CN111733188B

CN111733188B - 促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的抑制剂及应用

Info

Publication number: CN111733188B
Application number: CN202010736671.XA
Authority: CN
Inventors: 吴珍芳; 顾婷; 周健; 甘炎民; 邢萍萍; 谭宝华; 乔佳鑫; 严冠豪; 蔡更元; 李紫聪; 洪林君; 杨杰; 郑恩琴; 黄思秀; 徐铮
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2040-07-28
Also published as: CN111733188A

Abstract

本发明公开了促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的抑制剂及应用。通过抑制ITGB6基因表达来促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的ITGB6基因抑制剂及其在瘦肉型猪选育上的应用。为促进骨骼肌发育提供了新的靶点和研究方向，为瘦肉型猪品系选育提供了新的思路。

Description

促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的抑制剂及应用

技术领域

本发明涉及动物生物技术领域，特别涉及一种促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的抑制剂及应用。

背景技术

猪肉是我国主要的肉类产品，随着国民生活水平的提高，老百姓对猪肉的需求量不断增长，因此提高猪肉产量对国民生活有着重要意义。猪肉按其结构和功能的差异，可以分为骨骼肌、平滑肌和心肌，其中骨骼肌是其最主要构成类型。因此，研究骨骼肌的发育调控过程有助于提高猪肉产量。猪骨骼肌的生长发育是一个相当复杂的过程，主要包括肌细胞的形成与增殖、肌管和肌纤维的形成以及最后的成熟阶段。该过程大致分为三个阶段：在妊娠开始至35天前体细胞激活形成成肌细胞，成肌细胞增殖和分化形成肌管，肌管融合成初级纤维，这个过程将一直持续到妊娠第60天；在妊娠50-60天时开始形成次级纤维，这一过程在约75天达到增殖高峰；此后次级纤维不断增殖体积增大直至到达妊娠第90天时肌纤维数量不再变化最终形成成熟的肌纤维。

发明内容

猪骨骼肌的生长发育过程涉及众多转录因子、信号通路、miRNAs和表观遗传修饰等一系列因素的调控。其中表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、长链非编码RNAs以及转录因子的结合等方面。近年来，H3K27me3修饰对肌肉发育的调控备受关注，大量研究表明H3K27me3对骨骼肌的发育起到重要的调控作用，然而具体调控机制尚不清楚，同时在猪上H3K27me3调控肌肉发育的相关研究较少。

本发明通过研究H3K27me3调控肌肉发育的机制时，发现ITGB6基因在猪骨骼肌发育过程中是受H3K27me3修饰作用的一个关键靶基因，该基因的募集水平在猪骨骼肌发育过程中随着H3K27me3修饰水平的上调而不断下调，并能够抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖功能进而抑制猪骨骼肌的发育。

本发明的目的是提供一种促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的抑制剂及应用。

根据本发明的一个方面，提供了促进骨骼肌发育的方法，该方法包括抑制ITGB6基因表达。

在某些实施方式中，该方法包括通过RNA干扰方法抑制ITGB6基因表达。

在某些实施方式中，该方法包括在胚胎水平通过RNA干扰方法抑制ITGB6基因表达。

在某些实施方式中，该方法包括在猪胚胎水平通过RNA干扰方法抑制ITGB6基因表达来促进猪骨骼肌发育

根据本发明的另一个方面，提供了一种促进骨骼肌发育的抑制剂，该抑制剂包括ITGB6基因抑制剂。

在某些实施方式中，ITGB6基因抑制剂包括抗ITGB6基因的siRNA。

在某些实施方式中，抗ITGB6基因的siRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。

根据本发明的又一个方面，提供了促进骨骼肌发育的抑制剂在瘦肉型猪选育上的应用。

在某些实施方式中，该应用包括通过转基因方法制备抑制ITGB6基因表达的可促进骨骼肌发育和提高瘦肉率的转基因猪上的应用；或向受精卯或胚胎显微注射ITGB6基因抑制剂，并将受精卯或胚胎移植至代孕母猪子宫内获得可促进骨骼肌发育和提高瘦肉率的猪上的应用；或将ITGB6基因抑制剂与精液孵育，然后体外受精获得能促进骨骼肌发育和提高瘦肉率的猪上的应用。

根据本发明的再一个方面，提供了一种促进骨骼肌发育和提高猪瘦肉率的试剂盒，其中，所述试剂盒包括ITGB6基因抑制剂；

优选地，其包括能抑制ITGB6基因表达的siRNA；

更优选地，其包括能抑制ITGB6基因表达的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。

本发明提供的试剂盒还可以包括独立包装的无菌、DNase&RNase free的胚胎注射级水。在使用时，siRNA可以使用无菌、DNase&RNase free的胚胎注射级水配制成注射剂对激活后的猪克隆重构胚胎进行注射或与精液共孵育或显微注射入受精卯或胚胎等。

本发明的有益效果在于：

1、发现一个在猪骨骼肌发育过程中受H3K27me3修饰作用的一个关键靶基因ITGB6，并经过发现该基因的募集水平在猪骨骼肌发育过程中随着H3K27me3修饰水平的上调而不断下调，抑制ITGB6表达能够促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖功能进而促进猪骨骼肌的发育；

