CN113897393A - 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法 - Google Patents
一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。所述四种抗原基因分别为C129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF110‑4L。该载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达C129Rubiqutin和MGF5L6L、CP312R和MGF110‑4L基因，从而获得全新的腺病毒载体。该载体相对于第一代腺病毒载体，增加了约3kb的载体容量，再通过293TD37细胞系进行包装，获得滴度较高的重组腺病毒，用于制作非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗。本发明可以极大地提高腺病毒载体疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应。
Description
本申请主张中国在先申请,申请号:2020106427538，申请日2020年7月6日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域和免疫学领域，具体而言，涉及一种非洲猪瘟病毒的重组腺病毒疫苗及其构建方法。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是一种具有高度传染性的猪病毒病。在家猪中可导致接近100％的高死亡率。ASF是由ASF病毒(ASFVirus,ASFV)引起，ASFV是一种较大的双链DNA病毒,主要在巨噬细胞的细胞质中复制，具有20面体结构，直径为175～215nm,基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。构成ASFV病毒粒子的结构蛋白有P30、P72、P49、P54、P220、P62、pB602L、CD2v蛋白等，基于一个或两个亚单位疫苗迄今未能诱导免疫强大到足以对疫苗接种者具有显著保护作用。
我国已于2018年发现ASF疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。因此，迫切需要开发针对ASFV的疫苗。有报道，ASFV疫苗的先前的研究主要集中灭活疫苗和减毒疫苗。然而，灭活疫苗不能诱导有效的保护性应答；减毒疫苗的生物安全是其使用的主要限制因素，减毒毒株在我国是不允许研究的。然而在现阶段不能进行活病毒实验的情况下，需要提供疫苗以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
因此需要开发新型的ASFV疫苗。潜在的候选疫苗是活载体疫苗。与其他疫苗相比，活载体疫苗的优势体现在：(1)能主动感染靶组织或细胞，提高了外源基因进入细胞的效率；(2)载体自身有佐剂效应，能诱导细胞因子和趋化因子的产生；(3)多数能诱导长期的免疫应答。有利的是，需要用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质。
活载体疫苗是指将病原体的蛋白质编码基因克隆到活病毒载体，然后用于免疫动物，在动物体内表达所述蛋白质，从而诱导针对所述蛋白质的免疫应答。腺病毒5型作为表达非洲猪瘟抗原蛋白的载体具有很多优势：①腺病毒表达载体是复制缺陷型的，只能在其独特的互补细胞系中生产制备，同时腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低，制备疫苗安全性好；②重组的腺病毒载体可获得较高的滴度，利于大规模生产，工厂化效率高，生产成本低；③目前对腺病毒5型的结构、特性、功能的研究较为深入，腺病毒载体容易复制，操作简单，利于研究；④普通的一代腺病毒载体基因组敲除了6K的基因，能插入外源基因7.5k，具有较大的容量；⑤腺病毒相对稳定，经得起纯化、浓缩、保存。
现有技术报道了一些活载体疫苗。例如将ASFV p32、p54、p72和pp62基因分别重组入人腺病毒Ad5载体中进行“鸡尾酒”式免疫,获得了良好的抗原特异性CTL反应；之后他们又将ASFV A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R-A104R共7个ASFV抗原基因,重组入复制缺陷型腺病毒载体,通过“鸡尾酒”式混合免疫后能够诱导强烈体液免疫反应和细胞免疫应答。但“鸡尾酒”式免疫，每个ASFV抗原基因都必须重组入一个复制缺陷型腺病毒载体，因此需要的载体数量非常多，有在免疫过程中受到针对腺病毒载体的免疫反应的风险。CN108504686A和CN108504687A分别提供了表达ASFV的EP153R和EP402R基因的重组腺病毒载体。CN109652449A公开了EP153R与EP402R两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，CN109735567A公开了EP153R与P54两种抗原基因共表达的重组腺病毒载体。
但为了进一步增强对ASF的特异性免疫反应，还需进一步提高腺病毒载体的抗原基因容量，需用尽可能少的活载体输送尽可能多的病原体蛋白质，以引发针对尽可能多的抗原的免疫应答。
CN110269932A公开了将ASFV的A104R、A151R、B119L、B602L、CD2v、K205R、P49等5-7种抗原基因基于腺病毒载体融合在一起用于制备活载体疫苗。但多个抗原基因融合存在降低免疫原性和可能导致免疫失效的风险，因此要提高疫苗活性，还是必须要在每一个腺病毒载体上表达完全独立的抗原基因。
但目前现有技术中还没有四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，也没有关于ASFV的CP129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF110-4L四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体并运用于活载体疫苗的开发。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；所述四种抗原基因分别为CP129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF110-4L，其中CP129Rubiqutin为了提高疫苗的免疫应答反应，在CP129R上添加了分子佐剂ubiqutin而获得，CP129Rubiqutin和MGF5L6L表达在E1区，CP312R和MGF110-4L表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L。
其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L必须通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞才能实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
普通的293细胞中含有腺病毒5型的E1基因，敲除E1、E3的腺病毒能在该细胞系中复制，但敲除了E4、E2a基因的腺病毒则不能在293细胞中复制。
293TD37细胞株由本发明小组发明，并已申请发明专利CN201911033247.2，于2019年5月8日保藏与中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293-TD-37，该细胞株包含腺病毒的E2a-DBP基因和E4-ORF6/7基因，能够用于包装E2a-DBP基因和E4基因缺乏的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒，该二代腺病毒与第一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础，并且由于E2a-DBP和E4基因的同时缺失使得包装容量相较与E2a突变或E4缺失的二代腺病毒再次增加，进一步提高了腺病毒载体外源基因的插入量，对增强腺病毒载体的应用水平具有重要意义。
其中，CP129R、ubiqutin、MGF5L6L、CP312R、MGF110-4L、pAd5LCL3分别具有如序列表中SeqID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
非洲猪瘟病毒的抗原基因共计有160多种，发明人经过大量筛选实验，从中选出了20种免疫效果更强的抗原基因，分别为：P72、B602L、P30、P54、CP129R、MGF5L6L、CP312R、MGF110-4L、L8L、I215L、I73R、E146L、EP402R、EP153R、I177L、K205R、F317L、A151R、P34、pp62；这20种抗原基因根据基因片段大小，被分成五组，每组的4种抗原基因能在本发明提供的重组腺病毒载体pAd5LCL3中得以共表达，即能在同一载体中完全独立表达四种抗原基因。这五组抗原基因疫苗(包括了5个重组腺病毒载体pAd5LCL3)组成了完整的非洲猪瘟病毒疫苗，取得了非常好的免疫效果。本发明选取了CP129R、MGF5L6L、CP312R、MGF110-4L四种抗原基因，可以很好地搭配组装在同一重组腺病毒载体中，从而得以完全独立表达这四种抗原基因。
研究证明，表E3区对于外源蛋白的表达水平不高，而在E1和E4区进行抗原基因的表达，表达水平更高，因此可以将四个抗原分别表达在E1区和E4区。
E3基因由于跟复制相关，需要敲除，让其复制缺陷；E3的作用是与腺病毒的免疫逃逸相关；敲除E3区可以增加腺病毒载体的容量；并使腺病毒载体能够正常包装。
另一方面，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，包含以下步骤：
1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5。
2)再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
在已经敲除了E1、E3基因的基础上，敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，同时可以在E4区域插入外源基因，外源基因可以在E4位置大量表达，而不影响腺病载体的包装。在E1、E4基因处表达外源基因，能避免多个外源基因在同一区域表达的相互干扰，更利于表达，同时减少了不必要的E4相关基因，降低了腺病毒的免疫原性，使腺病毒能较为长期得存在于宿主细胞中，使外源基因更长期表达。
E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于是腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，因此在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
为了使E4基因能敲除完全，便于大载体质粒的连接，使用CRISPR/cas9方法将E4区域的上游Fiber基因、以及E4的基因，进行敲除，使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入I-sceI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，重新获得E4敲除引进了I-sceI单酶切位点的载体质粒。使用I-sceI将载体质粒线性化，构建E4区域的穿梭质粒，使外源基因重组到E4区域，并在E4区域大量表达。
3)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5ΔE4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3。
E4区域的ORF1～ORF5的序列进行敲除，保留E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列，并将其插入E2a位置，因此E4位置可以进行表达外源基因。同时还敲除了E2a区的DBP序列。腺病毒E2a基因是一个DNA binding protein，与腺病毒的复制相关，敲除这个基因并不影响腺病毒的结构蛋白以及腺病毒的包装。DBP缺失可以阻止或极大减低回复突变。E2a和E4部分序列的敲除，增加了约3kb的载体容量。
研究发现腺病毒复制相关的基因为E1、E2、E3、E4，缺失这些基因，并不影响腺病毒结构蛋白的表达，不妨碍腺病毒的包装，但是会使腺病毒无法复制；因此构建这些复制相关的细胞系，能使敲除复制基因的复制缺陷型的腺病毒载体能够在其特有的细胞系中进行复制包装。同时，研究发现，只要表达腺病毒的E4基因中ORF6或是ORF3均能够代替整个E4基因，使敲除了E4的腺病毒能够复制包装。通过进一步对E4、E2a基因进行序列的研究分析，E4基因能够在E2a处表达。因此，本发明对E4基因进行序列分析，找出了E4的promoter、ORF6/7、polyA这几个基本元素，将其整合成一个完整的表达框，将其构建在敲除了E2a基因的序列位置，使ORF6、ORF7基因正常表达，最终获得了敲除E1、E3、E4、E2a，并将E4表达框置于E2a位置的复制缺陷型腺病毒5型载体，能在含有DBP序列的293TD37细胞中进行复制包装。
研究发现，E4基因中含有ORF1,2,3,4,5,6,7共7个表达框，其中ORF6/7是不能缺失的，一旦缺失了，将会明显影响腺病毒的包装和抗原基因的表达，因此需要将ORF6/7补回，同时为了获得更大的载体空间，需要将ORF6/7在E2a处表达，从而制得容量更大、表达效果更好的腺病毒载体。
4)构建腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1，通过DNA连接酶分别与CP129Rubiqutin、IRES、MGF5L6L基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L。
穿梭质粒pS5E1先与核糖体进入位点IRES片段连接得到pS5E1-IRES载体，再与MGF5L6L片段连接，得到pS5E1-IRES-MGF5L6L，pS5E1-IRES-MGF5L6L与CP129Rubiqutin片段进行酶切并连接，获得E1区域穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L，并进行菌落PCR验证。
CP129Rubiqutin是通过在CP129R上添加分子佐剂ubiqutin，形成CP129Rubiqutin，分子佐剂ubiqutin可以帮助提高疫苗的免疫应答反应。
5)构建腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，CP312R、2A、MGF110-4L基因通过融合PCR技术得到CP312R-2A-MGF110-4L基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与CP312R-2A-MGF110-4L无缝克隆连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L。
通过对E4的穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP替换为pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L。CP312R-2A-MGF110-4L为CP312R、MGF110-4L通过2A序列连接。2A序列的加入是为了蛋白的裂解，EF1α启动子串联表达，2A序列又进一步裂解获得的CP312R、MGF110-4L抗原。
6)将穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L。
7)将穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L，所述四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体具有如序列表中Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。
现有的腺病毒载体构建普遍采用穿梭质粒，需要寻找单一的酶切位点。本发明创造性地采用CRISPR/cas9来构建重组腺病毒载体，通过比对，选择合适的E1、E3、E4、E2a敲除位点，根据E1、E3、E4、E2a序列的位置，敲除的基因碱基的数量，选择CRISPR位点，并设计了最佳的gRNA，从而完成重组腺病毒载体的构建。
进一步地，步骤1)所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。
进一步地，步骤3)所述的ORF6/7表达框基因具有如序列表中Seq ID NO.8所示的核苷酸序列；步骤4)所述的IRES具有如序列表中Seq ID NO.9所示的核苷酸序列；步骤5)所述的2A具有如序列表中Seq IDNO.10所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤4)所述的穿梭质粒pS5E1骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV-MCS SV40 early polyA；步骤5)所述的E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因；其中puc origin、amp等基本元素具有如序列表可见中Seq ID NO.11所示的核苷酸序列，EF1α-EGFP-HBVpolyA基因具有如序列表可见中Seq ID NO.12所示的核苷酸序列。
穿梭质粒pS5E1的骨架由北京博迈德基因技术有限公司合成，合成采用pucorigin、amp等基本元素(2796bp)，Ad5左臂ITR部分序列(400bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(944bp)SV40 early polyA(160bp)。经PCR扩增和基因片段纯化后，进行无缝克隆连接，连接产物转化至感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，培养后挑选阳性克隆进行酶切验证，获得腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1。
穿梭质粒pS5E4的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列(370bp)，右臂部分fiber基因序列(1746bp)，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因。经PCR扩增和基因片段纯化后，进行无缝克隆连接，连接产物转化至感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，培养后挑选阳性克隆进行酶切验证，获得腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP。
进一步地，步骤6)穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
进一步地，步骤7)穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L同源重组，是通过PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
另一方面，本发明提供一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞，收集细胞悬液，实现重组腺病毒包装。其中的293TD37细胞株于2019年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293-TD37，该细胞株包含腺病毒5型的E2a基因和E4-ORF6/7基因，是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，能用于包装缺失E2a和E4基因的二代重组腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒。
进一步地，所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，由以下步骤制得：
1)将pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L共表达重组腺病毒载体用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；使用PEI转染试剂转染293TD37细胞；
2)转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为TP0代腺病毒；
3)TP0代腺病毒感染293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即TP1代腺病毒；
4)重复3)，收集细胞悬液即TP2代腺病毒；
5)持续接毒直至细胞出现病变。
另一方面，本发明还提供了293TD37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为CP129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF110-4L，其中CP129Rubiqutin和MGF5L6L表达在E1区，CP312R和MGF110-4L表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L；其中，所述293TD37细胞是由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的，细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒疫苗，所述疫苗是通过构建非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，并经293TD37细胞包装而获得。其中，非洲猪瘟病毒的四种抗原基因分别为CP129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF110-4L。非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建，主要通过CRISPR/cas9敲除腺病毒载体的E1、E3、E2a和E4基因，构建了E1、E4区域的穿梭质粒，分别用于表达CP129Rubiqutin和MGF5L6L、CP312R和MGF110-4L基因，从而获得全新的腺病毒载体。本发明的有益效果主要体现在：
①提供了全新的腺病毒5型载体CRISPR/cas9的构建方法，选择了合适的敲除位点，并设计了最佳的gRNA，避免了过去载体构建用穿梭质粒敲除，需要找单一的酶切位点。
②由于E4区基因在免疫原性中起着关键作用，大量E4区域基因的表达会使宿主产生较为强烈的免疫反应，诱导抗体的产生，不利于腺病毒载体在宿主中长期表达目的蛋白，本发明在E4区域敲除不必要的基因可以降低腺病毒载体的免疫原性，使载体能够在较长时间内进行表达。
②本发明将E4区域的ORF1～ORF5的序列进行敲除，保留E4 promoter、ORF6、ORF7、polyA序列，并将其插入E2a位置，因此E4位置可以进行表达外源基因。
③本发明还进一步敲除了DBP(E2a)序列，DBP缺失可以阻止或极大减低回复突变。④E2a和E4部分序列的敲除，相对于一代载体，增加了约3kb的载体容量。
⑤腺病毒载体的E2a、E4敲除，并将E4promoter-ORF6/7-polyA放于E2a区域，由此可以用E2a互补的细胞系进行包装，同时，外源基因可以在E1、E4区域同时表达而不相互干扰，目前该腺病毒疫苗在我们公司构建的互补细胞系—293TD37细胞系中的拯救，该细胞系能够持久的表达DBP蛋白。
⑥本发明构建了E1、E4区域的穿梭质粒，用于E1、E4区域外源基因表达。
⑦本发明经293TD37细胞系包装制备得到的重组腺病毒病毒的滴度较高。
基于以上原则，本发明可以极大地提高腺病毒载体的疫苗的容量，使用在一个腺病毒载体上同时表达非洲猪瘟四个独立抗原的方式，增强对非洲猪瘟病毒的特异性免疫反应，可以使家猪获得更好的免疫保护。
附图说明
图1为实施例2的Ad5-E4-up-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图2为实施例2的Ad5-E4-down-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图3为实施例2的Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒电泳检测结果，其中泳道1为Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”，M为Marker
图4为实施例2含有部分敲除的fiber、ITR片段扩增电泳检测结果，其中泳道1为fiber部分片段扩增结果，泳道2为ITR部分片段扩增结果，M为Marker
图5为实施例2的Fiber-ITR融合片段电泳检测结果，其中泳道1为Fiber-ITR融合片段，M为Marker
图6为实施例2的菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-24为菌落，M为Marker
图7为实施例2对图6的阳性克隆菌落质粒进行BamHI、XhoI酶切验证的电泳检测结果，其中1-5为BamHI酶切，6-10为XhoI酶切，1、10为pAd5对照(为确实E4基因)，M为marker
图8为实施例3的100k-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图9为实施例3的protease-gRNA裂解位点和PAM位点示意图
图10为实施例3的100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒电泳检测结果，泳道1为100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒结果，M为marker
图11为实施例3的100k、E4 ORF6/7表达框、protease PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为E4ORF6/7表达框，泳道2为100k，M为Marker
图12为实施例3的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的融合PCR电泳检测结果，其中泳道1为片段100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR产物，M为Marker
图13为实施例3的菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-24为菌落，M为marker
图14为实施例3对图13的菌落挑取9、18、21、24号阳性克隆菌落进行XhoI酶切验证的电泳检测结果，其中泳道1为9号阳性克隆XhoI酶切，泳道2为18号阳性克隆XhoI酶切，泳道3为21号阳性克隆XhoI酶切，泳道4为24号阳性克隆XhoI酶切，泳道5为对照质粒pAd5LCL3的XhoI酶切，M为marker
图15为实施例4的CMV-MCS和SV40 earlypolyA片段扩增电泳检测结果，其中泳道1为CMV-MCS片段，泳道2为SV40 earlypolyA片段，M为2000 Marker
