EA043009B1 - Выделенное антитело человека, связывающееся с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии, и его применение - Google Patents
Выделенное антитело человека, связывающееся с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии, и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA043009B1 EA043009B1 EA201691130 EA043009B1 EA 043009 B1 EA043009 B1 EA 043009B1 EA 201691130 EA201691130 EA 201691130 EA 043009 B1 EA043009 B1 EA 043009B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sequence
- antibody
- cells
- aml
- seq
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 510
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 title claims description 418
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 title claims description 386
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 303
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 189
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 175
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 171
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 171
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 156
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 156
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 140
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 108
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 108
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 70
- 230000002071 myeloproliferative effect Effects 0.000 claims description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 66
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 48
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 48
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 48
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 claims description 43
- 201000007224 Myeloproliferative neoplasm Diseases 0.000 claims description 38
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 claims description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 26
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 25
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 11
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 229960001259 diclofenac Drugs 0.000 claims description 6
- DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N diclofenac Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl DCOPUUMXTXDBNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 5
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims 2
- LFWHFZJPXXOYNR-RQZCQDPDSA-N 2-[(3e)-6-fluoro-2-methyl-3-[(4-methylsulfanylphenyl)methylidene]inden-1-yl]acetic acid Chemical compound C1=CC(SC)=CC=C1\C=C/1C2=CC=C(F)C=C2C(CC(O)=O)=C\1C LFWHFZJPXXOYNR-RQZCQDPDSA-N 0.000 claims 1
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 claims 1
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 claims 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 155
- 241001122767 Theaceae Species 0.000 description 75
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 51
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 49
- 230000004044 response Effects 0.000 description 49
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 44
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 42
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 36
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 36
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 36
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 35
- 201000001268 lymphoproliferative syndrome Diseases 0.000 description 31
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 31
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 30
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 30
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 30
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 29
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 29
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 29
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 29
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 27
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 27
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 25
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 24
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 24
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 23
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 22
- 230000034994 death Effects 0.000 description 21
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 19
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 19
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 16
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 16
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 15
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 15
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 14
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 13
- 208000017972 multifocal atrial tachycardia Diseases 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 208000035330 Acute monoblastic/monocytic leukemia Diseases 0.000 description 11
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N cytochalasin D Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@H]\3[C@]2([C@@H](/C=C/[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)C/C=C/3)OC(C)=O)C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N 0.000 description 10
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 10
- XVLXYDXJEKLXHN-UHFFFAOYSA-M dioc6 Chemical compound [I-].O1C2=CC=CC=C2[N+](CCCCCC)=C1C=CC=C1N(CCCCCC)C2=CC=CC=C2O1 XVLXYDXJEKLXHN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 10
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 9
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 7
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 6
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 6
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 5
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 5
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 5
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 5
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 5
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000012953 feeding on blood of other organism Effects 0.000 description 5
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- JCJAEDXFONBNIP-PTPTXAFISA-N n-[4-[2-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-5-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyethyl]phenyl]-2,2,2-trifluoroacetamide Chemical compound O([C@H]1[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H]([C@@H](O[C@@H]1CO)OCCC=1C=CC(NC(=O)C(F)(F)F)=CC=1)NC(=O)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O JCJAEDXFONBNIP-PTPTXAFISA-N 0.000 description 5
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 5
- 230000004987 nonapoptotic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012552 review Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 102100026094 C-type lectin domain family 12 member A Human genes 0.000 description 4
- 101710188619 C-type lectin domain family 12 member A Proteins 0.000 description 4
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 4
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000021603 oncosis Effects 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 4
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000007056 transamidation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- OOBJCYKITXPCNS-REWPJTCUSA-N (3s)-5-(2,6-difluorophenoxy)-3-[[(2s)-3-methyl-2-(quinoline-2-carbonylamino)butanoyl]amino]-4-oxopentanoic acid Chemical compound O=C([C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C(C)C)COC1=C(F)C=CC=C1F OOBJCYKITXPCNS-REWPJTCUSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- XBJPSVQFCQFGDC-WSCOIBMGSA-K 2-[4-[2-[[(2R)-1-[[(4R,7S,10S,13R,16S,19R)-10-(4-aminobutyl)-4-[[(1S,2R)-1-carboxy-2-hydroxypropyl]carbamoyl]-7-[(1R)-1-hydroxyethyl]-16-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-13-(1H-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicos-19-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]-7,10-bis(carboxylatomethyl)-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetate gallium-68(3+) Chemical compound [68Ga+3].C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](Cc2ccccc2)NC(=O)CN2CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@H](Cc2c[nH]c3ccccc23)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1)C(O)=O XBJPSVQFCQFGDC-WSCOIBMGSA-K 0.000 description 3
- 208000010581 Acute myeloid leukemia with minimal differentiation Diseases 0.000 description 3
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 3
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 3
- 101000600434 Homo sapiens Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 3
- 102100037401 Putative uncharacterized protein encoded by MIR7-3HG Human genes 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000021597 necroptosis Effects 0.000 description 3
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 3
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 2
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 2
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 2
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 2
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 2
- 208000003250 Mixed connective tissue disease Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 208000009052 Precursor T-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 2
- 208000029052 T-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- -1 TVSE Proteins 0.000 description 2
- 102000006837 U5 Small Nuclear Ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010086857 U5 Small Nuclear Ribonucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 201000011186 acute T cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000011441 consolidation chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000009108 consolidation therapy Methods 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 208000015688 methicillin-resistant staphylococcus aureus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000006610 nonapoptotic cell death Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- WKAVAGKRWFGIEA-UHFFFAOYSA-N 17-acetyl-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,12,14,15,16,17-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,11-dione Chemical compound C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(=O)C)C1(C)CC2=O WKAVAGKRWFGIEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 101100339431 Arabidopsis thaliana HMGB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000797614 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 5 Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 1
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 1
- 229940124294 CD33 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005749 Copper compound Substances 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037573 Dual specificity protein phosphatase 12 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018693 Focal Adhesion Kinase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010091820 Focal Adhesion Kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 description 1
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000881110 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 12 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000960952 Homo sapiens Interleukin-1 receptor accessory protein Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000620554 Homo sapiens Ras-related protein Rab-38 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101001074035 Homo sapiens Zinc finger protein GLI2 Proteins 0.000 description 1
- 208000028958 Hyperferritinemia Diseases 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100039880 Interleukin-1 receptor accessory protein Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101001010620 Mus musculus Interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 101710092490 Protein kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100022305 Ras-related protein Rab-38 Human genes 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000018165 U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010091281 U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035558 Zinc finger protein GLI2 Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N amsacrine Chemical compound COC1=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=C1NC1=C(C=CC=C2)C2=NC2=CC=CC=C12 XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001220 amsacrine Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000001880 copper compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000046699 human CD14 Human genes 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000000936 membranestabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 235000011835 quiches Nutrition 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000002287 time-lapse microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к областям биологии, иммунологии, медицины и терапии рака, в особенности к терапии миелопролиферативных или лимфопролиферативных расстройств. В частности, настоящее изобретение относится к антителам, направленным против клеток острой миелоидной лейкемии.
Острая миелоидная лейкемия (ОМЛ) представляет собой злокачественное новообразование с высокой степенью риска с уровнями выживаемости пять лет у 40-50% пациентов моложе 60 лет. Для пациентов старше 65 лет исходы еще хуже, и длительные ремиссии наблюдаются лишь у менее чем 20% пациентов. Для лечения острой лейкемии часто применяют аллогенную трансплантацию стволовых клеток (ТСК). Изначально ее разработали, чтобы спасти пациентов, получающих в противном случае летальную миелоаблативную химиотерапию, но впоследствии обнаружили, что она осложняется связанными с аллореактивным иммунным ответом осложнениями (реакцией трансплантат против хозяина; РТПХ). Обеднение Т-клетками трансплантатов перед реинфузией предотвращало РТПХ, но в результате наблюдения того, что у реципиентов трансплантатов с уменьшенным количеством Т-клеток, аналогично реципиентам трансплантата монозиготного близнеца-донора, выявляли гораздо более высокую частоту рецидивов, становилось все более ясно, что успех аллогенной ТСК зависит от индукции иммунного ответа против лейкемии (трансплантат против лейкемии (ТПЛ)). Это привело к развитию стратегий применения аллогенной трансплантации стволовых клеток без миелоаблативного кондиционирования (трансплантация стволовых клеток в условиях пониженной интенсивности, ТСКПИ), чтобы снизить цитотоксичность и позволить проведение аллогенной ТСК у большей группы пациентов, включая пациентов старшего возраста и пациентов, получивших интенсивное предварительное лечение. Подготовительные схемы лечения при ТСКПИ нацелены на уничтожение адаптивной иммунной системы реципиента, чтобы предотвратить отторжение трансплантата, но не допускают полного разрушения костного мозга реципиента, тем самым снижая раннюю токсичность ТСК. После трансплантации стволовые клетки донора постепенно замещают стволовые клетки реципиента, и полный донорский химеризм обычно достигается в течение трех месяцев после ТСК. Хотя аллогенная ТСК исцеляет значительное количество пациентов, и был достигнут значительный прогресс в поддерживающей терапии реципиентов ТСК, 15-30% пациентов все еще погибает в результате связанных с трансплантацией осложнений, таких как РТПХ, и инфекционных осложнений (возникающих в результате медленного восстановления иммунной системы после ТСК или как осложнение иммуносупрессивной терапии от РТПХ).
Следовательно, хотя ТСК потенциально исцеляет, если удается вызвать эффективные реакции трансплантата против лейкемии (ТПЛ), ее терапевтический успех ограничен иммунными ответами, направленными на организм реципиента, приводящими к РТПХ, которая вызывает высокую частоту осложнений и смертность.
Приблизительно у 70% пациентов, которым провели ТСК, в некоторый момент после ТСК развивается РТПХ, при этом затронутые органы включают кожу, печень, кишечник и легкое. РТПХ лечат посредством местной или системной иммуносупрессивной терапии, включающей кортикостероиды. Значительное количество пациентов с РТПХ не отвечает на терапию стероидами, и приблизительно половина данных пациентов также плохо отвечает на альтернативные (и отчасти все еще экспериментальные) меры, такие как трансплантация мезенхимальных стромальных клеток (MSC) или терапия, модулирующая Т-клетки, такая как терапия, направленная против фактора некроза опухоли α (анти-TNFa; инфликсимаб). Экстенсивная и длительная иммуносупрессивная терапия нежелательна, поскольку она может задерживать развитие терапевтических ответов против лейкемии. В действительности, когда происходит рецидив ОМЛ во время прохождения пациентом иммуносупрессивной терапии, первым шагом будет быстро свести на нет введение иммуносупрессоров. Это может вызвать исцеляющий ответ ТПЛ, часто ценой возникновения РТПХ. У пациентов с рецидивом, находящихся на иммуносупрессивной терапии, которые не отвечают на постепенное уменьшение количества иммуносупрессоров, или у пациентов с рецидивом, которые уже прекратили прием иммуносупрессоров до того, как произошел рецидив, но у которых не развилась РТПХ, снижение опухолевой нагрузки посредством химиотерапии, а затем инфузии донорских лимфоцитов (ИДЛ) в возрастающих дозах могут приводить к длительной ремиссии заболевания. Хотя отсутствие диагностических тестов, позволяющих продемонстрировать наличие сильного ответа ТПЛ, усложняет точную оценку частоты индукции ответов ТПЛ при аллогенной ТСК при первичной или рецидивирующей ОМЛ, в некоторых исследованиях предоставили убедительное доказательство индукции такого ответа у значительного количества пациентов. Например, Schmid и коллеги продемонстрировали эффективные ответы ТПЛ при ИДЛ у 50% из небольшой группы пациентов с рецидивом заболевания ОМЛ, у которых наблюдалась вторая ремиссия после химиотерапии (Schmid и др., 2007). Schlenk и коллеги убедительно показали аддитивное значение аллогенной ТСК при первичной ОМЛ, которая приводила к удвоению 5-летней выживаемости без рецидивов заболевания у пациентов с ОМЛ с высокой степенью риска, которые получили аллогенную ТСК от брата или сестры, по сравнению с пациентами, у которых не было подходящего донора брата или сестры (Schlenk и др., 2008). Таким образом, ответы ТПЛ часто достигаются за счет возникновения РТПХ, и наблюдение, что обеднение трансплантата Т-клетками уменьшало частоту РТПХ, но повышало частоту рецидивов заболевания, позволило предположить, что оба данных ответа преимущественно опосредуются зависимыми от Т-клеток иммунными
- 1 043009 ответами на антигены реципиента.
В связи с высокой частотой РТПХ после аллогенной трансплантации стволовых клеток, приводящей к гибели 15-30% пациентов, а также тем фактом, что подходящий донор не всегда доступен для данного пациента, требуются альтернативные подходы к лечению. Целью настоящего изобретения является предоставление альтернативных средств и способов противодействия и/или предотвращения ОМЛ.
Согласно настоящему изобретению предложены полученные из пациента ОМЛ-специфические антитела человека, которые способны связываться с интактными клетками ОМЛ. Важно отметить, что указанные антитела получают из пациентов-людей с ОМЛ, которые получили аллогенную ТСК и находятся в полной ремиссии, свидетельствуя о том, что данные антитела эффективны против ОМЛ. В действительности, в разделе Примеры продемонстрировали, что антитела согласно настоящему изобретению способны связываться с интактными клетками ОМЛ. ОМЛ-специфические антитела человека согласно настоящему изобретению, следовательно, особенно подходят для применения в направленной против ОМЛ терапии. Например, антитело согласно настоящему изобретению связано с токсичной молекулой. После введения антитела, клетки ОМЛ будут связывать и/или интернализовать его, и токсичная молекула будет оказывать токсичное действие на клетку ОМЛ. В качестве альтернативы, в некоторых вариантах реализации антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) или комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ) вызывается применением антитела согласно настоящему изобретению, возможно связанного с иммуномодулирующим соединением. Тот факт, что предложены антитела человека, или функциональные части или функциональные эквиваленты антител человека, уменьшает вероятность побочных действий у людей, что является существенным преимуществом. Следовательно, с антителами, предложенными в настоящем изобретении, стали доступны новые возможности лечения ОМЛ, которые можно применять дополнительно к существующей терапии ОМЛ, или в качестве ее альтернативы.
В важном варианте реализации настоящего изобретения предложены ОМЛ-специфические антитела человека, которые способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ. Введение таких антител пациенту с ОМЛ будет противодействовать клеткам ОМЛ без необходимости добавления к антителу дополнительных (токсических) молекул. В особенно предпочтительном варианте реализации предложены ОМЛспецифические антитела человека, которые способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо от антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), апоптоза или фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки. Предпочтительно, такие антитела способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ (по существу) независимо от любых других иммунных клеток, или комплемента, или апоптоза. В разделе Примеры показано, что такие антитела способны непосредственно уменьшать или ингибировать рост клеток ОМЛ, или даже способны убивать клетки ОМЛ, в отсутствие иммунных клеток, таких как NK-клетки или макрофаги, и в отсутствие комплемента. Данный вариант реализации противоположен подходам известного уровня техники, таким как, например, описанные в Majeti и др., 2009 г., и Willingham и др., 2012 г., в которых специфическое к CD47 антитело применяли для того, чтобы позволить фагоцитоз макрофагами опухолевых клеток. В WO 2009/051974 описано применение антител, специфичных к молекуле 1, подобной лектину типа С (CLL-1), которые способны вызывать КЗЦ против клеток ОМЛ in vitro в присутствии компонентов комплемента кролика. Bakker и др., 2004 г., тем не менее, не предусмотрели, что антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность или комплементзависимая цитотоксичность посредством CLL-1 будет эффективным механизмом нацеливания, и предложили конъюгированные с токсином антитела к CLL-1 для применения против ОМЛ. В WO 2012/098407 описано применение антител, специфичных к IL1RAP, для индукции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, направленной против клеток ОМЛ, путем привлечения NKклеток, которые вызывают гибель клеток ОМЛ. Следовательно, описанный выше известный уровень техники сфокусирован на применении антител для того, чтобы активировать другие иммунные клетки, что не может обеспечить желательные результаты у индивидов с нарушенным иммунитетом, таких как пациенты с ОМЛ, которые прошли химиотерапию с аллогенной ТСК или без нее.
В WO 2013/071068 описаны антитела к CXCR4, которые получили в трансгенных трансхромосомных мышах, экспрессирующих гены антител человека. Полученные антитела связывались с широким спектром гематопоэтических клеток и были способны ингибировать рост линии клеток ОМЛ in vitro. Данные антитела к CXCR4 вызывают апоптоз в различных линиях клеток ОМЛ.
Также была описана терапия ОМЛ моноклональным антителом к CD33 (Walther и др., 2012). Например, описаны CD33-специфические антитела, конъюгированные с лекарственным средством.
В WO 2010/102244 описано гуманизированное антитело к EphA3, которое способно вызывать апоптоз клеток ОМЛ. Более того, у Biernacki и др., 2010 г., и Wu и др., 2000 г., описаны антитела, полученные из пациентов с ОМЛ, которые специфичны к внутриклеточным антигенам, таким как RAB38, ТВСЕ, DUSP12 и RAFTK.
В заключение, в нескольких публикациях описаны антитела против ОМЛ, которые связываются с внутриклеточными антигенами. Такие антитела не являются антителами первого выбора для борьбы с живыми интактными клетками ОМЛ in vivo вследствие недоступности таких внутриклеточных мишеней,
- 2 043009 когда клетки ОМЛ интактны. В других публикациях описаны антитела, которые связываются с широким спектром гематопоэтических клеток, например, посредством CD33, CXCR4, CD47 или CLL-1. Антитела, которые связываются с широким спектром (гематопоэтических) клеток, приводят к риску тяжелых побочных эффектов.
Некоторые антитела, описанные в данной области, действуют, вызывая фагоцитоз, АЗКЦ или КЗЦ, что означает, что необходимы другие иммунные клетки или компоненты комплемента для противодействия клеткам ОМЛ. Применение таких антител, следовательно, ограничено у индивидов с нарушенным иммунитетом. Более того, некоторые из описанных антител не принадлежат человеку, что вызывает высокий риск побочных действий. В других публикациях (таких как WO 2013/071068 и WO 2010/102244) описаны антитела, которые вызывают апоптоз клеток ОМЛ.
В противоположность приведенным выше публикациям, авторы настоящего изобретения использовали отличный подход. Вместо искусственного получения антител против компонента, который присутствует, среди прочего, на клетках ОМЛ, авторы настоящего изобретения выделили антитела из пациентов-людей с ОМЛ, у которых после получения аллогенной ТСК развился сильный ответ трансплантата против лейкемии, при этом они оставались в полной ремиссии. Данные антитела способны специфично связывать интактные клетки ОМЛ. Следовательно, вместо применения искусственно разработанных антител авторы настоящего изобретения изящно воспользовались преимуществом природной иммунной защиты, вызванной у пациентов-людей с ОМЛ после получения аллогенной ТСК. Гуморальный ответ, встречающийся в природе, приводит к очень точной селекции и разрастанию популяции В-клеток, которые продуцируют эффективные антитела in vivo. Антитела согласно настоящему изобретению, или функциональные части или функциональные производные указанных антител, следовательно, особенно подходят для связывания с клетками ОМЛ у пациентов с ОМЛ. Тот факт, что указанные антитела специфичны к интактным клеткам ОМЛ, а не к внутриклеточным антигенам, делает их особенно подходящими для терапии ОМЛ.
Было описано, что антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению может быть связано с токсичной молекулой. Такая токсичная молекула затем будет направлена на клетки ОМЛ in vivo посредством связывания антитела с клетками ОМЛ. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложены антитела человека, или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, которые способны связываться с интактными клетками ОМЛ и которые способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ. Такое антитело избавляет от необходимости соединения антитела с дополнительным токсичным компонентом (хотя применение токсичной молекулы все же может быть полезно для получения дополнительного эффекта, направленного против ОМЛ). В одном особенно предпочтительном варианте реализации предложены антитела человека, или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, согласно настоящему изобретению, которые способны связываться с интактными клетками ОМЛ и которые способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо от антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) или фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки. Предпочтительно, такие антитела способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо или по существу независимо от других иммунных клеток или компонентов комплемента. Применение таких антител, обладающих сильной активностью, направленной против ОМЛ, предпочтительно, особенно у индивидов с нарушенным иммунитетом. В одном предпочтительном аспекте настоящего изобретения, следовательно, предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело человека или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое способно связываться с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и которое способно уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо или по существу независимо от антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) или фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки. Предпочтительно, такие антитела способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ (по существу) независимо от любых других иммунных клеток или комплемента. В разделе Примеры показано, что по меньшей мере антитела AT12-023, AT12-025 и AT13-024 обладают данными свойствами. Следовательно, они являются предпочтительными антителами согласно настоящему изобретению.
В дополнительном предпочтительном варианте реализации предложены антитела человека, или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, согласно настоящему изобретению, которые способны связываться с интактными клетками ОМЛ и которые способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо от апоптоза. В разделе Примеры показано, что по меньшей мере антитела АТ12-023, АТ13-031 и АТ13-037 обладают данным свойством. Это ясно из того факта, что данные антитела могут вызывать гибель клеток ОМЛ в присутствии ингибиторов апоптоза, таких как неспецифические ингибиторы каспаз Q-VD-OPh или Z-VAD-fmk, и из того факта, что большинство из данных антител (за исключением антитела AT13-031) сохраняет цитотоксические свойства при 4°С. Согласно настоящему изобретению, антитела, такие как AT12-023, AT13-031 и AT13-037, убивают клетки ОМЛ, на которые они нацелены, посредством некроза (такого как онкоз или некроптоз). Это обеспечивает пре
- 3 043009 имущество над известными на сегодняшний день вызывающими апоптоз антителами, состоящее в том, что вызывающие некроз антитела согласно настоящему изобретению будут усиливать иммунный ответ пациента больше, чем вызывающие апоптоз антитела. Это происходит благодаря тому факту, что в результате некроза содержимое клетки в большей степени открыто для контакта с иммунной системой индивида. Следовательно, дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело человека или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое способно связываться с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и которое способно уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо или по существу независимо от апоптоза.
В дополнительном предпочтительном варианте реализации предложены антитела человека, или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, согласно настоящему изобретению, которые способны уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо как от апоптоза, так и от приведенных выше иммунных клеток и комплемента. Следовательно, дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело человека или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое способно связываться с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и которое способно уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ по существу независимо от антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), апоптоза или фагоцитоза макрофагами или дендритными клетками.
Антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению предпочтительно способно связывать интактные клетки ОМЛ. Предпочтительно, такое антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, способно связываться с компонентом поверхности клетки, который специфичен для клеток ОМЛ. Это обычно означает, что не относящиеся к гематопоэтическим клетки или незлокачественные гематопоэтические клетки, такие как, например, гепатоциты, клетки толстого кишечника, фибробласты, эндотелиальные клетки, здоровые мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и здоровые клетки костного мозга, не узнаются или в значительно меньшей степени узнаются (по аффинности связывания) антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, согласно настоящему изобретению, чем клетки ОМЛ. Это означает, что связывание антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению с не относящимися к гематопоэтическим клетками или незлокачественными гематопоэтическими клетками обычно находится в том же диапазоне аффинностей, что и связывание с данными клетками постороннего контрольного антитела (где указанное контрольное антитело не обладает специфичностью к указанным клеткам). Некоторая реакционная способность по отношению к другим типам злокачественных гематопоэтических клеток, тем не менее, входит в объем термина ОМЛ-специфические. Например, в табл. 4 и на фиг. 6 показано, что антитела АТ13-031 и АТ12023 способны связывать полученные из пациента В-клетки неходжкинской лимфомы. Следовательно, также предложено применение антитела AT13-031 или антитела AT12-023, или функциональной части или функционального производного любого из данных антител, для получения лекарственного средства от В-клеточной неходжкинской лимфомы или агента для ее профилактики, также, как и антитела AT13031 или антитела AT12-023, или функциональной части или функционального производного любого из данных антител, для применения в способе по меньшей мере частичного лечения или предупреждения Вклеточной неходжкинской лимфомы. Аналогично, антитела AT13-024, AT13-031 и AT12-019 способны связываться с линиями клеток лимфомы и/или множественной миеломы (табл. 4). Применение антитела AT13-024, или антитела AT13-031, или антитела AT12-019, или функциональной части или функционального производного любого из данных антител, для получения лекарственного средства или агента для профилактики лимфомы и/или миеломы, следовательно, также предложено, как и антитело AT13024, или антитело AT13-031, или антитело AT12-019, или функциональная часть или функциональное производное любого из данных антител, для применения в способе по меньшей мере частичного лечения или предупреждения лимфомы и/или миеломы.
В данном изобретении в объем термина клетки ОМЛ входят природные клетки ОМЛ, такие как первичные бластные клетки ОМЛ, которые присутствуют в пациентах с ОМЛ, а также линии клеток ОМЛ, такие как например, ТНР-1, Mono-Mac 6 и Molm 13.
Термин антитело в данном изобретении относится к белку иммуноглобулина, содержащему по меньшей мере вариабельную область тяжелой цепи (VH), соединенную в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), который специфичен к целевому эпитопу.
В данном изобретении функциональная часть антитела означает ту часть, которая обладает по меньшей мере одним общим с указанным антителом свойством по типу, не обязательно по величине. Указанная функциональная часть способна связывать тот же антиген, что и указанное антитело, хотя не обязательно в той же степени. В одном варианте реализации функциональная часть антитела содержит по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (VH). Лишь некоторые из примеров функциональной части антитела представляют собой однодоменное антитело, одноцепочечное антитело, нанотело, унитело (unibody), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), фрагмент Fab и фрагмент F(ab')2.
- 4 043009
Функциональный эквивалент антитела в данном изобретении означает искусственное связывающее соединение, содержащее по меньшей мере одну последовательность определяющей комплементарность области (CDR) антитела, предпочтительно последовательность CDR3 тяжелой цепи. Указанный функциональный эквивалент предпочтительно содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи антитела, а также последовательность CDR3 легкой цепи указанного антитела. Более предпочтительно, указанный функциональный эквивалент содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи антитела, а также последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи указанного антитела. Функциональный эквивалент антитела, например, получают путем изменения антитела таким образом, что по меньшей мере способность полученного соединения связывать антиген была по существу такая же по типу, не обязательно по величине. Это осуществляют многими способами, например, посредством консервативной замены аминокислоты, при которой аминокислотный остаток заменяют на другой остаток, как правило, с аналогичными свойствами (размером, гидрофобностью и т.д.), таким образом, что общее функционирование антитела по существу не нарушено.
Специалисту в данной области техники хорошо известно, что тяжелая цепь антитела является большей из двух типов цепей, образующих молекулу иммуноглобулина. Тяжелая цепь содержит константный домен и вариабельный домен, указанный вариабельный домен участвует в связывании антигена. Легкая цепь антитела является меньшей из двух типов цепей, образующих молекулу иммуноглобулина. Легкая цепь содержит константный домен и вариабельный домен. Указанный вариабельный домен часто, но не всегда, вместе с вариабельным доменом тяжелой цепи вовлечен в связывание антигена.
Определяющие комплементарность области (CDR) представляют собой гипервариабельные участки, присутствующие в вариабельных доменах тяжелой цепи и вариабельных доменах легкой цепи. В случае целых антител, CDR1-3 тяжелой цепи и CDR1-3 присоединенной легкой цепи вместе образуют сайт связывания антигена.
В данном изобретении термин антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению также называют связывающим соединением согласно настоящему изобретению.
Термин компонент поверхности клеток ОМЛ означает любой компонент, который по меньшей мере отчасти присутствует около или на поверхности клеток ОМЛ, или компонент, который присоединен к поверхности клетки ОМЛ. Лишь некоторые из примеров компонентов поверхности клеток ОМЛ представляют собой (транс)мембранные белки, гликопротеины и любое соединение, присоединенное к ним.
Термины специфичный к и способный специфично связывать используют в данном изобретении взаимозаменяемо, и они относятся к взаимодействию между антителом, или функциональной частью или функциональным эквивалентом указанного антитела, и его эпитопом. Это означает, что указанное антитело, или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, предпочтительно связывается с указанным эпитопом, чем с другими антигенами или последовательностями аминокислот. Таким образом, хотя указанное антитело, или его функциональная часть или эквивалент, может неспецифично связываться с другими антигенами или последовательностями аминокислот, аффинность связывания указанного антитела, или функциональной части или функционального эквивалента указанного антитела, с его эпитопом значительно выше, чем аффинность неспецифического связывания указанного антитела, или функциональной части или функционального эквивалента, с другими антигенами или последовательностями аминокислот.
Антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое способно связываться с конкретным эпитопом клеток ОМЛ, также может быть специфичным к другим, не относящимся к ОМЛ клеткам, если указанный эпитоп клеток ОМЛ также присутствует на других клетках (например, других клетках лейкемии, клетках миеломы или клетках лимфомы). В указанном случае антитело, называемое в данном изобретении специфичным к клеткам ОМЛ, также специфично к указанным другим клеткам, содержащим такой же эпитоп. Предпочтительно, антитела человека против ОМЛ, и функциональные части и функциональные эквиваленты указанных антител, предложенные в данном изобретении, значительно не связываются с не относящимися к гематопоэтическим клетками и незлокачественными гематопоэтическими клетками.
Аффинность связывания относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иначе, в данном изобретении аффинность связывания относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между партнерами в связывающейся паре (например, между антителом и антигеном). Аффинность, как правило, может быть представлена посредством равновесной константы диссоциации (KD), которую рассчитывают как отношение константы скорости ассоциации (ka) к константе скорости диссоциации (kd), см., например, Chen, Y., и др., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Аффинность можно измерить с помощью обычных способов, известных в данной области, таких как, например, анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР), например, с помощью устройства BiaCore или IBIS-iSPR в IBIS Technologies BV (Хенгело, Нидерланды), или анализ в жидкой фазе, такой как Kinexa. Предпочтительно
- 5 043009 аффинность связывания антитела согласно настоящему изобретению с эпитопом около или на поверхности клеток ОМЛ характеризуется константой диссоциации (KD), равной не более 100 нМ, более предпочтительно не более 50 нМ, более предпочтительно не более 25 нМ, более предпочтительно не более 10 нМ, более предпочтительно не более 5 нМ, более предпочтительно не более 2 нМ, более предпочтительно не более 1 нМ, более предпочтительно не более 0,5 нМ, более предпочтительно не более 0,3 нМ, более предпочтительно не более 0,1 нМ.
Процент идентичности последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот или термин % идентичности последовательностей в данном изобретении означает процент остатков в кандидатной последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот, которые идентичны остаткам в эталонной последовательности после выравнивания двух указанных последовательностей и введения разрывов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности. Способы и компьютерные программы для выравнивания хорошо известны в данной области, например, Align 2.
В особенно предпочтительном варианте реализации предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое способно вызывать гибель первичных бластных клеток ОМЛ. Поскольку первичные бластные клетки ОМЛ получают непосредственно из пациента с ОМЛ, в противоположность доступным для приобретения линиям клеток, активность антитела против таких бластных клеток ОМЛ еще более характерна для ситуации in vivo. В разделе Примеры показано, что по меньшей мере антитела AT13-024 и AT12-025 обладают данным свойством. Данные антитела, следовательно, являются предпочтительными. В особенно предпочтительном варианте реализации предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое способно вызывать гибель первичных бластных клеток ОМЛ независимо или по существу независимо от антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), апоптоза и/или фагоцитоза макрофагами или дендритными клетками. Предпочтительно такие связывающие соединения способны вызывать гибель бластных клеток ОМЛ по существу независимо от других иммунных клеток, или комплемента, или апоптоза. Антитела AT13-024 и AT12-025 также обладают данным предпочтительным свойством.
В данном изобретении термин по существу независимо от АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, означает, что АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоз связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, не требуются для направленного против ОМЛ действия, вызванного связывающим соединением согласно настоящему изобретению, даже если в ситуации in vivo АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоз связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, также может происходить. Следовательно, в данном варианте реализации АЗКЦ, КЗЦ и фагоцитоз связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, не исключаются, но также и не являются необходимыми. Аналогичным образом, термин по существу независимо от других иммунных клеток или комплемента означает, что связывающее соединение согласно настоящему изобретению, в принципе, способно оказывать направленное против ОМЛ действие без присутствия других иммунных клеток или комплемента, даже если в ситуации in vivo другие иммунные клетки или комплемент также могут проявлять направленную против ОМЛ активность. Термин по существу независимо от апоптоза означает, что направленное против ОМЛ действие оказывается связывающим соединением согласно настоящему изобретению посредством механизма, отличного от апоптоза. Предпочтительно, указанное направленное против ОМЛ действие оказывается посредством некроза.
В дополнительном предпочтительном варианте реализации предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое способно уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ in vitro в течение 7 дней, предпочтительно в течение 5 дней, более предпочтительно в течение 3 дней и еще более предпочтительно в течение 1 дня. Это указывает на быстрый терапевтический эффект.
Согласно настоящему изобретению предложены выделенные синтетические и рекомбинантные антитела человека и функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, которые способны связываться с интактными клетками ОМЛ. Указанные клетки ОМЛ предпочтительно по франко-американо-британской (ФАБ) классификации принадлежат к типам, выбранным из группы, состоящей из М5, М0, M1, М2, М3 и М4. Более предпочтительно, указанные клетки ОМЛ по ФАБклассификации принадлежат к типам М5, или M1, или М0, или М4, предпочтительно к типу М5. Перечисленные типы по ФАБ-классификации часто встречаются у пациентов с ОМЛ.
В дополнительном предпочтительном варианте реализации предложены выделенные синтетические и рекомбинантные антитела человека или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, которые способны связываться с различными клетками ОМЛ, принадлежащими к по меньшей мере двум, предпочтительно по меньшей мере трем, более предпочтительно по меньшей мере четырем различным типам по ФАБ-классификации. Такие антитела полезны для различных пациентов с ОМЛ различных типов по ФАБ-классификации, так что данные антитела можно широко применять. В табл. 3 показано, что антитело AT12-025 способно связывать клетки ОМЛ, принадлежащие к по меньшей мере двум типам по ФАБ-классификации (М5+М1). Следовательно, оно представляет собой предпочти
- 6 043009 тельное антитело согласно настоящему изобретению. Антитела AT13-024, AT12-019, AT13-023, и AT13022 способны связывать клетки ОМЛ, принадлежащие к по меньшей мере трем типам по ФАБклассификации (М5+МО+М1). Антитело АТ13-031 также способно связывать клетки ОМЛ, принадлежащие к по меньшей мере трем типам по ФАБ-классификации ( М5+М1+М4). Данные антитела, следовательно, еще более предпочтительны. Более того, антитело AT12-023 способно связывать клетки ОМЛ, принадлежащие к по меньшей мере четырем типам по ФАБ-классификации (М5+МО+М1+М4). Данное антитело, следовательно, можно еще более широко применять, и, следовательно, оно является особенно предпочтительным.
В одном особенно предпочтительном варианте реализации предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, при этом указанное антитело принадлежит к изотипу IgG, предпочтительно к IgGl или IgG3. Это имеет практическую значимость для медицинских применений у людей.
В табл. 1А и 1B и на фиг. 1 приведен обзор вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепей, а также отдельных последовательностей CDR, антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, AT13-037, АТ14013, AT14-014, AT14-015 и AT14-016. Данные антитела представляют собой предпочтительные антитела согласно настоящему изобретению, полученные из трех пациентов-людей с ОМЛ. В данном изобретении в объем терминов АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14014, АТ14-015 и АТ14-016 входят все антитела, и функциональные части и функциональные эквиваленты, содержащие по меньшей мере области CDR1-3 тяжелой и легкой цепей, предпочтительно вариабельные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, данных антител, представленные в табл. 1А и 1В и на фиг. 1, такие как например, выделенные и/или очищенные антитела или полученные рекомбинантным способом антитела.
В данном изобретении любая ссылка на табл. 1 включает ссылку на таблицу 1А и/или табл. 1В.
На основе антител, представленных в табл. 1 и на фиг. 1, можно получить антитело, или функциональную часть или функциональный эквивалент указанного антитела, содержащее по меньшей мере одну последовательность CDR антитела, представленного в табл. 1 и на фиг. 1, которое специфично к клеткам ОМЛ. Следовательно, предложено выделенное рекомбинантное и/или синтетическое антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, содержащее по меньшей мере одну последовательность CDR антитела, представленного в табл. 1. Указанная последовательность CDR предпочтительно представляет собой последовательность CDR3 антитела согласно настоящему изобретению. Предпочтительно предложены связывающие соединения, которые содержат по меньшей мере две CDR, более предпочтительно по меньшей мере три CDR, тяжелой и легкой цепей одного и того же антитела, указанного в табл. 1 или на фиг. 1. Следовательно, предпочтительно по меньшей мере две или три CDR тяжелой и легкой цепей антитела AT12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, AT13-037, АТ14-013, AT14014, AT14-015 или AT14-016 совместно присутствуют в одном связывающем соединении согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, связывающее соединение согласно настоящему изобретению содержит все три CDR тяжелой цепи и все три CDR легкой цепи одного и того же антитела, представленного в табл. 1 или на фиг. 1. Возможно, по меньшей мере одна из указанных последовательностей CDR оптимизирована, в результате чего получают вариант связывающего соединения, предпочтительно для того, чтобы улучшить эффективность, селективность или стабильность связывания. Это, например, осуществляют с помощью процедур мутагенеза, в которых после того, как предпочтительно исследовали стабильность и/или эффективность связывания полученного соединения, выбирают улучшенное ОМЛспецифическое связывающее соединение. Специалист вполне способен получить варианты, содержащие по меньшей мере одну измененную последовательность CDR согласно настоящему изобретению. Например, осуществляется консервативная замена аминокислоты. Примеры консервативной замены аминокислоты включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой гидрофобный остаток, и замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин. Предпочтительно, предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, содержащее последовательность CDR, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CDR, представленной в табл. 1 или на фиг. 1, таким образом, что полезная способность ОМЛ-специфического антитела, представленного в табл. 1 или на фиг. 1, связывать клетки ОМЛ и/или убивать клетки ОМЛ сохраняется или даже улучшается. Варианты связывающих соединений, включающих последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CDR, представленной в табл. 1 или на фиг. 1, следовательно, также входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно, указанные связывающие соединения содержат последовательности CDR1-3 тяжелой цепи и легкой цепи, которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательностям CDR1-3 тяжелой и легкой цепей одного и того же антитела, представленного в табл. 1 или на фиг. 1. Предпочтительно, последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не бо
- 7 043009 лее чем двумя, предпочтительно не более чем одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела согласно настоящему изобретению.
Помимо оптимизации последовательностей CDR для улучшения эффективности связывания или стабильности, можно оптимизировать по меньшей мере одну последовательность в по меньшей мере одной из каркасных областей. Это предпочтительно осуществляют для того, чтобы улучшить эффективность связывания или стабильность. Каркасные последовательности, например, оптимизируют путем мутирования молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую каркасную последовательность, при этом впоследствии предпочтительно исследуют свойства полученного в результате этого антитела - или функциональной части или функционального эквивалента. Таким образом, можно получить улучшенные связывающие соединения. В предпочтительном варианте реализации для каркасных областей в антителах согласно настоящему изобретению используются человеческие зародышевые последовательности. Применение человеческих зародышевых последовательностей минимизирует риск иммуногенности указанных антител, так как данные последовательности с меньшей вероятностью будут содержать соматические изменения, которые уникальны для индивидов, из которых получили указанные каркасные области, и могут вызывать иммуногенный ответ, если их применить у другого человека. Следовательно, дополнительно предложено синтетическое или рекомбинантное антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, содержащее по меньшей мере одну неприродную мутацию в каркасной области. В качестве дополнения или альтернативы, предложено синтетическое или рекомбинантное антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое содержит по меньшей мере одну неприродную мутацию в константной области. Под неприродной мутацией понимают, что полученная в результате этого последовательность аминокислот не встречается в природе. Вместо этого, она была получена искусственным путем. В одном варианте реализации Fc-область IgG3 антитела АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ13-022, AT12-020, AT14-014, AT14-015 или AT14-016 по меньшей мере частично заменена на Fcобласть IgG1. Это, как правило, повышает стабильность и время полужизни полученного в результате этого иммуноглобулина.
Связывающее соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит человеческую вариабельную область. Более предпочтительно, указанное связывающее соединение содержит человеческую константную область и человеческую вариабельную область. В наиболее предпочтительном случае указанное связывающее соединение представляет собой антитело человека. Применение ОМЛспецифических антител человека предпочтительнее, чем применение не относящихся к человеку антител. Применение in vivo не относящихся к человеку антител для диагностики и/или лечения заболеваний человека затрудняется множеством факторов. В частности, организм человека может узнавать не относящиеся к человеку антитела как чужеродные, что будет приводить к иммуногенному ответу против не относящихся к человеку антител, приводящему к нежелательным побочным действиям и/или быстрому клиренсу указанных антител из кровотока. Антитело человека уменьшает вероятность побочных действий при введении человеку и часто приводит к большему времени полужизни в кровотоке благодаря пониженному клиренсу по сравнению с не относящимися к человеку антителами. В другом варианте реализации связывающее соединение согласно настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело. В другом варианте реализации связывающее соединение согласно настоящему изобретению представляет собой химерное антитело. В химерном антителе интересующие последовательности, такие как, например, дополнительный интересующий сайт связывания, включены в связывающее соединение согласно настоящему изобретению.
Кроме того, связывающие соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой моноклональные антитела. Моноклональное антитело представляет собой антитело, состоящее из одного молекулярного вида. Моноклональные антитела можно получить в больших количествах с помощью клеток, продуцирующих моноклональные антитела, или посредством технологии рекомбинантных ДНК.
Следовательно, варианты связывающих соединений на основе предпочтительных антител, представленных в табл. 1 и на фиг. 1, также можно получить, применяя методики, известные в данной области, такие как, например, мутагенез. Обычно, допускаются вариации последовательности от 80 до 99%, при которых сохраняется некоторая антигенная специфичность. Связывающие соединения согласно настоящему изобретению, содержащие последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична по меньшей мере последовательности CDR любого из антител, представленных в табл. 1 или на фиг. 1, следовательно, также предложены в данном изобретении. Поскольку на антигенную специфичность антитела, как правило, оказывают преобладающее влияние последовательности CDR3, вариант антитела согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере последовательность CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности CDR3 тяжелой цепи, представленной в табл. 1 или на фиг. 1. Указанный вариант антитела предпочтительно содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи и последовательность CDR3 легкой цепи, которые по меньшей мере на 80% идентичны последовательностям CDR3 тяжелой и легкой цепей одного и того же антитела, выбранного из группы, состоящей из АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023,
- 8 043009
АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14015 и АТ14-016.
Следовательно, дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит по меньшей мере последовательность CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 27-39 и 217220, и последовательность CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 66-78 и 229-232. Данные последовательности представляют собой последовательности CDR3 антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13036, АТ13-037, АТ14-013, AT14-014, AT14-015 и AT14-016, представленных в табл. 1 и на фиг. 1. Предпочтительно, указанная идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Ранее упоминалось, что связывающее соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит последовательность CDR3 тяжелой и легкой цепей, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательностям CDR3 тяжелой и легкой цепей одного и того же антитела, выбранного из представленных в табл. 1 или на фиг. 1.
Обычно, по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка данной последовательности CDR могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, связывающее соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит последовательность CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи, в которой не более 3, предпочтительно не более 2, более предпочтительно не более 1 аминокислоты отличается от последовательности CDR3 тяжелой и легкой цепей из того же антитела, выбранного из группы, состоящей из АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14-015 и АТ14-016.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1-13 и 209-212; и/или последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 14-26 и 213-216; и/или последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 27-39 и 217-220; и/или последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 40-52 и 221-224; и/или последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 53-65 и 225-228; и/или последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 66-78 и 229-232.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR тяжелой и легкой цепей антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, AT13-037, АТ14-013, AT14-014, AT14-015 и AT14-016, представленных в табл. 1А и 1В и на фиг. 1.
Описанные выше последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно происходят из одного и того же антитела, выбранного из представленных в табл. 1 или на фиг. 1. Предпочтительно указанное антитело, или его функциональная часть или эквивалент, содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, которые по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 86%, более предпочтительно по меньшей мере на 87%, более предпочтительно по меньшей мере на 88%, более предпочтительно по меньшей мере на 89%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по
- 9 043009 меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно на 100% идентичны перечисленным выше последовательностям CDR (SEQ ID NO: 1-78 и 209-232).
В предпочтительном варианте реализации последовательности CDR1, и CDR2, и CDR3 тяжелой цепи, а также последовательности CDR1, и CDR2, и CDR3 легкой цепи одного и того же антитела, выбранного из группы, состоящей из антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, AT14-014, ATM
015 и AT14-016, присутствуют в данном связывающем соединении согласно настоящему изобретению.
Предпочтительное антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело AT12023. Данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ - ТНР-1, как показано в разделе Примеры и на фиг. 7 и 8. Данное антитело, следовательно, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Интересно отметить, что AT12-023 принадлежит к изотипу IgG3 и принадлежит к семейству VH4-34, которое представляет собой семейство последовательностей VH, известных своей потенциальной способностью убивать клетки (Bhat и др., 1997). Антитело АТ12-023 также способно эффективно связывать первичные бластные клетки ОМЛ, принадлежащие к по меньшей мере четырем различным типам по ФАБклассификации (табл. 3). Указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела AT12-023 представляют собой последовательности SEQ ID NO: 1, 14, 27, 40, 53 и 66, соответственно, представленные в табл. 1. В настоящем изобретении, следовательно, дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, ко торое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 1; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 14; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 27; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 40; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 53; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO: 66.
Предпочтительно, указанная идентичность последовательностей составляет по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Ранее в данном изобретении описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, указанные последовательности CDR 1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, полученные из антитела AT12-023, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT12-023.
Другое предпочтительное антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело AT12-025. Данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ - ТНР-1, а также полученные из пациента первичные бластные клетки ОМЛ, как показано в разделе Примеры и на фиг. 8 и 10. Данное антитело, следовательно, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Интересно отметить, что AT12-025 принадлежит к изотипу IgG3 и принадлежит к семейству VH4-34, которое представляет собой семейство последовательностей VH, известных своей потенциальной способностью убивать клетки (Bhat и др., 1997). Указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела АТ12-025 представляют собой последовательности SEQ ID NO: 2, 15, 28, 41, 54 и 67, соответственно, представленные в табл. 1. В настоящем изобретении, следовательно, дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или
- 10 043009 функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 2; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 15; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 28; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 41; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 54; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 67.
Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT12-025 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR 1, 2 и 3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT12-025.
Другое предпочтительное антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антитело AT13-024. Данное антитело является предпочтительным, так как оно способно связывать и убивать полученные из пациента первичные бластные клетки ОМЛ, как показано в разделе Примеры и на фиг. 10. Данное антитело, следовательно, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Интересно отметить, что AT13-024 принадлежит к изотипу IgG3 и принадлежит к семейству VH3-30. Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи антитела AT13-024 представляют собой последовательности SEQ ID NO: 3, 16 29, 42, 55 и 68, соответственно, представленные в табл. 1. В настоящем изобретении, следовательно, дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональ ный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 3; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 16; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 29; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 42; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 55; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 68.
Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-024 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных по
- 11 043009 следовательностей CDR AT13-024.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антите ла, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 4; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 17; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 30; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 43; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 56; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 69.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT12-019. Антитело AT12-019, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно эффективно связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT12-019, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT12-019 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT12-019.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антите ла, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 5; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 18; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 31; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 44; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 57; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 70.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-022. Интересно отметить, что антитело AT13-022 принадлежит к изотипу IgG3. Антитело AT13-022, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, что делает связывающее соединение, содержащее, последовательности CDR, полученные из AT13-022, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вы
- 12 043009 звать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-022 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-022.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антите ла, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 6; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 19; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 32; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 45; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 58; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 71.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-023. Интересно отметить, что AT13-023 принадлежит к семейству VH4-34, которое представляет собой семейство последовательностей VH, известных своей потенциальной способностью убивать клетки (Bhat и др., 1997). Антитело AT13-023, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-023, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-023 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-023.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей
- 13 043009 мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 7; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 20; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 33; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 46; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 59; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 72.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-031. Интересно отметить, что AT13-031 принадлежит к семейству VH4-34, которое представляет собой семейство последовательностей VH, известных своей потенциальной способностью убивать клетки (Bhat и др., 1997). Антитело AT13-031, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ. Более того, данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ -ТНР-1. Следовательно, связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-031, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-031 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-031.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 8; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 21; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 34; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 47; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 60; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 73.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT12-020. Интересно отметить, что антитело AT12-020 принадлежит к изотипу IgG3. Антитело AT12-020, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT12-020, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухо
- 14 043009 лью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT12-020 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT12-020.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 9; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 22; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 35; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 48; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 61; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 74.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-033. Антитело AT13-033, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ. Более того, данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ - ТНР-1. Следовательно, связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-033, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-033 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-033.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 10; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 23; и
- 15 043009 последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 36; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 49; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 62; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 75.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-034. Антитело AT13-034, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-034, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-034 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-034.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 11; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 24; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 37; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 50; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 63; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 76.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-035. Антитело AT13-035, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ. Более того, данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ - ТНР-1. Следовательно, связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-035, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпоч
- 16 043009 тительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-035 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-035.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антите ла, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 12; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 25; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 38; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 51; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 64; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 77.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-036. Антитело AT13-036, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ. Более того, данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ - ТНР-1. Следовательно, связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-036, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-036 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-036.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антите ла, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 13; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 26; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 39; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 52; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей ме
- 17 043009 ре на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 65; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 78.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT13-037. Антитело AT13-037, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ. Более того, данное антитело является предпочтительным, так как оно способно эффективно связывать и убивать клетки, принадлежащие к линии клеток ОМЛ - ТНР-1, а также полученные из пациента первичные бластные клетки ОМЛ, как показано в разделе Примеры. Следовательно, связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT13-037, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT13-037 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT13-037.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 209; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 213; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 217; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 221; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 225; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 229.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT14-013. Антитело АТ14-013, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать первичные бластные клетки ОМЛ, принадлежащие к по меньшей мере трем различным типам по ФАБ-классификации, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из АТ14-013, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют для уменьшения пролиферации клеток ОМЛ, предпочтительно независимо от апоптоза и/или независимо от АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоза макрофагами или дендритными клетками. Предпочтительно, указанное связывающее соединение применяют, чтобы вызвать гибель клеток ОМЛ. В некоторых вариантах реализации такое связывающее соединение применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛспецифический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере
- 18 043009
91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT14-013 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT14-013.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 210; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 214; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 218; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 222; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 226; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 230.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT14-014. Интересно отметить, что антитело AT14-014 принадлежит к изотипу IgG3. Антитело AT14-014, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT14-014, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют для уменьшения пролиферации клеток ОМЛ, предпочтительно независимо от апоптоза и/или независимо от АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоза макрофагами или дендритными клетками. Предпочтительно, указанное связывающее соединение применяют, чтобы вызвать гибель клеток ОМЛ. В некоторых вариантах реализации такое связывающее соединение применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT14-014 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT14-014.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 211; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 215; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 219; и
- 19 043009 последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 223; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 227; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 231.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT14-015. Интересно отметить, что антитело AT14-015 принадлежит к изотипу IgG3. Антитело AT14-015, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT14-015, особенно подходит для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют для уменьшения пролиферации клеток ОМЛ, предпочтительно независимо от апоптоза и/или независимо от АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоза макрофагами или дендритными клетками. Предпочтительно, указанное связывающее соединение применяют, чтобы вызвать гибель клеток ОМЛ. В некоторых вариантах реализации такое связывающее соединение применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT14-015 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT14-015.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено выделенное синтетическое или рекомбинантное антитело или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит:
последовательность CDR1 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 212; и последовательность CDR2 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 216; и последовательность CDR3 тяжелой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 220; и последовательность CDR1 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 224; и последовательность CDR2 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 228; и последовательность CDR3 легкой цепи, включающую последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 232.
Данные последовательности представляют собой последовательности CDR антитела AT14-016. Интересно отметить, что антитело AT14-016 принадлежит к изотипу IgG3. Антитело AT14-016, полученное из пациента-человека с ОМЛ, находящегося в полной ремиссии, способно специфично связывать интактные клетки ОМЛ, благодаря чему связывающее соединение, содержащее последовательности CDR, полученные из AT14-016, особенно подходящими для терапии и/или диагностики ОМЛ. Такое связывающее соединение, например, применяют для уменьшения пролиферации клеток ОМЛ, предпочтительно независимо от апоптоза и/или независимо от АЗКЦ, КЗЦ или фагоцитоза макрофагами или дендритными клетками. Предпочтительно, указанное связывающее соединение применяют, чтобы вызвать гибель клеток ОМЛ. В некоторых вариантах реализации такое связывающее соединение применяют в виде конъюгата антитела с лекарственным средством (ADC), таким образом, что токсичное соединение будет направлено на клетки ОМЛ, или его применяют, чтобы вызвать КЗЦ и/или АЗКЦ. В качестве альтернативы или дополнения, такое связывающее соединение можно применять для того, чтобы пометить клетки ОМЛ для специфического фагоцитоза связанными с опухолью миелоидными клетками, такими как
- 20 043009 макрофаги или дендритные клетки, такие клетки могут впоследствии вызвать ОМЛ-специфический иммунный ответ. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%. Выше описано, что по меньшей мере 1, 2 или 3 аминокислотных остатка в перечисленных последовательностях CDR AT14-016 могут отличаться, при этом сохраняя тот же тип активности связывания (по типу, не обязательно по величине). Следовательно, описанные выше последовательности CDR1, -2 и -3 тяжелой и легкой цепей предпочтительно включают последовательности CDR, которые отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, более предпочтительно не более чем одной аминокислотой от перечисленных последовательностей CDR AT14-016.
Предпочтительно, антитело согласно настоящему изобретению содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи и/или вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в табл. 1 или на фиг. 1, или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанным последовательностям. В табл. 1 показано, что вариабельные последовательности тяжелых цепей антител AT12023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, AT13-036, AT13-037, АТ14-013, AT14-014, AT14-015 и AT14-016 представляют собой последовательности SEQ ID NO: 79-91 и 233-236, соответственно. Вариабельные последовательности легких цепей антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14-015 и АТ14-016 представляют собой последовательности SEQ ID NO: 92-104 и 237-240, соответственно. Следовательно, также предложено антитело, или его функциональная часть, или эквивалент, согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 79-91 и 233-236, и/или содержащее вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 92-104 и 237-240, или последовательности, которые по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 86%, более предпочтительно по меньшей мере на 87%, более предпочтительно по меньшей мере на 88%, более предпочтительно по меньшей мере на 89%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, или даже на 100% идентичны любой из данных последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи. Чем выше идентичность, тем больше антитело похоже на антитело, изображенное на фиг. 1. Предпочтительно, связывающее соединение согласно настоящему изобретению содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи любого из антител, представленных на фиг. 1, вместе с вариабельной последовательностью легкой цепи из того же антитела, или последовательности тяжелой и легкой цепей, которые по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичны указанным последовательностям.
Например, антитело AT12-023 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 79, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 92, показанные в табл. 1. Следовательно, предпочтительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 79. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или
- 21 043009 по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 92.
Антитело AT12-025 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 80, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 93, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 80. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 93.
Антитело AT13-024 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 81, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 94, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 81. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 94.
Антитело AT12-019 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 82, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 95, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 82. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 95.
Антитело AT13-022 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 83, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 96, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 83. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере
- 22 043009 на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 96.
Антитело AT13-023 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 84, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 97, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 84. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 97.
Антитело AT13-031 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 85, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 98, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 85. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 98.
Антитело AT12-020 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 86, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 99, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 86. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 99.
Антитело AT13-033 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 87, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 100, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 87. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит
- 23 043009 вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 100.
Антитело AT13-034 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 88, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 101, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 88. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 101.
Антитело AT13-035 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 89, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 102, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 89. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 102.
Антитело AT13-036 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 90, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 103, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 90. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 103.
Антитело AT13-037 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 91, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 104, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей
- 24 043009 мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 91. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 104.
Антитело AT14-013 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 233, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 237, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 233. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 237.
Антитело AT14-014 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 234, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 238, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 234. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 238.
Антитело AT14-015 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 235, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 239, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 235. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 239.
Антитело AT14-016 содержит вариабельную последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 236, и вариабельную последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 240, показанные в табл. 1. Следовательно, дополнительно предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, содержащее вариабельную последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере
- 25 043009 на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 236. Предпочтительно, указанное связывающее соединение также содержит вариабельную последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 86%, или по меньшей мере на 87%, или по меньшей мере на 88%, или по меньшей мере на 89%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97%, или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 240.
