode resultar em um aumento na expressão geral em comparação com uma inserção aleatória do transgene. Altemativamente, uma cópia do transgene pode ser inserida em um gene e outra cópia do transgene pode ser inserida em um gene diferente. O transgene pode ser direcionado para que possa ser inserido no genoma da célula imunorreativa em um local específico.
[00123] Em algumas modalidades, um ácido polinucleico compreendendo uma sequência que codifica um receptor de ligação ao antígeno pode estar na forma de um vetor plasmídico. O vetor plasmídico pode compreender um promotor. Em certos casos, o promotor pode ser constitutivo. Em algumas modalidades, o promotor é indutível. O promotor pode ser ou pode ser derivado de CMV, U6, MND ou EFla. Em algumas modalidades, o promotor pode ser adjacente à sequência CAR. Em algumas modalidades, o vetor plasmídeo compreende adicionalmente um aceitador de
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39/77 emenda. Em algumas modalidades, o aceitador de emenda pode ser adjacente à sequência CAR. A sequência do promotor pode ser um promotor de PKG ou MND. O promotor MND pode ser um promotor sintético contendo a região U3 do MoMuLV LTR modificado com intensificador de vírus de sarcoma mieloproliferativo.
[00124] Em algumas modalidades, um ácido polinucleico que codifica um receptor de interesse pode ser projetado para ser entregue a uma célula por técnicas não virais. Em certos casos, o ácido polinucleico pode ser um reagente compatível com Boas Práticas de Fabricação (BPF).
[00125] A expressão de um ácido polinucleico que codifica um receptor de ligação ao antígeno de interesse ou um CAR pode ser controlada por um ou mais promotores. Os promotores podem ser onipresentes, constitutivos (promotores irrestritos, permitindo a transcrição contínua de genes relevantes), promotores específicos de tecidos ou promotores induzíveis. A expressão de um transgene inserido adjacente ou próximo a um promotor pode ser regulada. Por exemplo, um transgene pode ser inserido próximo ou ao lado de um promotor onipresente. Alguns promotores onipresentes podem ser o promotor CAGGS, o promotor hCMV, o promotor PGK, o promotor SV40 ou o promotor ROSA26.
[00126] Os promotores podem ser endógenos ou exógenos. Por exemplo, um ou mais dos transgenes podem ser inseridos adjacentes ou próximos ao promotor ROSA26 endógeno ou exógeno. Além disso, o promotor pode ser específico para células imunorreativas. Por exemplo, um ou mais dos transgenes podem ser inseridos adjacentes ou próximos ao promotor ROSA26 porcino.
[00127] Promotores específicos de tecido ou promotores específicos de célula podem ser usados para controlar a localização da expressão. Por exemplo, um ou mais dos transgenes podem ser inseridos adjacentes ou próximos a um promotor específico de tecido. Os promotores específicos de
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40/77 tecido podem ser o promotor FABP, o promotor Lck, o promotor CamKII, o promotor CD 19, o promotor de queratina, o promotor de albumina, o promotor aP2, o promotor de insulina, o promotor MCK, o promotor MyHC, o promotor WAP ou o promotor Col2A.
[00128] Promotores induzíveis também podem ser usados. Esses promotores induzíveis podem ser ligados e desligados adicionando ou removendo um indutor, se necessário. Espera-se que o promotor induzível seja, mas não limitado a, Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx e/ou Trex.
[00129] O termo “promotor induzível”, conforme usado neste documento, é um promotor controlado que não dirige a expressão ou conduz a baixa expressão de um gene operacionalmente ligado ao mesmo antes que a condição desejada seja atingida, e dirige a expressão ou alta expressão do gene operacionalmente ligado ao mesmo sob a condição desejada.
[00130] Além disso, embora não sejam essenciais para a expressão, as sequências transgênicas também podem compreender sequências reguladoras da transcrição ou da tradução, tais como promotores, intensificadores, isoladores, locais internos de entrada do ribossomo e sequências que codificam peptídeos 2A e/ou sinais de poliadenilação.
[00131] Em algumas modalidades, o transgene codifica um receptor de ligação ao antígeno de interesse ou um CAR, em que o transgene é inserido em um porto seguro para que o receptor de ligação ao antígeno seja expresso. Em algumas modalidades, o transgene é inserido no locus PD1 e/ou CTLA-4. Em outros casos, o transgene é entregue com um lentivírus a uma célula para inserção aleatória, enquanto uma nuclease específica de PD1- ou CTLA-4 pode ser provida como um mRNA. Em algumas modalidades, o transgene é entregue por um sistema de vetor viral, como retrovirus, AAV ou adenovirus, e um mRNA que codifica uma nuclease (por exemplo, AAVS1, CCR5, albumina ou HPRT) específica para um porto seguro. As células também
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41/77 podem ser tratadas com um mRNA que codifica uma nuclease específica de PD1 e/ou CTLA-4. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o CAR é provido junto com um mRNA que codifica uma nuclease específica de HPRT e uma nuclease específica de PD1- ou CTLA-4 por um sistema de entrega viral. Os CARs que podem ser utilizados com os métodos e composições aqui divulgados podem compreender todos os tipos dessas proteínas quiméricas.
[00132] Em algumas modalidades, um transgene pode ser introduzido em uma célula imunorreativa usando um vetor retroviral (γ-retroviral ou vetor lentiviral). Por exemplo, um transgene que codifica um CAR ou qualquer receptor de ligação ao antígeno, ou uma variante ou fragmento do mesmo, pode ser clonado em um vetor retroviral e pode ser acionado por um promotor endógeno, uma repetição terminal longa retroviral ou uma célula alvo específica do tipo promotor. Vetores não virais também podem ser usados. Os sistemas de entrega de vetores não virais podem compreender plasmídeos de DNA, ácidos nucleicos nus e ácidos nucleicos complexados com vetores de entrega, como lipossomos ou poloxâmeros.
[00133] Muitos sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para a transferência de genes para células de mamíferos. Por exemplo, os retrovirus proveem uma plataforma conveniente para sistemas de entrega de genes. O gene selecionado pode ser inserido em um vetor e empacotado em uma partícula retroviral usando técnicas conhecidas na arte. Os vetores derivados de retrovirus, como os lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar a transferência de genes a longo prazo, porque permitem a integração estável a longo prazo do transgene e sua propagação nas células filhas. Os vetores lentivirais têm uma vantagem adicional sobre vetores derivados de retrovirus, como o vírus da leucemia murina, na medida em que podem transduzir células não proliferativas. Eles também têm uma vantagem adicional de baixa imunogenicidade. Uma vantagem dos vetores adenovirais é
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42/77 que eles não são fundidos no genoma da célula alvo, ignorando, assim, eventos negativos relacionados à integração.
[00134] As células podem ser transfectadas com um transgene que codifica o receptor de ligação ao antígeno. A concentração do transgene pode variar de cerca de 100 picogramas a cerca de 50 microgramas. Em algumas modalidades, a quantidade de um ácido nucleico (por exemplo, ssDNA, dsDNA ou RNA) introduzida em uma célula pode ser alterada para otimizar a eficiência da transfecção e/ou a viabilidade celular. Por exemplo, 1 micrograma de dsDNA pode ser adicionado a cada amostra de célula para eletroporação. Em algumas modalidades, a quantidade de ácido nucleico (por exemplo, DNA de fita dupla) necessária para a eficiência ideal de transfecção e/ou viabilidade celular varia dependendo do tipo de célula. Em algumas modalidades, a quantidade de ácido nucleico (por exemplo, dsDNA) usada para cada amostra pode corresponder diretamente à eficiência da transfecção e/ou viabilidade celular. Por exemplo, é utilizada uma faixa de concentrações de transfecção. O transgene codificado pelo vetor pode ser integrado ao genoma da célula. Em algumas modalidades, o transgene codificado pelo vetor é integrado adiante. Em outros casos, o transgene codificado pelo vetor é integrado reversamente.
[00135] Geralmente, o vetor é entregue in vivo por administração a um paciente individual por administração sistêmica (por exemplo, infusão intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou intracraniana) ou aplicação tópica, como descrito abaixo. Como alternativa, um vetor pode ser entregue ex vivo a uma célula, como uma célula removida de um paciente individual (por exemplo, linfócitos, células T, aspirados de medula óssea, biópsias de tecidos) e, em seguida, tipicamente reimplantada em um paciente após a seleção da célula na qual o vetor foi incorporado. As células podem ser expandidas antes ou depois da seleção.
[00136] As células imunorreativas adequadas para a expressão de um
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43/77 receptor de ligação ao antígeno podem ser células autólogas ou não autólogas a um indivíduo com necessidade das mesmas.
[00137] Uma fonte adequada de células de resposta imune pode ser obtida de um indivíduo. Em certos casos, as células T podem ser obtidas. As células T podem ser obtidas de várias fontes, incluindo PBMCs, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo e tecidos de locais infectados, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tecido tumoral. Em certos casos, as células T podem ser obtidas a partir do sangue coletado de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas dos especialistas na arte, como a separação FicollTM. Em algumas modalidades, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese. Os produtos de aférese normalmente contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em algumas modalidades, as células coletadas por coleta de aférese podem ser lavadas para remover as frações plasmáticas e colocadas em um tampão ou meio adequado para as etapas de processamento subsequentes.
[00138] Alternativamente, as células podem ser derivadas de um doador saudável, de um paciente com diagnóstico de câncer ou de um paciente com infecção. Em algumas modalidades, as células podem ser parte de uma população celular mista com diferentes características fenotípicas. As linhagens celulares também podem ser obtidas a partir de células T transformadas de acordo com os métodos descritos anteriormente. As células também podem ser obtidas em uma biblioteca de terapia celular. As células modificadas que são resistentes à terapia imunossupressora podem ser obtidas por qualquer um dos métodos aqui descritos. Também é possível selecionar uma população celular adequada antes da modificação. A população de células projetadas também pode ser selecionada após a modificação. As células projetadas podem ser usadas para transplante autólogo.
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Alternativamente, as células podem ser usadas para transplante alogênico. Em algumas modalidades, as células são administradas ao mesmo paciente cuja amostra é usada para identificação de uma sequência alvo associada ao câncer. Em outros casos, as células são administradas a um paciente diferente do paciente cuja amostra é usada para identificação da sequência alvo associada ao câncer.
