CN116790606A - 一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体及其制备与应用，属于基因工程技术领域，本发明先构建了遍在染色质开放表达元件，并将该元件插入pCDNA3.1载体的CMV启动子之前，获得了一种包含遍在染色质开放表达元件的重组表达载体；所得的重组表达载体可显著提高EGFP基因序列的荧光表达强度，同时能提高哺乳动物下游目的蛋白在重组表达载体中的表达水平，为哺乳动物提供高效的重组表达系统。

Description

一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体及其制备方法 与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体及其制备与应用。

背景技术

随着重组蛋白类药物种类和需求的不断变化，用于重组蛋白类的表达系统也不断改进。基于哺乳动物表达系统对蛋白的翻译后修饰以及所表达的蛋白更接近天然蛋白的优势，目前CHO表达系统的应用更为广泛。但哺乳动物表达系统存在重组蛋白表达水平低下、稳定细胞株筛选周期长等缺陷，因此，制备高效的重组表达系统是生产重组类蛋白药物的关键所在。遍在染色质开放元件(ubiquitously-acting chromatin opening element,UCOE)是具有组织非特异性显性染色质重塑功能的DNA结构域，能使DNA不依赖于染色体插入位点，使其转录活性处于"开放"的状态。自从UCOE发现以来，已经得到了广泛应用，有研究证实在表达载体的启动子之前插入UCOE可以显著提高转录水平。研究表明，人HNRPA2B1/CBX3基因座位的染色质开放元件UCOE包含一个双向启动子及无甲基化的CpG岛，具有染色质重塑功能。当它作为调控元件连接在启动子的上游时能够防止转录沉默，增强转基因的表达水平。

目前，通过将人HNRPA2B1/CBX3基因座的CpG岛片段加在启动子前作为调控元件，以提高目的基因蛋白的表达水平已有研究，但如何获得表达效果更强的遍在染色质开放表达元件，以及如何获得一种能提高哺乳动物下游目的蛋白表达水平的重组表达载体仍具有积极的意义。

发明内容

针对背景技术提出的问题，本发明的目的之一在于提供一种遍在染色质开放表达元件，目的之二在于提供一种包含遍在染色质开放表达元件的重组表达载体。本发明的遍在染色质开放表达元件及包含该表达元件的重组表达载体可显著提高下游目标蛋白的表达水平，可为哺乳动物提供高效的重组表达系统。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的遍在染色质开放表达元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遍在染色质开放表达元件在提高细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。

所述的重组表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的重组表达载体，包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的遍在染色质开放表达元件，该遍在染色质开放表达元件位于表达载体表达框的启动子上游。

进一步的，所述的表达载体为pCDNA-3.1。

进一步的，所述的启动子为CMV。

进一步的，所述的遍在染色质开放表达元件位于pCDNA-3.1载体CMV启动子上游NruI位点。

上述的重组表达载体的制备方法，包括以下步骤：

（1）以1F-5'- CTAAAACAGCTTCACATGGCTT -3' 和

1R-5'- gagcacctccgcacgggacccggcgctgctgctact -3'为引物，

扩增HNRPA2B1/CBX3基因片段1 (3045-5058位点)，得序列1；

（2）以2F-5'- agcagcgccgggtcccgtgcggaggtgctcctcgcag -3'和

2R-5'-TCGCGAaagccaaagcctgtattctgggcacttatga-3'为引物

扩增 HNRPA2B1/CBX3基因片段2(5046-7125位点)，得序列2；

（3）以步骤（1）得到的序列1和步骤（2）得到的序列2为模板，以3F-5'-TCGCGAagcttatcgataccggtggcgcgccaattgttactaaaacagcttcacatggctta-3'和2R-5'-TCGCGAaagccaaagcctgtattctgggcacttatga-3'为引物将序列1和序列2搭桥PCR扩增；得序列3；

（4）将序列3和pCDNA3.1载体分别通过NruI限制性内切酶酶切，通过凝胶电泳后切胶回收；分别得pCDNA3.1载体NruI酶切线性化产物和HNRPA2B1/CBX3序列NruI酶切产物；

（5）将载体（pCDNA3.1载体NruI酶切线性化产物）和 片段（HNRPA2B1/CBX3序列NruI酶切产物）通过连接酶连接、培养、克隆，得重组表达载体。

一种细胞表达系统，包含上述的任一重组表达载体。

上述的任一重组表达载体在表达重组蛋白方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明以人4.0kb UCOE为模版，通过引物设计及PCR扩增及搭桥PCR扩增，获得一种新的遍在染色质开放表达元件，将该元件插入pCDNA-3.1载体的CMV启动子前，构建出包含该遍在染色质开放表达元件的重组表达载体。所获得的重组表达载体可显著提高EGFP基因序列的荧光表达强度；且下游目的蛋白在重组表达载体中的表达水平明显提高，为哺乳动物提供了一种高效的重组表达系统。