В одном особенно предпочтительном варианте реализации предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое способно связывать snRNP200. SnRNP200, также известный как U5-snRNP, представляет собой белковый комплекс, который является частью сплайсосомы во всех эукариотических клетках. Обычно, snRNP200 расположен в ядре. Тем не менее, в настоящем изобретении предложили неожиданный вывод, что snRNP200 также присутствует на поверхности клеток ОМЛ. Данный антиген связывается по меньшей мере антителами AT12-023, AT13-031 и AT13-037, и функциональными частями и функциональными эквивалентами перечисленных антител. Следовательно, snRNP200 представляет собой важную мишень для направленной против ОМЛ терапии, и snRNP200-специфические антитела согласно настоящему изобретению, следовательно, являются особенно подходящими для противодействия данным клеткам.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена выделенная синтетическая или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 15 нуклеотидов или ее функциональный эквивалент, кодирующая по меньшей мере одну последовательность CDR антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению. Предпочтительно длина молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению составляет по меньшей мере 30 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 50 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 75 нуклеотидов. Молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, например, выделяют из В-клетки, которая способна продуцировать антитело согласно настоящему изобретению. Указанная В-клетка предпочтительно продуцирует антитело AT12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13036, АТ13-037 АТ14-013, AT14-014, AT14-015 или AT14-016. В предпочтительном варианте реализации предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере последовательность CDR3 тяжелой цепи и последовательность CDR3 легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.
В данном изобретении формулировка выделенная синтетическая или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты длиной по меньшей мере 15 нуклеотидов или функциональный эквивалент указанной молекулы, кодирующая по меньшей мере одну последовательность CDR антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, также относится к молекуле нуклеиновой кислоты или ее функциональному эквиваленту согласно настоящему изобретению.
В данном изобретении молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению предпочтительно включает цепь нуклеотидов, более предпочтительно ДНК, кДНК или РНК. В других вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты или последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включает другие виды структур на основе нуклеиновых кислот, такие как например, спираль ДНК/РНК, пептидо-нуклеиновая кислота (ПНК), закрытая нуклеиновая кислота (ЗНК) и/или рибозим. Такие другие структуры на основе нуклеиновых кислот называют функциональными эквивалентами последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, в объем термина функциональный эквивалент молекулы нуклеиновой кислоты входит цепь, содержащая неприродные нуклеотиды, модифицированные нуклеотиды и/или не относящиеся к нуклеотидам элементы структуры, которые проявляют такую же функцию, как и природные нуклеотиды.
Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие CDR тяжелой цепи и легкой цепи антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, AT14-014, AT14-015 и AT14-016, представлены в табл. 1. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие некоторую CDR тяжелой цепи или легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению, которые отличаются от последовательностей нуклеиновых кислот CDR, представленных в табл. 1, но содержат кодоны нуклеиновых кислот, которые кодируют такие же аминокислоты, как и в указанной CDR тяжелой цепи или легкой цепи, также входят в объем настоящего изобретения. Такие молекулы нуклеиновых кислот, например, включают последовательности нуклеиновых кислот, которые были кодон-оптимизированы для экспрессии в клетке-продуценте, таком как, например, E.coli или клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки NSO (клетки миеломы мыши) или клетки 293(Т), чтобы позволить крупномасштабное производство связывающих соединений согласно настоящему изобретению. Следует отметить, что получение антител можно осуществить с помощью лю
- 26 043009 бой системы продукции рекомбинантных антител; четыре системы клеток-продуцентов, упомянутые в данном изобретении, представляют собой лишь немногие примеры многих систем, которые доступны на сегодняшний день. В данном изобретении термин кодон означает триплет нуклеотидов (или его функциональные эквиваленты), которые кодируют определенный аминокислотный остаток. Термин кодоноптимизированный означает, что один или более кодонов из исходной человеческой последовательности нуклеиновой кислоты были заменены на один или более кодонов, которые предпочтительны для определенной системы продукции антител. Данные замещающие кодоны предпочтительно кодируют такой же аминокислотный остаток, как и кодируемый исходным человеческим кодоном, который был заменен. В качестве альтернативы, один или более замещающих кодонов кодируют отличный аминокислотный остаток. Это предпочтительно приводит к консервативной замене аминокислоты, хотя и не обязательно. Обычно, в константных областях и каркасных областях, как правило, допускается одна или более замен аминокислот. В определяющих комплементарность областях предпочтительно используют кодоны, которые кодируют такой же аминокислотный остаток, как и кодируемый исходным человеческим кодоном, который был заменен.
Более того, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие некоторую CDR тяжелой цепи или легкой цепи, которая не идентична, но основана на последовательности CDR антитела, представленного в табл. 1, также входят в объем настоящего изобретения, при условии, что последовательность полученной в результате этого CDR по меньшей мере на 80% идентична последовательности CDR, представленной в табл. 1.
Следовательно, дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или функциональный эквивалент указанной молекулы, или вектор, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 105-182 и 241-264. Предпочтительно, полученная в результате этого CDR отличается не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходной последовательности CDR антитела согласно настоящему изобретению.
Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот, или их функциональные эквиваленты, или векторы согласно настоящему изобретению содержат:
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 105 -117 и 241-244, и/или последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 118-130 и 245-248, и/или последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 131-143 и 249-252, и/или последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 144-156 и 253-256, и/или последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 157-169 и 257-260, и/или последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 170 - 182 и 261-264.
Указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит последовательности, кодирующие CDR1-3 тяжелой цепи, и последовательности, кодирующие CDR1-3 легкой цепи, из одного и того же антитела, при этом указанное антитело выбрано из группы, состоящей из AT12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, AT14-015 и AT14016, и последовательности, кодирующие CDR1-3 тяжелой цепи, и последовательности, кодирующие CDR1-3 легкой цепи, которые по меньшей мере на 80% идентичны указанным последовательностям.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 105, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 118, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 131, и
- 27 043009 последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 144, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 157, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 170.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT12-023. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT12-023.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 106, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 119, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 132, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 145, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 158, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 171.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT12-025. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT12-025.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 107, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 120, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 133, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 146, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 159, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 172.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ13-024. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-024.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 108, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 121, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентич
- 28 043009 на последовательности SEQ ID NO: 134, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 147, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 160, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 173.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ12-019. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT12-019.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 109, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 122, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 135, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 148, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 161, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 174.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ13-022. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-022.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 110, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 123, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 136, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 149, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 162, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 175.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT13-023. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-023.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 111, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 124, и
- 29 043009 последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 137, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 150, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 163, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 176.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ13-031. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-031.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 112, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 125, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 138, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 151, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 164, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 177.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ12-020. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT12-020.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 113, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 126, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 139, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 152, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 165, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 178.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT13-033. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-033.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 114, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентич
- 30 043009 на последовательности SEQ ID NO: 127, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 140, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 153, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 166, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 179.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ13-034. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-034.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 115, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 128, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 141, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 154, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 167, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 180.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT13-035. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-035.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 116, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 129, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 142, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 155, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 168, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 181.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ13-036. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-036.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 117, и
- 31 043009 последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 130, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 143, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 156, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 169, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 182.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ13-037. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT13-037.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 241, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 245, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 249, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 253, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 257, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 261.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT14-013. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT14-013.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 242, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 246, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 250, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 254, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 258, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 262.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ14-014. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT14-014.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей
- 32 043009 мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 243, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 247, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 251, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 255, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 259, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 263.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела AT14-015. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT14-015.
Дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, которые(ый) содержат(ит):
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CDR1 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 244, и последовательность, кодирующую CDR2 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 248, и последовательность, кодирующую CDR3 тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 252, и последовательность, кодирующую CDR1 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 256, и последовательность, кодирующую CDR2 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 260, и последовательность, кодирующую CDR3 легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 264.
Перечисленные последовательности SEQ ID NO представляют собой указанные последовательности CDR1-3 тяжелой и легкой цепей антитела АТ14-016. Вновь, указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Предпочтительно, полученные в результате этого последовательности CDR отличаются не более чем тремя, предпочтительно не более чем двумя, предпочтительно лишь одной аминокислотой от исходных последовательностей CDR антитела AT14-016.
Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты или вектор(ы) согласно настоящему изобретению кодирует(ют) по меньшей мере вариабельную последовательность тяжелой цепи и/или вариабельную последовательность легкой цепи антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, указанная молекула нуклеиновой кислоты (молекулы нуклеиновых кислот) или вектор(ы) кодирует(ют) по меньшей мере вариабельную последовательность тяжелой цепи и/или вариабельную последовательность легкой цепи антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению. В одном варианте реализации предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов согласно настоящему изобретению, который(е) содержит(ат) последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 183-195 и 265-268, и/или последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 196-208 и 269-272. Указанная идентичность последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86%, более предпочтительно по меньшей мере 87%, более предпочтительно по меньшей мере 88%, более предпочтительно по меньшей мере 89%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 91%, более предпочтительно по меньшей мере 92%, более предпочтительно по меньшей мере 93%, более предпочтительно по меньшей мере 94%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96%, более предпочтительно по меньшей мере 97%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, более предпочтительно 100%.
Более предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов согласно настоящему изобретению содержит(ат) последовательность, коди
- 33 043009 рующую вариабельную область тяжелой цепи, а также последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, которые сходны с последовательностями, кодирующими вариабельные области тяжелой и легкой цепей одного и того же антитела, представленного в табл. 1. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или вектор(ы) согласно настоящему изобретению содержит(ат) последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014,
AT14-015 или AT14-016, и последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, одного и того же антитела, или последовательности, которые по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 86%, более предпочтительно по меньшей мере на 87%, более предпочтительно по меньшей мере на 88%, меньшей мере на 89%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, меньшей мере на 99% идентичны указанным последовательностям.
более предпочтительно по более предпочтительно по более предпочтительно по более предпочтительно по более предпочтительно по более предпочтительно по
В некоторых вариантах реализации предложены молекулы нуклеиновых кислот, и их функциональные эквиваленты, и векторы, которые кодируют антитело, или его функциональную часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению. Следовательно, дополнительно предложена молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, который(е) кодирует(ют) антитело АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14-015 или
АТ14-016, или функциональную часть или функциональный эквивалент указанного антитела. В некоторых вариантах реализации указанная молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или вектор(ы) кодон-оптимизированы для не относящейся к человеку рекомбинантной системы экспрессии.
Дополнительно предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению. В данном изобретении вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению также называют вектором согласно настоящему изобретению. В объем данных терминов входит один или более вектор(ов) согласно настоящему изобретению, содержащие одну или более молекул(у) нуклеиновой(ых) кислоты (кислот), или их функциональный(е) эквивалент(ы), согласно настоящему изобретению. В данном изобретении упоминание единственного числа включает термин один или более.
Способы конструирования векторов, содержащих одну или более молекул(у) нуклеиновых(ой) кислот(ы), или их функциональный(е) эквивалент(ы), согласно настоящему изобретению хорошо известны в данной области. Лишь некоторые из примеров векторов, подходящих для получения вектора согласно настоящему изобретению, представляют собой ретровирусные и лентивирусные векторы. Такие векторы подходят для различных применений. Например, один или более векторов согласно настоящему изобретению, содержащих терапевтически полезную последовательность нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, подходят(ит) для профилактического или терапевтического применения, направленного против ОМЛ. Введение такого(их) вектора(ов) индивиду, предпочтительно нуждающемуся в этом человеку, приводит к экспрессии указанной профилактической или терапевтической последовательности нуклеиновой кислоты in vivo, приводящей к по меньшей мере частичному лечению или профилактике ОМЛ. Указанный(е) вектор(ы) также можно использовать для применений, включающих экспрессию in vitro интересующей молекулы нуклеиновой кислоты, например, для (коммерческого) производства антитела, или его функциональных эквивалентов, согласно настоящему изобретению. Также, следовательно, предложена выделенная или рекомбинантная клетка или не относящееся к человеку животное, содержащее по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или по меньшей мере один вектор согласно настоящему изобретению.
Молекула нуклеиновой кислоты или вектор согласно настоящему изобретению особенно полезны для получения антител, или их функциональных частей или функциональных эквивалентов, согласно настоящему изобретению, которые специфичны к ОМЛ. Такое получение, например, осуществляют путем введения такой молекулы нуклеиновой кислоты или вектора(ов) в клетку таким образом, что аппарат трансляции нуклеиновых кислот в указанной клетке будет продуцировать кодируемые ими антитела, или их функциональные части или функциональные эквиваленты. В одном варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты или вектор, кодирующий тяжелую и/или легкую цепь согласно настоящему изобретению, экспрессируется в так называемых клетках-продуцентах, таких как, например, клетки E.coli, CHO, NSO или 293(Т), некоторые из которых пригодны для коммерческого производства антител. Следует отметить, что подходит любая система продукции рекомбинантных антител; эти упомянутые четыре системы клеток-продуцентов представляют собой лишь немногие из примеров многих систем, кото
- 34 043009 рые доступны на сегодняшний день. Ранее в данном изобретении было описано, что в таких случаях предпочтительно применение молекул нуклеиновых кислот, в которых исходные человеческие последовательности, приведенные в данном изобретении, были кодон-оптимизированы для данной клеткипродуцента. Пролиферация указанных клеток-продуцентов позволяет получить линию клетокпродуцентов, способных продуцировать связывающие соединения согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, указанная линия клеток-продуцентов подходит для получения антитела для применения у людей. Следовательно, указанная линия клеток-продуцентов предпочтительно свободна от патогенных агентов, таких как патогенные микроорганизмы. В наиболее предпочтительном случае получают антитела, состоящие из человеческих последовательностей, применяя по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты или по меньшей мере один вектор согласно настоящему изобретению.
Следовательно, также предложена клетка, продуцирующая выделенное или рекомбинантное антитело, способная продуцировать связывающее соединение согласно настоящему изобретению. Такая клетка обычно содержит по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты или по меньшей мере один вектор согласно настоящему изобретению, который предпочтительно включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодон-оптимизирована для указанной клетки. Продуцирующая антитело клетка в данном изобретении означает клетку, которая способна продуцировать и/или секретировать антитела, или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител, и/или которая способна развиться в клетку, которая будет способна продуцировать и/или секретировать антитела, или функциональные части или функциональные эквиваленты указанных антител. Продуцирующая антитело клетка согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой клетку-продуцента, которая пригодна для коммерческого производства антител. Выше объяснено, что указанная клеткапродуцент предпочтительно подходит для продукции антител для применения у людей. Следовательно, также предложен способ получения антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, указанный способ включает предоставление клетки, предпочтительно продуцирующей антитело клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или вектор согласно настоящему изобретению, и обеспечение возможности трансляции указанной клеткой указанной молекулы нуклеиновой кислоты, или ее функционального эквивалента, или вектора, посредством чего получают указанное антитело, или его функциональную часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению. Способ согласно настоящему изобретению предпочтительно дополнительно включает этап сбора, очистки и/или выделения указанного антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению. Полученные связывающие соединения согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют для терапии человека, возможно после дополнительных этапов очистки, выделения или процессинга.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, которое связано с другим соединением. В одном варианте реализации связывающее соединение согласно настоящему изобретению связано с другой терапевтической молекулой, такой как химиотерапевтическое средство или другое токсичное соединение или радиоактивное соединение, с образованием так называемого конъюгата антитела с лекарственным средством. В другом варианте реализации молекула, которая связана со связывающим соединением согласно настоящему изобретению, представляет собой иммуномодулирующую молекулу, такую как, например, CD3-специфическое антитело. Такое CD3-специфическое антитело способно связывать Т-клетки и, если оно связано со связывающим соединением согласно настоящему изобретению, оно будет нацеливать Т-клетки на клетки ОМЛ, тем самым усиливая противолейкемический Тклеточный ответ. Это оказывает еще более сильное направленное против ОМЛ действие. В одном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, следовательно, предложено биспецифическое или мультиспецифическое связывающее соединение, содержащее ОМЛ-специфическое связывающее соединение согласно настоящему изобретению и иммуномодулирующую молекулу, предпочтительно CD3-специфическое связывающее соединение. В другом предпочтительном варианте реализации предложено направленное против ОМЛ соединение, указанное соединение содержит связывающее соединение согласно настоящему изобретению, которое специфично к клеткам ОМЛ, и токсичную молекулу. В некоторых других вариантах реализации связывающее соединение согласно настоящему изобретению связано с меткой. Это позволяет детектировать миелопролиферативные клетки, такие как клетки ОМЛ, применяя такое меченое связывающее соединение. В других вариантах реализации предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, которое связано с другим связывающим ОМЛ соединением. В некоторых вариантах реализации такое другое связывающее ОМЛ соединение также представляет собой связывающее соединение согласно настоящему изобретению. Следовательно, предложено соединение, содержащее два связывающих соединения согласно настоящему изобретению, которые связаны друг с другом. Тем не менее, это не обязательно, поскольку связывающее соединение согласно настоящему изобретению также может быть связано с другими связывающими ОМЛ соединениями, такими как известные на сегодняшний день антитела, которые связываются с клетками ОМЛ. Биспецифические соединения согласно настоящему изобретению позволяют, например, добиться боль
- 35 043009 шего связывания с клетками ОМЛ, особенно если два соединенных связывающих соединения специфичны к различным эпитопам на клетках ОМЛ. Такое биспецифическое соединение, таким образом, особенно подходит для применения для терапии или диагностики. Также можно использовать биспецифические соединения согласно настоящему изобретению в анализах, в которых различные клетки ОМЛ связываются с одним и тем же биспецифическим связывающим соединением.
В одном варианте реализации предложено синтетическое или рекомбинантное антитело, или функциональная часть или функциональный эквивалент указанного антитела, которое содержит один фрагмент Fab антитела согласно настоящему изобретению и один фрагмент Fab другого антитела согласно настоящему изобретению. Полученное в результате этого связывающее соединение специфично к клеткам ОМЛ, но каждое плечо Fab, как правило, будет связываться с собственным эпитопом. В некоторых вариантах реализации эпитопы, которые узнаются фрагментами Fab, отличны друг от друга. В другом варианте реализации указанные эпитопы одинаковы. Плечи Fab могут связываться с указанными эпитопами с различной аффинностью. В качестве альтернативы, плечи Fab связываются со своими эпитопами по существу с одинаковой аффинностью, что означает, что KD для указанных плечей Fab отличаются друг от друга не более чем на 30%, предпочтительно не более чем на 20% или не более чем на 10%.
Указанная другая молекула, например, химиотерапевтический агент или CD3-специфическое антитело, предпочтительно связана со связывающим соединением согласно настоящему изобретению посредством линкера, такого как, например, кислотолабильный гидразоновый линкер, или посредством пептидного линкера, такого как цитруллин-валин, или посредством тиоэфирной связи, или путем катализируемого сортазой трансамидирования, которое подробно описано в WO 2010/087994.
Катализируемое сортазой трансамидирование включает конструирование сайта узнавания сортазой (LPETGG) на тяжелой цепи антитела, предпочтительно на С-концевой части тяжелой цепи, и на молекуле, которую нужно связать с указанным антителом. Указанное антитело и указанная молекула, как правило, дополнительно содержат последовательность GGGGS и метку для проведения очистки, такую как гистидиновая метка. Впоследствии осуществляют опосредованное сортазой трансамидирование, а затем соединение путем клик-химии. При катализируемом сортазой трансамидировании соединение путем клик-химии обычно включает соединение химическим путем, например, содержащего алкин реагента и, например, содержащего азид реагента, которые добавляются сортазой благодаря добавлению молекул глицина к мотиву распознавания сортазой на тяжелой цепи антитела и к мотиву распознавания сортазой на молекуле (такой как белок, пептид или антитело), которую нужно связать с антителом. В одном варианте реализации настоящего изобретения, следовательно, предложено антитело согласно настоящему изобретению, в котором сайт узнавания сортазой (LPETGG) сконструирован на тяжелой цепи антитела, предпочтительно на С-концевой части тяжелой цепи, указанное антитело предпочтительно дополнительно содержит последовательность GGGGS и метку для очистки, такую как гистидиновая метка.
В другом варианте реализации связывающее соединение согласно настоящему изобретению связано с другой молекулой посредством тиоэфирной связи. В данном случае, в связывающее соединение согласно настоящему изобретению предпочтительно добавлен один или более цистеинов. Цистеины содержат тиольную группу, и, следовательно, включение одного или более цистеинов в связывающее соединение согласно настоящему изобретению, или замена одной или более аминокислот на один или более цистеинов в связывающем соединении согласно настоящему изобретению позволяет соединить указанное связывающее соединение с другой молекулой. Указанный один или более цистеинов предпочтительно внедряют в такое положение в связывающем соединении согласно настоящему изобретению, в котором они значительно не влияют на укладку указанного связывающего соединения и значительно не изменяют антигенсвязывающую или эффекторную функцию. В настоящем изобретении, следовательно, также предложено связывающее соединение согласно настоящему изобретению, в котором по меньшей мере одна аминокислота, отличная от цистеина, была заменена на цистеин.
В одном варианте реализации ОМЛ-специфическое связывающее соединение согласно настоящему изобретению связано с по меньшей мере одним другим ОМЛ-специфическим связывающим соединением согласно настоящему изобретению. Такое биспецифическое или мультиспецифическое связывающее соединение оказывает сильное направленное против ОМЛ действие.
Связывающие соединения согласно настоящему изобретению подходят для применения против миелопролиферативных расстройств, таких как ОМЛ, или острых лейкемий, которые развились из миелодиспластического синдрома, хронической миелоидной лейкемии, миелофиброза или других незлокачественных миелопролиферативных синдромов. Так как некоторые из указанных антител также связываются с немиелоидными лимфопролиферативными злокачественными новообразованиями, такими как множественная миелома и В-неходжкинская лимфома (В-НХЛ), они также подходят для применения для лечения данных расстройств. Связывающие соединения согласно настоящему изобретению, следовательно, особенно подходят для применения в качестве лекарства или агента для профилактики. Предпочтительно применяют связывающие соединения согласно настоящему изобретению, которые состоят из человеческих последовательностей, чтобы уменьшить вероятность нежелательных побочных действий при лечении людей. Такие человеческие последовательности можно выделить из человека или получить синтетическим или рекомбинантным способом на основе последовательности антител человека, возмож
- 36 043009 но, применяя кодон-оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют такие же аминокислоты, как и в исходной последовательности нуклеиновой кислоты человека. Следовательно, предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства и/или агента для профилактики. Указанное антитело предпочтительно включает антитело, выбранное из группы, состоящей из АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14-015 и АТ14-016. Также предложена молекула нуклеиновой кислоты, или функциональный эквивалент указанной молекулы, согласно настоящему изобретению или вектор согласно настоящему изобретению, содержащий такую нуклеиновую кислоту или ее функциональный эквивалент, или клетка согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства и/или агента для профилактики. Когда вводят одну или более молекул(у) нуклеиновых(ой) кислот(ы), или их (ее) функциональные(й) эквивалент(ы), (вектор, содержащий их (ее)) согласно настоящему изобретению, указанная(ые) молекула(ы) нуклеиновой(ых) кислоты (кислот), или ее (их) функциональный(е) эквивалент(ы), будет(ут) транслироваться in situ аппаратом хозяина в связывающее соединение согласно настоящему изобретению. Полученные связывающие соединения согласно настоящему изобретению способны предупреждать и/или противодействовать миелопролиферативным расстройствам, таким как ОМЛ, и лимфопролиферативным расстройствам, таким как, например, лимфома, В-НХЛ и множественная миелома. Следовательно, дополнительно предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или вектор или клетка согласно настоящему изобретению для применения в способе по меньшей мере частичного лечения или предупреждения миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства. Ранее в данном изобретении было описано, что такое расстройство можно лечить или предупреждать, применяя цитотоксические связывающие соединения согласно настоящему изобретению. В разделе Примеры продемонстрировали, что по меньшей мере антитела AT13-033, AT13-035, AT13-036, AT13-037, AT12-023, AT12-025 и AT13-031 обладают цитотоксической активностью. Следовательно, дополнительно предложено антитело, выбранное из группы, состоящей из антител AT13-033, AT13-035, AT13-036, AT13-037, AT12-023, AT12-025 и AT13-031, и функциональных частей и функциональных эквивалентов указанных антител, или молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, кодирующих их, для применения в способе по меньшей мере частичного лечения или предупреждения миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства.
Предпочтительно, указанное расстройство представляет собой ОМЛ.
В некоторых вариантах реализации связывающее соединение согласно настоящему изобретению соединяют с терапевтической молекулой, такой как химиотерапевтическое средство, или другое токсичное соединение, или радиоактивное соединение, или иммуномодулирующая молекула, такая как например, CD3-специфическое антитело, с получением так называемого конъюгата антитела с лекарственным средством или Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR Т-клетки), соответственно, которая способна противодействовать миелопролиферативному или лимфопролиферативному расстройству.
В некоторых вариантах реализации указанное лимфопролиферативное расстройство лечат с помощью одного или более антител, выбранных из группы, состоящей из антител АТ12-019, АТ12-023, АТ12025, АТ13-024 и АТ13-031, и функциональных частей и функциональных эквивалентов указанных антител. Следовательно, дополнительно предложено антитело, выбранное из группы, состоящей из антител АТ12-019, АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024 и АТ13-031, и функциональных частей и функциональных эквивалентов указанных антител, или молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, или один или более векторов, кодирующих их, для применения в способе по меньшей мере частичного лечения или предупреждения лимфопролиферативного расстройства. Предпочтительно, указанное лимфопролиферативное расстройство представляет собой лимфому, В-НХЛ или множественную миелому.
Связывающее соединение согласно настоящему изобретению, или молекулу нуклеиновой кислоты, или функциональный эквивалент указанной молекулы, согласно настоящему изобретению, или по меньшей мере один вектор, или клетку согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют для по меньшей мере частичного лечения и/или предупреждения ОМЛ. В данном изобретении термин по меньшей мере частичное лечение и/или предупреждение ОМЛ включает противодействие росту опухоли ОМЛ и/или облегчение симптомов, возникших в результате присутствия клеток ОМЛ у пациента. Также, следовательно, предложено применение антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, или молекулы нуклеиновой кислоты, или ее функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, или по меньшей мере одного вектора или клетки согласно настоящему изобретению, для получения лекарственного средства и/или агента для профилактики для по меньшей мере частичного лечения и/или предупреждения ОМЛ. Дополнительно предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, со
- 37 043009 гласно настоящему изобретению, или по меньшей мере один вектор или клетка согласно настоящему изобретению, для применения в способе по меньшей мере частичного лечения и/или предупреждения ОМЛ.
Предпочтительные антитела для применения в любом из перечисленных способов представляют собой антитела АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14-015 и АТ14-016.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена композиция, содержащая антитело, или его функциональную часть или функциональный эквивалент согласно настоящему изобретению. Также предложена композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, а также композиция, содержащая вектор или клетку согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере два антитела, их функциональных части или функциональных эквивалента согласно настоящему изобретению.
Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно включает фармацевтическую композицию. Указанная фармацевтическая композиция предпочтительно также содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или вспомогательное вещество. Лишь некоторые из примеров подходящих носителей, например, включают гемоцианин лимфы улитки (ГЛУ), сывороточный альбумин (например, бычий сывороточный альбумин (БСА) или кроличий сывороточный альбумин (КСА)) и овальбумин. В одном предпочтительном варианте реализации указанный подходящий носитель включает раствор, такой как, например, солевой раствор. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно подходит для применения у человека.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ по меньшей мере частичного лечения и/или предупреждения миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, включающий введение нуждающемуся в этом индивиду терапевтически эффективного количества антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, или ее функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, и/или вектора или клетки согласно настоящему изобретению, и/или композиции согласно настоящему изобретению. В данном изобретении индивид или субъект представляет собой человека или животного, предпочтительно пациента-человека с ОМЛ. Указанная композиция предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению.
Связывающее соединение и/или композиция согласно настоящему изобретению особенно подходит для введения индивидам с нарушенным иммунитетом с повышенным риском осложнений, таким как индивиды, которых подвергли химиотерапии, особенно младенцы и пожилые люди. Связывающее соединение, или молекулу нуклеиновой кислоты, или функциональный эквивалент указанной молекулы, или вектор, и/или фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению предпочтительно вводят путем одной или более инъекций. Типичные дозы вводимого связывающего соединения согласно настоящему изобретению находятся в диапазоне от 0,1 до 10 мг на кг массы тела.
