CN117925726A - 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用 - Google Patents
基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925726A CN117925726A CN202410020470.8A CN202410020470A CN117925726A CN 117925726 A CN117925726 A CN 117925726A CN 202410020470 A CN202410020470 A CN 202410020470A CN 117925726 A CN117925726 A CN 117925726A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- car
- cells
- multivalent
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 133
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 125
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 124
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 74
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 21
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010039203 Tripeptidyl-Peptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 102100031663 Alpha-tocopherol transfer protein Human genes 0.000 claims abstract 5
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 claims abstract 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 6
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 4
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 2
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 13
- 102100035767 Adrenocortical dysplasia protein homolog Human genes 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 2
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 2
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 2
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 101100520452 Arabidopsis thaliana PMD2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- KEYDJKSQFDUAGF-YIRKRNQHSA-N prostaglandin D2 ethanolamide Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(=O)NCCO)[C@@H](O)CC1=O KEYDJKSQFDUAGF-YIRKRNQHSA-N 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供一种基于多价多肽识别的CAR‑NK细胞的构建方法及其应用；通过对胞外抗原结合结构域进行改造，使用多价多肽包括多肽TPP1、多肽L1、多肽S1代替单链抗体作为胞外结合结构域，构建以多肽为基础的三特异性CAR‑NK细胞；所述多肽TPP1能够特异性靶向PD‑L1，所述多肽L1能够特异性靶向EGFR，所述多肽S1能够特异性靶向肿瘤血管中的VEGFR2。本发明通过改造胞外抗原结合结构域，将多价多肽代替单链抗体作为胞外结合结构域，成功构建靶向PD‑L1、EGFR和VEGFR2的多价多肽CAR‑NK细胞，进而提高对肿瘤的特异性靶向杀伤能力，并通过多肽的亲和力调节减少脱靶毒性，使CAR‑NK细胞更好地深入实体瘤中，解决CAR‑NK对实体瘤效果不佳的难题。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的设计构建及应用
