KR20190127740A - Il-13ra2를 표적화하는 항체 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체가 제공되며, 이는 표적화 항-종양 약물뿐만 아니라 종양 진단용 약물을 제조하는 데 사용될 수 있다.

Description

IL-13RA2-표적화된 항체 및 이의 적용
본 발명은 종양 면역 치료나 진단에 관한 것이며, 보다 구체적으로 IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체 및 그 용도에 관한 것이다.
미국에서는 매년 다형성 교모세포종 및 교모세포종을 포함하는 악성 신경교종(MG)의 20,000건의 새로운 병례가 있다. 미국 뇌종양 학회의 통계 자료에 따르면, 미국에서는 2010년까지 140,000명의 사람들이 악성 뇌종양을 앓고 있다. MG는 희귀 질병이기는 하지만, 악성도와 치사율이 매우 높다. 현재 표준 치료 수단은 매우 제한적인 효과를 가지고 있고, 수술과 방사선 치료 후 5년 생존율도 매우 낮다. 수술 후 재발한 환자의 경우, 새로운 치료 옵션이 거의 없다. 따라서, 새로운 표적 및 새로운 치료 수단의 개발은 대다수의 환자에게 절박하게 필요하다.
인터류킨-13 수용체 서브유닛 α 2(IL-13RA2)는 인간 신경교종 등과 같은 악성 종양 세포의 표면에서 특이적으로 높게 발현되는 종양-특이적 마커(Dehinski 등, (1995)Clin.Cancer Res.1, 1253-1258)이다. 인간 신경교종의 치료 표적으로서의 인간 IL-13RA2는 1988년 이후 미국 FDA의 관심을 끌고 있으며, 조직체는 치료 표적으로서의 인간 IL-13RA2에 대한 약물 IL-13-PE38 및 인간 IL-13RA2에 대한 단쇄 항체 scFv-PE 융합 분자를 차례로 제조했다. IL-13-PE38은 신경교종, 두경부 종양, 난소암 및 신장암과 같은 악성 종양의 치료 효능을 달성했으며 미국 FDA에 의해 임상 치료가 승인되기는 했지만; 치료 과정에 있어서, IL-13-PE38은 종양 세포 표면에서 특이적으로 발현된 인간 IL-13RA2에 결합할 뿐만 아니라 정상 조직 세포 표면에서 발현된 IL13-RA1에도 결합하여 정상 조직과 세포를 손상시킨다. 엄격한 표적 피험자가 없기 때문에 IL-13-PE38의 추가 적용에 제한이 있다.
본 발명은 IL-13RA2에 특이적인 항체를 찾고, IL-13RA2를 표적화하는 면역 이펙터 세포를 개발하는 것을 목표로 한다.
본 발명의 목적은 IL-13RA2에 대한 항체 및 그 용도를 제공하는 것이다.
제 1 양태에 있어서, 본 발명은 IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체를 제공하며, 여기서 IL-13RA2를 내인성으로 발현하는 U251 세포에 대한 항체의 상대 결합 친화도 EC50은 100nM 이하이고, 바람직하게는 10nM 이하이고, 보다 바람직하게는 0.01~10nM이다.
바람직한 예에 있어서, GraphPad Prism 5 소프트웨어(GraphPad Software, Inc)는 상대 친화도 데이터의 처리에 사용된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 상기 항체는 다음 중 어느 하나로부터 선택된다.
(1) SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63, 또는 64로 나타내어지는 HCDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65, 또는 66으로 나타내어지는 HCDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 11 또는 12 중 어느 하나로 나타내어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(2) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 15 또는 16 중 어느 하나로 나타내어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(3) 상기 (1)의 항체의 중쇄 가변 영역 및 상기 (2)의 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
(4) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 따른 항체의 변이체이고, 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 따른 항체와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 항체
구체적인 실시형태에 있어서, 항체는 다음 중 어느 하나로부터 선택된다.
(1) SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 8의 변이체의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(2) SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 또는 61로 나타내어지는 서열, 또는 그 서열의 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
(3) 상기 (1)의 항체의 중쇄 가변 영역 및 상기 (2)의 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체
구체적인 실시형태에 있어서, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4 또는 8로 나타내어지는 서열을 갖거나, 또는 임의의 상기 서열과 적어도 80%, 예를 들면 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 유사성을 갖는 서열을 가진다.
구체적인 실시형태에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 또는 64로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 또는 66으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 또는 61로 나타내어지는 서열을 갖거나, 또는 임의의 상기 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 유사성을 갖는 서열을 가진다.
구체적인 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 영역의 CDR 영역 및 중쇄 가변 영역의 CDR 영역은 다음의 임의의 서열 또는 그것의 변이체를 갖는다.
(1) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(2) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3;
(3) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 64로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 66으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3;
(4) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 45로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 52로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(5) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 63으로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 65로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3;
(6) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 50으로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 56으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(7) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 46으로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 52로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(8) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 48로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 54로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(9) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 47로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 53으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(10) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 49로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 55로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
(11) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 51로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 57로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3; 또는
(12) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 49로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 58로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3
구체적인 실시형태에 있어서,
(1) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(2) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6으로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(3) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 61로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(4) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(5) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 59로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(6) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(7) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 31로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(8) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(9) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 33으로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(10) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
(11) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖거나; 또는
(12) 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖는다.
제 2 양태에 있어서, 본 발명은 IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는 제 1 양태의 항체와 동일한 항원 결정기를 인식한다.
제 3 양태에 있어서, 본 발명은 IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체를 제공하고, 여기서 항체는 제 1 양태의 항체와 경쟁적으로 IL-13RA2에 결합한다.
제 4 양태에 있어서, 본 발명은 제 1 양태~제 3 양태의 항체를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
제 5 양태에 있어서, 본 발명은 제 4 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제 6 양태에 있어서, 본 발명은 제 5 양태의 발현 벡터를 포함하거나 또는 게놈에 통합된 제 4 양태의 핵산을 갖는 숙주 세포를 제공한다.
제 7 양태에 있어서, 본 발명은,
제 1 양태~제 3 양태의 항체; 및
그것에 연결된 기능성 분자로서, 종양 표면 마커를 표적화하는 분자, 종양을 억제하는 분자, 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자, 또는 검출가능한 표지물로부터 선택된 기능성 분자를 포함하는 다기능성 면역접합체를 제공한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 종양 표면 마커를 표적화하는 분자는 IL-13RA2 외의 종양 표면 마커에 결합하는 항체 또는 리간드이거나; 또는
종양을 억제하는 분자는 항-종양 사이토카인 또는 항-종양 독소이며; 바람직하게는 상기 사이토카인은 IL-12, IL-15, I형 인터페론, 및 TNF-α로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자는 면역 세포 표면 마커에 결합하는 항체이며, 바람직하게는 상기 결합된 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD16 및 CD28로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 면역 세포 표면 마커에 결합하는 항체는 항-CD3 항체이다.
구체적인 실시형태에 있어서, 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자는 T 세포 표면 마커에 결합하는 항체이고, T 세포가 관여하는 제 1 양태~제 3 양태 중 어느 하나의 항체와 함께 이기능성 항체를 형성한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 다기능성 면역접합체는 제 1 양태~제 3 양태 중 어느 하나의 항체와, 그것에 연결된 기능성 분자 사이에 링커 펩티드를 더 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
제 8 양태에 있어서, 본 발명은 제 7 양태의 다기능성 면역접합체를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
제 9 양태에 있어서, 본 발명은 제 1 양태~제 3 양태의 항체의 키메라 항원 수용체를 제공하고, 여기서 키메라 항원 수용체는 순차적으로 연결된 제 1 양태~제 3 양태의 항체, 막 관통 영역, 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 세포내 신호 전달 영역은 단백질의 기능성 신호 전달 도메인 CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, FcRγ(FCER1G), FcRβ(FcεR1b), CD79a, CD79b, FcγRIIa, DAP10 및 DAP12, 또는 그것의 조합으로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 세포내 신호 전달 영역은 공자극 신호 전달 도메인을 더 갖고, 상기 공자극 신호 전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46 및 NKG2D, 또는 그것의 조합으로부터 선택된 단백질의 기능성 신호 전달 도메인을 포함한다.
구체적인 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체는 다음과 같이 순차적으로 연결된 항체, 막 관통 영역, 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다.
제 1 양태~제 3 양태의 항체, CD8 및 CD3ζ;
제 1 양태~제 3 양태의 항체, CD8, CD137 및 CD3ζ; 또는
제 1 양태~제 3 양태의 항체, CD28 분자의 막 관통 영역, CD28 분자의 세포내 신호 전달 영역, 및 CD3ζ; 또는
제 1 양태~제 3 양태의 항체, CD28 분자의 막 관통 영역, CD28 분자의 세포내 신호 전달 영역, CD137 및 CD3ζ
제 10 양태에 있어서, 본 발명은 제 9 양태의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
제 11 양태에 있어서, 본 발명은 제 10 양태의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제 12 양태에 있어서, 본 발명은 제 11 양태의 벡터를 포함하는 바이러스를 제공한다.
제 13 양태에 있어서, 본 발명은 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포를 제공하고, 여기서 상기 면역 세포는 제 10 양태의 핵산, 또는 제 11 양태의 발현 벡터 또는 제 12 양태의 바이러스에 의해 형질 도입(transduced)되거나; 또는 제 9 양태의 키메라 항원 수용체가 표면에서 발현되고;
바람직하게는, 상기 면역 세포는 T 림프구, NK 세포 또는 NKT 림프구이다.
구체적인 실시형태에 있어서, 상기 면역 세포는 외인성 사이토카인의 코딩 서열을 더 갖거나; 또는
상기 면역 세포는 CD3ζ를 함유하지 않는 다른 키메라 항원 수용체를 더 발현하거나; 또는
상기 면역 세포는 케모카인 수용체를 더 발현하고; 바람직하게는 상기 케모카인 수용체는 CCR을 포함하거나; 또는
상기 면역 세포는 PD-1의 발현을 감소시키는 siRNA 또는 PD-L1을 차단하는 단백질을 더 발현하거나; 또는 상기 면역 세포 내의 내인성 PD-1이 유전자 편집 기술에 의해 녹아웃되거나; 또는
상기 면역 세포는 안전 스위치를 더 발현한다.
제 14 양태에 있어서, 본 발명은 제 1 양태~제 3 양태의 항체 또는 그 항체를 인코딩하는 핵산; 또는
제 7 양태의 면역접합체 또는 그 면역접합체를 인코딩하는 핵산; 또는
제 9 양태의 키메라 항원 수용체 또는 그 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산; 또는
제 13 양태의 항원 수용체-변형 면역 세포; 및
약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
제 15 양태에 있어서, 본 발명은,
용기, 및 그 용기 내의 제 14 양태의 약학적 조성물; 또는
용기, 및 그 용기 내의 제 11 양태~제 13 양태의 항체 또는 그 항체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 17 양태의 면역접합체 또는 그 면역접합체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 9 양태의 키메라 항원 수용체 또는 그 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 13 양태의 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포를 포함하는 키트를 제공한다.
제 16 양태에 있어서, 본 발명은 IL-13RA2를 발현하는 종양을 치료하기 위한, 제 1 양태~제 3 양태의 항체 또는 그 항체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 7 양태의 면역접합체 또는 그 면역접합체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 9 양태의 키메라 항원 수용체 또는 그 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산의 용도; 또는 제 13 양태의 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포의 용도를 제공하고,
바람직하게는, 상기 IL-13RA2를 발현하는 종양은 뇌암, 췌장암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 위암, 장암, 두경부암, 갑상선암, 전립선암, 및 카포시 육종이다. 보다 바람직하게는, 뇌암은 성상 세포종, 수막종, 핍지교종, 및 신경교종으로부터 선택된다.
위에서 설명되고 이하에서 구체적으로 설명되는 모든 다양한 기술적 특징(실시예 등)은 새로운 또는 바람직한 기술적 해결책을 형성하도록 본 발명의 범위 내에서 서로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 공간적 제한으로 인해, 이들은 더 이상 장황하게 일일이 설명하지 않는다.
도 1은 IL-13RA2_huFc, 및 IL13RA1_huFc의 SDS 전기 영동도(환원 조건)를 나타낸다.
도 2는 ELISA에 의한 IL-13RA2 및 IL13Ra1에 대한 31C2 및 32H4의 결합의 검출을 나타낸다.
도 3은 ELISA에 의한 쥐 IL-13RA2에 대한 항체 31C2 및 32H4의 결합의 검출을 나타낸다.
도 4는 FACs에 의한 U251(IL-13RA2-양성) 및 293T(IL-13RA2-음성) 세포에 대한 항체 31C2 및 32H4의 결합의 검출을 나타낸다.
도 5는 Biacore에 의한 항체 31C2 및 32H4(scFv_Fc)의 친화도의 검출을 나타낸다.
도 6은 FACs에 의한 U215 세포에 대한 항체 31C2 및 32H4의 결합의 EC50의 검출을 나타낸다.
도 7은 친화도 성숙에 대한 프라이머 정보를 나타낸다.
도 8은 친화도 성숙 후 스크리닝된 10개의 클론의 해리 상수 Kd를 나타낸다.
도 9a는 31C2의 친화도 성숙된 클론의 중쇄 서열 정렬을 나타내고, 도 9b는 31C2의 친화도 성숙된 클론의 HCDR1 및 HCDR2의 서열을 나타내고, 도 9c는 32H4의 친화도 성숙된 클론의 중쇄 서열 정렬을 나타내고, 도 9d는 32H4의 친화도 성숙된 클론의 HCDR1 및 HCDR2의 서열을 나타낸다.
도 10a는 친화도 성숙된 항체의 결합 및 해리 상수를 나타내고; 도 10b는 항체 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3, 및 1B11의 특이적인 식별 결과를 나타낸다.
도 11a는 30ml 발현 시스템에 있어서의 항체의 scFv_Fc 형태의 수율 및 친화도 성숙 후의 정제된 생성물의 응집도 측정의 결과를 나타내고; 도 11b~11g는 항체의 scFv_Fc 형태의 친화도를 나타내고; 도 11h는 항체의 결합 및 해리 상수의 결과를 나타낸다.
도 12는 U251 세포에 대한 항체 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3, 및 1B11의 scFv_Fc 형태의 결합의 EC50을 나타낸다.
도 13은 상이한 CAR-T 세포의 시험관내에서의 사멸 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 예의 연구 및 검토를 거쳐 단쇄 항체 및 인간화 항체를 포함하는, IL-13RA2를 특이적으로 식별하는 항체를 수득한다. 본 발명의 항체는 다양한 표적화 항-종양 약물뿐만 아니라 종양 진단용 약물을 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명을 보다 이해하기 쉽게 하기 위해, 먼저 몇몇 용어를 정의한다.
본원에서 CD213A2라고도 불리는 용어 "IL-13RA2"는 인터류킨-13 수용체 복합체의 서브유닛이다. 380개의 아미노산 잔기로 이루어진 막 관통 단백질(NCBI 참조 서열: NP_000631.1)이다. 그것은 IL-13RA1(NCBI 참조 서열: NP_001551.1)과 유사하며 IL-13에 강하게 결합하지만 세포내 신호 전달 도메인은 없다.
본원에서 용어 "항체"는 면역계의 항원 결합 단백질을 지칭하고; 항원 결합 영역을 갖는 온전한 전장 항체를 포함하고, "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 영역"을 갖는 단편, 또는 단쇄 가변 단편(scFv)과 같은 그것의 단쇄뿐만 아니라 본원에 제공된 항체의 변이체를 포함한다. 항체 단편은 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지고 Fab' 및 Fab'-SH를 포함하는 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (iv) 단일 가변 영역으로 이루어지는 dAb 단편(Ward 등, 1989, Nature 341: 544-546); (v) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vi) 단쇄 Fv 분자 항원-결합 부위; (vii) 이특이적 단쇄 Fv 다이머(PCT/US92/09965); (viii) "디아바디(diabody)" 또는 "트리아바디(triabody)", 유전자 융합에 의해 구성된 다가 또는 다중 특이적 단편; 및 (ix) 동일하거나 상이한 항체에 유전자 융합된 scFv를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 제 1 불변 영역 면역글로불린 도메인 외의 항체 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인의 N-말단에서의 유연한 힌지를 지칭한다. IgA 및 IgM에 대해서, Fc는 J쇄를 포함할 수 있다. IgG에 대해서, Fc는 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 및 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 그것의 카르복시 말단에 잔기 C226 또는 P230를 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스에 기반한다. 인간 IgG1에 대해서, Fc는 그것의 카르복시 말단에 잔기 P232를 포함하는 것으로 본원에 정의되고, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스에 기반한다. Fc는 분리된 영역, 또는 Fc 폴리펩티드(예를 들면, 항체) 환경의 영역을 지칭할 수 있다. 상술한 "힌지"는 항체의 제 1 불변 도메인과 제 2 불변 도메인 사이에 아미노산을 함유하는 유연한 폴리펩티드를 포함한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 위치 EU220에서 끝나고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU237에서 시작한다. 따라서, IgG에 대해서, 본원의 항체 힌지는 위치 221(IgG1의 D221)부터 231(IgG1의 A231)까지를 포함하는 것으로 본원에 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat의 EU 인덱스에 기반한다.
