SA516371011B1 - فيروسات غدية حالة للورم مُسَلَّحَة بجينات مختلفة التكوين - Google Patents

فيروسات غدية حالة للورم مُسَلَّحَة بجينات مختلفة التكوين Download PDF

Info

Publication number
SA516371011B1
SA516371011B1 SA516371011A SA516371011A SA516371011B1 SA 516371011 B1 SA516371011 B1 SA 516371011B1 SA 516371011 A SA516371011 A SA 516371011A SA 516371011 A SA516371011 A SA 516371011A SA 516371011 B1 SA516371011 B1 SA 516371011B1
Authority
SA
Saudi Arabia
Prior art keywords
sequence
antibody
virus
gene
rrr
Prior art date
Application number
SA516371011A
Other languages
English (en)
Inventor
كلير نويل براون أليس
روبيرت شامبيون براين
نيكولسون تمارا
ديفيد فيشر كيري
Original Assignee
بيسيوكساس ثيرابيوتكس ليميتد
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1318880.0A external-priority patent/GB201318880D0/en
Priority claimed from GB201318885A external-priority patent/GB201318885D0/en
Priority claimed from GBGB1322851.5A external-priority patent/GB201322851D0/en
Priority claimed from GB201401159A external-priority patent/GB201401159D0/en
Priority claimed from GB201406470A external-priority patent/GB201406470D0/en
Application filed by بيسيوكساس ثيرابيوتكس ليميتد filed Critical بيسيوكساس ثيرابيوتكس ليميتد
Publication of SA516371011B1 publication Critical patent/SA516371011B1/ar

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

يتعلق الكشف الحالي بفيروس غدي adenovirus من المجموعة B يشتمل على متوالية لها الصيغة (I): 5'ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3'ITR حيث: تكون B1 عبارة عن رابطة أو تشتمل على: E1A، E1B أو E1A-E1B؛ تشتمل BA على -E2B-L1-L2-L3-E2A-L4؛ تكون B2 عبارة عن رابطة أو تشتمل على: E3؛ تكون BX عبارة عن رابطة أو متوالية DNA تشتمل على: موضع تقييد، واحد أو أكثر من الجينات الناقلة transgenes أو كلاهما؛ تشتمل BB على L5؛ تكون BY عبارة عن رابطة أو متوالية DNA تشتمل على: موضع تقييد، واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون B3 عبارة عن رابطة أو تشتمل على: E4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من BX أو BY عبارة عن رابطة، تركيبات صيدلانية تشتمل عليها واستخدام الفيروسات viruses والتركيبات في العلاج، بشكل محدد في علاج السرطان. كما يتعلق الكشف ببلازميدات plasmids وعمليات مستخدمة في تحضير الفيروسات المذكورة. [الشكل 37]