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)基本结构由胞外抗原识别域、跨膜区和胞内信号域组成。胞外抗原识别域通常由单链抗体可变片段(scFv)构成，可以特异性识别并结合靶抗原。跨膜结构域由疏水性α螺旋组成，主要作用是将CAR锚固在工程细胞膜上。胞内信号结构域，如CD28、4-1BB或OX40等结构域，通常起到触发免疫细胞激活和杀伤的作用。
近年来，免疫疗法在肿瘤治疗方面取得了很大的成功并成为研究的热点。目前，全球已经有7种CAR-T细胞疗法产品获批，应用于多种血液恶性肿瘤的治疗。然而，随着CAR-T疗法的迅速发展，新的挑战接踵而至。虽然CAR-T细胞疗法取得了成功，但是也面临了很多问题。CAR-T细胞疗法中是采用患者自体T细胞进行表达，制备工艺繁琐、制备周期过长以及高昂的价格导致其无法得到广泛的应用。另外，CAR-T疗法可能出现的细胞因子释放综合征(CRS)、移植物抗宿主病(GVHD)以及神经毒性等副作用也是不容忽视的问题。
肿瘤微环境(tumor microenvironment，简称TME)，主要由肿瘤细胞，及其周围的免疫和炎症细胞，肿瘤相关的成纤维细胞，和附近的间质组织，微血管，以及各种细胞因子和趋化因子构成，是一个复杂的综合系统。在肿瘤生长过程中，癌细胞和肿瘤微环境成分不断适应环境条件，促进肿瘤的整体生长。因此有效地靶向肿瘤微环境即靶向肿瘤微环境的多个靶点是攻克实体瘤的关键。靶抗原可根据组织分布分为肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是指仅仅表达在肿瘤细胞表面而不表达在正常组织细胞表面的抗原。TAA是指不仅表达在肿瘤细胞，同时也表达在正常细胞表面的抗原分子，如HER2。目前，肿瘤特异性抗原较为缺乏且寻找较为困难，因此也难以获得肿瘤特异性抗原相关的抗体。此外，临床上大多数CAR靶点都是肿瘤相关抗原(TAA)，单链抗体的亲和力较高，靶向TAA的CAR疗法在临床应用时会引发非肿瘤靶向毒性(on-target，off-tumor)。
进一步地，肿瘤微环境一般都是免疫抑制微环境，现有技术中PD-1/PD-L1的免疫检查点疗法已经在临床上取得了一定的疗效。首先PD-L1在多种类型的肿瘤细胞上高表达，靶向PD-L1的CAR-T细胞疗法不仅能解除免疫抑制微环境，还能引导CAR-T细胞靶向肿瘤细胞；肿瘤细胞是肿瘤微环境中主要的成分，EGFR在多种肿瘤细胞中均高表达，因此靶向EGFR可以有效地抑制肿瘤的生长。肿瘤的发生发展和迁徙转移都与肿瘤微环境中的血管生成密切相关，肿瘤新生血管的存在促进肿瘤的无限增殖和转移，VEGFR2是一个关键的受体，主要负责形成新生血管。现有技术中，通常选用两种靶向联合作用来协同杀伤肿瘤以增强治疗的效果，例如Ling Jiao等人研究表明靶向PD-L1和VEGFR2的联合应用可以起到协同杀伤肿瘤的作用，黄延林和孙天元等人的研究均显示EGFR和VEGFR2的联合治疗对恶性胶质瘤的杀伤作用。
为了解决特异性抗原缺乏以及复杂的肿瘤微环境阻碍实体瘤治疗的困境，选择针对肿瘤微环境的多个TAA靶点联合使用增强特异性以精准靶向杀伤肿瘤，防止脱靶。目前用单链抗体构建CAR细胞是最普遍的方法，但是因为单链抗体的分子量大，无法构建多价CAR细胞，即用单链抗体构建的CAR细胞无法靶向多个靶点，需要寻找一种能克服上述缺点的分子。
CAR-NK细胞疗法是通过基因工程手段修饰使NK细胞表达CAR分子，通过识别靶细胞(如病毒感染的细胞、癌细胞)表面的抗原(或受体)，然后激活免疫细胞下游信号分子，以此增强NK细胞对靶细胞的特异性杀伤的效果。CAR-NK细胞疗法已然在血液瘤方面取得了不错的疗效，但是在实体瘤方面的疗效并不好，其中实体瘤复杂的肿瘤微环境和实体瘤特异性抗原的缺乏是最主要的原因之一。中国发明专利CN 114249834A公开了一种能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的NK细胞及应用，其中，所述嵌合抗原受体包括依次连接的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号结构域，其中，所述胞外抗原结合结构域包含能够特异性靶向结合肿瘤细胞或病原的多肽，通过单价多肽-CAR-NK来介导对肿瘤细胞的杀伤，但是单价多肽-CAR-NK细胞容易产生脱靶，对肿瘤细胞的靶向杀伤能力以及对实体瘤的浸润能力是有限的，而且无法同时靶向肿瘤微环境，会限制CAR-NK细胞对实体瘤的疗效，因此可以通过构建多价多肽CAR-NK来提高对肿瘤的靶向杀伤能力和减少脱靶。
基于上述分析，本发明通过提供一种具有特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境的多价多肽CAR-NK细胞，来提高对实体瘤的杀伤作用，以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的设计构建及应用，通过工程化NK细胞的策略，联合多个靶点靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞，减少脱靶和增强对实体瘤的杀伤能力。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案，一种基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，通过对胞外抗原结合结构域进行改造，将多肽TPP1、多肽L1、多肽S1作为胞外结合结构域，构建多肽为基础的三特异性CAR-NK细胞；所述多肽TPP1能够特异性靶向PD-L1，所述多肽L1能够特异性靶向EGFR，所述多肽S1能够特异性靶向肿瘤微环境中新生血管的VEGFR2。