图16为实施例4的CMV-MCS-SV40 earlypolyA、PUC、Ad5右臂、Ad5左臂扩增电泳检测结果，其中泳道1为CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段，泳道2为PUC，泳道3为Ad5右臂，泳道4为Ad5左臂，M为2000 Marker
图17为实施例4的pS5E1骨架、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA四个片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-6为菌落，M为Marker
图18为实施例4的选取图17中的1-6号菌落酶切验证的电泳检测结果，其中左1-6为质粒pS5E1 NcoI单酶切，右1-6为质粒pS5E1 PacI单酶切，M为15000bp Marker
图19为实施例4的IRES片段PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1、2为IRES片段PCR扩增产物，M为15000bp Marker
图20为实施例4的片段IRES与pS5E1载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为片段IRES EcoRV、NotI酶切，泳道2为pS5E1EcoRV、NotI酶切，M为15000bp Marker
图21为实施例4的pS5E1载体与IRES片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-9号为菌落，M为Marker
图22为实施例4的pS5E1-IRES质粒NotI、EcoRV酶切电泳检测验证，选取图21的2、6进行质粒提取，酶切验证，其中1号泳道为2号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，2号泳道为6号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定
图23为实施例4的MGF5L6L与pS5E1-IRES载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为pS5E1-IRES，NotI和XhoI双酶切，泳道2为片段MGF5L6L，NotI和XhoI双酶切，M为15000bpMarker
图24为实施例4的MGF5L6L与pS5E1-IRES连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-12号为菌落，M为2000bp Marker
图25为实施例4的pS5E1-IRES-MGF5L6L质粒酶切电泳检测验证，选取图24中的2、9、11号菌落进行质粒提取，酶切验证，其中2号泳道为2号质粒酶切验证，9号泳道为9号质粒酶切验证，11号泳道为11号质粒酶切验证，M为Marker
图26为实施例4的片段CP129Rubiqutin与pS5E1-IRES-MGF5L6L载体酶切产物电泳检测结果，其中泳道1为pS5E1-IRES-MGF5L6L质粒，EcoRV和BamHI酶切，泳道2为C129Rubiqutin片段，EcoRV和BamHI酶切，M为15000bp Marker、2000bp Marker
图27为实施例4的pS5E1-IRES-MGF5L6L与CP129Rubiqutin连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-5号为菌落，M为2000bp Marker
图28为实施例4的pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L质粒酶切电泳检测验证，其中1、2号泳道为选取图27中的1、2号菌落质粒BamHI、EcoRV酶切鉴定，M为2000bp Marker
图29为实施例5的pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架扩增电泳检测结果，其中泳道1为pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂，泳道2为pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂，泳道3为EF1α-EGFP-HBV，泳道4为pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架，M为2000Marker
图30为实施例5的pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架四个片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中泳道1-20为菌落，M为Marker
图31为实施例5的选取图30中的3、4、5、6号菌落酶切验证的电泳检测结果，其中1-4为3、4、5、6号阳性克隆PacI单酶切，5-8为3、4、5、6号阳性克隆HindIII单酶切，M1、M3为15000bp Marker，M2为2000bp Marker
图32为实施例5的片段CP312R、MGF110-4L、2A的PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为CP312R扩增片段，泳道2为2A扩增片段，泳道3为MGF110-4L扩增片段，M为2000bp Marker
图33为实施例5的片段CP312R-2A-MGF110-4L融合PCR扩增电泳检测结果，其中泳道1为CP312R-2A-MGF110-4L片段，M为2000bp Marker
图34为实施例5的片段CP312R-2A-MGF110-4L与pS5E4-EGFP载体酶切电泳检测结果，其中泳道1为片段CP312R-2A-MGF110-4L胶回收，泳道2为片段pS5E4-EGFP，BamHI和XhoI双酶切胶回收，M为15000bp Marker
图35为实施例5的pS5E4与CP312R-2A-MGF110-4L片段连接产物转化感受态细胞菌落PCR验证电泳检测结果，其中1-12号为菌落，M为15000bp Marker
图36为实施例5挑取图35的1、2、3、4号阳性克隆提取质粒进行BamHI、XhoI双酶切验证的电泳检测结果，其中泳道1、2、3、4分别为1、2、3、4号阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，M为15000bpMarker
图37为实施例6的pAd5LCL3与pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L琼脂糖凝胶验证电泳检测结果，其中泳道1为pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L，泳道2为pAd5LCL3
图38为实施例6的穿梭质粒pS5E1-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组获得pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L质粒的电泳检测结果，其中泳道1-5为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L克隆，M为15000bp Marker
图39为实施例6挑取图38的4号阳性质粒转化至感受态细胞，提取质粒进行酶切验证检测结果，其中1、2号泳道为pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L质粒XhoI酶切，M为15000bp Marker
图40为实施例6对穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L琼脂糖凝胶验证电泳检测结果，其中泳道1为pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L，泳道2为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L，M为15000bpMarker
图41为实施例6的穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L同源重组获得重组腺病毒载体pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒的电泳检测结果，其中泳道1-6为质粒，M为15000bp Marker
图42为实施例6的挑取图41的3号阳性质粒转化至感受态细胞，提取质粒进行酶切验证检测结果，其中1号泳道为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒PacI酶切，M为15000bp Marker
图43为实施例7的TP0引起的293TD37细胞照片
图44为实施例7的TP1引起的293TD37细胞照片
图45为实施例7的TP2引起的293TD37细胞照片
图46为实施例7的TP3引起的293TD37细胞照片
图47为实施例7的TP4引起的293TD37细胞病变照片
图48为实施例11用Western Blot检测非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L中CP312R蛋白结果示意图
图49为pAd5LCL3的载体图谱
图50为pS5E1的载体图谱
图51为pS5E1-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L的载体图谱
图52为pS5E4-EGFP的载体图谱
图53为pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L的载体图谱
图54为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L的载体图谱
图55为实施例12的pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L诱导的CD8+T细胞反应结果示意图
图56为实施例12的pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L诱导的CD4+T细胞反应结果示意图
图57为实施例12的肌肉注射pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L后细胞免疫反应代表图
图58为实施例12的空白对照免疫反应代表图
具体实施方式
下面结合附图对本发明的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5的构建
在A549细胞(
CCL-185)中扩增野生型人腺病毒5型(
VR-1516，基因序列AC_000008.1)病毒，收集并进行浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，使用cosmid的方法将线性的hAd5基因组构建成环状的supercos-Ad5载体质粒，利用CRISPR/cas9对hAd5腺病毒E1区域进行切除，设计gRNA如下：
hAd5-E1上游gRNA:
GGCGGGAAAACUGAAUAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
hAd5-E1下游gRNA:
GAGAUGAUCCAGUCGUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
在hAd5E1区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，设计引物，通过融合PCR将ITR，PIX序列分别插入上、下游，并引入SwaI酶切位点，然后将融合后的片段与载体进行无缝克隆，获得E1敲除的supercos-Ad5ΔE1腺病毒载体，而后对supercos-Ad5ΔE1质粒进行E3区域的切除，设计gRNA如下：
hAd5-E3上游gRNA:
GCGGGACAUUUCAGAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
hAd5-E3下游gRNA:
GUAAGGGUACUGCUAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
在hAd5E3区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，后设计引物，对E3上下游过多切除的Fiber，以及pVIII序列进行融合PCR，使用无缝克隆的方式连接，获得缺失E1和E3基因，并引入SwaI酶切位点的腺病毒载体质粒pAd5。
实施例2缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4的构建
采用实施例1获得的已经敲除了E1、E3基因的载体质粒pAd5，进一步敲除敲除E4基因，能提高腺病毒载体的容量，降低其免疫原性，并使用PCR的方法扩增部分fiber以及引入NdeI单酶切位点，再使用Gibson的无缝克隆方法，将多余切除的片段连接至载体上，获得缺失E1、E3和E4基因，并引入SwaI和I-sceI酶切位点的载体质粒pAd5ΔE4。
1、目的基因E4CRISPR靶序列的选择
1)E4基因上游fiber基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入fiber基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E4基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择GCTACTAAACAATTCCTTCC作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为Ad5-E4-up-gRNA，裂解位点和PAM位点如图1所示。
2)E4下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E4下游的300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择AGGTTCGCGTGCGGTTTTCT作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为Ad5-E4-down-gRNA，裂解位点和PAM位点如图2所示。
2、Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA扩增
1)Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGTACTAAACAATTCCTTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增。
引物设计：
Ad5-E4-up-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGTACTAAACAATTCCT
Ad5-E4-up-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACGGAAGGAATTGTTTAGTA
Ad5-E4-down-gRNA-Forward：TAATACGACTCACTATAGGTTCGCGTGCGGTTT
Ad5-E4-down-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAACAGAAAACCGCACGCGAAC
4、扩增Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板
1)准备0.3μM的Ad5-E4-up-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液
10μM的Ad5-E4-up-gRNA-Forward引物3μl，10μM的Ad5-E4-up-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
2)准备0.3μM的Ad5-E4-down-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液
10μM的Ad5-E4-down-gRNA-Forward引物3μl，10μM的Ad5-E4-down-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
3)PCR反应体系
Ad5-E4-up-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2×)12.5μl，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μl，0.3μM Ad5-E4-up-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
Ad5-E4-down-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-FidelityPCR Master Mix(2×)12.5μl，Tracr Fragment+T7 Primer Mix 1μl，0.3μM Ad5-E4-down-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
4)PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
5、体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA
使用TranscriptAidTM Enzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA。
体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，E1A-gRNADNA模板6μl，5×TranscriptAidTM Reaction Buffer 4μl，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得Ad5-E4-down-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，E1B-gRNA DNA模板6μl，5×TranscriptAidTM Reaction Buffer 4μl，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA。
6、体外转录产物的纯化
1)将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200μl；
2)加入100μl的Binding buffer，充分混匀；
3)加入300μl的乙醇(>96％)，充分混匀；
4)将混合液转移到the Gene JETTM RNA Purification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；
5)加入700μl的Wash Buffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；
6)加入700μl的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次；
7)14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中；
8)在柱子中心加入10μl的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTM Enzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的Ad5-E4-up-gRNA和Ad5-E4-down-gRNA的RNA序列如下所示：
Ad5-E4-up-gRNA:GUACUAAACAAUUCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
Ad5-E4-down-gRNA:GGUUCGCGUGCGGUUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
7、CRISPR/Cas9“酶切”
使用Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA和cas9双酶切实施例1获得载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg，Ad5-E4-up-gRNA 6μg，Ad5-E4-down-gRNA 6μg，pAd5-REBP载体质粒3μg，NEB buffer3.1 5μl，补充水至50μl。
酶切反应于37℃孵育过夜。取3μl样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果电泳图如图3所示。泳道1为Ad5-E4-up-gRNA、Ad5-E4-down-gRNA以及cas9“双酶切”pAd5载体质粒结果，出现了目的大小在2500bp-5000bp的片段，可见酶切结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
8、获得含有部分敲除的fiber、ITR片段并引入I-SceI酶切位点，敲除使用含有敲除部分fiber的引物，扩增fiber片段并引入I-SceI酶切位点
1)片段fiber的扩增
扩增引物：
Fiber-RH-F：GAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGG
Fiber-ISceI-ITR-R：TGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTG
扩增序列为：
TGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTGAAACATAACACAAACGATTCTTTATTCTTGGGCAATGTATGAAAAAGTGTAAGAGGATGTGGCAAATATTTCATTAATGTAGTTGTGGCCAGACCAGTCCCATGAAAATGACATAGAGTATGCACTTGGAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTAATGGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTGTCTCCGTTTAAGTAAACTTGACTGACAATGTTACTTTTGGCAGTTTTACCGTGAGATTTTGGATAAGCTGATAGGTTAGGCATAAATCCAACAGCGTTTGTATAGGCTGTGCCTTCAGTAAGATCTCCATTTCTAAAGTTCCAATATTCTGGGTCCAGGAAGGAATTGTTTAGTAGCACTC
扩增体系为：10μM Fiber-RH-F引物1μl；10μM Fiber-ISceI-ITR-R引物1μl；模板pAd5(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果电泳图如图4所示，泳道1为fiber部分片段扩增结果，M为2000Marker，可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
2)ITR片段的扩增
扩增引物：
ISceI-ITR-F：TAGGGATAACAGGGTAATAACACCACTCGACACGGCAC
ITR-RH-R：GGCGTAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGGGTGTTTTTTGTGGACTT
扩增序列为：
GGCGTAGGTTCGCGTGCGGTTTTCTGGGTGTTTTTTGTGGACTTTAACCGTTACGTCATTTTTTAGTCCTATATATACTCGCTCTGCACTTGGCCCTTTTTTACACTGTGACTGATTGAGCTGGTGCCGTGTCGAGTGGTGTTATTACCCTGTTATCCCTA
扩增体系为：10μM ISceI-ITR-F引物1μl；10μM ITR-RH-R引物1μl；模板pAd5(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图4所示，泳道2为ITR部分片段扩增结果，M为2000Marker，可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
3)融合PCR获得Fiber-ITR的融合片段
扩增体系为：10μM Fiber-RH-F引物1μl，10μM Fiber-ISceI-ITR-R引物1μl，模板pAd5(100ng/μl)0.5μl，Q5高保真酶25μl，补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图5所示，泳道1为Fiber-ITR的融合片段，M为2000Marker，可见融合结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
9、载体连接
使用NEB的Gibson使Fiber-ITR片段与敲除E4后的载体质粒连接，连接体系如下所示：胶回收产物载体质粒片段100ng，胶回收产物fiber-ITR片段50ng，Gibson预混液10μl，补水至20μl。于50℃，孵育40分钟。
10、转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10μl连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
11、菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对转化子进行菌落PCR验证。
设计菌落PCR的下游引物
E4-cexu-F：AGTGACGATTTGAGGAAGTTG
E4-cexu-R：TCAATTGCAGAAAATTTCAAGTC
反应体系为：10μM E4-cexu-F引物1μl，10μM E4-cexu-R引物1μl，Q5高保真酶10μl，补水至20μl，挑取单克隆菌落于反应体系中。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图6所示，除了2、8、11、17号，大部分菌落出现了阳性条带。
12、质粒酶切验证
挑取4个阳性克隆菌落，提取质粒，进行BamHI、XhoI酶切验证，酶切结果如图7所示，从图7可以看出，2-5号质粒BamHI、XhoI酶切结果均正确，同时测序结果正确，即获得了缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5ΔE4。
实施例3缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3的构建
1、目的基因E2a CRISPR靶序列的选择
1)E2a基因上游100k基因CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入100k基因的前400个碱基，软件自动分析该400个碱基的序列，提供了6个潜在的CRISPR靶序列。考虑到E2a基因敲除序列的长度，以及构建活载体的要求，选择ATAGGTGGCGTTCGTAGGCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为100k-gRNA，裂解位点和PAM位点如图8所示。
2)E2a下游非编码序列CRISPR靶序列的选择