附图说明

图1是本发明的重组表达载体pCDNA3.1-hUCOE-EGFP的构建图；

图2是本发明的实施例3中EGFP基因序列构建在两种不同载体中的荧光表达强度对比；

图3是本发明的实施例4中优化SARS-COV-2刺突蛋白S1基因序列在两种不同载体中的表达水平对比；

备注：图2中白色标尺代表100μm；

图3中右侧箭头S1表示检测到的蛋白S1；GAPDH表示内参基因。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的说明，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下多获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 一种遍在染色质开放表达元件及其制备方法

一种遍在染色质开放表达元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该遍在染色质开放表达元件的制备方法包括以下步骤：

（1）利用PCR方法扩增人4.0kb UCOE。

首先，以提取的人血液的全基因组DNA为模板，设计引物（划线序列为15bp同源臂序列）

1F-5'- CTAAAACAGCTTCACATGGCTT -3'和

1R-5'-gagcacctccgcacgggacccggcgctgctgctact -3'进行HNRPA2B1/CBX3基因片段1(5046-7125位点)的扩增。PCR扩增程序：98℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸（1kb/min），34个循环，扩增后得到序列1(3045-5058)，扩增体系见表1。

表1. PCR扩增体系

；

（2）通过第二对引物

2F-5'- agcagcgccgggtcccgtgcggaggtgctcctcgcag -3'（划线序列为15bp同源臂序列）， 和2R-5'-TCGCGAaagccaaagcctgtattctgggcacttatga-3'（划线序列为NruI酶切序列）进行HNRPA2B1/CBX3基因序列2 (5046-7125位点)的扩增，PCR扩增程序：98℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸（1kb/min），34个循环，扩增体系同表1，得序列2。

（3）以序列1(3045-5058)和序列2 (5046-7125)为模板，通过第三对引物3F-5'-T CGCGAagcttatcgataccggtggcgcgccaattgttactaaaacagcttcacatggctta-3'（划线序列为NruI酶切序列）和2R-5'-TCGCGAaagccaaagcctgtattctgggcacttatga-3'，将序列1和序列2通过搭桥PCR扩增。

搭桥PCR扩增程序：98℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸（1kb/min），34个循环，扩增体系见表2，得序列HNRPA2B1/CBX3遍在染色体开发元件序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

表2. PCR扩增体系

；

实施例2

一种重组表达载体及其制备方法

所述的重组表达载体包含实施例1的遍在染色质开放表达元件，该重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该重组表达载体的制备方法包括以下步骤：

（1）将实施例1所得的遍在染色质开放表达元件和pCDNA3.1载体分别通过NruI限制性内切酶37℃酶切3h，酶切结束后分别进行琼脂糖凝胶电泳（120V，30min），分别切取目的胶条置于1.5ml EP管中，加入PN溶液（0.1g/100μL）于50℃水浴锅中直到凝胶融化，将融化后的凝胶液分别加入吸附柱CA2中，静置2min，5000rpm离心2分钟，然后加入PW溶液洗涤12000rpm离心1分钟，重复2次，空管12000rpm离心1分钟后室温晾干，加入无菌无酶水洗涤，12000rpm离心2分钟获得酶切回收后的样品。

（2）将NruI酶切回收后的线性化pCDNA-3.1载体片段和遍在染色体开放元件序列片段按照摩尔比1:3通过T4连接酶16℃连接过夜，取5μl连接后的体系加入50μl感受态，冰浴30min后42℃水浴热激90s，然后冰浴2min，加入200μl SOC培养基，置于37℃摇床180rpm1h，涂板，过夜培养，挑选单克隆进行测序鉴定。

（3）将测序鉴定正确的单克隆进行LB培养基37℃，转速180rpm，过夜扩增培养12小时，按照天根质粒提取试剂盒将菌液12000rpm离心获得沉淀，加入500μl溶液P1重悬，加入等体积的溶液P2，温和翻转6-8次使菌液裂解，加入700μl的溶液P3，上下颠倒3-4次，沉淀10分钟进行12000rpm离心10min，将上清液加入吸附柱CP3中进行吸附，PW溶液洗涤2次，加入100μl无菌无酶水洗涤后提取DNA，获得pCDNA3.1-hUCOE重组载体（h代表human），其核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

pCDNA3.1-hUCOE重组载体的制备过程如附图1所示。

实施例3

将EGFP基因序列分别插入pCDNA3.1载体和实施例2得到的pCDNA3.1-hUCOE载体，比较EGFP基因序列在两种不同载体中的荧光表达强度，包括以下步骤：