优选地，所述多价多肽CAR-NK细胞中，所述多肽S1用于识别肿瘤微环境新生血管的VEGFR2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，血管内皮细胞生长因子受体2，简称又称FLK-1)受体，肿瘤的发生发展和迁徙转移都与肿瘤血管生成密切相关，所述多肽S1靶向VEGFR2受体来破坏肿瘤新生血管的生成。
优选地，所述多价多肽CAR-NK包括依次串联的多肽TPP1-多肽L1-多肽S1-CAR-NK。
优选地，所述多肽TPP1的序列如SEQ ID NO.1所示；所述多肽L1如SEQ ID NO.2所示；所述多肽S1如SEQ ID NO.3所示；其中，SEQ ID NO.1的序列为SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK；SEQ ID NO.2的序列为KLARLLT；SEQ ID NO.3的序列为LIDHEWKENYFPLSF。
优选地，所述肿瘤细胞包括人非小细胞肺癌H460、非小细胞肺癌A549细胞、人肝癌细胞HEPG2中的至少一种。
优选地，所述肿瘤细胞作为靶细胞，所述多价多肽CAR-NK细胞作为效应细胞进行实验，效靶比为1∶2，1∶1，2∶1；4∶1；8∶1；16∶1。
作为本发明的目的之一，还提供了一种多价多肽CAR-NK细胞，采用上述的构建方法得到。
作为本发明的目的之一，还提供了一种多价多肽CAR质粒载体，所述表达载体中含有上述的多价多肽CAR-NK细胞的表达基因。
所述表达基因的序列从5’端到3’端的顺序按照多肽序列-MYC标签序列-NKG2D序列-2B4序列-CD3ζ进行基因合成得到；所述表达基因连接到慢病毒包装质粒上，构建出的所述表达载体。
优选地，所述多肽系列包括依次串联的多肽TPP1-多肽L1-多肽S1-CAR-NK。
作为本发明的目的之一，还提供了一种能够特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体中的胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域中包括所述的多价多肽CAR-NK细胞。
作为本发明的目的之一，还提供了一种药物组合物，有效成分至少包括如权利要求8所述的基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的嵌合抗原受体；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步地，本发明还提供了上述的多价多肽CAR-NK细胞在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用；其中，所述肿瘤疾病选自肺癌。
尤其地，NK细胞与T细胞相比是一种具有优势的CAR载体细胞，主要表现在以下几个方面：第一，相比于T细胞，NK细胞作为先天免疫系统的成分保留了天然受体识别，因此具有靶向肿瘤细胞的内在能力，从而减少了肿瘤细胞通过下调靶抗原的表达从而逃逸的可能性；第二，CAR-NK细胞是MHC非限制性的，不会引起严重的GVHD，具有良好的安全性；第三，CAR-NK细胞由于不需要经过严格的HLA匹配，因而多种来源NK细胞如异体NK细胞、NK92细胞系都可以用于CAR-NK的构建，有望成为潜在的“现货型”抗肿瘤产品。第四，CAR-NK细胞在体内的存续时间较短，产生细胞因子的能力弱于T细胞，几乎不会发生CRS和神经毒性等不良反应；第五，CAR-NK细胞的制备成本远比CAR-T细胞的制备成本低得多，并且CAR-NK有望选择重复治疗周期，在临床治疗中更具优势。
进一步地，多肽由于分子量小，且具有相对于单链抗体稍低的靶向结合抗原的能力，因此可以用多肽代替抗体来串联多个靶向不同靶点的多肽以构建多价多肽CAR细胞，同时多肽比抗体稍低的亲和力避免靶向正常组织，从而克服由于单链抗体分子量大无法构建多价CAR以及脱靶的难题。多肽药物本质上是指2～50个氨基酸所组成的肽链，多肽和蛋白一样，也是氨基酸通过肽键连接在一起形成的化合物，因此靶向多肽在功能理论上具有和抗体相类似的性质，具有部分替代抗体的功能。多肽具有分子量小，成本低，易于体外合成并修饰，优良的组织渗透性，能深入肿瘤内部，免疫原性低等优良特点。
本发明将多肽TPP1、多肽L1、多肽S1进行串联构建多价多肽CAR细胞，通过同时靶向PD-L1，EGFR和VEGFR2来协同杀伤肿瘤以达到增强治疗效果的作用。
此外，因此本发明选取靶向PD-L1、EGFR、VEGFR2的三条靶向性多肽来构建CAR-NK细胞，通过靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境来增强对实体瘤的杀伤。