용어 "변이체"는 본 출원에 제공된 항체의 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 하나 이상의 활성 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체는 본 출원의 실시예에 제공된 항체와 동일하거나 유사한 활성을 갖는다.
변이체는 모항체와 비교해서 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖는다. 구체적인 실시형태에 있어서, 본원의 변이체 서열은 모항체 서열과 바람직하게는 적어도 약 80%, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98%, 가장 바람직하게는 적어도 약 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 변이체는 항체 그 자체를 지칭할 수 있고, 모항체를 포함하는 조성물을 지칭할 수도 있다. 용어 "아미노산 변형"은 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함하고, "아미노산 치환"은 모체 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미하고, "아미노산 삽입"은 모체 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치의 아미노산을 첨가하는 것을 의미하고, "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모체 폴리펩티드 서열에 있어서 특정 위치의 아미노산을 제거하는 것을 의미한다.
"아미노산 변형"은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이 유도 및 PCR-매개 돌연변이 유도에 의해 본 발명의 항체에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면 리신, 아르기닌, 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산 및 글루탐산), 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면 글리신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 및 트리토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 및 메티오닌), β-분기 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 트레오닌, 발린, 및 이소류신), 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면 티로신, 페닐알라닌, 트리토판, 및 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 또는 프레임워크 영역에 있어서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 같은 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체(변이체 항체)에 의해 보유되는 기능이 시험될 수 있다.
상술한 용어 "모항체"는 본 출원에 의해 제공된 항체 또는 본 출원에 의해 제공된 항체에 기반한 돌연변이, 친화도 성숙 또는 다른 처리 수단에 의해 수득된 항체를 지칭하고, 바람직하게는 실시예에 나타내어진 항체를 지칭한다. 모항체는 자연적으로 발생하는 항체이거나, 또는 자연적으로 발생하는 항체의 변이체 또는 변형된 버전일 수 있다. 모항체는 항체 그 자체, 모항체를 포함하는 조성물, 또는 모항체의 코딩 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결정기"는 항원성 에피토프라고도 하며, IL-13RA2 단백질 서열의 연속적인 서열로 구성될 수 있거나 또는 IL-13RA2 단백질 서열의 불연속적인 3차원 구조로 구성될 수 있다.
항-IL-13RA2 항체
본 개시 내용에 있어서, 항체를 포함하고, scFv에 기반한 항원 결합 영역을 갖는 항원 결합 단백질이 기재되어 있다. scFv는 재조합 IL-13RA2를 사용한 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택되었다. 이들 분자는 미세한 특이성을 나타낸다. 예를 들면, 항체는 IL-13RA2만을 인식하고 IL-13RA1을 인식하지 못한다. 본 발명에 있어서, IL-13RA2는 달리 명시되지 않는 한, 인간 IL-13RA2를 지칭한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명은 2가 단백질을 생성하기 위한 인간 면역글로불린 Fc 영역을 갖는 항체를 형성함으로써 항체의 전체 친화도 및 안정성을 증가시키도록 하나 이상의 중쇄 불변 영역에 융합된 scFv 서열을 갖는 항체를 포함한다. 또한, Fc 부분은 친화도 측정, 치료제의 표적화된 전달, 면역 이펙터 세포를 이용한 Fc-매개 세포 독성의 검출, 및 많은 다른 적용을 위해 항체를 고정화하도록, 다른 분자(형광 염료, 세포 독소, 방사성 동위 원소 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않음)를 예를 들면, 항원 정량화 연구에 사용된 항체에 직접 접합시킨다.
본원에 제시된 결과는 IL-13RA2를 표적화함에 있어서 본 발명의 항체의 특이성, 민감성, 및 유용성을 강조한다.
본 발명의 분자는 파지 디스플레이를 사용하여 식별되고 선택된 단쇄 가변 단편(scFv)에 기반하고고, 단쇄 가변 단편의 아미노산 서열은 IL-13RA2에 대해 분자에 특이성을 부여하고 본 개시 내용의 모든 항원 결합 단백질의 기초를 형성한다. 따라서. scFv는 예를 들면 전장 항체, Fab 및 F(ab')2와 같은 그것의 단편, 융합 단백질(scFv_Fc 포함) 및 다가 항체, 즉 동일한 항원 또는 상이한 항원에 대해 하나보다 많은 특이성을 갖는 항체, 예를 들면 이특이적 T-세포 관여자(BiTE), 트라이바디 등(Cuesta 등, Multivalent antibodies:when design surpasses evolution, Trends in Biotechnology 28: 355-362, 2010 참조)을 포함하는 일련의 상이한 "항체" 분자를 설계하는 데 사용될 수 있다.
항원 결합 단백질이 전장 항체인 일실시형태에 있어서, 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄는 전장이어도 좋고(예를 들면, 항체는 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 온전한 중쇄, 및 적어도 하나, 바람직하게는 2개의 온전한 경쇄를 포함해도 좋음); 또는 항원 결합 부분(Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv)이 포함되어도 좋다. 다른 실시형태에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역은 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE로부터 선택된다. 항체 유형의 선택은 설계된 항체가 유도하고자 하는 면역 이펙터 기능에 따라 결정될 것이다. 재조합 면역글로불린의 구축에 있어서 다양한 면역글로불린 동종형의 불변 영역에 적합한 아미노산 서열 및 다양한 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
제 1 양태에 있어서, 본 발명은 인간 IL-13RA2에 의해 안정되게 형질 주입(transfected)된 U251 세포에 대해 100nM 미만, 바람직하게는 10nM 미만, 보다 바람직하게는 0.1~1nM, 가장 바람직하게는 0.3~0.6nM의 상대 결합 친화도 EC50을 갖는 IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 IL-13RA2의 항체는 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 의해 제공된 IL-13RA2에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및/또는 SEQ ID NO: 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, IL-13RA2에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, IL-13RA2에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3, SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3을 포함하거나; 또는 EQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3, SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3을 포함한다.
보다 바람직하게는, IL-13RA2에 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3, SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3을 포함한다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 IL-13RA2에 결합하는 항체를 제공하며, 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 6의 서열, 또는 SEQ ID NO: 2나 SEQ ID NO: 6 중 어느 하나의 변이체의 서열로부터 선택된다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 8로부터 선택된 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는, IL-13RA2에 결합하는 항체 또는 그것의 단편을 제공한다.
이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열이 IL-13RA2에 개별적으로 결합할 수 있다는 것을 고려해 볼 때, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 본 발명의 항-IL-13RA2 결합 분자를 생성하도록 "혼합 및 매칭"될 수 있다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 IL-13RA2에 결합하는 항체 또는 그것의 단편의 변이체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열과 적어도 80% 동일한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 그것의 단편을 제공한다. 바람직하게는, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 동일성은 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 특히 96%, 보다 특히 97%, 더욱 보다 특히 98%, 가장 특히 99%이고, 예를 들면 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함한다. 변이체는 본 출원에 있어서의 항체를 모항체로서 사용하여 효모 라이브러리 스크리닝, 파지 라이브러리 스크리닝, 점 돌연변이 및 그 외 수단에 의해 수득될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 항-IL-13RA2 항체와 동일한 항원 결정기를 인식하는 항체를 제공한다.
항-IL-13RA2 항체의 특성
IL-13RA2에 대한 항체와 같은 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 측정법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, ELISA, biacore, 웨스턴 블롯, 및 유세포 분석법을 포함한다. 적합한 측정법이 실시예에 상세히 기재되어 있다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 IL-13RA2에 결합하는 항체 및 그것의 단편을 인코딩하는 핵산 및 벡터; 및 상기 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다. 핵산은 온전한 세포 및 세포 용해물에 위치될 수 있거나, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술, 예를 들면 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술을 이용하여 수득되어 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 VH 및 VL 세그먼트를 인코딩하는 cDNA를 수득할 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들면, 파지 디스플레이 기술을 이용하여)로부터 수득된 항체에 대해서, 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 상기 라이브러리로부터 회수될 수 있다. 외인성 핵산을 숙주 세포로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 사용된 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 7로부터 선택된 경쇄 가변 영역, 및/또는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 5로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 것이다. SEQ ID NO: 1의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 3의 경쇄 서열, 또는 SEQ ID NO: 5의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 7의 경쇄 서열을 포함하는 핵산 분자가 보다 바람직하다.
단백질의 발현을 위해, 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산이 발현 벡터에 통합될 수 있다. 단백질 발현을 위해 다양한 발현 벡터가 이용가능하다. 발현 벡터는 자기-복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈에 통합된 벡터를 포함해도 좋다. 본 발명에 사용하기 위한 발현 벡터는 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포, 효모, 및 시험관내 시스템에서의 단백질의 발현을 가능하게 하는 것을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 다양한 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하거나 또는 다른 방식으로 수득되고, 본 발명에서 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.
면역접합체
본 발명은 본원에 기재된 항체를 포함하고 다른 유형의 기능성 분자를 적어도 하나 더 포함하는 다기능성 면역접합체를 더 제공한다. 기능성 분자는 종양 표면 마커를 표적화하는 분자, 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자, 또는 검출가능한 표지물로부터 선택되지만, 이들에 한정되지 않는다. 항체 및 기능성 분자는 공유결합, 커플링, 부착, 가교 등에 의해 접합체를 구성해도 좋다.
바람직한 방식에 있어서, 면역접합체는 본 발명의 항체 및 종양 표면 마커를 표적화하는 적어도 하나의 분자 또는 종양을 억제하는 분자를 포함해도 좋다. 종양을 억제하는 분자는 항-종양 사이토카인 또는 항-종양 독소이어도 좋고; 바람직하게는 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, I형 IFN, 및 TNF-α를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 실시형태에 있어서, 종양 표면 마커를 표적화하는 분자는 본 발명의 항체가 표적화되는 동일한 종양의 표면 마커를 표적화하는 분자이다. 예를 들면, 종양 표면 마커를 표적화하는 분자는 종양 표면 마커에 결합하는 항체 또는 리간드일 수 있고, 예를 들면, 이러한 분자는 본 발명의 항체와 협력하여 보다 정확하게 종양 세포를 선택적으로 표적화할 수 있다.
바람직한 실시형태로서, 면역접합체는 본 발명의 향체 및 검출가능한 표지물을 포함해도 좋다. 검출가능한 표지물은 형광 표지물, 발색 표지물; 예를 들면 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 물질을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 하나보다 많은 표지물이 포함되어도 좋다. 검출 및/또는 분석 및/또는 진단 목적으로 항체를 표지하기 위해 사용된 표지물은 (조직)샘플의 면역 조직화학적 염색법, 유세포 분석법 등과 같은 사용된 특정 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 따라 결정된다. 당업계에 공지되어 있는 검출/분석/진단 기술 및/또는 방법에 적합한 표지물은 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 방식으로서, 면역접합체는 본 발명의 항체 및 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자를 포함해도 좋다. 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자는 면역 세포 표면 마커에 결합하는 항체 또는 리간드이어도 좋고, 이러한 분자는 면역 세포를 인식할 수 있어 본 발명의 항체를 면역 세포로 운반할 할 수 있고, 이어서 본 발명의 항체는 면역 세포를 종양 세포에 표적화시킴으로써 종양의 면역 세포-특이적 사멸을 유도할 수 있다. 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD16 및 CD28로부터 선택되어도 좋고, 보다 바람직하게는 면역 세포 표면 마커에 결합하는 항체는 항-CD3 항체이다. 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 및 NKT 세포로부터 선택될 수 있다.
직접 또는 간접(예를 들면, 링커를 통해) 접합에 의한 면역접합체의 화학적 생성에 의해, 면역접합체는 본 발명의 항체 및 다른 적합한 단백질을 포함하는 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 융합 단백질은 당업계에 공지되어 있는 방법, 예를 들면 핵산 분자를 구축하고 후속하여 발현시킴으로써 제조합에 의해 생성될 수 있고, 이는 리딩 프레임에 따라 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 적합한 표지물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 적어도 하나의 항체, 기능적 변이체 또는 그것의 면역접합체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 관련 서열이 수득되면, 재조합 방법을 이용하여 상기 관련 서열을 대량으로 수득할 수 있다. 이것은 일반적으로 상기 서열을 벡터에 클로닝하여 세포로 운반시킨 후, 증식된 숙주 세포로부터 종래의 방법으로 상기 관련 서열을 분리시킴으로써 수행된다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 세포외 결합 도메인, 막 관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세포내 신호 전달 도메인에 융합된 종양 항원 결합 도메인을 지칭한다. 전형적으로, CAR의 세포외 결합 도메인은 쥐, 또는 인간화된 또는 인간 단일 클론 항체로부터 유래된다.
세포외 결합 도메인은 본 발명의 항체이고, 비제한적인 예로서는 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv), 라이브러리로부터 선택된 항원 결합 단편(Fab), 단일 도메인 단편, 또는 상동 수용체와 결합하는 내추럴 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역은 scFv, Fab, 또는 내추럴 리간드뿐만 아니라 그것의 임의의 유도체도 포함할 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 온전한 항체 외의 분자를 지칭하고, 이는 온전한 항체의 일부분을 포함할 수 있으며 온전한 항체와 결합하는 항원에 결합할 수 있다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 이특이적 항체, 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들면, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
scFv, Fab 또는 내추럴 리간드와 같은 세포외 항원 결합 영역은 항원 특이성을 결정하는 CAR의 부분일 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 임의의 상보적 표적에 결합할 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 공지된 가변 영역 서열의 항체로부터 유래될 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 이용가능한 쥐 하이브리도마로부터 수득될 수 있는 항체 서열로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 세포외 항원 결합 영역은 종양 침윤 림프구(TIL)와 같은 종양 세포 또는 1차 세포에 대한 전체 외부 절단 서열화로부터 수득될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역의 결합 특이성은 경쇄 CDR 또는 중쇄 CDR과 같은 상보성 결정 영역 또는 CDR에 의해 결정될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 결합 특이성은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 의해 결정될 수 있다. 주어진 중쇄 CDR과 경쇄 CDR의 조합은 다른 기준 항원보다 항원에 대해 더 큰 친화도 및/또는 특이성을 부여할 수 있는 주어진 결합 포켓을 제공할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 소정 양태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역, 예를 들면 scFv는 항원에 대해 특이적인 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 경쇄 CDR은 CAR과 같은 항체의 scFv 경쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 경쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열을 포함하거나, 또는 비상보성 결정 영역(예를 들면, 프레임워크 영역)에 의해 분리된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속적인 서열을 포함해도 좋다. 일부 실시형태에 있어서, 경쇄 CDR은 2개 이상의 경쇄 CDR을 포함할 수 있고, 이는 경쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 경쇄 CDR은 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있고, 이는 각각 경쇄 CDR-1, 경쇄 CDR-2 및 경쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 일반적인 경쇄 상에 존재하는 CDR의 세트는 경쇄 CDR로 통칭될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 실시형태의 소정 양태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역, 예를 들면 scFv는 항원에 대해 특이적인 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 중쇄 CDR은 scFv와 같은 항체의 중쇄 상보성 결정 영역일 수 있다. 중쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속적인 서열을 포함하거나, 또는 비상보성 결정 영역(예를 들면, 프레임워크 영역)에 의해 분리된 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 중쇄 CDR은 2개 이상의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고, 이는 중쇄 CDR-1, CDR-2 등으로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 중쇄 CDR은 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고, 이는 각각 중쇄 CDR-1, 중쇄 CDR-2 및 중쇄 CDR-3으로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 일반적인 중쇄 상에 존재하는 CDR의 세트는 중쇄 CDR로 통칭될 수 있다.