[00139] Em algumas modalidades, as células primárias adequadas compreendem células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), linfócitos do sangue periférico (PBLs) e outras subpopulações de células sanguíneas, tais como, mas não limitadas a, células T, células exterminadoras naturais, monócitos, células T exterminadoras naturais, células precursoras de monócitos, células-tronco hematopoiéticas ou células-tronco não pluripotentes. Em algumas modalidades, a célula pode ser qualquer célula imune, incluindo qualquer célula T, como uma célula infiltrante de tumor (TIL), como uma célula T CD3+, uma célula T CD4+, uma célula T CD8+ ou qualquer outro tipo de célula T. As células T também podem compreender células T de memória, células T estaminais de memória ou células T efetoras. Também é possível selecionar células T de uma grande população, por exemplo, selecionar células T do sangue total. As células T também podem ser expandidas a partir de uma grande população. As células T também podem ser de um modo preferido aquelas de populações e fenótipos específicos. Por exemplo, as células T podem de um modo preferido ter um fenótipo compreendendo CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) e/ou IL-7Ra(+). As células adequadas podem ter um ou mais marcadores selecionados da lista de CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) e/ou IL-7Rd(+). As células adequadas também compreendem células-tronco, como células-tronco embrionárias, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco neuronais e células-tronco mesenquimais. As
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 51/107 /77 células adequadas podem compreender qualquer número de células primárias, como células humanas, células não humanas e/ou células de camundongo. As células adequadas podem ser células progenitoras. As células adequadas podem ser derivadas de um indivíduo a ser tratado (por exemplo, um paciente).
[00140] A quantidade terapeuticamente eficaz das células necessária em um paciente pode variar dependendo da viabilidade das células e da eficiência com que as células são geneticamente modificadas (por exemplo, a eficiência com a qual o transgene é integrado a uma ou mais células ou o nível de expressão da proteína codificada pelo transgene). Em algumas modalidades, o resultado (por exemplo, multiplicação) da viabilidade celular após modificação genética e a eficiência de integração do transgene podem corresponder a uma quantidade terapêutica de células disponíveis para administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, um aumento na viabilidade celular após modificação genética pode corresponder a uma redução na quantidade essencial de células administradas eficazes para tratar um paciente. Em algumas modalidades, um aumento na eficiência da integração do transgene em uma ou mais células pode corresponder a uma redução na quantidade essencial de células administradas eficazes para tratar um paciente. Em algumas modalidades, determinar a quantidade terapeuticamente eficaz das células que é necessária pode compreender determinar uma função associada a uma alteração nas células ao longo do tempo. Em algumas modalidades, determinar a quantidade terapeuticamente eficaz de células necessária pode compreender determinar uma função correspondente a uma mudança na eficiência de integrar o transgene em uma ou mais células de acordo com uma variável dependente do tempo (por exemplo, tempo de cultura celular, tempo de eletroporação, tempo de estimulação celular). Em algumas modalidades, a célula terapeuticamente eficaz pode ser uma população de células compreendendo a expressão de
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46/77 cerca de 30% a cerca de 100% dos receptores de ligação ao antígeno na superfície celular. Em algumas modalidades, as células terapeuticamente eficazes podem expressar cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou mais do que cerca de 99,9% dos receptores de ligação ao antígeno na superfície da célula, conforme medido por citometria de fluxo.
[00141] De acordo com um aspecto da invenção, a invenção também abrange um ácido nucleico que codifica o receptor de ligação ao antígeno. A invenção também se refere a uma variante do polinucleotídeo acima mencionado, que codifica um polipeptídeo com a mesma sequência de aminoácidos da invenção, ou um fragmento, um análogo e um derivado do polipeptídeo.
[00142] A invenção provê adicionalmente um vetor compreendendo o ácido nucleico acima mencionado que codifica a proteína receptora de ligação ao antígeno que é expressa na superfície de uma célula de resposta imune.
[00143] A invenção abrange adicionalmente um vírus compreendendo o vetor acima mencionado. O vírus da invenção compreende um vírus infeccioso empacotado e também compreende um vírus a ser empacotado contendo componentes necessários para o empacotamento como um vírus infeccioso. Outros vírus conhecidos na técnica que podem ser utilizados para transduzir um gene exógeno para uma célula de resposta imune e seus vetores plasmidiais correspondentes também podem ser utilizados na invenção.
[00144] Em outro aspecto, é aqui provida uma célula hospedeira, compreendendo um anticorpo ou receptor de antígeno quimérico, como descrito aqui, e opcionalmente interferon Tipo I. Em outro aspecto, é aqui provida uma célula hospedeira, compreendendo ácidos nucleicos que codificam um anticorpo ou receptor de antígeno quimérico aqui descrito e, opcionalmente, interferon do tipo I.
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47/77 [00145] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de resposta imune. Em algumas modalidades, a célula de resposta imune é uma célula T, uma célula exterminadora natural, um linfócito T citotóxico, uma célula T exterminadora natural, uma célula DNT e/ou uma célula T reguladora. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula NK92.
[00146] A célula de resposta imune da invenção pode adicionalmente transportar uma sequência de codificação de uma citocina exógena; e a citocina inclui, mas não se limita a: IL-12, IL-15 ou IL-21, etc. Essas citocinas têm atividade imunomodulatória ou antitumoral adicional e podem melhorar a função das células T efetoras e das células NK ativadas, ou exercer diretamente o efeito antitumoral. Assim, as pessoas versadas na técnica apreciarão que o uso destas citocinas ajudará a célula de resposta imune a funcionar melhor.
[00147] A célula de resposta imune da invenção também pode expressar um receptor de ligação ao antígeno que não seja o receptor de ligação ao antígeno descrito acima.
[00148] A célula de resposta imune da invenção também pode expressar um receptor de quimiocina; e o receptor de quimiocina inclui, mas não está limitado a, CCR2. Os especialistas na técnica compreenderão que o receptor de quimiocina CCR2 pode permitir que o CCR2 in vivo se ligue à quimiocina competitivamente, o que é vantajoso para bloquear as metástases de tumores.
[00149] A célula de resposta imune da invenção também pode expressar um siRNA que reduz a expressão de PD-1 ou uma proteína que bloqueia PD-L1. As pessoas versadas na técnica compreenderão que o bloqueio competitivo da interação da PD-L1 com seu receptor PD-1 facilita a recuperação das respostas das células T antitumorais, inibindo assim o crescimento tumoral.
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48/77 [00150] A célula de resposta imune da invenção também pode expressar uma chave de segurança; de um modo preferido, a chave de segurança compreende: iCaspase-9, EGFR truncado ou RQR8.
[00151] Em algumas modalidades, a célula de resposta imune da invenção não expressa um ligando coestimulatório como 4-1BBL.
[00152] Por conseguinte, em outro aspecto, é aqui provido um método para gerar um anticorpo ou receptor de antígeno quimérico aqui descrito ou uma composição compreendendo o mesmo, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira aqui descrita em condições adequadas. Em algumas modalidades, o método compreende isolar e obter um produto de expressão da célula hospedeira.
[00153] Em outro aspecto, é aqui provida uma composição, compreendendo um anticorpo, receptor de antígeno quimérico ou ácido nucleico aqui descrito. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo, receptor quimérico de antígeno ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00154] Em outro aspecto, é aqui provida uma composição farmacêutica, compreendendo uma célula hospedeira aqui descrita e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00155] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa que, quando uma molécula em si e uma composição são administradas adequadamente a um animal ou humano, elas não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação adversa.
[00156] Em algumas modalidades, a composição compreende um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente quimioterapêutico, como os descritos em US 20140271820 e/ou sais ou análogos farmaceuticamente aceitáveis dos
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 55/107 /77 mesmos. Em algumas modalidades, o agente terapêutico inclui, mas não está limitado a, um inibidor mitótico (alcalóide da vinca), incluindo vincristina, vinblastina, vindesina e navelbina (TM) (vinorelbina, sulfeto de 5’-desidrohidrogênio); um inibidor da topoisomerase I, como compostos de camptotecina, incluindo CamptosarTM (irinotecano HCL), HycamtinTM (topotecano HCL) e outros compostos derivados da camptotecina e análogos dos mesmos; um derivado de podofilotoxina, tal como etoposido, teniposido e midoxizoz; um agente alquilante, como cisplatina, ciclofosfamida, mostarda nitrogenada, trimetileno tiofosforamida, carmustina, bussulfano, clorambucil, briquinolizina, uracila mostarda, cloprofeno e dacarbazina; um antimetabólito, incluindo citarabina, 5-fluorouracila, metotrexato, mercaptopurina, azatioprina e procarbazina; um antibiótico, incluindo, mas não limitado a, doxorrubicina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, miccinmicina, mitomicina, sarkomicina C e daunomicina; e outros fármacos quimioterapêuticos, incluindo, entre outros, anticorpos antitumorais, dacarbazina, azacitidina, amsacon, melfalano, ifosfamida e mitoxantrona. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é selecionado dentre um ou mais de epirubicina, oxaliplatina e 5-fluorouracil. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional inclui, mas não está limitado a, um agente antiangiogênico, incluindo anticorpos anti-VEGF (incluindo anticorpos humanizados e quiméricos, aptâmeros anti-VEGF e oligonucleotídeos antisentido) e outros inibidores da angiogênese, como angiostatina, endostatina, interferon, interleucina 1 (incluindo oc e β), interleucina 12, ácido retinóico, inibidores de tecido das metaloproteinases-1 e -2, e similares.
[00157] Exemplos específicos de algumas substâncias que podem ser usadas como veículos ou componentes dos mesmos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares como lactose, glicose e sacarose; amidos como amido de milho e amido de batata; celulose e derivados dos mesmos, tais como
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50/77 carboximetilcelulose, etilcelulose e metilcelulose de sódio; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; lubrificantes sólidos, tais como ácido esteárico e estearato de magnésio; sulfato de cálcio; óleos vegetais, como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e manteiga de cacau; polióis, tais como propileno glicol, glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; ácido algínico; emulsificantes como Tween; agentes umectantes, tais como lauril sulfato de sódio; agentes corantes; agentes aromatizantes; agentes de formação de comprimidos, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; água livre de pirogênio; soluções salinas isotônicas; tampões de fosfato e similares.