使用赛默飞GeneArtTMCRISPR Search and Design tool(thermofisher.com/crisprdesign)软件，输入E4下游的300个碱基，软件自动分析，提供了6个潜在的CRISPR靶序列，选择TACCCCGGTAATAAGGTTCA作为靶向序列，最终获得的gRNA命名为protease-gRNA，裂解位点和PAM位点图9所示。
2、100k-gRNA和protease-gRNA的DNA扩增
1)100k-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGAGGTGGCGTTCGTAGGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
2)protease-gRNA的DNA模板设计
5’-TAATACGACTCACTATAGCCCCGGTAATAAGGTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC GTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT-3’
3、设计扩增100k-gRNA和protease-gRNA的DNA模板的上下游引物
设计上下游引物分别进行PCR扩增100k-gRNA的DNA模板和protease-gRNA的DNA模板，使用GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit试剂盒进行扩增。
1)引物设计
100k-gRNA-Foward：TAATACGACTCACTATAG AGGTGGCGTTCGTAG
100k-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC TGCCTACGAACGCCACCT
protease-gRNA-Foward：TAATACGACTCACTATAG CCCCGGTAATAAGGT
protease-gRNA-Reverse：TTCTAGCTCTAAAAC TGAACCTTATTACCGGGG
2)扩增100k-gRNA和protease-gRNA的DNA模板
①准备0.3μM的100k-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液，包括10μM的100k-gRNA-Forward引物3μl，10μM的100k-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
②准备0.3μM的Aprotease-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液，包括10μM的protease-gRNA-Forward引物3μl，10μM的protease-gRNA-Reverse引物3μl，补充水至100μl。
③PCR反应体系
100k-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2×)12.5μl，Tracr Fragment+T7Primer Mix 1μl，0.3μM 100k-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
protease-gRNA的DNA模板扩增的PCR反应体系为：PhusionTM High-Fidelity PCRMaster Mix(2×)12.5μl，Tracr Fragment+T7Primer Mix 1μl，0.3μM protease-gRNA-Forward/Reverse引物混合工作液1μl，补水至25μl。
④PCR程序
起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火55℃，15sec，32循环；延伸72℃，1min，1循环；保持4℃。
3、体外转录获得100k-gRNA和protease-gRNA
使用TranscriptAidTM Enzyme Mix对模板DNA进行体外转录，获得100k-gRNA和protease-gRNA。
1)体外转录获得100k-gRNA、protease-gRNA
体外转录获得100k-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，100k-gRNADNA模板6μl，5×TranscriptAidTM Reaction Buffer 4μl，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
体外转录获得protease-gRNA的反应体系为：NTP mix 8μl，protease-gRNA DNA模板6μl，5×TranscriptAidTM Reaction Buffer 4μl，TranscriptAidTM Enzyme Mix 2μl。于37℃孵育4小时后加入1μl的DNase I，于37℃孵育15分钟。
2)体外转录产物的纯化
将转录后的反应体系用无核酸酶水补充至200μl，加入100μl的Binding buffer，充分混匀，加入300μl的乙醇(>96％)，充分混匀，将混合液转移到the Gene JETTM RNAPurification Micro Column中，14000×g离心30-60秒，弃下液；加入700μl的WashBuffer1(加入13mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液；加入700μl的Wash Buffer2(加入30mL乙醇)，14000×g离心30-60秒，弃下液，重复上述步骤一次。14000×g空离60秒，将所有的洗脱液完全去除，将空管放置于1.5mL的收集管中，在柱子中心加入10μl的无核酸酶水，14000×g离心60秒收集gRNA。
其中，Wash Buffer1和Wash Buffer2均为TranscriptAidTM Enzyme Mix试剂盒中的试剂，转录获得的100k-gRNA和protease-gRNA的RNA序列如下所示：
100k-gRNA:GAGGUGGCGUUCGUAGGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
protease-gRNA:GCCCCGGUAAUAAGGUUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
4、CRISPR/Cas9“酶切”
使用100k-gRNA、protease-gRNA和cas9双酶切实施例2获得的缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒，反应体系为Cas9蛋白3μg；100k-gRNA6μg；protease-gRNA 6μg；实施例2获得的载体质粒3μg；NEB buffer 3.1 5μl；补充水至50μl。
上述酶切反应分别于37℃孵育过夜。取3μl样品进行琼脂糖凝胶验证，实验结果如图10所示。泳道1为100k-gRNA、protease-gRNA以及cas9“双酶切”载体质粒结果，出现了目的大小在1000-2500bp的片段，可见酶切结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将载体进行纯化。
5、获得含有部分敲除的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段
1)部分敲除的100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的扩增
①部分敲除的100k扩增引物：
100k-F：TGAGAATAGGTGGCGTTCGTAGGCAAGGCTGACATCCGCTATGG
100k-ORF6/7-R：TACAATTCCCAACACATACAAGTTTCCTTCTCCTATAGGCAGAA
扩增体系为：10μM 100k-F引物1μl；10μM 100k-ORF6/7-R引物1μl；模板pAd5ΔE4(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
②E4 ORF6/7表达框扩增引物：
ORF6/7-F：ACTTGTATGTGTTGGGAATTGTA
ORF6/7-R：ATCGTTTGTGTTATGTTTCAACG
扩增体系为：ORF6/7-F引物1μl；10μM ORF6/7-R引物1μl；模板ORF6/7表达框基因(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
③部分敲除的Protease片段的扩增
ORF6/7-Protease-F：CCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTATCGTTTGTGTTATGTTTCAACG
Protease-R：ATGGATCACAACCCCACCATGAACCTTATTACCGGGGTACCCA
扩增体系为：10μM ORF6/7-Protease-F引物1μl；10μM Protease-R引物1μl；模板pAd5ΔE4(100ng/μl)0.5μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，10sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。
④100k、E4 ORF6/7表达框、protease PCR扩增结果如图11所示，其中泳道1为E4ORF6/7表达框，泳道2为100k，M为15000bpMarker
可见扩增结果正确，使用Axygen胶回收试剂盒将片段分别进行胶回收纯化。
6、融合PCR获得100k、E4 ORF6/7表达框、Protease片段的融合片段
扩增体系为：10μM 100k-F引物1μl；10μM Protease-R引物1μl；模板100k胶回收产物(50ng/μl)1μl模板E4 ORF6/7表达框胶回收产物(50ng/μl)1μl模板E4 ORF6/7表达框胶回收产物(50ng/μl)1μl；Q5高保真酶25μl；补水至50μl。
PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，50sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。扩增结果如图12所示，其中泳道1为片段100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR产物，可见扩增结果正确。使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化。
7、载体连接
使用NEB的Gibson使100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR胶回收产物与步骤4中敲除E2a后的载体连接，连接体系如下所示：胶回收产物敲除E2a后的载体片段100ng，胶回收产物100k、E4 ORF6/7表达框、protease融合PCR片段50ng，Gibson预混液10μl，补水至20μl。于50℃，孵育40分钟。
8、转化
取出卡那抗性培养基平板，将制备好的NEB 10β感受态细胞放在冰上融化后，加入10μl连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟；将离心管放置42℃水浴，热击90秒，利用卡那青霉素抗性筛选转化子。
9、菌落PCR进行转化子筛选
使用PCR扩增方式对转化子进行菌落PCR验证。
设计菌落PCR的下游引物
DBP-upsteam-F：GTTGGGCTCGCATGTGCCG
DBP-downsteam-R：ACTCCCATGGATCACAACCC
反应体系为：10μM DBP-upsteam-F引物1μl，10μM DBP-downsteam-R引物1μl，Q5高保真酶10μl，补水至20μl，挑取单克隆菌落于反应体系中。PCR程序为：起始变性98℃，10sec，1循环；变性98℃，5sec；退火60℃，30sec；延伸72℃，20sec，35循环；延伸72℃，5min，1循环；保持4℃。进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图13所示，在9、18、21、24出现阳性条带。
10、质粒酶切验证
挑取9、18、21、24这4个阳性克隆菌落，提取质粒，进行XhoI酶切验证，酶切结果如图14所示，其中泳道1为9号阳性克隆XhoI酶切，泳道2为18号阳性克隆XhoI酶切，泳道3为21号阳性克隆XhoI酶切，泳道4为24号阳性克隆XhoI酶切，泳道5为对照质粒pAd5LCL3的XhoI酶切。从图14可以看出，质粒XhoI酶切结果均正确，同时测序结果正确，即获得了缺失E1、E3、E4和E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置的pAd5LCL3质粒，其载体图谱如图49所示。
实施例4非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L的构建
1、人类腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒的构建
穿梭质粒pS5E1的骨架采用puc origin、amp等基本元素(2796bp)(pS5E1骨架由北京博迈德基因技术有限公司合成)，Ad5左臂ITR部分序列(355bp)，右臂PIX、PIVa2部分序列(2100bp)，以及CMV-MCS(Seq ID NO.13)(944bp)SV40 early polyA(Seq ID NO.14)(160bp)。
1)引物设计
puc-Ad5-right arm-F：TAATGCAGCTGGCTTATCGAAACGTGGAATGCGAGACCGTCT
Ad5-right arm-CMV-R：ACACACAAGCAGGGAGCAGATACAAGGGTGGGAAAGAATATATAAG
CMV-F：GTATCTGCTCCCTGCTTGTG
CMV-SV40-R：TAAACAAGTTGGGGTGGGCGAAGTGATCAGCGGGTTTAAACGGG
SV40-F：CTTCGCCCACCCCAACTTGT
SV40-R：AGAGGTCGACGGTATACAGAC
SV40-Ad5-left arm-F：TGTCTGTATACCGTCGACCTCTCCGGGCCCTAGACAAATATTA
Ad5-left arm-puc-R：
ACACTATAGAATACACGGAATTCTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG
puc-F：GAATTCCGTGTATTCTATAGTGT
puc-R：TTTCGATAAGCCAGCTGCATTA
2)目的片段的扩增
①以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以CMV-F和CMV-SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV启动子MCS片段；扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10uM CMV-F引物1ul，10uM CMV-SV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min，35个循环；72℃，5min。
②以pCDNA3.1(+)为模板(该质粒购自赛默飞公司)，以SV40-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的SV40-earlypolyA片段；扩增体系：pCDNA3.1(+)质粒50ng，10uM SV40-F引物1ul，10uMSV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min。
扩增产物琼脂糖验证如图15所示，其中泳道1为CMV-MCS片段，泳道2为SV40earlypolyA片段，M为2000Marker。由图15可见，扩增结果正确。
③使用Axygen胶回收试剂盒进行纯化。
④以博迈德公司合成的pS5E1骨架质粒为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E1穿梭质粒骨架，扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10uM puc-F引物1ul，10uM puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。
⑤以pAd5LCL3质粒为模板，以SV40-Ad5-left arm-F和Ad5-left arm-puc-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM SV40-Ad5-left arm-F引物1ul，10uM Ad5-leftarm-puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。
⑥以pAd5LCL3质粒为模板，以puc-Ad5-right arm-F和Ad5-right arm-CMV-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的右臂，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM puc-Ad5-right arm-F引物1ul，10uM Ad5-rightarm-CMV-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、15s，35个循环；72℃，5min。
⑦以胶回收产物CMV-MCS为模板，以CMV-F和SV40-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的CMV-MCS-SV40 earlypolyA片段，扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM CMV-F引物1ul，10uMSV40-R引物1ul，Q5高保真酶20ul，补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min。
扩增产物琼脂糖验证如图16所示，其中泳道1为CMV-MCS-SV40 earlypolyA融合片段，泳道2为PUC，泳道3为Ad5右臂，泳道4为Ad5左臂。
3)片段的连接转化
使用Axygen胶回收试剂盒将片段进行纯化，然后使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E1骨架、Ad5左臂、Ad5右臂、CMV-MCS-SV40 earlypolyA这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix 10μl、pS5E1骨架片段50ng、Ad5左臂50ng、Ad5右臂50ng、CMV-MCS-SV40 polyA 50ng、补水至20μl，50℃保温40分钟，获得连接产物质粒pS5E1。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
4)质粒的验证
①菌落PCR验证
挑选菌落进行琼脂糖凝胶验证，结果如图17所示，出现阳性条带。
②酶切验证
挑取阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，电泳结果如图18所示，其中左1-6为质粒pS5E1 NcoI单酶切，右1-6为质粒pS5E1 PacI单酶切，M为15000bp Marker，酶切结果正确，成功构建人类腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1，其载体图谱如图50所示。
2、非洲猪瘟腺病毒5型载体穿梭质粒pS5E1-P72-IRES-B602L构建
1)pS5E1与IRES片段的连接
①引物合成
IRES-EcoRV-F：ccg GATATC TGTCGTCATCATCCTTATAGTCC
IRES-NotI-R：aaatat GCGGCCGC GGTTGTGGCCATTATCATCGTG
②扩增IRES片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物IRES-EcoRV-F 1ul，10uM引物IRES-NotI-R 1ul，模板IRES模板2ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。扩增结果电泳检测如图19所示，其中泳道1、2为IRES片段PCR扩增产物，M为15000bp Marker，可见扩增结果正确。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化IRES片段。
④目的片段IRES与pS5E1载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1、IRES片段～2ug，EcoRV和NotI各1ul；10×cutsmartbuffer 5ul；补水至50ul；反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活；胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图20所示，其中泳道1为片段IRES EcoRV、NotI酶切，泳道2为pS5E1EcoRV、NotI酶切，M为15000bp Marker。
⑤pS5E1载体与IRES片段连接
连接体系：pS5E1(100ng)；IRES片段(载体：片段＝1：5,摩尔比)；T4DNA连接酶1ul；10×ligase buffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物IRES-EcoRV-F 1ul，10uM引物IRES-NotI-R 1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、20s，35个循环；72℃，5min。进行电泳验证，如图21所示，其中1-9号为菌落，M为Marker，由图21可见，2和6号出现阳性条带。
⑦质粒NotI、EcoRV酶切验证，选取2、6进行质粒提取，酶切验证，结果如图22所示，其中2号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，6号质粒NotI、EcoRV酶切鉴定，可见酶切结果正确。
2)pS5E1-IRES与MGF5L6L片段的连接
①引物合成
MGF5L6L-NotI-F：aaggaaaaaaGCGGCCGCgccaccATGCTGGTGATCTTCCTGGG
MGF5L6L-XhoI-R：catgCTCGAG TCAGGCGTAGTCAGGCACAT
②PCR扩增MGF5L6L片段
扩增体系：Q5酶25ul，10uM引物MGF5L6L-NotI-F 1ul，10uM引物MGF5L6L-XhoI-R1ul，模板MGF5L6L 1ul，补水至50ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40s，35个循环；72℃，5min。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化MGF5L6L片段。
④目的片段MGF5L6L与pS5E1-IRES载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1-IRES、MGF5L6L片段～2ug，NotI和XhoI各1ul；10×cutsmart buffer 5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图23所示，其中泳道1为pS5E1-IRES，NotI和XhoI双酶切，泳道2为片段MGF5L6L，NotI和XhoI双酶切，M为15000bp Marker。
⑤目的片段MGF5L6L与pS5E1-IRES连接
连接体系：pS5E1-IRES(100ng)；MGF5L6L片段(载体：片段＝1：3摩尔比)；T4DNA连接酶1ul；10×ligase buffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物MGF5L6L-NotI-F 1ul，10uM引物MGF5L6L-XhoI-R1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃，5min。进行电泳验证，如图24所示，其中1-12号为菌落，M为2000bp Marker。
⑦质粒酶切验证(NotI和XhoI)，选取2、9、11菌落进行质粒提取，酶切验证。结果如图25所示，均为阳性质粒。
3)pS5E1-IRES-MGF5L6L与片段CP129Rubiqutin的连接
①引物合成
CP129R-BamHI-F：cgcGGATCCgccaccATGGAGCACCCCAGCACAAA
CP129R-ubiqutin-R：GGGTTTTCACGAAAATCTGCATGGCGTAATCGGGCACGTCGTAA
ubiqutin-F：ATGCAGATTTTCGTGAAAACCC
ubiqutin-EcoRV-R：ccgGATATC TTACTTGTCTTCTGGTTTGTTGA
②PCR扩增CP129Rubiqutin片段
扩增CP129R片段
扩增体系：Q5酶25ul，引物CP129R-BamHI-F 1ul，引物CP129R-ubiqutin-R 1ul，模板C129R2ul，补水至50ul；反应条件：98℃30S；98℃10s，68℃30s，72℃15s，35个循环；72℃5min。
扩增ubiqutin片段
扩增体系：Q5酶25ul，引物ubiqutin-F 1ul，引物ubiqutin-EcoRV-R 1ul，模板ubiqutin 2ul，补水至50ul；反应条件：98℃30S；98℃10s，68℃30s，72℃15s，35个循环；72℃5min。
融合PCR扩增C129Rubiqutin片段
扩增体系：Q5酶25ul，上游引物CP129R-BamHI-F、下游引物ubiqutin-EcoRV-R，模板片段CP129R、片段ubiqutin各50ng，补水至50ul；反应条件：98℃；98℃5s，68℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
③使用Axygen PCR纯化试剂盒纯化CP129Rubiqutin片段。
④目的片段CP129Rubiqutin与pS5E1-IRES-MGF5L6L载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E1-IRES-MGF5L6L、CP129Rubiqutin片段2ug，EcoRV和BamHI各1ul；10×cutsmart buffer 5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。胶回收纯化。酶切产物电泳检测如图26所示，其中泳道1为pS5E1-IRES-MGF5L6L，EcoRV和BamHI酶切；泳道2为CP129Rubiqutin片段，EcoRV和BamHI酶切，M为15000bpMarker、2000bp Marker。
⑤pS5E1-IRES-MGF5L6L载体与CP129Rubiqutin片段连接
连接体系：pS5E1-IRES-MGF5L6L 100ng；CP129Rubiqutin片段50ng；T4DNA连接酶1ul；10×ligasebuffer 1ul；补水至10ul。反应条件：室温，30min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
⑥菌落PCR验证