세포외 항원 결합 영역은 유전 공학에 의해 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역은 돌연변이가 일어날 수 있어 세포외 항원 결합 영역이 그것의 표적에 대해 보다 높은 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역의 그것의 표적에 대한 친화도는 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현될 수 있는 표적에 대해 최적화될 수 있다. 이 최적화는 잠재적인 독성을 최소화하기 위해 행해질 수 있다. 다른 경우에 있어서, 표적의 막-결합 형태에 대해 보다 높은 친화도를 갖는 세포외 항원 결합 영역의 클론이 표적의 가용 형태의 대응물보다 바람직할 수 있다. 표적의 상이한 수준의 가용 형태가 검출될 수 있고 이러한 형태에 대한 표적화가 바람직하지 않은 독성을 유발할 수 있기 때문에 이러한 변형이 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포외 항원 결합 영역은 힌지 또는 스페이서를 포함한다. 용어 힌지 및 스페이서는 호환되어 사용될 수 있다. 힌지는 세포외 항원 결합 영역에 유연성을 부여하기 위한 CAR의 일부로서 간주될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 힌지는 특히, 세포외 항원 결합 영역을 검출하기 위한 항체가 비효율적이거나 이용이 불가능할 때 세포의 세포 표면 상의 CAR을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린으로부터 유래된 힌지의 길이는 세포외 항원 결합 영역에 의해 표적화된 표적 상의 에피토프의 위치에 따라 최적화될 필요가 있을 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 힌지는 면역글로불린에 속하지 않을 수 있지만, CD8α 분자의 네이티브(native) 힌지와 같은 다른 분자에 속할 수 있다. CD8α 힌지는 CD8α 공수용체와 MHC 분자의 상호작용에 역할을 하는 것으로 알려진 시스테인 및 프롤린 잔기를 함유해도 좋다. 시스테인 및 프롤린 잔기는 CAR의 성능에 영향을 줄 수 있다.
CAR 힌지는 크기 조정이 가능하다. 또한, 면역 반응 세포와 표적 세포 사이의 면역 시냅스의 이러한 형태는 세포 표면 표적 분자 상의 막 원위부 에피토프로 인해 CAR에 의해 기능적으로 가교될 수 없는 간격을 제한하며, 이 경우에 짧은 힌지 CAR의 사용으로도 시냅스 간격이 신호 전달을 수행할 수 있는 대략적인 값에 도달하지 못한다. 마찬가지로, 막 근위부 CAR 표적 항원성 에프토프의 경우, 신호 출력은 긴 힌지 CAR의 상황에서만 관찰된다. 힌지는 사용된 세포외 항원 결합 영역에 따라 조정될 수 있다. 힌지는 임의의 길이일 수 있다.
막 관통 도메인은 CAR을 세포의 원형질 막에 고정시킬 수 있다. CD28의 내추럴 막 관통 부분은 CAR에 사용될 수 있다. 다른 경우에 있어서, CD8α의 내추럴 막 관통 부분도 CAR에 사용될 수 있다. "CD8"은 NCBI 참조 번호: NP_001759 또는 자극 활성을 갖는 그것의 단편에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 단백질이어도 좋다. "CD8 핵산 분자"는 CD8 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이어도 좋고, 어떤 경우에 있어서, 막 관통 영역은 CD28의 내추럴 막 관통 부분이어도 좋고, "CD28"은 NCBI 참조 번호: NP_006130 또는 자극 활성을 갖는 그것의 단편에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 단백질을 지칭할 수 있다. "CD28 핵산 분자"는 CD28 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 막 관통 부분은 CD8α 영역을 포함할 수 있다.
CAR의 세포내 신호 전달 영역은 CAR이 위치된 면역 반응 세포의 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당할 수 있다. CAR은 T 세포의 이펙터 기능을 유도할 수 있고, 예를 들면 이펙터 기능은 세포 용해 활성 또는 헬퍼 활성이며, 사이토카인의 분비를 포함한다. 따라서, 용어 세포내 신호 전달 영역은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특이적 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 일부를 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 신호 전달 영역이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 신호 전달 도메인의 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 일부 실시형태에 있어서, 세포내 신호 전달 영역의 절단된 부분이 사용된다. 따라서 일부 실시형태에 있어서, 세포내 신호 전달 영역이라는 용어는 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호 전달 영역의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의도하고 있다.
CAR에 사용하기 위한 신호 전달 도메인의 바람직한 예는 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 표적-수용체 결합 후 신호 전달을 개시하도록 상승적으로 작용하는 공수용체뿐만 아니라 그 둘의 임의의 유도체 또는 변이체 서열, 및 동일한 기능을 갖는 이들 서열의 합성 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포내 신호 전달 영역은 면역수용체 티로신 활성화 모티프(ITAM)의 공지된 신호 모티프를 포함할 수 있다. 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 그러나, 바람직한 실시형태에 있어서 세포내 신호 전달 도메인은 CD3ζ쇄로부터 유래된다.
하나 이상의 ITAM을 포함하는 T 세포 신호 전달 도메인의 일례는 T 세포 수용체 T3ζ쇄 또는 CD247이라고도 알려진 CD3ζ 도메인이다. 이 도메인은 T 세포 수용체-CD3 복합체의 일부이고, 여러 세포내 신호 전달 경로의 항원 인식과 T 세포의 주요 이펙터 활성화를 조합하는 데 중요한 역할을 한다. 본원에 사용된 바와 같이, CD3ζ는 Swissprot 엔트리 P20963으로부터 공지된 바와 같이 주로 인간 CD3ζ 및 그것의 동종형을 지칭하고, 실질적으로 동일한 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 키메라 항원 수용체의 일부로서, 전체 T 세포 수용체 T3ζ쇄가 필요하지 않으며, T 세포 수용체 T3ζ쇄의 신호 전달 도메인을 포함하는 임의의 유도체가 적합하며, 그것의 임의의 기능적 등가물을 포함한다는 것을 다시 한번 강조한다.
세포내 신호 전달 도메인은 표 1의 도메인 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 참조 도메인과의 동일성이 약 50%~약 100%의 범위가 되도록 도메인을 변형시킬 수 있다. 표 1 중의 어느 하나의 도메인은 변형된 형태가 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 최대 약 100%의 동일성을 갖도록 변형될 수 있다.
CAR의 세포내 신호 전달 영역은 하나 이상의 공자극 도메인을 더 포함해도 좋다. 세포내 신호 전달 영역은 ζ쇄(제 1 세대 CAR) 또는 플러스 CD28 또는 4-1BB(제 2 세대 CAR)와 같은 단일 공자극 도메인을 포함해도 좋다. 다른 예에 있어서, 세포내 신호 전달 영역은 CD28/OX40 또는 CD28/4-1BB(제 3 세대)와 같은 2개의 공자극 도메인을 포함할 수 있다.
이들 공자극 도메인은 CD8과 같은 세포내 신호 전달 도메인과 함께 키나아제 경로의 하류를 활성화시켜 유전자 전사 및 기능성 세포 반응을 지지할 수 있다. CAR의 공자극 도메인은 CD28(포스파티딜이노시톨-4,5-디포스페이트 3-키나아제) 또는 4-1BB/OX40(TNF-수용체-관련 인자 어댑터) 경로뿐만 아니라 MAPK와 Akt의 활성화와 관련된 근위부 신호 단백질을 활성화시킬 수 있다.
어떤 경우에 있어서, CAR에 의해 발생된 신호는 보조 또는 공자극 신호와 결합될 수 있다. 공자극 신호 전달 도메인에 대해서, 키메라 항원 수용체-유사 복합체는 여러 가능한 공자극 신호 전달 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 미성숙한 T 세포에 있어서 T 세포 수용체의 개별 접합은 T 세포를 세포 독성 T 세포로의 완전한 활성화를 유도하기에 충분하지 않다. 완전한 생산성 T 세포 활성화를 위해서 제 2 공자극 신호가 필요하다. T 세포 활성화를 위한 공자극을 제공하는 여러 수용체가 보고되었고, CD28, OX40, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), 4-1BBL, MyD88, 및 4-1BB를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이들 공자극 분자에 의해 사용된 신호 전달 경로는 주요 T 세포 수용체 활성화 신호와 함께 상승적으로 작용할 수 있다. 이들 공자극 신호 전달 영역에 의해 제공된 신호는 하나 이상의 ITAM 모티프(예를 들면, CD3ζ 신호 전달 도메인)로부터 유래된 주요 이펙터 활성화 신호와 함께 상승적으로 작용할 수 있고, T 세포 활성화에 대한 요구 조건을 충족시킬 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체-유사 복합체에 공자극 도메인을 추가함으로써 조작 세포의 효능 및 내구성을 증강시킬 수 있다. 일부 다른 실시형태에 있어서, T 세포 신호 전달 도메인 및 공자극 도메인은 서로 융합되어 신호 전달 영역을 형성한다.
[표 4]
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키메라 항원 수용체는 표적 항원에 결합한다. T 세포 활성화가 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo)에서 측정될 때, 표적 항원은 다양한 발생원으로부터 수득되거나 분리될 수 있다. 본원에서 사용된 표적 항원은 포유동물에게 있어서 면역 인식 및 발명 인자 또는 질병 상태의 궁극적인 제거나 제어에 매우 중요한 항원 또는 상기 항원 상의 항원성 에피토프이다. 면역 인식은 세포 및/또는 체액 면역 인식일 수 있다. 세포내 병원체와 암의 경우, 면역 인식은 예를 들면, T 림프구 반응일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 표적 항원은 전암성 또는 증식성 상태와 관련된 항원을 포함한다. 또한, 표적 항원은 암과 관련이 있거나 암에 의해 유발될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에 있어서 본 발명의 키메라 항원 수용체는 본원에서 상술한 바와 같은 IL-13RA2를 포함하는 종양 항원을 인식하고 이에 결합한다.
일부 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체가 세포의 원형질 막 상에 존재하고, 그것의 표적에 결합하고 활성화될 때, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포는 표적을 지닌 세포에 대해 세포 독성을 유발시킬 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에 있어서 키메라 항원 수용체가 NK 세포 또는 세포 독성 T 세포와 같은 세포 독성 세포 상에 존재하고, 표적에 의해 활성화될 때, 상기 표적 세포에 대한 세포 독성 세포의 독성이 증가될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본원의 키메라 항원 수용체는 종양 세포와 같은 IL-13RA2를 발현하는 세포에 대한 면역 반응성 세포의 효과를 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포는 IL-13RA2를 발현하는 세포에 대한 세포 독성 효과가 본원의 키메라 항원 수용체를 발현하지 않는 세포보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 1배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 증가한다.
관심 있는 항원 결합 수용체 또는 CAR을 인코딩하는 이식 유전자를 세포에 혼입시킬 수 있다. 예를 들면, 이식 유전자를 T 세포와 같은 면역 반응 세포에 혼입시킬 수 있다. 세포에 삽입될 때, 이식 유전자는 메신저 RNA(mRNA)의 복제인 상보적 DNA(cDNA)일 수 있거나; 또는 그것의 게놈 DNA의 원래 영역에 위치한 유전자 자체(인트론을 포함하거나 포함하지 않음)일 수 있다.
DNA와 같은 이식 유전자 서열을 인코딩하는 핵산은 세포의 염색체에 랜덤으로 삽입될 수 있다. DNA와 같은 핵산을 세포에 도입하는 임의의 방법에 의해 랜덤으로 통합될 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 전기 천공법, 초음파, 유전자총의 사용, 리포펙션, 인산칼슘 형질주입, 덴드리머의 사용, 현미 주사, 및 아데노바이러스, AAV, 및 레트로바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 벡터의 사용, 및/또는 II형 리보자임을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 이식 유전자를 인코딩하는 DNA는 리포터 유전자를 포함하도록 설계될 수 있어 이식 유전자 또는 그것의 발현 생성물의 존재가 리포터 유전자의 활성화에 의해 검출될 수 있다. 상술한 것과 같은 임의의 리포터 유전자가 사용될 수 있다. 세포 배양물 중에서 리포터 유전자가 활성화된 세포를 선택함으로써 이식 유전자를 함유하는 세포가 선택될 수 있다.
CAR의 발현은 qPCR 또는 RNA의 수준을 측정하는 것과 같은 발현 측정에 의해 확인될 수 있다. 또한, 발현 수준은 복제본의 수를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 발현 수준이 매우 높으면, CAR의 하나보다 많은 복제본이 게놈에 통합되어 있음을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 고발현은 이식 유전자가 고전사 영역, 예를 들면 고발현 프로모터 근처와 같은 고전사 영역에 통합되어 있음을 나타낼 수 있다. 또한, 단백질 수준을 측정함으로써, 예를 들면 웨스턴 블로팅에 의해 발현을 확인할 수도 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역 반응 세포는 하나 이상의 이식 유전자를 포함해도 좋다. 하나 이상의 이식 유전자는 항원 상의 적어도 하나의 에피토프를 인식하고 이에 결합하거나 또는 항원 상의 돌연변이 에피토프에 결합하는 CAR 단백질을 발현할 수 있다. CAR은 기능성 CAR일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역 반응 세포는 하나 이상의 CAR을 포함할 수 있거나, 또는 단일 CAR 및 2차 조작된 수용체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자는 자살 유전자를 인코딩할 수 있다. 암 환자에 대한 많은 효과적인 치료법에 의해 입증된 바와 같이, CAR 면역 반응 세포는 종양 퇴행을 일으키지만 독성을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 항원이 정상 조직과 종양 세포 모두에 존재할 때, CAR 면역 반응 세포는 종양과 정상 조직을 구별하지 못할 수 있다("온-표적/오프-표적 독성"). 일부 다른 경우에 있어서, 사이토카인 방출 증후군(CRS)이라고 불리는 면역계의 전신성 교란이 발생할 수 있다. CRS는 전신성 염증 반응 증후군 또는 사이토카인 폭풍을 포함할 수 있으며, 이는 생체내에서 CAR 면역 반응 세포의 급속한 증식의 결과일 수 있다. CRS는 발열과 저혈압을 특징으로 하는 질환이며, 이는 심각한 경우에 복합 장기 부전으로 이어질 수 있다. 대부분의 경우에, 독성은 주입된 CAR 면역 반응 세포의 생체내에서의 증식과 관련이 있으며, 이는 면역계의 전반적인 교란을 일으킬 뿐만 아니라 TNFα와 IL-6과 같은 높은 수준의 전염증성 사이토카인을 방출시킨다. 자살 유전자는 CAR 면역 반응 세포의 제거를 유도할 수 있다. 자살 유전자는 CAR 면역 반응 세포에서 세포 자멸(apoptosis)를 유도하는 임의의 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 항원 결합 수용체와 함께 바이러스 벡터에 인코딩될 수 있다. 자살 유전자의 코딩은 특정 조건 하에서 주입된 CAR 면역 반응 세포의 생체내에서의 증식에 의해 유발된 독성을 완화하거나 완전히 종결시킬 수 있도록 한다.
일부 실시형태에 있어서, 정상 조직에 존재하는 항원에 대한 CAR 면역 반응 세포는 예를 들면, 전기 천공에 의해 수용체를 인코딩하는 mRNA를 도입한 후 CAR을 일시적으로 발현하도록 생성될 수 있다. 또한, 안전 스위치를 포함함으로써 CAR 면역 반응 세포를 더욱 강화하려는 주된 노력은 표적 독성이 심각한 경우에 CAR 면역 반응 세포를 대량 제거할 있다.
일부 실시형태에 있어서, CAR을 인코딩하는 벡터는 예를 들면, 유도형 카스파아제-9 유전자(이분자체 화학 유도제에 의해 활성화됨) 또는 절단된 형태의 EGF 수용체 R(단일 클론 항체 세툭시맙에 의해 활성화됨) 또는 RQR8 안전 스위치와 함께 조합될 수 있다.
본원에서 사용된 하나 이상의 이식 유전자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 이식 유전자는 인간 유전자, 생쥐 유전자, 쥐 유전자, 돼지 유전자, 소 우전자, 개 유전자, 고양이 유전자, 원숭이 유전자, 침팬지 유전자, 또는 그것의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이식 유전자는 인간 유전자 서열을 갖는 인간으로부터 유래될 수 있다. 하나 이상의 이식 유전자는 인간 유전자를 포함해도 좋다. 어떤 경우에 있어서, 하나 이상의 이식 유전자는 아데노바이러스 유전자가 아니다.