Связывающее соединение согласно настоящему изобретению также особенно подходит для применения в диагностике. Например, если подозревают, что индивид, предпочтительно человек, страдает от миелопролиферативного расстройства, такого как ОМЛ, или лимфопролиферативного расстройства, такого как В-НХЛ или множественная миелома, то можно проверить присутствие миелопролиферативных клеток или лимфопролиферативных клеток в образце из указанного индивида, таком как образец крови или ткани, применяя связывающее соединение согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, указанный образец смешивают со связывающим соединением согласно настоящему изобретению, которое будет специфично связываться с миелопролиферативными клетками. Миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки, связанные со связывающим соединением согласно настоящему изобретению, можно выделить из образца и/или обнаружить, применяя любой способ, известный в данной области, например, но не ограничиваясь перечисленными способами: выделение с применением магнитных гранул, покрытых стрептавидином гранул, или выделение путем применения вторичных антител, иммобилизованных на колонке. В качестве альтернативы или дополнения, связывающее соединение согласно настоящему изобретению помечено, чтобы позволить детектирование указанного антитела, например, но не ограничиваясь перечисленными способами мечения, пометить флуоресцентной меткой, пометить ферментативной меткой или пометить радиоактивной меткой. В качестве альтернативы, связывающее соединение согласно настоящему изобретению детектируют, применяя меченое вторичное антитело, которое направлено против указанного связывающего соединения. Если связывание указанного антитела обнаружено, то это свидетельствует о присутствии миелопролиферативных или лимфопролиферативных клеток. В настоящем изобретении, следовательно, предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или молекула нуклеиновой кислоты, или ее функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или вектор или клетка согласно настоящему изобретению, для применения для обнаружения миелопролиферативных клеток или лимфопролиферативных клеток. Также предложено антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или молекула нуклеиновой
- 38 043009 кислоты, или ее функциональный эквивалент, согласно настоящему изобретению, или вектор или клетка согласно настоящему изобретению для применения для диагностики миелопролиферативного расстройства или лимфопролиферативного расстройства. Указанное миелопролиферативное расстройство предпочтительно представляет собой ОМЛ. В некоторых вариантах реализации указанное лимфопролиферативное расстройство представляет собой лимфому, В-НХЛ или множественную миелому. Лимфопролиферативные клетки предпочтительно обнаруживают с помощью одного или более антител, выбранных из группы, состоящей из АТ12-019, АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024 и АТ13-031, и функциональных частей и функциональных эквивалентов указанных антител.
Также предложено применение антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, или применение молекулы нуклеиновой кислоты, или ее функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению, или применение вектора или клетки согласно настоящему изобретению для определения того, содержит ли образец миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки, а также способ обнаружения миелопролиферативных клеток или лимфопролиферативных клеток путем применения антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, согласно настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ определения того, присутствуют ли миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки в образце, включающий:
приведение указанного образца в контакт с антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, согласно настоящему изобретению, и обеспечение возможности связывания указанного антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, с миелопролиферативными клетками или лимфопролиферативными клетками, если они присутствуют, и определение того, связаны или нет миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки с указанным антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, тем самым позволяя определить, присутствуют или нет миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки в указанном образце.
В предпочтительном варианте реализации указанные миелопролиферативные клетки представляют собой клетки ОМЛ. В другом предпочтительном варианте реализации указанные лимфопролиферативные клетки представляют собой клетки лимфомы, В-НХЛ или множественной миеломы. Лимфопролиферативные клетки предпочтительно обнаруживают с помощью одного или более антител, выбранных из группы, состоящей из AT12-019, АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024 и АТ13-031, и функциональных частей и функциональных эквивалентов указанных антител.
В дополнительном варианте реализации определяют, страдает ли индивид от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства. Также, следовательно, предложен способ определения того, страдает ли индивид от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, включающий:
приведение образца из указанного индивида в контакт с антителом или его функциональной частью или функциональным эквивалентом согласно настоящему изобретению, и обеспечение возможности связывания указанного антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, с миелопролиферативными клетками или лимфопролиферативными клетками, если они присутствуют, и определение того, связаны или нет миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки с указанным антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, тем самым позволяя определить, страдает или нет указанный индивид от миелопролиферативного расстройства или лимфопролиферативного расстройства. Предпочтительно указанный индивид представляет собой человека. В некоторых вариантах реализации указанное миелопролиферативное расстройство представляет собой ОМЛ. В других вариантах реализации указанное лимфопролиферативное расстройство представляет собой лимфому, В-НХЛ или множественную миелому.
Ранее в данном изобретении было описано, что в настоящем изобретении предложен неожиданный вывод, что snRNP200 присутствует на поверхности клеток ОМЛ, тогда как snRNP200 обычно располагается только в ядре. Следовательно, snRNP200 представляет собой важную мишень для направленной против ОМЛ терапии. Более того, антитела АТ12-023 и АТ13-031, которые специфичны к snRNP200, также связывают клетки В-НХЛ и клетки множественной миеломы. Это свидетельствует о том, что экспрессия snRNP200 также происходит на поверхности клеток В-НХЛ и клеток множественной миеломы. Теперь, когда был сделан данный вывод, стали возможными многие применения. Например, специфичные к snRNP200 связывающие соединения теперь можно применять для лечения или предотвращения миелопролиферативных или лимфопролиферативных расстройств. Следовательно, дополнительно предложено применение snRNP200-специфического связывающего соединения для получения лекарственного средства для лечения или профилактики миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, такого как ОМЛ, В-НХЛ или множественная миелома. Также предложено snRNP200специфическое связывающее соединение для применения в способе по меньшей мере частичного лечения или предупреждения миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, а также в
- 39 043009 способе по меньшей мере частичного лечения и/или предупреждения миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, включающем введение нуждающемуся в этом индивиду терапевтически эффективного количества snRNP200-специфического связывающего соединения.
Также стали доступны новые способы детектирования. Поскольку snRNP200 обычно присутствует только в ядре, но, похоже, также присутствует на поверхности миелопролиферативных и лимфопролиферативных клеток, данные клетки теперь можно обнаружить и отличить от здоровых клеток путем определения того, присутствует ли snRNP200 на их поверхности. Следовательно, дополнительно предложен способ определения того, является ли миелоидная клетка или лимфоидная клетка миелопролиферативной клеткой или лимфопролиферативной клеткой, указанный способ включает определение того, присутствует ли snRNP200 на поверхности указанной клетки, при этом присутствие snRNP200 на поверхности указанной клетки свидетельствует о том, что указанная клетка является миелопролиферативной или лимфопролиферативной. Также предложен способ идентификации миелопролиферативных или лимфопролиферативных клеток, включающий обнаружение присутствия snRNP200 на поверхности указанных клеток. В данном изобретении формулировка экспрессия присутствует около поверхности клетки или экспрессия присутствует на поверхности клетки означает, что по меньшей мере часть snRNP200 присутствует на поверхности или внутри поверхности клетки или связана с ней.
В некоторых вариантах реализации подвергают типированию образец, содержащий клетки из индивида. В некоторых вариантах реализации в таком образце, который обычно содержит лимфоидные клетки и/или миелоидные клетки, исследуют присутствие snRNP200 на поверхности данных клеток. Если похоже, что snRNP200 присутствует на поверхности клеток, то указанный образец относят к типу образцов, содержащих миелопролиферативные или лимфопролиферативные клетки. Следовательно, дополнительно предложен способ типирования образца, содержащего миелоидные клетки, или образца, содержащего лимфоидные клетки, из индивида, указанный способ включает определение того, присутствует ли snRNP200 на поверхности клеток из указанного образца. А если это так, то, это свидетельствует о том, что миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки присутствуют в указанном образце.
В некоторых вариантах реализации указанный индивид страдает, или подозревают, что он страдает, от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства. Тем не менее, это не обязательно, поскольку такой способ типирования также может быть частью общего скринингового анализа, например, для проверки состояния здоровья.
Указанный образец может представлять собой любой образец, который содержит миелоидные и/или лимфоидные клетки, например, такой как образец костного мозга, образец ткани или образец лимфатической жидкости. Предпочтительно, указанный образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови, поскольку образец крови легко получить с незначительным дискомфортом для индивида.
В настоящем изобретении предложен вывод, состоящий в том, что по меньшей мере подгруппа пациентов, которые страдают от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, продуцирует антитела, которые специфичны к snRNP200. Присутствие таких антител в образце из индивида, следовательно, свидетельствует о наличии миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства. Следовательно, дополнительно предложен способ определения того, страдает ли индивид от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, включающий определение того, содержит ли образец из указанного индивида антитела, которые специфичны к snRNP200. В некоторых вариантах реализации такой способ включает следующие этапы:
приведение образца из указанного индивида в контакт с snRNP200 или его эпитопом;
обеспечение возможности связывания указанного snRNP200 или его эпитопа с snRNP200специфическими антителами из указанного образца, если они присутствуют; и определение того, связан или нет указанный snRNP200 или его эпитоп с snRNP200специфическими антителами, при этом связывание указанного snRNP200 или его эпитопа с snRNP200специфическими антителами свидетельствует о том, что указанный индивид страдает от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства.
Скрининговые анализы, упомянутые в данном изобретении, можно осуществить, применяя такие способы, как, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологические анализы (RIA), анализы вестерн-блот и анализы путем иммуногистохимического окрашивания. Данные анализы хорошо известны в данной области и, следовательно, не требуют дополнительного объяснения. Вариации или модификации ELISA, RIA, анализа вестерн-блот и анализа путем иммуногистохимического окрашивания также известны в данной области.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ определения того, повышен ли шанс пациента, страдающего от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, на положительный исход лечения антителом, его функциональной частью или функциональным эквивалентом, согласно настоящему изобретению, по сравнению со средним шансом в популяции пациентов, страдающих от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, указанный способ включает определение того, присутствует ли snRNP200 на поверхности миелопролиферативных клеток или лим
- 40 043009 фопролиферативных клеток из указанного пациента. Если это так, то snRNP200-специфические антитела, такие как AT12-023, AT13-031 и AT13-037, особенно подходят для противодействия такому миелопролиферативному или лимфопролиферативному расстройству. Следовательно, если известно, что миелопролиферативные или лимфопролиферативные клетки из индивида экспрессируют snRNP200 на своей поверхности, то шанс на успешное лечение повышен. Такой способ согласно настоящему изобретению предпочтительно включает следующие этапы:
приведение образца, содержащего миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки, из указанного индивида в контакт с антителом или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, которое специфично к snRNP200;
обеспечение возможности связывания указанного антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, с миелопролиферативными клетками или лимфопролиферативными клетками из указанного образца; и определение того, связано или нет указанное snRNP200-специфическое антитело, или его функциональная часть или функциональный эквивалент, с миелопролиферативными клетками или лимфопролиферативными клетками из указанного образца, при этом связывание указанного snRNP200специфического антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, с миелопролиферативными клетками или лимфопролиферативными клетками из указанного образца свидетельствует о том, что у указанного пациента повышен шанс на положительный исход лечения антителом, его функциональной частью или функциональным эквивалентом, согласно настоящему изобретению, по сравнению со средним шансом в популяции пациентов, страдающих от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства.
Указанное лечение предпочтительно включает применение антитела AT12-023, AT13-031 или AT13-037, или функциональных частей или функциональных эквивалентов указанных антител, поскольку по меньшей мере данные антитела способны связывать snRNP200. Следовательно, дополнительно предложено антитело согласно настоящему изобретению, или антитело для применения согласно настоящему изобретению, или применение или способ согласно настоящему изобретению, где указанное антитело представляет собой АТ12-023, АТ13-031, AT13-037, или функциональную часть или функциональный эквивалент указанных антител.
Если предполагается применение антитела AT12-023, AT13-031 и/или AT13-037, то предпочтительно заблаговременно определить, содержатся ли у данного пациента злокачественные клетки, которые экспрессируют snRNP200 на своей поверхности. В некоторых вариантах реализации, следовательно, предложен способ определения того, является ли пациент, страдающий от миелопролиферативного расстройства или лимфопролиферативного расстройства, кандидатом для лечения антителом AT12-023, AT13-031 или AT13-037, или функциональной частью или функциональным эквивалентом указанного антитела, указанный способ включает определение того, присутствует ли snRNP200 на поверхности миелопролиферативных клеток или лимфопролиферативных клеток из указанного пациента.
В некотором способе согласно настоящему изобретению указанное миелопролиферативное расстройство предпочтительно представляет собой ОМЛ, и указанные миелопролиферативные клетки предпочтительно представляют собой клетки ОМЛ. Более того, указанное лимфопролиферативное расстройство предпочтительно представляет собой лимфому, В-неходжкинскую лимфому или множественную миелому, и указанные лимфопролиферативные клетки предпочтительно представляют собой клетки лимфомы, В-неходжкинской лимфомы или множественной миеломы.
Приведенные выше процедуры для обнаружения миелопролиферативных или лимфопролиферативных клеток с применением связывающих соединений согласно настоящему изобретению, например, особенно подходят для определения того, проявляет ли ответ ТПЛ пациент, страдающий от миелопролиферативного расстройства или лимфопролиферативного расстройства, который получил терапевтическое лечение, такой как, например, пациент с ОМЛ, которого лечили от ОМЛ, например, пациент с ОМЛ, который получил иммунотерапию, такую как трансплантация стволовых клеток или инфузия донорских лимфоцитов. До сегодняшнего дня не существовало средств диагностики для тестирования наличия эффективного ответа ТПЛ у подвергнутого лечению пациента. Такое средство диагностики остро необходимо, например, так как:
1) оно позволит раннюю идентификацию реципиентов аллогенной ТСК с высокой степенью риска рецидива, в момент времени до возникновения рецидива, что позволит раньше принять меры, такие как постепенное снижение количества иммуносупрессоров или инфузии донорских лимфоцитов;
2) оно позволит титровать такие инфузии донорских лимфоцитов до тех пор, пока не появятся противолейкемические антитела; и
3) оно даст надежду реципиентам аллогенной ТСК в то время как они часто страдают от одного из многих связанных с ТСК осложнений, когда можно продемонстрировать наличие эффективного ответа ТПЛ.
В настоящее время пациенты должны ждать и наблюдать, происходит рецидив или нет, и не существует способов прогнозирования рецидива заболевания. Доступность теста для определения того, проявляет ли пациент ответ ТПЛ, следовательно, сильно улучшит клиническое ведение пациентов, которым
- 41 043009 провели ТСК, окажет влияние на прогноз и качество их жизни. Следовательно, дополнительно предложено применение связывающего соединения согласно настоящему изобретению для определения того, свидетельствует ли образец о наличии ответа ТПЛ. Также предложено применение связывающего соединения согласно настоящему изобретению для определения того, проявляет или нет пациент с ОМЛ ответ ТПЛ, и применение связывающего соединения согласно настоящему изобретению для определения того, эффективно ли лечение, направленное против миелопролиферативного или лимфопролиферативного заболевания, такое как, например, направленная против ОМЛ терапия, направленная против В-НХЛ терапия или направленная против множественной миеломы терапия. Это, например, осуществляют путем определения того, содержит ли образец (например, образец крови или ткани) из пациента (который, например, получил ТСК, или ИДЛ, или любую другую форму иммунотерапии) миелопролиферативные или лимфопролиферативные клетки, например, клетки ОМЛ, клетки В-НХЛ или клетки множественной миеломы. Отсутствие миелопролиферативных или лимфопролиферативных клеток свидетельствует о том, что указанный пациент проявляет ответ ТПЛ. Следовательно, дополнительно предложен способ определения того, проявляет ли пациент, страдающий от миелопролиферативного или лимфопролиферативного расстройства, который получил иммунотерапию, направленную против указанного расстройства, ответ ТПЛ, указанный способ включает приведение образца из указанного пациента в контакт с антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, согласно настоящему изобретению, и обеспечение возможности связывания указанного антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, с миелопролиферативными или лимфопролиферативными клетками, если они присутствуют, и определение того, связаны или нет миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки с указанным антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, с помощью чего определяют проявляет или нет указанный индивид ответ ТПЛ, при этом отсутствие миелопролиферативных или лимфопролиферативных клеток свидетельствует об ответе ТПЛ, а присутствие миелопролиферативных или лимфопролиферативных клеток свидетельствует об отсутствии ответа ТПЛ или о недостаточном (неэффективном) ответе ТПЛ. В некоторых вариантах реализации указанное лимфопролиферативное расстройство представляет собой лимфому, В-НХЛ или множественную миелому. В некоторых вариантах реализации указанное миелопролиферативное расстройство представляет собой ОМЛ. Следовательно, также предложен способ определения того, проявляет ли пациент с ОМЛ, который получил направленную против ОМЛ иммунотерапию, ответ ТПЛ, указанный способ включает приведение образца из указанного пациента с ОМЛ в контакт с антителом или его функциональной частью или функциональным эквивалентом согласно настоящему изобретению; обеспечение возможности связывания указанного антитела, или его функциональной части или функционального эквивалента, с клетками ОМЛ, если они присутствуют; и определение того, связаны или нет клетки ОМЛ с указанным антителом, или его функциональной частью или функциональным эквивалентом, что позволяет определить, проявляет или нет указанный индивид ответ ТПЛ, при этом отсутствие клеток ОМЛ свидетельствует об ответе ТПЛ, а наличие ответа ОМЛ свидетельствует об отсутствии ответа ТПЛ или о недостаточном (неэффективном) ответе ТПЛ. Предпочтительно указанный индивид представляет собой человека. В качестве альтернативы, связывающие соединения согласно настоящему изобретению, которые помечены детектируемой молекулой, такой как, например, соединение меди, вводят пациенту с ОМЛ, который получил направленную против ОМЛ иммунотерапию, такую как ТСК или ИДЛ, и впоследствии определяют, связано ли указанное меченое антитело с клетками ОМЛ из указанного пациента in vivo, например, применяя ПЭТ-сканирование. Отсутствие связанных связывающих соединений свидетельствует об ответе ТПЛ, а присутствие связанных связывающих соединений свидетельствует об отсутствии ответа ТПЛ или о недостаточном (неэффективном) ответе ТПЛ.
Также можно определить количество антитела, принадлежащего к семейству VH4-34, до и после проведения направленной против ОМЛ иммунотерапии. Если количество антитела, принадлежащего к семейству VH4-34, которое представляет собой семейство последовательностей VH, известных своей потенциальной способностью убивать клетки (Bhat и др., 1997), значительно увеличилось после иммунотерапии, то это свидетельствует о том, что присутствует ответ ТПЛ. Следовательно, дополнительно предложен способ определения того, проявляет ли пациент с ОМЛ, который получил направленную против ОМЛ иммунотерапию, ответ ТПЛ, указанный способ включает определение количества антитела, принадлежащего к семейству VH4-34, до и после проведения направленной против ОМЛ иммунотерапии, и определение того, произошло ли значительное увеличение количества антитела, принадлежащего к семейству VH4-34, после иммунотерапии. А если это так, то приходят к выводу, что у указанного пациента наблюдается ответ ТПЛ. Если это не так, то приходят к выводу, что ответ ТПЛ отсутствует или не достаточен.
Настоящее изобретение дополнительно объяснено в следующих примерах. Данные примеры не ограничивают объем настоящего изобретения, но предоставлены лишь для пояснения настоящего изобретения.
- 42 043009
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Последовательности антител АТ12-023, АТ12-025, АТ13-024, АТ12-019, АТ13-022, АТ13023, АТ13-031, АТ12-020, АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036, АТ13-037, АТ14-013, АТ14-014, АТ14-015 и АТ14-016.
Фиг. 2. 36-летняя пациентка с ОМЛ, у которой наблюдалась полная ремиссия после первого цикла индукционной химиотерапии, и которая получила миелоаблативную (МА) аллогенную трансплантацию стволовых клеток (ТСК) от HLA-совместимого родного брата в качестве консолидирующей терапии. Тем не менее, произошел рецидив ОМЛ через 5 месяцев после трансплантации. Повторная индукционная химиотерапия снова привела к полной ремиссии и к тяжелой (IV степени) реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) в печени и к I степени РТПХ в коже. Наблюдение, что у нее продолжалась полная ремиссия в течение более чем трех лет, теперь означает, что у нее развился эффективный ответ трансплантата против лейкемии. В-лимфоциты выделяли из продукта флеботомии, полученного приблизительно через 1,5 года после одного цикла повторной индукционной химиотерапии.
Фиг. 3.
а) Супернатант из одной из миникультур (20 или 40 клеток на лунку), связывающийся с линией клеток ОМЛ - ТНР-1.
b) В-клетки из данной миникультуры высевали в виде растворов, содержащих 1 клетку/лунку, и супернатанты снова подвергали скринингу для обнаружения связывания с ТНР-1.
ТНР-1 экспрессируют HLA-DR, который в данном скрининговом эксперименте использовали в качестве положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали моноклональное антитело, специфичное к вирусу гриппа.
Фиг. 4. Два примера идентифицированных ОМЛ-специфических антител. AT12-023 (а) и AT13-031 (b) связываются с линиями клеток ОМЛ ТНР-1 и MonoMac6, но не со здоровыми мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК), эндотелиальными клетками (эндотелиальными клетками пупочной вены человека: HUVEC), линией Т-клеток Jurkat, первичными фибробластами, гепатоцитами (линией клеток печеночно-клеточной карциномы: HepG2) или линией клеток аденокарциномы толстого кишечника НТ-29. MRSA-mAb F1 представляет собой полученное внутри лаборатории MAT IgG3 человека, которое использовали в качестве контрольного антитела.
Фиг. 5. Антитела, полученные из донора 59, связываются с линиями клеток ОМЛ - ТНР-1 и MonoMac6-и с первичными лейкемическими бластными клетками, выделенными из пациентов с впервые диагностированной ОМЛ (в диапазоне ФАБ-классификаций М0 - М4). См. также табл. 3 для более подробного обзора.
Фиг. 6. Некоторые из указанных антител также связываются с другими гематологическими злокачественными новообразованиями. Здесь показано связывание AT12-023 (антител, выделенных из супернатанта клона В-клетки) и АТ13-031 (рекомбинантного антитела) с клетками В-неходжкинской лимфомы (В-НХЛ), свежевыделенными из пациента с лимфомой. Указанные антитела не связывались с незлокачественными В-клетками (не показано в данном эксперименте). Антитело к вирусу саркомы Рауса (ВСР) паливизумаб -использовали в качестве отрицательного контроля, а ритуксимаб, антитело к CD20, специфично связывающее В-клеточную лимфому, - в качестве положительного контроля. Более подробное описание антитела, связывающегося с другими гематологическими злокачественными новообразованиями, см. в табл. 4.
Фиг. 7. Клетки ТНР-1 культивировали в среде отдельно или с добавлением антител при концентрации 5 мкг/мл в день 0. В присутствии AT12-023 выявили значительное ингибирование роста клеток ТНР1. Изображены суммарные количества клеток в культуре.
Фиг. 8. При добавлении антител АТ12-023 и АТ12-025 в культуру в день 0 сильно уменьшалась жизнеспособность клеток ТНР-1. Жизнеспособность изображена в виде доли клеток, дважды отрицательных по маркерам гибели клеток - аннексину V и 7AAD.
Фиг. 9. Для того чтобы определить количество клеток ТНР-1, специфическим образом уничтоженных антителом AT12-023, мы использовали анализ высвобождения ацетооксиметилового эфира кальцеина (кальцеина-АМ). Вкратце, перед тем, как клетки ТНР-1 инкубировали с AT12-023, указанные клетки ТНР-1 нагружали кальцеином-АМ, который высвобождался, когда клетки погибали и клеточная мембрана становилась нестабильной. Считывали количество лизированных клеток после 4 ч инкубации и определяли соотношение между ним и фоновой гибелью нагруженных кальцеином клеток, измеренной с помощью постороннего антитела.
Фиг. 10.
а) Помимо уничтожения клеток ТНР-1, АТ12-025 также вызывает гибель первичных опухолевых клеток, аналогично AT13-024. Лейкемические бластные клетки, выделенные из пациента с ОМЛ-М5 в момент постановки диагноза, инкубировали с AT12-025 или AT13-024 (5 мкг/мл) в течение 24 ч при 37°С, после чего клетки окрашивали 7AAD и аннексином V, чтобы определить количество мертвых клеток (положительных по двум маркерам: 7AAD и аннексину V).
b) Кроме того, в качестве маркера для определения умирающих клеток можно использовать лактатдегидрогеназу (ЛДГ).
- 43 043009
Лейкемические бластные клетки, выделенные из пациента с ОМЛ-М0, инкубировали с AT13-024 или с антителом к ВСР паливизумабом в течение 18 ч, после чего измеряли высвобождение ЛДГ. В данных двух экспериментах показали, что AT13-024, но не паливизумаб, вызывало гибель лейкемических бластных клеток, и что данное свойство не было ограничено одним типом ОМЛ, но также включало различные типы по ФАБ-классификации (от М0 до М5).
Фиг. 11. У донора 58 была диагностирована ОМЛ-М5, для лечения которой она получила три цикла химиотерапии. У нее сохранялась полная ремиссия в течение приблизительно года, после чего произошел рецидив ОМЛ. Она получила один цикл повторной индукционной химиотерапии, а затем аллогенную трансплантацию стволовых клеток в условиях пониженной интенсивности (ТСКПИ) от совместимого неродственного донора (СНД). У нее развилась I степень РТПХ в печени и на данный момент сохраняется полная ремиссия в течение почти 4 лет, подразумевая, что у нее развился эффективный ответ трансплантата против лейкемии. В-клетки выделяли из продукта флеботомии, полученного из данной пациентки приблизительно через 3 года после ТСК.
Фиг. 12. Антитела, полученные из донора 58, связываются с линиями клеток ОМЛ ТНР-1 и MonoMac6. Паливизумаб, доступное для приобретения специфичное к ВСР антитело, использовали в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 13. История болезни третьего пациента с эффективным ответом ТПЛ. У донора 101 была диагностирована ОМЛ промежуточного риска (отсутствовали цитогенетические или молекулярные отклонения от нормы; ОМЛ-М5 по ФАБ-классификации) в возрасте 49 лет. Он получил два курса химиотерапии и один курс консолидирующей химиотерапии, а затем аутологичную ТГСК, так как у него не было доступного HLA-совместимого родственного донора стволовых клеток. Через четырнадцать месяцев после первой диагностики произошел рецидив его заболевания. Полной ремиссии у него добились после одного цикла химиотерапии цитарабином в высокой дозе, после которой он получил аллогенную ТГСК в условиях пониженной интенсивности от совместимого неродственного донора (ТСКПИ-СНД). Через шесть недель у него развилась острая РТПХ в коже, печени и кишечнике (стадия 1; степень II), которая хорошо отвечала на терапию кортикостероидами. В-клетки выделяли из продукта флеботомии, полученного из данного пациента через 38 месяцев после аллогенной ТГСК. На сегодняшний день у него сохраняется длительная ремиссия.
Фиг. 14. Антитела, полученные из донора 101, связываются с линиями клеток ОМЛ - ТНР-1 и Molm13, но не с фибробластами, моноцитами, В-клетками и Т-клетками. Полученное внутри лаборатории антитело человека против CD30 использовали в качестве отрицательного контроля. AT14-013 проявило незначительную реакционную способность с фибробластами, по сравнению с его связыванием с линиями клеток ОМЛ. См. обзор связывающих способностей антител, полученных из донора 101, в табл. 7 и 8.
Фиг. 15. ОМЛ-специфическое антитело AT14-013 (донор 101) связывает первичные лейкемические бластные клетки, выделенные из пациентов с впервые диагностированной ОМЛ (М0 - М5 по ФАБклассификации). Отрицательный контроль: полученное внутри лаборатории антитело к CD30. Обзор способностей антител, полученных из донора 101, связывать первичные бластные клетки ОМЛ см. в табл. 7.