Description

فيروسات غدية حالة للورم مُمَلّحَة بجينات مختلفة التكوين ‎ONCOLYTIC ADENOVIRUSES ARMED WITH HETEROLOGOUS‏ ‎GENES‏ ‏الوصف الكامل خلفية الاختراع المجال التقني للاختراع: يتعلق الكشف الحالي بفيروس غدي ‎adenovirus‏ معدل؛ على سبيل المثال ‎ar‏ بجين ناقل ‎transgene‏ واحد على الأقل يتضمن جين ناقل ‎therapeutic ade‏ و/أو مرشد؛ بشكل محدد فيروس 1505/ا من المجموعة 8؛ مثل فيروس غدي ‎s3adenovirus‏ ‏5 نمط مصلى 11 ‎serotype‏ أو فيروس خيمري ‎chimeric Virus‏ به ‎«aL‏ بنتون ‎penton‏ ‏وهكسون ‎hexon‏ من 8011 تركيبة؛ ‎Jie‏ صيغة صيدلانية تشتمل على الفيروس؛ استخدام الفيروس ‎Eas‏ فيروسية 4 يبشكل محدد في علاج؛ ‎ala‏ في علاج السرطان . كما يتعلق ‎asst‏ ‏بعمليات لتحضير الفيروس. الخلفية التقنية للاختراع: تم فحص نواقل فيروسات غدية ‎adenovirus‏ بها نقص في النسخ ‎Baal‏
0 سنوات ‎Lad‏ يتعلق بتوصيل ‎cilia‏ ناقلة1805960©65 . تم إدخال غالبية الجينات في المنطقة ‎El‏ ‏و/أو المنطقة 3 ‎oY‏ هذه المناطق الخاصة بمجموعة العوامل الوارثية للناقل تعتبر غير أساسية للنواقل. على نحو مفاجئ تم إجراء عمل بسيط على مواقع بديلة لإدخال جينات ناقلة في مجوعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي. بالإضافة إلى ذلك تم إجراء غالبية العمل في 805.
يوجد حاليًا جيل جديد من فيروسات غدية ‎dlls‏ للورم مؤهلة للنسخ في مجال الطب السريري. لا تتطلب هذه الفيروسات تكامل سلالات الخلية للنسخ. تعتبر 1 منطقة أساسية للنسخ الفيروسي بينما يمكن استخدام المنطقة 3 نظريًا كموقع لإدخال جين ناقل؛ وقد يكون من المفيد إن أمكن إدخال جين ناقل في أكثر من الموقع المذكور. مع ذلك يجب توخي الحذر بحيث لا يتم تعطيل دورة حياة الفيروس و/أو الخواص الفيروسية المميزة؛ ‎Sie‏ الخواص العلاجية للفيروس.
يكون إينادينوتوسيريف ‎Enadenotucirev (EnAd)‏ عبارة عن فيروس غدي خيمري حال للورم ‎chimeric oncolytic adenovirus‏ ؛ معروف سابقًا ب (الطلب الدولي 2005/118825( 00 ؛ به ألياف؛ بنتون ‎penton‏ وهكسون ‎hexon‏ من م8011 وعليه يكون فيروس من المجموعة الفرعية 8. يكون به منطقة 28 خيمرية؛ تشتمل على الحمض النووي الريبوزي منزوع الأكسجين ‎DNA‏ من م8011 و803. يتم حذف كل المنطقة 53 وجزءِ من المنطقة 54 تقريبًا في ‎chiles ENA‏ يكون به حيز كبير في مجموعة العوامل الوراثية لاستيعاب مادة وراثية إضافية بينما يظل حيوي. علاوة على ذلك؛ بسبب أن 50/0 عبارة عن فيروس غدي من المجموعة الفرعية 8؛ فتكون المناعة الموجودة ‎Baie‏ في البثر أقل شيوعًا من؛ على سبيل ‎AS Jaa‏ تتضمن أمثلة ‎(AT‏ لفيروسات خيمرية حالة للورم بها ألياف؛ بنتون وهكسون 8011 تتضمن
0 07/801 و07802 (راجع الطلب الدولي 2006/060314). يبدو أن 50/80 تقوم على نحو مفضل بإصابة خلايا الورم بالعدوى؛ تتناسخ بسرعة في هذه الخلايا وتتسبب في تحلل الخلية. يمكن أن يعمل ذلك»؛ بدوره؛ على توليد استجابات مناعية التهابية ‎inflammatory immune‏ وعليه يتم تحفيز الجسم أيضًا على محارية السرطان. يفترض أن جزءًا من نجاح 0/0 يرجع إلى النسخ السريع لفيروس داخل الخلية الحية ‎Virus in vivo‏
5 في حين أن 50/80 يقوم ‎Wl)‏ بحل خلايا الورم؛ ‎ald‏ من الممكن إدخال خواص مفيدة أخرى؛ على سبيل المثال زيادة النشاط العلاجي ‎therapeutic‏ للفيروس أو تقليل التأثيرات الجانبية للفيروس بواسطة تسليحه بجينات ناقلة1180750©610765 ؛ ‎Jie‏ جين ناقل مُشفر لبروتين ‎protein‏ ‏إرسال إشارات لخلية أو جسم مضادء أو جين ناقل مُشفر لوحدة تحفز بروتين (بروتينات) إرسال إشارات لخلية.
يمكن أن يتيح التسليح المميز لفيروس» بقيام ‎DNA‏ بتشفير بروتينات معينة يمكن التعبير عنها ‎Gl),‏ داخل الخلية السرطانية؛ باستخدام دفاعات الجسم نفسه لمكافحة خلايا الورم بفاعلية ‎OS‏ ‏على سبيل المثال بجعل الخلايا واضحة أكثر للجهاز المناعي أو بواسطة توصيل جين/يروتين علاجي على نحو مفضل إلى خلايا الورم المستهدفة.
علاوة على ذلك؛ يمكن أن تساعد القدرة على إدخال جينات ناقلة والتي تكون عبارة عن جينات مرشدة داخل مجموعة العوامل الوراثية فى الدراسات الإكلينيكية ‎clinical‏ أو قبل الإكلينيكية ‎pre—‏ ‎.clinical‏ ‏من المهم ألا يؤثر التعبير الوراثي عن الجينات الناقلة بالسلب على الاستنساخ أو خواص أخرى مميزة للفيروس. وعليه؛ يجب إدخال الجين أو الجينات في موقع لا يعرض كفاءة الاستنساخ
والخواص المميزة الأخرى للفيروس للخطر. بالإضافة إلى ذلك؛ تتم تعبئة مجموعة العوامل الوراثية للفيروسات الغدية بشكل محكم ووعليه قد يكون من الصعب العثور على موقع مناسب لإدخال جينات ناقلة. كما يحد ذلك من حجم الجينات الناقلة التى يتم استيعابها. في المنتجات العلاجية يكون من المهم التحكم بدقة في خواص العامل الفعال؛ بحيث يتم تمييزه
0 جيدًا ويمكن تحضيره بشكل قابل للإنتاج. لا تكون الأنظمة الواردة في الفن السابق التي تستخدم عوامل وراثية قافزة يتم إدخالها عشوائيًا مناسبة للاستخدام في منتجات صيدلانية لأنه يتم إدخال الجين الناقل عشوائيًا في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس ويمكن أن يتأثر موضع الإدخال بالجين الناقل نفسه. قد يكون من الصعب استبدال الجينات التي تم إدخالها بواسطة العامل الوراثي القافز بجينات بديلة.
5 وعليه يكون من المطلوب تطوير وسائل قوية وقابلة للتكرار لتوليد فيروسات غدية ‎halo‏ والتي تتحمل مجموعة كبيرة من الجينات الناقلة. قام المخترعون الحاليون بتطوير طريقة لتسليح فيروس غدي مناسب لاستيعاب نطاق واسع من الجينات الناقلة في ظل تحكم معزز داخلي أو خارجي ينتج ‎die‏ فيروس حيوي؛ ثابت؛ قابل للاستخلاص يعبر وراثيًا عن الجين الناقل في خلايا الورم. تكون الطريقة قوية وقابلة للتكرار ويمكن
0 التحكم فيها على نحو صارم. يوجد الجين الناقل بالقرب من (بجوار) الجين المُشفر لبروتين ‎fibre protein ad‏ ؛ إما عند الطرف 5” و/أو الطرف 3” للجين؛ وهو ما لا يؤثر بالسلب على ثبات الفيروس. توصل المخترعون الحاليون إلى أنه يمكن إدخال البروتينات المعقدة التي تكون في صورة أجسام مضادة أو شظايا جسم مضاد ويروتينات إرسال إشارات لخلية في هذا الموقع في مجموعة العوامل
الوراثية للفيروسات الغدية ¢ على سبيل المثال فيروسات من المجموعة ‎Ad 1 1 Jia ¢ B‏ وفيروسات مشتقة من 8011 والتعبير عنها ‎or lay iy‏ على سبيل المثال في ظل تحكم 4 الداخلي أو معزز متأخر رئيسي؛ بحيث يتم التعبير عن البروتين ولا يتم تعريض استنساخ الفيروس للخطر. يوفر بلازميد ‎plasmid‏ تم التوصل إليه بواسطة المخترعون الحاليون مواضع تقفييد جديدة في مجوعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي التي يمكن استخدامها لإدخال مجموعات جين ناقل بالقرب
من جين ‎LS‏ (ألياف) لتوفير فيروسات خاصة بالكشف الحالي. على نحو بديل؛ يمكن تخليق بلازميدات ‎plasmids‏ تحتوي على جينات ناقلة أو مجموعات جين ‎BU‏ عند مواقع موضع الإدخال المذكورة بالكامل بشكل مباشر بدون خطوة إنشاء نسائل وعليه دون الحاجة إلى استخدام مواضع التقييد.
0 الوصف العام للاختراع يوفر الكشف الحالي فيروس غدي يشتمل على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة )1( 5ا) ‎ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR‏ ‏حيث:
5 تكون 31عبارة عن رابطة أو تشتمل على: 18 18ح 4 ‎(E1A-E1B‏ ‏تكون ‎BA‏ عبارة عن ‎¢(E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ ‏تكون 82 عبارة عن رابطة أو تشتمل على ‎E3‏ ‏تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة ‎transgenes‏ أو كلاهما؛
0 تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛
تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على ‎Bd‏ ‏حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة؛ على سبيل المثال تكون واحدة على الأقل من ‎BY 3 BX‏ عبارة عن جين ‎«JU‏ موضع تقييد أو كلاهماء مثل جين ناقل. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ على موضع تقييد؛ على سبيل المثال 1؛ 2؛ 3 أو 4 مواضع تقييد؛ مثل 1 أو 2. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ على جين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل المثال 1 أو 2 من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ على جين ‎Jib‏ واحد على ‎(JV‏ على سبيل المثال 1 أو 2 من الجينات الناقلة وواحد أو أكثر من مواضع التقييد؛ على سبيل المثال 2 أو 3 مواضع ‎cai‏ بشكل محدد حيث تقوم مواضع التقييد بإقحام جين أو متوالية ‎DNA‏ ‏تشتمل على جينات تسمح باستئصاله/إستئصالها نوعيًا من مجموعة العوامل الوراثية و/أو 0 استبدالها. على نحو بديل؛ يمكن أن تقوم مواضع التقييد بإقحام كل جين؛ على سبيل المثال ‎Lovie‏ ‏تكون هناك حاجة إلى اثنين من الجينات الناقلة وثلاث مواضع تقييد مختلفة للتأكد من أنه تم استئصال الجينات نوعيًا و/أو استبدالها. في أحد التجسيدات يكون واحد أو ‎«ST‏ على سبيل المثال جميع الجينات الناقلة في صورة مجموعة جين ناقل. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ على متوالية رقم: 10. في أحد التجسيدات تت إعاقة المتوالية رقم: 10؛ على سبيل المثال بواسطة جين 5 تاقل. في أحد التجسيدات لا تتم إعاقة المتوالية رقم: 10. في أحد التجسيدات لا تشتمل ‎BX‏ على موضع تقييد. في أحد التجسيدات تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ ‏على أو تتألف من واحد أو ‎AST‏ من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على موضع تقييد؛ على سبيل المثال 1؛ 2؛ 3 أو 4 مواضع ‎canis‏ مثل 1 أو 2. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على جين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل 0 المثال 1 أو 2 من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على جين ‎Jib‏ واحد على ‎(JV‏ على سبيل المثال 1 أو 2 من الجينات الناقلة وواحد أو أكثر من مواضع التقييد؛ على سبيل المثال 2 أو 3 مواضع ‎cali‏ بشكل محدد حيث تقوم مواضع التقييد بإقحام جين أو متوالية ‎DNA‏ ‏تشتمل على جينات تسمح باستئصاله/إستئصالها نوعيًا من مجموعة العوامل الوراثية و/أو استبدالها. على نحو بديل يمكن أن تقوم مواضع التقييد بإقحام كل جين؛ على سبيل المثال عندما 5 تكون هناك حاجة إلى اثنين من الجينات الناقلة وثلاث مواضع تقييد مختلفة للتأكد من أنه يمكن
استئصال الجينات نوعيًا و/أو استبدالها. في أحد التجسيدات يكون واحد أو ‎«ST‏ على سبيل المثال جميع الجينات الناقلة في صورة مجموعة جين ناقل. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على متوالية رقم: 11. في أحد التجسيدات تتم إعاقة المتوالية رقم: 11؛ على سبيل المثال بواسطة جين ناقل. في أحد التجسيدات لا تتم إعاقة المتوالية رقم: 11. في أحد التجسيدات لا تشتمل ‎BY‏ على موقع تقييد. في أحد التجسيدات تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على أو تتألف من واحد أو ‎SST‏ من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات تشتمل كل من ‎BX‏ و87 على موضع تقييد؛ على سبيل المثال1؛ 2؛ 3 أو 4 مواضع تقييد؛ مثل 1 أو 2. في أحد التجسيدات تشتمل كل من ‎BX‏ و87 على جين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل المثال 1 أو 2 من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات تشتمل كل من ‎BX‏ ‏0 و87 على جين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل المثال 1 أو 2 من الجينات الناقلة وواحد أو أكثر من مواضع التقييد؛ على سبيل المثال 2 أو 3 مواضع تقييد؛ بشكل محدد حيث تقوم مواضع التقييد بإقحام جين أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على جينات للسماح باستئصالها ‎leg‏ من مجموعة العوامل الوراثية و/أو استبدالها. على نحو بديل يمكن أن تقوم مواضع التقييد بإقحام كل جين؛ على سبيل المثال عندما تكون هناك حاجة إلى اثنين من الجينات الناقلة وثلاث مواضع تقييد مختلفة 5 لللتأكد من أنه يمكن استتئصال الجينات نوعيًا و/أو استبدالها. في أحد التجسيدات يكون واحد أو أكثر؛ على سبيل المثال جميع الجينات الناقلة في صورة مجموعة جين ناقل. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ و87 على المتوالية رقم: 10 والمتوالية رقم: 11 على التوالي. في أحد التجسيدات لا تشتمل ‎BX‏ و87 على موضع تقييد. في أحد التجسيدات تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة ولا تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة. في أحد التجسيدات تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة ولا تكون ‎BX‏ عبارة عن 0 رابطة. في أحد التجسيدات يوجد الجين الناقل في ‎BX‏ في أحد التجسيدات يوجد الجين الناقل أو مجموعة جين ناقل ‎cassette‏ 18059606 في 87. في أحد التجسيدات يوجد جين ناقل أو مجموعة جين ناقل في ‎BX‏ و87؛ على سبيل المثال يمكن أن تكون الجينات الناقلة متماثلة أو مختلفة. في كل موقع.
على نحو مميزء يتم إدخال الجين الناقل الموجود في بنيات الفيروس المنشأة الحالية في موقع تتم إزالته من الجينات السابقة لأن ذلك يقلل من احتمالية التأثير على التعبير الوراثي لجين الفيروس أو سرعة الاستنساخ. في أحد الجوانب المستقلة يتم توفير فيروس غدي حال للورم ‎competent oncolytic‏
‎adenovirus 5‏ مؤهل للنسخ ذو نمط مصلي 11 أو مشتق فيروسي ‎die‏ حيث تكون الألياف+الهكسون والبروتين الغلافي ذات نمط مصلي 11؛ حيث تشتمل مجموعة العوامل الوراثية للفيروس على متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجسم مضاد علاجي أو شظية ارتباط بجسم ‎alias‏ يتم اختيار متوالية ‎DNA‏ المذكورة في ظل تحكم معزز موجود داخل الفيروس الغدي من تلك التي تتألف من 4 والمعزز المتأخر الرئيسي؛ بحيث لا يتداخل الجين الناقل مع استنساخ الفيروس؛ على سبيل
‏0 المثال حيث تكون متوالية ‎DNA‏ مُشفرة للجسم المضاد العلاجي أو شظية الارتباط بالجسم المضاد في ظل تحكم معزز 4 أو على نحو بديل في ظل تحكم المعزز المتأخر الرئيسي؛ بشكل محدد حيث يتم وضع متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجسم مضاد أو شظية الارتباط بالجسم المضاد بعد 15 في متوالية مجموعة العوامل الوراثية للفيروس (أي نحو الطرف 73 لمتوالية الفيروس). على نحو مميز معزز داخلي يزيد من مقدار الحيز المتاح لإدخال جينات ناقلة إلى الحد الأقصى.
‏5 على نحو مميز؛ عندما يكون في ظل تحكم المعززات المذكورة يظل الفيروس مؤهل للنسخ ويكون قادر أيضًا على التعبير وارثيًا عن جسم المضاد في صورة جسم مضاد ذي الطول الكامل أو شظية ارتباط مناسبة أو بروتين آخر. وعليه سيتم التعبير ‎Gly‏ عن الجسم المضاد أو بروتين آخر محل اختيار بواسطة الخلية السرطانية. يمكن أن يكون استخدام المعزز الداخلي ‎Faas‏ لأنه يقلل من حجم مجموعة الجين الناقل التي يجب إدخالها لتعبر ‎Gly‏ عن الجسم المضاد؛ شظية أو
‏0 بروتين آخرء أي المجموعة يمكن أن تكون أصغر لأنه لا تكون هناك حاجة إلى تضمين معزز خارجي. كما يمكن أن يكون استخدام معزز داخلي في الفيروس ‎aes‏ في السياق العلاجي لأنه يتم التعبير وراثيًا فقط عن الجين الناقل عند استنساخ الفيروس على النقيض من معزز خارجي بنيوي 06 الذي سيقم بشكل مستمر بنسخ الجين الناقل ويمكن أن يؤدي إلى تركيز غير ملائم
‏5 للجسم المضاد أو الشظية.
في أحد التجسيدات يكون التعبير الوراثى عن جسم المضاد أو شظية في ظل تحكم المعزز
المتأخر الرئيسي.
في أحد التجسيدات يكون التعبير ‎Shell‏ عن جسم المضاد أو شظية ‎dis‏ ظل تحكم معزز ‎Ed‏
في أحد الجوانب المستقلة يتم توفير فيروس غدي حال للورم مؤهل للنسخ ذو نمط مصلي 11 أو مشتق فيروسي منه حيث تكون الألياف؛الهكسون والبروتين الغلافي ذات نمط مصلي 11؛ حيث
تشتمل مجموعة العوامل الوراثية للفيروس على متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجسم مضاد علاجى أو شظية
ارتباط بجسم مضاد توجد في جزءِ من مجموعة العوامل الوراثية للفيروس التي يتم التعبير عنها
‎i)‏ بشكل متأخر في دورة استنساخ الفيروس وبحيث لا يتداخل الجين الناقل مع استنساخ
‎(ug pd‏ حيث تكون متوالية ‎DNA‏ المذكورة في ظل تحكم معزز خارجي للفيروس الغدي؛ على
‏10 سبيل المثال حيث تكون متوالية ‎DNA‏ مُشفرة للجسم المضاد العلاجي أو شظية الارتباط بالجسم المضاد في ظل تحكم معزز فيروس مضخم للخلايا ‎«Cytomegalovirus (CMV)‏ بشكل محدد توجد متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجسم مضاد أو شظية ارتباط بجسم مضاد بعد 15 فى متوالية مجموعة العوامل الوراثية للفيروس (أي نحو نهاية الطرف 3 لمتوالية الفيروس). يمكن أن يكون استخدام معزز خارجي ‎Baas‏ لأنه يمكن التعبير ‎Wily‏ بقوة وعلى نحو بنيوي عن
‏5 الجسم المضاد أو الشظية؛ وهو ما يمكن أن يكون مفيد بشكل محدد في بعض الحالات؛ على سبيل المثال عندما يعاني المريض من سرطان واسع الانتشار بدرجة كبيرة. في أحد التجسيدات يكون التعبير ‎(Shell‏ عن جسم المضاد أو شظية في ظل تحكم معزز ‎CMV‏ ‏فى أحد التجسيدات يكون المعزز الخارجى مرتبط بمتوالية ال ‎DNA‏ المذكورة؛ على سبيل ‎JE‏ ‏تُمثل جزءًا من مجموعة التعبير ‎hell‏ المُشفرة للجسم المضاد أو الشظية.
‏0 في أحد التجسيدات توجد متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجسم المضاد أو شظية بعد الجين 5 في متوالية الفيروس. على نحو ‎Grae‏ توصل المخترعون الحاليون إلى أن يمكن إدخال مجموعة من الجينات الناقلة في ‎BY l/s BX‏ في ظل تحكم معزز خارجي أو داخلى؛ بدون التأثير بالسلب على دروة حياة الفيروس أو ثبات الناقل.
— 0 1 — فى أحد التجسيدات يُمثل الجين الناقل جزءًا من مجموعة جين ناقل تشتمل على متوالية تشفير واحدة على الأقل (أي جين ناقل واحد على الأقل) وعلى نحو اختياري واحد أو أكثر من العناصر التى يتم اختيارها على حدة من: 1. منظم للتعبير ‎hell‏ عن الجين؛ مثل معزز خارجي أو مستقبل ‎splice acceptor Jaa‏ ؛ 2. متوالية ‎DNA‏ لمدخل رببوسوم ‎¢internal ribosome entry (IRES) Ail‏ 3. متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لببتيد/2 ‎peptide‏ ذو فاعلية انشطار ذاتى عالية؛ 4 متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لمتوالية ‎Jul‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات ‎polyadenylation‏ « و 5. توليفات منها. وعليه في أحد التجسيدات تشتمل مجموعة الجين الناقل على 1) أو 2) أو 3) أو 4).
0 في أحد التجسيدات تشتمل مجموعة الجين الناقل على 1) و2)؛ أو 1) و3)؛ أو 1) ‎(ds‏ أو 2) 35(« أو 2( 45(« أو 6 و4). في أحد التجسيدات تشتمل مجموعة الجين الناقل على 1 ( 25( 35( ‘ أو 1( 25( 45( ‘ أو 1 ( و3) و4)؛ أو 2) و3) و4). في أحد التجسيدات تشتمل مجموعة الجين الناقل على 1 ( 25( 35( 45( .
5 فى أحد التجسيدات يشتمل الجين الناقل أو مجموعة الجين الناقل على متوالية كوزاك ‎(Kozak‏ ‏التي تساعد في تحور حمض نووي ريبوزي مرسل ‎(Bhs MRNA‏ على سبيل المثال عند بداية متوالية تشفير البروتين. في أحد التجسيدات يكون الفيروس مؤهل للنسخ. في أحد التجسيدات يكون الفيروس به نقص بالنسخ» أي يكون عبارة عن ناقل.
0 كما يتم توفير تركيبة تشتمل على فيروس أو ناقل ‎Bag‏ للكشف الحالي؛ بشكل محدد تركيبة صيد ‎dy‏ على سبيل المثال تشتمل على فيروس غدي ‎Lg‏ للكشف وسواغ مقبول صيد ‎aay‏ .
— 1 1 — كما يتعلق الكشف الحالي لفيروس غدي أو تركيبة ‎Gg‏ للكشف للاستخدام في العلاج؛ على سبيل المثال للاستخدام في علاج السرطان. طريقة للعلاج تشتمل على إعطاء كمية دوائية فعالة من الفيروس على النحو الموصوف هنا أو تركيبة تشتمل على عليه إلى مريض في حاجة إليها بشكل محدد مريض من البشر. شرح مختصر للرسومات
الشكل 1 يوضح ‎(Goal Jay‏ إلى وتضخيم جسيمات فيروس 35 1 ‎NG-‏ في خلايا ‎HEK293‏ بعد ‎Jaa‏ العدويى باستخدام مجموعة العوامل الوراثية لفيروس ‎.NG-135‏ ‏تم نقل العدوى إلى خلايا ‎HEK293‏ باستخدام ‎DNA‏ حامل لمجموعة العوامل الوراثية 1 ‎NG—‏ ‏5 متقى وتمت مراقبته لإنتاج الفيروس بواسطة ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي ‎cytopathic‏
‎(CPE) 0‏ 0601©. الصور المجهرية (أ-ه) ‎(CPE‏ الذي يتم تمييزه بواسطة تكون الصفائح في الطبقة الأحادية للخلية؛ يمكن ملاحظتة بعد 144 ساعة من نقل العدوى؛ تم تجميع الفيروس بعد 6 ساعة من تقل العدوى (ه). تم تضخيم الفيروس المجمع في ‎(HEK293 LIA‏ وتم تجميعه عند ملاحظة ‎CPE‏ بعد 72 ساعة (و-ز) ثم تم تضخيمه ‎Bye‏ ثانية؛ وتم تجميعه عند ملاحظة ‎CPE‏ بعد 48 ساعة (ح-ط).
‏5 1 الشكل 2 يوضح ‎(Goal Jay‏ إلى وتضخيم جسيمات فيروس 16-4 في خلايا 1-23 بعد ‎Jaa‏ العدويى باستخدام مجموعة لعوامل الوراثية لفيروس ‎.NG-74‏ ‏تم نقل العدوى إلى خلايا ‎HEK293‏ باستخدام ‎DNA‏ حامل لمجموعة العوامل الوراثية ل نقي 16-4 وتمت مراقبته لإنتاج الفيروس بواسطة ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي ‎(CPE)‏ توضح ‎gual‏ المجهرية (أ-دي) ‎(CPE‏ الذي يتم تمييزه بواسطة تكون الصفائح في الطبقة الأحادية
‏0 اللخلية؛ يمكن ملاحظتة بعد 336 ساعة من نقل ‎(Goal‏ ؛ تم تجميع الفيروس بعد 384 ساعة من نقل العدوى (ي). تم تضخيم الفيروس المجمع في خلايا ‎HEK293‏ (ك-ص)؛ وتم تجميعه عند ملاحظة ‎CPE‏ بعد 240 ساعة (ص) ثم تم تضخيمه لمرة ثانية (ق-ت)؛ ثالثة (ث-خ)؛ رابعة ‎(Ud)‏ وخامسة (©)وتم التجميع عند ملاحظة ‎CPE‏ كبير.
— 2 1 — الشكل 3 يوضح ‎(Goal Jay‏ إلى وتضخيم جسيمات فيروس 16-3 في خلايا 1-23 بعد نقل العدوى باستخدام مجموعة عوامل وراثية لفيروس ‎NG=T3‏ ‏تم نقل العدوى إلى ‎HEK293 LA‏ باستخدام ‎DNA‏ حامل لمجموعة العوامل الوراثية 1 ‎NG-73‏ ‏نقي وتمت مراقبته لإنتاج الفيروس بواسطة ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي (008). توضح الصور المجهرية (أ-ز) ‎CPE‏ الذي يتم تمييزه بواسطة تكون الصفائح في الطبقة الأحادية للخلية؛ يمكن ملاحظتة بعد 144 ساعة من نقل العدويى 3 تم تجميع الفيروس بعد 192 من ‎Jay‏ العدويى . تم تضخيم الفيروس المجمع في خلايا ‎HEK?293‏ )2( ثم تم تضخيمه ثمرة ثانية (طل) ومرة ثالثة (م)؛ وتم التجميع عند ملاحظة ‎CPE‏ كبير. الشكل 4 يوضح الكشف ب ‎ELISA‏ لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ يتم إفرازه من خلايا ‎HEK293‏ تم 0 تقل العدوى إليها ب ‎NG-135‏ ‏تم ‎(Goal Jay‏ إلى خلايا ‎HEK293‏ خارج الخلية الحية لمدة 72 ‎Lo} dela‏ باستخدام فيروس مستخدم فى عينة مقارنة؛ 7-ولل أو جسم مضاد ل ‎VEGF‏ يعبر وراثيا عن الفيروس « ‎NG-‏ ‏5. تم قياس مستويات الجسم المضاد ل ‎VEGF‏ ل 1061 بشري في مواد طافية لمستنبت بواسطة ‎ELISA‏ باستخدام أطباق مغلفة ب ‎VEGF‏ بشري وجسم مضاد للكشف عن مضاد -96وا 5 © بشري (أ). تم تحديد كمية مستويات الجسم المضاد باستخدام منحنى قياسى للجسم المضاد ل ‎VEGF‏ البشري النقي؛ بيفاسيزوماب(8) ‎.bevacizumab‏ ‏الشكل 5 يوضح الكشف ببقعة وسترن ‎Western‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ يتم إفرازه من خلايا ‎HEK293‏ تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-135‏ ‏تم ‎(Goal Jay‏ إلى خلايا ‎HEK293‏ خارج الخلية الحية لمدة 24 ساعة باستخدام الجسم المضاد ل ‎VEGF 20‏ الذي يعبر وراثيًا عن الفيروس» 6-135ل. تم تقييم جسم مضاد ل ‎VEGF‏ ل 061و بشري في مواد طافية لمستنبت بواسطة التبقيع لوسترن باستخدام جسم مضاد للكشف عن مضاد ‎IgG‏ بشري . الشكل 6 يوضح منحنى قياسي لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري نقي 6 بيفاسيزوماب .
— 3 1 — تم تخفيف جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري نقي؛ بيفاسيزوماب؛ تتابعيًا وتحديد كميته بواسطة ‎ELISA‏ ‏باستخدام أطباق مغلفة ب ‎VEGF‏ بشري. حدد ذلك التركيزات المطلوية لإنتاج منحنى قياسي للبيفاسيزوماب لاستخدامه فى ‎ELISA‏ ‏الشكل 7 يوضح الكشف ببقعة وسترن عن 501 مضاد ل ‎VEGF‏ يتم إفرازه من خلايا ‎HEK293 5‏ تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-76‏
تم نقل العدوى إلى ‎HEK293 Wa‏ باستخدام فيروس ‎ING=T6‏ تم استنباتها ‎sad‏ 24 أو 44 ساعة ثم تم تقييمها للتعبير الوواثي عن 5007 مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة التبقيع لوسترن باستخدام جسم مضاد لبطاقة ‎His‏ للكشف عن منتج 5071 المُشفر. الشكل 8 يوضح الكشف ببقعة وسترن عن ‎alias SCFV‏ ل ‎VEGF‏ يتم إفرازه من خلايا كارسينوما
0 القولون التي تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-T76‏ أو ‎NG-T78‏ ‏تم نقل العدوى إلى ‎WIA‏ كارسينوما القولون 111-29 باستخدام فيروسات ‎(EnAd‏ 16-76 أو 16-8 تم استنباتها ‎sad‏ 22؛ 46 أو 70 ساعة ثم تم تقييمها للتعبير الوراثي عن 50517 ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ بواسطة التبقيع لوسترن باستخدام جسم مضاد لبطاقة ‎His‏ للكشف عن منتج ‎Sckv‏ المُشفر ‎(A)‏
الشكل 9 يوضح استنساخ الفيروس ‎NG=T6‏ بعد 48 ساعة من نقل العدوى في خلايا ‎HT=29‏ ‏تم نقل العدوى إلى خلايا كارسينوما القولون 11-29 باستخدام 10 أو 1 من جسيمات فيروس 6-6 لكل خلية (جسيم لكل خليةاا66 ‎ppe particles per‏ )؛ تم استنباتها لمدة 48 ساعة ثم تم تقييمها للتعبير الوراثي عن مجموعة عوامل وراثية للفيروس بواسطة ‎QPCR‏ ‏الشكل 10 يوضح تلخيص تخطيطي لإنشاء مجموعات جين ناقل لجسم مضاد ل ‎VEGF‏
0 "تم إدخال متواليات لنسخ كاملة (سلاسل ثقيلة وخفيفة) أو ‎SCFV‏ لأجسام مضادة ل ‎VEGF‏ في مجموعة عوامل وراثية ل ‎ENAd2.4‏ بين مواضع التقييد 507 و5907 الموجودة بعد جين ‎LS‏ ‏(ألياف) للفيروس.
الشكل 11 يوضح أن استنساخ الفيروس ‎NG=135‏ والتعبير الوراثي عن الجين مشابه ل ‎EnAd‏ ‏في سلالات خلية كارسينوما القولون. تم نقل العدوى إلى سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم البشرية 111-29 و0100 خارج الخلية الحية ‎Lo)‏ باستخدام 50/0 أو 06-135 وتم استنباتها لمدة 3 أيام. تم تقييم استنساخ الفيروس (المُقاس بواسطة تحديد كمية ‎DNA‏ الفيروسي باستخدام ‎(GPCRS‏ والتعبير الوراثي عن جين الفيروس (هكسون) (المُقاس بواسطة تحديد كمية ‎RNA‏
الفيروسي باستخدام ‎(RTQPCR‏ تم الحصول على بيانات مشابهة باستخدام كلا الفيروسين ((أ) و(ب)). الشكل 12 يوضح التعبير الوراثي عن جين الجسم المضاد ل ‎VEGF‏ الذي يمكن الكشف عنه في سلالات خلية كارسينوما القولون التي تم نقل ‎(goad)‏ إليها ب 6-135ل8. تم نقل العدوى إلى
0 سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم البشرية 111-29 و0010 خارج الخلية الحية ‎Lo}‏ ‏باستخدام ‎EnAd‏ أو ‎(NG=135‏ تم استنباتها لمدة 3 أيام ثم تم تقييمها للتعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة 10005 ل ‎RNA‏ من الخلايا. الشكل 13 يوضح وجود جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في المواد الطافية لسلالات خلية كارسينوما القولون التي تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-135‏ ويمكنه الارتباط ب 11/561-165. تم نقل العدوى
إلى سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم البشرية 111-29 ‎HCT-116 3 DLD‏ خارج الخلية الحية إما باستخدام ‎ENA‏ أو 806-135 تم استنباتها لمدة 3 أيام. تم قياس مستويات الجسم المضاد ل ‎VEGF‏ ل 1961 بشري في مواد ‎dla‏ لمستنبت بواسطة ‎ELISA‏ باستخدام أطباق مغلفة ب ‎VEGF‏ بشري وجسم مضاد للكشف عن مضاد 196-12 بشري. تم تحديد كمية مستويات الجسم المضاد باستخدام منحنى قياسي للجسم المضاد ل ‎VEGF‏ البشري النقي؛
0 يفاسيزوماب. الشكل 14 يوضح وجود ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ في المواد الطافية لسلالات خلية كارسينوما القولون التي تم نقل العدوى إليها ب ‎NG=76‏ ويمكنه الارتباط ب 01/561-165. تم نقل العدوى إلى خلايا كارسينوما ‎carcinoma‏ القولون ‎HT-29‏ باستخدام فيروسات ‎(EnAd‏ 86-76 أو 16-8 تم استنباتها ‎sad‏ 22؛ 46 أو 70 ساعة ثم تم تقييمها للتعبير الوراثي عن 50517
— 1 5 — مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة التبقيع لوسترن باستخدام مضاد بطاقة ‎His‏ للكشف عن منتج ‎ScFV‏ (A) ‏المُشفر‎ تم تقييم التعبير ‎hall‏ عن 5057 في خلايا 1 جنينية بشرية بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط
VEGF ‏بواسطة تثبيط ارتباط‎ VEGF ‏تم تأكيد نوعية 5057 المُعبر عنه وراثيًا تجاه‎ VEGF ‏بيفاسيزوماب؛ في‎ «all ‏البشري‎ VEGF ‏بواسطة تضمين تركيز منخفض من الجسم المضاد ل‎ 5 ‎ELISA‏ (ب). ‏الشكل 5 1 يوضح أن استنساخ الفيروس 35 1 ‎NG-‏ مشابه 1 ‎EnAd‏ في نموذج الطعم الخارجي ‏تحت الجلد تم زرعه مع ‎.DLD WDA‏ تم زرع خلايا كارسينوما القولون البشرية ‎DLD‏ في صورة ‏طعم خارجي تحت الجلد في 601 لفئران 714/010 وتم حقن الأورام التي تم التوصل إليها ب 5 ‎x‏ ‏0 910 من جسيمات الفيروس 50/0 أو ‎NG=135‏ تم تقييم استنساخ الفيروس في الأورام في لأيام 73 ‎١0 - + f)‏ لكل نقطة زمنية) أو بعد 28 يوم من نقل العدويى )< « 0 - 0 بواسطة ‎.qPCR‏ ‎DLD‏ تحت الجلد مُعالج ب ‎.NG-135‏ تم زرع خلايا كارسينوما القولون البشرية ‎DLD‏ في صورة ‏5 طعم خارجي تحت الجلد في 601 لفئران 71/010 وتم حقن الأورام التي تم التوصل إليها ب 5 ‎Xx‏ ‏0 9 من جسيمات الفيروس 50/0 أو ‎NG=135‏ تم تقييم جين هكسون فيروس )1( والتعبير الوواثي عن جين السلسلة الثقيلة للجسم المضاد ‎VEGF‏ المُشفر (ب) ‎(MRNA)‏ تم تقييم بواسطة ‎RTQPCR‏ لنسيج الورم ‎RNA‏ بعد 3 و7 أيام من العلاج. ‏0 مُعالج ب ‎.NG-135‏ تم زرع خلايا كارسينوما القولون البشرية ‎DLD‏ في صورة طعم خارجي تحت الجلد في 601 ‎ial‏ 71/010 وتم حقن الأورام التي تم التوصل إليها ب 5 7 10 9 من جسيمات الفيروس (4 = ‎EnAd (n‏ أو (8 = ‎.NG=135 (n‏ تم استئصال الأورام بعد 28 يوم من نقل العدويى ¢ وتم تجانسها وتم تقييم نواتج ‎f‏ لاستخلاص قابلة للإذابة لإجمالي 1 ‎IgG‏ بشري 0 وجسم مضاد ل ‎VEGF‏ (ب) بواسطة ‎ELISA‏ تم تثبيت نواتج الاستخلاص من أحد أورام ‎EnAd‏
— 6 1 — باستخدام 8 نانو جرام/ملليلتر من جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري (بيفاسيزوماب) كعينة مقارنة موجبة فى كل ‎ELISA‏ ‏الشكل 18 ‎Jaa‏ العدويى 2 35 ‎NG-1‏ لنموذج الطعم الخارجي تحت الجلد يوضح التعبير ‎hs!‏ ‏عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ واستنساخ الفيروس في أورام ‎HCT-116‏ ‏5 تم ‎SY)‏ خلايا كارسيتوما القولون البشرية 116 ‎HCT-‏ في صورة طعم خارجي تحت الجلد في
‎CD 1‏ لفئران ‎nu/nu‏ وتم حفن الأورام التي تم التوصل إليها = 5 ‎X‏ 0 1 9 من جسيمات فيروس ‎EnAd‏ أو ‎.NG-135‏ تم استئصال الأورام في الأيام 3 7 و14 )5 = ‎JIN‏ نقطة زمنية). تم ‎IgGl) VEGF‏ بشري) بواسطة ‎JELISA‏ 06 بشري (ب).
‏0 الشكل 19 يمكن الكشف عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في الدورة الدموية المحيطية بعد 28 يوم من العلاج 2 5 13 ‎NG-‏ في نموذ ‎z‏ طعم خارجي للورم . تم ‎SY)‏ خلايا كارسيتوما القولون البشرية ‎DLD‏ في صورة طعم خارجي تحت الجلد في ‎CDT‏ لفئران ‎nufnu‏ وتم حقن الورم الذي تم التوصل ‎ad)‏ ب 5 ‎X‏ 109 من جسيمات الفيروس 50/0 أو 6-135ل2. تم تقييم مستويات من جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في الدورة الدموية المحيطية لفئران ‎dala‏ للورم بواسطة اختبارات ‎JELISA‏
‎19G1 5‏ بشري. يتم توضيح امتصاص تم ‎die‏ طرح مستوي النشاط القاعدي عند 450 نانو متر في (أ) وتم تحديد تركيز جسم مضاد ل ‎VEGF‏ باستخدام منحنى قياسي للجسم المضاد ل ‎VEGF‏ ‏البشري النقي؛ بيفاسيزوماب (8). الشكل 20 يوضح مخطط لعناصر توضيحية يمكن أن تكون موجودة في مجموعة جين ناقل. الشكل 21 يوضح مخطط تعناصر توضيحية مُشفرة في مجموعات جين ناقل.
‏0 الشكل 22 يوضح مخططات لمجموعات جين ناقل مُشفرة للجينات المرشدة. الشكل 23 يوضح مخططات لمجموعات جين ناقل مُشفرة لسيتوكينات. الشكل 24 يوضح مخططات لمجموعات جين ناقل مُشفرة لأجسام مضادة أو نطاقات جسم مضاد.
الشكل 25 يوضح استنساخ الفيروس والتعبير الوراثي عن بروتين وظيفي مرشد سلالات خلية كارسينوما القولون تم نقل العدوى إليها ب فيروسات 16-47 و 6-61ل. تم نقل العدوى إلى سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم البشرية 11-29 لمدة 24( 48؛ 72 أو 96 ساعة باستخدام ‎ENAd‏ أو الفيروسات 806-47 أو 806-61 التي تعبر ‎Why‏ عن بروتينات ‎GFP‏ ‏5 المرشدة أو ليوسيفيراز» على التوالي. تم تقييم استنساخ الفيروس بواسطة ‎GPCR‏ عند كل نقطة
زمنية وكانت مشابه ل ‎ENA‏ (أ-ب). تم تقييم التعبير الوراثي عن ‎GFP‏ بواسطة مستوى الوميض الذي يمكن الكشف ‎die‏ في نواتج تحلل الخلايا (ج). الشكل 26 يوضح أن فاعلية الفيروس 16-47 و 16-61 الحالة للورم مماثلة ل 0/0. تم نقل العدوى إلى سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم البشرية ‎١11-29‏ بجسيمات الفيروس
‎NG-47 (EnAd 0‏ أو ‎NG-61‏ بعد 72 ساعة من نقل العدوى تم تحديد مقدار قدرة الخلايا على البقاء حية ووتم رسمه ‎Wily‏ عند 96 بقاء الخلايا (أ-ب). كانت فاعلية كل من الفيروسات ‎NG-‏ ‎NG-61 5 7‏ مكافئة ل ‎EnAd‏ في سلالات الخلية ‎HT29‏ (أ-ب) وفي سلالات الخلية ‎HT29‏ ‎MRC5 3 8‏ (ج). الشكل 27 يوضح استنساخ الفيروس والتعبير الوراثي عن الجين الناقل في مجموعة من فيروسات
‎EnAD 5‏ تعبر وراثيًا عن الجينات المرشدة. تم نقل العدوى إلى سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم البشرية 17-29 باستخدام ‎ENA‏ أو مجموعة من الفيروسات التي تعبر ‎Gils‏ عن ‎GFP‏ في ظل معزز خارجي؛ ‎«CMV‏ المعزز الداخلي المتأخر الرئيسي ‎major late‏ ‎promoter (MLP)‏ أو معزز داخلي 54. بعد 24؛ 48؛ 72 أو 96 ساعة تم تقييم استنساخ الفيروس بواسطة ‎QPCR‏ (أ) وتم تحديد مقدار التعبير الوراثتي عن ‎GPF‏ بواسطة الكشف عن
‏0 الوميض على قاريء طبقي (ب). الشكل 28 يوضح إنتاج جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في سلالات الخلية كارسينوما القولون والرئة تم نقل العدوى إليها ب 6-135ل. تم نقل العدوى إلى سلالات خلية كارسينوما القولون والمستقيم ‎HT-29‏ أو كارسينوما الرئة ‎A549‏ البشرية لمدة 24؛ 48 أو 72 ساعة باستخدام جسيمات فيروس 816-135. عند كل نقطة زمنية تم تقييم إنتاج الجسم المضاد في المادة الطافية الخلوية
— 8 1 — خلال 5 ‎(38a‏ ساعة واحدة أو 3 ساعات بواسطة ‎av) 061 J ELISA‏ توضيح بيانات ‎HT-‏ ‏9 في ‎of‏ يتم توضيح بيانات ‎A549‏ في ب). يتم توضيح حساب كمية من 961| منتجة لكل 1 ‎x‏ 10 6 خلية خلال 24 48 أو 72 ساعة في الجدول (ج). الشكل 29 يوضح إنتاج فيروس 06-139" والتعبير ‎Shall‏ عن ‎TNFa‏ في سلالات خلية كارسينوما القولون تم نقل العدوى إليها ب فيروس ‎NG-139‏ تم نقل العدوى إلى خلايا 11-29
باستخدام فيروس 39 1 ‎NG-‏ لمدة 36 ساعة قبل تقييم إنتاج الفيروس بواسطة رؤية ‎CPE‏ والتبقيع لإنتاج الفيروس هكسون بروتين لبروتين غلافي بواسطة الكيمياء الهيستولوجية المناعية ‎(IHC)‏ ‏((أ) و(ب)). تم تقييم إنتاج ‎TNF‏ في مادة طافية لخلية تم نقل العدوى إليها ب 816-139 بواسطة ‎ELISA‏ وتم تحديد مقدارها في الجدول الموضح في (ج). تم زرع خلايا كارسينوما القولون
0 1 البشرية ‎DLD‏ في صورة طعم خارجي تحت الجلد في 1 ‎CD‏ لفئران ‎nu/nu‏ وتم علاج الورم الذي تم التوصل إليه في 3 حالات باستخدام 5 ‎x‏ 910 من جسيمات الفيروس ‎EnAd‏ أو ‎NG-‏ ‏5. تم تقييم مستويات ‎TNF‏ في الأورام بعد 15 يوم من العلاج بواسطة ‎{ELISA (D)‏ الشكل 31 يوضح استنساخ الفيروس ‎NG=61‏ بعد 3 و7 أيام من العلاج في نموذج الطعم
5 1 الخارجي تحت الجلد تم زرعه مع خلايا ‎.DLD‏ ‏الشكل 32 يوضح التعبير الوراثي عن الجين الناقل ليوسيفيراز في الأورام بعد 7 أيام من العلاج في نموذ ‎z‏ الطعم الخارجي تحت الجلد تم زرعه مع خلايا ‎.DLD‏ ‏الشكل 33 يوضح استنساخ الفيروس 16-135" والتعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في سلالات خلية كارسينوما القولون» الرئة والمبيض. تم نقل العدوى إلى سلالات خلية كرسينوما
‎DLD 161-116 11-29 0‏ (القولون)؛ ‎SKOV‏ (المبيض) أو ‎A549‏ (الرئة) باستخدام جسيمات الفيروس 806-135 أو 50/0 لمدة 120-24 ساعة. تم تقييم استنساخ الفيروس كل 4 ساعة بواسطة ‎QPCR‏ وتم رسم الاستنساخ الأقصى عبر الفترة الزمنية ‎Gly‏ في (أ). كما تم الجسم المضاد الذي تم إفرازه في المادة الطافية للخلية عند كل نقطة زمنية في (ب).
الشكل 34 يوضح مخططات لمجموعات جين ناقل مُشفرة لورم مصاحب لمولد ‎cam‏ أجسام مضادة أو نطاقات جسم مضاد. الشكل 35 يوضح استنساخ الفيروس 86-135 والتعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في غريسة خارجية تم استنباتها خارج الخلية الحية لأورام طعم خارجي تحت الجلد 167-116 تم نقل العدوى إليها داخل الخلية ‎all‏ بواسطة إعطاء جرعات ‎AT‏ ‏تم زرع خلايا كارسينوما القولون البشرية 101-116 في صورة طعم خارجي تحت الجلد في ‎CD‏ لفئران 010/010 وتم حقن الورم الذي تم التوصل إليه ب 5 ‎X‏ 10 9 من جسيمات فيروس ‎NG-135‏ بعد 10 أيام تم استئصال الأورام واختبار مستويات مجموعة ‎alge‏ وراثية للفيروس (أ) والجسم المضاد ل ‎VEGF‏ (ب) قبل أو بعد 7 أيام من الاستنبات خارج الخلية الحية. مستويات 0 جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في أمصال. الشكل 36 يوضح استنساخ الفيروس ‎NG=135‏ وتأثيره على أنسجة الورم في نموذج ورم خلية ‎Jala A549 Lg)‏ الخلية الحية في الفئران. تم حقن خلايا 8549 بشرية داخل الوريد في ‎Ob‏ ‎SCID‏ للحصول على أورام عقدية في الرئتين. بعد 8 أسابيع؛ عند التوصل إلى الأورام» تم حقن الفيروسات ‎EnAd‏ أو 816-135 (5 ‎x‏ 10 9 جسيمات) داخل الوريد وتمت مراقبة التأثيرات على 5 الأورام عند نقاط زمنية مختلفة. يتم توضيح نظام إعطاء الجرعات في (أ). يتم توضيح تأثير ‎NG-‏ ‏5 على حجم الورم في الرئتين (على ‎gail)‏ المُقاس بواسطة ‎GPCR‏ للجسن البشري ‎(PTGER2‏ لفئران مختلفة بعد 3 و25 يوم من إعطاء الجرعات في (ب). توضح (ج) مستويات مجموعات العوامل الوراثية للفيروس ‎(QPCR)‏ المرتبطة بمستويات الورم ‎PTGER2 1gPCR)‏ بشري). تم تشريح الرئتين في صور عقد ورم مرئية وتم ‎Load‏ تقييم نسيج الرئة المتبقي لمستويات 0 من مجموعة عوامل وراثية للفيروس (نا). الشكل 37 يوضح نشاط ‎ENA NG-135‏ في نموذج طعم خارجي فأري سوي الموضع لسرطان المبيض باستخدام ‎LIA‏ كارسينوما ‎ane‏ بشرية ‎SKOV=3‏ تعبر ‎Bly‏ بشكل ثابت عن ليوسيفيراز ‎luciferase‏ تم غرزه في فئران ‎CB17-SCID‏ عن طريق الحقن داخل العشاء البريتوني (5 ‎x‏ 10 6 خلية/فأر). بعد 22 يوم من الغرز تم علاج ‎glad‏ إما ب ‎due) PBS‏
— 0 2 — مقارنة) أو 5 ‎x‏ 10 7 من جسيمات فيروس ‎(EnAd‏ 216-135 أو 6-78 يتم توصيلها بواسطة الحقن داخل العشاء البريتوني وتمت مراقبة نمو الورم كنشاط الليوسيفيراز بمرور الوقت. الشكل 38 يوضح تمييز فيروس 116-135 وجسم مضاد ل ‎VEGF‏ مُعبر عنه وراثيًا بعد الزيادة التصاعدية لإنتاج وتتقية مادة الفيروس من خلايا ‎HEK293‏ مستنبته في مفاعل حيوي. يكون 16-135 مشابه من حيث الفاعلية (أ) والاستنساخ (ب) لمقياس فيروس ‎ENA‏ مع زبادة
مستويات الجسم المضاد التي تم الكشف عنها في مواد طافية لمستنبت بمرور الوقت (ج). يُظهر التمييز ببقعة ويسترن (د) و باياكور ‎Biacore‏ (ه) للجسم المضاد النقي تشابه مع جسم مضاد ل ‎VEGF‏ مُصنع تجاريًا (أفاستين ‎(Avastin‏ ‏الشكل 39 يوضح إنتاج وتمييز فيروسات 0/0 مُشفرة لسلاسل ثقيلة وخفيفة لجسم مضاد ل
‎VEGF 0‏ مرتبط بببتيد ‎P2A‏ ذاتي الانشطار (816-165)؛ باستخدام بيانات مقارنة لفاعلية الفيروس (أ)؛ الاستنساخ (ب) وإنتاج جسم مضاد ل ‎EnAd 1 VEGF‏ و(©) ‎NG-135‏ ‏الشكل 40 يوضح تمييز فيروسات ‎(EnAd‏ 16-76 و216-78 المُشفرة ل ‎ScFvs‏ لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ في ظل تحكم معززات داخلية أو خارجية. يُظهر كلا الفيروسين فاعلية مماثلة ‎Ala‏ ‏للورم لفيروس 50/80 قياسي ((أ) و(ب)). بالنسبة ل ‎(NG=78‏ يتم توضيح نشاط الارتباط
‏5 المباشر ل ‎ScFv‏ ب ‎VEGF‏ في كل من أجزاء المادة الطافية وناتج تحلل الخلايا في (ج)؛ ‎ag‏ ‏توضيح التنافس على الارتباط ب ‎VEGF‏ بواسطة جسم مضاد ل ‎VEGF‏ (بيفاسيزوماب) في (د). الشكل 1 4 يوضح مقارنة نشاط فيروس 16-6 تجاه ‎EnAd‏ في فثران حاملة للورم؛ مع قياس استنساخ الفيروس ‎of)‏ هكسون ‎MRNA‏ (ب) و5007 ل ‎MRNA‏ (ج). الشكل 42 يوضح الفترة الزمنية لكل من الاستنساخ والتعبير ‎(Shell‏ عن جسم مضاد بواسطة
‏0 16-135 في خلايا 111-29. يمكن الكشف عن جسم مضاد تم إفرازه عند 72 ساعة لجميع ‎MOls‏ التي تم اختبارهاء ولكن مستوى التعبير ‎Shell‏ عن الجسم المضاد يعتم على دخل ‎MOI‏ ‏(أ). تم توضيح إنتاج الجسم المضاد والاستنساخ بعد 24 48 و72 ساعة من نقل العدوى إما ب 1 أو 10 جسيمات من الفيروس لكل خلية في (ب-د).
— 1 2 — الشكل 43 يوضح استنساخ ‎NG-135‏ (أ)؛ جسم مضاد ل ‎VEGF‏ (ب) وإنتاج جسيمات فيروس معدية (ج) في كارسينوما ‎HT-29‏ و 10/138 5 ‎(MRCS‏ خلايا أرومة ليفية سدوية. الشكل 44 يوضح التعبير ‎J hl‏ لانتقائي عن جين تاقل مرشد ‎eGFP‏ يتم التعبير عنه وراثيًا في ظل تحكم معزز خارجي ‎(CMV) (NG-47)‏ موضح في (ب) أو معزز داخلي -110)816/
(107 موضح في (0) في الخلايا الشجرية الأولية البشرية. يتم توضيح التعبير الوراثي عن الجين ‎Jalil)‏ المرشد 8650 للخلايا الشجرية المعرضة ل 50/0 في (أ) وخلايا مستخدمة في عينة مقارنة لم يتم ‎Jaa‏ العدويى إليها موضحة في ‎(z)‏ . الشكل 45 يوضح التعبير ‎(hell‏ عن الجين الناقل ليوسيفيراز في الأورام والاستجابة المناعية الوظيفية للجين ‎J‏ فيروس أو ورم في فئران ‎BALB/C‏ عندما يكون التعبير الوراثي عن الجين
0 الناقل في ظل تحكم إما معزز معزز خارجي (6-61ل8) ‎(CMV)‏ أو معزز ‎MLP‏ الداخلي (816-63). تم حقن أورام 61-26 تم إنمائها على خاصرة فئران ‎BALB/C‏ سليمة مناعيًا داخل الورم باستخدام أي من الفيروسات وتتم مراقبة التعبير الوراتي عن الليوسيفيراز بواسطة التصوير بالإشعاع الضوئي بمرور الوقت (أ) وتم قياس استجابات الخلايا التائية لمولدات ضد الليوسيفيراز (ب) (©) ‎EnAd‏ أو الورم (د) بواسطة تجرية ‎ELISPOT‏
5 الشكل 46 يوضح فاعلية الفيروس الحالة للورم ‎df)‏ ب) واستنساخ (ج؛ د) الفيروسات المشفرة للأجسام المضادة ‎(NG=190)‏ أو صورة متغيرة للجسم المضاد (816-221) 5057 لبروتين مسار متبط نقط فحص مناعية 1 ا-ناط مع المقارنة بفيروس ‎EnAd‏ كمجموعة مقارنة قياسية. الشكل 47 يوضح تمييز جسم مضاد ل 00-11 أو إنتاج ‎SCFV‏ (أ) ونشاطات ربط المركب الترابطي 00-11 (ب» ج؛ د) في خلايا 11-29 تم نقل العدوى إليها بواسطة المواد الطافية
‎(NG-221 3NG190 0‏ مع مقارنة إنتاج وارتباط 961 ل 16-165 منتج ل لجسم مضاد 961ا مضاد ل ‎VEGF‏ كعينة مقارنة للنوعية. الشكل 48 يوضح تقييم النشاط الوظيفي لجسم مضاد ل 00-11 يتم التعبير ‎die‏ وراثيًا في ‎sale‏ ‏طافية من خلايا 8549 تم نقل العدوى إليها ب 6-190 بواسطة نطاق تنشيط الخلية التائية في تفاعل خلايا لمفاوية مختلط؛» مُقاس في صورة 2-اا في مواد طافية لمستنبت. تم استخدام الخلايا
— 2 2 — الشجرية التي تم تمايزها من ‎PBMCs‏ لمتبرعين مختلفين ‎LIAS‏ منبهة مع 004 لخلايا تائية منقاه من متبعر ثالث. تتم مقارنة تحسين استجابة الخلية التائية بواسطة المواد الطافية ‎NG-190‏ ‏بتلك الخاصة جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل 0011 ومواد طافية من مستنبتات ‎NG-165‏ ‏الشكل 49 يوضح النشاط الوظيفي لجسم مضاد ل 00-11 يتم التعبير ‎die‏ وراثيًا في مادة طافية 2933 خلية تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-177‏ مقارنة ب 806-135 كعينة مقارنة لنوعية جسم
مضاد. نتج عن كلا الفيروسين مستويات ‎IGG]‏ مماثلة في 293 خلية (أ). قامت المواد الطافية ‎be ss 16-7‏ بتثبيط ارتباط 00-11 بمركبه الترابطي 001 مقارنةً ب 816-135 (ب)؛ وكانت نفس المواد الطافية 216-177 قادرة على تحسين إنتاج 2-اا في تجربة ‎(MLR‏ باستخدام مضاد 00-11 أحادي النسيلة نقي كعينة مقارنة موجبة (ج).
0 الشكل 50 يوضح تحليل ‎FACS‏ لنشاط ارتباط 00-11 خلوي للمواد الطافية 116-177 على خلايا ‎A549‏ تم حثها ب ‎FN‏ مقارنةٌ بارتباط جسم مضاد أحادي النسيلة ل 00-11 نقي ومواد ‎NG-135‏ طافية. الشكل 1 5 يوضح تمبيز فيروس ‎PTAA EnAd‏ لجسم مضاد لبروتين مسار مثبط ‎La‏ فحص مناعية ‎(NG-242)‏ 8-4ا1©. كان استنساخ الفيروس مشابه لعنية مقارنة ‎ENA‏ (). كان
5 إنتاج ‎I9G1‏ بواسطة 816-242 مشابه ل 116-135 (ب). تم توضيح النشاط الوظيفي للجسم المضاد ل 611/84 في المواد الطافية ‎NG242‏ بواسطة الارتباط المباشر بالمركب الترابطي (ج)؛ مقارنة بمواد طافية لعينة المقارنة ‎(NG-165‏ وكذلك بواسطة ارتباط ‎CTLA4-Fc‏ ناتج عن عودة الارتباط الجينى بمركبه الترابطي 87-1 (د) في تجارب ‎ELISA‏ ‏الشكل 52 يوضح تمييز فيروسات مُشفرة مولد ضد ‎TAA‏ مصاحب للوري؛ ‎NY-ESO-1 (NG-‏
0 (220. كان استنساخ الفيروس ‎NG=220‏ (أ) أو 206-217 (ب) مشابه لعينة المقارنة ‎ENA‏ ‏يمكن الكشف عن ‎NY-ESO-1‏ بواسطة بقعة ويسترن في ناتج تحلل خلايا تم نقل العدوى إليها ب 16-220 ولكن ليس فى خلايا مستخدمة فى عينة مقارنة ‎(z) EnAd‏ .
— 3 2 — الشكل 53 يوضح تمييز فيروس ‎ENA‏ باستخدام مواضع تقييد فريده تم إدخالها في المناطق ‎Bx‏ ‎By‏ لمجموعة العوامل الوراثية (816-185). كان نشاط الفيروس الحال للبرتين ‎Lae‏ بتجرية قدرة الخلايا على البقاء حية (أ) واستنساخ الفيروس (ب) مشابه لعينة المقارنة ‎ENAd‏ ‎mung 54 Jal‏ مخططات لمجموعات جين ‎Jil‏ مُشفرة للعديد من ‎ShRNAs (ScFVs‏ أو بروتين ‎dale‏ يوديد الصوديوم. الوصف التفصيلى: يشير الجين الناقل على النحو المستخدم هنا إلى جين تم إدخاله في متوالية مجموعة العوامل ‎dill)‏ وهو جين غير طبيعي للفيروس (الخارجي) أو لا يتم العثور عليه بصورة طبيعية في ذلك الموقع المحدد في الفيروس. يتم توضيح أمثلة الجينات الناقلة أدناه. كما يتضمن الجين الناقل على 0 النحو المستخدم هنا شظية وظيفية للجين والتي ثمثل جزءًا من الجين الذي عند إدخاله يكون ‎Gulia‏ ‏لتنفيذ وظيفة أو غالبية وظيفة الجين ذي الطول الكامل. يتم استخدام الجين الناقل ومتوالية التشفير تبادليًا هنا في سياق عمليات الإدخال في مجموعة العوامل الوارثية للناقل» ما لم يشير السياق إلى خلاف ذلك. تشير متوالية التشفير على النحو المستخدم ‎Lia‏ على سبيل المثال إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة 1 ‎RNA‏ وظيفى»؛ ببتيد ‎«peptide‏ بولى ‎polypeptide ain 5‏ أو بروتين 0001610. ‎Waa‏ تكون متوالية التشفير عبارة عن ‎cDNA‏ للجين ‎Jal)‏ الذي يُشفر ‎RNA‏ الوظيفي؛ ببتيد؛ بولي ببتيد أو بروتين محل اهتمام. يتم فيما يلي ‎RNA‏ ‏الوظيفى 3 ببتيدات 3 بولى ببتيد وبروتينات محل أهتمام . بوضوح تحتوي مجموعة العوامل الوراثية للفيروس عل متواليات تشفير ‎DNA‏ لا تعتبر (الجينات الموجودة بطبيعتها) الداخلية المتوالية الحاملة لمجموعة العوامل الوراثية لللفيروس جين ناقل ضمن 0 سياق الوصف الحالي إلا إذا تم تعديلها بواسطة تقنيات ناتج ‎sage‏ الارتباط الجيني ‎die‏ أن تكون في موقع غير طبيعي أو في بيئة غير طبيعية. في أحد التجسيدات يشير جين ناقل على النحو المستخدم هنا إلى مقطع من ‎DNA‏ يحتوي على جين أو متوالية ‎CDNA‏ تم عزلها من أحد الكائنات الحية وبتم إدخالها في كائن حي مختلف أي
— 4 2 — الفيروس الوارد في الكشف الحالي. في أحد التجسيدات يمكن أن يقوم مقطع ‎DNA‏ غير الأصلي المذكور بالاحتفاظ بالقدرة على إنتاج ‎RNA‏ الوظيفيء ببتيد؛ بولي ببتيد أو بروتين. وعليه في أحد التجسيدات يقوم الجين الناقل الذي تم إدخاله بتشفير بروتين؛ بولي ببتيد أو ببتيد بشري أو متوافق مع البشر.
في أحد التجسيدات يقوم الجين الناقل الذي تم إدخاله بتشفير بروتين؛ بولي ببتيد أو ببتيد غير بشري (مثل بروتين؛ بولي ببتيد أو ببتيد ثديي غير بشري) أو جزئ ‎(RNA‏ على سبيل المثال من فأر» ‎WY eden cif apa‏ أو ما شابه. على نحو مميز؛ تسمح الفيروسات الواردة في الكشف ‎Jay al)‏ الجينات الناقلة داخل الخلية السرطانية. وعليه؛ يمكن تقليل الاستجابات التي يتم توليدها بواسطة مربض من البشر تجاه متوالية غير بشرية (مثل بروتين) إلى الحد الأدنى بواسطة
0 التوصيل داخل الخلايا المذكور. يمكن أن تشتمل متوالية ‎DNA‏ على أكثر من جين تاقل واحد؛ على سبيل المثالء 61 2 3 أو 4 جينات ناقلة؛ ‎Jie‏ 1 أو 2. يمكن أن تشتمل مجموعة جين تاقل على أكثر من جين تاقل واحد؛ على سبيل ‎Jd)‏ 61 2 3 أو 4 جينات ناقلة ‎Jia‏ 1 أو 2 5 في واحد أو أكثر من التجسيدات يتم وضع المجموعة على النحو الموضح في واحد أو أكثر من الأشكال أو الأكثلة. تشير مجموعة جين ناقل على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لواحد أو أكثر من الجينات الناقلة فى صورة واحد أو أكثر من متواليات تشفير وواحد أو أكثر من عناصر منظمة. يمكن أن تقوم مجموعة جين ناقل بتشفير واحدة أو ‎JST‏ من متواليات ‎MRNA‏ أحادية الجينات 0 وإ/أو متعددة الجينات. فى أحد التجسيدات يقوم الجين الناقل أو مجموعة جين ناقل بتشفير ‎MRNA‏ أحادية الجينات ‎monocistronic‏ أو متعددة الجينات ©70150001ا00؛ وعلى سبيل المثال تكون المجموعة
— 5 2 — مناسبة ‎JADU‏ في مجوعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي عند موقع في ظل تحكم معزز داخلي أو معزز خارجي أو توليفة منها. تشير ‎mRNA‏ أحادية الجينات على النحو المستخدم هنا إلى جزئ ‎jis mRNA‏ ل ‎RNA‏ ‏وظيفي؛ ببتيد؛ بولي ببتيد أو بروتين مفرد. في أحد التجسيدات تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفير ‎MRNA‏ أحادية الجينات. فى أحد التجسيدات تشير مجموعة الجين الناقل فى سياق مجموعة مُشفرة ل ‎MRNA‏ أحادية الجينات إلى مقطع من ‎DNA‏ يحتوي على نحو اختياري على معزز خارجي (والذي يكون عبارة عن متوالية منظمة تحدد كيف ومتى يكون الجين الناقل ‎(Vlad‏ أو موقع جدل (والذي يكون ‎Sle‏ ‏عن متوالية منظمة تحدد متى سيتم انشطار جزئ ‎MRNA‏ بواسطة جسيم مجدول) متوالية تشفير 0 (أي الجين الناقل)؛ الذي يتم اشتقاقه ‎Bale‏ من ‎DNA‏ للبروتين محل الاهتمام» على نحو اختياري يحتوي على متوالية إشارة ‎POIYA‏ ومتوالية إنهاء . في أحد التجسيدات يمكن أن تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفير واحدة أو أكثر من متواليات ‎MRNA‏ متعددة الجينات. تشير ‎MRNA‏ متعددة الجينات على النحو المستخدم هنا إلى جزئ ‎MRNA‏ يشفر اثنين أو أكثر من ‎(ald) RNA‏ ببتيدات أو بروتينات أو توليفة منها. في أحد التجسيدات تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفير ‎MRNA‏ متعددة الجينات. فى أحد التجسيد ات تتضمن مجموعة جين ‎Jal‏ فى سياق مجموعة مُشفرة ل ‎MRNA‏ متعددة الجينات مقطع من ‎DNA‏ يحتوي على نحو اختياري على معزز خارجي (وهو عبارة عن متوالية منظمة ستحدد كيف ومتى يكون الجين الناقل ‎(Uns‏ أو موقع جدل (الذي يكون عبارة عن متوالية 0 منظمة تحدد سيتم انشطار جزئ ‎MRNA‏ بواسطة الجسيم المجدول) لاثنين أو أكثر متواليات تشفير (أي الجينات الناقلة)؛ التي يتم اشتقاقها ‎Bale‏ من ‎CDNA‏ للبروتين أو الببتيد محل اهتمام؛ على سبيل المثال حيث يتم فصل كل متوالية تشفير بواسطة إما ‎IRES‏ أو ببتيد 2/8. بعد متوالية التشفير الأخيرة المراد نسخهاء يمكن أن تحتوي المجموعة على نحو اختياري على متوالية ‎POIYA‏ ‏ومتوالية إنهاء .
في أحد التجسيدات تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفير ‎MRNA‏ أحادية الجينات يليه بواسطة ‎MRNA‏ متعددة الجينات. في تجسيد آخر تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفير ‎MRNA‏ متعددة الجينات يليع بواسطة ‎MRNA‏ أحادية الجينات. في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي عبارة عن فيروس غدي بشري. يشير تعبير 'فيروس غدي ‎"Adenovirus‏ 'نمط مصلي ‎"serotype‏ أو 'نمط مصلي فيروسي غدي ‎adenoviral‏ ‎"serotype‏ على النحو المستخدم هنا إلى أي فيروس غدي يمكن تعيينه لأي من الأنماط المصلية الفيروسية الغدية التي يزيد عددها عن 50 المعروفة ‎lly (lla‏ يتم تصنيفها إلى المجموعات الفرعية ا+-؛ وتمت أيضًا إلى أي؛ حتى ‎(oY)‏ الأنماط المصلية الفيروسية الغدية غير المحددة أو غير المصنفة. راجع؛ على سبيل المثال؛ ‎Strauss, "Adenovirus infections 1١‏ ‎humans,” in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, 10‏ ‎NY, pp. 451-596 (1984) and Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and‏ ‎Their Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe,35ea.,‏ ‎(Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)‏ على النحو الموضح في الجدول 1. 8 640173 34:21 3135 000 04ل قد قد ته قوف ذصصي2ة 8 4140 ااا 5 في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي عبارة عن المجموعة الفرعية 8؛ على سبيل المثال يتم اختياره على الحدة من المجموعة التي تشتمل على أو تتألف من: ‎Ad11 Ad7 Ad3‏ 14و 6م 8021 8034 و8051 ‎Jie‏ 8011 بشكل محدد م8011 (سلالة 6ا5105115).في ‎aa‏ التجسيدات يحتوي الفيروس الغدي الوارد في الاختراع على البروتين الغلافي ‎Jie capsid‏ هكسون و/أو ألياف فيروس غدي من المجموعة الفرعية 8؛ ‎Jie‏ 8011 بشكل محدد ‎ALP‏
— 7 2 — في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي عبارة عن 8011 أو يحتوي على ألياف و/أو هكسون و/أو بنتون 8011؛ ‎Jie‏ م8011. فى أحد التجسيدات لا يكون فيروس من المجموعة ‎A‏ ‏في أحد التجسيدات لا يكون الفيروس الغدي ‎Ble‏ عن فيروس من المجموعة 0. في أحد التجسيدات لا يكون الفيروس الغدي ‎Sle‏ عن 805. يشير 805 على النحو المستخدم هنا إلى
فيروسات غدية معروفة مخصصة للنمط المصلى 5 ‘ ولا تمتد إلى فيروسات ‎Gly, Maas‏ تشتمل على متواليات من 805. فى أحد التجسيدات لا تحتوي الفيروسات الواردة فى الكشف الحالى على بروتين ‎Ble‏ ل ‎AdS‏ ‏في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي الوارد في الكشف الحالي خيمري ‎Lexie chimeric‏ المصلي. يشير تعبير خيمري على النحو المستخدم هنا إلى فيروس يشتمل على ‎DNA‏ اثنين على الأقل من الأنماط المصلية الفيروسية المختلفة؛ والتى تتضمن أنماط مصلية من نفس المجموعة. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الحال للورم على ألياف؛ هكسون ‎Ogg‏ بروتينات من نفس النمط المصلى؛ على سبيل المثال 8011؛ بشكل محدد م8011؛ على سبيل المثال الموجودة عند
5 المواضع 31789-30812؛ 21100-18254 5 15367-13682 للمتوالية الحاملة لمجموعة العوامل الوراثية للأخير حيث تكون مواضع النوكليوتيد ‎nucleotide‏ مناظرة لهوية بنك الجينات رقم 217307399 (رقم الوصول: جي سي 689208( في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي عبارة عن ‎enadenotucirev‏ (المعروف ‎Gila‏ أيضًا ب ‎EnAd‏ و 080ع). يشير ‎Enadenotucirev‏ على النحو المستخدم هنا إلى الفيروس الغدي
0 الخيمري لمتوالية ‎chimeric adenovirus‏ رقم: 12. ويكون ‎Ble‏ عن فيروس غدي خيمري حال للورم مؤهل للنسخ له خواص علاجية محسنة مقارنة فيروسات غدية من النوع غير المعالج (راجع الطلب الدولي 2005/118825). يكون ل ‎EnAd‏ منطقة 28 خيمرية؛ والتي تتسم ب ‎DNA‏ من 0 و03 وحذوفات في 3/4. ينتج عن التغييرات البنائية في ‎enadenotucirev‏
— 8 2 — مجموعة عوامل وراثية أصغر بحوالي 3.5 كيلو قاعدة من 80110 وعليه يتم توفير ‎"nt‏ إضافي لإدخال جينات ناقلة. كما تكون ‎OVA]‏ و07/802 فيروسات غدية خيمرية مماثلة لذ ‎ls cenadenotucirev‏ تحتوي أيضًا على ‎"at‏ إضافي في مجموعة العوامل الوراثية (راجع الطلب الدولي 2008/080003). وعليه في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي عبارة عن 07801 أو 0/2 في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي حال للورم. يشير تعبير فيروس غدي حال للورم على النحو المستخدم هنا عبارة عن فيروس غدي يقوم على نحو مفضل بقتل الخلايا السرطانية مقارنة 0 في أحد التجسيدات يكون الفيروس الحال للورم ‎oncolytic Virus‏ مميت80001016 . بشكل محددء يعجل من الموت المبرمج للخلايا . في أحد التجسيدات يكون الفيروس الحال للورم ‎oncolytic virus‏ حال للخلايا6الاا10/© . يمكن تحديد النشاط الحال للخلايا للفيروسات الغدية الحالة للورم الواردة في الكشف في سلالات خلية ورم تمثيلية ودتم تحويل البيانات إلى قياس للفاعلية؛ على سبيل المثال باستخدام فيروس غدي ينتمى 5 إلى المجموعة الفرعية ©؛ ‎Jie‏ 805؛ التي يتم استخدامها كمعيار (أي أخذ فاعلية تبلغ 1 في الاعتبار). تتمثل طريقة مناسبة لتحديد النشاط الحال ‎LIAN‏ في تجرية ‎MTS‏ (راجع المثال 4الشكل 2 الوارد في الطلب الدولي 2005/118825 المتضمن هنا كمرجع). في أحد التجسيدات يكون الفيروس الحال للورم نخري انحلالي06/اا706010 . بشكل محدد؛ يتسبب في أو يعجل من نخر الخلية أو موت الخلية المولد للمناعة. في أحد التجسيدات يكون موت الخلية 0 النخري الانحلالى مميزًا لأنه يستهدف؛ وبحث الاستجابات المناعية للمرضى (العائل). ما لم يشير السياق إلى خلاف ذلك؛ يشير تعبير فيروس غدي على النحو المستخدم هنا إلى فيروس مؤهل للنسخ والنواقل الفيروسية التي يكون بها نقص في النسخ كذلك.
في أحد التجسيدات يكون الفيروس مؤهل للنسخ. يشير تعبير مؤهل للنسخ في سياق الوصف الحالي إلى يحتوي على جميع الآليات اللزمة للنسخ في الخلايا خارج الخلية الحية وداخل الخلية الحية؛ أي بدون مساعدة تعبئة سلالة الخلية. لا يكون الناقل الفيروسي؛ على سبيل المثال المحذوف في المنطقة ‎(E1‏ القادر على النسخ في سلالة خلية تعبئة متممة عبارة عن فيروس مؤهل للنسخ في السياق الحالي.
تكون النواقل الفيروسية بها نقص في النسخ وتتطلب خلية تعبئة لتوفير جيم متمم للسماح بالاستنساخ. يشير تعبير مجموعة عوامل وراثية لفيروس غدي ‎Adenovirus genome‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لبروتينات بنائية وعناصر ذات صلة بدورة حياة/وظيفة الفيروس
0 الغدي. يكون لجميع مجموعات العوامل الوراثية للفيروس الغدي البشري التي تم فحصها حتى الآن نفس التنظيم العام أي؛ توجد الجينات المشفرة لوظائف محددة عند نفس الموضع في مجموعة العناصر الوراثية الفيروسية (المُشار إليها هنا بعناصر بنائية). يكون لكل طرف لمجموعة العناصر الوراثية الفيروسية متوالية قصيرة تعرف بوحدة طرفية متكررة معكوسة (أو ‎((ITR‏ والتي تكون مطلوبة
5 للنسخ الفيروسي. تحتوي مجموعة العناصر الوراثية الفيروسية خمس وحدات نسخ مبكرة ‎ETA)‏ ‎(E45 <E3 8‏ ثلاث وحدة مبكرة متأخرة ‎١/82 (IX)‏ و2 متأخرة) ووحدة متأخرة واحدة (وحدة رئيسية متأخرة) تتم معالجتها لتوليد خمس عائلات من ‎MRNAS‏ متأخرة (5ا-1ا). تكون البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المبكرة متضمن بشكل أساسي في نسخ وتعديل استجابة الخلية العائلة للعدوى؛ ‎Cus‏ تقوم الجينات المتأخرة بتشفير البروتينات البنائية الفيروسية. تكون الجينات
0 المبكرة مسبوقة بالحرف ‎BE‏ وتكون الجينات المتأخرة مسبوقة بالحرف ا. تتم تعبئة مجموعة العوامل الوراثية للفيروسات الغدية بشكل محكم» أي؛ يوجد القليل من المتواليات غير المشفرة؛ وعليه يكون من الصعب العثور على موقع مناسب لإدخال جينات ناقلة. حدد المخترعون الحاليون اثنين من مناطق ‎DNA‏ حيث تتوافق الجينات الناقلة مع بعضها البعض؛ بشكل محدد تكون المواضع المحددة مناسبة لاستيعاب جينات ناقلة معقدة؛ مثل تلك المُشفرة
— 0 3 — لأجسام المضادة. ‎og)‏ يتم التعبير وراثيًا عن الجين الناقل بدون التأثير بالسلب على حيوية الفيروس» الخواص الأصلية مثل الخواص الحالة للورم أو الاستنساخ. في أحد التجسيدات يمكن أن يكون الفيروس الحال للورم أو الحال للورم ‎Gy Win‏ للكشف نتيجة للحذف فى المنطقة 4 و/أو 53؛ على سبيل ‎JE‏ حذف فى ‎gia‏ من المنطقة 4 أو حذف كامل في المنطقة 53؛ أو على نحو بديل حذف في ‎ein‏ من المنطقة 54 (مثل 54 أو ‎(f4‏
وحذف كامل في المنطقة ‎E3‏ على سبيل المثال على النحو الموضح في المتواليات التي تم الكشف عنها هنا. في أحد التجسيدات يكون الفيروس الحال للورم الوارد في الكشف خيمري. يشير تعبير خيمري على النحو المستخدم هنا إلى فيروس يشتمل على ‎DNA‏ من اثنين أو أكثر من الأنماط المصلية
0 المختلفة ويكون له خواص فيروس حال للورم. في أحد التجسيدات يكون الفيروس الحال للورم عبارة عن 50/0 أو ‎Gide‏ فعال منه والذي يحتفظ بخواص أساسية مفيدة للفيروس. يتم الكشف عن 50/0 في الطلب الدولي 2005/118825 (المتضمن هنا كمرجع) ودتم توفير المتوالية الكاملة للفيروس هنا في صورة المتوالية رقم :4 12. يتم توفير منطقة 28ح الخيمرية هنا في صورة المتوالية رقم: ‎AT‏
5 تتضمن الفيروسات الحالة للورم البديلة 07/8801 5 ‎«OVAd2‏ والتى يتم الكشف عنها على الوالي في صورة المتوالية رقم: 2 و3 في الطلب الدولي 2008/080003 والمتضمن هنا كمرجع. على نحو مميزء تظهر الفيروسات الغدية الواردة في الكشف الحالي انتشار فيروس مماثل»؛ على سبيل المثال سمات الاستنساخ و/أو عدم الفاعلية؛ ل 50/0 بعد الإصابة بعدوى العديد من سلالات الخلية خارج الخلية الحية لسرطان القولون المختلفة. يتعلق الكشف الحالى كذلك بمتواليات جديدة للفيروسات أو المكونات/الأجزاء المنشأة الفيروسية؛ ‎Jie‏ البلازميدات ‎plasmids‏ التي يتم الكشف عنها هنا.
في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة )1( ‎ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR (I)’5‏ حيث: تشتمل 81 على ‎¢tE1IA-E1B J EIB (EIA‏ تشتمل ‎BA‏ على ‎E2B-L1-L2-L3-‏ ‎¢E2A-L4 5‏ تكون 82 ‎gle‏ عن رابطة أو تشتمل على ‎¢B3‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ ‏على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BY 3 BX‏ عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو 0 كلاهما. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة (ا) حيث تشتمل ‎Bl‏ على ‎EIB (E1A‏ أو ‎¢E1A-E1B‏ تشتمل ‎BA‏ على ‎E2B-‏ ‏2-4 -2-13ا-1؛ تكون 82 عبارة عن رابطة أو تشتمل على ‎¢E3‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن ‎daly‏ أو تؤثر على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن ‎daily‏ وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهما. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(I)‏ حيث: تشتمل ‎BI‏ على ‎EIB (E1A‏ أو ‎¢(E1A-EIB‏ تقوم ‎BA‏ بالتأثير على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4 0‏ تكون 82 عبارة عن رابطة أو تشتمل على ‎¢E3‏ تكون ‎BX‏ ‏عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 88 عبارة عن 5ا؛ تكون 87 عبارة عن رابطة؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و8977 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهما.
— 3 2- في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة (18):
ITR-BA-B2-BX-BB-BY-B3-3’ITR (la)’5 حيث: تشتمل ‎BA‏ على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون 82 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 53؛ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل واحدة على الأقل على جين ناقل أو موضع تقييد؛ ‎Jie‏ جين ناقل. 0 في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(1a)‏ حيث: تشتمل ‎BA‏ على 4ا-28-11-12-13-22/8؛ تكون 82 عبارة عن رابطة أو تشتمل على ‎E3‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 3 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة 5 عن رابطة وتشتمل واحدة على الأقل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء ‎Jie‏ جين ناقل. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(1a)‏ حيث تشتمل ‎BA‏ على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون 82 عبارة عن رابطة أو تشتمل على ‎¢E3‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة؛ تكون 0 83 عبارة عن ‎daily‏ أو تشتمل على 54؛ ‎Gua‏ لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء ‎Jie‏ جين ناقل. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة (0ا):