상술한 바와 같이, 이식 유전자는 면역 반응 세포의 게놈에 랜덤으로 또는 부위-특이적 방식으로 삽입될 수 있다. 예를 들면, 이식 유전자는 랜덤 부위에서 면역 세포의 게놈에 삽입될 수 있다. 이식 유전자는 기능적일 수 있고, 예를 들면, 게놈의 랜덤 부위에 삽입될 때 완전하게 기능적일 수 있다. 예를 들면, 이식 유전자는 그 자체의 프로모터를 인코딩할 수 있거나 또는 내인성 프로모터에 의해 제어되는 위치에서 삽입될 수 있다. 대안적으로, 이식 유전자는 유전자의 인트론 또는 엑손, 프로모터 또는 비코딩 영역과 같은 유전자에 삽입될 수 있다. 이식 유전자를 삽입하여 내인성 면역 검출점과 같은 유전자가 삽입에 의해 파괴되도록 할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자의 하나 이상의 복제본은 다수의 랜덤 부위에서 게놈에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 다수의 복제본은 랜덤 부위에서 게놈에 삽입될 수 있다. 이것은 이식 유전자의 한번의 무작위 삽입과 비교했을 때 전체 발현의 증가로 이어진다. 대안적으로, 이식 유전자의 복제본은 유전자에 삽입될 수 있고, 이식 유전자의 또 다른 복제본은 다른 유전자에 삽입될 수 있다. 이식 유전자는 특정 부위에서 면역 반응 세포의 게놈에 삽입될 수 있도록 표적화될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 항원 결합 수용체를 인코딩하는 서열을 포함하는 다핵산은 플라스미드 벡터의 형태일 수 있다. 플라스미드 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 프로모터는 구성적일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 유도적이다. 프로모터는 CMV, U6, MND 또는 EF1a이거나 이로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 프로모터는 CAR 서열에 인접할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 플라스미드 벡터는 스플라이스 억셉터를 더 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 스플라이스 억셉터는 CAR 서열에 인접할 수 있다. 프로모터 서열은 PKG 또는 MND 프로모터일 수 있다. MND 프로모터는 골수 증식 육종 바이러스 인핸서로 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 포함하는 합성 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 관심 있는 수용체를 인코딩하는 다핵산은 비바이러스 기술에 의해 세포로 전달되도록 설계될 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 다핵산은 우수 의약품 제조관리기준(GMP)에 부합되는 시약일 수 있다.
관심 있는 항원 결합 수용체 또는 CAR을 인코딩하는 다핵산의 발현은 하나 이상의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 프로모터는 보편적, 구성적(제한되지 않은 프로모터, 관련 유전자의 연속적인 전사를 허용함), 조직-특이적 프로모터 또는 유도적 프로모터일 수 있다. 프로모터에 인접하거나 가까이에 삽입된 이식 유전자의 발현이 조절될 수 있다. 예를 들면, 이식 유전자는 보편적 프로모터의 근처 또는 옆에 삽입될 수 있다. 일부 보편적 프로모터는 CAGGS 프로모터, hCMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터 또는 ROSA26 프로모터일 수 있다.
프로모터는 내인성이거나 외인성일 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 이식 유전자는 내인성 또는 외인성 ROSA26 프로모터에 인접하거나 가까이에 삽입될 수 있다. 또한, 프로모터는 면역 반응 세포에 대해 특이적일 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 이식 유전자는 돼지 ROSA26 유전자에 인접하거나 가까이에 삽입될 수 있다.
조직-특이적 프로모터 또는 세포-특이적 프로모터는 발현 위치를 제어하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 이식 유전자는 조직-특이적 프로모터에 인접하거나 가까이에 삽입될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 FABP 프로모터, Lck 프로모터, CamKII 프로모터, CD19 프로모터, 케라틴 프로모터, 알부민 프로모터, aP2 프로모터, 인슐린 프로모터, MCK 프로모터, MyHC 프로모터, WAP 프로모터, 또는 Col2A 프로모터이어도 좋다.
또한, 유도적 프로모터가 사용될 수 있다. 이들 유도적 프로모터는 필요에 따라 유도제를 추가하거나 제거함으로써 턴 온 및 턴 오프될 수 있다. 유도적 프로모터는 Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx, 및/또는 Trex일 것으로 예상되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "유도적 프로모터"는 소망의 조건에 도달하기 전에 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시키지 않거나 낮은 수준으로 발현시키고, 소망의 조건 하에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시키거나 높은 수준으로 발현시키는 제어된 프로모터이다.
또한, 발현에 필수적이지는 않지만, 이식 유전자 서열은 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 및 2A 펩티드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 인코딩하는 서열과 같은 전사 또는 번역 조절 서열을 포함해도 좋다.
일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자는 관심 있는 항원 결합 수용체 또는 CAR을 인코딩하고, 여기서 이식 유전자는 항원 결합 수용체가 발현되도록 안전한 하버(harbor)에 삽입된다. 일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자는 PD1 및/또는 CTLA-4 유전자 자리에 삽입된다. 다른 경우에 있어서, 이식 유전자는 랜덤 삽입을 위해 렌티바이러스에 의해 세포로 전달되는 반면, PD1- 또는 CTLA-4 특이적 뉴클레아제는 mRNA로서 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자는 레트로바이러스, AAV 또는 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터 시스템, 및 안전 하버에 대해 특이적인 뉴클레아제(예를 들면 AAVS1, CCR5, 알부민, 또는 HPRT)를 인코딩하는 mRNA에 의해 전달된다. 또한, 세포는 PD1 및/또는 CTLA-4 특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA로 처리될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 전달 시스템에 의해 HPRT-특이적 뉴클레아제 및 PD1- or CTLA-4 특이적 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA와 함께 제공된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 CAR은 이들 키메라 단백질의 모든 유형을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자는 레트로바이러스 벡터(γ-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 면역 반응 세포에 도입될 수 있다. 예를 들면, CAR 또는 임의의 항원 결합 수용체를 인코딩하는 이식 유전자, 또는 그것의 변이체 또는 단편은 레트로바이러스 벡터에 클로닝될 수 있고, 내인성 프로모터, 레트로바이러스 긴 말단 반복순서, 또는 표적 세포 유형-특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 또한, 비바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 벡터와 복합화된 핵산을 포함할 수 있다.
유전자를 포유동물 세포로 전달하기 위한 바이러스 기반의 많은 시스템들이 개발되었다. 예를 들면, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 이식 유전자의 장기적이고 안정적인 통합과 딸세포에서의 그것의 증식을 허용하기 때문에 장기적인 유전자 전달을 달성하는 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비증식 세포를 형질 도입할 수 있다는 점에서 쥐 백혈병 바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 이점을 갖는다. 또한, 면역원성이 낮다는 추가적인 이점을 갖는다. 아데노바이러스 벡터의 이점은 이들이 표적 세포의 게놈에 융합되지 않아 부정적인 통합-관련 이벤트를 회피한다는 것이다.
세포는 항원 결합 수용체를 인코딩하는 이식 유전자에 의해 형질 주입될 수 있다. 이식 유전자의 농도는 약 100pg~약 50μg의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포에 도입된 핵산(예를 들면 ssDNA, dsDNA, 또는 RNA)의 양은 형질 주입 효율 및/또는 세포 생존능을 최적화하도록 변경될 수 있다. 예를 들면, 전기 천공을 위해 각각의 세포 샘플에 1μg의 dsDNA를 첨가할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 최적의 형질 주입 효율 및/또는 세포 생존능에 필요한 핵산(예를 들면 이중가닥 DNA)의 양은 세포 유형에 따라 다르다. 일부 실시형태에 있어서, 각각의 샘플에 사용된 핵산(예를 들면, dsDNA)의 양은 형질 주입 효율 및/또는 세포 생존능에 직접적으로 대응될 수 있다. 예를 들면, 다양한 형질 주입 농도가 사용된다. 벡터에 의해 인코딩된 이식 유전자가 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 벡터에 의해 인코딩된 이식 유전자는 순방향으로 통합된다. 다른 경우에 있어서, 벡터에 의해 인코딩된 이식 유전자는 역방향으로 통합된다.
일반적으로 벡터는 후술되는 바와 같이 전신 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용을 통해 개별 환자에게 투여함으로써 생체내에서 전달된다. 대안적으로, 벡터는 개별 환자로부터 제거된 세포(예를 들면, 림프구, T 세포, 골수 흡인물, 조직 생검)와 같은 세포가 생체외에서 전달될 수 있고, 이어서 전형적으로 벡터가 혼입된 세포를 선택한 후 환자에게 재이식될 수 있다. 세포는 선택 전 또는 선택 후에 증식될 수 있다.
항원 결합 수용체의 발현에 적합한 면역 반응 세포는 필요로 하는 개체에 대해 자가적이거나 비자가적인 세포일 수 있다.
적합한 면역 반응 세포의 발생원은 개체로부터 수득될 수 있다. 어떤 경우에는 T 세포가 수득될 수 있다. T 세포는 PBMC, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 및 감염 부위, 복수, 흉수, 비장 조직, 및 종양 조직으로부터의 조직을 포함하는 다양한 발생원으로부터 수득될 수 있다. 어떤 경우에 있어서, T 세포는 FicollTM 분리와 같은 당업자에게 공지되어 있는 많은 기술을 이용하여 개체에게서 수집된 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포가 성분 채집술에 의해 수득될 수 있다. 성분 채집 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 성분 채집 수집에 의해 수집된 세포는 세척하여 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위한 적합한 완충제 또는 배지에 둘 수 있다.
대안적으로, 세포는 건강한 공여자, 암 진단 환자, 또는 감염 진단 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 상이한 표현 형질을 갖는 혼성 세포 집단의 일부일 수 있다. 또한, 세포주는 상술한 방법에 따라 형질 전환(transformed)된 T 세포로부터 수득될 수 있다. 또한, 세포는 세포 치료 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 면역 억제 치료에 대해 내성을 갖는 변형 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 변형 전에 적합한 세포 집단을 선택하는 것도 가능하다. 또한, 조작 세포 집단은 변형 후에 선택될 수 있다. 조작 세포는 자가 이식에 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 동종이계 이식에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 암 관련 표적 서열의 식별을 위해 샘플이 사용된 동일한 환자에게 투여된다. 다른 경우에 있어서, 세포는 암 관련 표적 서열의 식별을 위해 샘플이 사용된 환자와는 다른 환자에게 투여된다.
일부 실시형태에 있어서, 적합한 1차 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 말초 혈액 림프구(PBL), 및 T 세포, 내추럴 킬러 세포, 단핵구, 내추럴 킬러 T 세포, 단핵구 전구체 세포, 조혈모 세포 또는 비다능성 줄기세포와 같은 기타 혈액 세포 서브 집단을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 임의의 면역 세포일 수 있으며, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 임의의 다른 유형의 T 세포 등의 종양 침윤성 세포(TIL)와 같은 임의의 T 세포를 포함한다. 또한, T 세포는 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 또는 이펙터 T 세포를 포함할 수 있다. 또한, 대규모의 집단으로 T 세포를 선택하는 것이 가능하고, 예를 들면 전혈로부터 T 세포를 선택하는 것이 가능하다. 또한, T 세포는 대규모의 집단으로부터 증식될 수 있다. 또한, T 세포는 바람직하게는 특정 집단 및 표현형의 것일 수 있다. 예를 들면, T 세포는 바람직하게는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+), 및/또는 IL-7Rα(+)를 포함하는 표현형을 가져도 좋다. 적합한 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)의 항목으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 가져도 좋다. 또한, 적합한 세포는 배아 줄기세포, 유도 만능 줄기세포, 조혈모 세포, 뉴런 줄기세포, 및 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포를 포함한다. 적합한 세포는 인간 세포, 비인간 세포, 및/또는 생쥐 세포와 같은 다수의 1차 세포를 포함할 수 있다. 적합한 세포는 전구 세포일 수 있다. 적합한 세포는 치료받는 피험자(예를 들면, 환자)로부터 유래될 수 있다.
환자에게 필요한 세포의 치료 유효량은 세포의 생존능 및 세포가 유전적으로 변형되는 효율(예를 들면, 이식 유전자가 하나 이상의 세포에 통합되는 효율 또는 이식 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현 수준)에 따라 달라진다. 일부 실시형태에 있어서, 유전적 변형 후의 세포 생존능 및 이식 유전자의 통합 효율의 결과(예를 들면, 배증)는 피험자에게 투여가능한 치료량의 세포에 대응될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 유전적 변형 후의 세포 생존능의 증가는 환자를 치료하는 데 효과적인 투여된 세포의 필수량의 감소에 대응될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 이식 유전자의 하나 이상의 세포에의 통합 효율의 증가는 환자를 치료하는 데 효과적인 투여된 필수량의 세포의 감소에 대응될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 필요로 되는 세포의 치료 유효량을 결정하는 것은 경시에 따른 세포의 변화와 관련된 기능을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 필요로 되는 세포의 치료 유효량을 결정하는 것은 시간-의존적 변수(예를 들면, 세포 배양 시간, 전기 천공 시간, 세포 자극 시간)에 따라 이식 유전자가 하나 이상의 세포에 통합되는 효율의 변화에 대응되는 기능을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 유세포 분석법에 의해 측정된 바와 같이 치료적으로 유효한 세포는 세포 표면에서 항원 결합 수용체를 약 30%~약 100% 발현시키는 것을 포함하는 세포 집단일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 치료적으로 유효한 세포는 세포 표면에서 항원 결합 수용체를 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 약 99.9%를 초과하여 발현시킬 수 있다.
본 발명의 일양태에 따르면, 또한 본 발명은 항원 결합 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 단편, 유사물 및 유도체를 인코딩하는 상술한 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 면역 반응 세포의 표면에서 발현된 항원 결합 수용체 단백질을 인코딩하는 상술한 핵산을 포함하는 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 상술한 벡터를 포함하는 바이러스를 더 포함한다. 본 발명의 바이러스는 패키징된 감염 바이러스를 포함하고, 또한 감염 바이러스로서 패키징하는 데 필요한 성분을 포함하는 패키징될 바이러스를 포함한다. 외인성 유전자를 면역 반응 세포로 형질 도입하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다른 바이러스 및 그들의 대응되는 플라스미드 벡터도 본 발명에 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 키메라 항원 수용체, 및 선택적으로 I형 인터페론을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 양태에 있어서, 본원에 기재된 항체 또는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 I형 인터페론을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 면역 반응 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 반응 세포는 T 세포, 내추럴 킬러 세포, 세포 독성 T 림프구, 내추럴 킬러 T 세포, DNT 세포, 및/또는 조절 T 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 숙주 세포는 NK92 세포이다.
본 발명의 면역 반응 세포는 외인성 사이토카인의 코딩 서열을 더 가져도 좋고; 상기 사이토카인은 IL-12, IL-15 또는 IL-21 등을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 사이토카인은 면역 조절 또는 항-종양 활성을 더 가지며, 이펙터 T 세포 및 활성화된 NK 세포의 기능을 향상시킬 수 있거나, 또는 항-종양 효과를 직접적으로 발휘할 수 있다. 따라서, 당업자는 이들 사이토카인의 사용이 면역 반응 세포가 보다 우수하게 기능하는 데 도움이 된다는 것을 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 면역 반응 세포는 상술한 항원 결합 수용체 외의 항원 결합 수용체를 발현할 수 있다.
또한, 본 발명의 면역 반응 세포는 케모카인 수용체를 발현할 수 있고; 상기 케모카인 수용체는 CCR2를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 CCR2 케모카인 수용체가 생체내에서 CCR2를 케모카인과 경쟁적으로 결합하도록 하고, 종양 전이를 차단하는 데 유리하다는 것을 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 면역 반응 세포는 PD-1 발현을 감소시키는 siRNA 또는 PD-L1을 차단하는 단백질을 발현할 수 있다. PD-L1과 그것의 수용체 PD-1의 상호작용을 경쟁적으로 차단하면 항-종양 T 세포 반응의 회복을 촉진함으로써 종양 성장을 억제한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 면역 반응 세포는 안전 스위치를 발현할 수 있고; 바람직하게는 상기 안전 스위치는 iCaspase-9, 절단된 EGFR 또는 RQR8을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역 반응 세포는 4-1BBL과 같은 공자극 리간드를 발현하지 않는다.
따라서, 또 다른 양태에 있어서 본원에 기재된 항체 또는 키메라 항원 수용체 또는 그것을 포함하는 조성물을 생성하는 방법이 본원에 제공되고, 본원에 기재된 숙주 세포를 적합한 조건 하에서 배양하는 것이 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포의 발현 생성물을 분리 및 수득하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 또는 핵산을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 항체, 키메라 항원 수용체 또는 핵산을 포함하는 약학적 조성물이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 캐리어를 더 포함한다.