扩增体系：Q5酶10ul，10uM引物CP129R-BamHI-F 1ul，10uM引物ubiqutin-EcoRV-R1ul，补水至20ul；PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃，5min；进行电泳验证，如图27所示，其中1-5号为菌落，M为2000bp Marker。由图27可见，1号和2号出现阳性条带。
⑦质粒BamHI、EcoRV酶切验证，选取1、2号菌落进行质粒提取，酶切验证，结果如图28所示，其中1、2号泳道为1、2号菌落质粒BamHI、EcoRV酶切鉴定，M为2000bp Marker。由图28可见，酶切结果正确，成功构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L，其载体图谱如图51所示。
实施例5非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L的构建
1、人类腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒的构建
穿梭质粒pS5E4的骨架采用puc origin、amp等基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列(370bp)，右臂部分fiber基因序列(1746bp)，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因。
1)基因合成
EF1α-EGFP-HBV polyA基因由博迈德公司合成。
2)引物设计
puc-Ad5E4-left arm-F：
AGGTGACACTATAGAATACACGTTAATTAAATCATCAATAATATACCTTATTTTG
Ad5E4-left arm-EF1α-R：caatccccccttttcttttaaaaAACACCACTCGACACGGCAC
EF1α-F：ttttaaaagaaaaggggggattg
EF1α-R：TAGAGCCCCAGCTGGTTCTTT
EF1α-Ad5E4-right arm-F：GGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGCAATTGAAAAATAAACACGTTGA
Ad5E4-right arm-puc-R：TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAAATGTAACCACTGTGAG
puc-F：TCTCCCTATAGTGAGTCGTATT
puc-R：CGTGTATTCTATAGTGTCACCT
ORF6/7-Protease-F：CGTTGAAACATAACACAAACGATACGGCGCAGACGGCAAGGGTGGG
3)目的片段的扩增
①以EF1α-EGFP-HBV基因合成片段为模板，以EF1α-F和EF1α-R为引物，扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒的EF1α-EGFP-HBV polyA片段；扩增体系：EF1α-EGFP-HBV基因合成片段50ng，10uM EF1α-F引物1ul，10uM EF1α-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
②以pAd5LCL3为模板，以puc-Ad5E4-left arm-F和Ad5E4-left arm-EF1α-R为引物，扩增pS5E1穿梭质粒的左臂片段。扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM puc-Ad5E4-leftarm-F引物1ul，10uM Ad5E4-left arm-EF1α-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、10sec，35个循环；72℃，5min。
③以pAd5LCL3为模板，以EF1α-Ad5E4-right arm-F和Ad5E4-right arm-puc-R为引物，扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒的右臂片段；扩增体系：pAd5LCL3质粒50ng，10uM EF1α-Ad5E4-right arm-F引物1ul，10uM Ad5E4-right arm-puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。
PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、40sec，35个循环；72℃，5min。
④以pS5E1质粒为模板，以puc-F和puc-R为引物，PCR扩增pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架；扩增体系：pS5E1骨架质粒50ng，10uM puc-F引物1ul，10uM puc-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul。PCR程序为：98℃，10s；98℃、5s，60℃、30s，72℃、1min20sec，35个循环；72℃，5min。扩增产物琼脂糖验证如图29所示，其中泳道1为pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂，泳道2为pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂，泳道3为EF1α-EGFP-HBV，泳道4为pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架，M为2000Marker。由图29可见，扩增结果正确。
4)使用Axygen胶回收试剂盒纯化目的片段。
5)片段的连接转化
使用博迈德公司无缝克隆试剂盒将pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂、EF1α-EGFP-HBV、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架这四个片段连接，连接体系为2×Smealess Cloning Mix 10μl、pS5E4-EGFP穿梭质粒左臂片段50ng、pS5E4-EGFP穿梭质粒右臂片段50ng、EF1α-EGFP-HBV片段50ng、pS5E4-EGFP穿梭质粒骨架片段50ng、补水至20μl，50℃保温40分钟；将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
6)质粒的验证
①菌落PCR验证
用引物puc-Ad5E4-left arm-F/EF1α-R为引物菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶验证，结果如图30所示，出现阳性条带。
②酶切验证
挑取3、4、5、6号阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行酶切验证，电泳结果如图31所示，其中1-4为3、4、5、6号阳性克隆PacI单酶切，5-8为3、4、5、6号阳性克隆HindIII单酶切，M1、M3：15000bp Marker；M2：2000bp Marker；酶切结果正确，测序正确；成功构建人类腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，其载体图谱如图52所示。
2、非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L构建
1)引物设计
PS5E4-CP312R-HamHI-F：ccaagctgtgaccggcgcctacGGATCCGCCACCATGACAACCCACAT
CP312R-2A-R：GAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGGCGTAATCAGGCACGTCGTA
CP312R-2A-F：TACGACGTGCCTGATTACGCCGGAAGCGGAGCTACTAACTTC
2A-MGF110-4L-R：GCCCAGAAACACCACCAGCATAGGTCCAGGGTTCTCCTCCA
MGF110-4L-F：ATGCTGGTGGTGTTTCTGGG
MGF110-4L-XhoI-R：CGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGTCACAGGTCCTTCT
EF1α2(jd)-F：tggtgcctcctgaactgcgt
HBV(jd)-R：TAAGGGTCAATGTCCATGCC
2)目的片段CP312R、MGF110-4L、2A的扩增
①以CP312R基因合成片段为模板，以PS5E4-CP312R-HamHI-F和CP312R-2A-R为引物，扩增CP312R片段；扩增体系：CP312R基因合成片段50ng，10uM PS5E4-CP312R-HamHI-F引物1ul，10uM CP312R-2A-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
②以MGF110-4L基因合成片段为模板，以MGF110-4L-F和MGF110-4L-XhoI-R为引物，扩增MGF110-4L片段；扩增体系：MGF110-4L基因合成片段50ng，10uM MGF110-4L-F引物1ul，10uM MGF110-4L-XhoI-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
③以2A基因合成片段为模板，以CP312R-2A-F和2A-MGF110-4L-R为引物，扩增2A片段；扩增体系：2A基因合成片段50ng，10uM CP312R-2A-F引物1ul，10uM 2A-MGF110-4L-R引物1ul，Q5高保真酶20ul；补水至40ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、20sec，35个循环；72℃，5min。
扩增结果如图32所示，其中泳道1为CP312R扩增片段，泳道2为2A扩增片段，泳道3为MGF110-4L扩增片段，M为2000bp Marker。
3)使用Axygen胶回收试剂盒纯化目的片段。
4)融合PCR扩增CP312R-2A-MGF110-4L片段
扩增体系：CP312R胶回收片段50ng、2A胶回收片段50ng、MGF110-4L胶回收片段50ng，10uM PS5E4-CP312R-HamHI-F引物1ul，10uM MGF110-4L-XhoI-R引物1ul，Q5高保真酶25ul；补水至50ul；PCR程序为：98℃，10sec；98℃、5sec，60℃、30sec，72℃、50sec，35个循环；72℃，5min。融合结果如图33所示，其中泳道1为CP312R-2A-MGF110-4L片段，M为2000bpMarker。
5)pS5E4-EGFP载体酶切
酶切反应体系：载体pS5E4-EGFP 2ug，BamHI和XhoI各1ul；10×cutsmart buffer5ul；补水至50ul。反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。Axygen试剂盒胶回收纯化。胶回收结果如图34所示，其中泳道1为片段CP312R-2A-MGF110-4L胶回收，泳道2为载体pS5E4-EGFP，BamHI、XhoI双酶切胶回收，M为15000bp Marker。
6)pS5E4载体与CP312R-2A-MGF110-4L片段无缝克隆连接与转化
连接体系：pS5E4-EGFP胶回收产物(100ng)，CP312R-2A-MGF110-4L片段(50ng)，2×Smealess Cloning Mix 5ul，补水至10ul。反应条件：50℃，40min。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄抗性的平板上，37℃培养12-16小时。
7)质粒的验证
①菌落PCR验证
用引物以EF1α2(jd)-F、HBV(jd)-R为引物，菌落PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶验证，结果如图35所示，其中1-12号为菌落，M为15000bp Marker，均为阳性条带。
②酶切验证
挑取1、2、3、4号阳性克隆置于5mL含有氨苄抗性LB液体培养基中培养12-15小时，提取质粒进行BmHI、XhoI双酶切验证；酶切结果如图36所示，其中泳道1、2、3、4为阳性克隆BamHI、XhoI双酶切验证，M为15000bp Marker。酶切结果正确，测序正确，成功构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L，其载体图谱如图53所示。
实施例6穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L、pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L与pAd5LCL3重组构建pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒
1、穿梭质粒pS5E1-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3的同源重组
1)PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L 3μg；PacI 2μl；buffercutsmart 4μl；补水至40μl。
B、腺病毒载体质粒pAd5LCL3 3ug；SwaI 2μl；Buffer 3.1 4μl；补水至40μl。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
取2ul琼脂糖凝胶验证，验证结果如图37所示，其中泳道1为pS5E1-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L，泳道2为pAd5LCL3。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5μl；去磷酸化酶1μl；去磷酸化buffer 5μl；补水至50μl。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证；结果如图38所示，其中泳道1-5为pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L克隆，M：15000bp Marker，从图38可以看出，4号和5号克隆酶切正确。
6)将4号阳性质粒转化至DH5a感受态，挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI酶切验证，酶切结果如图39所示，其中1、2号泳道为pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L质粒XhoI酶切，M为15000Marker，由图39可知，酶切结果正确，成功构建腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L。
2、穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L同源重组获得pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L
1)PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-C129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L进行酶切，酶切反应体系如下：
A、穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L 3μg；PacI 2μl；10×cutsmart buffer4μl；补水至40μl。
B、腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L3ug；I-sceI 2μl；Buffer cutsmart 4μl；补水至40μl。
反应条件37℃，1h；65℃，20min灭活。
取2ul琼脂糖凝胶验证，验证结果如图40所示，其中泳道1为pS5E4-CP312R-2A-MGF110-4L，泳道2为pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L。
2)酶切产物去磷酸化
反应体系：酶切反应液37.5μl；去磷酸化酶1μl；去磷酸化buffer 5μl；补水至50μl。反应条件37℃，1h；65℃，5min灭活。
3)使用OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段。
4)取100ng纯化后的穿梭质粒和100ng纯化后的腺病毒载体共转化BJ5183感受态细胞，转化产物涂布含有Kan的LB平板，37℃培养12～16h。
5)挑取6个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒进行XhoI酶切验证，结果如图41所示，其中泳道1-6为质粒，M为15000Marker，可以看出，3、4号质粒正确。
6)将3号阳性质粒转化至DH5a感受态；挑取一个菌落于5mL含有Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16h，并提取质粒再次进行XhoI酶切验证；酶切结果如图42所示，其中1号泳道为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒XhoI酶切，2号泳道为pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒PacI酶切，M为15000Marker，由图42可知，酶切结果正确，成功构建腺病毒载体质粒pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L，其载体图谱如图54所示。
实施例7重组腺病毒的包装
使用293TD37细胞包装pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L质粒，操作步骤：
准备293TD37细胞：转染前一天准备细胞，将待转染的293TD37细胞接种到6孔板中，0.5×106活细胞/孔，于37℃，5％CO2静置培养24小时，转染当天细胞有40-50％汇合率。
质粒pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L线性化：将待转染的质粒用PacI酶切，于37℃孵育40min后，65℃灭活20min。
转染：用100μl无血清培养基将线性化的2μg质粒和PEI分别稀释；向PEI稀释液中加入质粒稀释液，反复吸取5次或涡旋10秒钟混匀，室温下孵育10分钟后形成转染复合物。孵育过程中，从培养板上轻柔地吸出细胞培养液，加入新鲜的生长培养基2mL，10分钟后将转染复合物加到换了新鲜培养基的细胞中。
细胞培养：将转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中静置培养72-96小时；病毒质粒转染72-96小时后收集6孔板细胞悬液于1.5ml离心管中即TP0。
持续接毒：将收集的细胞悬液在-80℃反复冻融3次，4℃、2000g离心10分钟，取上清500μl感染293TD37细胞(293TD37细胞需要提前一天准备)，37℃、5％CO2孵育60分钟，补充2mL的FBS的培养基，37℃、5％CO2培养培养72小时，收集细胞悬液即TP1；重复之前的步骤，收集细胞悬液即TP2。持续接毒直至细胞出现病变。
细胞病变：当293TD37细胞培养从TP0至TP4后，细胞逐渐病变，直至293TD37细胞完全病变。TP0至TP4引起的细胞病变情况分别如图43-47所示，TP4已完全病变。
实施例8非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗滴度的检测
准备293TD37细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，接种6孔板中(5×105/mL，每孔2ml)，于37℃，5％CO2二氧化碳培养箱中静置培养。24小时后，待细胞贴壁生长成单层细胞，弃去培养基，用无血清DMEM维持液对重组的腺病毒作10-3～10-6倍连续稀释，每个稀释度接种2孔，每孔250uL，感染1小时后，弃上清，补充完全培养基，然后于37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养。24h后，弃上清，用PBS洗细胞，每孔1mL，弃PBS后，每孔加1mL冷甲醛固定，室温10min，弃甲醛，再用PBS冲洗细胞，每孔1mL，加腺病毒抗体-FITC，每孔1ml，室温1h后，再次用PBS冲洗细胞，每孔1mL，两遍后每孔加1mL PBS，荧光显微镜下计数(200倍,10个连续视野)。计算：病毒滴度(FFU/mL)＝平均数×1013×4×10(-n)。pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒的FFU为1.9×108FFU/mL，滴度较高。
实施例9非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L稳定性的检测
准备293TD37细胞，取T75培养瓶中生长良好的细胞，弃上清，PBS洗细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，再加入含有10％胎牛血清的DMEM新鲜培养基10mL终止消化，然后吹打混匀，将293TD37细胞种入6孔板中(5×105cells/mL，2mL/孔)，室温孵育1小时使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度。用pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒颗粒进行感染，感染的滴度为5MOI/孔。293TD37细胞48小时后发生病变后，收集细胞，反复冻融3次后2000g离心，收集上清，将收集的上清检测FFU，后重新感染新的293TD37细胞，直至30代。将收集的第5、10、15、20、25、30代次的病毒液进行检测，发现病毒的基因组仍然完整，说明复制缺陷型pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒能够在293TD37细胞中稳定包装。
实施例10非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L恢复突变(RCA)的检测
pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒RCA检测，检测方法如下：
1、准备pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒液，并测其病毒滴度，测定病毒颗粒浓度，病毒液加1％Universal nuclease(Universal nuclease 7.5～15units/mL病毒液)消化宿主细胞的DNA，37℃水浴40min。用300Kd的超滤离心管，经1000g，30min离心，1×PBS洗脱收集病毒颗粒，测A260，颗粒浓度＝A260*1.1*10^12VP/mL。
2、病毒感染，准备A549细胞的6孔板，每孔细胞为2.5×105活细胞/孔，弃培养基，PBS清洗一次，将腺病毒按照1×109vp/孔接种病毒，感染A549细胞，野生型腺病毒5型为对照，37℃，5％CO2，1h后，弃去病毒液，补足5％完全培养基，37℃，5％CO2培养48h。
3、免疫染色，弃细胞上清，PBS表面冲洗细胞，用冰甲醛固定，放置-20℃，20min，1×PBS清洗三遍，每遍5min，每孔加入2ml 1％BSA-PBS溶液，放置摇床，孵育1h。弃去上清，加入腺病毒5型荧光抗体(1:500稀释)，孵育1h，1×PBS清洗三遍，每遍5min。
用10倍荧光显微镜观察，使用公式计算RCA
RCA＝(average positive cell field)×(374field/well)×(dilutionfactor))/Total VPs in 0.5ml viral sample
判断标准为RCA的水平小于1RCA/3×1010vp。经过统计，pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L的RCA的水平小于1RCA/3×1010vp，说明本发明所制备的复制缺陷型pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒在293TD37细胞中能够稳定包装，不会转化为野生型或转化为野生型的几率较低。
实施例11非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L蛋白表达检测
提前一天准备293TD37细胞，置于12孔细胞培养板中，使用非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L病毒感染293TD37细胞，48小时后细胞发生病变，收集全部的1ml细胞，使用PBS洗涤，制样，用于Western Blot检测；使用HA的抗体检测目的蛋白，HA的抗体采购于Abcam。其中C129Rubiquitin、MGF5L6L、CP312R具有HA标签，其中C129Rubiquitin融合蛋白大小为34kda，MGF5L6L蛋白大小为25kda，CP312R蛋白大小为35kda。实验结果如图48所示，该疫苗可以清晰可见MGF5L6L蛋白，由此可见pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L的蛋白表达量较高。
实施例12非洲猪瘟多抗原重组腺病毒疫苗pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L在小鼠模型上的免疫学评价
12.1细胞免疫反应检测
10只SPF级小鼠(6-8周龄)，随机分成2组，每组5只。根据表1所示分组情况对小鼠进行pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L免疫。注射方式为：后大腿内侧肌肉注射；注射剂量：100ul。
表1：疫苗免疫检测小鼠分组情况
免疫后14天处死小鼠，分离脾淋巴细胞，使用穿梭质粒pS5E1-C129Rubiqutin-MGF5L6L和pS5E4-CP312R-MGF110-4L转染的PK15细胞刺激培养6小时，同时加入蛋白分泌阻断剂阻断细胞因子分泌。6小时后，阻断Fc受体，对死细胞和细胞表面分子标志物进行染色，细胞经固定和穿孔之后，对细胞内细胞因子进行染色。细胞表面标志物包括CD4、CD8，细胞内细胞因子包括IFNγ、IL2。使用流式细胞仪(CyExpert)分析CD4+T细胞和CD8+T细胞经目的蛋白刺激后表达IFNγ、IL2的水平。
pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L诱导的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应如图55、56所示，代表性结果如图57至图58所示，其中图57为肌肉注射pAd5LCL3-C129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L后细胞免疫反应代表图，图58为空白对照免疫反应代表图。结果表示：小鼠免疫后14天，脾细胞经目的蛋白刺激后，CD8+T细胞，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。CD4+T细胞经过刺激后，其表达的IFNγ、TNFα和IL2水平均显著高于Ad5载体对照组(Control)(P<0.05)。细胞免疫反应检测结果说明肌肉注射免疫1*10^7FFU的腺病毒载体疫苗，可诱导其免疫的小鼠产生特异性细胞免疫反应。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
