PL179877B1 - Zdefektowany replikacyjnie adenowirus, linia komórkowa do infekowania zdefektowanym adenowirusem oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Zdefektowany replikacyjnie adenowirus, linia komórkowa do infekowania zdefektowanym adenowirusem oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL179877B1 PL179877B1 PL94308122A PL30812294A PL179877B1 PL 179877 B1 PL179877 B1 PL 179877B1 PL 94308122 A PL94308122 A PL 94308122A PL 30812294 A PL30812294 A PL 30812294A PL 179877 B1 PL179877 B1 PL 179877B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- gene
- genes
- deletion
- promoter
- adenovirus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/075—Adenoviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
1. Zdefektowany replikacyjnie adenowirus rekombinacyjny zawierajacy sekwencje adenowirusowe, zwlasz- cza pochodzace z adenowirusa psiego albo ludzkiego klasy C, oraz sekwencje heterologicznego DNA kodujaca gen terapeutyczny, antysensowne RNA albo peptyd antygenowy, znamienny tym, ze jako sekwencje adenowirusowe za- wiera: sekwencje ITR, sekwencje kapsydacyjna, gen E 1 posiadajacy delecje, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada delecje oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierajacej: geny pózne L1-L5 posiadajace delecje, geny E3 posiadajace delecje, gen L5 posiadajacy delecje, sprawny gen E3 od kontrola heterologicznego pro- motora. 10. Linia komórkowa do infekowania replikacyjnie zdefektowanym adenowirusem rekombinacyjnym, znamienna tym, ze zawiera zintegrowane w swoim genomie geny potrzebne do komplementacji replikacyjnie zdefektowanego adenowirusa rekombinacyjnego zawierajacego jako sekwencje adenowirusowe: sekwencje ITR, - sekwencje kapsydacyjna, gen E 1 posiadajacy delecje, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada de- lecje oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierajacej: geny pózne L 1-L5 posiadajace dele- cje, geny E3 posiadajace delecje, gen L5 posiadajacy delecje, sprawny gen E3 pod kontrola heterologicznego promotora., przy czym jeden z komplementujacych genów jest kontrolowany przez indukowalny promotor. 20. Srodek farmaceutyczny zawierajacy czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako czynnik aktywny zawiera zdefektowanego replikacyjnie adenowirusa rekombinacyjnego zawierajacego sekwencje adenowirusowe, zwlaszcza pochodzace z adenowirusa psiego albo ludzkiego klasy C, oraz sekwencje heterologicznego DNA kodujacagen terapeutyczny, antysensowne RNA albo peptyd antygenowy, przy czym jako sekwencje adenowirusowe zawiera: sekwencje ITR, sekwencje kapsydacyjna, gen E l posiadajacy delecje, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada delecje oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierajacej: geny pózne L1-L5 posiadajace delecje, geny E3 posiadajace delecje, gen L5 posiadajacy dele- cje, sprawny gen E3 pod kontrola heterologicznego promotora. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku są nowe wektory wirusowe, sposób ich otrzymywania i ich zastosowanie w terapii genowej. Wynalazek dotyczy również środków farmaceutycznych, zawierających wymienione wektory. W szczególności wynalazek dotyczy adenowirusów rekombinacyjnych jako wektorów do terapii genowej.
Terapia genowa polega na korygowaniu wad lub nieprawidłowości (mutacji, zniekształconej ekspresji, etc.) przez wprowadzenie do dotkniętych nimi komórki lub narządu informacji genetycznej. Ta informacja genetyczna może być wprowadzona albo in vitro do wydzielonej komórki narządu, po czym następuje ponowne wprowadzenie zmodyfikowanej komórki do organizmu, albo bezpośrednio in vivo do odpowiedniej tkanki. W drugim przypadku stosuje się różne techniki, wśród nich różne techniki transfekcji z użyciem kompleksów DNA i DEAE-dekstran (Pagano i współpr., J. Virol. 1 (1967) 891), DNA i białek jądrowych (Kaneda i współpr., Science 243 (1989) 375), ZDNA i lipidów (Felgner i współpr., PNAS 84 (1987) 7413), liposomów (Fraley i współpr., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), etc. Ostatnio jako obiecująca alternatywa dla tych fizycznych technik transfekcji pojawiło się zastosowanie wirusów jako wektorów do przenoszenia genów. Testowano pod tym względem różne wirusy, badając ich zdolność do infekowania pewnych populacji komórkowych. W szczególności badano retrowirusy (RSV, HMS, MMS, etc.), wirus HSV, wirusy pokrewne adenowirusom i adenowirusy.
179 877
Spośród tych wirusów pewne interesujące właściwości z punktu widzenia zastosowania w terapii genowej posiadająadenowirusy. Mianowicie posiadająone wystarczająco duże spektrum biorców, sązdolne do infekowania komórek w stanie spoczynku, nie integrują się z genomem komórki zainfekowanej i dotychczas nie jest znany ich związek z istotnymi chorobami człowieka.
Adenowirusy są wirusami o dwuniciowym, liniowym DNA o wielkości około 36 kz. Ich genom zawiera w szczególności na końcu odwróconą sekwencję powtarzalną (ITR), sekwencję opłaszczania, geny wczesne i geny późne (figura 1). Głównymi genami wczesnymi są geny El (Ela i Elb), E2, E3 i E4. Głównymi genami późnymi są geny LI do L5.
Wykorzystując wymienione wyżej właściwości adenowirusów wirusy te zastosowano już do przenoszenia genów in vivo. W tym celu sporządzono różne wektory pochodzące od adenowirusów, zawierające różne geny (β-gal, OTC, a-l AT, cytokiny, etc.). W każdej z tych konstrukcji adenowirus zmodyfikowano w ten sposób, że stawał się on niezdolny do replikacji w zainfekowanej komórce. Konstrukcje opisane w stanie techniki sąrównież adenowirusami z delecjami regionów El (Ela i/lub Elb) oraz ewentualnie E3, w miejscu których wprowadzono sekwencje heterologicznego DNA (Levrero i współp., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury i współpr., Gene 50 (1986) 161). Niemniej wektory opisane w stanie techniki mają wiele niedogodności, które ograniczają ich wykorzystanie w terapii genowej. W szczególności wszystkie te wektory przenoszą liczne geny wirusowe, których ekspresja in vivo w ramach terapii genowej jest niepożądana. Ponadto wektory te nie umożliwiają włączenia fragmentów DNA o dużej wielkości, które mogą być niezbędne w niektórych zastosowaniach.
Wynalazek pozwala na usunięcie tych niedogodności. Wynalazek dotyczy w istocie adenowirusów rekombinacyjnych do terapii genowej, zdolnych do efektywnego przenoszenia DNA (do 30kz) in vivo, ekspresji na wysokim poziomie i w sposób stabilny tego DNA in vivo, przy ograniczeniu wszelkiego ryzyka wytworzenia białek wirusowych, przeniesienia wirusa, patogenności, etc. W szczególności stwierdzono, że możliwe jest znaczne zmniejszenie wielkości genomu adenowirusa bez przeszkadzania w tworzeniu opłaszczonej cząsteczki wirusa. Jest to nieoczekiwane, jako że w przypadku innych wirusów, na przykład retrowirusów, obserwowano, że pewne sekwencje rozmieszczone wzdłuż genomu były niezbędne do efektywnego opłaszczenia cząstek wirusa. Z tego powodu tworzenie wektorów posiadających ważne delecje wewnętrzne była silnie ograniczona. Wynalazek niniejszy pokazuje jednakże, że strumienie podstawowego genu wirusowego nie przeszkadza już w tworzeniu podobnej cząstki wirusowej. Ponadto tak otrzymane adenowirusy rekombinacyjne zachowująmimo ważnych modyfikacji ich struktury genomowej swoje korzystne właściwości silnej zdolności infekującej, stabilności in vivo, etc.
Wektory według wynalazku są szczególnie korzystne, ponieważ umożliwiają włączenie żądanych sekwencji DNA o bardzo dużej wielkości. Możliwa jest również insercja genu o długości powyżej 30 kz. Jest to szczególnie interesujące w przypadku niektórych patologii, których leczenie wymaga ekspresji wielu genów lub ekspresji bardzo dużych genów. Także na przykład w przypadku dystrofii mięśniowej nie było dotychczas możliwe przenoszenie DNA odpowiadającego genowi natywnemu, odpowiedzialnemu za tę chorobę (gen dystrofiny) z powodu jego dużej wielkości (14 kz).
Wektory według wynalazku sąrównież bardzo korzystne, ponieważ posiadaj ąbardzo mało funkcjonalnych regionów wirusa i z tego powodu inherentne zagrożenia związane ze stosowaniem wirusów jako wektorów w terapii genowej, takie jak immunogenność, patogenność, transmisja, replikacja, rekombinacja, etc. są znacznie zmniejszone a nawet zniesione.
Wynalazek dostarcza także wektorów wirusowych, szczególnie przystosowanych do transferu i ekspresji in vivo żądanych sekwencji DNA
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zdefektowany replikacyjnie adenowirus rekombinacyjny zawierający sekwencje adenowirusowe, zwłaszcza pochodzące z adenowirusa psiego albo ludzkiego klasy C, oraz sekwencję heterologicznego DNA kodującą gen terapeutyczny, antysensowne RNA albo peptyd antygenowy charakteryzujący się tym, że jako sekwencje adenowirusowe zawiera: sekwencje ITR, sekwencję kapsydacyjną, gen El posiadający delecję, gen E2 i E4, z któ
179 877 rych co najmniej jeden posiada delecję, oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierającej : geny późne LI-L5 posiadające delecję, geny E3 posiadające delecję, gen L5 posiadający delecję, sprawny gen E3 pod kontrolą heterologicznego promotora.
Korzystnie zdefektowany adenowirus według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja heterologicznego DNA zawiera sekwencję umożliwiającą jej ekspresję, korzystnie promotor wybrany z grupy zawierającej adenowirusowy promotor El A, adenowirusowy promotor MLP, promotor CMV, oraz promotor RS V LTR.
Równie korzystnie zdefektowany według wynalazku charakteryzuje się tym, że sekwencja heterologicznego DNA zawiera również sekwencję sygnałową.
Równie korzystnie zdefektowany według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera:
- sekwencje ITR,
- sekwencję kapsydacyjną,
- sekwencję heterologicznego DNA, oraz
- region E2.
Równie korzystnie zdefektowany według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera:
- sekwencje ITR,
- sekwencję kapsydacyjną,
- sekwencję heterologicznego DNA, oraz
- region E4.
Równie korzystnie zdefektowany według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera:
- sekwencje ITR,
- sekwencję kapsydacyjną,
- sekwencję heterologicznego DNA, oraz
- region E4.
przy czym geny E4 posiadają mutacje na zewnątrz regionu kodującego E4.
Korzystnie geny E4 posiadajądelecję całego łub części regionu promotora transkrypcji E4. Korzystnie geny E4 posiadają substytucję co najmniej jednej zasady do genów E4. Równie korzystnie geny E4 posiadają mutacje w regionach odpowiedzialnych za regulację ekspresji lub transkrypcji, lub obydwu.
Przedmiotem wynalazku jest także linia komórkowa do infekowania replikacyjnie zdefektowanym adenowirusem rekombinacyjnym charakteryzująca się tym, że zawiera zintegrowane w swoim genomie geny potrzebne do komplementacji replikacyjnie zdefektowanego adenowirusarekombinacyjnego zawierającego jako sekwencje adenowirusowe: sekwencje ITR, sekwencję kapsydacyjną, gen El posiadający delecję, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden gen posiada delecję oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierającej: geny późne L1-L5 posiadające delecję, geny E3 posiadające delecję, gen L5 posiadający delecję, sprawny gen E3 pod kontrolą heterologicznego promotora, przy czym jeden z komplementujących genów jest kontrolowany przez indukowalny promotor.
Korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera w swoim genomie gen E1 i gen E2, przy czym gen E2 jest kontrolowany przez indukowalny promotor.
Równie korzystnie linia według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera ponadto gen E4, przy czym gen E4 jest umieszczony pod kontrolą indukowalnego promotora.
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera w swoim genomie gen E1 i gen E4, przy czym gen E4 jest kontrolowany przez indukowalny promotor.
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera ponadto gen receptora glukokortykoidowego.
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera w swoim genomie geny E2 i E4, przy czym geny E2 i E4 sąkontrolowane przez indukowalny promotor.
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że promotor indukowalny jest promotorem LTR z MMTV.
179 877
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera gen E2 kodujący białko 72K, przy czym gen kodujący białko 72K jest umieszczony pod kontrolą indukowalnego promotora.
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest otrzymana z linii ludzkich embrionalnych komórek nerki 293.
