CN110714027A - 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达质粒、一种用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用。本发明的细胞株于2019年05月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019111，分类命名是人胚肾转化细胞AY293‑6015。本发明的细胞株包含腺病毒的E4‑ORF6/7基因，能够用于包装E4基因缺失的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒。本发明的真核质粒以RSV启动子代替病毒载体中常用的CMV启动子，减少了病毒细胞包装中同源重组的发生几率，降低了RCA的形成。

Description

一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用

技术领域

本发明属于基因治疗和重组疫苗领域，具体涉及一种表达质粒、一种用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用。

背景技术

近年来，病毒载体的应用颇受多方学者关注，其中，腺病毒载体因其对细胞周期的要求低而具有转基因效率高，宿主范围广，病毒滴度高，又不整合到宿主基因组中，安全性高的优点，在基因治疗和大分子医药方面有越来越多的应用和价值的体现，为当前非常有应用前景的病毒载体。腺病毒基因组含有4个早期转录元，分别为E1(E1a和E1b)、E2(E2a和E2b)、E3和E4，编码病毒的调节蛋白，以及5个晚期转录元L1～L5，编码晚期表达的病毒结构蛋白。腺病毒的基因组约为36000bp，整个基因组被分为100个基因图距单位，基因组的5＇端和3＇端各有长100-150bp的反向末端重复序列(ITR)，在其左端ITR 3＇端为长约300bp的包装信号Ψ，ITR及包装信号Ψ是腺病毒基因组复制和包装不可缺少的顺式作用元件，其长度不到1kb，除此以外的病毒基因组都可以被置换，其功能可用反式作用提供补偿。要在腺病毒中插入外源基因，必须缺失一段腺病毒基因组，缺失位点一般有E1、E3及E4与末端反向重复序列(ITR)之前的区域。

现有的腺病毒载体根据包装容量可分为三代。第一代腺病毒载体为缺失E1、E3区，外源基因片段最多可插入6kb。第二代腺病毒载体为缺失E1、E3的基础上将E2a突变或者缺失E4，最大包装容量为9kb。第三代腺病毒载体为辅助依赖型腺病毒载体，其缺失所有的编码序列，只含有两端的ITR和包装信号Ψ，插入外源基因可达36kb。这些腺病毒载体由于病毒基因组内非必需区域缺失，插入外源基因后，必须由反式作用提供补偿。反式补偿方式有两种，一种是由辅助病毒提供反式补偿，即辅助病毒依赖型，腺病毒基因片段可缺失相当一部分；另一种是由辅助包装细胞提供反式补偿，即由互补的细胞系提供反式补偿，比如第一代腺病毒载体需要293细胞系、911细胞系以及PERC6细胞系等，这些细胞系可以反式提供E1区的蛋白功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。

第一代腺病毒载体由于具有病毒滴度高、感染效率高、制备简单等优点，使其在基因治疗领域备受青睐，但是，第一代腺病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列，通过重组，可重新获得E1区，导致产生可复制的腺病毒(RCA，replication-competentadenovirus)，由于RCA具有复制能力，在腺病毒的包装过程中一旦出现，就可能呈现优势生长，它不但影响载体病毒的产量，也为腺病毒噬菌斑的筛选纯化带来困难。另一方面，研究发现当以较高的MOI(感染复数，病毒/细胞Multiply Of Infection)感染细胞时，E2区对E1区功能上的依赖可以被忽略，病毒仍可以复制并表达晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒载体最多只能装载约6kb的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说仍是远远不够的。

因此，第二代腺病毒载体的应用尤为重要，其引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代相比较要弱很多，因此在靶细胞中更稳定，目的基因的表达的时间也更长。同第一代腺病毒载体一样，第二代腺病毒载体的包装依赖于辅助细胞(或)病毒提供其所缺失的反式作用元件，研发一种能够大规模生产第二代腺病毒载体的特异性细胞系是目前增强第二代腺病毒载体临床应用水平的理想解决方案。