Фиг. 16. Антитело AT13-037 вызывает гибель первичных бластных клеток. Лейкемические бластные клетки, выделенные из пациента с ОМЛ при постановке диагноза (BL-038; ОМЛ-М5), инкубировали с антителами, очищенными из супернатантов исходного клона В-клетки (sAT13-037), или с рекомбинантным антителом (rAT13-037) при концентрации 5 мкг/мл в течение 4 ч при 37°С, после чего клетки окрашивали с помощью маркера гибели клеток Dapi. Для количественного определения гибели клеток добавляли стандартное количество гранул. Рекомбинантное антитело, специфичное к вирусу гриппа, rAT10-002 -использовали в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 17. Цитотоксические антитела индуцировали неапоптический путь гибели:
а) Визуализация методом фазового контраста клеток ТНР-1. Клетки ТНР-1 инкубировали с нецитотоксическим ОМЛ-специфическим антителом AT13-023 (слева) или с цитотоксическим ОМЛспецифическим антителом AT13-037 (справа). Взаимодействие визуализировали, применяя замедленную визуализацию, и продемонстрировали набухание целевых клеток, после чего клетки погибали. Кадры были получены через 4 ч инкубации, где голубые стрелки указывают на большие клетки, которые погибли.
b) Двойное окрашивание DiOC6 и йодидом пропидия (PI) показало, что цитотоксические антитела не вызывают апоптоз. Клетки ТНР-1 инкубировали с цитотоксическим ОМЛ-специфическим антителом AT12-023, с диклофенаком (который вызывает апоптоз в клетках ТНР-1) или только со средой. Клетки, перетерпевающие апоптоз, сначала утрачивают трансмембранный потенциал митохондрий (утрата окрашивания DiOC6), после чего они становятся проницаемыми (PI-положительными), что можно наблюдать после инкубации клеток ТНР-1 с диклофенаком. У клеток ТНР-1, которых инкубировали с AT12023, выявили повышенную проницаемость мембран (PI+), но у них сохранился трансмембранный потенциал митохондрий (DioC6+), что свидетельствует об индукции неапоптического пути гибели клеток.
с) Для того чтобы подтвердить неапоптическую природу вызванного пути гибели, мы исследовали
- 44 043009 участие каспаз в индукции гибели клеток. Гибель клеток ТНР-1 под воздействием ОМЛ-специфических антител не предотвращалась при добавлении неспецифических ингибиторов каспаз Q-VD-OPh (слева) или Z-VAD-fmk (справа).
Фиг. 18. Гибель клеток, вызванная ОМЛ-специфическими антителами, также происходила при 4°С, что предполагало вовлечение пассивного процесса. Это соблюдалось для всех антител, за исключением AT13-031, которое было цитотоксическим лишь при 37°С (не показано). Отрицательные контроли включали ОМЛ-специфические нецитотоксические антитела AT13-034, АТ12-019, АТ13-022, АТ13-023 и АТ13-024.
Фиг. 19.
а) Инкубация целевых клеток с цитохалазином D не ингибировала связывание с указанными антителами. Клетки ТНР-1 инкубировали с цитохалазином D, после чего добавляли ОМЛ-специфические антитела AT12-023, АТ13-031 и АТ13-037.
(b ) Предварительная инкубация целевых клеток со стабилизирующим мембраны агентом цитохалазином D не защищала клетки ТНР-1 от гибели под воздействием ОМЛ-специфических цитотоксических антител.
Фиг. 20. Проверка мишени AT12-023, AT13-031 и AT13-037:
а) Лизат мембран ТНР-1 инкубировали с AT12-023 и AT13-031, с антителом, специфичным к вирусу гриппа, AT10-002, или с маркером отдельно. Анализ вестерн-блот с антителом мыши к snRNP200 человека (и HMGB1 в качестве отрицательного контроля) выявил специфическое связывание АТ12-023 и АТ13-031 с snRNP200.
b) ОМЛ-специфическими антителами AT12-019, AT12-023, AT13-031 и AT13-037 или доступными для приобретения snRNP200-специфическими антителами snRNP200 453 и snRNP200 454 покрывали планшет ELISA, инкубировали с конструкцией snRNP200-FLAG для захвата и с антителом к FLAG, меченым HRP, для обнаружения. АТ12-023, АТ13-031 и АТ13-037 специфично связывали snRNP200, и при этом не связывали отрицательные контроли и, например, AT12-019.
Фиг. 21. Клетки ТНР-1 экспрессируют snRNP200 на мембране. Клетки ТНР-1 и клетки Jurkat окрашивали с помощью доступного для приобретения антитела человека к snRNP200 мыши. Внутриклеточное окрашивание клеток Jurkat и клеток ТНР-1 выявило окрашивание ядра, как и ожидали (слева). Тем не менее, окрашивание мембранного snRNP200 наблюдалось только в клетках ТНР-1 (справа).
Примеры
Пример 1.
Материалы и методы.
Материалы из пациентов и здоровых людей.
Протоколы исследований были одобрены Медицинской комиссией по вопросам этики Академического медицинского центра. Все участники подписали информированное согласие. Мы выбрали двух пациентов, которые получили аллогенную трансплантацию стволовых клеток (миелоаблативную трансплантацию от родственного донора для донора 59 и трансплантацию стволовых клеток от совместимого неродственного донора в условиях пониженной интенсивности для донора 58) для лечения ОМЛ, и у которых, на основании их историй болезни, можно было предположить развитие сильных ответов трансплантата против лейкемии. Каждый из двух указанных реципиентов ТСК пожертвовал по 500 мл периферической крови: продукты одной из многих флеботомий, которым их подвергли, чтобы избежать посттрансфузионной гиперферритинемии. Кроме того, пациенты, госпитализированные в нашу клинику с впервые диагностированной ОМЛ, согласились сдать по 2-5 мл костного мозга или крови, содержащих бластные клетки ОМЛ, для их применения в анализах связывания антител. Здоровый костный мозг пожертвовали пациенты, подвергнутые торакотомии для проведения операции на сердце в нашем институте. Клетки В-неходжкинской лимфомы получили как остаточный материал от биоптатов из пациентов с впервые диагностированной В-неходжкинской лимфомой. Данные клетки В-неходжкинской лимфомы использовали для анализа связывания наших антител, описанного ниже. Остаточный материал эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECS), свежевыделенных на Кафедре офтальмологии (АМС, Амстердам, Нидерланды), непосредственно использовали в анализах связывания, описанных ниже. Для обеспечения чистоты клетки также окрашивали антителами к CD14 человека и осуществляли селекцию CD14+ клеток.
Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови и костного мозга здоровых индивидов и пациентов с ОМЛ путем разделения в градиенте плотности фиколла. Дополнительные маркеры, такие как CD45, CD33, CD34, CD14, CD3 и CD19, использовали для выделения определенных популяций клеток (бластных клеток ОМЛ, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, соответственно, полученных из зарегистрированных доноров крови).
Выделение В-клеток.
Мы получили В-клетки из периферической крови путем разделения в градиенте плотности фиколла и магнитной сортировки (MACS) с помощью микрогранул с CD22 (Miltenyi Biotech). Впоследствии мы подвергли данные клетки сортировке по маркерам CD27- или CD27+ CD19+CD3’IgM’IgA (непримированные клетки или несущие IgG клетки памяти, соответственно) и CD19+CD3’CD27+IgG’IgA
- 45 043009 (несущие IgM клетки памяти) на устройстве для проведения сортировки клеток с возбуждением флуоресценции FACSAria (Becton Dickinson).
Культура клеток.
Мы поддерживали В-клетки (2x105 клеток/мл) в культуральной среде IMDM (Gibco), содержащей 8% эмбриональной бычей сыворотки (ЭБС) (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche), дополненной рекомбинантным IL-21 мыши (50 нг/мл, собственного производства), и подвергали совместному культивированию на у-облученных (50 грей) L-клетках (фибробластах) мыши, стабильно экспрессирующих CD40L (CD40L-L-клетки, 105 клеток/мл). Культуры исследовали обычным способом на наличие микоплазмы с помощью ПЦР (результаты не представлены).
Ретровирусная трансдукция.
Ретровирусную трансдукцию осуществляли, как описано в Kwakkenbos и др., Nat Med, 2010. Вкратце, непримированные В-клетки и несущие IgG и несущие IgM В-клетки памяти культивировали и активировали в течение 36 ч на CD40L-L-клетках в присутствии IL-21 мыши (mIL-21). Затем ретровирусные конструкции с BCL6 и Bcl-xL, которые содержали маркерный ген, кодирующий GFP, использовали для трансдукции В-клеток, как описано ранее (Diehl и др., J Immunol, 2008), с одним дополнением, состоящим в том, что мы центрифугировали клетки и вирус при комнатной температуре в течение 60 мин при 360xg (1800 об/мин). Эффективность трансдукции находилась в диапазоне 69-90%.
Культивирование целевых линий клеток.
Целевые линии клеток ОМЛ ТНР-1 (Американская коллекция типовых культур (АТСС); плотность от 2x105 клеток/мл до 1x106 клеток/мл) и Mono-Mac6 (любезно предоставленные Dr. Hamann с Кафедры экспериментальной иммунологии, плотность от 2x105 клеток/мл до 2x106 клеток/мл) поддерживали в культуральной среде RPMI 1640 (Gibco), содержащей 10% ЭБС (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche). Культуральную среду для Mono-Mac6 обогащали заменимыми аминокислотами (Invitrogen), 1 мМ пируватом натрия (Invitrogen) и 10 мкг/мл инсулина человека (Sigma). Линию клеток ОМЛ Molm13 поддерживали при плотности от 5x105 клеток/мл до 1,5x106 клеток/мл в культуральной среде RPMI 1640 (Gibco), содержащей 20% ЭБС (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche). Линии клеток печени HepG2 и Huh7 и линию клеток толстого кишечника НТ29 (любезно предоставленные из Tytgat Institute, АМС, Амстердам, Нидерланды) культивировали в культуральной среде DMEM (Gibco), содержащей 8% ЭБС (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche). Линию клеток Jurkat острой Т-клеточной лейкемии (АТСС) поддерживали в культуральной среде RPMI 1640 (Gibco), содержащей 10% ЭБС (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche), при плотности от 1x105 клеток/мл до 2x106 клеток/мл. Первичные фибробласты кожи (любезно предоставленные Лейденским университетом, Нидерланды) культивировали с пересеванием дважды в неделю в культуральной среде DMEM (Gibco), содержащей 10% ЭБС (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche). Клетки пересевали не более 10 раз. Линии клеток диффузной Вкрупноклеточной лимфомы (DLBCL) OCI-Ly1 и OCI-Ly7 (DSMZ и АТСС, соответственно) поддерживали в культуральной среде IMDM (Gibco), содержащей 8% ЭБС (HyClone) и пенициллин/стрептомицин (Roche). Указанные культуры поддерживали при плотности 0,5-2x106 клеток/мл.
Наконец, линии клеток множественной миеломы (MM) U266 и NCI-H929 поддерживали и культивировали, как описано для клеток ТНР-1.
Получение ОМЛ-специфических клонов.
Трансдуцированные непримированные В-клетки и несущие IgG и несущие IgM В-клетки памяти из каждого пациента высевали при концентрации 20 или 40 клеток на лунку (далее их называют микрокультурами) и растили с добавлением IL-21 и CD40L. Супернатанты выращенных микрокультур В-клеток затем подвергали скринингу на связывание антител с линиями клеток лейкемии (ТНР-1, MonoMac6 и линиями клеток, представленными в табл. 4), с линиями клеток печени и толстого кишечника, и некоторые супернатанты также подвергали скринингу на наличие антител, связывающихся с первичными бластными клетками, выделенными из пациентов с ОМЛ М0, M1, М4 и М5, посредством FACS, применяя IgG человека, меченые РЕ (Southern Biotech), или IgG H+L человека, меченые AF647 (Life Technologies), в качестве вторичного антитела. Некоторые антитела собственного производства использовали для отрицательного контроля антител, такие как антитело к CD30 (экспрессируется на активированных В- и Тлимфоцитах), антитело к CD33 (экспрессируется на моноцитах, миелоидных клетках-предшественниках и клетках миелоидной лейкемии), D25 (против ВСР; описано в WO 2008/147196), AT10-002, AT10-004 (против вируса гриппа; описаны в WO 2013/081463) и F1 (против MRSA; описано в WO 2011/008092). Кроме того, использовали некоторые доступные для приобретения антитела, такие как ритуксимаб (против CD20), паливизумаб (против ВСР), панитумумаб (против EGFR) и HLA-DR. Выбирали микрокультуры, которые связывались с линиями клеток ОМЛ, но не с линиями клеток печени и толстого кишечника, и высевали их при концентрации 1 клетка/лунку, и их супернатанты снова исследовали на специфичность к линиям клеток ОМЛ. Клоны с супернатантами, специфично связывающими линии клеток ОМЛ, но не линии клеток печени или толстого кишечника, или здоровые клетки МКПК и клетки костного мозга, выбирали для секвенирования. Клоны растили при стандартных условиях культивирования в присутствии эмбриональной бычей сыворотки с низким содержанием иммуноглобулинов (FBS Low IgG, Hy
- 46 043009
Clone) и антител, очищенных из супернатантов данных культур, как описано ниже для рекомбинантных антител.
Клонирование ОМЛ-специфических антител.
Для получения рекомбинантных антител мы выделили общую РНК с помощью набора RNeasy® mini (Qiagen), получили кДНК, провели ПЦР и клонировали вариабельные области тяжелой и легкой цепей в клонирующий вектор pCR2.1 ТА (Invitrogen). Для того чтобы исключить мутации, введенные обратной транскриптазой или ДНК-полимеразой, мы провели несколько независимых экспериментов по клонированию. Для получения рекомбинантных МАТ мы клонировали вариабельные области тяжелой и легкой цепей из каждого антитела в одной рамке считывания с IgG1 или IgG3 человека и константные области каппа в вектор на основе pcDNA3.1 (Invitrogen) и осуществили временную трансфекцию клеток 293Т. Мы очистили рекомбинантные антитела из культурального супернатанта с помощью белка А или G, в зависимости от подтипа Ig каждого клона.
Активность in vitro ОМЛ-специфических антител.
Для того чтобы измерить влияние in vitro ОМЛ-специфических антител на клетки ОМЛ мы использовали несколько подходов. Сначала клетки ТНР-1 (2х104) высевали в 96-луночные планшеты с плоским дном (Costar). Антитела к ОМЛ или контрольные антитела добавляли в день 1 при концентрации 5-10 мкг/мл. Количества клеток на лунку считали ежедневно. Индукцию ОМЛ-специфическими антителами гибели как клеток ТНР-1, так и первичных лейкемических клеток измеряли параллельно путем одновременного окрашивания в аликвоте клеток аннексина V (BD Pharmingen) и 7- аминоактиномицина D (7AAD; Beckman Coulter), дважды отрицательные клетки представляли собой жизнеспособные клетки. Кроме того, мы использовали анализ специфического лизиса. Целевые клетки (ТНР-1) метили кальцеином-АМ (Becton Dickinson) - зеленым флуоресцентным красителем, который высвобождался из цитоплазмы, когда клетки погибали. Вкратце, 2 миллиона клеток ТНР-1 инкубировали с 2 мл 2 мкМ кальцеина-АМ в течение 30 мин при 37°С. Антитела к ОМЛ или контрольные антитела добавляли на 4 ч, после чего измеряли зеленую флуоресценцию, применяя флуоресцентный спектрофотометр для прочтения планшетов. Долю специфического лизиса рассчитывали как (экспериментальное значение - низкий контроль)/(высокий контроль - низкий контроль)х100, где низкий контроль означает самопроизвольное высвобождение кальцеина-АМ из незатронутых клеток и высокий контроль означает максимальное количество высвобожденного кальцеина-АМ, когда все клетки лизированы. Дополнительно к анализу высвобождения кальцеина-АМ мы применяли анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) для измерения активности ОМЛ-специфических антител в отношении уничтожения целевых клеток. ЛДГ высвобождается поврежденными клетками, из их цитозоля. Лейкемические бластные клетки, выделенные при постановке диагноза из пациента с ОМЛ-М0, инкубировали с AT13-024 при максимальной концентрации, равной 10 мкг/мл на 10000 бластных клеток. Высвобождение ЛДГ измеряли после добавления Реакционной смеси и Останавливающего раствора (Roche Diagnostics/Applied Science), следуя протоколу производителя, на спектрофотометре для прочтения планшетов ELISA. Процент цитотоксичности рассчитывали как:
(экспериментальное значение - низкий контроль)/(высокий контроль - низкий контроль)х100, где низкий контроль означает самопроизвольное высвобождение ЛДГ из незатронутых клеток и высокий контроль означает максимальное количество высвобожденного ЛДГ, когда все клетки лизированы.
Для того чтобы количественно оценить гибель целевых клеток, вызванную ОМЛ-специфическими антителами, мы использовали анализ лизиса лейкемических клеток на основе FACS, описанный ранее (Schmiedel и др., 2013). Вкратце, калибровочные гранулы FACS (Accudrop Fluorescent Beads, BD Biosciences) добавляли к клеткам в соотношении 50/50, после чего стандартное количество гранул захватывали с помощью FACS. Так как калибровочные гранулы гарантировали равные анализируемые объемы, количество мертвых или исчезнувших клеток затем можно было рассчитать, как описано далее:
100-((Dapi-отрицательные клетки при соответствующем лечении/Dapi-отрицательные клетки в контроле)х100).
Наконец, чтобы различить апоптический и неапоптический пути гибели клеток, вызванной нашими антителами, мы осуществляли совместное окрашивание целевых клеток йодидом 3,3дигексилоксакарбоцианина (DiOC6) и йодидом пропидия (PI). DiOC6 представляет собой проникающий в клетку зеленый флуоресцентный липофильный краситель, который избирательно проникает в митохондрии живых клеток, когда его используют в низких концентрациях. Апоптические клетки утратят трансмембранный потенциал митохондрий (утрата окрашивания DiOC6) до того, как клеточная мембрана станет проницаемой (PI-положительные клетки); некротические клетки станут PI-положительными до того, как они утратят трансмембранный потенциал митохондрий (и станут DiOC6-отрицательными). Способы, применяемые для окрашивания, были основаны на описанных в Hugh J. М и др., 2004. Вкратце, клетки ТНР-1 окрашивали с помощью 40 нМ DiOC6 (Invitrogen) в течение 20 мин при 37°С. Добавляли PI, после чего образцы незамедлительно анализировали с помощью проточной цитометрии.
Проточная цитометрия.
- 47 043009
Окрашенные клетки анализировали на проточных цитометрах FACSAria (BD), FACSCanto (BD), FACS LSRFortessa X-20 (BD) и Guava (Millipore), и результаты проточной цитометрии обрабатывали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star).
Фазово-контрастная визуализация.
Клетки ТНР-1 добавляли в двухкамерную систему с покровными стеклами (LabTek). Применяя микроскоп для фазово-контрастной визуализации (собственного производства), выбрали по четыре интересующих поля в каждой камере. Программное обеспечение установили на режим съемки каждого интересующего поля через минуту. Непосредственно перед запуском добавляли связывающее ТНР-1 нецитотоксическое антитело AT13-023 и связывающее ТНР-1 цитотоксическое антитело AT13-037 в соответствующие лунки при концентрации 10 мкг/мл.
Проверка мишени: иммунопреципитация и проточная цитометрия.
Клетки ТНР-1 лизировали и предварительно очищали с помощью постороннего антитела (полученного внутри лаборатории антитела к ВСР - D25) и гранул, чтобы удалить неспецифически связанные белки. Предварительно очищенный лизат затем инкубировали с мечеными с помощью гранул ОМЛспецифическими антителами или с антителом, специфичным к вирусу гриппа, АТ10-002, в качестве отрицательного контроля (3 ч при 4°С). Инкубированные с антителом лизаты промывали пять раз, связанные белки элюировали из лизата ТНР-1, а затем разделяли путем электрофореза (ЭФ) в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ/ДСН). Белки подвергали блоттингу и окрашивали с помощью красителя Пунцовый S, чтобы обнаружить общий белок. Блот блокировали в БСА и инкубировали с антителами мыши к snRNP200 (Millipore, клон 3В6.1) или с антителами кролика к HMGB1 (Abcam) для анализа методом вестерн-блот. Внутриклеточное окрашивание snRNP200 осуществляли после фиксации и пермеабилизации клеток ТНР-1 с помощью метанола (Sigma) и пермеабилизирующего буфера, содержащего Тритон Х-100 (Sigma), ЭДТА (Gibco) и БСА (Roche), с последующей инкубацией с антителом кролика против snRNP200 человека (Sigma) в течение ночи при 4°С.
Подтверждение мишени: snRNP200 ELISA.
Клетки НЕК 293Т трансфицировали вектором экспрессии, содержащим полноразмерную открытую рамку считывания snRNP200 с N-концевой меткой FLAG. Через 2 дня после трансфекции клетки собирали и лизировали в лизирующем буфере, содержащем ингибиторы протеаз. Лизат очищали и измеряли концентрацию белка. ОМЛ-специфическими антителами AT12-019, AT12-023, АТ13-031 и АТ13-037 или доступными для приобретения snRNP200-специфическими антителами (Bethyl labs) затем покрывали планшет ELISA. Лизат добавляли при концентрации 3 мкг/мл для захвата. После обильной промывки захваченный snRNP200-flag обнаруживали с помощью моноклонального антитела мыши к flag, меченого пероксидазой хрена (HRP) (Sigma-Aldrich, клон М2).
Результаты.
Получение ОМЛ-специфических антител.
В нашем проекте мы применяем уникальную методику, которая была недавно разработана в нашей лаборатории (WO 2007/067046; включена в данную заявку посредством ссылки), которая позволяет осуществить селекцию встречающихся в природе специфичных к лейкемии В-клеток и антител, продуцируемых данными клетками. Мы использовали данную методику для получения линий специфичных к лейкемии В-клеток из двух пациентов с ОМЛ, у которых развились эффективные ответы ТПЛ параллельно с тяжелой РТПХ в печени и коже. С помощью нашей методики иммортализации В-клеток стало возможным определение ответов В-клеток из пациентов с лейкемией и создание специфичных к лейкемии линий В-клеток, которые позволяют проводить функциональные исследования продуцируемых данными линиями клеток антител и позволяют получить большие количества антител по сравнению с другими способами, известными в данной области, с диагностическим и терапевтическим потенциалом.
Сначала мы применили нашу методику, описанную в WO 2007/067046, для проведения ряда пробных экспериментов, в рамках которых мы выделили и иммортализовали В-лимфоциты из тщательно выбранной пациентки (донора 59), у которой развился эффективный ответ ТПЛ после обширной РТПХ в печени и коже. У данной пациентки была диагностирована ОМЛ в возрасте 36 лет. У нее наблюдалась полная ремиссия после первого из двух курсов индукционной химиотерапии, после которого она получила миелоаблативную ТСК от HLA-совместимого родственного донора в качестве консолидирующей терапии. Лишь через 5 месяцев после ТСК, вскоре после плавной отмены иммуносупрессивной терапии, у нее произошел рецидив ОМЛ. С помощью одного цикла высокой дозы цитарабина вновь добились у нее полной ремиссии, после которой у нее спонтанно, до запланированной инфузии донорских лимфоцитов, развилась степень III РТПХ в печени и степень II РТПХ в коже. Ее успешно лечили высокими дозами кортикостероидов, но во время постепенной отмены терапии произошло два рецидива печеночной РТПХ. В конце концов, терапия кортикостероидами была успешно прекращена приблизительно за 6 месяцев до начала описанных экспериментов (через 1,5 года после рецидива ОМЛ), и на данный момент у нее продолжается полная ремиссия лейкемии в течение более трех лет (фиг. 2).
Из данной пациентки мы получили клоны В-клеток, применяя нашу методику иммортализации Вклеток. Вкратце, МКПК выделяли из периферической крови путем центрифугирования в градиенте фиколла, и В-лимфоциты отсортировывали с помощью FACS. Выделенные В-лимфоциты затем культиви
- 48 043009 ровали с добавлением IL21 и CD40L и трансдуцировали их BCL6 и BCL-xL, при этом эффективность трансдукции составляла приблизительно 70%. Применяя данную методику были получены уникальные клоны В-клеток, которые одновремено экспрессируют В-клеточный рецептор и секретируют моноклональные антитела. Иммортализованные CD27- непримированные В-клетки и CD27+ IgG+ В-клетки памяти высевали при концентрациях 20 или 40 клеток на лунку и растили с добавлением IL21 и CD40L. Супернатанты выращенных микрокультур В-клеток затем подвергали скринингу на наличие антител, связывающихся с линиями клеток лейкемии, печени и толстого кишечника, посредством FACS, применяя IgG человека, меченые РЕ, в качестве вторичного детектируемого антитела.
Так как у данной пациентки была диагностирована ОМЛ-М5 согласно Франко-американобританской (ФАБ) классификации (Bennett и др., 1976), мы выбрали для данных скрининговых тестов линию клеток ТНР-1, которая морфологически и фенотипически примерно аналогична ОМЛ-М5 (Tsuchiya и др., 1988). Кроме того, так как данная пациентка страдала от обширной РТПХ в печени, мы провели скрининг для идентификации связывающихся с печенью клонов В-клеток, применяя линию клеток печени HepG2. В качестве отрицательного контроля, и для того, чтобы исключить перекрестносвязывающиеся клоны В-клеток, мы использовали линии клеток толстого кишечника НТ-29 и LSTR. Микрокультуры с наибольшим связыванием с любой из данных линий клеток затем сортировали, и отдельные клетки помещали в 96-луночные форматы, растили, и супернатанты данных выращенных клонов снова подвергали скринингу для выявления связывания с линиями клеток лейкемии (фиг. 3).
Свойства ОМЛ-специфических антител.
Применяя данный подход мы получили из данной одной пациентки восемь линий В-клеток, продуцирующих антитела, которые связываются с ТНР-1 (фиг. 3), но не с линиями клеток печени или толстого кишечника, фибробластами, эндотелиальными клетками (эндотелиальными клетками пупочной вены человека, или HUVEC), здоровыми МКПК или клетками костного мозга (табл. 2 и фиг. 4). Данные антитела представляли собой AT12-019, АТ12-023, АТ12-025, АТ13-022, АТ13-023, АТ13-024, АТ13-031 и АТ12-020.
Вариабельные области тяжелой и легкой цепей данных антител представлены в табл. 1 и на фиг. 1.
Интересно отметить, что указанные антитела принадлежат к изотипам IgG1 и IgG3, и в некоторых из последовательностей их ДНК выявили соматические гипермутации. Антитела AT12-023, АТ12-025, АТ13-023 и АТ13-031 принадлежат к семейству VH4-34, которое представляет собой семейство последовательностей VH, известных своей потенциальной способностью убивать клетки (Bhat и др., 1997). Данные антитела происходят от донора, что подтвердили с помощью анализов микрохимеризма.
Затем мы определили широту связывания в рамках спектра подтипов ОМЛ, и протестировали связывание полученных ОМЛ-специфических клонов В-клеток с другими типами ОМЛ по ФАБклассификации. Выбранные специфичные к лейкемии клоны также связывались с линией клеток ОМЛМ5 MonoMac6 (табл. 3) (см. обзор линий клеток ОМЛ в Drexler и Minowada, 1998).
Наши ОМЛ-специфические антитела также связывались со свежевыделенными из впервые диагностированных пациентов бластными клетками ОМЛ (табл. 3 и фиг. 5).
Более того, некоторые антитела также связывались с линиями клеток других гематопоэтических злокачественных новообразований, такими как линии клеток диффузной В-крупноклеточной лимфомы (OCI-Ly1 и OCI-Ly7) и линии клеток множественной миеломы (U266 и NCI-H929), и/или с полученными из пациента гематологическими опухолевыми клетками (табл. 4 и фиг. 6).
Активность in vitro ОМЛ-специфических антител.
Тестируя специфичность ОМЛ-связывающих антител, мы сделали поразительное наблюдение. Три из восьми антител спонтанно вызывали гибель лейкемических клеток, с которыми они связывались. Клетки ТНР-1 уничтожались антителами АТ12-023 и АТ12-025, а первичные бластные клетки ОМЛ, выделенные из пациентов, у которых была диагностирована ОМЛ, уничтожались антителами АТ12-025 и АТ12-024 (табл. 5 и фиг. 7-10).
На фиг. 7 показано быстрое уничтожение клеток ТНР-1 антителом АТ12-023. Умирающие бластные клетки экспрессируют 7-AAD и аннексин V. Удивительно, что хотя совместное культивирование ТНР-1 с AT12-025 сначала не влияло на суммарные количества клеток в культурах (фиг. 7), данное антитело, похоже, также вызывало гибель клеток ТНР-1, хотя и с небольшой задержкой по сравнению с АТ12-023 (фиг. 8). Наблюдение, состоящее в том, что некоторые из указанных антител напрямую убивают лейкемические клетки, весьма впечатляет и, насколько нам известно, об этом не сообщалось ранее.
Подтверждение наших открытий путем получения линий ОМЛ-специфических В-клеток из второго пациента.