ITR-BA-BX-BB-BY-B3-3’ITR 5
— 3 3 —
حيث: تشتمل ‎BA‏ على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة أو متوالية
‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على
‏5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من
‏الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء
‏مثل جين ناقل.
‏في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي
‏لها الصيغة ‎(Ib)‏ حيث: تقوم ‎BA‏ بالتأثير على ‎$E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون ‎BX‏
‏عبارة عن رابطة؛ تقوم ‎BB‏ بالتأثير على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على:
‏0 موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تؤثر على ‎Gus (E4‏ لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تيد أو كلاهماء ‎Jie‏ جين ناقل. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(Ib)‏
‏5 حيث: تشتمل ‎BA‏ على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ ‎Jail‏ على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4]؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BY 3 BX‏ عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء مثل جين ناقل.
‏0 في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة (10):
‎ITR-BA-B2-BX-BB-BY-3’ITR 5‏ حيث: تشتمل ‎BA‏ على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون 82 عبارة عن ‎¢E3‏ تكون ‎BX‏ ‏عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو
-4 3 — كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع ‎canis‏ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء مثل جين ناقل. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي 5 .لها الصيغة ‎cus (Ic)‏ تشتمل ‎BA‏ على 528-11-12-13-22/8-14؛ تشتمل 82 في ‎(E3‏ ‏تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء مثل جين ناقل. 0 في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(Ic)‏ حيث: تشتمل ‎BA‏ على ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تشتمل 82 على 3؛ تكون ‎BX‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة؛ ‎Cua‏ لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد؛ ‎Jie‏ جين ناقل. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎:)١0(‏ ‎ITR-B1-BA-BX-BB-BY-B3-3’ITR (Id)’5‏ حيث: تشتمل 81 على ‎EIB (E1A‏ أو ‎sE1A-E1B‏ تشتمل ‎BA‏ على ‎E2B-L1-L2-L3-‏ ‏4-//2؛ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر 0 .من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ ‏تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ‎Jb‏ موضع تيد أو كلاهما.
في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(Id)‏ حيث: تشتمل 81 على ‎EIB (EIA‏ أو 51/8-818؛ تكون ‎BA‏ عبارة عن ‎¢E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ ‏عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو ‎AST‏ من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BY 5 BX‏
‎Sle‏ عن رابطة وتشتمل على جين ناقل موضع تقييد أو كلاهماء ‎Jie‏ جين ناقل. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(1d)‏ حيث: تشتمل ‎Bl‏ على ‎(E1A‏ 18ت أو ‎¢E1A-E1B‏ تشتمل ‎BA‏ على ‎$E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقبيد؛
‏0 واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة؛ تكون 83 عبارة عن رابطة أو تشتمل على 4]؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BY 3 BX‏ عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل موضع تقييد أو كلاهما. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(Ie)‏
‎ITR-B1-BA-B2-BX-BB-BY-3’ITR (le)’5 5‏ حيث: تشتمل 81 على ‎E1B (EIA‏ أو ‎EIA-E1B‏ تشتمل ‎BA‏ على ‎E2B-L1-L2-L3-‏ ‏4ا-/2؛ تشتمل 82 على ‎¢E3‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو
‏0 كلاهما؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BY 3 BX‏ عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل موضع تقييد أو كلاهما. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(le)‏ حيث: تشتمل ‎Bl‏ على ‎(E1A‏ 18ت أو ‎¢E1A-E1B‏ تشتمل ‎BA‏ على 14-م28-11-12-12-2ت؛ تشتمل 82 على 53؛ تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة؛ تشتمل ‎BB‏
على 5ا؛ تكون ‎BY‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BX‏ و87 عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل موضع تقييد أو كلاهما. في أحد التجسيدات يشتمل الفيروس الغدي على مجموعة عوامل وراثية تشتمل على المتوالية التي لها الصيغة ‎(le)‏ حيث تشتمل ‎Bl‏ على ‎(E1A‏ 18ح أو ‎¢E1A-E1B‏ تشتمل ‎BA‏ على ‎E2B-‏
‎¢L1-L2-L3-E2A-L4‏ تشتمل 82 على ‎¢E3‏ تكون ‎BX‏ عبارة عن متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة أو كلاهما؛ تشتمل ‎BB‏ على 5ا؛ تكون ‎BY‏ ‏عبارة عن رابطة؛ حيث لا تكون واحدة على الأقل من ‎BY 5 BX‏ عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل موضع تقييد أو كلاهما.
‏0 في أحد التجسيدات يتم توفير مركب له الصيغة (!) (18)؛ ‎(Id) (Ic) (Ib)‏ أو ‎(le)‏ حيث لا تكون ‎BY 3 BX‏ عبارة عن رابطة وتشتمل على جين ناقل أو موضع تقييد أو كلاهماء على سبيل المثال تكون ‎BY 5 BX‏ عبارة عن جين ناقل. تشير الرابطة إلى رابطة تساهمية تربط متوالية ‎DNA‏ بمتوالية ‎DNA‏ أخرى؛ على سبيل المثال توصيل أحد أجزاء مجموعة العوامل الوراثية للفيروس بآخر. وعليه عندما يُمثل متغير في الصيغة
‎(I) 5‏ (ا)ء (0ا) (ا)؛ ‎(Id)‏ أو ‎(le)‏ رابطة فإن السمة أو العنصر الذي يتم التعبير ‎die‏ بواسطة الرابطة يكون غير موجود أي محذوف. بما أنه بنية الفيروسات الغدية تكون» بوجهٍ عام؛ مماثلة للعناصر الواردة أدناة فإنه تتم مناقشتها أدناه في ضوء العناصر البنائية والتسمية المستخدمة بصورة شائعة للإشارة إليهاء ‎lly‏ تكون معروفة لصاحب المهارة في المجال. عندما تتم الإشارة إلى عنصر هنا فإننا نشير إلى متوالية
‎DNA 0‏ مُشفرة للعنصر أو متوالية ‎DNA‏ مشفرة لنفس البروتين البنائي للعنصر الموجود في الفيروس الغدي. يكون الأخير ذو صلة بسبب تكرار كود ‎(DNA‏ يجب أخذ أفضلية الفيروسات بالنسبة لاستخدام الرامزة في الاعتبار للحصول على نتائج محسنة. يمكن أن يشتمل عنصر بنائي من فيروس غدي مستخدم في الفيروسات الواردة في الكشف الحالي أو يتألف من متوالية طبيعية أو يمكن بها تماثل بالنسبة لطول 9695 على ‎Jie «J‏ 9696؛
— 7 3 — ‎%9T‏ 9698 9699 أو 100 %. يمكن تعديل المتوالية الأصلية لحذف 9610 969 968 7ب 6ت ذك %4 %3 9762 أو %1 من مادة وراثية. يجب أن يتوخى أصحاب المهارة فى المجال الحذر أثناء إجراء تعديلات تتمثل في عدم تمزيق إطارات قراءة الفيروس بحيث لا يتم تعطيل التعبير الوراثي عن البروتينات البنائية. في أحد التجسيدات يكون العنصر المحدد عبارة عن متوالية ذات طول كامل أي جين ذي طول
كامل. فى أحد التجسيدات يكون العنصر المحدد أقل من الطول الكامل ويحتفظ بوظيفة مماثلة أو مناظرة مثل المتوالية ذات الطول الكامل. في أحد التجسيدات بالنسبة لعنصر محدد والذي يكون اختياري في الأجزاء المنشأة الواردة في
0 الكشف الحالي؛ يمكن أن تكون متوالية ‎DNA‏ أقل من الطول الكامل ولا يكن لها أي وظيفة. يتم ‎dng‏ عام ربط الجينات البنائية المُشفرة للبروتينات البنائية أو الوظيفية للفيروس الغدي بواسطة مناطق غير مشفرة ل ‎DNA‏ وعليه توجد بعض المرونة فيما يتعلق بمكان "قطع” المتوالية الحاملة لمجموعة العوامل الوراثية للعنصر البنائي محل الاهتمام (خاصة المناطق غير المشفرة ‎(A‏ بهدف إدخال جين ناقل فى الفيروسات الواردة فى الكشف الحالى. وعليه لأغراض تتعلق بالوصف مادة طفيلية. وعليه؛ إن كان ‎We‏ فإنه سيتم ريط الجين بمناطق غير مشفرة مناسبة؛ على سبيل المثال على النحو الموجود في البنية الطبيعية للفيروس. وعليه في أحد التجسيدات عند إدخال ‎gia‏ إقحام؛ ‎DNA Jie‏ مُشفر لموضع تقييد و/أو جين ‎(Jil‏ ‏في منطقة غير مشفرة 1 ‎DNA‏ لفيروس حام لمجموعة العوامل الوراثية؛ ‎Jia‏ إنترون ‎intron‏ أو
0 متالية بين الجينات1046:98010 . يمكن أن يكون لبعض المناطق غير المشفرة المذكورة للفيروس الغدي وظيفة؛ على سبيل المثال في الجدل البديل؛ تنظيف النسخ أو تنظيم التحور الوراثي؛ ويجب أخذ ذلك في الاعتبار.
تكون المواضع المحددة هناء ‎Allg‏ تكون مرتبطة بمنطقة ‎(LS‏ مناسبة لاستيعاب مجموعة من متواليات ‎DNA‏ مشفرة لوحدات معقدة ‎(RNAI Jie‏ سيتوكينات 07/10/6065 ؛ بروتينات أحادية السلسلة أو متعددة الوحدات؛ مثل أجسام مضادة. يشير تعبير جين على النحو المستخدم هنا إلى متواليات مشفرة أو أي متواليات غير مشفرة مصاحبة ‎lg‏ على سبيل المثال إنترونات وإكسونات مصاحبة. في أحد التجسيدات يشتمل الجين أو يتألف من مكونات بنائية أساسية فقطء على سبيل المثال منطقة تشفير. فيما يلي مناقشة تتعلق بالعناصر البنائية لفيروسات غدية. متواليات تكون الوحدة الطرفية المتكررة المعكوسة(> ‎Inverted Terminal Repeat )١١‏ مشتركة لجميع الفيروسات الغدية المعروفة وتمت تسميتها بهذا الاسم بسبب تماثلها؛ وتعتبر 0 مصادر الكروموسوم ‎chromosome‏ الفيروسي للاستنساخ. تتمثل خاصية أخرى لهذه المتواليات في قدرتها على تكوين حلقة على شكل دبوس الشعر. تشير 115 على النحو المستخدم هنا إلى جزءِ من ‎ITR‏ أو كله من الطرف 5” لفيروس غدي؛ الذي يحتفظ بوظيفة ‎[TR‏ عند تضمينه في فيروس غدي في موقع مناسب. في أحد التجسيدات تشتمل ‎١1475‏ على أو تتألف من متوالية من حوالي 1 زوج قاعدة إلى 138وج قاعدة من المتوالية 5 رقم:12 أو متوالية مطابقة لها بنسبة 90 95؛ 96 ‎OT‏ 98 أو 1699 بامتداد الطول الكلي؛ بشكل محدد تحتوي المتوالية على حوالي 1 زوج قاعدة 138 زوج قاعدة من المتوالية رقم: 12. تشير 113 على النحو المستخدم هنا ‎oda‏ من “11# أو كله من الطرف 3” لفيروس غدي الذي يحتفظ بوظيفة ‎[TR‏ عند تضمينه في فيروس غدي في موقع مناسب. في أحد التجسيدات تشتمل 3 على أو تتألف من متوالية من حوالي 32189 زوج قاعدة إلى 32326 زوج قاعدة من 0 متوالية رقم: 12 أو متوالية مطابقة لها بنسبة 90( 95 96 97؛ 98 أو 9699 بامتداد الطول الكلي» بشكل محدد تحتوي المتوالية على حوالي 32189 زوج قاعدة إلى 32326 زوج قاعدة من المتوالية رقم: 12.
— 9 3 — تشير 81 على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ تُشفر: جزءِ من 1/8 أو كله من فيروس غدي جزء من أو كل منطقة 18 لفيروس غدي 3 وبشكل مستقل جزءٍ من ‎E1A‏ أو كلها ومنطقة 8 لفيروس غدي. عندما تكون 81 عبارة عن رابطة فإنه سيتم ‎Cada‏ المتواليات ‎ETA‏ و18 من الفيروس. في أحد التجسيدات تكون 81 عبارة عن رابطة وعليه يكون الفيروس عبارة عن ناقل. فى أحد التجسيدات تشتمل 81 كذلك على جين ناقل. من المعروف فى المجال أن المنطقة ‎El‏ ‏يمكن أن تستوعب جين ناقل يمكن إدخاله بطريقة 485 في المنطقة 1 (أي في 'منتصف" المتوالية) أو يمكن حذف ‎oda‏ من المنطقة 51 أو كلها لتوفير مساحة أكبر لاستيعاب مادة وراثية. ‎EIA ui‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة ‎ial‏ من المنطقة ‎ETA‏ لفيروس 0 الغدي أو كلها. يشير الأخير هنا إلى ‎Jo‏ ببتيد/ ‎polypeptide‏ بروتين1/8ع] ‎protein‏ ويمكن تطفيره بحيث يحوتي البروتين المُشفر بواسطة جين ‎ETA‏ تغييرات حمض أميني محافظة أو غير محافظة؛ بحيث يكون لها: نفس وظيفة النوع غير المعالج (أي البروتين غير المطفر المناظر)؛ وظيفة زائدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج؛ وظيفة منخفضة؛ ‎ie‏ عدم وجود وظفية مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج؛ أو وجود وظيفة جديدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج أو 5 توليفة مما سبق حسب الحاجة. تشير ‎EIB‏ على النحو المستخدم هنا متوالية ‎DNA‏ مُشفرة ‎shal‏ من منطقة 518 ‎ag ill‏ الغدي أو كلها (أي بولي ببتيد أو بروتين)» يمكن تطفيره بحيث يكون للبروتين المشفر بواسطة جين إمنطقة ‎E 1 B‏ تغييرات ‎aan‏ أميني محافظة أو غير محافظة بحيث يكون لها : نفس وظيفة النوع غير المُعالج (أي البروتين غير الطفر المناظر)؛ وظيفة زائدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج ¢ وظيفة منخفضة ‎Jie‏ عدم وجود وظفية مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج ¢ أو وجود وظيفة جديدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج أو توليفة مما سبق حسب الحاجة. وعليه يمكن تعديل 81 أو عدم تعديله بالنسبة ل منطقة ‎ET‏ من النوع غير المعالج؛ ‎EIA Jie‏ و/أو ‎EIB‏ من النوع غير المعالج. يمكن أن يحدد صاحب المهارة في المجال بسهولة ما إذا كانت ‎E 1A‏ و/أو ‎E 1 B‏ موجودة أو تم حذف أو تطفير (جزء منها) .
— 0 4 — يشير عبير من النوع غير المعالج على النحو المستخدم هنا إلى فيروس غدي معروف. يكون فيروس غدي معروف عبارة عن ذلك الذي تم تحديده وتسميته؛ بغض النظر عن ما إذا كان المتوالية متاحة أم لا. في أحد التجسيدات يكون ل 81 متوالية تتراوح من 139 زوج قاعدة إلى 3932 زوج قاعدة لمتوالية رقم: 12 تشير ‎BA‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎sais DNA‏ للمناطق ‎E2B-L1-L2-L3~‏ ‎E2A-L4‏ بما في ذلك أي متواليات غير مشفرة؛ حسب الحاجة. بوجهٍ عام لن تشتمل هذه المتوالية على جين ناقل. في أحد التجسيدات تكون المتوالية مماثلة أو مطابقة إلى حدٍ لمتوالية متوالية مجاورة من فيروس غدي معروف 3 على سبيل المثال نمط مصلي موضح في الجدول 1 0 بشكل محدد فيروس من المجموعة ‎(B‏ على سبيل المثال ‎(Ad3‏ 7ادح ‎Ad16 Ad14 (Ad11‏ 1ه ‎AdST <Ad35 <Ad34‏ أو توليفة منهاء متل ‎(Ad3‏ 8011 أو توليفة منها. فى أحد التجسيدات تشير ‎E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ بأنها تشتمل على هذه العناصر والعناصر البنائية ‎gal)‏ المصاحبة للمنطقة؛ على سبيل المثال ستتضمن ‎dag BA‏ عام متوالية مشفرة للبروتين 1/28 على سبيل المثال كما يلى: ‎AV2A IV2a-E2B-L1-L2-L3-E2A-L4‏ 5 في أحد التجسيدات تكون المنطقة 28 خيمرية. بشكل محدد؛ تشتمل على متواليات ‎DNA‏ من اثنين أو أكثر الأنماط المصلية الفيروسية الغدية ‎adenoviral serotypes‏ المختلفة؛ على سبيل المثال من ‎Ad3‏ و8011؛ ‎Jie‏ م8011. في أحد التجسيدات يكون للمنطقة 28 متوالية تتراوح من 5068 زوج قاعدة إلى 10355 زوج قاعدة لمتوالية رقم: 12 أو متوالية مطابقة لها بنسبة 5 9696 9697 9698 أو 9699 بامتداد الطول الكلى. 0 في أحد التجسيدات تشتمل 28 في مكون ‎BA‏ على المتوالياات الموضحة فى متوالية رقم: 47 (المناظرة للمتوالية رقم: 3 التي تم الكشف عنها في الطلب الدولي 2005/118825. في أحد التجسيدات يكون ل ‎BA‏ متوالية تتراوح من 3933 زوج قاعدة إلى 27184 زوج قاعدة لمتوالية رقم: 12
— 1 4 — يشير 3 على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجزءِ من المنطقة ‎E3‏ للفيروس الغدي أو كلها (أي بروتين/يولي ببتيد)؛ يمكن تطفيره بحيث يكون للبروتين المشفر بواسطة جين 3 تغييرات حمض أميني محافظة أو غير محافظة؛ بحيث يكون لها نفس وظيفة النوع غير المُعالج (البروتين المناظر غير المطفر)؛ وظيفة زائدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج؛ وظيفة منخفضة؛ مثل عدم وجود وظفية مقارنةً ببروتين من النوع غير المعالج أو وجود وظيفة جديدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج أو توليفة منهاء حسب الحاجة. منهاء بشكل محدد نمط مصلى من المجموعة 8؛ على سبيل المثال 803 807 8011 (بشكل محدد ‎«(Ad 11p‏ 4مه) ‎Ad51 (Ad35 (Ad34 (Ad21 (Ad16‏ أو توليفة منهاء ‎Jie‏ 03م 0 8011 (بشكل محدد م80110) أو توليفة منها. في أحد التجسيدات يتم حذف المنطقة 3 ‎(Wha‏ على سبيل المثال يتم حذفها بنسبة 9695؛ 0 %85 9860 ذلك 970 %65 960 %55 9650 9645 9640 9035 60 %25 920 915 9610 %5 فى أحد التجسيدات تكون 82 عبارة عن رابطة؛ ‎Gua‏ يكون ‎DNA‏ المُشفر للمنطقة ‎E3‏ غير موجود . فى أحد التجسيدات يمكن استبدال ‎DNA‏ المُشفر للمنطقة ‎E3‏ أو إعاقته بواسطة جين ناقل.على النحو المستخدم هنا تتضمن "المنطقة 3 التي يتم استبدالها بواسطة الجين الناقل على النحو المستخدم هنا استبدال ‎eda‏ من المنطقة 53 أو كلها بالجين الناقل. في أحد التجسيدات تشتمل المنطقة 82 متوالية تتراوح من 27185 زوج قاعدة إلى 28165 زوج 0 قاعدة لمتوالية رقم: 12. في أحد التجسيدات تتألف 82 من متوالية تتراوح من 85 1 27 زوج قاحدة إلى 165 28 زوج قاعحدة لمتوالية رقم: 12
تشير ‎BX‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ بالقرب من الطرف 5” للجين 5ا في ‎BB‏ ‏يشير تعبير بالقرب من أو بجوار الطرف 5” للجين ‎LS‏ على النحو المستخدم هنا إلى: بالقرب من (بجوار) الطرف 5” للجين ‎LS‏ أو منطقة غير مشفرة مصاحبة بشكل متأصل له أي مرتكزة على أو مجاورة للطرف البادئ 5” للجين ‎LS‏ أو منطقة غير مشفرة مصاحبة له بشكل متأصل. على نحو بديل؛ يمكن أن تشير بجوار أو بالقرب من إلى القرب من الجين 5ا؛ بحيث لا يكون هناك
متواليات تشفير بين المنطقة ‎BX‏ والطرف 5" للجين 5ا. وعليه في أحد التجسيدات يتم ريك ‎BX‏ مباشرةً بقاعدة ‎LS‏ التي ثمثل؛ على سبيل المثال بداية متوالية التشفير للجين 5ا. وعليه في أحد التجسيدات يتم ربط ‎BX‏ مباشرةً بقاعدة 5ا التي ثمثل؛ على سبيل المثال بداية
0 متوالية غير مشفرة»؛ أو ‎Why‏ مباشرةً بمنطقة غير مشفرة مصاحبة بصورة طبيعية ل 5ا. تشير منطقة غير مشفرة مصاحبة بصورة طبيعية ل ‎LS‏ على النحو المستخدم هنا إلى جزءِ من المناطق غير المشفرة أو جميعها والتي تُمثل جزءًا من الجين 5 أو مجاور له ولكن ليس جزءًا من جين ‎CAT‏ ‏في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ متوالية من المتوالية رقم: 10. تكون هذه المتوالية عبارة عن
5 متوالية تخليقية غير مشفرة ‎Cus‏ تشتمل متوالية ‎(DNA‏ على سبيل المثال على جين ناقل (أو مجموعة جين ناقل)؛ موضع تقييد أو توليفة منها يمكن إدخاله فيها. تكون هذه المتوالية مفيدة لأنها تعمل كمنظم حيث أنها تسمح ببعض المرونة على الموقع الفعلي للجين الناقل بينما يتم تقليل التأثيرات التَمَزْقِية على ثبات وحيوية الفيروس. يمكن أن يظهر ‎ein‏ الإقحام (أجزاء الإقحام) في أي مكان داخل المتوالية رقم: 10 من الطرف
0 25 الطرف 73 أو عند أي نقطة بين أزواج القاعدة 1 إلى 201 على سبيل المثال بين أزواج القاعدة 2/1 3/2 4/3 5/4 6/5 1/6 8/7 9/8 10/9 11/10 12/11 13/12 14/13 15/14 16/15« 17/16 18/17« 19/18 20/19 21/20 22/21« 23/22« 24/23 25/24 26/25 27/26 28/27 29/28 30/29 31/30 32/31« 33/32« 34/33 35/34 36/35 37/36 38/37 39/38 40/39 41/40 42/41 43/42
3 45/44 46/45 46ر47ك 48/47 49/48 50/49 51/50« 52/51 53/52« 54/53 55/54 56/55 57/56 58/57« 59/58« 60/59 61/60« 62/61« 63/62« 64/63 65/64 66/65 61/66 68/67 69/68 70/69 71/10 72/11 73/12 14/13 15/14 16/15 01/16 18/17 79/78« 80/79« 81/80« 82/81« 83/82« 84/83 85/84 86/85 87/86 88/87 89/88 90/89 91/90 92/91 93/92« 94/93 95/94 96/95 97/96 98/97 99/98 100/99 101/100« 102/101« 103/102« 104/103« 105/104 106/105« 107/106 108/107 109/108« 110/109« 111/110« 112/111 113/112« 114/113 115/114« 116/115 117/116« 118/117« 119/118 120/119« 121/120« 122/121 123/122« 0 124/123« 125/124 126/125 127/126« 128/127 129/128« 130/129« 131/130« 132/131« 133/132 134/133 135/134 136/135 137/136« 138/137 139/138« 140/139 141/140« 142/141 143/142 144/143« 145/144 146/145 147/146 148/147 149/148 151/150« 152/151« 153/152« 154/153« 155/154 156/155« 157/156« 158/157« 159/158« 160/159 161/160« 162/161 163/162« 164/163 165/164« 166/165 167/166 168/167 169/168 170/169« 171/170 172/171 173/172( 174/173 175/174 176/175 177/176« 178/177 179/178« 180/179 181/180« 182/181« 183/182 184/183 185/184« 186/185« 187/186« 188/187 190/189« 191/190 192/191« 193/192 194/193 195/194« 0 196/195« 197/196« 198/197« 199/198« 200/199 أو 201/200 في أحد التجسيدات تشتمل ‎BX‏ على متوالية رقم: 10 مع إدخال متوالية ‎DNA‏ زوج القاعدة 27 وزوج القاعدة 28 أو مكان مناظر لمواقع تقع بين 28192 زوج قاعدة و28193 زوج قاعدة لمتوالية رقم: 12. في أحد التجسيدات يكون ‎ga‏ الإقحام عبارة عن ‎gia‏ إقحام موضع تقييد. في أحد التجسيدات 5 يشتمل ‎ga‏ إقحام موضع التقييد على واحد أو اثنين من مواضع التقييد. في أحد التجسيدات يكون
موضع التقييد ‎Ble‏ عن جزءِ إقحام موضع تقييد يبلغ 19 زوج قاعدة يشتمل على موضعي تقييد. في أحد التجسيدات يكون ‎ga‏ إقحام موضع التقييد عبارة عن جزءِ إقحام موضع تقييد يبلغ 9 زوج قاعدة يشتمل ‎aa gale‏ تقييد واحد. في أحد التجسيدات يشتمل ‎gia‏ إقحام موضع التقييد على واحد أو اثنين من مواضع التقييد وجين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل المثال واحد أو اثنين من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات يكون موضع التقييد ‎Ble‏ عن ‎ga‏ إقحام موضع تقييد يبلغ
9 زوج قاعدة يشتمل على موضعي تقييد وجين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل المثال واحد أو اثنين من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات يكون جزء إقحام موضع التقييد ‎Ble‏ عن جزءٍ إقحام موضع تقييد يبلغ 9 زوج قاعدة يشتمل على موضع تقييد واحد وجين ناقل واحد على ‎(JY‏ على سبيل المثال ‎candy‏ اثنين أو ثلاثة جينات ناقلة؛ مثل واحد أو اثنين. في أحد التجسيدات يقوم اثنين
من مواضع التقييد بإقحام واحد أو أكثر من؛ مثل اثنين من الجينات الناقلة (على سبيل المثال في مجموعة جين ناقل). في أحد التجسيدات عندما تشتمل ‎BX‏ على اثنين من مواضع التقييد تكون مواضع التقييد المذكورة مختلفة عن بعضها البعض. في أحد التجسيدات تكون مواضع التقييد الواحدة أو أكثر المذكورة الموجودة في ‎BX‏ موجودة بطبيعتها في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي المحددة التي تم إدخالها فيها. في أحد التجسيدات تكون مواضع التقييد الواحدة أو أكثر
5 المذكورة الموجودة في ‎BX‏ مختلفة عن مواضع التقييد الأخرى الموجودة في مكان آخر في مجوعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي؛ على سبيل المثال مختلفة عن مواضع التقييد الموجودة بطبيعتها و/أو مواضع التقييد التي تم إدخالها في أجزاء أخرى من مجموعة العوامل الوراثية؛ ‎Jie‏ موضع تقييد تم إدخاله في ‎BY‏ وعليه في أحد التجسيدات تسمح موضع أو مواضع التقييد بقطع ‎DNA‏ ‏الموجود في هذا ‎gall‏ على ‎dag‏ التحديد.
0 على نحو ‎uae‏ يوفر استخدام تعبير مواضع تقييد 'فريدة' انتفائية وتحكم في مكان قطع مجموعة العوامل الوراثية للفيروس؛ ببساطة باستخدام إنزيم ‎enzyme‏ التقييد الملائم. يشير القطع بشكل محدد على النحو المستخدم هنا إلى مكان استخدام إنزيم نوعي لمواضع التقييد لقطع الفيروس فقط في الموقع المطلوب؛ ‎Bale‏ موقع واحد؛ بالرغم من أنه يوجد في بعض الأحيان زوج من المواقع. يشير زوج من المواقع على النحو المستخدم هنا إلى اثنين من مواضع التقييد
— 5 4 — بالقرب من بعضها البعض والتي تم تصميمها لقطعها بواسطة نفس الإنزيم (أي لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض). في أحد التجسيدات يكون ‎gin‏ إقحام موضع التقييد عبارة عن متوالية رقم: 55. في أحد التجسيدات يكون ل ‎BX‏ متوالية تتراوح من 166 28 زوج قاحدة إلى 28366 زوج قاعحدة لمتوالية رقم: 2 1 . فى أحد التجسيدات تكون ‎BX‏ عبارة عن رابطة. تشير 88 على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة للمنطقة 5ا. على النحو المستخدم هنا تشير المنطقة 5ا إلى متوالية ‎DNA‏ تحتوي على الجين المُشفر لألياف بولى ببتيد/يروتين» حسب الحاجة في السياق. يقوم جين/منطقة ليفية بتشفير البروتين الليفي ‎fibre protein‏ وهو 0 مكوين البروتين الغلافي ‎capsid‏ الرئيسي للفيروسات الغدية. تستخدم الألياف في تمييز المستقبل وتساهم في قدرة الفيروس الغدي على الارتباط نوعيًا وإصابة الخلايا بالعدوى. في الفيروسات الواردة في الكشف الحالي يمكن أن تكون الألياف من أي نمط مصلي لفيروس غدي وتكون الفيروسات الغدية التي تكون خيمرية كنتيجة لتغيير الألياف من أحد الأنماط المصلية المختلفة معروفة . فى أحد التجسيدات تكون ‎f‏ لألياف من فيروس من المجموعة ‎B‏ ¢ يبشكل محدد 5 11 لكل ‎Adllp J‏ في أحد التجسيدات يكون لذ ‎BB‏ متوالية تتراوح من 28367 زوج قاحدة إلى 29344 زوج قاعحدة لمتوالية رقم: 12 تشير متوالية ‎DNA‏ فيما يتعلق ب ‎BY‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ بالقرب من الطرف 3” للجين ‎ILS‏ 88. يشير تعبير بالقرب من أو بجوار الطرف 3” للجين ‎LS‏ على النحو 0 المستخدم هنا إلى: بالقرب من (بجوار) الطرف 3” للجين 5ا أو منطقة غير مشفرة مصاحبة له بشكل متأصل أي مرتكزة أو مجاورة للطرف البادئ 3” للجين ‎LS‏ أو منطقة غير مشفرة مصاحبة له بشكل متأصل (أي كل المتوالية الداخلية غير المشفرة أو ‎gia‏ منها ل 15). على نحو بديل؛
— 6 4 — يمكن أن يشير بجوار أو بالقرب من إلى القرب من الجين 5ا؛ بحيث لا توجد متواليات تشفير بين المنطقة ‎BY‏ والطرف 3” للجين 5ا. وعليه في أحد التجسيدات يتم ربط ‎BY‏ مباشرةً بقاعدة ‎LS‏ التي تُمثل "طرف" متوالية التشفير. وعليه في أحد التجسيدات يتم ربط ‎BY‏ مباشرةً بقاعدة 5ا التى تُمثل "طرف" متوالية غير مشفرة؛ أو ريطها مباشرةً بمنطقة غير مشفرة مصاحبة بصورة طبيعية ل 5ا. يتم استخدامها بشكل متأصل وبصورة طبيعية تبادليًا هنا. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على متوالية من المتوالية رقم: 11. تكون هذه المتوالية عبارة عن متوالية غير مشفرة حيث تشتمل متوالية ‎(DNA‏ على سبيل المثال على إمكانية إدخال جين ناقل (أو مجموعة جين ‎(BU‏ موضع تقييد أو توليفة منها. تكون هذه المتوالية مفيدة لأنها تعمل كمنظم حيث أنها تسمح ببعض المرونة 0 على الموقع الفعلي للجين الناقل بينما يتم تقليل التأثيرات 4850 على ثبات وحيوية الفيروس. يمكن أن يظهر جزء الإقحام (أجزاء الإقحام) في أي مكان داخل المتوالية رقم: 11 من الطرف 5؛ الطرف 3” أو عند أي نقطة بين أزواج القاعدة 1 إلى 35 على سبيل المثال بين أزواج القاعدة 2/1 3/2 3ر4 5/4 6/5« 1/6 7[ 9/8 10/9 11/10 12/11 13/12 14/13 5/14 16/15 17/16 18/17 19/18 20/19 21/20 22/21 23/22 5 24/23 25/24 26/25 27/26 28/27 29/28 30/29 31/30 32/31 33/32 3 أو 35/34. في أحد التجسيدات تشتمل ‎BY‏ على متوالية رقم: 11 مع إدخال متوالية ‎DNA‏ بين مواقع تقع بين أزواج القاعدة 12 و13 أو مكان مناظر لزوج القاعدة 29356 وزوج القاعدة 29357 في متوالية رقم: 12. في أحد التجسيدات يكون ‎ga‏ الإقحام عبارة عن ‎gia‏ إقحام موضع تقييد. في أحد 0 التجسيدات يشتمل جزءٍ إقحام موضع التقييد على واحد أو اثنين من مواضع التقييد.في أحد التجسيدات يكون موضع التقييد عبارة عن جزء إقحام موضع تقييد يبلغ 19 زوج قاعدة يشتمل على موضعي تقييد. في أحد التجسيدات يكون جزءٍ إقحام موضع التقييد ‎Ble‏ عن جزءِ إقحام موضع تقييد يبلغ 9 زوج قاعدة يشتمل على موضع تقييد واحد. في أحد التجسيدات يشتمل ‎en‏ إقحام موضع التقييد على واحد أو اثنين من مواضع التقييد وجين ناقل واحد على ‎«JI‏ على سبيل
— 7 4 — المتال واحد أو اثنين أو ثلاثة جينات ناقلة؛ ‎Jie‏ واحد أو اثنين من الجينات الناقلة. فى أحد التجسيدات يكون موضع التقييد عبارة عن جزء إقحام موضع تقييد يبلغ 19 زوج قاعدة يشتمل على موضعي تقييد وجين ناقل واحد على الأقل؛ على سبيل المثال واحد أو اثنين من الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات يكون ‎gn‏ إقحام موضع التقييد عبارة عن جزءٍ إقحام موضع تقييد يبلغ 9 زوج قاعدة يشتمل على موضع تقييد واحد وجين ناقل واحد على ‎(JBI‏ على سبيل المثال واحد أو اثنين من الجينات الناقلة.في أحد التجسيدات اثنين من مواضع التقييد إقحام واحد أو أكثر من؛ مثل اثنين من الجينات الناقلة ‎le)‏ سبيل المثال في مجموعة جين ناقل). في أحد التجسيدات عندما تشتمل ‎BY‏ على اثنين من مواضع التقييد تكون مواضع التقييد المذكورة مختلفة عن بعضها البعض. في أحد التجسيدات تكون مواضع التقييد الواحدة أو أكثر المذكورة الموجودة في ‎BY‏ موجودة بطبيعتها ‎Ji) 0‏ فريدة) في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي المحددة ‎al‏ تم إدخالها فيها. في أحد التجسيدات تكون مواضع التقييد الواحدة أو ‎AST‏ المذكورة الموجودة في ‎BY‏ مختلفة عن مواضع التقييد الأخرى الموجودة في مكان آخر في مجوعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي؛ على سبيل المتال مختلفة عن مواضع التقييد الموجودة بطبيعتها أو مواضع التقييد التي تم إدخالها في أجزاء أخرى من ‎(dil olf Jal gall de gana‏ مثل ‎dle .BX‏ في أحد التجسيدات تسمح موضع أو مواضع 5 التقييد بقطع ‎DNA‏ الموجود في هذا ‎hall‏ على ‎dag‏ التحديد. في أحد التجسيدات يكون ‎gin‏ إقحام موضع التقييد عبارة عن متوالية رقم: 54. في أحد التجسيدات يكون ل ‎BY‏ متوالية تتروح من 29345 زوج قاعدة إلى 29379 زوج قاعدة لمتوالية رقم: 12 فى أحد التجسيدات تكون ‎BY‏ عبارة عن رابطة. 0 في أحد التجسيدات يكون جزء الإقحام بعد زوج القاعدة 12 في المتوالية رقم: 11. في أحد التجسيدات يكون ‎ey‏ الإقحام عند موضع زوج القاعدة 29356 تقريبًا لمتوالية رقم :4 12. في أحد التجسيدات يكون ‎ga‏ الإقحام ‎Ble‏ عن مجموعة جين ناقل تشتمل على واحد أو أكثر من الجينات الناقلة؛ على سبيل المثال 2.1 أو 3 ‎Jie‏ 1 أو 2
— 4 8 —
يشير ‎E4‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة لجزءِ من المنطقة ‎E4‏ للفيروس
الغدي أو كلها ‎(gl)‏ منطقة بولي ببتيد/بروتين)؛ ‎(Allg‏ يمكن تطفيرها بحيث يكون للبروتين المُشفر
بواسطة الجين ‎E4‏ لتغييرات ‎aan‏ أميني محافظة أو غير محافظة ويكون لها نفس وظيفة النوع
غير المُعالج (البروتين غير الطفر المناظر)؛ وظيفة زائدة ‎Alia‏ ببروتين من النوع غير المعالج؛ وظيفة منخفضة؛ مثل عدم وجود وظفية مقارنةً ببروتين من النوع غير المعالج أو وجود وظيفة
جديدة مقارنة ببروتين من النوع غير المعالج أو توليفة مما سبق حسب الحاجة.
في أحد التجسيدات يتم حذف المنطقة 54 ‎(Wha‏ على سبيل المثال يتم حذفها بنسبة 9695؛
%990 %85« %80 75ت 70فك 965 960 %55 %50 945 9640 9635
%30 %25 9620 9015 9610 أو %5 فى أحد التجسيدات المنطقة يكون للمنطقة ‎E4‏
0 متوالية تتراوح من 32188 زوج قاعدة إلى 29380 زوج قاعدة لمتوالية رقم: 12. في أحد التجسيدات تكون 83 عبارة عن رابطة؛ أي حيث تكون 4 غير موجودة. في أحد التجسيدات يكون ل 83 متوالية تحتوي على ما يتراوح من 32188 زوج قاعدة إلى 29380 زوج قاعدة لمتوالية رقم :0 12. على النحو المستخدم هنا تتضمن نطاقات العدد النقاط الطرفية.
5 سيدرك صاحب المهارة فى المجال أن العناصر الموجودة فى الصيغة الواردة هناء ‎Jie‏ الصيغة )1(« (8ا) ‎(Ib)‏ (0ا) ‎(le) 5 (Id)‏ تكون متجاورة ‎(Sag‏ أن تتضمن متواليات ‎DNA‏ غير مشفرة بجانب جينات ومتواليات ‎DNA‏ مشفرة (سمات بنائية) مذكورة هنا. في واحد أو أكثر من التجسيد ات تحاول الصيغ الواردة فى الكشف الحالى وصف متوالية موجودة بطبيعتها فى مجوعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي. في هذا السياق سيتضح لصاحب المهارة في المجال أن الصيغة
تشير إلى العناصر الرئيسية التي تميز ‎gall‏ ذو الصلة لمجموعة العوامل الوراثية ولا يقصد بها أن تكون وصف شامل لامتداد مجموعة العناصر الوراثية ‎D NA J‏ . تشير كل من ‎E45 E3 (EIB (E1A‏ على النحو المستخدم هنا على حدة إلى النوع غير المعالج ومكافئاته»؛ الصور المطفرة أو المحذوفة ‎Bisa‏ لكل منطقة على النحو الموصوف هناء بشكل محدد متوالية من النوع غير المعالج من فيروس غدي معروف.
— 9 4 — يشير تعبير ‎gia’‏ إقحام” على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ يتم تضمينها إما عند الطرف 5؛ الطرف 3” أو في مقطع مرجعي لمتوالية ‎DNA‏ بحيث تعيق المتوالية المرجعية. يكون الأخير عبارة عن متوالية مرجعية مستخدمة كنقطة مرجعية يتم بالنسبة لها وضع جزء الإقحام. في سياق الكشف الحالى توجد أجزاء الإقحام ‎dag‏ عام إما في المتوالية رقم: 10 أو المتوالية رقم: 11. يمكن أن يكون ‎On‏ الإقحام ‎Ble‏ عن جزءِ إقحام موضع تقييد؛ مجموعة جين ناقل أو كلاهما.
عند إعاقة المتوالية سيظل الفيروس مشتملًا على المتوالية الأصلية؛ ولكن ‎dng‏ عام سيكون ‎Sle‏ ‏عن اثنين من الشظايا تقوم بإقحام جزء الإقحام. فى أحد التجسيدات لا يشتمل الجين الناقل أو مجموعة جين ناقل على الإدخال غير الموجه لعامل وراثى قافز ‎transposon‏ ¢ مثل عامل وراثى قافز ‎TNT‏ أو ‎eda‏ منه. يشير عامل وراثى قافز
0 18017 على النحو المستخدم هنا إلى الإدخال غير الموجه لعامل وراثي قافز على النحو الموصوف في الطلب الدولي 2008/080003. مواضع التقييد تكون مواضع التقييد في المواقع التي تم الكشف عنها هنا (على سبيل المثال في ‎BX‏ و/أو ‎(BY‏ ‏في الفيروسات والأجزاء المنشأة الواردة في الكشف الحالي؛ مثل البلازميدات؛ لأنها تسمح بتغيير
5 الجين الناقل بسرعة و؛ على سبيل المثال بشكل نوعي عندما تكون مواضع التقييد حول الجين الناقل (الجينات الناقلة) فريدة. يشير تعبير فربد على النحو المستخدم هنا إلى مرة حدوث واحدة فقط في الفيروس أو الجزءٍ المنشأ بالكامل. في أحد التجسيدات يشتمل الجين الناقل أو مجموعة الجين الناقل على موضع تقييد عند كل
طرف؛ وعليه يتم السماح باستبدال المجموعة. موضع التقييد يكون عبارة عن موقع في متوالية ‎(Ka) DNA‏ قطعه بواسطة إنزيم تقييد؛ ‎Sale‏ ‏يكون إنزيم نوعي للمتوالية. في أحد التجسيدات يشتمل موضع التقييد على 3 إلى 22 زوج ‎(acd‏ ‏على سبيل المثال 4 إلى 22 مثتل ‏ 6 7( 8 9 00 12011 13 1514 16 17
— 0 5 — 8 ¢19 20« 21 أو 22 زوج قاعدة. تتضمن أمثلة مواضع التقييد التي يتم قطعها بواسطة إنزيمات التقييد ولكن لا تقتصر على: متوالية ‎GCGGCCGC‏ يتم قطعها بواسطة ‎Notl‏ والاأه6 تاركة لطَفَائف 5: ‎GGCC-‏ ‏متوالية 66006606 يتم قطعها بواسطة ‎Rigl 5 Fsel‏ تاركة ‎CCGG- :3 Lilia!‏ 5 . متوالية ‎GCGATCGC‏ يتم قطعها بواسطة ‎SfaAl 5 591 (Rgal (AsiS|‏ تاركة لطفائف 3 ‎AT-‏ ‏. متوالية ‎CCTGCAGG‏ يتم قطعها بواسطة ‎Sse83871 5 Sdal (Sbfl‏ تاركة ‎Castell‏ ‏1608-3 ‏متوالية ‎TGATCA‏ يتم قطعها بواسطة ‎Ksp221 «Fbal Bell‏ و 85101 تاركة ‎distal)‏ ‏0 6816-5 متوالية ‎CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG‏ | متوالية رقم: 14] يتم قطعها بواسطة ‎[-CrE1‏ تاركة ‎GTGA - 3 Clik‏ متوالية ‎TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA‏ [ متوالية رقم: 15] يتم قطعها بواسطة انا0©8-| تاركة ‎CTAA :3 Zak!‏ ‎١٠ 5‏ متوالية ‎TAGGGATAACAGGGTAAT‏ [ متوالية رقم: 76[ يتم قطعها بواسطة ‎١-‏ ‏501 تاركة لطفائف °3 ‎ATAA‏ ‏. متوالية 60006666 يتم قطعها بواسطة 5:11 تاركة لأطراف غير حادة . متوالية ‎GTTTAAAC‏ يتم قطعها بواسطة ‎Pmel (Mss|‏ تاركة لأطراف غير حادة . متوالية ‎ATTTAAAT‏ يتم قطعها بواسطة ‎Smil (Swal‏ تاركة لأطراف غير حادة 0 . متوالية ‎GGCGCGCC‏ يتم قطعها بواسطة ‎PalAl (Ascl‏ و5951 تاركة ‎Casall‏ 5" ‎CGCG‏
يمكن إنزيمات التقييد الأخرى التي تقطع نفس مواضع التمييز مناسبة ‎Lal‏ ‏في أحد التجسيدات يتم اختيار واحد أو أكثر من مواضع التقييد في ‎BX‏ و87 على حدة من موضع تقييد نوعي لإنزيم موصوف ‎(lia‏ على سبيل المثال ‎Sgfl AsiSI Fsel (Notl‏ رواآم5؛ بشكل محدد تكون جميع مواضع التقييد التي تم إدخالها مختلفة؛ مثل مواضع نوعية ل ‎Notl‏ ‏5 ومواضع نوعية ل ‎Fsel‏ موجودة في ‎Sgfl y BX‏ و5511 موجودة في ‎BY‏ ‏على النحو المناقش أعلاه في أحد التجسيدات لا تشتمل المنطقة ‎BX‏ و/أو ‎BY‏ على موضع تقييد. على نحو مميز؛ يمكن تحضير الفيروسات والأجزاء المنشأة الواردة في الكشف الحالي بدون مواضع تقييد؛ على سبيل المثال باستخدام تقنيات تخليقية. تسمح هذه التقنيات بمرونة كبيرة في تكوين الفيروسات والأجزاء المنشأة. علاوة على ذلك» توصل المخترعون الحاليون إلى أن خواص 0 الفيروسات والأجزاء المنشأة لا تنخفض عند تحضيرها بواسطة تقنيات تخليقية. المعززات يشير المعزز على النحو المستخدم هنا إلى منطقة ‎DNA‏ تبدأ استنساخ جين أو جينات محددة. توجد المعززات ‎dag‏ عام بالقرب من جينات تقوم بنسخهاء على نفس الجديلة وبشكل قبلي (أي 5) على ‎DNA‏ يشير تعبير بالقرب من على النحو المستخدم في هذا السياق قريب بشكل كافٍ ليعمل كمعزز. في أحد التجسيدات يتراوح المعزز بين 100 زوج قاعدة موضع بدء الاستنساخ. وعليه يشير معزز داخلي على النحو المستخدم هنا إلى معزز موجود بطبيعته أي (أي أصلي تجاه) الفيروس الغدي (أو ‎eda‏ منشاً) الذي يتم فيه إدخال الجين الناقل. في واحد أو أكثر من التجسيدات يكون المعزز الداخلي المستخدم عبارة عن المعز الموجود بطبيعته في الفيروس في موقعه الرئيسي في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس؛ بشكل محدد يكون ذلك هو المعزز الأساسي 0 أو الوحيد المستخدم في التعبير الوراثي عن الجين الناقل أو الجينات الناقلة. في أحد التجسيدات يكون المعزز الداخلي المستخدم في تعزيز التحور الوراثي ‎og‏ نحو اختياري استنساخ الجين الناقل يكون دائم؛ أي مدمج في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي ولم يتم إدخاله مسبقًا بواسطة تقنيات ناتج عودة الارتباط الجيني.
— 5 2 —
يشير تعبير في ظل تحكم معزز داخلي على النحو المستخدم هنا إلى مكان إدخال الجين الناقل/مجموعة جين ناقل في اتجاه مناسب ليتم الحكم بها بواسطة المعزز الداخلى المذكور. بشكل محدد؛ عندما يكون المعزز ‎dag‏ عام على الجديلة المضادة لاتجاه النسخ؛ يتم إدخال المجموعة؛ على سبيل ‎JE‏ في الاتجاه المضاد لاتجاه ‎antisense orientationz.all‏ .
ولكن بالرغم من ذلك؛ يمكن التعبير وراثيًا عن الجينات في واحد أو اثنين من الاتجاهات. مع ذلك؛ ‎dag‏ عام يوفر أحد الاتجاهات مستويات مرتفعة من التعبير الوراثي مقارنةٌ بالاتجاه الآخرء لجين ‎Jal‏ محدد (خاص) . في أحد التجسيدات تكون المجموعة في اتجاه النسخ. بشكل محدد؛ يتم نسخها في الاتجاه 5” إلى 3. في أحد التجسيدات تكون المجموعة في الاتجاه المضاد لاتجاه النسخ. بشكل محدد؛ يتم
0 نسخها في الاتجاه 3” إلى 5”. يمكن استخدام المعززات الداخلية الموجودة في الفيروس؛ على سبيل المثال؛ بواسطة استخدام جين مُشفر لجين ناقل ومتوالية مستقبل جدل. وعليه فى أحد التجسيدات ستشتمل المجموعة على مستقبل ‎Jaa‏ متوالية عندما تكون فى ظل تحكم معزز داخلى. وعليه في أحد التجسيدات تشتمل متوالية التشفيرء على سبيل المثال المتوالية المشفرة للجسم المضاد أو شظية ارتباط بجسم مضاد
5 أيضًا على متوالية مستقبل ‎splice acceptordaa‏ . في أحد التجسيدات يكون الجين الناقل؛ الجينات الناقلة؛ أو مجموعة الجين الناقل في ظل تحكم معزز ‎E4‏ أو معزز متأخر رئيسي؛ ‎Jie‏ المعزز المتأخر الرئيسي (معزز ‎(ML‏ ‏يشير تعبير في ظل تحكم على النحو المستخدم هنا إلى تنشيط الجين الناقل؛ أي نسخه؛ عندم يحدد معزز محدد ذلك.
0 يشير المعزز المتأخر الرئيسي ‎Major Late Promoter‏ (معزز 1/ا أو ‎(MLP‏ على النحو المستخدم هنا إلى معزز الفيروس الغدي الذي يتحكم في التعبير الوراثي عن جينات 'معبر عن عنها وراثيًا بشكل ‎ale‏ ¢ مثل الجين 5ا. يكون ‎MLP‏ عبارة عن معزز "جديلة في اتجاه النسخ50800 ‎sense‏ ". بشكل محدد؛ يؤثر المعزز على الجينات التي تكون موجودة بعد المعزز
في الاتجاه 3-75”. يشير المعزز المتأخر الرئيسي على النحو المستخدم هنا إلى معزز متأخر
رئيسي أصلي موجود في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس.
يشير معزز 54 على النحو المستخدم هنا إلى معزز الفيروس الغدي للمنطقة 54. تكون المنطقة
4 عبارة عن منطقة مضادة لاتجاه النسخ؛ وعليه يكون المعزز عبارة عن معزز مضاد لاتجاه النسخ. بشكل محدد؛ يكون المعزز قبل المنطقة 4 في الاتجاه 5-73 وعليه قد تحتاج أي
مجموعة جين ناقل في ظل تحكم المعزز 54 للتوجيه بشكل مناسب. في أحد التجسيدات تكون
المجموعة في ظل تحكم المعزز 54 في الاتجاه المضاد لاتجاه النسخ. في أحد التجسيدات تكون
المجموعة في ظل تحكم المعزز 54 في اتجاه النسخ. يشير معزز 4 على النحو المستخدم هنا
إلى معزز 54 الأصلي الموجود في مجموعة العوامل الوراثية للفيروس.
0 وعليه في أحد التجسيدات يتم توفير فيروس غدي حال للورم مؤهل للنسخ نمط مصلي 11 (مثل 10)) أو مشتق فيروسي منه حيث تكون الألياف؛ الهكسون والبروتين الغلافي ذات نمط مصلي 11 (مثل م80110)؛ حيث تشتمل مجموعة العوامل الوراثية للفيروس على متوالية ‎DNA‏ ‏مُشفرة لجسم مضاد علاجي أو شظية ارتباط بجسم ‎Cus alias‏ يتم اختيار متوالية ‎DNA‏ المذكورة في ظل تحكم معزز موجود داخل الفيروس الغدي من تلك التي تتألف من 54 والمعزز المتأخر
5 الرئيسي (أي معزز 54 أو المعزز المتأخر الرئيسي)؛ بحيث لا يتداخل الجين الناقل مع استنساخ ‎cag ail‏ على سبيل المثال يكون مصاحب للمنطقة ‎LS‏ (أي قبل أو بعد المنطقة المذكورة)؛ ‎Jie‏ ‏وجوده بعد ‎(ALS‏ مجموعة العوامل الوراثية للفيروس؛ على سبيل المثال على النحو الموضح في متوالية رقم: 1 إلى 9 46؛ 48 إلى 53 56 إلى 63 69-66 و713-72. في أحد التجسيدات يتم إدخال معزز داخلي في مجموعة العوامل الوارثية للناقل عند موقع مطلوب
0 بواسطة تقنيات ناتج عودة الارتباط الجيني؛ على سبيل المثال يتم إدخاله في مجموعة الجين الناقل. مع ذلك؛ في سياق الوصف الحالي يتتم الإشارة إلى هذا الترتيب ‎dag‏ عام بمعزز خارجي. في أحد التجسيدات تشتمل مجموعة الجين الناقل على معزز خارجي. يشير معزز خارجي على النحو المستخدم هنا إلى معزز غير موجود بطبيعته في الفيروس الغدي الذي يتم فيه إدخال الجين الناقل. ‎Glas‏ تكون المعززات الخارجية من فيروسات أخرى أو تكون عبارة عن معززات ثديية.
يشير معزز خارجي على النحو المستخدم هنا إلى عنصر ‎DNA‏ يوجد ‎Bale‏ قبل الجين محل الاهتمام؛ والذي ينظم استنساخ الجين. في أحد التجسيدات يكون منظم التعبير الوراثي عن الجين ‎Ble‏ عن معزز خارجي؛ على سبيل المثال ‎CMV‏ (معزز الفيروس المضخم للخلايا !010000196 ‎cytomegalovirus‏ )؛ ‎CBA‏ (معزز بيتا أكتين مأخوذ من ‎chicken beta actin promoterz laall‏ ( أو ‎PGK‏ (معزز فُسْفُوجليسَرات كيناز ‎phosphoglycerate kinase 1 promoter]‏ )؛ مثل معزز ‎.CMV‏ ‏في أحد التجسيدات يكون لمعزز ‎CMV‏ الخارجي المستخدم متوالية نوكليوتيد ‎nucleotide‏ ‏لمتوالية رقم: 13. في أحد التجسيدات يكون لمعزز ‎PGK‏ الخارجي المستخدم متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 14. في أحد التجسيدات يكون لمعزز ‎CBA‏ الخارجي متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 0 15. في أحد التجسيدات يتم توفير فيروس غدي حال للورم مؤهل للنسخ نمط مصلي 11 (مثل م10)) أو مشتق فيروسي منه حيث تكون الألياف؛الهكسون والبروتين الغلافي ذات نمط مصلي 1 (مثل ‎(Ad11p‏ حيث تشتمل مجموعة العوامل الوراثية للفيروس على متوالية ‎seis DNA‏ لجسم مضاد علاجي أو شظية ارتباط بجسم مضاد توجد في جزءِ من مجموعة العوامل الوراثية 5 للفيروس التي يتم التعبير عنها ‎Gi‏ بشكل متأخر في دورة استنساخ الفيروس وبحيث لا يتداخل الجين الناقل مع استنساخ الفيروس» حيث تكون متوالية ‎DNA‏ المذكورة في ظل تحكم معزز خارجي للفيروس الغدي (على سبيل المثال معزز ‎(CMV‏ في أحد التجسيدات تكون متوالية ‎DNA‏ المُشفرة لجسم مضاد أو شظية مصاحبة للمنطقة 5ا على النحو الموصوف هنا. في أحد التجسيدات يكون المعزز الخارجي عبارة عن معزز خلية يعطي مولد ضد. يشير معزز 0 خلية يعطي مولد ضد على النحو المستخدم هنا إلى معزز لجين يتم التعبير عنه وراثيًا بصورة نوعية بواسطة خلايا تعطي مولد ضدء مثل الخلايا الشجرية أو الخلايا الملتهمة الكبيرة. تتضمن هذه الجينات ولكن لا تقتصر على: 11-3 ‎«CDlc «CDla (TLRs (FLT-3 Lily‏ ‎«CD207 «CD205 «CD172a «CD123 «CD86 «CD83 0080 «CD11c «CD11b‏ ‎«CXCR4 (CD287 «CD289 00286 00283 CD281 «CD273 «CD209‏ رابط
— 5 5 — الاق ‎<IL-23 <IL-12 FN-a2‏ 11ااء ‎¢ILTS <ILT4 ¢ILT3 «ILT2‏ 11-17 مستقبل ‎XCR1 «CLECY9a (CADM] «CD303 00141 (TSLP‏ أو 060304 ؛ عوامل وسيطة لمعالجة وتقديم ‎CTIA Jia Aa A ga‏ أو ‎dle GILT‏ فى أحد التجسيدات يكون المعزز الخارجى مناسب للتعبير الوراثى الانتقائى عن جينات ناقلة فى الخلايا المذكورة ‎All‏ تعطى ‎Age‏ ‏5 ضد.
متواليات منظمة أخرى يشير "منظم التعبير الوراثي عن ‎Regulator of gene expression pall‏ ' (أو عنصر منظم/تنظيمي) على النحو المستخدم هنا إلى سمة وراثية؛ ‎Jie‏ معززء محسن أو مستقبل جدل متوالية يلعب دورًا في التعبير الوراثي عن الجين؛ نمطيًا بواسطة بدء أو تحسين الاستنساخ أو
0 التحور الوراثي. يشير 'متوالية مستقبل ‎Splice acceptor sequence Jas‏ " 'مستقبل جدل ‎splice acceptor‏ ' أو ‎splice sitedas ads’‏ ' على النحو المستخدم هنا إلى متوالية منظمة تحدد متى سيتم تمييز جر ‎MRNA‏ بواسطة بروتينات ردبو نوكليوتيدية النووية الصغيرة لمعقد الجسيم المجدول . فور تجميعه يقوم الجسيم المجدول بتحفيز الجدل بين موقع مستقبل الجدل لجزئ ‎MRNA‏ إلى موقع
‎wile 5‏ جدل قبلي منتج ‎MRNA (gal‏ ناضج ‎(Sar‏ تحويره وراثيًا لإنتاج بولي ببتيد أو بروتين واحد. يمكن استخدام متواليات مستقبل جدل مختلفة في الاختراع الحالي ويمكن وصفها على أنها مستقبل جدل قصير (صغير) 3 مستقبل جدل (متوسط) ومستقبل جدل متفرع (كبير) . يشير ‎SSA‏ على النحو المستخدم هنا إلى مستقبل جدل قصير » يشتمل نمطيًا على موقع الجدل فقطء على سبيل المثال 4 زوج قاعدة. يشير ‎SA‏ على النحو المستخدم هنا إلى مستقبل جدل؛
‏0 يشتمل ‎Gha‏ على مستقبل الجدل القصير ومسار البولي بيرميدين» على سبيل المثال 16 زوج قاعدة. يشير 05/8 على النحو المستخدم هنا إلى مستقبل جدل متفرع؛ يشتمل نمطيًا على مستقبل الجدل القصيرء مسار بولي بيرميدين ونقطة التفرع؛ على سبيل المثال 26 زوج قاعدة. في أحد التجسيدات يتم توضيح مستقبل الجدل المستخدم في الأجزاء المنشأة الواردة في الكشف في متوالية رقم: 16 إلى 18. في أحد التجسيدات يكون ل ‎SSA‏ متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 16.
في أحد التجسيدات يكون ل 5/8 متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 17. في أحد التجسيدات يكون ل
‎DSA‏ متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 18. في أحد التجسيدات يتم اختيار متوالية مستقبل الجدل
‏على حدة من المجموعة التي تشتمل على: 110866 0011101010 ‎TGCTAATCTT‏
‏(متوالية رقم: 18(« ‎CCTTTCTCTCTT CAGG‏ (متوالية رقم: 17(« و0866 (متوالية رقم: 16(
‏في أحد التجسيدات يستمر موقع الجدل مباشرةً (أي يتم اتباعه في الاتجاه 5” إلى 3( بواسطة
‏متوالية ‎Kozak‏ التوافقية التي تشتمل على ‎.CCACC‏ في أحد التجسيدات ‎the‏ موقع جدل ويتم
‏تخلل متوالية ‎Kozak‏ بما يصل إلى 100 زوج قاعدة أو أقل. في أحد التجسيدات يكون لمتوالية
‎.45 ‏متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم:‎ Kozak
‏0 نطيًاء عندما تكون في ظل تحكم معزز داخلي أو خارجي (مثل معزز داخلي)؛ ستكون متوالية التشفير مسبوقة مباشرةٌ بمتوالية ‎Kozak‏ تتم الإشارة إلى بداية منطقة التشفير بواسطة رامزة بدء ‎(AUG)‏ على سبيل المثال يكون في سياق متوالية ‎(gec)gecRecAUGY‏ [ متوالية رقم: 77[ تتم الإشارة إلى بداية متوالية التشفيربواسطة القواعد المشار إليها بالخط العريض. يشير الحرف الصغير إلى القواعد المشتركة في هذا الموضع (والتي يمكن أن تكون بالرغم من ذلك متفاوتة)
‏5 وتدل الحرفو الكبيرة إلى قواعد محفوظة بدرجة كبيرة؛ أي تكون المتوالية ' 8066" ثابتة أو نادرًا ما تتغير» إن وجد؛ تدل ‎RY‏ على ملاحظة بورين (أدنين ‎adenine‏ أو جوانين 9080106 ) عادةً في هذا الموضع ولا تُمثل المتوالية الموجودة بين الأقواس ‎(GCC)‏ أهمية محددة. وعليه في أحد التجسيدات يتم تضمين رامزة البدء ‎AUG‏ في متوالية ‎Kozak‏ ‏تشير متوالية ‎DNA‏ لمدخل ريبوسوم داخلي على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ‎DNA‏ مُشفرة
‏0 لمتوالية مدخل ريبوسوم داخلي ‎Internal Ribosome Entry Sequence (IRES)‏ تشير ‎IRES‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية نوكليوتيد تسمح ببدء نسخ متوالية مرسال ‎RNA‏ ‎Ly (MRNA)‏ في ذلك البدء ‎Jala‏ متوالية ‎MRNA‏ يعتبر ذلك مفيد بشكل خاص ‎Lovie‏ تقوم المجموعة بتشفير ‎MRNA‏ متعدد الجينات. يؤدي استخدام ‎IRES‏ في ‎MRNA‏ متعدد الجينات التي يتم تحويرها ‎Gy‏ إلى العديد من البروتينات أو الببتيدات المستقلة. في أحد التجسيدات يكون
‏5 لمتوالية ‎DNA‏ لمدخل رببوسوم داخلي متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 19. في أحد التجسيدات يتم
استخدام ‎IRES‏ محدد لمرة واحدة فقط في مجموعة العوامل الوراثية. يمكن أن يكون لذلك فوائد فيما يتعلق بثبات مجموعة العوامل الوراثية. يشير 'ببتيد 82 ذو فاعلية انشطار ذاتي عالية' أو "ببتيد ‎"A peptide 2A2‏ على النحو المستخدم هنا إلى ‎any‏ ينتشطر على نحو فعال بعد التحور الوراثي. تتضمن ببتيدات 82 المناسبة ‎(PA‏
‎(F2A 5‏ 28ج و128. لاحظ المخترعون الحاليون أنه فور استخدام متوالية ‎DNA‏ نوعية مُشفرة لببتيد ‎A2‏ محدد؛ قد لا يتم استخدام نفس متوالية ‎DNA‏ النوعية مرة أخرى. مع ذلك؛ يمكن استخدام التكرار في كود ‎DNA‏ لتوليد متوالية ‎DNA‏ يتم تحويرها ‎Gs‏ في نفس ببتيد 82. يكون استخدام ببتيدات 82 مفيد بشكل خاص عندما تقوم المجموعة بتشفير ‎MRNA‏ متعدد الجينات. ينتج عن استخدام ببتيدات ‎A2‏ سلسلة بولي ببتيد مفردة يتم تحويرها وراثيًا والتي يتم تعديلها ما بعد
‏0 التحور الوراثي لتوليد العديد من البروتينات أو الببتيدات المفردة. في أحد التجسيدات يكون لببتيد ‎P2A‏ المشفر المستخدم متوالية الحمض الأميني للمتوالية رقم: 5. في أحد التجسيدات يكون لببتيد ‎F2A‏ المُشفر المستخدم متوالية الحمض الأميني للمتوالية رقم: 26. في أحد التجسيدات يكون لببتيد ‎E2A‏ المشفر المستخدم متوالية الحمض الأميني للمتوالية رقم: 27. في أحد التجسيدات يكون لببتيد ‎T2A‏ المشفر المستخدم متوالية الحمض
‏5 الأميني للمتوالية رقم: 28. في أحد التجسيدات يشتمل ‎MRNA‏ أو كل ‎MRNA‏ مشفر بواسطة جين ناقل على متوالية إشارة تذييل بعديد الأدينيلات؛ ‎Jie‏ نمطيًا عند طرف متوالية ‎MRNA‏ على سبيل المثال على النحو الموضح في متوالية رقم: 20. وعليه يشتمل أحد تجسيدات الجين الناقل أو مجموعة الجين ‎JE‏ ‏على متوالية واحدة على الأقل مُشفرة لمتوالية إشارة تذييل بعديد الأدينيلات.
‏0 يشير تعبير "هلاه" "إشارة تذييل بعديد الأدينيلات 51958 ‎Polyadenylation‏ " أو 'متوالية ‎Hu‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات 560060706 ‎polyadenylation‏ على النحو المستخدم هنا متوالية ‎(DNA‏ تحتوي ‎Bale‏ على موضع 81ل والذي فور استنساخه يمكن تمييزه بواسطة معقد بروتين متعدد يعمل على انشطار وتذييل جزئ ‎MRNA‏ الناشىء بعديد الأدينيلات. في أحد التجسيدات يون لمتوالية ‎Jul‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات متوالية نوكليوتيد لمتوالية رقم: 20.
— 8 5 — فى أحد التجسيدات لا يتضمن ‎gall‏ المنشاً متوالية تَذَبِيلٌ بِعَدِيدٍ الأدينيلات. فى أحد التجسيدات يكون منظم التعبير ‎Abell‏ عن الجين عبارة عن متوالية مستقبل جدل. في ‎af‏ التجسيدات تشتمل المتوالية المُشفرة لبروتين/بولى ببتيد/ببتيد؛ ‎Jie‏ جسم مضاد أو جسم مضاد شظية ‎Wiad‏ على إشارة تذييل بعديد الأدينيلات. عوامل تشفير جين ناقل في أحد التجسيدات تقوم الجين الناقل أو الجينات الناقلة بشكل مستقل بتشفير بروتين؛ ‎(Sh afin‏ ‎dic (RNA‏ جزئ ‎RNA‏ على نحو مميز يمكن توصيل الجين الناقل بين الخلايا ‎(Sarg‏ نسخه بعد ذلك وتحويره وراثيًا حسب الحاجة. تتضمن أمثلة ‎sale‏ وراثية مُشفرة بواسطة جين ناقل» على سبيل المثال أجسام مضادة أو شظايا ارتباط منهاء كيموكينات ‎chemokines‏ « ‎cytokinesis 0‏ « عوامل معزّلة ‎immunmodulatorsde lic‏ « إنزيمات ‎enzymes‏ ‏(على سبيل المثال قادرة على تحويل عقار أولي في العامل الفعال) وجزئ ‎RNAI‏ ‏يشير ببتيد على النحو المستخدم هنا إلى متوالية حمض أميني 801100 بها ما يتراوح من 2 إلى 0 وحدة بنائية؛ على سبيل المثال 5 إلى وحدة بنائية. يشير بولي ببتيد على النحو المستخدم هنا إلى متوالية حمض أميني بها أكثر من 50 وحدة بنائية بدون بنية ‎(AEE‏ بشكل محدد بدن بنية 5 ثائية وثلاثية. يشير البروتين إلى متوالية حمض أميني بها أكثر من 50 وحدة بنائية؛ بها بنية ثنائية و/أو ‎ADE‏ بشكل محدد بها بنية ثنائية وثلاثية. في أحد التجسيدات تقوم المتوالية المُشفرة بتشفير ‎(ale RNA‏ ببتيد علاجي؛ بولي ببتيد علاجي أو جين علاجي (أي يكون عبارة عن جين علاجي). يشير الجين العلاجي على النحو المستخدم هنا إلى جين يُشفر وحدة يمكن أن تكون مفيدة في 0 علاج؛ تحسين أو منع مرض؛ على سبيل المثال الجين الذي يعبر ‎Gly‏ عن جين علاجي؛ بولي ببتيد؛ ببتيد أو ‎(RNA‏ والذي يعمل على الأقل على إبطاء؛ إيقاف أو عكس تفاقم مرض؛ ‎Jie‏ ‏السرطان .
في أحد التجسيدات يؤدي الكيان الذي يتم تشفيره بواسطة الجين الناقل عند استنساخه أو تحويره وراثيًا في خلية؛ مثل خلية سرطانية؛ إلى زيادة إنتاج إشارات الخطر بواسطة الخلية. تشير "إشارات الخطر" على النحو المستخدم هنا إلى مجموعة من الجزيئات التي يتم إنتاجها بواسطة خلايا تتعرض للإصابة؛ الإجهاد أو الموت غير المبرمج الذي يعمل كإشارات إنذار؛ على سبيل المثال
بواسطة تحفيز خلايا الجهاز المناعي الفطري على الاستجابة ‎Bale‏ بجانب العمل على تحسين تنشيط خلايا الجهاز المناعي التكيفي. من المعروف أن البيئة الدقيقة للأورام عادة ما تتغير بحيث يتم تقليل الاستجابات المناعي البشرية الطبيعية بشكل متحكم فيه. وعليه من المحتمل أن تكون القدرة على إعادة بدء الاستجابات المناعية من داخل الورم مثيرة للاهتمام بدرجة كبيرة في علاج السرطان.
0 في أحد التجسيدات يتم تصميم الببتيد العلاجي أو البروتين المُشفر ليتم إفرازه في البيئة خارج الخلايا. في أحد التجسيدات يتم إطلاق ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين» مثل الجسم المضاد في البيئة الدقيقة الخارجية للخلية؛ على سبيل المثال في مادة طافية لمستنبت؛ أو داخل الخلية الحية: نسيج؛ الخلايا السدوية؛ الدورة الدموية؛ جهاز الدم و/أو الليمفاوي ‎Jymphatic‏
في أحد التجسيدات يشتمل الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين؛ المُشفر بواسطة الجين ‎Jil‏ على إشارة المتوالية. يشير إشارة ببتيد على النحو المستخدم هنا إلى متوالية ببتيد قصيرة بها 36-13 وحدة بنائية توجد عند الطرف لا للبروتينات والتي تساعد في دخول البروتين في المسار الإفرازي للإفراز أو التعبير ‎Gly‏ عن الغشاء. في أحد التجسيدات يكون للمتوالية الرائدة (إشارة ببتيد) متوالية الحمض الأميني للمتوالية رقم: 21 أو 22.
0 في تجسيد آخر يتم تصميم الببتيد العلاجي أو البروتين المُشفرء ‎Jie‏ جسم مضاد ليتم التعبير ‎aie‏ ‏وراثيًا في هيئة صورة مثبتة بالغشاء في سطح غشاء الخلية؛ على سبيل المثال بواسطة تضمين تشفير نطاق عبر الغشاء في البروتين أو موضع لربط مثبت غشاء دهني. في أحد التجسيدات يتم إطلاق ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين؛ ‎fio‏ جسم مضاد من خلية يتم نقل العدوى إليها بواسطة الفيروس الغدي؛ على سبيل المثال بواسطة الإفراز الفعال أو
— 0 6 — كنتيجة لتحلل الخلية. وعليه في أحد التجسيدات يقوم الفيروس الغدي بتحليل الخلية؛ وعليه يتم إطلاق ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين» ‎Jie‏ جسم المضاد. في تجسيد آخر يتم تصميم الببتيد العلاجي أو البروتين المُشفر؛ مثل جسم مضاد ليتم احتجازه في الخلية السليمة.
على نحو مميز؛ يمكن الكشف عن ‎RNA‏ الوظيفي » الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين» ‎Jie‏ أجسام مضادة يتم التعبير عنها بواسطة فيروسات غدية واردة في الكشف الحالي في نسيج داخل الخلية الحية في صورة كل من ‎mRNA‏ (راجع الشكل 16 الشكل 1 4ج( ودروتين جسم مضاد (راجع الشكل 17 الشكل 35ب). علاوة على ذلك؛ يمكن ربط ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد أو البروتين المُعبر ‎die‏ وراثيًاء مثل الجسم المضاد بالمركب الترابطي الخاص به في ‎ELISA‏ (راجع الشكل
0 17ب). علاوة على ذلك؛ يمكن الكشف عن ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد؛ البولى ببتيد أو البروتين» مثل الجسم المضاد مبكرًا (خلال 3 أيام من الإصابة بالعدوى راجع الشكل 18ب) وبستمر التعبير الوراثي لعدة أسابيع (راجع الأشكال 17 و18ب). فى أحد التجسيدات تعبر فيروسات غدية واردة فى الكشف الحالى ‎Gilg‏ عن ‎RNA‏ الوظيفى ‎can‏ البولي ببتيد أو البروتين؛ مثل الأجسام المضادة خلال حوالي 3 أو أكثر من الإصابة
5 بالعدوى؛ ‎Jie‏ خلال حوالي 36؛ 48 60 أو 72 ساعة؛ أو ‎Jie‏ 2؛ 3؛ 4؛ 5 أو 6 أيام. فى أحد التجسيدات تعبر فيروسات غدية واردة فى الكشف الحالى ‎Gilg‏ عن ‎RNA‏ الوظيفى ‎casa)‏ البولي ببتيد أو البروتين» ‎Jie‏ الأجسام المضادة لعدة أسابيع؛ مثل حوالي 1 2 3 4 5 أو 6 أسابيع. مثل ‎T‏ 8 9 قل 120011 13 15014 16 18.17 ¢19 20 21 22 23 24 ذك 6ك 27« 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37« 38 39«
0 40 41 أو 42 أيام. على نحو مميز؛ يكون التعبير الوراثي عن ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد أو البروتين؛ ‎Jie‏ الجسم المضاد عالي بشكل كافي للتمكن من الكشف عن ‎RNA‏ الوظيفيء الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين» ‎Jie‏ الجسم المضاد في الدم (راجع الشكل 19( الشكل 35ب).
في أحد التجسيدات؛ يدخل ‎caudal} RNA‏ الببتيد أو البروتين؛ مثل الأجسام المضادة المُعبر عنها ‎Gig‏ بواسطة الفيروس الغدي الوارد في الكشف الحالي في تيار الدم و/أو الجهاز الليمفاوي. في أحد التجسيدات يكون الفيروس الغدي الوارد في الكشف الحالي عبارة عن فيروس حال للورم والذي يكون له مؤشر علاجي مُحسن للخلايا السرطانية.
في أحد التجسيدات تقوم المتوالية المُشفرة بتشفير ‎RNA‏ الوظيفي؛ على سبيل المثال ‎RNA‏ ‏علاجي. ‏يشير ‎RNA‏ الوظيفي على النحو المستخدم هنا إلى ‎RNA‏ له وظيفة بخلاف تشفير البروتين أو الببتيد ويتضمن على سبيل المثال أجزاء ‎RNA‏ منشأة مناسبة لتثبيط أو تقليل نشاط الجين؛ بما في ذلك ‎shRNA (ic (RNA‏ وغخللأه. تشير ‎ShRNA‏ على النحو المستخدم هنا إلى حلقة
‎RNA 0‏ على شكل دبوس شعر قصيرة والتي تكون عبارة عن متوالية ‎RNA‏ تقوم بعمل لفة حلقة على شكل دبوس شعر محكمة لإخماد التعبير الوراثي المستهدف عن الجين بواسطة تداخل ‎.RNA (RNAI)‏ تشير ‎MIRNA (microRNA)‏ على النحو المستخدم هنا إلى جزئ ‎RNA‏ ‏صغير غير مُشفر (يحتوي على حوالي 22 نوكليوتيد) والذي ‎cam‏ من خلال ازدواج القواعد مع متاليات متممة داخل جزيئات ‎dmMRNA‏ على تنظيم التعبير الوراثي عن الجين عند مستوى
‏5 الاستنساخ أو ما بعد الاستنساخ. يتم إخماد جدائل ‎MRNA‏ مقيدة بواسطة ‎MIRNA‏ لأنه لا ييمكن تحويرها وراثيًا في بروتينات بواسطة الريبوسومات 00500765 ؛ وعادة ما يتم فك هذه المعقدات بفاعلية بواسطة الخلية. في أحد التجسيدات يقوم الجين الناقل بتشفير بروتين. يتضمن البروتين على النحو المستخدم هنا مركب بروتين ترابطي؛ مستقبل بروتين؛ أو ‎(Sa‏ جسم مضاد.
‏0 يشير مركب بروتين ترابطي على النحو المستخدم هنا إلى غشاء سطح الخلية أو شظايا ارتباط ببروتينات مفرزة منهاء ترتبط أو بخلاف ذلك تتعشق بالمستقبلات الخلوية للتأثير على وظيفة ‎cds‏ على سبيل المثال بواسطة تحفيز إرسال الإشارات داخل الخلية وتعديل استنساخ الجين داخل الخلية. في أحد التجسيدات يتم تعديل البروتين الذي يتم التعبير عنه وراثيًا بحيث يتم التعبير عنه وراثيًا على سطح الخلية و/أو إفرازه من الخلية.
— 2 6 — في أحد التجسيدات يكون البروتين المشفر عبارة عن ‎ail‏ على سبيل المثال كولاجيناز ‎collagenase‏ ماتريكس ميتالوبروتيناز ‎MMP2 (i) matrix metalloproteinase‏ أو 14( أو ما شابه. يمكن أن تكون أجسام مضادة وشظايا جسم مضاد مناسبة مساعدة أو مضادة وتتضمن تلك التي يكون لها نشاط مضاد للسرطان وتلك التى تعدل استجابات الخلية العائلة للسرطان» على سبيل المثال: يمكن أن يقلل جسم مضاد أو شظية جسم مضاد مساعدة أو مضادة من تكون الأوعية أو ضبط تكون الأوعية بالنسبة للورم. في أحد التجسيدات يمكن أن تؤدي أجسام مضادة مساعدة أو بروتينات مشفرة أخرى إلى جعل الخلية العائلة مرئية بدرجة أكبر الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية للعائل على سبيل المثال بواسطة التعبير وراثيا عن مولدات الضدء إشارات الخطر 0 سيتوكينات أو كيموكينات لجذبها وتنشيطها؛ أو بواسطة الارتباط بجزيئات مسار استثاري بشكل مشترك أو نقطة فحص لتحسين الاستجابات المناعية التكيفية. يشير جسم مضاد أو شظية ارتباط بجسم مضاد علاجية على النحو المستخدم هنا إلى جسم مضاد أو شظية ارتباط بجسم مضاد والتي؛ عند إدخالها في الفيروس الحال للورم؛ يكون له تأثير مفيد على الأسباب المرضية التي يعاني منها المريض؛ على سبيل المثال على السرطان الذي يتم 5 علاجه. يشير التأثير المفيد على النحو المستخدم هنا إلى تأثير مطلوب و/أو مفيد للجسم المضاد الذي يتم التعبير عنه وراثيًا داخل الخلية الحية. تتضمن فئات أجسام مضادة وشظايا ارتباط بجسم مضاد علاجية: أجسام مضادة ل ‎(EGF‏ أجسام مضادة ل ‎VEGF‏ أجسام مضادة ل ‎(PDGF‏ أجسام مضادة ل 8ا01؛ أجسام مضادة ‎(PD1 J‏ 0 أجسام مضادة ل 0001-1 وأجسام مضادة لذ ‎FGF‏ ‏تتضمن الأجسام المضادة العلاجية المسجلة والمناسبة للتضمين في فيروسات الكشف ‎pall‏ ‏أبسيكسيماب 850110185 « أداليموماب 8021100000085 ¢ أليمتوزوماب ‎alemtzumab‏ « باسيليكسيماب 68511411186 » بليموماب 1701785ا66 » بيفاسيزوماب ‎bevacizumab‏ « برنتوكسيماب فيدوتين ‎brentuximab vedotin‏ ¢ كاناكينوماب ‎canakinumab‏ «
— 3 6 — ستوكسيماب ‎cetuximab‏ ¢ سيرتوليزوماب ‎certolzumab‏ ؛ داكليزوماب ‎daclizumab‏ « دينوزوماب 060050180 » إيكوليزومَاب 601201180 ؛ إيفاليزوماب 181700086 « جيمتوزوماب 961771020117185 ؛ غوليموماب 90107001180 ¢ ايبروتيوموماب تيوكيتان ‎tiuxetan‏ 1071100101180 إنفليكسيماب 171117411185 ¢ إيبيليموماب 1011107001180 ؛ ميوروموناب- ‎cmuromonab—-CD3 603 5‏ أوفاتوموماب 018101700185 « باليفيزوماب ‎«palivizumab‏
بانيتوموماب ‎panitumumab‏ ؛ رانيبيزوماب 181015120118 ؛ ريتوكسيماب 1110710186 توكليزماب ‎tocilizumab‏ ؛ توسيتوموماب ‎tositumomab‏ وتراستوزوماب ‎trastuzumab‏ . في أحد التجسيدات تكون متواليات منطقة متغيرة للجسم المضاد لجسم مضاد أو شظية جسم مضاد مستخدمة مماثلة أو مطابقة بنسبة تتراوح بين 95 و6100 للمناطق المتغيرة للبيفاسيزوماب
0 1 (يعرف أيضًا 2 ‎«(®Avastin‏ على سبيل المثال مماثلة أو مطابقة بنسبة 96 97 98 أو %99. كما تعتبر متواليات التشفير للأجسام المضادة وشظايا ارتباط منها مناسبة أيضًا للتضمين في فيروسات الكشف الحالى ‎lly‏ تمت الموافقة عليها كمؤشرات للسرطان؛ على سبيل المثال تراستوزوماب»؛ توسيتوموماب؛ ربتوكسيماب؛ بانيتوموماب؛ أوفاتوموماب؛ إيبيليموماب؛ ايبروتيوموماب تيوكيتان؛ جيمتوزوماب؛ دينوزوماب؛ ستوكسيماب؛ برنتوكسيماب فيدوتين؛ أفاستين