与现有技术相比，本发明的至少具有以下有益效果：
1.采用本发明的技术方案，采用靶向PD-L1、EGFR、VEGFR2三个靶向性多肽构建CAR-NK细胞，同时通过靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境来杀伤实体瘤；多肽TPP1可以与PD-L1特异性结合；多肽L1可以与EGFR特异性结合；多肽S1可以识别肿瘤血管中的VEGFR2。同时靶向PD-L1、EGFR、VEGFR2可以起到协同杀伤肿瘤增强治疗效果的作用。
2.本发明通过改造胞外抗原结合结构域，将多价多肽(多肽TPP1、多肽L1、多肽S1)代替单链抗体作为胞外结合结构域，成功构建靶向PD-L1、EGFR和VEGFR2的三特异性CAR-NK细胞，用多价多肽构建的CAR-NK细胞，增强了靶向杀伤能力并减少脱靶，使CAR-NK细胞更好地深入实体瘤中，解决CAR-NK对实体瘤杀伤效果不佳的难题。
3.采用本发明技术方案构建的多价多肽CAR-NK细胞，其中多肽TPP1特异性靶向结合PD-L1不仅可以使NK细胞靶向杀伤肿瘤，还能阻断PD-L1与PD-1结合，解除肿瘤抑制微环境；多肽L1可以与EGFR特异性结合，仅允许CAR与过度表达EGFR的肿瘤细胞结合，避免了非肿瘤靶向毒性。
附图说明
图1为本发明提供的一典型实施例中CAR质粒的构建示意图；
图2为本发明提供的一典型实施例中多价多肽的基因序列图。
图3为本发明一典型实施例中用流式细胞仪检测NK92MI的阳性率结果示意图；
图4A为本发明提供的一典型实施例中采用流式细胞术检测细胞表面人PD-L1的表达示意图。
图4B为本发明提供的一典型实施例中采用流式细胞术检测细胞表面人EGFR的表达示意图。
图4C-图4E是本发明一典型实施例中多价多肽-CAR-NK杀伤靶细胞测试结果示意图。
图5A-图5C是本发明一典型实施例中细胞培养上清中IFN-γ的检测结果示意图。
具体实施方式
使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，通过对胞外抗原结合结构域进行改造，联合使用多肽TPP1、多肽L1、多肽S1作为胞外结合结构域，构建得到多价多肽CAR-NK细胞；所述多肽TPP1能够特异性靶向PD-L1，所述多肽L1能够特异性靶向EGFR，所述多肽S1能够特异性靶向肿瘤血管的VEGFR2。
本发明采用的检测方法为通过流式细胞仪检测NK细胞表面Myc标签的表达即CAR分子的表达水平，以表征CAR-NK构建成功，通过检测细胞因子验证CAR-NK细胞的活化，以及肿瘤细胞杀伤实验检测其细胞毒作用。与单链抗体(scFv)介导的靶向识别作用一样，本发明所构建的多价多肽-CAR-NK能够特异性靶向肿瘤细胞和肿瘤微环境，而且，多价多肽-CAR-NK中的多肽更易于筛选，通过将多个多肽进行融合构建，得到以多肽为基础的三特异性CAR-NK细胞，来提高CAR-NK细胞对肿瘤细胞和肿瘤微环境的特异性和靶向杀伤能力以及减少脱靶毒性，具有同时靶向多靶点的特点。
本发明中所用的检测杀伤技术，除使用本发明中D-荧光素钾检测活细胞中表达的荧光素酶，还可采用MTT法、CCK8法检测效应细胞对肿瘤细胞的杀伤。
本发明采用的术语解释如下：
CAR-NK细胞疗法：是通过基因工程手段修饰使NK细胞表达CAR，将识别靶细胞(如病毒感染的细胞、癌细胞)表面抗原的抗体(或受体)与激活免疫细胞所需要的信号分子连接，可以突破抑制性受体的限制而激活NK细胞，以此增强NK细胞对靶细胞的特异性杀伤。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)：包括胞外抗原识别域、跨膜结构域和胞内信号结构域。
肿瘤相关抗原：(tumor-associated antigen，TAA)：不仅表达在肿瘤细胞，同时也表达在正常组织细胞表面的抗原。
下面通过具体的实施例来进一步详细说明本发明的技术方案。
实施例1
多价多肽CAR质粒的构建方法，具体步骤包括：
多肽质粒的设计构建的序列结构如图1所示，CAR质粒的序列从5’端到3’端的顺序为：多肽序列，MYC标签序列、NKG2D序列、2B4序列、CD3ζ。CAR质粒按照上述顺序进行基因合成，然后通过酶切，连接到慢病毒包装质粒上，共设计了2个多价多肽CAR-NK，和一个scFv-CAR-NK，其基因序列如图2所示，分别为：TPP1-L1-S1-CAR-NK、TPP1-L1-CAR-NK、scFv-PD-L1-EGFR-CAR-NK。将上述含有目的基因的载体导入到stabl3甘油菌中备用，其中，MYC标签的作用主要用于后续检测阳性率。
具体地，TPP1-L1-S1核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
TPP1-L1核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：
scFv-PD-L1-EGFR核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：
多肽TPP1的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK。