Приблизительно от 0,05 до 0,1% В-клеток из первого пациента, которые мы подвергли скринингу, оказались ОМЛ-специфическими. Для того чтобы подтвердить наши открытия, мы выбрали вторую пациентку с рецидивом ОМЛ, у которой добились длительной ремиссии после аллогенной ТСК (донор 58; фиг. 11). Также у данной пациентки развилась РТПХ в коже и печени, от которой ее лечили пероральным введением стероидов. После того, как было прекращено лечение стероидами, приблизительно через один год после ТСК, выделяли МКПК, В-клетки иммортализовали и линии В-клеток подвергали скринингу для обнаружения связывания с линиями клеток ОМЛ, как описано выше. Из данной пациентки получили
- 49 043009 пять клонов В-клеток, которые связываются с линиями клеток ОМЛ - ТНР-1 и МопоМасб (фиг. 12), но не с линиями клеток печени или кишки, фибробластами или здоровыми МКПК (табл. 6). Данные клоны продуцируют антитела АТ13-033, АТ13-034, АТ13-035, АТ13-036 и АТ13-037. Интересно отметить, что все данные антитела принадлежат к изотипу IgG3. Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей данных антител также представлены в табл. 1 и на фиг. 1. Полученные результаты подтверждают достижимость нашего проекта; несмотря на низкую встречаемость В-клеток, на которые мы нацелились, мы смогли выделить их и получить надежные продуцирующие антитела линии В-клеток, которые были специфичны к ОМЛ.
Обсуждение.
Данные предварительные результаты весьма впечатляют, так как, насколько нам известно, мы первые получили несколько человеческих нехимерных специфичных к лейкемии клонов В-лимфоцитов из пациентов, у которых развился сильный продолжительный ответ ТПЛ против ОМЛ. Наблюдение, состоящее в том, что некоторые из данных антител спонтанно проявляют активность, способную убивать лейкемические бластные клетки in vitro, весьма впечатляет и очень перспективно. Кроме того, наблюдение, состоящее в том, что у некоторых из указанных антител зародышевая последовательность, и что они принадлежат к подклассу IgG3, к типу антител, который может индуцироваться без помощи Т-клеток, заслуживает дополнительного внимания, так как данные открытия демонстрируют, что 'природные' антитела, полученные независимым от Т-клеток способом, влияют на ответы ТПЛ у пациентов, которым провели ТСК. Важно отметить, что полученные результаты представляют доказательства концепции того, что применяя данную методику мы можем выбирать специфичные к лейкемии клоны В-клеток.
Пример 2.
ОМЛ-специфические антитела из третьего пациента.
Для того чтобы дополнительно подтвердить наш подход и показать, что данный направленный против ОМЛ ответ возникает не только у пациентов-женщин, мы также выбрали пациента-мужчину. У данного пациента (фиг. 13), донора 101, была диагностирована ОМЛ промежуточного риска (без цитогенетических или молекулярных отклонений от нормы; ФАБ-классификация ОМЛ-М5) в возрасте 49 лет. Он получил два курса химиотерапии (цитарабин, идарубицин, амсакрин) и один курс консолидирующей химиотерапии (бусульфан, циклофосфамид), а затем аутологичную ТГСК, так как у него не было доступного HLA-совместимого родственного донора стволовых клеток. Через четырнадцать месяцев после первой диагностики произошел рецидив его заболевания. Полной ремиссии у него добились после одного цикла химиотерапии цитарабином в высокой дозе, после которой он получил аллогенную ТГСК в условиях пониженной интенсивности от совместимого неродственного донора (ТСКПИ-СНД). Через шесть недель у него развилась острая РТПХ в коже, печени и кишечнике (стадия 1; степень II), которая хорошо отвечала на терапию кортикостероидами. В-клетки выделяли из продукта флеботомии, полученного из данного пациента через 38 месяцев после ТСК.
Применяя такие же способы, как описанные в примере 1, из данного пациента получили четыре клона В-клеток, которые связываются с линиями клеток ОМЛ - ТНР-1 и/или Molm13 (фиг. 14 и табл. 7), но не с линиями (эмбриональных) клеток печени или кишки, фибробластами или здоровыми МКПК (табл. 8). Данные клоны продуцируют антитела AT14-013 (IgG1), AT14-014 (IgG3), AT14-015 (IgG3) и AT14-016 (IgG3). Интересно отметить, что, снова, большинство антител принадлежало к изотипу IgG3. В последовательностях вариабельных областей тяжелой и легкой цепей данных антител выявили большие количества соматических гипермутаций, и они представлены в табл. 1В и на фиг. 1. Клон АТ14-013 проявил лишь незначительную реакционную способность в отношении линии клеток печеночно-клеточной карциномы Huh7, но не в отношении линии клеток печеночно-клеточной карциномы HepG2 или здоровых зародышевых клеток печени. Также наблюдали незначительную реакционную способность в отношении фибробластов, тем не менее, связывание данного антитела с данными тканеспецифичными клетками, по сравнению со связыванием с первичными лейкемическими бластными клетками, было пренебрежимо мало (фиг. 14).
Также исследовали, могут ли четыре антитела из донора 101 связываться с первичными бластными клетками ОМЛ (материалы и методы: см. пример 1). На фиг. 15 и в табл. 7 показано, что антитело AT14013, похоже, связывается с первичными бластными клетками, принадлежащими к по меньшей мере трем различным типам по ФАБ-классификации (ОМЛ-М0, М4 и М5). Антитела AT14-015 и AT14-016 способны связываться с первичными бластными клетками ОМЛ типа М4 по ФАБ-классификации.
Пример 3.
Активность in vitro ОМЛ-специфических антител из доноров 59, 58 и 101.
В примере 1 определили широту связывания указанных антител из донора 59 в рамках спектра подтипов ОМЛ (табл. 3). Применяя такие же способы, широту связывания также определили и для антител из донора 58. Результаты представлены в табл. 9А: все пять антител из донора 58 (AT13-033, AT13-034, AT13-035, AT13-036 и AT13-037) связывались с линией клеток ОМЛ-М5-ТНР-1, а также с линией клеток ОМЛ-М5-MonoMac6. Данные ОМЛ-специфические антитела не проявляли значительного связывания со свежевыделенными бластными клетками ОМЛ из пациентов с впервые диагностированной ОМЛ М0, M1 или М4 по ФАБ-классификации. АТ13-034 было способно лишь слабо связываться с бластными клетка- 50 043009 ми М0. Это свидетельствует о том, что данные антитела специфичны (по меньшей мере) к бластным клеткам ОМЛ М5.
В примере 1 также определили, что антитела AT12-023 и AT12-025 из донора 59 убивали клетки ТНР-1 (табл. 5 и фиг. 7-9). Впоследствии мы исследовали, могут ли другие антитела из донора 59, а также антитела из донора 58, также убивать клетки ТНР-1, применяя такие же материалы и методы, как и в примере 1. В табл. 9В - 10 показано, что дополнительно к AT12-023 и АТ12-025, также антитело АТ13031 (донор 59), как и антитела АТ13-033, AT13-035, AT13-036 и AT13-037 (донор 58), похоже, способны убивать клетки ТНР-1.
Также исследовали способность вызывать гибель первичных бластных клеток ОМЛ (материалы и методы: см. пример 1). Аналогично некоторым из указанных антител, полученных из донора 59, некоторые из указанных антител, полученных из донора 58, также были способны вызывать гибель первичных клеток ОМЛ. Это показано на фиг. 16 для антитела AT13-037 в обеих формах (очищенный супернатант В-клеток (sAT13-037) и полученное рекомбинантным способом антитело (rAT13-037); оба в конформации IgG3). Указанные лейкемические клетки получали из костного мозга пациента с впервые диагностированной ОМЛ, ФАБ-классификация ОМЛ-М5.
Пример 4.
Активность in vitro антител против ОМЛ проявляется быстро и вовлекает неапоптический путь гибели клеток.
Для того чтобы исследовать путь, посредством которого некоторые из приведенных выше антител вызывали гибель целевых клеток, мы визуализировали гибель целевых клеток путем микроскопии в режиме замедленной съемки (фиг. 17а). Мы наблюдали, что в течение нескольких минут после инкубации с антителом AT13-037, клетки начинали разбухать, а затем погибали. Это позволило предположить, что антитела согласно настоящему изобретению активировали пути, отличные от классических путей апоптоза, так как апоптические клетки сжимаются, а не разбухают. Для того чтобы дополнительно исследовать это, мы осуществили двойное окрашивание маркерами гибели клеток DiOC6 и йодидом пропидия (PI). Клетки, в которых индуцирован путь апоптоза, сначала утрачивают митохондриальный заряд (что можно визуализировать по утрате связывания DiOC6) до того, как повышается проницаемость мембраны клетки (визуализируют путем окрашивания йодидом пропидия (PI)), тогда как клетки, подвергнутые некрозу, утрачивают целостность мембраны (становятся PI-положительными), но не сразу утрачивают трансмембранный потенциал митохондрий. Так как известно, что диклофенак вызывает апоптоз клеток ТНР-1, мы использовали диклофенак в качестве положительного контроля. Обработанные диклофенаком апоптические клетки ТНР-1 становились DiOC6-отрицательными (утрачивали трансмембранный потенциал митохондрий), но сохраняли целостность мембраны клетки. При инкубации с ОМЛ-специфическим цитотоксическим антителом AT12-023 трансмембранный потенциал митохондрий сохранялся (DiOC6положительные клетки), при этом проницаемость мембран клеток ТНР-1 повышалась (PI-положительные клетки). Таким образом, клетки ТНР-1, обработанные ОМЛ-специфическим антителом, становились PIположительными, при этом сохраняя трансмембранный потенциал митохондрий (фиг. 17b, справа), что указывало на активацию неапоптического пути гибели. В действительности, гибель клеток ТНР-1 при обработке цитотоксическим ОМЛ-специфическим антителом невозможно было предотвратить путем инкубации клеток с неспецифическими ингибиторами каспаз Z-VAD-fmk или QVD-OPh (фиг. 17с).
Гибель клеток опосредовалась нарушением мембраны целевой клетки.
Неапоптические пути гибели включают некроптоз и онкоз. Некроптоз аналогичен апоптозу, это активный путь гибели клеток, который зависит от активации определенных молекулярных путей, включая активацию взаимодействующей с рецептором протеинкиназы 3 (RIPK3). Для того чтобы исследовать, зависила ли вызванная ОМЛ-специфическим антителом гибель клеток от активации внутриклеточных молекулярных путей, мы проверили, зависила ли вызванная антителом цитотоксичность от температуры. Мы обнаружили, что при данных условиях эксперимента цитотоксические активности по меньшей мере антител AT13-033, AT13-035, AT13-036, AT13-037, AT12-023 и AT12-025 были одинаково эффективны при 4°С при сравнении с их активностями при 37°С (фиг. 18), позволяя предложить, что по меньшей мере данные антитела вызывали гибель клеток посредством пассивного процесса. Следует отметить, что цитотоксическая активность антитела AT13-031 была значительно более эффективной при 37°С по сравнению с таковой при 4°С. Тем не менее, поскольку антитело AT13-031 вызывает гибель клеток ОМЛ в присутствии ингибиторов апоптоза (таких как неспецифические ингибиторы каспаз Q-VD-OPh или ZVAD-fmk), было ясно, что антитело AT13-031 также способно уменьшать пролиферацию клеток ОМЛ независимо от апоптоза.
Онкоз представляет собой способ гибели клеток, который характеризуется набуханием клеток, посредством селективного повреждения мембраны, приводящего к повышенной проницаемости мембраны и, в конечном итоге, к гибели клеток. Были описаны вызывающие онкоз антитела, которые опосредуют гибель клеток путем образования больших пор в мембране посредством дестабилизации мембраны (Hernandez и др., 2011). Цитохалазин D представляет собой ингибитор полимеризации актина, который может стабилизировать цитоскелет. Обработка целевой линии клеток ТНР-1 цитохалазином D не предотвращала связывание антитела с данными клетками (фиг. 19а), тем не менее, она предотвращала гибель
- 51 043009 целевых клеток (фиг. 19b). Таким образом, стабилизация мембраны защищает целевые клетки от цитотоксической активности наших антител.
Пример 5.
Одна из мишеней, которые узнаются нашими антителами, представляет собой snRNP200.
Затем мы решили определить мишень, которая узнается некоторыми ОМЛ-специфическими антителами. Для этого мы использовали иммунопреципитацию лизатов мембран клеток ТНР-1 с антителами AT12-023 и АТ13-031. Мы обнаружили явную полосу белка на уровне 250 кДа, которую отправили на анализ методом масс-спектрометрии, который показал, что целевым антигеном является snRNP200, и это можно было подтвердить с помощью анализа методом вестерн-блот (фиг. 20а). Мы разработали анализ ELISA, чтобы убедиться, что snRNP200 является мишенью некоторых из указанных антител против ОМЛ. С помощью данного анализа ELISA мы обнаружили, что, дополнительно к АТ12-023 и АТ13-031, АТ13-037 специфично узнавало snRNP200 (фиг. 20b). Другие ОМЛ-специфические антитела, такие как АТ12-019, не узнавали snRNP200 как целевой антиген.
snRNP200 является частью сплайсосомы во всех эукариотических клетках и, следовательно, ожидается, что он должен быть расположен в ядре. Для того чтобы подтвердить, что клетки ОМЛ экспрессируют данный белок на своей поверхности, мы окрашивали мембраны клеток ТНР-1 доступным для приобретения антителом к snRNP200. На фигуре 21 показано, что данное антитело к snRNP200 в действительности связывается с мембраной клеток ОМЛ, но не с линией клеток Jurkat. Как и ожидали, так как snRNP200 представляет собой ядерный белок, то оно не связывалось с внутриклеточным содержимым линий клеток Jurkat и ТНР-1 (фиг. 21).
Все эукариотические клетки содержат белок snRNP200 (также известный как U5-snRNP) в ядре, который является частью сплайсосомы (Kattah, 2010). Сплайсосома состоит из множества белков. Было описано, что по меньшей мере один из данных белков, U1-snRNP, экспрессировался на апоптических клетках у пациентов с системной красной волчанкой (SLE) и смешанным заболеванием соединительной ткани (СЗСТ), приводя к аутоиммунным реакциям (Kattah, 2010).
Мы предполагаем, что экспрессия snRNP200 клетками ОМЛ запустила аллоиммунный ответ (ответ трансплантата против лейкемии), который поддерживал длительную ремиссию у пациентов. Следовательно, данный белок теперь можно применять в качестве новой мишени для лечения ОМЛ. Более того, поскольку антитела AT12-023 и AT13-031 специфично узнают snRNP200, а также узнают клетки В-НХЛ, snRNP200 теперь также можно применять в качестве мишени для лечения В-НХЛ.
Таблица 1А
Предпочтительные направленные против ОМЛ антитела согласно настоящему изобретению (нумерация CDR согласно Kabat и др. 1991)
| SEQ ID NO. | Антитело | Название | Последовательность |
| 1 | АТ12-023 | CDR1 тяжелой цепи | GYYWS |
| 2 | АТ12-025 | CDR1 тяжелой цепи | GYYWS |
| 3 | АТ 13-024 | CDR1 тяжелой цепи | SYGMH |
| 4 | АТ12-019 | CDR1 тяжелой цепи | SYAMS |
| 5 | АТ 13-022 | CDR1 тяжелой цепи | SYGMH |
| 6 | АТ 13-023 | CDR1 тяжелой цепи | GYFWT |
| 7 | АТ13-031 | CDR1 тяжелой цепи | GYYWS |
| 8 | АТ12-020 | CDR1 тяжелой цепи | TYSMN |
- 52 043009
| 9 | AT13-033 | CDR1 тяжелой цепи | NYGMH |
| 10 | AT13-034 | CDR1 тяжелой цепи | SHAIH |
| 11 | AT13-035 | CDR1 тяжелой цепи | SYGMH |
| 12 | AT13-036 | CDR1 тяжелой цепи | SYSMN |
| 13 | AT13-037 | CDR1 тяжелой цепи | TYGMH |
| 14 | AT12-023 | CDR2 тяжелой цепи | EINHSGSTNYNPSLKS |
| 15 | AT12-025 | CDR2 тяжелой цепи | EINHSGSTNYNPSLKS |
| 16 | AT 13-024 | CDR2 тяжелой цепи | FIRYDGSNKYFADSVRG |
| 17 | AT12-019 | CDR2 тяжелой цепи | TIRASGGSTSYADSVKG |
| 18 | AT 13-022 | CDR2 тяжелой цепи | ISYDGSNKYYADSVKG |
| 19 | AT 13-023 | CDR2 тяжелой цепи | ETVHSGGTNYNPSLKS |
| 20 | AT13-031 | CDR2 тяжелой цепи | EINHSGSTNYNPSLKS |
| 21 | AT12-020 | CDR2 тяжелой цепи | SISSSSGYIYYADSVKG |
| 22 | AT13-033 | CDR2 тяжелой цепи | VISHDGSKTYYGHSVKG |
| 23 | AT13-034 | CDR2 тяжелой цепи | LIWYDGSNNYYADSVKG |
| 24 | AT13-035 | CDR2 тяжелой цепи | VISYDGSNKYY AD S VKG |
| 25 | AT13-036 | CDR2 тяжелой цепи | SISSSSTYIYYADSVKG |
| 26 | AT13-037 | CDR2 тяжелой цепи | VIWYDGSNTYYADSVKG |
| 27 | AT12-023 | CDR3 тяжелой цепи | GRSTSPLDYYYYYMDV |
| 28 | AT12-025 | CDR3 тяжелой цепи | GSMARPKPFDY |
| 29 | AT 13-024 | CDR3 тяжелой цепи | DPQERIYYSDTSGYLDY |
| 30 | AT12-019 | CDR3 тяжелой цепи | SPAMIRGVRGGDYFDY |
- 53 043009
| 31 | AT 13-022 | CDR3 тяжелой цепи | DGKGIVVIYYYYGMDV |
| 32 | AT 13-023 | CDR3 тяжелой цепи | GLNSPFDY |
| 33 | AT13-031 | CDR3 тяжелой цепи | GPRGMYSSSSGDY |
| 34 | AT12-020 | CDR3 тяжелой цепи | DGTFSYYYYMDV |
| 35 | AT13-033 | CDR3 тяжелой цепи | AGLNYYGNLLSNYFYYGMDV |
| 36 | AT13-034 | CDR3 тяжелой цепи | ARDGCTGGSCCYFDN |
| 37 | AT13-035 | CDR3 тяжелой цепи | AKDSYYYGSGRRWGYYFDY |
| 38 | AT13-036 | CDR3 тяжелой цепи | ARRREVGRDGYSLYPRGYHYGMDV |
| 39 | AT13-037 | CDR3 тяжелой цепи | ARGRGYSAQGNRNRAYYFDY |
| 40 | AT12-023 | CDR1 легкой цепи | QGDFLRSYYAS |
| 41 | AT12-025 | CDR1 легкой цепи | RASQSISRYLN |
| 42 | AT 13-024 | CDR1 легкой цепи | RASQSISSWLA |
| 43 | AT12-019 | CDR1 легкой цепи | RASQAFSSYLV |
| 44 | AT 13-022 | CDR1 легкой цепи | SGDKLGDKYAC |
| 45 | AT 13-023 | CDR1 легкой цепи | RASQGIRNVLG |
| 46 | AT13-031 | CDR1 легкой цепи | RASQGIRNDLG |
| 47 | AT12-020 | CDR1 легкой цепи | RASQDISSSLA |
| 48 | AT13-033 | CDR1 легкой цепи | TGTSSDIGGYNYVS |
| 49 | AT13-034 | CDR1 легкой цепи | RASQSISNNLG |
| 50 | AT13-035 | CDR1 легкой цепи | QGDSLRSYYAS |
| 51 | AT13-036 | CDR1 легкой цепи | TGTSSDVGGYNYVS |
| 52 | AT13-037 | CDR1 легкой цепи | RASQSVSSNLA |
-54043009
| 53 | AT12-023 | CDR2 легкой цепи | GKNKRPS |
| 54 | AT12-025 | CDR2 легкой цепи | AASSLQS |
| 55 | AT 13-024 | CDR2 легкой цепи | KASSLES |
| 56 | AT12-019 | CDR2 легкой цепи | ATSTLQG |
| 57 | AT 13-022 | CDR2 легкой цепи | QDSKRPS |
| 58 | AT 13-023 | CDR2 легкой цепи | AASSLQS |
| 59 | AT13-031 | CDR2 легкой цепи | AAVSLQS |
| 60 | AT12-020 | CDR2 легкой цепи | AASTLQS |
| 61 | AT13-033 | CDR2 легкой цепи | EVTKRPS |
| 62 | AT13-034 | CDR2 легкой цепи | GASTRAT |
| 63 | AT13-035 | CDR2 легкой цепи | GKNNRPS |
| 64 | AT13-036 | CDR2 легкой цепи | DVNDRPS |
| 65 | AT13-037 | CDR2 легкой цепи | GAFTRVT |
| 66 | AT12-023 | CDR3 легкой цепи | NSRDRSGNHLV |
| 67 | AT12-025 | CDR3 легкой цепи | QQSYSTPRT |
| 68 | AT 13-024 | CDR3 легкой цепи | QQYNTYPYT |
| 69 | AT12-019 | CDR3 легкой цепи | QQYYSYPPT |
| 70 | AT 13-022 | CDR3 легкой цепи | QAWDSSTVVF |
| 71 | AT 13-023 | CDR3 легкой цепи | LQHNSHPRT |
| 72 | AT13-031 | CDR3 легкой цепи | LQHNSYPRT |
| 73 | AT12-020 | CDR3 легкой цепи | QQYYSYPPT |
| 74 | AT13-033 | CDR3 легкой цепи | SSYAGSNDLL |
- 55 043009
| 75 | AT13-034 | CDR3 легкой цепи | QQYNNWPRLT |
| 76 | AT13-035 | CDR3 легкой цепи | NSRDSSGNHVV |
| 77 | AT13-036 | CDR3 легкой цепи | SSYTRSNTVI |
| 78 | AT13-037 | CDR3 легкой цепи | QQYNDRPPYT |
| 79 | AT12-023 | Тяжелая цепь | QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARGRSTSPLDYYYYYMDVWAKGTTVTVSS |
| 80 | AT12-025 | Тяжелая цепь | QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSMARPKPFDYWGQGTLVTVSS |
| 81 | AT 13-024 | Тяжелая цепь | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYFADSVRGRFTISRDNS KNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPQERIYYSDTSGYLDYWGQGTLVTVSS |
| 82 | AT12-019 | Тяжелая цепь | EVHLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTIRASGGSTSYADSVKGRFTISRDNSQS RLYLQMNSLTAEDTAVYYCAKSPAMIRGVRGGDYFDYWGQGTLVTVSS |
| 83 | AT 13-022 | Тяжелая цепь | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGKGIVVIYYYYGMDVWGQGTTVTVSS |
| 84 | AT 13-023 | Тяжелая цепь | QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWTWIRQPPGKGLEWIGETVHSGGTNYNPSLKSRVTISVDTSKN QFSLRLNSVTAADTAVYYCVRGLNSPFDYWGQGTLVTVSS |
| 85 | AT13-031 | Тяжелая цепь | QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKK QFSLKLSSVTAADTAVYYCARGPRGMYSSSSGDYWGQGTLVTVSS |
| 86 | AT12-020 | Тяжелая цепь | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSGYIYYADSVKGRFTISRDNAK NSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGTFSYYYYMDVWGKGTTVTVSS |
| 87 | AT13-033 | Тяжелая цепь | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAVSGLSFRNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISHDGSKTYYGHSVKGRFTISRDKS KTMLFLQMNSLRPEDTAVYYCAKAGLNYYGNLLSNYFYYGMDVWGQGTTVTVSS |
| 88 | AT13-034 | Тяжелая цепь | QVHLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASEFTFSSHAIHWVRQAPGKGLEWVALIWYDGSNNYYADSVKGRFTISRDSSK NTVHLQMNSLRVEDTAVYYCARDGCTGGSCCYFDNWGQGTLVTVSS |
| 89 | AT13-035 | Тяжелая цепь | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDSYYYGSGRRWGYYFDYWGQGTLVTVSS |
| 90 | AT13-036 | Тяжелая цепь | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSTYIYYADSVKGRFTISRDNARN SLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRREVGRDGYSLYPRGYHYGMDVWGQGTTVTVSS |
| 91 | ATI 3-037 | Тяжелая цепь | QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQIKSLRAEDTAVYYCARGRGYSAQGNRNRAYYFDYWGQGTLVTVSS |
| 92 | AT12-023 | Легкая цепь | SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDFLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIFGKNKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQ AEDEADYYCNSRDRSGNHLVFGGGTKLTVL |
| 93 | AT12-025 | Легкая цепь | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQ PEDFATYYCQQSYSTPRTFGPGTKVDIK |
| 94 | AT 13-024 | Легкая цепь | DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQ PDDFATYYCQQYNTYPYTFGQGTKLEIK |
| 95 | AT12-019 | Легкая цепь | AIRLTQSPSSVSASTGDRVTITCRASQAFSSYLVWYQQKPGKAPNLLIYATSTLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQ SEDFATYYCQQYYSYPPTFGQGTKLEIK |
| 96 | AT 13-022 | Легкая цепь | SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQ AMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL |
| 97 | AT 13-023 | Легкая цепь | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNVLGWYQQKPGKAPKCLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQ PEDFATYYCLQHNSHPRTFGQGTKVEIK |
| 98 | AT13-031 | Легкая цепь | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAAVSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSL QPEDFATYYCLQHNSYPRTFGQGTKLEIK |
- 56 043009
| 99 | АТ12-020 | Легкая цепь | AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITCRASQDISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQS EDFATYYCQQYYSYPPTFGQGTRLEIK |
| 100 | АТ13-033 | Легкая цепь | QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDIGGYNYVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVS GLQAEDEAHYYCSSYAGSNDLLFGGGTKLTVL |
| 101 | АТ13-034 | Легкая цепь | EVVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSISNNLGWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPGRFSGSGSGTEFTLTIYSL QSEDFAVYYCQQYNNWPRLTFGGGTKVEIK |
| 102 | АТ13-035 | Легкая цепь | SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGA QAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL |
| 103 | АТ13-036 | Легкая цепь | QSALTQPASVSGSPRQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQLPGKAPKLMIYDVNDRPSGVSIRFSGSKSGNTASLTIS GLQAEDEADYYCSSYTRSNTVIFGGGTKLTVL |
| 104 | АТ13-037 | Легкая цепь | EIVMTQSPATLSVSPGERVILSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQPPRLLIYGAFTRVTGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQ SEDFAVYYCQQYNDRPPYTFGQGTKLEIK |
| 105 | АТ12-023 | CDR1 тяжелой цепи | ggt tac tac tgg age |
| 106 | АТ12-025 | CDR1 тяжелой цепи | ggt tat tac tgg age |
| 107 | AT 13-024 | CDR1 тяжелой цепи | age tat ggc atg cac |
| 108 | АТ12-019 | CDR1 тяжелой цепи | age tat gee atg agt |
| 109 | AT 13-022 | CDR1 тяжелой цепи | age tat ggc atg cac |
| ПО | AT 13-023 | CDR1 тяжелой цепи | ggt tac ttc tgg ace |
| 111 | AT13-031 | CDR1 тяжелой цепи | ggt tac tac tgg age |
| 112 | AT12-020 | CDR1 тяжелой цепи | ace tat age atg aac |
| ИЗ | AT13-033 | CDR1 тяжелой цепи | aat tat ggc atg cac |
| 114 | AT13-034 | CDR1 тяжелой цепи | tec cat gee ata cac |
| 115 | AT13-035 | CDR1 тяжелой цепи | age tat ggc atg cac |
| 116 | AT13-036 | CDR1 тяжелой цепи | agt tat age atg aac |
| 117 | AT13-037 | CDR1 тяжелой цепи | ace tat ggc atg cac |
| 118 | AT12-023 | CDR2 тяжелой цепи | gaa ate aat cat agt gga age ace aac tac aac ccg tec etc aag agt |
| 119 | AT12-025 | CDR2 тяжелой цепи | gaa ate aat cat agt gga age ace aac tac aac ccg tec etc aag agt |
| 120 | AT 13-024 | CDR2 тяжелой цепи | ttt ata egg tat gat gga agt aat aaa tac ttt gca gac tec gtg agg ggc |
- 57 043009
| 121 | AT12-019 | CDR2 тяжелой цепи | act att agg get agt ggt ggt age аса age tac gca gac tcc gtg aag ggc |
| 122 | AT 13-022 | CDR2 тяжелой цепи | ata tea tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg aag ggc |
| 123 | AT 13-023 | CDR2 тяжелой цепи | gaa acc gtt cat agt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc etc aag agt |
| 124 | AT13-031 | CDR2 тяжелой цепи | gaa ate aat cat agt gga age acc aac tac aac ccg tcc etc aag agt |
| 125 | AT12-020 | CDR2 тяжелой цепи | tcc att agt agt agt agt ggt tac ata tac tac gca gac tea gtg aag ggc |
| 126 | AT13-033 | CDR2 тяжелой цепи | gtc att teg cat gat gga agt aag аса tac tat gga cac tcc gtg aag ggc |
| 127 | AT13-034 | CDR2 тяжелой цепи | ett ata tgg tat gat gga agt aat aat tat tat gca gac tcc gtg aag ggc |
| 128 | AT13-035 | CDR2 тяжелой цепи | gtt ata tea tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg aag ggc |
| 129 | AT13-036 | CDR2 тяжелой цепи | tcc att agt agt agt agt act tac ata tac tac gca gac tea gtg aag ggc |
| 130 | AT13-037 | CDR2 тяжелой цепи | gtt ata tgg tat gat gga agt aat аса tac tat gca gac tcc gtg aag ggc |
| 131 | AT12-023 | CDR3 тяжелой цепи | ggc cgt agt acc age ccg etc gac tac tac tac tac tac atg gac gtc |
| 132 | AT12-025 | CDR3 тяжелой цепи | ggc tea atg gca aga ccc aag cca ttt gac tac |
| 133 | AT 13-024 | CDR3 тяжелой цепи | geg aaa gat ccc caa gag cgt att tat tac tet gat act agt ggt tac ett gac tac |
| 134 | AT12-019 | CDR3 тяжелой цепи | tot cot get atg att egg gga gtt agg ggg ggt gac tac ttt gac tac |
| 135 | AT 13-022 | CDR3 тяжелой цепи | gat ggg aag ggg att gta gtt att tac tac tac tac ggt atg gac gtc |
| 136 | AT 13-023 | CDR3 тяжелой цепи | ggc ett aac age ccc ttt gac tac |
| 137 | AT13-031 | CDR3 тяжелой цепи | ccc egg ggc atg tat age age teg tcc ggg gac tac |
| 138 | AT12-020 | CDR3 тяжелой цепи | gat ggg act ttc tcc tac tac tac tac atg gac gtc |
| 139 | AT13-033 | CDR3 тяжелой цепи | gcc ggg ttg aac tac tat gga aac eta tta tea aac tac ttc tac tac gga atg gac gtc |
| 140 | AT13-034 | CDR3 тяжелой цепи | geg aga gat ggt tgt act ggt ggt age tgc tgc tat ttt gac aac |
| 141 | AT13-035 | CDR3 тяжелой цепи | geg aaa gac teg tat tac tat ggt teg ggg aga ega tgg ggc tac tac ttt gac tac |
| 142 | AT13-036 | CDR3 тяжелой цепи | geg aga agg agg gag gtc ggt aga gat ggc tac agt ttg tac ccc egg ggg tac cac tac ggt atg gac gtc |
-58043009
| 143 | AT13-037 | CDR3 тяжелой цепи | gcg aga ggc cgt gga tat agt gcc caa ggg aat egg aat agg get tac tac ttt gac tac |
| 144 | AT12-023 | CDR1 легкой цепи | caa gga gac ttc etc aga age tat tat gca age |
| 145 | AT12-025 | CDR1 легкой цепи | egg gca agt cag age att age agg tat tta aat |
| 146 | AT 13-024 | CDR1 легкой цепи | egg gcc agt cag agt att agt age tgg ttg gcc |
| 147 | AT12-019 | CDR1 легкой цепи | egg gcg agt cag get ttt age agt tat tta gtc |
| 148 | AT 13-022 | CDR1 легкой цепи | tet gga gat aaa ttg ggg gat aaa tat get tgc |