[00158] A composição farmacêutica aqui descrita pode compreender um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. O “sal farmaceuticamente aceitável” se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada de um composto original e não produz qualquer efeito toxicológico adverso (ver, por exemplo, Berge, SM et al. 1977, J. Pharm. Sei. 66: 1 a 19). Exemplos desse sal compreendem sais de adição de ácido e sais de adição de base.
[00159] Os sais de adição de ácido compreendem sais derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, como ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico e ácido fosforoso, etc.; e sais derivados de ácidos orgânicos não tóxicos, como um ácido monocarboxílico alifático e ácido dicarboxílico, um ácido alcanóico substituído por fenil, um ácido hidroxialcanóico, um ácido aromático e um ácido sulfônico alifático ou aromático, etc. Os sais de adição de base compreendem sais derivados de metais alcalino-terrosos (como sódio, potássio, magnésio e cálcio) e sais derivados de aminas orgânicas não tóxicas, como Ν,Ν’-dibenziletilenodiamina, N-metilglucosamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina e procaína, etc.
[00160] A composição farmacêutica aqui descrita também pode compreender um antioxidante. Exemplos do antioxidante incluem, mas não
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 57/107 /77 estão limitados a: antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, hidrogenossulfato de sódio, metabissulfito de sódio e sulfito de sódio, etc.; antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila e oc-tocoferol, etc.; e agentes quelantes de metais, como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico e ácido fosfórico, etc.
[00161] A composição da invenção pode ser formulada em várias formas de dosagem conforme necessário e pode ser administrada após a determinação de uma dose benéfica para um paciente por um médico, de acordo com fatores como tipo de paciente, idade, peso corporal e condição geral da doença, e modo de administração, etc. O modo de administração pode ser, por exemplo, administração parenteral (por exemplo, injeção) ou outras formas de tratamento.
[00162] A administração “parenteral” de uma composição imunogênica compreende, por exemplo, técnicas de injeção ou infusão subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) ou intrasternal.
[00163] Uma formulação compreendendo uma população de células imunorreativas administrada a um indivíduo compreende uma pluralidade de células imunorreativas eficazes para tratar e/ou prevenir uma indicação ou doença específica. Assim, uma população terapeuticamente eficaz de células imunorreativas pode ser administrada a um indivíduo. Tipicamente, é administrada uma formulação compreendendo de cerca de 1 x 104 a cerca de 1 x 1010 células imunorreativas. Na maioria dos casos, a formulação compreenderá de cerca de 1 x 105 a cerca de 1 x 109 células imunorreativas, de cerca de 5 x 105 a cerca de 5 x 108 células imunorreativas ou de cerca de 1 x 106 a cerca de 1 x 107 células imunorreativas. No entanto, dependendo da localização, fonte, identidade, extensão e gravidade do câncer, idade e condição física do indivíduo a ser tratado e similares, o número de células
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52/77 imunorreativas para CAR administradas ao indivíduo variará dentro de uma ampla faixa. O médico finalmente decidirá uma dose apropriada a ser usada.
[00164] Em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimérico é usado para estimular uma resposta imune mediada por células imunes. Por exemplo, uma resposta imune mediada por células T é uma resposta imune que envolve a ativação de células T. As células T citotóxicas específicas para o antígeno ativado são capazes de induzir apoptose nas células-alvo que exibem epítopos antigênicos exógenos na superfície, como células cancerígenas que exibem antígenos tumorais. Em algumas outras modalidades, um receptor de antígeno quimérico é usado para prover imunidade antitumoral em um mamífero. Um indivíduo desenvolverá imunidade antitumoral devido a respostas imunes mediadas por células T.
[00165] Em certos casos, um método de tratamento de um indivíduo com câncer pode envolver a administração de uma ou mais células de resposta imune da invenção ao indivíduo necessitado de tratamento. As células de resposta imune podem se ligar às moléculas alvo tumoral e induzir a morte de células cancerígenas. Como descrito acima, a invenção provê adicionalmente um método para o tratamento de uma infecção por patógeno em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma célula de resposta imune da invenção.
[00166] A frequência de administração das células imunorreativas da invenção dependerá de fatores incluindo a doença a ser tratada, os elementos das células imunorreativas particulares e o modo de administração. Por exemplo, as células imunorreativas podem ser dosadas 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ao dia, uma vez ao dia, a cada dois dias, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, a cada seis dias, uma vez por semana, uma vez a cada oito dias, uma vez a cada nove dias, uma vez a cada dez dias, uma vez por semana ou duas vezes por mês. Como aqui descrito, uma vez que as células de resposta imune do presente pedido têm viabilidade aprimorada, elas podem
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 59/107 /77 ser administradas não apenas em uma quantidade terapeuticamente eficaz mais baixa, mas também em uma frequência mais baixa, para obter eficácia pelo menos semelhante e de um modo preferido mais pronunciada, em comparação com uma célula de resposta imune que é semelhante, mas não expressa o interferon exógeno tipo I.
[00167] Em algumas modalidades, as composições podem ser isotônicas, isto é, podem ter a mesma pressão osmótica que o sangue e as lágrimas. A isotonicidade desejada da composição da invenção pode ser alcançada usando cloreto de sódio, ou outros agentes farmaceuticamente aceitáveis, como glicose, ácido bórico, tartarato de sódio, propilenoglicol ou outros solutos orgânicos ou inorgânicos. Se desejado, a viscosidade da composição pode ser mantida em um nível selecionado usando um espessante farmaceuticamente aceitável. Os espessantes adequados compreendem, por exemplo, metilcelulose, goma xantana, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, carbômero e similares. A concentração preferida de um espessante dependerá do reagente selecionado. Será evidente que a escolha de um veículo adequado e de outros aditivos dependerá da via exata de administração e da natureza da forma de dosagem específica, tal como uma forma de dosagem líquida.
[00168] A invenção provê adicionalmente um kit que compreende o anticorpo, receptor quimérico de antígeno e célula de ácido nucleico ou de resposta imune aqui descrita. Em algumas modalidades, o kit pode compreender uma composição terapêutica ou profilática compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo, receptor de antígeno quimérico, ácido nucleico ou célula de resposta imune aqui descrita em uma ou mais formas de dosagem unitárias. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente estéril que pode conter a composição terapêutica ou profilática; esse recipiente pode ser um cartucho, ampola, garrafa, frasco, tubo, saco ou blister ou outras formas de recipiente adequadas conhecidas na técnica. Esses
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 60/107 /77 recipientes podem ser feitos de plástico, vidro, papel laminado, folha de metal ou outros materiais adequados para reter o medicamento. Em algumas modalidades, o kit compreende o anticorpo, receptor de antígeno quimérico, ácido nucleico ou célula de resposta imune aqui descrita e instruções indicando a administração do anticorpo, receptor de antígeno quimérico, ácido nucleico ou célula de resposta imune aqui descrita a um indivíduo. As instruções geralmente compreendem o uso do anticorpo, receptor quimérico de antígeno, ácido nucleico ou célula de resposta imune aqui descrita para o tratamento ou prevenção de câncer ou tumores. Em algumas modalidades, o kit compreende a célula hospedeira aqui descrita e pode compreender de cerca de 1 x 104 células a cerca de 1 x 106 células. Em algumas modalidades, o kit pode compreender pelo menos cerca de 1 x 105 células, pelo menos cerca de 1 x 106 células, pelo menos cerca de 1 x 107 células, pelo menos cerca de 4 x 107 células, pelo menos cerca de 5 x 107 células, pelo menos cerca de 6 x 107 células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca de 7 x 10 células, pelo de 9 x 107 células, pelo de 2 x 108 células, pelo de 4 x 108 células, pelo de 6 x 108 células, pelo de 8 x 108 células, pelo de 1 x 109 células, pelo de 3 x 109 células, pelo de 5 x 109 células, pelo de 7 x 109 células, pelo de 9 x 109 células, pelo de 2 x IO10 células, pelo de 4 x IO10 células, pelo de 6 x IO10 células, pelo de 8 x IO10 células, pelo menos cerca de 8 x 10 menos cerca de 1 x 108 menos cerca de 3 x 108 menos cerca de 5 x 108 menos cerca de 7 x 108 menos cerca de 9 x 108 menos cerca de 2 x 109 menos cerca de 4 x 109 menos cerca de 6 x 109 menos cerca de 8 x 109 menos cerca de 1 x IO10 menos cerca de 3 x IO10 menos cerca de 5 x IO10 menos cerca de 7 x IO10 menos cerca de 9 x IO10
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 61/107 /77 células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca células, pelo menos cerca de 1 x 1011 células, pelo de 3 x 1011 células, pelo de 5 x 1011 células, pelo de 7 x 1011 células, pelo menos cerca de 2 x 1011 menos cerca de 4 x 1011 menos cerca de 6 x 1011 menos cerca de 8 x 1011 células, pelo menos cerca de 9 x 1011 células ou pelo menos cerca de 1 x 1012 células. Por exemplo, aproximadamente 5 x IO10 células podem ser incluídas no kit. Em outro exemplo, o kit pode compreender 3 x 106 células; e as células podem ser expandidas para cerca de 5 x IO10 células e administradas a um indivíduo.
[00169] Em algumas modalidades, o kit pode compreender células alogênicas. Em algumas modalidades, o kit pode compreender células que podem conter modificações genômicas. Em algumas modalidades, o kit pode compreender células “prontas para uso”. Em algumas modalidades, o kit pode compreender células que podem ser expandidas para uso clínico. Em certos casos, o kit pode incluir um conteúdo para fins de pesquisa.
[00170] Em algumas modalidades, as instruções compreendem pelo menos uma dentre: uma descrição de um agente terapêutico; um regime de dosagem e administração para tratamento ou prevenção de um tumor ou um sintoma do mesmo; medidas preventivas, avisos, contra-indicações, informações excessivas, reações adversas, farmacologia animal, estudos clínicos e/ou citações. As instruções podem ser impressas diretamente no contêiner (se houver), ou como uma etiqueta no contêiner, ou como um papel, livreto, cartão ou pasta separado dentro do contêiner ou no contêiner. Em algumas modalidades, as instruções proveem um método para administrar a célula de resposta imune da invenção para tratar ou prevenir um tumor. Em certos casos, as instruções proveem um método para administrar a célula imunorreativa da invenção antes, depois ou simultaneamente com a administração de um agente quimioterapêutico.