发明内容

研究表明腺病毒E4的产物对于高效的病毒感染至关重要，本发明小组发现，E4的几种开放阅读框(ORF)如ORF3和ORF6以及ORF6/7是成功包装腺病毒所必须的，本发明通过构建RSV启动表达的ORF6/7制备了一种表达质粒以及一种用于包装第二代腺病毒载体的细胞株，该细胞株中包含腺病毒基因组E4的ORF6/7，能够为缺失E4的二代腺病毒提供反式补偿。

作为本发明的第一方面，本发明提供了一种表达质粒。

作为优选，所述表达质粒包括腺病毒E4-ORF6/7基因的核酸序列。

作为优选，所述表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQ ID No.3。

作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

作为优选，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。

作为优选，所述表达质粒的碱基序列如SEQ ID No.5所示。

作为本发明的第二方面，本发明提供了包含上述表达质粒的细胞株。

作为本发明的第三方面，本发明提供了上述表达质粒在用于制备能够包装二代腺病毒的细胞株中的应用。

作为本发明的第四方面，本发明提供了一种用于包装二代腺病毒的细胞株，该细胞株中包含腺病毒E4基因的ORF6/7。

作为优选，所述细胞株的保藏编号为：CCTCC No:C2019111。

作为优选，所述细胞株是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，该细胞株用于包装缺失E4基因的重组二代腺病毒载体。

作为优选，所述细胞株的构建包括如下步骤：

1)构建表达质粒，所述表达质粒包含编码腺病毒E4-ORF6/7蛋白的核酸序列；

2)以步骤1)所获得的表达质粒转染HEK293细胞，筛选获得表达E4-ORF6/7蛋白的阳性细胞株；

3)用缺失E4基因的二代腺病毒转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E4基因的重组二代腺病毒载体的细胞株。

作为优选，所述步骤1)中的表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQ ID No.3。

作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

作为优选，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。

作为本发明的第五方面，本发明提供了上述的细胞株在用于包装二代腺病毒中的应用。

作为本发明的第六方面，本发明提供一种制备用于包装二代腺病毒的细胞株的方法。

作为优选，所述方法包括如下步骤：

1)构建表达质粒，所述表达质粒包含编码腺病毒E4-ORF6/7蛋白的核酸序列；

2)以步骤1)所获得的表达质粒转染表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株，筛选获得表达E4-ORF6/7蛋白的阳性细胞株；

3)用缺失E4基因的二代腺病毒转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E4基因的二代腺病毒的细胞株。

作为优选，所述步骤1)中的表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQ ID No.3。

作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

作为优选，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。

作为优选，所述步骤2)中的表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株为293细胞系、911细胞系或PERC6细胞系。

有益效果：

(1)本发明采用DNA转染的方式将腺病毒hAd5-E4-ORF6/7基因运输到真核表达载体制备了一种包含E4-ORF6/7基因的表达质粒，以及利用该表达质粒转染HEK293细胞获得了一种能够对二代腺病毒提供反式补偿的新的细胞株。该细胞株能够表达腺病毒的E4-ORF6/7蛋白，使得缺失E4基因的二代腺病毒基因组复制，结构蛋白表达，能够包装形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒。二代腺病毒与一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础。

(2)本发明通过构建能够表达腺病毒E4基因的ORF6/7开放阅读框，也就是能够同时表达腺病毒E4基因的ORF6开放阅读框和ORF7开放阅读框的新型细胞株，使得该新型细胞株能够包装E4基因缺失的重组二代腺病毒载体。

(3)本发明的真核质粒以RSV启动子代替病毒载体中常用的CMV启动子，减少了病毒细胞包装中同源重组的发生几率，降低了RCA的形成。

本发明所涉及的术语定义：

表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株－本发明中描述的表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株是指可以反式提供E1区的蛋白功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒的细胞或细胞系，即能够编码腺病毒E1蛋白质的细胞或细胞系，如293细胞系(如HEK293)、911细胞系以及PERC6细胞系等。

转染－是指使用本领域技术人员已知的技术将细胞或细胞系与包含腺病毒基因组的质粒接触，通过用磷酸钙、二乙胺乙基葡萄糖、聚凝胺与DNA的共沉淀，电穿孔，显微注射，脂质体介导的融合，反转录和biolistic转染等方式所进行的转染。