또 다른 양태에 있어서, 본원에 기재된 숙주 세포와 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 분자 자체 및 조성물이 동물 또는 인간에게 적절하게 투여될 때, 부작용, 알러지 또는 기타 부작용을 일으키지 않는 것을 의미한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 추가 치료제를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 추가 치료제는 US 20140271820에 기재된 것 및/또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염 또는 유사물과 같은 화학 치료제이다. 일부 실시형태에 있어서, 치료제는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 나벨빈(TM)(비노렐빈, 5'-디히드로히드로젠술파이드)을 포함하는 유사 분열 억제제(빈카알카로이드); CamptosarTM(이리노테칸 HCL), HycamtinTM(토포테칸 HCL), 및 캠프토더신 및 그것의 유사체로부터 유래된 다른 화합물을 포함하는 캠프토더신 화합물과 같은 토포이소머라아제 I 억제제; 에토포시드, 테니포시드 및 미독시조즈(midoxizoz)와 같은 포도필로톡신 유도체; 시스플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스터드, 트리메틸렌티오포스포르아미드, 카무스틴, 부설판, 클로람부실, 브리퀴놀리진, 우라실 머스터드, 클로프로펜 및 디카바진과 같은 알킬화제; 시타라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토푸린, 아자티오프린 및 프로카바진을 포함하는 대사 길항 물질; 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 마이신마이신, 마이토마이신, 사르코마이신 C 및 다우노마이신을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 항생제; 및 항-종양 항체, 디카바진, 아자시티딘, 암사콘, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 화학 치료 약물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 추가의 치료제는 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 추가의 치료제는 항-VEGF 항체(인간화 및 키메라 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 포함)를 포함하는 항-혈관신생제, 및 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1(α 및 β 포함), 인터류킨 12, 레티노산, 메탈로프로테이나아제-1 및 -2의 조직 억제제 등과 같은 다른 혈관 신생 억제제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 그것의 성분으로서 사용될 수 있는 일부 물질의 구체예는 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스 등의 당; 옥수수 전분 및 감자 전분 등의 전분; 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 및 메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 및 유도체; 트라가칸트 분말; 맥아; 젤라틴; 탤크; 스테아르산 및 스테아르산마그네슘과 같은 고체 윤활제, 황산칼슘; 땅콩유, 면실유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 코코아 버터와 같은 식물성유; 프로필렌글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리올; 알긴산; Tween 등의 유화제; 라우릴황산나트륨 등의 습윤제; 착색제; 감미제; 타블렛화제, 안정제; 산화방지제; 방부제; 발열 물질이 없는 물; 등장액; 인산 완충액 등이다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염을 포함해도 좋다. "약학적으로 허용가능한 염"은 모화합물의 소망의 생물학적 활성을 보유하고 어떠한 유해한 독성 효과도 생성하지 않는 염을 지칭한다(예를 들면, Berge, S.M 등, 1977, J. Pharm. Sci. 66: 1-19 참조). 이러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다.
산 부가 염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 아인산 등과 같은 비독성 무기산으로부터 유래된 염; 및 지방족 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐-치환 알칸산, 히드록시알칸산, 방향족산, 및 지방족 또는 방향족 술폰산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기 부가 염은 알칼리 토금속(예를 들면 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘)으로부터 유래된 염, 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루코사민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민으로부터 유래된 염을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 약학적 조성물은 산화방지제를 포함해도 좋다. 산화방지제의 예는 아스코르브산, 시스테인, 시스테인염산, 황산수소나트륨, 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨 등과 같은 수용성 산화방지제; 아스코르빌팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필갈레이트, 및 α-토코페롤 등과 같은 유용성 산화방지제; 및 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 및 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 다양한 제형으로 제제화될 수 있고, 환자 유형, 연령, 체중, 및 일반적인 질환 상태와 같은 요인에 따라 환자에게 유리한 투여량, 및 투여 방식을 의사가 결정한 후에 투여될 수 있다. 투여 방식은 예를 들면, 비경구 투여(예를 들면, 주사) 또는 다른 치료 방식일 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들면, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
개체에게 투여된 면역 반응 세포 집단을 포함하는 제제는 특정 징후나 질병을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 복수의 면역 반응 세포를 포함한다. 따라서, 치료적으로 효과적인 면역 반응 세포 집단이 개체에게 투여될 수 있다. 전형적으로, 약 1×104~약 1×1010개의 면역 반응 세포를 포함하는 제제가 투여된다. 대부분의 경우, 상기 제제는 약 1×105~약 1×109개의 면역 반응 세포, 약 5×105~약 5×108개의 면역 반응 세포, 또는 약 1×106~약 1×107개의 면역 반응 세포를 포함할 것이다. 그러나, 암의 위치, 발생원, 신분, 암의 정도와 심각도, 치료받는 개체의 연령 및 신체 상태 등에 따라, 개체에게 투여되는 CAR 면역 반응 세포의 수가 광범위하게 달라질 것이다. 의사는 사용할 적절한 투여량을 최종적으로 결정할 것이다.
일부 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체는 면역 세포 매개 면역 반응을 자극하기 위해 사용된다. 예를 들면, T 세포 매개 면역 반응은 T 세포 활성화와 관련된 면역 반응이다. 활성화된 항원-특이적 세포 독성 T 세포는 표면에서 외인성 항원 에피토프가 나타나는 표적 세포, 예를 들면 종양 항원이 나타나는 암 세포에서 세포 자멸을 유발할 수 있다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 키메라 항원 수용체는 포유동물에게 있어서 항-종양 면역을 제공하기 위해 사용된다. T 세포-매개 면역 반응으로 인해 피험자는 항-종양 면역이 생길 것이다.
어떤 경우에 있어서, 암에 걸린 피험자를 치료하는 방법은 치료가 필요한 피험자에게 본 발명의 면역 반응 세포를 하나 이상 투여하는 것과 관련될 수 있다. 면역 반응 세포는 종양 표적 분자에 결합하고 암 세포 사멸을 유도할 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 면역 반응 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 병원체 감염을 치료하는 방법을 더 제공한다.
본 발명의 면역 반응 세포의 투여 빈도는 치료되는 질환, 특정 면역 반응 세포의 요소, 및 투여 방식을 포함한 요인에 따라 결정될 것이다. 예를 들면, 면역 반응 세포는 하루에 4번, 3번, 2번, 하루에 한번, 하루 걸러 1번, 3일에 한번, 4일에 한번, 5일에 한번, 6일에 한번, 1주일에 한번, 8일에 한번, 9일에 한번, 10일에 한번, 1주일에 한번, 또는 한달에 2번 투약될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 면역 반응 세포는 개선된 생존능을 가지므로, 유사하기는 하지만 외인성 I형 인터페론을 발현하지 않는 면역 반응 세포에 비해 더 낮은 치료 유효량으로 투여될 뿐만 아니라 더 낮은 빈도로 투여될 수 있어 적어도 유사하고 바람직하게는 보다 현저한 효능을 얻을 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 조성물은 등장성이어도 좋고, 즉 혈액 및 눈물과 동일한 삼투압을 가져도 좋다. 본 발명의 조성물의 소망의 등장성은 염화나트륨, 또는 글루코오스, 붕산, 타르타르산나트륨, 프로필렌글리콜 또는 다른 무기 용질이나 유기 용질과 같은 기타 약학적으로 허용가능한 제제를 사용하여 달성될 수 있다. 필요한 경우, 조성물의 점도는 약학적으로 허용가능한 증점제를 사용하여, 선택된 수준으로 유지될 수 있다. 적합한 증점제는 예를 들면, 메틸셀룰로오스, 크산탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카보머 등을 포함한다. 증점제의 바람직한 농도는 선택된 시약에 따라 결정될 것이다. 적합한 캐리어 및 다른 첨가제의 선택은 확실한 투여 경로 및 액체 제형과 같은 특정 제형의 성질에 따라 결정될 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 및 핵산 또는 면역 반응 세포를 포함하는 키트를 더 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 핵산 또는 면역 반응 세포를 유효량 포함하는 치료적 또는 예방적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 치료적 또는 예방적 조성물을 함유할 수 있는 무균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 카트리지, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백 또는 블리스터 팩, 또는 당업계에 공지된 기타 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기를 플라스틱, 유리, 적층 종이, 금속박 또는 약물을 담기에 적합한 기타 재료로 제조될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트에는 본원게 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 핵산 또는 면역 반응 세포, 및 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 핵산 또는 면역 반응 세포를 개체에게 투여하는 방법을 나타내는 설명서가 포함된다. 일반적으로 설명서에는 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 핵산 또는 면역 반응 세포를 사용하여 암 또는 종양을 치료하거나 예방하는 방법이 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 본원에 기재된 숙주 세포를 포함하고, 약 1×104개의 세포~약 1×106개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 적어도 약 1×105개의 세포, 적어도 약 1×106개의 세포, 적어도 약 1×107개의 세포, 적어도 약 4×107개의 세포, 적어도 약 5×107개의 세포, 적어도 약 6×107개의 세포, 적어도 약 6×107개의 세포, 8×107개의 세포, 적어도 약 9×107개의 세포, 적어도 약 1×108개의 세포, 적어도 약 2×108개의 세포, 적어도 약 3×108개의 세포, 적어도 약 4×108개의 세포, 적어도 약 5×108개의 세포, 적어도 약 6×108개의 세포, 적어도 약 6×108개의 세포, 적어도 약 8×108개의 세포, 적어도 약 9×108개의 세포, 적어도 약 1×109개의 세포, 적어도 약 2×109개의 세포, 적어도 약 3×109개의 세포, 적어도 약 4×109개의 세포, 적어도 약 5×109개의 세포, 적어도 약 6×109개의 세포, 적어도 약 8×109개의 세포, 적어도 약 9×109개의 세포, 적어도 약 1×1010개의 세포, 적어도 약 2×1010개의 세포, 적어도 약 3×1010개의 세포, 적어도 약 4×1010개의 세포, 적어도 약 5×1010개의 세포, 적어도 약 6×1010개의 세포, 적어도 약 7×1010개의 세포, 적어도 약 8×1010개의 세포, 적어도 약 9×1010개의 세포, 적어도 약 1×1011개의 세포, 적어도 약 2×1011개의 세포, 적어도 약 3×1011개의 세포, 적어도 약 4×1011개의 세포, 적어도 약 5×1011개의 세포, 적어도 약 8×1011개의 세포, 적어도 약 9×1011개의 세포, 또는 적어도 약 1×1012개의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트에 약 5×1010개의 세포가 포함될 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 키트는 3×106개의 세포를 포함할 수 있으며; 세포는 약 5×1010개의 세포로 증식되어 피험자에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 키트는 동종이계 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 게놈 변형을 포함할 수 있는 세포를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 "즉시 사용가능한(ready-to-use)" 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 임상 용도로 증식될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 어떤 경우에 있어서, 키트는 연구 목적의 내용물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 설명서에는 치료제에 대한 설명; 종양 또는 그것의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 투약 요법 및 투여; 예방책, 경고, 금기 사항, 과다량에 대한 정보, 부작용, 동물 약리학, 임상 연구, 및/또는 인용문헌 중 적어도 하나가 포함된다. 설명서는 용기(만약 있다면)에 직접 인쇄되거나, 용기의 라벨로서, 또는 용기 내부나 용기에 있는 별도 용지, 작은 책자, 카드 또는 접는 인쇄물로서 인쇄될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 설명서는 종양을 치료하거나 예방하기 위해 본 발명의 면역 반응 세포를 투여하는 방법을 제공한다. 어떤 경우에 있어서, 설명서는 화학 치료제의 투여 전, 후 또는 동시에 본 발명의 면역 반응 세포를 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 세포를 본원에 기재된 항체, 본원에 기재된 키메라 항원 수용체, 본원에 기재된 조성물, 또는 본원에 기재된 숙주 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, IL-13RA2를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 접촉은 시험관내에서의 접촉이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 접촉은 생체내에서의 접촉이다.
일부 실시형태에 있어서, 세포는 종양 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 뇌종양이고, 보다 구체적으로는 성상 세포종, 뇌수막종, 및 신경교종일 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 이를 필요로 하는 개체에게서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 조성물, 벡터 또는 숙주 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 면역 반응 세포는 피험자에게 투여될 수 있고, 여기서 투여될 수 있는 면역 반응 세포의 연령은 약 1~약 35일일 수 있다. 예를 들면, 투여된 세포의 연령은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34일 또는 최대 약 40일일 수 있다. CAR 면역 반응 세포의 연령은 자극 시점으로부터 계산될 수 있다. 면역 반응 세포의 연령은 혈액 수집 시점으로부터 계산될 수 있다. 면역 반응 세포의 연령은 형질 도입 시점으로부터 계산될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 피험자에게 투여될 수 있는 면역 반응 세포의 연령은 약 10~ 약14일이나 약 20일이다. 일부 실시형태에 있어서, 면역 반응 세포의 "연령"은 말단 소체 길이에 의해 결정될 수 있다. 얘를 들면, "젊은" 면역 반응 세포는 "고갈된" 또는 "노화된" 면역 반응 세포보다 말단 소체 길이 더 길 수 있다. 특정 이론에 얽매이는 일 없이, 면역 반응 세포는 배양물에서 1주일에 약 0.8kb의 추정된 말단 소체 길이가 소실되고, 젊은 면역 반응 세포 배양물은 연령이 약 44일인 면역 반응 세포보다 약 1.4kb 더 긴 말단 소체를 갖는 것으로 생각된다. 특정 이론에 얽매이는 일 없이, 더 긴 말단 소체 길이는 환자에게 있어서의 양성의 객관적 임상 반응 및 생체내에서의 세포의 지속성과 관련될 수 있는 것으로 생각된다.
세포(예를 들면, 조작된 세포 또는 조작된 1차 T 세포)는 이식 전, 후, 및/또는 도중에 기능적일 수 있다. 예를 들면, 이식된 세포는 이식 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100일 기능할 수 있다. 이식된 세포는 이식 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 기능할 수 있다. 이식된 세포는 이식 후 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30년 기능할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 이식된 세포는 수용자의 수명기간 동안 기능할 수 있다.
또한, 이식된 세포는 그들의 정상적인 예상 기능의 100%로 기능할 수 있다. 또한, 이식된 세포는 그들의 정상적인 예상 기능의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 최대 약 100%를 발휘할 수 있다.
또한, 이식된 세포는 정상적인 예상 기능의 100% 이상을 수행할 수 있다. 예를 들면, 이식된 세포는 정상적인 예상 기능의 약 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% 또는 최대 약 5,000%를 발휘할 수 있다.
이식은 임의의 형태의 이식을 통해 행해질 수 있다. 국소 이식은 간밑 낭 공간, 비장밑 낭 공간, 신장밑 낭 공간, 장막, 위 또는 장 점막하층, 소장 혈관 분절, 정맥낭, 고환, 뇌, 비장 또는 각막을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면, 이식은 피막하 이식일 수 있다. 이식은 근육내 이식일 수도 있다, 이식은 간문맥 이식일 수 있다.
하나 이상의 야생형 세포가 수용자에게 이식되는 경우와 비교해서, 본 발명의 면역 반응 세포로 치료하면 이식 거부 반응을 개선할 수 있다. 예를 들어, 이식 거부 반응은 초급성 거부 반응일 수 있다. 이식 거부 반응은 급성 거부 반응 일 수도 있다. 다른 유형의 거부 반응은 만성 거부 반응을 포함할 수 있다. 이식 거부 반응은 세포-매개 거부 반응 또는 T 세포-매개 거부 반응일 수 있다. 이식 거부 반응은 내추럴 킬러 세포-매개 거부 반응일 수 있다.
이식 개선은 초급성 거부 반응을 완화시키는 것을 의미할 수 있으며, 이는 부작용 또는 증상을 감소, 경감시키거나 또는 줄이는 것을 포함할 수 있다. 이식은 세포 생성물의 입양(adoptive) 이식을 지칭할 수 있다.