[00171] Em outro aspecto, é aqui provido um método para induzir a
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56/77 morte de uma célula compreendendo IL-13RA2, compreendendo o contato da célula com o anticorpo aqui descrito, o receptor de antígeno quimérico aqui descrito, a composição aqui descrita ou a célula hospedeira aqui descrita. Em algumas modalidades, o contato é contato in vitro. Em algumas modalidades, o contato é contato in vivo.
[00172] Em algumas modalidades, a célula é uma célula tumoral. Em algumas modalidades, a célula é um tumor cerebral e, mais especificamente, pode ser astrocitoma, meningioma e glioma.
[00173] Em outro aspecto, é aqui provido um método para o tratamento de um tumor em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz do anticorpo, receptor de antígeno quimérico, composição, vetor ou célula hospedeira aqui descrita.
[00174] Em algumas modalidades, a célula imunorreativa pode ser administrada a um indivíduo, em que a célula imunorreativa que pode ser administrada pode ter de 1 a 35 dias de idade. Por exemplo, as células administradas podem ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 dias ou até cerca de 40 dias de idade. A idade da célula imunorreativa do CAR pode ser calculada a partir do momento da estimulação. A idade da célula imunorreativa pode ser calculada a partir do momento da coleta de sangue. A idade da célula imunorreativa pode ser calculada a partir do momento da transdução. Em algumas modalidades, as células imunorreativas que podem ser administradas ao indivíduo têm entre 10 e 14 ou 20 dias de idade. Em algumas modalidades, a “idade” de uma célula imunorreativa pode ser determinada pelo comprimento do telômero. Por exemplo, uma célula de resposta imune “jovem” pode ter um comprimento de telômero maior que uma célula imunorreativa “empobrecida” ou “antiga”. Sem estar vinculado a uma teoria específica, acredita-se que a célula imunorreativa perca um comprimento estimado de telômeros de cerca de 0,8 kb por semana em
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57/77 cultura, e a cultura de células imunorreativas jovens pode ter um telômero com cerca de 1,4 kb a mais do que a célula imunorreativa cerca de 44 dias de idade. Sem estar vinculado a uma teoria específica, acredita-se que um comprimento de telômero mais longo possa estar associado a uma resposta clínica objetiva positiva em um paciente e à persistência de células in vivo.
[00175] As células (por exemplo, células projetadas ou células T primárias projetadas) podem funcionar antes, depois e/ou durante o transplante. Por exemplo, as células transplantadas podem funcionar pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 dias após o transplante. As células transplantadas podem funcionar pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses após o transplante. As células transplantadas podem funcionar pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ou 30 anos após o transplante. Em algumas modalidades, as células transplantadas podem funcionar durante a vida de um destinatário.
[00176] Além disso, as células transplantadas podem funcionar a 100% de sua função esperada normal. As células transplantadas também podem realizar cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15 %, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%,
38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%,
51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%,
64%, 65 %, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,
77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou até cerca de 100% da função esperada normal.
[00177] As células transplantadas também podem executar mais de 100% de sua função normal pretendida. Por exemplo, as células transplantadas podem executar aproximadamente 110%, 120%, 130%, 140%,
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150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou até cerca de 5000% da função normal esperada.
[00178] O transplante pode ser feito por qualquer tipo de transplante. O transplante local pode incluir, mas não está limitado a, espaço do saco subhepático, espaço do saco subsplênico, espaço do saco sub-renal, omento, submucosa gástrica ou intestinal, segmento vascular do intestino delgado, saco venoso, testículo, cérebro, baço ou córnea. Por exemplo, o transplante pode ser transplante subcapsular. O transplante também pode ser transplante intramuscular. O transplante pode ser transplante de veia porta.
[00179] A rejeição do transplante pode ser melhorada após o tratamento com a célula de resposta imune da invenção, em comparação com os casos em que uma ou mais células do tipo selvagem são transplantadas para o receptor. Por exemplo, a rejeição de transplante pode ser uma rejeição hiperaguda. A rejeição do transplante também pode ser uma rejeição aguda. Outros tipos de rejeição podem incluir rejeição crônica. A rejeição de transplante também pode ser rejeição mediada por células ou rejeição mediada por células T. A rejeição do transplante também pode ser uma rejeição mediada por células exterminadoras naturais.
[00180] Melhorar o transplante pode significar aliviar a rejeição hiperaguda, que pode incluir reduzir, aliviar ou reduzir efeitos ou sintomas adversos. O transplante pode se referir ao transplante adotivo de produtos celulares.
[00181] Outra indicação de transplante bem-sucedido pode ser o número de dias em que o receptor não precisa de terapia imunossupressora. Por exemplo, após prover a célula de resposta imune da invenção, o receptor pode não exigir a terapia imunossupressora por pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias. Isso pode indicar que o transplante foi bem sucedido. Isso também pode indicar que as células, tecidos e/ou órgãos
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59/77 transplantados não são rejeitados.
[00182] Em algumas modalidades, o anticorpo, receptor de antígeno quimérico, composição, vetor ou célula hospedeira aqui descrita pode ser administrado em combinação com outro agente terapêutico. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um agente quimioterapêutico, como os descritos em US 20140271820. O medicamento quimioterapêutico que pode ser usado em combinação com a célula de resposta imune da invenção inclui, mas não está limitado a, um inibidor mitótico (alcalóide da vinca), incluindo vincristina, vinblastina, vindesina e navelbina (TM) (vinorelbina, sulfeto de 5’-desidro-hidrogênio); um inibidor da topoisomerase I, como compostos de camptotecina, incluindo CamptosarTM (irinotecano HCL), HycamtinTM (topotecano HCL) e outros compostos derivados da camptotecina e análogos dos mesmos; um derivado de podofilotoxina, tal como etoposido, teniposido e midoxizoz; um agente alquilante, como cisplatina, ciclofosfamida, mostarda nitrogenada, trimetileno tiofosforamida, carmustina, bussulfano, clorambucil, briquinolizina, uracila mostarda, cloprofeno e dacarbazina; um antimetabólito, incluindo citarabina, 5fluorouracila, metotrexato, mercaptopurina, azatioprina e procarbazina; um antibiótico, incluindo, mas não limitado a, doxorrubicina, bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, miccinmicina, mitomicina, sarkomicina C e daunomicina; e outros fármacos quimioterapêuticos, incluindo, entre outros, anticorpos antitumorais, dacarbazina, azacitidina, amsacon, melfalano, ifosfamida e mitoxantrona. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é selecionado dentre um ou mais de epirubicina, oxaliplatina e 5fluorouracila.
[00183] Em algumas modalidades, o medicamento quimioterapêutico que pode ser usado em combinação com a célula de resposta imune da invenção inclui, mas não está limitado a, um agente antiangiogênico, incluindo anticorpos anti-VEGF (incluindo anticorpos humanizados e
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60/77 quiméricos, aptâmeros anti-VEGF e oligonucleotídeos antissentido) e outros inibidores da angiogênese, como angiostatina, endostatina, interferon, interleucina 1 (incluindo (X e β), interleucina 12, ácido retinóico e inibidores teciduais de metaloproteinases-1 e -2.
[00184] A invenção adicionalmente se refere a um vetor que compreende a sequência de DNA apropriada acima mencionada, bem como um promotor ou uma sequência de controle apropriada. O vetor pode ser usado para transformar uma célula hospedeira apropriada para permitir que ela expresse uma proteína. A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, como uma célula bacteriana; ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura; ou uma célula eucariótica superior, como uma célula de mamífero.
[00185] A invenção é adicionalmente ilustrada em conexão com exemplos particulares como se segue. Deve ser entendido que estes exemplos são meramente ilustrativos da invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Os métodos experimentais nos exemplos a seguir, que não especificam as condições específicas, são geralmente realizados de acordo com as condições convencionais, como descrito por J. Sambrook et al. em Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, Science Press, 2002, ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante.
Exemplo 1. Preparação de proteínas IL-13RA2 e IL-13RA1 recombinantes
a. Construção dos plasmídeos de expressão IL-13RA2_huFc e IL13RAl_huFc [00186] O gene (SEQ ID NO: 17) do segmento extracelular Asp27Arg343 (SEQ ID NO: 18) da IL-13RA2 humana foi sintetizado in vitro', e o gene foi inserido em um plasmídeo de expressão eucariótica contendo o segmento Fc Aspl04-Lys330 da região constante da cadeia pesada de IgGl humana, conectado via “GS” entre os mesmos para formar uma proteína de
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61/77 expressão de fusão IL-13RA2_huFc (SEQ ID NO: 22), e a sequência gênica correspondente da proteína de expressão de fusão é mostrada na SEQ ID NO:
11. Alternativamente, o gene (SEQ ID NO: 19) do segmento extracelular da IL-13RA1 foi inserido em um plasmideo de expressão eucariótica que contém o segmento F Aspl04- Lys330 da região constante da cadeia pesada de IgGl humana, conectada via “GS” entre os mesmos para formar uma proteína de expressão de fusão IL-13RAl_huFc (SEQ ID NO: 24), e a sequência gênica correspondente da proteína de expressão de fusão é mostrada como na SEQ ID NO: 23.
b. Expressão de IL-13RA2_huFc e IL-13RAl_huFc através de transfecção transitória [00187] 1) Um dia antes da transfecção, foram inoculadas 6 a 7 x
105/ml de células 293F em um balão de cultura de 125 ml.
[00188] 2) No dia da transfecção, 3 x 107 células foram ajustadas em um meio de expressão FreeStyleTM 293 de 28 ml.
[00189] 3) O complexo lipídeo-DNA foi preparado seguindo as etapas da operação:
ug de DNA foram diluídos com Opti-MEM I até um volume final de 1 ml e misturados completamente.
ul de 293fectinTM foram diluídos com Opti-MEM I até um volume final de 1 ml e misturados completamente.
a mistura foi incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente.
[00190] 4) Os DNAs diluídos foram misturados com 293fectinTM e incubados por 20 minutos em temperatura ambiente.