2、通过抑制ITGB6基因表达，可促进猪骨骼肌的发育，从而为提高猪的瘦肉率提供了一种新的方法和靶点，以及研究的新方向；

3、ITGB6基因抑制剂在促进骨骼肌发育上的应用，可为瘦肉型猪的选育提供新的思路和靶点。

4、ITGB6基因抑制剂作用于猪的胚胎时期，通过多种不同的方法均能达到促进骨骼肌发育的效果，具有广泛的适用性。

5、促进骨骼肌发育和提高猪瘦肉率的试剂盒，用于生产实践中更加便捷和高效。

附图说明

图1为胚胎骨骼肌H3K27me3的表达量：图1A表示，H3K27me3修饰存在于不同时期的猪胚胎骨骼肌中，图1B表示，猪骨骼肌中的H3K27me3修饰水平随着胚胎的发育而不断升高；

图2为RNA-seq与ChIP联合分析结果：其中图2A为ChIP-seq与RNA-seq中共有的差异表达基因，图2B为受H3K27me3修饰的富集水平下降但表达水平上调的基因，图2C为受H3K27me3修饰的富集水平上调但表达水平下降的基因；

图3为在H3K27me3修饰下不同时期的胎儿骨骼肌ITGB6基因的募集水平；

图4为不同时期的胚胎骨骼肌中ITGB6基因的相对表达量，其中以65日龄骨骼肌中的ITBG6基因的平均Ct值为基准；

图5为超表达载体pcDNA3.1-ITGB6的PCR扩增结果，其中M为Marker DL5000，扩增片段大小为2367bp；

图6为超表达载体pcDNA3.1-ITGB6双酶切鉴定结果，其中上面的条带为pcDNA3.1(+)载体骨架，大小为5428bp，下面的条带为插入的ITGB6基因片段，大小为2367bp，M为Marker DL5000；

图7为超表达ITGB6基因后抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖的效果图，其中图7A为EdU增殖检测成像结果图，图7B为EdU阳性率统计图，标尺为100μm；

图8为siRNA干扰ITGB6基因后促进猪骨骼肌卫星细胞增殖的效果图，其中图8A为EdU增殖检测成像结果图，图8B为EdU阳性率统计图，标尺为100μm。

具体实施方式

下面结合附图对发明作进一步详细的说明。

实施例一3个不同时期猪骨骼肌样本中H3K27me3表达水平检测

取杜洛克猪胚胎33天、65天及90天背最长肌样品共6个组织样品进行检测，具体实验过程如下：

(1)总蛋白的提取

①配制蛋白裂解液。

②用干净的剪刀、镊子剪取约0.1g组织样品，快速放进预冷过的匀浆器中，按1∶10比例加入蛋白裂解液。

③冰上匀浆直至组织消化，将样品移至1.5mL离心管中。

④12,000×g 4℃离心10分钟，取上清至新的1.5mL离心管中。

(2)蛋白定量

根据BCA蛋白定量试剂盒进行定量，方法如下：

①取40μl蛋白标准(25mg/mL)，加入1960μlPBS稀释配制成0.5mg/mL蛋白标准。

②加入PBS将BSA标准品按照说明书进行稀释。

③将蛋白标准品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl，每一浓度做三个重复。

④加20μl待测的蛋白溶液(1∶10稀释)到96孔板的样品孔中，做三个重复。

⑤每孔加入20μl BCA工作液，60℃放置60分钟(具体时间看颜色变化而定)。

⑥孵育完成后冷却至室温，在562nm处读取吸光度值，扣除空白对照组的吸光度值后计算各浓度蛋白标准的平均吸光度，绘制标准曲线，计算回归方程。

(3)Western blotting检测蛋白的表达

①将清洗干净的玻璃板与梳子组装固定好，根据实验检测指标分子量大小选择配制12％分离胶，配制的分离胶加入TEMED后立即摇匀、灌胶(留约1.5cm的高度做浓缩胶)。

②加入400μl超纯水使分离胶面平整成直线。

③约20分钟后可以看到水与胶之间出现一条明显的凝胶线，表明分离胶已充分凝固，将胶上层的水倒掉并用滤纸纸将玻片间的水吸干。

④配制5％浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀，将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子斜着插入浓缩胶中，再抚平，避免产生气泡。

⑤等到浓缩胶凝固后，把做好的胶片连同玻板整体拿出并放入电泳槽中夹紧，取出梳子，加入足够的电泳缓冲液(内槽液面需高于胶)。

⑥用微量移液器吸取10μl样品缓慢加入样品孔中。

⑦电压调到80V进行浓缩胶电泳，30分钟左右当指示剂跑到分离胶后，电压调至90V，60分钟后至指示剂即将跑出即终止电泳。

⑧剪取与凝胶样品同样大小的PVDF膜和4张滤纸，膜在甲醇中浸5min，然后连同滤纸，海绵一起浸于转移缓冲液中。

⑨在靠负极端(黑色)依次叠放海绵、两层滤纸、胶、膜、两层滤纸、海绵，放于转移装置上；350mA转膜70min。

⑩将膜浸在封闭液中37℃封闭1～2h或4℃封闭过夜。

将膜取出直接放入一抗中，37℃孵育1h，TBST洗膜5次，每次5分钟。

将膜转入二抗中，37℃孵育40分钟；TBST洗膜5次，每次5分钟；用化学发光法(ECL)显影。

结果如图1所示，肌肉组织中存在H3K27me3修饰，且H3K27me3修饰水平伴随着胚胎发育时间的增长而提高，胚胎90天骨骼肌组织的H3K27me3表达量高于胚胎65天骨骼肌组织，差异不显著；胚胎65天骨骼肌组织的H3K27me3表达量高于胚胎33天骨骼肌组织，差异不显著；胚胎90天骨骼肌组织的H3K27me3表达量高于胚胎33天骨骼肌组织，差异显著。