真核表达载体－是指用于将目标核酸序列插入以构建表达质粒的载体，适合本发明的用于插入目标核酸序列构建表达质粒的真核表达载体包括ppCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pSVL等。

附图说明

图1是pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7质粒酶切鉴定结果图。

图2是RSV酶切鉴定结果图。

图3是pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7的质粒图谱。

图4是pcDNA3.1+RSV-EGFP的质粒图谱。

图5是RSV启动子的验证结果，其中，图(A)为CMV启动子，图(B)为RSV启动子。

图6是RT-PCR电泳结果图。

图7是pAd5△E4-EGFP-PacI线性化电泳结果图。

图8是本发明的细胞株包装重组腺病毒pAd5△E4-EGFP-PacI的细胞CPE结果图，其中，(A)为转染后0代，(B)为转染后1代，(C)为转染后2代，(D)为转染后3代，(E)为转染后4代。

图9是HEK293细胞包装重组腺病毒pAd5△E4-EGFP-PacI的结果图，其中，(A)为转染后0代，(B)为转染后1代，(C)为转染后2代，(D)为转染后3代，(E)为转染后4代。

本发明的细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C2019111；分类命名是：人胚肾转化细胞AY293-6015；保藏时间是：2019年05月08日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学校内，邮政编码430072。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

在本发明中，若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术，所有的设备和原料等均为本行业常用产品，可从市场中购得。

实施例1：质粒pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7的构建

(一)质粒pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7构建

1、引物合成及目的片段的扩增

根据NCBI中人5型腺病毒(hAd5)序列设计引物(序列号AC_000008.1)，PCR扩增编码hAd5-E4的ORF6/7DNA序列。

上游引物5‘-CCCAAGCTTgccaccATGACTACGTCCGGCGTTCCAT-3’(ORF6/7-F Primer，SEQ ID No.1)；

下游引物5‘-CGCGGATCCTCACAGAACCCTAGTATTCA-3’(ORF6/7-R Primer，SEQ IDNo.2)；

DNA模板：人腺病毒5型病毒提取基因组；

扩增体系为：高保真Q5 DNA聚合酶25μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL，补水至50μL；

扩增程序为：98℃，30sec；(98℃，10sec；60℃，30sec；72℃，120/60sec)×35循环；72℃，7min；4℃，∞；

纯化后获得的Ad5-E4-ORF6/7的DNA序列如SEQ ID No.3所示。

2、质粒构建

(1)目的片段和载体酶切

酶切反应体系：pcDNA3.1载体(购买自Thermo，货号为V79020)2μg，BamHI1μL，HindⅢ1μL，10×cutsmart buffer 5μL，补水至50μL；

Ad5-E4-ORF6/7片段2μg，BamHI、HindⅢ各1μL；10×Cutsmart buffer 5μL；补水至50μL；

酶切条件：37℃，1h；65℃，20min灭活；

PCR clean-up试剂盒纯化，Axygen胶回收纯化试剂盒，取2.5μL跑胶鉴定。

(2)连接载体与目的片段

连接体系：pcDNA3.1载体2.5μL，Ad5-E4-ORF6/7片段1μL，2x Smealess CloningMix酶5μL，补水至10μL；

反应条件：室温条件下，15min。

转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(Ampamycin抗性)涂布，37℃过夜培养。

(3)载体构建验证

挑取单克隆菌落进行酶切验证，酶切鉴定结果如图1所示，获得了pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7质粒。

(二)质粒优化

根据pcDNA3.1的CMV启动子两边的酶切位点，查找最邻近的两个可以酶切下来CMV的酶切位点为MfeI和NheI，结合pLKO.1质粒中(4736-4964)位置中获得RSV启动子的序列，由华大基因公司通过化学合成得到MfeI-RSV-NheI片段，MfeI-RSV-NheI片段的序列如SEQIDNo.4所示。采用酶切方式将pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7的CMV启动子替换，构建pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7/质粒。