[00191] 5) 2 ml de complexo DNA-293fectina foram adicionados a ml de células, cultivadas a 37°C, em 8% de CO2, a 125 rpm por 3 a 4 dias, e 0 sobrenadante foi coletado.
c. Purificação de IL-13RA2_huFc e IL-13RAl_huFc
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62/77 [00192] 1) O sobrenadante foi cultivado sob centrifugação a 13000 rpm por 15 minutos.
[00193] 2) A purificação por afinidade foi realizada usando carga de proteína A, e as etapas específicas da operação foram as seguintes:
Equilíbrio: o enchimento de proteína foi equilibrado com 10 volumes de coluna de um tampão de equilíbrio.
[00194] Carregamento: todas as amostras processadas com membrana de filtro de 0,45 qm foram carregadas.
[00195] Lavagem: as impurezas foram lavadas com 20 volumes de coluna do tampão de equilíbrio até a ruptura sem vazão.
[00196] Eluição: a proteína de interesse foi eluída com 10 volumes de coluna de um tampão de eluição (6% de tampão de neutralização foram adicionados ao tubo de coleta previamente).
Fórmula da solução
Tampão de equilíbrio: PBS a pH 7,4
Tampão de eluição: glicina 0,1 M a pH 2,6
Tampão de neutralização: 1 M Tris [00197] 3) O eluato foi filtrado através de uma membrana de 0,22 um, concentrada usando um tubo de ultrafiltração milipore com uma quantidade de corte de 10 KD até um volume não superior a 1 ml, dessalinizada usando uma coluna de dessalinização PD-Midi e 1,5 ml de uma amostra foi coletada. A concentração de proteína foi medida por OD280/1,47.
[00198] - Foram tomados 2 qg para executar o SDS-PAGE, e os resultados são mostrados como na Figura 1.
Exemplo 2. Triagem de scFv específico para IL-13RA2 usando uma biblioteca inteira de exibição de fagos humanos [00199] A biblioteca de exibição de fagos usada na invenção é uma biblioteca de fagos scFv natural humana inteira construída pela empresa e tem uma capacidade de biblioteca de 1E+11. Um fragmento scFv altamente
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63/77 específico para IL-13RA2 foi obtido usando métodos de triagem conhecidos das pessoas versadas na técnica. Resumidamente, 10 pg/ml dos antígenos IL-13RA2_huFc e IL-13RAl_huFc foram revestidos nos imunotubos, respectivamente. Para rastrear anticorpos que se ligam especificamente a IL-13RA2, a biblioteca de fagos foi adicionada ao imunotubo revestido com IL-13RAl_huFc para ligação por 1 hora. O sobrenadante foi adicionado ao imunotubo revestido com IL-13RA2_huFc para ligação por 1,5 horas, depois os fagos não específicos foram lavados, os fagos ligados foram eluídos e tomados para infectar E. coli TG1 na fase de crescimento logarítmico. Os fagos eluídos foram cultivados por expansão e a biblioteca de fagos expandida foi purificada usando o método de precipitação com PEG/NaCl para a próxima rodada de triagem. O desenvolvimento foi realizado por 3 a 4 ciclos para enriquecer os clones de fago scFv que se ligam especificamente a IL-13RA2. Os clones positivos foram determinados por métodos ELISA padrão para IL-13RA2_huFc. A IL-13RAl_huFc foi usada no ELISA como um antígeno não relacionado para verificar a especificidade do anticorpo. Um total de 3.420 clones foi rastreado, dos quais 44 clones foram detectados pelo ensaio ELISA para se ligar especificamente a IL-13RA2_huFc e não se ligar a IL-13RAl_huFc. Após o sequenciamento, foram obtidas 5 sequências únicas. Os 5 clones foram expressos e purificados, apenas 2 deles especificamente ligados a células U251 que expressam IL13RA2 (compradas no banco de células da Academia Chinesa de Ciências) (Figuras 2 e 4), e os nomes dos clones são 31C2 e 32H4.
[00200] A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 31C2 é mostrada como na SEQ ID NO: 2, a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é mostrada como na SEQ ID NO: 4; a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 32H4 é mostrada como na SEQ ID NO: 6 e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve é mostrada como na SEQ ID NO: 8. A
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 70/107 /77 sequência de aminoácidos do HDCR1 de 31C2 é mostrada como na SEQ ID NO: 9, a sequência de aminoácidos de HDCR2 é mostrada como na SEQ ID NO: 10, a sequência de aminoácidos de HDCR3 é mostrada como na SEQ ID
NO: 11, a sequência de aminoácidos de LDCR1 é mostrada como na SEQ ID
NO: 13, a sequência de aminoácidos de LDCR2 é mostrada como na SEQ ID
NO: 14 e a sequência de aminoácidos de LDCR3 é mostrada como na SEQ ID
NO: 15; a sequência de aminoácidos de HDCR1 de 32H4 é mostrada como na SEQ ID NO: 9, a sequência de aminoácidos de HDCR2 é mostrada como na SEQ ID NO: 10, a sequência de aminoácidos de HDCR3 é mostrada como na SEQ ID NO: 12, a sequência de aminoácidos de LDCR1 é mostrada como na SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácidos de LDCR2 é mostrada como na SEQ ID NO: 14 e a sequência de aminoácidos de LDCR3 é mostrada como na SEQ ID NO: 16.
Exemplo 3. Ensaio de ligação a ELISA [00201] A especificidade das espécies dos anticorpos 31C2 e 32H4 foi determinada por ELISA padrão. A IL-13RA2 murina foi adquirida da Sino Biological Inc. A placa ELISA foi revestida com 100 ul de IL-13RA2 murina por 5 pg/ml por poço a 4°C durante a noite. A placa ELISA revestida foi lavada com PBS três vezes. Foram adicionados 200 ul de solução de leite em pó desnatado a 2% em PBS por poço para bloquear à temperatura ambiente durante 1 hora. A placa foi lavada com PBS três vezes. Os anticorpos diluídos gradualmente com uma concentração inicial de 10 pg/ml, 3 vezes diluídos em série, foram adicionados e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura foi lavada com PBST três vezes e lavada com PBS três vezes. Foi adicionado Fc anti-humano de cabra marcado com HRP e foi incubado à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura foi lavada com PBST três vezes e lavada com PBS três vezes. Após TMB foi adicionado para o desenvolvimento da cor por 15 minutos, e a reação foi interrompida pela adição de ácido sulfurico e lida em um leitor de microplacas. O resultado é
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 71/107 /77 mostrado na Figura 3. O anticorpo 31C2 pode se ligar à IL-13RA2 murina e o anticorpo 32H4 não se liga à IL-13RA2 murina.
Exemplo 4. Construção do anticorpo de fusão anti-IL-13RA2 scFv_Fc e sua transfecção transitória, expressão, purificação e identificação de atividade em uma célula eucariótica [00202] Os primers foram projetados para os fragmentos VH e VL de 31C2 e 32H4, respectivamente, e um ligando composto por 15 aminoácidos flexíveis (GGGGSGGGGGSGGGGS) foi introduzido para formar um scFv; um local de restrição adequado e uma base protetora foram introduzidos a montante do VH, e um local de restrição adequado e uma base protetora foram introduzidos a jusante do VL. O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1%, purificado e recuperado. Após digestão enzimática, o produto é ligado a um vetor de expressão eucariótico adequado. As células 293F na fase de crescimento logarítmico foram transfectadas transitoriamente com o reagente 293fectin™ Transfection (Invitrogen, 12347019) ou polietilenoimina (PEI) (Sigma-Aldrich, 408727). O sobrenadante da cultura foi coletado 5 a 7 dias após a transfecção e submetido à purificação por afinidade pela proteína A.
[00203] A ligação do anticorpo às células U251 que expressam endogenamente IL-13RA2 foi testada por citometria de fluxo, com células 293T como controle celular negativo. O método específico de ensaio de FACs foi o seguinte: as células foram colhidas, lavadas uma vez com um meio de crescimento e ressuspensas em PBS, e a concentração de células foi ajustada para 4E+5 células/ml. O anticorpo de fusão scFv_Fc diluído foi incubado com as células por 30 minutos em gelo e a concentração de anticorpos foi de 111 nM. Em seguida, a mistura foi incubada com um anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com FITC. Após duas etapas de lavagem, a detecção foi realizada usando um instrumento Guava easyCyteTM HT System. A Figura 4 mostra o estado de ligação das formas de fusão scFv_Fc
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66/77 dos anticorpos 31C2 e 32H4 às células U251 e 293T. Ambos os anticorpos se ligam especificamente às células U251 que expressam IL-13RA2 endogenamente e não se ligam à célula negativa 293T.
Exemplo 5. Determinação da afinidade de anticorpos usando a tecnologia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) [00204] A afinidade de diferentes anticorpos para IL-13RA2 foi determinada usando o biacore T200. Os procedimentos específicos foram os seguintes.
[00205] A IL-13RA2_huFc foi revestida no chip CM5 por acoplamento de amino, revestida a cerca de 500 RU, e os anticorpos gradualmente diluídos foram passados através do canal revestido de antígeno a uma taxa de fluxo de 30 ul/min como uma fase móvel. O tampão de corrida era HBS-N e a temperatura era de 25°C. Os dados experimentais foram analisados pela BIAevaluation 3,2 e as curvas cinéticas foram ajustadas usando um modelo langmuir 1:1.0 KD de 31C2 (scFv_Fc) foi de 1,79 nM e o KD de 32H4 (scFv_Fc) foi de 3,76 nM (ver Figura 5).
Exemplo 6. Determinação da ligação de EC50 de anticorpos a células U251 usando FACs [00206] As células foram coletadas, lavadas uma vez com um meio de crescimento e ressuspensas em PBS, e a concentração de células foi ajustada para 4E+5 células/ml. O anticorpo de fusão scFv_Fc gradualmente diluído foi incubado com as células por 30 minutos em gelo, e o anticorpo foi diluído em série 5 vezes com 500 nM como concentração inicial, em 8 gradientes. Em seguida, a mistura foi incubada com um anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com FITC. Após duas etapas de lavagem, a detecção foi realizada usando um instrumento Guava easyCyteTM HT System. Os resultados são mostrados na Figura 6, na qual ambos os anticorpos têm uma ligação dependente do gradiente de concentração às células U251, 31C2 (ScFv_Fc) tem uma EC50 de 2,8 nM e 32H4 (ScFv_Fc) tem uma EC50 de
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67/77 nM.