Równie korzystnie linia komórkowa według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera otwarte ramki odczytu ORF6 i ORF6/7 z E4, przy czym otwarte ramki odczytu są kontrolowane przez indukowalny promotor.
Przedmiotem wynalazku jest także środek farmaceutyczny zawierający czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera zdefektowanego replikacyjnie adenowirusa rekombinacyjnego zawierającego sekwencje adenowirusowe, zwłaszcza pochodzące z adenowirusa psiego albo ludzkiego klasy C, oraz sekwencję hetero logicznego DNA kodującą gen terapeutyczny, antysensowne RNA albo peptyd antygenowy, przy czym jako sekwencje adenowirusowe zawiera: sekwencje ITR, sekwencję kapsydacyjną, gen El posiadający delecję, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada delecję oraz korzy śmie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierającej: geny późne L1-L5 posiadające delecję, geny E3 posiadające delecję, gen L5 posiadający delecję, sprawny gen E3 pod kontrolą heterologicznego promotora.
Omówienie wynalazku
Wynalazek ujawnia rekombinacyjny, zdefektowany adenowirus, zawierający: sekwencje ITR, sekwencję umożliwiającąopłaszczenie, sekwencję heterologicznego DNA, i w którym: gen El nie jest funkcjonalny i co najmniej jeden z genów E2, E4, L1-L5 nie jest funkcjonalny.
W rozumieniu niniejszego wynalazku określenie „adenowi - rus zdefektowany” oznacza adenowirus niezdolny do autonomicznej replikacji w komórce celowej. Generalnie genom zdefektowanego adenowirusa według wynalazku jest zatem pozbawiony co najmniej sekwencji niezbędnych do replikacji wspomnianego wirusa w zainfekowanej komórce. Regiony te mogą być albo wyeliminowanie (w całości lub w części) bądź pozbawione funkcjonalności, bądź zastąpione przez inne sekwencje, a w szczególności przez sekwencję heterologicznego DNA.
Odwrócone sekwencje powtarzalne (ITR) stanowią początek replikacji adenowirusa. Są one zlokalizowane na końcach 3' i 5' genomu wirusowego (Figura 1), od którego mogą być łatwo oddzielone klasycznymi technikami biologii molekularnej znanymi specjalistom. Sekwencja nukleotydowa sekwencji ITR adenowirusów ludzkich (w szczególności serotypów Ad2 i Ad5) jest opisana w literaturze, podobnie jak dla adenowirusów psich (mianowicie CAV1 i CAV2). Na przykład w przypadku adenowirusa Ad5 lewa sekwencja ITR odpowiada regionowi genomu obejmującemu nukleotydy 1 do 103.
Sekwencja opłaszczania (oznaczana również jako sekwencja Psi) jest niezbędna do opłaszczania wirusowego DNA. Region ten powinien być zatem obecny aby możliwe było utworzenie rekombinacyjnych, zdefektowanych adenowirusów według wynalazku. Sekwencja opłaszczania jest zlokalizowana w genomie adenowirusa między lewą ITR (5^ a genem El (figura 1). Może być ona wyizolowana lub zsyntetyzowana sztucznie za pomocą klasycznych technik biologii molekularnej. Sekwencja nukleotydowa sekwencji opłaszczania adenowirusów ludzkich (w szczególności serotypów Ad2 i Ad5) jest opisana w literaturze, podobnie jak adenowirusów psich (mianowicie CAV1 i CAV2). Na przykład w przypadku adenowirusa Ad5 sekwencja opłaszczania odpowiada regionowi genomu zawierającemu nukleotydy 194 do 358.
Istnieją różne serotypy adenowirusów, których struktura i właściwości trochę się różnią. Niemniej jednak wirusy te przedstawiają sobą porównywalną organizację genetyczną a rozwiązania opisane w niniejszym zgłoszeniu mogą być łatwo odtworzone przez specjalistę dla każdego rodzaju adenowirusa.
Adenowirusy według wynalazku mogą być wirusami pochodzenia ludzkiego, zwierzęcego lub mieszanego (ludzkiego i zwierzęcego).
179 877
W przypadku adenowirusów pochodzenia ludzkiego korzystnie stosuje się wirusy z klasy C. Bardziej korzystnie spośród różnych serotypów adenowirusów ludzkich w zakresie wynalazku stosuje się adenowirusy rodzaju 2 lub 5 (Ad2 lub Ad5).
Jak wskazano powyżej, adenowirusy według wynalazku mogą być również pochodzenia zwierzęcego, lub może zawierać sekwencje pochodzące z adenowirusa zwierzęcego. Zgłaszający wykazał, że adenowirusy pochodzenia zwierzęcego są zdolne do infekowania z dużą efektywnością komórek ludzkich i że są one niezdolne do rozmnażania się w komórkach ludzkich, w których były testowane (patrz francuskie zgłoszenie patentowe nr 93 05954). Zgłaszający wykazał również, że adenowirusy pochodzenia zwierzęcego nie są wcale transkomplementame do adenowirusa pochodzenia ludzkiego, co eliminuje wszelkie ryzyko rekombinacji i rozmnażania in vivo, w obecności adenowirusa ludzkiego, co mogłoby doprowadzić do utworzenia cząstki zakaźnej. Wykorzystanie adenowirusa lub regionów adenowirusa pochodzenia zwierzęcego jest zatem szczególnie korzystne, ponieważ ryzyka nierozłącznie związane ze stosowaniem wirusów jako wektorów w terapii genowej sąjeszcze słabsze.
Adenowirusy pochodzenia zwierzęcego, które mogą być wykorzystane w wynalazku mogą być pochodzenia psiego, bydlęcego, mysiego (przykład: Mavl, Beard i współpr., Virology 75 (1990) 81), owczego, świńskiego, ptasiego lub małpiego (Przykład: SAV). W szczególności wśród adenowirusów ptasich można wymienić serotypy 1 do 10, dostępne w ATCC, jak na przykład szczepy Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) lub szczepy oznaczone ATCC VR-831 do 845. Spośród adenowirusów bydlęcych można wykorzystać różne znane serotypy, a mianowicie te, które są zdeponowane w ATCC (typy 1 do 8) o numerach akcesyjnych ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 i 769. Można również wymienić adenowirusy mysie FL (ATCC VR-550) i E20308 (ATCC VR-528), adenowirusy owcze typu 5 (ATCC VR-1343) lub typu 6 (ATCC VR-1340); adenowirus świński 5359 lub adenowirusy małpie, takie jak adenowirusy zdeponowane w ATCC pod numerami VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
Korzystnie spośród różnych adenowirusów pochodzenia zwierzęcego stosuje się adenowirus lub regiony adenowirusa pochodzenia psiego, a zwłaszcza wszelkie szczepy adenowirusa CAV2 (na przykład szczep manhattan lub A26/61 (ATCC VR-800). Adenowirusy psie były przedmiotem licznych badań strukturalnych. W stanie techniki opisane są również kompletne mapy restrykcyjne adenowirusów CAV1 i CAV2 (Spibey i współpr., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), a geny Ela, E3 oraz sekwencje ITR zostały sklonowane i zsekwencjonowane (patrz zwłaszcza Spibey i współpr., Virus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO91/11525).
Jak wskazano powyżej, adenowirusy według wynalazku zawierają sekwencję heterologicznego DNA. Przez sekwencję heterologicznego DNA określa się każdą sekwencję DNA wprowadzoną do wirusa rekombinacyjnego, która jest przenoszona i/lub której ekspresja w komórce celowej jest pożądana.
W szczególności sekwencja heterologicznego DNA może zawierać jeden lub więcej genów terapeutycznych i/lub jeden lub więcej genów kodujących dla peptydów antygenowych.
Genami terapeutycznymi, które mogą być również przenoszone są wszelkie geny, których transkrypcja i ewentualnie translacja w komórce celowej generuje produkty mające działanie terapeutyczne.
Chodzi w szczególności o geny kodujące dla produktów proteinowych mających działanie terapeutyczne. Tak kodowanym produktem terapeutycznym może być białko, peptyd, aminokwas, etc. Ten produkt proteinowy może być homologiczny w stosunku do komórki celowej (to jest produkt, którego ekspresja normalnie przebiega w komórce celowej kiedy nie jest ona dotknięta żadanąpatologią). W tym przypadku ekspresja białka pozwala na przykład za złagodzenie skutków niewystarczającej ekspresji komórkowej lub ekspresji białka nieaktywnego albo słabo aktywnego z powodu modyfikacji, albo nawet na nadekspresję wspomnianego białka. Gen terapeutyczny może również kodować mutant białka komórkowego, mający zwiększoną stabil
179 877 ność, zmodyfikowaną aktywność, etc. Produkt proteinowy może być również heterologiczny w stosunku do komórki celowej. W tym przypadku wyrażane białko może na przykład uzupełniać lub zwiększać deficytową aktywność komórkową co pozwala na zwalczanie przez komórkę choroby.
Spośród produktów terapeutycznych w rozumieniu niniejszego wynalazku można w szczególności wymienić enzymy, produkty krwiopochodne, hormony, limfokiny: interleukiny, interferony, TNF, etc, (FR 9203120), czynniki wzrostowe, neurotransmitery lub ich prekursory albo enzymy syntetyzujące, czynniki troficzne: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteiny. ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), dystrofma lub minidystrofina (FR 9111947), geny supresorowe nowotworów: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), geny kodujące czynników krzepnięcia krwi: czynniki VII, VIII i IX, etc.
Genem terapeutycznym może być również gen lub sekwencja antysensu, której ekspresja w komórce pozwala na regulację ekspresji genów lub transkrypcji komórkowych RNA. Sekwencje te mogą być na przykład transkrybowane w komórce celowej na RNA komplementarne do RNA komórkowych, blokując również ich translację do białka, według techniki opisanej w patencie EP 140308.
Jak wskazano powyżej, heterologiczna sekwencja DNA może również zawierać jeden lub kilka genów kodujących peptyd antygenowy, zdolny do wytwarzania u człowieka odpowiedzi immunologicznej. W tym szczególnym sposobie realizacji wynalazek pozwala na uzyskanie szczepionek, pozwalających na uodpamianie człowieka, zwłaszcza przeciwko mikroorganizmom lub wirusom. Chodzi zwłaszcza o peptydy antygenowe swoiste dla wirusa Epstein-Barra, wirusa HIV, wirusa zapalenia wątroby typu Β (EP 185573), wirusa wścieklizny rzekomej lub nawet swoistych dla nowotworów (EP 259212).
Generalnie heterologiczna sekwencja DNA zawiera również sekwencje umożliwiające ekspresję genu terapeutycznego i/lub genu kodującego peptyd antygenowy w komórce zainfekowanej. Chodzi o sekwencje, które sąnaturalnie odpowiedzialne za ekspresję genu gdy sekwencje te są zdolne do funkcjonowania w komórce zainfekowanej. Chodzi również o sekwencje innego pochodzenia (odpowiedzialne za ekspresję innych białek lub białek syntetycznych). W szczególności chodzi o sekwencje promotorowe genów eukariotów lub wirusowych. Na przykład chodzi o sekwencje promotorowe pochodzące z genomu komórki, którą zamierza się zainfekować. Chodzi również o sekwencje promotorowe pochodzące z genomu wirusa, to jest zastosowanego adenowirusa. Można na przykład wymienić promotory genów El A, MLP, CMV, RSV, etc. Ponadto te sekwencje ekspresyjne mogą być zmodyfikowane przez dodanie sekwencji aktywacyjnej, regulacyjnej, etc. Z drugiej strony, kiedy wprowadzany gen nie zawiera sekwencji ekspresyjnej, może on być wprowadzany do genomu zdefektowanego wirusa poniżej takiej sekwencji.
Z drugiej strony, heterologiczna sekwencja DNA może również zawierać, w szczególności powyżej genu terapeutycznego, sekwencję sygnałową kierującą syntetyzowany produkt terapeutyczny na ścieżki wydzielania komórki celowej. Ta sekwencja sygnałowa może być naturalną sekwencją sygnałową produktu terapeutycznego, ale może również chodzić o każdą inną funkcjonalną sekwencję sygnałową lub sztuczną sekwencję sygnałową.
Jak wskazano powyżej, wektory według wynalazku posiadają co najmniej jeden niefunkcjonalny gen E2, E4, LI -L5. Przedmiotowy gen wirusowy można uczynić niefunkcjonalnym za pomocą dowolnej techniki znanej specjalistom, a w szczególności przez supresję, wymianę, delecję lub addycję jednej lub kilku zasad w przedmiotowym genie lub genach. Modyfikacje takie mogą być uzyskiwane in vitro (na DNA izolowanym) lub in situ, na przykład za pomocą technik inżynierii genetycznej lub przez działanie czynnikami mutagennymi.