وأداليموماب. في أحد التجسيدات تكون متواليات منطقة متغيرة للجسم المضاد لجسم مضاد أو شظية جسم مضاد مستخدمة ‎Alas‏ أو مطابقة بنسبة تتراوح بين 95 و00 961 للمناطق المتغيرة جسم مضاد معروف أو جسم مضاد تم الكشف عنه هنا. على النحو المستخدم هنا يتضمن "جزئ جسم ‎"alias‏ أجسام مضادة وشظايا ارتباط منها.
0 يشير جسم مضاد على النحو المستخدم هنا ‎dag‏ عام إلى صور جسم مضاد ذي الطول الكامل وثنائى النوعية أو متعدد النوعية تشتمل عليه. تتضمن شظايا ارتباط بجسم مضاد شظية جسم مضاد قادرة على استهداف مولد ضد له ‎Log‏ ‏مماثلة؛ مشابهة أو أفضل تجاه "جسم ‎"alias‏ يتم اشتقاقها منه. تتضمن شظايا الجسم المضاد: ‎Fab (Fab‏ معدل ‎"Fab Fab’‏ معدل» 85(2)؛ ‎(FV‏ أجسام مضادة أحادية المجال (على
سبيل المثال ‎VH‏ أو ‎VL‏ أو 1/1411)؛ 5057؛ أجسام مضادة ثنائية؛ ثلاثية أو ‎ll Lely‏ ‎(Bis—scFv‏ أجسام ثنائية؛ أجسام ثلاثية؛ أجسام رباعية وشظايا ارتباط بقمة لاصقة من أي من المذكور أعلاه (راجع على سبيل المثال ‎Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech.‏ ‎Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews -‏ ;23(9):1126-1136 ‎(Online 2(3), 209-217 5‏ تكون طرق تكوين تصنيع شظايا الجسم المضاد المذكورة معروفة
جيدًا في المجال (راجع على سبيل المثال ‎Verma et al., 1998, Journal of‏ ‎(Immunological Methods, 216, 165-181‏ تتضمن شظايا الجسم المضاد الأخرى المستخدمة في الاختراع الحالي ‎“Faby Fab Lad‏ الموصوفة في طلبات براءات الاختراع الدولية رقم 9 + 2005/003170 و 2005/003171. يمكن أن تشتمل أجسام مضادة
0 متعددة التكافؤ العديد من قيم النوعية على سبيل المثال ثنائي النوعية أو يمكن أن تكون أحادية التوعية (راجع على سبيل المثال الطلبات الدولية 92/22853 « 05/113605؛ 2 و 2010/035012). يقصد بنوعي على النحو المستخدم هنا جسم مضاد أو شظية يميز فقط مولد الضد الذي يكون نوعي تجاهه أو جسم مضاد أو شظية لها ألفة ارتباط أعلى إلى حدٍ كبير تجاه مولد الضد الذي
يكون نوعي تجاهه مقارنة بألفة الارتباط الخاصة به تجاه مولدات الضد الذي لا يكون نوعي تجاههاء على سبيل المثال ألفة ارتباط أعلى ب 5» 6» 7 8 9 10 مرات. يمكن استخدام أجسام مضادة أو شظايا ارتباط بجسم مضاد معروفة لتوليد صور جسم مضاد بديلة بها نفس ‎CDRS‏ أو نفس المناطق المتغيرة؛ على سبيل المثال» يمكن تحويل جسم مضاد ذي الطول الكامل بسهولة إلى شظية ‎"Fab (Fab‏ أو ‎scFv‏
يمكن استخدام نطاق واسع من الصور المختلفة من الجسم المضاد في أجزاء منشأة واردة في الكشف الحالي تتضمن جزيئات جسم مضاد من حيوانات غير بشرية؛ جزيئات جسم مضاد بشرية؛ جزيئات جسم مضاد متوافقة مع البشر وجزيئات جسم مضاد خيمرية. في أحد التجسيدات يكون الجسم المضاد أو شظية الارتباط أحادي النسيلة. يمكن تحضير أجسام مضادة أحادية النسيلة بواسطة أي طريقة معروفة في المجال ‎(ie‏ تقنية الورم الهجين ( 8 ‎Kohler‏
— 5 6 — ‎(Milstein, 1975, Nature, 256:495-497‏ تقنية الورم الهجين البشري؛ تقنية ورم هجين بالخلايا البائية البشري )4:72 ‎(Kozbor et al., 1983, Immunology Today,‏ وتقنية الورم الهجين ‎EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,‏ ‎.pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)‏ في أحد التجسيدات يكون الجسم المضاد أو شظية الارتباط غير بشري؛ أي يكون بالكامل من
مصدر غير بشري. يكون ذلك ‎Bes‏ لأنه يمكن توصيل الأجسام المضادة والشظايا داخل الخلية السرطانية بواسطة الفيروس. في أحد التجسيدات يكون الجسم المضاد ‎(Grad‏ على سبيل المثال يكون به منطقة (مناطق) ثابتة بشرية ومناطقة متغيرة غير بشرية.
0 في أحد التجسيدات يكون الجسم المضاد أو شظية الارتباط بشري؛ أي يكون بالكامل من مصدر بشري. في أحد التجسيدات يتم جعل الجسم المضاد أو شظية الارتباط متوافق مع البشر. تكون أجسام مضادة متوافقة مع البشر (والتي تتضمن أجسام مضادة مطعمة ب ‎Ble (CDR‏ عن جزيئات جسم مضاد بها واحدة أو أكثر من مناطق تحديد التكامل ‎(CDRS)‏ من أنواع غير بشرية ومنطقة إطارية
5 من جزئ جلوبولين مناعي بشري (راجع؛ على سبيل المثال 5,585,089 5لا؛ 7 /ا). سيتم إدراك أنه قد يكون من الضروري نقل وحدات تحديد النوعية البنائية ل 5 فحسب بدلا من ‎CDR‏ بالكامل (راجع على سبيل المثال» ,2005 ‎Kashmiri et al.,‏ 25-4 ,36 ,10161005). يمكن أن تشتمل أجسام مضادة متوافقة مع البشر على نحو اختياري ‎Lia‏ على واحدة أو أكثر من الوحدات البنائية الإطارية المشتقة من الأنواع غير البشرية؛ على
سبيل المثال التي تم منها اشتقاق ‎.CDRs‏ ‏في أحد التجسيدات تقوم متوالية التشفير بتشفير سلسلة ثقيلة لجسم مضاد؛ سلسلة خفيفة لجسم ‎alias‏ أو شظية جسم مضاد. تشير السلسلة الثقيلة(10!) ‎Heavy chain‏ على النحو المستخدم هنا إلى وحدة بولي ببتيد فرعية كبيرة للجسم المضاد. تشير سلسلة خفيفة(0ا) ‎Light chain‏
على النحو المستخدم هنا إلى وحدة بولي ببتيد فرعية صغيلا للجسم المضاد. في أحد التجسيدات تشتمل السلسلة الخفيفى للجسم المضاد على مجال ‎(CL‏ إما ‎WS‏ أو لمدا. يمكن استخدام أجسام مضادة للاستخدام في الكشف الحالي باستخدام أي طريقة مناسبة معروفة في المجال. يمكن استخدام بولي ببتيد/يروتين ‎alge‏ الضد بما في ذلك بروتينات اندماج؛ تتضمن خلايا (ناتجة عن عودة الارتباط الجيني أو طبيعية) تعبر ‎Why‏ عن البولي ببتيد (مثل خلايا تائية منشطة) لإنتاج أجسام مضادة تقوم نوعيًا بتمييز مولد الضد. يمكن أن يكون البولي ببتيد عبارة عن “بولي ببتيد ناضج” أو شظية أو مشتق فعال بيولوجيًا منه. يمكن تحضير بولي ببتيدات1065م0017/06 ؛ للاستخدام في تحصين حيوان عائل» بواسطة عمليات معروفة في المجال من الخلايا العائلة المعدلة ‎Gly‏ التي تشتمل على أنظمة تعبير وراثي 0 أو ‎(Sa‏ استخلاصها من مصادر بيولوجية طبيعية. في الطلب الحالي؛ يتضمن تعبير 'بولي ببتيدات" ببتيدات؛ بولي ببتيدات وبروتينات. ويتم استخدامها تبادليًا ما لم يتحدد ‎CDA‏ ذلك. يمكن أن يُمثل بولي ببتيد مولد الضد في بعض الحالات جزءًا من بروتين أكبر مثل بروتين اندماج على سبيل المثال مندمج ببطاقة ألفة. يمكن العثور على أجسام مضادة تم توليدها مقابل بولي ببتيد ‎Age‏ الضد؛ حيث يكون تحصين 5 الحيوان ضروريًا؛ بواسطة إعطاء البولي ببتيدات إلى حيوان» يفضل حيوان غير بشري؛ باستخدام بروتوكولات ‎protocols‏ معروفة جيدًا وروتينية؛ راجع على سبيل المثال ‎Handbook of‏ ‎Experimental Immunology, D.
M.
Weir (ed 2D) Vol 4, Blackwell Scientific‏ ‎(Publishers, Oxford, England, 1986‏ يمكن تحصين العديد من ذوات الدم الحارء مثل الأرانب» الفتران» الجرذان؛ الماشية؛ الأبقارء الجمال أو الخنازير. مع ذلك؛ تكون الفئران» الأرانب؛ 0 الخنازير والجرذان بوجةٍ عام مناسبة أكثر. كما يمكن توليد أجسام مضادة للاستخدام في الاخترع باستخدام طرق جسم مضاد ليمفاوي مفرد بواسطة إنشاء نسائل من والتعبير ‎Why‏ عن منطقة متغيرة لجلوبولين مناعي ‎CDNAS‏ تم ‎Lads‏ ‏من خلايا لمفاوية مفردة تم اختيارها لإنتاج أجسام مضادة نوعية ‎by‏ على سبيل المثال؛ الطرق الموصوفة بواسطة ‎Babcook, J. et al., 1996, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA‏
ا93)15(:7843-78458؛ 92/02551؛ 2004/051268 ‎ally‏ براءة الاختراع الدولي رقم 7 .. يمكن أن يتم فحص الأجسام المضادة باستخدام تجارب تقيس الارتباط بمولد الضد و/أو تجارب تقيس القدرة على تضاد المستقبل. يتمثل أحد أمثلة تجارب الارتباط في ‎ELISA‏ بشكل محدد؛
باستخدام بروتين اندماج (على نحو اختياري يشتمل على ‎(aye‏ والذي يتم تثبيته على الأطباق؛ وستخدم جسم مضاد ثانوي مترافق للكشف عن جسم مضاد لمولد الضد مقيد ببروتين الاندماج. يمكن اختيار مجالات منطقة ثابتة لجزئ الجسم المضاد الوارد في الاختراع الحالي؛ إن وجد؛ مع الأخذ في الاعتبار الوظيفة المقترحة لجزئ الجسم المضاد؛ وبشكل محدد وظائف المؤثر التي يمكن أن تكون مطلوية. على سبيل ‎(Jia)‏ يمكن أن تكون مجالات المنطقة الثابتة عبارة عن
0 مجالات هواء 0واء ‎IgG (IGE‏ أو ‎IgM‏ بشرية. بشكل محدد؛ يمكن استخدام مجالات منطقة ثابتة ل ‎IgG‏ بشري؛ ‎Lala‏ من أنماط 1061 5 ‎I9G3‏ المتماثلة عندما يكون جزئ الجسم المضاد مُعد لاستخدامات علاجية وتكون وظائف المؤثر للجسم المضاد مطلوية. على نحو بديل؛ يمكن استخدام أنماط 1062 و964ا متماثلةعندما يكون جزئ الجسم المضاد مُعد لأغراض علاجية ولا تكون هناك حاجة إلى وظائف المؤثر للجسم المضاد؛ على سبيل المثال ليتم ببساطة تحفير النشاط
5 أو للمعادلة المستهدفة. سيتم إدراك أنه يمكن أيضًا استخدام صور المتوالية المتغيرة لمجالات المنطقة الثابتة المذكورة. على سبيل المثال يمكن استخدام ‎cilia‏ 064 التي تم فيها تغيير السيرين الموجود عند الموضع 241 إلى برولين على النحو الموصوف في ‎Angal et al.,‏ ‎.Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108‏ بالنسبة لوظائف جسم مضاد محددة؛ على سبيل المثال لتوصيل إشارات تنشيط إلى خلايا حاملة
0 لجزئ الجسم المضاد المستهدف؛ مثل خلايا الجهاز المناعي؛ فقد يكون من المفيد استخدام نسخ مثبتة بالغشاء من الجسم المضاد بحيث يتم التعبير وراثيًا عن الجسم المضاد على سطح خلية التعبير الوراثي. تسمح جزيئات الارتباط المعبر عنها ‎Wh‏ على سطح الخلية المذكورة بتفاعلات فعالة متعددة الوحدات بين جزئ إرسال الإشارات المستهدف على سطح خلية أخرى تحسن من توصيل إشارات التنشيط من الجزئ المستهدف إلى داخل الخلية المستقبلة.
— 8 6 — على نحو مميزء يمكن أن تعبر الفيروسات الغدية الواردة فى الكشف الحالى ‎Gil‏ عن صور ذات طول كامل و5057 من الأجسام المضادة. في أحد التجسيدات تشتمل المتوالية المُشفرة للجسم المضاد أو شظية جسم مضاد على أو تشتمل كذلك على متوالية مدخل رببوسوم داخلي. تشير متوالية مدخل ريبوسوم داخلي ‎(IRES)‏ على النحو المستخدم هنا إلى متوالية نوكليوتيد تسمح ببدء التحور الوراثي في منتصف متوالية مرسال
.RNA (mRNA) ‏في أحد التجسيدات تكون الجينات أو الببتيدات العلاجية المشفرة عبارة عن بروتينات؛ بولي ببتيدات‎ ‏أو ببتيدات نوعية مستهدفة.‎ ‏تشير البروتينات أو الببتيدات النوعية المستهدفة على النحو المستخدم هنا إما إلى البروتينات‎
0 المستهدفة نفسهاء أو بروتينات أو ببتيدات مختلفة ترتبط مباشرةً ‎Ae)‏ سبيل المثال نوعية للهدف) بالبروتينات أو الببتيدات المستهدفة أو بخلاف ذلك تعدل مستوياتها. يتمثل أحد أمثلة ما سبق فى ‎cytokine psu‏ ؛ ‎Lay‏ يتم أحد ‎Aid‏ الأخير فى جسم ‎alias‏ مضاد للسيتوكين المذكور. ‎sles‏ الأهداف محل الاهتمام بوجهٍ عام بخلايا محددة؛ منتجات خلوي؛ مولدات الضد أو مسارات إرسال الإشارات المصاحبة للمرض؛ بشكل محدد السرطان. كما يمكن أن يتعلق الهدف؛ بناءً على
5 السياق؛ ب ‎MRNA‏ أو ما يماثله مستنسخ من الجين المُشفر للبروتين أو البولي ببتيد؛ والذي يمكن على سبيل المثال تثبيطه بواسطة تقنية من نوع ‎[RNAI‏ وعليه في سياق ‎(RNA‏ مثل تقنية ‎RNAI‏ ‏يكون الهدف عبارة عن ‎MRNA‏ يتم تشفيره بواسطة الجين الخاص بالهدف. تتضمن أمثلة الأهداف محل الاهتمام؛ ولكن لا تقتصر ‎(de‏ مستقبلات خلايا تائية مشتركة تنبيهية ومركبات ترابطية منهاء جزيئات نقطة فحص مستقبل خلايا تائية مشترك تثبيطي ومركبات
0 ترابطية منهاء مستقبلات ومركبات ترابطية منها يتم التعبير عنها وراثيًا بواسطة ‎WA‏ تائية منظمة؛ ‎LIA‏ كابتة مشتقة من النخاع وخلايا مناعية كابتة للمناعة؛ خلي شرية ومستقبلات خلية تعطي مولد ضد ومركبات ترابطية منهاء عوامل وسيطة لمعالجة وتقديم ‎Age‏ ضد؛ سيتوكينات ومستقبلات السيتوكين؛ كيموكينات ومستقبلات الكيموكين؛ عوامل استنساخ ومنظمات الاستنساخ؛ جزيئات
الانتقال بين الخلوي ومنظمات وظيفة الخلية؛ ستقبلات خلية ورم ومستقبلات ومنتجات بيئة ورم دقيقة؛ إنزيمات خلية ورم داخل الخلايا ‎Jie‏ 00ا؛ مولدات ضد يتم تمييزها بواسطة ‎WIA‏ مناعية. وعليه في أحد التجسيدات يشير الهدف على النحو المستخدم هنا إلى بروتين أو بولي ببتيد يمكن؛ على سبيل المثال ثبيطه؛ معادلته أو تنشيطه بواسط» على سبيل المثال جسم مضاد أو شظية
ارتباط منه؛ حسب الحاجة. يشير الهدف في سياق السيتوكينات إلى سيتوكين في حد ذاته أو جسم مضاد أو شظية ارتباط منه نوعية للسيتوكين. وعليه؛ يمكن أن يشفر الفيروس ويعبر وراثيًا عن السيتوكين نفسه حيث أن إطلاقه يمكن أن يحفز الاستجابات المناعية 'للعائل”. في سياق المركبات الترابطية؛ يمكن تشفير صور مُطفرة من المركب الترابطي بواسطة الفيروس الذي يتنافس مع المركب الترابطي الطبيعي لربط المستقبل. يمكن أن يكون للمركب الترابطي المُطفر ألفة ارتباط
0 زائدة تجاه المستقبل» على سبيل المثال بحيث يكون له معدل استبعاد بطيء وعليه يتم شغل المستقبل وزيادة أو تقليل إرسال الإشارات منه. على نحو بديل» يمكن تقليل نشاط المركب الترابطي المطفر مقارنة مركب ترابطي من النوع غير المعالج؛ وعليه يتم تقليل الارتباط والنشاط الكلي خلال المستقبل من المركب الترابطي الطبيعي. في أحد التجسيدات يقوم الفيروس أو ‎Land) shall‏ وفقًا للكشف الحالي بتشفير عقار أولي؛ عامل
‎Jie 5‏ مناعي و/أو إنزيم. يشير عقار أولي على النحو المستخدم هنا إلى جزئ يتم إعطائه في صورة مشتق غير فعال (أو أقل من فعال بالكامل) والذي يتم تحويله بعد ذلك إلى عامل دوائي فعال في الجسم؛ ‎Bale‏ بواسطة عمليات أيضية طبيعية. يعمل العقار الأولي كنوع من مادة منتجة لعقار مطلوب. يعمل إنزيم تحويل العقار الأولي كإنزيم يقوم بتحويل عقار أولي إلى صورته الفعالة دوائيًا.
‏0 يشير عامل ‎Jina‏ مناعي على النحو المستخدم هنا إلى عامل مُعدل للاستجابة المناعية. تعمل العوامل المعيّلة المناعية على ضبط الاستجابة المناعية عند مستوى مطلوب؛ كما في التأيير المناعي؛ الكبت المناعي؛ أو حث التحمل المناعي. يشير إنزيم على النحو المستخدم هنا إلى مادة تعمل كمحفز في الكائنات الحية؛ وتنظيم المعدل الذي تستمر عنده التفاعلات الكيميائية بدون أن تتغير في حدا ذاتها داخل العملية.
فيما يلي مناقشة غير شاملة للببتيدات/البولي ببتيدات والبروتينات المستهدفة التوضيحية. في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على: ‎«B7-H4 (B7-H3 VISTA (PD-L2 PD-L1 PD-1 «CTLA-4‏ ‎LIGHT (BTLA (LAG-3 (TIM-3 (ILT-4 (ILT-3 (LT-2 HVEM‏ أو ‎«CD160‏ ‏5 على سبيل المثال ‎.PD-L2 4 PD-L1 PD-1 «CTLA-4‏ في أحد التجسيدات يتم توفير جسم مضاد أو شظية ارتباط منه والتي تكون نوعية تجاه توليفة واحدة منها. وعليه في أحد التجسيدات يقوم جين ناقل أو مجموعة جين ناقل بتشفير جسم مضاد أو شظية جسم مضاد نوعية تجاه 8-4ا01؛ 0-1؛ 00-11 أو 00-12. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي ‎Gh‏ عن جسم مضاد أو شظية جسم مضاد نوعية تجاه ‎(PD-1 (CTLA-4‏ 00-11 أو 60-12. 0 في أحد التجسيدات يكون الجسم المضاد عبارة عن جسم مضاد لمثبط نقطة فحص؛ على سبيل المثال مضاد 00-11. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي وراثيًا عن جسم مضاد ل -0م 1] بشري ذي طول كامل. في أحد التجسيدات يكون التعبير الوراثي عن جسم ‎alias‏ ل ‎PD-L1‏ ‏بشري ذي طول كامل في ظل تحكم معزز داخلي؛ ‎Jie‏ المعزز المتأخر الرئيسي ‎major late‏ ‎promoter (MLP)‏ بشكل محدد في الموضع 87. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي ‎Gly 5‏ عن الصورة 507 لجسم مضاد ل 000-11 بشري. في أحد التجسيدات يكون التعبير الوراثي عن صورة /501 لجسم مضاد ل 010-11 بشري في ظل تحكم معزز داخلي؛ مثل المعزز المتأخر الرئيسي؛ بشكل محدد في الموضع ‎BY‏ ‏في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض الأميني لسلسلة ثقيلة متغيرة لجسم ‎alias‏ ل ‎PD-L1‏ ‏مشفرة بواسطة فيروس أو ‎gia‏ منشاً وارد في الكشف ‎all‏ عبارة عن متوالية رقم: 30. في أحد 0 التجسيدات تكون متوالية الحمض الأميني لسلسلة ثقيلة ثابتة للجسم المضاد ل 00-11 عبارة عن المتوالية رقم: 33 أو 34. في أحد تكون التجسيدات متوالية الحمض الأميني سلسلة خفيفة متغيرة للجسم المضاد ل 00-11 عبارة عن المتوالية رقم: 32. في أحد التجسيدات متوالية الحمض الأميني لمنطقة خفيف ثابتة للجسم المضاد ل 00-11 عبارة عن المتوالية رقم: 35. في أحد التجسيدات تكون متوالية حمض أميني لشظية جسم مضاد ‎SCFV‏ مضادة ل 00-11 عبارة عن المتوالية رقم: 37.
— 1 7- في أحد التجسيد ات يتم توفير فيروس أو جزءٍ ‎Gg Lae‏ للكشف الحالي يشفر جسم مضاد أو شظية ارتباط منه؛ للجسم المضاد ذي الطول الكامل أو 5057 نوعية تجاه 0118-4؛ على سبيل المثال على النحو الموضح هنا. في أحد التجسيدات يكون الهدف»؛ عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على ‎«CD44 «CD43 «CD31 00127 «CD332 «CD33 (CD25 «CD16‏ ‎CD301b «CD301a «CD162‏ و6816000-3. في أحد التجسيدات يتم توفير جسم مضاد أو شظية ارتباط ‎die‏ نوعيه تجاهه؛ على سبيل المثال جسم مضاد ذي الطول الكامل أو ‎SCFV‏ ‏في أحد التجسيدات يكون الهدف؛ على سبيل المثال لذي يمكن استهدافه بواسطة جسم مضاد أو شظية ارتباط عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة ‎All‏ تشتمل على: ‎«CD1c 0018 0657 ‏ترابطية‎ TLR ‏مركبات‎ (TLRs ‏ترابطى»‎ FLT-3 ‏مركب‎ (FLT-3 0 «CD207 «CD205 001728 «CD123 «CD86 CD83 «CD80 «CD11c «CD11b ‏مركب‎ «CXCR4 (CD287 «CD289 (CD286 «CD283 00281 «CD273 «CD209
LTT ¢ILT5 ¢ILT4 «ILT3 ¢ILT2 ¢ILT1 «IL-23 ¢IL-12 (IFN-02 ‏ترابطئى‎ GITR .CD304 3 XCR1 «CLEC9a (CADM1 00303 «CD141 (TSLP ‏مستقبل‎ ‏15 يكون لمركبات ‎TLR‏ ترابطية معينة القدرة على تحفيز الاستجابات المناعية و؛ على سبيل المثال يتم استخدامها في صورة مواد مساعدة. فى أحد التجسيدات يقوم الفيروس بتشفير ‎hil‏ مركب ‎TRL‏ ترابطى. في أحد التجسيدات يتم اختيار الهدف من معالج مولد ضد وعامل وسيط لتقديم مولد ضد؛ على سبيل المثال ‎CTIA‏ أو ‎GILT‏ ‏0 في أحد التجسيدات يكون الهدف؛ على سبيل المثال الذي يمكن استهدافه بواسطة جسم مضاد أو شظية ارتباط عبارة عن هدف السرطان. في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على: ‎<OX40‏ مركب ‎OX40‏ ترابطى» ‎«CD40 «CD30 «CD28 «CD27‏ مركب
-2 7- 0 ترابطى» ‎«GITR (CD137 «CD70‏ 881-4؛ ‎ICOS‏ أو مركب ‎ICOS‏ ترابطى» على سبيل المثال 01040 ومركب 00040 ترابطي. في أحد التجسيدات تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفير مركب ترابطي يشتمل على 0040 أو مركب ‎(aly CD40‏ أو جسم مضادء شظية جسم مضاد أو ‎shRNA‏ تستهدف ‎CD40‏ أو مركب 0040 ترابطي. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي ‎Gilg‏ عن مركب ترابطي يشتمل على ‎CD40‏ أو مركب ‎CD40‏ ترابطى؛ أو جسم مضادء شظية جسم مضاد أو ‎sh RNA‏ تستهدف (نوعية تجاه) 06040 أو مركب 6040 ترابطي. في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تفتمل ‎dL-1o Je‏ 18حاالء ‎(IL-9 (IL-6‏ 12حالء 13حال 17حال 18حال 22حاا؛ ‎L-25 IL-24 (IL-23 10‏ 26-االك ‎JL=35 ¢IL-33 «IL-27‏ إنترلوكين -2 (2-اا) ‎«IL-15 «IL=10 «IL-7 «IL-5 (IL-4 Interleukin-2 (IL-2)‏ 21حال 25حال اا مع ل ‎(TNFa (IFNy (IFN «IFN‏ 168 سم ‎a (LTA) lymphotoxin or stead‏ ‎GM-CSF 4(LTA)‏ في أحد التجسيدات تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفيرجسم مضاد أو شظية جسم مضاد نوعية تجاه حا ‎«IL-7 «IL-22 «IL-18‏ فذحا 21حاال وال ‎«TNF «IFNy‏ 1698 أو سم ليمفاوي ‎(LTA) lymphotoxin ao (LTA)‏ © . فى أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي وباثيًا عن 12حالء 18حال 22حال ‎¢IL=15 IL-7‏ 21حال ملاعل ‎TNFa, TGFB «IFNy‏ أو سم ليمفاوي ‎o (LTA) lymphotoxin a (LTA)‏ . في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض الأمينى ‎IFNOCD‏ عبارة عن المتوالية رقم: 41. في أحد 0 التجسيدات تكون متوالية الحمض الأمينى ‎IFNOCD‏ عبارة عن المتوالية رقم: 42. في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض ‎TNF aa)‏ عبارة عن المتوالية رقم: 40. في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن كيموكين» على سبيل المثال واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة ‎ll‏ تشتمل على:؛ ‎«CCL22 (CCL20 «CCL17 «CCL5 «IL-8‏
«CCL21 06119 612 46112 6113 6111 «CXCL10 «CXCL9 084 (CXCR3 (CCR8 (CCR7 (CCR6 ‏كتمع‎ (CCR4 (CCR2 (CXCR2 .CRTH2 3 CXCR5 ‏في أحد التجسيدات تقوم مجموعة الجين الناقل بتشفيرجسم مضاد أو شظية جسم مضاد نوعية تجاه‎
CCR4 (CCR2 (CXCR2 60121 «CCL19 «CCL2 (CXCL12 «CXCL9 ‏كا00.‎ 5 أو ‎.CXCR4‏ في سياق الكيموكينات يتضمن الهدف أين تقوم الفيروسات بتشفير والتعبير ‎Gilg‏ ‏عن الكيموكين»؛ على سبيل المثال لحث أو زيادة الاستجابات المناعية للعائل تجاه السرطان. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي وراثيًا عن جسم مضاد أو شظية جسم مضاد نوعية تجاه ‎«CXCL12 «CXCL9 «CCL5‏ عاو ‎CCR4 (CCR2 (CXCR2 (CCL21 «CCL19‏ ‎.CXCR4 4 10‏ في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على: إعضاء عائلة ‎MyD88 (CTIA (STAT6 STAT4 (STAT (STAT3‏ ‎(NFKB‏ على سبيل المثال يتم استهداف البروتين باستخدام متبط على سبيل المثال جسم مضاد أو شظية ارتباط منه؛ أو يتم تثبيط ‎MRNA‏ مستنسخ من الجين ذو الصلة بواسطة آلية؛ مثل ‎RNAi 5‏ في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن 15070 أو منظم بقاء أو موت الخلية ‎Jie‏ ‏سيرفايفين ‎surviving‏ ؛ على سبيل المثال يتم استهداف البروتين بواسطة مثبطء على سبيل المثال جسم مضاد أو شظية ارتباط ‎die‏ أو يتم تثبيط ‎MRNA‏ مستنسخ من الجين ذو الصلة بواسطة ‎RNAi (ic adi‏ ‏20 في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن واحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على: أمفيرجيولين ‎(NRG3 (NRG1b (NRGla (BTC camphiregulin‏ 1678 ‎(EGF-L6 (EGF (LRIG3 (LRIG]‏ ابيجن ‎«(Her2 (EGFR (HB-EGF (Epigen‏ ‎(Her3 and 4‏ على سبيل المثال يتم استهداف البروتين بواسطة مثبط على سبيل المثال جسم مضاد أو شظية ارتباط منه؛ أو مستنسخ من الجين ذو الصلة بواسطة آلية؛ ‎RNAI Jie‏
في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن مركب ترابطي أو مستقبل لواحد أو أكثر يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على: عامل محدد الخلاياء ‎VEGF (Wnt (IGF (FGF‏ عات 678 ‎PDGF‏ رطعامفلا. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي وراثيًا عن جسم مضاد أو شظية جسم مضاد نوعية تجاه ‎VEGF 5‏ في أحد التجسيدات يكون الجسم المضاد عبارة عن جسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ على سبيل
المثال» مثل جسم مضاد به متوالية الحمض الأميني للجسم المضاد بيفاسيزوماب 200050 أو مكافئ له. في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي ‎iy‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري ذي طول كامل. في أحد التجسيدات يكون التعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري ذي طول كامل في ظل تحكم معزز داخلي؛ ‎Jie‏ المعزز المتأخر الرئيسي
‎((MLP) 0‏ بشكل محدد في الموضع ‎BY‏ في أحد التجسيدات يعبر الفيروس الغدي ‎Gils‏ عن الصورة 50171 لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري. في أحد التجسيدات يكون التعبير ‎Shall‏ عن الصورة ‎SCFV‏ لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري في ظل تحكم معزز داخلي؛ ‎Jie‏ المعزز المتأخر الرئيسي؛ بشكل محدد في الموضع 87. في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض الأميني لسلسلة ثقيلة متغيرة لجسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ عبارة عن المتوالية رقم: 29. في أحد التجسيدات تكون متوالية
‏5 الحمض الأميني لسلسلة ثقيلة ثابتة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ عبارة عن المتوالية رقم: 33 أو 34. في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض الأميني لسلسلة خفيفة متغيرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ ‏عبارة عن المتوالية رقم: 31. في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض الأميني لسلسلة خفيفة ثابتة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ عبارة عن المتوالية رقم: 35. في أحد التجسيدات تكون متوالية حمض أميني لشظية جسم مضاد ‎SCFV‏ مضادة ل ‎VEGF‏ عبارة عن المتوالية رقم: 36.
‏0 في ‎af‏ التجسيدات يكون الهدف ‎gle‏ عن ‎ADO‏ ‏في أحد التجسيدات يكون الهدف عبارة عن مولد ضد يتم تمييزه بواسطة خلايا مناعية لواحد أو أكثر من البروتينات أو الببتيدات التي يتم اختيارها من المجموعة التي تشتمل على : بروتينات مولدة للمناعة من كائنات معدية؛ ‎Jie‏ مولدات الضد للفيروس المضخم ‎LAAN‏ مولدات الضد للإنفلونزاء مولدات الضد السطحية والقلبية للالتهاب الكبدي ‎diphtheria Lal {lisa B‏
‎«Crm197 toxoid 5‏ ذوفان الكُزاز ‎tetanus toxoid‏ ؛ ببتيدات مشتقة من مولدات الضد المذكورة
والتي تكون ‎Ble‏ عن قمم لصقة لخلايا تائية أو جسم مضاد معروفة؛ أو مواد مركبة أو وحدات
متعددة معدلة وراثيًا من مولدات الضد المذكورة؛ بروتينات مشتقة من ورم ‎Jie‏ مولدات الضد؛
ببتيدات مشتقة من مولدات الضد المذكورة والتي تكون عبارة عن قمم لصقة لخلايا تائية أو جسم
مضاد معروفة؛ ومواد مركبة أو وحدات متعددة معدلة وراثيًا من مولدات الضد المذكورة على سبيل المثال 0/11 ‎LMP2 (MUCT‏ نمط ذاتي؛ ‎(HER-2/neu (EGFRVIII (E73 HPV EG‏
«PCSA (PSMA (GD2 (NY-ESO-1 (p33 ‏53م غير طافرة؛ طفرة‎ (MAGE A3
(PR1) 3 ‏بروتيناز‎ «Ras ‏طفرة‎ (MelanA/MART1 (CEA (gp100 (PSA
«PSA survivin ‏سيرفايفين‎ « tyrosinase jug yi dber-abl 01016103563 (PR1)
‎hTERT‏ بشكل محدد ‎(NY-ESO-1 (HER-2/neu (MUC1 WTI‏ سيرفايفين أو
‎hTERT 0‏ سيدرك صاحب المهارة في المجال أنه يوجد العديد من الاحتمالات لمتواليات الحمض النووي التي تشفر متوالية حمض أميني محدد بسبب تكرار الرامزة؛ وأنه يتم تحمل طفرات زوج قاعدة حمض نووي خامدة وأن جميع متواليات الحمض النووي التي تشفر متوالية حمض أميني على النحو المحدد في أي من أرقام المتواليات يتم تصورها بواسطة الكشف الحالي.
‏5 في أحد التجسيدات يكون الببتيد؛ البولي ببتيد أو البروتين المُشفر بواسطة الجين الناقل عبارة عن محاكي قمة لاصقة. على النحو المستخدم هنا يكون محاكي قمة لاصقة عبارة عن جزئ؛ ‎Bile‏ ‏ببتيد؛ يحاكي بنية القمة اللاصقة. تتسبب الخاصية الأخيرة في استجابة جسم مضاد ممثلة لتلك التي يتم استنباطها بواسطة القمة اللاصقة. سيقوم جسم مضاد لمولد ضد قمة لاصقة محدد بتمييز محاكي ‎dad‏ لاصقة يحاكي القمة اللاصقة المذكورة. يتم ‎Bale‏ الحصول على محاكيات القمة
‏0 اللاصقة من مجموعات إظهار الخلايا الملتهمة من خلال الفرز الحيوي. يتم تطوير لقاحات تستخدم محاكيات قمة لاصقة. وعليه يمكن استخدام أجسام مضادة ذات نوعية معروفة لفحص المجموعات (على سبيل المثال مجموعات ببتيد في إظهار الخلايا الملتهمة - على سبيل المثال مجموعات متوالية ‎Ab‏ أو مجموعات ببتيد ليست عبارة عن جسم مضاد؛ بشكل محدد تلك التي يتم تحسينها لإنتاج ببتيدات بها أكثر من 3 توافقات 03 ثابتة) - تم وصف توليد محاكيات القمة
‎Tribbick G, Rodda 5. Combinatorial methods for ‏في المجال (راجع‎ ls ‏الاصقة‎ 5
‎discovery of peptide ligands which bind to antibody-like molecules.J Mol‏ ‎Recognit. 2002 15(5):306-10; Masuko 1, Ohno Y, Masuko K, Yagi H,‏ ‎Uejima S, Takechi M, Hashimoto Y.Towards therapeutic antibodies to‏ ‎membrane oncoproteins by a robust strategy using rats immunized with‏ ‎transfectants expressing target molecules fused to green fluorescent 5‏ ‎.(protein.
Cancer Sci. 2011 102(1):25-35‏ في أحد التجسيدات يتم تشفير محاكي قمة لاصقة أو مولدات ضد لقاح أخرى مصممة بواسطة جين ناقل ويتم التعبير عنها ‎Wi‏ لحث استجابة جسم مضاد في المريض المتلقي؛ حيث يكون للأجسام المضادة المستحثة التأثير العلاجي المطلوب. في أحد التجسيدات يتم استخدام بروتينات 0 اندماج ببتيد ‎«GFP‏ مع متواليات ببتيد من المركب الترابطي البشري المطلوب؛ لحث استجابات جسم مضاد مستهدفة مضادة لذاتهاء على سبيل المثال يمكن ربط ببتيد منطقة 00-11 معروف بكونه ‎lage‏ للارتباط بجزئ 00-1 مستهدف ‎Gis‏ ب ‎GFP‏ أو بروتينات ‎Jala‏ غريب مولد للمناعة بدرجة كبيرة بحيث تتضمن استجابة جسم مضاد مناعية للببتيد أجسام مضادة تتفاعل ‎Woks‏ مع ‎PDLI (gia‏ أصلي وعليه تعمل على إعاقة تفاعلات ‎PD-L1:PD-1‏ بنفس طريقة التشفير المباشر لجسم مضاد ل 001-1. يتم وصف مبادئ استجابات جسم مضادة علاجي مضادة لذاتها لحث اللقاحات جيدًا في المجال (راجع ‎Spohn G, Bachmann MF.Therapeutic‏ ‎vaccination to block receptor-ligand interactions.Expert Opin Biol Ther.‏ ‎Link A, Bachmann MF.
Immunodrugs: breaking B-‏ ;3(3):469-76 2003 ‎but not T-cell tolerance with therapeutic anticytokine‏ ‎Assier E, 20‏ ما ‎vaccines.Immunotherapy 2010 2(4):561-74;Delavallée‏ ‎Bessis N, Boissier MC.
Emerging applications of anticytokine‏ ا ‎Semerano‏ ‎.(vaccines.Expert Rev Vaccines. 2008 7(10):1507-17‏ في واحد أو ‎JST‏ من التجسيدات يقوم الجين الناقل المستخدم بتشفير متوالية موضحة في أي من واحدة من المتوالية رقم: 29 إلى 44؛ 67 و71-70.
على نحو مميز تقوم فيروسات غدية واردة في الكشف الحالي بالتعبير ‎Why‏ عن وإطلاق صور جسم مضاد وبروتينات آخرى مثل سيتوكينات مشفرة بواسطة جين ناقل موجود بداخلها إلى مادة طافية لمستنبت خارج الخلية الحية أو في الخلايا السدوية لنسيج ورم داخل الخلية الحية (راجع الأشكال 8-4 12-11 19-16 29-28 33 35 40-38 43-42 47 49 51 ). يمكتأن تقوم المتواليات الرائدة بمساعدة البروتينات/البولي ببتيد أو الببتيد المشفر التي تنتج عن الخلية السرطانية. وعليه؛ في أحد التجسيدات يشتمل "البروتين" المشفر على متوالية رائدة. تشير المتوالية الرائدة على النحو المستخدم هنا إلى متوالية بولي نوكليوتيد موجودة بين متوالية المعزز ومنطقة التشفير التي يمكن أن تنظم التعبير الوراثي عن الجين عند مستوى الاستنساخ أو التحور الوراثي.
0 في أحد التجسيدات تقوم متوالية التشفير بتشفير ببتيد. يشير الببتيد على النحو المستخدم هنا إلى سلسلة حمض أميني ‎(Ally‏ لا تكون عبارة عن بروتين وظيفي كامل. نمطيًا تحتفظ الشظية ببعض أو كل وظيفة البروتين التي تعتبر شظية منه؛ أو يمكن تمييزها بواسطة الجهاز المناعي؛ على سبيل المثال ببتيدات من 8 أحماض أمينية أو أكثر يمكن تمييزها بواسطة الخلايا ‎Atl‏ ‏في أحد التجسيدات يكون الجين الناقل ‎Ble‏ عن جين مرشد يشفر؛ على سبيل المثال عامل
5 تصوير يتضمن مادة إضاءة حيوية؛ عوامل تصوير ومضية (بما في ذلك عوامل تصوير ومضية قابلة للتنشيط)» مثل ليوسيفيراز ‎GFP luciferase‏ أو ‎@GFP‏ أو بروتين بوميض أحمر. يشير الجين المرشد أو المتوالية المرشدة على النحو المستخدم هنا إلى جين أو متوالية ‎DNA‏ تنتج ‎mite‏ يسهل الكشف ‎die‏ في الخلايا حقيقية النواة ‎(Sag‏ استخدامها كمرقم لتحديد نشاط جين آخر تم به ربط أو دمج ‎DNA‏ الخاص به بشكل محكم. تقوم الجينات المرشدة بنقل الخواص الموجودة
0 على ‎LAN‏ أو الكائنات والتعبير عنها وراثيًا بحيث يتم تحديدها وقياسها بسهولة؛ أو تكون مرقمات قابلة للاختيار. ‎Bale‏ ما يتم استخدام الجينات المرشدة كدلالة على ما إذا تم تجميع جين محدد بواسطة أو التعبير عنه ‎Gy‏ في الخلية أو مجموعات الكائن الحي. تتضمن أمثلة الجينات المرشدة الشائعة؛ ولكن لا تقتصر علىء ‎LacZ‏ ليوسيفيراز» ‎@GFP (GFP‏ نيوميسين فوسفو ترانسفيراز ‎neomycin phosphotransferase‏ « كلورامفينيكول أسيتيل
— 8 7 — ترانسفيراز ‎chloramphenicol acetyltransferase‏ « مُرَاجل يوديد الصوديوم ‎(NIS)‏ ‎sodium iodide symporter (NIS‏ « نيترو رديكتاز ‎nitroreductase‏ سبيل المثال ‎gp‏ رديار د ىالا ‎(NfsB‏ بروتينات معدنية ‎Jala‏ الخلايا ‎intracellular metalloproteins‏ 151/1-16 أو مستقبل الإستروجين ‎.oestrogen receptor‏ في أحد التجسيدات لا تُشفر مادة الوراثية (بشكل محدد الجين الناقل) أو تعبر ‎Why‏ عن جين مرشد مثل عامل تصويرء ليوسيفيراز» ‎GFP‏ أو ‎GFP‏ ‏في أحد التجسيدات تكون متوالية الحمض ‎ud)‏ ل ‎NIS‏ عبارة عن المتوالية رقم: 67. ‎(Say‏ فحص الفيروسات ‎By‏ للكشف الحالي ‎Lad‏ يتعلق بتفضيلها لنوع ورم محدد بواسطة فحص قدرتها على التحلل في مجموعة من خلايا الورم؛ على سبيل المثال سلالات خلية ورم القولون تتضمن 11-29 ‎DLD-1‏ 1741قا 51034 ‎«SW48 101116 SW403‏ و 0174 .. ستكون أي سلالات خلية ورم قولون متوفرة مفيدة بشكل متساوي للتقييم المذكور. تتضمن سلالات خلية البروستاتا ‎LIA‏ 1000145 و00-3. تتضمن سلالات الخلية البنكرباسية ‎Wa‏ 0800-1. تتضمن سلالات خلية ورم الثدي سلالة خلية 1/108231 وتتضمن سلالات الخلية المبيض سلالة خلية 01/0/814-3. تتضمن سلالات خلية مكونة للدم؛ ولكن لا تقتصر 5 على الخلايا الليمفاوية البائية ‎(Daudi yj Raji‏ الخلايا البيضاء والحمراء ‎(KS562‏ الخلايا النخاعية 7 والخلايا الليمفاوية التائية 11582. تكون سلالات خلية الورم ‎(GAY)‏ المتوفرة مفيدة على نحو متساوي . كما يتعلق الكشف الحالي بمتواليات جديدة تم الكشف عنها هنا. في أحد التجسيدات يتم توضيح الفيروس في أي من المتواليات التي تم الكشف عنها هناء على سبيل المثال متواليات رقم: 1 إلى 9 متواليات رقم: 53-48 متوالية رقم: 63-56؛ متوالية رقم: 66؛ متوالية رقم: 69-68 و متوالية رقم: 73-72 . الصيغ ‎slay‏ الكشف الحالى أيضًا بصيغة صيدلانية من الفيروس على النحو الموصوف هنا.
— 9 7 — في أحد التجسيدات يتم توفير صيغة سائلة عن طريق الحقن غير المعوي؛ على سبيل المثال لتسريب أو حقن؛ عامل حال للورم قادر على الاستنساخ وفقًا للكشف ‎Hig Cua Jal‏ الصيغة جرعة في نطاق يتراوح من 1 * 10 10 إلى 1 ‎x‏ 10 14 من جسيمات فيروسية لكل حجم من الجرعة.
تشير صيغة عن طريق الحقن غير المعوي إلى صيغة تم تصميمها بحيث لا يتم توصيلها من خلال المسار المعدي المعوي. تتضمن طرق التوصيل عن طريق الحقن غير المعوي النمطية الحقن؛ الزرع أو التسريب. في أحد التجسيدات يتم توفير الصيغة عن طريق التوصيل بجرعة في أحد التجسيدات تكون صيغة عن طريق الحقن غير المعوي في صورة حقن. يتضمن الحقن
0 طرق الحقن داخل الوريد؛ تحت الجلد؛ داخل الورم أو داخل العضل. يشير الحقن على النحو المستخدم هنا إلى إدخال سائل فى الجسم بواسطة سرنجة. في أحد التجسيدات لا تتضمن الطريقة الواردة في الكشف الحالى الحقن داخل الورم. في أحد التجسيدات تكون صيغة عن طريق الحقن غير المعوي عن طريق التسريب. يشير التسريب على النحو المستخدم هنا إلى إعطاء موائع بمعدل ‎Und‏ بواسطة التساقط على هيئة قطرات مضخة تسريب محرك سرنجة أو وسيلة مكافئة. فى أحد التجسيدات يتم ‎J‏ لإعطاء بالتسريب أفترة زمنية تتراوح من 1.5 دقيقة إلى 120 دقيقق » ‎Jie‏ حوالي ‎T6543‏ 8 و 0 12:11 16151413 1817 2019 25 30 35 0ك ذك 50« 55« 60« 65« 70 65« 80« 85 90 95 100 105 110 أو 115 دقيقة. في أحد التجسيدات يتم إعطاء جرعة واحدة من صيغة أقل من 100 ملليلترء على سبيل المثال 0 30 ملليلترء على سبيل المثال بواسطة محرك ‎Syringeda yu‏ . في أحد التجسيدات يكون ا لإعطاء في صورة إعطاء بطئ على سبيل المتال خلال فترة تتراوح من 5 إلى 30 دقيقة.
في أحد التجسيدات تكون الصيغة للإعطاء داخل الوريد (في الوريد). تكون هذه الطريقة فعالة لتوصيل فيروس حال للورم لأنها تسمح بالوصول بسرعة إلى غالبية الأعضاء والأنسجة وتكن مفيدة بشكل خاص لعلاج السرطانات الثانوية؛ على سبيل المثال السرطانات الثانوية التي تم التوصل إليها خاصة تلك الموجودة في مناطق تم بها تكوين أوعية بدرجة كبيرة مثل الكبد والرئتين. نمطيًا ستكون الصيغ العلاجية معقمة وثابتة في ظل ظروف التصنيع والتخزين. يمكن صياغة
التركيبة في صورة محلول؛ مستحلب دقيق؛ جسيم شحمي؛ أو صيغة عن طريق الحقن غير المعوي أخرى مناسبة للإعطاء إلى إنسان ويمكن صياغتها في صورة وسيلة معبأة مسبقًا ‎fie‏ سرنجة أو ‎cig‏ بشكل محدد في صورة جرعة مفردة. ستشتمل الصيغة بوجهٍ عام على مادة مخففة أو مادة حاملة مقبلة ‎(Glan‏ على سبيل المثال مادة
0 حاملة غير سامة؛ مساوية التوتر متوافقة مع ‎(ug pill‏ وحيث يكون الفيروس ثابت لفترة زمنية مطلوية. يمكن أن تكون المادة الحاملة عبارة عن مذيب أو وسط تشتيت يحتوي؛ على سبيل المثتال. على ماء؛ ‎ethanol Jeti)‏ ؛ كحول عديد الهيدروكسيل ‎polyol‏ (على سبيل المثال؛ جليسرول ‎(glycerol‏ بروبيلين ‎propylene glycol Jsla‏ « وبولي ‎pli‏ جليكول سائل ‎liquid‏
‎polyethylene glycol 5‏ « وما شابه)؛ وخلائط مناسبة منها. يمكن الحفاظ على ميوعة مناسبة؛ على سبيل المثال؛ بواسطة استخدام مادة مشتتة أو مادة خافضة للتوتر السطحي مثل ليسيتين أو ‎sale‏ خافضة للتوتر السطحي غير أيونية ‎Jie‏ بولى سوريات 80 أو 40. في المشتتات يمكن المساعدة في الحفاظ على الحجم الجسيمي المطلوب بواسطةوجود ‎sale‏ خافضة للتوتر السطحي. تتضمن أمثلة عوامل مساوبة التوتر سكريات»؛ كحولات متعددة ‎Jie‏ مانيتول ‎mannitol‏
‎sorbitol Js eu 0‏ « أو كلوريد الصوديوم ‎sodium chloride‏ في التركيبة. في أحد التجسيدات يمكن أن تشتمل صيغ عن طريق الحقن غير المعوي مستخدمة على واحد أو أكثر من المحاليل المنظمة ‎dll)‏ على سبيل المثال حمض 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيرازين إيثان سلفونيك 8010-4 ‎(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic‏ ؛ محلول فوسفات منظم ‎phosphate buffer‏ و/أو محلول ‎Tris‏ منظم؛ ‎Su‏ على سبيل المثال
— 1 8 — دكستروز ‎dextrose‏ « مانوز ‎Mannose‏ « سكروز ‎sucrose‏ أو ما شابه؛ ملح مثل كلوريد الصوديوم؛ كلوريد الماجنسيوم ‎magnesium chloride‏ أو كلوريد البوتاسيوم ‎potassium‏ ‎chloride‏ ؛ مطهر ‎Jie‏ مادة خافضة للتوتر السطحى غير أيونية 000-0116 ‎PS— briji Ji‏ 0. 05-40 أو ما شابه. كما يمكن أن تشتمل الصيغة على ‎sole‏ حافظة ‎EDTA (fie‏ أو إيثانول أو توليفة من ‎EDTA‏ وإيثانول؛ والتي يعتقد أنا تمنع واحد أو أكثر من مسارات التحلل
المحتمل. في أحد التجسيدات ستشتمل الصيغة على فيروس نقىي حال للورم وفقًا للكشف الحالي؛ على سبيل المثال من 1 ‎X‏ 10 10 إلى 1 ‎x‏ 10 14 من جسيمات فيروسية لكل جرعة؛ مثل 1 ‎x‏ 10 10 إلى 1 * 10 12 من جسيمات فيروسية لكل جرعة. في أحد التجسيدات يتراوح تركيز الفيروس في
0 الصيغة من 2 ‎x‏ 10 8 إلى 2 ‎x‏ 10 14 بروتين فيروسي/ملليلتر» مثل 2 ‎x‏ 10 12 بروتين فيروسي/ملليلتر. فى أحد التجسيدات تشتمل الصيغة عن طريق الحقن غير المعوي على ‎glycerol Js yuls‏ . في أحد التجسيدات تشتمل الصيغة على فيروس غدي حال للورم على النحو الموصوف هناء ‎HEPES‏ (حمض 2-ل١-هيدروكسي‏ إيثيل ببرازين -2- ل١-إيثان‏ سلفونيك) ‎N-2-)‏
‎(hydroxyethylpiperazine—N"-2-ethanesulfonic acid 5‏ جليسرول ومحلول منظم. فى أحد التجسيدات تحتوي الصيغة عن طريق الحقن غير المعوي على الفيروس الوارد فى الكشف؛ ‎HEPES‏ على سبيل المثال 5 ‎Mo‏ مولار؛ جليسرول على سبيل المثال 9020-5 (حجم/حجم)؛ حمض هيدرو كلوريك 8010 ‎hydrochloric‏ ؛ على سبيل المثال لضبط الرقم الهيدروجيني بحيث يقع في نطاق يتراوح من 8-7 وماء للحقن.
‏0 في أحد التجسيدات تتم صياغة 0.7 ملليلتر من الفيروس الوارد في الكشف بتركيز يبلغ 2 ‎x‏ 10 2 بروتين فيروسي/ملليلتر في 5 مللي مولار من ‎HEPES‏ 7620 جليسرول برقم هيدروجيني ‎Mu Sle‏ 1.8 توجد مناقشة شاملة للمادة الحاملة المقبولة صيدليًا فى ‎Remington's Pharmaceutical‏ ‎.Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)‏
— 8 2 —
في أحد التجسيدات يتم توفير الصيغة في صورة صيغة للإعطاء الموضعي بما في ذلك الاستنشاق. تتضمن مستحضرات قابلة للاستنشاق مناسبة مساحيق ‎ALE‏ للاستنشاق» أيروسولات معايرة تحتوي على غازات دفعية أو محاليل قابلة للاستنشاق خالية من الغازات الدفعية. ستحتوي المساحيق
القابلة للاستنشاق ‎a‏ للكشف ‎dag‏ عام على فيروس على النحو الموصوف هنا مع سواغ مقبول ‎physiologicallytasls.5:8‏ . يمكن أن تتضمن المساحيق القابلة للاستنشاق المذكورة مونو سكاريد (على سبيل المثال جلوكوز ‎glucose‏ أو أرابينوز ‎arabinose‏ )ء ‎(gla‏ سكاريد ‎le) disaccharides‏ سبيل المثال لاكتوز ‎lactose‏ ؛ ‎saccharose jy Su‏ « مالتوز ‎gall «( maltose‏ — 060 ويولى سكاريد
‎polysaccharides 0‏ (على سبيل المتال دكستران ‎dextranes‏ )؛ كحولات متعددة (على سبيل المتال ‎sorbitol J giv you‏ ؛ ‎mannitol Jive‏ » زيليتول ‎xylitol‏ (« أملاح (على سبيل المثال كلوربد الصوديوم؛ كربونات ‎(calcium carbonate a sudlSll‏ أو خليط مما سبق. يتم استخدام المونو- أو الداي سكاريد بشكل مناسب؛ استخدام لاكتوز أو جلوكوز؛ بشكل محدد ‎(alg‏ حصري فى صورة الهيدرات الخاصة بها.
‏5 .من المطلوب أن يكون للجسيمات المراد ترسيبها في الرئة حجم جسيمي أقل من 10 ميكرون؛ ‎Jie‏ ‏9-1 ميكرون على سبيل المثال من 0.1 إلى 5 ميكرو تر بشكل محدد من 1 إلى 5 ميكرو متر. يكون الحجم الجسيمي للفيروس الحامل ذو أهمية أساسية وعليه في أحد التجسيدات يمكن امتزاز أو امتصاص أو الفيروس وفقًا للكشف الحالي على الجسيم؛ مثل جسيم لاكتوز ذو حجم محدد .
‏0 تكون الغازات الدفعية التى يمكن استخدامها لتحضير أيروسولات قابلة للإستنشاق معروفة فى المجال. يتم اختيار الغازات الدفعية المناسبة من ضمن هيدروكريونات ‎N= نايورب-١ Jie‏ ‎n-butane (isn «propane‏ أو أيزو بيوتان ‎isobutane‏ وهالو هيدروكريونات
‎Jie halohydrocarbons‏ مشتقات معالجة بالكلور و/أو معالجة بالفلور من الميثان ‎ethane i) «methane‏ « برويان ‎propane‏ ؛ بيوتان ‎butane‏ ؛ سايكلو برويان
‎cyclopropane‏ أو سايكلو بيوتان ‎cyclobutane‏ . يمكن استخدم الغازات الدفعية المذكورة أعلاه
‏بمفردها أو في خلائط منها.
‏تكون الغازات الدفعية المناسبة بشكل خاص عبارة عن مشتقات ألكان مهلجنة يتم اختيارها من
‎TG 1348 (TG 12 (TG 1‏ و16227. من ضمن الهيدروكريونات المهلجنة المذكورة أعلاه؛ تكون 161348 )1< 1< 1« 2-تترا فلورو إيثان ‎tetrafluoroethane‏ ) و16227 )1 1:1
‏2 ؛ 3 3-هبتا فلورو برويان ‎heptafluoropropane‏ ) وخلائط منها مناسبة بشكل محدد.
‏كما يمكن أن تحتوي أيروسولات قابلة للاستنشاق تحتوي على غاز دفعي على مكونات أخرى؛ مثل
‏مذيبات مشتركة؛ مثبتات؛ عوامل نشطة عند السطح (مواد خافضة للتوتر السطحي)؛ مضادات
‏أكسدة؛ مواد مزلقة ووسائل لضبط الرقم الهيدروجيني. تكون جميع هذه المكونات معروفة في
‏0 المجال. يمكن أن تحتوي الأيروسولات القابلة للاستنشاق التي تحتوي على غاز دفعي ‎Bay‏ للاختراع على ما يصل إلى 965 بالوزن من مادة فعالة. تحتوي الأيروسولات ‎By‏ للاختراع» على سبيل المثال» على 2 إلى 965 بالوزن» 0.01 إلى %3 ‎«hsb‏ 0.015 إلى 962 ‎«ish‏ 0.1 إلى 762 بالوزن» 0.5 إلى 962 بالوزن أو 0.5 إلى 961 بالوزن من المكون الفعال.
‏5 على نحو بديل يمكن أيضاً أن تتم عمليات الإعطاء بالرئة بواسطة إعطاء محلول سائل أو صيغة معلق؛ على سبيل المثال باستخدام وسيلة مثل بخاخ؛ على سبيل المثال؛ بخاخ متصل بضاغط (على سبيل المثال؛ بخاخ ‎Pari LC-Jet Plus(R)‏ متصل بضاغط ‎Pari Master(R)‏ مصنع ‎.(.Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va duis‏ يمكن توصيل الفيروس الوارد في الاختراع بشكل مشتت في مذيب؛ على سبيل المثال في صورة
‏0 محلول أو معلق؛ على سبيل المثال على النحو الموصوف بالفعل أعلاه للصيغ عن طريق الحقن غير المعوي. يمكن تعليقه في محلول فيزيولوجي مناسب؛ على سبيل المثال؛ محلول ملحي أو مذيب ‎AT‏ مقبول دوائيًا أو محلول منظم. يمكن أن تحتوي المحاليل المنظمة المعروفة في المجال على 0.05 مجم إلى 0.15 مجم من إديتات ‎gla‏ صوديوم 6061816 ‎«disodium‏ 8.0 مجم إلى 9.0 مجم من ‎«NaCl‏ 0.15 مجم إلى 0.25 مجم بولى سوريات ‎«polysorbate‏ 0.25
— 8 4 —
مجم إلى 0.30 مجم حمض ستريك لامائي ‎anhydrous citric acid‏ « 0.45 مجم إلى 0.55
مجم سيترات الصوديوم ‎sodium citrate‏ لكل 1 ملليلتر من الماء بحيث يتم الحصول على رقم
هيدروجيني يتراوح من حوالي 4.0 إلى 5.0.
كما يمكن أن تحتوي المعلقات العلاجية أو صيغ المحلول على واحد أو أكثر من السواغات. تكون السواغات معروفة في المجال وتتضمن محاليل منظمة ‎Jo)‏ سبيل المثال» محلول منظم
بالسيترات 0116 ‎citrate‏ ؛ محلول فوسفات ‎phosphate buffers‏ ؛ محلول منظم
بالأسيتات ‎acetate buffer‏ ومحلول منظم بالباي كريونات ‎«(bicarbonate buffer‏ أحماض
‎Urealsys cdi‏ ¢ كحولات» حمض أسكوربيك 8010 85001016 ؛ دهون الفوسفورية؛ بروتينات
‏(على سبيل المثال؛ ‎JY)‏ مصل) « ‎EDTA‏ كلوريد الصوديوم؛ جسيمات شحمية؛
‏10 مانيتولا01800110 ؛ سورييتولا5000110 ؛ وجليسرول. يمكن تغليف المحاليل أو المعلقات فى جسيمات شحمية أو كريات دقيقة قابلة للتحلل الحيوي. سيتم توفير الصيغة ‎dag‏ عام في صورة معقمة إلى ‎NEN‏ كبير باستخد ام عمليات تصنيع ‎cadre‏ ‏يمكن أن يتضمن ذلك الإنتاج والتعقيم بالترشيح لمذيب/محلول منظم مستخدم في الصيغة؛ التعليق المعقم للجسم المضاد في محلو مذيب منظم معقم وتشتيت الصيغة في أوعية معقمة بواسطة طرق
‏5 مألوفة لأصحاب المهارة العادية فى المجال. يمكن توفير صيغ قابلة للرش وفقًا للكشف الحالي؛ على سبيل ‎(JB‏ في صورة وحدات جرعة مفردة (على سبيل ‎(JE‏ أوعية وقنينات بلاستيكية محكم الغلق) معبأة في أغلفة رقائقية. تحتوي كل قنينة على وحدة جرعة بحجم يبلغ على سبيل المثال؛ 2 ‎elle‏ من مذيب/محلول منظم . العلاج في العلاج؛ بشكل محدد لعلاج السرطان . في أحد التجسيدات يتم استخدام الطريقة الخاصة بالعلاج في علاج ورم.
— 5 8 — يقصد بالورم على النحو المستخدم هنا كتلة نسيج غير سوية تنتج عن الانقسام المفرط للخلايا غير المتحكم فيها ومتفاقمة؛ وبطلق عليها أيضًا ورم 060018507. يمكن أن تكون الأورام إما حميدة (غير سرطانية) أو خبيثة. يتضمن الورم جميع صور السرطان والسرطانات الثانوية. في أحد التجسيدات يكون الورم ‎Ble‏ عن ورم صلب. يمكن أن يكون الورم الصلب موضعي أو انتشاري . في أحد التجسيدات يكون الورم ذو مصدر ظهاري. في أحد التجسيدات يكون الورم خبيث؛ مثل سرطان القولون والمستقيم؛ ورم كبدي؛ سرطان البروستاتاء سرطان البنكرياس ¢ سرطان الثدي ¢ سرطان المبيض؛ سرطان الغدة الدرقية؛ سرطان الكلى» سرطان ‎(ASE‏ سرطان الرأس والعنق أو سرطان الرئة. 0 في أحد التجسيدات يكون الورم عبارة عن سرطان القولون والمستقيم الخبيث. يشير المرض الخبيث على النحو المستخدم هنا إلى الخلايا السرطانية. في أحد التجسيدات يتم استخدام الفيروس الغدي حال للورم في علاج أو الوقاية من السرطانات الثانوية الانتشارية. في أحد التجسيدات يتم استخدام الطريقة أو الصيغة الواردة هنا في علاج الأورام السرطانية 5 المقاومة للعقار. فى أحد التجسيد ات يتم إعطاء الفيروس فى توليفة مع إعطاء علاج ‎AT‏ للسرطان . في أحد التجسيد ات يتم توفير فيروس أو صيغة ‎Cassi FE‏ الحالي للاإستخد ام في تصنيع دواء لعلاج السرطان؛ على سبيل المثال السرطان الموصوف أعلاه. في جانب آخر يتم توفير طريقة لعلاج السرطان تشتمل على إعطاء كمية دوائية فعالة من فيروس 0 أو صيغة ‎By‏ للكشف الحالي إلى مريض في حاجة ‎lal]‏ على سبيل المثال مريض من البشر. في أحد التجسيدات يتم إعطاء الفيروس الحال للورم أو الصيغة الواردة هنا في توليفة مع علاج ‎CAT‏
— 6 8 — يقصد بتعبير "في توليفة' على النحو المستخدم هنا أن يتضمن إعطاء الفيروس الحال للورم قبل؛ يبشكل مصاحب و/أو بعد علاج السرطان . يتضمن علاج السرطان الجراحة؛ العلاج بالإشعاع؛ العلاج الموجه و/أو العلاج الكيماوي . يشير علاج السرطان على النحو المستخدم هنا إلى مركب علاجي أو عامل بيولوجي؛ على سبيل المثال جسم مضاد معد لعلاج السرطان و/أو العلاج الدائم له. في أحد التجسيدات يتم اختيار علاج السرطان من أي علاج مضاد للسرطان والذي يتضمن عامل علاج ‎(Gla‏ عامل موجه مضاد للسرطان؛ العلاج بالإشعاع؛ العلاج بالنظائر المشعة أو أي توليفة مما سبق. في أحد التجسيدات يمكن استخدام الفيروس الوارد في الكشف الحالي مثل فيروس غدي حال للورم 0 كمعالجة مسبقة للعلاج مثل الجراحة (علاج تمهيدي مساعد)؛ لتقليص الورم»لعلاج السرطانات الثانوية الانتشارية و/أو منع السرطانات الثانوية الانتشارية أو السرطانات الثانوية الانتشارية الأخرى. يمكن استخدام الفيروس الغدي حال للورم بعد العلاج؛ ‎die‏ الجرحة (علاج مساعد)؛ لعلاج السرطانات الثانوية الانتشارية و/أو منع السرطانات الثانوية الانتشارية أو السرطانات الثانوية الانتشارية الأخرى. 5 يشير تعبير بشكل مصاحب على النحو المستخدم هنا إلى إعطاء علاج إضافي للسرطان في نفس الوقت أو في نفس الوقت ‎Lois‏ مع صيغة الفيروس الغدي حال للورم. يمكن تضمين العلاج في نفس الصيغة أو إعطائع في صيغة منفصلة. في أحد التجسيدات يتم إعطاء الفيروس في توليفة مع إعطاء عامل علاج كيماوي ‎.chemotherapeutic agent‏ يقصد بعامل علاج كيماوي على النحو المستخدم هنا الإشارة إلى عوامل أو عقاقير كيميائية خاصة مضادة للورم ‎lly‏ تكون ‎Sate‏ نوعيًا للخلايا والأنسجة الخبيثة. على سبيل المثال» عوامل ‎alkylating agents‏ « مضادات للأيض» أنثراسيكلين ‎anthracyclines‏ « قلوانيات ‎plant alkaloidsasls‏ ¢ مثبطات توبوايزوميراز ‎topoisomerase inhibitors‏ « وعوامل أخرى
مضادة للورم. تتضمن الأمثلة الأخرى للعلاج الكيماوي دوكسورونيسيين 0000101010 5-فلورو يوراسيل ‎(5-FU) S-fluorouracil‏ ؛ باكليتاكسيل ‎(paclitaxel‏ كابيسيتابين ‎capecitabine‏ « إيرينوتيكان ‎irinotecan‏ « والبلاتينات 018105 ‎Jie‏ سِيشبلاتين ‎cisplatin‏ ‏وأكساليبلاتين ‎oxaliplatin‏ . يمكن اختيار الجرعة المفضلة بواسطة الممارس على أساس طبيعة السرطان المراد علاجه. في أحد التجسيدات يتمثل العامل العلاجي في ‎ganciclovir ysis‏ ؛ والذي يمكن أن يساعد في التحكم في الاستجابات المناعية و/أو تكون الأوعية بالورم. في أحد التجسيدات يكون واحد أو أكثر من العلاجات المستخدمة هنا ميترونوميكي 0160000006 وهو عبارة عن علاج مستمر أو متكرر باستخدام جرعات منخفضة من عقاقير 0 مضادة للسرطان؛ ‎Sale‏ ما يتم إعطائه بشطل مصاحب لطرق أخرى للعلاج. يمكن أن تكون فيروسات غدية حالة للورم من المجموعة الفرعية 8؛ بشكل محدد 8011 وتلك المشتقة ‎Lge‏ مثل 50/0 مؤازرة بشكل محدد للعلاجات الكيماوية لأنه يبدو أن لها آلية تأثير مستقلة بدرجة كبيرة عن تلاشي الخلايا؛ قتل الخلايا السرطانية بواسطة في الغالب آلية نخر انحلالي. علاوة على ذلك؛ يمكن أن يسمح الكبت المناعي الذي يحدث أثناء العلاج الكيماوي 5 لللفيروس الحال للورم بأن يعمل بفاعلية أكبر. تشير الجرعة العلاجية على النحو المستخدم هنا إلى كمية من فيروس؛ ‎fie‏ فيروس غدي حال للورم مناسبة لتحقيق تأثير علاجي مطلوب عند استخدامها في نظام علاجي؛ على سبيل المثال تُحسن من أعراض أو حالات المرض. يمكن أن تعتبر الجرعة كجرعة علاجية في علاج السرطان أو السرطانات الثانوية عندما يكون عدد الجسيمات الفيروسية كافٍ لتحقيق ما يلي: إبطاء أو إيقاف 0 نمو الورم أو انتشاره؛ أو ملاحظة تقلص ‎ana‏ الورم أو السرطانات الثانوية الانتشارية» و/أو إطالة المدى العمري للمريض. تكون الجرعات اعلاجية المناسبة ‎dag‏ عام عبارة عن توازن بين التأثير العلاجي والسشّمية المسموح بها؛ على سبيل المثال ندما يكون التأثير الجانبي والسمية ضمن الحدود المسموح بها مع أخذ الفائدة التي تم تحقيقها بواسطة العلاج في الاعتبار.
— 8 8 —
في أحد التجسيدات يتم إعطاء فيروس أو ‎gia‏ علاجي منشاً وفقًا للكشف ‎all‏ (يتضمن صيغة
تشتمل عليه) أسبوعيًا؛ على سبيل المثال في الأسبوع 1 يتم إعطاء الجرعة في اليوم 1؛ 3؛ 5؛
يليها جرعة واحدة في كل أسبوع لاحق.
في أحد التجسيدات يتم إعطاء فيروس أو ‎gia‏ علاجي منشاً وفقًا للكشف ‎all‏ (يتضمن صيغة تشتمل عليه) مرتين بالأسبوع أو ثلاث مرات بالأسبوع؛ على سبيل المثال يتم إعطاء واحدة في لأسبوع 1 في الأيام 31 و5 ¢ ودتم ‎Wad‏ إعطائها في | لأسبوع 2 أو 3 في | لأيام 3.1 و5 ‎Ada‏
يمكن تكرار نظام إعطاء الجرعات المذكور عدة مرات حسب الحاجة .
في أحد التجسيدات يتم إعطاء فيروس أو ‎gia‏ علاجي منشاً وفقًا للكشف ‎all‏ (يتضمن صيغة
تشتمل عليه) شهريًا.
0 في أحد التجسيدات يت تحضير الفيروسات والأجزاء المنشأة الواردة في الكشف الحالي بواسطة تقنيات ناتج عودة الارتباط الجيني. سيدرك صاحب المهارة في المجال أنه يمكن تصنيع مجموعة العوامل الوراثية للفيروس الغدي المُسلح بواسطة وسائل فنية أخرى؛ والتي تتضمن تخليق مجموعة العوامل الوراثية أو بلازميد ‎plasmid‏ يشتمل عل ‎ein‏ من مجموعة العوامل الوراثية أو جميعها بالكامل. سيدرك صاحب المهارة العادية فى المجال أنه فى ‎Ala‏ تخليق مجموعة العوامل الوراثية
5 .قد لا تشتمل منطقة الإدخال على نوكليوتيدات موضع التقييد حيث أن الأخير يخدع الإدخال التالي للجينات باستخدام طرق إنشاء النسائل. في أحد التجسيدات يتم تصنيع ‎de game‏ العوامل الوراثية للفيروس الغدي المُسلح تخليقيًا بالكامل» على سبيل المثال وفقًا للمتوالية رقم: 63. كما يتعلق الكشف بفيروس غدي له الصيغة )1( أو صيغة فرعية منهاء يتم الحصول ‎lle‏ أو أو
يمكن الحصول عليها من إدخال جين ناقل أو مجموعة جين ناقل. تشير 'في ‎(Is)‏ على النحو المستخدم هنا إلى يشتمل على. في سياق الوه 0 الحالي يتم ا ِ ‎hy‏ 0 على" على أنها أت ‎Sas‏
— 9 8 — كما يُقصد بتجسيدات الاختراع التي تشتمل على سمات/عناصر محددة أن تمتد إلى تجسيدات بديلة 'تحتوي على" أو " تحتوي بصفة أساسية على" عناص ر/سمات ذات صلة. عندما يكون مناسبًا من الناحية الفنية؛ فإنه يمكن دمج تجسيدات الاختراع. يتم تضمين المراجع الفنية مثل براءات الاختراع والطلبات هنا كمرجع. يمكن أن تُشكل أي من التجسيدات المذكورة هنا على ‎dag‏ التحديد ‎Jang‏ صريح أساسًا ل للتنازل عن الحق إما بمفردها أو في توليفة مع واحدة أو أكثر من التجسيدات الأخرى. يتم أيضًا وصف الاختراع الحالي على سبيل التوضيح فحسب فى الأمثلة التالية؛ التى تشير إلى الأشكال المرفقة. المتواليات 0 متوالية رقم: 1 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=TT‏ تشتمل على مجموعة عوامل وراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ ذي الطول الكامل التي تم الطرف 5" ‎«(bSA) branched splice acceptor sequence‏ متوالية ثقيلة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 75 55> متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5" 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3. متوالية رقم: 2 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 816-135 تشتمتل على مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ ذي الطول الكامل التي تم الطرف 5" ‎(SSA)‏ متوالية ثقيلة السلسلة 85 ذات متوالية رائدة عند الطرف 75 ‎IRES‏ متوالية 0 خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5” ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 3 متوالية مجموعة عوامل وراثية لفيروس تشتمل على مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ ذي الطول الكامل التي تم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة
الجين الناقل على ‎SSA‏ متوالية ‎ALE‏ السلسلة ‎Ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 275 ‎(SSA‏ ‏ومتوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5”. متوالية رقم: 4 متوالية مجموعة عوامل وراثية لفيروس تشتمل على مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ ذي الطول الكامل التي تم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎SSA‏ متوالية ‎ALE‏ السلسلة ‎Ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 275 ‎(SSA‏ ‏متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 5 متوالية مجموعة عوامل وراثية ‎NG=T4 ug pil‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎DSA‏ متوالية ‎SCV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة 0 عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 6 متوالية مجموعة عوامل وراثية ‎NG=T8 ug pill‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات بطاقة ‎His6‏ عند الطرف ©؛ يتم إدخالها في المنطقة 81. تحتوي مجموعة الجين الناقل على 05/8 متوالية ‎SCFV‏ ‏مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎X‏ 6 هستيدين ‎histidine‏ عند الطرف 5 3 ومتوالية ‎poly(A)‏ ‏متوالية رقم: 7 متوالية مجموعة عوامل وراثية لفيروس 6-76ل! متوالية تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 50/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل 80177 مضاد ل ‎VEGF‏ ذات بطاقة 6 عند الطرف 0؛ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎(CMV‏ متوالية ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5” ومتوالية ‎X‏ 6 هستيدين 0 عند الطرف 3 ومتوالية ‎poly(A)‏ ‏متوالية رقم: 8 متوالية مجموعة عوامل وراثية لفيروس ‎NG=T3‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎«CMV‏ متوالية ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5" ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3”.
— 1 9 — متوالية رقم :9 متوالي مجموعة عوامل وراثية للفيروس 134 ‎NG-‏ تشتمل على ‎Jal gall de gana‏ الوراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ‎VEGF J‏ ذي الطول الكامل تم إدخالها فى المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎(CMV‏ متوالية ثقيلة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 75 ‎(IRES‏ متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3. متوالية رقم: 10 متوالية ‎BX IDNA‏ مناظرة ل وتتضمن زوج القاعدة 28366-28166 لمجموعة العوامل الوراثية ل 0/0. متوالية رقم: 11 متوالية ‎BY IDNA‏ مناظرة ل وتتضمن زوج القاعدة 29379-29345 لمجموعة العوامل الوراثية ل 0/0. 0 1 متوالية رقم :12 مجموعة عوامل وراثية ل ‎.EnAd‏ ‏متوالية رقم : 3 1 معزز خارجي ‎.CMV‏ ‏متوالية رقم : 4 1 معزز خارجي ‎PGK‏ . متوالية رقم : 5 1 معزز خارجي ‎CBA‏ . متوالية رقم: 16 مستقبل جدل قصير ‎Short splice acceptor‏ (/55). متوالية فارغة متوالية رقم: 17 مستقبل ‎.(SA) splice acceptor Jas‏ متوالية رقم: 18 مستقبل جدل متفرع ‎.(bSA) branched splice acceptor‏ متوالية رقم: 19 متوالية مدخل ريبوسوم داخلي ‎Internal Ribosome Entry sequence‏ ‎.(IRES)‏ ‏متوالية رقم: 20 متوالية ‎Ju‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات. 0 متوالية رقم: 21 المتوالية الرائدة (11/11). متوالية رقم: 22 المتوالية الرائدة ‎(BHG)‏
متوالية رقم: 23 بطاقة هستيدين. متوالية رقم: 24 بطاقة ‎V5‏ ‏متوالية رقم: 25 ببتيد ‎P2A‏ ‏متوالية رقم: 26 ببتيد ‎F2A‏
متوالية رقم: 27 ببتيد ‎E2A‏ ‏متوالية رقم: 28 ببتيد 12/8 . متوالية رقم: 29 متوالية حمض أميني ‎amino acid‏ ذات سلسلة ‎AL‏ متغيرة 800 لمضاد ‎VEGF‏ ‏متوالية رقم: 30 متوالية حمض أميني ذات سلسلة ثقيلة متغيرة لجسم مضاد ل ‎PD-L1‏
0 متوالية رقم: 31 متوالية حمض أميني ذات سلسلة خفيفة متغيرة 80 لمضاد ‎VEGF‏ ‏متوالية رقم: 32 متوالية حمض أميني ذات سلسلة خفيفة متغيرة لجسم مضاد ل ‎PD-L1‏ ‏متوالية رقم: 33 متوالية حمض أميني ذات سلسلة ثقيلة ثابتة ل ‎IgG]‏ بشري. متوالية رقم: 34 متوالية حمض أميني ذات سلسلة ثقيلة ثابتة معدلة لذ ‎IgG]‏ بشري. متوالية رقم: 35 متوالية حمض أميني ذات سلسلة خفيفة ثابتة لكابا بشري. 5 متوالية رقم: 36 متوالية حمض أميني ل ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ‏متوالية رقم: 37 متوالية حمض أميني ل ‎SCFV‏ مضاد ‎PD-L1‏ ‏متوالية رقم: 38 متوالية حمض أميني لبروتين فلوري أخضر ‎Green fluorescent protein‏ ‎..amino acid‏ متوالية رقم: 39 متوالية حمض أميني لليوسيفيراز ‎.Luciferase amino acid‏
— 3 9 — متوالية رقم: 40 متوالية حمض أميني لعامل نخر الورم البشري ‎Tumour necrosis ll‏ ‎(TNFa) factor alpha‏ متوالية رقم : 41 متوالية حمض أمينى لإنترفيرون جاما بشري ‎Interferon gamma (IFNy)‏ متوالية رقم: 42 متوالية حمض أميني لإنترفيرون ألفا بشري ‎Interferon alpha (IFN)‏ متوالية رقم: 43 متوالية حمض أميني لمولد ضد لسرطان الخصيتين البشري 1 ‎NY-ESO-)‏ ‏1( ‏متوالية رقم : 44 متوالية ‎aan‏ أميني ‎MUC- 1 J‏ بشري . متوالية رقم: 45 متوالية ‎(Kozak‏ 900800819 (متوالية فارغة) متوالية رقم: 46 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=177‏ تشتمل على مجموعة العوامل 0 الوراثية ل 50/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل 00-11 ذي الطول الكامل تم إدخالها فى المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎CMV‏ متوالية ‎ALE‏ السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 75 ‎(IRES‏ متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 47 متوالية ‎DNA‏ مناظرة لمنطقة 28 لمجموعة العوامل الوراثية ل 50/0 (زوج 5 القاعدة 5068-10355). متوالية رقم: 48 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=167‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 50/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات بطاقة ‎His6‏ عند الطرف ؛ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎SSA‏ عند الطرف ¢°5 متوالية ‎ScFv‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5” ومتوالية ‎poly(A)‏ عند 0 الطرف 3”.
— 9 4 —
متوالية رقم: 49 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 116-95 تشتمل على مجموعة جين ناقل مُشفرة للسيتوكين» ‎IFNy‏ يتم إدخالها في المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎CMV‏ عند الطرف 25 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎IFNy‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 متوالية رقم: 50 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 116-97 تشتمل على مجموعة جين
ناقل مُشفرة للسيتوكين» ‎IFN‏ يتم إدخالها في المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎CMV‏ عند الطرف 5”» متوالية ‎cDNA‏ ل ‎IFNa‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 متوالية رقم: 51 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=92‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة للسيتوكين» ‎(IFNy‏ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ ‏تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎BSA‏ عند الطرف 25 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎IFNy‏ ومتوالية
‎poly(A) 0‏ عند الطرف 3. متوالية رقم: 52 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=96‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مجموعة جين ناقل مُشفرة للسيتوكين» 6ل1-ا؛ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ ‏تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎BSA‏ عند الطرف 25 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎IFNor‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3
‏5 مقتوالية رقم: 53 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 816-139 تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة للسيتوكين» 111706 يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ ‏تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎SSA‏ عند الطرف 25 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎TNFa‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 متوالية رقم: 54 ‎gia‏ إقحام موضع تقييد ‎(BY)‏