Exemplo 7. Maturação por afinidade de anticorpos [00207] A maturação por afinidade foi realizada utilizando a tecnologia de exibição em fagos.
[00208] Utilizando 31C2 e 32H4 como anticorpos parentais, foram construídas duas bibliotecas de fagos respectivamente: uma tendo CDR1 e CDR2 de cadeia leve aleatória e a outra tendo CDR1 e CDR2 de cadeia pesada aleatória. As bibliotecas foram então analisadas quanto ao antígeno, e os anticorpos de alta afinidade, isto é, variantes de 31C2 e 32H4, foram rastreados pela tecnologia SPR e similares. A informação dos primers é mostrada na Figura 7.
[00209] O plasmídeo modelo foi construído primeiro com base no anticorpo 31C2 (scFv) (tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 26). Para bibliotecas de fagos com CDR1 e CDR2 de cadeia leve randomizados, o fragmento 1 foi amplificado por PCR usando os primers LMF e IL1R; o fragmento 2 foi amplificado por PCR usando os primers IL2F e FdR; em seguida, o fragmento 1 e o fragmento 2 foram ligados por ponte de PCR para obter as sequências aleatórias contendo scFv de tamanho completo; o fragmento de comprimento total foi digerido com Ncol e Notl e ligado pela ligase T4 ao plasmídeo modelo digerido da mesma forma e o plasmídeo foi eletrotransformado em células competentes TG1 com uma capacidade de biblioteca de l,68E+9. Para bibliotecas de fagos com CDR1 e CDR2 de cadeia pesada aleatória, o fragmento 3 foi amplificado por PCR usando os primers LMF e BH1R; o fragmento 4 foi amplificado por PCR usando os primers BH2F e FdR; em seguida, o fragmento 3 e o fragmento 4 foram ligados por ponte de PCR para obter sequências aleatórias contendo scFv de tamanho completo; o fragmento de comprimento total foi digerido com Ncol e Notl, e ligado pela ligase T4 ao plasmídeo modelo digerido da mesma forma, e o plasmídeo foi
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68/77 eletrotransformado em células competentes TGI com uma capacidade de biblioteca de l,75E+9.
[00210] A construção da biblioteca de maturação por afinidade do anticorpo 32H4 foi semelhante à do 31C2, e o plasmídeo modelo foi construído com base no anticorpo 32H4 (scFv) (com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 e uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 27). As CDR1 e CDR2 da cadeia leve foram randomizadas usando os mesmos primers que os de 31C2, e a capacidade da biblioteca de fagos resultante foi de 2,lE+9. Da mesma forma, as CDR1 e CDR2 da cadeia pesada foram randomizadas usando os mesmos primers que os de 31C2, e a capacidade da biblioteca de fagos resultante foi de l,5E+9.
Exemplo 8. Triagem de bibliotecas de fagos [00211] Pode-se fazer referência ao método no Exemplo 2 da patente. A concentração inicial do antígeno IL13RA2_huFc foi de 50 nM e uma diluição de gradiente de 2 vezes foi realizada para a próxima rodada de triagem. O desenvolvimento foi realizado por 2 a 3 ciclos para enriquecer os clones de fago scFv que se ligam especificamente a IL13RA2_huFc. Os clones positivos foram determinados por métodos ELISA padrão para IL13RA2_huFc. O segmento IL13RAl_huFc humano foi utilizado no ELISA como um antígeno não relacionado para verificar a especificidade do anticorpo. Um total de 111 clones positivos para ELISA foram coletados; e a constante de dissociação Kd do sobrenadante induzido foi determinada por biacore após re-indução. Entre eles, 10 clones tinham uma constante de dissociação Kd mais de 10 vezes menor que a do clone parental, como mostrado na Figura 8.
[00212] Por sequenciamento, as cadeias leves dos clones 2C7, 2D3, 1D11, 1B11, 2A5, 2D4, 1H7 e 1D8 eram idênticas à cadeia leve de 31C2 (com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 3). As sequências de aminoácidos da cadeia
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69/77 pesada dos clones 2C7 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 29 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 30), 2D3 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 31 e uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32), 1D11 (com um aminoácido de SEQ ID NO: 33 e uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34), 1B11 (com um aminoácido de SEQ ID NO: 35 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 36), 2A5 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 37 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 38), 2D4 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 39 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 40), 1H7 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 41 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 42), 1D8 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 43, e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 44) e 31C2 (com um aminoácido da SEQ ID NO: 2 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1) foram comparadas na Figura 9A.
[00213] Nos clones amadurecidos por afinidade de 31C2, as sequências de HCDR1 são mostradas como nas SEQ ID NOs: 45 a 51, respectivamente, e as sequências de HCDR2 são mostradas como nas SEQ ID NOs: 52 a 58, respectivamente. Ver a Figura 9B para detalhes.
[00214] Comparado com o VH do anticorpo parental 31C2, o 2C7 tem mutações de 4 locais, com 96,7% de similaridade; 2D3 tem mutações de 5 locais, com 95,8% de similaridade; 1D11 tem mutações de 6 locais, com 95% de similaridade; 1B11 tem mutações de 5 locais, com 95,8% de similaridade; 2A5 tem mutações de 4 locais, com 96,7% de similaridade; 2D4 tem mutações de 5 locais, com 95,8% de similaridade; 1H7 tem mutações de 4 locais, com 96,7% de similaridade; e 1D8 tem mutações de 4 locais, com 96,7% de similaridade.
[00215] Por sequenciamento, as cadeias leves dos clones 5G3 e 5D7 eram idênticas à cadeia leve de 32H4 (tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 e uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 7). As sequências de aminoácidos da cadeia pesada dos clones 5G3 (tendo uma
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70/77 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 e uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 60), 5D7 (tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 62) e 32H4 (tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 e uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 5) foram comparadas na Figura 9C.
[00216] Nos clones amadurecidos por afinidade de 32H4, as sequências de HCDR1 são mostradas como nas SEQ ID NOs: 63 e 64, respectivamente, e as sequências de HCDR2 são mostradas como nas SEQ ID NOs: 65 e 66, respectivamente. Ver a Figura 9D para detalhes.
[00217] Comparado com o VH do anticorpo parental 32H4, o 5G3 tem mutações de 5 locais, com 95,7% de similaridade; 2D3 tem mutações de 5 locais, com 95,8% de similaridade; 5D7 tem mutações de 8 locais, com 95% de similaridade; e 1B11 tem mutações de 5 locais, com 93,2% de similaridade.
Exemplo 9. Expressão e purificação de scFv [00218] O TG1 contendo o gene do anticorpo foi riscado para cultura, os clones únicos foram coletados e inoculados em meio de glicose 2xTYAmp-5% e cultivados a 37°C, a 220 rpm, para OD600 nM = 0,8 a 0,9, e o IPTG foi adicionado a concentração final de 1 mM, seguida de incubação a 220 rpm a 25°C durante a noite para induzir a expressão de scFv.
[00219] As cepas foram coletadas por centrifugação, suspensas em Tris HCI 30 mM, sacarose 20% e EDTA 1 mM (pH 8,0) (80 ml por grama de cepas), banhadas em gelo e centrifugadas a 4°C a 8000 g. O sobrenadante A foi tomado, o precipitado foi suspenso com 8 ml de MgSCU 5 mM, banhado em gelo, agitado suavemente por 10 minutos, e centrifugado a 4°C a 8000 g, e o sobrenadante B foi tomado. O sobrenadante A e o sobrenadante B foram combinados, centrifugados a 12000 g por 15 minutos, e o sobrenadante foi tomado como o fluido de choque osmótico frio.
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71/77 [00220] A purificação por afinidade foi realizada usando uma coluna de níquel, a afinidade foi medida usando o biacore T200 e as constantes de associação e dissociação dos anticorpos amadurecidos por afinidade são mostradas na Figura 10A.
[00221] A especificidade dos anticorpos 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 e 1B11 foi determinada por ELISA padrão seguindo o método do Exemplo 3. Os resultados foram mostrados como na Figura 10B. Os clones 1B11, 2C7, 2D3 e 2D4 do anticorpo parental 31C2 se ligam especificamente à IL13RA2 humana, não se ligam à IL13RA1 humana e reagem de maneira cruzada com a IL13RA2 murina. Os clones 5D7 e 5G3 do anticorpo parental 32H4 se ligam especificamente à IL13RA2 humana, não se ligam à IL13RA1 humana e não se ligam à IL13RA2 murina.
Exemplo 10. Determinação da expressão e afinidade das formas scFv_Fc dos anticorpos [00222] Os seis anticorpos 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 e 1B11 com maior afinidade foram capturados para construção da forma de fusão scFv_Fc.
[00223] Com referência ao Exemplo 4, um local de restrição adequado e uma base protetora foram introduzidos à montante do VH, e um local de restrição adequado e uma base protetora foram introduzidos à jusante do VL. O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1%, purificado e recuperado. Após digestão enzimática, o produto foi ligado ao vetor de expressão eucariótico VI52 contendo o segmento Fc humano (adquirido da ShangHai Raygene Biotechnology Co., Ltd.). O vetor foi transientemente transfectado em 30 ml de células 293F pela 293Fectina e expresso. O sobrenadante da cultura foi coletado 5 a 7 dias após a transfecção e submetido à purificação por afinidade pela proteína A. A agregação dos anticorpos foi analisada por SEC. O resultado é mostrado como na Figura 11. [00224] A afinidade foi determinada usando o método do Exemplo 5
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72/77 usando biacore T200, e os resultados são mostrados como nas Figuras 11B a 11G. Os anticorpos amadurecidos por afinidade têm uma afinidade 3 a 10 vezes maior que a do anticorpo parental. As constantes de associação e dissociação dos anticorpos são mostradas na Figura 11F.
Exemplo 11. Determinação de EC50 da ligação de formas scFv_Fc de anticorpos a células U251 [00225] Seguindo o método do Exemplo 6, as células foram coletadas, lavadas uma vez com um meio de crescimento e ressuspensas em PBS, e a concentração de células foi ajustada para 4E+5 células/ml. O anticorpo de fusão scFv_Fc gradualmente diluído foi incubado com as células por 30 minutos em gelo, e o anticorpo foi diluído em série 5 vezes com 2000 nM como concentração inicial, em 11 gradientes. Em seguida, a mistura foi incubada com um anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com FITC. Após duas etapas de lavagem, a detecção foi realizada usando um instrumento Guava easyCyteTM HT System. Os resultados são mostrados na Figura 12: as CE50s de ligação das formas scFv_Fc dos anticorpos 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 e 1B11 a U251 células foram de 0,56 nM, 0,57 nM, 0,53 nM, 0,37 nM, 0,33 nM e 0,47 nM, respectivamente. Há também um aumento de 2 a 8 vezes em comparação com o anticorpo parental.