Spośród czynników mutagennych można wymieć na przykład czynniki fizyczne, takie jak promieniowanie energetyczne (promienie X, g, ultrafiolet, etc.) lub czynniki chemiczne, zdolne do reagowania z różnymi grupami funkcyjnymi zasad DNA na przykład czynniki alkilujące (etylometanosulfonian (EMS), N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna, 1 -tlenek N-nitrochinoliny (NQO)), czynniki dialkilujące, czynniki interkalujące, etc.
179 877
Przez delecję rozumie się wszelkie usuwanie przedmiotowego genu. Chodzi w szczególności o cały lub część regionu dokującego wspomniany gen i/lub cały lub część regionu promotorowego dla transkrypcji wspomnianego genu. Usuwanie może być prowadzone przez trawienie za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych a następnie ligację, za pomocą klasycznych technik, tak jak opisano w przykładach.
Modyfikacje genetyczne mogą być również uzyskane przez rozerwanie genowe, na przykład zgodnie z protokołem opisanym po raz pierwszy przez Rothsteina (Meth. Enzymol. 101 (1983) 202). W tym przypadku całość lub część sekwencji kodującej jest preferencyjnie zaburzana poprzez umożliwienie wymiany, za pomocą rekombinacji homologicznej, sekwencji genomowej na sekwencję niefunkcjonalną lub zmutowaną.
Ta lub wspomniane modyfikacje genetyczne mogą być zlokalizowane w części kodującej rozważanego genu, lub poza regionem kodującym, na przykład w regionach odpowiedzialnych za ekspresję i/lub regulację transkrypcji wspomnianych genów. Niefunkcjonalny charakter wspomnianych genów może zatem manifestować się przez wytwarzanie białka, które jest nieaktywne z powodu modyfikacji strukturalnych lub konformacyjnych, przez brak wytwarzania, przez wytwarzanie białka mającego zmienioną aktywność lub przez wytwarzanie białka naturalnego w zmniejszonej ilości lub według pożądanego sposobu regulacji.
Z drugiej strony niektóre zmiany, takie jak mutacje punktowe, są z natury podatne na korygowanie lub osłabianie za pomocą mechanizmów komórkowych. Zainteresowanie takimi zmianami genetycznymi ze strony przemysłu jest zatem ograniczone. Szczególnie korzystne jest zatem, aby charakter niefunkcj onalny był wyj ątkowo trwały segregacyjnie i/lub nieodwracalny.
Korzystnie gen jest niefunkcjonalny z powodu delecji częściowej lub całkowitej.
Korzystnie zdefektowane adenowirusy rekombinacyjne według wynalazku są pozbawione genów późnych adenowirusa.
Szczególnie korzystną postacią wynalazku jest zdefektowany adenowirus rekombinacyjny, zawierający:
- sekwencje ITR,
- sekwencję umożliwiającą opłaszczanie,
- heterologiczną sekwencję DNA, i
- region noszący gen lub część genu E2.
W inne szczególnie korzystnej postaci wynalazku zdefektowany adenowirus rekombinacyjny zawiera:
- sekwencje ITR,
- sekwencję umożliwiającą opłaszczenie,
- heterologiczną sekwencję DNA, i
- region noszący gen lub część genu E4.
W jeszcze innej szczególnie korzystnej postaci wektory według wynalazku posiadają ponadto gen funkcjonalny E3 pod kontroląpromotora heterologicznego. Bardziej korzystnie wektory posiadają część genu E3, pozwalającą na ekspresję białka gpl9K.
Zdefektowane adenowirusy rekombinacyjne według wynalazku mogą być otrzymane na różne sposoby.
Pierwszy sposób polega na transfekowaniu DNA zdefektowanego wirusa rekombinacyjnego, otrzymanego in vitro (przez ligację lub w postaci plazmidu) do kompetentnej linii komórkowej, to jest linii posiadającej wszystkie funkcje niezbędne do komplementacji zdefektowanego wirusa. Korzystnie funkcje te są zintegrowane z genomem komórki, co pozwala na uniknięcie zagrożeń rekombinacji i nadaje linii komórkowej zwiększoną stabilność. Otrzymywanie takich linii komórkowych jest opisane w przykładach.
Drugie podejście polega na ko-transfekcji do odpowiedniej linii komórkowej DNA zdefektowanego wirusa rekombinacyjnego in vitro (przez ligację lub w postaci plazmidu) i DNA wirusa pomocniczego. Zgodnie z tym sposobem nie jest konieczne dysponowanie kompetentną linią komórkową, zdolną do komplementacji wszystkich brakujących funkcji adenowirusa rekombinacyjnego. Część tych funkcji jest w praktyce komplementowana przez wirus pomocni
179 877 czy. Ten wirus pomocniczy powinien być sam zdefektowany, a linia komórkowa przenosi wszystkie funkcje konieczne do uzupełnienia. Otrzymywanie zdefektowanych adenowirusów rekombinacyjnych według wynalazku tym sposobem jest również zilustrowane w przykładach.
Spośród linii komórkowych mogących znaleźć zastosowanie w sposobie według drugiego podejścia można wymienić w szczególności linię nerki zarodka ludzkiego 293, komórek KB, komórek Hela, MDCK, GHK, etc (patrz przykłady).
Wektory, które nie są rozmnożone są regenerowane, oczyszczane i amplifikowane za pomocą klasycznych technik biologii molekularnej.
Wynalazek niniejszy dotyczy zatem także linii komórkowych nadających się do zainfekowania przez adenowirusa, zawierających zintegrowane ze swoim genomem funkcje niezbędne do uzupełnienia opisanego poprzednio zdefektowanego adenowirusa rekombinacyjnego. W szczególności wynalazek dotyczy linii komórkowych, zawierających zintegrowane w swoim genomie regiony El i E2 (w szczególności region kodujący białko 72K) i/lub E4 i/lub gen receptora glukokortykoidowego. Korzystnie linie te otrzymuje się wychodząc z linii 293 lub gm DBP6.
Wynalazek niniejszy dotyczy również środka farmaceutycznego, zawierającego jeden lub kilka zdefektowanych adenowirusów rekombinacyjnych takich jak opisane poprzednio. Środki farmaceutyczne według wynalazku mogą być formułowane zależnie od sposobu podawania drogą miejscową doustną pozajelitową donosową dożylną domięśniową podskórną dooczną transdermalną etc.
Korzystnie środek farmaceutyczny zawiera podłoża farmaceutyczne dopuszczalne dla preparatów iniekcyjnych. Chodzi w szczególności o jałowe i izotoniczne roztwory soli (fosforan monosodowy i disodowy, chlorek sodu, potasu, wapnia lub magnezu, etc., lub mieszaniny takich soli) lub kompozycje suche, zwłaszcza liofilizowane, które po dodaniu zależnie od potrzeby jałowej wody lub surowicy fizjologicznej umożliwiają utworzenie roztworów do iniekcji.
Dawki wirusa stosowane do iniekcji mogą być dobrane zależnie od różnych parametrów, w szczególności zależnie od zastosowanej drogi podawania, choroby, wyrażanego genu lub nawet wymaganego czasu leczenia. Generalnie adenowirusy rekombinacyjne według wynalazku są for mułowane i podawane w postaci dawek zawartych między 104a 1014 pfu/ml, a korzystnie 106a 1010 pfu/ml. Określenie pfu („plaque forming unit”) odpowiada zdolności zakażającej roztworu wirusa i jest oznaczane przez zakażenie odpowiedniej hodowli komórkowej i pomiar, na ogół po 5 dniach, liczby łysinek zainfekowanych komórek. Techniki oznaczania miana pfu roztworu wirusowego są dobrze udokumentowane w literaturze.
Zależnie od rodzaju wprowadzonej sekwencji heterologicznego DNA adenowirusy według wynalazku mogą być wykorzystane do leczenia lub zapobiegania licznym chorobom, łącznie z chorobami genetycznymi (dystrofia, mukowiscydoza, etc.), chorób neurodegeneracyjnych (choroba Alzheimera, Parkinsona, ALS), nowotworów, patologii leżących u podłoża zaburzeń krzepnięcia lub dyslipoproteinemii, patologii leżących u podłoża infekcji wirusowych (zapalenie wątroby, AIDS, etc.).
Wynalazek zostanie dokładniej opisany za pomocą poniższych przykładów, które należy traktować jako ilustracyjne i nieograniczające.
Objaśnienie figur
Figura 1: Organizacja genetyczna adenowirusa Ad5. Kompletna sekwencja Ad5 jest dostępna na podstawie danych i pozwala specjaliście na wyselekcjonowanie lub stworzenie wszystkich miejsc restrykcji, jak również wyizolowanie całego regionu genomu. Fig. 2: Mapa restrykcyjna adenowirusa CAV2 szczep Manhattan (według Spibey i współp., cyt. uprzednio). Fig. 3: Konstrukcja zdefektowanych wirusów według wynalazku przez ligację. Fig. 4: Konstrukcja wirusa rekombinacyjnego noszącego gen E4. Fig. 5: Konstrukcja wirusa rekombinacyjnego noszącego gen E2. Fig. 6: Konstrukcja i ilustracja plazmidu pPY32. Fig. 7: Ilustracja plazmidu pPY55. Fig. 8: Ilustracja plazmidu p2. Fig. 9: Ilustracja plazmidu pośredniego, stosowanego do konstrukcji plazmidu pITRL5-E4. Fig. 10: Ilustracja plazmidu pITRL5-E4.
179 877
Ogólne techniki biologii molekularnej
Metody klasycznie stosowane w biologii molekularnej, takie jak preparatywna ekstrakcja DNA plazmidu, wirowanie DNA plazmidu w gradiencie chlorku cezu, elektroforeza na żelach agarozowych lub akryloamidowych, oczyszczanie fragmentów DNA przez elektroelucję, ekstrakcję białek fenolem lub układem feno-chloroform, wytrącanie DNA w środowisku soli za pomocą etanolu lub izopropanolu, transformacja w Escherichia coli, etc..., są dobrze znane specjalistom i obficie opisane w literaturze (Maniatis T. i współpr., „Molecular Cloning, a Laboratory Manuał”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. i współpr., (ed.), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, New York 1987).
Plazmidy rodzaju pBR322, pUC i fagi serii M13 są pochodzenia handlowego (Bethesda Research Laboratories).
W celu ligacji fragmenty DNA mogą być rozdzielone pod względem ich wielkości przez elektroforezę na żelach agarozowych lub akryloamidowych, ekstrahowane fenolem łub mieszaniną fenol/chloroform, strącane etanolem, a następnie inkubowane w obecności ligazy DNA faga T4 (Biolabs) zgodnie z instrukcjami dostawcy.
Wypełnienie wystających końców 5' może być dokonane za pomocąfragmentu Klenowa polimerazy DNA E.coli (Biolabs) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Obcięcie wystających końców 3' przeprowadza się w obecności polimerazy DNA faga T4 (Biolabs) zgodnie z zaleceniami dostawcy. Obcięcie wystających końców 5' przeprowadza się przez ostrożne działanie nukleazą SI.
Ukierunkowana mutageneza in vitro za pomocą oligodezoksynukleotydów syntetycznych może być przeprowadzona metodą opracowaną przez Taylora i współpr. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] przy użyciu zestawu dostarczanego przez firmę Amersham.
Enzymatyczna amplifikacja fragmentów DNA za pomocą techniki zwanej PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. i współpr., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. i Faloona F.A., Meth Enzym. 155 (1987) 335-350] może być przeprowadzona przy użyciu urządzenia zwanego „DNA thermal cycler” (Perkin Ehner Cetus) zgodnie z opisem producenta.
Weryfikacja sekwencji nukleotydowych może być przeprowadzona metodą opracowaną przez Sangera i współpr. [Prosc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467], przy użyciu zestawu dostarczanego przez firmę -Amersham.
Stosowane linie komórkowe
W poniższych przykładach mogą być wykorzystane następujące linie komórkowe:
- Linia nerki zarodka ludzkiego 293 (Graham i współpr., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Linia ta zawiera w szczególności, zintegrowaną ze swoim genomem, lewą część genomu adenowirusa ludzkiego Ad5 (12%).
- Linia ludzkich komórek KB: pochodząca od raka naskórka ludzkiego, linia ta j est dostępna w ATCC (nr ref. CCL17) łącznie z warunkami umożliwiającymi jej hodowlę.
- Linia komórek ludzkich Hela: pochodząca od ludzkiego raka śródbłonka, linia ta wraz z warunkami do jej hodowli jest dostępna w ATCC (nr ref. CCL2).
- Linia komórek psich MDCK: Warunki hodowli komórek MDCK zostały opisane w szczególności przez Macatneya i współpr., Science 44 (1989) 9.
- Linia komórkowa gm DBP6 (Brough i współpr., Virology 190 (1992) 624). Linia ta jest utworzona przez komórki Hela, noszące gen E2 adenowirusa pod kontrolą LTR z MMTV.