多肽L1的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：KLARLLT。
多肽S1如SEQ ID NO.3所示，具体为：LIDHEWKENYFPLSF。
MYC标签序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.4，具体为：EQKLISEEDL。NKG2D蛋白多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：
2B4蛋白多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：
CD3ζ蛋白多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：
实施例2
病毒的包装与滴度检测，具体步骤包括：
1.慢病毒质粒的抽提：
将上述含目的基因的菌液接种到LB培养基中，于摇床中37℃摇床中过夜。转移到离心管中，5000rpm离心10min，弃上清，加入5mL的Buffer A1进行重悬。加入5mL的BufferB1静置5min，再加入3mL的Buffer C1混匀。将上述液体移入高速离心管，12000×g离心10min。将上清转移到50mL离心管中，加入9mL的Buffer C1和10mL无水乙醇，混匀转移至Maxi Column。将上述Maxi Column置于干净收集管内8000×g离心1min，弃滤液，将大提柱(Maxi Column)放回收集管；然后加入10mL的DNA清洗缓冲液，8000×g离心1min，弃滤液。再加入10mL的无水乙醇，8000×g离心1min，弃滤液，开盖空转，10000×g离心10min后，将MaxiColumn置于超净台内干燥2h。然后将Maxi Column转移至另一个50mL的收集管中，加入1.5mL的去内毒素水，静置5min，10000×g离心5min洗脱质粒。
将所得到的质粒用0.22μm滤膜过滤，并取适量质粒在分光光度计中检测浓度与纯度。
2.慢病毒包装：
病毒包装细胞293T用DMEM完全培养基(添加10％FBS，1％双抗)进行培养，细胞密度达到90％时进行病毒包装操作。
第一个离心管中加入450μL无血清的DMEM培养基中，以及包装质粒12μg，PSPAX2质粒9μg，PMD2.G质粒4.5μg，混匀。
第二个离心管中加入PEI 75μL和400μL无血清DMEM混匀，第二个离心管放置5min后加入到第一个离心管中，混匀并静置20min。提前将细胞培养皿中的完全培养基换成无血清DMEM培养基，将第一个离心管中的混合液均匀后滴入到培养皿中，轻轻晃动培养皿并置于37℃，5％CO2中培养，3-4h后将无血清DMEM培养基换成DMEM完全培养基，20-24h再换一次新鲜培养基，培养48h后收取293T细胞的培养上清液。
将培养上清液在4℃条件下以4000rpm进行离心10min，0.45μm滤膜过滤，弃沉淀，293T细胞中另补全DMEM完全培养基，继续培养24h，再次收集病毒。将收集的病毒上清60000g离心2h，弃上清，用无血清无抗α-MEM培养基重悬沉淀，分装保存。长久保存置于-80℃冰箱中。
3.慢病毒滴度检测：
在48孔板中每孔分别接种Jurkat细胞2×105个。过夜后分别加入以0.1μL、1μL、10μl、100μL的慢病毒，同时每孔加入7.5ng/mL的polybrene(聚凝胺)，12h后换液；再经过48h后用Myc(兔抗体)的流式抗体染色，用流式细胞术检测Jurkat细胞上的Myc阳性率。按照以下公式计算滴度：病毒滴度(TU/ml)＝(2×105×Myc-tag阳性率)/病毒原液体积，即可得到病毒滴度。
实施例3
多价多肽-CAR-NK的构建及阳性率检测
在48孔板中每孔分别接种NK92MI细胞2×105个。按照MOI＝20加入浓缩的CAR-慢病毒以及7.5ng/mL的聚凝胺(polybrene)，混匀，置于37℃细胞培养箱中，12h后离心换液。12-72h之间根据细胞状态选择换液，72h后通过流式细胞术进行NK92MI阳性率的检测。
流式结果如图3所示，阳性率的检测结果为TPP1-L1-S1-CAR-NK的阳性率为63.5％、TPP1-PD-L1-CAR-NK的阳性率为61.0％、scFv-PD-L1-EGFR-CAR-NK的阳性率为52.8％，通过阳性率的检测结果可知，多价多肽具有更高的靶向能力。
实施例4
多价多肽-CAR-NK的靶向杀伤能力检测
采用流式细胞术检测不同细胞表面PD-L1和EGFR的表达，包括人非小细胞肺癌H460(H460-luc)、人非小细胞肺癌A549(A549-luc)、人肝癌细胞HEPG2(HEPG2-luc)。
表达结果如图4A和4B所示，其中，图4A为细胞表面人PD-L1的表达，图4B为细胞表面人EGFR的表达。
由图4A和4B结果所示，人非小细胞肺癌H460高表达PD-L1和EGFR，人非小细胞肺癌A549高表达EGFR，但是低表达PD-L1，人肝癌细胞HEPG2均低表达PD-L1和EGFR。将这些细胞作为靶细胞进行后续的杀伤实验。