Exemplo 12. Preparação de células CAR-T [00226] 2D4 e 5G3 foram selecionados para preparação de células
CAR-T e estudos de atividade antitumoral.
1. Construção do plasmídeo de embalagem lentiviral pRRL-hu8E3-28Z [00227] Utilizando PRRLSIN-cPPT.EF-loc como vetor, foram construídos plasmídeos lentivirais que expressam os receptores de antígeno quiméricos dos anticorpos 2D4 e 5G3, incluindo PRRLSIN-cPPT.EF-loc2D4-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-la-2D4- BBZ, PRRLSIN-cPPT.EF-la-2D428BBZ e PRRLSIN-cPPT.EF-la-5G3-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-la-5G3BBZ, PRRLSIN-cPPT.EF-la-5G3-28BBZ.
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73/77 [00228] A sequência 2D4-28Z consiste em peptideo de sinal CD8oc (SEQ ID NO: 68), 2D4scFv (SEQ ID NO: 67), dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 69), região transmembranar CD28 (SEQ ID NO: 70) e domínio de sinalização intracelular (SEQ ID NO: 71) e o segmento intracelular Οϋ3ζ (SEQ ID NO: 72) de CD3.
[00229] A sequência 2D4-BBZ consiste em peptideo sinal CD8oc (SEQ ID NO: 68), 2D4scFv (SEQ ID NO: 67), dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 69), região transmembranar CD8 (SEQ ID NO: 73), domínio de sinalização intracelular CD137 (SEQ ID NO: 74) e o segmento intracelular CD3Ç (SEQ ID NO: 72) de CD3.
[00230] A sequência 2D4-28BBZ consiste em peptideo de sinal CD8oc (SEQ ID NO: 68), 2D4scFv (SEQ ID NO: 67), dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 69), região transmembranar CD28 (SEQ ID NO: 70) e domínio de sinalização intracelular (SEQ ID NO: 71), o domínio de sinalização intracelular de CD137 (SEQ ID NO: 74) e o segmento intracelular Οϋ3ζ (SEQ ID NO: 72) de CD3.
[00231] A sequência 5G3-28Z consiste em peptideo sinal CD8oc (SEQ ID NO: 68), 5G3scFv (SEQ ID NO: 75), dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 69), região transmembranar CD28 (SEQ ID NO: 70) e domínio de sinalização intracelular (SEQ ID NO: 71) e o segmento intracelular Οϋ3ζ (SEQ ID NO: 72) de CD3.
[00232] A sequência 5G3-BBZ consiste em peptideo sinal CD8oc (SEQ ID NO: 68), 5G3scFv (SEQ ID NO: 75), dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 69), região transmembranar CD8 (SEQ ID NO: 73), domínio de sinalização intracelular CD137 (SEQ ID NO: 74) e o segmento intracelular CD3Ç (SEQ ID NO: 72) de CD3.
[00233] A sequência 5G3-28BBZ consiste em peptideo sinal CD8(X (SEQ ID NO: 68), 5G3scFv (SEQ ID NO: 75), dobradiça CD8 (SEQ ID NO: 69), região transmembranar CD28 (SEQ ID NO: 70) e domínio de sinalização
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74/77 intracelular (SEQ ID NO: 71), o domínio de sinalização intracelular de CD137 (SEQ ID NO: 74) e o segmento intracelular Οϋ3ζ (SEQ ID NO: 72) de CD3.
2. Embalagem lentiviral, concentração de vírus e determinação de títulos do vetor lentiviral CAR direcionado a IL13Ra2 [00234] As células 293T foram semeadas a uma densidade de 1,7 x 107 em uma placa de cultura de 15 cm, e o meio é DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (BioWest). 13,73 pg dos plasmideos do gene alvo PRRLSIN2D4-28Z, PRRLSIN-2D4-BBZ, PRRLSIN-2D4-28BBZ, PRRLSIN-5G328Z, PRRLSIN-5G3-BBZ e PRRLSIN-5G3-28BBZ e 16,4 pg de plasmideos de embalagem pRs REV, 16,4 pg de RRE-PMDLg e 6,4 pg de Vsvg foram dissolvidos respectivamente em 2048 pL de um líquido de cultura DMEM em branco e bem misturados.
[00235] 158,4 pg de PEI (1 pg/pl) foram dissolvidos em 2048 pl de líquido de cultura DMEM isento de soro, bem misturados e incubados à temperatura ambiente. A mistura plasmídica foi adicionada à mistura PEI e incubada à temperatura ambiente durante 20 minutos. 4096 ml do complexo de transfecção foram adicionados gota a gota a uma placa de cultura de 15 cm contendo 20 ml de meio DMEM. Após 4 a 5 horas, as células 293T transfectadas foram trocadas com meio FBS DMEM a 10% e incubadas a 37°C por 72 h. O sobrenadante da solução do vírus foi coletado e concentrado, e o título do vírus foi determinado. Os títulos de vírus concentrados foram:
2D4-28Z: 3,89E x 108 U/ml,
2D4-BBZ: 3.O8E x 108 U/ml,
2D4-28BBZ: 2,72E x 108 U/ml,
5G3-28Z: 3,7E x 108 U/ml, 5G3-BBZ: 1,88E x 108 U/ml, e 5G3-28BBZ: 3,1 IE x 108 U/ml, respectivamente.
3. Transdução lentiviral de linfócitos T------preparação de linfócitos T
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75/77 positivos para CAR [00236] Ativação dos linfócitos T: os linfócitos T foram adicionados a um meio de cultura de linfócitos a uma densidade de cerca de 5 x 105/mL, e esferas magnéticas (Invitrogen) revestidas com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28 ao mesmo tempo foram adicionado a uma proporção de esferas magnéticas: célula de 2:1 e IL-2 humana recombinante (Shanghai Huaxin Biotechnology Co., Ltd.) com uma concentração final de 500 U/mL foi adicionada para estimulação e cultivada por 24 a 48 horas.
[00237] Revestimento de uma placa de 24 poços com retronectina: 380 μΐ de solução de retronectina 5 μg/ml (PBS) foram adicionados a cada poço e incubados a 4°C durante a noite. A solução de retronectina (PBS) na placa de 24 poços foi descartada, seguida por lavagem com 1 ml de PBS duas vezes, lavagem com o meio uma vez (os poços sendo mantidos úmidos); as células foram inoculadas em uma placa de 24 poços revestida com retronectina, com o número de células por poço sendo 5 x 105 e o volume da solução de cultura sendo 500 μΐ; o lentivírus concentrado foi adicionado às células PBMC com MOI de 15, centrifugado a 32°C a 1200 g por 60 minutos, transferido para uma incubadora de células e após infecção por vírus por 24 h, o líquido da cultura foi centrifugado a baixa velocidade (300 rpm, 10 minutos, centrífuga grande) para mudar o líquido da cultura. As esferas magnéticas podem ser removidas 3 a 4 dias após a infecção.
4. Expressão do receptor de antígeno quimérico de linfócitos T [00238] Os linfócitos T infectados com lentivírus foram cultivados e, no dia 7, foram retiradas células T, 1 x 106, divididas em alíquotas em duas porções, centrifugadas a 4°C a 5000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o restante foi lavado com PBS duas vezes. As células do grupo de controle foram incubadas com 50 μΐ de anticorpo PE-SA (diluição 1:200) em gelo por 45 minutos, lavadas com PBS (2% NBS) duas vezes e ressuspensas como controle. As células do grupo de teste foram incubadas
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76/77 com 50 mL de anticorpo IgG humano humano cabra-anti-IgG, F(ab’)2 diluído 1:50 no gelo por 45 minutos e lavadas com PBS (2% NBS) duas vezes; 50 μΐ de anticorpo PE-SA (diluição 1:200) foram adicionados e incubados em gelo por 45 minutos; 2 ml de PBS (2% de NBS) foram adicionados para ressuspender as células e centrifugados a 4°C a 5000 rpm/min por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o processo foi repetido duas vezes; a proporção de células T positivas para CAR foi detectada por um citômetro de fluxo.
5. Ensaio de citotoxicidade de células T CAR dirigidas a IL13Ra2 [00239] Ao comparar a atividade de morte in vitro das células UTD, 2D4-28Z, 2D4-BBZ, 2D4-28BBZ, 5G3-28Z, 5G3-BBZ, 5G3-28BBZ CAR T, as taxas positivas de infecção para as seis células T CAR foram de 66,0 %, 26,3%, 34,8%, 59,9%, 35,5% e 23,8%, respectivamente.
[00240] 50 ul de RMPI + 10% de soro fetal bovino (Gibco) + anticorpo duplo foram adicionados a cada uma das três placas E 16, respectivamente, e colocados em um monitor em tempo real para ajustar a linha de base.
[00241] Células alvo: 50 ul de 1 x 104/mL de células U251 foram inoculadas em uma placa E-Plate 16 respectivamente, permaneceram por 30 a 40 minutos e colocadas no monitor em tempo real para iniciar o monitoramento.
[00242] Células efetoras: Após 18 horas, células UTD e CAR T expressando diferentes receptores quiméricos de antígeno foram adicionadas a uma proporção efetor: alvo de 3:1,1:1 ou 1:3.
[00243] Dois poços duplicados foram providos em cada grupo e a média de dois poços duplicados foi tomada. O tempo de detecção foi às 38 h. [00244] Cada grupo experimental e cada grupo de controle são os seguintes.
[00245] Cada grupo experimental: cada célula alvo + CAR T expressando diferentes receptores quiméricos de antígeno.
Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 83/107 /77 [00246] Grupo de controle 1: células alvo.
[00247] Grupo controle 2: meio em branco.
[00248] A fórmula de cálculo da citotoxicidade é: % citotoxicidade = [(grupo experimental - grupo espontâneo de células efetoras - grupo espontâneo de células alvo)/(célula alvo máxima - célula espontânea máxima)] * 100.