Przykłady
Przykład I
Przykład ten wykazuje możliwość wykonania adenowirusa rekombinacyjnego pozbawionego genów wirusowych. W tym celu skonstruowano serię mutantów delecyjnych adenowirusa przez ligację in vitro i każdy z tych mutantów ko-transfekowano za pomocą wirusa pomocniczego do komórek KB. Komórki te nie pozwalają na rozmnażanie się wirusów z brakiem El, tak więc trans-komplementacja dotyczy regionu El.
Z adenowirusa Ad5 otrzymano różne mutanty delecyjne przez trawienie, a następnie ligację in vitro. W tym celu wyizolowano DNA wirusa Ad5 za pomocą techniki opisanej przez Lippa i współpr. (J. Yirol. 63 (1989) 5133), poddano trawieniu w obecności różnych enzymów restry
179 877 kcyjnych (patrz figura 3), po czym produkt trawienia ligowano w obecności ligazy DNA faga T4. Wielkość różnych mutantów delecyjnych sprawdzano następnie na żelu agarozowym SDS 0,8%. Następnie sporządzono mapę tych mutantów (patrz figura 3). Te różne mutanty zawierały następujące regiony:
mt 1: ligacja między fragmentami Ad5 0-20642 (Saul) i (Saul) 33797-35935 mt 2: ligacja między fragmentami Ad5 0-19549 (Ndel) i (Ndel) 31089-35935 mt 3: ligacja między fragmentami Ad5 0-10754 (Aatll) i (Aatll) 25915-35935 mt 4: ligacja między fragmentami Ad5 0-11311 (Mlul) i (Mlul) 24392-35935 mt 5: ligacja między fragmentami Ad5 0-9462 (Sali) i (Xhol) 29791-35935 mt 6: ligacja między fragmentami Ad5 0-5788 (Xhol) i (Xhol) 29791-35935 mt 7: ligacja między fragmentami Ad5 0-3665 (SphI) i (SphI) 31224-35935
Każdy z mutantów otrzymanych powyżej ko-transfekowano z DNA wirusowym Ad.RSV 3Gal (Stratford-Perricaudet i współpr., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) do komórek KB w obecności fosforanu wapnia. Komórki zebrano w 8 dni po transfekcji, a supematanty hodowli zebrano i amplifikowano na komórkach KB aż do otrzymania zasobu 50 studzienek na każdątransfekcję. Z każdej próbki wyizolowano DNA episomu i rozdzielono na gradiencie chlorku cezu. W każdym przypadku zaobserwowano dwa różne prążki wirusa, które wycięto i zanalizowano. Prążek o większym ciężarze cząsteczkowym odpowiadał DNA wirusowemu Ad.RSV3Gal, a prążek o mniejszym ciężarze DNA wirusa wytworzonego przez ligowanie (fig. 3). Miano uzyskane dla prążka lżejszego wynosi około 108pfu/ml.
Za pomocą tej samej metodologii skonstruowana in vitro drugą serię mutantów delecyjnych adenowirusa. Te różne mutanty zawierały następujące regiony:
mt8: ligacja między fragmentami 0-4623 (Apal) Ad RS vpGal i (Apal) 31909-35935 Ad5 mt9: ligacjamiędzy fragmentami 0-10178 (BgHI) AdRSYfiGal i (BamHI) 21562-35935 Ad5. Mutanty te, noszące gen LacZ pod kontrolą promotora LTR wirusa RS V ko-transfekowano następnie do komórek 293 w obecności DNA wirusowego H2dl 808 (Weinberg i współpr., J. Virol. 57 (1986) 833) z wyciętym regionem E4. W tej drugiej technice transkomplementacja dotyczy E4 a nie El. Technika ta pozwala również na generowanie, jak opisano powyżej, wirusów rekombinacyjnych posiadających jako gen wirusowy tylko region E4.
Przykład II
Przykład ten opisuje otrzymywanie zdefektowanych adenowirusów rekombinacyjnych według wynalazku przez ko-transfekcję za pomocą wirusa pomocniczego DNA wirusa rekombinacyjnego inkorporowanego do plazmidu.
W tym celu skonstruowano plazmid noszący złącza ITR z Ad5, sekwencję opłaszczania, gen E4 pod kontrolą właściwego promotora i jako gen heterologiczny gen LacZ pod kontrolą kpromotora LTR wirusa RSV (fig. 4). Plazmid ten, oznaczony pE4Gal, otrzymano przez klonowanie i ligację następujących fragmentów (patrz fig. 4):
- fragment Hindlll-SacII pochodzący z plazmidu pFG144 (Graham i współpr., EMBO J. 8 (1989) 2077). Fragment ten nosi sekwencje ITR z Ad5 w części przedniej łańcucha i sekwencję opłaszczania: fragment Hindlll (34920)-SacII (352).
- fragment Ad5 zawarty między miejscami SacII (zlokalizowany na poziomie pary zasad 3827) i Pstl (zlokalizowany na poziomie pary zasad 4245);
- fragment pSP 72 (Promega) zawarty między miejscami Pstl (pz 32) i Sali (pz 34);
- fragment Xhol-Xbal plazmidu pAdLTR Gal IX opisany przez Stratford-Perricaudet i współpr. (JCI 90 (1992) 626). Fragment ten nosi gen LacZ pod kontrolą LTR z wirusa RSV.
- fragment Xbal (pz 40) - Ndel (pz 2379) plazmidu pSP 72;
- fragment Ndel (pz 31089) - Hindlll (pz 34930) Ad5. Fragment ten, zlokalizowany na prawym końcu genomu Ad5 zawiera region E4 pod kontrolą właściwego promotora. Sklonowano go na poziomie miejsc Ndel (2379) plazmidu pSP 72 i Hindlll fragmentu pierwszego.
Plazmid ten otrzymano przez klonowanie różnych fragmentów we wskazanych regionach plazmidu pSP 72. Zrozumiałe jest, że równoważne fragmenty mogą być otrzymane przez specjalistę z innych źródeł.
179 877
Plazmid pE4Gal następnie ko-transfekowano z DNA wirusa H2dl808 do komórek 293 w obecności fosforanu wapnia. Następnie otrzymano wirus rekombinacyjny w sposób opisany w przykładzie I. Wirus ten nosi, jako pojedynczy gen wirusowy, gen E4 adenowirusa Ad5 (fig. 4). Jego genom ma wielkość około 12 kz, co pozwala na insercję bardzo dużego DNA heterologicznego (do 20 kz). Ponadto specjalista może łatwo zastąpić gen LacZ przez inny gen terapeutyczny, taki jak jeden z wymienionych powyżej. Wirus ten zawiera między innymi niektóre sekwencje pochodzące od plazmidu pSP 72, które w razie konieczności mogą być wyeliminowane za pomocą klasycznych technik biologii molekularnej.
Przykład ΠΙ
Ten przykład opisuje otrzymywanie innego zdefektowanego adenowirusa rekombinacyjnego według wynalazku przez ko-transfekcję za pomocą wirusa pomocniczego DNA wirusa rekombinacyjnego włączonego do plazmidu.
W tym celu skonstruowano plazmid noszący złącza ITR z Ad5, sekwencję opłaszczania, gen E2 i Ad2 pod kontrolą właściwego promotora i, jako gen heterologowy, gen LacZ pod kontroląpromotora LTR wirusa RSV (fig. 5). Plazmid ten, oznaczony pE2Gal, otrzymano przez klonowanie i ligowanie odpowiednich fragmentów (patrz fig. 5):
- fragment Hindlll pochodzący z plazmidu pFG144 (Graham i współpr., EMBO J. 8 (1989) 2077). Fragment ten nosi sekwencje ITR Ad5 na czele łańcucha i sekwencję opłaszczania: fragment HindUI (34920)-SacII (352). Klonowano go, z poniższym fragmentem, na poziomie miejsc Hindlll (16)-PstI (32) plazmidu pSP 72.
- fragment Ad5 zawarty między miejscami Sac Π (zlokalizowany na poziomie pary zasad 3 827) i Pstl (zlokalizowany na poziomie pary zasad 4245). Ten fragment klonowano na poziomie miejsca SacII poprzedniego fragmentu i miejsca Pstl (32) plazmidu pSP 72.
- fragment pSP 72 (Promega) zawarty między miejscami Pstl (pz 32) i Sali (pz 34);
- fragment Xhol-Xbal plazmidu pAdLTR CalIX opisany przez Stratford-Perricaudet i współpr. (JCI 90 (1992) 626). Fragment ten przenosi gen LacZ pod kontrolą LTR wirusa RSV. Sklonowano go na poziomie miejsc Sali (34) i Xbal plazmidu pSP 72.
- fragment pSP 72 (Progema) zawarty między miejscami Xbal (pz 34) i BamHI (pz 46);
- fragment BamHI (pz 21606) - Smal (pz 27339) Ad2. Ten fragment genomu Ad2 zawiera region E2 pod kontrolą właściwego promotora. Sklonowano go na poziomie miejsc BamHI (46) i EcoRV plazmidu pSP 72.
- fragment EcoRV (pz 81) -Hindlll (pz 16) plazmidu pSP 72.
Plazmid ten otrzymano przez klonowanie różnych fragmentów we wskazanych regionach plazmidu pSP 72. Zrozumiałe jest, że równoważne fragmenty mogą być otrzymane przez fachowca wychodząc z innych źródeł.
Plazmid pE2Gal ko-transfekowano następnie z DNA wirusa H2dl 802, pochodzącym z regionu E2 (Rice i współpr., J. ViroL 56 (1985) 767) do komórek 293 w obecności fosforanu wapnia. Następnie otrzymano wirusa rekombinacyjnego w sposób pisany w przykładzie I. Wirus ten przenosi, jako pojedynczy gen wirusowy, gen E2 adenowirusa Ad2 (fig. 5). Jego genom ma wielkość około 12 kz, co pozwala na insercję DNA heterologowego o dużej wielkości (do 20 kz). Ponadto specjalista może łatwo zastąpić gen LacZ dowolnym innym terapeutycznym, takim jak wspomniane powyżej. Z drugiej strony wirus ten zawiera pewne sekwencje pochodzące z plazmidu pośredniego, które w frazie konieczności można wyeliminować za pomocą klasycznych technik biologii molekularnej.
Przykład IV
Ten przykład pisuje konstrukcję linii komórkowych komplementarnych dla regionów El, E2 i/lub E4 adenowirusa. Linie te umożliwiają konstrukcję adenowirusów rekombinacyjnych według wynalazku z delecjątych regionów bez uciekania się do wirusa pomocniczego. Wirusy te otrzymano przez rekombinację in vivo i mogą one zawierać ważne sekwencje heterologiczne.
W opisanych liniach komórkowych regiony E2 i E4, które są potencjalnie cytotoksyczne, są umieszczone pod kontroląpromotora induko walnego: LTR z MMTV (Pharmacia), indukowanego przez deksametazon, albo natywnego albo w postaci minimalnej, opisanej w PNAS 90
179 877 (1993) 5603; lub systemu z represją tetracyklinową, opisanego przez Gosena i Bujard (PNAS 89 (1992) 5547). Jest zrozumiałe, że mogąbyć wykorzystane inne promotory, a zwłaszcza odmiany LTR z MMTV, noszące na przykład regiony heterologowe regulacji (zwłaszcza region „wzacniacza”). Linia według wynalazku skonstruowano przez transfekcję odpowiadających komórek w obecności fosforanu wapnia fragmentem DNA przenoszącym wskazane geny (region adenowirusa i/lub genu receptora glikokortykoidowego) pod kontrolą promotora transkrypcji i terminatora (miej sca poliadenylacj i). Terminatorem może być terminator naturalny transfekowanego genu albo inny terminator, jak na przykład terminator wczesnego mRNA wirusa SV40. Korzystnie fragment DNA przenosi również gen umożliwiający selekcję transformowanych komórek, na przykład gen oporności na gentycynę. Gen odporności może być również przenoszony przez inny fragment DNA, ko-transfekowany razem z pierwszym.
Po transfekcji transformowane komórki są selekcjonowane, a ich DNA analizowany w celu potwierdzenia integracji fragmentu DNA z genomem.
Technika ta pozwala na otrzymanie następujących linii komórkowych.