进一步地，为了验证RSV启动子的启动能力，采用同样的方法将具有EGFP标签的pcDNA3.1-EGFP载体(购买自赢润生物)中的CMV启动子替换为RSV，构建得到pcDNA3.1+RSV-EGFP质粒。

对pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7质粒、pcDNA3.1-EGFP载体和MfeI-RSV-NheI片段进行酶切，酶切反应体系如下：

pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7质粒2μg，MfeI 1μL，NheI 1μL，10×cutsmart buffer 5μL，补水至50μL。

pcDNA3.1-EGFP载体2μg，MfeI 1μL，NheI 1μL，10×cutsmart buffer 5μL，补水至50μL。

MfeI-RSV-NheI片段2μg，MfeI 1μL，NheI 1μL，10×Cutsmart buffer 5μL，补水至50μL。

酶切条件：37℃，1h；65℃，20min灭活。

琼脂糖凝胶电泳，Axygen胶回收纯化试剂盒，取2.5μL跑胶鉴定。

(2)载体与MfeI-RSV-NheI片段的连接

连接体系：pcDNA3.1-Ad5-E4-ORF6/7质粒或pcDNA3.1-EGFP载体2.5μL，MfeI-RSV-NheI片段1μL，2x Smealess Cloning Mix酶5μL，补水至10μL；

反应条件：室温条件下，15min。

转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(Ampamycin抗性)涂布，37℃过夜培养。

(3)载体构建验证

挑取单克隆菌落进行酶切验证，酶切鉴定结果如图2所示，获得了pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7和pcDNA3.1+RSV-EGFP质粒。

pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7质粒的DNA序列如SEQ ID No.5所示，质粒图谱如图3所示；pcDNA3.1+RSV-EGFP质粒的DNA序列如SEQ ID No.6所示，质粒图谱如图4所示。

实施例2：RSV启动子验证

将HEK293细胞(ATCC，CRL-1573TM)按照1×10⁶/孔接种于6孔板中，待细胞汇合率达到80％左右，利用阳离子聚合物PEI转染方法将pcDNA3.1+RSV-EGFP和pcDNA3.1-EGFP分别转入宿主细胞HEK293中，每种、每孔2μg质粒，转染后将细胞放置在37℃，5％CO₂培养箱中进行培养，24～48小时后通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况。实验结果如图5所示，从图可以看出，以RSV作为启动子的pcDNA3.1+RSV-EGFP质粒转染宿主后，EGFP在宿主大量表达，说明RSV能够启动外源蛋白的表达。

实施例3：细胞系的构建

(一)细胞稳定转染

将HEK293细胞按照1×10⁶/孔接种于6孔板中，待细胞汇合率达到80％左右，利用阳离子聚合物PEI转染方法将pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7转入宿主细胞HEK293中，每孔2μg质粒，转染后将细胞放置在37℃，5％CO₂培养箱中进行培养。

(二)筛选阳性克隆

转染后2日后换含500μg/mL G418和10％FBS的DMEM筛选培养基，取其中一孔进行表达情况的检测，之后每3～4天换新鲜的筛选培养基，直至对照孔细胞99％以上都死掉，用0.05％的胰蛋白酶消化细胞，按1：20的稀释传到10cm培养平皿。继续每3～4天换新的筛选培养基，直至形成肉眼可见克隆，结合克隆环将其扩大到24孔板中，待细胞生长良好，备份传代，利用RT-PCR检测蛋白RNA水平的表达情况。

1、用Trizol提取细胞总RNA，通过RT-PCR检测蛋白RNA水平的表达情况，提取细胞总RNA的方法如下：

(1)待24孔板细胞汇合度为80％左右时，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加Trizol试剂0.5mL，摇匀，无菌罩内消化1min；

(2)将各孔内消化好的细胞裂解液吸到DEPC处理过的1.5mL的EP管中，加入氯仿0.2mL，轻摇15s；

(3)室温静置2-3min后，于12000rpm，4℃，离心15min，然后取上清无色水相(约0.3mL)到EP管(DEPC处理过)中，加入0.3mL异丙醇，室温下静置10min；