<150> 2020106427538
<151> 2020-07-06
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagcacc ccagcacaaa ctacaccccc gagcagcagc acgagaagct gaagcactac 60
gtgctgatcc ctaagcacct gtggtcctac atcaagtacg gcacccacgt gagatactac 120
acaacacaga acgtgttcag agtgggcggc tttgtgctgc agaaccctta cgaggccgtg 180
atcaagaatg aggtgaagac agccatcaga ctgcagaatt ccttcaacac caaggccaag 240
ggccacgtga cctgggccgt gccatacgat aacatcagca agctgtacgc caagcccgat 300
gccatcatgc tgacaatcca ggagaatgtg gagaaggccc tgcacgccct gaatcagaat 360
gtgctgaccc tggccagcaa gatcaggtac ccttacgacg tgcccgatta cgcc 414
<210> 2
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcagattt tcgtgaaaac ccttacgggg aagaccatca ccctcgaggt tgaaccctcg 60
gatacgatag aaaatgtaaa ggccaagatc caggataagg aaggaattcc tcctgatcag 120
cagagactga tctttgctgg caagcagctg gaagatggac gtactttgtc tgactacaat 180
attcaaaagg agtctactct tcatcttgtg ttgagacttc gtggtggtgc taagaaaagg 240
aagaagaagt cttacaccac tcccaagaag aataagcaca agagaaagaa ggttaagctg 300
gctgtcctga aatattataa ggtggatgag aatggcaaaa ttagtcgcct tcgtcgagag 360
tgcccttctg atgaatgtgg tgctggggtg tttatggcaa gtcactttga cagacattat 420
tgtggcaaat gttgtctgac ttactgtttc aacaaaccag aagacaagta a 471
<210> 3
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgctggtga tcttcctggg catcctgggc ctgctggcca gccaggtgag cagccagctg 60
gtgggccagc tgaggcccac cgaggagcca cctgaggagg agctggagta ctggtgtgcc 120
tacatggaga gctgccagtt ctgctgggat tgtcaggatg gcacctgcat caacaagatc 180
gacggctccg tgatctacaa gaatgagtac gtgaagagct gtctggtgag cagatggctg 240
gacaagtgca tgtacgatct ggacaagggc atctaccaca ccatgaactg caaccaggtg 300
ctgggcctgc ctaaccagcc cgccggacag ctgcacccca ccgataatcc cccccaggag 360
gagctggaat actggtgcac ctacaccgag aactgcaagt tctgctggaa ttgtcagaat 420
ggcctgtgtg agggcaagct ggagaacaca accatcctgg agaatgagta cgtccagagc 480
tgcatcgtga gcagatggct caacaagtgt atgtacgatc tcggccaggg catccaccac 540
gtgatggcct gctccgagcc caagccctgg aatccttaca agatcctgaa gagagagtgg 600
aaggagaata actcctaccc ctacgatgtg cctgactacg cctga 645
<210> 4
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgacaaccc acatcttcca cgccgatgat ctgctgcagg ccctgcagca ggccaaggcc 60
gagaagaact tctccagcgt gttcagcctg gattgggata agctgaggac agccaagagg 120
aacacaaccg tgaagtacgt gacagtgaac gtgatcgtga agggcaagaa ggcccccctg 180
atgttcaact tccagaacga gaagcacgtg ggcacaatcc cccctagcac agatgaggag 240
gtgatcagaa tgaatgccga gaatcccaag ttcctggtga agaagagaga tagggacccc 300
tgcctgcagt tcaataagta caagatcagc cctcccctgg aggatgatgg cctgacagtg 360
aagaagaacg agcagggcga ggagatctac cctggcgacg aggagaagag caagctgttc 420
cagatcatcg agctgctgga ggaggccttt gaggacgccg tgcagaaggg ccctgaggcc 480
atgaagacca agcacgtgat caagctgatc cagagaaaga tcagcaactc cgccgtgaag 540
aacgccgata agcctctgcc caaccctatc gccaggatca gaatcaagat caatcctgcc 600
acatccatcc tgacacccat cctgctggac aagaacaagc ctatcacact gcagaacggc 660
aagaccagct tcgaggagct gaaggatgag gacggcgtga aggccaaccc tgacaacatc 720
cacaagctga tcgagtccca cagcatccac gatggcatca tcaacgccag aagcatctgc 780
atctccaaca tgggcatcag cttccccctg tgcctggaga tgggcgtggt gaaggtgttt 840
gagaagaata atggcatcga cgtgaatagc atctacggct ccgacgacat ctccacactg 900
gtgaaccaga tcgccatcgc ctacccctac gacgtgcctg attacgcc 948
<210> 5
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgctggtgg tgtttctggg catcctgggc ctgctggcca atcaggtggt gggcctgccc 60
acccaggccg gaggacatct gagatccacc gataatcccc cccaggagga gctgggctac 120
tggtgcacct acatggagag gtgcaagttc tgctgggagt gcgcccacgg catctgcaag 180
aataaggtga acaattccat gcctctgatc atcgagaatt cctacctgac cacatgtgag 240
gtgtccaggt ggtacaacca gtgtacctac ggcgagggca atggccacta ccacgtgatg 300
gactgctccg atcccgtgcc tcacaacaga ccctaccagc tgctgatgaa gatctacgag 360
aagaaggacc tgtga 375
<210> 6
<211> 32619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 60
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 120
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 180
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 240
atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa ttggttgtaa cactggcaga 300
gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 360
gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt tccgtggcaa agcaaaagtt 420
caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt 480
ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt cttcacgagg 540
cagacctcag cgctcaaaga tgcaggggta aaagctaacc gcatctttac cgacaaggca 600
tccggcagtt caacagatcg ggaagggctg gatttgctga ggatgaaggt ggaggaaggt 660
gatgtcattc tggtgaagaa gctcgaccgt cttggccgcg acacgccgac atgatccaac 720
tgataaaaga gtttgatgct cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac gggatcagta 780
ccgacggtga tatggggcaa atggtggtca ccatcctgtc ggctgtggca caggctgaac 840
gccggaggat cctagagcgc acgaatgagg gccgacagga agcaaagctg aaaggaatca 900
aatttggccg caggcgtacc gtggacagga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 960
gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 1020
gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 1080
cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 1140
gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat 1200
tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 1260
aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1320
tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca 1380
tgattacgcc aagcttgcat gcctgcaggt cgatcgatta attaacgacc catcatcaat 1440
aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt ttgtgacgtg 1500
gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg taggttttag ggcggagtaa cttgtatgtg 1560
ttgggaattg tagttttctt aaaatgggaa gttacgtaac gtgggaaaac ggaagtgacg 1620
atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt cgtttctggg cgtaggttcg cgtgcggttt 1680
tctgggtgtt ttttgtggac tttaaccgtt acgtcatttt ttagtcctat atatactcgc 1740
tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt 1800
tattaccctg ttatccctag caattgaaaa ataaacacgt tgaaacataa cacaaacgat 1860
tctttattct tgggcaatgt atgaaaaagt gtaagaggat gtggcaaata tttcattaat 1920
gtagttgtgg ccagaccagt cccatgaaaa tgacatagag tatgcacttg gagttgtgtc 1980
tcctgtttcc tgtgtaccgt ttagtgtaat ggttagtgtt acaggtttag ttttgtctcc 2040
gtttaagtaa acttgactga caatgttact tttggcagtt ttaccgtgag attttggata 2100
agctgatagg ttaggcataa atccaacagc gtttgtatag gctgtgcctt cagtaagatc 2160
tccatttcta aagttccaat attctgggtc caggaaggaa ttgtttagta gcactccatt 2220
ttcgtcaaat cttataataa gatgagcact ttgaactgtt ccagatattg gagccaaact 2280
gcctttaaca gccaaaactg aaactgtagc aagtatttga ctgccacatt ttgttaagac 2340
caaagtgagt ttagcatctt tctctgcatt tagtctacag ttaggagatg gagctggtgt 2400
ggtccacaaa gttagcttat cattattttt gtttcctact gtaatggcac ctgtgctgtc 2460
aaaactaagg ccagttccta gtttaggaac catagccttg tttgaatcaa attctaggcc 2520
atggccaatt tttgttttga ggggatttgt gtttggtgca ttaggtgaac caaattcaag 2580
cccatctcct gcattaatgg ctatggctgt agcgtcaaac atcaacccct tggcagtgct 2640
taggttaacc tcaagctttt tggaattgtt tgaagctgta aacaagtaaa ggcctttgtt 2700
gtagttaata tccaagttgt gggctgagtt tataaaaaga gggccctgtc ctagtcttag 2760
atttagttgg ttttgagcat caaacggata actaacatca agtataaggc gtctgttttg 2820
agaatcaatc cttagtcctc ctgctacatt aagttgcata ttgccttgtg aatcaaaacc 2880
caaggctcca gtaactttag tttgcaagga agtattatta atagtcacac ctggaccagt 2940
tgctacggtc aaagtgttta ggtcgtctgt tacatgcaaa ggagccccgt actttagtcc 3000
tagttttcca ttttgtgtat aaatgggctc tttcaagtca atgcccaagc taccagtggc 3060
agtagttaga gggggtgagg cagtgatagt aagggtactg ctatcggtgg tggtgagggg 3120
gcctgatgtt tgcagggcta gctttccttc tgacactgtg aggggtcctt gggtggcaat 3180
gctaagtttg gagtcgtgca cggttagcgg ggcctgtgat tgcatggtga gtgtgttgcc 3240
cgcgaccatt agaggtgcgg cggcagccac agttagggct tctgaggtaa ctgtgagggg 3300
tgcagatatt tccaggttta tgtttgactt ggtttttttg agaggtgggc tcacagtggt 3360
tacattttgg gaggtaaggt tgccggcctc gtccagagag aggccgttgc ccattttgag 3420
cgcaagcatg ccattggagg taactagagg ttcggatagg cgcaaagaga gtaccccagg 3480
gggactctct tgaaacccat tgggggatac aaagggagga gtaagaaaag gcacagttgg 3540
aggaccggtt tccgtgtcat atggatacac ggggttgaag gtatcttcag acggtcttgc 3600
gcgcttcatc tgcaacaaca tgaagatagt gggtgcggat ggacaggaac aggaggaaac 3660
tgacattcca tttagattgt ggagaaagtt tgcagccagg aggaagctgc aataccagag 3720
ctgggaggag ggcaaggagg tgctgctgaa taaactggac agaaatttgc taactgattt 3780
taagtaagtg atgctttatt attttttttt attagttaaa gggaataaga tctttgagac 3840
cgcacagggt cttaataagg gtgcagagat cctcaggtcc ttgacaaggt gagtgaatgc 3900
agccttcggt ttctaccgag tgctgagtta tggtaatggg cttttctccc accatgacca 3960
ccaatttctg acgcttggtt ggcaacttgt agctaaggcg gtgtccggtg gtattactgt 4020
cgtaggtgac tttggcctgc tttaccagac aaaagatacc ccttttgcac tggtgcaagt 4080
taaccatgtc ttggagctct tgattcatgc gctgttgctc ggccgctgcc ctgcgtcttt 4140
ctagcaggcg ctgctctgta ataattccgt ccatttctag ctagagaaac ctgaattaga 4200
atagcccgta gagttgcttg aattgttcat aaaccccaca gtagctgcgc ctttggccta 4260
ataccctaag ggttttctaa gctcacctcc tgttctggta aacagagtta ttgaggtctg 4320
tccggaaaaa gtctggttta cggtcaggcg gtaggtgtgg tgcagcggcc ggtgacgcac 4380
tcgtacgttc ccggcaggta aggagggtgg tgttttttct gatggagtag ctgagctcgg 4440
agaggttctc tcgtagactc actccgtctg ggttgaaact gttgtaaatc acagagggag 4500
agatgttaaa agtaccaggt aaggttcgcc ttggtttgct tgggcgggtg aagacggtgg 4560
cgtttacagg atggcgatag gagccccagt atattttaat ttctgtattt attatactca 4620
gcacagagat ggcaacaaag atcttgatgt aatccagggt taggacagtt gcaaatcaca 4680
gtgagaacac agggtcccct gtcccgctca actagcaggg ggcgctgggt aaactcccga 4740
atcaggctac gggcaagctc tccctgggcg gtaagccgga cgccgtgcgc cgggccctcg 4800
atatgatcct cgggcaattc aaagtagcaa aactcaccgg agtcgcgggc aaagcacttg 4860
tggcggcgac agtggaccag gtgtttcagg cgcagttgct ctgcctctcc acttaacatt 4920
cagtcgtagc cgtccgccga gtcctttacc gcgtcaaagt taggaataaa ttgatccgga 4980
tagtggccgg gaggtcccga gaaggggtta aagtagaccg atggcacaaa ctcctcaata 5040
aattgcagag ttccaatgcc tccagagcgc ggctcagagg acgaggtctg cagagttagg 5100
attgcctgac gaggcgtgaa tgaagagcgg ccggcgccgc cgatctgaaa tgtcccgtcc 5160
ggacggagac caagcgagga gctcaccgac tcgtcgttga gctgaatacc tcgccctctg 5220
attgtcaggt gagttatacc ctgcccgggc gaccgcaccc tgtgacgaaa gccgcccgca 5280
agctgcgccc ctgagttagt catctgaact tcggcctggg cgtctctggg aagtaccaca 5340
gtggtgggag cgggactttc ctggtacacc agggcagcgg gccaactacg gggattaagg 5400
ttattacgag gtgtggtggt aatagccgcc tgttccagga gaattcggtt tcggtgggcg 5460
cgtattccgt tgacccggga tatcatgtgg ggtcccgcgc tcatgtagtt tattcgggtt 5520
gagtagtctt gggcagctcc agccgcaagt cccatttgtg gctggtaact ccacatgtag 5580
ggcgtgggaa tttccttgct cataatggcg ctgacaacag gtgctggcgc cgggtgtggc 5640
cgctggagat gacgtagttt tcgcgcttaa atttgagaaa gggcgcgaaa ctagtcctta 5700
agagtcagcg cgcagtattt actgaagaga gcctccgcgt cttccagcgt gcgccgaagc 5760
tgatcttcgc ttttgtgata caggcagctg cgggtgaggg atcgcagaga cctgtttttt 5820
attttcagct cttgttcttg gcccctgctc tgttgaaata tagcatacag agtgggaaaa 5880
atcctgtttc taagctcgcg ggtcgatacg ggttcgttgg gcgccagacg cagcgctcct 5940
cctcctgctg ctgccgccgc tgtggatttc ttgggctttg tcagagtctt gctatccggt 6000
cgcctttgct tctgtgtggc cgctgctgtt gctgccgctg ccgccggtgc agtatgggct 6060
gtagagatga cggtagtaat gcaggatgtt acgggggaag gccacgccgt gatggtagag 6120
aagaaagcgg cgggcgaagg agatgttgcc cccacagtct tgcaagcaag caactatggc 6180
gttcttgtgc ccgcgccatg agcggtagcc ttggcgctgt tgttgctctt gggctaacgg 6240
cggcggctgc ttggacttac cggccctggt tccagtggtg tcccatctac ggttgggtcg 6300
gcgaacgggc agtgccggcg gcgcctgagg agcggaggtt gtagccatgc tggaaccggt 6360
tgccgatttc tggggcgccg gcgaggggaa tgcgaccgag ggtgacggtg tttcgtctga 6420
cacctcttcg acctcggaag cttcctcgtc taggctctcc cagtcttcca tcatgtcctc 6480
ctcctcctcg tccaaaacct cctctgcctg actgtcccag tattcctcct cgtccgtggg 6540
tggcggcggc agctgcagct tctttttggg tgccatcctg ggaagcaagg gcccgcggct 6600
gctgctgata gggctgcggc ggcgggggga ttgggttgag ctcctcgccg gactgggggt 6660
ccaagtaaac cccccgtccc tttcgtagca gaaactcttg gcgggctttg ttgatggctt 6720
gcaattggcc aagaatgtgg ccctgggtaa tgacgcaggc ggtaagctcc gcattaggcg 6780
ggcgggattg gtcttcgtag aacctaatct cgtgggcgtg gtagtcctca ggtacaaatt 6840
tgcgaaggta agccgacgtc cacagccccg gagtgagttt caaccccgga gccgcggact 6900
tttcgtcagg cgagggaccc tgcagctcaa aggtaccgat aatttgactt tcgttaagca 6960
gctgcgaatt gcaaaccagg gagcggtgcg gggtgcatag gttgcagcga cagtgacact 7020
ccagtagacc gtcaccgctc acgtcttcca ttatgtcaga gtggtaggca aggtagttgg 7080
ctagctgcag aaggtagcag tggccccaaa gcggcggagg gcattcgcgg tacttaatgg 7140
gcacaaagtc gctaggaagt gcacagcagg tggcgggcaa gattcctgag cgctctagga 7200