성공적인 이식의 다른 현상은 수용자가 면역 억제 치료를 필요로 하지 않는 날의 수일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 면역 반응 세포를 제공한 후, 수용자는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 또는 더 오랫동안 면역 억제 치료를 필요로 하지 않을 수 있다. 이것은 성공적인 이식을 나타낼 수 있다. 또한 이것은 이식된 세포, 조직 및/또는 기관에서 거부 반응이 없음을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 항체, 키메라 항원 수용체, 조성물, 벡터 또는 숙주 세포는 다른 치료제와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 추가 치료제는 US 20140271820에 기재된 것과 같은 화학 치료제이다. 본 발명의 면역 반응 세포와 함께 조합하여 사용될 수 있는 화학 치료 약물은 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 나벨빈(TM)(비노렐빈, 5'-디히드로히드로젠술파이드)을 포함하는 유사 분열 억제제(빈카알카로이드); CamptosarTM(이리노테칸 HCL), HycamtinTM(토포테칸 HCL), 및 캠프토더신 및 그것의 유사체로부터 유래된 다른 화합물을 포함하는 캠프토더신 화합물과 같은 토포이소머라아제 I 억제제; 에토포시드, 테니포시드 및 미독시조즈와 같은 포도필로톡신 유도체; 시스플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스터드, 트리메틸렌티오포스포르아미드, 카무스틴, 부설판, 클로람부실, 브리퀴놀리진, 우라실 머스터드, 클로프로펜 및 디카바진과 같은 알킬화제; 시타라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 메르캅토푸린, 아자티오프린 및 프로카바진을 포함하는 대사 길항 물질; 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 마이신마이신, 마이토마이신, 사르코마이신 C 및 다우노마이신을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 항생제; 및 항-종양 항체, 디카바진, 아자시티딘, 암사콘, 멜팔란, 이포스파미드 및 미톡산트론을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 기타 화학 치료 약물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 추가의 치료제는 에피루비신, 옥살리플라틴 및 5-플루오로우라실 중 하나 이상으로부터 선택된다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 면역 반응 세포와 함께 조합하여 사용될 수 있는 화학 치료 약물은 항-VEGF 항체(인간화 및 키메라 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스올리고뉴클레오티드를 포함)를 포함하는 항-혈관 신생제, 및 안지오스타딘, 엔도스타틴, 인터페론, 인터페론 1(α 및 β 포함), 인터류킨 12, 레티노산 및 메탈로프로테이나아제-1 및 -2의 조직 억제제와 같은 기타 혈관 신생 억제제를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상술된 적절한 DNA 서열뿐만 아니라 적절한 프로모터 또는 제어 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주 세포를 형질 전환시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵 세포; 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포; 또는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 특정 실시예와 관련하여 더 설명된다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려고 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 특정 조건을 명시하지 않는 하기 실시예의 실험 방법은 일반적으로 J. Sambrook 등, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd Edition, Science Press, 2002에 기술된 통상적인 조건, 또는 제조업체가 권장하는 조건에 따라 행해진다.
실시예 1. 재조합 IL-13RA2 및 IL-13RA1 단백질의 제조
a. IL-13RA2_huFc, 및 IL-13RA1_huFc 발현 플라스미드의 구축
인간 IL-13RA2의 세포외 세그먼트 Asp27-Arg343(SEQ ID NO: 18)의 유전자(SEQ ID NO: 17)를 시험관내에서 합성하고; 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 Fc 세그먼트 Asp104-Lys330을 함유하는 진핵 발현 플라스미드에 유전자를 삽입하고, 그들 사이를 "GS"에 의해 연결하여 융합 발현 단백질 IL-13RA2_huFc(SEQ ID NO: 22)을 형성했고, 융합 발현 단백질의 대응되는 유전자 서열은 SEQ ID NO: 11로 나타내어진다. 대안적으로, IL-13RA1 세포외 세그먼트의 유전자(SEQ ID NO: 19)를 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 Fc Asp104-Lys330을 함유하는 진핵 발현 플라스미드에 삽입했고, 그들 사이를 "GS"에 의해 연결하여 융합 발현 단백질 IL-13RA1_huFc(SEQ ID NO: 24)을 형성했고, 융합 발현 단백질의 대응되는 유전자 서열은 SEQ ID NO: 23으로 나타내어진다.
b. 형질 주입을 통한 IL-13RA2_huFc 및 IL-13RA1_huFc의 발현
1) 형질 주입 하루 전, 6~7×105/ml의 293F 세포를 125ml의 배양 플라스크에 접종했다.
2) 형질 주입 당일에, 3×107개의 세포를 28ml의 FreeStyleTM 293 발현 배지에서 조정했다.
3) 다음의 조작 단계에 따라 지질-DNA 복합체를 제조했다:
Opti-MEM I로 30ug의 DNA를 최종 체적 1ml에 이르도록 희석하고, 완전히 혼합했다.
Opti-MEM I로 60ul의 293fectinTM을 최종 체적 1ml에 이르도록 희석하고, 완전히 혼합했다.
상기 혼합물을 실온에서 5분간 인큐베이팅했다.
4) 희석된 DNA를 293fectinTM과 혼합하고, 실온에서 20분간 인큐베이팅했다.
5) 2ml의 DNA-293fectin 복합체를 28ml의 세포에 첨가하고, 37℃, 8% CO2, 125rpm에서 3~4일간 배양하고, 상청액을 수집했다.
c. IL-13RA2_huFc 및 IL-13RA1_huFc의 정제
1) 상청액을 13000rpm에서 15분간의 원심 분리 하에 배양했다.
2) 단백질 A 충전제를 사용하여 친화도 정제를 행하고, 구체적인 조작 단계는 다음과 같았다:
평형: 10 컬럼 체적의 평형 완충액으로 단백질 충전제를 평형화시켰다.
로딩: 0.45㎛의 필터 멤브레인으로 처리된 모든 샘플을 로딩했다.
세척: 불순물은 유출 없이 파과할 때까지 20 컬럼 체적의 평형 완충액으로 세척했다.
용출: 관심 있는 단백질을 10 컬럼 체적의 용출 완충액으로 용출했다(6% 중화 완충액을 미리 수집 튜브에 첨가했다).
용액 제조
평형 완충액: pH 7.4에서의 PBS
용출 완충액: pH 2.6에서의 0.1M 글리신
중화 완충액: 1M Tris
3) 용출액을 0.22um의 멤브레인을 통해 여과하고, 컷-오프량이 10KD인 밀리포어 한외여과 튜브를 사용하여 1ml 이하의 체적으로 농축시키고, PD-Midi 탈염 컬럼을 사용하여 탈염하고, 1.5ml의 샘플을 수집했다. 단백질 농도는 OD280/1.47에 의해 측정했다.
SDS-PAGE를 시행하기 위해 2μg을 취했으며, 그 결과는 도 1에서와 같이 나타내어진다.
실시예 2: 전체 인간 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 IL-13RA2에 대해 특이적인 scFv의 스크리닝
본 발명에 사용된 파지 디스플레이 라이브러리는 당사에 의해 구축된 전체 인간 내추럴 ScFv 파지 라이브러리이고, 1E+11의 라이브러리 용량을 갖는다. IL-13RA2에 대해 매우 특이적인 scFc 단편은 당업자에게 공지된 스크리닝 방법을 사용하여 얻어졌다. 간단히 말하면, 10ug/ml의 항원 IL-13RA2_huFc 및 IL-13RA1_huFc는 각각 면역 튜브에 코팅되었다. IL-13RA2에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 파지 라이브러리를 IL-13RA1_huFc로 코팅된 면역 튜브에 첨가하여 1시간 동안 결합시켰다. 상청액을 IL-13RA2_huFc로 코팅된 면역 튜브에 첨가하여 1.5시간 동안 결합시킨 후, 비특이적인 파지를 세척하고, 결합된 파지를 용출시켜 대수 생장기에 대장균 TG1(E. coli TG1)을 감염시켰다. 용출된 파지는 증식 배양되고, 증식된 파지 라이브러리는 다음 번 스크리닝을 위해 PEG/NaCl 침전법을 이용하여 정제되었다. IL-13RA2에 특이적으로 결합하는 scFc 파지 클론을 풍부하게 하기 위해 3~4 사이클 동안 팬닝(panning)이 수행되었다. IL-13RA2_huFc에 대한 표준 ELISA법에 의해 양성 클론이 결정되었다. 항체의 특이성을 확인하기 위해 IL-13RA1_huFc가 무관련 항원으로서 ELISA에 사용되었다. 총 3,420개의 클론이 스크리닝되었고, 이 중 44개의 클론이 IL-13RA2_huFc에 특이적으로 결합하고, IL-13RA1_huFc에 결합하지 않는 것으로 ELISA 측정법에 의해 검출되었다. 서열화 후, 5개의 단일 서열이 수득되었다. 5개의 클론이 발현되고 정제되었으며, 그들 중 2개만이 IL13RA2를 발현하는 U251 세포(중국과학원의 세포 은행으로부터 구입)에 특이적으로 결합하고(도 2 및 도 4), 그 클론의 이름은 31C2 및 32H4이다.
31C2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에서와 같이 나타내어지고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에서와 같이 나타내어지고; 32H4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 6에서와 같이 나타내어지고, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 8에서와 같이 나타내어진다. 31C2의 HDCR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9에서와 같이 나타내어지고, HDCR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10에서와 같이 나타내어지고, HDCR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 11에서와 같이 나타내어지고, LDCR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13에서와 같이 나타내어지고, LDCR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14에서와 같이 나타내어지고, LDCR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 15에서와 같이 나타내어지고; 32H4의 HDCR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 9에서와 같이 나타내어지고, HDCR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 10에서와 같이 나타내어지고, HDCR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 12에서와 같이 나타내어지고, LDCR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 13에서와 같이 나타내어지고, LDCR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14에서와 같이 나타내어지고, LDCR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16에서와 같이 나타내어진다.
실시예 3. ELISA 결합 측정법
항체 31C2 및 32H4의 종특이성은 표준 ELISA에 의해 결정되었다. 쥐 IL-13RA2는 Sino Biological Inc.로부터 구입했다. ELISA 플레이트는 4℃에서 웰당 5ug/ml의 쥐 IL-13RA2 100ul로 하룻밤 코팅되었다. 코팅된 ELISA 플레이트는 PBS로 3회 세척되었다. 차단을 위해 웰당 PBS 중의 200ul의 2% 탈지 분유 용액이 실온에서 1시간 동안 첨가되었다. 상기 플레이트는 PBS로 3회 세척되었다. 3배 연속 희석된 개시 농도 10μg/ml의 구배 희석된 항체가 첨가되었고 1시간 동안 인큐베이팅되었다. 혼합물은 PBST로 3회 세척되었고, PBS로 3회 세척되었다. HRP-표지된 염소 항-인간 Fc가 첨가되었고 실온에서 1시간 인큐베이팅되었다. 혼합물은 PBST로 3회 세척되었고 PBS로 3회 세척되었다. 발색을 위해 TMB를 15분간 첨가한 후, 황산을 첨가하여 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더 상에서 판독했다. 그 결과는 도 3에 나타내어진다. 항체 31C2는 쥐 IL-13RA2에 결합하고, 항체 32H4는 쥐 IL-13RA2에 결합하지 않는다.
실시예 4. 항-IL-13RA2 scFv_Fc 융합 항체의 구축, 및 진핵 세포에서의 일시적 형질 주입, 발현, 정제 및 활성화 식별
31C2 및 32H4 각각의 VH 및 VL 단편에 대해 프라이머를 설계했고, 15개의 유연한 아미노산(GGGGSGGGGSGGGGS)으로 이루어진 링커를 도입하여 scFc를 형성하고; VH의 상류에 적합한 제한 부위 및 보호 염기를 도입하고, VL의 하류에 적합한 제한 부위 및 보호 염기를 도입했다. PCT 생성물은 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분석되고, 정제되고, 회수되었다. 효소 분해 후, 생성물은 적합한 진핵 발현 벡터에 연결된다. 대수 생장기의 293F 세포는 293fectinTM 형질 주입 시약(Invitrogen, 12347-019) 또는 폴리에틸렌이민(PEI)(Sigma-Aldrich, 408727)을 이용하여 일시적으로 형질 주입되었다. 형질 주입 후 5~7일에 배양 상청액을 수집했고, 단백질 A에 의해 친화도 정제를 행했다.
IL-13RA2을 내인성으로 발현하는 U251 세포에 대한 항체의 결합은 음성 세포 대조군으로서 293T 세포를 이용하여 유세포 분석법으로 시험되었다. FACs 측정의 구체적인 방법은 다음과 같다: 세포를 수확하고, 증식 배지로 1회 세척하고, PBS에 재부유시키고, 세포 농도를 4E+5cells/ml로 조정했다. 희석된 scFv_Fc 융합 항체는 얼음 상에서 30분간 세포와 함께 인큐베이팅되었고, 항체 농도는 111nM이었다. 이어서, 혼합물을 FITC-표지된 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이팅했다. 2회의 세척 단계 후, Guava easyCyteTM HT 시스템 기기를 사용하여 검출을 행했다. 도 4는 U251 및 293T 세포에 대한 항체 31C2 및 32H4의 scFv_Fc 융합 형태의 결합 상태를 나타낸다. 두 항체 모두 IL-13RA2를 내인성으로 발현하는 U251 세포에 특이적으로 결합하고, 음성 세포 293T에는 결합하지 않는다.
실시예 5. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 이용한 항체 친화도 측정
상이한 항체의 IL-13RA2에 대한 친화도는 biacore T200을 사용하여 측정했다. 구체적인 절차는 다음과 같다:
IL-13RA2_huFc는 아미노 커플링에 의해 CM5 칩 상에 코팅되었고, 약 500RU로 코팅되었으며, 구배 희석된 항체는 이동상으로서 30ul/min의 유속으로 항체-코팅된 채널을 통과했다. 런닝 완충액은 HBS-N이고 온도는 25℃이었다. 실험 데이터는 BIAevaluation 3.2에 의해 분석되었고, 동역학적 곡선은 1:1 랭뮤어 모델을 사용하여 피팅되었다. 31C2(scFv_Fc)의 KD는 1.79nM이었고, 32H4(scFv_Fc)의 KD는 3.76nM이었다(도 5 참조).
실시예 6. FACs를 사용한 U251 세포에 대한 항체의 결합 EC50의 측정
세포를 수확하고, 증식 배지로 1회 세척하고, PBS에 재부유시키고, 세포 농도를 4E+5cells/ml로 조정했다. 구배 희석된 scFv_Fc 융합 항체는 얼음 상에서 세포와 함께 30분간 인큐베이팅되었고, 상기 항체는 초기 농도 500nM으로 8개의 구배로 5배 연속 희석했다. 이어서, 혼합물은 FITC-표지된 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이팅되었다. 2회의 세척 단계 후, Guava easyCyteTM HT 시스템 기기를 이용하여 검출이 행해졌다. 그 결과는 도 6에서와 같이 나타내어지며, 두 항체 모두 U251 세포에 대해 농도 구배-의존적 결합을 가지며, 31C2(ScFv_Fc)의 EC50은 2.8nM이고, 32H4(ScFv_Fc)의 EC50은 1nM이다.
실시예 7. 항체의 친화도 성숙
파지 디스플레이 기술을 이용하여 친화도 성숙이 행해졌다.
모항체로서 31C2 및 32H4를 사용하여, 하나는 랜덤화된 경쇄 CDR1 및 CDR2를 갖고, 다른 하나는 랜덤화된 중쇄 CDR2 CDR1 및 CDR2를 갖는 2개의 파지 라이브러리를 각각 구축했다. 이어서, 라이브러리를 항원에 대해 팬닝하고, 고친화도 항체, 즉 31C2 및 32H4의 변이체가 SPR 기술 등에 의해 스크리닝되었다. 프라이머의 정보는 도 7에 나타내어진다.
먼저 항체 31C2(scFv)(SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 26의 핵산 서열을 가짐)에 기반하여 템플릿 플라스미드를 구축했다. 랜덤화된 경쇄 CDR1 및 CDR2를 갖는 파지 라이브러리의 경우, 프라이머 LMF 및 IL1R을 사용하여 PCR에 의해 단편 1이 증폭되었고; 프라이머 IL2F 및 FdR을 사용하여 PCR에 의해 단편 2가 증폭되었고; 이어서 랜덤화된 서열을 포함하는 전장 scFv를 수득하기 위해 PCR 브릿징에 의해 단편 1과 단편 2가 연결되었고, 이어서 NcoI 및 NotI에 의해 상기 전장 단편이 분해되었고, T4 리가아제에 의해 분해된 템플릿 플라미드에 마찬가지로 연결되었고, 플라스미드는 라이브러리 용량이 1.68E+9인 TG1 수용성 세포로 전기-형질 전환되었다. 랜덤화 중쇄 CDR1 및 CDR2를 갖는 파지 라이브러리의 경우, 프라이머 LMF 및 BH1R을 사용하여 PCR에 의해 단편 3이 증폭되었고; 프라이머 BH2F 및 FdR을 사용하여 PCR에 의해 단편 4가 증폭되었고; 이어서 랜덤화된 서열을 포함하는 전장 scFv를 수득하기 위해 PCR 브릿징에 의해 단편 3과 단편 4가 연결되었고; 이어서 NcoI 및 NotI에 의해 상기 전장 단편이 분해되었고, T4 리가아제에 의해 분해된 템플릿 플라미드에 마찬가지로 연결되었고, 플라스미드는 라이브러리 용량이 1.75E+9인 TG1 수용성 세포로 전기-형질 전환되었다.
항체 32H4의 친화도 성숙의 구축은 31C2와 유사했으며, 항체 32H4(scFv)(SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열을 가짐)에 기반하여 템플릿 플라스미드를 구축했다. 31C2에 사용한 것과 동일한 프라이머를 사용하여 경쇄 CDR1 및 CDR2가 랜덤화되었고, 얻어진 파지 라이브러리 용량은 2.1E+9이었다. 마찬가지로, 31C2에 사용한 것과 동일한 프라이머를 사용하여 중쇄 CDR1 및 CDR2가 랜덤화되었고, 얻어진 파지 라이브러리 용량은 1.5E+9이었다.