实施例二ChIP-seq与RNA-seq联合分析及差异表达基因的筛选

1、ChIP-seq实验

(1)工作试剂的配制

ChIP-seq实验流程中所用到的工作试剂配制体系如下：

①Douncing Buffer(1mL)：分别加入10μl Tris-HCl(pH＝7.5)、4μl MgCl2、2μlCaCl2、10μl PIC、974μl ddH2O；

②IP Buffer(1mL)：分别加入10μl Tris-HCl(pH＝8.0)、10μl Triton X-100、10μl Deoxycholate(DOC)、10μl SDS、18μl NaCl、4μl EDTA、10μl PIC、928μl ddH2O；

③Hypotonic Lysis Buffer(1mL)：分别加入0.4μl EDTA(pH＝8.0)、0.1μlBenzamidine、1μl PMSF、3μl DTT、10μl PIC、985.5μl ddH2O；

④ChiP Wash Buffer(1mL)：分别加入20μl Tris-HCl(pH＝8.0)、10μlSDS、10μlTriton X-100、4μl EDTA、30μl NaCl、10μl PIC、916μl ddH2O；

⑤ChiP Final Wash Buffer(1mL)：分别加入20μl Tris-HCl(pH＝8.0)、10μlSDS、10μl Triton X-100、4μl EDTA、100μl NaCl、10μl PIC、846μl ddH2O；

⑥Elution Buffer(1mL)：分别加入100μl NaHCO3、100μl SDS、800μl ddH2O。

(2)磁珠的准备

①将蛋白A和蛋白G偶联的磁珠储存液上下颠倒几次，重悬蛋白琼脂糖磁珠，使混合均匀。

②从每管磁珠储存液中取出磁珠各60μl，将两种磁珠加入1.5mL的硅化离心管中，用剪去尖的1mL枪头上下吹打几次混匀。

③向离心管中加入1mL IP Buffer，上下颠倒几次来清洗磁珠。

④4,000rpm 4℃冷冻离心2min，使珠子初步沉淀成块。

⑤将离心管放到磁力架上持续15S直至磁珠全部沉淀，用200μl枪头将上清液吸出去除。

⑥重复步骤④⑤⑥一次。

⑦加入1mL IP Buffer，30μl的10mg/mL的单链鲑鱼精子DNA，75μl的10mg/mL BSA到磁珠中。在4℃中旋转混匀封闭3h。4,000rpm 4℃冷冻离心2min，将离心管放到磁力架上持续15S直至磁珠全部沉淀，用200μl枪头将上清液吸出去除。

⑧重复步骤④⑤⑥一次。

⑨用300μl的IP Buffer重悬珠子，悬液储存在4℃直到需要。

(3)微球菌核酸酶消化

①在1.5mL离心管中加入配置好的Douncing Buffer，置于冰上预冷。

②称取20-30mg肌肉组织样品，用干净的剪刀、镊子将肌肉样品移至含有液氮的研钵中，用研磨棒将组织研磨成粉末状。

③用1mL蓝色枪头吹打混匀，然后使用规格为25 5/8 gauge l的注射器吸取所有的试剂再全部打出，反复吸入和打出20次。

④加入50U/mL的微球菌核酸酶在37℃水浴锅中孵育7min。

⑤加入5μl 0.5M的EDTA，冰上孵育5min。

⑥加入1mL的Hypotonic Lysis Buffer后混匀，冰上孵育60min。

⑦3,000×g 4℃离心5min，上清液转移到1.5mL的离心管中。

(4)苯酚抽提检测DNA大小

①锁相离心管中加入上步获取的100μl上清液和100μl ddH2O，200μl的25∶24∶1的苯酚-氯仿-异戊醇。

②颠倒混匀数次，然后最大转速离心5min，转移上层液体到新的1.5mL管子里。

③加入500μl冰无水乙醇和20μl 3M NaOAc，震荡混匀，-20℃静置孵育30min。

④4℃最大转速离心20min，弃上清。

⑤70％酒精清洗，4℃最大转速离心5min，弃上清。

⑥将EP管盖打开在放在空气中风干，加入50μl ddH2O溶解。

⑦取5μl溶液在1.5％的胶检测酶切后的DNA大小。

(5)免疫沉淀

①取100μl封闭的磁珠悬液到微球菌核酸酶消化的部分溶液中，然后4℃旋转2h。

②4,000rpm 4℃冷冻离心2min，取上清液到1.5mL离心管中。

③将步骤②中上清液的10％分到1.5mL离心管中作为Input，冻存于-20℃。剩余上清液分到1.5mL离心管中作为IP管，每管0.2-0.25mL。Input用于计算被各种抗体钓取出来的DNA含量。