taaagttcct aaagttctgc aacatgcttt gactggtgaa gtctggcaga ccctgttgca 7260
gggttttaag caggcgttcg gggaaaatga tgtccgccag gtgcgcggcc acggagcgct 7320
cgttgaaggc cgtccatagg tccttcaagt tttgctttag cagtttctgc agctccttga 7380
ggttgcactc ctccaagcac tgctgccaaa cgcccatggc cgtctgccag gtgtagcata 7440
gaaataagta aacgcagtcg cggacgtagt cgcggcgcgc ctcgcccttg agcgtggaat 7500
gaagcacgtt ttgcccaagg cggttttcgt gcaaaattcc aaggtaggag accaggttgc 7560
agagctccac gttggagatc ttgcaggcct ggcgtacgta gccctgtcga aaggtgtagt 7620
gcaatgtttc ctctagcttg cgctgcatct ccgggtcagc aaagaaccgc tgcatgcact 7680
caagctccac ggtaacgagc actgcggcca tcattagttt gcgtcgctcc tccaagtcgg 7740
caggctcgcg cgtttgaagc cagcgcgcta gctgctcgtc gccaactgcg ggtaggccct 7800
cctctgtttg ttcttgcaaa tttgcatccc tctccagggg ctgcgcacgg cgcacgatca 7860
gctcactcat gactgtgctc atgaccttgg ggggtaggtt aagtgccggg taggcaaagt 7920
gggtgacctc gatgctgcgt tttagtacgg ctaggcgcgc gttgtcaccc tcgagttcca 7980
ccaacactcc agagtgactt tcattttcgc tgttttcctg ttgcagagcg tttgccgcgc 8040
gcttctcgtc gcgtccaaga ccctcaaaga tttttggcac ttcgttgagc gaggcgatat 8100
caggtatgac agcgccctgc cgcaaggcca gctgcttgtc cgctcggctg cggttggcac 8160
ggcaggatag gggtatcttg cagttttgga aaaagatgtg ataggtggca agcacctctg 8220
gcacggcaaa tacggggtag aagttgaggc gcgggttggg ctcgcatgtg ccgttttctt 8280
ggcgtttggg gggtacgcgc ggtgagaata ggtggcgttc gtaggcaagg ctgacatccg 8340
ctatggcgag gggcacatcg ctgcgctctt gcaacgcgtc gcagataatg gcgcactggc 8400
gctgcagatg cttcaacagc acgtcgtctc ccacatctag gtagtcgcca tgcctttcgt 8460
ccccccgccc gacttgttcc tcgtttgcct ctgcgttgtc ctggtcttgc tttttatcct 8520
ctgttggtac tgagcggtcc tcgtcgtctt cgcttacaaa acctgggtcc tgctcgataa 8580
tcacttcctc ctcctcaagc gggggtgcct cgacggggaa ggtggtaggc gcgttggcgg 8640
catcggtgga ggcggtggtg gcgaactcag agggggcggt taggctgtcc ttcttctcga 8700
ctgactccat gatctttttc tgcctatagg agaaggaaac ttgtatgtgt tgggaattgt 8760
agttttctta aaatgggaag ttacgtaacg tgggaaaacg gaagtgacga tttgaggaag 8820
ttgtgggttt tttggctttc gtttctgggc gtaggttcgc gtgcggtttt ctgggtgttt 8880
tttgtggact ttaaccgtta cgtcattttt tagtcctata tatactcgct ctgcacttgg 8940
ccctttttta cactgtgact gattgagctg gtgccgtgtc gagtggtgtt tttttaatag 9000
gttttctttt ttactggtaa ggctgactgt tatgactacg tccggcgttc catttggcat 9060
gacactacga ccaacacgat ctcggttgtc tcggcgcact ccgtacagta gggatcgtct 9120
acctcctttt gagacagaaa cccgcgctac catactggag gatcatccgc tgctgcccga 9180
atgtaacact ttgacaatgc acaacgtgag ttacgtgcga ggtcttccct gcagtgtggg 9240
atttacgctg attcaggaat gggttgttcc ctgggatatg gttctaacgc gggaggagct 9300
tgtaatcctg aggaagtgta tgcacgtgtg cctgtgttgt gccaacattg atatcatgac 9360
gagcatgatg atccatggtt acgagtcctg ggctctccac tgtcattgtt ccagtcccgg 9420
ttccctgcag tgtatagccg gcgggcaggt tttggccagc tggtttagga tggtggtgga 9480
tggcgccatg tttaatcaga ggtttatatg gtaccgggag gtggtgaatt acaacatgcc 9540
aaaagaggta atgtttatgt ccagcgtgtt tatgaggggt cgccacttaa tctacctgcg 9600
cttgtggtat gatggccacg tgggttctgt ggtccccgcc atgagctttg gatacagcgc 9660
cttgcactgt gggattttga acaatattgt ggtgctgtgc tgcagttact gtgctgattt 9720
aagtgagatc agggtgcgct gctgtgcccg gaggacaagg cgccttatgc tgcgggcggt 9780
gcgaatcatc gctgaggaga ccactgccat gttgtattcc tgcaggacgg agcggcggcg 9840
gcagcagttt attcgcgcgc tgctgcagca ccaccgccct atcctgatgc acgattatga 9900
ctctaccccc atgtagacta gggttctgtg agtttgatta aggtacggtg atctgtataa 9960
gctatgtggt ggtggggcta tactactgaa tgaaaaatga cttgaaattt tctgcaattg 10020
aaaaataaac acgttgaaac ataacacaaa cgatacggcg cagacggcaa gggtgggggt 10080
aaataatcac ccgagagtgt acaaataaaa gcatttgcct ttattgaaag tgtctctagt 10140
acattatttt tacatgtttt tcaagtgaca aaaagaagtg gcgctcctaa tctgcgcact 10200
gtggctgcgg aagtagggcg agtggcgctc caggaagctg tagagctgtt cctggttgcg 10260
acgcagggtg ggctgtacct ggggactgtt gagcatggag ttgggtaccc cggtaataag 10320
gttcatggtg gggttgtgat ccatgggagt ttggggccag ttggcaaagg cgtggagaaa 10380
catgcagcag aatagtccac aggcggccga gttgggcccc tgtacgcttt gggtggactt 10440
ttccagcgtt atacagcggt cgggggaaga agcaatggcg ctacggcgca ggagtgactc 10500
gtactcaaac tggtaaacct gcttgagtcg ctggtcagaa aagccaaagg gctcaaagag 10560
gtagcatgtt tttgagtgcg ggttccaggc aaaggccatc cagtgtacgc ccccagtctc 10620
gcgaccggcc gtattgacta tggcgcaggc gagcttgtgt ggagaaacaa agcctggaaa 10680
gcgcttgtca taggtgccca aaaaatatgg cccacaacca agatctttga caatggcttt 10740
cagttcctgc tcactggagc ccatggcggc agctgttgtt gatgttgctt gcttctttat 10800
gttgtggcgt tgccggccga gaagggcgtg cgcaggtaca cggtttcgat gacgccgcgg 10860
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tcgtccatgg gatccacctc aaaagtcatg tctagcgcgt gggcggagtt ggcgtagaga 10980
aggttttggc ccaggtctgt gagtgcgccc atggacataa agttactgga gaatgggatg 11040
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cctataagcg gataggggaa gttagcaggg taggcctgtc cttcgcgcat ggtgggggca 11160
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ttgtatttag tatcatccac cacctgacgg ctcatgggct ggaagtttct aaagaaggag 11280
tacatgcggt ccttgtagct ctctgggata tagaagccct ggtagccaat gttatagtta 11340
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ggcccgtgac ctgtggagct cattcgtcgc ttccaaccct catcttgcag actgggccct 24840
ttcagagcac gggctcagct cccctgaaga gctcacctac gaggaactta aaaaattgcc 24900
ttccatcaag ggcatcccgc gcttcttgga actttacatt gtgggccaca acatcaacgg 24960
ctttgacgag atcgtgctcg ccgcccaggt aattaacaac cgttccgagg tgccgggacc 25020
cttccgcatc acacgcaact ttatgcctcg cgcgggaaag atactcttca acgatgtcac 25080
cttcgccctg ccaaatccgc gttccaaaaa gcgcacggac tttttgctct gggagcaggg 25140
cggatgcgac gacactgact tcaaatacca gtacctcaaa gtcatggtca gggacacctt 25200
tgcgctcacc cacacctcgc tccggaaggc cgcgcaggca tacgcgctac ccgtagaaaa 25260
gggatgctgc gcctaccagg ccgtcaacca gttctacatg ctaggctctt accgttcgga 25320
ggccgacggg tttccgatcc aagagtactg gaaagaccgc gaagagtttg tcctcaaccg 25380
cgagctgtgg aaaaaaaagg gacaggataa gtatgacatc atcaaggaaa ccctggacta 25440
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ctccttcgtg cgtgacgcgg taggtctcac agacgccagc ttcaacgtct tccagcgtcc 25560
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cgcccgtagc aacctcggtc ccgacctcct cgctccctcg cacgaactat acgattacgt 25680
gcgcgccagc atccgcggtg gaagatgcta ccctacatat cttggaatac tcagagagcc 25740
cctctacgtt tacgacattt gcggcatgta cgcctccgcg ctcacccacc ccatgccatg 25800
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agacttgcaa ggatgcaaga tagactactt cgacgcgcgc ctgctgcccg gggtctttac 25920
cgtggacgca gaccccccgg acgagacgca gctagacccc ctaccgccat tctgctcgcg 25980
caagggcggc cgcctctgct ggaccaacga gcgcctacgc ggagaggtag ccaccagcgt 26040
tgaccttgtc accctgcaca accgcggttg gcgcgtgcac ctggtgcccg acgagcgcac 26100
caccgtcttt cccgaatggc ggtgcgttgc gcgcgaatac gtgcagctaa acatcgcggc 26160
caaggagcgc gccgatcgcg acaaaaacca aaccctgcgc tccatcgcca agttgctgtc 26220
caacgccctc tacgggtcgt ttgccaccaa gcttgacaac aaaaagattg tcttttctga 26280
ccagatggat gcggccaccc tcaaaggcat caccgcgggc caggtgaata tcaaatcctc 26340
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ggacccccta gtggacaacg accgctaccc ctcccactta gcctccttcg tgctggcctg 26640
gacgcgagcc tttgtctcag agtggtccga gtttctatac gaggaggacc gcggaacacc 26700
gctcgaggac aggcctctca agtctgtata cggggacacg gacagccttt tcgtcaccga 26760
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cctggttttt gaccccgaac ggccagagct cacctggctc gtggaatgcg agaccgtctg 26880
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caagggccac gccgcggagg ggctggacta tgacaccatg gtcaaatgct acctggccga 27060
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acggcggacg gtctcaaacc gttgaaaaac tttgcttcct tgcaagaact gctatcgctg 27420
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aacctgcttt cttcccagct gatctcccct accccggaaa ccgttttctt catcgccccg 27660
caggtagaca tgatcccccc atctgaactc aaagcgtggg aaatgcaaat ctgtgagggt 27720
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agaaatatct tcgcccaggc cgccgcccgt gggcccattg ccatcattat ggacgaatgc 27900
atggaaaatc ttggaggtca caagggcgtc tccaagttct tccacgcatt tccttctaag 27960
ctacatgaca aatttcccaa gtgcaccgga tacactgtgc tggtggttct gcacaacatg 28020
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ctcatatccc cacgtatgca cccatcccag cttaaccgct ttgtaaacac ttacaccaag 28140
ggcctgcccc tggcaatcag cttgctactg aaagacattt ttaggcacca cgcccagcgc 28200
tcctgctacg actggatcat ctacaacacc accccgcagc atgaagctct gcagtggtgc 28260
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gagtctggtt ttttatttat gttttaaacc gcattgggag gggaggaagc cttcagggca 28500
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ctagacaaat attacgcgct atgagtaaca caaaattatt cagatttcac ttcctcttat 28800
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atcggcgcga gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc gcgtgcaggg ccagactgga 30240
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aatgtaattc agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc cgcgttttcg cagaaacgtg 30360
gctggcctgg ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat actctgcgac 30420
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tgaagcagac cctatcatct ctctcgtaaa ctgccgtcag agtcggtttg gttggacgaa 30720
ccttctgagt ttctggtaac gccgttccgc accccggaaa tggtcagcga accaatcagc 30780
agggtcatcg ctagccagat cctctacgcc ggacgcatcg tggccaaaag gatctaggtg 30840
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atctctgatg ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg 32040
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aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 32580
atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcata 32619
<210> 7
<211> 38432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 60
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 120
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gcattacgct gacttgacgg gacggcggct ttgttgaata aatcgaactt ttgctgagtt 360
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tgataaaaga gtttgatgct cagggtgtag cggttcggtt tattgacgac gggatcagta 780
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tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt 1800
tttttaaaag aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa 1860
tagcaacaga catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaattc aaaattttat 1920
cgtactagtg gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 1980
cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag agaaggtggc 2040
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gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 2160
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cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc tgtggtgcct 2280
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ccaggaggag ctgggctact ggtgcaccta catggagagg tgcaagttct gctgggagtg 3660
cgcccacggc atctgcaaga ataaggtgaa caattccatg cctctgatca tcgagaattc 3720
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ccgctgatca gcctcgataa tcatctcttg tacatgtccc actgttcaag cctccaagct 3960
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agttagctta tcattatttt tgtttcctac tgtaatggca cctgtgctgt caaaactaag 4800
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ttgaaaccca ttgggggata caaagggagg agtaagaaaa ggcacagttg gaggaccggt 5880
ttccgtgtca tatggataca cggggttgaa ggtatcttca gacggtcttg cgcgcttcat 5940
ctgcaacaac atgaagatag tgggtgcgga tggacaggaa caggaggaaa ctgacattcc 6000
atttagattg tggagaaagt ttgcagccag gaggaagctg caataccaga gctgggagga 6060
gggcaaggag gtgctgctga ataaactgga cagaaatttg ctaactgatt ttaagtaagt 6120
gatgctttat tatttttttt tattagttaa agggaataag atctttgaga ccgcacaggg 6180
tcttaataag ggtgcagaga tcctcaggtc cttgacaagg tgagtgaatg cagccttcgg 6240
tttctaccga gtgctgagtt atggtaatgg gcttttctcc caccatgacc accaatttct 6300
gacgcttggt tggcaacttg tagctaaggc ggtgtccggt ggtattactg tcgtaggtga 6360
ctttggcctg ctttaccaga caaaagatac cccttttgca ctggtgcaag ttaaccatgt 6420
cttggagctc ttgattcatg cgctgttgct cggccgctgc cctgcgtctt tctagcaggc 6480
gctgctctgt aataattccg tccatttcta gctagagaaa cctgaattag aatagcccgt 6540
agagttgctt gaattgttca taaaccccac agtagctgcg cctttggcct aataccctaa 6600
gggttttcta agctcacctc ctgttctggt aaacagagtt attgaggtct gtccggaaaa 6660
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cccggcaggt aaggagggtg gtgttttttc tgatggagta gctgagctcg gagaggttct 6780
ctcgtagact cactccgtct gggttgaaac tgttgtaaat cacagaggga gagatgttaa 6840
aagtaccagg taaggttcgc cttggtttgc ttgggcgggt gaagacggtg gcgtttacag 6900
gatggcgata ggagccccag tatattttaa tttctgtatt tattatactc agcacagaga 6960
tggcaacaaa gatcttgatg taatccaggg ttaggacagt tgcaaatcac agtgagaaca 7020