‏0 متوالية رقم: 55 جزء إقحام موضع تقييد ‎(BX)‏ ‏متوالية رقم: 56 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 16-220 تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لمولد ضد مصاحب للورم؛ ‎(NY-ESO-1‏ يتم
إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎PGK‏ عند الطرف 5 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎NY-ESO-1‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 متوالية رقم: 57 ‎NG=217‏ متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس تشتمل على ‎de gana‏ العوامل الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لمولد ضد مصاحب للورم؛ ‎(NY-ESO-1‏ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎CMV‏ عند الطرف 5 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎NY-ESO-1‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 متوالية رقم: 58 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=242‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎CTLA=4‏ ذي الطول الكامل تم إدخالها في المنطقة 87. تحتوي ‎de gene‏ الجين الناقل على ‎SSA‏ متوالية ثقيلة السلسلة ‎ab‏ ذات 0 متوالية رائدة عند الطرف 5 ‎RES‏ متوالية خفيفة السلسلة ‎Ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5” ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3”. متوالية رقم: 59 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=165‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ ذي الطول الكامل تم إدخالها في المنطقة 87. تحتوي ‎de gene‏ الجين الناقل على ‎SSA‏ متوالية ثقيلة السلسلة ‎ab‏ ذات 5 متوالية رائدة عند الطرف 5 متوالية ببتيد ‎(P2A‏ متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 60 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 806-190 تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل 010-11 ذي الطول الكامل تم إدخالها في المنطقة 87. تحتوي ‎de gene‏ الجين الناقل على ‎SSA‏ متوالية ثقيلة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 متوالية ببتيد ‎(P2A‏ متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 61 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=221‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎ScFv‏ مضاد 010-11 ذو بطاقة 1156 عند الطرف 0؛ يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎SSA‏ عند الطرف
— 6 9 — 5.؛ متوالية ‎ScFv‏ مضاد ‎PD-L1‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 75 ومتوالية ‎X‏ 6 هستيدين عند الطرف 3” ثم المتوالية ‎poly(A)‏ ‏متوالية رقم: 62 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 16-258 تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ ذي الطول الكامل تم إدخالها فى المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎«CMV‏ متوالية ثقيلة السلسلة
‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 25 متوالية ببتيد ‎(P2A‏ متوالية خفيفة السلسلة ‎ab‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 63 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 16-185 تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مواضع تقييد فريدة يتم إدخالها في المناطق ‎BY 5 BX‏
‏10 متوالية رقم: 64 بلازميد ‎((pColoAd2.4) 0016-33 IDNA‏ يشتمل على مصدر بكتيري للاستنساخ (/015)؛ جين مقاومة مضاد حيوي ‎(KaNR)‏ ومتوالية مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع إدخال مواضع تقييد فريدة في المنطقة ‎BY‏ ‏متوالية رقم: 65 بلازميد ‎DNA‏ ل 016-185 (06001002.6)؛ يشتمل على مصدر بكتيري للاستنساخ (/015)؛ جين مقاومة مضاد حيوي ‎(KaNR)‏ ومتوالية مجموعة العوامل الوراثية ل
‎EnAd 1 5‏ مع إدخال مواضع ‎Angi‏ فريدة فى المناطق ‎BY, BX‏ . متوالية رقم: 66 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 116-5001 تشتمل على مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎shRNA‏ ل ‎GAPDH‏ تم إدخالها في المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على معزز ‎DNA; U6 RNA pollll‏ مُشفر ل ‎.ShRNA‏ ‏متوالية رقم : 67 متوالية حمض أمينى لمُرَاجل يوديد الصوديوم ‎Sodium lodide symporter‏
‎(NIS) 0‏ متوالية رقم: 68 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=280‏ تشتمل على مجموعة جين ناقل مُشفرة ‎Jabal‏ يوديد الصوديوم ‎(NIS)‏ تم إدخالها في المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين ‎Jalil‏ على ‎SSA‏ عند الطرف 5 متوالية ‎cDNA‏ ل ‎NIS‏ ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3
— 7 9 — متوالية رقم: 69 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=272‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل ‎5017١‏ مضاد ل ‎alias ScFv 3 VEGF‏ ل 00-1 تم إدخالها في المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎(SSA‏ متوالية ‎ScFv‏ ‏مضاد 010-11 ذات متوالية رائدة عند الطرف 5" وبطاقة ‎6XHis‏ عند الطرف 3 متوالية ببتيد ‎(P2A 5‏ متوالية 507 مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5” وبطاقة ‎V5‏ عند الطرف 3 ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 متوالية رقم: 70 متوالية حمض أميني ذات سلسلة ثقيلة متغيرة لمضاد ‎CTLA-4‏ ‏متوالية رقم: 71 متوالية حمض أميني ذات سلسلة خفيفة متغيرة لمضاد ‎CTLA-4‏ ‏متوالية رقم: 72 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس 16-257 تشتمل على مجموعة العوامل 0 الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل 5017 مضاد ل ‎VEGF‏ تم إدخالها في المنطقة ‎BX‏ تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎bSA‏ متوالية ‎ScFv‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5" ‎days‏ 61115 عند الطرف 3 ثم المتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف ‎U3‏ ‏متوالية رقم: 73 متوالية مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG=281‏ تشتمل على مجموعة العوامل الوراثية ل 0/0 مع مجموعة جين ناقل مُشفرة ل /501 مضاد ل ‎VEGF‏ تم إدخالها في المنطقة 8# و مجموعة جين ناقل ثانية مُشفرة ل ‎ScFv‏ مضاد 010-11 تم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ ‏تحتوي مجموعة الجين الناقل على ‎(bSA‏ متوالية ‎ScFv‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ذات متوالية رائدة عند الطرف 5" ويطاقة ‎6XHis‏ عند الطرف 3 ثم المتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3”. متوالية رقم: 74 موضع تقييد يتم تمييزه وقطعه بواسطة الإنزيم ‎A=CrEl‏ ‏متوالية رقم : 75 موضع تيد يتم تمييزه وقطعه بواسطة ‎f‏ لإنزيم 1 نا06)-|. متوالية رقم : 76 موضع تيد يتم تمييزه وقطعه بواسطة ا ‎.1-Scel ayy‏ متوالية رقم: 90-78 تعرض بادئات. الأمثلة
— 8 9 — ‎Ju‏ "م" المستخدمة كبادئة فى تسمية الأجزاء المنشأة على أن ‎gall‏ المنشاً عبارة عن بلازميد. ‎aby!‏ 6-1 تم تحضير الفيروسات باستخدام المتواليات الموضحة فى المتوالية رقم: 2 ‎6S‏ 857 باستخدام الطرق الموصوفة أدناه. تم استنبات خلايا ‎(Agilent #240085) AD293‏ في ‎DMEM‏ به محتوى عالى من الجلوكوز 06 مع الجلوتامين ‎Ae 5 (Gibco: 10109163) glutamine‏ مولار من ا- جلوتامين» 2 ‎(Ale‏ مولار من بيروفات الصوديوم ‎«Sodium pyruvate‏ 1 مللي مولار من أحماض أمينية غير أساسية ‎(PAA:M11-003)‏ وم060/508. تتم الإشارة إلى هذه الأوساط 0 بأوساط '80293". يتم إلى أوساط مستنبت خلية روتينية إضافة 9610 ‎Gibco: ( FBS‏ 2 ) ولعمليات نقل العدوى وحالات العدزى ب 962 ‎FBS‏ ‏تم استزراع 1.2 ‎x‏ 10 6 خلية 810293/قارورة في قواربير 1-25 قبل 24 ساعة من نقل العدوى بحيث تبلغ الكثافة عند ‎(Goal Jaa‏ ب 9675 يبشكل مجمع. نقل العدوى لمجموعة عوامل وراثية للفيروس تم قياس تركيز بلازميد ‎DNA‏ للبلازميدات ‎(pNG-135‏ 73-لاام ‎pNG-74‏ 75-ولام ‎pNG-76‏ (الجدول 2) و7.0 ميكرو جرام أو يتم بعد ذلك جعل كل منها خطية باستخدام إنزيم تقييد ‎Ascl‏ لمدة ساعتين» عند 37 درجة. تم تخفيف ‎DNA‏ المهتضمن باستخدام 50 ميكرولتر من ماء ‎JB‏ من النوكلياز ‎NUclease‏ ثم تمت تنقيته بواسطةاستخلاص الفينول/كلوروفورم. بعد ذلك تم ترسيب ال ‎DNA‏ المستخلص لمدة 16 ساعة؛ عند -20 درجة مثئوية في 300 ميكرو لتر 20 .من <%95 إيثانول من 45% البَبُولُوجيا الجُزَيئِيّة و10 ميكرو لتر من 3 مولار من أسيتات الصودويم. تم تشكيل ال ‎DNA‏ المترسب في صورة كريات بواسطة الطرد المركزي بمعدل 14000 لفة في الدقيقة؛ لمدة 5 دقائق وتم غسله في 500 ميكرو لتر من 9670 إيثانول ‎ethanol‏ قبل الطرد المركزي مرة أخرى؛ بمعدل 14000 لفة في الدقيقة؛ لمدة 5 دقائق. تم تجفيف كريات ال
‎DNA‏ النظيفة بالهواء؛ تمت ‎sale]‏ تعليقها في 500 ميكرو لتر ‎OtiMEM‏ يحتوي على15 ميكرو لتر من مادة كاشفة لنقل العدوى من فكتامين شحمي ‎lipofectamine‏ وتم تحضينها لمدة 0 دقيقة؛ عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تمت إضافة خليط نقل العدوى بالتقطير إلى قارورة 1-5 تحتوي على خلايا 20293. بعد تحضين الخلايات مع خليط نقل العدوى لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية؛ تمت إضافة 4 ملليلتر من 965 602 من أوساط الخلية ‎DMEM)‏ به
محتوى عالي من الجلوكوز مع الجلوتامين المضاف إليه 962 ‎(FBS‏ إلى الخلايا وتمت حضانة القوارير عند 37 درجة مئوية. 06025 96. تمت مراقبة الخلايا يوميًا للتحقق من وجود تأثير الاعتلال الخلوي ‎(CPE)‏ (الشكل 1أ-ه؛ الشكل 5-12« الشكل 3-ج). فور ملاحظة وجود ‎CPE‏ كبير تم تجميع الفيروس وتم تسجيل نقطة
0 التجميع الزمنية في الجدول 2. تجميع وتضخيم الفيروس تم امتصاص الخلايا الموجودة في الأوساط من قاع القارورة ونقلها إلى أنبوب فالكون سعة 15 تم تشكيل الخلايا في صورة ‎LS‏ بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 1500 لفة في
5 الدقيقة وتم تجميع المادة الطافية وتخزينها (-4 ملليلتر). تمت إعادة تعليق كريات الخلية في 1 ملليلتر من أوساط ‎AD293‏ وتم تجميع الفيروس باستخدام ثلاث دوران تجميد-إذابة. بالنسبة ‎SIA‏ ‏تم تجميد كريات الخلية في نيتروجين سائل ثم تمت إذابتها في حمام ماء تبلغ درجة حرارته 37 درجة ‎gia‏ قبل الطرد المركزي بمعدل 1200 لفة في الدقيقة؛ لمدة 10 دقائق وتجميع الفيروس الذي يحتوي على المادة الطافية. تم استخدام الفيروسات المجمعة لإعادة نقل العدوى إلى خلايا
0 80293 لتضخيم محاليل الفيروس الخام. تم تأكيد إنتاج الفيروس الحيوي أثناء التضخيم بواسطة ملاحظة ‎CPE‏ الكبير في الطبقة الأحادية للخلية (الشكل 1 و-3؛ الشكل 2 ‎pad‏ الشك 3ح). فور ملاحظة ‎CPE‏ تم تجميع الفيروس من 293 خلية بواسطة ثلاث دوران تجميد -إذابة. تم تكرار التضخيم في خلايا 810293 حتى 5 مرات حتي يتم توليد محاليل الفيروس الخام التي نتج ‎ie‏
‎CPE‏ الكبير في طبقات الخلية الأحادية خلال 48 ساعة من الإصابة بالعدوى (الشكل 1 ‎mz‏ ‏الشكل 2 ق-ضء الشكل 2© الشكل 3 ط-م؛ الجدول 2). تنقية الفيروس السيزيوم لإنتاج محاليل الفيروس الخام ‎NG-78 3; NG-76 (NG-74 6-73 (NG-135‏ تمت معايرة المحاليل الخام المذكورة بواسطة قياس الامتصاص عند 280/260 نانو متر (تم تسجيل العيارات في الجدول 2). الجدول 2 ‎CPE‏ عيار الفيروس ‎DNA]‏ ‏هوية الكبير الذنى ‎١‏ دورات الفطوق ب ‎CsCl‏ ‏متوالية رقم: | البلازميد] نانو الفيروس تم الكشف ‎١‏ التضخيم (بروتين جرام/ملليلتر إ: عنه فيروسي/ملليلتر) ‎١, NG-‏ متوالية رقم: 241 6 ماعة |2 1.51 ‎x‏ 10 12 135 2 ‎NG-‏ | متوالية رقم: 260 2 ساعة |3 9.90 ‎x‏ 10 10 73 8 ‎١, NG-‏ متوالية رقم: ‎x 9 5١ del. 384 253‏ 10 11 74 5 ‎NG-‏ | متوالية رقم: 330 4 ساعة |2 0 ‎x‏ 10 10 76 7 ‎١, NG-‏ متوالية رقم: 260 2 ساعة |3 0 ‎x‏ 10 11 78 6
المتال 7 ‎ELISA‏ لارتباط ‎:VEGF‏ ‏تم تقييم نشاط ارتباط ‎VEGF‏ لجسم مضاد ذي الطول الكامل بمتوالية الحمض الأميني لبيفاسيزوماب يتم إفرازه من خلايا تم نقل العدى إليها بواسطة 0/80 يحتوي على جين -55/8 ‎(NG-135) Bev-PA 5‏ بواسطة اختبار المادة الماصة المناعية المتصلة بالإنزيم ‎(ELISA)‏
تم استزراع ‎LIA‏ 810293 عند تركيز ‎x 3.25 aly‏ 10 5 خلية/ملليلتر وتم تركها لتنمو لمدة 20 ساعة. تم نقل العدوى إلى الخلايا إما باستخدام 0/0 يحتوي على مجموعة جين ناقل -55/8 ‎Bev-P‏ أو فيروس مستخدم فى عينة مقارنة ‎EnAd‏ يحتوي على مجموعة جين ناقل ‎SSA-‏ ‎(NG-107) GFP-PA‏ (عينة مقارنة). بعد 44 ساعة من نقل العدوى تم تجميع المواد الطافية
0 من الخلايا التي تم نقل العدوى إليها وتمت تصفيتها بالطرد المركزي. تم تحضير أطباق ‎ELISA‏ (طبق دقيق يحتوي على 96 عين ‎(Nunc Immuno MaxiSorp‏ بواسطة التغليف في فترة وجيزة عند 4 درجة ‎Lge‏ باستخدام 65 1 ‎VEGF-‏ بشري )5 . 0 ميكرو جرام/ملليلتر»؛ ‎(VE-050-293 (R and D Systems‏ في محلول منظم بالكريونات/باي كريونات. تم غسل الأطباق بين جميع خطوات الريط اللاحقة باستخدام ‎Tween 960.05 PBS‏
20. تمت إعاقة نشاط الأطباق ‎sad‏ ساعةعند درجة حرارة الغرفة باستخدام 963 من ‎BSA‏ في ‎.Tween 20 %0.05 PBS‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه في 963/085 ‎Tween 20 %0.05/BSA‏ )1: 2« 1 32:1 1: 128 1: 512 1: 2048). تم تحضير مخفف تتابعي من بيفاسيزوماب نقي (1000 نانو جرام/ملليلتر - 0.0128 نانو جرام/ملليلتر) وتم أيضًا تثبيت عينات
0 بيفاسيزوماب مخففة بحجم 40 نانو جرام/ملليلتر و0.2 نانو جرام/ملليلتر في مواد نقل العدوى الطافية مستخدمة فى عينة مقارنة. تمت إضافة كل العينات إلى أطباق مغلفة ب ‎VEGF-165‏ ‏وتم تحضينها لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تم استخدام جسم مضاد مستخدم في الاستكشاف»؛ مضاد ‎Fe‏ بشري مترافق مع ‎(@b97225 Abcam) HRP‏ لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة قبل إجراء الكشف عن ‎HRP‏ باستخدام محلول ركيزة ‎HRP‏ 3 3 ى 5"تيرا
ميثيل إيثيلين داي أمين ‎.(Thermo-Fisher (TMB)‏ تم استخدام 1 مولار من ‎HCl‏ لإيقاف
التفاعل وتم قياس اللون الذي تم الحصول عليه عند 450 نانو متر على قاريء طبقي. تم رسم الامتصاص عند 40 نانو متر بيانيًا ل ‎ENA‏ ومواد نقل العدوى الطافية المستخدمة في عينة مقارنة (الشكل 4أ) وهو ما يُظهر ارتباط نوعي لجسم مضاد ‎VEGF J‏ مُفرز في ‎sale‏ طافية
لخلايا 816-135 تم نقل العدوى إليها. تم رسم المنحنى القياسي للبيفاسيزوماب ‎Gly‏ (الشكل 6( وتم تحديد تركيزات الجسم المضاد ل ‎VEGF‏ المُفرز أوعينات البيفاسيزوماب المُثبتة المقيدة ب ‎VEGF‏ بواسطة الاستكمال من المنحنى القياسي (الشكل 4( المثال 6: إنتاج فيروسات ‎ENA‏ مُشفرة لأجسام مضادة ل ‎VEGF‏ أو ‎ScFvs‏ مضادة ل ‎VEGF‏
تم استخدام البلازميد 050/02.4 (العُشار إليه هنا أيضًا ب ‎PCOIOAD2.4‏ متوالية رقم: 64)؛
0 تتوليد البلازميدات ‎(pNG-135‏ 73-لاام ‎PNG- 3 pNG-78 pNG-76 pNG-74‏ 17 بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل في مواضع تقييد فريدة ل ‎PENAA2.4‏ ‏موجودة بين الجينات 5ا و54 (المنطقة ‎(BY‏ تم تقديم طرق توليد البلازميد في المثال 31.
الفيروسات المحضرة
0016-5 يحتوي على مجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ يتم تشفيرها بتضمين 5 سلسلة ثقيلة متغيرة لمضاد ‎VEGF‏ (متوالية رقم: 29( جسم مضاد ذو سلسلة ثقيلة ثابتة (متوالية
رقم: 33( ‎VEGF alias‏ ذو سلسلة خفيفة متغيرة (متوالية رقم: 31) وجسم مضاد ذو سلسلة
خفيفة ثابتة (متوالية رقم: 35) في مجموعة ‎(pall‏ الناقل. يحتوي 016-73 و0016-74 على
مجموعات جين ناقل مُشفرة ل 5017/5 مضادة ل ‎VEGF‏ (متوالية رقم: 36) في ظل تحكم معزز
‎CMV (ala‏ (متوالية رقم: 13)؛ أو معزز داخلي متأخر رئيسي ‎EnAd‏ (1/10). يحتوي
‎pPNG-167 3 pNG-78 (pNG-76 0‏ على مجموعات جين ناقل مُشفرة ل ‎ScFvs‏ مضادة ل ‎VEGF‏ (متوالية رقم: 36( بها بطاقات ببتيد هستيدين ‎Histidine peptide‏ عند الطرف ‎C‏
‏(متوالية رقم 23) في ظل تحكم إما معزز خارجي؛ ‎CMV‏ (متوالية رقم: 13( أو 50/0 داخلي ‎.MLP‏ يتم توضيح مخططات مجموعات الجين الناقل التي تم إدخالها فيالبلازميدات -6لام
‎pNG-T74 (pNG-73 (135‏ 016-76 0016-78 و 016-167 في الشكل 24. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏إنتاج الفيروس تم جعل البلازميدات ‎pNG-78 3 pPNG-76 0016-74 016-73 pNG-135‏ خطية بواسطة ‎f Angi‏ لاهتضام بالإنزيم ‎Ascl‏ لإنتاج مجموعات العوامل الوراثية للفيروس ‎NG-135‏ ‏(متوالية رقم: 2)» 06-73 (متوالية رقم: 8( 106-74 (متوالية رقم: 5(« 16-76 (متوالية رقم: 7) 5 ‎NG=T78‏ (متوالية رقم: 6). تم ضبط تفاعلات تقييد الاهتضام ‎Bg‏ للجدول 3 وتم إجرائها لمدة ‎(ie lu‏ عند 37 درجة مئوية: الجدول 3 الحد المادة الكاشفة لحجم المورد (ميكرو لتر) بلازميد ‎DNA‏ )~7 +15 ميكرو ‎(p>‏ ‏محلول متم 2 — ‎Fisher Scientific(BPE‏ ماء خالى من النوكلياز 27.5 ‎١‏ )2484-100 0 تتم تخفيف ال ‎DNA‏ المهتضم باستخدام 50 ميكرو لتر من ماء خالي من النوكلياز ثم تمت تنقيته بواسطة استخلاص الفينول/كلوروفورم. بعد ذلك تم ترسيب ال ‎DNA‏ المستخلص لمدة 16 ساعة؛ عند -20 درجة مئوية في 300 ميكرو لتر من >9695 من إيثانول من 458 البَيُولُوجِيا الجُزَيبْبَّة و10 ميكرو لتر من 3 مولار من أسيتات الصودويم. تم تشكيل ال ‎DNA‏ المترسب في صورة
كريات بواسطة الطرد المركزي بمعدل 14000 لفة في الدقيقة؛ لمدة 5 دقائق وتم غسله في 500 ميكرو لتر من 9670 إيثانول؛ قبل الطرد المركزي مرة أخرى؛ بمعدل 14000 لفة في الدقيقة؛ لمدة دقائق. تم تجفيف كريات ال ‎DNA‏ النظيفة بالهواء؛ تمت إعادة تعليقها في 500 ميكرو لتر ‎OptiMEM‏ يحتوي على 15 ميكرو لتر من مادة كاشفة لنقل العدوى من فكتامين شحمي وتم
5 تحضينها لمدة 30 ‎(dads‏ عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تمت إضافة خليط نقل العدوى بالتقطير إلى قارورة 1-25 تحتوي على خلايا ‎HEK293‏ تم إنماءها حتى يتم الحصول على تشابك يبلغ 0. بعد تحضين الخلايات مع خليط نقل العدوى لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية؛ تمت إضافة 4 ملليلتر من 965 602 من أوساط الخلية ‎DMEM)‏ به محتوى ‎Je‏ من الجلوكوز مع الجلوتامين المضاف إليه 962 ‎(FBS‏ إلى الخلايا وتمت حضانة القوارير عند 37 درجة ‎(Augie‏
0 9705 002. تمت مراقبة خلايا ‎HEK293‏ التي تم نقل العدوى إليها كل 24 ساعة ووتم إليها إضافة أوساط إضافية كل 72-48 ساعة. تمت مراقبة إنتاج الفيروس بواسطة ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي
الكبير ‎(CPE)‏ في الطبقة الأحادية للخلية (الشكل 1أ-ه؛ الشكل 2آ-ي والشكل 3-ز). فور ملاحظة ‎CPE‏ ممتد يتم تجميع الفيروس من 293 خلية بواسطة ثلاث دوران تجميد-إذابة. تمت ‎sale) 5‏ استخدام الفيروسات المجمعة لإعادة نقل العدوى إلى 293 خلية لتضخيم محاليل الفيروس الخام. تم تأكيد إنتاج فيروس حيوي أثناء التضخيم بواسطة ملاحظة ‎CPE‏ الكبير في الطبقة الأحادية للخلية (الشكل 1و-ز؛ الشكل 2ك-ص؛ الشكل 3ح). فور ملاحظة ‎CPE‏ تم تجميع الفيروس من 293 خلية بواسطة ثلاث دوران تجميد-إذابة. تم تكرار التضخيم في 293 خلية حتى 5 مرات حتى يتم توليد محاليل الفيروس الخام التي نتج عنها ‎CPE‏ الكبير في طبقات الخلية 0 الأحادية خلال 48 ساعة من الإصابة بالعدوى (الشكل ‎dap]‏ الشكل 2ق-ض؛ الشكل 2©؛ الشكل 3 ط-م). فور تضخيم محاليل الفيروس الخام الفعالة تمت تنقية الفيروسات بواسطة التطويق المزدوج بكلوريد السيزيوم لإنتاج محاليل الفيروس الخام 16-135 ‎NG- (NG-73‏ ‎NG-78 s 16-76 74‏ المثال 9 تمييز نشاط الفيروس 806-135 مقارنةً ب ‎ENA‏ في سلالات خلية كارسينوما القولون
تمت مقارنة استنساخ الفيروس ‎NG=135‏ أو 50/0 (تم تقييمه بواسطة ‎(QPCR‏ التعبير الوراثي عن الجين (تم تقييمه بواسطة ‎(RTGPCR‏ والتعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ (تم تقييمه بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط ‎(VEGF‏ في سلالات خلية كارسينوما القولون. يكون 16-135 (متوالية رقم: 2) عبارة عن فيروس مشتق من ‎BNA‏ يحتوي على مجموعة جين ناقل لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ بعد جين ‎ENAD‏ المتأخر؛ ‎LS‏ (ألياف). يتم توضيح مخطط للمجموعة التي تم إدخالها في الشكل 110 والشكل 24. يتم توضيح إنتاج الفيروس 806-135 بالتفصيل في المثال 8. تم استزراع سلالات خلية كارسينوما القولون 167-116 ‎DLD‏ أو ‎HT-29‏ في أطباق تحتوي على 6 عيون بقيم كثافة للخلايا تبلغ 7.5 ‎x‏ 10 5 خلية/عين ‎HCT-116 Wal‏ و0ا0 أو 2. ‎x‏ ‏0 6 خلية/عين لخلايا ‎HT-29‏ تم تحضين الأطباق لمدة 18 ساعة؛ عند 37 درجة مئوية؛ 0 %5 0602؛ قبل نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام»؛ 100 أو 10 من جسيمات الفيروس ‎ENAd‏ ‏أو 806-135 لكل خلية أو تركها بدون نقل العدوى إليها. تم إجراء التجارب بعد 24 48 أو 72 ساعة من تقل العدوى. تحديد كمية ‎DNA‏ فيروسي بواسطة ‎GPCR‏ ‏تم استخدام سلالات خلايا 117-29 5 ‎DLD‏ التي إما تم نقل العدوى إليها لمدة 72 ساعة باستخدام 5 10 جسيمات لكل خلية من 50/0 أو ‎NG-135‏ أو تركها بدون نقل العدوى إليها لتحديد كمية ‎DNA‏ فيروسي بواسطة ‎.GPCR‏ تم تجميع المواد الطافية للخلية وتمت تصفيتها بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 1200 لفة في الدقيقة. تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ‎PBS‏ وتم تحليلها بالتجميد-الإذابة عند -20 درجة مئوية في 400 ميكرو لتر/عين محلول منظم لحل ‎LAY‏ مرشد مركز لمرة واحدة ‎(Promega: E3971)‏ تم استخلاص ال ‎DNA‏ من 3 ميكرو لتر من ناتج تحلل الخلايا أو 10 ميكرو لتر من ‎sale‏ طافية باستخدام طقم استخلاص ال ‎DNA‏ ‎(Sigma Genelute‏ وفقًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم ‎Lal‏ تحضير منحنى قياسي باستخدام جسيمات فيروس ‎X 2.5 = 10 10 x 2.5) ENAd‏ 10 5 جسيمات فيروسية) واستخلاصها باستخدام طقم ‎.Sigma Genelute‏ تم تحليل كل ‎die‏ أو معيار تم استخلاصه بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎E3‏ 50/0 في خليط التفاعل 5 الموضح بالتفصيل في الجدول 4
الجدول 4 حجم/يئر المادة الكاشفة ‎FE‏ ‎Tagman fast advance master mix‏ تم إجراء ‎QPCR‏ وفقًا للبرنامج الوارد في الجدول 5: الجدول 5 درجة الحرارة الفترة عدد الدورات ‎el]‏ اع
ال أظهر تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس التي تم الكشف عنها لكل خلية أن استنساخ الفيروس ‎١16-135‏ أو 50/80 ممائل في كل من سلالات الخلية ‎HT-29‏ و0انا (الشكل 111( لم يتم الكشف عن مجموعات العوامل الوراثية للفيروس في الخلايا التي لم يتم نقل العدويى إليها (البيانات غير موضحة) .
RTqPCR تم استخدام سلالات خلايا ‎DLD 3 HT=29‏ التي إما تم نقل العدوى إليها لمدة 72 ساعة باستخدام 0 جسيمات لكل خلية من ‎EnAd‏ أو 16-135 أو تركها بدون نقل العدوى إليها لتحليل التعبير ‎Sl‏ عن هكسون أو جين جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة ‎.RTGPCR‏ تمت إزالة المادة الطافية من كل عين وتم غسل الخلايا باستخدام ‎PBS‏ ثم تم تحليلها في 600 ميكرو لتر/عين من محلول ‎RLT‏ منظم ‎(QIAgen)‏ يحتوي على م]-ميركابتو إيثانول (1: 100). تمت تصفيةنواتج تحلل ‏الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق؛ بمعدل 1300 لفة في الدقيقة وبعد ذلك تم استخدام ‏0 ميكرو لتر من ناتج التحلل لاستخلاص ‎RNA‏ باستخدام طقم استخلاص ‏غلا /خلاا0/يروتين ‎(QlAgen) Allprep‏ وفتًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم قياس تركيز ‎RNA 5‏ المستخلص من كل ‎die‏ ووتم استخدام 800 نانو جرام لتخليق ‎cDNA‏ باستخدام ‎Life ) qRT-PCR ‏ل‎ SuperScript lll First Strand Synthesis SuperMix ‎¢Technologies‏ 11752-0350( وفقًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم استخدام 1 ميكرو لتر ‏من كل ‎DNA die‏ مخلقة للتحليل بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام إما مجموعة مجس بادئ نوعية ‏لهكسون 50/0 أو مجموعة مجس بادئ نوعية لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ في خليط التفاعل الموضح 0 بالتفصيل أدناه؛ فى الجدول 6. ‏الجدول 6 ‏المادة الكاشفة حجم/يثئر (ميكرو ‎(A‏
‎Tagman fast advance master mix‏
‎(Lifetech)‏ ‏تم إجراء ‎Gg QPCR‏ للبرنامج الوارد في الجدول 5. أظهر تحديد كمية عدد نسخ ‎DNA‏ الذي تم الكشف ‎die‏ بواسطة بواسطة ‎qPCR‏ تعبير وراثى عن جين الفيروس المتأخر ممائل» هكسون»؛ فى ‎Wa‏ 111-29 أو ‎DLD‏ تم نقل العدوى إليها ب 816-135 أو ‎EnAd‏ (الشكل 11ب). مع ذلك؛ تم الكشف عن التعبير الوراثى عن جين جسم مضاد ل ‎VEGF‏ فقط في خلايا 111-29 أو ‎DLD‏ ‏5 تم نقل العدوى إليها بواسطة فيروس 806-135 الذي يحتوي على مجموعة الجين الناقل لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ (الشكل 12). تحليل التعبير ‎Shall‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ ‏تم استخدام سلالات الخلايا 11-29 ‎HCT=116 5 DLD‏ التي إما تم نقل العدوى إليها ‎Baal‏ ‏4 أو 72 ساعة باستخدم 100 جسيم لكل خلية من ‎EnAd‏ أو ‎NG-135‏ أو تركها بدون تقل العدوى إليها لتحليل التعبير ‎Shell‏ عن جسم مضاد بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ ‏تمت إزالة مواد طافية لمستنبت من كل عين وطردها مركزيًا لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 1200 لفة في الدقيقة لإزالة بواقي الخلايا. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ (طبق دقيق يحتوي على 96 عين ‎Nunc‏ ‎(Immuno MaxiSorp‏ ب ‎VEGF-165‏ بشري )0.5 ميكرو جرام/ملليلتر» ‎Rand D‏ ‎(293-VE-050 «Systems‏ وتم إيقاف نشاطها وفقًا للطرق الموضحة بالتفصيل في المثال 7.
تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية في 963/085 ‎Tween 20 %0.05/BSA‏ (1: 2 أو 1: 4) وتم تحضير مخفف تتابعي جسم مضاد نقي ل ‎VEGF‏ )1000 نانو جرام/ملليلتر - 0.0128 ‎sil‏ جرام/ملليلتر). تمت إضافة كل العينات إلى الأطباق المغلفة ب 165-]56/ وتم اختبارها ‎Gg‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 7.
5 .تم تحديد تركيزات الجسم ‎VEGF J alias‏ المُفرز المقيد ب ‎VEGF‏ بواسطة الاستكمال من المنحنيات القياسية. زاد التعبير ‎Shall‏ عن الجسم المضاد ل ‎VEGF‏ بمرور الوقت في خلايا ‎DLD 11-9‏ و101١‏ حتى 72 ساعة؛ عند هذه النقطة تم اكشف عن تعبير وراثي مماثل عن الجسم المضاد في المادة الطافية لسلالات الخلية التي تم اختبارها (الشكل 13). المثال 10 تحديد كمية التعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في سلالات الخلية كارسينوما
0 القولون وكارسينوما الرئة تم وضع سلالات الخلية كارسينوما القولون 117-29 وكارسينوما الرئة 0549 في أطباق في أطباق تحتوي على 12 عين بقيم كثافة تبلغ 1 ‎x‏ 10 6 خلية/عين 1 11-29 و5 ‎x‏ 10 5 خلية/عين لخلايا ‎.AS49‏ تم تحضين الأطباق لمدة 24 ساعة؛ 37 درجة مئوية؛ 965 002؛ قبل نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام» 100 جسيم من الفيروس 50/0 أو 206-135 لكل خلية
أو تركها بدون نقل العدوى إليها. تم إجراء التجارب بعد 24( 48 أو 72 ساعة من نقل العدوى. عند كل نقطة زمنية تمت إزالة مواد طافية لمستنبت من كل عين واستبدالها ب 400 ميكرو لتر من أوساط مستنبت الخلية. بعد ذلك تم تحضين الأطباق لمدة 5 دقائق» ساعة واحدة أو 3 ساعات قبل تجميع الأوساط من كل عين وطردها مركزيًا لمدة 5 دقائق» بمعدل 1200 لفة في الدقيقة لإزالة بواقي الخلايا. تم تغليق أطباق ‎Nunc Immuno MaxiSorp) ELISA‏ طبق دقيق يحتوي على
0 96 عين) لمدة 16 ساعة؛ 4 درجة مئوية؛ باستخدام جسم مضاد ‎alias FC‏ ل 1061 بشري أحادي النسيلة مأخود من فأر )2 ميكرو جرام/ملليلتر» ‎(Abcam @B1927‏ مخفف في محلول منظم بالكربونات/باي كربونات. تمت إعاقة نشاط الأطباق لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة باستخدام 963 من ‎BSA‏ في ‎Tween 20 960.05 PBS‏ قبل غسلها باستخدام ‎PBS‏ 160.05
‎due 21. Tween 0‏ الأطباق 3 مرات باستخدام ‎Tween 20 960.05 PBS‏ بين جميع خطوات الريط اللاحقة. تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه في 963 ‎Tween 20 960.05 BSA/PBS‏ )1: 2« 11 8 1: 32). تم ‎Lad‏ تحضير مخفف تتابعي من بيفاسيزوماب نقي (200 نانو جرام/ملليلتر - 0.1 نانو جرام/ملليلتر) في 963/085 ‎Tween 20 %0.05/BSA‏ تمت إضافة العينات والمعايير إلى الأطباق المغلفة وتم تحضينها لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تم استخدام جسم مضاد مستخدم في الاستكشاف» ‎Fab‏ مضاد ل ‎19G‏ بشري مترافق مع ‎HRP‏ (0.5 ميكرو جرام/ملليلتر 8587422 ‎(Abcam‏ لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة قبل إجراء الكشف عن ‎HRP‏ باستخدام محلول ركيزة ‎HRP‏ 3( 3 5؛ 5 ”-تيرا ميثيل إيثيلين داي أمين ‎(Thermo-Fisher (TMB) 3.3.5.5’ -teramethylethylenediamine 0‏ .3 استخدام 1 مولار من ‎HCI‏ لإيقاف التفاعل وتم قياس اللون الذي تم الحصول عليه عند 450 نانو متر على قاريء طبقي. تم تحديد تركيزات الجسم مضاد ل ‎VEGF‏ المُفرز في خلايا 17-29 (الشكل 128( ‎La,‏ 8549 (الشكل 28ب) بواسطة الاستكمال من المنحنيات القياسية. تم تلخيص إجمالي البروتين المتوقع التعبير عنه وراثيًا بواسطة 1 ‎x‏ 10 6 من ‎Wa‏ 11-29 أو ‎A549‏ خلال 24 5 48و72 ساعة في الشكل 28ج. المثال 11 التعبير الوراثي عن 5017 مضاد ل ‎VEGF‏ في سلالة خلايا كارسينوما القولون تمت مقارنة التعبير الوراثي عن 501 مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة 16-76 (متوالية رقم: 7(« 16-8 (متوالية رقم: 6( 5 ‎ENA‏ في ‎DIA‏ كارسينوما القولون ‎HT29‏ بواسطة بقعة ويسترن. يكون ‎NG=78 5 NG-76‏ عبارة عن فيروسات مشتقة من 0/0 يحتوي على مجموعات جين ناقل ل ‎ScFv‏ مضاد ل ‎VEGF‏ بعد جين ‎ENA‏ المتأخرء ‎LS‏ (ألياف). يتم توضيح مخططات المجموعات التي تم إدخالها في الشكل 10(ب) و(ج) وتم وصف إنتاج الفيروسات في المثال 8. تم استزراع ‎Wa‏ 111-29 في أطباق مزرعة تحتوي على 6 عيون بكثافة تبلغ 4 ‎x‏ 10 6 خلية/عين وتم تحضينها لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مثوية؛ 965 002. بعد ذلك تم ‎Jai‏ ‏العدوى إلى الخلايا لمدة 22 46 أو 70 ساعة باستخدام 50 جسيم من فيروس ‎NG- (NG-T6‏
8 أو 0هدح لكل خلية. تمت إزالة الأوساط من العيون وتم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام قبل التحلل في 250ميكرو لتر من محلول منظم لحل الخلايا (150 ‎A‏ مولار ‎(NaCl‏ ‎SDS 960.5 (Triton 2-100 1‏ 50 مللي مولار ا10ا-115 (رقم هيدروجيني يبلغ 7.5)) يحتوي على خليط مثبط مضاد للبروتياز )539134 ‎.١|| (Calbiochem:‏ تم علاج نواتج التحلل 5 باستخدام بنزوناز لتحلل ‎DNA‏ حامل لمجموعة العوامل الوراثية وتم تخفيفها ‎Waal‏ بنسبة 1: 4 في محلول منظم لحل الخلايا يحتوي على محلول ‎NUPAGE‏ منظم لعينة ‎LDS‏ وعامل الاختزال ‎.NUPAGE (Life Technologies)‏ تم تسخين العينات لمدة 10 دقائق؛ عند 70 درجة مثوية قبل إجراء ‎SDS-PAGE‏ باستخدام 9612-4 أنواع الهلام ‎NUPAGE (Life‏ 815-115 ‎Technologies)‏ وفقًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم نقل البروتينات على أغشية ‎PVDF‏ ‏0 بواسطة بقعة ويسترن باستخدام ‎.Xcell ١١ Blot Module (Life Technologies)‏ تم إجراء إيقاف النشاط والتبقيع المناعي في 117680-20 0.1% ‎PBS‏ مُضاف إليه 965 مسحوق ‎ula‏ ‏وتم إجراء جميع خطوات الغسل في 1170/660-20 0.196 085. تم الكشف عن 5011/5 مضادة ل ‎VEGF‏ باستخدام جسم مضاد فأري أحادي النسيلة مضاد ‎Ct-Hisx6 J‏ لبطاقة ‎His‏ عند الطرف © ل 5057 وتم الكشف عن جسم مضاد ثانوي باستخدام ‎IgG-HRP‏ مأخوذ من الماعز 5 والمضاد للفتران. تمت رؤية البروتينات بواسطة التألق الكيميائي المحسن. يمكن الكشف عن التعبير الوراثقي عن 50517 في نواتج تحلل ‎WAN‏ 17-29 التي تم نقل العدوى إليها بواسطة ‎NG-T6‏ أو 816-78 لكن ليس في الخلايا التي تم نقل العدوى إليها بواسطة 50/0 (مرقمة ب ‎AdL 5 78 6‏ على التوالي في الشكل 14أ). تم الكشف عن التعبير الوراثي عن 50017 بشكل مبكر؛ في الساعة 22؛ في الخلايا التي تم نقل العدوى إليها بواسطة الفيروس 116-76 حيث 0 يكون التعبير الوراثي عن ‎SCFV‏ في ظل تحكم معزز خارجي مقارنة بفيروس 816-78 يكون فيه التعبير الوراثي عن 5017 في ظل تحكم المعزز الداخلي المتأخر الرئيسي. المثال 12 التعبير الوراثي عن ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ تم الكشف ‎aie‏ بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ ‏تمت مقارنة التعبير ‎Shell‏ عن ‎NG=T76‏ (متوالية رقم: 7( 5 ‎ScFv (EnAd‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ‏5 في سلالات الخلية كُلَيَةٌ جنينية بشرية بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ أو بقعة ويسترن. تم
استزراع خلايا ‎AD293‏ في أطباق مزرعة تحتوي على 6 عيون بكثافة تبلغ 5 ‎x‏ 10 5 خلية لكل عين. بعد 24 ساعة من الاستزراع تم نقل العدوى إلى خلايا 80293 باستخدام 16-76 أو 0ح بمعدل 100 جسيم من الفيروس لكل خلية. تم استنبات الخلايا لمدة 72 ساعة قبل تجميع المواد الطافية من العيون وطردها مركزيًا لمدة 5 دقائق» بمعدل 1200 لفة في الدقيقة لإزالة بواقي الخلايا. بعد ذلك تم استخدام المواد الطافية المصفاه إما لتحليل ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ أو بقعة ويسترن. بالنسبة ل ‎ELISA‏ تم تخفيف المواد الطافية بنسبة 1: 2 في 963 ‎BSA/PBS‏ ‎Tween‏ 0.0596 ووتم تثبيت 8 نانو جرام/ملليلتر من جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بها أو تم تركها بدون جسم مضاد. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ ب ‎VEGF‏ وتم إيقاف نشاطها ‎Bg‏ للطريقة المذكورة بالتفصيل في المثال 7. تمت إضافة العينات إلى الأطباق بمعدل 100 ميكرو لتر/عين وتم الاختبار. بعد ذلك تم استخدام جسم مضاد مستخدم في الاستكشاف»؛ مضاد ‎His‏ متعدد النسائل مترافق مع ‎HRP (Abcam aB1187)‏ لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة قبل إجراء الكشف عن ‎HRP‏ باستخدام محلول ركيزة 3 ‎(HRP‏ 3 5؛ 5”-تيرا ميثيل إيثيلين داي أمين ‎TMB)‏ ‎(Thermo-Fisher‏ .5 استخدام 1 مولار من ‎HOI‏ لإيقاف التفاعل وتم قياس اللون الذي تم الحصول عليه عند 450 نانو متر على قاريء طبقي. تم رسم الامتصاص عند 40 نانو متر 5 ييانيًا ل ‎EnAd‏ 016-76 و8 + ‎NG=76‏ نانو جرام/ملليلتر من مواد نقل العدوى الطافية لجسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ (الشكل 14ب). تم تأكيد نوعية 5057 المُعبر عنه وراثيًا تجاه ‎VEGF‏ في المواد الطافية لخلايا تم نقل العدوى إليها ب ‎NG=T76‏ بواسطة التثبيط الجزئي لارتباط ‎VEGF‏ ‏بإضافة 8 نانو جرام/ملليلتر من جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بشري نقيء بيفاسيزوماب. بالنسبة لبقعة وبسترن تم تحضير المواد الطافية واختبارها وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 0 11. يمكن الكشف عن التعبير الوراثي عن ‎SCFV‏ عند مستويات منخفضة بعد 24 ساعة من نقل العدوى وقد زاد التعبير الوراثي بدرجة كبيرة بعد 44 ساعة (الشكل 7). المثال 13 تمييز نشاط فيروس ‎NG=135‏ مقارنة ب ‎ENA‏ في فئران حاملة للورم تم زرع خلايا كارسينوما القولون ‎DLD‏ أو 101-116 في صورة طعم خارجي تحت الجلد في 1 لقئران 0/010ا0. فور وصول الأورام إلى -100مم3 تم تجميع ‎hill‏ وعلاجها باستخدام 5 ”910 من جسيمات الفيروس 50/0 أو ‎NG=135‏ التي يتم توصيلها بواسطة حقن مفرد داخل
الورم. في كل دراسة تم ‎Load‏ تضمين مجموعة من فئران مستخدمة كعنية مقارنة لم يتم ‎Jib‏ العدوى إليها. تم استئصال الأورام ‎DLD‏ بعد 3 7 أو 28 يوم من العلاج وتم استئصال أورام ‎HCT-‏ ‏6 بعد 3؛ 7 أو 14 يوم من العلاج. تحليل استنساخ مجموعة عوامل وراثية للفيروس بواسطة ‎QPCR‏ ‏5 تم وزن الأورام المستأصلة وتم تجانسها في محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز مرة واحدة
١١١ ‏يحتوي على 1: 200 من خليط مثبط مضاد للبروتياز‎ (Promega E3971) ‏عند تركيز يبلغ 100 ميكرو لتر من محلول منظم لكل 25 مجم من الورم. تم‎ (Calbiochem) 10 x 2.5) 50/0 ‏استخدام نواتج تجانس الورم غير المعالجة لتحضير منحنى قياسي لفيروس‎ ‏من 2 ميكرو‎ DNA ‏جسيم فيروسي/عينة ناتج تحلل ورم). تم استخلاص ال‎ 5 10 x 2.5 -0
0 لتر من كل عينة ورم تم علاجها أو من 100 ميكرو لتر من كل معيار باستخدام طقم استخلاص ال ‎(DNA Sigma Genelute‏ وفقًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم تحليل العينات والمعايير المستخلصة بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎E3‏ 50/0 وفقًا لطرق ‎PCR‏ المذكورة بالتفصيل في المثال 8. يتم توضيح تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس لكل ورم لأورام 010 بعد 3 أو 7 أيام من العلاج (الشكل 115( أو بعد 28 يوم من
العلاج (الشكل 15ب). تم توضيح تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس لكل ورم لأورام ‎HCT‏ بعد 3؛ 7 أو 14 يوم من العلاج ب 50/80 أو ‎NG-135‏ (الشكل 18أ). ‎Yieal‏ ‏لاتُظهر البيانات اختلاف كبير بين استنساخ الفيروس 80/0 و 806-135 في أورام 101 أو ‎.DLD‏ ‏تحليل التعبير الوراثي عن جين فيروسي (هكسون) أو جين جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة
7068م تم وزن الأورام المستأصلة وتم تجانسها في ‎RLT‏ محلول منظم لحل الخلايا ‎(QIAgen)‏ يحتوي ‎Ae‏ -ميركابتو إيثانول ‎mercaptoethanol (Sigma)‏ عند تركيز يبلغ 350 ميكرو لتر من محلول منظم لكل 20 مجم من الورم. تم استخلاص ‎RNA‏ من عينات الورم باستخدام طقم ل /ظلا0/يروتين صغير ‎AllPrep (QIAgen)‏ وتم علاجه باستخدام مجموعة ‎DNASE‏
خالية من ‎Gis RNAse (QlAgen)‏ لبروتوكولات القائم على التصنيع. تم قياس تركيز ‎RNA‏ ‏المستخلص من كل عينة وتم استخدام 800 نانو جرام لتخليق ‎cDNA‏ و9004 وفقًا لطرق ‎RTQPCR‏ المذكورة بالتفصيل في المثال 8. أظهر تحديد كمية عدد نسخ ‎RNA‏ تم الكشف عنها بواسطة ‎QPCR‏ تعبير الوراثي مماثل عن جين الفيروس المتأخر؛ هكسون»؛ في أورام ‎DLD‏ معالجة ب 6-135 أو ‎EnAd‏ بعد 3 أو 7 أيام من العلاج (الشكل 116( وعلى النقيض؛ تم الكشف
عن التعبير الوراثى عن جين جسم مضاد ل ‎VEGF (RNA)‏ فقط في خلايا ‎dalle DLD‏ بفيروس 16-135 (الشكل 16[ب). التعبير الوراثى عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ تم الكشف عنه بواسطة مضاد ‎IgG]‏ بشري أو ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏
تم أيضًا استخدام نواتج تحلل الورم المستأصل المحضرة من ‎QPCR‏ (أعلاه) لتحليل التعبير الوواثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة ‎ELISA‏ لمضاد 0961| بشري ‎(Abcam Kit)‏ أو ‎ELISA‏ لارتباط ‎.VEGF‏ تم أيضًا اختبار المصل من عينات الدم التي تم الحصول عليها في ‎cig‏ استئصال الورم ل 961 بشري بواسطة ‎ELISA‏ ‏قبل الاختبار تم تخفيف نواتج تحلل الورم التي تم الحصول عليها من فثران معالجة وفثران
5 مستخدمة كعينة مقارنة بنسبة 1: 2 في 150 ميكرو لتر محلول منظم مرشد مركز لمرة واحدة أو محلول منظم لحل الخلايا ‎(Promega)‏ يحتوي على 962 26-100 ‎(Triton‏ تم تدويمه لفرة وجيزة وتعريضة للموجات الصونية لمدة 5 دقائق حمام ماء معالج بالموجات الصوتية . تم طرد عينات الدم مركزيًا لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 5000 لفة في الدقيقة وتم تجميع المصل. تم تحضير مخفف
0 جرام/ملليلتر) وتثبيته إما في نواتج تحلل مجمعة مأخوذة من فئران مستخدمة كعينة مقارنة أو عينات مصل من فئران غير معالجة لإنتاج المنحنيات القياسية للتجرية. ‎ELISA‏ لذ ‎IgG1‏ بشري ‎(Abcam)‏ ‏تم أيضًا تخفيف نواتج التحلل المعالجة بالموجات فوق الصوتية من أورام ‎dallas‏ ب 816-135 أو 0 بنسبة 1: 2 في محلول منظم للتجربة وكعينة مقارنة موجبة تم تثبيت عينة ناتج تحلل ورم
مأخوذ من فر معالج ب 50/0 باستخدام 8 نانو جرام/ملليلتر من بيفاسيزوماب نقي. تم تخفيف عينات المصل بنسبة 1: 2 أو 1: 5 في محلول منظم للتجرية. بعد ذلك تم اختبار جميع العينات والمعايير لمضاد ‎IgG]‏ بشري باستخدام ‎Abcam ELISA Kit‏ وفقًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم تحديد تركيزات الجسم المضاد في الأورام بواسطة الاستكمال من المنحنيات القياسية. يمكن الكشف عن التعبير الوراثي عن جسم مضاد ل 1961 بشري في أورام ‎dalle DLD‏ ب 16-5 واختبارها بعد 28 يوم من العلاج (الشكل 117( وفي ‎die‏ مصل من فأر معالج ب 06-5" تم اختباره بعد 28 يوم من العلاج (الشكل 19). تم أيضًا الكشف عن جسم مضاد في جميع أورام ‎HCT-116‏ تم علاجها ب 6-135 وتم اختبارها بعد 3 7 أو 14 من العلاج (الشكل 18ب). لم يتم الكشف عن التعبير الوراثي عن جسم مضاد في أي من الأورام أو عينات 0 الدم المأخوذة من ‎dallas oly‏ ب ‎EnAd‏ ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ ‏تم ‎Load‏ تخفيف نواتج التحلل المعالجة بالموجات فوق الصوتية من أورام معالجة ب 816-135 أو 0 بنسبة 1: 2 في محلول منظم للتجربة وكعينة مقارنة موجبة تم تثبيت عينة ناتج تحلل ورم مأخوذ من فأر معالج ب 50/80 باستخدام 1.6 نانو جرام/ملليلتر من بيفاسيزوماب نقي. تم تغليف 5 أطباق ‎ELISA‏ (طبق دقيق يحتوي على 96 ‎Nunc Immuno MaxiSorp cue‏ ) ب ‎VEGF-‏ ‏5 بشري )0.5 ميكرو جرام/ملليلتر) وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 7. تمت إضافة مواد طافية من العينات والمعايير إلى الأطباق المغلفة ب ‎VEGF-165‏ وتم اختبارها ‎Gig‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 7. تم تحديد تركيزات جسم مضاد مرتبط بمضاد ‎VEGF‏ في الأورام بواسطة الاستكمال من المنحنى القياسي. تم الكشف عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ قادر على الارتباط 0 ب 01/567-165 في عينات ورم ‎DLD‏ معالجة ب 16-135 ولكن ليس عينات معالجة ب ‎EnAd‏ (الشكل 17ب). المثال 14 إنتاج وتمييز فيروسات 0/0 مُشفرة للجينات المرشدة تم إنتاج مجموعة من ‎GFP‏ أو ليوسيفيراز تعبر وراثيًا عن فيروسات مرشدة حيث يكون التعبير الوراثي عن الجين الناقل في ظل تحكم معزز فيروسي خارجي ‎(NG-61 «CMV (NG-47‏
معزز تثديي خارجي؛ 59 ‎«(PGK (NG-1‏ معزز متأخر رئيسي لفيروس داخلي (6-62لا
‎(NG-108 «(NG-107 (NG-106 «(NG-105 (NG-98 (NG-93 (NG-63‏ أو معزز
‏مبكر لفيروس داخلي» ‎.(NG-110 E4 (NG-109‏ تم اشتقاق جميع الفيروسات من ‎EnAd‏
‏باستخدام إنشاء نسائل من البلازميد 050/02.4 (الموصوف في الطلب رقم ‎(GB1322851.5‏
‏5 ويكون بها مجموعات جين ‎BU‏ يتم إدخالها بعد جين 50/80 المتأخر» 5ا (ألياف).
‏إنتاج الفيروس
‏تم استخدام البلازميد ‎pENAd2.4‏ لتوليد البلازميدات ‎PNG-93 pNG-62 pPNG-47‏
‎PNG- 3 pNG-110 ‏108-لام 6-109لاام‎ (pNG-107 «pNG-106 pNG-105
‏9 بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل ‎sais‏ لبروتين فلوري أخضر ‎(GFP)‏ متوالية 0 رقم: 38) في مواضع التقييد الفريدة ل 080/02.4 موجودة بين الجينات ‎LS‏ و4. يتم توضيح
‏مخططات مجموعات الجين الناقل المنشأة فى بلازميدات 6-47لاام ‎PNG-93 (pNG-62‏
‎PNG- 3 pNG-110 ‏108-لام 6-109لاام‎ (pNG-107 «pNG-106 pNG-105
‏9 في الشكل 22. تم أيضًا استخدام البلازميد 050/02.4 (متوالية رقم: 64( لتوليد
‏بلازميدات ‎pNG-61‏ و6-63لام بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل مُشفرة لبروتين متألق ضوتيًاء ليوسيفيراز (متوالية رقم: 39)؛ في مواضع التقييد الفريدة ل ‎PENAD2.4‏ يتم
‏توضيح مخططات مجموعات الجين الناقل المنشأة في بلازميدات ‎PNG-61‏ و 0016-63 في
‏الشكل 22. تم تأكيد جميع البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏
‏تم جعل البلازميدات المُشفرة للجينات المرشدة خطية وتم نقل العدوى إليها داخل خلايا ‎HEK293‏
‏لإنتاج جسيمات فيروس وفقًا لطرق إنتاج الفيروس المذكورة بالتفصيل في المثال 8. تمت تنقية 0 جديمات الفيروس المضخمة بواسطة التطويق المزدوج بكلوريد السيزيوم لإنتاج محاليل الفيروس
‏الخام؛ ‎(NG-47‏ 6-62لال ‎(NG-107 «NG-106 (NG-105 «{NG-93‏ 6-106لا
‎NG-63 3 NG-61 (NG-110 (NG-109
‏تمييز الفيروس
تمت مقارنة استنساخ الفيروس 6-47ل 6-62لا ‎(NG-93‏ 6-105لا ‎NG- (NG-106‏
107« 16-08 816-109 116-110 أو ‎EnAd‏ (تم تقييمه بواسطة ‎(GPCR‏ والتعبير
الوراثي عن الجين ‎GFP‏ (تم تقييمه بواسطة تجرية الفلورة) في سلالة خلايا كارسينوما القولون؛
‎.HT-29‏ تم استزراع سلالات خلية كارسينوما القولون ‎HT=29‏ في أطباق تحتوي على 12 عين بقيم كثافة للخلايا تبلغ 1 ‎x‏ 10 6 خلية/عين. تم تحضين الأطباق ‎sad‏ 24 ساعة؛ عند 37
‏درجة مثوية؛ 965 002؛ قبل نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام 1 جسيم من الفيروس لكل خلية
‏لكل من الفيروسات المذكورة بالتفصيل أعلاه أو تركها بدون نقل العدوى إليها. تم إجراء التجارب
‏بعد 24( 48 72 أو 96 ساعة من تقل العدوى.
‏تحديد كمية ‎DNA‏ فيروسي بواسطة ‎GPCR‏
‏0 تم تجميع المواد الطافية للخلية وتمت تصفيتها بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 1200 لفة في الدقيقة. تم غسل ‎WAY‏ مرة واحدة باستخدام ‎PBS‏ وتم تحليلها بالتجميد-الإذابة عند -20 درجة مئوية في 400 ميكرو لتر/عين محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز لمرة واحدة ‎(Promega: E3971)‏ .23 استخلاص ال ‎DNA‏ من 1 ميكرو لتر من ناتج ‎das‏ الخلايا أو 10 ميكرو لتر من ‎sale‏ طافية باستخدام طقم استخلاص ال ‎(DNA Sigma Genelute‏ 1&5
‏5 لبروتوكول القائم على التصنيع. تم ‎Wail‏ تحضير منحنى قياسي باستخدام جسيمات فيروس 0/0 ‎x 2.5 - 10 10 x 2.5)‏ 10 5 جسيمات فيروسية) واستخلاصها باستخدام طقم ‎Sigma‏ ‎.Genelute‏ تم تحليل كل عينة أو معيار تم استخلاصه بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام ‎de gana‏ مجس بادئ نوعية لجين ‎E3‏ 50/0 وفقًا لطرق ‎QPCR‏ المذكورة بالتفصيل في المثال 9. تم توضيح تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس لكل خلية بعد 24( 48( 72 أو 96
‏20 ساعة من تقل العدوى (الشكل 127( تحديد كمية التعبير الوراثي عن الجين الناقل بالفلورة تم اختبار نواتج تحلل الخلايا المحضرة أعلاه باستخدام إما 25 ميكرو لتر من ناتج تحلل نقي مذاب أو ناتج تحلل مخفف بنسبة 1: 2 من محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز لمرة واحدة ‎(Promega: E971)‏ تم قياس مستوى فلورة ‎GFP‏ في كل ‎(pe‏ على قاريء طبقي ( ‎BioTek‏
‎(Synergy HT‏ تم رسم الفلورة ‎(dull)‏ المطروحة من نشاط المستوى القاعدي؛ للعينات التي تم نقل العدوى إليها بعد 24 48؛ 72 أو 96 ساعة بيانيًا في الشكل 27ب. المثال 15 تمييز فيروسات 50/0 مُشفرة للجينات المرشدة في ظل تحكم المعزز الخارجي؛ ‎CMV‏ ‏تمت مقارنة استنساخ الفيروس (تم تقييمه بواسطة ‎(qPCR‏ النشاط الحال للورم (تم تقييمه بواسطة تجربة قدرة الخلايا على البقاء حية) والتعبير ‎Shel‏ عن الجين المرشد (تم تقييمه بواسطة الفلورية ( لفيروسات مرشدة ‎NG-47‏ و ‎.EnAd 2 NG-61‏ تم ذكر إنتاج وتصميم الفيروسات ‎NG-47‏ ‎NG-61‏ بالتفصيل في المثال 14 تمييز استنساخ الفيروس والتعبير الوراثي عن الجين الناقل تم استزراع خلايا كارسينوما القولون 11-29 سلالة خلية أرومة ليفية 10/138 أو سلالة خلية 0 أرومة ليفية 1/1405 في أطباق تحتوي على 6 عيون ‎WIA BES‏ تبلغ 2. ‎x‏ 10 6 خلية/عين. تم تحضين الأطباق لمدة 18 ساعة؛ عند 37 درجة مئوية؛ 965 002؛ قبل نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام 1 جسيم فيروس ‎NG-47 (EnAd‏ أو 06-61 لكل خلية. تم إجراء التجارب بعد 24( 48؛ 72 أو 96 ساعة من نقل العدوى. تم تجميع المواد الطافية للخلية وتمت تصفيتها بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 1200 لفة في الدقيقة. تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 585 وتم تحليلها بالتجميد-الإذابة عند -20 درجة مئوية في 400 ميكرو لتر/عين محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز لمرة واحدة ‎(Promega: E3971)‏ تم استخلاص ال ‎DNA‏ من ناتج تحلل الخلايا أو ‎sale‏ طافية باستخدام طقم استخلاص ال ‎(DNA Sigma Genelute‏ وففًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم ‎Wal‏ تحضير منحنى قياسي باستخدام جسيمات فيروس ‎EnAd‏ ‎x 2.5 = 10 10 x 2.5)‏ 10 5 جسيمات فيروسية) واستخلاصها باستخدام ‎Sigma ails‏ ‎.Genelute 0‏ تم تحليل كل ‎due‏ أو معيار تم استخلاصه بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجس بادئ نوعى لجين ‎EnAd E3‏ أظهر تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس التي تم الكشف عنها لكل خلية أن استنساخ 116-47 و 116-61 مشابه ل ‎ENAd‏ (مرقم في صورة 50/0 في الأشكال 25 و26) في خلايا ‎HT29‏ (الشكل 125 و25ب) ‎Ag‏ سلالات الخلية 11129 ‎MRC5 5 WI38‏ (الشكل
6 ح). كما تم استخدام نواتج تحلل الخلايا 16-47 و ‎ENA‏ المحضرة أعلاه أيضًا لتقييم التعبير ‎Al)‏ عن الجين الناقل. تم قياس فلورة ‎GFP‏ النسبية على قاريء ‎(BioTek) ah‏ إما على ناتج تحلل نقي أو ناتج تحلل مخفف بنسبة 1: 2 ‎in‏ محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز مرة واحدة (الشكل ‎(C25‏ ‏5 مقارنة فاعلية الفيروس الحالة للورم
تم استزراع خلايا كارسينوما القولون 111-29 في أطباق تحتوي على 96 عين بكثافة خلايا تبلغ 4 خلية/عين. تم تحضين الأطباق لمدة 4 ساعات؛ عند 37 درجة مئوية؛ 965 002 قبل ‎(Goal Jay‏ إلى الخلايا باستخدام جسيمات فيروس ‎NG-47 «EnAd‏ أو ‎NG-61‏ ‏بنطاق كثافة نقل عدوى يبلغ 0.39-100 جسيم لكل خلية. تم تقييد قدرة الخلايا ‎١11-29‏ على
0 البقاء حية باستخدام ‎Cell Titre 96 MTS Reagent (Promega: G3581)‏ بعد 72 ساعة من نقل العدوى. أظهر تحديد مقدار 96 بقاء الخلايا عند كل كثافة نقل عدوى أن فاعيلة ‎NG-47‏ ‎NG-61‏ الحالة للورم كانت مشابهه ل ‎EnAd‏ في خلايا ‎HT29‏ (الشكل 26 و26ب). المثال 16: إنتاج فيروسات 50/0 مُشفرة لأجسام مضادة لبروتينات مسار مثبط نقطة فحص مناعية
5 تم استخدام البلازميد 050/02.4 (متوالية رقم: 64( لتوليد البلازميد 016-177 بواسطة الإدخال المباشر لمجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎PD-L1‏ بشري (17//243.55.570) بين مواضع التقييد الفريدة ل 050/802.4 الموجودة بين الجينات ‎LS‏ و4. يقوم بلازميد -6لام 7 بتشفير مضاد 000-11 ذو سلسلة ثقيلة متغيرة (متوالية رقم: 30( جسم مضاد ذو سلسلة ثقيلة ثابتة (متوالية رقم: 34( مضاد ‎VEGF‏ ذو سلسلة خفيفة متغيرة (متوالية رقم: 32( وجسم
0 مضاد ذو سلسلة خفيفة ثابتة (متوالية رقم: 35). تم توضيح مخطط لمجموعة جسم مضاد ل -0اط ‎L1‏ تم إدخالها موجودة في مجموعة عوامل وراثية للفيروس ‎NG-177‏ (متوالية رقم : 46( في الشكل 24 المثال 117 إنتاج وتمييز فيروسات 50/0 مُشفرة لسيتوكينات إنتاج الفيروس
تم استخدام البلازميد ‎pENAD2.4‏ لتوليد البلازميدات ‎PNG-96 pNG-95 pNG-92‏ ‎PNG-136 3 pNG-139 (pNG-97‏ بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل مُشفرة لإنترفيرون-/1 بشري ‎IFNy)‏ (متوالية رقم: 41؛ ‎«(PNG=95 3 PNG-92‏ إنترفيرون-0 بشري ‎IFNQ)‏ متوالية رقم: 42؛ ‎pPNG-96‏ و081697) أو عامل نخر الورم البشري ‎Ulf‏ 0711700
متوالية رقم: 40؛ ‎(PNG-139‏ في مواضع التقييد الفريدة ل 050/02.4 موجودة بين الجينات 5ا و54 (المنطقة ‎(BY‏ تم توضيح مخططات مجموعات الجين الناقل المنشأة في بلازميدات ‎pNG-139 5 0016-97 (pNG-96 pNG-95 (pNG-92‏ في الشكل 23. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏تم ‎das‏ البلازميدات ‎pPNG-139 3 016-95 pNG-92‏ خطية لإنتاج مجموعات العوامل
0 الوراثية 806-92 (متوالية رقم: 51( 86-95 (متوالية رقم: 49( 5 ‎NG-139‏ (متوالية رقم: 3). تم نقل العدوى إلى مجموعات العوامل الوراثية داخل خلايا ‎HEK293‏ لإنتاج جسيمات فيروس ‎Wg‏ لطرق إنتاج الفيروس المذكورة بالتفصيل في المثال 8. تمت تنقية جسيمات الفيروس المضخمة بواسطة التطويق المزدوج بكلوريد السيزيوم لإنتاج محاليل فيروس 016-92 ‎NG-95‏ ‎NG-139‏ خام. تم تأكيد الإنتاج الحيوي لجسيمات فيروس 816-139 أثناء التضخيم بواسطة 5 التبقيع المناعي لبروتين البروتين الغلافي ‎(ENA‏ الهكسون. تم نقل العدوى إلى خلايا 17-29 باستخدام ناتج تحلل خلايا لمدة 48 ساعة؛ بعد ذلك تمت إزالة الأوساط من ‎(LAN‏ وتم تثبيت الخلايا في 1: 1 ‎MeOH‏ أسيتون وتم تبقيعه باستخدام جسم مضاد وفيروس غدي ( ‎Abcam:‏ ‏8 6 لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تم غسل الخلايا وتم الكشف عن جسم مضاد ثانوي باستخدام مضاد ‎IgG‏ فأري مترافق مع ‎(HRP (Abcam: ab6728)‏ تمت 0 رؤية بروتين الهكسون بواسطة إضافة ركيزة ‎DAB‏ لمدة 25 دقيقة. يمكن الكشف عن تبقي هكسون خلال الطبقات الأحادية للخلية (الشكل 129 والشكل 29ب). تحديد كمية إنتاج 11170 في سلالات خلية كارسينوما القولون ونموذج طعم خارجي لورم تحت الجلد لكارسينوما القولون
تم وضع سلالات خلية كارسينوما القولون ‎HT-29‏ في أطباق تحتوي على 6 عيون بكثافة تبلغ 5 ‎x‏ 10 5 خلية/عين. تم نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام 100 جسيم فيروس 816-139 لكل خلية أو تركها بدون نقل العدوى إليها. تم إجراء التجارب بعد 24 أو 36 ساعة من تقل العدوى. عند كل نقطة زمنية تمت إزالة مواد طافية لمستنبت من كل عين وطردها ‎Bie‏ لمدة 5 دقائق؛
بمعدل 1200 لفة في الدقيقة لإزالة بواقي الخلايا. تم تخفيف المواد الطافية المصفاه في محلول منظم للتجرية واستخدامها في ‎ELISA‏ ل ‎Gg TNFor‏ لبروتوكول القائم على التصنيع. تم تحديد تركيزات ‎TNFa‏ المفرز بواسطة الاستكمال من المنحنيات القياسية وتم توضيحها في الشكل ‎.z29‏ ‏تم ‎SY)‏ خلايا كارسيتوما القولون ‎DLD‏ في صورة طعم خارجي تحت الجلد في 1 ‎CD‏ لفئران
‎.nunu 0‏ فور وصول الأورام إلى -100مم3 تم تجميع الفئران وعلاجها باستخدام 5 ‎x‏ 10 9 جسيمات فيروس ‎EnAd‏ أو 39 1 ‎NG-‏ التي يتم توصيلها بواسطة حفن مفرد داخل الورم في ‎f‏ لأيام ‎ha‏ 3 و6. في كل دراسة تم ‎Wad‏ تضمين مجموعة من ‎Gh‏ مستخدمة كعنية مقارنة لم يتم نقل العدوى إليها. تم استئصال الأورام 010 بعد 15 يوم من العلاج وتم اختبارها لإنتاج ‎TNF‏ ‏بواسطة ‎dg ELISA‏ لبروتوكول القائم على التصنيع. تم تحديد تركيزات ‎TNFOU‏ الذي تم الكشف
‏5 عنه في الورم بواسطة الاستكمال من المنحنى القياسي وتم توضيحها في الشكل 29د. المثال 18: استنساخ الفيروس والتعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في سلالات الخلية كارسينوما القولون؛ المبيض والرئة تمت مقارنة استنساخ الفيروس 16-5 (متوالية رقم : 2( ‎EnAd‏ ‘ والتعبير ‎hs‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في سلالات الخلية كارسينوما القولون (11-29 1161116 ‎«(DLD‏ الرئة
‎(A549) 0‏ أو المبيض ‎(SKOV3)‏ بواسطة اا ل ‎.hIgG1‏ ‏تم استزراع الخلايا في أطباق مزرعة بها 12 عين بكثافة تبلغ 5 ‎x 1-5 10 x‏ 10 6 خلية لكل عين. بعد 24 ساعة من الاستزراع تم نقل العدوى إلى سلالات الخلية بواسطة 816-135 أو ‎Jara EnAd‏ 100 جسيم من الفيروس لكل خلية. تم استنبات الخلايا لمدة 24 48 72 96 أو 120 ساعة قبل تجميع المواد الطافية من العيون وطردها مركزيًا لمدة 5 دقائق؛ بمعدل 1200
لفة في الدقيقة لإزالة بواقي الخلايا. تم استخدام نصف كمية المادة الطافية لتقييم إنتاج الجسم المضاد وتم استخدام النصف الآخر لتقييم مجموعات العوامل الوراثية للفيروس. بعد ذلك تم غسل الخلايا الموجودة في كل عين باستخدام ‎PBS‏ مركز مرة واحدة وتم تحليلها في محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز لمرة واحدة ‎(Promega)‏ تم تجميد وإذابة نواتج التحلل ثم تم تقييمها لاستنساخ الفيروس. تم استخلاص ال ‎DNA‏ من 5-1 ميكرو لتر من ناتج تحلل الخلايا أو 10 ميكرو لتر من مادة طافية باستخدام طقم استخلاص ال ‎(DNA Sigma Genelute‏ وففًا لبروتوكول القائم على التصنيع. تم ‎Wad‏ تحضير منحنى قياسي باستخدام جسيمات فيروس 80/0 )2.5 ‎x‏ 10 10 - 5 10 5 جسيمات فيروسية) واستخلاصها باستخدام طقم ‎Sigma Genelute‏ .3 تحليل 0 كل عينة أو معيار تم استخلاصه بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎Gy EnAd 3‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. تم رسم أقصى استنساخ خلال كل النقاط الزمنية في كل سلالة خلية بيانيًا ل ‎NG-135, EnAd‏ في الشكل 133 تم تحضير أطباق ‎Nunc Immuno MaxiSorp) ELISA‏ طبق دقيق يحتوي على 96 عين) بواسطة التغليف في فترة وجيزة عند 4 درجة مئوية باستخدام جسم مضاد ‎FC‏ مضاد ل 961ا 5 بشري أحادي النسيلة مأخود من فر ‎Abcam)‏ 881927) في محلول منظم بالكريونات/باي كربونات. تم غسل الأطباق بين جميع خطوات الريط اللاحقة باستخدام ‎PBS 0.05% Tween‏ 0. تمت إعاقة نشاط الأطباق لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة باستخدام 963 من ‎BSA‏ في ‎.PBS 0.05% Tween 20‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه في %3 ‎BSA‏ في 20 ‎:1)PBS 0.05% Tween‏ 0 2 4:1 1: 16). تم تحضير مخفف تتابعي من بيفاسيزوماب نقي (1000 نانو جرام/ملليلتر - 8 نانو جرام/ملليلتر) وتخفيفه. تم أيضًا تثبيت عينات بيفاسيزوماب تبلغ 8 نانو جرام/ملليلتر في مواد نقل العدوى الطافية المستخدمة في عينة المقارنة. تمت إضافة كل العينات إلى الأطباق المغلفة وتم تحضينها لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تم استخدام جسم مضاد مستخدم في الاستكشاف؛ مضاد ‎Fab‏ بشري مترافق مع ‎HRP‏ لمدة 1 ساعة عند درجة ‎sa 5‏ الغرفة قبل إجراء الكشف عن ‎HRP‏ باستخدام محلول ركيزة 3 ‎HRP‏ 3( 5< 5”-تيرا ميثيل
إيثبلين داي أمين ‎(TMB)‏ +:©1160110-7150). تم استخدام 1 مولار من ‎HCI‏ لإيقاف التفاعل وتم قياس اللون الذي تم الحصول عليه عند 450 نانو متر على قاريء طبقي. تم تحديد تركيزات الجسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ المُفرز بواسطة الاستكمال من متحنى البيفاسيزوماب القياسي (الشكل 3ب). المثال 19: تمييز إنتاج الجسم المضاد من أورام معالجة ب 16-135
تم زرع خلايا كارسينوما القولون 101-116 في صورة طعم خارجي تحت الجلد في 601 لفئران ‎.nuU/nU‏ فور وصول الأورام إلى -100مم3 تم تجميع الفئران وعلاجها باستخدام 5 ‎x‏ 10 9 من جسيمات الفيروس 50/0 أو 16-135 التي يتم توصيلها بواسطة حقن مفرد داخل الورم. بعد 0 أيام من العلاج تم استئصال الأورام من بعض الحيوانات»؛ وتم وزنها وتقطيعها في صورة ‎shal‏
0 تزن -100 مج. تم وضع كل جزءِ في كوب ترشيح ‎(NUNC)‏ في طبق به 12 عين ثم تم استنباته خارج الخلية الحية لمدة 7 أيام في أوساط ‎DMEM‏ مضاف إليها 9610 ‎FBS‏ تم اختبار ‎shal‏ ‏الورم و أوساط الاستنبات خارج الخلية الحية لاستنساخ مجموعة العوامل الوارثية للناقل أو التعبير الوواثي عن جسم مضاد عند الأيام صفر أو 7 بعد الاستئتصال. تم الحصول على الأمصال من حيوانات أخرى لقياسات جسم مضاد ل ‎VEGF‏ في الدورة الدموية
5 تحليل استنساخ مجموعة عوامل وراثية للفيروس بواسطة ‎QPCR‏ ‏تمت إزالة أوساط الاستنبات من أكواب الترشيح والعيون المحيطة. بالنسبة ل ‎(GPCR‏ تم تخفيف عينات الأوساط بنسبة 1: 200 في طقم استخلاص ال ‎DNA Sigma Genelute‏ وتم تجانس محلول منظم لإعادة التعليق والأورام المستأصلة أو أجزاء الورم المستنبتة في محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز لمرة واحدة ‎(Promega E3971)‏ يحتوي على 1: 200 من خليط متبط
0 مضاد للبروتياز عند تركيز يبلغ 100 ميكرو لتر من محلول منظم لكل 25 مجم من الورم. تم تحضير معايير 50/80 وتم إجراء استخلاص ‎Gy GPCR 3 DNA‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 13. أظهر تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس لكل ورم في اليوم صفر أو اليوم 7 بعد الاستئصال زيادة في إجمالي مجموعات العوامل الوارثية للناقل في اليوم 7 لكل من
‎NG-135 5 EnAd‏ وهو ما يقترح الاستمرار في إنتاج مجموعة العوامل الوارثية للناقل أثناء الاستنبات خارج الخلية الحية. تم توضيح بينات ‎١16-135‏ في الشكل 135 تحليل التعبير الوراثيى عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة مضاد ‎IgG]‏ بشري تم استخدام عينات الورام المتجانسة أو عينات الأوساط النقية المحضرة من ‎(PCR‏ لتحليل 1 في 963 ‎BSA/PBS 0.0596 Tween‏ ثم تم إجراء ‎IgG] JELISA‏ وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. يمكن الكشف عن جسم مضاد في أورام 101-116 في ‎cdg‏ ‏الاستشصال (اليوم صفر) لكن كمية الجسم المضاد التي يمكن الكشف عنها بواسطة الأورام زادت بدرجة كبيرة بعد 7 أيام من الاستنبات خارج الخلية الحية (الشكل 35ب). تم الحصول على 0 الأمصال من الفئران بعد 7 أو 14 يوم من الحقن داخل الورم باستخدام ‎(NG=135‏ وتم اختبارها بواسطة ‎ELISA‏ لمضاد 061 بشري؛ وأظهر مستويات من جسم مضاد يمكن الكشف عنها في اليوم 14 (الشكل 35ج). لم يتم الكشف عن الجسم المضاد في الأمصال أو العينات المستنبتة خارج الخلية الحية من الفئران التي تم علاجها ب ‎EnAd‏ ‏المثال 20 : تمبيز نشاط فيروس 35 1 ‎NG-‏ في نموذج طعم خارجي فأري سوي الموضع لسرطان الرئة تم حقن خلايا كارسينوما الرئة 8549 داخل الوريد في فئران ‎SCID‏ 6817 وتم السماح للأورام بالنمو في الرئتين. بعد 8 أسابيع من الحقن تم تجميع الفئران وعلاجها باستخدام إماء 5 ‎x‏ 10 9 جسيمات من الفيروس 50/0 أو 816-135 التي يتم توصيلها بواسطة الإعطاء داخل ‎call‏ أو تم تركها بدون علاج عبر حقن ‎PBS‏ فقط. تم تجميع الرئتين والكبد من الفئران بعد 3 11 18 0 أو 25 يوم من العلاج (الشكل 136). عند كل نقطة زمنية تم استتصال أي ‎die‏ ورم مرئية في الرئة وتم تجميد كل من العقد المجمعة من كل رئة وأنسجة الرئة المتبقية بسرعة في نيتروجين سائل. تم تقييم نسيج الرئة وعقد أورام الرئة لحجم الورم 8549 ومجموعات العوامل الوراثية للفيروس بواسطة ‎PCR‏ 9. تحليل استنساخ مجموعة عوامل وراثية للفيروس أو حجم الخلية ‎A549‏ بواسطة ‎qPCR‏
تم تجانس نسيج ‎BA‏ المستأصل؛ عقد الورم أو أنسجة الكبد في محلول منظم لحل الخلايا مرشد مركز لمرة واحدة. تم استخلاص ال ‎DNA‏ من 100-10 ميكرو لتر من العينات المتجانسة باستخدام طقم استخلاص ال ‎DNA Sigma Genelute‏ وفقًا لبروتوكول المُصنع. لتقييم استنساخ مجموعة عوامل وراثية للفيروس؛ تم تحضير العينات والمنحنيات القياسية وتحليلها وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في
المثال 13. لتقييم حجم الخلية 0549 تم تحضير منحنى قياسي بواسطة تثبيت ‎A549 Wa‏ ‎x 3.6 - 610 x 2.25)‏ 10 3 خلية) في نسيج رئة متجانس غير معالج ثم استخلاص ‎DNA‏ ‏إجمالي باستخدام طقم استخلاص ال ‎DNA Sigma Genelute‏ تم تحليل المعايير والعينات المستخلصة لحجم الخلية 8549 بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين
0 مستقبل بروستاجلاندين ‎E‏ بشري ‎(PTGER2)‏ وخليط التفاعل والبرنامج المستخدم ل ‎EnAd‏ ‎qPCR‏ على النحو المذكور بالتفصيل في المثال 9. أظهر تحديد كمية حجم الورم 8549 بعد 3 أيام من العلاج حجم ورم ‎A549‏ مشابه في فئران معالجة ب ‎NG-135‏ وفتران مستخدمة في عينة مقارنة 085. لكن في اليوم 25 كان حجم الورم في الفئران ‎dalled)‏ ب ‎NG=135‏ أقل بدرجة كبيرة من مجموعة المقارنة ‎PBS‏ (الشكل 36ب). تم ‎Lad‏ إظهار مدى حجم الورم في رئة الفئران