NK92MI和CAR-NK细胞作为效应细胞，H460-luc、A549-luc、HEPG2-luc作为靶细胞，分别在0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1的效靶比下进行杀伤实验，具体过程如下：
分别将靶细胞铺板过夜，然后按照上述的效靶比加入对应数量的效应细胞，24h后加入D-荧光素钾孵育5min后在酶标仪上检测荧光强度，生物发光强度与活细胞数量成正比，结果分别如图4C、图4D和图4E所示，在4：1时，TPP1-L1-S1-CAR-NK细胞对于高表达PD-L1和/或EGFR的细胞表现出优异的肿瘤靶向杀伤能力，虽然多肽的亲和力稍低于抗体，但是采用多价多肽构建的CAR-NK能达到和抗体构建的CAR-NK相似的杀伤能力。
实施例5
多价多肽-CAR-NK细胞杀伤上清中细胞因子的检测
按照实施例4进行杀伤能力检测的效靶比为4∶1时培养的上清中NK92-MI或多价多肽-CAR-NK释放IFN-γ的量，以验证效应细胞的活化杀伤水平，通过ELISA方法进行检测。ELISA检测方法按照上海酶计IFN-γ细胞因子检测试剂盒说明书进行，检测结果如图5A、图5B图和5C所示，细胞因子的释放和肿瘤杀伤结果一致。
数据统计和分析
上述实施例中的数据制备得到的柱状图和折线图使用Graphpad Prism9软件进行绘制，并进行数据处理和统计学分析，所有数据均为平均值(Mean)±标准误差(SEM)；使用t检验和方差分析等手段进行统计学差异的分析；*P＜0.05表示结果具有统计学差异；流式细胞仪的数据用flowjo V10.0.7软件进行分析得到流式数据图。
综上所述，本发明中的多价多肽-CAR-NK可以提高CAR-NK对H460-luc、A549-luc、HEPG2-luc细胞的杀伤能力。通过细胞毒性实验和杀伤性细胞因子检测的结果可以看出，基于多肽的三特异性CAR-NK细胞具有良好的肿瘤靶向杀伤能力，该结果说明多价多肽-CAR-NK体系构建成功；尤其地，采用本发明的技术方案得到的多价多肽-CAR-NK细胞可以同时靶向多个靶点，且显著地提高了CAR-NK细胞的靶向的特异性，与单链抗体(scFv)相比还具有工艺简单、分子量小，能够同时靶向多靶点的特点。
以上仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，通过对胞外抗原结合结构域进行改造，联合使用多肽TPP1、多肽L1、多肽S1作为胞外结合结构域，构建以多肽为基础的CAR-NK细胞；所述多肽TPP1能够特异性靶向PD-L1，所述多肽L1能够特异性靶向EGFR，所述多肽S1能够特异性靶向肿瘤血管的VEGFR2。
2.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，其特征在于，所述多价多肽CAR-NK细胞中，所述多肽S1用于识别肿瘤新生血管的VEGFR2受体，肿瘤的发生发展和迁徙转移都与肿瘤血管生成密切相关，所述多肽S1靶向VEGFR2来破坏肿瘤新生血管的生成。
3.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，其特征在于，
所述多价多肽CAR-NK包括依次串联的多肽TPP1-多肽L1-多肽S1-CAR-NK。
4.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，其特征在于，所述多肽TPP1的序列如SEQ ID NO.1所示；所述多肽L1如SEQ ID NO.2所示；所述多肽S1如SEQID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括人非小细胞肺癌H460、非小细胞肺癌A549细胞中的至少一种；
所述肿瘤细胞作为靶细胞，所述多价多肽CAR-NK细胞作为效应细胞，在不同的效靶比下进行实验。
6.一种多价多肽CAR-NK细胞，采用如权利要求1-5任一项所述的构建方法得到。
7.一种多价多肽CAR质粒载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求5所述的多价多肽CAR-NK细胞的表达基因；
所述表达基因的序列从5’端到3’端的顺序按照多肽序列-MYC标签序列-NKG2D序列-2B4序列-CD3ζ进行基因合成得到；所述表达基因连接到慢病毒包装质粒上，构建所述表达载体；
所述多肽系列包括依次串联的多肽TPP1-多肽L1-多肽S1-CAR-NK、多肽TPP1-多肽L1-CAR-NK或scFv-PD-L1-EGFR-CAR-NK。
8.一种能够特异性靶向肿瘤细胞及肿瘤微环境的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体中的胞外抗原结合结构域，所述胞外抗原结合结构域中包括如权利要求6所述的多价多肽CAR-NK细胞。
9.一种药物组合物，有效成分至少包括如权利要求8所述的基于多价多肽识别的CAR-NK细胞的嵌合抗原受体；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