(4)于12000rpm，4℃，离心10min，弃去上清，用0.5mL75％乙醇(用DEPC水配制)洗涤后，于7500rpm，4℃离心5min；

(5)去上清，用小Tip吸干液体，气干沉淀5-10min后，加入DEPC处理水20-30μL，混匀，55-60℃水浴10min溶解总RNA，测定OD值。

2、通过TAKARA一步法的试剂盒(购买自宝生物，Prime Script One Step RT-PCRKit Ver2 RR055A)进行RT-PCR扩增，50μL反应体系如下表所示：

表1反应体系

RT-PCR程序为50℃30min、94℃2min、94℃30s、62℃30s、72℃2min、72℃5min、4℃循环。

RT-PCR检测结果见图6，其中，图A中的3、4、5泳道为不同退火温度的阳性质粒对照，6、7、10、11泳道为阳性克隆目的条带，图B中的8泳道为阳性克隆目的条带。

最终获得5株表达hAd5-E4-ORF6/7的阳性细胞克隆，对阳性细胞克隆如表2所示进一步扩大培养后，冻存细胞库，建立原始细胞库。

表25个细胞株的细胞库信息

(三)蛋白功能鉴定

第一日，将293-ORF6/7-43/55/53/10/60细胞、HEK293细胞按照6×10⁵/mL密度接种于6孔板，第二日细胞汇合率在60～70％将腺病毒载体pAd5△E4-EGFP 2μg载体DNA通过PacI内切酶线性化灭活，通过PEI将pAd5△E4-EGFP-PacI转染至上述293-ORF6/7-43/55/53/10/60细胞、HEK293细胞中，培养72小时后，收集细胞悬液，经过-80℃和37℃反复冻融3次后，500g，5min，4℃离心后，取上清再次接种同样密度细胞，传代4代次后，发现只有293-ORF6/7-60细胞中能够稳定表达大量绿色荧光蛋白，并且出现明显的CPE(图8)，HEK293细胞只在转染后观察到荧光，后面就再没有观察到荧光，HEK293细胞随着接种代次增加也没有荧光出现(图9)，说明293-ORF6/7-60能够成功包装第二代病毒载体，而HEK293细胞不能包装二代腺病毒载体。通过免疫荧光法检测其病毒的滴度在2×10⁸FFU/mL。

其中，pAd5△E4-EGFP的制备流程如下：

在A549细胞(CCL-185)中扩增野生型人腺病毒5型(VR-1516，基因序列AC_000008.1)病毒，收集并进行浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，使用cosmid的方法将线性的hAd5基因组构建成环状的supercos-Ad5载体质粒，利用CRISPR/cas9对hAd5腺病毒E1区域进行切除，设计gRNA如下：

hAd5-E1上游gRNA:

GGCGGGAAAACUGAAUAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E1下游gRNA:

GAGAUGAUCCAGUCGUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在hAd5 E1区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，设计引物，通过融合PCR将ITR，PIX序列分别插入上、下游，并引入SwaI酶切位点，然后将融合后的片段与载体进行无缝克隆，获得E1敲除的supercos-Ad5△E1腺病毒载体，而后对supercos-Ad5△E1质粒进行E3区域的切除，设计gRNA如下：

hAd5-E3上游gRNA:

GCGGGACAUUUCAGAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E3下游gRNA:

GUAAGGGUACUGCUAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在hAd5 E3区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，后设计引物，对E3上下游过多切除的Fiber，以及pVIII序列进行融合PCR，使用无缝克隆的方式连接，得到E3敲除的载体，并将其命名为pAd5。在pAd5的基础上敲除E4，设计gRNA如下：

hAd5-E4上游gRNA:

GUACUAAACAAUUCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E4下游gRNA:

GGUUCGCGUGCGGUUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在Ad5 E4区域的上下游设计gRNA位点，对序列进行“切割”，回收大片段的载体；后设计引物，对E4上下游过多切除的Fiber，以及ITR序列进行融合PCR，并引入ISceI酶切位点，使用无缝克隆的方式连接，得到的质粒命名为pAd5△E4。