5 الفردية المرتبطة باستنساخ الفيروس (الشكل 36ج) وانتقائية استنساخ الفيروس بواسطة زيادة تبلغ -2 لوغاريتم في جسيمات الفيروس التي يمكن الكشف عنها في عقد الورم مقارنة بأنسجة الرئة المحيطة التي لا تحتوي على عقد ورم مرئية مجهريًا (الشكل 36د). المثال 21: مقارنة نشاط 116-135 3 ‎ENA‏ في نموذج طعم خارجي فأري سوي الموضع لسرطان المبيض
0 تتم زرع خلايا كرسينوما المبيض ‎SKOV=3‏ التي تعبر ‎Why‏ بشكل ثابت عن ليوسيفيراز في ‎Ob‏ ‏6817-00 عن طريق الحقن داخل العشاء البريتوني بمعدل 5 ‎X‏ 10 6 خلية/فأر. بعد 22 يوم من الزرع تم علاج ‎idl‏ إما ب ‎PBS‏ (عينة مقارنة) أو 5 ” 10 7 جسيمات فيروس ‎NG-135 (EnAd‏ أو 06-78 التي يتم توصيلها بواسطة الحقن داخل العشاء البريتوني. تم تصوير الفئران مرتين في الأسبوع باستخدام كاميرا التصوير ‎VIS‏ بعد حقن 32 مجم من
5 الوسيفيرين داخل العشاء البريتوني. تم تحديد وحدات الضوء النسبية ‎relative light unit‏
‎(RLU)‏ كقياس لحجم ‎call‏ لمنطقة ثابتة محل اهتمام عند نقاط زمنية مختلفة. أظهرت البيانات أن الفيروسات ‎NG=T78 5 NG-135 (EnAd‏ أدت بدرجة كبيرة إلى تقليل حجم الورم في هذا النموذج مقارنة بعينات المقارنة ‎PBS‏ (الشكل 37). المتال 22: تمييز فيروس ‎NG=135‏ وجسم مضاد ل ‎VEGF‏ مُعبر عنه ‎ils‏ بعد الإنتاج والتنقية المتزايدة لمادة الفيروس من مفاعل حيوي. تمت إذابة خلايا ‎HEK293‏ وتمديدها في قوارير رج قبل التمدد إلى 3 لتر من حجم التشغيل في مفاعل حيوي صهريجي ذي أداة تقليب سعة 5 لتر (وعاء زجاجي). تم ضبط وسيلة التحكم في المفاعل الحيوي عند متغيرات تبلغ 37 درجة مئوية؛ نقطة ضبط رقم هيدروجيني تبلغ 7.4 أكسجين مذاب ‎dissolved oxygen (DO)‏ يبلغ ‎SO‏ معدل تدفق هواء يبلغ 100 ملليلتر/دقيقة؛ 0 والتقليب بمعدل 100 لفة في الدقيقة. بعد معادلة نظام المفاعل الحيوي؛ تم استزراع حجم أولي من 5 لتر من وسط مستنبت خلية خارجي مع خلايا ‎HEK293‏ عند كثافة خلية حيوية تبلغ 5 ‎X‏ ‏0 5 خلية/ملليلتر ثم تم تمديده إلى حجم تشغيل يبلغ 3 لتر فور تمدد الخلايا إلى الكثافة المطلوية يتم نقل العدوى إلى المستنبت باستخدام 816-135 عند ‎MOI‏ يبلغ 50 جسيم لكل خلية. بعد 48 ساعة من نقل العدوى تم تجميع مستنبت بحجم 3 لتر وتمت تنقية الفيروس منه بواسطة 5 عمليات تم إجرائها مسبقًا لتصنيع ‎GMP‏ لفيروس 50/0 (موضح أدناه) بحيث ‎(Say‏ مقارنة فيروس 16-135 المنتج بفيروس 50/0 تم تصنيعه مسبقًا. بالإضافة إلى تنقية الفيروس» تم ‎Lal‏ تنقية جسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ تم إنتاجه بواسطة ‎WAY‏ التي تم نقل العدوى إليها من أوساط مستتبت الخلية للسماح بإجراء تحليلات بنائية ووظيفية للمقارنة بمنتج البيفاسيزوماب الإكلينيكي؛ أفاستين. 0 تتقيى فيروس ‎١16-135‏ ‏تمت تنقية فيروس 116-135 من حصاد المفاعل الحيوي. تم علاج المادة المجمعة ب 6 لاهتضام ‎DNA‏ الخلية العائلة ثم تم تركيزه وتبادل محلوله المنظم بواسطة ترشيح تدفق مماسي ‎tangential flow filtration (TFF)‏ باستخدام غشاء ليفي مجوف بوزن ‎Ea‏ ‏يبلغ 500 كيلو دالتون. عند هذه الخطوة تم تجميع ناتج نفاذية 17؛ الذي عادة ما يتم التخلص
منه؛ واستخدامه لتنقية جسم مضاد ل ‎VEGF‏ (راجع ما يلي). تمت تنقية المادة المحتجزة بواسطة
‎TFF‏ والتى تحتوي على فيروس 16-135 بواسطة الاحتجاز الانتقائى والتصفية التتابعية
‏لفيروس ‎NG=135‏ باستخدام راتنج استشراب التبادل الأنيوني ‎LSartobind‏ بعد ذلك تم تبادل
‏المحلول المنظم للفيروس النقي في 50 ‎Ma‏ مولار من ‎(Tris—HCI‏ 2 مللي مولار 1/902 965
‏5 محلول جليسرول منظم» تمت معايرته ب ‎(HPLC‏ وتخزينه عند -80 درجة مثوية.
‏تمييز فيروس 16-135
‏تمت مقارنة ‎dads‏ فيروس ‎NG=135‏ النقي (يطلق عليه ‎(NG-135-BR1‏ النشاط الحال للورم
‏(تم تقييمه بواسطة تجرية قدرة الخلايا على البقاء حية)؛ استنساخ الفيروس (تم تقييمه بواسطة
‎NG- sale ‏أو‎ ENAd ‏مع‎ (ELISA ‏والتعبير الوراثي عن جسم مضاد (تم تقييمه بواسطة‎ (QPCR ‏مرجعية تم تمييزها مسبقًا.‎ 135 0
‏لتقييم الفاعلية الحالة للورم مقارنة ب ‎ENA‏ تم إجراء تجرية قدرة الخلايا على البقاء حية ‎ay‏
‏للطرق المذكورة بالتفصيل فى المثال 15. أظهر ‎NG-135-BR1‏ النقى فاعلية مماثلة للمادة
‏المرجعية ‎EnAd‏ المفصنعة (الشكل 138(
‏لتقييم استنساخ الفيروس أو التعبير الوراثي عن جسم مضاد؛ تم استزراع خلايا 111-29 في أطباق مزرعة بها 12 عين بكثافة تبلغ 1 ” 10 6 خلية/عين؛ تم السماح لها بأن تلتصق وتم نقل العدوى
‏إليها باستخدام 100 جسيم لكل خلية من ‎NG-135 (EnAd‏ أو ‎NG-135-BR1‏
‏بالنسبة ل ‎(PCR‏ تم تجميع ‎DNA‏ بعد 24؛ 48 أو 2 ساعة من نقل العدوى من كل من نواتج
‎LAN as‏ والمواد الطافية وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحليل عينات ال
‎DNA‏ المستخلصة مقابل معايير 50/0 بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎ENA E3‏ وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل فى المثال 9. كان إجمالى مجموعات العوامل
‏الوراثية للفيروس التي تم الكشف عنها خلال فترة ‎Jas‏ العدوى ‎Alas‏ لجميع الفيروسات التي تم
‏اختبارها (الشكل 8 ب).
‏لتقييم التعبير ‎Syl)‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه في
‎Tween 20‏ 85//0.0596 085/396 ثم تم اختبارها بواسطة ‎ELISA‏ مقابل منحنى قياسي
للبيفاسيزوماب ‎hg‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحديد تركيز جسم مضاد بواسطة الاستكمال من المنحنى القياسي (الشكل 038). تنقية جسم مضاد ل ‎VEGF‏ ‏تم تركيز ناتج نفاذية ‎TRF‏ المجمع؛ الذي يحتوي على أحادي النسيلة جسم مضاد مضاد ل
‎VEGF 5‏ وتم تبادل محلوله المنظم في محلول منظم للترشيح المزدوج لبروتين ‎A‏ (200 مللي مولار من ‎(Na2PO4‏ برقم هيدروجيني يبلغ 7.0( باستخدام خطوة ‎TRF‏ ثانية بواسطة غشاء ليفي مجوف بوزن جزيئي يبلغ 30 كيلو دالتون. تمت تنقية الجسم المضاد المركز بواسطة استشراب البروتين ‎A‏ باستخدام عمود بروتين ‎A‏ سعة 1 ملليلتر على نظام تنقية ‎AKTA‏ تم تركيز ‎ola‏ الجسم المضاد المفصول تتابعيًا باستخدام مادة تركيز بحجم جزيئي يبلغ 50 كيلو دالتون
‎Amicon Ultra 10‏ وتم تبادل محلوله المنظم في محلول منظم للتخزين )50 ‎Me‏ مولار ‎Tris—‏ ‎(HC‏ 965 جليسرول؛ رقم هيدروجيني يبلغ 7.0( باستخدام عمود ‎PD10‏ تم تحديد تركيز جسم مضاد نقي بواسطة (01- في صورة 0.15مجم/ملليلتر وتم تأكيد النقاء بواسطة ‎SDS-PAGE‏ ‏تمييز جسم مضاد نقي ل ‎VEGF‏ ‏تمت مقارنة بنية جسم مضاد نقي ل ‎VEGF‏ بأفاستين إكلينيكي بواسطة بقعة وسترن يليه بعد أو ‎SDS-PAGE 5‏ غير مختزل أو مختزل وتم تقييم ألفة الجسم المضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة 6398 . بالنسبة بقعة ويسترن؛ تم تحضير 7.5 ميكرو جرام/ملليلتر من أفاستين أو 6 ميكرو جرام/ملليلتر من منتج جسم مضاد نقي في محلول ‎NUPAGE‏ منظم ‎LDS dual‏ لإختزال أنواع الهلام تمت إضافة عامل الاختزال ‎NUPAGE‏ إلى كل عينة قبل تسخين كل العينات ‎sad‏ 10 دقائق» عند 70 درجة مثوية. تم إجراء ‎SDS-PAGE‏ باستخدام 9612-4 من أنواع الهلام ‎Bis—‏ ‎Gg Tris NUPAGE 0‏ لبروتوكول القائم على التصنيع. تم نقل البروتينات على أغشية ‎PVDF‏ ‏بواسطة بقعة ويسترن باستخدام ‎Xcell ١| Blot Module‏ تم إجراء إيقاف النشاط والتبقيع المناعي في 774/660-20 0.196 ‎PBS‏ مُضاف إليه 165 مسحوق حليب. تم الكشف عن أجسام مضادة لذ ‎VEGF‏ باستخدام مضاد ‎19G‏ بشري متعدد النسائل مترافق مع ‎«HRP (Promega‏ (4031//. تمت رؤية البروتينات بواسطة التألق الكيميائي المحسن ‎enhanced‏
‎.chemiluminescence (ECL)‏ أظهر جسم مضاد نقي ل ‎VEGF‏ تم إنتاجه من عملية إنتاج
‏الفيروس ‎NG=135‏ فئات بروتين يمكن الكشف عنها على بقع غير مختزلة ومختزلة ‎Jie‏
‏الأفاستين ‎Avastin‏ (الشكل 38د).
‏لتحليل ألفة الارتباط ب ‎VEGF‏ لمادة جسم مضاد نقي مقارنةٌ بالأفاستين؛ تم تحليل المادة باستخدام
‏5 تجرية ارتباط ب ‎VEGF Biacore‏ تم التأكد من صحتها (تم إجرائها بواسطة ‎«BioOutsource‏
‎(UK‏ . أظهر التحليل الحركي ‎(Biacore 1200 Evaluation Software)‏ بعد بروتوكول
‏التجرية المحدد أن عينة الجسم المضاد النقى 1 ‎VEGF‏ قادر على الارتباط ب ‎VEGF165‏
‏بحركيات وألفة مماثلة لمادة أفاستين قياسية مرجعية (الشكل 8 23( .
‏المثال 23: إنتاج وتمييز فيروسات 50/0 مُشفرة لسلاسل جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل ‎VEGF 0‏ مرتبطة بببتيد ‎P2A‏ ذاتي الانشطار ‎(NG-165)‏
‏تم استخدام البلازميد 050/02.4 (متوالية رقم: 64) لتوليد البلازميد 086-165 (متوالية رقم:
‏59( بواسطة ‎f‏ لإدخال المباشر لمجموعة جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل ‎VEGF‏ فى مواضع
‏التقييد الفريدة الموجودة بين الجينات ‎(E45 LS‏ تقوم ‎de sane‏ الجين الناقل ‎PNG-165‏ بتشفير
‏جسم مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة تضمين متوالية مضاد ‎VEGF‏ ذات سلسلة ثقيلة متغيرة (متوالية رقم: 29( متوالية جسم مضاد ذات سلسلة ثقيلة ثابتة (متوالية رقم: 33)؛ متوالية ببتيد ‎P2A‏ ذات
‏فاعلية انشطار ذاتي عالية (متوالية رقم: 25)؛ متوالية مضاد ‎VEGF‏ ذو سلسلة خفيفة متغيرة
‏(متوالية رقم: 31) ومتوالية جسم مضاد ذو سلسلة خفيفة ثابتة (متوالية رقم: 35). تكون متوالية
‏تشفير الجسم المضاد محاطة بمتوالية مستقبل جدل قصير عند الطرف 5” (متوالية رقم: 16(
‏ومتوالية ‎Jul‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات عند الطرف 3” (متوالية رقم: 20). يتم توضيح مخطط لمجموعة جين ناقل تم إدخالها في الشكل 34. تم تأكيد إنشاء البلازميد بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏
‏إنتاج الفيروس
‏تم تضخيم الفيروس 6-165 وتنقيته وفقًا للطرق المستخدمة لتنقية فيروس ‎NG=135‏ المذكورة
‏بالتفصيل في المثال 8.
‏تمييز الفيروس
تمت مقارنة نشاط ‎NG-165‏ الحال للورم (تم تقييمه بواسطة تجرية قدرة الخلايا على البقاء حية)؛ استنساخ الفيروس (تم تقييمه بواسطة ‎(QPCR‏ والتعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ (تم تقييمه بواسطة ‎(ELISAs‏ ب ‎EnAd‏ أو 806-135 في خلايا كارسينوما القولون. لتقييم الفاعلية الحالة للورم مقارنة ب 50/0 تم إجراء تجرية قدرة الخلايا على البقاء حية وفقًا للطرق المذكورة
بالتفصيل في المثال 15. أظهر الفيروس 6-165 فاعلية مماثلة للمادة المرجعية ‎EnAd‏ ‏المُصنعة (الشكل 839). لتقييم استنساخ الفيروس أو التعبير ‎Shall‏ عن جسم مضاد؛ تم استزراع خلايا 111-29 في أطباق مزرعة بها 12 عين بكثافة تبلغ 1 ‎x‏ 10 6 خلية/عين؛ تم السماح لها بأن تلتصق وتم نقل العدوى إليها باستخدام 100 جسيم لكل خلية من ‎NG-135 (EnAd‏ أو 6-165ل2. بالنسبة ل ‎«qPCR‏
0 .تم تجميع ‎DNA‏ بعد 24؛ 48 أو 72 ساعة من نقل العدوى من كل من نواتج تحلل الخلايا والمواد الطافية وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحليل عينات ال ‎DNA‏ ‏المستخلصة بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎Gig 50/0 E3‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. كان إجمالي مجموعات العوامل الوراثية للفيروس الذي تم الكشف عنه ل ‎NG-165‏ خلال فترة نقل العدوى مماثل لفيروس 50/80 المرجعي (الشكل 39ب).
‎ail 5‏ التعبير الوراثي عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه بعد 4 48 أو 72 ساعة من نقل العدوى في 20 ‎Tween‏ 85//0.0596 585/396 ثم تم اختباره بواسطة ‎ELISA‏ ل 1961 باستخدام منحنى قياسي للبيفاسيزوماب ‎dy‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحديد تركيز الجسم المضاد 0961| بواسطة الاستكمال من المنحنى القياسي ‎Jug‏ على أن 806-165 يعبر ‎Gilg‏ عن مستويات مماثلة من ‎IG]‏ لفيروس ‎NG-‏
‏20 135 المرجعي (الشكل 39ج). المثال 24: تمييز فيروسات ‎EnAd‏ مُشفرة ل ‎ScFvs‏ مضادة ل ‎VEGF‏ في ظل تحكم معززات داخلية أو خارجية تم أيضًا تمييز الفيروسات ‎(NG-T78 5 NG-T6‏ الموصوفة سابقًا في الأمثلة 8 و11؛ بواسطة النشاط الحال للورم الخاص بها في خلايا كارسينوما القولون (تم تقييمه بواسطة تجربة قدرة ‎LIAN‏
على البقاء حية) والتعبير الوراثي عن بروتين ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ وظيفي (تم تقييمه بواسطة ‎ELISA‏ لارتباط ]56/). لتقييم الفاعلية الحالة للورم مقارنةً ب 50/80 تم إجراء تجارب قدرة الخلايا على البقاء حية ‎Gg‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 15. أظهر كل من 816-76 ‎NG-78‏ فاعلية ‎Als‏ للورم مماثلة للمادة المرجعية ‎ENA‏ المُصنعة (الشكل 140 و40ب).
بالنسبة ل 006-76 تم وصف نشاط ارتباط ‎alias ScFV‏ ل ‎VEGF‏ مُعبر عنه في ظل معزز خارجي ‎(CMV)‏ في المثال 12. بالنسبة لنشاط ارتباط ‎NG=78‏ تم تقييم ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ مُعبر عنه وراثيًا من معزز متأخر رئيسي لفيروس داخلي بواسطة إما ‎ELISA‏ مباشر لارتباط ‎VEGF‏ أو في ‎Cus ELISA‏ يتم تضمين منتج بيفاسيزوماب إكلينيكي للمنافسة على ارتباط ‎dilly VEGF‏ لكلا ‎ELISAs‏ تم نقل العدوى إلى خلايا ‎F293‏ باستخدام 50 جسيم لكل
0 خلية من فيروس 816-78 وتم استنباتها لمدة 70 ساعة. تم تجميع ‎LAY‏ والأوساط من القارورة وتم فصل المادة الطافية والخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق؛ بمعدل 1000 لفة في الدقيقة. تم تجميع المادة الطافية وتمت إعادة تعليق كريات الخلية المتبقية في 1 ملليلتر من أوساط الخلية قبل إجراء 3 دورات تجميد-إذابة لحل الخلايا.. بعد التحلل تم فصل بواقي الخلايا والأوساط بواسطة خطوة طرد مركزي ثانية وتم تجميع المادة الطافية من ناتج التحلل. تم تخفيف المواد
5 الطافية أو نواتج التحلل بنسبة 1 إلى 2 في 963 ‎.BSA/PBS 0.05% tween‏ بالنسبة ل ‎ELISA‏ للارتباط المباشر تم أيضًا تخفيف العينات تتابعيًا إلى أقل تخفيف يبلغ 1 إلى 4 بالنسبة ل ‎ELISA‏ التنافسي تمت إضافة بيفاسيزوماب إلى العينات بتركيزات تبلغ صفرء 5 0.5 أو 5 ميكرو جرام/ملليلتر. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ ب ‎VEGF‏ إعاقة نشاطها وغسلها وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 7. تمت إضافة العينات إلى الأطباق بمعدل
0 100 ميكرو لتر/عين وتم تحينها لمدة ساعة واحدة وتم الكشف عن ‎VEGF‏ مقيد ب ‎ScFV‏ ‏باستخدام مضاد ‎His‏ متعدد النسائل مترافق مع ‎HRP (Abcam aB1187)‏ يليه الكشف ب 8. تمت قراءة الامتصاص عند 450 نانو متر على قاريء طبقي وتم رسم امتصاص تم منه طرح مستوي النشاط القاعدي بيانيًا للارتباط المباشر للعينات ب ‎VEGF‏ (الشكل 40ج) والارتباط المباشر في وجود تركيزات كبيرة من البيفاسيزوماب (الشكل 40د). على النحو الموضح مسبقًا ل
86-6 يمكن التعبير وراتيًا عن ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ وظيفى يرتبط نوعيًا ب ‎VEGF165‏ ‏ويتم إفرازه من ‎LIA‏ 816-78 تم نقل العدوى إليها. المثال 25. تمييز نشاط فيروس 6-76 مقارنةً ب ‎ENAd‏ في فئران حاملة للورم تم ‎SY)‏ خلايا كارسيتوما القولون ‎DLD‏ في صورة طعم خارجي تحت الجلد في 1 ‎CD‏ لفئران ‎.NUMNU 5‏ فور وصول الأورام إلى -100مم3 تم تجميع ‎hill‏ وعلاجها باستخدام 5 ‎x‏ 10 9
جسيمات فيروس ‎EnAd‏ أو 16-6 التي يتم توصيلها بواسطة حفن مفرد داخل الورم . في كل دراسة تم ‎Waal‏ تضمين مجموعة من ‎Gh‏ مستخدمة كعنية مقارنة لم يتم نقل العدوى إليها. تم استئصال الأورام 00100 بعد 7 ‎all‏ من العلاج وتم تقييمها بالنسبة لاستنساخ الفيروس (بواسطة ‎(QPCR‏ والفيروس أو التعبير الوراثى عن جين ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ (بواسطة ‎(RTQPCR‏ ‏تم وزن الأورام المستأصلة؛ وتجانسها وتم استخلاص ‎dg DNA‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 13. تم تحليل العينات والمعايير المستخلصة بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎Gs 50/80 E3‏ لطرق ‎QPCR‏ المذكورة بالتفصيل في المثال 9. يتم توضيح تحديد كمية عدد مجموعات العوامل الوراثية للفيروس لكل ورم لأورام 010 بعد 7 أيام من العلاج
ويظهر أن 1816-76 و080ع لهما استنساخ كبير للفيروس أعلى من المدخل (الشكل 41أ). تحليل التعبير ‎hs‏ عن جين فيروسي (هكسون) أو جين جسم مضاد ‎ScFv‏ مضاد ل ‎VEGF‏ ‏بواسطة "7006 تم تحضير ‎DNA‏ من ‎RNA‏ للأورام المستأصلة وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 13. أظهر تحديد كمية عدد نسخ ‎CDNA‏ تم الكشف عنها بواسطة ‎QPCR‏ تعبير ‎hy‏ مماثل عن
0 جين الفيروس المتأخرء هكسون؛ في أورام ‎DLD‏ معالجة ب 816-76 أو 50/0 بعد 7 أيام من العلاج (الشكل 1 4«( . وعلى النقيض ؛ تم الكشف فقط عن التعبير ‎hs‏ عن جين ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ في خلايا ‎DLD‏ معالجة بفيروس 816-76 (الشكل 41ج).
المثال 26: انتقائية التعبير ‎Shell‏ في جينات ناقلة مشفرة بخلايا أو أورام فيروس باستخدام معززات داخلية أو خارجية ‎(NG-107 5 NG-63 (NG-61 (NG-47 (NG-135)‏ التعبير الوراثي عن الجسم المضاد ‎NG-135‏ يعتمد على استنساخ الفيروس يتم تشفير مجموعة جسم مضاد ‎VEG F J‏ في الفيروس 35 1 ‎N G-‏ في ظل تحكم معزز داخلي متأخر رئيسي ‎(ENA (MLP)‏ تم مسبقًا تمييز أنه أثناء نقل العدوى بفيروس غدي فإن غالبية التعبير الوراثي عن الجين من المعزز المتأخر الرئيسي تعتمد على استنساخ الفيروس. لتوضيح أن التعبير الوراثيى عن جسم مضاد عند التحكم فيه بواسطة ‎EnAd‏ فإنه ‎MLP‏ يعتمد كذلك على استنساخ الفيروس فإنه تتم مقارنة حركيات استنساخ الفيروس 35 1 ‎NG-‏ (تم تقييمه بواسطة ‎(QPCR‏ والتعبير الوراثيى عن جسم مضاد (تم تقييمه بواسطة ‎(ELISA‏ عند ‎MOIs‏ مختلفة. 0 .تم استزراع خلايا كارسينوما القولون ‎١11-29‏ في أطباق تحتوي على 6 عيون بكثافة تبلغ 2 ‎x‏ ‏0 6 خلية/عين. بعد الاستزراع ب 18 ساعة تم نقل العدوى إلى الخلايا باستخدام 1؛ 10 أو 100 جسيم لكل خلية من فيروس ‎.NG-135‏ ‏لتقييم التعبير الوراثى عن جسم ‎alias‏ ل ‎VEGF‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه بعد نقل العدوى ب 24؛ 48 أو 72 ساعة في 20 ‎Tween‏ 85//0.0596 085/396 ثم تم اختبارها 5 بواسطة مضاد ‎ELISA‏ لارتباط ‎VEGF‏ وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. تم تحديد تركيز الجسم المضاد بواسطة الاستكمال من المنحنى القياسي. بالنسبة لتحليل استنساخ الفيروس بواسطة ‎«qPCR‏ تم تجميع ‎DNA‏ بعد 24؛ 48 أو 72 ساعة من نقل العدوى من كل من نواتج تحلل الخلايا والمواد الطافية ‎Bg‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. تم تحليل عينات ال ‎DNA‏ المستخلصة بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ 0 نوعية لجين ‎Gig ENAD E3‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. أظهر تحليل التعبير الوراثي عن جسم مضاد بعد 72 ساعة من نقل العدوى جسم مضاد مفرز يمكن ‎die CRASH‏ لجميع 05 التي تم اختبارها ولكن مستوى التعبير الوراثي عن الجسم المضاد يعتمد على ‎MOI‏ المدخل (الشكل 142). تظهر حركيات التعبير الوراثي عن جسم مضاد زيادة التعبير الوراثي عن جسم
مضاد خلال فترة نقل العدوى ولكن التعبير الوراثي عن الجسم المضاد الذي يمكن الكشف عنه يكون مرتبط بمستوى كبير من استنساخ الفيروس أعلى من المدخل (الأشكال 42ب و42ج). التعبير الوراثي عن الجسم المضاد ‎NG-135‏ في الكارسينوماء خلايا أرومة ليفية سدوية وخلايا أولية لتأكيد أنه يمكن التعبير الوراثي عن الجسم المضاد ‎Legs‏ في خلايا تسمح بنقل العدوى ب ‎NG‏
5 واستنساخ الفيروس؛ تم تحديد استنساخ ‎(ug pill‏ 5-135ل8 (تم تقييمه بواسطة ‎«(QPCR‏ ‏التعبير الوراثي عن جسم مضاد (تم تقييمه بواسطة ‎(ELISA‏ والقدرة على إنتاج جسيمات فيروس معدية (تم تقييمه بواسطة تجرية إعادة نقل العدوى) في الخلايا السرطانية ‎(HT=29)‏ المعروف عنها أنها تسكح بنقل العدوى ب 50/0 وخلايا أرومة ليفية (1-38//ا ‎(MRC=5‏ التي تم تمييزها
مسبقًا على أنها غير سَموحة. باختصارء تم استزراع الخلايا في أطباق تحتوي على 12 عين وتم تقل العدوى إليها بعد 18 ساعة من الاستزراع باستخدام 100 جسيم لكل خلية من فيروس ‎NG=‏ ‏5 لمدة 4 ساعات وقبل نقل العدوى تمت إزالة الأوساط من الخلايا واستبدالها بأوساط الاستنبات. بعد ساعة واحدة أو 72 ساعة من فترة نقل العدوى التي تستغرق 4 ساعات؛ تم تجميع ‎sal‏ الطافية للخلية ونواتج التحلل من الأطباق وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18.
5 بالنسبة ل ‎«qPCR‏ تم استخلاص ‎DNA‏ وتم تحليل العينات باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎Gay 50/80 E3‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. لتقييم التعبير ‎(Shell‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه بعد نقل العدوى في 585/396 ‎Tween 0‏ 85//0.0596 ثم تم اختبارها بواسطة ‎Gig ELISA‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18.
‎anit! 0‏ إنتاج جسيم الفيروس المعدي؛ تم تخفيف المواد الطافية تتابعيًا 10 مرات من ‎neat‏ وتم استخدامها لإعدة نقل العدوى إلى مستنبتات من خلايا 11-29 تم استزراعها بكثافة تبلغ 3 ‎x‏ 10 4 خلية/عين في أطباق تحتوي على 96 عين. تمت إزالة الأوساط من الأطباق بعد 72 ساعة من إعادة نقل العدوى وتم تثبيت الخلايا باستخدام ‎sad Me: Ac‏ 10 دقائق عند درجة ‎hs‏ الغرفة. بعد ذلك تم غسل العيون باستخدام ‎PBS‏ وتم تبقيع الخلايا للتعبير الوراثي عن بروتين لبروتين
‎EnAd‏ غلافي بواسطة التحضين باستخدام جسم مضاد أولي مضاد لهكسون مأخوذ من أرنب (مذابة بنسبة 1 إلى 800) ثم جسم مضاد مستخدم في الكشف ثانوي ضد أرنبي مقترن ب ‎HRP‏ ‏تمت رؤية بروتين الهكسون بواسطة إضافة ركيزة ‎DAB‏ والتصوير باستخدام الفحص المجهري الضوئي. تم تحديد المعيار المُعدي (101050/ملليلتر) بواسطة تسجيل جميع العيون التي تحتوي على تبقيع بروتين لبروتين غلافي موجب. كشف تحليل البيانات عن أن خلايا 117-29 فقط هي التي أظهرت استنساخ الفيروس ‎NG-135‏ ‏أعلى من مستويات العدوى المدخلة (الشكل 43( أو تعبير وراثي يمكن الكشف ‎die‏ عن جسم مضاد (الشكل 43ب). باستخدام معلومات حساسية تجرية ‎ELISA‏ ل 961ا؛ فإن عد وجود تعبير ‎Jl)‏ يمكن الكشف ‎die‏ عن جسم مضاد بواسطة خلايا غير ورمية عن أن هذه الخلايا تنتج أقل 0 من 0.33 فيمتو جرام/خلية/24 ساعة مقارنة بمستويات أعلى من 100 فيمتو جرام/خلية/24 ساعة لخلايا الورم ‎HT=29‏ تكون هذه البيانات مرتبطة بالإنتاج المفرط لجسيمات فيروس معدي في خلايا الورم ‎HT=29‏ ولكن لم يتم الكشف عن إنتاج الفيروس في سلالات ‎WA‏ أرومة ليفية (الشكل 43ج). التعبير الوراثي الانتقاتي عن جينات ناقلة في خلايا مناعية أولية 5 تتم تمييز التعبير ‎Shell‏ الانتقائي عن جينات ناقلة في خلايا مناعية أولية طبيعية لفيروسات ‎(NG-107 y NG-47 (EnAd‏ التي تعبر وراثيًا عن الجين المرشد؛ ‎eGFP‏ في ظل تحكم معزز خارجي ‎(CMV)‏ أو داخلي ‎(MLP‏ على التوالي. تم توضيح تمييز الفيروس 816-47 ‎NG-107 4‏ بالتفصيل في المثال 14. تم عزل ‎WIS‏ أحادية النواة من الدم الكامل وتم استنباتها لتمييزها في ‎LAN‏ الشجرية وفقًا للطرق 0 المذكورة بالتفصيل في المثال 28. في اليوم 5 تم استزراع خلية أحادية النواة تم تمايزها من المستنبت مشتقة من الخلايا الشجرية في أطباق تحتوي على 96 عين وتم تعريضها ل 200 جسيم لكل خلية من ‎(EnAd‏ 216-47 أو 16-107 أو تم تركها بدون علاج. بعد 48 ساعة تم تجميع الخلايا من العيون؛ وغسلها وتعليمها بجسم مضاد ل 6083 مترافق مع ‎PE/CY5‏ ‎.(CD83-PE/CyS (BioLegend))‏ بعد ذلك تم تقييم التعبير الوراثي عن ‎eGFP 5 CD83‏
على ‎DCs‏ بواسطة تعداد الخلايا المتدفقة ‎(Applied Biosystems)‏ وتم تحليل البيانات باستخدام برنامج ‎(FlowJo‏ يمكن الكشف عن التعبير الوراثي عن ‎GFP‏ فقط في الخلايا التي يتم تعريضها ل 116-47 حيث يكون التعبير الوواثي عن 6610 في ظل معزز خارجي ‎CMV‏ غير معتمد على النسخ الفيروسي للتعبير الوراثي عن الجين (الشكل 44). التعبير الوراثي ‎SEY)‏ عن جينات ناقلة في نماذج داخل الخلية الحية للتحقق من انتقائية التعبير ‎Shell‏ عن الجين الناقل داخل الخلية الحية؛ تم استخدام فيروسات مرشدة لتحديد التعبير الوراثي عن الجين الناقل في أورام خلية كارسينوما فأرية معرفوة بعدم سماحها لاستنساخ الفيروس 50/80. كان التعبير الوراثي عن الجين الناقل والاستجابة المناعية الوظيفية للجين الناقل؛ الفيروس أو الورم عند اختباره عند التعبير ‎Shell‏ عن الجين الناقل في ظل تحكم إما 0 المعزز الخارجي ‎(CMV)‏ أو الداخلي ‎MLP‏ ‏تم مسبقًا وصف وتمييز فيروسات مرشدة 116-61 5 ‎(NG=63‏ تعبر وراثيًا عن بروتين متألق ‎(Wisin‏ ليوسيفيراز» في المثال 14. تم ‎BALB/C gis‏ زرع 1 ‎x‏ 10 6 خلايا كارسينوما قولون فأرية ‎(CT26)‏ تحت الجلد على خاصرتها. فور الوصول إلى حجم متوسط يبلغ حوالي 100 ‎Bae‏ تم حقن الأورام ب 2.5 ‎X‏ 10 9 من جسيمات ‎NG-61‏ أو ‎NG=63‏ تم تصوير الفئران 5 بصورة دورية بعد 14 يوم من العلاج باستخدام كاميرا التصوير ‎VIS‏ بعد حقن 32 مجم من اللوسيفيرين داخل العشاء البربتوني. تم رسم المناطق محل الاهتمام ذات الحجم الثابت حول الأورام للسماح بقياس وحدات الضوء النسبية ‎(RLU)‏ لكل ورم. تم أيضًا تصوير فئران حاملة للورم غير معالجة لتحديد خلفية التصوير. أظهر تحديد كمية التعبير الوراثي عن الجين الناقل عبر مجموعات العلاج أنه يمكن الكشف عن الليوسيفيراز فقط في الأورام المعالجة بفيروس 16-61 حيث يكون 0 الليوسيفيراز في ظل تحكم المعزز الخارجي ‎CMV‏ (الشكل 145( بعد 14 يوم من العلاج تم استئصال الطحال من الفئران وفصله. تم تثبيت جسم مضاد لإنترفيرون ‎Lis‏ على أطباق ]01/0. تمت إضافة خلايا الطحال ومنبه» أي من فيروس ‎(ENA‏ نواتج تحلل خلايا 6126 أو بروتين ليوسيفيراز ناتج عن عودة الارتباط الجيني مهتضمن بالتريبسين؛ إلى أطباق ‎PVDF‏ وتم تحضينها في فترة وجيزة. بعد ذلك تم غسل الأطباق وتحضينها باستخدام جسم
مضاد لإنترفيرون جاما مرقم بالبيوتين قبل غسلها مرة أخرى وتحضينها باستخدام مترافق ستريتافيدين ‎—ALP‏ 50601817/010. بعد ذلك تم غسل الأطباق؛ وتمت إضافة ركيزة ‎BCIP/NBT‏ ‏ثم تم ترك الأطباق لتقوم بالإنماء حتى يمكن رؤية بقع واضحة. تم غسل الأطباق مرة أخرى ثم تم تجفيفها قبل إجراء التحليل في ‎(CTL Europe‏ لا68100180. كشف تحديد الكمية أن خلايا الطحال من 06-61 ولكن ليس من ‎dallas oh‏ ب ‎NG-63‏ تظهر استجابات نوعية تجاه جين الليوسيفيراز الناقل (الشكل 45ب). تكون هذه النتيجة مرتبطة بالاستجابات الزائدة في فتران معالجة ب 86-61 تجاه كل من فيروس ‎ENA‏ وخلايا الورم ‎CT26‏ (الشكل 45ج و45د). المثال 27: إنتاج وتمييز فيروسات ‎ENA‏ مُشفرة لأجسام مضادة ‎(NG=177 (NG-190)‏ أو صورة متغيرة للجسم المضاد (816-221) 5057 لبروتين مسار مثبط نقطة فحص مناعي ‎PD-‏ ‎LI 10‏ تم استخدام البلازميد ‎PENAD2.4‏ (متوالية رقم: 64( لتوليد البلازميدات ‎PNG-177‏ (متوالية رقم: 46 على النحو الموصوف في المثال 16( 6-190ل008 (متوالية رقم: 60(« و ‎PNG-221‏ ‏(متوالية رقم: 61) بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل مُشفرة إما لجسم مضاد ل ‎PD-‏ ‎(YW243)‏ 1 أو ‎ScFv‏ مضاد ل 00-11 للجسم المضاد 71//243؛ في مواضع التقييد 5 الفربدة الموجودة بين الجينات 5ا و54. تقوم مجموعة الجين الناقل 006-177 بتشفير جسم مضاد ل 010-11 بواسطة تضمين متوالية مضاد 000-11 ذات سلسلة ثقيلة متغيرة (متوالية ‎tad)‏ ‏30(« متوالية جسم مضاد ذات سلسلة ‎ALE‏ ثابتة (متوالية رقم: 34)؛ متوالية مدخل رببوسوم داخلي (متوالية رقم 19)؛ متوالية مضاد 00-11 ذات سلسلة خفيفة متغيرة (متوالية رقم: 32( ومتوالية جسم مضاد ذات سلسلة خفيفة ثابتة (متوالية رقم: 35). تقوم مجموعة الجين الناقل ‎PNG-190‏ ‏0 بتشفير جسم مضاد ل 010-11 بواسطة تضمين متوالية مضاد 010-11 ذات سلسلة ثقيلة متغيرة (متوالية رقم: 30(« متوالية جسم مضاد ذات سلسلة ‎ALE‏ ثابتة (متوالية رقم: 34)؛ متوالية ببتيد ‎P2A‏ ذو فاعلية انشطار ذاتي عالية (متوالية رقم: 25)؛ متوالية مضاد 010-11 ذات سلسلة خفيفة متغيرة (متوالية رقم: 32) ومتوالية جسم مضاد ذات سلسلة خفيفة ثابتة ‎Asie)‏ رقم: 35). تقوم مجموعة الجين الناقل ‎pNG-221‏ بتشفير ‎ScFv‏ مضاد ل 000-11 (متوالية رقم: 37). متواليات تشفير الجسم المضاد أو ‎SCV‏ محاطة بمتوالية مستقبل ‎Jaa‏ قصير عند الطرف 5"
(متوالية رقم: 16) و متوالية ‎JS‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات عند الطرف 3 (متوالية رقم: 20). يتم توضيح مخططات مجموعات جين ناقل تم إدخالها في الشكل 34. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏إنتاج الفيروس
تم تضخيم الفيروسات 90 1 ‎NG-‏ و 1 16-2 وتنقيتها ‎Lg‏ للطرق المستخدمة لتنقية الفيروس 16-5 المذكورة بالتفصيل فى المثال 8. تمييز الفيروس تمت مقارنة النشاط الحال للورم ل ‎NG=221 3 NG-190‏ (تم تقييمه بواسطة تجرية قدرة الخلايا على البقاء حية)؛ استنساخ الفيروس (تم تقييمه بواسطة ‎(QPCR‏ والتعبير الوراثي عن جسم مضاد
0 00-112 أو ‎ScFv‏ في خلايا كارسينوما القولون (تم تقييمه بواسطة ‎(ELISA‏ إما بفيروس 0 مرجعي أو الفيروسات 16-165 16-135" التي تم تمييزها مسبقًا وتعبر ‎Gls‏ عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ لتقييم الفاعلية الحالة للورم مقارنة ب ‎ENA‏ تم إجراء تجربة قدرة الخلايا على البقاء حية وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل فى المثال 15. أظهرت الفيروسات ‎NG-190‏ ‎BARA! NG-221‏ حال للورم ممائل 1 ‎EnAd‏ (الشكل 6 ب .
5 -_لتقييم استنساخ الفيروس أو التعبير الوراثي عن جسم مضاد؛ تم استزراع خلايا 111-29 في أطباق مزرعة بها 12 عين بكثافة تبلغ 1 ‎x‏ 10 6 خلية/عين وبعد الالتصاق تم نقل العدوى إليها باستخدام 100 جسيم لكل خلية من ‎(NG-190 EnAd‏ 16-221 أو ‎NG-165‏ بالنسبة ل ‎«qPCR‏ تم تجميع ‎DNA‏ بعد 24< 48 أو 72 ساعة من نقل العدوى من كل من نواتج تحلل الخلايا والمواد الطافية ‎Bag‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم ‎(las‏ عينات ال ‎DNA‏
0 المستخلصة بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎Gig 50/0 E3‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. كان إجمالي مجموعات العوامل الوراثية للفيروس التي تم الكشف عنها ‎NG-190 J‏ (الشكل 46ج) أو ‎NG-221‏ (الشكل 46د) مماثلة لفيروس 50/80 المرجعي خلال فترة نقل العدوى بالكامل.
لتقييم التعبير ‎Soll‏ عن الجسم المضاد المفرز من ‎WIA‏ تم نقل العدوى إليها ب ‎NG=190‏ أو ‎(NG-165‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية المنقاه بعد 24( 48 أو 72 ساعة من نقل العدوى في 20 ‎Tween‏ 85//0.0596 085/396 ثم تم اختبارها بواسطة ‎ELISA‏ لمضاد 1 بشري وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. على نحو مماثل؛ تم تقييم التعبير الوراثي عن الجسم المضاد المفرز من ‎WIA‏ تم نقل العدوى إليها ب 816-177 أو 116-135 في مواد طافية نقية بعد 72 ساعة من نقل العدوى. تم تحديد تركيز الجسم المضاد في العينات بواسطة الاستكمال من ‎dad‏ منحنى قياسي ويظهر أنه يتم إفراز الجسم المضاد الذي يمكن الكشف ‎die‏ من خلايا تم نقل العدوى إليها ب 116-190 عند مستوبات مماثلة لفيروس ‎NG-165‏ ‏مقارن (الشكل 47أ) ومن ‎WIA‏ تم نقل العدوى إليها ب 16-177 عند مستويات مماثلة لفيروس ‎NG-135 0‏ مقارنة (الشكل 49أ). المثال 28: تمييز جسم مضاد ل 00-11 أو 5057 يتم التعبير عنه وراثيًا من خلايا تم النقل العدوى إليها ب 16-190 ‎NG-177‏ أو ‎NG-221‏ ‏اختبار الارتباط المباشر ل ‎PD-L1‏ ‏تم تقييم نشاط ارتباط مضاد 00-11 للجسم المضاد أو ‎SCV‏ المُعبر ‎die‏ وراثيًا من خلايا تم 5 تقل العدوى إليها ب ‎NG-190‏ و 816-221 بواسطة ‎ELISA‏ للارتباط المباشر ب ‎PD-L1‏ ‏تم نقل العدوى إلى ‎WIA‏ كارسينوما الرئة ‎A549‏ لمدة 72 ساعة باستخدام 100 جسيم لكل خلية من 06-190 ‎NG=221‏ أو الفيروس مستخدم في ‎die‏ المقارنة 6-165ل8. تم تجميع مواد طافية لمستنبت وتركيزها حتى 300 جرام لمدة 5 دقائق لإزالة بواقي الخلايا. بعد ذلك تم تركيز مواد طافية لمستنبت 10 مرات بواسطة الطرد المركزي في عمود دوار لوسيلة تركيز بروتين ‎KO‏ ‎(MWCO (Pierce 0‏ 87748( لمدة 30 دقيقة عند 4000 جم. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ (طبق دقيق يحتوي على 96 عين ‎(Nunc Immuno MaxiSorp‏ ب ‎PDL1-Fc‏ ناتج عن ‎sage‏ ‏الارتباط الجيني )0.5 ميكرو جرام/ملليلتر» ‎«R&D Systems‏ 87-100156-) في فترة ‎Bang‏ ‏عند 4 درجة مئوية. تم غسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام ‎Tween—20‏ 085-0.0596 ثم تم إيقاف نشاطها باستخدام ‎Tween20‏ 85//0.0596 085/396. تم تحضير مخففات تتابعية
مزدوجة من المواد الطافية المركزة في ‎Tween20‏ 085/39685//0.0596 بنسبة تتراوح بين 1 إلى 2 و1 إلى 2048 ثم تمت إضافتها إلى طبق ‎ELISA‏ وتم تحضينها لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. بالنسبة لعينات 116-190 5 ‎(NG-165‏ تم غسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام -85م ‎Tween-20 5‏ 0.0596 ثم تمت إضافة 50 ميكرو لتر 8000/1 جسم مضاد لكابا ذو سلسلة خفيفة ‎Abcam)‏ 38124727) إلى كل العيون. بعد التحضين لمدة 1 ساعة والغسل؛ تم إجراء عملية كشف أخرى باستخدام جسم مضاد ماعزي ضد أرنبي من نوع ‎IgG H&L (HRP)‏ ‎.@b6721) (Abcam‏ بعد ذلك تم إنماء الطبق بإضافة 50 ميكرو لتر/عين من 1- ‎Step‏ ‎Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (thermo‏ 34028). بعد 20 دقيقة تم إيقاف 10 التفاعل بإضافة 50 ميكرو لتر من 1 مولار من ‎HOE‏ وتم قياس الامتصاص عند 450 نانو متر ورسمه بيانيًا. يمكن الكشف عن نشاط ارتباط مضاد 00-11 نوعيًا في المواد الطافية لخلايا 9 تم نقل العدوى إليها ب 16-190 وليس خلايا 8549 تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-165‏ ‏(الشكل 7جب). بالنسبة لعينات 806-221 تم غسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام ‎PBS-0.05% Tween—20‏ ثم تمت إضافة 50 ميكرو لتر من 1: 5000 من جسم مضاد ل 6 ‎X His tag® (HRP)‏ ‎«(Abcam‏ (881187 إلى كل العيون لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة ثم تم غسلها. تم إنماء الطبق بإضافة 50 ميكرو لتر من 1- ‎Step Ultra TMB-ELISA Substrate‏ ‎«Solution (thermo‏ 34028(. بعد 20 دقيققتم إيقاف التفاعل بإضافة 50 ميكرو لتر من 1 مولار من ‎HO‏ وتم قياس الامتصاص عند 450 نانو متر. يمكن الكشف عن نشاط ارتباط ‎507١7‏ ‏0 مضاد ل 00-11 ‎Leg‏ في المواد الطافية 816-221 (الشكل 47ج). تجرية تثبيط ارتباط مستقبل ‎PD-L1‏ ‏تم تقييم نشاط تثبيط جسم مضاد ل 00-11 مُعبر عنه ‎Wily‏ في المادة الطافية لخلايا تم نقل العدوى ‎le)‏ ب ‎NG-190‏ أو 116-177 في تجرية تفاعل مركب 00-11 ترابطي: مستقبل ‎.PD-1‏
تم نقل العدوى إلى 293 خلية ‎sad‏ 72 ساعة باستخدام 100 جسيم لكل خلية من 816-190 أو ‎.NG-177‏ تم تجميع مواد طافية لمستنبت وتركيزها وفقًا للطريقة المذكورة بالتفصيل أعلاه. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ ب 0011-6 (2 ميكرو جرام/ملليلترن ‎(R&D Systems‏ 87-156- 0) في فترة وجيزة عند 4 درجة مئوية. تم غسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام 085 ثم تم إيقاف نشاطها باستخدام 20 ‎Tween‏ 085/39685//0.0596 لمدة ساعة واحدة عند درجة
حرارة الغرفة. تم تحضير مخففات تتابعية مزدوجة من المواد الطافية المركزة في ‎PBS‏ ثم تمت إضافة 45 ميكرو لتر من كل مخفف إلى طبق ‎(ELISA‏ تمت إضافة 10نانو جرام من ‎PD1-‏ ‎Fe‏ ناتج عن عودة الارتباط الجيني ‎(R&D Systems)‏ 00-0501086 -) إلى كل عين وتم تحضين الطبق لمدة ساعة. بعد ذلك تم غسل جميع العيون ثلاث مرات باستخدام ‎PBS/0.05%‏
‎Tween20 0‏ وتم إيقاف نشاطها ‎sad‏ 10 دقائق باستخدام ‎PBS/3%BSA/0.05%‏ ‏0 . بعد ذلك تمت إضافة جسم مضاد معالج بالبيوتينيل نقي من حيث الألفة إلى ‎PD-1‏ ‏بشري ‎(BAF1086 «R&D Systems)‏ إلى العيون بمعدل 0.4 ميكرو جرام/ملليلتر لمدة 1 ساعة. تم غسل العيون ثلاث مرات باستخدام ‎Tween20‏ 085/0.0596 قبل إضافة مخفف بنسبة 1: 200 من ستريتافيدين ‎(HRP (R&D Systems—‏ (07998 لمدة ساعة. تم إنماء
‏5 الطبق بإضافة 50 ميكرو لتر من 1- ‎Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution‏ ‎(thermo‏ 34028. بعد 20 دقيقة تم إيقاف التفاعل بإضافة 50 ميكرو لتر من 1 مولار من ‎HC‏ وتم قياس الامتصاص عند 450 نانو متر. لتحديد النسبة المئوية لارتباط 010-1؛ يتم التعبير عن قيم الامتصاص المقاسة كنسبة مئوية من عينات المقارنة التي لا تحتوي على جسم مضاد ل 010-11. يكون جسم مضاد ل 000-11 يتم إفرازه من خلايا تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-‏
‏0 190 قادرة على تثبيط ارتباط مستقبل 10-1 بطريقة معتمدة على الجرعة (الشكل 47د). على نحو مماثل؛ كانت مادة طافية نقية من 16-177 وليس من خلايا تم نقل العدوى إليها ب ‎NG‏ ‏5. قادرة على تثبيط ارتباط مستقبل ‎PD-1‏ ب 000-11 بنسبة <%50 (الشكل 49ب) تفاعل خلايا لمفاوية مختلط ‎(MLR)‏
تم تقييم النشاط الوظيفي لجسم مضاد ل 00-11 مُعبر عنه ‎Wily‏ في المادة الطافية لخلايا تم نقل
العدوى إليها ب ‎NG-190‏ أو 116-177 بواسطة مدى تنشيط الخلية التائية في تفاعل خلايا
لمفاوية مختلط.
تم عزل خلايا أحادية النواة بالدم المحيطي ‎(PBMCs)‏ من تم بشري متجدد ( ‎Clinical Trials‏ ‎(Laboratory Services 5‏ بواسطة طرد 1: 2 من الدم المخفف مركزيًا في 13 ملليلتر من
1300 ‏بمعدل‎ Ficoll-Paque Plus (GE healthcare life sciences, 17-1440-02(
لفة في الدقية لمدة 30 دقيقة. تم ‎CD14 Jie‏ + خلايا أحادية النواة باستخدام كريات ‎CD14‏
دقيقة بشرية ‎Gag )201-050-130 Miltenyi)‏ لبروتوكول القائم على التشغيل. تم استنبات
خلايا أحادية النواة معزولة في ‎(RPMI 1640 (life technologies‏ 093-11875( مضاف
0 إليها 2 مللي مولار من ا-جلوتامين (511-003 ‎(GE Healthcare:‏ 1 مللي مولار من بيروفات الصوديوم ‎«(GE Healthcare: P11-010)‏ 1 مللي مولار من أحماض أمينية غير أساسية ‎A 1 (GE Healthcare: M11-004)‏ مولار من ‎pen/strep (GE‏ ‎Healthcare: P11-010)‏ و9610 ‎SV30160.03) 500 «FBS (Thermo fisher‏ وحدة/ملليلتر من ‎—IL-050)204 IL-4 (R&D Systems‏ 5 800 وحدة/ملليلتر من ‎GM-‏
‎«CSF (R&D Systems 5‏ 050(215-/1©-. تمت تغذية المستنبتات كل يومين بواسطة استبدال نصف المستنبت بوسط جديد. تم إنضاج الخلايا الشجرية المشتقة من خلية أحادية النواة في اليوم 5 من المستنبت بإضافة 1 ميكرو جرام/ملليلتر ‎L2654) (LPS (Sigma-Aldrich‏ لمدة 24 ساعة. تم استخدام الخلايا لتجرية ‎MLR‏ في اليوم 6.
‏0 "تم عزل خلايا ‎١‏ 604 من ‎PBMCs‏ (تم عزلها على النحو الموصوف أعلاه) باستخدام طقم ‎Jie‏ ‏خلية ‎T‏ +604 بشرية ‎Gg )533-096-130 Miltenyi)‏ لبروتوكول القائم على التصنيع. تم استخدام ‎T LDA‏ +004 المعزولة في ‎AMLR‏ يوم العزل. بالنسبة ل ‎MLR‏ تم خلط 1 ‎x‏ 10 5 من خلية ‎T‏ +0104 معزولة لكل عين مع 2 »* 10 4الخلايا الشجرية التي تم إنضاجها ب ‎LPS‏ المشتقة من خلية أحادية النواة ثم تمت إضافة إما
جسم مضاد ل 010-11 مستخدم كعينة مقارنة موجبة (5ميكرو جرام/ملليلتر» ‎Biolegend‏ ‏6) أو 20 ميكرو لتر من مواد طافية مركزة (محضرة أعلاه) إلى آبار الاختبار. تم تحضين ‎MLR‏ لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية. تمت إزالة المواد الطافية من الطبق؛ وتنقيتها ثم تم اختبارها للسيتوكين ‎IL-2‏ بواسطة ‎(ELISA‏ باختصار؛ تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ ب ‎IL-2 mAb‏ بشري ‎(MABGO2 (R&D Systems)‏ في فترة وجيزة عند 4 درجة مئوية. تم ‎Jud‏ الأطباق ثلاث مرات باستخدام ‎PBS‏ ثم تم إيقاف نشاطها باستخدام ‎Tween‏ 85/39685//0.0596ط لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضير منحنى 2-اا قياسي من بروتين 2-اا ناتج عن عودة الارتباط الجيني ‎(R&D Systems)‏ 050202-ا-) في نطاق يتراوح من 2000بيكو جرام/ملليلتر إلى 31.3 بيكو جرام/ملليلتر. تم تحضير عينات ‎MLR‏ بواسطة تخفيف مواد طافية 0 تقية محضرة أعلاه في بنسبة 1 إلى 4 في ‎Tween20‏ 085/39685//0.0596. تمت إضافة العينات والمعايير بمعدل 50 ميكرو لتر/عين إلى أطباق ‎ELISA‏ لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة ثم تم غسلها ثلاث مرات باستخدام ‎PBS/0.05% Tween20‏ قبل إضافة جسم مضاد مستخدم في الكشف مضاد ل ‎IL-2‏ بشري معالج بالبيوتينيل ‎.(BAF202 (R&D Systems)‏ بعد ساعة واحدة تم غسل طبق التحضين ثلاث مرات أخرى باستخدام ‎PBS/0.05%‏ ‎Tween20 5‏ وتمت إضافة مخفف بنسبة 1: 200 من ستريتافيدين ‎«HRP (R&D Systems—‏ (07998 لمدة ساعة. تم إنماء الطبق بإضافة 50 ميكرو لتر من 1--11/8 ‎Step Ultra‏ ‎«ELISA Substrate Solution (thermo‏ 34028(. بعد 20 دقيقة تم إيقاف التفاعل بإضافة 0 ميكرو لتر من 1 مولار من ‎HCL‏ وتم قياس الامتصاص عند 450 نانو متر. بالنسبة لمجموعتي منح خلايا ‎DC: ١1‏ مختلفتين من تجارب مستقلة؛ فإنه يمكن الكشف عن استجابات 0 الخلية آ 0004 المحسنة؛ في ضوء التعبير الوراثي المتزايد عن ‎algal (IL-2‏ طافية لمستنبت تم نقل العدوى إليها ب 816-190 وليس ب 816-165 (الشكل 148 و48ب). على نحو مماثل؛ تم أيضًا تحسين استجابات الخلية ‎T‏ 004 لمواد طافية لمستنبت تم نقل العدوى إليها ب 816-177 وليس ب 806-135 (الشكل 49ج). يظهر استخدام هذه البيانات ‎le‏ أنه يتم إنتاج جسم مضاد ل ‎PD-L1‏ وظيفي في سياق نقل العدوى إلى الخلية بورم لكل من الفيروسات المسلحة ب 816-190 ‎NG-1775 5‏
ارتباط مركب 00-11 ترابطي خلوي تم تقييم نشاط ارتباط مضاد 10-11 للجسم المضاد المُعبر عنه وراثيًا منخلايا تم نقل ‎goal)‏ ‏إليها ب 16-177 لقدرتها على الارتباط مباشرةً بمركب 50-11 ترابطي غير ناتج عن عودة الارتباط الجيني مُعبر عنه ‎Wh‏ في بيئة غشائية على سطح ‎WIA‏ كارسينوما الرئة ‎(A549)‏
تم إما تحفيز خلايا ‎A549‏ باستخدام 50 نانو جرام/ملليلتر من ‎IFNy‏ بشري لتعزيز الزيادة المتحكم فيها في التعبير الوراثي عن 0-1-1 على سطح الخلية أو تركها بدون تحفيز. بعد 24 ساعة تمت معالجة ‎WAY‏ بالترربسين وتحضينها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجة مئوية باستخدام الأوساط فقطء أو 50 ميكرو لتر من ‎sale‏ طافية للخلية تم نقل العدوى إليها بواسطة ‎NG=177‏ أو 16-5 (محضر أعلاه). تم غسل ‎WAY‏ مرتين باستخدام ‎BSA‏ 585/196 قبل التحضين
لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مثوية باستخدام 50 ميكرو لتر من ‎IgG‏ ماعزي ضد بشري مرقم ب ‎A11013) Alexa—fluor 488 (H+L) (LifeTechnologies‏ مذاب بنسبة 1 إلى 250. تم غسل الخلايا مرة أخرى» وإعادة تعليقها في ‎BSA‏ 085/196 وتم تحليلها باستخدام مقياس خلايا بؤري ‎(Life Technologies) isa‏ 800006. يمكن الكشف عن نشاط ارتباط ‎«PD-L1‏ ‏المماثل لارتباط جسم مضاد ل 10-11 مستخدم كعينة مقارنة مرقم ب ‎PE‏ (2/329. من
5 8:0169800)؛ في مواد طافية 806-177 ولكن لم يتم الكشف ‎die‏ في مواد طافية لفيروس ‎NG-135‏ مستخدم في عينة مقارنة (الشكل 50). المثال 29: إنتاج وتمييز فيروسات 50/0 مُشفرة لأجسام مضادة لبروتين مسار مثبط نقطة فحص ‎CTLA-4 (NG-242)‏ تم استخدام البلازميد ‎pENAD2.4‏ لتوليد البلازميد ‎pPNG-242‏ (متوالية رقم: 58( بواسطة
0 الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل مُشفرة لجسم مضاد ل 8-4ا01 (11.2.1) في مواضع التقييد الفريدة موجودة بين الجينات ‎LS‏ و4. تقوم مجموعة الجين الناقل ‎PNG-242‏ بتشفير جسم مضاد ل ‎CTLA-4‏ بواسطة تضمين متوالية مضاد 0118-4 ذات سلسلة ثقيلة متغيرة (متوالية رقم: 70)؛ متوالية جسم مضاد ذات سلسلة ثقيلة ثابتة (متوالية رقم: 33(« متوالية مدخل رببوسوم داخلي (متوالية رقم: 19( متوالية مضاد 0118-4 ذات سلسلة خفيفة متغيرة (متوالية
رقم 1 7( ومتوالية جسم مضاد ذات سلسلة خفيفة ثابتة (متوالية رقم :5 3( . تم توضيح مخطط لمجموعات جين ناقل تم إدخالها في الشكل 34. تم تأكيد إنشاء البلازميد بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏إنتاج الفيروس تم تضخيم الفيروس 16-2 وتنقيته ‎Lg‏ للطرق المستخدمة لتنقية فيروس 16-5 المذكورة بالتفصيل في المثال 8. تمييز الفيروس تمت مقارنة النشاط الحال للورم ‎NG=242‏ (تم تقييمه بواسطة تجربة قدرة الخلايا على البقاء حية) والتعبير الوراثى عن جسم مضاد ل 6118-4 (تم تقييمه بواسطة ‎(ELISA‏ في خلايا كارسينوما 0 القولون إما ب فيروس 50/0 مرجعي أو فيروس 806-135 مرجعي الذي يعبر وراثيًا عن جسم مضاد ل ‎VEGF‏ لتقييم الفاعلية الحالة للورم ‎Lyles‏ 50/0 تم إجراء تجرية قدرة الخلايا على ‎ola)‏ حية ‎Udy‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 15. أظهر الفيروس 16-242 فاعلية مماثلة تجاه المادة المرجعية ‎ENA‏ المُصنعة (الشكل 51أ). لتقييم التعبير الوراثي عن جسم مضاد؛ تم استزراع خلايا 11-29 في أطباق مزرعة بها 12 عين 5 بكتافة تبلغ 1 ‎x‏ 10 6 خلية/عين وبعد الالتصاق تم نقل العدوى إليها بواسطة 100 جسيم لكل خلية من ‎NG-242 (EnAd‏ أو ‎.NG=135‏ تم تخفيف مواد نقل العدوى الطافية التى تم تجميعها بعد 24؛ 48 أو بعد 72 ساعة من نقل العدوى فى 85/8/0.0596 ‎PBS/3%‏ ‎Tween 0‏ ثم تم اختبارها بواسطة ‎ELISA‏ لمضاد ‎IgG]‏ بشري وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحديد تركيز جسم مضاد في العينات بواسطة الاستكمال المنحنى القياسي 0 لتجرية وأظهر أنه يتم إفراز جسم مضاد يمكن الكشف عنه يتم من خلايا تم نقل العدوى إليها ب 16-2 عند مستويات مماثلة لفيروس 16-5 المقارن (الشكل 51<( . اختبار الارتباط المباشر 1 ‎CTLA-4‏
تم تقييم نشاط ارتباط مضاد 6118-4 لجسم مضاد مُعبر عنه وراثيًا من ‎WIA‏ تم نقل العدوى إليها ب ‎NG-242‏ بواسطة ‎ELISA‏ للارتباط المباشر ب ‎CTLA-4‏ ‏تم نقل العدودإلى خلايا ‎A549‏ لمدة 72 ساعة باستخدام 100 جسيم لكل خلية من فيروس -6لا 2 أو 16-165 مستخدم في عينة مقارنة؛ الذي يعبر وراثيًا عن الجسم المضاد ‎IgG]‏ ‏5 المضاد ل ‎VEGF‏ تم تجميع مواد طافية لمستنبت وتركيزها حتى 300 ‎sad aha‏ 5 دقائق لإزالة
بواقي الخلايا. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ ب ‎CTLA4-Fe‏ ناتج عن عودة الارتباط الجيني )0.5 ميكرو جرام/ملليلتر» ‎(R&D Systems‏ 01-200325-) في فترة وجيزة عند 4 درجة مئوية. تم غسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام ‎Tween20‏ 085/0.0596 ثم تم إيقاف نشاطها باستخدام ‎Tween20‏ 085/39685//0.0596. تم تحضير مخففات تتابعية مزدوجة من المواد الطافية
0 المركزة في ‎PBS/3%BSA/0.05% Tween20‏ بنسبة تتراوح بين 1 إلى 2 و1 إلى 2048 ثم تمت إضافتها إلى طبق ‎ELISA‏ وتحضينها لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك تمت معالجة ‎ELISA‏ المذكور وفقًا للطرق الخاصة بالكشف عن ارتباط 00-11 المذكورة بالتفصيل في المثال 28. يمكن الكشف عن نشاط ارتباط مضاد 6118-4 نوعيًا في المواد الطافية لخلايا تم نقل العدوى إليها ب 16-242 ولكن ليس خلايا 8549 تم نقل العدوى إليها ب 16-165
(لشكل 51ج). تجرية تثبيط ارتباط مستقبل ‎CTLA-4‏ ‏تم تقييم نشاط تثبيط جسم مضاد ل 6118-4 مُعبر عنه وراثيًا في المادة الطافية لخلايا تم نقل العدوى إليها ب 806-242 في تجرية تفاعل مركب 6118-4 ترابطي: مستقبل 87-1. تم تجميع مواد طافية لمستنبت من ‎LA‏ تم نقل العدوى إليها ب 116-242 موصوفة ‎hel‏
0 وتركيزها وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 28. تم تغليف أطباق ‎ELISA‏ ب ‎CTLA4-Fc‏ ‏)2 ميكرو جرام/ملليلتر» ‎(R&D Systems‏ 01-200325-) في فترة وجيزة عند 4 درجة مئوية. تم غسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام ‎PBS‏ ثم تم إيقاف نشاطها باستخدام ‎saad PBS/3%BSA/0.05% Tween 0‏ 1 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحضير مخففات تتابعية مزدوجة من المواد الطافية المركزة في ‎PBS‏ ثم تمت إضافة 45 ميكرو لتر من
كل مخفف إلى طبق ‎(ELISA‏ تمت إضافة 10 نانو ‎aha‏ من ‎BT-1-FC‏ ناتج عن عودة الارتباط الجيني ‎(R&D Systems)‏ 81-100140-) إلى كل عين وتم تحضين الطبق لمدة ساعة. بعد ذلك تم ‎Jud‏ جميع العيون ثلاث مرات باستخدام ‎Tween20‏ 085/0.0596 ثم تم إيقاف نشاطها لمدة 10 دقائق باستخدام ‎Tween20‏ 085/39685//0.0596. تمت إضافة 2 ميكرو جرام/ملليلتر من جسم مضاد ل 87-1 بشري معالج بالبيوتينيل ‎«R&D Systems)‏ 2-//8) وتم تحضين الطبق لمدة ساعة. تم إجراء ثلاث عمليات غسل بمخفف بنسبة 1: 0 من ستريتافيدين ‎(HRP (R&D Systems—‏ (07998. تم إنماء الطبق بإضافة 50 ميكرو لتر من ‎«Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (thermo-1‏ 34028). بعد 0 دقيقة تم إيقاف التفاعل بإضافة 50 ميكرو لتر من 1 مولار من ‎HO‏ وتم قياس الامتصاص 0 عند 450 نانو متر. تم تحليل النتائج بواسطة قسمة إمتصاص العينة على ذلك الخاص بعينة المقارنة (بدون مثبط اختبار) وضربه في 100 لتحديد النسبة المئوية لأقصى تقييد ب 87-1. يكون جسم مضاد ل ‎CTLA=4‏ يتم إفرازه من ‎WIA‏ تم نقل العدوى إليها ب 816-242 قادر أيضًا على تثبيط ارتباط مستقبل 87-1 (الشكل 51( المثال 30: إنتاج وتمييز فيروسات 50/0 مُشفرة لمولدات ضد مصاحبة للورم ‎(TAAS) (NG-‏ ‎NG-220) 217 5‏ تم استخدام البلازميد ‎PENAD2.4‏ (متوالية رقم: 64( لتوليد البلازميدات ‎PNG-217‏ (متوالية رقم: 57(« ‎PNG—220‏ (متوالية رقم: 56( بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل مُشفرة لمولد ضد مصاحب للورم؛ ‎NY-ESO-1‏ في مواضع التقييد الفريدة موجودة بين الجينات ‎LS‏ ‎.E4‏ تقوم مجموعة الجين الناقل ‎pPNG-217‏ بتشفير جين ‎NY-ESO-1‏ (متوالية رقم: 43( 0 محاط بمتوالية معزز ‎CMV‏ (متوالية رقم: 13) ومتوالية ‎Ou‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات عند الطرف 3" (متوالية رقم: 20). تقوم مجموعة الجين الناقل ‎pPNG=220‏ بتشفير جين ‎NY-ESO-1‏ محاط بمتوالية معزز ‎PGK‏ (متوالية رقم: 14) ومتوالية ‎Ju‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات عند الطرف 3” (متوالية رقم: 20). تم توضيح مخططات مجموعات جين ناقل تم إدخالها في الشكل 34. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏5 إنتاج الفيروس
تم تضخيم الفيروسات 116-217 3 ‎NG-220‏ وتنقيتها وفقًا للطرق المستخدمة لتنقية فيروس ‎NG-135‏ المذكورة بالتفصيل في المثال 8. تمييز الفيروس تمت مقارنة استنساخ الفيروس 16-220 9 ‎NG=217‏ (تم تقييمه بواسطة ‎(QPCR‏ والتعبير الوراثي عن الجين الناقل ‎NY-ESO-1‏ 116-220 في ‎WIA‏ كارسينوما القولون (تم تقييمه بواسطة ‎das‏ ويسترن) ب 50/80. لتقييم استنساخ الفيروس تم استزراع خلايا ‎١17-29‏ في أطباق مزرعة بها 12 عين بكثافة تبلغ 1 * 10 6 خلية/عين وبعد الالتصاق تم نقل العدوى إليها بواسطة 100 جسيم لكل خلية من ‎NG-220 EnAd‏ أو ‎NG-217‏ بالنسبة ل ‎«qPCR‏ تم تجميع ال ‎DNA‏ بعد 24 أو 48 من نقل العدوى من كل من نواتج تحلل الخلايا والمواد الطافية ‎Gy 0‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحليل عينات ال ‎DNA‏ المستخلصة بواسطة ‎qPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎Gay ENA E3‏ للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. كان إجمالي مجموعات العوامل الوراثية للفيروس التي تم الكشف عنها بواسطة 16-0 (الشكل 152( أو 16-217 (الشكل 52ب) لفيروس 50/0 المرجعي. لتقييم بقعة ويسترن للتعبير ‎hs)‏ عن ‎(NY-ESO-1‏ تم استزراع خلايا 111-29 في أطباق 5 مززرعة تحتوي على 6 ‎(ge‏ بكتثافة تبلغ 4 ‎x‏ 10 6 خلية/عين وتم تحضينها لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية؛ 965 002. بعد ذلك تم نقل العدوى إلى الخلايا لمدة 48 أو 72 ساعة باستخدام 100 جسيم من فيروس ‎NG=220‏ أو 50/80 لكل خلية. تمت إزالة الأوساط من العيون وتم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام ‎PBS‏ قبل التحلل في 250 ميكرو لتر من محلول منظم لحل الخلايا )150 مللي مولار ‎A 50 SDS 960.5 «Triton 26-100 961 «NaCl‏ مولار 0 105-110 (رقم هيدروجيني يبلغ 7.5)) يحتوي على خليط مثبط مضاد للبروتياز ‎١١١‏ ‎(Calbiochem: 539134)‏ تم علاج نواتج التحلل باستخدام بنزوناز لتحلل ‎Jala DNA‏ لمجموعة العوامل الوراثية وتم تخفيفها أيضًا بنسبة 1: 4 في محلول منظم لحل الخلايا يحتوي على محلول ‎NUPAGE‏ منظم لعينة ‎LDS‏ وعامل الاختزال ‎.NUPAGE (Life Technologies)‏ تم تسخين العينات لمدة 10 3183( عند 70 درجة مئوية قبل إجراء ‎SDS-PAGE‏ باستخدام 4- 5 %12 أنواع الهلام ‎Gag 819-1115 NUPAGE (Life Technologies)‏ لبروتوكول القائم على
التصنيع. تم نقل البروتينات على أغشية ‎PVDF‏ بواسطة بقعة ويسترن باستخدام ‎Xcell ١١ Blot‏ ‎.Module (Life Technologies)‏ تم إجراء إيقاف النشاط والتبقيع المناعي في 0.196 ‎PBS‏ ‎Tween-20‏ مُضاف إليه 965 مسحوق حليب وتم إجراء جميع خطوات الغسل في ‎PBS‏ ‎Tween-20‏ 0.196. تم الكشف عن ‎NY-ESO-1‏ باستخدام جسم مضاد فأري أحادي النسيلة مضاد لذ ‎NY-ESO-1‏ (3ميكرو جرام/ملليلتر) وتم الكشف عن جسم مضاد ثانوي باستخدام 196-14 مأخوذ من الماعز والمضاد للفئران. تمت رؤية البروتينات بواسطة التألق الكيميائي المحسن. كان التعبير الوراثي عن ‎NY-ESO-1‏ قابل للكشف بعد 48 و72 ساعة من نقل العدوى ب ‎NG-220‏ وليس عينة المقارنة 0/80 (الشكل 52ب). المتال 31: بناء بلازميد إنشاء نسائل من ‎(PENAD2.4 (EnAd‏ لإدخال مجموعات جين ناقل 0 بعد جين ‎LS‏ ألياف. تم الحصول على البلازميد 050/02.4 (متوالية رقم: 64) بواسطة ‎sale)‏ الاتحاد الجيني المتجانس بين ناقل مكوكي» ‎pENA2.4 Shuttle‏ ومجموعة العوامل الوراثية ل 0/0. يحتوي بلازميد 0802.4 على مصدر ‎PISA‏ بكتيري للاستنساخ؛ جين مقاومة كاناميسين ومجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ مع مواضع تقييد فريدة يتم إدخالها في المنطقة ‎BY‏ ‏5 يكون بناء بلازميد 00010/802.4 كما يلي. تم ‎Wane‏ بناء -12 كيلو قاعدة من بلازميد مكوكي؛ ‎(pColoAd] Shuttle‏ بحيث يتم إدخال مواضع تقييد فريدة في منطقة الجين ‎abil‏ 5ا؛ لمجموعة العوامل الوراثية ل 50/0 (المنطقة ‎(BY‏ تم تضخيم الأطراف 5” (نوكليوتيد 4632-1) 3" (نوكليوتيد 32326-27837) ل ‎ENA‏ من ‎de sane‏ العوامل الوراثية ل 0/0 بواسطة ‎PCR‏ باستخدام البادئ 5" - ‎TTGGCGGCGCGCCTATCTATATAATATACC-3‏ ] 0 متوالية رقم: 80[ والبادئات ‎"AATGCAAATCTGTGAGGGG-3-"5‏ [ متوالية رقم: 82] أو ‎'CTTAGTGGTGTTGTGGTATTGG-3 - 5‏ [ متوالية رقم: 53] على التوالي. يحتوي الذراع 5 لمنتج ‎PCR‏ على موقع ا8506 يتم إدخاله عند الطرف 5" وموقع ‎PSpOMI‏ عند الطرف 3 مناظر للموقع ‎PSPOMI‏ عند النوكليوتيد 4626 في مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80. يحتوي الذراع 3" لمنتج ‎PCR‏ على موقع ‎PSPOMI‏ عند الطرف 5" مناظر للموقع ‎PSpOMI‏ ‏5 عند النوكليوتيد 27837 في مجموعة العوامل الوراثية 1 0/0 وموقع ‎AsCl‏ تم إدخاله عند
الطرف 3”. تم اهتضام منتجات ‎PCR‏ بالتقييد باستخدام ‎Ascl/PsSpOMI‏ وتم إلحاقها بوصلة ثلاثية المسالك من خطوة واحدة في بلازميد تم جعله خطيًا ‎ASC‏ يحتوي على مصدر ‎PISA‏ ‏للاستنساخ ومجموعة مقاومة كاناميسين. تولد عن ذلك بلازميد 080/0 مكوكي. تم تخليق شظية ‎DNA‏ مناظرة لمنطقة مجموعة العوامل الوراثية ل ‎ENA‏ محاطة بمواضع تقييد ‎Acll 3 PSpOMI‏ وتحتوي على الجين المتأخرء 5اء (نوكليوتيد 30060-27837( باستخدام منطقة مضافة ل 19 زوج قاعدة 5- ‎"GCGATCGCTACCCTGCAGG-3‏ [ متوالية رقم: 90] يتم إدخالها غند موضع مناظر لنوكليوتيد 29356 ل 0/80 في المنطقة ‎(By‏ تتضمن هذه المنطقة الإضافية مواضع تقبيد لاثنين من الإنزيمات غير الموجودة في مجموعة العوامل الوراثية ل 0/80 ‎((CCTGCAGG y GCGATCGC)‏ ويمكن يتم قطعها بواسطة ‎Sgfl‏ و5011. يتم اهتضام ‎DNA 0‏ شظية المخلقة بالتقييد باستخدام إنزيمات ‎PSPOMI‏ وا201 وبتم إنشاء نسائل منها في المنطقة المناظرة في بلازميد 00010801 مكوكي مهتضم ب 05001/1//011 لتكوين بلازميد 4 مكوكي. للحصول على بلازميد 00010/02.4 بواسطة ‎sale)‏ الاتحاد الجيني المتجانس؛ تم جعل بلازميد ‎pCOIOAD2.4‏ مكوكي خطيًا بواسطة الاهتضام بالتقييد بواسطة الإنزيم ‎PSPOMI‏ ومعالجته باستخدام فوسفاتاز القلوي لإزالة مركبات الفوسفات عند الطرف 5”. تم 5 تحويل بلازميد تم جعله ‎ha‏ ومجموعة العوامل الوراثية ل 50/0 بشكل مشترك إلى خلايا 3 بواسطة التوصيل الكهربائي وفقًا لبروتوكول القائم على التصنيع وتم تحديد توليد بلازميد 4 بواسطة إعادة الاتحاد الجيني المتجانس بواسطة الاهتضام بالتقييد. تم تأكيد إنشاء جميع البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏المتال 32: ‎Galas‏ بلازميد إنشاء نسائل من ‎pColoAd2.6 (EnAd‏ لإدخال مجموعات جين 0 تاقل قبل أو بعد جين ‎LS‏ ألياف. تم توليد بلازميد ‎pPNG-185) pCoIOAd2.6‏ متوالية رقم: 65( بواسطة طريقة تجميع مقطع جين تخليقي بواسطة ‎(La Jolla‏ 8ل01-ا56؛ ‎«CA‏ (5/8لا. تم تأكيد الإنشاء الصحيح للبلازميد بواسطة عمل متواليات من جين تالي ‎(SGI-DNA)‏ يحتوي بلازميد 0116-1855 على مصدر 58م بكتيري للاستنساخ؛ جين مقاومة كاناميسين ومجموعة العوامل الوراثية ل 50/80 مع 5 مواضع تقييد فريدة يتم إدخالها في المناطق ‎BY 3 BX‏
إنتاج الفيروس تم تضخيم الفيروس 16-185 وتنقيته وفقًا للطرق المستخدمة لتنقية فيروس 16-135 المذكورة بالتفصيل في المثال 8. تمييز الفيروس تمت مقارنة النشاط الحال للورم 06-185 (تم تقييمه بواسطة تجرية قدرة الخلايا على البقاء حية) واستنساخ الفيروس (تم تقييمه بواسطة ‎EnAd = (0 PCR‏ مرجعى. لتقييم الفاعلية الحالة للورم ‎lie‏ ب ‎ENA‏ تم إجراء تجربة قدرة الخلايا على البقاء حية وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 15. أظهر فيروس ‎NG=185‏ نشاط حال للورم مماثل تجاه 50/80 (الشكل 53أ). لتقييم استنساخ الفيروس؛ تم استزراع خلايا 117-29 في أطباق مزرعة بها 12 عين بكثافة تبلغ 1 0 ”610 خلية/عين وبعد الالتصاق تم نقل العدوى إليها بواسطة 100 جسيم لكل خلية من ‎<EnAd‏ أو ‎dually .NG-185‏ ل ‎«qPCR‏ تم تجميع ال ‎DNA‏ بعد 48 أو بعد 72 ساعة من نقل العدوى من كل من نواتج تحلل الخلايا والمواد الطافية وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 18. تم تحليل عينات ال ‎DNA‏ المستخلصة بواسطة ‎QPCR‏ باستخدام مجموعة مجس بادئ نوعية لجين ‎ENA E3‏ وفقًا للطرق المذكورة بالتفصيل في المثال 9. كان ‎Saal‏ ‏5 مجموعات العوامل الوراثية للفيروس التي تم الكشف عنها ل 16-185 (الشكل 53ب) ‎Alles‏ ‏لفيروس ‎EnAd‏ مرجعي خلال ‎Jas‏ العدويى بالكامل . المثال 33: إنتاج فيروسات 0/0ح البلازميد ‎pColoAd2.6 (PNG-185)‏ تم استخدام بلازميد 0/02.6ع0 (متوالية رقم: 65)؛ لتوليد البلازميدات ‎pPNG-257‏ و-قلام 1 بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات جين ناقل في مواضع تقييد ‎PENAA2.6‏ فريدة موجودة فى المناطق ‎BY, BX‏ . تحتوي ‎pNG-257‏ على مجموعة جين ‎Jal‏ مُشفرة ل ‎ScFv‏ مضاد ل ‎VEGF‏ (متوالية رقم: 36) بها بطاقات ببتيد هستيدين عند الطرف © (متوالية رقم: 23(¢ محاطقة ب ‎BSA‏ عند الطرف 5” (متوالية رقم: 18) ومتوالية ‎Poly(A)‏ عند الطرف 3” (متوالية رقم:. 20( يتم إدخالها في المنطقة ‎BX‏ تحتوي 016-281 على مجموعات جين ناقل مُشفرة ل ‎ScFv‏ ‏مضاد ل ‎VEGF‏ (متوالية رقم: 36) بها بطاقات ببتيد هستيدين عند الطرف © (متوالية ‎tad)‏ 23)؛
محاطة ب ‎BSA‏ عند الطرف 75 (متوالية رقم: 18( ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 73 (متوالية رقم: 20( تم إدخالها في المنطقة ‎BX‏ و8 مجموعة جين ناقل ثانية مُشفرة ل ‎ScFV‏ مضاد ‎PD—‏ ‎L1‏ (متوالية رقم: 37( بها بطاقة ‎V5‏ (متوالية رقم: 24( محاطة ب 55/8 عند الطرف 5 (متوالية رقم: 16) ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3" (متوالية رقم: 20) يتم إدخالها في منطقة ‎BY‏ تم توضيح مخططات مجموعات الجين الناقل المنشأة في بلازميدات 016-257 3 ‎PNG-281‏ في الشكل 54. تم ‎ash‏ إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ تحتوي البلازميدات المذكورة على مجموعات العوامل الوراثية للفيروس 0/0 المتمثلة في ‎NG-257‏ (متوالية رقم: 72( 16-281 (متوالية رقم: 73). المثال 34: إنتاج صور متغيرة للجسم المضاد 50617 متعددة تعبر ‎Gilg‏ عن فيروسات ‎EnAd‏ ‏0 تتم استخدام البلازميد ‎PENAD2.4‏ (متوالية رقم: 64) لتوليد البلازميد ‎PNG-272‏ بواسطة الإدخال المباشر لمجموعة مُشفرة ‎ScFv J‏ مضاد 1 ‎alas ScFv 3 VEGF‏ 010-11 في مواضع التقييد الفريدة الموجودة بين الجينات 5ا ‎E45‏ (المنطقة ‎(BY‏ تقوم مجموعة الجين الناقل -6لام 2 بتشفير ‎50-١7‏ مضاد ‎PD-L1‏ و7١50‏ مضاد ل ‎VEGF‏ بواسطة تضمين متوالية ‎ScFv‏ ‏مضاد 010-11 (متوالية رقم: 37)؛ متوالية ببتيد ‎P2A‏ ذو فاعلية انشطار ذاتي عالية (متوالية 5 رقم: 25(« متوالية ‎SCFV‏ مضاد ل ‎VEGF‏ (متوالية رقم 36( ومتوالية ‎Jul‏ بِعَدِيدٍ الأدينيلات عند الطرف 73 (متوالية رقم: 20). يتم توضيح مخططات مجموعات جين ناقل تم إدخالها في الشكل 4. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎DNA‏ ‏إنتاج الفيروس تم تضخيم الفيروس 816-272 (متوالية رقم: 69) وتنقيته وفقًا للطرق المستخدمة لتنقية فيروس 0 06-135 المذكورة بالتفصيل في المثال 6. المتال 35: إنتاج فيروسات ‎EnAd‏ مُشفرة للبروتين العابر للغشاء؛ مُرَاجل الصوديوم/اليوديد ‎(NIS)‏ ‏تم استخدام البلازميد ‎PENA2.4‏ (متوالية رقم: 64) لتوليد البلازميد ‎PNG-280‏ بواسطة الإدخال المباشر لمجموعة جين ناقل مُشفرة ‎Jabal‏ يوديد الصوديوم ‎sodium iodide‏
‎symporter (NIS)‏ في المنطقة ‎(BY‏ تحتوي مجموعة 016-280 على ‎SSA‏ عند الطرف 5" (متوالية رقم: 16)؛ متوالية ‎cDNA‏ ل ‎NIS‏ (متوالية رقم: 67( ومتوالية ‎poly(A)‏ عند الطرف 3 (متوالية رقم: 20( وتشفر مجموعة عوامل وراثية للفيروس 86-280 (متوالية رقم: 68). يتم توضيح مخططات مجموعات جين ناقل تم إدخالها في الشكل 54. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل المتواليات.
المثال 36: إنتاج فيروسات ‎ENA‏ تعبر ‎Gilg‏ عن ‎ShRNAs‏ ‏تم استخدام البلازميد 050/802.4 (متوالية رقم: 64) لتوليد البلازميدات ‎pPNG-sh(0]‏ و-6لام 2 بواسطة الإدخال المباشر لمجموعات تشفر على التوالى إما ‎ShRNA‏ للبروتين ‎«GAPDH‏ ‏أو ‎shRNA‏ كعينة مقارنة لا يُشارك المتوالية مع أي جين بشري . تحتوي ‎pNG-sh( 1 de gana‏
0 على معزز 6لا ‎RNA hadi‏ بشري ‎[Il RNA polymerase Ill promoter‏ « ومتوالية ‎ShRNA‏ تحتوي على: متوالية مضادة لاتجاه النسخ تحتوي على 29 نوكليوتيد» متوالية حلقية؛ متوالية في اتجاه النسخ تحتوي على 29 نوكليوتيد ومتوالية 3 111111. تم توضيح مخططات مجموعات جين ناقل تم إدخالها في الشكل 54. تم تأكيد إنشاء البلازميدات بواسطة عمل متواليات من ‎.DNA‏
5 إنتاج وتمييز الفيروس تم تضحيم الفيروسات 1 ‎NG-sh()‏ (متوالية رقم : 66( ; ‎NG-sh(Q2‏ وتنقيتها ‎Gg‏ للطرق المستخدمة لتنقية الفيروس 816-135 المذكورة بالتفصيل في المثال 8. يتم تقليل التعبير الوراثي عن ‎GAPDH‏ في سلالات خلية بشرية في الخلايا ‎Al‏ يتم علاجها ب 16-5101 وليس الخلايا التى يتم علاجها ب ‎NG-sh02‏