（1）利用同源重组的方法将EGFP基因序列分别插入pCDNA3.1-hUCOE载体和pCDNA3.1载体，具体为：

首先利用NheI将pCDNA3.1-hUCOE和pCDNA3.1分别酶切线性化，酶切体系见表3，

表3 酶切体系

；

37℃酶切3h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳（120V，30min）通过天根琼脂糖凝胶回收试剂盒切取目的胶条置于1.5ml EP管中，加入PN溶液（0.1g/100μL）于50℃水浴锅中直到凝胶融化，将融化后的凝胶液加入吸附柱CA2中，静置2min，5000rpm离心2分钟，然后加入PW溶液洗涤12000rpm离心1分钟，重复2次，空管12000rpm离心1分钟后室温晾干，加入20μl无菌无酶水洗涤，12000rpm离心2分钟获得酶切回收样品，分别得到浓度为110ng/μl（20μl）的pCDNA3.1-hUCOE片段和浓度为95ng/μl（20μl）的pCDNA3.1片段，

（2）同时设计引物（划线序列为15bp同源臂序列）

F-5'- GGAGACCCAAGCTGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA -3'和R-5'-AAGTTTAAACGCTAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'进行EGFP基因序列的扩增，PCR扩增程序：98℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸（1kb/min），34个循环，扩增体系同表1。PCR扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳（120V，30min），通过天根琼脂糖凝胶回收试剂盒切取目的胶条置于1.5ml EP管中，加入PN溶液（0.1g/100μL）于50℃水浴锅中直到凝胶融化，将融化后的凝胶液加入吸附柱CA2中，静置2min，5000rpm离心2分钟，然后加入PW溶液洗涤12000rpm离心1分钟，重复2次，空管12000rpm离心1分钟后室温晾干，加入20μl无菌无酶水洗涤，12000rpm离心2分钟获得酶切回收样品，所得EGFP基因片段，紫外分光光度计检测浓度均为84 ng/μl。

（3）将回收的线性化pCDNA3.1-hUCOE或pCDNA3.1片段与EGFP片段（步骤2获得）分别按照摩尔比为1:3（线性化pCDNA3.1-hUCOE与EGFP片段的摩尔比，以及线性化pCDNA3.1片段与EGFP片段的摩尔比均为1:3）加入In-Fusion HD预混合酶试剂，在56℃条件下反应30min进行同源重组连接，同源重组连接体系见表4。

表4.同源重组连接体系

；

取5μl连接后的体系加入50μl感受态，冰浴30min后42℃水浴热激90s，然后冰浴2min，加入200μl SOC培养基，置于37℃摇床180rpm 1h，涂板，过夜培养，挑选单克隆进行测序鉴定。

（4）将测序鉴定正确的单克隆进行LB培养基37℃，转速180rpm，过夜扩增培养12小时，天根质粒提取试剂盒提取DNA，将菌液12000rpm离心获得沉淀，加入500μl溶液P1重悬，加入等体积的溶液P2，温和翻转6-8次使菌液裂解，加入700μl的溶液P3，上下颠倒3-4次，沉淀10分钟进行12000rpm离心10min，将上清液加入吸附柱CP3中进行吸附，PW溶液洗涤2次，加入100μl无菌无酶水洗涤后分别得到插入EGFP基因序列的pCDNA3.1-hUCOE-EGFP重组表达载体和pCDNA3.1-EGFP重组表达载体。

分别取2μg（5μg）pCDNA3.1-hUCOE-EGFP和pCDNA3.1-EGFP质粒，分别加入6μl（15ul）的Lipofection 2000试剂（按照质粒：脂质体用量比为1:3）进行室温混匀后静置10min，缓慢加入293T细胞后24h观察荧光强度，很明显可以观察到pCDNA3.1-hUCOE-EGFP的荧光强度高于pCDNA3.1-EGFP（附图2）。

实施例4

新型冠状病毒S1基因分别构建至pCDNA3.1-hUCOE和pCDNA3.1载体中在哺乳动物表达情况比较

根据目前新冠病毒不同突变株的相关序列及研究，我们采用申请号为ZL2022114792814的专利（公开号为CN115947800A）所公开的优化SARS-COV-2刺突蛋白S1基因序列（以下简称S1基因）插入至pCDNA3.1载体和实施例2所得的pCDNA3.1-hUCOE载体，比较S1基因在两种不同载体中的表达水平。具体包括如下步骤：