실시예 8. 파지 라이브러리의 스크리닝
본 특허의 실시예 2의 방법을 참조할 수 있다. 항원 IL13RA2_huFc의 초기 농도는 50nM이었고, 다음 번 스크리닝을 위해 2배 구배 희석이 행해졌다. IL13RA2_huFc에 특이적으로 결합하는 scFv 파지 클론을 풍부하게 하기 위해 2~3 사이클 동안 팬닝이 수행되었다. IL13RA2_huFc에 대한 표준 ELISA법에 의해 양성 클론이 결정되었다. 항체의 특이성을 확인하기 위해 인간 IL13RA1_huFc 세그먼트가 무관련 항원으로서 ELISA에 사용되었다. 총 111개의 ELISA-양성 클론이 픽업되었고; 유도된 상청액의 해리 상수 Kd는 재유도 후 biacore에 의해 결정되었다. 그 중 10개의 클론은 도 8에 나타내어진 바와 같이 해리 상수 Kd가 모클론의 해리 상수보다 10배 이상 낮았다.
서열화에 의해, 클론 2C7, 2D3, 1D11, 1B11, 2A5, 2D4, 1H7 및 1D8의 경쇄는 31C2(SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열을 가짐)의 경쇄와 동일하다. 클론 2C7(SEQ ID NO: 29의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 30의 핵산 서열을 가짐), 2D3(SEQ ID NO: 31의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 32의 핵산 서열을 가짐), 1D11(SEQ ID NO: 33의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 34의 핵산 서열을 가짐), 1B11(SEQ ID NO: 35의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 36의 핵산 서열을 가짐), 2A5(SEQ ID NO: 37의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 38의 핵산 서열을 가짐), 2D4(SEQ ID NO: 39의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 40의 핵산 서열을 가짐), 1H7(SEQ ID NO: 41의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 42의 핵산 서열을 가짐), 1D8(SEQ ID NO: 43의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 44의 핵산 서열을 가짐) 및 31C2(SEQ ID NO: 2의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 가짐)의 중쇄 아미노산 서열을 도 9에서 비교했다.
31C2의 친화도 성숙된 클론에 있어서, HCDR1의 서열은 각각 SEQ ID NO: 45~51에서와 같이 나타내어지고, HCDR2의 서열은 각각 SEQ ID NO: 52~58에서와 같이 나타내어진다. 상세는 도 9b를 참조한다.
모항체 31C2의 VH와 비교했을 때, 2C7은 4개 부위의 돌연변이을 갖고, 96.7%의 유사성을 가지며; 2D3은 5개 부의의 돌연변이를 갖고, 95.8%의 유사성을 가지며; 1D11은 6개 부위의 돌연변이를 갖고, 95%의 유사성을 가지며; 1B11은 5개 부위의 돌연변이를 갖고, 95.8%의 유사성을 가지며; 2A5는 4개 부의의 돌연변이를 갖고, 96.7%의 유사성을 가지며; 2D4는 5개 부위의 돌연변이를 갖고, 95.8%의 유사성을 가지며; 1H7은 4개 부위의 돌연변이를 갖고, 96.7%의 유사성을 가지며; 1D8은 4개 부위의 돌연변이를 갖고, 96.7%의 유사성을 가진다.
서열화에 의해, 5G3 및 5D7의 경쇄는 32H4(SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 7의 핵산 서열을 가짐)의 경쇄와 동일하다. 클론 5G3(SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 60의 핵산 서열을 가짐), 5D7(SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 62의 핵산 서열을 가짐), 및 32H4(SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열, 및 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 가짐)의 중쇄 아미노산 서열은 도 9c에서 비교했다.
32H4의 친화도 성숙된 클론에 있어서, HCDR1의 서열은 각각 SEQ ID NO: 63 및 64에서와 같이 나타내어지고, HCDR2의 서열은 각각 SEQ ID NO: 65 및 66에서와 같이 나타내어진다. 상세는 도 9d를 참조한다.
모항체 32H4의 VH와 비교했을 때, 5G3은 5개 부위의 돌연변이를 갖고, 95.7%의 유사성을 가지며; 2D3은 5개 부위의 돌연변이를 갖고, 95.8%의 유사성을 가지며; 5D7은 8개 부위의 돌연변이를 갖고, 95%의 유사성을 가지며; 1B11은 5개 부위의 돌연변이를 갖고, 93.2%의 유사성을 가진다.
실시예 9. scFv의 발현 및 정제
항체 유전자를 함유하는 TG1은 배양을 위해 스트리킹하고, 단일 클론을 픽업하여 2xTY-Amp-5% 글루코오스 배지에 접종하고, OD600nM=0.8~0.9가 되도록 37℃에서 220rpm으로 배양하고, 최종 농도가 1mM이 되도록 IPTG를 첨가하고, 이어서 25℃에서 220rpm으로 하룻밤 인큐베이션하여 scFv 발현을 유도했다.
원심 분리에 의해 균주를 수집하고, 30mM Tris HCl, 20% 수크로오스, 및 1mM EDTA(pH 8.0)(균주의 g당 80ml)에 부유시키고, 얼음욕 처리를 행하고, 4℃에서 8000g을 원심 분리했다. 상청액 A를 취하고, 침전물은 8ml의 5mM MgSO4으로 부유되고, 얼음욕 처리를 행하고, 10분간 부드럽게 진탕하고, 4℃에서 8000g을 원심 분리하여 상청액 B를 취했다. 상청액 A와 상청액 B를 혼합하고, 15분간 12,000g을 원심 분리하여 저온의 삼투압 충격 유체로서 상청액을 취했다.
니켈 컬럼을 사용하여 친화도 정제가 행해졌고, biacore T200을 사용하여 친화도 측정이 행해졌으며, 친화도 성숙된 항체의 해리 상수는 도 10a에서와 같이 나타내어진다.
항체 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 및 1B11의 특이성은 실시예 3의 방법에 따라 표준 ELISA에 의해 결정되었다. 그 결과는 도 10b에서와 같이 나타내어졌다. 모항체 31C2로부터의 클론 1B11, 2C7, 2D3 및 2D4는 인간 IL13RA2에 특이적으로 결합하고, 인간 IL13RA1에 결합하지 않으며, 쥐 IL13RA2와 교차 반응한다. 모항체 32H4로부터의 클론 5D7 및 5G3은 인간 IL13RA2에 특이적으로 결합하고, 인간 IL13RA1에 결합하지 않으며, 쥐 IL13RA2에 결합하지 않는다.
실시예 10. 항체의 scFv_Fc 형태의 발현 및 친화도 측정
scFv_Fc 융합 형태의 구축을 위해 보다 높은 친화도를 갖는 6개의 항체 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 및 1B11을 픽업했다.
실시예 4를 참조하여, VH의 상류에 적합한 제한 부위 및 보호 염기를 도입하고, VL의 하류에 적합한 제한 부위 및 보호 염기를 도입했다. PCR 생성물은 1% 아가로오스겔 전기 영동에 의해 분석되고, 정제되고, 회수되었다. 효소 분해 후, 생성물은 Fc 세그먼트(ShangHai Raygene Biotechnology Co., Ltd.로부터 구입)를 함유하는 진핵 발현 벡터 V152에 연결되었다. 벡터는 293Fectin에 의해 30ml의 293F 세포에 일시적으로 형질 주입되고 발현되었다. 형질 주입 후 5~7일에 배양 상청액이 수집되었고, 단백질 A에 의해 친화도 정제가 행해졌다. 항체의 응집은 SEC에 의해 분석되었다. 그 결과는 도 11에서와 같이 나타내어진다.
biacore T200을 사용한 실시예 5의 방법을 이용하여 친화도를 측정했고, 그 결과는 도 11b~11g에서와 같이 나타내어진다. 친화도 성숙된 항체의 친화도는 모항체의 친화도보다 3~10배 더 높다. 항체의 결합 및 해리 상수는 도 11f에서와 같이 나타내어진다.
실시예 11. 항체의 scFv_Fc 형태의 U251에 대한 결합 EC50의 측정
실시예 6의 방법에 따라, 세포를 수확하고, 증식 배지로 1회 세척하고, PBS에 재부유시키고, 세포 농도를 4E+5cells/ml로 조정했다. 구배 희석된 scFv_Fc 융합 항체를 얼음 상에서 30분간 세포와 함께 인큐베이팅되었고, 항체는 초기 농도 2,000mM으로 11개의 구배로 5배 연속 희석되었다. 이어서, 혼합물은 FITC-표지된 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이팅되었다. 2회의 세척 단계 후, Guava easyCyteTM HT 시스템 기기를 이용하여 검출이 행해졌다. 그 결과는 도 12에서와 같이 나타내어지고, 항체 5D7, 2C7, 5G3, 2D4, 2D3 및 1B11의 scFv_Fc 형태의 U251 세포에 대한 결합 EC50은 각각 0.56nM, 0.57nM, 0.53nM, 0.37nM, 0.33nM 및 0.47nM이었다. 또한, 이것은 모항체와 비교하여 2~8배 증가한다.
실시예 12. CAR-T 세포의 제조
CAR-T 세포 제조 및 항-종양 활성화 연구를 위해 2D4 및 5G3을 선택했다.
1. 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pRRL-hu8E3-28Z의 구축
PRRLSIN-cPPT.EF-1α를 벡터로서 사용하여, 항체 2D4 및 5G3의 키메라 항원 수용체를 발현하는 렌티바이러스 플라스미드를 구축했고, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-2D4-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-2D4-BBZ, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-2D4-28BBZ 및 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-5G3-28Z, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-5G3-BBZ, PRRLSIN-cPPT.EF-1α-5G3-28BBZ를 포함한다.
2D4-28Z 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 68), 2D4scFv(SEQ ID NO: 67), CD8 힌지(SEQ ID NO: 69), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 70)과 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 71), 및 CD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 72)로 이루어진다.
2D4-BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 68), 2D4scFv(SEQ ID NO: 67), CD8 힌지(SEQ ID NO: 69), CD8 막 관통 영역(SEQ ID NO: 73), CD137 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 74), 및 CD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 72)로 이루어진다.
2D4-28BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 68), 2D4scFv(SEQ ID NO: 67), CD8 힌지(SEQ ID NO: 69), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 70)과 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 71), CD137의 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 74), 및 CD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 72)로 이루어진다.
5G3-28Z 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 68), 5G3scFv(SEQ ID NO: 75), CD8 힌지(SEQ ID NO: 69), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 70)과 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 71), 및 CD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 72)로 이루어진다.
5G3-BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 68), 5G3scFv(SEQ ID NO: 75), CD8 힌지(SEQ ID NO: 69), CD8 막 관통 영역(SEQ ID NO: 73), CD137 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 74), 및 CD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 72)로 이루어진다.
5G3-28BBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 68), 5G3scFv(SEQ ID NO: 75), CD8 힌지(SEQ ID NO: 69), CD28 막 관통 영역(SEQ ID NO: 70)과 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 71), CD137의 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 74), 및, CD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 72)로 이루어진다.
2. IL13Ra2를 표적화하는 CAR 렌티바이러스 벡터의 렌티바이러스 패키징, 바이러스 농도 및 역가 측정
1.7×107의 밀도로 293T 세포를 15cm의 배양 접시에 접종하고, 배지는 10%의 소태아 혈청(BioWest)을 함유한 DMEM이다. 13.73μg의 표적 유전자 플라스미드 PRRLSIN-2D4-28Z, PRRLSIN-2D4-BBZ, PRRLSIN-2D4-28BBZ, PRRLSIN-5G3-28Z, PRRLSIN-5G3-BBZ 및 PRRLSIN-5G3-28BBZ와, 16.4μg의 패키징 플라스미드 pRsv-REV, 16.4μg의 RRE-PMDLg, 및 6.4μg의 Vsvg를 2,048μL의 블랭크 DMEM 배양액에 각각 용해시키고, 잘 혼합했다.
158.4μg의 PEI(1μg/μl)를 2,048μl의 무혈청 DMEM 배양액에 용해시키고, 잘 혼합하고 실온에서 인큐베이팅했다. 플라스미드 혼합액을 PEI 혼합액에 첨가하고 실온에서 20분간 인큐베이팅했다. 4.096ml의 형질 주입 복합체를 20ml의 DMEM 배지가 함유된 15cm의 배양 접시에 적하 첨가했다. 4~5시간 후, 형질 주입된 293T 세포를 10%의 FBS DMEM 배지와 교환하고, 37℃에서 72시간 동안 인큐베이팅했다. 바이러스액의 상청액을 수집하고, 농축시켜 바이러스 역가를 측정했다. 농축된 바이러스 역가는 각각 다음과 같다:
2D4-28Z: 3.89E×108U/ml,
2D4-BBZ: 3.08E×108U/ml,
2D4-28BBZ: 2.72E×108U/ml,
5G3-28Z: 3.7E×108U/ml,
5G3-BBZ: 1.88E×108U/ml, 및
5G3-28BBZ: 3.11E×108U/ml
3. T 림프구의 렌티바이러스 형질 도입 ------ CAR-양성 T 림프구의 제조
T 림프구의 활성화: 약 5×105/mL의 밀도로 림프구 배양 배지액에 T 림프구를 첨가하고, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 코팅된 자성 비드(Invitrogen)를 2:1의 자성 비드:세포비로 동시에 첨가하고, 자극을 위해 최종 농도가 500U/mL인 재조합 인간 IL-2(Shanghai Huaxin Biotechnology Co., Ltd.)를 첨가하고 24~48시간 동안 배양했으며;
레트로넥틴을 이용한 24-웰 플레이트의 코팅: 5μg/ml의 레트로넥틴 용액(PBS) 380μl를 각 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이팅했다. 24-웰 플레이트 내 레트로넥틴 용액(PBS)을 버리고, 이어서 1ml의 PBS로 2회 세척하고, 배지로 1회 세척하고(웰을 촉촉하게 유지시킴); 세포를 레트로넥틴으로 코팅된 24-웰 플레이트 내에 접종하고, 웰당 세포의 수는 5×105개이고 배양액의 체적은 500μl이고; 농축된 렌티바이러스를 MOI가 15인 PBMC 세포에 첨가하고, 32℃에서 60분간 1200g을 원심 분리하고, 세포 인큐베이터로 옮기고, 24시간 동안 바이러스 감염시킨 후, 배양액을 저속(300rpm, 10분, 대형 원심 분리기)으로 원심 분리하여 배양액을 교환했다. 자성 비드는 감염 후 3~4일에 제거될 수 있다.
4. T 림프구 키메라 항원 수용체의 발현
렌티바이러스-감염된 T 림프구를 배양하여 7일째에 1×106개의 T 세포를 취하고, 두 부분으로 분취하고, 4℃에서 5000rpm으로 5분간 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 나머지를 PBS로 2회 세척했다. 대조군의 세포를 50μl의 PE-SA(1:200 희석) 항체와 함께 얼음 상에서 45분간 인큐베이팅하고, PBS(2% NBS)로 2회 세척하고, 대조군으로서 재부유시켰다. 실험군의 세포를 1:50으로 희석된 50μl의 비오틴-염소 항 인간 IgG, F(ab')2 항체를 얼음 상에서 45분간 인큐베이팅하고, PBS(2% NBS)로 2회 세척하고; 50μl의 PE-SA(1:200 희석) 항체를 첨가하여 얼음 상에서 45분간 인큐베이팅하고; 2ml의 PBS(2% NBS)를 첨가하여 세포를 재부유시키고, 4 ℃에서 5000rpm/min으로 5분간 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 상기 공정을 2회 반복하고; 유세포 분석기에 의해 CAR-양성 T 세포의 비율을 검출했다.
5. IL13Ra2를 표적화하는 CAR T 세포의 세포 독성 분석
UTD, 2D4-28Z, 2D4-BBZ, 2D4-28BBZ, 5G3-28Z, 5G3-BBZ, 5G3-28BBZ CAR T 세포의 시험관내에서의 사멸 활성을 비교했을 때, 6개의 CAR T 세포에 대한 양성 감염률은 각각 66.0%, 26.3%, 34.8%, 59.9%, 35.5% 및 23.8%이었다.
50ul의 RMPI+10%의 소태아 혈청(Gibco)+이중 항체를 각각 3개의 E-Plate 16에 첨가하고, 베이스라인을 조정하기 위해 실시간 모니터 상에 배치했다.