④加入IP Buffer至每个IP管的体积达到325μl。

⑤分别加入抗体H3K27me3和对照IgG后4℃旋转混匀1h，用封口膜封好管口。

⑥加入20μl磁珠悬液到每个IP管中，4℃旋转混匀过夜，封口膜封管口。

(6)清洗

①IP管4,000rpm 4℃冷冻离心2min，在磁力架上放置15s使磁珠充分沉淀，200μl的枪头去除上清液。

②加入400μl的ChIP Wash buffer后轻轻震荡10s，在4℃旋转封闭3min，然后4,000rpm 4℃冷冻离心2min，在磁力架上放置15s使磁珠充分沉淀，200μl的枪头去除上清液。

③同样的方法用ChIP Wash buffer再洗一次，然后用ChIP Final wash buffer再洗一次。

④取出Input，加入Elution buffer至体积达到200μl。

⑤IP管中加入100μl Elution buffer。

⑥Input和IP各加入0.5μl 10μlg/μl的RNase，68℃水浴孵育2h。

⑦IP管4000rpm 4℃冷冻离心2min，取上清至1.5mL离心管中。

⑧IP管再加100μl Elution buffer，68℃水浴孵育5min，4,000rpm 4℃冷冻离心2min，取上清至相同的1.5mL离心管中。

(7)试剂盒纯化DNA

采用OMEGA的

DNA Clean-Up Kit试剂盒(型号：D6296)进行DNA纯化。具体操作参考说明书。

(8)选取染色质免疫共沉淀中获取的与H3K27me3抗体互作的富集量足够的DNA片段，将所选取的DNA片段送诺禾致源科技公司进行DNA测序。

2、RNA-seq实验

(1)组织RNA抽提

按照OMEGA的Total RNA Kit II试剂盒(型号：R6934-02)操作手册进行RNA抽提，具体操作如下：

①称取20-30mg动物组织样品至含有液氮的研钵中，用研磨棒将组织研磨成粉末状。

②在1.5mL离心管中加入1mL RNA-Solv Reagent和20μl 2-巯基乙醇，将①中粉末转移至离心管中，室温静置5分钟。

③向离心管中分别加入200μl三氯甲烷，涡旋20秒，室温静置2-3分钟。

④12,000×g 4℃离心15min。

⑤转移上清液至新的1.5mL离心管，加入等体积的70％乙醇，涡旋使之充分混匀。

⑥将

RNA收集柱套入2mL收集管中，转移700μl步骤⑤混合液至

RNA收集柱中。10,000×g室温离心30s，弃去滤液。

⑦重复步骤⑥直至所有的混合液全部通过收集柱过滤。

⑧把

RNA收集柱套回收集管中，加入500μl RNA Wash BufferI至收集柱中。10,000×g室温离心1分钟，弃去滤液和收集管。

⑨把

RNA收集柱套入新的2mL收集管中，加入500μl RNA Wash Buffer II洗涤柱子，10,000×g室温离心1分钟，弃去滤液。使用前，RNA Wash Buffer II需要按照说明书用无水乙醇稀释。

⑩把

RNA收集柱套回收集管内，加入500μl RNA Wash Buffer II[洗涤柱子，10,000×g室温离心1分钟，弃去滤液。

把

RNA收集柱套回收集管内，最大转速室温离心空管2min，使

RNA收集柱干燥。

把

RNA收集柱套入新的1.5mL离心管中，往收集柱正中心加入45-70μlDEPC水，室温静置3-5分钟，10,000×g室温离心2min。DEPC水需要预热到70℃。

(2)RNA反转录合成cDNA

采用TaKaRa的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)试剂盒的使用说明使RNA反转录合成cDNA。

(3)将RNA样品送至诺禾致源科技公司测序。

3、ChIP-seq与RNA-seq的数据处理

(1)RNA-seq数据处理

①为了保证数据分析的质量与可靠性，首先对测序获得的原始数据进行过滤。过滤内容为：去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(质量值Qphred≤20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。随后分别进行测序错误率检查、GC含量分布检查，获得后续分析使用的clean reads。在HISAT软件上将预处理后的clean reads进行猪基因组定位分析。

②进行差异分析，基因差异表达分析主要分为三部分：

a.首先对read数据进行标准化；

b.然后根据模型计算假设检验概率(P-value)；

c.最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)。

③为了研究差异基因与哪些生物学功能或通路显著性相关，使用clusterProfiler软件对差异基因集进行GO功能富集分析，KEGG通路富集分析。

(2)ChIP-seq数据处理

①数据质量控制

通过Illumina测序平台产生的原始数据(raw reads)进行进行质量控制，使用FastQC v0.11.5软件对原始数据的质量进行初步统计。为了保证数据质量，同时更高效地利用测序数据以方便后续的分析，使用Skewer v0.1.126软件对原始数据进行过滤，数据过滤步骤具体如下：

a.截去低质量reads：平均质量值低于20的reads截去；

b.截去碱基为N的占整个reads所有碱基个数的比例超过15％的reads；

c.去除带接头(adapter)的reads；

d.舍弃修剪后短于18nt的reads。

②序列比对

对于过滤后数据(clean reads)，使用BWA v0.7.12软件将clean data与猪基因组进行比对，将比对结果形成bam文件，通过IGV(Integrative Genomics Viewer)浏览器对bam文件进行可视化分析。

