CN106834349B - 一种安全性提高的病毒基因递送系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种安全性提高的病毒基因递送系统。本发明保护的系统包括元件甲、元件乙和元件丙；所述元件甲为具有片段甲和片段乙的质粒；所述片段甲为对CVB3的全基因组进行如下改造得到的：在衣壳蛋白的编码基因内部引入UAG，得到片段甲；所述片段乙为目的基因表达盒，所述表达盒含有目的基因插入位点；所述元件乙为具有片段丙和片段丁的质粒；所述片段丙为编码吡咯赖氨酰‑tRNA合成酶的DNA片段；所述片段丁为编码吡咯赖氨酸tRNA的DNA片段；所述元件丙为非天然氨基酸。本发明提供的系统不仅改善了现有非病毒基因递送系统的递送效率问题，同时也改善了病毒作为载体带来的安全性问题。

Description

一种安全性提高的病毒基因递送系统

技术领域

本发明涉及一种安全性提高的病毒基因递送系统。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackieviruses)是一类人致病性肠病毒，属于小RNA病毒科(picornaviridae)。CV病毒存在两个亚型：A型与B型(依据对乳鼠不同的致病特点以及不同的细胞敏感性)，两种均主要通过口-粪便途径或气溶胶形式传染。其中A亚型(CoxsackievirusA，CVA)主要引起肠胃系统紊乱；而B亚型(Coxsackie B viruses，CVB)则与众多严重疾病相关，包括：胰腺炎、无菌性脑膜炎和以I型糖尿病为代表的各类综合征。CVB3是CVBs中致病性最强的亚型，长期报道与病毒性心肌炎相关，在青少年中发病最为广泛。

CVB3是一种无包膜、正二十面体病毒，包含一条～7400bp的正义单链RNA基因组((+)ssRNA)。CVB3病毒衣壳是由60个原体排列形成直径约为对称度T＝1(伪对称T＝3)的二十面体。在成熟的衣壳中，每个原体包含四个衣壳蛋白：VP1、P2、VP3和VP4。在细胞质中，CVB3病毒以RNA为模板转录为一个长的多聚蛋白。CVB3的基因组并不像真核细胞一样在mRNA的5’末端带有包含7-甲基鸟苷帽子结构，病毒的VPg蛋白起始于一种非帽子依赖的结构——位于5’非转录区(untranslated region，UTR)的内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)。紧接着，病毒编码的蛋白酶2A蛋白酶和3C蛋白酶把已经合成的多聚蛋白切割成为三个前体分子(P1、P2和P3)。然后3CD蛋白酶将P1切割成结构性的衣壳蛋白，即VP1-VP4；而P2和P3片段将被切割为非结构性病毒蛋白酶和病毒聚合酶(2A^pro，2B，2C，3A，3B/VPg，3C^pro/3CD^pro，3D^pol)。一旦蛋白酶(2A，3C)能够折叠成为活性形式，这些剪切过程随即发生，其中包含转录中的自剪切。事实上，包括转录起始因子eIF4G在内的一些细胞蛋白也被病毒蛋白酶所切割，因此抑制了宿主细胞的帽子依赖型转录。病毒3D^pro是一种RNA依赖的RNA聚合酶，产生蛋白引物VPg-pU-pU(VPg尿苷酸)用以在病毒基因组的3’poly(A)区域起始反义RNA的合成。反过来，众多拷贝的反义RNA成为正义RNA基因组产物的模板。这些正义RNA基因组既可以被包装成致病病毒颗粒释放，也可以作为下一轮的非帽子依赖转录的模板。从病毒进入细胞到释放致病颗粒，这个裂解性复制循环需要大约6-8h。

重组病毒载体是当今病毒基因工程研究的热点之一。载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。近年来重组病毒载体因其转染效率高并能获得稳定表达外源基因的靶细胞等优点而越来越多的被应用。目前研究最多的主要有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体和疱疹病毒载体等，具体选择何种转基因方式取决于各病毒载体特点、外源基因的大小以及最终将被感染的靶细胞特性等。然而在临床试验研究中，安全性和靶向性一直是人们研究的重点，除将外源基因顺利导入外，病毒载体的安全性问题还需要得到进一步的研究解决。研制能高效转移基因、精确控制表达的病毒载体迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种安全性提高的病毒基因递送系统。