[00249] Os resultados experimentais são mostrados como na Figura 13. Cada uma das células T CAR que expressam diferentes receptores quiméricos de antígeno teve significativa atividade in vitro contra células positivas para IL13Ra2.
[00250] Todos os documentos mencionados na invenção são citados como referência, como se cada documento fosse citado como referência individualmente. Além disso, deve ser entendido que, depois de ler os ensinamentos da invenção descritos acima, as pessoas versadas na técnica podem fazer várias alterações ou modificações da invenção, e essas formas equivalentes também devem se enquadrar no escopo do presente pedido, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims (32)

    REIVINDICAÇÕES
  1. (1) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 10 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
    (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 8;
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    (1) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo HCDR1 mostrada nas SEQ ID NOs: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 ou 64 e/ou HCDR2 mostrada nas SEQ ID NOs: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 ou 66, e/ou HCDR3 mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 11 ou 12;
    1. Anticorpo que reconhece especificamente IL-13RA2, caracterizado pelo fato de que a afinidade de ligação relativa EC50 do anticorpo para células U251 que expressam endogenamente IL-13RA2 não é superior a 100 nM, de um modo preferido não superior a 10 nM, de um modo mais preferido 0,01 a 10 nM.
  2. (2) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO:
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    (2) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 16; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 9, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 10 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 12;
    2/11 (2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 ou 61, ou uma variante da sequência;
    (2) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13 e/ou LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e/ou LCDR3 mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 15 ou 16;
    2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dentre qualquer um de:
  3. (3) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 61 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    (3) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 16; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 64, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 66 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 12;
    3/11 opcionais ou variantes das mesmas:
    (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de (1) e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de (2).
    3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dentre qualquer um de:
    (3) um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada do anticorpo de (1) e uma região variável de cadeia leve do anticorpo de (2); e (4) um anticorpo que é uma variante do anticorpo em conformidade com qualquer um de (1) a (3) e tem atividade idêntica ou semelhante ao anticorpo em conformidade com qualquer um de (1) a (3).
  4. (4) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 29 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    4/11 (8) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 48, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 54 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
    (4) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 45, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 52 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
    4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve do anticorpo compreende LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 16
  5. (5) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 59 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    5/11
    (5) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 16; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 63, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 65 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 12;
    5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve do anticorpo tem uma sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 4 ou 8, ou tem uma sequência com pelo menos 80%, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de similaridade com qualquer uma das sequências acima.
  6. 6/11
    (6) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 39 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    6 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    (6) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 50, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 56 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
    6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende HCDR1 mostrada nas SEQ ID NOs: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 ou 64, HCDR2 mostrada nas SEQ ID NOs: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 ou 66 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
  7. 7/11 o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11; e uma molécula funcional ligada ao mesmo; a molécula funcional sendo selecionada a partir de uma molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral, uma molécula que inibe um tumor, uma molécula que tem como alvo um marcador da superfície celular imune ou um marcador detectável.
    (7) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 31 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    (7) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 46, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 52 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 87/107
    7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada do anticorpo tem uma sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 ou 61, ou tem uma sequência com pelo menos 80%, de um modo mais preferido 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de similaridade com qualquer uma das sequências acima.
  8. 8/11 um peptideo ligante entre o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e a molécula funcional ligada ao mesmo.
    (8) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 35 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as regiões CDR da região variável de cadeia leve e as regiões CDR da região variável de cadeia pesada têm as seguintes sequências
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 86/107
  9. 9/11
    2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD 160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, LylO8), SLAM (SLAMF1, CD 150 , IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NK p46 e NKG2D, ou uma combinação dos mesmos.
    (9) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 33 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 89/107
    9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que (1) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    (9) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 47, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 53 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
  10. 10/11 como definido na reivindicação 26 ou o vírus como definido na reivindicação 27; ou expressa o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 na superfície;
    de um modo preferido, a célula imune é: um linfócito T, uma célula NK ou um linfócito NKT.
    10. Anticorpo que reconhece especificamente IL-13RA2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo reconhece o mesmo determinante antigênico que o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
    (10) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 37 ou uma sequência de uma variante da mesma;
    (10) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 49, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 55 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11;
  11. 11 / 11
    11. Anticorpo que reconhece especificamente IL-13RA2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga competitivamente a IL13RA2 com o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
    (11) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 41 ou uma sequência de uma variante da mesma; ou (12) a região variável de cadeia leve tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de uma variante da mesma e a região variável de cadeia pesada tem uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 43 ou uma sequência de uma variante da mesma.
    (11) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 51, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 57 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11; ou (12) LCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 13, LCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 14 e LCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 15; HCDR1 mostrada na SEQ ID NO: 49, HCDR2 mostrada na SEQ ID NO: 58 e HCDR3 mostrada na SEQ ID NO: 11.
  12. 12. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
  13. 13. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 12.
  14. 14. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 13 ou tem o ácido nucleico como definido na reivindicação 12 integrado no genoma.
  15. 15. Imunoconjugado multifuncional, caracterizado pelo fato de que o imunoconjugado multifuncional compreende:
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 90/107
  16. 16. Imunoconjugado multifuncional de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a molécula que tem como alvo um marcador de superfície tumoral é um anticorpo ou ligando que se liga a um marcador de superfície tumoral diferente de IL-13RA2; ou a molécula que inibe um tumor é uma citocina antitumoral ou uma toxina antitumoral; de um modo preferido, a citocina é selecionada dentre IL-12, IL-15, interferon de tipo I e TNF-alfa.
  17. 17. Imunoconjugado multifuncional de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a molécula que se dirige a um marcador de superfície celular imunológico é um anticorpo que se liga a um marcador de superfície celular imune, de um modo preferido selecionado dentre CD3, CD 16 e CD28 e de um modo mais preferido, o anticorpo que se liga ao marcador de superfície da célula imune é um anticorpo anti-CD3.
  18. 18. Imunoconjugado multifuncional de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a molécula que se dirige ao marcador de superfície celular imune é um anticorpo que se liga a um marcador de superfície de células T e forma um anticorpo bifuncional com o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em que as células T estão envolvidas.
  19. 19. Imunoconjugado multifuncional de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o imunoconjugado multifuncional é um polipeptídeo de fusão compreendendo adicionalmente
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 91/107
  20. 20. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica o imunoconjugado multifuncional como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19.
  21. 21. Receptor de antígeno quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o receptor de antígeno quimérico compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, uma região transmembrana e uma região de sinalização intracelular conectada sequencialmente.
  22. 22. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular é selecionada dentre domínios de sinalização funcionais de proteínas CD3Ç, CD3% CD3Ô, CD3e, FcRy (FCER1G), FcRP (FceRlb), CD79a, CD79b, FcyRIIa, DAP10 e DAP12 ou uma combinação dos mesmos.
  23. 23. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular tem ainda um domínio de sinalização coestimulatório e o domínio de sinalização coestimulatório compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada dentre: CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, EIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligando que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (FIGHTR), SFAMF7, NKp80 (KFRF1), CD160, CD19, CD4, CD8a, CD83, IF2R3, IF2RY, IF7R0C, ITGA4, VFA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VFA6, CD49f, ITGAD, CDlld, ITGAE, CD103, ITGAF, CDlla, FFA-1, ITGAM, CD lib, ITGAX, CD 11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD 18, FFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKF, DNAM1 (CD226), SFAMF4 (CD244,
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 92/107
  24. 24. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o receptor de antígeno quimérico compreende um anticorpo, uma região transmembrana e uma região de sinalização intracelular conectada sequencialmente como segue:
    o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CD8 e CD3Ç; o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CD8, CD137 e CD3Ç; ou o anticorpo como definido em qualquer uma das
    reivindicações 1 a 11, a região transmembranar de molécula CD28, a região de sinalização intracelular de molécula CD28 e CD3Ç; ou o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, a região transmembranar de molécula CD28, a região de sinalização intracelular de molécula CD28, CD137 e CD3Ç.
  25. 25. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que codifica o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 21a 24.
  26. 26. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 25.
  27. 27. Vírus, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 26.
  28. 28. Célula imune modificada pelo receptor do antígeno quimérico, caracterizada pelo fato de que a célula imune é transduzida com o ácido nucleico como definido na reivindicação 27, ou o vetor de expressão
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 93/107
  29. 29. Célula imune de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a célula imune porta ainda uma sequência de codificação de uma citocina exógena; ou a célula imune expressa ainda outro receptor de antígeno quimérico que não contém CD3Ç; ou a célula imune expressa ainda um receptor de quimiocina; de um modo preferido, o receptor de quimiocina compreende CCR; ou a célula imune expressa ainda um siRNA que reduz a expressão de PD-1 ou uma proteína que bloqueia PD-L1; ou a PD-1 endógena na célula imune é eliminada pela tecnologia de edição de genes; ou a célula imune expressa ainda um interruptor de segurança.
  30. 30. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende:
    o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou um ácido nucleico que codifica o anticorpo; ou o imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19 ou um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado;
    ou o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 ou um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico; ou a célula imune modificada do receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 28 ou 29;
    e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
    Petição 870190093052, de 17/09/2019, pág. 94/107
  31. 31. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:
    um recipiente e a composição farmacêutica como definido na reivindicação 30 no recipiente; ou um recipiente e o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou um ácido nucleico que codifica o anticorpo; ou o imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19 ou um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado; ou o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 ou um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico; ou a célula imune modificada do receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 28 ou 29, no recipiente.
  32. 32. Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou um ácido nucleico que codifica o anticorpo; ou o imunoconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 19 ou um ácido nucleico que codifica o imunoconjugado; ou o receptor de antígeno quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 24 ou um ácido nucleico que codifica o receptor de antígeno quimérico; ou a célula imune modificada do receptor de antígeno quimérico como definido na reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de ser para tratar um tumor que expressa IL-13RA2, de um modo preferido, o tumor que expressa IL-13RA2 é câncer no cérebro, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer renal, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer gástrico, câncer intestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de tireoide, câncer de próstata e sarcoma de Kaposi e de um modo mais preferido, o câncer cerebral é selecionado dentre astrocitoma, meningioma, oligodendroglioma e glioma.
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