cagggtcccc tgtcccgctc aactagcagg gggcgctggg taaactcccg aatcaggcta 7080
cgggcaagct ctccctgggc ggtaagccgg acgccgtgcg ccgggccctc gatatgatcc 7140
tcgggcaatt caaagtagca aaactcaccg gagtcgcggg caaagcactt gtggcggcga 7200
cagtggacca ggtgtttcag gcgcagttgc tctgcctctc cacttaacat tcagtcgtag 7260
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gttccaatgc ctccagagcg cggctcagag gacgaggtct gcagagttag gattgcctga 7440
cgaggcgtga atgaagagcg gccggcgccg ccgatctgaa atgtcccgtc cggacggaga 7500
ccaagcgagg agctcaccga ctcgtcgttg agctgaatac ctcgccctct gattgtcagg 7560
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cctgagttag tcatctgaac ttcggcctgg gcgtctctgg gaagtaccac agtggtggga 7680
gcgggacttt cctggtacac cagggcagcg ggccaactac ggggattaag gttattacga 7740
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ttgacccggg atatcatgtg gggtcccgcg ctcatgtagt ttattcgggt tgagtagtct 7860
tgggcagctc cagccgcaag tcccatttgt ggctggtaac tccacatgta gggcgtggga 7920
atttccttgc tcataatggc gctgacaaca ggtgctggcg ccgggtgtgg ccgctggaga 7980
tgacgtagtt ttcgcgctta aatttgagaa agggcgcgaa actagtcctt aagagtcagc 8040
gcgcagtatt tactgaagag agcctccgcg tcttccagcg tgcgccgaag ctgatcttcg 8100
cttttgtgat acaggcagct gcgggtgagg gatcgcagag acctgttttt tattttcagc 8160
tcttgttctt ggcccctgct ctgttgaaat atagcataca gagtgggaaa aatcctgttt 8220
ctaagctcgc gggtcgatac gggttcgttg ggcgccagac gcagcgctcc tcctcctgct 8280
gctgccgccg ctgtggattt cttgggcttt gtcagagtct tgctatccgg tcgcctttgc 8340
ttctgtgtgg ccgctgctgt tgctgccgct gccgccggtg cagtatgggc tgtagagatg 8400
acggtagtaa tgcaggatgt tacgggggaa ggccacgccg tgatggtaga gaagaaagcg 8460
gcgggcgaag gagatgttgc ccccacagtc ttgcaagcaa gcaactatgg cgttcttgtg 8520
cccgcgccat gagcggtagc cttggcgctg ttgttgctct tgggctaacg gcggcggctg 8580
cttggactta ccggccctgg ttccagtggt gtcccatcta cggttgggtc ggcgaacggg 8640
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ctggggcgcc ggcgagggga atgcgaccga gggtgacggt gtttcgtctg acacctcttc 8760
gacctcggaa gcttcctcgt ctaggctctc ccagtcttcc atcatgtcct cctcctcctc 8820
gtccaaaacc tcctctgcct gactgtccca gtattcctcc tcgtccgtgg gtggcggcgg 8880
cagctgcagc ttctttttgg gtgccatcct gggaagcaag ggcccgcggc tgctgctgat 8940
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ccccccgtcc ctttcgtagc agaaactctt ggcgggcttt gttgatggct tgcaattggc 9060
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ggtcttcgta gaacctaatc tcgtgggcgt ggtagtcctc aggtacaaat ttgcgaaggt 9180
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tgcaaaccag ggagcggtgc ggggtgcata ggttgcagcg acagtgacac tccagtagac 9360
cgtcaccgct cacgtcttcc attatgtcag agtggtaggc aaggtagttg gctagctgca 9420
gaaggtagca gtggccccaa agcggcggag ggcattcgcg gtacttaatg ggcacaaagt 9480
cgctaggaag tgcacagcag gtggcgggca agattcctga gcgctctagg ataaagttcc 9540
taaagttctg caacatgctt tgactggtga agtctggcag accctgttgc agggttttaa 9600
gcaggcgttc ggggaaaatg atgtccgcca ggtgcgcggc cacggagcgc tcgttgaagg 9660
ccgtccatag gtccttcaag ttttgcttta gcagtttctg cagctccttg aggttgcact 9720
cctccaagca ctgctgccaa acgcccatgg ccgtctgcca ggtgtagcat agaaataagt 9780
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tttgcccaag gcggttttcg tgcaaaattc caaggtagga gaccaggttg cagagctcca 9900
cgttggagat cttgcaggcc tggcgtacgt agccctgtcg aaaggtgtag tgcaatgttt 9960
cctctagctt gcgctgcatc tccgggtcag caaagaaccg ctgcatgcac tcaagctcca 10020
cggtaacgag cactgcggcc atcattagtt tgcgtcgctc ctccaagtcg gcaggctcgc 10080
gcgtttgaag ccagcgcgct agctgctcgt cgccaactgc gggtaggccc tcctctgttt 10140
gttcttgcaa atttgcatcc ctctccaggg gctgcgcacg gcgcacgatc agctcactca 10200
tgactgtgct catgaccttg gggggtaggt taagtgccgg gtaggcaaag tgggtgacct 10260
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atacggggta gaagttgagg cgcgggttgg gctcgcatgt gccgttttct tggcgtttgg 10620
ggggtacgcg cggtgagaat aggtggcgtt cgtaggcaag gctgacatcc gctatggcga 10680
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tgatcttttt ctgcctatag gagaaggaaa cttgtatgtg ttgggaattg tagttttctt 11100
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tgagacagaa acccgcgcta ccatactgga ggatcatccg ctgctgcccg aatgtaacac 11520
tttgacaatg cacaacgtga gttacgtgcg aggtcttccc tgcagtgtgg gatttacgct 11580
gattcaggaa tgggttgttc cctgggatat ggttctaacg cgggaggagc ttgtaatcct 11640
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gtgtatagcc ggcgggcagg ttttggccag ctggtttagg atggtggtgg atggcgccat 11820
gtttaatcag aggtttatat ggtaccggga ggtggtgaat tacaacatgc caaaagaggt 11880
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tgggattttg aacaatattg tggtgctgtg ctgcagttac tgtgctgatt taagtgagat 12060
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tggtggggct atactactga atgaaaaatg acttgaaatt ttctgcaatt gaaaaataaa 12360
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cccgagagtg tacaaataaa agcatttgcc tttattgaaa gtgtctctag tacattattt 12480
ttacatgttt ttcaagtgac aaaaagaagt ggcgctccta atctgcgcac tgtggctgcg 12540
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gggctgtacc tggggactgt tgagcatgga gttgggtacc ccggtaataa ggttcatggt 12660
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cgtattgact atggcgcagg cgagcttgtg tggagaaaca aagcctggaa agcgcttgtc 13020
ataggtgccc aaaaaatatg gcccacaacc aagatctttg acaatggctt tcagttcctg 13080
ctcactggag cccatggcgg cagctgttgt tgatgttgct tgcttcttta tgttgtggcg 13140
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gcggagagat agtcgttaaa ggactggtcg ttggtgtcgt ttctaagcat ggcctcaagc 14100
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ttaatgctgg ctccgtcaac ccttaggtca tttcctaggg agctctgcag aaccatgtta 14220
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accactcgct tgttcatgta gtcgtaggtg tttgggttat cagaaatttt tacgttggaa 14520
ggactgtact ttagcttgtc gggcaaatac agcgctatgt tggagtacag gaaatttctc 14580
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gcgcacgacg catgccgccc gtcaggccgt ggccggccat gcccctccta cggtgcattc 17100
ttcctcggaa tcccggcacc gggaaacgga ggcggcaggt gagggccata tctgcaagaa 17160
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gaatgtggtg ctggggtgtt tatggcaagt cactttgaca gacattattg tggcaaatgt 33000
tgtctgactt actgtttcaa caaaccagaa gacaagtaag atatcggact ataaggatga 33060
tgacgacaaa taatagcaat tcctcgacga ctgcataggg ttacccccct ctccctcccc 33120
cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat 33180
gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt 33240
cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 33300
gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 33360
gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc 33420
acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 33480
agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc 33540
ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 33600
tgtttagtcg aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt 33660
tgaaaaacac gatgataatg gccacaaccg cggccgcgcc accatgctgg tgatcttcct 33720
gggcatcctg ggcctgctgg ccagccaggt gagcagccag ctggtgggcc agctgaggcc 33780
caccgaggag ccacctgagg aggagctgga gtactggtgt gcctacatgg agagctgcca 33840
gttctgctgg gattgtcagg atggcacctg catcaacaag atcgacggct ccgtgatcta 33900
caagaatgag tacgtgaaga gctgtctggt gagcagatgg ctggacaagt gcatgtacga 33960
tctggacaag ggcatctacc acaccatgaa ctgcaaccag gtgctgggcc tgcctaacca 34020
gcccgccgga cagctgcacc ccaccgataa tcccccccag gaggagctgg aatactggtg 34080
cacctacacc gagaactgca agttctgctg gaattgtcag aatggcctgt gtgagggcaa 34140
gctggagaac acaaccatcc tggagaatga gtacgtccag agctgcatcg tgagcagatg 34200
gctcaacaag tgtatgtacg atctcggcca gggcatccac cacgtgatgg cctgctccga 34260
gcccaagccc tggaatcctt acaagatcct gaagagagag tggaaggaga ataactccta 34320
cccctacgat gtgcctgact acgcctgact cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg 34380
atcacttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 34440
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 34500
aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tcggtgatca ccgatcccgg gccctagaca 34560
aatattacgc gctatgagta acacaaaatt attcagattt cacttcctct tattcagttt 34620
tcccgcgaaa atggccaaat cttactcggt tacgcccaaa tttactacaa catccgccta 34680
aaaccgcgcg aaaattgtca cttcctgtgt acaccggcgc acaccaaaaa cgtcactttt 34740
gccacatccg tcgcttacat gtgttccgcc acacttgcaa catcacactt ccgccacact 34800
actacgtcac ccgccccgtt cccacgcccc gcgccacgtc acaaactcca ccccctcatt 34860
atcatattgg cttcaatcca aaataaggta tattattgat gatgataagc tatcaaacat 34920
gagaattcgg cgcgccatta tcatttgcgg gtcctttccg gcgatccgcc ttgttacggg 34980
gcggcgacct cgcgggtttt cgctatttat gaaaattttc cggtttaagg cgtttccgtt 35040
cttcttcgtc ataacttaat gtttttattt aaaataccct ctgaaaagaa aggaaacgac 35100
aggtgctgaa agcgagcttt ttggcctctg tcgtttcctt tctctgtttt tgtccgtgga 35160
atgaacaacg cgcctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 35220
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt 35280
cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt 35340
tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt 35400
gacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatatcc 35460
gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg 35520
ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga 35580
aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga 35640
gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc 35700
gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta 35760
ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat 35820
aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga 35880
tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag 35940
gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg 36000
cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca 36060
acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa 36120
ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc 36180
tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat 36240
aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc 36300
ataccgcgaa aggttttgca ccattcacct gcacaccgcg ccttaattaa gaattccgtg 36360
tattctatag tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt attaattgta 36420
gccgcgttct aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct tactgaagca 36480
gaccctatca tctctctcgt aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac gaaccttctg 36540
agtttctggt aacgccgttc cgcaccccgg aaatggtcag cgaaccaatc agcagggtca 36600
tcgctagcca gatcctctac gccggacgca tcgtggccaa aaggatctag gtgaagatcc 36660
tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 36720
accccttaat aagatgatct tcttgagatc gttttggtct gcgcgtaatc tcttgctctg 36780
aaaacgaaaa aaccgccttg cagggcggtt tttcgaaggt tctctgagct accaactctt 36840
tgaaccgagg taactggctt ggaggagcgc agtcaccaaa acttgtcctt tcagtttagc 36900
cttaaccggc gcatgacttc aagactaact cctctaaatc aattaccagt ggctgctgcc 36960
agtggtgctt ttgcatgtct ttccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 37020
cagcggtcgg actgaacggg gggttcgtgc atacagtcca gcttggagcg aactgcctac 37080
ccggaactga gtgtcaggcg tggaatgaga caaacgcggc cataacagcg gaatgacacc 37140
ggtaaaccga aaggcaggaa caggagagcg cacgagggag ccgccagggg gaaacgcctg 37200
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca ccactgattt gagcgtcaga tttcgtgatg 37260
cttgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cggctttgcc gcggccctct cacttccctg 37320
ttaagtatct tcctggcatc ttccaggaaa tctccgcccc gttcgtaagc catttccgct 37380
cgccgcagtc gaacgaccga gcgtagcgag tcagtgagcg aggaagcgga atatatcctg 37440
tatcacatat tctgctgacg caccggtgca gccttttttc tcctgccaca tgaagcactt 37500
cactgacacc ctcatcagtg ccaacatagt aagccagtat acactccgct agcgctgagg 37560
tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag 37620
ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat 37680
tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc 37740
cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg 37800
atgttacatt gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat 37860
aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc 37920
gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt 37980
cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt 38040
tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa 38100
ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga 38160
tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata 38220
tcctgattca ggtgaaaata ttgctgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc 38280
gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca 38340
atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg 38400
gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca ta 38432