Claims (1)

  1. عناصر الحماية 1- فيروس غدي مؤهل للنسخ ‎replication competent adenovirus‏ من المجموعة ‎B‏ ‏الحالة للورم يشتمل على متوالية لها الصيغة ‎(I)‏ ‏+81-311-ب83-8-«8-+5-8- 5114-8 حيث: تشتمل الأعلى: م1 218 ‎SJ‏ 8-818م1؛ تشتمل على ‎¢(E2B-L1-L2-L3-E2A-L4-‏ ‏تكون 2 عبارة عن رابطة أو تشتمل على: ‎(E3‏ ‏تكون *لعبارة عن رابطة أو متوالية ‎DNA‏ تشتمل على: موضع تقييد؛ واحد أو أكثر من الجينات الناقلة18050©065 أو كلاهما؛ 0 تشتمل ‎Be‏ 5ا؛ تشتمل ‎BY‏ على مجموعة جين ‎transgene cassette LU‏ تشتمل على جين ‎transgene ib‏ ومتوالية مستقبل ‎splice acceptor Jas‏ ؛ و تكون 3لأعبارة عن ‎dl)‏ أو تشتمل على: 54؛ حيث تكون مجموعة الجين الناقل ‎transgene cassette‏ في ظل تحكم معزز داخلي يتم اختياره من المجموعة التي تتألف من 54 ومعزز متأخر ‎Cuag major late promoter ui)‏ تشتمل مجموعة الجين ‎transgene cassette Jill‏ على مادة مشفرة لجين علاجي ‎therapeutic‏ ‏6 يتم اختيارها من المجموعة التي تتألف من متوالية ‎RNAI‏ ؛ جسم مضاد أو شظية ارتباط منه؛ كيموكينات ‎chemokines‏ ؛ ‎cytokinesis giv‏ ¢ عامل معدّل ‎immunomodulator eli‏ وإنزيمات 602/0165 . 0 2- فيروس غدي مؤهل للنسخ ‎Gay replication competent adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 حيث يكون المعزز عبارة عن معزز متأخر رئيسي. 3- فيروس غدي مؤهل للنسخ ‎Gd, replication competent adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث تشتمل ‎Wad By‏ على المتوالية الموضحة في متوالية رقم: 11 أو متوالية ‎DNA‏ يتم تهجينها له في ظل ظروف صارمة.
    4— فيروس غدي مؤهل للنسخ ‎Gd, replication competent adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يتم اختيار مستقبل الجدل ‎splice acceptor‏ من ‎(CAGG‏ متوالية رقم: 17 و متوالية رقم: 18 5- فيروس غدي مؤهل للنسخ ‎Gay replication competent adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2 ‎Gua‏ تشتمل مجموعة الجين الناقل ‎transgene cassette‏ كذلك على متوالية مدخل ‎ribosomes gus,‏ داخلي أو ببتيد ‎A2‏ ذو فاعلية انشطار ذاتي عالية. 6- فيروس غدي مؤهل للنسخ ‎Gd, replication competent adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يشتمل الجين الناقل كذلك على متوالية ‎Kozak‏ ‏7- فيروس غدي ‎Gig adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ ‎Cua‏ تشتمل ‎de gene‏ الجين ‏10 النناقل ‎transgene cassette‏ كذلك على متوالية تَذَبِيلَ بِعَدِيدٍ الأدينيلات ‎polyadenylation‏ . 8- فيروس غدي ‎ki adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ ‎Cua‏ تشتمل ‎de gene‏ الجين ‎Jal‏ كذلك على موضع تقييد عند الطرف 3 لمتوالية ‎DNA‏ و/أو عند الطرف 5” لمتوالية
    ‎.DNA‏ ‏9- فيروس غدي ‎Gay adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث تقوم ‎de gana‏ جين ‏5 ناقل ‎transgene cassette‏ واحدة على الأقل بتشفير ‎MRNA‏ أحادية الجينات 1000001510010 أو ‎MRNA‏ متعددة ‎polycistroniccituall‏ . 0- فيروس غدي 808600710015 ._وفقًا لعنصر الحماية 1 أو 2؛ ‎Cua‏ الجسم المضاد أو شظية ارتباط منه نوعية ل 017440 مركب 07640 ترابطي»؛ ‎«CD40 «CD30 «CD28 «CD27‏ مركب 00040 ترابطي» ‎(GITR «CD137 «CD70‏ 881-4؛ 1005 مركب ‎ICOS‏ ترابطي؛ ‎«CTLA-4 0‏ 1-اض [ا-ناض ‎(HVEM (B7-H4 (B7-H3 VISTA (PD-L2‏ 2- آنا ‎«PD-1 (CTLA-4 (CD160 LIGHT BTLA (LAG-3 ١4-3 (ILT-4 (ILT-3‏
    ‎.PD-L2 (PD-L1‏ 1- فيروس غدي ‎adenovirus‏ وفقًا لعنصر الحماية 1 أو 2 حيث يكون البروتين ‎protein‏ ‏المشفر عبارة عن سيتوكين ‎cytokine‏ يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على ‏5 وآحالا 18حال 6حالء وحال 12حال 13حال 7احال ‎«IL-18‏ 22حال 23حال حاا 24 25حال 26حال 27حال 33حال دحال دحال محال دحال ‎¢IL=7‏ 0 حال
    حال 21حال 25حال هه احال ملاعل ‎TGFB (TNFa «IFNy ¢IFNB‏ ؛ سم ليمفاوي
    ‎.GM-CSF 5 a (LTA)lymphotoxin a (LTA)‏ 2- فيروس غدي ‎adenovirus‏ وفقًا لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يكون البروتين ‎protein‏ ‏المشفر عبارة عن كيموكين ‎chemokine‏ يتم اختياره على حدة من المجموعة التي تشتمل على ‎«CXCL11 «CXCL10 «CXCL9 00122 «CCL20 «CCL17 «CCLS5 (IL-8 5‏ ‎«CCR4 (CCR2 (CXCR2 (CCL21 «CCL19 «CCL2 «CXCL12 «CXCL13‏ مثا ‎CRTH2 4 CXCRS5 (CXCR4 (CXCR3 (CCR8 (CCR7 (CCR6‏ . 13— فيروس غدي ‎dy adenovirus‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يكون الجين الناقل ‎transgene‏ عبارة عن جين مرشد؛ على سبيل المثال مُرَاجل يوديد الصوديوم ‎sodium‏ ‎iodide symporter 0‏ ؛ بروتينات معدنية داخل الخلايا ‎«dntracellular metalloproteins‏ ‎«GFPs (HSV1-tk‏ ليوسيفيراز ‎luciferase‏ أو مستقبل ‎oestrogen receptor pas jul‏ . 4- فيروس ‎Gy adenovirus sae‏ لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يكون الفيروس ‎adenovirus gall‏ عبارة عن 011. 5- فيروس غدي 206007015 ._وفقًا لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يكون الفيروس الغدي806007/015 عبارة عن ‎Enadenotucirev (EnAd)‏ خيمري كما في المتوالية رقم 12. 6- فيروس غدي 8060070015 ._وفقًا لعنصر الحماية 1 أو 2؛ حيث يشتمل الفيروس على متوالية من المتوالية رقم: 1؛ متوالية رقم: 2؛ متوالية رقم: 3؛ متوالية رقم: 4؛ متوالية رقم: 5؛ متوالية رقم: 6؛ متوالية رقم: 7 متوالية رقم: 8« متوالية رقم: 9؛ متوالية رقم: 46؛ متوالية رقم: 48 متوالية رقم: 49 متوالية رقم: ‎(SO‏ متوالية رقم: 51؛ متوالية رقم: 52؛ متوالية رقم: 53؛ 0 متوالية رقم: 58( متوالية رقم: 59 متوالية رقم: 60؛ متوالية رقم: 61؛ متوالية رقم: 63« متوالية رقم: 67 متوالية رقم: 68؛ متوالية رقم: 69؛ أو متوالية رقم: 73. 7- تركيبة صيدلية تشتمل على فيروس غدي ‎adenovirus‏ وفقًا لعنصر الحماية 1 أو 2.
    a 8 sooo RN TAA NE ‏ل ا‎ em NN ne X Nn ‏مم ا ا أ‎ RN Ta : 1 : Haas a Ra NL Ne ag aan Xn — AEE SR Lg SE 8 NER ‏ال‎ ‏اا‎ Sas ‏ا‎ RE Sas oo ERR CER NN aii RE : HR ‏اال‎ : Saas 288 aT SEAR EY RE OF AEN nN £ & 0 0 RN San res TRO EE RNa an.
    AE a R ‏د ئ_‎ ha SESE RIE Rr nnn a 0 Nae RIS A No x Se REE SRR ERIS ay RX ‏ا‎ So x Ta ‏ا‎ 8 Nie 0 ass aN RRR i = RN Sa EE aa NR hs . Sno : LL a NRE ER AR Raa ER TERE Ras REN EEE ERE 5 Raa ERE SE SRR RRR RRS SRR | 8 a 3 SEN gS aaa) RNR SE RR 1 0 ‏اد‎ a ‏ا ا 1 ا‎ ‏ااا اد 5 ا ايا ا‎ : — = SRR ‏الإ‎ I SERRE 0 IR RRR 1 SER 1 3 A ‏اج‎ ONE Ska RE SEN Sian NE ‏اد‎ : 8 Naha RRR RN ERNE al i RN a R aN 3 RE SE RE BRANNAN RRR ENE RRR NEARS 3 Rae 1 i Na 1 a LL NN Shane Na Ta REG THEE REE RE NN Naa fg Saas SE Baia wn EAN = 3 8 ‏ا‎ 0 a RR RR ERA 2% 3 NR nay EE aR a SRR SN AR a on ns 0 SER an X Yah : ‏ا‎ 8 RN aa No The TER a NR NR Shae LL Nan ‏اا‎ NEN NERY Ta aa . Ne Nias NN EEE RN NN : 2 Sh INARI 5 Rana Nn : 3 ea 5% ss EINER SERENE LL EX Sa WN Sh 5 ; a : aE : Sa SE SN EN RRR ChE NN 3 RE 8 Nas NN RS aa . > EN Raa NE Rg EIN RA SRY Ro RN R Lo 3 NN NE 8 ‏م‎ 3 NENA RN RD NaN NN 1 Wa i! 2 > NE 0 ANNE SEE 1 vt ‏م‎ 5 3 NL Rg RNR NA Sus 8 ‏اال‎ : 8 IN RN NER Shas 5 ‏ل‎ 8 8 Th NN ‏ااا‎ ER Low N N 8 RRR ERR SEER SNES REE = RRs 2 3 - SINR NE Aha REE Nhe AN a XN Tm ‏ميا الاي‎ Hi ANE SERRE 38 8:8 NX ha 10 ‏ا ا ا ل‎ XN Naa Haas EE RRR 3 ER AREY Nan EEE A NE : ‏ااال«‎ Naa YR as HERS EE § Na TN NN Na . ‏ا‎ = IY y Lo 9 NR AR RRNA y Sa EEE : ‏ل‎ RHE NEN) RRR Coa : a a ‏ا‎ RD = : RRA SERRE aN FANE OR aaa Sa ARRAN : ER Na AN a RRR Sanaa REN 8 ‏ا‎ RTT Aaa LL Te Naa SEN AAS SAE Naas ae Nha Ll a A) AN NN . BRR a BRN EER % SEER Ne 0 5 RR
    ‎Yoo Ea‏ اا د اي سس 8 ل ‎DB‏ مع ]+ ‎2B 5s ja‏ ا اي ا ااا أ ا ل اد = ‎a Bo NN N‏ | 0 / ‎oN eal‏ \ \ اا ا ب ‎i‏ ا ا ا ا ا ل أ ا الا ا ."> م ‎Rese \ I‏ ا ا ‎SEER Nn SEE‏ 85 ‎LL Co .‏ 2 ‎a : = Sain 8 [NN a‏ ل ‎R | ) 3 . aa go‏ \ ااا د هي ٍ ‎LL Co ae WN‏ ‎Wea hee Laan Na‏ 58 ‎Ga San a Cora NN‏ يه . \ ‎Ne LL‏ اا الا الأ اا د تجن ‎a cea‏ ادم اا اد اق لك ‎RB‏ اا ‎TT Lo a‏ ‎A‏ ا اللا ااا ‎Lo‏ . ا ل ا ال اذا ال دأ الل ‎No NN NL PN‏ ا ‎a ae Loa a by‏ ‎A Raa‏ 0 0 ‎oo 2‏ : : ا ا ل ‎4a 1 a I» oo‏ ]2 ‎Le = ae‏ — ‎i LL LL =} . -‏ ‎No‏ . ال الي ا ا ا ]} ا الج ا ااا اا ااا ال ا ا ل ‎ARN‏ 8 ا
    ‏ا‎ AANA i ‏د‎ 0 Nas SN ) : Wan Sian Nt TRE © Ka aa . Pama a « = : aa BE ‏ا الأ‎ ‏ااا ا ل‎ 8 ‏ا ا ا ل اه‎ ‏ا اا ا ب"‎ = Le : aaa 0 0 3 NN =
    =. no Bae a NN . .
    hea. AN ] ‏ا ا‎ x LC - as = ‏د : 0 ل‎ # SN ‏الام اا ا ا‎ LL NL 0 ‏اا ا اا ا‎ — . LN oo = a a > SEE Eames Sl 2 EE 3 - ‏ا 8 الل سم‎ ‏ا‎ « oo 3 6 ‏د‎ ‏ا ااا‎ ‏ا ل‎ 5 CR S—— aan Shaan . 0 ‏د ددا م‎ _rryE an _ SARE EE 1 DEE Na : Tl - : ‏ا ا 4 لك ا ال ب ا اد‎ ‏ا 0 8 ااا ا‎ — 3» ‏ا‎ ‏الا اا‎ RN NN Nn DL Ya a Ee — -— = ‏الا‎ HON a NE a 3 ‏د ا ل ا ا اا ا‎ ANN Yh NER Na Ne a 8 ‏ال ا‎ na Chal Naas Saas " 3 = ‏ا‎ ‎Sls a NNN Saal Nu de ‏ا ا د‎ ha EER 3 SR 8 ‏ا‎ ERNE 3 SRE 1 ‏ل‎ ‎NN LL LL . ‏أ ا ل‎ Na a A ‏ا ا‎ ‏ل‎ RNa
    قت اسيل 2 عا ‎ate‏ ليما ‎To‏ ‏ررس ‎HE Bev‏ 0 رس اسادختم في عيئة طرية 3 الس ل" ل 3 اح ال * ‎wy SN‏ ا المح > ‎Vato‏ لا ل 1 ‎EE‏ ,3 ‎fed 1 ge‏ ‎i = |‏ ديت ‎oR a‏ تا ‎EE: SRE. ERR A ar‏ ‎Hom Woon TT a en ne Td‏ © 2 داج ‎TR‏ دج ‎A‏ ‎EN‏ ل ل ا شيف البتدة الحنكية ‎BAR‏ حب ‎By‏ ملي ب ‎SSR HRI‏ لكل سين د اجا 3 1 3 تم ‎Yer (ENE NE WEG‏ ‎ae 8‏ ا د 1 ات ا ا تم \ ال ‎NN‏ ال اش ‎RTI‏ ‎I) IEE BR Ba NN‏ ‎N\‏ ال ‎TEEN ER‏ 3
    ‎EE. \‏ ا 1 1 ‎EER‏ ‎BEE Say \ :‏ ‎NNR | SR > Xx k o‏ المح ‎RRR‏ 3 ‎JUNE ER dae :‏ الا ‎RRR‏ ‎BRP: § ER SN > EY‏ ‎WET RE ES REE‏ ‎FEES gn EER‏ حر ‎FEE OIE HE J: SED TEE: TEN: BEC‏ ل لا لا ‎NES i i‏ دا دالخ قد لق لها ال ال ااا ات اا واو اراي اا ام ادا ا ‎CO‏ ا ل 3 % ¥ 3 ‎jad‏ ‏ا ‎NS a‏ ‎od od 3 :‏ 8 4 ‎GD‏ الاب ‎Nea‏ ‏8 0 ما الخ 3 امد الج اجا اخ م حو اخ ‎١‏ ‏و ‎ELE‏ ‏33 ‎wo‏ ‎i‏ 0 3 3+ 4 4 ‎FF‏ ‎wo‏
    ‎Be‏ 8 :2 بيفاسيز وهاب اتا الل ‎GE‏ داق ان + كيلو ‎SFR‏ ‎dry.‏ دالتون ‎FEEL‏ ‏§ *:* كيلو دالتون ‎iN . 0 aa Sa FRI ¥ A .‏ نا | ‎Shs dg oa MEE‏ اساءة كيلو دالتون ال ‎oii.‏ ‎ihe Ed‏ — ب . . ‎Fe‏ دالتون ‎Seis‏ حقيقة ا كك 52 كيلو دالثتون ‎Ca‏ الا اا ان ل كا دالثون ‎frase LL‏ ات راب 3 ‎ene NRE‏ الخال ‎cathy‏
    ‎١.‏ كيلو دانتون
    TE GA ‏منحنى قباسي لمنتج‎ 1 I; : ‏سي‎ ‎5 J Lo 7 Fd LX) 2 ad 1 pr 3 3 & EE : 4 yd ES haat ‏ثاتو جر‎ dag ‏بيقاسيز‎
    ‏اا‎ ad x4
    « . 0 ‏ل هل‎ dade YE Raden iE ‏لي الاح‎ a 0 ‏اد : ل ا ا‎ pata Rad + Sn 8 Ba 1 8 EE TE ‏بلاج سا ل اا‎ ER ‏كك‎ TET
    & Rak ‏الزمنء‎ Rats ‏ساعة *؟‎ 55 fete vs reer ed ‏تلخ‎ Vive Sadi 3 ¥2 ‏ميا لا للد‎ ‏ا ا اد‎ ‏لسلس‎ es
    ‎BR .‏ حا ب" 0 ا ‎i 0‏ ض 1
    ‎1 4
    الشكل ‎Ks‏ % ‎NG-138‏ : تو ‎ET‏ او ‎hw‏ وا إشارة المتوالية إشارة المتوالية ; iim ji! tC : ‏لية‎ : REY p 0 3 I" 0 ١ : : ‏لالع إْ مستقيل جدن‎ ty on ‏فاوط ال ا ا‎ wl ‏متوا‎ alas ‏سلسلة‎ RES | Add dada i ‏سس وو‎ =...
    ~~. nn = NG-TR = &
    +. ‏ا‎ ; ‏الجدل‎ Cats ok dull ‏تو‎ متوالية ‎gepy POlvA‏ اا ا سالا ‎nN‏ ’ ‏اب‎ ‎erin GALL {His ‏بطافة‎ ‎٠: ‏راع‎ Rg ‏عني‎ ‎z ‏نوالا‎ ‏إشارة المتوالية‎ ‏ا‎ \ All ‏متو‎ ‎CRY 3 ‏احا‎ ond PolvA ‏ستوالية‎ ‎Duby i
    NS. we = : ‏الا‎ Mew {His} ‏بضاقة‎
    : I )
    RRR ‏افاي الشكل‎ + Ent + Po ‏ا‎ ‎3 ‎ERS TD : & RY Td == a a 3 a Ry ‏ال الا‎ + J EEE
    FE . : se 3 Ea Eo RRS in i
    Fy . 2 8 0 ‏ا‎ ‎RE I noe 3 Ben. 8 o RS ‏دم يا الم ماكر لض الما حك‎ Ted Uaioe MGS Doing MES 1 ‏ججح ححا‎ ARREARS TER Ne ‏اا‎ en ng Ee RES EIR Hi Peet] DLE
    + ‏اللشكل‎ ‎ai ‏ان‎ ie 4 1 smn ow 3 ‏ا‎ ‎0 : Na HO } oe 3 3 wii on 5] ER 8 = 3 ‏ود‎ Be 00 * ‏ا ا‎ 2 oo. 1 ‏ينا‎ BRT wt i LL NN ‏ل أ‎ ] EL ‏الاق الى‎ ‏الفيروس:‎ 0-85
    EE JX 8 Lolodd = ‏فح‎ ‎wo Seles TX doles 5 Sodas We ‏اتيت الزمنة‎ eee Ll ‏سس ا‎ ‏القييرس.‎ A WT wa AST WR ‏لابخ د”‎ WY ‏ذا‎ ‎=X Re Coals SE TD sss ‏دانتون‎ gE TS Aa ads dE ‏اج«#‎ aa a ‏يبر مانتون‎ ¥ Nn wet ‏ا‎ ‎0 ‎po ¥ ER i i § ‏َه‎ § FE .. ‏امش ؟‎ 4 kad 4 ‏ال‎ ‎0 ‏ا‎ ‎a NE LY | Ea ‏ا ا‎ 0 i aoa \ ‏الت ؟ ل ب‎ 3 0 # ‏ال‎ 3 *ٍ ‏ا‎ : * ‏الل اي‎ : ad | Ea 3 i | EE 3 Pr : od i EE 1 ‏م“ 3 ل‎ 8 | Ea 3 ~ i BEE : ‏ا‎ 1 i ‏اس‎ : ‏اا د‎ ENN SO ‏036ل الفبروس:‎ NGS Oolodeit ‏اليش‎ ARE ‏تاي‎ Aad I] 5 ‏ميق امي § شاي‎
    << ‏الشكل‎ Codsall © ‏ضح‎ ‎3 ¥ 5 LAC 1 sey, 3 3 3, ] Lo ss wa 3 Tr. -- \ ] T i 1 E © Ls 2 000 ‏ا © 2 ا‎ 8» ‏أ‎ : LL 1 ‏ا‎ x ‏ا‎ = I ‏وميا‎ ‎3 iF Ta Pe ‏القيروس‎ ha ‏ب‎ 4 a ‏ال‎ ‏ةه 00م »هط 5ط & اب‎ ‏رسي‎ al ‏اتات‎ RETA Cobos! ‏متا‎ ‏ته وو‎ ‏جا لاع 5 ”نا‎ ‏لير‎ F ‏ب الوم حا‎ sp ed Ww 3 LR 1 ‏ب بو‎ 1 0# Ra 4 ‏ا ا‎ 3 ‏ا‎ EE + 0 ‏الا‎ ‏الا 0 ا‎ a LY SEE Soa SE 8 0 Sa fo ‏لالم‎ 7-0 3 ys BB wy ‏؟‎ § La =F, ea Shee pt : Ea Ha ‏الا ا ال‎ ‏الل‎ ted ‏ا د‎ Seb EY IE Le LE a Le ‏ل‎ Y EEE SEE a! : BB RPE = = ‏لفقا شري‎ 8 ‏ل الس‎ ‏تمر حي‎ 8 salt
    ١ 2 0 0. 1 | ٍ | . he ١ 0 ‏م‎
    << ‏لعف > للفوامة الل‎ Vale eg RO 3 ey H a oF GO. BEER ope ‏يح‎ ‎= i ‏ل 3 ل‎ FREE ||] | ‏نم‎ a ia IgE Em i Ba Bo 3 \ ot) ‏ا‎ ANS: KOMI OND ‏الست‎ SRN NOREEN 8 8 ih Bam ae a NN EN TEE SEE Ben Em Ei fn Emm a . 4 YE ‏أ‎ =e ‏ا اا ييا‎ a Ee \ >< 4 ‏يا ا اذ الل‎ a ‏اد‎ a a \ 3 ١ i PES ‏حت حب‎ Bm ‏لح لحم‎ Sam ‏ححا‎ \ ‏ا‎ 1| 0 ‏بح‎ i 22 EE Sm BR Sm Ban SS Ee 0 BS: 1 F&F § oF oR OR A ahs ‏ا ا‎ SE HS ‏رةه‎ SE SE SR GE RE ‏اقيق‎ SE ES og ‏شير‎ A ‏امس‎ ge aden Pe a ‏مام حق ياي‎ ‏ليا‎ ‏ا‎ ‎3 ١ ‏أ‎ Fl 3 11 4 ‏ا م‎ Fy - a RT ‏شتت‎ 3 ERE i aie En ae 3 28 0 BES ES 1 SRE ge RT ‏الت‎ JRE a Sa ‏لح حت‎ a g Re EE a. 1 ‏؟‎ ١ gas 5 aE * SH a a BR ot ac a 4 7 ‏ا ا‎ $v ow ow + * ‏والمم‎ oy ow ‏جاع‎ See ‏كرا فر‎ Gey ee ge IEE FINE Rat ‏ا صم‎
    ‎Pad‏ >< +فعهالم الشكل 5
    $ a Wo Ta ‏ب"‎ oo as 8 ] § = FF Le 0 0 0 0 0 =
    = i 113!)
    ا ‎Ha Se Sl‏ سني 80 ‎i oh i 0‏ 0 م *ه» ‎BF Be‏ د + اران ال اااي أ
    تس تبت =
    ‏تفط = لفون الل‎ 0 ‏حي‎ ‎% Yai wg on pee i ‏و"‎ 5 Se : : 1 ‏ل‎ se obama: h : : Wid CEE 8 rE: ‏ااا ال أل‎ bis iE 84 : RE i iy 0 ‏د‎ A ede + hei . ‏لريب‎ NGS ColoAdd ‏لريب‎ NG-138 ColoAdt RRR RAR TR RRR ER RRR ‏اسح سس سساح‎ os Day 28 ‏ال من‎ TS ‏ايوم‎
    LE HOE LL: WN Viol wy TY § en TS SCIEN 1 1 FEE PN { 3 ITE NCE wok io 3 ‏خارجية‎ he | PRK ANN ‏وو تنه‎ ee 1 + SEEN he 3 NE nes i Yona DN ‏مي تسد‎ Urea i i i i TOR § ie Le H 3 i BEA [ied Zax 1 5 ‏حتالية رم‎ 8 i . HR Ne ern 1 88 NS ep a i AR 8 AR gay i 1 FR ‘ 8 1 : ‏ع‎ NET Pe i Cee ‏فقا‎ WN ieleartt i ‏حتوانية ريم ا‎ R i H 1 ‘on TE IT RR Se : H oS py 2 ‏مترالية متك‎ 1 BRAINY EES NE ‏م جاع ؟‎ SB ‏رجيوسوم‎ Se Sle | ‏الدع‎ RES ‏لمرو لدعي ال‎ HRCI PER i R i ‏م اله م ا ل‎ i TRAE po ‏تلقن‎ SAN | ‏براض # كايا‎ 1 elgg Por Ade 1 ak H ‏والية ا‎ H i H i i 2 ry ‏ا‎ 5 by : SILAS § ide ‏برج تقار‎ OY 1 + ‏عا‎ ‏يدت قر‎ ١ i LAP a SU Sei ro by oe tapes, § a AS RAF IEE RN i i i H : i 2, RE Sd : as © $y H Coe. ‏رقم +3 1 كد وج الور مط لحيني 8 بحمقة مت ل‎ dng FET i i ‏ةا‎ ‎, : ‏ل ا حا الب مستت‎ hy ung aids 8 FES {Smid 3X 1 ‏متزالية قرا‎ 8 i Come A ee Teed i . { EH A ‏اميتي‎ one TURE ‏رج‎ 7 1 Ee JE RP 3 3 1 eT NY a PA .. ‏ل‎ 3 0 . i wa NN ‏أميني‎ chon TIRE ‏برج‎ 3T REF TEE v8 ‏نات بات فاعلية العا الثاني غانية‎ Ri a8 : 1 i ‏لامي ابيب‎ a ‏ا ا : اليه مغانت اد‎ en ‏ا‎ = HN da ! Wa 8 ‏امش لمي‎ Said ‏كروي‎ % wr dy LEY i i oo AE aed . ‏حيط‎ TONES PES a PRES NY en pon TERR ‏رزج‎ VE EXE PETE
    TERN 3 ‏اال > واي الع ع ا‎ LEE Fn ‏مقا 3< : الاير ل‎ 1 FLEE ‏عع ما‎ RR Ra SER ‏متر اليد رضم * 13 5 ديج‎ STR LAER RS . . FI a Tom wR a Sede prod 3 Re RA oes Prin ad RN ‏البيني‎ mam 3 3 Aaa eg} EY H Te ‏عتوائية تر‎ a) ‏صخي‎ ‎H ‎H ‎H ‎H ‎: H CE NSN : ‏ا‎ 3, Stay wd ‏ا‎ J ThE i. ‏لمعا‎ deme SRONESW nat pine be ‏دج تمك‎ YY H ERP ERE ‏ميك‎ posed 3 ‏متقير‎ Fd A : = i ‏ب"‎ ‎= h EY de ad 4 ‏لمح‎ VERE : + J I] ERS TOI SY) A a Sol SRE OTT eRe H H H H ee ii ends FF EAE wg VEY H £03 Na I Ta BG ‏ا‎ oR ee TY RR mA Porridge Rain ‏للدم‎ BES RI aR § 3 0 Eg ! ِ 3 5 0 SU SY 1 ‏وا الم‎ 3 ‏عفاي‎ Hels I Ree TE fad ‏تكح متخ‎ i NS He i wg 3 H 1 ‏ب 1 0 احاح‎ RRA . oo PEE > ne . 1 by CR: 3 ‏امامل حقيقة تانة نهم يع‎ i AREER SRE ‏الى يني‎ YAR ER TIS H ‏ا‎ ER) 3 SHEE ‏ين لمجي‎ 1 AE H ‏ايه ركم‎ 3 3 H
    H . : H ‏لاي ا لي الت ال اين كيت الت‎ H ET ‏مومع‎ Adee SERENA Gelb YRS ‏اما الهة ترد : م دوي‎ 1 N ‏سم‎ 1 3 Se Holy 18a ani fae 1 ) } ssn Th en 99 Sh a ER HE RE ERT See ‏ل‎ Sea TAR pa VE HEE FE FE i ENS HN 8 : 1 3 GEN ‏ليل الح‎ ke 7 7# ae ‏اس‎ FAY Yor ATTN A i ‏طيخ‎ IN chee pind ‏سا‎ RR : ‏يف‎ Ad Se i SERRE SEN 3 am ea i 3 Ted wale ST TO AO SR Ce wa ‏الم "م‎ IE ‏امليف ل * : مغ ا نهدي .+ © الا المي‎ i Sale Sh 3 3
    H . HN 1 ‏ما‎ N.oah ‏؟ اج لاحش‎ § SH a ‏ا ا‎ ara bh a ‏ا‎ HERE ie i H +0 ‏الود‎ mn To RS oa ‏حم‎ © ee Ee TEE I INN a TR ‏متوكلية رق 3 1 مت ترج‎ H 5 H HE ‏ا وم جا ا ا ب‎ ‏لت الت أ‎ oe oes TSU ‏اقرع مع ريع‎ H H
    - . H . << ACER MANIA NaN A ‏ىا‎ SOR ‏م امه ب لا : مجان‎ cis EEA SREY EE SE ee Ale ‏عي لد د ل 1 2 رج‎ ‏لس‎ ) os Cae RAH hate y ‏تدوع مضي‎ ee ‏بحت لمحي اميتي‎ H REEL ‏متو‎ ‎8 ‏ا ال م ال‎ SIRE
    TER ‏مزل‎ Bi ‏تيع المجمو‎ ws Ba CRY GEE Ba en we & EO ‏ا‎ N 3 fDi a NST LoL GFR BA in oe ‏ذف‎ ENN Jl ‏ا‎ ‎8 8 ‏ال‎ Pod ‏ممح أ قط‎ Bl i ‏؟‎ AT ‏ب‎ ‎ENN ‏الإ‎ 8-3 i NN 8 ‏ا‎ 1 ‏فط‎ Hood 84 i { WN vm Ee I NGS 1 YEA ‏مح‎ 8 \ ‏مقط‎ i | ‏امسر‎ nas i A ‏متا‎ { EFS ‏ال‎ ‎HN x Cb wsA GFP ْ ‏رسي‎ AR ‏معزز‎ 1 WN a PNG i reg i 0 " 8 REP) \ ‏م‎ GFR Pi i H 3 NN BS ARs KAA N eS ST RS sl ‏لي مجو‎ \ A \ Sy TI i B48 {SPR \ 1 ‏وجو 1 ا‎ H R 1 ‏مت إْ‎ FR 5 ‏إْ‎ ‎\ ‏تا ا‎ TMNT ‏إْ‎ ‎١ ‏5ق ا‎ i : Ba QFp BEA Yo i a 1 NGG ‏اد ااا‎ 3 0 8 BEA ‏أ‎ ‎} He © NG-108
    ** ‏الكل‎ ‎ea Sie pit ‏اتيم‎ pine Ch Lo RNY Ba H 0 N ‏ا‎ EN em : ‏ا ميال‎ weds} DRE Fie pa ! i ‏ااه مودت مج الت‎ Panag 1 ‏مانية را‎ ‏ا ا‎ PvE . ‏م لل ميخ‎ vo ! 1 aS ‏ارا‎ i HERE i 2 ‏اذ رم‎ ge ‏إٍْ 1 دا لاف ال امازل متاك رسي‎ ‏اتا 1 ال‎ ae ‏قي‎ NEAT SEE 1 388 TNF Ba 1 \ LRG 2+ ‏متوالية رقم‎
    Yi ‏الشكل‎ ‎Ex Si gon pact pt ‏دوية‎ ‎EE ‏برو مضا‎ ‏لت ل‎ 0 oe i NIE NNN ‏الس امج تت ع‎ vals SiR NN as Rede ce Ni 3 H eA i EER, Bey NF % BR 3 H oma bo VEGRS ‏ناا‎ {i Pada ENN Ferns PEER se i 3 i 3 H i i H sy Ase Ney i eo RIN ‏ل‎ 3 3 1 ‏ا لاع ال‎ 8 ‏ا‎ REC base N i 3 i Haag SSCERPY HR Wi i ; Ny } Srv b 3 Hy 3 3 ‏ا غم :| اا الجن‎ SER N ‏بت جه ا‎ Sd ‏متوالية رم 3 1 اد‎ N A i : N san Sele RIFE 1 Mig { i N TRIES RE ae : i H N 3 ‏رن ]ربيخ‎ © : 8 i 3 ‏معز شار‎ i SE as HERE i ‏ا‎ i Co OVINE ‏لضع‎ a PRET ead ads SEY ‏اريسي‎ i : C3 i i BN hy H N i 3 sued CE rcs | i N UVR Sie ‏عمطي يت اما‎ H § N SE [Ena RES PWG many By i N SEONG sy ET i i I NEARY gs i i 1 N Rati : 3 er 0 H 8 3 ‏ووو‎ stein HR BREA See | 1 3 snr § Pd TRE En H oie cm 3 H oe N BEAL ‏تت‎ Gel EES NE ded BS Leary ‏متزهية كرا[‎ BORON ‏لهات :تا‎ # SOR a ‏اتا‎ hd k ERE
    ‏كل *؟*‎ Ledndal + ‏مفصة‎ ‎i NITE \ Soda EE 3 3 SE ‏م 4 رن‎ SON ‏الس‎ ‎i LET 2 NB Lo 0 ‏ا ا #4 ع‎ 5 0 #4 i = \ ‏ل‎ 0 = ed NN es i - 0 ‏ب‎ 0 0 3 1 - 0 0 a Boog NN NE ‏ا \ 0 0 ع‎ NN = 1 ARS RES R Re J i 2 \ Be \ Be N = 4 na : Re Rk | pe 4 = N i N ge \ EE REN RA Be A Fs A po no 0 ‏سا‎ Fa Seta Fedex TLL © Colo HOEY ‏ما 8 ال‎ 0 wa 3 : ‏اي ل‎ ‏بخ‎ RRR ‏ا‎ RR ‏ا ل اللا‎ BS thE ag Log 5 : 2B % Sal ‏د لا‎ ‏الأ‎ § §
    0 5. BB 0 RE ‏ال اي‎ $F EB BB 2 a LSE LL ‏ساحة‎ YE dab 8 Eine ‏بثمة‎ ‎NN foley Theos EE BGT ‏اه‎ 5 send om 0 1 0 0 = i BEE Ga To See a. . i. ‏الس ان‎ N Seder TE Rela EAL ‏#كينية‎ Sie 43
    + ‏مقحة = لتغوام لش‎ i ] : ‏اشوا .ا‎ ‏الس‎ ae BEET SS ‏ا‎ ‎NY ‎Bh ‎\ ‎i ‏ا‎ ‎» ‎y + > # ¥ bs Mapas} ‏يتم‎ fd nd 1 tas ‏حلا‎ << nodal ‏مج ايع لد‎ ‏ا خف‎ NT 8 Nelo, 2 3 88 ‏خخ‎ ‏ا‎ ERY 3 8 ‏ا‎ ‎# “2 ‏لا عا الجخ‎ 0]
    XN ‏ب“‎ ‏مس‎ ‏بلج اج تح‎ 3 x 3 ¥ ky pl LL 3 ‏فقوا‎ ‎Ba 88 : 5 A nh ERE i ‏الا نا ألا‎ 3 ‏ا ا‎ A iE i ae | 0 EN 18s Tae 5 coy, James EE aR hd TYEE nn ard Na ES 3s LR a oN ‏سس‎ niin SER RR pes ‏ل ابا‎ pessaseed Ea rr 5-5: Sh 4 eB 5 a a 4 i 3 ‏لد‎ FB wy + BI daa ‏ل ا‎ SR dae 3 ‏ل ا انا‎ TONEY ‏ال‎ NINN Se ‏ل‎ ‏ا ا 0 ب‎ a ga ha A IEEE 0... EEE 0: SE hie A wo 3a a es 0" Jean Ta we YEE Sa nn an gas aa i 00055705 ‏الشششططة‎ ‏]ل ]© ]ع 1 ل‎ | : ‏الحا‎ 2 x hy 3 BAL ‏رضم‎ ‎7-29 WIZE MRCS
    + ‏مكل‎ ‎i ‎“rey . 3 ‏اللي سا‎ oN say ‏الى‎ © oo 0 . : ٍْ AN ‏ب 3 ادل ج‎ eth no ai > ‏ل‎ my 2 WER aR 3 i t, 3 a N © a 2 i 3 CEN ERNE : Fg $3 1 . TNE NIE So pss ‘ Es >. ‏ال اذ‎ SRN: ‏ا اج‎ - yd 43 1 "mrE 1: BEB.
    Ca ‏م‎ tog FoR.
    NTE aan inn ‏جم اي‎ oad 8 3 ‏م ا‎ 8 SERN EN x 8 ON NN Hen 8 RL ‏ل‎ i EN 0 IENEEE NN NN BEE MSE a: EN ‏الي لاا‎ hee an 3 1 £0 N oN Nn © & a ENE 1 : EEN ENE Ea AINE F te ENE NN 0 NN DMN ‏اا‎ ‎TNE ‏ل الا‎ IN ‏ا‎ ‎HEE ‏ا‎ FEN 0-0 3 FE 8 20 ‏اليم خخ خخ الاإااا_س_ ا أأ_ذذ_ذذذ‎ NIE ‏خض‎ ‎1 NE NE NEE NINE Et 1 2 : ‏ال‎ Sac ‏اذى ل‎ sh 3 ‏الم‎ To ‏لاك اا‎ Ty, dd IEEE S\N.
    ARAN CREW INR ‏دجي سخ‎ ERNE te £1 ‏لعة‎ ¥Y Se MW 3 ETE BE ‏ياي‎ 3 ‏ايه‎ ‏اللي وات‎ hancock Brees 1 ‏اماي‎ § Re { dn RAR i i ‏اماما‎ ‎+ 1 ES wm NAT Twi ed 8 ‏حي ادوع اميت‎ 1 0 ‏لتحجالة الا‎ 3 i by Sh ‏اص‎ ‎3 ‏إْ‎ 8 Ls NN 16-5 at H = = 8 ‏الك ا تريح اح‎ SER I Eo MN Fie HES 1 EI EE 8 Mees ‏حي ا ا ا إْ‎ i ‏اي‎ 0 i Ea Rae i EB : 8 AE ‏يلايع‎ a 8 Ny NIHSS HS 1 ‏ا‎ - ER fie am ‏ا إٍْ‎ a DN ‏جل‎ ‎N CEN ‏لج‎ REE FEN GUE Ber A 1 EN SN ER BE ‏وحن‎ ‎1 > ‏75خ ل ل‎ AN . ER —— ‏مس امس‎ SN H FECES 3 ‏ساهة‎ 5 Sigh XY FREE RY ‏لواو‎ > EA UI eal cd ‏بتو ال‎ ph Re le Se
    ‎pd hz‏ ال ‎Yael‏ ‎se‏ ! ْ نا ‎i k = ni‏ ‎Nada 3‏ م ‎EE 3 Nh‏ ‎HE ew‏ ا 'ْ = ‎k 3 3‏ 2 اب ‎py k 3 NTR‏ ‎T=‏ ا ا ‎a REE :‏ 1 المت 3 81 ‎ENN‏ : ب ‎we } 3‏ ] + ‎at 0 SHEE 1‏ ‎of Th 3‏ م3 ‎Fe‏ ‏ْ ا 3 ‎Shae ; 3‏ | 1 ‎Gane‏ ا ‎wo‏ ‎Yao San‏ ‎HE ;‏ ‎Ra : 3‏ مس : ال 8 18 ‎un‏ رآ © حاتت ‎٠‏ ساعة مدقي ‎Few‏ مين يدق 8 ْ ‎SO = de‏ ‎a ® p:‏ ‎Sw‏ ا اا اع == ا 2 ‎RR 3‏ ااا 0 + ‎a‏ § ‎SI a‏ ‎N 3 Sana‏ ‎oF ¥ pas RR‏ ا ل ‎fi) i aa‏ ‎i Fes:‏ ل ' 1 ‎ Sonohun‏ الخ خخ § ‎Emme nbn‏ § ‎mt = 1‏ ‎NEC IE JF AN #‏ باق ‎x‏ ‏إجمالي ‎Bet ae SE AR‏ > << © علي ‎LNA : ASI EO‏ 322 ااا ‎Sr‏ —— : ‎TYE 1 EL‏ ال 1 ‎a ;‏ ٍْ اد 1 و اد ساعة. 1 ‎fev Ira T EY, |‏ ; بأأ<دد<< << <<< ججح حت ددا ندا دح حا لدج
    38 ‏الل‎ Coloadl « End
    ET. 3 : ER Sd La 3 LL aaa Mila Sl EE TT EEE WB AMET AT -_—. © SaaS Loa NY ‏ا ا ا ا ا ل ا‎ N 8 Li a 8 ‏اا‎ NN I TE Tn nt Ll NR ET a \ N Tahaan EE \ aaa Ne 0 SEI Nr ‏ا‎ NR RRR NN DR TIE IIIT x sameam FO SN on EY IEC I I 3, ’ ‏قن مخ‎ : y RN ‏دما‎ ‎3 ‏امس £3 ا حي‎ tw TRE
    *. ‏الشكل‎ ‎OR ‎boy Sa bod ROR ‏يدج‎ £3 £3 in 18 ‏ب 0 ع‎ NSN AN LE ‏حاب‎ ‎TEER ‏اتا ااا‎ TR Ll SS + ‏بجر ]: ] تل م مر‎ ‏ال‎ can 1 HEA ‏سيا‎
    ‎+R‏ 8 اا ب ول 3 ‎J free‏ ‎BB‏ أي 3 ات ال 4 ‎aaa‏ لد 6 3 = § ل 8 ‎xy Renee REE‏ ‎II‏ ا 5 ‎o iE a‏ 0 ا ‎Er‏ ‎SLY Rs IEE‏ ‎fiat ii: -‏ : غيم ‎Ne:‏ ‎Vall Waal‏ الهرد* 8 عجن ال اا ‎ER‏ ‏ررس حير ممم ‎REEL‏
    FY ‏اق‎ ‏مسي‎ TT CORED ER LL -_ RA i SRR NR SS Na ue Rs RED S RN SR Erinn EER Es i ion 0 ‏ا ا‎ ae RENE Na. Haake BR RNR RRR 3 NE 1 Na 5 ‏إٍْ‎ ‎NN OL NL i RAE NR 2 SR EE EE Tah dn . 0 NN REE RRR NE ‏لما لاتيم ام جر‎ i NN XX ‏ل‎ RE 3 AR 1... Lucci ed 3 NN Th BRR SEE RN Na 8 ‏نتيا‎ ‎nt IER Saas Shaan 3 Te : 0 A 0 EIR RR hn: NE : nn HEE Se ThE NN RRR RR a SR NR aaa aE : THT aaa EE Ema NY RR RN ‏ا‎ IRR NN SEERA 8 ‏اموت ل ل ا‎ NER SERRE ER ER. RN CE ee RR RE REARS 0 EY RS ARR Ra LL 5 EERE ‏ا‎ Lo Hd
    BRR. main REN me WN ENA SEE 0 a HEY Baa ag NEE REE ‏ا‎ ‏ال ا ل‎ NNR 055 5 BEN ARR a sue a a Na nas Ea NN TE ‏ل الا ب يي ا‎ ‏د‎ ae ‏ال‎ or ‏يض[‎ || 0 ‏ل اا ايا ا‎ SRE SE RE Ey aaa RRR ERY BE SR RN Ba 5 Ra aaa 0 ‏ا‎ Ban UNE Bae Naa RE RR ER LR GR SRR EINE 5 ‏ال‎ ٠ : RN SERN ST ROR NE a Sh £1 ‏ب‎ ‎ROR AR SEER ERA NE Ne I aE SEE Se ‏لخ ا الا أ اا‎ ‏ل‎ Th REE BEE EE iE 5 a aE at Na RRR 2 TRE ER ais ER HHS 1: RES 0 THR pe SER RR SER fn DEERE NaS NS SEA Ea SEE nn : Nh NN ‏م‎ 5 My NE RRR NNN TR EEE ARERR SERENE ENE EE 1 RR RRR RN : AEE A a RRR X ‏د‎ ‎RES NE RR NN RN NN ER REE ERR 0 RRA N RR 5 NTT : RE Rene : ae NN NT. Ea Nf NN NN Nah Fy ‏ل‎ 8 RRR NN Na. NEY AR aN 8 IR RN RX NHS RRR SRR RE RY RR a RRR LEELA RR RRR RRR AN 8 0 3 ON NR NE NN 3 NT. fl a NER ARN Na 0 ‏ل‎ RR NN RR NER a. nee PR sen . 3 EE Se i Case TH THN NR CER ‏م‎ | ee ‏ا‎ RRS SEE RSE SH | 1 : SN ——.-—. RR ERR RR Re aR | ‏لاا سح‎ ] 0 Lo RR RRR ERR RRR ERE ‏ا‎ SRE ENTERS fl = i See ‏ا‎ "١١١١ ‏ا‎ 0 ‏ا‎ ‏ا‎ ‎RA a Hyak ‏اد‎ ‏ل‎
    + ‏مر‎ Atl = Badly ‏د‎ = REB-135 Tg 1, 8 . } Nr Noe NE CET boil on nl NE 3 0 : . 1 | ٍ 0 ‏ا‎ ‎4 ‏:ل‎ NTE ‏اي لا‎ NG ‏ا‎ ‎3 8 IRIE} « sean EEL 0 1 1 0 0 ‏ا‎ ‎k; I IE IE ‏برض 8 ا‎ RE 8: ve . I \ 0 0 ) ha ‏م ا‎ 1 NN ‏ال‎ IR IR IR IR SEF iFgr Figs ‏جام م ب‎ nl 3 ‏وده اتح‎ 1 ‏الا الات اد‎ ‏تس ا و44‎ we DUD i : ‏ل ا‎ ROT Fe SS ‏تحرج‎ ٠ S&F we SKOV 3 = 5 0 Nd aie AER EO a 3 h 8 ‏ا‎ ‎¥ + 8 wy 35 > 0 .
    الل ‎Bak‏ لير رمن ‎amass‏ الجر ‎REN Go‏ ‎Ba‏ الوا ضح 1 ‎AS‏ يدايالا : امتح ال لشت إٍْ : يخ لضع يمت ‎i ١‏ يداي م | ‎PRG‏ يددع لال اننا ‎ERE FT‏ ميض 1 : : مضه لتك م وا ‎i ١‏ ‎weg Bd Uae bin‏ ات ليع ‎mgt‏ ل انض 1 ‎Po SONNE ENON sa I NGS | TT AEs‏ إٍْ : ‎ds mn Me ERI‏ : مض ‎t 3 Thea‏ اا لضا ‎TTR‏ 1 ‎en‏ من 1 اش ‎ML mas‏ ل ‎WES‏ تي ‎ECE‏ ‎NEARY EEE‏ اللا ‎i‏ ‎ety Bey ٍْ ]ٍ‏ رف : : مضا قفتت معت 8 ا ‎Looasal WR Het se WL ma Lo ٍِْ‏ ا ‎i ae i SRN re ¥ ER‏ ‎sar | ٍّ ٍْ :‏ ‎EEN 0 :‏ : : نسم ‎VT naa (POLE‏ ‎I‏ ا ا لل لل اي ‎ow hg‏ افق 1 لا ال ان اع ها الات ات مايا ا ٍ ْ ا ‎ERT‏ ‏: ز معت 1 ٍْ ا ‎Voss SF ea‏ ا بساك سنا ا
    LER wigs Ea Avg ; ‏ل‎ = 0 EE RRR Sn rg | pe rg | pa pr
    Be. § UE ¥ EE aaa 8 2 : 8 IE a men EERE | EI] 0 0 | | 0 0 1 . 0 | ‏لابب‎ ‏للم الل‎ - + ‏تل نشم‎ AN RR. od i ‏لمحم‎ Pl i MI ‏دي‎ MI ‏لي‎
    ++ ‏ع‎ ‎8 ‏ا‎ ASAE ‏حدر لون‎ x Lead tie eileen Al 2 = , SNE =. % WRN pee 1 3 Ter \ ‏اس‎ 1 allt Tout ‏الع‎ a wise TO i y J a ET : & i + ‏؟‎ + SETI JC ot ET ol Gd ‏حك‎ S435 Ee we i k = RET i fa ‏ا اا ححا‎ ٠ 1 ‏بو‎ By A x AY i fo 7 ِ ٍ LI Y ox i pes » 1: a 8 i * 1 : sd Sea ASR SE ae Hoong 1 ‏ميا 34# في ري‎ REE ‏انها لمجو في‎ 2 1 "> TA) i 0 ‏الا‎ 1 PRN MGUERE.
    FRY RSE ‏تمس‎ ‎Tadd $2 FES Fag § : 3 oe, RARER 1 ‏ا‎ 3 ‏إ يم ابد اج 3 : بذ‎ SE 3 SPR J ‏لاتتقا‎ en | RE J. wn 3 4 & be 8 ‏م‎ ga A Seg i } Ba 2 ‏الم‎ 3 SRR N 3.011 a pe enn . an ‏وي ال‎ 0 * 0 1 4 a a2 ‏ودر مجم‎ lt da Roa 0: ‏حت‎ wen RAT 0-05 A te Re 2 3 ‏2ج‎ Ries *® Ny 4 ‏ا 1 ا“‎ en pe Fema ‏ركد‎ ‎2 1 3 By RTT : penn Ra % 3 ٠ ‏ا‎ N 0M J SI 3 sya 8 N ow ¥ pa H Lo pees H H ‏ب‎ 1 WALLER ‏ل‎ | BE] ‏م عب‎ ‏ا‎ * ® \ 3 EE EEE EEE Ek: ‏جم‎ ® i B22 | BEE | wots ISO ENERO SUNCREST ASIEN | Cra Emel HE J p ‏من شي‎ ‏ب‎ <n 5 ‏م ا ا“‎ Eas HE J i : i 0 + A to Ren : ‏ا‎ : H ‏جيرج‎ SEAS HN frome BRR mm <<. ‏نس‎ ‎1 ARS 2 sa SSE ga ME IE seo and Thad
    ب ا بم ‎veg,‏ ‎N‏ ‏4 ‏م ‎i‏ ‏| 4 ب § ‎rR‏ < ‎oo‏ ؛. ‎N ral‏ يب + 43 مين * ٍ ب :3 ‎X‏ ‏1 : 4 ‎WE‏ 7 1 ' ٍ 4 ‎N &: rd E : i‏ ,= ‎A i‏ 1 3 با ا ام 1 ْ ا م © كر 01 + ‎WN ¥ Fh & A ER 1 8‏ ‎bo) be BR A ar Bs a RR‏ ‎ol 3‏ 2 من ‎Ry)‏ يا ا لاني د ‎at‏ ‎Toate ER‏ ابا 1 ع ‎oo ; A‏ 8 - د ‎SN.‏ ¥ © ‎RA ¢‏ ا 1 ‎ERA.
    Nl‏ 3 1 ا © بلا : = & = ب ‎H‏ ‎SRC Th i —‏ . : 0 ا 5 ‎by‏ ‎faded H‏ § ا 2 ‎PRE i‏ 8 8 : ‎H H‏ = ‎PR WN‏ § : العامة ‎CE‏ : ‎H‏ 1 وده ‎H KE‏ 34 ‎de 00-335‏ : ‎N H H‏ ‎BIENCVR :‏ ا ‎H‏ > ‎i # 0-8 i‏ : الاح ا ا : : ا ‎A‏ يدجم ده ممم ييا ها ‎Fa Te.‏ ص 4 > ليو المعلج #3 £3
    :5 تع ام ‎Todd‏ > تفي نٍ ‎SE 8‏ قوري ‎ERATED‏ ‏ل 0 ; ‎an i so. ~ cS hasta ba < iS pen we‏ ‎aoa 0: FE — ng ’ 1 7‏ 3 ا للا : اميت ال : ا ‎Ee Lo y‏ 0 د ‎i‏ لتو الاج ‎Ro‏ ادح سكعي الس + ‎EI =‏ ل ‎im Lo‏ 4 ال ‎FON‏ ل 8 لمات لأ ‎A 3 NE‏ 4.3 == ا ‎ES + py N 8 8 goose‏ ب ‎Be‏ شع ذا ل 10 ‎VY Low 8 0 _._ N 5 = Nears‏ ] ‎Ba‏ الحم 5 ‎NE 0 von H‏ : 1 ال 3 ‎I NEB NRE‏ من ‎i Y x EER‏ ‎pe 8 Bo 8 Bp IR F BEE iE‏ 5ج 8 بت ‎SIRE‏ ا 1 ‎NE N 2 N 2 4 Bn‏ يه ا 3 ‎i 1 > pag: a I 2 3a a poo aan‏ = = اج 8 8 0 = 8 ‎Nw FRO 8 J‏ } ‎aR N 5% x & =‏ م ‎xX wm N a pans! N‏ الا 4 ‎INE © Ni 3 & =‏ مات ; ‎J SET‏ ‎Sa‏ = ب" 8 | ‎4s LXE aN MN‏ اح ‎presi a‏ # ‎ER = BEE. ES BER‏ ا ‎Rete‏ امم ‎SE, LE AT a‏ ا 0 الراك ‎ge a‏ الل ‎Pi‏ ‎i EE CLP EN)‏ ‎a‏ : م اماي ‎SE Cage, BY‏ الح ‎sa peed pe So‏ ب 1 ‎Sse‏ ال 0 0 اس ا بم ريط ‎mr‏ = ل« ‎I »' DRA 1‏ . 3 : : كار فرج ‎IE ES ١‏ ممالل تباط 1 ‎NPT EE ERT a 0 Rad‏
    ‎pe. maw. = SI OEE hi tet Saal Sa RE‏ ‎is gb Pose bom omen 0‏ ا ‎ta WE bee ; FREE Ss SEA ETRE‏ ‎A rat er |‏ ال ‎a mew EE‏ ال ل ب" : 8 مي ‎EE ERA SRR a nent BE Se‏ : ا ل لا ا ال 0 ‎Baas : |‏ اذ ‎i‏ ‎mee wid EE : sense BAIR ECE Gerd ate ban Ly PICT‏ 0 ا ‎wd‏ ايب ا 1 : : ‎nan‏ ا ال يو 0:2 : و اا اا ااا م لمعيل مرجع ال ‎we panama MN seed SRN A‏ ‎I‏ اليا ‎do 0 reese TO poe i EN‏ ‎Baa EL Ra ELE: ch I TAA RTE NR‏ : ٍ نمسم 0 ‎RRR‏ ‏:رس ‎wi En TT‏ £23 0 ا ‎RNR‏ 0 ‎RENTON CI Te‏ ‎est E:‏ ل ل ‎DNR Re‏ كيل حمطا لق
    ع ا م ‎TR GRA‏ ‎RETRY ops AS Ry jad‏ ‎vr ¥ 3‏ ‎Yrs SEINE § ROTA‏ لق تا جيم ‎A * ining 3 LR‏ ‎Sm FL NGOS :‏ £3 < ‎wg H Fe 8‏ ب ‎Ro oe Endl‏ & ‎SRT A TE‏ بدا 8 ا 4 1 ‎fo 3‏ ‎phage AA RRA AS AAR‏ ©
    ‎i. : : ¥ .‏ ج : ‎GRE‏ [لمسيم لال حلي ‎elie : 1 :‏ لوز ‎a‏ ‎FR ed‏ عن ري & ‎ia‏ لها ا ‎ET‏ ‏: ‏0 ‎i ! |‏ 0 اروس : ‎a H 4 i‏ 3 يم اح ‎FR 0 H red ; 3 i i on :‏ ‎N : 0‏ ب شخب ‎wnt Ie‏ ‎on N H 3 LEER ga 11065‏ 22-2 1 شط أ[ بج 1 الا ‎ON‏ ‏إ:ْ ‎Longa‏ ا 1 ‎HE & - B00 Badd i a‏ نف ال“ > حم تاي لبس :ال 0 3 هوا اليج ال ‎PLB TEER‏ 18 ‎Ne A RY i | 8 5‏ ب ‎lel EE‏ 4 ‎IRE TA sme L v 0 fo gag oe‏ بح الك ‎BE NOER oad 7 gees Boca‏ ا 2 8 ‎EY FI‏ 3 ‎TIER ER TUNER lenient he tq FE 2 a‏ 3 ‎wR » PEER EE 7 { HI fas BEE‏ ‎RN, Ponies EASE | IERER RS 0 HI ga =a‏ ‎EE 0 Tog BN Maan‏ لا © 5 5 ‎Ti‏ ‏ا 3 حم 0 ‎Xo FREE 1 RE SEE‏ ‎an‏ ا تجح ‎SF Fig mg H 8 0 ES i‏ ‎is 52‏ م7 1011 ا ال 0 ‎IRE‏ لاد حا يا 7 101:1 ‎IEE ENE HE i‏ ا £2 م 1011 ‎i‏ 3 ا "ساد ,د ‎PIE ERE i Bee 3 i 101:1 d 2s 8‏ ا يط 01:1 : ا سد : ‎HERE‏ ‏يا 101:1 ‎i‏ > ا ل لات ا ‎AR‏ ا ا ا ‎LS REY‏ حب ‎roe Wy CEE‏ م ا ; الزمن بخذ نكل ‎a‏ العا ‎RT ad (Many 2‏
    4+ ‏شاي‎ Copa Enda x N° fein fee Clog . a Colo®et 8 H H ne 0 ] 0 ‏الاسم‎ Yk ‏وا قا ا : رجح ايخ د‎ : Seed Lowe NGS lnm Dae ROWE ~ PEER AAR LN ereiiaanalaan ian aad £ +N 32 ho & > > ‏ا‎ “3 Re Gi AY 3 EN Ny 1 1 LY ES Ho » AN bY OR ‏حي‎ +“ LN ‏يي و لمات‎ " + Y HES ‏برعي م‎
    3 . 3 2 ‏ب‎ i. : i v 7 RE pn] i i ‏م‎ Fl ‏لكل‎ ana se z a ‏اج‎ ‏ب‎ ‎ry ‎oem ‎= i FH = 0 Pd po 4 py Pr = 1 io aes EIR So 5. io as 5 Pio a 3 EEE XI ees o To Sa SE 0: pat 3 Po Sons 3 ‏ا‎ FI aa 001 52 v4 Pod a RE 2 Ba fd 2 ‏د‎ To Raa wl eh i HN a ‏الدج ل“‎ Se Ea SRT SE 3 0: 7 a Ral io past A a a I ‏مم‎ a Rr ‏ممم حا اس 3 ا‎ Pro Th Ress ‏الس‎ et CR Pata Ee: ‏1:؟‎ 11 : RE ‏شي‎ FE I HER IE. se Soe HE 1 a Be ‏ل ل‎ 08 JE SOO FA Ed LETT iin RRR SORE ‏حدس‎ nmin ‏كنك اللا‎ TER ARYL ‏يها‎ gp YRIYARREs I + ‏الخ كيت‎ : SE CNR ‏كر هر‎ be a ١ ‏الات‎ ‎Sakis ‏ثني تسل‎ 7 ERICH Had ‏نانج‎
    الل + 8 ot ‏نتساج‎ ca ‏بكسي فو‎ mA 3 ‏ا لل ل‎ ‏يس سس ا ا 1 ل يسييسسيسييسنيسييييسسين ل ذا‎ : 3 i a H ye : ١ 1 Ce Ny OE A St : oF NOW : H ‏م‎ : : 1 TL 8 H Pon ‏حا‎ : BS IE I Ee vi ‏مجح‎ 3 Eo H FN. N 4 : : rr | hy 0 H 2 yd Demis | 3 H I Emm | : gms ES hi HE EN ‏بحص : م‎ |: IX Keke a 5% ME FR 8 = : [A a ‏مسمس ب"‎ | 8 ‏ل‎ y : : ‏لتم : : 4 8 ا مسب‎ | hi ¥ 0 H 3 ARS CH : ‏ا مسب‎ 8 A HE | 3 By rn ‏ا‎ ‎Hh 0 FI ‏بحس : : بي الم‎ © 3 = i | © 3 0 ‏ا‎ pees 8 x H : ‏ببسيس‎ | 4 H ‏بت‎ | 8 pe ٠ ٠ : Dashes N 2. I : ‏مسمس‎ | 0 he Rashi ‏ا‎ ©“ 0: HE EN RRR + © EEE | SAR ‏شح م‎ |: ‏ا "م‎ EE : 0 Fd | gE he aa Tv had ced SEER ‏لل‎ BY Ja EE FC. [3 Ean |: © 0: HE ‏)مح : : ب ضح‎ ٠: ERP ‏ب‎ | 8 ٠١0-08 ‏م‎ : 3 : H TT ¥ CRORE H A : ‏بحست‎ 8 : To ‏متتس 8 | مس‎ © ‏بم‎ FI 8 1 : Ho | 8 ‏مسب‎ 1 To EI : : ‏بت )| بح‎
    (RA... ‏ل‎ RRR. ‏ال ا‎ ‎Ti _ : i 2 9‏ امع <> ال 6 فقضع الب 5 قوع لديف 3-5 قوع مذ
    HE > SRG ‏شام ساي‎ 5 ES Rl fen 1 Po 5 ‏حلي‎ SN et + H 1 ‏اا‎ 8 3 4 i 3 i he : A oa} : ER I § I N 3 Peg bon NN ; : fo Vina ‏ا 8 اناج‎ Ni 0 i ‏نستي‎ 3 FRE. ‏ع‎ } 0 ‏إٍْ‎ 3 I Vin ‏ا‎ ‏ةج‎ | < oo 4 a nN i Fl N ceed NINES & 8 1 ER \ i ‏اللي‎ MORE RCE Ue RL ‏##«ناعة‎ ‏8ج‎ Th LL ‏تاموصخ ا إٍْ‎ oud
    J. ] ‏ع‎ J ‏ا ال‎ NN 5 EERE RE yp ‏لاا اس‎ gr Ke ‏ا‎ 13 ET ) ‏كسما‎ - 88# ‏ا‎ ١ ] ‏ا ع‎ 1 0 ‏م"‎ Sai REN 3 UF NBER NN ‏؟ ال ف‎ RR & $d NN 2 a TE , N RNR 3 4 ‏ال‎ ON ‏جنير‎ ets 3 ‏ا‎ VN ens Wea ‏له‎ EO hE } 8 : ‏ب‎ x San . 1 3 ™ . ‏ع ار‎ hae yd Ns ‏ع‎ ‏ا الج ا نحت‎ ‏ال‎ i a . FOE ‏لقا‎ NN £01 REE RRs R J [A $0 Nan ‏مستا‎ © SNES WN ‏مه‎ ‎Baty ‏رد الا‎ WY eng fel YY ‏ناما‎ Wa ‏دجن الس لطاب رن‎
    + ‏متي‎ ‎0 5 ‏مي مم‎ : San 7 ‏جه ناد واج‎ ? a aaa lp 1 ‏رح‎ 3 Ta, ‏وا‎ N 3 5 = 3 8 : 8 Ng : X 1 ‏ب‎ v NN ‏مب : اك الى‎ EA LL " - 0 8 3 3 v 3 cof i oud NN SN = 1 =~ 3 8 7 3 i 3 = : > 4 1 8 . BEE IS ‏ا‎ 3 3 3 ; 4 g 1 > 4 ‏ايد ا 2 لمحي‎
    8 . Emad mmm EN & 2 EO LL Bean bee EO ¢ Ged 4 : | Emm med =~ : ‏ب‎ 3 ‏ل ا‎ Ss © 3 03 ‏الب‎ EEl rede ‏شطع اله‎ ١ Er + Road ‏ححا‎ AAA AA AANA 8 = " ee : ‏ال حي‎ rn in poy HEI WHE MRC ‏تاب حو تيبا‎ HEA AIRE MRR NEE ‏نوع الغية‎ HEE ‏ا الو نيا التشف:‎
    . متلا ‎NG-47‏ 7 اا ا ‎EL PACER‏ ‎Ed 1 3 H :‏ ‎H i‏ 2 1 2 ‎Yaad : vi, 4 H :‏ ‎i‏ 1 0 1 3 ‎E 1 H i‏ ‎H H :‏ : 3 ‎i‏ 1 3 : 3 ‎hand 1 Be fa 1‏ ‎N 1 uy Tey AAR RY 3‏ 3 ب ‎oF PR SEE NT :‏ 1 مف ‎a LG FE‏ ‎Lb Rr en 3‏ 3 ل ‎Sr‏ ‎Ey, RE i 2 oo hae i‏ : الحم يع ‎aR‏ حا ا 1 اح ‎Ke HAAR RRR‏ ‎i‏ 8 اانا ا المت اا امنا ‎ARR SiR t A‏ = ‎Sa‏ ال ‎RD 3 : RR‏ 8 + ‎i‏ ال 5 2 1 ‎NEE‏ ®& ‎NN a 4 oo A RR da SEAT 3‏ وا مخ ‎XN RR Vpsesat © Foes ROR BRENT i‏ 7 اا ‎i UE Nie } - + 8 ea p ١ ;‏ ‎RE RRR : RRA :‏ ‎TRANS { Tone !‏ ‎ER a NEN 1 FX SRR RN H‏ ‎a SAN 1 Ny A H‏ ‎RS 3 ta AE YORERRRRN LY :‏ ا : ا ‎AR‏ ل ار 2 1 ا : مإ ‎FR : 3 OVER‏ ‎Foy, 3 aNRIEESAR 1 . 3 AAR A 3‏ ‎OO a :‏ : الل ا ‎Ve‏ ‎Ve AN‏ اكلا وداج > ‎٠‏ لطي را لوطه حرا = دحاج بجا ‎ad‏ بجوأ ازعم دا الوا اوماد ل لاود عا ‎Fa | > oy 0 ¥ iJ tha) 2‏ بين ‎NYY x‏ 23 ‎ETE CULE PEE PLS‏ لح مجح لجع الت ‎Ta.
    Th.‏ الوك ‎ii [ep‏ ‎i‏ ا ا ا م 7 6 ا & 3 جتنت ‎c Awol‏ جك يتويج للحتت تبنت ‎Fg‏ وميا 1 3 إٍْ 1 5 ال ‎i PR i‏ 0 مخ ‎BE CY i 0 + 3‏ ‎es | 0 3 3‏ ‎a = N 1 3 H‏ ‎ge i 0 ; 4 i‏ ‎N : WY he 3‏ ل ‎Cr‏ ‎gage vt od A hi he 3 H‏ ‎ov BE RRR | hi PAS Ta fa 3% > 3‏ ‎H‏ ما ضري . : ‎i‏ متي ‎vo EEE‏ ‎ie EE RR, : HN) RAR H‏ ‎hE BW . ; PERE a oe i‏ ‎bad ES RR ON SER 0 pe A A TEER 3‏ 3 05 ارمح ‎fa Ro ry aE : 5 HNN NS SR‏ ‎Ea on SNR : 3 aR 2‏ ‎oo RR RY v = ARRAN Ren 3 1 3‏ ‎H‏ ل ا ‎Eee‏ ا ا : ‎hey HERR Ar‏ 8 ‎٠ NRE 8‏ ا | ‎ARC ARN‏ ‎REN i Naa = 3‏ ب ‎ARRAN} i SERINE 3‏ = ‎١ | 0 H‏ الا ل 5 ‎٠ b a eR RRO H‏ ا سام & ‎oy 0‏ ل ا 1 : ‎RARER ٠‏ جا ا ‎JI TEE Sl : ESE Iv i‏ ‎SON SRY A H‏ : + ال را 5 3 2 ا لجال 0 ‎I ERIS oS‏ الوب ب ‎snag‏ لودو ‎Leos srg‏ ياوا ا وه ‎ve peng sv apap re vay sores‏ لمر لا ‎BOA‏ ‏ما ال ‎ENE ETE‏ لوك ‎dL‏ لجع ‎vi.
    SAL‏ لوم ‎Foo,‏ ‎DRED RE‏ اانا ‎opm aa‏ ‎GH‏
    8 ال د اا ا : ‎NA 1‏ يج ‎H‏ 1 3 ‎ie y : TEES 1‏ 0 3 0 الوا ثم بام تف : 1 1 ا ا 7 ال اا اال ‎os‏ 1 ل 4 = 2 1 = ‎ee fs : 7‏ ا ‎of‏ 4 ‎gs ps Co 1‏ ا 1 ب 4 اي م ل ميا 1 > ‎Ra a Ban‏ 1 إل ا جح الحا ‎ay pas‏ ا ل 0 ‎ot‏ ‏م يي م 1 7 = ‎sek‏ لد اللا لد ‎ELE EXE LE‏ 1 ال ‎or, FER eh EER Lem EER LC EER LO EE MR BE Liam‏ > ب > ‎hd‏ اج < 1 ‎dS‏ بعد ‎god‏ ‎IS -« 0‏ 2 ‎So LES . 2 SERS NRE‏ املد ‎heh LIRA‏ حر مح ‎apn Badd‏ 1 يو ‎ried‏ لوبي + ‎Fe a § i‏ § 3 ابر ‎Fe A‏ 3 ‎i Food‏ 1 ال ب ‎a‏ ‎i H 3 3 i‏ 3 5 3 ‎eg “He H H ¥ “Ey i 3‏ ا 0 + ‎H‏ = § 3 ‎aa‏ 4 الل ‎H i‏ د ‎ad‏ 8 5 ‎ar A i H H ¥ 8 H 0‏ ‎i 7 i Sa‏ ا ا : احج 0 دير د 0 ‎SE EE‏ <> ‎HH id i < i nes‏ 5 ‎lume 8‏ سق | 1ل الل ات بي >“ جيل الت مسبت ‎y Ses 3 EI tI + 8 Tol‏ 4 ‎F 4 HE FE io + 3 | EES een Sess‏ ‎Pod i i | SESE mma: gma‏ 01 1 ب ل ‎ERE‏ بن د ات اح جد ‎Ot.
    SU‏ . ‎x ~ $x > 2, a‏ 2 ا > 8“ ا 8 ‎OF rs SE‏ & ‎Ris Ea Fe Fe 3‏ . + + ‎Rac ws NR‏
    مج تي £5 1 ‎sent fed Rs‏ امت ةا 1 2 ومع ‎i pr‏ التي ها ال * + : .3 ‎Rado‏ #4 ‎LER‏ ا م ع ‎CINE TR‏ الي ‎og N‏ ا ‎NG‏ 4 = ا ‎AN ® 8‏ 0 ا إٍْ ‎J es, 1‏ م قي ‎BIEN‏ مستبا . ‎ISN a > > w‏ * ف ‎To - x‏ لعا ‎BB nd Fl anf sly‏ ‎i EE rrr 1‏ ‎mead | 24 PR‏ | 1 0 انج يس ‎IN ; Ey i‏ ا اح ا مهم ٍْ >< ‎H‏ ع ل 8 ‎By‏ : اليا ‎EERIE‏ ا ‎NEL‏ ا ان لا لت ا »« 3 ‎Lo‏ ‏ا ا" ‎Lo‏ | م آذ أ ‎1B‏ )| »ا ا ‎NIN IB‏ | ال ‎INE [EE BE 3 = =‏ 3 3 ‎FEE HEEE BE 3 i g = B21‏ 2 % ‎LINE IRENE [NEE HE ki 18 = 3‏ ‎J te { B = =‏ أل ‎CUES IEEE (NEE‏ ‎INE [EE IE 8 iE = = :‏ 3 3 ‎Toe LE ELE 4 188 22 aL |‏ ‎‘i Ix or ovr, By 1 BEL BS : di‏ ‎EY bs‏ « ‎Forte ited go 0 0 4‏ 3 3 2
    LF RAN ‏جا ا ل‎ . ‏لخدا‎ : 5 1 MN . CEL 1 : : { ‏الست لخ[ اي ا‎ or ofl. a H EE 1 HN PR Rs a @ rnd ‏أ اربع بام 1 :ا‎ 1 al ® 8 0 : 0: ‏رذ اج ردة:‎ 7 3 ! [a FP 1 4 4 ‏ا‎ ‎: x 1 8 1 ‏ل اا : حي‎ % od on Ci ‏؟‎ 0-0 = : = 1 Pod sod oF ‏ا‎ ّ ٍ ‏ب ب‎ H 3 4 | 08 ‏سيا ايخ‎ 2 ‏الال‎ To ‏مج يح ليها : 1 : اش‎ SN | ‏الخ‎ RE 1 : 1 H WR ‏الع‎ oy 1 ‏بل‎ 21 1 ‏:شخ‎ RRS “1 3 his H WR ‏المح‎ i # ًْ ‏ا‎ ‎]ٍ ‏ا‎ 1B 1 3 ‏ا‎ ‎1 RE WE ot ‏ا‎ : - ‏ا ل ا‎ 1 3 ge Io | . ‏جمد ل ا د ل‎ 0 0 = . ‏ب‎ AR ‏الع بكر أحامل‎ ‏الاج‎ ْ 1 Ta H 1 ‏قاع‎ ‎0 ‏ا‎ ‎Ta ¥ 1 2 ‏ادير‎ aad 5 \ 3 BLE 1. ;
    pr. 0 ١ ْْ g PI } 0: ‏ا‎ : ¥ Fr. ‏امم اج‎ a} 1 ‏ذْ‎ ‎Vee + ‏نهب‎ ١ y N A = Lees Noon 3 ed i 1 & 7 i 2 1 ‏لب‎ N 8 0 0 : ‏اا‎ R BS H i : ‏لها‎ BG TES #8 ٍ ‏متنك‎ H 3 dl 5 ْ BRR STORER UNE ‏ا إ جح م سوا سج‎ ‏ا بوجت هود جود جو جود‎ | : aa +4 1 < : + 1 SE. Pu — ES ; ; = 2 Gi ka > : ٍ ْ ‏ل‎ ‏لمتشت‎ alan ‏لد تاج‎
    : J . : i ‏ل‎ 5 1 3 © 0 NN 0 _ = » ‏سن‎ 0
    ب لمكن ك2 ل ل ل ل ‎x Yrs. mer —————————— : pp TT‏ ‎Tal‏ : | اشيم ‎ad 4‏ المج ؟ ‎v pores EE i i a‏ ‎SE i Es | SI = EE‏ ‎H 3 by fo 1 : 1 0 ft‏ ‎HN H fon 3 a 3 ITT Saal 3‏ 3 ‎pe ;‏ ل ل 5 ال 1 ‎A‏ ‎bon NTE i‏ لاا ‎Srep‏ اللا | بع اشيج ال« 0 ل ‎Dona‏ مخ 1 ص | بح 8 ¥ ‎Ey‏ ‎BS 3 3 es A a 3 SRE EE SN H‏ - ‎Ba R 3 {sae 3 a 3 0 Raa b3 REE 3‏ ‎HN BN Pa 3 7 1 0 Tein Eig 3‏ : 4 ‎an‏ 0 -- ل | الب ‎PEE a‏ ‎x H N 3 Foon H 5 1 a Shh 3‏ ال ا ال | ‎Pood i EER‏ & ‎x i RRR Ta Soe 0‏ | | بح 8 ‎Fld‏ ‏ل لم ‎a tal : 3 mE,‏ ‎aa | ACE mae.
    IB‏ | ا الل ‎N Bs Pe 3 5 3 0 Shas Se Sa 3‏ + ب ‎SEE) 3‏ الم ل 0 1 ل 3 ‎by EET‏ 1 ¥ ‎by RR 3 5G 1] a Ss Ras Ry 3‏ : 3 ‎pS by N Pa H 1 0 Sia See SEE 3‏ ‎H by : Pa 3 3 0 ERE pea EEE 3‏ ‎HN B es 3 2 0 Pasa Sea SRR H‏ ¥ ‎HN N foo 1 3 Ts SEER Bs Th A 3‏ 1 نا الا خش ‎H H 1 H Ue.
    REESE.‏ ‎x‏ ااا ف ااا ب 85 ‎NP‏ ‏د لمحتي م1 حا ‎Hae 3‏ & ‎N‏ ‎N‏ ‎N‏ ‎N‏ ‎N‏ ‎N‏ ‎N‏ ‎H‏ ‎Nod 0‏ ‎os Vaid 8‏ ‎WN‏ 3 ا 1 ‎F‏ ‎H Je‏ ل ‎A i ER‏ ‎PEt LL :‏ ‎ES N AREER‏ ‎i I~ EEE‏ = ‎i ete Be‏ 3 ل ا ‎wf aI, Bs‏ 8 ا ‎FRY H H 3 ee‏ ‎H bs 3 ERE‏ :7 ‎y 3 Hi : 3 0‏ ‎yg H H 3 EEE‏ ‎ti i | 8 1 1‏ ‎Jessa asa‏ ا ‎H 5 Rs‏ الت ‎IRR,‏ تاكاه ‎EIEN Arriaga‏ ‎a at‏ د ‎b re‏ ‎SRE win 8 Ade NGI REFEFY‏ ا ا ‎Sia‏ ‏نواد نكية لمستيت 7 امغر اجر لايش
    PINAR ve) *١ ‏اقل‎ ‎INR ‏تح ديدح ارط‎ ‏وا الت‎ Sate ‏لايق بغري امور ع ات‎ San 1000077 ‏تابخ‎ ‏بكري مطل مم اودر‎ ATES ‏ا نضا‎ WGI RYE ‏نا : مد وس‎ ax ‏و‎ ‎fess g ; TOA : TiN { PN HS ‏؟‎ 0 He : 5 : 3 = i ‏ميض يي‎ J E : 8 : 2 EE ‏مق ا‎ SPC NL sy : TR 8 3 5 ¢ FI ‏ال‎ R : 3 4 ‏ل“‎ 3 i EH H 0 OR SE { 7 REN : ‏مجه اي :8 لخدي 8 اتاج‎ I ‏ايت‎ ERY ‏د‎ i Re 5 8 H 7 Poe Rll 0: i oH IE Pos 7 1 8 8: ‏ممع‎ ‎25 RI Hi TER Do TEE t ‏ل‎ ‎4 ‏ا 80 7 -؟‎ 3 Ey i ‏عن لع تال‎ ! 8 8 Dp hee SEN ‏اح للحي‎ i ca Ls Nowa EER FE TT 3 yam i LEA : : ‏ل‎ [a dR $d TOA RE 1 ‏ا : 4 1 ايا‎ ie! ‏ل خخ 6 الل ا ا‎ pe : ‏ىا 3 ا الا ال ا 2 اب ل‎ 8 ‏كير مل‎ AIR §o 8 Ed HR TR + ER : 1 Sted ‏ال‎ HEAR I 53 RR IRR SS Sh : 8 0 5 LE 3 PoE : 3 don H $ ERR te : : ‏ا : ال : ا‎ : ~ IOnEER 2 ‏ل‎ 3 Io : S ‏ا‎ SREY 07 SO J S530) EE JOC J 5 : Toa ‏المت‎ H <2 3 SEER H Lom A B TREE : Tom : TSE : 0 ‏ا‎ : ‏ا‎ : BREEN 3 3 Rn : i 85 8 ‏المت ين حت تت + 8 ا‎ + ‏ل اريت ومني سه ات يا‎ ean REE we 1 + ® ‏مج جع ا‎ ِ BN 1: EE + TRL i * te EEN ER Fag Ay >» ‏ع‎ 4 or ١ - ‏ا و ا اا و‎ ‏لاي ا اي ريه امد ل‎ aE ESR SR ‏؟ : اس‎ ١ ٍّ : : : ‏دا‎ . 8 3 : Te : RN & 8 3 2 ‏ع‎ H TTY 5 x : 3 : 3 = Tu : va } : ‏؟‎ 2 TOE EH : RIS a : <5 ‏ب :2 : ا‎ i : SE 5 : ER 3 RE iy : oh EE ii FR ‏لحك‎ fa TB 8s : 3 EO fi PRS 3 3 : * 8 Ty H 4 Tan HE v x FO = pa H pes id : = ‏ا ا : :1 ا‎ Pos ‏؟‎ : > 8 Ya : 8 ‏ا اماه ول ا‎ 4 : 9 ‏ا ال‎ + FR 3 OR 2 Lo Ved Ra H TE : + Ube dnd HT SS I ‏؟‎ : SENS a ‏يا‎ 23 wb Nan mn FI vg 0 ُ > ‏لخ‎ |: +“ H TEE aa ‏ادي‎ 8 RR : : 3 ‏ا ا‎ : EY FIC : : “x ‏اي‎ yoy Dak RE aR ‏ا‎ od : ‏ال‎ 4+ mm REE +) GONE I TET SE ‏اج‎ + + H Few BE O§ 5 fed BR FORE 1 : ‏اي‎ Shon yor : + + osm oy + : hed RRR 3 H : ‏الا : 41 اي‎ 0 : 3 Io io BE A ‏ات شخ : ]5 ا‎ H 5: ‏ا اا ا : 0 ا‎ oom ov 1 : 5 ‏اي‎ : : 4 : yo oi SEER HN : vos N 3 : Taal SEE : Fragman ‏م‎ 3 : ‏ا : ّ ل امتح لجالا‎ : 3 smn t : Samm 3 3 : ‏ا‎ : ToS } : $n y x : ‏ا : اي‎ 1 : ‏تيا ال‎ bY : 5 Em : 2 \ Croan VENEERS 8 i = NEI ‏و روج‎ Rp SEAR SE ng at aap nang and ARERR rg ees HE NERY he ‏حت دمح ا ات‎ 3 i 8 0 Se < 4 IN TR CH XA > A > : Th PE a SN Sa, > EB ‏:ا‎ ‏مجح اج ا ار‎ . 0 SA Gh SE BR IN ‏ريع مد‎ ATR HAAR IE ‏ريع الم‎
    << ‏قدا لومس اتن‎ 1 ‏الا لأس‎ = ‏"م‎ 2 : THEE RL i a ‏ا‎ CE CE or Ee 8 i cmd o 3 oy a ‏ل‎ ‎#2 ‏ا ب اله اا‎ Calatuft | 8 1 #2 PENG Dod NILE 8 i CE 2 To fd RN N N 82 3 >: EY Los 4 N oa aia
    Io. 1% 0 NN = = . 3 1 0 = 8 = 8 4 ‏ل‎ Sa 0 ‏ا | ا‎ ‏ا 0 ال‎ NN sa NN se 2 1 Ne NX 2 ‏لحب‎ : NN sa ‏ل ب يي‎ eden : TNE SNR oe N ‏ال‎ + 0 0 i. ‏لس . * > ب 3ج‎ aa 3 ‏ب ا ل‎ Th ‏يكم لجسب لك‎ A 0-5 2 PERS 3 by 0 ‏ا‎ ‏إٍْ إٍْ‎ : 1 Nod < “4 I ‏الس‎ oN ‏ا‎ ‎PE ‏سب لمم ايا‎ 8 1 Po eee ‏مسقي‎ A od ‏ب‎ ‎5 1 Ba ‏با‎ SESE oF Rap 2 4 ‏ا‎ & = wd ‏ل‎ _— oF ‏سم‎ ¥ i >44 ‏ا‎ 5 RA = 1 ‏7ج ب‎ i rel Boo : vod 1 ‏وسور سو وسو ببس وسيم‎ wd 1 2 A Y. - 1 wd Yh tn IEEE RE ete RN © ‏يي عل‎ i at ia ‏ترا‎
    رق دا ‎okay Sede‏ ا ل عفدت = تلمضواية لمكن ‎ay‏ ‏3 وا 2 ! ا نا ‎p‏ ‎TEE Colada‏ جبجوي و } ‎YR, — Red NESEY i‏ 4 لتنا ل : ‎SEE‏ 3 ‎EEE Be‏ 1 3 ‎aN Ra Re‏ ‎Nora, a at‏ 1 ‎es ae‏ 3 4 3 ‎ay Se a‏ ‎bo) E ees I =‏ ا ‎Ea a‏ . ب ‎Th fe SE i Cn‏ 1 و ل ‎pty Boed‏ ا .2 مي 5 جني ‎Basen RE SE oT‏ ا الداعت ‎SE‏ اها 1 0 ا ممح مح مسج مم ا ‎TET‏ 5 ا .0 اا ‎Fi es‏ ادل ااا ااا الها ‎Tai‏ ‎RR‏ وي ‎BEL‏ 8 :+ 1 2 . ‎Bale YE ةحاشالخلا WY EEE‏ ‎Fo‏ ‏- يست ‎aed SE‏ ا ‎Fin‏ ‎et FE‏ ‎ae RR wR ER‏ لي ‎BE‏ ‎DA Eke TE‏ ‎i Tanda 8 RRR aR‏ ‎2B nid H BR RRR:‏ : لمي ‎WE‏ 8 : ‎Liey ary ٠ N To‏ : > ا ا ‎i‏ الاي ‎Ed‏ : .5 ‎EO NET‏ 3 ‎[Eras‏ 1 ل ‎SRR ٠‏ 1 ‎hI | Fes : Es‏ § ‎eS Roose EE 3 5# 0‏ 1 : ين ‎PE‏ 5 ‎FR‏ 3 0 ل 1 24 3 ‎o ET | Ra IR 3 Fi‏ 3" ‎wa RR A Tow I‏ 1 3 2 ‎nf Sn ] me‏ ] كٍ 3 ‎REE BE‏ أ ا ‎Ye‏ > ‎BR 3‏ 1 ل > ‎RR 3‏ ل ال ا 8 ‎EE i EE i gaa Feat 1‏ 3 ‎i gE get Beat 1‏ ‎REWER: 3 see Ss :‏ 4 بباية 0 #الاماعة 1 ‎RUSTE‏
    3 ‏لبق‎ (EGER ENE he "> 3 0 I 3 Cobad ‏الماع ها‎ ١ 0 ‏لي اجيج عسي اجيم بيج‎ ' ‏ا‎ I ‏اج‎ noon eed Tog ‏د‎ in REE SN 5 - ei
    ‎TYE‏ سيم 1 3 امسا : ا
    ‎JOR x HH I.
    ‏حت © ال لحن ) ل " :
    ‎1 ‏ا‎ Ng : + i Ba B=
    ‎8 RY 3 i EE ‏شا‎
    ‎% Fed k ‏ا‎ = 3 “x “3 ga N i EES
    ‏ات 8 الالح ) 3 ‎1 88 : i EE
    ‎i ‏ال‎ i : ‏لد‎
    ‎ٍ 8 2 ‏اللا‎ RE
    ‎i ‏.ب‎ 8 18 od
    ‎{ &. & : J FN
    ‏لش الم لج اله ‎SUN‏ سس سس - ‎fa re‏ « * 1 ِ ٍ ب اريثم جميم أكل ‎Pls‏
    لل دل لمي المجمر ‎i A‏ مسب ‎mili‏ ا ابي اا ‎H‏ ‎H JRC RRR‏ ‎by EY : 0‏ ‎SA i {‏ اليا التبيخ 3 ‎YIYTYY‏ لالع ‎SEE da‏ ‎QT, erie H R‏ .
    ‎a... wm i i‏ ل ما 8 5 ‎H‏ ‏وري 1 093501 : : ‎EI‏ ؟ ‎H‏ ‎i i‏ ‎N i‏ ‎i i‏ ‎i i‏ ‎N 3 8‏ ‎FORT ; i i‏ : ‎SE NIE i i‏ جم 0030 ا ‎By BS 3 H N‏ ‎Sy 8 i‏ عطق ‎aa‏ معي ا 88 ‎i‏ ‎H N‏ ا ‎H Rl‏ ْ إْ ا 1 امسا ل تت إٍْ ‎١ --١ EAN DORRIT wan‏ ‎١ FERAL SSR <3 SETI‏ ‎Bs or‏ \ : اصح ‎H Sh‏ ‎NCES) 1 i‏ ا 1 م ‎Aa med Bada REF 1 \‏ ‎i i‏ اج ‎by‏ 8 : إْ ‎veers‏ ال ميج 1 ريني 883 8 0 0 ‎SENN Long Pera‏ إٍْ ‎H 1 TONER {ae‏ ‎i 3 Segond TC Ege‏ ٍ ا 1 ‎H‏ ‎RN‏ ‏إْ 8 ‎osm‏ ‎Be 1‏ ل ‎١‏ ‎٠ Done |‏ ع ‎H‏ ‎i NG i TR AER‏ ددع ‎EEE‏ : ‎i 3 R‏ ا 1 ‎HE‏ ‎Es :‏ ا ‎HEH‏ رع ‎H‏ ‎i‏ رج ينيف لجع ‎H i‏ ‎H ene bam 1 i‏ إْ 88 | تسد ‎i TN MMS pay‏ ‎H 88 88 Cn i i‏ ا 1 اتا ‎SHDN A‏ ايخ الية ا ‎FERAL SS AAS‏ ‎i NERA‏ ‎i‏ 3
    لاله الهيلة السعودية الملضية الفكرية ا ‎Sued Authority for intallentual Property‏ ‎RE‏ .¥ + \ ا 0 § 8 ‎Ss o‏ + < م ‎SNE‏ اج > عي كي الج ‎TE I UN BE Ca‏ ‎a‏ ةا ‎ww‏ جيثة > ‎Ld Ed H Ed - 2 Ld‏ وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها ‎of‏ سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. ‎Ad‏ ‏صادرة عن + ب ب ‎٠.‏ ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > فهذا ص ب ‎101١‏ .| لريا ‎1*١ v=‏ ؛ المملكة | لعربية | لسعودية ‎SAIP@SAIP.GOV.SA‏
SA516371011A 2013-10-25 2016-04-24 فيروسات غدية حالة للورم مُسَلَّحَة بجينات مختلفة التكوين SA516371011B1 (ar)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1318880.0A GB201318880D0 (en) 2013-10-25 2013-10-25 Adenovirus
GB201318885A GB201318885D0 (en) 2013-10-25 2013-10-25 Adenovirus
GBGB1322851.5A GB201322851D0 (en) 2013-12-23 2013-12-23 Method
GB201401159A GB201401159D0 (en) 2014-01-23 2014-01-23 Adenovirus
GB201406470A GB201406470D0 (en) 2014-04-10 2014-04-10 Virus
PCT/EP2014/072919 WO2015059303A1 (en) 2013-10-25 2014-10-24 Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SA516371011B1 true SA516371011B1 (ar) 2020-08-13