| 149 | AT 13-023 | CDR1 легкой цепи | egg gca agt cag ggc att aga aat gtt tta ggc |
| 150 | AT13-031 | CDR1 легкой цепи | egg gca agt cag ggc att aga aat gat tta ggc |
| 151 | AT12-020 | CDR1 легкой цепи | egg gcg agt cag gat att age agt tet tta gcc |
| 152 | AT13-033 | CDR1 легкой цепи | act ggg acc age agt gac att ggt ggt tat aac tat gtc tcc |
| 153 | AT13-034 | CDR1 легкой цепи | agg gcc agt cag age att age aac aac tta ggc |
| 154 | AT13-035 | CDR1 легкой цепи | caa gga gac age etc aga age tat tat gca age |
| 155 | AT13-036 | CDR1 легкой цепи | act gga acc age agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tec |
| 156 | AT13-037 | CDR1 легкой цепи | agg gcc agt cag agt gtt age age aac tta gcc |
| 157 | AT12-023 | CDR2 легкой цепи | ggt aaa aac aag egg ccc tea |
| 158 | AT12-025 | CDR2 легкой цепи | get gca tec agt ttg caa agt |
| 159 | AT 13-024 | CDR2 легкой цепи | aag gcg tet agt tta gaa agt |
| 160 | AT12-019 | CDR2 легкой цепи | get аса tec act ttg caa ggt |
| 161 | AT 13-022 | CDR2 легкой цепи | caa gat age aag egg ccc tea |
| 162 | AT 13-023 | CDR2 легкой цепи | get gca tec agt ttg caa agt |
| 163 | AT13-031 | CDR2 легкой цепи | get gca gtc agt ttg caa agt |
| 164 | AT12-020 | CDR2 легкой цепи | get gca tec act ttg caa agt |
- 59 043009
| 165 | AT13-033 | CDR2 легкой цепи | gag gtc act aag egg ccc tea |
| 166 | AT13-034 | CDR2 легкой цепи | ggt gca tec ace agg gee act |
| 167 | AT13-035 | CDR2 легкой цепи | ggt aaa aac aac egg ccc tea |
| 168 | AT13-036 | CDR2 легкой цепи | gat gtc aat gat egg ccc tea |
| 169 | AT13-037 | CDR2 легкой цепи | ggt gca ttc acg agg gtc act |
| 170 | AT12-023 | CDR3 легкой цепи | aac tcc egg gac ege agt ggt aac cac etg gtg |
| 171 | AT12-025 | CDR3 легкой цепи | caa cag agt tac agt acc cct ege act |
| 172 | AT 13-024 | CDR3 легкой цепи | caa cag tat aat act tac ccg tac act |
| 173 | AT12-019 | CDR3 легкой цепи | caa cag tat tat agt tac cct ccg act |
| 174 | AT 13-022 | CDR3 легкой цепи | cag geg tgg gac age age act gtg gta ttc |
| 175 | AT 13-023 | CDR3 легкой цепи | eta cag cat aat agt cac ccc egg acg |
| 176 | AT13-031 | CDR3 легкой цепи | eta cag cat aat agt tac cct egg act |
| 177 | AT12-020 | CDR3 легкой цепи | caa cag tat tat agt tac cct ccg acg |
| 178 | AT13-033 | CDR3 легкой цепи | age tea tat gca ggc age aac gat ttg eta |
| 179 | AT13-034 | CDR3 легкой цепи | caa caa tat aat aac tgg cct egg etc act |
| 180 | AT13-035 | CDR3 легкой цепи | aac tcc egg gac age agt ggt aac cat gtg gta |
| 181 | AT13-036 | CDR3 легкой цепи | age tea tat аса aga age aac act gtg ata |
| 182 | AT13-037 | CDR3 легкой цепи | cag cag tac aat gac egg ccc ccg tac act |
| 183 | AT12-023 | Тяжелая цепь | cag gtg cag eta cag cag tgg ggc gca gga etg ttg aag cct teg gag acc etg tcc etc acc tgc get gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac tac tgg age tgg ate ege cag ccc cca ggg aag ggg etg gag tgg att ggg gaa ate aat cat agt gga age acc aac tac aac ccg tcc etc aag agt ega gtc acc ata tea gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc etg aag etg age tet gtg acc gee geg gac acg get gtg tat tac tgt geg agg ggc cgt agt acc age ccg etc gac tac tac tac tac tac atg gac gtc tgg gee aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea |
| 184 | AT12-025 | Тяжелая цепь | cag gtg cag eta cag cag tgg ggc gca gga etg ttg aag cct teg gag acc etg tcc etc acc tgc get gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tat tac tgg age tgg ate ege cag ccc cca ggg aag ggg etg gag tgg att ggg gaa ate aat cat agt gga age acc aac tac aac ccg tcc etc aag agt ega gtc acc ata tea gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc etg aag etg age tet gtg acc gee geg gac acg get gtg tat tac tgt geg aga ggc tea atg gca aga ccc aag cca ttt gac tac tgg ggc cag gga acc etg gtc acc gtc tcc tea |
| 185 | AT 13-024 | Тяжелая цепь | cag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg tcc etg aga etc tcc tgt gca geg tet gga ttc acc ttc agt age tat ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg etg gag tgg gtg gca ttt ata egg tat gat gga agt aat aaa tac ttt gca gac tcc gtg agg ggc |
- 60 043009
| 186 | AT12-019 | Тяжелая цепь | cga ttc асе ate tec aga gac aat tec aag aac acg etg ttt etg caa atg aac age etg aga get gag gac acg get gtg tat tac tgt geg aaa gat ccc caa gag cgt att tat tac tet gat act agt ggt tac ett gac tac tgg ggc cag gga acc etg gtc ace gtc tec tea gag gtg cac etg ttg gag tet ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg tcc etg aga etc tec tgt gca gee tet gga ttc acc ttt age age tat gee atg agt tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg etg gag tgg gtc tea act att agg get agt ggt ggt age аса age tac gca gac tcc gtg aag ggc egg ttc acc ate tcc aga gac aat tcc cag age agg ttg tat etg caa atg aac agt etg аса gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgt geg aaa tet cct get atg att egg gga gtt agg ggg ggt gac tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc etg gtc acc gtc tcc tea |
| 187 | AT 13-022 | Тяжелая цепь | cag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg tcc etg aga etc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt age tat ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg etg gag tgg gtg gca gtt ata tea tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg etg tat etg caa atg aac age etg aga get gag gac acg get gtg tat tac tgt geg aaa gat ggg aag ggg att gta gtt att tac tac tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea |
| 188 | AT 13-023 | Тяжелая цепь | cag gta cag eta cag cag tgg ggc gca gga etg ttg aag cct teg gag acc etg tcc etc acc tgc get gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac ttc tgg acc tgg ate ege cag ccc cca ggg aag ggg etg gag tgg att ggg gaa acc gtt cat agt gga ggc acc aac tac aac ccg tcc etc aag agt cga gtc acc ata tea gtc gac acg tcc aag aac cag ttc tcc etg agg etg aac tet gtg acc gcc geg gac acg get gtg tat tac tgt gtg aga ggc ett aac age ccc ttt gac tac tgg ggc cag gga acc eta gtc acc gtc tcc tea |
| 189 | AT13-031 | Тяжелая цепь | cag gtg cag eta cag cag tgg ggc gca gga etg ttg aag cct teg gag acc etg tcc etc acc tgc get gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac tac tgg age tgg ate ege cag ccc cca ggg aag ggg etg gag tgg att ggg gaa ate aat cat agt gga age acc aac tac aac ccg tcc etc aag agt cga gtc acc ata tea gta gac acg tcc aag aag cag ttc tcc etg aag etg age tet gtg acc gcc geg gac acg get gtg tat tat tgt geg aga ggc ccc egg ggc atg tat age age teg tcc ggg gac tac tgg ggc cag gga acc etg gtc acc gtc tcc tea |
| 190 | AT12-020 | Тяжелая цепь | gag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc etg gtc aag cct ggg ggg tcc etg aga etc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt acc tat age atg aac tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg etg gag tgg gtc tea tcc att agt agt agt agt ggt tac ata tac tac gca gac tea gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aac gcc aag aac tea etg tat etg caa atg aac age etg aga gcc gag gac acg get gtg tat tac tgt geg aga gat ggg act ttc tcc tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea |
| 191 | AT13-033 | Тяжелая цепь | cag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg tcc etg aga etc tcc tgt gca gtc tet gga etc agt ttc agg aat tat ggc atg cac tgg gtc ege cag get ccc ggc aag ggg etg gag tgg gtg gca gtc att teg cat gat gga agt aag аса tac tat gga cac tcc gtg aag ggc cga ttc acc ata tcc aga gac aaa tcc aag act atg ttg ttt etc caa atg aac age etg aga cct gag gac acg get gtt tat tac tgt geg aaa gcc ggg ttg aac tac tat gga aac eta tta tea aac tac ttc tac tac gga atg gac gtc tgg ggc caa ggg асе аса gtc acc gtc teg tea |
| 192 | AT13-034 | Тяжелая цепь | cag gtg cac etg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg acg tcc etg aga etc tcc tgt gca geg tet gaa ttc acc ttc agt tcc cat gcc ata cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg etg gag tgg gtg gca ett ata tgg tat gat gga agt aat aat tat tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac agt tcc aag aac acg gtg cat etg caa atg aac age etg aga gtc gag gac acg get gtg tat tac tgt geg aga gat ggt tgt act ggt ggt age tgc tgc tat ttt gac aac tgg ggc cag gga acc eta gtc acc gtc tcc teg |
| 193 | AT13-035 | Тяжелая цепь | cag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg tcc etg aga etc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt age tat ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg etg gag tgg gtg gca gtt ata tea tat gat gga agt aat aaa tac tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac acg etg tat etg caa atg aac age etg aga get gag gac acg get gtg tat tac tgt geg aaa gac teg tat tac tat ggt teg ggg aga cga tgg ggc tac tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc etg gtc acc gtc tcc tea |
| 194 | AT13-036 | Тяжелая цепь | gag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc etg gtc aag cct ggg ggg tcc etg aga etc tcc tgt gca gcc tet gga ttc acc ttc agt agt tat age atg aac tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg etg gag tgg gtc tea tcc att agt agt agt agt act tac ata tac tac gca gac tea gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aac gcc agg aac tea etg tat etg caa atg aac age etg aga gcc gag gac acg get gtg tat tat tgt geg aga agg agg gag gtc ggt aga gat ggc tac agt ttg tac ccc egg ggg tac cac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tea |
| 195 | AT13-037 | Тяжелая цепь | cag gtg cag etg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg tcc etg aga etc tcc tgt gca geg tet gga ttc acc ttc agt acc tat ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg ett gag tgg gtg gca gtt ata tgg tat gat gga agt aat аса tac tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac аса etg tat etg caa ata aag age etg aga gcc gag gac acg get gtc tat tac tgt geg aga ggc cgt gga tat agt gcc caa ggg aat egg aat agg get tac tac ttt gac tac tgg ggc cag gga acc etg gtc acc gtc tcc tea |
| 196 | AT12-023 | Легкая цепь | tet tet gag etg act cag gac cct get gtg tet gtg gcc ttg gga cag аса gtc agg ate аса tgc caa gga gac ttc etc aga age tat tat gca age tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ett gtc ate ttt ggt aaa aac aag egg ccc tea ggg ate cca gac cga ttc tet ggc tcc age tea gga aac аса get tcc ttg acc ate act ggg get cag geg gaa gat gag get gac tat tac tgt aac tcc egg gac ege agt ggt aac cac etg gtg ttc ggc gga ggg acc aag etg acc gtc eta |
| 197 | AT12-025 | Легкая цепь | gac ate cag atg acc cag tet cca tcc tcc etg tet gca tet gta gga gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag age att age agg tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag etc etg ate tat get gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc agt gga tet ggg аса gat ttc act etc acc ate age agt etg caa cct gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct ege act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa |
| 198 | AT 13-024 | Легкая цепь | gac ate cag atg acc cag tet cct tcc acc etg tet gca tet gta gga gac aga gtc acc ate act tgc egg gcc agt cag agt att agt age tgg ttg gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag etc etg ate tat aag geg tet agt tta gaa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc act gga tet ggg аса gaa ttc act etc acc ate age age etg cag cct gat gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aat act tac ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag etg gag ate aaa |
- 61 043009
| 199 | АТ12-019 | Легкая цепь | gcc ate egg ttg ace cag tet cca tec tea gtc tet gca tet аса gga gac aga gtc ace ate act tgt egg geg agt cag get ttt age agt tat tta gtc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aac etc etg ate tac get аса tec act ttg caa ggt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc agt gga tet ggg аса gat ttc act etc ace ate age aac etg cag tet gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag tat tat agt tac cct ccg act ttt ggc cag ggg acc aag ttg gag ate aaa |
| 200 | АТ 13-022 | Легкая цепь | tec tat gag etg act cag cca ccc tea gtg tec gtg tec cca gga cag аса gcc age ate acc tgc tet gga gat aaa ttg ggg gat aaa tat get tgc tgg tat cag cag aag cca ggc cag tec cct gtg etg gtc ate tat caa gat age aag egg ccc tea ggg ate cct gag ega ttc tet ggc tec aac tet ggg aac аса gcc act etg acc ate age ggg acc cag get atg gat gag get gac tat tac tgt cag geg tgg gac age age act gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag etg acc gtc eta |
| 201 | АТ 13-023 | Легкая цепь | gac ate cag atg acc cag tet cca tec tec etg tet gca tet gta gga gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag ggc att aga aat gtt tta ggc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag tgc etg ate tat get gca tec agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc agt gga tet ggg аса gaa ttc act etc аса ate age age etg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt eta cag cat aat agt cac ccc egg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa |
| 202 | АТ13-031 | Легкая цепь | gac ate cag atg acc cag tet cca tec tec etg tet gca tet gta gga gac aga gtc acc ate act tgc egg gca agt cag ggc att aga aat gat tta ggc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ege etg ate tat get gca gtc agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc agt gga tet ggg аса gaa ttc act etc аса ate age age etg cag cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt eta cag cat aat agt tac cct egg act ttt ggc cag ggg acc aag etg gag ate aaa |
| 203 | АТ12-020 | Легкая цепь | gcc ate egg atg acc cag tet cca tec tea ttc tet gca tet аса gga gac aga gtc acc ate act tgt egg geg agt cag gat att age agt tet tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag etc etg ate tat get gca tec act ttg caa agt gga gtc cca tea agg ttc age ggc agt gga tet ggg аса gac ttc act etc acc ate age tgc etg cag tet gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag tat tat agt tac cct ccg acg ttc ggc caa ggg acc agg ttg gaa ate aaa |
| 204 | АТ13-033 | Легкая цепь | cag tet gcc etg act cag cct ccc tec geg tec ggg tet cct ggt cag tea gtc acc ate tec tgt act ggg acc age agt gac att ggt ggt tat aac tat gtc tec tgg tac caa cac cac cca ggc aaa gcc ccc aaa ttg atg att tat gag gtc act aag egg ccc tea ggg gtc cct gat cgt ttc tet ggc tec aag tet ggc aac acg gcc tec etg acc gtc tet gga etc cag get gag gat gag get cat tat tac tgc age tea tat gca ggc age aac gat ttg eta ttc ggc gga ggg acc aag etg acc gtc etg |
| 205 | АТ13-034 | Легкая цепь | gaa gta gtg atg acg cag tet cca gcc acc etg tet gtg tet cca ggg gaa aga gcc acc etc tec tgc agg gcc agt cag age att age aac aac tta ggc tgg tat cag cag aaa cct ggc cag get ccc agg etc etc ate tac ggt gca tec acc agg gcc act ggt ate cca ggc agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg аса gag ttc act etc acc ate tac age etg cag tet gag gat ttt gca gtt tat tac tgt caa caa tat aat aac tgg cct egg etc act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa |
| 206 | АТ13-035 | Легкая цепь | tet tet gag etg act cag gac cct get gtg tet gtg gcc ttg gga cag аса gtc agg ate аса tgc caa gga gac age etc aga age tat tat gca age tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ett gtc ate tat ggt aaa aac aac egg ccc tea ggg ate cca gac ega ttc tet ggc tec age tea gga aac аса get tec ttg acc ate act ggg get cag geg gaa gat gag get gac tat tac tgt aac tec egg gac age agt ggt aac cat gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag etg acc gtc eta |
| 207 | АТ13-036 | Легкая цепь | cag tet gcc etg act cag cct gcc tec gtg tet ggg tet cct aga cag teg ate acc ate tec tgc act gga acc age agt gac gtt ggt ggt tat aac tat gtc tec tgg tac caa caa etc cca ggc aaa gcc ccc aaa etc atg att tat gat gtc aat gat egg ccc tea ggg gtt tet att ege ttc tet ggc tec aag tet ggc aac acg gcc tec etg acc ate tet ggg etc cag get gag gac gag get gat tat tac tgc age tea tat аса aga age aac act gtg ata ttc ggc gga ggg acc aaa etg acc gtc eta |
| 208 | АТ13-037 | Легкая цепь | gaa ata gtg atg acg cag tet cca gcc acc etg tet gtg tet cca ggg gaa agg gtc ate etc tec tgc agg gcc agt cag agt gtt age age aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag cct ccc agg etc etc ate tat ggt gca ttc acg agg gtc act ggt gtc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg аса gaa ttc act etc acc ate age age etg cag tet gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tac aat gac egg ccc ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag etg gag ate aaa |
Таблица IB
Предпочтительные направленные против ОМЛ антитела согласно настоящему изобретению ________________ (нумерация CDR согласно Kabat и др. 1991)_____________________
| SEQ ID NO. | Антитело | Название | Последовательность |
| 209 | AT14-013 | CDR1 тяжелой цепи | SPNWWT |
| 210 | AT14-014 | CDR1 тяжелой цепи | DAWMS |
| 211 | AT14-015 | CDR1 тяжелой цепи | DFAMS |
| 212 | AT14-016 | CDR1 тяжелой цепи | SYAMT |
| 213 | AT14-013 | CDR2 тяжелой цепи | EIYYGGRVSYNSALRS |
| 214 | AT14-014 | CDR2 тяжелой цепи | HINTKVDGGTTEYAAPVKG |
| 215 | AT14-015 | CDR2 тяжелой цепи | FIRTKANDGTTEYAASVKG |
| 216 | AT14-016 | CDR2 тяжелой цепи | SISGSGGSTYYADSVRG |
-62043009
| 217 | AT14-013 | CDR3 тяжелой цепи | AGQKNIGCGYSSCFISWFDT |
| 218 | AT14-014 | CDR3 тяжелой цепи | TTEAIYDSSGYFHDY |
| 219 | AT14-015 | CDR3 тяжелой цепи | ASDPFMTTDYYYYYMDV |
| 220 | AT14-016 | CDR3 тяжелой цепи | AKGYVGCSGGNCYSGGAFDI |
| 221 | AT14-013 | CDR1 легкой цепи | KSSQTILQRSNHLNYLA |
| 222 | AT14-014 | CDR1 легкой цепи | KSSRSVLYSSNNKNYLA |
| 223 | AT14-015 | CDR1 легкой цепи | TGTSSDVGGYNSVS |
| 224 | AT14-016 | CDR1 легкой цепи | GGNNIGSESVH |
| 225 | AT14-013 | CDR2 легкой цепи | WASTRES |
| 226 | AT14-014 | CDR2 легкой цепи | WASIRES |
| 227 | AT14-015 | CDR2 легкой цепи | EVYKRPL |
| 228 | AT14-016 | CDR2 легкой цепи | YDTDRPS |
| 229 | AT14-013 | CDR3 легкой цепи | HQYYTTPQT |
| 230 | AT14-014 | CDR3 легкой цепи | QQYSRPPT |
| 231 | AT14-015 | CDR3 легкой цепи | SSYGGTVLF |
| 232 | AT14-016 | CDR3 легкой цепи | QVWDNTSDHPVVF |
| 233 | AT14-013 | Тяжелая цепь | QGRLQESGPGLVKPSETLTLTCAVSGGSSVSSPNWWTWVRQAPGKGLEWIGEIYYGGRVSYNSALRSRVTISSDRS KEEFSLKLRSVTAADTAIYYCAGQKNIGCGYSSCFISWFDTWGQGIAVTVSS |
| 234 | AT14-014 | Тяжелая цепь | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMSWVRQAPGKGLEWVGHINTKVDGGTTEYAAPVKGRFTISRD DSKNSLYLHMDSLKTEDTAVYYCTTEAIYDSSGYFHDYWGQGSLVTVSS |
| 235 | AT14-015 | Тяжелая цепь | EVQLVESGGGLAQPGRSLRLSCTASGFRFGDFAMSWVRQAPGKGLEWVGFIRTKANDGTTEYAASVKGRFIISRDD SKSIAYLQMNSLKTEDTAVYYCASDPFMTTDYYYYYMDVWGKGTTVTVSS |
| 236 | AT14-016 | Тяжелая цепь | EVQVLESGGDSVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLKWVSSISGSGGSTYYADSVRGRFTISRDNSK NTLYVQMNSLRAEDTAVYYCAKGYVGCSGGNCYSGGAFDIWGQGTVVTVSS |
| 237 | AT14-013 | Легкая цепь | DIVMTQSPDSLAVSLGERATIACKSSQTILQRSNHLNYLAWYQQKPGQPPKVLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTINSLQAEDVAVYYCHQYYTTPQTFGQGTKVEIK |
| 238 | AT14-014 | Легкая цепь | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSRSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDF TLTINSLQAEDVAVYYCQQYSRPPTFGQGTKVEIK |
- 63 043009
| 239 | AT14-015 | Легкая цепь | QSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNSVSWYQHHPGKAPKLMIYEVYKRPLGVPDRFSGSKSGNTASLTV SGLQAEDEAYYYCSSYGGTVLFGGGTKLTVL |
| 240 | AT14-016 | Легкая цепь | SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSESVHWYQQKPGQAPVVVIYYDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVE AGDEADYYCQVWDNTSDHPVVFGGGTKLTVL |
| 241 | AT14-013 | CDR1 тяжелой цепи | agt cct aac tgg tgg act |
| 242 | AT14-014 | CDR1 тяжелой цепи | gac gcc tgg atg age |
| 243 | AT14-015 | CDR1 тяжелой цепи | gat ttt get atg agt |
| 244 | AT14-016 | CDR1 тяжелой цепи | age tat gcc atg acc |
| 245 | AT14-013 | CDR2 тяжелой цепи | gaa ate tat tat ggt ggg aga gtg age tac aac teg gcc etc agg agt |
| 246 | AT14-014 | CDR2 тяжелой цепи | cat att aac acc aaa gtt gat ggt ggg аса аса gag tac get gca ccc gtg aaa ggc |
| 247 | AT14-015 | CDR2 тяжелой цепи | ttc att aga acc aaa get aat gat ggg аса аса gaa tac gcc geg tet gtg aaa ggc |
| 248 | AT14-016 | CDR2 тяжелой цепи | agt att agt ggt agt ggt ggt age аса tac tac gca gac tcc gtg agg ggc |
| 249 | AT14-013 | CDR3 тяжелой цепи | geg ggt caa aaa aat att ggc tgt ggt tac age agt tgc ttt ate agt tgg ttc gac acc |
| 250 | AT14-014 | CDR3 тяжелой цепи | acc аса gag geg ata tat gat agt agt ggt tat ttc cat gac tat |
| 251 | AT14-015 | CDR3 тяжелой цепи | get age gat ccc ttc atg act аса gac tat tac tac tac tac atg gac gtc |
| 252 | AT14-016 | CDR3 тяжелой цепи | geg aaa gga tat gtg ggg tgt agt ggt ggg aac tgc tac teg ggg ggt get ttt gat ate |
| 253 | AT14-013 | CDR1 легкой цепи | aag tcc age cag act att tta caa agg tec aac cat ttg aac tac tta get |
| 254 | AT14-014 | CDR1 легкой цепи | aag tcc age egg agt gtt tta tac age tcc aac aat aag aac tac tta get |
| 255 | AT14-015 | CDR1 легкой цепи | act ggg acc age agt gac gtt ggt ggt tat aac tet gtc tcc |
| 256 | AT14-016 | CDR1 легкой цепи | ggg ggg aac aac att gga agt gaa agt gtt cac |
| 257 | AT14-013 | CDR2 легкой цепи | tgg gca tet acc egg gaa tcc |
| 258 | AT14-014 | CDR2 легкой цепи | tgg gca tet ate egg gaa tcc |
| 259 | AT14-015 | CDR2 легкой цепи | gag gtc tat aag egg ccc tta |
| 260 | AT14-016 | CDR2 легкой цепи | tat gat acc gac egg ccc tea |
- 64 043009
| 261 | АТ14-013 | CDR3 легкой цепи | сас саа tat tat act act ccg cag act |
| 262 | АТ14-014 | CDR3 легкой цепи | cag caa tat tct cgt cct ccg acg |
| 263 | АТ14-015 | CDR3 легкой цепи | age tea tat gga ggc ace gtg eta ttc |
| 264 | АТ14-016 | CDR3 легкой цепи | cag gtg tgg gat aac act agt gat cat cct gtg gta ttc |
| 265 | АТ14-013 | Тяжелая цепь | cag ggg ega etg cag gag teg ggc cca gga etg gtg aag cct teg gag ace etg ace etc acg tgc get gtg tec ggt ggc tec tec gtc age agt cct aac tgg tgg act tgg gtc ege cag gee ccc ggg aag ggg etg gag tgg att gga gaa ate tat tat ggt ggg aga gtg age tac aac teg gee etc agg agt ega gtc ace att tea tea gac agg tec aaa gag gag ttc tec etg aaa etg agg tct gtg ace gee geg gac acg gee ata tat tat tgt geg ggt caa aaa aat att ggc tgt ggt tac age agt tgc ttt ate agt tgg ttc gac ace tgg gga cag gga att geg gtc ace gtc tec tea |
| 266 | АТ14-014 | Тяжелая цепь | gag gtg cag etg gtg gag tct ggg gga ggt ttg gta aag cct ggg ggg tec ett aga etc tec tgt gca gee tct gga ttc act ttc agt gac gee tgg atg age tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg etg gag tgg gtt ggc cat att aac ace aaa gtt gat ggt ggg аса аса gag tac get gca ccc gtg aaa ggc aga ttc ace ate tea aga gat gat tea aaa aat teg etg tat etg cac atg gac age etg aaa ace gag gac аса gee gtg tat tac tgt асе аса gag geg ata tat gat agt agt ggt tat ttc cat gac tat tgg ggc cag gga tec etg gtc ace gtc tec tea |
| 267 | АТ14-015 | Тяжелая цепь | gag gtg cag etg gtg gag teg ggg gga ggc ttg gca cag cca ggg egg tec etg aga etc tec tgt аса get tct gga ttc agg ttt ggt gat ttt get atg agt tgg gtc ege cag get cca ggg aag gga etg gag tgg gta ggt ttc att aga ace aaa get aat gat ggg аса аса gaa tac gee geg tct gtg aaa ggc aga ttc ate ate tea aga gat gat tec aaa agt ate gee tat etg caa atg aac age etg aaa ace gag gac аса gee gtt tat tac tgt get age gat ccc ttc atg act аса gac tat tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg ace acg gtc ace gtc tec tea |
| 268 | АТ14-016 | Тяжелая цепь | gag gtg caa gtg ttg gag tct ggg gga gac teg gta cag cct ggg ggg tec etg aga etc tec tgt gca gee tct gga ttc ace ttt age age tat gee atg ace tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg etg aaa tgg gtc tea agt att agt ggt agt ggt ggt age аса tac tac gca gac tec gtg agg ggc egg ttc ace ate tec aga gac aat tec aag aac acg etg tat gtg cag atg aac age etg aga gee gag gac acg gee gta tat tac tgt geg aaa gga tat gtg ggg tgt agt ggt ggg aac tgc tac teg ggg ggt get ttt gat ate tgg ggc caa ggg аса gtg gtc ace gtc tct tea |
| 269 | АТ14-013 | Легкая цепь | gac ate gtg atg ace cag tct cca gac tec etg get gtg tct etg ggc gag agg gee ace ate gee tgc aag tec age cag act att tta caa agg tec aac cat ttg aac tac tta get tgg tac cag cag aaa cca gga cag cct cct aaa gtg etc att tat tgg gca tct ace egg gaa tec ggg gtc cct gac ega ttc agt ggc age ggg tct ggg аса gat ttc act etc ace ate aac age etg cag get gag gat gtg gca gtt tat tac tgt cac caa tat tat act act ccg cag act ttt ggc cag ggg ace aag gtg gag ate aaa |
| 270 | АТ14-014 | Легкая цепь | gac ate gtg atg ace cag tct cca gac tec etg get gtg tct etg ggc gag agg gee ace ate aac tgc aag tec age egg agt gtt tta tac age tec aac aat aag aac tac tta get tgg tac cag cag aaa cca gga cag cct cct aag etg etc att tac tgg gca tct ate egg gaa tec ggg gtc cct gac ega ttc agt ggc age ggg tct ggg аса gat ttc act etc ace ate aac age etg cag get gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa tat tct cgt cct ccg acg ttc ggc caa ggg ace aag gtg gaa ate aaa |
| 271 | АТ14-015 | Легкая цепь | cag tct gee etg act cag cct ccc tec geg tec ggg tct cct gga cag tea gtc ace ate tec tgc act ggg ace age agt gac gtt ggt ggt tat aac tct gtc tec tgg tac caa cat cac cca ggc aaa gee ccc aaa etc atg att tat gag gtc tat aag egg ccc tta ggg gtc cct gat ege ttc tct ggc tec aag tct ggc aac acg gee tec etg ace gtc tct ggg etc cag get gag gat gag get tat tat tac tgc age tea tat gga ggc ace gtg eta ttc ggc gga ggg ace aag etg ace gtc eta |
| 272 | АТ14-016 | Легкая цепь | tec tat gtg etg act cag cca ccc tea gtg tea gtg gee cca gga aag acg gee egg att ace tgt ggg ggg aac aac att gga agt gaa agt gtt cac tgg tac cag cag aag cca ggc cag gee cct gtg gtg gtc ate tat tat gat ace gac egg ccc tea ggg ate cct gag ege ttc tct ggc tec aac tct ggg aac acg gee ace etg ace ate age agg gtc gaa gee ggg gat gag gee gac tat tac tgt cag gtg tgg gat aac act agt gat cat cct gtg gta ttc ggc gga ggg ace aag etg ace gtc eta |
Таблица 2
МАТ специфичны к ОМЛ
| MAT | Линии клеток | Первичные клетки | ||||||||||||
| Название | Класс Ig | Мел1 | М ел 2 | Мел^ | BJ | ФБ | Киш1 | Киш^ | КишЗ | Vero | HUVEC | HepG2 | МКПК | км |
| AT12-019 | IgGl к | . | - | - | - | - | - | . | - | - | ||||
| AT 13-023 AT13-O31 | IgGl к IgGl к | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AT12-020 | IgG3 к | . | - | - | - | - | - | . | - | - | ||||
| AT12-023 | IgG3 λ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AT12-025 | IgG3 к | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| AT 13-022 | IgG3 λ | . | - | - | - | - | - | . | - | - | ||||
| AT 13-024 | IgG3 к | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
Мел1 - меланома 126.2;
Мел2 - меланома BLM;
Мел3 - меланома WBO;
BJ - линия клеток фибробластов;
ФБ - первичные фибробласты (кожа);
Киш'Со1о205;
Киш2-Сасо-2;
Киш3-НТ29;
Vero - клетки не принадлежащей человеку почки;
МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови;
КМ - клетки костного мозга.