1. Komórki 293, posiadające gen 72K regionu E2 Ad5 pod kontrolą LTR z MMTV;
2. Komórki 293, posiadające gen 72K regionu E2 Ad5 pod kontroląLTR z MMTV i gen receptora glikokortykoidowego;
3. Komórki 293, posiadające gen 72K regionu E2 Ad5 pod kontroląLTR z MMTV i region E4 pod kontrolą LTR z MMTV;
4. Komórki 293, posiadające gen 72K regionu E2 Ad5 pod kontroląLTR z MMTV, region E4 pod kontrolą LTR z MMTV i gen receptora glikokortykoidowego;
5. Komórki 293, posiadające region E4 pod kontrolą LTR z MMTV;
6. Komórki 293, posiadające region E4 pod kontroląLTR z MMTV i gen receptora glikokortykoidowego;
7. Komórki gm DBP6 posiadające regiony E1A i E1B pod kontrolą właściwego promotora;
8. Komórki gm DBP6 posiadające regiony El A i El B pod kontrolą właściwego promotora i region E4 pod kontrolą LTR z MMTV.
Przykład V
Przykład ten opisuje otrzymywanie zdefektowanych adenowirusów rekombinacyjnych według wynalazku, z których genomu wycięto geny El, E3 i E4. Zgodnie z korzystnym sposobem realizacji wynalazku, opisanym zwłaszcza w tym przykładzie i przykładzie III, genom adenowirusów rekombinacyjnych według wynalazku zmodyfikowano w ten sposób, że geny El i E4 są co najmniej niefunkcyjne. Takie adenowirusy posiadają przede wszystkim zdolność inkorporacji ważnych genów heterologicznych. Z drugiej strony wektory te posiadająpodwyższone bezpieczeństwo z powodu delecji regionu E4, który jest zaangażowany w regulację ekspresji genów późnych, stabilność RNA jądrowych późnych, tłumienie ekspresji białek w komórce biorcy i w efektywność replikacji wirusowego DNA. Wektory te posiadają zatem bardzo zmniejszone tło transkrypcji i ekspresji genów wirusowych. Wreszcie bardzo korzystne jest, że wektory te mogą być wytwarzane do mian porównywalnych z adenowirusami typu dzikiego.
Adenowirusy te otrzymano z plazmidu pPY55, przenoszącego część prawą genomu adenowirusa Ad5 zmodyfikowaną przez ko-transfekcję za pomocą plazmidu pomocniczego (patrz również przykłady I, Π i ΙΠ) albo za pomocą linii komplementarnej (przykład IV).
5.1. Konstrukcja plazmidu pPY55
a) Konstrukcja plazmidu pPY32
Fragment AvrII-BcII plazmidu pFG144 [F.L. Graham i współpr., EMBO J. 8 (1989) 2077-2085], odpowiadający prawemu końcowi genomu adenowirusa Ad5 klonowano najpierw między miejscami Xbal i BamHI wektora pIC19H, otrzymanego ze struktury dam-. Otrzymuje się w ten sposób plazmid pPY32. Interesującą cechą plazmidu pPY32 jest to, że miejsce Sali pochodzące z miejsca wielokrotnego klonowania wektora pIC19H pozostaje unikalne i że jest ono zlokalizowane w pobliżu prawego końca genomu adenowirusa Ad5. Następnie fragment HaelllSall plazmidu pPY23, który zawiera prawy koniec genomu adenowirusa Ad5 począwszy od miejsca HaeUI, zlokalizowanego w pozycji 35614, sklonowano między miejsca EcoRV i Xhol wekto
179 877 ra pIC20H, otrzymując plazmid pPY29. Interesującą cechą tego plazmidu jest to, że miejsca Xbal i Ciał, pochodzące z wielomiejscowego klonowania wektora pIC20H są zlokalizowane obok złącza EcoRV/HaeIII, powstającego w wyniku klonowania. Co więcej, złącze to modyfikuje strukturę nukleotydowąbezpośrednio sąsiadującąz miejscem Ciał, które staje się wtedy metylowalne w strukturze dam+.
Następnie fragment Xbał (30470)-MaeII (32811) genomu adenowirusa Ad5 klonowano między miejscami Xbał a Ciał plazmidu pPY29, wytworzonego ze struktury dam+, otrzymując palzmid pPY30. Na końcu fragment Sstł plazmidu pPY30, odpowiadający sekwencji genomu adenowirusa Ad5 od miejsca Sstł w pozycji 30556 do prawego końca sklonowane między miejscami Sstł wektora pIC20H, otrzymując plazmid pPY31, którego mapa restrykcyjna dla insertu zlokalizowanego między miejscami Hindllł jest podana na fig. 6.
Plazmid pPY32 otrzymano przez częściowe trawienie plazmidu pPY31 za pomocą BgUI, następnie trawienie całkowite za pomocą BamHI, następnie ponowną ligację. Plazmid pPY32 odpowiada zatem delecji genomu adenowirusa Ad5, usytuowanej między miejscem BamHI plazmidu pPY31 a miejscem BgUI, zlokalizowanym w pozycji 30818. Mapa restrykcyjna fragmentu Hindllł plazmidu pPY32 podana jest na fig. 6. Cechą charakterystyczną plazmidu pPY32 jest posiadanie unikalnych miejsc Sali i Xbal.
b) Konstrukcja plazmidu pPY47
Fragment BamHI (21562)-Xbał (28592) genomu adenowirusa Ad5 klonowano najpierw między miejscami BamHI a Xbal wektora plC19H, otrzymanego ze struktury dam-, otrzymując plazmid pPY17. Plazmid ten zawiera zatem fragment Hindllł (26328)-BglII (28133) genomu adenowirusa Ad5, który może być klonowany między miejscami Hindllł a BgUI wektora pIC20R z wytworzeniem plazmidu pPY34. Charakterystyką tego plazmidu jest to, że miejsce BamHI powstające z miejsca wielokrotnego klonowania, zlokalizowane jest w bezpośredniej bliskości miejsca Hindllł (26328) genomu adenowirusa Ad5.
Fragment BamHI (21562)-HindIII (26328) genomu adenowirusa Ad5 powstający z plazmidu pPY17 jest następnie klonowany między miejscami BamHI i Hindllł plazmidu pPY34 z wytworzeniem plazmidu pPY39. Fragment BamHI-Xbał plazmidu pPY39, otrzymany ze struktury dam-, zawierający część genomu adenowirusa Ad5 zawartą między miejscami BamHI (21562) i BgUI (28133) jest następnie klonowany między miejscami BamHI i Xbal wektora pIC9H, otrzymanego ze struktury dam-. Tak otrzymuje się plazmid pPY47, którego interesującą cechąjest to, że miejsce Sali, powstające z miejsca wielokrotnego klonowania jest zlokalizowane w pobliżu miejsca Hindllł (fig. 7).
c) Konstrukcja plazmidu pPY55
Fragment Salł-Xbał plazmidupPY47, otrzymany ze struktury dam-, zawierający część genomu adenowirus Ad5 począwszy od miejsca BamHI (21562) do miejsca BgUI (28133) sklonowane między miejscami Sali i Xbał plazmidu pPY32, otrzymując plazmid pPY55. Plazmid ten stosuje się bezpośrednio do otrzymania adenowirusów rekombinacyjnych ze zdeletowanymi co najmniej regionem E3 (Delecja między miejscami BgUI zlokalizowanymi w pozycjach 28133 i 30818 genomu adenowirusa Ad5) i regionem E4 w całości (delecja między miejscami Haell (32811) i Haein (35614) genomu adenowirusa Ad5 (fig. 7).
5.2. Otrzymywanie adenowirusa zawierającego co najmniej jednądelecję w regione E4, a korzystnie co najmniej w regionach El i E4.
a) Otrzymywanie przez ko-transfekcję za pomocą wirusa pomocniczego E4 w komórkach 293
Zasada polega na transkomplementacji między „mini-wirusem” (wirusem pomocniczym) wyrażającym region E4 a wirusem rekombinacyjnym ze zdeletowanymi co najmniej E3 i E4. Wirusy te otrzymuje się przez ligowanie in vitro albo przez rekombinację in vivo zgodnie z następującymi strategiami:
(i) DNA wirusa Ad-dl324 (Thimmappaya i współpr., Celi 31 (1982) 543) i plazmid pPY5 5, oba trawione za pomocą BamHI, najpierw ligowano in vitro, po czym ko-transfekowano z plazmidem pEAGal (opisany w przykładzie II) do komórek 293.
179 877 (ii) DNA wirusa Ad-dl324 trawionego EcoRI i plazmid pPY55 trawiony BamHI ko-transfekowano z plazmidem pE4Gal do komórek 293.
(iii) DNA adenowirusa Ad5 i plazmid pPY55, oba trawione BamHI, ligowano a następnie ko-transfekowano z plazmidem pE4Gal do komórek 293.
(iv) DNA adenowirusa Ad5 trawionego EcoRI i plazmid pPY55 trawiony BamHI ko-transfekotwano z pEAGal do komórek 293.
Strategie (i) i (ii) pozwalająna generowanie adenowirusa rekombinacyjnego ze zdeletowanymi regionami El, E3 i E4; strategie (iii) i (iv) pozwalająna generowanie adenowirusa rekombinacyjnego ze zdeletowanymi regionami E3 i E4. Oczywiście w strategiach (i) lub (ii) zamiast DNA wirusa Ad-dl324 może być zastosowane DNA wirusa rekombinacyjnego ze zdeletowanym regionem El, ale wyrażające dowolny transgen w celu wytworzenia wirusa rekombinacyjnego ze zdeletowanymi regionami El, E3 i E4 wyrażającego wspomniany transgen.
b) Otrzymywanie przy użyciu linii komórkowych transkomplementujących funkcje E1 i E4.
Zasada polega na tym, że linia komórkowa pochodząca z linii wyrażającej region El, na przykład linii 293, i wyrażająca również do najmniej odwrócone fazy ORF6 i ORF6/7 regionu E4 adenowirusa Ad5 pod kontrolą promotora, na przykład indukowalnego, jest zdolna do transkomplementacji zarazem regionów El i E4 adenowirusa Ad5. Takie linie opisano w przykładzie IV.
Wirus rekombinacyjny ze zdeletowanymi regionami El, E3 i E4 może zatem być otrzymany przez ligowanie in vitro lub przez rekombinację in vivo zgodnie z z protokołami opisanymi powyżej. Niezależnie od protokołu zastosowanego do generowania wirusów ze zdeletowanym co najmniej regionem E4, po transfekcji użytych komórek obserwowano efekt cytopatyczny (wskazujący na produkcję wirusów rekombinacyjnych). Następnie komórki zbierano, rozrywano przez trzy cykle zamrażania-rozmrażania supernatanta, następnie wirowano przy 4000 rpm przez 10 minut. Tak otrzymany supematant amplifikowano następnie na świeżej hodowli komórkowej (komórki 293 dla protokołów a) i komórki 293 wyrażające region E4 dla protokołu b). Następnie wirusy oczyszczano począwszy od plam i analizowano ich DNA metodą Hirta (uprzednio cytowaną). Następnie przygotowano roztwory podstawowe wirusa na gradiencie chlorku cezu.
Przykład VI
Przykład ten opisuje otrzymywanie zdefektowanych adenowirusów rekombinacyjnych według wynalazku, z których genomów wycięto geny El, E3, L5 i E4. Wektory te są szczególnie korzystne, ponieważ region L5 koduje włókno, które jest białkiem wyjątkowo toksycznym dla komórki.
Adenowirusy te otrzymano z plazmidu p2, noszącego zmodyfikowaną część prawą genomu adenowirusa Ad5, przez ko-transfekcję różnymi wirusami pomocniczymi. Mogą one być również otrzymane za pomocą linii komplementującej.
6.1. Konstrukcja plazmidu p2
Plazmid ten zawiera cały prawy region genomu adenowirusa Ad5, począwszy od miejsca BamHI (21562), z którego wycięto fragment zawarty między miejscami Xbal (28592) i AvrII (35463), noszący geny E3, L5 i E4. Plazmid p2 otrzymano przez klonowanie i ligowanie poniższych fragmentów w plazmidzie pIC19R linearyzowanym przez Bam i defosforylowanym (patrz fig. 8):
- fragment genomu adenowirusa Ad5 zawarty między miejscami BamHI (21562) i Xbal (28592), i
- prawy koniec genomu adenowirus Ad5 (zawierający prawą ITR), począwszy od miejsca AvrII (35463) do miejsca Bell (zgodne z BamHI).
6.2. Konstrukcja plazmidu pomocniczego (pITRL5-E4) noszącego gen L5
Plazmid pomocniczy pITRL5-E4 przenosi geny E4 i L5. Odpowiada on plazmidowi pE4Gal opisanemu w przykładzie II, zawierając ponadto region L5 kodujący włókno pod kontrolą promotora MLP adenowirusa Ad2. Plazmid pITRL5-E4 skonstruowano w następujący sposób (fig. 9 i 10):
Zsyntetyzowano oligonukleotyd o długości 58 pz, zawierający, w kierunku 5'-3', miejsce Hindlll, ATG włókna i sekwencję kodującą włókno do miejsca Ndel w pozycji 31089 genomu adenowirusa Ad5. Sekwencja tego oligonukleotydu jest podana poniżej, w kierunku 5'-3':
179 877
AAGCTTATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTCAACCCCGTGTATCCATATG
Miejsca Hindlll, przy 5', i Ndel, przy 3', sąpodkreślone linią pojedynczą, ATG włókna jest podkreślone podwójnie.