Family

ID=51900851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SA516371011A SA516371011B1 (ar) 2013-10-25 2016-04-24 فيروسات غدية حالة للورم مُسَلَّحَة بجينات مختلفة التكوين

Country Status (30)

Country Link
US (3) US9987314B2 (ar)
EP (3) EP3831398A1 (ar)
KR (1) KR102272932B1 (ar)
CN (2) CN114457044A (ar)
AU (1) AU2014338864C1 (ar)
CA (2) CA3183645A1 (ar)
CL (1) CL2016000959A1 (ar)
CY (1) CY1119955T1 (ar)
DK (1) DK3021859T3 (ar)
EA (1) EA036414B1 (ar)
ES (1) ES2661132T3 (ar)
HR (1) HRP20180317T1 (ar)
HU (1) HUE035875T2 (ar)
IL (2) IL244944B (ar)
LT (1) LT3021859T (ar)
MX (1) MX2016005170A (ar)
MY (1) MY175614A (ar)
NO (1) NO3021859T3 (ar)
NZ (1) NZ718931A (ar)
PE (1) PE20160951A1 (ar)
PH (1) PH12016500759A1 (ar)
PL (1) PL3021859T3 (ar)
PT (1) PT3021859T (ar)
RS (1) RS57043B1 (ar)
SA (1) SA516371011B1 (ar)
SG (2) SG11201602887QA (ar)
SI (1) SI3021859T1 (ar)
TR (1) TR201802728T4 (ar)
WO (1) WO2015059303A1 (ar)
ZA (1) ZA201603646B (ar)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112015030881A2 (pt) 2013-06-14 2017-10-24 Psioxus Theraupeutics Ltd “regime de dosagem e formulações para adenovírus de tipo b”
HUE035875T2 (hu) 2013-10-25 2018-06-28 Psioxus Therapeutics Ltd Heterológ géneket tartalmazó onkolitikus adenovírusok
GB201406608D0 (en) 2014-04-12 2014-05-28 Psioxus Therapeutics Ltd Virus
GB201510197D0 (en) 2014-06-12 2015-07-29 Psioxus Therapeutics Ltd Method of treating ovarian cancer
SG11201701502VA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Psioxus Therapeutics Ltd A process for the production of adenovirus
AU2016219785B2 (en) 2015-02-20 2021-10-28 Ohio State Innovation Foundation Bivalent antibody directed against NKG2D and tumor associated antigens
WO2016164370A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 Ohio State Innovation Foundation Egfr-directed car therapy for glioblastoma
CN107690479B (zh) 2015-04-30 2022-02-18 皮斯奥克斯治疗公司 编码b7蛋白质的溶瘤腺病毒
MX2018007249A (es) * 2015-12-17 2019-05-16 Psioxus Therapeutics Ltd Adenovirus del grupo b que codifica un anticuerpo contra el complejo tcr o fragmento de este.
WO2017118867A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Replimune Limited Use of an oncolytic virus for the treatment of cancer
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
WO2018041838A1 (en) * 2016-08-29 2018-03-08 Psioxus Therapeutics Limited Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite)
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
WO2018083257A1 (en) * 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding transgenes
WO2018083259A1 (en) * 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding transgenes
WO2018083258A1 (en) * 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding at least three transgenes
GB201700350D0 (en) * 2017-01-09 2017-02-22 Replimune Ltd Altered virus
WO2018170763A1 (zh) * 2017-03-22 2018-09-27 深圳市博奥康生物科技有限公司 ILA 基因的 RNAi 表达载体及其构建方法和应用
TWI796329B (zh) 2017-04-07 2023-03-21 美商默沙東有限責任公司 抗－ilt4抗體及抗原結合片段
SI3630143T1 (sl) * 2017-06-01 2023-11-30 Akamis Bio Limited Onkolitični virus in postopek
WO2019077113A1 (en) 2017-10-20 2019-04-25 F. Hoffmann-La Roche Ag COPY PROTECTION FOR ANTIBODIES
CN112673093A (zh) * 2018-07-04 2021-04-16 赛通免疫治疗公司 靶向flt3、pd-1和/或pd-l1的免疫疗法的组合物和方法
CA3176812A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020052551A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Genesail Biotech (Shanghai) Co. Ltd. A modified oncolytic virus, composition and use thereof
EP3927833A4 (en) * 2019-02-21 2022-11-30 Unleash Immuno Oncolytics, Inc. ONCOLYTIC ADENOVIRAL VECTOR AND METHODS OF USE
WO2020176809A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
GB201909081D0 (en) 2019-06-25 2019-08-07 Psioxus Therapeutics Ltd Method
IL292836A (en) 2019-11-12 2022-07-01 Actym Therapeutics Inc Platforms for administering bacteria that stimulate the immune system and their use for administering therapeutic products
KR20210118757A (ko) * 2020-03-23 2021-10-01 (주)큐리진 STAT3 및 mTOR를 이중 특이적으로 표적하는 핵산서열을 포함한 항암 바이러스
KR20210118760A (ko) * 2020-03-23 2021-10-01 (주)큐리진 AR 및 mTOR를 이중 특이적으로 표적하는 핵산분자를 포함하는 항암바이러스
EP4148126A1 (en) * 2020-03-25 2023-03-15 Curigin Co.,Ltd. Immunoevasive anti-tumor adenovirus
WO2022036159A2 (en) 2020-08-12 2022-02-17 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria-based vaccines, therapeutics, and rna delivery platforms
AU2021410765A1 (en) * 2020-12-22 2023-07-13 Ensoma, Inc. Adenoviral gene therapy vectors
CN114717203B (zh) * 2020-12-22 2023-06-27 广东东阳光药业有限公司 一种hIL7/hCCL19双基因重组溶瘤病毒及其制备方法和用途
GB202102049D0 (en) 2021-02-13 2021-03-31 Psioxus Therapeutics Ltd Viruses
WO2023086796A2 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment
WO2023168436A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd19 and anti-cd79b chimeric antigen receptors and methods of use thereof
CN116836283B (zh) * 2022-05-17 2024-05-07 苏州万灏生物科技有限公司 具有多种免疫调节因子的增强型溶瘤病毒及其制备方法和应用

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0170269A3 (en) 1984-08-02 1987-09-23 Kao Corporation Medicated cosmetic compositions
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
GB9113120D0 (en) 1991-06-18 1991-08-07 Kodak Ltd Photographic processing apparatus
US5358866A (en) 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
PL179877B1 (pl) 1993-07-13 2000-11-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Zdefektowany replikacyjnie adenowirus, linia komórkowa do infekowania zdefektowanym adenowirusem oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
US5631236A (en) 1993-08-26 1997-05-20 Baylor College Of Medicine Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5830686A (en) 1994-01-13 1998-11-03 Calydon Tissue-specific enhancer active in prostate
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
FR2730504B1 (fr) * 1995-02-13 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants
DE19648650C2 (de) 1996-01-29 1998-07-02 Schering Ag Puffersysteme und deren Verwendung zur Stabilisierung pharmazeutischer Zubereitung
US5877011A (en) 1996-11-20 1999-03-02 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
CN1242051A (zh) 1996-12-31 2000-01-19 昂尼克斯药物公司 用于肿瘤治疗和预防的致细胞病变病毒
DE69838510T2 (de) 1997-02-20 2008-07-03 Johns Hopkins University School Of Medicine Mutationen in atp-abhängigen transpositionsproteinen die die zielortspezifität reduzieren
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
DE69838340T2 (de) 1997-10-09 2008-05-21 Wellstat Biologics Corp. Behandlung von neoplasmen mit interferonempfindlichen, klonalen viren
US6291214B1 (en) 1998-05-11 2001-09-18 Glaxo Wellcome Inc. System for generating recombinant viruses
US20020019051A1 (en) 1998-05-27 2002-02-14 Monika Lusky Chimeric adenoviral vectors
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
CN1110553C (zh) 1998-07-15 2003-06-04 杭州赛狮生物技术开发有限公司 基因工程腺病毒及其用途
AU773202B2 (en) * 1998-08-27 2004-05-20 Aventis Pharma S.A. Targeted adenovirus vectors for delivery of heterologous genes
US6455314B1 (en) 1998-09-11 2002-09-24 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6689600B1 (en) 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
DK1137792T3 (da) 1998-12-09 2007-09-10 Us Gov Health & Human Serv En rekombinant vektor, der udtrykker adskillige costimulatoriske molekyler, og anvendelser deraf
DE60029195T2 (de) 1999-02-22 2007-06-28 Transgene S.A. Verfahren zur Gewinnung von purifizierter Virenzusammensetzung
CZ20013560A3 (cs) 1999-04-09 2002-01-16 Aventis Pharma S. A. Tekutý nebo zmrazený přípravek určený k uchování rekombinantních infekčních adenovirů
DE60043126D1 (de) 1999-05-17 2009-11-19 Crucell Holland Bv Von Adenovirus abgeleitete Gentransfervehikel, die zumindest ein Element des Adenovirus Typ 35 enthalten
EP1181382B1 (en) 1999-06-01 2005-03-23 The University of Washington Recombinant adenoviral vectors expressing chimeric fiber proteins for cell specific infection and genome integration
DK1916258T3 (da) 1999-08-09 2014-07-28 Genzyme Corp Forøgelse af ekspression af en enkeltstrenget, heterolog nukleotidsekvens fra rekombinante, virale vektorer ved en sådan udformning af sekvensen at den danner intrastrengbasepar
US7396679B2 (en) 1999-11-15 2008-07-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Oncolytic adenovirus
DK1252323T3 (da) 2000-01-21 2006-04-03 Biovex Ltd Virus-stammer til den onkolytiske behandling af cancer
US7456009B2 (en) 2000-03-07 2008-11-25 Merck & Co., Inc. Adenovirus formulations
JP2003534806A (ja) 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
CA2412377A1 (en) 2000-06-06 2001-12-13 Bristol-Myers Squibb Company B7-related nucleic acids and polypeptides and their uses for immunomodulation
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
ATE449859T1 (de) 2001-01-04 2009-12-15 Goeran Wadell Virusvektor zur gentherapie
US20050175589A1 (en) 2001-07-13 2005-08-11 Btg International Limited Anti-neoplastic viral agents
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
EP1327688A1 (en) 2002-01-14 2003-07-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Adenoviruses with enhanced lytic potency
WO2003064666A1 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Transgene S.A. Adenoviral vectors for modulating the cellular activities associated with pods
US20060147420A1 (en) * 2004-03-10 2006-07-06 Juan Fueyo Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
AU2003223775A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
PT1570267E (pt) 2002-12-03 2012-01-03 Ucb Pharma Sa Ensaio para a identificação de células produtoras de anticorpos
US20040167088A1 (en) 2003-02-25 2004-08-26 Genvec, Inc. Method of using adenoviral vectors with increased persistence in vivo
WO2004087930A1 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Saint Louis University Adenovirus replication-competent vectors expressing trail
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
GB0315457D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005003169A2 (en) 2003-07-01 2005-01-13 Celltech R & D Limited Modified antibody fab fragments
WO2005010149A2 (en) 2003-07-18 2005-02-03 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Subgroup b adenoviral vectors for treating disease
US20050186178A1 (en) 2003-08-28 2005-08-25 Ennist David L. Oncolytic adenoviral vectors encoding GM-CSF
AU2004283850C1 (en) 2003-10-16 2011-11-03 Amgen Research (Munich) Gmbh Multispecific deimmunized CD3-binders
WO2005107474A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Introgen Therapeutics, Inc. Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
GB0411186D0 (en) 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
CN104263703B9 (zh) * 2004-05-26 2019-12-17 普西奥克瑟斯医疗有限公司 用于治疗癌症的嵌合腺病毒
CN100361710C (zh) 2004-06-07 2008-01-16 成都康弘生物科技有限公司 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm-csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用
US20060292682A1 (en) 2004-07-22 2006-12-28 Hawkins Lynda K Addition of transgenes into adenoviral vectors
JP2008511336A (ja) 2004-09-01 2008-04-17 アメリカ合衆国 免疫原性が増加したアデノウイルスベクターをインビボで用いる方法
WO2006060314A2 (en) 2004-12-01 2006-06-08 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of replication competent viruses for therapeutic use
US20060205080A1 (en) 2005-03-01 2006-09-14 David Frey Formulations for therapeutic viruses having enhanced storage stability
EP1929021A2 (en) 2005-08-31 2008-06-11 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
CN1961961B (zh) 2005-11-11 2010-05-26 深圳市源兴生物医药科技有限公司 一种药物制剂及其制备方法
DE102005055128B4 (de) 2005-11-15 2015-04-02 Universität Rostock Viraler Vektor, dessen Verwendung zur Therapie von Leberzellkarzinomen und pharmazeutische Mittel umfassend den Vektor
ES2304281B1 (es) 2006-02-01 2009-08-12 Dnatrix Inc. Adenovirus oncoliticos para el tratamiento del cancer.
WO2008080003A2 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of oncolytic adenoviruses and uses thereof
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
US20110034560A1 (en) 2008-01-29 2011-02-10 Sven Jacobson Liquid formulations of compounds active at sulfonylurea receptors
EP2296678A4 (en) 2008-05-27 2012-03-21 Oncolytics Biotech Inc MODULATION OF INTERSTITIAL PRESSURE AND ONCOLYTIC VIRUS RELIEF AND DISTRIBUTION
WO2010035012A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
MX338038B (es) 2008-10-01 2016-03-30 Amgen Res Munich Gmbh Anticuerpo de una sola cadena bis-especifico de pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinaxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 o fapalfaxcd3 de especies cruzadas.
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.
US20100297072A1 (en) 2009-05-19 2010-11-25 Depinho Ronald A Combinations of Immunostimulatory Agents, Oncolytic Virus, and Additional Anticancer Therapy
EP2486137B1 (en) 2009-10-05 2018-05-30 Ya-Fang Mei Replication-competent ad11p based viral vectors
WO2012024351A2 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Salk Institute For Biological Studies Adenoviral assembly method
KR20130108371A (ko) 2010-09-24 2013-10-02 온코스 테라퓨틱스 오와이 단클론 항―ｃｔｌａ－４ 항체를 암호화하는 종양분해 아데노바이러스 벡터
RS56879B1 (sr) 2011-08-23 2018-04-30 Roche Glycart Ag Bispecifične molekule koje vezuju antigen za aktiviranje t ćelija
US20140316369A1 (en) 2011-11-14 2014-10-23 Regenerative Sciences, Llc Suspended particle delivery systems and methods
CN102586327B (zh) 2012-01-18 2013-09-11 陕西师范大学 一步法构建携带外源基因的d24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用
EP2844282B1 (en) 2012-05-04 2019-06-12 Pfizer Inc Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
US9314519B2 (en) 2012-08-21 2016-04-19 Intervet Inc. Liquid stable virus vaccines
JP2016512199A (ja) 2013-03-05 2016-04-25 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 腫瘍溶解性ウイルス
WO2015040234A1 (en) 2013-09-23 2015-03-26 Crucell Holland B.V. Adenovirus formulations
GB201322851D0 (en) 2013-12-23 2014-02-12 Psioxus Therapeutics Ltd Method
GB201318793D0 (en) 2013-10-24 2013-12-11 Plaquetec Ltd Vascular Biomarkers
HUE035875T2 (hu) 2013-10-25 2018-06-28 Psioxus Therapeutics Ltd Heterológ géneket tartalmazó onkolitikus adenovírusok
SG10201907841UA (en) 2013-11-22 2019-10-30 Dnatrix Inc Adenovirus expressing immune cell stimulatory receptor agonist(s)
BR112016022841B1 (pt) 2014-04-03 2023-09-26 Igm Biosciences, Inc Anticorpo igm, iga, igg/igm ou igg/iga compreendendo uma cadeia j modificada
GB201406608D0 (en) 2014-04-12 2014-05-28 Psioxus Therapeutics Ltd Virus
SG11201701502VA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Psioxus Therapeutics Ltd A process for the production of adenovirus
GB201503500D0 (en) 2015-03-02 2015-04-15 Ucl Business Plc Cell
SG11201707541WA (en) 2015-03-17 2017-10-30 Tilt Biotherapeutics Oy Oncolytic adenoviruses coding for bi-specific antibodies and methods and uses related thereto
CN107690479B (zh) 2015-04-30 2022-02-18 皮斯奥克斯治疗公司 编码b7蛋白质的溶瘤腺病毒
MX2018007249A (es) 2015-12-17 2019-05-16 Psioxus Therapeutics Ltd Adenovirus del grupo b que codifica un anticuerpo contra el complejo tcr o fragmento de este.
WO2018041838A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 Psioxus Therapeutics Limited Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite)
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
EP3529361B1 (en) 2016-10-20 2021-03-24 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
WO2018083259A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding transgenes
WO2018083258A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding at least three transgenes
WO2018083257A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding transgenes
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation

Also Published As

Publication number Publication date
LT3021859T (lt) 2018-06-11
PH12016500759B1 (en) 2016-05-30
KR20160067184A (ko) 2016-06-13
CA2927968A1 (en) 2015-04-30
US20160331793A1 (en) 2016-11-17
CL2016000959A1 (es) 2016-12-02
PL3021859T3 (pl) 2018-06-29
US20210187047A1 (en) 2021-06-24
SG10201804030WA (en) 2018-07-30
EA201690545A1 (ru) 2016-09-30
AU2014338864A8 (en) 2018-08-23
AU2014338864B2 (en) 2019-11-21
US20180311291A1 (en) 2018-11-01
AU2014338864C1 (en) 2020-07-16
CN114457044A (zh) 2022-05-10
CY1119955T1 (el) 2018-12-12
IL244944B (en) 2019-09-26
HUE035875T2 (hu) 2018-06-28
US11439678B2 (en) 2022-09-13
HRP20180317T1 (hr) 2018-07-13
ES2661132T3 (es) 2018-03-27
SI3021859T1 (en) 2018-04-30
MY175614A (en) 2020-07-01
EP3021859B1 (en) 2017-11-29
EP3021859A1 (en) 2016-05-25
TR201802728T4 (tr) 2018-03-21
EP3831398A1 (en) 2021-06-09
ZA201603646B (en) 2017-09-27
DK3021859T3 (en) 2018-03-05
NZ718931A (en) 2022-10-28
MX2016005170A (es) 2017-02-02
KR102272932B1 (ko) 2021-07-05
BR112016008973A2 (pt) 2017-09-19
PT3021859T (pt) 2018-03-09
PE20160951A1 (es) 2016-09-17
AU2014338864A1 (en) 2016-05-05
CA2927968C (en) 2023-02-21
NO3021859T3 (ar) 2018-04-28
IL269304B (en) 2020-06-30
EA036414B1 (ru) 2020-11-09
WO2015059303A1 (en) 2015-04-30
US9987314B2 (en) 2018-06-05
IL269304A (en) 2019-11-28
IL244944A0 (en) 2016-05-31
US11938159B2 (en) 2024-03-26
CN108064159A (zh) 2018-05-22
PH12016500759A1 (en) 2016-05-30
CA3183645A1 (en) 2015-04-30
EP3372236A1 (en) 2018-09-12
RS57043B1 (sr) 2018-05-31
SG11201602887QA (en) 2016-05-30
CN108064159B (zh) 2021-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SA516371011B1 (ar) فيروسات غدية حالة للورم مُسَلَّحَة بجينات مختلفة التكوين
EP3503918B1 (en) Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite)
Fajardo et al. Oncolytic adenoviral delivery of an EGFR-targeting T-cell engager improves antitumor efficacy
EP3389682B1 (en) Group b adenovirus encoding an anti-tcr-complex antibody or fragment
US10034905B2 (en) Group B adenovirus modified in the E4orf4 region
US20240100106A1 (en) Isolated recombinant oncolytic adenoviruses, pharmaceutical compositions, and uses thereof for drugs for treatment of tumors and/or cancers
JP2018514199A (ja) Ｂ７タンパク質をコードする腫瘍溶解性アデノウイルス
WO2020192684A1 (zh) 包含分离的重组溶瘤腺病毒和免疫细胞的治疗剂及其应用
UA118950C2 (uk) Поліпептид, який зв&#39;язує специфічний мембранний антиген простати та комплекс т-клітинного рецептора
US20230027475A1 (en) Anti-oncolytic virus antigen antibodies and methods of using same
CN112584849A (zh) 包含核酸及car修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
WO2018083259A1 (en) Oncolytic adenovirus encoding transgenes
WO2018083258A1 (en) Oncolytic adenovirus encoding at least three transgenes
WO2018083257A1 (en) Oncolytic adenovirus encoding transgenes
CN111378624A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
US20230242641A1 (en) Slamf7 cars
KR20240026182A (ko) 신규 단일 도메인 항원 결합 분자 및 이의 용도
CN117925726A (zh) 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用
BR112016008973B1 (pt) Adenovírus oncolítico munido de genes heterólogos