<210> 8
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgtttgtg ttatgtttca acgtgtttat ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt 60
ttcattcagt agtatagccc caccaccaca tagcttatac agatcaccgt accttaatca 120
aactcacaga accctagtct acatgggggt agagtcataa tcgtgcatca ggatagggcg 180
gtggtgctgc agcagcgcgc gaataaactg ctgccgccgc cgctccgtcc tgcaggaata 240
caacatggca gtggtctcct cagcgatgat tcgcaccgcc cgcagcataa ggcgccttgt 300
cctccgggca cagcagcgca ccctgatctc acttaaatca gcacagtaac tgcagcacag 360
caccacaata ttgttcaaaa tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg 420
gaccacagaa cccacgtggc catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct 480
cataaacacg ctggacataa acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg 540
gtaccatata aacctctgat taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc 600
caaaacctgc ccgccggcta tacactgcag ggaaccggga ctggaacaat gacagtggag 660
agcccaggac tcgtaaccat ggatcatcat gctcgtcatg atatcaatgt tggcacaaca 720
caggcacacg tgcatacact tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc 780
ccagggaaca acccattcct gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac 840
gtaactcacg ttgtgcattg tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag 900
tatggtagcg cgggtttctg tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg 960
ccgagacaac cgagatcgtg ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt 1020
cat 1023
<210> 9
<211> 644
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggactataag gatgatgacg acaaataata gcaattcctc gacgactgca tagggttacc 60
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 120
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 180
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 240
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 300
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 360
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 420
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 480
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 540
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 600
gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatggccac aacc 644
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 11
<211> 2796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattccgtg tattctatag tgtcacctaa atcgtatgtg tatgatacat aaggttatgt 60
attaattgta gccgcgttct aacgacaata tgtacaagcc taattgtgta gcatctggct 120
tactgaagca gaccctatca tctctctcgt aaactgccgt cagagtcggt ttggttggac 180
gaaccttctg agtttctggt aacgccgttc cgcaccccgg aaatggtcag cgaaccaatc 240
agcagggtca tcgctagcca gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 300
gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 360
cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 420
gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 480
ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 540
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag ccccgacacc 600
cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac 660
aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt gtcagaggtt ttcattcacc gtcatcaccg 720
aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata 780
ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 840
tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa 900
atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 960
attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 1020
gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 1080
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 1140
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 1200
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 1260
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 1320
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 1380
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 1440
caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 1500
taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 1560
ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 1620
aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 1680
agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 1740
atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 1800
tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 1860
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 1920
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 1980
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 2040
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 2100
ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 2160
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 2220
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 2280
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 2340
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 2400
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 2460
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 2520
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 2580
ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 2640
accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 2700
gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 2760
gttggccgat tcattaatgc agctggctta tcgaaa 2796
<210> 12
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaattca aaattttatc 120
gtactagtgg atctgcgatc gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac 180
agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg 240
cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg 300
agaaccgtat ataagtgcag tagctcccta tcagtgatag agatctccct atcagtgata 360
gagattcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agctgaagct 420
tcgaggggct cgcatctctc cttcacgcgc ccgccgccct acctgaggcc gccatccacg 480
ccggttgagt cgcgttctgc cgcctcccgc ctgtggtgcc tcctgaactg cgtccgccgt 540
ctaggtaagt ttaaagctca ggtcgagacc gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct 600
acctagactc agccggctct ccacgctttg cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt 660
tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag atccaagctg tgaccggcgc ctacggatcc 720
gccaccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 780
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 840
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 900
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 960
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 1020
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 1080
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 1140
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 1200
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 1260
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 1320
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 1380
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 1440
aagtaactcg agtctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgat aatcatctct 1500
tgtacatgtc ccactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 1560
attgaccctt ataaagaatt tggagctact gtggagttac tctcgttttt gccttctgac 1620
ttctttcctt ccgtcagaga tctcctagac accgcctcag ctctgtatcg agaagcctta 1680
gagtctcctc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc ta 1722
<210> 13
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtatctgctc cctgcttgtg tgttggaggt cgctgagtag tgcgcgagca aaatttaagc 60
tacaacaagg caaggcttga ccgacaattg catgaagaat ctgcttaggg ttaggcgttt 120
tgcgctgctt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga cattgattat tgactagtta 180
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 240
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 300
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 360
ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 420
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 480
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 540
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 600
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 660
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 720
ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat 780
cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagctggc tagcgtttaa acttaagctt 840
ggtaccgagc tcggatccac tagtccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 900
ggcggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcacttcgc ccacccc 957
<210> 14
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct gtataccgtc gacctct 147
Claims (10)
1.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗为通过构建一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体，再经293TD37细胞包装而获得；
所述四种抗原基因分别为CP129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF110-4L，其中CP129Rubiqutin是在CP129R上添加分子佐剂ubiqutin获得，CP129Rubiqutin和MGF5L6L表达在E1区，CP312R和MGF110-4L表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L；
其中，所述重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L需通过由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞实现重组腺病毒包装，293TD37细胞的细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心；
其中，CP129R、ubiqutin、MGF5L6L、CP312R、MGF110-4L、pAd5LCL3分别具有如序列表中Seq ID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.6所示的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒的E1基因，引入SwaⅠ酶切位点，融合后的片段与载体无缝克隆，再利用CRISPR/cas9敲除E3基因，再使用无缝克隆方式连接，获得缺失E1和E3基因的腺病毒载体质粒pAd5；
2)再利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5的E4基因，使用PCR扩增并引入I-sceI酶切位点，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3和E4基因的腺病毒载体质粒pAd5△E4；
3)利用CRISPR/cas9敲除腺病毒环状载体质粒pAd5△E4的E2a基因，并将E4区的ORF6/7表达框放在敲除了E2a区的序列位置，再使用无缝克隆方法，获得缺失E1、E3、E4和E2a基因的腺病毒载体质粒pAd5LCL3；
4)构建腺病毒E1区域穿梭质粒pS5E1，通过DNA连接酶分别与CP129Rubiqutin、IRES、MGF5L6L基因片段连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E1区域穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L；
5)构建腺病毒E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP，CP312R、2A、MGF5L6L基因通过融合PCR技术得到CP312R-2A-MGF5L6L基因片段，通过对穿梭质粒pS5E4-EGFP酶切，敲除EGFP，并通过DNA连接酶与CP312R-2A-MGF5L6L连接，构建非洲猪瘟腺病毒5型载体E4区域穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L；
6)将穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，得到腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L；
7)将穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L同源重组，获得四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L，pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L具有如序列表中Seq ID NO.7所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的腺病毒环状载体质粒来源于在A549细胞中扩增野生型人腺病毒5型病毒，收集并浓缩病毒液，采用HirtVirual DNAExtract方法提取腺病毒5型基因组，使用cosmid方法将线性的腺病毒5型基因组构建成环状的腺病毒环状载体质粒。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的ORF6/7表达框基因具有如序列表中Seq ID NO.8所示的核苷酸序列；步骤4)所述的IRES具有如序列表中Seq ID NO.9所示的核苷酸序列；步骤5)所述的2A具有如序列表中Seq ID NO.10所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的穿梭质粒pS5E1骨架采用pucorigin、amp基本元素，Ad5左臂ITR部分序列，右臂PIX、PIVa2部分序列，以及CMV-MCS SV40early polyA；步骤5)所述的E4区域穿梭质粒pS5E4-EGFP的骨架采用puc origin、amp基本元素，Ad5E4区域左臂ITR序列，右臂部分fiber基因序列，以及EF1α-EGFP-HBV polyA基因；其中puc origin、amp基本元素具有如序列表可见中Seq ID NO.11所示的核苷酸序列，EF1α-EGFP-HBV polyA基因具有如序列表可见中Seq ID NO.12所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6)穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3同源重组，是通过PacI和SwaI对穿梭质粒pS5E1-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep Gel Extraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤7)穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L与腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L同源重组，是通过PacI和I-sceI对穿梭质粒pS5E4-CP312R-2A-MGF5L6L和腺病毒载体质粒pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-IRES-MGF5L6L进行酶切，酶切产物去磷酸化，OMEGA Ultra-Sep GelExtraction Kit进行胶回收载体和片段，转化产物涂布平板，挑取菌落，进行XhoI酶切验证。
8.一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；转染由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的293TD37细胞，收集细胞悬液。
9.根据权利要求7所述的一种重组腺病毒载体的包装方法，其特征在于，由以下步骤制得：
1)将pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L共表达重组腺病毒载体用PacI酶切，线性化后的质粒用于转染；使用PEI转染试剂转染293TD37细胞；
2)转染后的293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72-96小时后收集细胞悬液，即为TP0代腺病毒；
3)TP0代腺病毒感染293TD37细胞于37℃，5％CO2培养箱中培养72小时，收集细胞悬液即TP1代腺病毒；
4)重复3)，收集细胞悬液即TP2代腺病毒；
5)持续接毒直至细胞出现病变。
10.293TD37细胞用于包装非洲猪瘟病毒四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体的用途，其特征在于，所述四种抗原基因分别为CP129Rubiqutin、MGF5L6L、CP312R和MGF5L6L，其中CP129Rubiqutin和MGF5L6L表达在E1区，CP312R和MGF5L6L表达在E4区，构成四种抗原基因共表达的重组腺病毒载体pAd5LCL3-CP129Rubiqutin-MGF5L6L-CP312R-MGF110-4L；
其中，所述293TD37细胞是由pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP构建的，细胞株保藏编号为：CCTCC NO:C201996，保藏于中国典型培养物保藏中心。
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