③片段大小预测

Clean reads在其特异性结合位点处会有显著富集，利用MACS2软件预测IP样品的片段大小，统计clean reads的富集程度。

④链互相关系数(Strand Cross Correlation，SCC)分析

测序所得clean reads会近似平均地分配到正负链上，通过对IP和Input数据的链互相关性检测不仅可以获得正负链间相关系数，同时也可以反映染色质免疫共沉淀效果。

⑤峰值分析与注释

利用MACS2软件完成峰检分析(peak calling)，设置阈值为P-value≤0.005，并对峰的个数、宽度、分布等进行统计，筛选出峰的相关基因等。利用PeakAnnotator软件确认峰相关基因，随后利用GOseq软件进行GO功能富集分析，以及利用KOBAS软件进行KEGG通路富集分析。

RNA-seq与ChIP联合分析结果如图2所示。根据以上结果分析H3K27me3富集水平随着胚胎发育时期增长而降低且基因表达量随着胚胎发育时期增长而提高的基因，并从中筛选胚胎90天与胚胎65天、胚胎90天与胚胎33天、胚胎65天与胚胎33天之间表达差异倍数均大于2的基因，最终筛选出可能对骨骼肌生长发育起关键调控作用的ITGB6基因，其表达趋势与通路预测结果如表1所示。

表1 ITGB6基因的表达趋势与通路预测

实施例三差异表达基因ITGB6的ChIP-qPCR验证

使用引物设计软件Oligo 7.56设计猪基因的定量PCR引物如表2所示。将染色质免疫共沉淀过程中获取的与抗体孵育的IP样品稀释到同一浓度，并将9个样本的Input分别稀释到10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL，不同浓度的Input用于绘制标准曲线，将所有样品按表3配制扩增体系。使用illumina的EcoTM Real-time PCR仪进行绝对定量PCR，每个IP样品和不同浓度的Input进行3个生物学重复，反应条件为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，20s，40-50个循环；95℃，15s；60℃，15s；95℃，15s。

表2 ChIP-qPCR引物

表3 ChIP-qPCR反应体系

结果如图3所示，ChIP-qPCR结果表明ITGB6基因在胚胎65天的富集量比胚胎33天低，无显著差异，ITGB6基因在胚胎90天的富集量比胚胎33天低，差异显著(p≤0.05)，ITGB6基因在胚胎90天的富集量比胚胎65天低，差异极显著(p≤0.01)。

实施例四差异表达基因ITGB6的RT-PCR验证

1、在NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站上设计基因及内参基因β-actin的定量PCR引物如表4所示。将反转录所得cDNA稀释到相同浓度，按表5配制扩增体系，每个样品3个生物学重复，随后使用illumina的EcoTM Real-time PCR仪进行实时定量荧光PCR，反应条件为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，15s，72℃，20s，40-50个循环；95℃，15s；60℃，15s；95℃，15s。

表4 RT-qPCR引物

表5 RT-qPCR反应体系

2、以β-actin作为内参，通过real-time PCR检测不同时期(胚胎33天、胚胎65天、胚胎90天)猪骨骼肌中ITGB6基因的相对表达量，以所测得的胚胎65天中ITGB6基因平均Ct值为基准，按2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量并将结果绘制成图。

如图4所示，RT-qPCR结果ITGB6基因表达量在胚胎65天比在胚胎33天高，差异极显著(p≤0.01)，ITGB6基因表达量在胚胎90天比在胚胎33天高，差异极显著(p≤0.01)，ITGB6基因表达量在胚胎90天比在胚胎65天高，差异极显著(p≤0.01)。

实施例五猪ITGB6基因的克隆

利用OMEGA公司的Total RNA kit II试剂盒从杜洛克猪背最长肌组织中提取总RNA，TaKaRa PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录(具体操作方法参照试剂盒说明书)获得猪ITGB6基因的cDNA。

(1)引物设计

在美国国立生物研究所网站NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找猪ITGB6基因(Gene ID：100037276)的CDS区域序列，利用TaKaRa公司的In-Fusion Cloning引物设计工具设计同源重组引物(引物序列如表6所示)。

表6猪ITGB6基因CDS的扩增引物

注：F代表上游引物，R代表下游引物，下划线部分为同源重组酶连接位点。

(2)PCR扩增反应

用质量检测合格的cDNA作为模板，并用高保真酶特异性扩增猪ITGB6基因的CDS，具体PCR反应体系如表7所示；反应条件为：95℃，4min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；4℃，10min。

表7 PCR反应体系

PCR扩增结果如图5所示。PCR扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后利用Omega公司的Gel Exteaction kit试剂盒纯化回收，并置于-20℃冰箱存放备用。