- 65 043009
Таблица 3
Обзор ОМЛ-специфических МАТ, полученных из пациента с эффективным ответом ТПЛ (донора 59)
| МАТ | ОМЛ | Первичная ОМЛ* | ||||||||
| Название | Класс 1g | CD27 | СГМ Vh/Vl | ТНР1 | ММ6 | МО | Ml | Ml | Ml | М4 |
| АТ 12-019 | IgGl к | + | 10/9 | ++ | + | + | + | ++ | +/- | - |
| АТ13-023 | IgGl к | + | 8/4 | ++ | ++ | + | ||||
| АТ13-031 | IgGl к | + | 1/1 | ++ | + | - | + | - | - | +/- |
| АТ 12-020 | IgG3 к | + | 4/2 | ++ | ||||||
| АТ 12-023 | IgG3 λ | - | Зародышевая/6 | +++ | ++ | + | ++ | ++ | +/- | ++ |
| АТ 12-025 | IgG3 к | - | 1/1 | ++ | ++ | - | +/- | + | - | - |
| АТ13-022 | IgG3 λ | + | Зародышевые | ++ | ++ | ++ | ||||
| АТ 13-024 | IgG3 к | - | 6/3 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
ММ6 - МопоМасб;
МО - донор 77;
Ml-доноры 69, 79, 86 соответственно;
М4-донор 78;
СГМ - количество соматических гипермутаций;
* ОМЛ согласно ФАБ-классификации.
Таблица 4
Некоторые МАТ связываются с другими гематологическими опухолями
| MAT | Линии клеток других гематологических опухолей | Первичные опухоли | |||||
| Название | Класс Ig | OCI-Lyl | OCI-Ly7 | U266 | NCI-H929 | НХЛ п.о. | ОЛЛ п.о. |
| АТ12-019 | IgGl к | + | - | - | - | - | - |
| АТ13-023 | IgGl к | ||||||
| АТ13-031 | IgGl к | ++ | + | - | +/- | ++ | - |
| AT 12-020 | IgG3 к | ||||||
| AT 12-023 | IgG3 λ | - | - | +/- | - | ++ | - |
| AT12-025 | IgG3 к | - | - | + | - | - | - |
| AT13-022 | IgG3 λ | ||||||
| AT13-024 | IgG3 к | ++ | + | - | - | - | - |
OCI-Lyl и ОС1-Гу7-линии клеток диффузной В-крупноклеточной лимфомы; U266 и КС1-Н929-линии клеток множественной миеломы;
НХЛ и.о. - клетки В-неходжкинской лимфомы, свежевыделенные из пациента, которому впервые поставили данный диагноз;
ОЛЛ п.о. - В-клетки острой лимфатической лейкемии, свежевыделенные из пациента, которому впервые поставили данный диагноз.
Таблица 5
Некоторые МАТ проявляют активность in vitro
| МАТ | Уничтожение | ||||
| Название | Класс Ig | CD27 | СГМ Vh/Vl | ТНР-1 | МО/5 |
| АТ 12-019 | IgGl к | + | 10/9 | нет | нет |
| АТ 13-023 | IgGl к | + | 8/4 | ||
| АТ13-031 | IgGl к | + | 1/1 | ||
| АТ 12-020 | IgG3 к | + | 4/2 | ||
| АТ 12-023 | IgG3 λ | - | Зародышевая/6 | да | |
| АТ 12-025 | IgG3K | - | 1/1 | да | да |
| АТ 13-022 | IgG3 λ | + | Зародышевые | ||
| АТ 13-024 | IgG3 к | - | 6/3 | нет | да |
Активность in vitro антител АТ13-023, АТ13-031, АТ12-020 и АТ13-022 пока еще не исследовали.
Таблица 6
2ой пациент с ОМЛ, проявивший ответ ТПЛ (донор 58)
| МАТ | ОМЛ | Нет связывания с | |||||||
| Клон | CD27 | Класс Ig | СГМ Vh/Vl | ТНР-1 | ММ6 | МКПК | Сасо | НТ-29 | HepG2 |
| АТ13-033 | + | IgG3 λ | 18/5 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ13-034 | + | IgG3 к | 14/6 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ13-035 | - | IgG3 λ | 0/0 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ13-036 | - | IgG3 λ | 4/9 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ13-037 | + | IgG3 к | 4/8 | ++ | ++ | - | - | - | - |
СГМ - количество соматических гипермутаций.
-66043009
Таблица 7
Обзор ОМЛ-специфических МАТ, полученных из Зег0 пациента с эффективным ответом ТПЛ (донор 101)
| МАТ | ОМЛ | Не] | рвичная ОМЛ* | ||||||
| Название | Класс 1g | CD27 | СГМ Vh/Vl | ТНР-1 | Molml3 | МО | М4 | М51 | М52 |
| АТ14-013 | IgGl к | + | 26/11 | +++ | +++ | +++ | ++ | +/- | + |
| АТ14-014 | IgG3 к | + | 9/6 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ14-015 | IgG3 λ | + | 9/9 | ++ | - | - | + | - | - |
| АТ14-016 | IgG3 λ | + | 9/5 | ++ | ++ | - | + | - | - |
Ml - донор 77;
М4 - донор BL-046;
М51 - донор BL-034,
М52 - донор BL-038 *ОМЛ согласно ФАБ-классификации;
СГМ - количество соматических гипермутаций.
Таблица 8
МАТ специфичны к ОМЛ (донор 101)
| МАТ | Линии клеток | МКПК | Первичные клетки | |||||||
| Название | Класс 1g | ФБ | Киш | Печ1 | Печ2 | CD3 | CD14 | CD19 | CD56 | Эмбриональные клетки печени |
| АТ14-013 | IgGl к | +/- | +/- | - | - | |||||
| АТ14-014 | IgG3 к | - | - | |||||||
| АТ14-015 | IgG3 λ | - | - | |||||||
| АТ14-016 | IgG3 λ | - | - |
FB: первичный фибробласты (кожа);
Col: Сасо-2;
Ыу^линия клеток печени Huh7;
Liv линия клеток печени HepG2;
МКПК - мононуклеарные клетки периферической крови.
Таблица 9А
Обзор ОМЛ-специфических МАТ, полученных из 20Г0 пациента с эффективным ответом ТПЛ (донор 58)
| МАТ | ОМЛ | Первичная ОМЛ* | |||||||
| Клон | CD27 | Класс 1g | СГМ Vh/Vl | ТНР-1 | ММ6 | МО | МО | Ml | М4 |
| АТ13-033 | + | IgG3 λ | 18/5 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ 13-034 | + | IgG3 к | 14/6 | ++ | ++ | +/- | - | - | - |
| АТ13-035 | - | IgG3 λ | 0/0 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ13-036 | - | IgG3 λ | 4/9 | ++ | ++ | - | - | - | - |
| АТ13-037 | + | IgG3 к | 4/8 | ++ | ++ | - | - | - | - |
ММ6 - МопоМасб;
МО - донор 77, BL-030, соответственно;
Ml - донор 69;
М4 - донор 78;
* ОМЛ согласно ФАБ-классификации;
СГМ - количество соматических гипермутаций.
Таблица 9В
Некоторые МАТ проявляют активность in vitro (донор 59)
| МАТ | Уничтожение | ||||
| Название | Класс 1g | CD27 | СГМ Vh/Vl | ТНР-1 | Ml |
| АТ 12-019 | IgGl к | + | 10/9 | нет | нет |
| АТ 13-023 | IgGl к | + | 8/4 | нет | н/о |
| АТ13-031 | IgGl к | + | 1/1 | да* | н/о |
| АТ 12-020 | IgG3 к | + | 4/2 | н/о | н/о |
| АТ 12-023 | IgG3 λ | - | Зародышевая/6 | да | н/о |
| АТ 12-025 | IgG3 к | - | 1/1 | да | да |
| АТ 13-022 | IgG3 λ | + | Зародышевые | нет | н/о |
| АТ 13-024 | IgG3 к | - | 6/3 | нет | да |
* Только при 37°С; н/о=не определили.
-67043009
Таблица 10
Некоторые МАТ проявляют активность in vitro (донор 58)
| MAT | Уничтожение | |||
| Клон | CD27 | Класс Ig | СГМ Vh/Vl | THP-1 |
| AT13-033 | + | IgG3 λ | 18/5 | да |
| AT13-034 | + | IgG3 к | 14/6 | нет |
| AT13-035 | - | IgG3 λ | 0/0 | да |
| AT13-036 | - | IgG3 λ | 4/9 | да |
| AT13-037 | + | IgG3 к | 4/8 | да |
Библиографический указатель ссылочных материалов
Bakker АВ, van den Oudenrijn S, Bakker AQ, Feller N, van Meijer M, Bia JA, Jongeneelen MA, Visser TJ, Bijl N, Geuijen CA, Marissen WE, Radosevic K, Throsby M, Schuurhuis GJ, Ossenkoppele GJ, de Kruif J, Goudsmit J, Kruisbeek AM. 2004. C-type lectin-like molecule-1: a novel myeloid cell surface marker associated with acute myeloid leukemia. Cancer Res 64:8443-50.
Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan C. 1976. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-AmericanBritish (FAB) co-operative group. Br J Haematol 33:451-458.
Bhat NM, Bieber MM, Hsu FJ, Chapman CJ, Spellerberg M, Stevenson FK, Teng NNH. 1997. Rapid cytotoxicity of human В lymphocytes induced by VH4-34 (VH4.21) gene-encoded monoclonal antibodies. Clin Exp Immunol 108: 151-159
Biernacki MA, Marina O, Zhang W, Liu F, Bruns I, Cai A, Neuberg D, Canning CM, Alyea EP, Soiffer RJ, Brusic V, Ritz J, Wu CJ. 2010. Efficacious immune therapy in chronic myelogenous leukemia (CML) recognizes antigens that are expressed on CML progenitor cells. Cancer Research 70:906-915.
Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM, Lowman HB. 1999. Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen. J Mol Biol 293:865-881.
Diehl SA, Schmidlin H, Nagasawa M, van Haren SD, Kwakkenbos MJ, Yasuda E, Beaumont T, Scheeren FA, Spits H. 2008. STAT3-mediated up-regulation of BLIMP1 Is coordinated with BCL6 down-regulation to control human plasma cell differentiation. J Immunol 180:4805-4815.
Drexler HG, Minowada J. 1998. History and classification of human leukemialymphoma cell lines. Leuk Lymphoma 31:305-316.
- 68 043009
Hernandez AM, Rodriguez N, Gonzalez JE, et al. Anti-NeuGcGM3 Antibodies, Actively Elicited by Idiotypic Vaccination in Nonsmall Cell Lung Cancer Patients, Induce Tumor Cell Death by an Oncosis-Like Mechanism. J Immunol 2011;186(6):3735-3744.
Hugh J. M et al, 2004 Methods in Molecular biology Vol. 282
Kattah NH, Kattah MG, Utz PJ. The Ul-snRNP complex: structural properties relating to autoimmune pathogenesis in rheumatic diseases. Immunol Reviews. 2010;233(l):126-145.
Керр O, Galluzzi L, Lipinski M, Yuan J, Kroemer G. Cell death assays for drug discovery. Nat Rev Drug Discov 2011;l-17.
Kwakkenbos MJ, Diehl SA, Yasuda E, Bakker AQ, Van Geelen CMM, Lukens MV, Van Bleek GM, Widjojoatmodjo MN, Bogers WMJM, Mei H, Radbruch A, Scheeren FA, Spits H, Beaumont T. 2010. Generation of stable monoclonal antibodyproducing В cell receptor-positive human memory В cells by genetic programming. Nat Med 16:123-128.
Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, Pang WW, Jaiswal S, Gibbs KD, Van Rooijen N, Weissman IL. 2009. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell 138:286-299
Schlenk RF, Dohner K, Krauter J, Frohling S, Corbacioglu A, Bullinger L, Habdank M, Spath D, Morgan M, Benner A, Schlegelberger B, Heil G, Ganser A, Dohner H, German-Austrian Acute Myeloid Leukemia Study Group. 2008. Mutations and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. N Engl J Med 358:1909-1918.
Schmid C, Labop in M, Nagler A, Bornhauser M, Finke J, Fassas A, Volin L, Giirman G, Maertens J, Bordigoni P, Holler E, Ehninger G, Polge E, Gorin N-C, Kolb H-J, Rocha V, EBMT Acute Leukemia Working Party. Donor lymphocyte infusion in the treatment of first hematological relapse after allogeneic stem-cell
-
Claims (36)
- transplantation in adults with acute myeloid leukemia: a retrospective risk factors analysis and comparison with other strategies by the EBMT Acute Leukemia Working Party. Journal of Clinical Oncology 25:4938-4945.Schmiedel BJ, Werner A, Steinbacher J, et al. Generation and Preclinical Characterization of a Fc-optimized GITR-Ig Fusion Protein for Induction of NK Cell Reactivity Against Leukemia. Mol Ther. 2013;21(4):877-886.Singh R, Cadeddu R-P, Frobel J, et al. The non-steroidal anti-inflammatory drugs Sulindac sulfide and Diclofenac induce apoptosis and differentiation in human acute myeloid leukemia cells through an AP-1 dependent pathway. Apoptosis. 2011;16(9):889-901.Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, Kobayashi Y, Konno K, Tada K. 1988. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer 26:171-176.Walter RB, Appelbaum FR, Estey EH, Bernstein ID. Acute myeloid leukemia stem cells and CD33-targeted immunotherapy. 2012. Blood 119: 6198-208.Willingham SB, Volkmer JP, Gentles AJ, Sahoo D, Dalerba P, Mitra SS, Wang J, Contreras-Trujillo H, Martin R, Cohen JD, Lovelace P, Scheeren FA, Chao MP, Weiskopf K, Tang C, Volkmer AK, Naik TJ, Storm TA, Mosley AR, Edris B, Schmid SM, Sun CK, Chua MS, Murillo O, Rajendran P, Cha AC, Chin RK, Kim D, Adorno M, Raveh T, Tseng D, Jaiswal S, Enger P0, Steinberg GK, Li G, So SK, Majeti R, Harsh GR, van de Rijn M, Teng NN, Sunwoo JB, Alizadeh AA, Clarke MF, Weissman IL. 2012. The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPa) interaction is a therapeutic target for human solid tumors. Proc Natl Acad Sci USA 109:66627.Wu CJ, Yang XF, McLaughlin S, Neuberg D, Canning C, Stein B, Alyea EP, Soiffer RJ, Dranoff G, Ritz J. 2000. Detection of a potent humoral response associated with immune-induced remission of chronic myelogenous leukemia. J Clin Invest 106:705-714.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Выделенное антитело человека, которое способно связываться с клетками острой миелоидной лейкемии (ОМЛ) и которое содержит:последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 209;последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 213;последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 217;последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 221;последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 225; и последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 229, или его антигенсвязывающий фрагмент.
- 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно п.1, отличающееся тем, что указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент принадлежит к изотипу IgG.
- 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент представляет собой однодоменное антитело, одноцепочечное антитело, нанотело, унитело, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), фрагмент Fab или фрагмент F(ab')2.- 70 043009
- 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из пп.1-3, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 233, и последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 237.
- 5. Конъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, который связан с детектируемой меткой.
- 6. Конъюгат, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, который связан с химиотерапевтическим средством, токсичной группой, иммуномодулирующей молекулой или радиоактивным соединением.
- 7. Мультиспецифическое антитело, содержащее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4 и CD3-специфическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
- 8. Мультиспецифическое антитело по п.7, которое представляет собой биспецифическое антитело.
- 9. Т-клетка с химерным антигенным рецептором (CAR), которая способна связываться с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии (ОМЛ), причем указанная Т-клетка содержит:последовательность CDR1 тяжелой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 209;последовательность CDR2 тяжелой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 213;последовательность CDR3 тяжелой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 217;последовательность CDR1 легкой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 221;последовательность CDR2 легкой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 225; и последовательность CDR3 легкой цепи, содержащую последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 229.
- 10. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4.
- 11. Молекула нуклеиновой кислоты согласно п.10, содержащая последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 265.
- 12. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4.
- 13. Молекула нуклеиновой кислоты по п.12, содержащая последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 269.
- 14. Молекула нуклеиновой кислоты согласно любому из пп.10-13, которая содержит кДНК, пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК), закрытую нуклеиновую кислоту (ЗНК) или спираль ДНК/РНК.
- 15. Вектор для клонирования и/или экспрессии нуклеиновой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно любому из пп.10-14.
- 16. Выделенная клетка для получения рекомбинантным способом антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13 или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13.
- 17. Не являющееся человеком животное для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.12 или 13 или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.12 или 13.
- 18. Композиция для обнаружения ОМЛ, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из пп.1-4 или молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13, или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.12 или 13, или клетку согласно п.16.
- 19. Композиция для лечения ОМЛ, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из пп.1-4 или молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.12 или 13, или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.12 или 13, или клетку согласно п.16.
- 20. Композиция согласно п.19, отличающаяся тем, что указанная композиция представляет собой фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
- 21. Композиция согласно любому из пп.18-20, которая содержит по меньшей мере два антитела или их антигенсвязывающих фрагмента согласно любому из пп.1-4.
- 22. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4 или конъюгата по п.5 или 6 для лечения или предупреждения миелопролиферативного расстройства.
- 23. Применение молекулы нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулы нуклеиновой ки- 71 043009 слоты согласно п.12 или 13 для лечения миелопролиферативного расстройства.
- 24. Применение вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты согласно п.12 или 13 для лечения миелопролиферативного расстройства.
- 25. Применение клетки согласно п.16 для лечения миелопролиферативного расстройства.
- 26. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4 или конъюгата по п.5 или 6 для диагностики миелопролиферативного расстройства.
- 27. Применение по любому из пп.22-26, где указанное миелопролиферативное расстройство представляет собой острую миелоидную лейкемию (ОМЛ).
- 28. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4 или конъюгата по п.5 или 6 для определения того, содержит ли образец миелопролиферативные клетки.
- 29. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.14, включающий предоставление клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13, или вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.10 или 11 и молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13, и обеспечение возможности трансляции указанной клеткой указанной молекулы нуклеиновой кислоты или вектора.
- 30. Способ по п.29, дополнительно включающий сбор, очистку и/или выделение указанного антитела, его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4.
- 31. Способ определения присутствия миелопролиферативных клеток в образце, включающий:приведение указанного образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно любому из пп.1-4 или конъюгатом по п.5 или 6, и обеспечение возможности связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата с миелопролиферативными клетками, если они присутствуют, и определение того, связаны или нет миелопролиферативные клетки или лимфопролиферативные клетки с указанным антителом или его фрагментом или конъюгатом, где связывание указывает на присутствие миелопролиферативных клеток в указанном образце.
- 32. Применение согласно п.28, отличающееся тем, что указанные миелопролиферативные клетки представляют собой клетки ОМЛ.
- 33. Способ по п.31, отличающийся тем, что указанные миелопролиферативные клетки представляют собой клетки ОМЛ.
- 34. Способ лечения миелопролиферативного расстройства, включающий введение нуждающемуся в этом индивиду терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из пп.1-4 или конъюгата по п.5 или 6.
- 35. Способ определения присутствия миелопролиферативного расстройства у индивида, включающий:приведение образца из указанного индивида в контакт с антителом или его антигесвязывающим фрагментом согласно любому из пп.1-4 или конъюгатом по п.5 или 6, и обеспечение возможности связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата с миелопролиферативными клетками, если они присутствуют, и определение того, связаны или нет миелопролиферативные клетки с указанным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или конъюгатом, где связывание указывает на присутствие миелопролиферативного расстройства у указанного индивида.
- 36. Способ согласно п.34 или 35, отличающийся тем, что указанное миелопролиферативное расстройство представляет собой ОМЛ, и при этом указанные миелопролиферативные клетки представляют собой клетки ОМЛ.-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13197882.7 | 2013-12-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043009B1 true EA043009B1 (ru) | 2023-04-19 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6296796B2 (ja) | 新規モジュレーターと使用の方法 | |
| TW202043280A (zh) | 對受體酪胺酸激酶樣孤兒受體１（ｒｏｒ１）具專一性之抗體及嵌合抗原受體 | |
| KR20200080270A (ko) | 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체 | |
| US11629200B2 (en) | Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders | |
| TW201639887A (zh) | 抗－ｄｌｌ３嵌合抗原受體及其使用方法 | |
| JP6534074B2 (ja) | 抗体 | |
| JP2017535283A (ja) | 抗ｃｌｄｎキメラ抗原受容体および使用方法 | |
| JP2021130676A (ja) | 抗体 | |
| US20210315985A1 (en) | Chimeric antigen receptor (car) that targets chemokine receptor ccr4 and its use | |
| CN112566937A (zh) | 对cd3特异性的抗体及其用途 | |
| AU2021383901A1 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
| JP2022550364A (ja) | 新規抗ｐｄ－ｌ１／抗ｌａｇ－３二重特異性抗体およびその使用 | |
| EP4378953A1 (en) | Cd229 targeting moiety for the tratment of cd229 positive cancer | |
| EA043009B1 (ru) | Выделенное антитело человека, связывающееся с компонентом поверхности клеток острой миелоидной лейкемии, и его применение | |
| JP7384668B2 (ja) | 細胞傷害性ｔ細胞枯渇用組成物 | |
| NZ760009B2 (en) | Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders | |
| NZ760009A (en) | Means and methods for counteracting myeloproliferative or lymphoproliferative disorders |