표적 세포: 50ul의 1×104/mL U251 세포를 각각 E-Plate 16 플레이트에 접종하고, 30~40분간 방치하고, 모니터링을 시작하기 위해 실시간 모니터 상에 배치했으며;
이펙터 세포: 18시간 후, UTD 및 상이한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR T 세포를 3:1, 1:1 또는 1:3의 이펙터:표적비로 첨가했으며;
각각의 군에는 2개의 복제 웰이 제공되었고, 2개의 복제 웰의 평균값이 취해졌다. 검출 시간은 38시간이었다.
긱각의 실험군과 각각의 대조군은 다음과 같다:
각각의 실험군: 각각의 표적 세포+상이한 키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR T;
대조군 1: 표적 세포
대조군 2: 블랭크 배지;
세포 독성의 계산식은:
세포 독성 %=[(실험군-이펙터 세포 자연발생군-표적 세포 자연발생군)/(표적 세포 최대-표적 세포 자연발생)]×100
실험 결과는 도 13에서와 같이 나타내어진다. 상이한 키메라 항원 수용체를 발현하는 각각의 CAR T 세포는 IL13Ra2-양성 세포에 대해 시험관내에서 살상 활성이 현저했다.
본 발명에서 언급된 모든 문헌은 각각의 문헌이 참조로서 각각 인용되는 것처럼 참조로서 인용된다. 또한, 상술한 본 발명의 교시를 읽은 후, 당업자가 본 발명의 다양한 변경 및 수정을 할 수 있으며, 또한 이들 등가물 형태가 첨부된 청구범위에 의해 규정된 본 출원의 범위에 속하는 것으로 이해되어야 한다.
Sequence list <110> Carsgen therapeutics Co.,Ltd <120> Antibody Targeting IL-13RA2 and Use Thereof <130> P2018-0140 <150> 201710087299.2 <151> 2017-02-17 <150> 201810079015.X <151> 2018-01-26 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 31C2 VH <400> 1 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300 tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 31C2 VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 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240 acgcttttac catggcaatg cacaaatgga tcagaagttc aaagttcctg ggcagaaact 300 acttattgga tatcaccaca aggaattcca gaaactaaag ttcaggatat ggattgcgta 360 tattacaatt ggcaatattt actctgttct tggaaacctg gcataggtgt acttcttgat 420 accaattaca acttgtttta ctggtatgag ggcttggatc atgcattaca gtgtgttgat 480 tacatcaagg ctgatggaca aaatatagga tgcagatttc cctatttgga ggcatcagac 540 tataaagatt tctatatttg tgttaatgga tcatcagaga acaagcctat cagatccagt 600 tatttcactt ttcagcttca aaatatagtt aaacctttgc cgccagtcta tcttactttt 660 actcgggaga gttcatgtga aattaagctg aaatggagca tacctttggg acctattcca 720 gcaaggtgtt ttgattatga aattgagatc agagaagatg atactacctt ggtgactgct 780 acagttgaaa atgaaacata caccttgaaa acaacaaatg aaacccgaca attatgcttt 840 gtagtaagaa gcaaagtgaa tatttattgc tcagatgacg gaatttggag tgagtggagt 900 gataaacaat gctgggaagg tgaagaccta tcgaagaaaa ctttgctacg t 951 <210> 18 <211> 317 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> IL13Ra2 ECD <400> 18 Asp Thr Glu Ile Lys Val Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp 1 5 10 15 Pro 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ttggcacaga agcctggaaa aaattcatca atgtgaaaac atctttagag aaggccaata 480 ctttggttgt tcctttgatc tgaccaaagt gaaggattcc agttttgaac aacacagtgt 540 ccaaataatg gtcaaggata atgcaggaaa aattaaacca tccttcaata tagtgccttt 600 aacttcccgt gtgaaacctg atcctccaca tattaaaaac ctctccttcc acaatgatga 660 cctatatgtg caatgggaga atccacagaa ttttattagc agatgcctat tttatgaagt 720 agaagtcaat aacagccaaa ctgagacaca taatgttttc tacgtccaag aggctaaatg 780 tgagaatcca gaatttgaga gaaatgtgga gaatacatct tgtttcatgg tccctggtgt 840 tcttcctgat actttgaaca cagtcagaat aagagtcaaa acaaataagt tatgctatga 900 ggatgacaaa ctctggagta attggagcca agaaatgagt ataggtaaga agcgcaattc 960 caca 964 <210> 20 <211> 322 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> IL13Ra1 ECD <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val Thr Asn 1 5 10 15 Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr Trp Asn 20 25 30 Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe Ser His 35 40 45 Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr 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tgttaatgga tcatcagaga acaagcctat cagatccagt 600 tatttcactt ttcagcttca aaatatagtt aaacctttgc cgccagtcta tcttactttt 660 actcgggaga gttcatgtga aattaagctg aaatggagca tacctttggg acctattcca 720 gcaaggtgtt ttgattatga aattgagatc agagaagatg atactacctt ggtgactgct 780 acagttgaaa atgaaacata caccttgaaa acaacaaatg aaacccgaca attatgcttt 840 gtagtaagaa gcaaagtgaa tatttattgc tcagatgacg gaatttggag tgagtggagt 900 gataaacaat gctgggaagg tgaagaccta tcgaagaaaa ctttgctacg tggatccgac 960 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 1020 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1080 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1140 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1200 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1260 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1320 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1380 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 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Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 38 <211> 363 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 2A5 VH <400> 38 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc aggtatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgcta gtggtggtgg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300 tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 39 <211> 121 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2D4 VH <400> 39 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 363 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 2D4 VH <400> 40 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgc aagtatgcca tgggctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggta gtgttggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300 tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 41 <211> 121 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1H7 VH <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 363 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 1H7 VH <400> 42 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgt cgctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagcggga gtggtggtgg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300 tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1D8 VH <400> 43 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 363 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 1D8 VH <400> 44 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agatacgcca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attaatgcaa gtggaggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300 tacggttggg gtgcaggtgc attcgactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2C7 HCDR1 <400> 45 Lys Leu Pro Ala Met Ser 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2D3 HCDR1 <400> 46 Arg Arg Pro Ala Met Thr 1 5 <210> 47 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1D11 HCDR1 <400> 47 Gly Thr Ile Pro Met Ser 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1B11 HCDR1 <400> 48 Ser Arg Asp Ala Leu Asn 1 5 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2A5&1D8 HCDR1 <400> 49 Ser Arg Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2D4 HCDR1 <400> 50 Arg Lys Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1H7 HCDR1 <400> 51 Arg Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2C7&2D3 HCDR2 <400> 52 Ala Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 53 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1D11 HCDR2 <400> 53 Ser Ile Ser Gly Ser Ala Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1B11 HCDR2 <400> 54 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2A5 HCDR2 <400> 55 Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2D4 HCDR2 <400> 56 Gly Ile Ser Gly Ser Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1H7 HCDR2 <400> 57 Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 1D8 HCDR2 <400> 58 Ala Ile Asn Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5G3 VH <400> 59 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 5G3 VH <400> 60 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttacgtcc tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attaggggta gtgctggtaa cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttgca 300 ttctctggtt ctttcgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 61 <211> 118 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5D7 VH <400> 61 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Arg Ser Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 354 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> 5D7 VH <400> 62 gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc aactatgcaa tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggc attcgtagta gtggtggtcg cacattctac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgtgttgca 300 ttctctggtt ctttcgacta ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5G3 HCDR1 <400> 63 Ser Ser Tyr Val Leu Ser 1 5 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5D7 HCDR1 <400> 64 Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5G3 HCDR2 <400> 65 Ala Ile Arg Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5D7 HCDR2 <400> 66 Gly Ile Arg Ser Ser Gly Gly Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 67 <211> 245 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 2D4 scFv <400> 67 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Ser Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Arg Tyr Gly Trp Gly Ala Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg 245 <210> 68 <211> 63 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD8??Signal peptide <400> 68 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 69 <211> 135 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD8 hinge <400> 69 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 70 <211> 81 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD28 transmembrane region <400> 70 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt g 81 <210> 71 <211> 123 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD28 intracellular domain <400> 71 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 72 <211> 339 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD3Z domain <400> 72 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339 <210> 73 <211> 63 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD8 transmembrane <400> 73 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 acc 63 <210> 74 <211> 126 <212> DNA <213> Artifical sequence <220> <223> CD137 intracellular signaling domain <400> 74 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 75 <211> 241 <212> PRT <213> Artifical sequence <220> <223> 5G3 scFv <400> 75 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Val Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Gly Ser Ala Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ala Phe Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu 130 135 140 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 165 170 175 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 210 215 220 Asn Arg Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Arg

Claims (32)

  1. IL-13RA2를 내인성으로 발현하는 U251 세포에 대한 항체의 상대 결합 친화도 EC50은 100nM 이하이고, 바람직하게는 10nM 이하이고, 보다 바람직하게는 0.01~10nM 이하인, IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (1) SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63, 또는 64로 나타내어지는 HCDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65, 또는 66으로 나타내어지는 HCDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 11 또는 12 중 어느 하나로 나타내어지는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
    (2) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, 및/또는 SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및/또는 SEQ ID NO: 15 또는 16 중 어느 하나로 나타내어지는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
    (3) 상기 (1)의 항체의 중쇄 가변 영역 및 상기 (2)의 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체; 및
    (4) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 따른 항체의 변이체이고, 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 따른 항체와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 항체 중 어느 하나로부터 선택되는, 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    (1) SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 아미노산 서열, SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 8의 변이체의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
    (2) SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 또는 61로 나타내어지는 서열, 또는 그 서열의 변이체를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체;
    (3) 상기 (1)의 항체의 중쇄 가변 영역 및 상기 (2)의 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 중 어느 하나로부터 선택되는, 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15 또는 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3을 포함하는, 항체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4 또는 8로 나타내어지는 서열을 갖거나, 또는 임의의 상기 서열과 적어도 80%, 예를 들면 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 유사성을 가진 서열을 갖는, 항체.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 9, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 63 또는 64로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 65 또는 66으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3을 포함하는, 항체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2, 6, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 59 또는 61로 나타내어지는 서열을 갖거나, 또는 임의의 상기 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 유사성을 가진 서열을 갖는, 항체.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 경쇄 가변 영역의 CDR 영역 및 상기 중쇄 가변 영역의 CDR 영역은 이하의 임의의 서열 또는 그것의 변이체를 갖는, 항체.
    (1) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (2) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 9로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 10으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3;
    (3) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 64로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 66으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3;
    (4) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 45로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 52로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (5) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 16으로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 63으로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 65로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 12로 나타내어지는 HCDR3;
    (6) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 50으로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 56으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (7) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 46으로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 52로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (8) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 48로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 54로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (9) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 47로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 53으로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (10) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 49로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 55로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3;
    (11) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 51로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 57로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3; 또는
    (12) SEQ ID NO: 13으로 나타내어지는 LCDR1, SEQ ID NO: 14로 나타내어지는 LCDR2, 및 SEQ ID NO: 15로 나타내어지는 LCDR3; SEQ ID NO: 49로 나타내어지는 HCDR1, SEQ ID NO: 58로 나타내어지는 HCDR2, 및 SEQ ID NO: 11로 나타내어지는 HCDR3
  9. 제 7 항에 있어서,
    (1) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 2로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (2) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6으로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (3) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 61로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (4) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (5) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 8로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 59로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (6) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 39로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (7) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 31로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (8) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (9) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 33으로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (10) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 가지며;
    (11) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 41로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖거나; 또는
    (12) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 4로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 43으로 나타내어지는 서열 또는 그것의 변이체의 서열을 갖는, 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와 동일한 항원 결정기를 인식하는, IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와 경쟁적으로 IL-13RA2에 결합하는, IL-13RA2를 특이적으로 인식하는 항체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산.
  13. 제 12 항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  14. 제 13 항에 기재된 발현 벡터를 포함하거나 또는 게놈에 통합된 제 12 항에 기재된 핵산을 갖는 숙주 세포.
  15. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체; 및
    그것에 연결된 기능성 분자로서, 종양 표면 마커를 표적화하는 분자, 종양을 억제하는 분자, 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자, 또는 검출가능한 표지물로부터 선택된 기능성 분자를 포함하는, 다기능성 면역접합체.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 종양 표면 마커를 표적화하는 분자는 IL-13RA2 외의 종양 표면 마커에 결합하는 항체 또는 리간드이거나; 또는
    상기 종양을 억제하는 분자는 항-종양 사이토카인 또는 항-종양 독소이며; 바람직하게는 상기 사이토카인은 IL-12, IL-15, I형 인터페론, 및 TNF-α로부터 선택되는, 다기능성 면역접합체.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자는 면역 세포 표면 마커에 결합하는 항체이고, 바람직하게는 상기 결합된 면역 세포 표면 마커는 CD3, CD16 및 CD28로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 면역 세포 표면 마커에 결합하는 항체는 항-CD3 항체인, 다기능성 면역접합체.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 면역 세포 표면 마커를 표적화하는 분자는 T 세포 표면 마커에 결합하는 항체이고, T 세포가 관여하는 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와 함께 이기능성 항체를 형성하는, 다기능성 면역접합체.
  19. 제 17 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, 그것에 연결된 상기 기능성 분자 사이에 링커 펩티드를 더 포함하는 융합 폴리펩티드인, 다기능성 면역접합체.
  20. 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 다기능성 면역접합체를 인코딩하는, 핵산.
  21. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체로서, 순차적으로 연결된 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 막 관통 영역, 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 영역은 단백질의 기능성 신호 전달 도메인 CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, FcRγ(FCER1G), FcRβ(FcεR1b), CD79a, CD79b, FcγRIIa, DAP10 및 DAP12, 또는 그것의 조합으로부터 선택되는, 키메라 항원 수용체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 영역은 공자극 신호 전달 도메인을 더 갖고, 상기 공자극 신호 전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46 및 NKG2D, 또는 그것의 조합으로부터 선택된 단백질의 기능성 신호 전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  24. 제 21 항에 있어서,
    이하와 같이 순차적으로 연결된 항체, 막 관통 영역, 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
    제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, CD8 및 CD3ζ;
    제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, CD8, CD137 및 CD3ζ; 또는
    제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, CD28 분자의 막 관통 영역, CD28 분자의 세포내 신호 전달 영역, 및 CD3ζ; 또는
    제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, CD28 분자의 막 관통 영역, CD28 분자의 세포내 신호 전달 영역, CD137 및 CD3ζ
  25. 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산.
  26. 제 25 항에 기재된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제 26 항에 기재된 벡터를 포함하는 바이러스.
  28. 제 27 항에 기재된 핵산, 또는 제 26 항에 기재된 발현 벡터 또는 제 27 항에 기재된 바이러스에 의해 형질 도입되거나; 또는 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체가 표면에서 발현되고;
    바람직하게는, T 림프구, NK 세포 또는 NKT 림프구인, 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포.
  29. 제 28 항에 있어서,
    외인성 사이토카인의 코딩 서열을 더 갖거나; 또는
    CD3ζ를 함유하지 않는 다른 키메라 항원 수용체를 더 발현하거나; 또는
    케모카인 수용체를 더 발현하고; 바람직하게는 상기 케모카인 수용체는 CCR을 포함하거나; 또는
    PD-1의 발현을 감소시키는 siRNA 또는 PD-L1을 차단하는 단백질을 더 발현하거나; 또는 면역 세포 내의 내인성 PD-1이 유전자 편집 기술에 의해 녹아웃되거나; 또는
    안전 스위치를 더 발현하는, 면역 세포.
  30. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 또는 그 항체를 인코딩하는 핵산; 또는
    제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 면역접합체, 또는 그 면역접합체를 인코딩하는 핵산; 또는
    제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체, 또는 그 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산; 또는
    제 28 항 또는 제 29 항에 기재된 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포; 및
    약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  31. 용기, 및 그 용기 내의 제 30 항에 기재된 약학적 조성물; 또는
    용기, 및 그 용기 내의 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 면역접합체 또는 그 면역접합체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체 또는 그 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 28 항 또는 제 29 항에 기재된 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포를 포함하는, 키트.
  32. IL-13RA2를 발현하는 종양을 치료하기 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 면역접합체 또는 그 면역접합체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 항원 수용체 또는 그 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산; 또는 제 28 항 또는 제 29 항에 기재된 키메라 항원 수용체-변형 면역 세포의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 IL-13RA2를 발현하는 종양은 뇌암, 췌장암, 난소암, 신장암, 방광암, 췌장암, 위암, 장암, 두경부암, 갑상선암, 전립선암, 및 카포시 육종이고, 보다 바람직하게는, 뇌암은 성상 세포종, 수막종, 핍지교종, 및 신경교종으로부터 선택되는, 용도.

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