Fragment Sspl-Hindlll, zawierający sekwencję promotora MLP następującą po potrójnej sekwencji liderowej adenowirusa Ad5 wyizolowano z plazmidu pMLPlO (Ballay i współpr., (1987) UCLA Symposia on molecular and cellular biology, New senes, Vol. 70, Robinson i współpr. (Ed.) New-York, 481). Fragment ten wprowadzono razem z oligonukleotydem o długości 58 pz opisanym powyżej między miejsca Ndel i EcoRV plazmidu pICl 9R, otrzymując plazmid pośredni (patrz fig. 9). Do plazmidu pośredniego między miejsca Sspl i Nddel wprowadzono następnie fragment SacII (tępy)-Ndel plazmidu pE4Gal (przykład II) w celu wytworzenia plazmidu pITRL5-E4 (fig. 10).
6.3. Otrzymywanie zdefektowanych adenowirusów rekombinacyjnych zawierających delecję w regionach El, E3, L5 i E4.
a) Otrzymywanie przez ko-transfekcję z wirusem pomocniczym do komórek 293.
Zasada polega na transkomplementacji między „mini-wirusem” (wirus pomocniczy) wyrażającym region L5 lub regiony E4 i L5, a wirusem rekombinacyjnym z delecjąco najmniej E3, E4 i L5.
Wirusy te otrzymano przez ligowanie in vitro albo rekombinację in vivo zgodnie z następującymi strategiami:
(i) DNA wirusa Ad-dl324 (Thimmappaya i współpr., Celi 31(1982) 543) i plazmid p2, oba trawione BamHI najpierw ligowano in vitro, po czym kontransfekowano z plazmidem pomocniczym pITRL5-E4 (przykład 6.2.) do komórek 293.
(ii) DNA wirusa Ad-dl324 trawiono EcoRI i plazmid p2 trawiony BamHI kotransfekowano z plazmidem pITRL5-E4 do komórek 293.
(iii) DNA adenowirusa Ad5 i plazmid p2, oba trawione BamHI, ligowano a następnie kotransfekowano z plazmidem pITRL5-E4 do komórek 293.
(iv) DNA adenowirusa Ad5 trawione EcoRI i plazmid p2 trawiony BamHI kontransfekowano z pITRL5-E4 do komórek 293.
Strategie (i) i (ii) pozwalająna utworzenie adenowirusa rekombinacyjnego z wyciętymi regionami E1, E3, L5 i E4, strategie (iii) i (iv) pozwalająnautworzenie adenowirusarekombinacyjnego z wyciętymi regionami E3, L5 i E4. Oczywiście w strategiach (i) lub (ii) zamiast DNA wirusa Ad-dl324 może być zastosowane DNA wirusa rekombinacyjnego z wyciętym regionem E1, ale wyrażające dowolny transgen, w celu utworzenia wirusa rekombinacyjnego z wyciętymi regionami El, E3, L5 i E4, ale wyrażającego wspomniany transgen.
Opisane powyżej protokoły mogą być również zastosowane dla wirusów pomocniczych przenoszących tylko region L5 przy użyciu linii komórkowej zdolnej od ekspresji regionów El i E4 adenowirusa, takiej jak opisana w przykładzie IV.
Z drugiej strony jest również możliwe zastosowanie linii komplementarnej zdolnej do ekspresji regionów El, E4 i L5, w ten sposób, w celu całkowitego uwolnienia się od stosowania wirusa pomocniczego.
Po transfekcji produkty wirusowe wyodrębnia się, amplifikuje i oczyszcza w warunkach opisanych w przykładzie V.
179 877
179 877
Fig o 8
179 877
Fig. 7
179 877
trawienie cząstk^ar SsIBO trawienie par KawHIil całkowite powtórnie ligowany
Fig. 6
179 877
AmpR
179 877
179 877
Fig . 3
179 877 a, β® σ»
Μα
J
O
O
179 877
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (20)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zdefektowany replikacyjnie adenowirus rekombinacyjny zawierający sekwencje adenowirusowe, zwłaszcza pochodzące z adenowirusa psiego albo ludzkiego klasy C, oraz sekwencję heterologicznego DNA kodującą gen terapeutyczny, antysensowne RN A albo peptyd antygenowy, znamienny tym, że jako sekwencje adenowirusowe zawiera: sekwencje ITR, sekwencję kapsydacyjną, gen El posiadający delecję, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada delecję oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierającej: geny późne L1-L5 posiadające delecję, geny E3 posiadające delecję, gen L5 posiadający delecję, sprawny gen E3 od kontroląheterologicznego promotora.
- 2. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA zawiera sekwencję umożliwiającąjej ekspresję, korzystnie promotor wybrany z grupy zawierającej adenowirusowy promotor E1A, adenowirusowy promotor MLP, promotor CMV, oraz promotor RSV LTR.
- 3. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja hetgerologicznego DNA zaiwera również sekwencję sygnałową.
- 4. Zdefektowany adenowirus wedłsug zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera:- sekwencje ITR,- sekwencję kapsydacyjną,- sekwencję heterologicznego DNA, oraz region E2.
- 5. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera:- sekwencje ITR,- sekwencję kapsydacyjną,- sekwencję heterologicznego DNA, oraz- region E4.
- 6. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera:- sekwencje ITR,- sekwencję kapsydacyjną,- sekwencję heterologicznego DNA, oraz- region E4.przy czym geny E4 posiadają mutacje na zewnątrz regionu kodującego E4.
- 7. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 6, znamienny tym, że geny E4 posiadajądelecję całego lub części regionu promotora transkrypcji E4.
- 8. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 6, znamienny tym, że geny E4 posiadają substytucję co najmniej jednej zasady do genów E4.
- 9. Zdefektowany adenowirus według zastrz. 6, znamienny tym, że geny E4 posiadają mutacje w regionach odpowiedzialnych za regulację ekspresji lub transkrypcji, lub obydwu.
- 10. Linia komórkowa do infekowania replikacyjnie zdefektowanym adenowirusem rekombinacyjnym, znamienna tym, że zawiera zintegrowane w swoim genomie geny potrzebne do komplementacji replikacyjnie zdefektowanego adenowirusa rekombinacyjnego zawierającego jako sekwencje adenowirusowe: sekwencje ITR - sekwencję kapsydacyjną, gen El posiadający delecję, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada delecję oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierającej: geny późne L1-L5 posiadające delecję, geny E3 posiadające delecję, gen L5 posiadający delecję, sprawny gen E3 pod kontrolą heterologicznego179 877 promotora, przy czym jeden z komplementujących genów jest kontrolowany przez indukowalny promotor.
- 11. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera w swoim genomie gen El i gen E2, przy czym gen E2 jest kontrolowany przez indukowalny promotor.
- 12. Linia komórkowa według zastrz. 11, znamienna tym, że zawiera ponadto gen E4, przy czym gen E4 jest umieszczony pod kontrolą indukowalnego promotora.
- 13. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera w swoim genomie gen El i gen E4, przy czym gen E4 jest kontrolowany przez indukowalny promotor.
- 14. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera ponadto gen receptora glukokortykoidowego.
- 15. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera w swoim genomie geny E2 i E4, przy czym geny E2 i E4 są kontrolowane prze indukowalny promotor.
- 16. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że promotor indukowalny jest promotorem LTR z MMTV.
- 17. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera gen E2 kodujący białko 72K, przy czym gen kodujący białko 72K jest umieszczony pod kontrolą indukowalnego promotora.
- 18. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że jest otrzymana z linii ludzkich embrionalnych komórek nerki 293.
- 19. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera otwarte ramki odczytu ORF6 i ORF6/7 z E4, przy czym otwarte ramki odczytu są kontrolowane przez indukowalny promotor.
- 20. Środek farmaceutyczny zawierający czynnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera zdefektowanego replikacyjnie adenowirusa rekombinacyjnego zawierającego sekwencje adenowirusowe, zwłaszcza pochodzące z adenowirusa psiego albo ludzkiego klasy C, oraz sekwencję heterologicznego DNA kodującą gen terapeutyczny, antysensowne RNA albo peptyd antygenowy, przy czym jako sekwencje adenowirusowe zawiera: sekwencje ITR, sekwencję kapsydacyjną gen El posiadający delecję, gen E2 i E4, z których co najmniej jeden posiada delecję oraz korzystnie co najmniej jeden gen wybrany z grupy zawierającej: geny późne L1-L5 posiadające delecję, geny E3 posiadające delecję, gen L5 posiadający delecję, sprawny gen E3 pod kontrolą heterologicznego promotora.* * *
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9308596A FR2707664B1 (fr) | 1993-07-13 | 1993-07-13 | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| FR9404590A FR2718749B1 (fr) | 1994-04-18 | 1994-04-18 | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| PCT/FR1994/000851 WO1995002697A1 (fr) | 1993-07-13 | 1994-07-08 | Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL308122A1 PL308122A1 (en) | 1995-07-24 |
| PL179877B1 true PL179877B1 (pl) | 2000-11-30 |
Family
ID=26230472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94308122A PL179877B1 (pl) | 1993-07-13 | 1994-07-08 | Zdefektowany replikacyjnie adenowirus, linia komórkowa do infekowania zdefektowanym adenowirusem oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030096787A1 (pl) |
| EP (1) | EP0667912B1 (pl) |
| JP (1) | JP4190028B2 (pl) |
| KR (1) | KR100356615B1 (pl) |
| CN (1) | CN1115414C (pl) |
| AT (1) | ATE399873T1 (pl) |
| AU (1) | AU7264694A (pl) |
| BR (1) | BR9405507A (pl) |
| CA (1) | CA2144040A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ287157B6 (pl) |
| DE (1) | DE69435108D1 (pl) |
| DK (1) | DK0667912T3 (pl) |
| ES (1) | ES2310924T3 (pl) |
| FI (1) | FI951138A (pl) |
| HU (1) | HU216871B (pl) |
| IL (1) | IL110284A0 (pl) |
| NO (1) | NO321309B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ269156A (pl) |
| PL (1) | PL179877B1 (pl) |
| PT (1) | PT667912E (pl) |
| RU (1) | RU2219241C2 (pl) |
| SK (1) | SK282843B6 (pl) |
| WO (1) | WO1995002697A1 (pl) |
Families Citing this family (223)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0575518A1 (en) | 1991-03-06 | 1993-12-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
| US6410010B1 (en) * | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
| US5747469A (en) | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
| WO1994029471A1 (en) | 1993-06-10 | 1994-12-22 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviral vectors for treatment of hemophilia |
| US7252989B1 (en) * | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
| US5851806A (en) * | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| DE69535178T2 (de) | 1994-06-10 | 2006-12-14 | Genvec, Inc. | Adenoviren-vektor systeme und zelllinien |
| EP0707071B1 (en) * | 1994-08-16 | 2003-07-30 | Crucell Holland B.V. | Recombinant vectors derived from adenovirus for use in gene therapy |
| FR2723697B1 (fr) * | 1994-08-17 | 1996-09-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement de la restenose par la therapie genique |
| DK0787200T3 (da) * | 1994-10-28 | 2005-08-15 | Univ Pennsylvania | Forbedret adenovirus og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
| US5856152A (en) * | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
| FR2727867B1 (fr) | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| FR2741891B1 (fr) * | 1995-06-01 | 1998-01-09 | Centre Nat Rech Scient | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| IL116816A (en) * | 1995-01-20 | 2003-05-29 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof |
| FR2729674B1 (fr) * | 1995-01-20 | 1997-04-11 | Centre Nat Rech Scient | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| FR2738575B1 (fr) * | 1995-09-08 | 1997-10-10 | Centre Nat Rech Scient | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| FR2730504B1 (fr) * | 1995-02-13 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| US5637456A (en) * | 1995-02-17 | 1997-06-10 | The University Of Texas, Board Of Regents | Rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation |
| US5652224A (en) | 1995-02-24 | 1997-07-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism |
| US6752987B1 (en) | 1995-02-28 | 2004-06-22 | The Regents Of The University Of California | Adenovirus encoding human adenylylcyclase (AC) VI |
| JP3961019B2 (ja) | 1995-02-28 | 2007-08-15 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 遺伝子転移媒介の血管形成療法 |
| FR2731710B1 (fr) * | 1995-03-14 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique |
| JP3770333B2 (ja) * | 1995-03-15 | 2006-04-26 | 大日本住友製薬株式会社 | 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法 |
| US5707618A (en) * | 1995-03-24 | 1998-01-13 | Genzyme Corporation | Adenovirus vectors for gene therapy |
| FR2732357B1 (fr) | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
| CA2218610A1 (en) * | 1995-04-17 | 1996-10-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | An adenovirus helper-virus system |
| FR2734826B1 (fr) * | 1995-06-01 | 1997-07-04 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Deltap62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations |
| US6019978A (en) * | 1995-06-05 | 2000-02-01 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier |
| US5756283A (en) * | 1995-06-05 | 1998-05-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy |
| US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| US5698202A (en) * | 1995-06-05 | 1997-12-16 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier |
| ES2333425T5 (es) | 1995-06-15 | 2012-08-28 | Crucell Holland B.V. | Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica |
| US6265212B1 (en) | 1995-06-15 | 2001-07-24 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US6783980B2 (en) | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| WO1997000954A1 (en) * | 1995-06-23 | 1997-01-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | C-cam expression constructs and their application in cancer therapy |
| FR2735789B1 (fr) * | 1995-06-23 | 1997-07-25 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant |
| FR2737221B1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-10-17 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs viraux pour la therapie genique |
| FR2737222B1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-10-17 | Transgene Sa | Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique |
| AUPN477695A0 (en) * | 1995-08-14 | 1995-09-07 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Gene therapy |
| US6482803B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-11-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modification of mutated P53 gene in tumors by retroviral delivery of ribozyme A |
| AU7674896A (en) * | 1995-10-31 | 1997-05-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus-antisense k-ras expression vectors and their application in cancer therapy |
| US6004797A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-21 | Avigen, Inc. | Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production |
| JP2006075171A (ja) * | 1995-11-09 | 2006-03-23 | Avigen Inc | 組換えａａｖビリオン産生における使用のための補助機能 |
| AU1867297A (en) * | 1995-11-17 | 1997-06-05 | Wolfgang M. Franz | Gene-therapeutic nucleic acid construct, production of same and use of same in the treatment of heart disorders |
| FR2746110B1 (fr) * | 1996-03-14 | 1998-04-17 | Methode de traitement par therapie genique des tumeurs humaines et virus recombinants correspondants | |
| US6132989A (en) * | 1996-06-03 | 2000-10-17 | University Of Washington | Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA |
| US20040156861A1 (en) | 1996-07-11 | 2004-08-12 | Figdor Carl Gustav | Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma |
| US5958892A (en) | 1996-07-30 | 1999-09-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells |
| WO1998010087A1 (en) * | 1996-09-06 | 1998-03-12 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Chimpanzee adenovirus vectors |
| US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| CA2266342C (en) * | 1996-09-25 | 2010-06-08 | Novartis Ag | Packaging cell lines for use in facilitating the development of high-capacity adenoviral vectors |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| US7008776B1 (en) | 1996-12-06 | 2006-03-07 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol |
| CZ299055B6 (cs) | 1996-12-06 | 2008-04-09 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genupro lipázu, prostredek mající fosfolipázovou úcinnost, farmaceutický prostredek, izolovaný imunizacní peptid a nukleová kyselina, biologicky aktivní prostredek, vektor, rekombinantní bunka, prostredek |
| WO1998032860A1 (en) * | 1997-01-28 | 1998-07-30 | Baxter International Inc. | Methods for highly efficient generation of adenoviral vectors |
| US6403370B1 (en) | 1997-02-10 | 2002-06-11 | Genstar Therapeutics Corporation | Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system |
| US6638502B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-28 | Gencell Sas | Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors |
| AUPO856097A0 (en) | 1997-08-14 | 1997-09-04 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Vector |
| US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| US6875606B1 (en) | 1997-10-23 | 2005-04-05 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Human α-7 nicotinic receptor promoter |
| US6653088B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-11-25 | Aventis Pharma S.A. | Interaction test for the investigation of inhibitory molecules of the interaction between a presenilin and the β-amyloid peptide |
| CA2308606A1 (en) | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigens |
| DE69926729T2 (de) | 1998-01-08 | 2006-06-08 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Transgenes kaninchen, dass ein funktionelles menschliches lipoprotein(a) exprimiert |
| AU1979599A (en) | 1998-01-14 | 1999-08-02 | Chiron S.P.A. | (neisseria meningitidis) antigens |
| US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| BR9910089A (pt) | 1998-05-01 | 2004-06-08 | Chiron Corp | Composições e antìgenos de neisseria meningitidis |
| US6225456B1 (en) | 1998-05-07 | 2001-05-01 | University Technololy Corporation | Ras suppressor SUR-5 |
| US6506889B1 (en) | 1998-05-19 | 2003-01-14 | University Technology Corporation | Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods |
| US6413776B1 (en) | 1998-06-12 | 2002-07-02 | Galapagos Geonomics N.V. | High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications |
| CN1342206A (zh) * | 1998-08-28 | 2002-03-27 | 杜克大学 | 在IVa2,100K和/或preterminal protein序列上有缺失的腺病毒 |
| US6441156B1 (en) * | 1998-12-30 | 2002-08-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Calcium channel compositions and methods of use thereof |
| US6387368B1 (en) | 1999-02-08 | 2002-05-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| US6291226B1 (en) * | 1999-02-25 | 2001-09-18 | National Research Council Of Canada | Adenovirus mutants with deleted protease gene |
| SI1533380T1 (sl) * | 1999-04-15 | 2010-03-31 | Crucell Holland Bv | Proizvajanje rekombinantnega proteina v človeški celici ki obsega vsaj en protein E adenovirusa |
| RU2245366C2 (ru) | 1999-04-30 | 2005-01-27 | Чирон С.Р.Л. | Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| US6793926B1 (en) | 1999-05-27 | 2004-09-21 | Genovo, Inc. | Methods for production of a recombinant adeno-associated virus |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| FR2799472B1 (fr) | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| EP2275552B1 (en) | 1999-10-29 | 2015-09-09 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Neisserial antigenic peptides |
| WO2001048164A2 (en) | 1999-12-27 | 2001-07-05 | The Regents Of The University Of California | Modified adenylylcyclase type vi useful in gene therapy for congestive heart failure |
| PT2289545T (pt) | 2000-01-17 | 2016-09-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacina de omv suplementada contra meningococos |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| ATE486089T1 (de) | 2000-03-31 | 2010-11-15 | Aventis Pharma Inc | Nuklearfaktor kb induzierender faktor |
| AU2001265219A1 (en) * | 2000-05-31 | 2001-12-11 | Human Gene Therapy Research Institute | Methods and compositions for efficient gene transfer using transcomplementary vectors |
| MXPA03003690A (es) | 2000-10-27 | 2004-05-05 | Chiron Spa | Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos. |
| US7060442B2 (en) | 2000-10-30 | 2006-06-13 | Regents Of The University Of Michigan | Modulators on Nod2 signaling |
| ES2359625T3 (es) | 2000-12-28 | 2011-05-25 | Wyeth Llc | Proteina protectora recombinante de. |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| AUPR518501A0 (en) | 2001-05-22 | 2001-06-14 | Unisearch Limited | Yin yang-1 |
| US6682929B2 (en) | 2001-07-23 | 2004-01-27 | Genvec, Inc. | Adenovector complementing cells |
| US7569217B2 (en) | 2001-09-24 | 2009-08-04 | University Of Saskatchewan | Porcine adenovirus E1 and E4 regions |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| ES2312649T3 (es) | 2001-12-12 | 2009-03-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis. |
| US20030232018A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-12-18 | Berlex Biosciences | Stabilized formulations of adenovirus |
| US7319001B2 (en) | 2002-03-09 | 2008-01-15 | Neurogenex Co., Ltd. | High throughput system for producing recombinant viruses using site-specific recombination |
| US7217796B2 (en) | 2002-05-24 | 2007-05-15 | Schering Corporation | Neutralizing human anti-IGFR antibody |
| US7977049B2 (en) | 2002-08-09 | 2011-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms |
| CA2421269A1 (en) | 2002-08-09 | 2004-02-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms |
| US7785608B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| RU2244928C2 (ru) * | 2003-02-19 | 2005-01-20 | Пинигина Нина Максимовна | Эндогенная фармацевтическая композиция, полученная на основе целенаправленной активации гуморальных медиаторов нервных окончаний коры головного мозга |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| ES2391975T3 (es) * | 2003-07-25 | 2012-12-03 | Genvec, Inc. | Vacunas a base de vector adenovírico |
| ATE458500T1 (de) | 2003-11-14 | 2010-03-15 | Genvec Inc | Pharmazeutische verbindung zur behandlung von lokal fortgeschrittenem primär inoperablen pankreaskarzinom (lapc). |
| US7432057B2 (en) | 2004-01-30 | 2008-10-07 | Michigan State University | Genetic test for PSE-susceptible turkeys |
| PT1736541E (pt) | 2004-03-29 | 2013-01-31 | Galpharma Co Ltd | Nova proteína galectina 9 modificada e sua utilização |
| JP2007532656A (ja) | 2004-04-12 | 2007-11-15 | アメリカ合衆国 | アデノウイルスベクターを用いて免疫応答を誘導するための方法 |
| ATE491799T1 (de) | 2004-05-26 | 2011-01-15 | Bayer Schering Pharma Ag | Chimäre adenoviren zur verwendung in der krebsbehandlung |
| EP1771582A4 (en) | 2004-06-18 | 2008-04-16 | Univ Duke | MODULATORS OF ODOR RECEIVERS |
| US7604798B2 (en) | 2004-07-15 | 2009-10-20 | Northwestern University | Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei |
| WO2006020071A2 (en) | 2004-07-16 | 2006-02-23 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Vaccines against aids comprising cmv/r-nucleic acid constructs |
| WO2006039045A2 (en) * | 2004-09-01 | 2006-04-13 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation |
| DK2002003T3 (en) | 2005-05-27 | 2016-03-21 | Ospedale San Raffaele Srl | Gene vector comprising miRNA |
| JP2009505680A (ja) | 2005-08-31 | 2009-02-12 | ジェンベク、インコーポレイティッド | アデノウイルスベクターに基づくマラリアワクチン |
| EP1951297A2 (en) | 2005-11-10 | 2008-08-06 | GenVec, Inc. | Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine |
| US20110206692A1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-25 | Novartis Ag | Conformers of bacterial adhesins |
| BRPI0714981A2 (pt) | 2006-07-28 | 2013-08-13 | Sanofi Aventis | composiÇço, mÉtodo para fazer a mesma a qual compreende um inibidor que inibe a atividade de uma proteÍna do complexo iii, um veÍculo e um membro da superfamÍlia da fator de necrose de tumor, mÉtodo para conduzir um ensaio para determinar se um composto É um inibidor de atividade de supressço de tnf de uma proteÍna do complexo iii e uso de um composto |
| JP5238710B2 (ja) | 2006-10-19 | 2013-07-17 | シーエスエル、リミテッド | インターロイキン−１３レセプターアルファ１の高親和性抗体アンタゴニスト |
| US8613925B2 (en) | 2006-10-19 | 2013-12-24 | Csl Limited | Anti-IL-13Rα1 antibodies and their uses thereof |
| AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
| JP2010522245A (ja) * | 2007-03-24 | 2010-07-01 | ゲンザイム コーポレイション | ヒトアポリポタンパク質ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与 |
| CN101067139B (zh) * | 2007-05-14 | 2010-05-26 | 清华大学深圳研究生院 | 一种RNAi载体及其应用 |
| CN101619324B (zh) * | 2008-07-01 | 2013-06-26 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用 |
| US20100183558A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-07-22 | Zhennan Lai | Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules |
| AU2009313615B2 (en) | 2008-11-05 | 2012-11-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (BHS) disease |
| EP2373338B1 (en) | 2008-12-03 | 2017-02-15 | The Johns Hopkins University | Annexina2 as immunological target |
| MX2011005918A (es) | 2008-12-04 | 2011-06-17 | Opko Curna Llc | Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen supresor de tumor mediante inhibicion del transcrito antisentido natural para el gen. |
| WO2010096561A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof |
| WO2011047316A1 (en) | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services | Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins |
| WO2011057254A2 (en) | 2009-11-09 | 2011-05-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Simian adenoviral vector-based vaccines |
| JP5980117B2 (ja) | 2009-11-09 | 2016-08-31 | ジェンヴェック，インコーポレーテッド | サルアデノウイルスベクターの増殖方法 |
| ES2887335T3 (es) | 2010-03-17 | 2021-12-22 | Univ Cornell | Vacuna contra las drogas de abuso basada en adenovirus alterado |
| WO2012021730A2 (en) | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Genvec, Inc. | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| ES2850973T3 (es) | 2010-08-23 | 2021-09-01 | Wyeth Llc | Formulaciones estables de antígenos rLP2086 de Neisseria meningitidis |
| WO2012032489A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
| WO2012083297A2 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors with modified hexon regions |
| WO2012088041A1 (en) | 2010-12-20 | 2012-06-28 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based dengue fever vaccine |
| AU2012236345B2 (en) | 2011-03-29 | 2014-10-02 | Dynavax Technologies Corporation | TLR8 transgenic animals |
| CN102240405A (zh) * | 2011-05-09 | 2011-11-16 | 上海市第十人民医院 | ApoA-Ⅰmilano基因药物 |
| WO2012162428A1 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Prime-boost vaccination for viral infection |
| US9233153B2 (en) | 2011-10-05 | 2016-01-12 | Genvec, Inc. | Affenadenovirus (gorilla) or adenoviral vectors and methods of use |
| BR112014008249B1 (pt) | 2011-10-05 | 2022-03-15 | Genvec Inc | Adenovírus ou vetor adenoviral e composição com os mesmos |
| EP2764011B1 (en) | 2011-10-05 | 2021-04-07 | GenVec, Inc. | Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| BR112014008284A2 (pt) | 2011-10-05 | 2020-10-27 | Genvec Inc. | adenovirus (gorilla) simian ou vetores adenovirais e métodos de uso |
| RU2619184C2 (ru) * | 2011-12-28 | 2017-05-12 | Ниппон Синяку Ко., Лтд. | Антисмысловые нуклеиновые кислоты |