通过同源重组的方式，将E1区域的穿梭质粒pS5E1-EGFP与载体质粒pAd5△E4重组，进而获得能够表达绿色荧光的质粒pAd5△E4-EGFP。

(四)构建生产用主细胞库

扩大培养293-ORF6/7-60冻存原始细胞库，同时将细胞再次进行单克隆化，通过有限稀释接种96孔培养板，经过10-14日的抗性筛选，最终得到AY293-6015细胞株，复苏验证同时继续传代30次，RT-PCR检测蛋白水平的表达，仍然可以检测到目的条带并且成功包装二代重组腺病毒载体，再次扩大培养AY293-6015冻存主细胞库，将细胞库的细胞株复苏进行无菌和支原体检测，结果均符合药典要求，说明本发明成功构建了用于包装二代腺病毒载体的新型细胞株AY293-6015。

发明人进一步使用pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7质粒转染911细胞和PERC6细胞，同样获得了能够包装二代腺病毒的细胞株，说明本发明公开了一种能够用于构建二代腺病毒包装细胞的表达质粒，以及一种二代腺病毒包装细胞的构建方法。

发明人进一步通过将腺病毒E4-ORF6/7基因插入本发明所列举的其他真核表达载体中构建表达质粒，并将该表达质粒转染HEK293细胞，同样获得了能够包装二代腺病毒的细胞株，此处不再一一赘述。

实施例4 AY293-6015细胞株增殖腺病毒的稳定性分析

将AY293-6015细胞株传代30代，每5代进行一次增殖腺病毒能力的检测，检测结果显示，AY293-6015细胞株增殖腺病毒的滴度维持在2.0×10⁸FFU/mL左右，说明本发明构建得到的AY293-6015细胞株具有较好的稳定性。

表3 AY293-6015细胞株增殖腺病毒的稳定性检测

本发明所涉及的相关基因和质粒的碱基序列如下所示：

SEQ ID No.3：Ad5-E4-ORF6/7的DNA序列

SEQ ID No.4：MfeI-RSV-NheI的DNA序列

SEQ ID No.5：pcDNA3.1+RSV-Ad5-E4-ORF6/7质粒的DNA序列

SEQ ID No.6：pcDNA3.1+RSV-EGFP质粒的DNA序列

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，而不是本发明全部的实施例。上述实施例并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则范围内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 嘉铭(固安)生物科技有限公司

<120> 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccaagcttg ccaccatgac tacgtccggc gttccat 37

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcct cacagaaccc tagtattca 29

<210> 3

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgactacgt ccggcgttcc atttggcatg acactacgac caacacgatc tcggttgtct 60

cggcgcactc cgtacagtag ggatcgtcta cctccttttg agacagaaac ccgcgctacc 120

atactggagg atcatccgct gctgcccgaa tgtaacactt tgacaatgca caacgtgagt 180

tacgtgcgag gtcttccctg cagtgtggga tttacgctga ttcaggaatg ggttgttccc 240

tgggatatgg ttctaacgcg ggaggagctt gtaatcctga ggaagtgtat gcacgtgtgc 300

ctgtgttgtg ccaacattga tatcatgacg agcatgatga tccatggtta cgagtcctgg 360

gctctccact gtcattgttc cagtcccggt tccctgcagt gtatagccgg cgggcaggtt 420

ttggccagct ggtttaggat ggtggtggat ggcgccatgt ttaatcagag gtttatatgg 480

taccgggagg tggtgaatta caacatgcca aaagaggtaa tgtttatgtc cagcgtgttt 540

atgaggggtc gccacttaat ctacctgcgc ttgtggtatg atggccacgt gggttctgtg 600

gtccccgcca tgagctttgg atacagcgcc ttgcactgtg ggattttgaa caatattgtg 660

gtgctgtgct gcagttactg tgctgattta agtgagatca gggtgcgctg ctgtgcccgg 720

aggacaaggc gccttatgct gcgggcggtg cgaatcatcg ctgaggagac cactgccatg 780

ttgtattcct gcaggacgga gcggcggcgg cagcagttta ttcgcgcgct gctgcagcac 840

caccgcccta tcctgatgca cgattatgac tctaccccca tgtaggcgtg gacttctcct 900

tcgccgcccg ttaagcaacc gcaagttgga cagcagcctg tggctcagca gctggacagc 960

gacatgaact taagtgagct gcccggggag tttattaata tcactgatga gcgtttggct 1020

cgacaggaaa ccgtgtggaa tataacacct aagaatatgt ctgttaccca tgatatgatg 1080

ctttttaagg ccagccgggg agaaaggact gtgtactctg tgtgttggga gggaggtggc 1140

aggttgaata ctagggttct gtga 1164

<210> 4

<211> 382

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc 60

cagatatacg caatgtagtc ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat ggtaacgatg 120

agttagcaac atgccttaca aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt ggtggaagta 180

aggtggtacg atcgtgcctt attaggaagg caacagacgg gtctgacatg gattggacga 240

accactgaat tgccgcattg cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg atacataaac 300

ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat 360

agggagaccc aagctggcta gc 382

<210> 5

<211> 6228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg caatgtagtc 240

ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat ggtaacgatg agttagcaac atgccttaca 300

aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt ggtggaagta aggtggtacg atcgtgcctt 360

attaggaagg caacagacgg gtctgacatg gattggacga accactgaat tgccgcattg 420

cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg atacataaac ctctggctaa ctagagaacc 480

cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctggcta 540

gcgtttaaac ttaagcttgc caccatgact acgtccggcg ttccatttgg catgacacta 600

cgaccaacac gatctcggtt gtctcggcgc actccgtaca gtagggatcg tctacctcct 660

tttgagacag aaacccgcgc taccatactg gaggatcatc cgctgctgcc cgaatgtaac 720

actttgacaa tgcacaacgt gagttacgtg cgaggtcttc cctgcagtgt gggatttacg 780

ctgattcagg aatgggttgt tccctgggat atggttctaa cgcgggagga gcttgtaatc 840

ctgaggaagt gtatgcacgt gtgcctgtgt tgtgccaaca ttgatatcat gacgagcatg 900

atgatccatg gttacgagtc ctgggctctc cactgtcatt gttccagtcc cggttccctg 960

cagtgtatag ccggcgggca ggttttggcc agctggttta ggatggtggt ggatggcgcc 1020

atgtttaatc agaggtttat atggtaccgg gaggtggtga attacaacat gccaaaagag 1080

gtaatgttta tgtccagcgt gtttatgagg ggtcgccact taatctacct gcgcttgtgg 1140

tatgatggcc acgtgggttc tgtggtcccc gccatgagct ttggatacag cgccttgcac 1200

tgtgggattt tgaacaatat tgtggtgctg tgctgcagtt actgtgctga tttaagtgag 1260

atcagggtgc gctgctgtgc ccggaggaca aggcgcctta tgctgcgggc ggtgcgaatc 1320

atcgctgagg agaccactgc catgttgtat tcctgcagga cggagcggcg gcggcagcag 1380

tttattcgcg cgctgctgca gcaccaccgc cctatcctga tgcacgatta tgactctacc 1440

cccatgtagg cgtggacttc tccttcgccg cccgttaagc aaccgcaagt tggacagcag 1500

cctgtggctc agcagctgga cagcgacatg aacttaagtg agctgcccgg ggagtttatt 1560

aatatcactg atgagcgttt ggctcgacag gaaaccgtgt ggaatataac acctaagaat 1620

atgtctgtta cccatgatat gatgcttttt aaggccagcc ggggagaaag gactgtgtac 1680

tctgtgtgtt gggagggagg tggcaggttg aatactaggg ttctgtgagg atccactagt 1740

ccagtgtggt ggaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc 1800

ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1860

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 1920

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 1980

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2040

tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg 2100

cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 2160

cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 2220

tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 2280

ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 2340

cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 2400

tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 2460

ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 2520

cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc 2580

aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc 2640

aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt 2700

cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 2760

ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct 2820

attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg 2880

agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat 2940

tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 3000

tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 3060

ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga 3120

cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 3180

cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 3240

cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 3300

gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 3360

gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 3420

tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 3480

ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 3540

cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 3600

gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 3660

gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 3720

gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca 3780

tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc 3840

cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac 3900

cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 3960

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 4020

tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag 4080

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 4140

ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 4200

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 4260

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 4320

ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 4380

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 4440

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 4500

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 4560

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 4620

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 4680

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 4740

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 4800

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 4860

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 4920

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 4980

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 5040

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 5100

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 5160

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 5220

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 5280

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 5340

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 5400

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 5460

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 5520

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 5580

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 5640

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 5700

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 5760

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 5820

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5880

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 5940

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 6000

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 6060

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 6120

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 6180

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 6228

<210> 6

<211> 5762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg caatgtagtc 240

ttatgcaata ctcttgtagt cttgcaacat ggtaacgatg agttagcaac atgccttaca 300

aggagagaaa aagcaccgtg catgccgatt ggtggaagta aggtggtacg atcgtgcctt 360

attaggaagg caacagacgg gtctgacatg gattggacga accactgaat tgccgcattg 420

cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg atacataaac ctctggctaa ctagagaacc 480

cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc aagctggcta 540

gcgtttaaac attaagcttg gtaccgagct cggatccacc ggtcgccacc atggtgagca 600

agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa 660

acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga 720

ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca 780

ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact 840

tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg 900

acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca 960

tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt 1020

acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg 1080

tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc 1140

agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca 1200

cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt 1260

tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa agcggccgct 1320

cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca 1380

gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 1440

tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 1500

tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 1560

tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag 1620

ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 1680

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 1740

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 1800

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 1860

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 1920

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 1980

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 2040

acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc 2100

ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg 2160

tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 2220

tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc 2280

gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 2340

tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc 2400

aaaaagctcc cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcaagagac aggatgagga 2460

tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag 2520

aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc 2580

cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 2640

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 2700

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 2760

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 2820

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 2880

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 2940

ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 3000

atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 3060

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 3120

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct 3180

gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat 3240

cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga 3300

cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct 3360

tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg 3420

agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 3480

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 3540

aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt 3600

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 3660

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 3720

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 3780

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 3840

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 3900

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 3960

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4020

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4080

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4140

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4200

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4260

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 4320

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 4380

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 4440

acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 4500

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtttt tttgtttgca 4560

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 4620

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 4680

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 4740

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 4800

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 4860

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 4920

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 4980

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 5040

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 5100

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 5160

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 5220

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 5280

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 5340

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 5400

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 5460

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 5520

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 5580

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 5640

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 5700

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 5760

tc 5762

Claims (12)

1.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒包括腺病毒E4-ORF6/7基因的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQID No.3。

3.根据权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

4.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。

5.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的碱基序列如SEQ IDNo.5所示。

6.一种包含如权利要求1～5任一项所述的表达质粒的细胞株。

7.一种用于包装二代腺病毒的细胞株，其特征在于，所述细胞株的保藏编号为：CCTCCNo:C2019111。

8.根据权利要求7所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，该细胞株用于包装缺失E4基因的二代重组腺病毒载体。

9.根据权利要求8所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株的构建包括如下步骤：

1)构建如权利要求1～5任一项所述的表达质粒；

2)以步骤1)所获得的表达质粒转染HEK293细胞，筛选获得表达E4-ORF6/7蛋白的阳性细胞株；

3)用缺失E4基因的二代腺病毒载体转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E4基因的二代重组腺病毒载体的细胞株。

10.如权利要求7～9任一项所述的细胞株在用于包装二代腺病毒中的应用。

11.一种制备用于包装二代腺病毒的细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)构建如权利要求1～5任一项所述的表达质粒；

2)以步骤1)所获得的表达质粒转染表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株，筛选获得表达E4-ORF6/7蛋白的阳性细胞株；

3)用缺失E4基因的二代重组腺病毒载体转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E4基因的二代重组腺病毒载体的细胞株。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株为293细胞系、911细胞系或PERC6细胞系。

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