本发明提供了一种以CVB3为病毒载体的基因递送系统，包括元件甲、元件乙和元件丙；

所述元件甲为具有片段甲和片段乙的质粒；所述片段甲为对CVB3的全基因组进行如下改造得到的：在衣壳蛋白的编码基因内部引入UAG，得到片段甲；所述片段乙为目的基因表达盒，所述表达盒含有目的基因插入位点；

所述元件乙为具有片段丙和片段丁；所述片段丙为编码吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的DNA片段；所述片段丁为编码吡咯赖氨酸tRNA的DNA片段；

所述元件丙为非天然氨基酸。

所述片段丙和片段丁反向存在。

所述片段丁为编码N个带有RNA聚合酶IⅡ启动子的tRNA转录单元的DNA片段；N为1-9之间的任意自然数。

所述N具体可为1-4之间的任意自然数，更具体可为4。

所述RNA聚合酶IⅡ启动子具体可为U6启动子。

所述编码N个(N为1)带有RNA聚合酶IⅡ启动子的tRNA转录单元的DNA片段具体可为序列表的序列5自5’端第1-344位核苷酸所示的DNA分子。

所述衣壳蛋白具体可为VP4蛋白。

所述“在衣壳蛋白的编码基因内部引入UAG”具体可通过将CVB3基因组中序列表的序列2自5′端第25位碱基由A突变为T实现。

所述片段甲具体可为序列表的序列4所示的DNA分子。

所述片段丙具体可为序列表的序列3自5’端第2141-3505位核苷酸所示的DNA分子。

所述片段丁具体可为序列表的序列5所示的DNA分子。

所述元件甲具体可为具有如下核酸序列的质粒(环形)：将序列表的序列1自5’端第2280位核苷酸突变为T。

所述元件乙具体可为将pcDNA3.1(+)质粒MfeI和BamHI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3自5’端第1-3505位核苷酸所示的DNA分子。

所述目的基因表达盒包括启动子、起始密码子、目的基因插入位点和终止密码子。

所述目的基因插入位点可为任意多克隆位点，具体可为Sfi I位点。

以上任一所述基因递送系统还包括哺乳动物细胞。

所述哺乳动物细胞具体可为HEK 293T细胞。

本发明还保护以上任一所述基因递送系统在递送目的基因中的应用。

本发明还保护一种递送目的基因的方法，包括如下步骤：

(1)在以上任一所述基因递送系统中的元件甲的目的基因插入位点插入目的基因，得到元件丁；

(2)将步骤(1)得到的元件丁和所述系统中的元件乙转染病毒包装细胞，在含有元件丙的体系中进行培养，然后破碎细胞并收集上清液；

(3)将步骤(2)得到的上清液感染宿主细胞并进行培养，从而在宿主细胞中表达目的基因。

所述步骤(3)中，所述宿主细胞具体可为HEK 293T细胞。

所述步骤(3)中，是所述培养时间具体可为24h。

所述步骤(3)中，所述培养使用的培养基具体可为含有2％FBS的DMEM培养基。

本发明还保护一种产品，其制备方法包括如下步骤：

(1)在以上任一所述基因递送系统中的元件甲的目的基因插入位点插入目的基因，得到元件丁；

(2)将步骤(1)到的元件丁和所述系统中的元件乙转染病毒包装细胞，在含有元件丙的体系中进行培养，然后破碎细胞并收集上清液。

所述上清液即为保护的产品。

根据插入的目的基因的不同，所述产品具有不同功能。

例如插入的目的基因为某种肿瘤抑制基因时，所述产品的功能为抑制肿瘤细胞增殖。

以上任一所述步骤(2)中，所述培养时间具体为36h。

以上任一所述步骤(2)中，所述“将元件丁和元件乙转染病毒包装细胞”的实现方法为：将元件丁和元件乙转染病毒包装细胞。

所述转染具体可为将含有元件丁和元件乙的转染复合物加至病毒包装细胞的培养基中。

所述转染复合物和培养基的配比关系具体可为100μL转染复合物：1mL培养基。

所述培养基具体可为含有10％FBS的DMEM培养基。

所述转染复合物的配置方法具体可为将元件丁、元件乙和转染试剂加至转染培养基中，室温孵育。

所述元件丁、元件乙、转染试剂和转染培养基的配比关系具体可为1.2μg元件丁：0.8μg元件乙：2μL转染试剂：100μL转染培养基。

所述转染试剂具体可为TurboFect转染试剂。

所述转染培养基具体可为opti-mem培养基。

所述室温孵育时间具体可为20min。

所述病毒包装细胞具体可为HEK 293T细胞。

以上任一所述步骤(2)中，所述“破碎细胞并收集上清液”的方法具体可为：将细胞反复冻融三次(-80℃冷冻，4℃融化)，1200g离心10min，收集上清液。

以上任一所述方法中，所述原件丙的使用浓度具体可为2mM。

以上任一所述非天然氨基酸具体可为Boc-氨基酸。

以上任一所述培养的培养条件具体可为37℃，5％CO₂培养。

以上任一所述目的基因具体可为eGFP基因。

目前的基因递送系统可以分为病毒基因递送系统和非病毒基因递送系统。常规的非病毒基因递送方法对于某些特定细胞递送效率很低甚至不能实现，所以发展出了现有的病毒基因递送系统，极大地解决了递送效率问题，但同时无论哪种病毒作为病毒载体都存在潜在的安全性问题。

本发明选择了CVB3作为病毒载体，CVB3为正链RNA病毒，作为载体其优势如下：

(1)CVB3基因组不会整合到宿主细胞基因组内，因此不会引起插入突变。

(2)CVB3可以在非分裂细胞内复制。

(3)CVB3的全基因组序列已知，因此方便在cDNA水平上操作构建重组病毒。

(4)CVB3的分子生物学相关知识、病毒受体、生活周期和组织嗜性都已研究清楚。

(5)已有研究CVB3感染的动物模型。标准的动物模型对于验证一种新发展的病毒载体在体内是否有效是必不可少的。CVB3感染小鼠的模型易于建立，因此可以很方便的评判CVB3载体是否发展成功。

本发明提供的以CVB3为病毒载体的基因递送系统，以改造过的CVB3作为病毒载体，系统中的Pyl aaRS/tRNA pair和非天然氨基酸都是天然环境中不存在的，只有通过人工添加才可以使改造的CVB3载体复制，因此大大提高了CVB3作为病毒载体的安全性。本发明提供的系统不仅改善了现有非病毒基因递送系统的递送效率问题，同时也改善了病毒作为载体带来的安全性问题。

附图说明

图1为pCE质粒和pCE-UAG质粒测序结果示意图。

图2为pCE-UAG质粒构建示意图。

图3为实施例2步骤2各组细胞EGFP表达情况。

图4为实施例2步骤6各组细胞形态观察结果。

图5为实施例2中EGFP相对表达量统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pCE质粒：pCE质粒的全序列如序列1所示。pCE质粒带有EGFP荧光报告基因(序列1自5’端第1512-2222位核苷酸)，并带有CVB3全基因组序列(序列1自5’端第2256-8810位核苷酸)。

pcDNA3.1(+)质粒：Invitrogen。

Q5DNA聚合酶、Dpn I酶、限制性内切酶NheI-HF、限制性内切酶BamHI-HF、限制性内切酶EcoRI-HF和限制性内切酶MfeI：NEB公司。

HEK 293T细胞：ATCC，货号：CRL-3216。

TurboFect转染试剂：Thermo公司。

Boc-氨基酸：BACHEM公司。

实施例1、可控性表达目的蛋白的系统的构建

一、pCE-UAG突变体克隆构建

1、以pCE质粒DNA为模板，采用定点突变引物VP4-1-F和VP4-1-R进行PCR扩增(PCR扩增体系如表1所示)，回收PCR扩增产物。

VP4-1-F：5′-CAACGCAATAGACTGGGGCACATGAGACCGGGC-3′；

VP4-1-R：5′-CAACGCAATAGACTGGGGCACATGAGACCGGGC-3′。

表1PCR扩增体系

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，58℃30s，72℃7min，共设置22个循环；72℃5min。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物使用Dpn I酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约13622bp的片段，得到胶回收产物。

3、将步骤2得到的胶回收产物用T4连接酶连接。

4、将步骤3的连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆，根据测序结果筛选得到突变成功的pCE-UAG质粒(突变区段测序结果如图1所示。图1中，1为pCE质粒质粒测序结果，2为pCE-UAG质粒测序结果。pCE-UAG质粒是将pCE质粒中CVB3基因组中序列2自5′端第25位碱基A突变为了T，其余核苷酸均与pCE质粒相同，突变位置为VP4蛋白第9个氨基酸的密码子)。pCE-UAG质粒的结构示意图见图2。

二、Pyl aaRS/tRNA pair的构建

构建Pyl aaRS/tRNA pair-4质粒(带有4个U6-tRNA转录单元)。根据测序结果，对Pyl aaRS/tRNA pair-4质粒进行结构描述如下：以pcDNA3.1(+)质粒为出发载体，将pcDNA3.1(+)质粒MfeI和BamHI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3自5’端第1-3505位核苷酸所示的DNA分子。序列3自5’端第1至1394位核苷酸与4×U6-tRNA转录单元序列反向互补，第2141至3505位核苷酸为Pyl RS序列。

实施例2、外源基因表达情况检测

1、将HEK 293T细胞接种于12孔板中(每孔4×10⁵个细胞)，采用DMEM培养基(10％FBS)37℃静置培养直至细胞长至60％-80％，将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(10％FBS)，每孔1mL。

2、完成步骤1后进行转染，步骤如下：

进行如下分组处理(培养条件均为：37℃，5％CO₂培养箱)：

实验组A：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物I，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的含有2mMBoc-氨基酸的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h后荧光显微镜观察；

实验组B：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物I，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h后荧光显微镜观察；

实验组C：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物II，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的含有2mMBoc-氨基酸的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h后荧光显微镜观察；

实验组D：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物II，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h后荧光显微镜观察；

对照组：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物IⅡ，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h后荧光显微镜观察；

转染复合物I：将1.2μg的pCE-UAG质粒和0.8μg的Pyl aaRS/tRNA pair-4质粒加至100μL opti-mem培养基中，加入2μl的TurboFect转染试剂，轻微吹打混匀；

转染复合物II：将1.2μg的pCE-UAG质粒加至100μL opti-mem培养基中，加入2μl的TurboFect转染试剂，轻微吹打混匀；

转染复合物IⅡ：100μL opti-mem培养基中加入2μl的TurboFect转染试剂，轻微吹打混匀。

结果如图3所示。结果表明，只有在pCE-UAG质粒、Pyl aaRS/tRNA pair-4质粒和Boc-氨基酸都存在时，病毒可以实现大量扩增，可以作为病毒载体实现后续步骤中基因递送载体的目的。

3、完成步骤1后进行转染，步骤如下：

进行如下分组处理(培养条件均为：37℃，5％CO₂培养箱)：

实验组A：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物A，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h；

实验组B：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物B，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h；

实验组C：取所述12孔板，向每孔中加入100μL室温孵育20min后的转染复合物B，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养6h；然后将培养基更换为新鲜的含有2mMBoc-氨基酸的DMEM培养基(10％FBS)，继续培养36h；

转染复合物A：将1.2μg的pCE质粒加至100μL opti-mem培养基中，加入2μl的TurboFect转染试剂，轻微吹打混匀；

转染复合物B：将1.2μg的pCE-UAG质粒和0.8μg的Py1 aaRS/tRNA pair-4质粒加至100μL opti-mem培养基中，加入2μl的TurboFect转染试剂，轻微吹打混匀。

4、完成步骤3后，收集细胞，反复冻融三次(-80℃冷冻，4℃融化)，1200g离心10min，收集上清液。

5、将HEK 293T细胞接种于12孔板中(每孔4×10⁵个细胞)，采用DMEM培养基(10％FBS)37℃静置培养直至细胞长至80％-90％，将培养基更换为新鲜的DMEM培养基(2％FBS)，每孔1mL。

6、将步骤4收集的上清液加入至步骤5的12孔板中(200μL/孔)，37℃，5％CO₂培养24h后镜下观察，结果见图4。

7、将步骤6的细胞反复冻融三次(-80℃冷冻，4℃融化)，1200g离心10min，收集上清液，提取RNA。

8、以步骤7得到的RNA为模板，采用引物EGFP-F和引物EGFP-R进行qRT-PCR反应，检测外源基因EGFP表达情况，采用GAPDH作为内参基因。

EGFP-F：5′-CTGCTGCCCGACAACCAC-3′：

EGFP-R：5′-TGTGATCGCGCTTCTCGTT-3′。

结果如图5所示。图5中，纵坐标为EGFP相对表达量。

综合上述结果表明，实验组A细胞单独转染pCE质粒后得到的病毒上清再次感染细胞后细胞明显变圆，呈现病毒感染状态，同时有大量EGFP表达。而实验组C细胞转染pCE-UAG质粒和Pyl aaRS/tRNA pair-4质粒并添加非天然氨基酸Boc后得到的病毒上清再次感染细胞后，细胞状态并未受影响，虽然EGFP的相对表达量不及实验组A，但是细胞毒性明显降低，安全性显著提高。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院

<120> 一种安全性提高的病毒基因递送系统

<160> 5

<210> 1

<211> 13622

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 420

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 540

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 600

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ttctgcagat atccagcaca gtggcggccg cttaaaacag cctgtgggtt gatcccaccc 780

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acatagtggt cccagcggat gcccaaagct cctgttacat catgtgtttc gtgtcagcat 3900

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gtacagggcc aaccaactca gaagctatac cagcactcac tgctgctgag acgggtcaca 4080

cgtcacaagt agtgccgggt gacactatgc agacacgcca cgttaagaac taccattcaa 4140

ggtccgagtc aaccatagag aacttcctat gtaggtcagc atgcgtgtac tttacggagt 4200

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aacttaggag aaagctagaa ttctttacct acgtccggtt cgacctggag ctgacgtttg 4320

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<223>

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tttgggcaga acatgcagta ccactactta ggccgaactg ggtataccgt acatgtgcag 540

tgcaatgcat ctaagttcca ccaaggatgc ttgctagtag tgtgtgtacc ggaagctgag 600

atgggttgcg caacgctaga caacacccca tccagtgcag aattgctggg gggcgatagc 660

gcaaaagagt ttgcggacaa accggtcgca tccgggtcca acaagttggt acagagggtg 720

gtgtataatg caggcatggg ggtgggtgtt ggaaacctca ccattttccc ccaccaatgg 780

atcaacctac gcaccaataa tagtgctaca attgtgatgc catacaccaa cagtgtacct 840

atggataaca tgtttaggca taacaacgtc accctaatgg ttatcccatt tgtaccgcta 900

gattactgcc ctgggtccac cacgtacgtc ccaattacgg tcacgatagc cccaatgtgt 960

gccgagtaca atgggttacg tttagcaggg caccagggct taccaaccat gaatactccg 1020

gggagctgtc aatttctgac atcagacgac ttccaatcac catccgccat gccgcaatat 1080

gacgtcacac cagagatgag gatacctggt gaggtgaaaa acttgatgga aatagctgag 1140

gttgactcag ttgtcccagt ccaaaatgtt ggagagaagg tcaactctat ggaagcatac 1200

cagatacctg tgagatccaa cgaaggatct ggaacgcaag tattcggctt tccactgcaa 1260

ccagggtact cgagtgtttt tagtcggacg ctcctaggag agatcttgaa ctattataca 1320

cattggtcag gcagcataaa gcttacgttt atgttctgtg gttcggccat ggctactgga 1380

aaattccttt tggcatactc accaccaggt gctggagctc ctacaaaaag ggttgatgcc 1440

atgcttggta ctcatgtaat ttgggacgtg gggctacaat caagttgcgt gctgtgtata 1500

ccctggataa gccaaacaca ctaccggtat gttgcttcag atgagtatac cgcagggggt 1560

tttattacgt gctggtatca aacaaacata gtggtcccag cggatgccca aagctcctgt 1620

tacatcatgt gtttcgtgtc agcatgcaat gacttctctg tcaggctatt gaaggacact 1680

cctttcattt cgcagcaaaa ctttttccag ggcccagtgg aagacgcgat aacagccgct 1740

atagggagag ttgcggatac cgtgggtaca gggccaacca actcagaagc tataccagca 1800

ctcactgctg ctgagacggg tcacacgtca caagtagtgc cgggtgacac tatgcagaca 1860

cgccacgtta agaactacca ttcaaggtcc gagtcaacca tagagaactt cctatgtagg 1920

tcagcatgcg tgtactttac ggagtatgaa aactcaggtg ccaagcggta tgctgaatgg 1980

gtattaacac cacgacaagc agcacaactt aggagaaagc tagaattctt tacctacgtc 2040

cggttcgacc tggagctgac gtttgtcata acaagtactc aacagccctc aaccacacag 2100

aaccaagatg cacagatcct aacacaccaa attatgtatg taccaccagg tggacctgta 2160

ccagataaag ttgattcata cgtgtggcaa acatctacga atcccagtgt gttttggacc 2220

gagggaaacg ccccgccgcg catgtccata ccgtttttga gcattggcaa cgcctattca 2280

aatttctatg acggatggtc tgaattttcc aggaacggag tttacggcat caacacgcta 2340

aacaacatgg gcacgctata tgcaagacat gtcaacgctg gaagcacggg tccaataaaa 2400

agcaccatta gaatctactt caaaccgaag catgtcaaag cgtggatacc tagaccacct 2460

agactctgcc aatacgagaa ggcaaagaac gtgaacttcc aacccagcgg agttaccact 2520

actaggcaaa gcatcactac aatgacaaat acgggcgcat ttggacaaca atcaggggca 2580

gtgtatgtgg ggaactacag ggtggtaaat agacatctag ctaccagtgc tgactggcaa 2640

aactgtgtgt gggaaagtta caacagagac ctcttagtga gcacgaccac agcacatgga 2700

tgtgatatta tagccagatg tcagtgcaca acgggagtgt acttttgtgc gtccaaaaac 2760

aagcactacc caatttcgtt tgaaggacca ggtctagtag aggtccaaga gagtgaatac 2820

taccccagga gataccaatc ccatgtgctt ttagcagctg gattttccga accaggtgac 2880

tgtggcggta tcctaaggtg tgagcatggt gtcattggca ttgtgaccat ggggggtgaa 2940

ggcgtggtcg gctttgcaga catccgtgat ctcctgtggc tggaagatga tgcaatggaa 3000

cagggagtga aggactatgt ggaacagctt ggaaatgcat tcggctccgg ctttactaac 3060

caaatatgtg agcaagtcaa cctcctgaaa gaatcactag tgggtcaaga ctccatctta 3120

gagaaatctc taaaagcctt agttaagata atatcagcct tagtaattgt ggtgaggaac 3180

cacgatgacc tgatcactgt gactgccaca ctagccctta tcggttgtac ctcgtccccg 3240

tggcggtggc tcaaacagaa ggtgtcacaa tattacggaa tccctatggc tgaacgccaa 3300

aacaatagct ggcttaagaa atttactgaa atgacgaatg cttgcaaggg tatggaatgg 3360

atagctgtca aaattcagaa attcattgaa tggctcaaag taaaaatttt gccagaggtc 3420

agggaaaaac acgagttcct gaacagactt aaacaactcc ccttattaga aagtcagatc 3480

gccacaatcg agcagagcgc gccatcccaa agtgaccagg aacaattatt ttccaatgtc 3540

caatactttg cccactattg cagaaagtac gctcccctct acgcggctga agcaaagagg 3600

gtgttctccc ttgagaagaa gatgagcaat tacatacagt tcaagtccaa atgccgtatt 3660

gaacctgtat gtttgctcct gcacgggagc cctggtgccg gcaagtcggt ggcaacaaac 3720

ttaattggaa ggtcgcttgc tgagaaactc aacagctcag tgtactcact accgccagac 3780

ccagatcact tcgacggata caaacagcag gccgtggtga ttatggacga tctatgccag 3840

aatcctgatg ggaaagacgt ctccttgttc tgccaaatgg tttccagtgt agattttgta 3900

ccacccatgg ctgccctaga agagaaaggc attctgttca cctcaccgtt tgtcttggca 3960

tcgaccaatg caggatctat taatgctcca accgtgtcag atagcagagc cttggcaagg 4020

agatttcact ttgacatgaa catcgaggtt atttccatgt acagtcagaa tggcaagata 4080

aacatgccca tgtcagtcaa gacttgtgac gatgagtgtt gcccggtcaa ttttaaaaag 4140

tgctgccctc ttgtgtgtgg gaaggctata caattcattg atagaagaac acaggtcaga 4200

tactctctag acatgctagt caccgagatg tttagggagt acaatcatag acatagcgtg 4260

gggaccacgc ttgaggcact gttccaggga ccaccagtat acagagagat caaaattagc 4320

gttgcaccag agacaccacc accgctcgcc attgcggacc tgctcaaatc ggtagacagt 4380

gaggctgtga gggagtactg caaagaaaaa ggatggttgg ttcctgagat caactccacc 4440

ctccaaattg agaaacatgt cagtcgggct ttcatttgct tacaggcatt gaccacattt 4500

gtgtcagtgg ctggaatcat atatataata tataagctct ttgcgggttt tcaaggtgct 4560

tatacaggag tgcccaacca gaagcccaga gtgcctaccc tgaggcaagc aaaagtgcaa 4620

ggccctgcct ttgagttcgc cgtcgcaatg atgaaaagga actcaagcac ggtgaaaact 4680

gaatatggcg agtttaccat gctgggcatc tatgacaggt gggccgtttt gccacgccac 4740

gccaaacctg ggccaaccat cttgatgaat gatcaagagg ttggtgtgct agatgccaag 4800

gagctagtag acaaggacgg caccaactta gaactgacac tactcaaatt gaaccggaat 4860

gagaagttca gagacatcag aggcttctta gccaaggagg aagtggaggt taatgaggca 4920

gtgctagcaa ttaacaccag caagtttccc aacatgtaca ttccagtagg acaggtcaca 4980

gaatacggct tcctaaacct aggtggcaca cccaccaaga gaatgcttat gtacaacttc 5040

cccacaagag caggccagtg tggtggagtg ctcatgtcca ccggcaaggt actgggtatc 5100

catgttggtg gaaatggcca tcagggcttc tcagcagcac tcctcaaaca ctacttcaat 5160

gatgagcaag gtgaaataga atttattgag agctcaaagg acgccgggtt tccagtcatc 5220

aacacaccaa gtaaaacaaa gttggagcct agtgttttcc accaggtctt tgaggggaac 5280

aaagaaccag cagtactcag gagtggggat ccacgtctca aggccaattt tgaagaggct 5340

atattttcca agtatatagg aaatgtcaac acacacgtgg atgagtacat gctggaagca 5400

gtggaccact acgcaggcca actagccacc ctagatatca gcactgaacc aatgaaactg 5460

gaggacgcag tgtacggtac cgagggtctt gaggcgcttg atctaacaac gagtgccggt 5520

tacccatatg ttgcactggg tatcaagaag agggacatcc tctctaagaa gactaaggac 5580

ctaacaaagt taaaggaatg tatggacaag tatggcctga acctaccaat ggtgacttat 5640

gtaaaagatg agctcaggtc catagagaag gtagcgaaag gaaagtctag gctgattgag 5700

gcgtccagtt tgaatgattc agtggcgatg agacagacat ttggtaatct gtacaaaact 5760

ttccacctaa acccaggggt tgtgactggt agtgctgttg ggtgtgaccc agacctcttt 5820

tggagcaaga taccagtgat gttagatgga catctcatag catttgatta ctctgggtac 5880

gatgctagct taagccctgt ctggtttgct tgcctaaaaa tgttacttga gaagcttgga 5940

tacacgcaca aagagacaaa ctacattgac tacttgtgca actcccatca cctgtacagg 6000

gataaacatt actttgtgag gggtggcatg ccctcgggat gttctggtac cagtattttc 6060

aactcaatga ttaacaatat cataattagg acactaatgc taaaagtgta caaagggatt 6120

gacttggacc aattcaggat gatcgcatat ggtgatgatg tgatcgcatc gtacccatgg 6180

cctatagatg catctttact cgctgaagct ggtaagggtt acgggctgat catgacacca 6240

gcagataagg gagagtgctt taacgaagtt acctggacca acgccacttt cctaaagagg 6300

tattttagag cagatgaaca gtaccccttc ctggtgcatc ctgttatgcc catgaaagac 6360

atacacgaat caattagatg gaccaaggat ccaaagaaca cccaagatca cgtgcgctca 6420

ctgtgtctat tagcttggca taacggggag cacgaatatg aggagttcat ccgtaaaatt 6480

agaagcgtcc cagtcggacg ttgtttgacc ctccccgcgt tttcaactct acgcaggaag 6540

tggttggact ccttt 6555

<210> 5

<211> 1394

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 60

tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 120

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 180

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 240

gtggaaagga cgaaacaccg gaaacctgat catgtagatc gaacggactc taaatccgtt 300

cagccgggtt agattcccgg ggtttccgga caagtgcggt ttttcaattc tgggcaggaa 360

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 420

ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 480

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 540

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 600

cgaaacaccg gaaacctgat catgtagatc gaacggactc taaatccgtt cagccgggtt 660

agattcccgg ggtttccgga caagtgcggt ttttcaattc tgggcaggaa gagggcctat 720

ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa 780

ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat 840

ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg 900

taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg 960

gaaacctgat catgtagatc gaacggactc taaatccgtt cagccgggtt agattcccgg 1020

ggtttccgga caagtgcggt ttttcaattc tgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat 1080

tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac 1140

tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta 1200

gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa 1260

gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gaaacctgat 1320

catgtagatc gaacggactc taaatccgtt cagccgggtt agattcccgg ggtttccgga 1380

caagtgcggt tttt 1394

Claims (3)

1.一种以CVB3为病毒载体的基因递送系统，包括元件甲、元件乙和元件丙；

所述元件甲为具有片段甲和片段乙的质粒；所述片段甲为对CVB3的全基因组进行如下改造得到的：在衣壳蛋白的编码基因内部引入UAG，得到片段甲；所述片段乙为目的基因表达盒，所述表达盒含有目的基因插入位点；

所述元件乙为具有片段丙和片段丁的质粒；所述片段丙为编码吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的DNA片段；所述片段丙和片段丁反向存在；

片段丁为编码4个带有RNA聚合酶Ⅲ启动子的tRNA转录单元的DNA片段；所述RNA聚合酶Ⅲ启动子为U6启动子；

所述衣壳蛋白为VP4蛋白；

所述元件丙为非天然氨基酸；

带有RNA聚合酶Ⅲ启动子的tRNA转录单元为序列表的序列5自5’端第1-344位核苷酸所示的DNA分子；

所述在衣壳蛋白的编码基因内部引入UAG通过将CVB3基因组中序列表的序列2自5′端第25位碱基由A突变为T实现；

所述片段甲为序列表的序列4所示的DNA分子；

所述片段丙为序列表的序列3自5’端第2141-3505位核苷酸所示的DNA分子；

所述片段丁为序列表的序列5所示的DNA分子；

所述元件甲为具有如下核酸序列的质粒：将序列表的序列1自5’端第2280位核苷酸突变为T；

所述元件乙为将pcDNA3.1（+）质粒MfeI和BamHI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3自5’端第1-3505位核苷酸所示的DNA分子；

所述目的基因表达盒包括启动子、起始密码子、目的基因插入位点和终止密码子；

所述目的基因插入位点为SfiⅠ位点；

所述目的基因为eGFP基因。

2.权利要求1所述的基因递送系统在递送目的基因中的应用；所述应用为非疾病诊断和治疗应用。

3.一种递送目的基因的方法，包括如下步骤：

（1）在权利要求1或2所述的基因递送系统中的元件甲的目的基因插入位点插入目的基因，得到元件丁；

（2）将步骤（1）到的元件丁和所述系统中的元件乙转染病毒包装细胞，在含有元件丙的体系中进行培养，然后破碎细胞并收集上清液；

（3）将步骤（2）得到的上清液感染宿主细胞并进行培养，从而在宿主细胞中表达目的基因；所述方法为非疾病诊断和治疗方法。