实施例六超表达载体pcDNA3.1-ITGB6的构建

(1)用BamH I与EcoR I对pcDNA3.1(+)真核表达载体进行双酶切，具体反应体系如表8；

表8 pcDNA3.1(+)双酶切反应体系

37℃酶切2h，随后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并回收目的片段。

(2)将回收的片段(包括目的片段和酶切后的pcDNA3.1(+)载体)按照表9的反应体系配制，于50℃反应15min(此步骤过程按照Takara In-Fusion HD Cloning kits试剂盒操作)；

表9 In-Fusion Cloning反应体系

(3)重组连接产物转化采用北京全式金生物公司的Trans5α感受态细胞进行转化，其具体操作步骤如下：

①取50μL冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；

②42℃水浴中热激45s，然后快速将其转移至冰浴中2min，该过程不要摇动离心管；

③向离心管中加入500μL无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm摇床中复苏1h；

④根据实验要求，吸取适量体积已转化的感受态细胞加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开；

⑤将平板置于37℃培养箱中正放培养30min，倒置平板，过夜培养。随后在超净工作台中用灭菌枪头从抗性平板中挑取单克隆菌落到500μL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于37℃恒温摇床扩大培养4-6h，取培养后的菌液1μL为模板，以特异性引物(见表6)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆后测序。利用NCBI网站中的BLASTn比对测序结果，鉴定序列是否正确。参照OMGEA公司的Endo-free Plasmid Mini Kit II试剂盒的说明书提取去内毒素质粒，利用BamH I与EcoR I双酶切鉴定抽提的质粒，酶切体系如表10所示，酶切结果见图6，超表达载体pcDNA3.1-ITGB6的构建成功(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)，置于-20℃冰箱备用。

表10克隆载体双酶切

实施例七抗ITGB6基因siRNA的设计、合成

在美国国立生物研究所网站NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查找猪ITGB6基因(Gene ID：100037276)的CDS区域序列，利用BlOCK-iTRNAiDesigner软件(http：//rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)，针对猪ITGB6基因不同靶位点设计3条siRNA(序列如表11所示)，并设计阴性对照siRNA-NC，序列由苏州吉玛基因有限公司合成。

表11猪ITGB6基因干涉片段序列

实施例八猪ITGB6基因超表达载体pcDNA3.1-ITGB6在猪骨骼肌卫星细胞增殖中的作用

(1)重组质粒的细胞转染

①转染前一天，将形态良好、生长旺盛的骨骼肌卫星细胞接种至细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，待细胞的密度达到60-70％时进行转染；

②用Opti-DEMETM培养基稀释LipofectamineTM 3000试剂并充分混匀，室温静置5min；

③用Opti-DEMETM培养基稀释重组质粒制备预混液，然后添加P3000^TM试剂并充分混匀，室温静置5min；

④将②③中液体1∶1混匀，室温孵育15min；

⑤将④中混合液体加入至细胞培养孔中，轻轻摇匀，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

⑥培养4-6h后，吸弃转染混合液，加入完全培养基继续培养。

(2)EdU细胞增殖检测

实验前，将骨骼肌卫星细胞以每孔5×103的数量接种于96孔板中于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，转染重组质粒，转染24h后利用广州锐博生物公司的EdU试剂盒进行细胞增殖成像检测，其具体操作步骤如下：

①用细胞完全培养基按1000∶1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；

②每孔加入100μL 50μM EdU培养基于37℃、5％CO2的培养箱中孵育2h，弃培养基；

③DPBS清洗细胞1-2次，每次5min；

④每孔加入50μL 4％多聚甲醛固定液室温孵育30min，弃固定液；

⑤每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液；

⑥每孔加入100μLDPBS，脱色摇床清洗5min，弃DPBS；

⑦每孔加入100μL渗透剂(含0.5％TritonX-100的DPBS)脱色摇床孵育10min，DPBS清洗5min；

⑧每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；

⑨加入100μL渗透剂脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；

⑩用ddH₂O按100∶1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；

每孔加入100μL 1×Hoechst33342反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；

每孔加入100μL μPBS清洗1-3次后用荧光显微镜进行成像检测。

结果如图7所示，转染pcDNA3.1-ITGB6组细胞EdU阳性率低于对照组，说明上调ITGB6基因的表达抑制了猪骨骼肌卫星细胞的增殖。

实施例九siRNA抑制ITGB6基因表达后促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖

(1)siRNA干扰片段的细胞转染

①转染前一天，将形态良好、生长旺盛的骨骼肌卫星细胞接种至细胞培养皿中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养，待细胞的密度达到60-80％时进行转染；

②用Opti-DEMETM培养基稀释RNAiMAXReagent试剂并充分混匀；

③用Opti-DEMETM培养基稀释siRNA干涉片段制备预混液并充分混匀；

④将②③中液体1∶1混匀，室温孵育5min；

⑥培养4-6h后，吸弃转染混合液，加入完全培养基继续培养。

(2)EdU细胞增殖检测

实验前，将骨骼肌卫星细胞以每孔5×10³的数量接种于96孔板中于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h后，转染重组质粒，转染24h后利用广州锐博生物公司的EdU试剂盒进行细胞增殖成像检测，其具体操作步骤如下：

②每孔加入100μL 50μM EdU培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中孵育2h，弃培养基；