10.根据权利要求6所述的多价多肽CAR-NK细胞在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的应用；其中，所述肿瘤疾病选自肺癌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410020470.8A CN117925726A (zh) | 2024-01-05 | 2024-01-05 | 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410020470.8A CN117925726A (zh) | 2024-01-05 | 2024-01-05 | 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925726A true CN117925726A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90758534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410020470.8A Pending CN117925726A (zh) | 2024-01-05 | 2024-01-05 | 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925726A (zh) |
-
2024
- 2024-01-05 CN CN202410020470.8A patent/CN117925726A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2748281C2 (ru) | Полностью человеческие антитела к мезотелину и иммунные эффекторные клетки, нацеленные на мезотелин | |
| CN110214025A (zh) | 携带双特异性T细胞衔接器(BiTE)的腺病毒 | |
| WO2020108645A1 (en) | Cd19-and bcma-based combined car-t immunotherapy | |
| CN110981958B (zh) | 一种pd-l1抗体 | |
| JP2021536435A (ja) | 核酸とｃａｒ修飾免疫細胞とを含む治療薬およびその使用 | |
| CN108276495B (zh) | 靶向csf1r嵌合抗原受体修饰的nk92mi细胞和t细胞及其制法和应用 | |
| CN110845623B (zh) | 一种egfr特异性嵌合抗原受体及其应用 | |
| WO2019024933A1 (zh) | 靶向gpc3的car nk细胞 | |
| WO2019196815A1 (zh) | 一种人白介素2和抗人上皮细胞黏附分子单链抗体融合蛋白及其应用 | |
| CN107033248A (zh) | 识别癌胚抗原的嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN112426526B (zh) | 一种nk细胞的制备方法及其在治疗癌症中的应用 | |
| CN113214408B (zh) | 一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途 | |
| CN109021114B (zh) | 联合两种单链抗体的双特异性嵌合抗原受体及表达载体 | |
| CN112480258A (zh) | 抗cd123纳米抗体及其应用 | |
| WO2022127401A1 (zh) | 靶向cd123的嵌合抗原受体及其用途 | |
| WO2023151346A1 (zh) | 一种新型双特异性嵌合抗原受体的构建及其应用 | |
| CN113416260A (zh) | 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
| WO2021129112A1 (zh) | 一种针对密蛋白6的抗体偶联药物及应用 | |
| CN111849905B (zh) | 间充质干细胞靶向运输趋化因子和细胞因子的免疫疗法 | |
| CN114249834B (zh) | 能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用 | |
| CN117925726A (zh) | 基于多价多肽识别的car-nk细胞的构建方法及应用 | |
| CN112755051B (zh) | 一种nk细胞的制备及治疗癌症中的应用 | |
| Zhao et al. | In vivo production of CAR-T cells using virus-mimetic fusogenic nanovesicles | |
| CN114887080B (zh) | 一种mRNA剂型的免疫抑制剂及其在制备肿瘤治疗药物中的应用 | |
| CN109988242A (zh) | 联合嵌合抗原受体、表达载体、慢病毒及t细胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |