CN112891336A

CN112891336A - 没食子儿茶素没食子酸酯及其衍生物的医药用途

Info

Publication number: CN112891336A
Application number: CN202110135883.7A
Authority: CN
Inventors: 张学敏; 李涛; 周涛; 李爱玲
Original assignee: Nanhu Laboratory
Current assignee: Academy Of Military Medicine Pla Academy Of Military Sciences; Nanhu Laboratory
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-06-04
Also published as: WO2022161436A1

Abstract

本发明公开了一种GCG及其衍生物新的医药用途。本发明所提供的医药用途为：(a)GCG或其衍生物在制备治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；(b)GCG或其衍生物在制备预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；(c)GCG或其衍生物在制备冠状病毒抑制剂中的应用。本发明的发明人研究发现，病毒感染时，SARS‑CoV‑2的N蛋白质发生相分离。GCG通过与N蛋白质特异性结合，抑制N蛋白质与病毒RNA的结合，破坏其相分离，最终抑制病毒的复制。

Description

没食子儿茶素没食子酸酯及其衍生物的医药用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种GCG及其衍生物的医药用途。

背景技术

新冠病毒是继2002年的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒SARS-CoV、2012年中东呼吸系统综合症冠状病毒MERS-CoV之后的第三种高致病性的人畜共患冠状病毒，其造成的肺炎也称为2019年冠状病毒病(COVID-19)。

新冠病毒SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒，编码29个蛋白质。核衣壳蛋白质(N蛋白质)作为一种结构蛋白质在新冠病毒的组装和复制中发挥重要作用。另外，SARS-CoV-2与SARS-CoV的N蛋白质存在极高相似性。

相分离是蛋白质或核酸聚集形成无膜细胞器的过程，是病毒的装配的关键步骤。因此，靶向相关病毒N蛋白质的相分离，具有重要的抗病毒意义。

(-)-Gallocatechol gallate(GCG)是茶的天然提取物之一。中文名称：没食子儿茶素没食子酸酯；英文名称：(-)-Gallocatechol gallate；CAS号：4233-96-9；分子式：C₂₂H₁₈O₁₁；分子量：458.37；其结构式如下所示：

目前已经公开的GCG的用途包括：抗癌、减脂、药物递送、美容、促进血液循环、抑制牙龈细菌、预防及改善氧化应激和神经元损伤等。

发明内容

本发明的目的是提供GCG及其衍生物新的医药用途。

本发明所提供的GCG及其衍生物的医药用途，为以下(a)和/或(b)和/或(c)：

(a)GCG或其衍生物在制备治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；

(b)GCG或其衍生物在制备预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；

(c)GCG或其衍生物在制备冠状病毒抑制剂中的应用。

本发明还提供了GCG及其衍生物的医药用途，为以下(d)和/或(e)和/或(f)：

(d)GCG或其衍生物抑制RNA诱导的冠状病毒N蛋白质的相分离；

(e)GCG或其衍生物抑制冠状病毒N蛋白质与RNA的结合；

(f)GCG或其衍生物抑制SARS-CoV-2N蛋白质的相分离。

GCG((-)-Gallocatechol gallate)是茶的天然提取物之一。中文名称：没食子儿茶素没食子酸酯；英文名称：(-)-Gallocatechol gallate；CAS号：4233-96-9；分子式：C₂₂H₁₈O₁₁；分子量：458.37；其结构式如下所示：

本发明所述GCG的衍生物包括EGCG(Epigallocatechin gallate，表没食子儿茶素没食子酸酯)、CG((-)-Catechin gallate，儿茶素没食子酸盐)等。

所述产品可为药物或药物制剂。

所述冠状病毒抑制剂能够抑制冠状病毒的复制。

所述冠状病毒可为α属冠状病毒和/或β属冠状病毒，具体的选自SARS-CoV-2、SARS-CoV中的至少一种。

上述应用中，制备药物或药物制剂时，GCG或其衍生物可作为有效成分之一，也可作为唯一有效成分。

上述应用中，制备药物或药物制剂时，还可加入载体材料。

载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。

本发明还提供了一种药物或药物组合物，其活性成分为GCG或其衍生物。

所述药物或药物组合物具有下述至少一种功效：

1)治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染；

2)预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染；

3)抑制冠状病毒。

上述药物或药物组合物可以按照本领域技术人员已知的常规方法制成溶液剂、片剂、胶囊或注射剂等剂型。

利用本发明提供的GCG或其衍生物预防和/或治疗冠状病毒引起的感染时，给予受试者生物体有效量的GCG或其衍生物。

本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医生的主观判断。

本发明中，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

本发明中，术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

本发明中，所述冠状病毒所致疾病可为呼吸系统感染和/或多器官感染。

所述呼吸系统感染为呼吸道感染和/或肺部感染；所述呼吸道感染可为鼻咽炎、鼻炎、咽喉炎、气管炎和/或支气管炎；所述肺部感染可为肺炎；所述多器官感染可为多器官功能衰竭。

本发明中，所述冠状病毒所致疾病通常包括病毒性肺炎、严重急性呼吸综合征、炎症因子风暴、多器官功能衰竭等。

本发明中，所述冠状病毒感染通常引起病毒性肺炎、严重急性呼吸综合征、炎症因子风暴、多器官功能衰竭等疾病。

本发明还保护一种抑制冠状病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用GCG或其衍生物以抑制冠状病毒感染动物。

本发明还保护一种治疗冠状病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用GCG或其衍生物进行治疗冠状病毒所致疾病。

本发明还保护一种预防冠状病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用GCG或其衍生物进行预防冠状病毒所致疾病。

以上任一所述冠状病毒可为α属冠状病毒和/或β属冠状病毒。

以上任一所述冠状病毒具体可为SARS-CoV-2、SARS-CoV中的至少一种。

SARS-CoV-2，其序列特征包括但不局限于代表病毒(Cell Host Microbe,2020；PMID:32183941.Nature,2020；PMID:32015508)

本发明的发明人研究发现，SARS-CoV-2感染时N蛋白质发生相分离。GCG通过与N蛋白质特异性结合，抑制N蛋白质与病毒RNA的结合，破坏其相分离过程，最终抑制病毒的复制。

同时发明人研究发现，GCG的衍生物EGCG，CG同样抑制SARS-CoV-2的N蛋白质在细胞内的相分离。

序列比对结果显示，SARS-CoV-2的N蛋白质与SARS-CoV的N蛋白质具有高度相似性。因此，GCG及其衍生物通过破坏病毒N蛋白质的相分离过程，从而抑制SARS-CoV-2及SARS-CoV类似病毒的复制与组装。

附图说明

图1为GCG抑制SARS-CoV-2的复制。

图2为GCG抑制RNA诱导的SARS-CoV-2N蛋白质的相分离。

图3为GCG与SARS-CoV-2N蛋白质特异性结合。

图4为GCG抑制SARS-CoV-2N蛋白质与病毒RNA的结合。

图5为GCG抑制SARS-CoV-2感染时N蛋白质的相分离。

图6为EGCG和CG抑制RNA诱导的SARS-CoV-2N蛋白质的相分离。

图7为EGCG和CG抑制SARS-CoV-2N蛋白质与病毒RNA的结合。

图8为SARS-CoV-2N蛋白质与SARS-CoV N蛋白质序列存在高度相似性。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的名词注释如下：

H1299：人肺腺癌细胞；A549：人非小细胞肺癌细胞；

mEGFP：单体绿色荧光蛋白质；poly(I:C)：聚肌苷酸胞苷酸；

Hoechst：细胞核染料；ACE2：血管紧张素转化酶2；

TRIZOL：RNA提取试剂；RT-qPCR：实时荧光定量PCR；

DMSO：二甲基亚砜；PBS：磷酸盐缓冲液；

TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液；

GCG：中文名称：没食子儿茶素没食子酸酯；购自TargetMol公司，产品目录号为T3807。

EGCG：中文名称：表没食子儿茶素没食子酸酯；购自Selleck公司，产品目录号为S2250。

CG：中文名称：儿茶素没食子酸酯；购自MCE公司，产品目录号为HY-N0356。

实施例中所用的SARS-CoV-2为新型冠状病毒上海株(nCoV-SH01)。(张荣,易志刚,王玉燕,等.新型冠状病毒上海株(nCoV-SH01)的分离和鉴定[J].微生物与感染,2020(1):16-21.)

实施例中涉及的实验在包括生物安全三级实验室(BSL-3)等实验室进行。

实施例1、

1、GCG抑制新冠病毒的复制

实验方法：

(1)将人源的ACE2蛋白质编码序列的C端，偶联Flag标签蛋白质序列，并构建到pLV-EF1a-IRES-Blast慢病毒载体上，通过慢病毒感染，将ACE2-Flag蛋白质稳定表达在A549细胞系中。

具体方法如下：

重组载体为将融合蛋白ACE2-Flag的编码基因插入pLV-EF1a-IRES-Blast慢病毒载体的BamHI和EcoRI酶切位点间；该载体表达融合蛋白质。

上述融合蛋白ACE2-Flag为ACE2蛋白质C端偶联Flag标签得到的。

该融合蛋白质ACE2-Flag的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

该融合蛋白质ACE2-Flag编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

pLV-EF1a-IRES-Blast慢病毒载体全序列图谱如SEQ ID No：3所示。

将重组载体转入A549细胞中，得到转染后细胞系，即A549-ACE2-Flag细胞系。

(2)提前12个小时将A549-ACE2-Flag细胞平铺在12孔板中(100,000个细胞/孔)，使其自然贴壁生长。

(3)将步骤(2)处理后的细胞用100μM GCG(溶剂为DMSO)预处理1个小时。加入DMSO的孔称为对照孔，加入含GCG的孔统称为供试孔。

(4)用SARS-CoV-2病毒液(1μl/孔，SARS-CoV-2病毒液中的病毒含量为100,000PFU/ml，MOI为1)感染完成步骤(3)的细胞，4个小时后收细胞。

弃上清培养基，用TRIZOL裂解并提取细胞的RNA，进行反转录，将得到cDNA作为模板，RT-qPCR检测新冠病毒RNA的复制量。

RT-qPCR采用的引物探针组如下(靶序列位于SARS-CoV-2的N蛋白质基因)：

上游引物：5’-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3’

下游引物：5’-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3’

检测所需荧光探针：5’-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC-BHQ1-3’

结果：

如图1所示，GCG存在的情况下，能够显著抑制新冠病毒的RNA复制。

2、GCG抑制RNA诱发的新冠病毒N蛋白质的相分离

实验方法：

(1)将新冠病毒的N蛋白质编码序列的C端，偶联mEGFP绿色荧光标签，并构建到pCDX-Tet-On慢病毒载体上，通过慢病毒感染，将Flag-N-mEGFP蛋白质稳定表达在H1299细胞系中。

具体方法如下：

重组载体为将融合蛋白Flag-N-mEGFP的编码基因插入pCDX-Tet-On慢病毒载体的NheI和NotI酶切位点间；该载体表达融合蛋白质。

上述融合蛋白Flag-N-mEGFP为N蛋白质N端偶联Flag标签，C端偶联mEGFP荧光蛋白质得到的。

该融合蛋白Flag-N-mEGFP的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。

该融合蛋白Flag-N-mEGFP编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。

将重组载体转入H1299细胞中，得到转染后细胞，即H1299-Flag-N-mEGFP细胞。

(2)提前12个小时在细胞培养皿中平铺细胞，使其贴壁均匀生长。

(3)将步骤(2)中的细胞，用DMSO溶解制成的10μM GCG预处理1个小时。

(4)用poly(I:C)处理细胞3个小时，模拟病毒感染时RNA的释放。

(5)将步骤(4)处理完毕的细胞，用PBS清洗三次，以弃去培养基，并用4％的多聚甲醛室温固定10分钟。

(6)用Hoechst对细胞核进行染色，室温15分钟。

(7)用PSB清洗三次，每次5分钟，并用封片剂将细胞贴片。

(8)用ZEISS LSM 880显微镜进行成像观察。

结果：

如图2所示，未处理GCG的细胞，在poly(I:C)处理下，N蛋白质发生了明显的点状聚集。GCG处理组，在poly(I:C)处理下，未见到N蛋白质的点状聚集，说明GCG抑制了RNA诱导的新冠病毒N蛋白质的相分离。

3、GCG与新冠病毒N蛋白质特异性结合

实验方法：

(1)将小分子化合物GCG溶解至2.5ml结合缓冲液(coupling buffer:0.1M NaHCO₃pH 8.3，包含0.5M NaCl)中。

(2)使用溴化氰(CNBr)-活化琼脂糖凝胶珠(C500099，生工)与GCG溶液在4℃状态下偶联过夜。

(3)使用纯化重组的N蛋白质(带有Flag标签)与CNBr-GCG琼脂糖凝胶珠进行4℃偶联6小时。

(4)通过免疫印迹法对N蛋白质进行检测。

结果：

如图3所示，与不加GCG的CNBr琼脂糖凝胶相比，N蛋白质能够特异性结合GCG。

4、GCG抑制新冠病毒N蛋白质与病毒RNA的结合

实验方法：

(1)2μg的N-mEGFP蛋白质与0-100μM的GCG室温预混合5分钟，随后加入Cy3标记的RNA室温共孵育5分钟。

(2)使用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，在0.5×TBE缓冲液中进行电压为200V时间为1小时的电泳。

(3)利用Bio-Rad公司的ChemiDocMP成像仪成像观察。

结果：

如图4所示，GCG抑制新冠病毒N蛋白质与RNA的结合。

5、GCG抑制新冠病毒感染下N蛋白质的相分离

实验方法：

(1)将人源的ACE2蛋白质编码序列的C端，偶联Flag标签蛋白质序列，并构建到pLV-EF1a-IRES-Blast慢病毒载体上，通过慢病毒感染，将ACE2-Flag蛋白质稳定表达在A549细胞系中。(具体构建方法同“GCG抑制新冠病毒的复制”)

(3)将步骤(2)处理后的A549细胞用DMSO溶解制成的100μM GCG预处理1个小时。加入DMSO的孔称为对照孔，加入含GCG的孔统称为供试孔。

(4)用SARS-CoV-2病毒液(1μL/孔，SARS-CoV-2病毒液中的病毒含量为100,000PFU/ml，MOI为1)感染步骤(3)的细胞24小时。

(5)用PBS清洗三次，以弃去培养基，并用4％的多聚甲醛室温固定10分钟。

(6)0.3％Triton X100室温打孔10分钟。

(7)用5％的羊血清室温封闭1小时。

(8)用特异性新冠病毒N蛋白质抗体进行免疫荧光染色。

(9)用ZEISS LSM 880显微镜进行成像观察。

结果：

如图5所示，SARS-CoV-2感染A549-ACE2-Flag细胞，新冠病毒的N蛋白质发生明显相分离聚集。在GCG处理组中这一现象被明显抑制，说明GCG抑制了SARS-CoV-2N蛋白质的相分离。

6、EGCG和CG抑制新冠病毒N蛋白质的相分离

实验方法：

(1)将新冠病毒的N蛋白质编码序列的C端，偶联mEGFP绿色荧光标签，并构建到pCDX慢病毒载体上，通过慢病毒感染，将N-mEGFP蛋白质稳定表达在H1299细胞中。

(3)将稳定表达了N-mEGFP的细胞，用DMSO溶解制成的20μM EGCG，20μM CG或20μMGCG预处理1个小时。

(4)用poly(I:C)处理细胞3个小时，模拟病毒感染时RNA的释放。

(6)用Hoechst对细胞核进行染色，室温15分钟。

(7)用PSB清洗三次，每次5分钟，并用封片剂将细胞贴片。

(8)用ZEISS LSM 880显微镜进行成像观察。

结果：

如6所示，在poly(I:C)处理下，N蛋白质发生了明显的点状聚集。EGCG，CG和GCG处理组，在poly(I:C)处理下，未见到N蛋白质的点状聚集，说明EGCG和CG同样抑制了RNA诱导的新冠病毒N蛋白质的相分离。

7.EGCG和CG抑制新冠病毒N蛋白质与病毒RNA的结合

实验方法：

(1)1μg的N蛋白质与100μM的GCG，EGCG或CG室温预混合5分钟，随后加入Cy3标记的RNA室温共孵育5分钟。

(3)利用Bio-Rad公司的ChemiDocMP成像仪成像观察。

结果：

如图7所示，EGCG和CG同样抑制新冠病毒N蛋白质与RNA的结合。

8.SARS-CoV-2的N蛋白质与SARS的N蛋白质具有高度相似性。

实验方法：

(1)从UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)下载SARS-CoV-2(Entry：P0DTC9)与SARS-CoV(Entry：P59595)的N蛋白(Nucleoprotein)的氨基酸序列数据文件(.fasta格式)

(2)将上述序列文件输入MAFFT软件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)进行序列比对，得到比对后的序列数据文件(.fasta格式)

(3)将比对后的序列数据文件输入MEGA软件(https://www.megasoftware.net/)，使用MEGA软件的”Analysis-Distance-Compute Pairwise Distances..”计算SARS-CoV-2与SARS的氨基酸序列差异。其中，”Model/Method”参数选择”p-distance”，其输出结果为nd/n，即序列间存在差异的氨基酸数量与序列全长的氨基酸数量之比。

(4)将通过公式1计算SARS-CoV-2与SARS的氨基酸序列的相似百分比(Percentsimilarity)：

结果：

如图8所示，SARS-CoV-2的N蛋白质序列与SARS的N蛋白质序列具有极高相似性。

以上数据说明，GCG及其衍生物可以靶向病毒的N蛋白质，抑制其相分离，进一步抑制相关病毒的复制。

<110>南湖实验室

<120>没食子儿茶素没食子酸酯及其衍生物的医药用途

<130>GNCZJ210012

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 825

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

405 410 415

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

420 425 430

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

435 440 445

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

450 455 460

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

465 470 475 480

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe

500 505 510

Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala

515 520 525

Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile

530 535 540

Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu

545 550 555 560

Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala

565 570 575

Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe

580 585 590

Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr

595 600 605

Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu

610 615 620

Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met

625 630 635 640

Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu

645 650 655

Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val

660 665 670

Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro

675 680 685

Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile

690 695 700

Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn

705 710 715 720

Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln

725 730 735

Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val

740 745 750

Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg

755 760 765

Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile

770 775 780

Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp

785 790 795 800

Val Gln Thr Ser Phe Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp

805 810 815

Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

820 825

<210> 2

<211> 2475

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60

attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120

tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180

aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240

caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300

cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360

aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420

tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480

aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540

gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600

gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660

cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720

catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780

tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840

ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900

gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960

cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020

aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080

tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140

tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200

catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260

attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320

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tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500

gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120

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acagagaaga ttacaatgct ttatgaggat aataaacatc atgtgggagc ggcaattcgt 4200

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atagaaatga atggcaagtt agtcaaaact acgattgaag aactcattcc actcaaatat 4500

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agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg 4860

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caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 5940

tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta 6000

taacttgcaa agaaatgaat atcagagagt gagaggcctt gacattgcta gcgttttacc 6060

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gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 6420

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 6480

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ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 6600

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tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 6720

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Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn

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Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr

20 25 30

Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg

35 40 45

Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu

50 55 60

Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val

65 70 75 80

Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg

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Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu

100 105 110

Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly

115 120 125

Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu

130 135 140

Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala

145 150 155 160

Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro

165 170 175

Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser

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Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly

195 200 205

Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp

210 215 220

Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser

225 230 235 240

Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys

245 250 255

Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala

260 265 270

Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu

275 280 285

Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr

290 295 300

Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser

305 310 315 320

Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly

325 330 335

Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro

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Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr

355 360 365

Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala

370 375 380

Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val

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Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln

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Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu

435 440 445

Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val

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Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr

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Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro

485 490 495

Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys

500 505 510

Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser

515 520 525

Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp

530 535 540

Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr

545 550 555 560

Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly

565 570 575

Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val

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Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys

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Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

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His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys

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Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr

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Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

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atggactaca aggacgacga tgacaagtct gataatggac cccaaaatca gcgaaatgca 60

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ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg 1740

cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag 1800

aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc 1860

gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac 1920

cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg 1980

gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag 2040

tga 2043

Claims

1.没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物的应用，为以下(a)和/或(b)和/或(c)：

(a)没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物在制备治疗冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；

(b)没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物在制备预防冠状病毒所致疾病或冠状病毒感染的产品中的应用；

(c)没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物在制备冠状病毒抑制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或药物制剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒为α属冠状病毒和/或β属冠状病毒；所述冠状病毒抑制剂能够抑制冠状病毒的复制；

所述没食子儿茶素没食子酸酯的衍生物包括表没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸盐。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV中的至少一种。

5.没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物的应用，为以下(d)和/或(e)和/或(f)：

(d)没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物抑制RNA诱导的冠状病毒N蛋白质的相分离；

(e)没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物抑制冠状病毒N蛋白质与RNA的结合；

(f)没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物抑制SARS-CoV-2N蛋白质的相分离。

6.抑制冠状病毒感染动物的方法，包括如下步骤：给受体动物施用没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物以抑制冠状病毒感染动物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述冠状病毒为α属冠状病毒和/或β属冠状病毒；所述冠状病毒具体选自SARS-CoV-2、SARS-CoV中的至少一种。

8.治疗冠状病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物进行治疗冠状病毒所致疾病。

9.预防冠状病毒所致疾病的方法，包括如下步骤：给受体动物施用没食子儿茶素没食子酸酯或其衍生物进行预防冠状病毒所致疾病。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述冠状病毒为α属冠状病毒和/或β属冠状病毒；所述冠状病毒具体选自SARS-CoV-2、SARS-CoV中的至少一种。