③DPBS清洗细胞1-2次，每次5min；

⑥每孔加入100μLDPBS，脱色摇床清洗5min，弃DPBS；

11每孔加入100μL 1×Hoechst33342反应液，避光室温脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；

12每孔加入100μL DPBS清洗1-3次后用荧光显微镜进行成像检测。

结果如图8所示，转染组细胞EdU阳性率高于对照组，说明下调ITGB6基因的表达促进了猪骨骼肌卫星细胞的增殖。

实施例十通过抑制ITGB6基因表达促进骨骼肌发育

1)通过制备抑制ITGB6基因表达的转基因猪，来提高猪骨骼肌发育和产量

将siRNA-ITGB6-1序列插入pcDNA3.1(+)真核表达载体，构建可以抑制ITGB6基因表达的siRNA-ITGB6-pcDNA载体，将该载体转染猪成纤维细胞，筛选出可稳定表达抗ITGB6的siRNA的细胞系，将该细胞系作为核供体细胞，进行体细胞克隆。

取上述转基因克隆胚胎33天、65天及90天背最长肌，与同日龄非转基因克隆胚胎进行比对，发现转基因克隆胚胎的ITGB6表达显著降低，同时转基因克隆胚胎的成熟肌纤维数量显著增加。

同时，抑制ITGB6基因表达的转基因猪出生后，出栏时与非转基因猪相比，骨骼肌发育更好，肌肉量更高。

由此，通过抑制ITGB6基因表达，可以提高猪骨骼肌发育，提高猪的肌肉含量，有利于培养瘦肉型猪品系，并可通过选育改善猪肉品质。

2)通过向受精卵或囊胚显微注射ITGB6基因抑制剂，来提高猪骨骼肌发育和产量

将猪体外受精的受精卯或囊胚进行显微注射10pL浓度为20nM siRNA-ITGB6-1，然后将处理后的胚胎移植入代孕母猪子宫。

取上述经处理的胚胎33天、65天及90天背最长肌，与同日龄未经处理胚胎进行比对，发现经处理的受精卯胚胎的ITGB6表达显著降低，同时经处理的受精卯胚胎的成熟肌纤维数量显著增加。

同时，经上述处理的受精卯代孕至小猪出生后，出栏时与未经处理的猪相比，骨骼肌发育更好，肌肉量更高。

由此，通过纤维注射ITGB6抑制剂至猪的受精卯，来抑制ITGB6基因表达，可以提高猪骨骼肌发育，提高猪的肌肉含量，有利于培养瘦肉型猪品系，并可通过选育改善猪肉品质。

3)用ITGB6基因抑制剂处理猪精液，来提高猪骨骼肌发育和产量。

将20nM siRNA-ITGB6-1加入精液中孵育半小时，并将处理后的精液进行猪的体外受精。

取经上述处理的胚胎33天、65天及90天背最长肌，与同日龄未经处理胚胎进行比对，发现经处理胚胎的ITGB6表达显著降低，同时经处理胚胎的成熟肌纤维数量显著增加。

同时，经上述处理的小猪出生后，出栏时与未经处理的猪相比，骨骼肌发育更好，肌肉量更高。

由此，通过ITGB6抑制剂处理精液，来抑制胚胎中ITGB6基因表达，可以提高猪骨骼肌发育，提高猪的肌肉含量，有利于培养瘦肉型猪品系，并可通过选育改善猪肉品质。

在其他实施例中，用ITGB6抑制剂来提高骨骼肌发育和产量的动物包括但不限于猪，还可以为牛、羊、鼠等其他动物。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 促进骨骼肌发育的方法和促进骨骼肌发育的抑制剂及应用

<130> 20200727

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

gcuaaaggau gucaacuaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

uuaguugaca uccuuuagct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 3

gcaacuuuag acugggcuut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 4

aagcccaguc uaaaguugct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 5

gcugaucauc ucggcuuaut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 6

auaagccgag augaucagct t 21

<210> 7

<211> 7778

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 7

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccatggga atcgagctgc tgtgcctgtt 960