| US20150157700A1 (en) | 2012-02-02 | 2015-06-11 | GanVec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccine |
| RU2491097C1 (ru) * | 2012-02-16 | 2013-08-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" | Фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| NZ628449A (en) | 2012-03-09 | 2016-04-29 | Pfizer | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| EP2855669B1 (en) | 2012-05-29 | 2018-10-10 | GenVec, Inc. | Modified serotype 28 adenoviral vectors |
| US9676824B2 (en) | 2012-05-29 | 2017-06-13 | Genvec, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
| WO2014107739A1 (en) | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Antibodies against pcsk9 |
| JP6446377B2 (ja) | 2013-03-08 | 2018-12-26 | ファイザー・インク | 免疫原性融合ポリペプチド |
| CA2940513C (en) | 2013-03-11 | 2023-08-15 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Delivery of card protein as therapy for ocular inflammation |
| CA2923129C (en) | 2013-09-08 | 2020-06-09 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| HUE050484T2 (hu) * | 2013-09-12 | 2020-12-28 | Biomarin Pharm Inc | VIII. faktort kódoló gént tartalmazó AAV vektorok |
| AU2014338864C1 (en) | 2013-10-25 | 2020-07-16 | Akamis Bio Limited | Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes |
| EP3107939B1 (en) | 2014-02-19 | 2020-06-17 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Delivery of nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species |
| WO2016037154A1 (en) | 2014-09-04 | 2016-03-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| EP3236998A1 (en) | 2014-12-24 | 2017-11-01 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant metapneumovirus f proteins and their use |
| JP7020917B2 (ja) | 2015-01-20 | 2022-02-16 | ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | キメラｒｓｖ／ｂｐｉｖ３ ｆタンパクを発現する組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（ｂ／ｈｐｉｖ３）およびその使用 |
| JP2018506530A (ja) | 2015-01-30 | 2018-03-08 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 脊柱軟膜下遺伝子送達システム |
| BR112017017460A2 (pt) | 2015-02-19 | 2018-04-10 | Pfizer Inc. | composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas |
| EP3261665A1 (en) | 2015-02-24 | 2018-01-03 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use |
| IL284375B (en) | 2015-04-30 | 2022-07-01 | Psioxus Therapeutics Ltd | A replication-competent group b oncolytic adenovirus |
| JP6924487B2 (ja) | 2015-06-10 | 2021-08-25 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | 非組み込みウイルス送達システムおよびその使用の方法 |
| WO2017007994A1 (en) | 2015-07-08 | 2017-01-12 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
| US20180305666A1 (en) | 2015-10-19 | 2018-10-25 | University Of Maryland, Baltimore | Methods for generating engineered human primary blood dendritic cell lines |
| BR112018012180A2 (pt) | 2015-12-17 | 2018-12-04 | Psioxus Therapeutics Ltd | vírus de codificação de um anticorpo ou fragmento de complexo anti-tcr |
| AU2017207906B2 (en) | 2016-01-15 | 2021-03-11 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
| US10137144B2 (en) | 2016-01-15 | 2018-11-27 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
| WO2017139065A1 (en) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv vaccination and immunotherapy |
| WO2017139392A1 (en) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| US10767183B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-09-08 | American Gene Technologies International Inc. | Combination vectors and methods for treating cancer |
| WO2017156272A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| WO2017172606A1 (en) | 2016-03-28 | 2017-10-05 | The Regents Of The University Of California | Method and composition for treating neuronal hyper-excitability |
| US11560412B2 (en) | 2016-04-01 | 2023-01-24 | University Of Maryland, Baltimore | Compositions comprising GRIM-19 therapeutics and methods of use |
| US11976292B2 (en) | 2016-06-08 | 2024-05-07 | American Gene Technologies International Inc. | Non-integrating viral delivery system and methods related thereto |
| CA2971303A1 (en) * | 2016-06-21 | 2017-12-21 | Bamboo Therapeutics, Inc. | Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use |
| CA3028982A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
| JP7176756B2 (ja) | 2016-07-21 | 2022-11-22 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | パーキンソン病を処置するためのウイルスベクター |
| GB201713765D0 (en) | 2017-08-28 | 2017-10-11 | Psioxus Therapeutics Ltd | Modified adenovirus |
| TW201823467A (zh) | 2016-09-20 | 2018-07-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 犬腺病毒載體 |
| TWI817933B (zh) | 2016-09-20 | 2023-10-11 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 新穎ehv插入位點orf70 |
| WO2018054822A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New swine influenza vaccine |
| NZ751966A (en) | 2016-09-20 | 2023-03-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New promoters |
| CA3038968A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Genvec, Inc. | Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells |
| US11602559B2 (en) | 2016-10-03 | 2023-03-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | HIV-1 Env fusion peptide immunogens and their use |
| EP3532095A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Prefusion coronavirus spike proteins and their use |
| US11147249B2 (en) | 2016-12-08 | 2021-10-19 | Alector Llc | Siglec transgenic mice and methods of use thereof |
| MX2019006349A (es) | 2016-12-16 | 2019-08-22 | Inst Res Biomedicine | Proteinas recombinantes rsv f de prefusion nuevas y usos de las mismas. |
| CN110234658B (zh) | 2017-01-31 | 2024-03-12 | 辉瑞大药厂 | 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法 |
| US11235056B2 (en) | 2017-03-24 | 2022-02-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Glycan-masked engineered outer domains of HIV-1 gp120 and their use |
| CA3057142A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | American Gene Technologies International Inc. | Compositions and methods for treating phenylketonuria |
| JP7502991B2 (ja) | 2017-10-16 | 2024-06-19 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療 |
| US20200237799A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| US11136356B2 (en) | 2017-10-16 | 2021-10-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use |
| US11470827B2 (en) | 2017-12-12 | 2022-10-18 | Alector Llc | Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof |
| AU2019231652A1 (en) | 2018-03-06 | 2020-10-01 | Precigen, Inc. | Hepatitis B vaccines and uses of the same |
| WO2020010035A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cannula system |
| JP2021529513A (ja) | 2018-07-02 | 2021-11-04 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 筋萎縮性側索硬化症および脊髄に関連する障害の治療 |
| AU2019368218A1 (en) | 2018-10-22 | 2021-05-27 | New York University | Recombinant GP120 protein with V1-loop deletion |
| AU2020361533A1 (en) | 2019-10-08 | 2022-04-28 | Trustees Of Boston College | Proteins containing multiple, different unnatural amino acids and methods of making and using such proteins |
| CN110714027A (zh) * | 2019-10-28 | 2020-01-21 | 嘉铭(固安)生物科技有限公司 | 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用 |
| EP4103229A1 (en) | 2020-02-11 | 2022-12-21 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Sars-cov-2 vaccine |
| CA3170369A1 (en) | 2020-03-05 | 2022-04-14 | Michal Shahar | Methods and compositions for treating cancer with immune cells |
| US11213482B1 (en) | 2020-03-05 | 2022-01-04 | University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat | SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system |
| US11773391B2 (en) | 2020-04-01 | 2023-10-03 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19 |
| EP4142785A2 (en) | 2020-04-29 | 2023-03-08 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant human metapneumovirus f proteins and their use |
| WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
| WO2022035860A2 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use |
| WO2022232648A1 (en) | 2021-04-29 | 2022-11-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use |
| IL308018A (en) | 2021-04-30 | 2023-12-01 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Oncolytic viruses for different MHC expression |
| CA3217862A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Radius Pharmaceuticals, Inc. | Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor |
| EP4380613A1 (en) | 2021-08-03 | 2024-06-12 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection |
| WO2023069987A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | University Of Rochester | Rejuvenation treatment of age-related white matter loss cross reference to related application |
| WO2023081633A1 (en) | 2021-11-02 | 2023-05-11 | University Of Rochester | Tcf7l2 mediated remyelination in the brain |
| WO2023091696A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. | Adenovirus delivery system for cancer treatment |
| WO2023192835A1 (en) | 2022-03-27 | 2023-10-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use |
| WO2023196898A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Beta globin mimetic peptides and their use |
| WO2024091824A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Ada Forsyth Institute, Inc. | Differentiation and reprogramming of chondrocyte |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5585362A (en) * | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
| US5670488A (en) * | 1992-12-03 | 1997-09-23 | Genzyme Corporation | Adenovirus vector for gene therapy |
| FR2681786A1 (fr) * | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
| AU680459B2 (en) * | 1992-12-03 | 1997-07-31 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
-
1994
- 1994-07-08 SK SK312-95A patent/SK282843B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 PT PT94922889T patent/PT667912E/pt unknown
- 1994-07-08 KR KR1019950700975A patent/KR100356615B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 JP JP50436895A patent/JP4190028B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 WO PCT/FR1994/000851 patent/WO1995002697A1/fr active IP Right Grant
- 1994-07-08 CZ CZ1995639A patent/CZ287157B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 CN CN94190594A patent/CN1115414C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 ES ES94922889T patent/ES2310924T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 DK DK94922889T patent/DK0667912T3/da active
- 1994-07-08 PL PL94308122A patent/PL179877B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 BR BR9405507A patent/BR9405507A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-07-08 NZ NZ269156A patent/NZ269156A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 DE DE69435108T patent/DE69435108D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-08 AT AT94922889T patent/ATE399873T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 CA CA002144040A patent/CA2144040A1/fr not_active Abandoned
- 1994-07-08 EP EP94922889A patent/EP0667912B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-07-08 HU HU9500732A patent/HU216871B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-07-08 AU AU72646/94A patent/AU7264694A/en not_active Abandoned
- 1994-07-08 RU RU95108217/13A patent/RU2219241C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-07-11 IL IL11028494A patent/IL110284A0/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-10 NO NO19950939A patent/NO321309B1/no not_active IP Right Cessation
- 1995-03-10 FI FI951138A patent/FI951138A/fi not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-11-21 US US10/301,085 patent/US20030096787A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL179877B1 (pl) | Zdefektowany replikacyjnie adenowirus, linia komórkowa do infekowania zdefektowanym adenowirusem oraz srodek farmaceutyczny PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL | |
| JP3816952B2 (ja) | 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス | |
| AU716508B2 (en) | Recombinant adenoviruses, use thereof for preparing AAVS, complementary cell line, and pharmaceutical compositions containing said adenoviruses | |
| US7037716B2 (en) | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy | |
| Zhang | Development and application of adenoviral vectors for gene therapy of cancer | |
| US8236293B2 (en) | Means and methods for nucleic acid delivery vehicle design and nucleic acid transfer | |
| CZ302895A3 (en) | The use of recombinant adenovirus of animal origin for preparing a pharmaceutical preparation | |
| CZ294969B6 (cs) | Buňka použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů, plazmid pro transformaci této buňky, způsob produkce defektních rekombinantních adenovirů, takto získaný defektní rekombinantní adenovir a použití uvedené buňky pro produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV | |
| JP2001510998A (ja) | 変更されたヘキソン蛋白質を有するアデノウィルス | |
| CA2454992A1 (en) | Adenoviral vector and related system and methods of making and use | |
| CA2218610A1 (en) | An adenovirus helper-virus system | |
| US6200798B1 (en) | Defective recombinant adenoviruses with inactivated IVa2 gene | |
| MXPA97001766A (en) | Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv | |
| AU725843B2 (en) | Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy | |
| WO2004108939A2 (en) | Bav packaging regions and e1 transcriptional control regions | |
| MXPA99011998A (en) | Generation of packaging system for human recombinant adenoviral vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20090708 |