ctttctgttc ctgggcagga acgatcacgt gcagggagga tgtgctctgg gaggagctga 1020

gacctgtgag gactgcctgc tgatcggacc acagtgtgcc tggtgcagcc aggagaactt 1080

tacctacctg tccggagtgg gagagcggtg cgacacacca gctaacctgc tggctaaggg 1140

ctgtcagctg aacttcatcg agaaccctct gtctcaggtg gagatcctga ccaacaagcc 1200

actgagcatc ggacgccaga agaacagctc ctctatcgtg cagatcgccc cacagtccct 1260

gacactgaag ctgaggccag gctctgagca gaccctgcag gtgcaggtgc gccagacaga 1320

ggattacccc gtggacctgt actacctgat ggatctgtcc gcttctatgg acgatgacct 1380

gaacaccatc aaggagctgg gctccctgct gtctaaggag atgagcaagc tgacatccaa 1440

cttcagactg ggcttcggat cttttgtgga gaagcctatc agccccttca tgaagaccac 1500

acctgaggag atcgccaacc cctgcagctc catcccttac ttctgtctgc caaccttcgg 1560

ctttaagcac atcctgcctc tgacaaacga cgctgagagg tttaacgaga tcgtgaagaa 1620

ccagaagatc tctgccaaca tcgatacccc agagggcgga ttcgacgcta tcatgcaggc 1680

cgccgtgtgc aaggagaaga tcggctggag aaacgatagc ctgcacctgc tggtgttcgt 1740

gtctgatgcc gacagccact ttggcatgga ctctaagctg gctggaatcg tgatccccaa 1800

cgatggcctg tgccacctgg acagcaagaa cgagtacagc atgtccaccg tgctggagta 1860

ccctacaatc ggccagctga tcgacaagct ggtgcagaac aacgtgctgc tgatctttgc 1920

cgtgacccag gagcaggtgc acctgtacga gaactacgcc aagctgatcc ctggcgctac 1980

agtgggagtg ctgcagaagg attccggaaa catcctgcag ctgatcatct ccgcttacga 2040

ggagctgcgg tctgaggtgg agctggaggt gctgggcgac acagagggac tgaacctgag 2100

cttcaccgcc atctgcaaca acggcacacc atttccccac cagaagaagt gtagccacat 2160

gaaagtggga gacaccgctt cctttaacat gacagtgggc atccccaact gcgagaagag 2220

gtccagacac gtgatcgtga agcctgtggg cctgggagat gccctggaga tcctgatctc 2280

cccagagtgc tcttgtgact gccagaagga ggtggaggtg aactctagca agtgcaacca 2340

cggcaacgga agcttccagt gtggcgtgtg cgcttgcaac ccaggacaca tgggacctca 2400

ctgtgagtgc ggcgaggata ccctgagcat ggactcctgc agggaggctc cagagcacct 2460

gtcttgtagc ggcagaggag attgttactg cggccagtgt acatgccacc tgagccccta 2520

cggcaacatc tacggacctt actgtcagtg cgatgacttc tcctgcgtga ggcacaaggg 2580

actgctgtgc ggcgataacg gagactgtga gtgcggcgag tgcgtgtgca gatccggctg 2640

gaccggagag tactgtaact gcaccacaag cacagatcag tgcgtgtccg aggacggcgt 2700

gctgtgctcc ggaaggggag actgcgtgtg cggcaagtgt atctgcacca accccggcgc 2760

ctctggactg acctgtgaga ggtgcccaac atgtggcgat ccctgcaact ctaagagaag 2820

ctgcatcgag tgtcacctga gcgccgacgg acaggctagg gaggattgcg tggacaagtg 2880

taagctggcc ggcgctacaa tctccgagga ggaggatttt tccaaggact ctgccgtgtc 2940

ctgctctctg cagggagaga acgattgtct gatcaccttc ctgatcacca cagacaacga 3000

gggcaagaca atcatccaca gcatctccga gaaggattgc cctaagcccc ctaactctcc 3060

aatgatcatg ctgggagtga gcctggccat cctgctgatc ggcgtggtgc tgctgtgcat 3120

ctggaagctg ctggtgtcct tccacgaccg gaaggaggtg gccaagtttg aggctgagag 3180

gagcaaggct aagtggcaga ccggaacaaa cccactgtac cggggctcta ccagcacatt 3240

caagaacgtg acctacaagc accgcgagaa gcagaaggtg gatctgagca tggacggctg 3300

agaattctgc agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac 3360

ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 3420

cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 3480

aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 3540

cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 3600

ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag 3660

cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 3720

cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 3780

tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 3840

cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 3900

gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 3960

aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 4020

gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt 4080

ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 4140

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 4200

gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 4260

actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 4320

ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag 4380

tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata 4440

tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 4500

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 4560

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 4620

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg 4680

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 4740

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 4800

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 4860

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 4920

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 4980

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 5040

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 5100

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 5160

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 5220

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 5280

gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt 5340

tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg 5400

gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt 5460

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5520

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 5580

tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 5640

tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 5700

aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 5760

ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 5820

gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 5880

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 5940

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 6000

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 6060

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 6120

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 6180

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 6240

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 6300

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 6360

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 6420

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 6480

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 6540

aacaaaccac cgctggtagc ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6600

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6660

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6720

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6780

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6840

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 6900

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 6960

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7020

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7080

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7140

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7200

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7260

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7320

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 7380

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 7440

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 7500

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 7560

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 7620

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 7680

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 7740

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc 7778

Claims

1.促进猪骨骼肌发育的方法，其中，所述方法通过抑制ITGB6基因表达来实现，所述方法不涉及疾病的诊断和治疗。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括通过RNA干扰方法抑制ITGB6基因表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括在胚胎水平通过RNA干扰方法抑制ITGB6基因表达。

4.抑制ITGB6基因表达的抑制剂在瘦肉型猪选育上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述的应用包括：通过转基因方法制备抑制ITGB6基因表达并可促进骨骼肌发育和提高瘦肉率的转基因猪上的应用；或通过向受精卵或胚胎显微注射ITGB6基因抑制剂，并将受精卵或胚胎移植至代孕母猪子宫内获得可促进骨骼肌发育和提高瘦肉率的猪上的应用；或通过将ITGB6基因抑制剂与精液孵育，然后体外受精获得能促进骨骼肌发育和提高瘦肉率的猪上的应用。