（1）首先将pCDNA3.1载体和pCDNA3.1-hUCOE载体分别利用KpnI限制性内切酶酶切线性化，酶切体系见表5。

表5.酶切体系

；

37℃酶切3h，进行琼脂糖凝胶电泳（120V，30min），通过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行切取目的胶条置于1.5ml EP管中，加入PN溶液（0.1g/100μL）于50℃水浴锅中直到凝胶融化，将融化后的凝胶液加入吸附柱CA2中，静置2min，5000rpm离心2分钟，然后加入PW溶液洗涤12000rpm离心1分钟，重复2次，空管12000rpm离心1分钟后室温晾干，加入20μl无菌无酶水洗涤，12000rpm离心2分钟获得酶切回收样品，回收的浓度分别为56ng/μl（20μl）。

（2）同时设计引物（划线序列为15bp同源臂序列）

F-5'- ACTTAAGCTTGGTACgccaccatggatgcaatgaagagagggctct-3'和R-5'-AGTGGA TCCGAGCTCGTTATCTAGCTCTTCTGTGAGACTTGGT-3'进行S1基因序列的扩增，PCR扩增程序：98℃变性15s，57℃退火30s，72℃延伸（1kb/min），34个循环；扩增体系见表6。

表6.PCR扩增体系

；

PCR扩增完成后通过琼脂糖凝胶切胶回收，得S1片段，紫外分光光度计检测浓度为60 ng/μl。

（3）将回收的线性化pCDNA3.1和pCDNA3.1-hUCOE线性化片段和S1片段分别按照摩尔比为1:3并加入In-Fusion HD预混合酶试剂，在56℃条件下反应30min进行同源重组连接，同源重组连接体系见表7。

表7.同源重组连接体系

；

取5μl连接后的体系加入50μl感受态，冰浴30min后42℃水浴热激90s，然后冰浴2min，加入200μl SOC培养基，置于37℃摇床180rpm 1h，涂板，过夜培养，挑选单克隆进行测序鉴定。

（4）将测序鉴定正确的单克隆进行LB培养基37℃，180rpm，过夜扩增培养12小时，天根质粒提取试剂盒按照提取DNA，将菌液1200rpm离心获得沉淀，加入500μl溶液P1重悬，加入等体积的溶液P2，温和翻转6-8次使菌液裂解，加入700μl的溶液P3，上下颠倒3-4次，沉淀10分钟进行12000rpm离心10min，将上清液加入吸附柱CP3中进行吸附，PW溶液洗涤2次，加入100μl无菌无酶水洗涤后获得pCDNA3.1-S1和pCDNA3.1-hUCOE-S1的DNA。

（5）将制备好的pCDNA3.1-S1和pCDNA3.1-hUCOE-S1分别取2μg，分别加入6μl的Lipofection 2000试剂（按照质粒：脂质体用量比为1:3）进行室温混匀后静置10min，缓慢加入293T和CHO-S细胞，转染24h后收取细胞裂解液进行Western Blot检测S1基因蛋白表达，很明显可以看到携带UCOE序列的质粒转染哺乳动物细胞后显著提高目的蛋白的表达量（附图3）。

在上述工作中，我们将hUCOE序列插入到pCDNA-3.1的CMV启动子序列前，很明显看到UCOE序列在哺乳动物表达系统可以显著提高下游目的蛋白的表达，为哺乳动物表达系统提供高效的重组表达系统。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 威瑞生物科技（昆明）有限责任公司

<120> 一种遍在染色质开放表达元件、重组表达载体及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4121

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agcttatcga taccggtggc gcgccaattg ttactaaaac agcttcacat ggcttaaaat60

aggggaccaa tgtcttttcc aatctaagtc ccatttataa taaagtccat gttccatttt120

taaaggacaa tcctttcggt ttaaaaccag gcacgattac ccaaacaact cacaacggta180

aagcactgtg aatcttctct gttctgcaat cccaacttgg tttctgctca gaaaccctcc240

ctctttccaa tcggtaatta aataacaaaa ggaaaaaact taagatgctt caaccccgtt300

tcgtgacact ttgaaaaaag aatcacctct tgcaaacacc cgctcccgac ccccgccgct360

gaagcccggc gtccagaggc ctaagcgcgg gtgcccgccc ccacccggga gcgcgggcct420

cgtggtcagc gcatccgcgg ggagaaacaa aggccgcggc acgggggctc aagggcactg480

cgccacaccg cacgcgccta cccccgcgcg gccacgttaa ctggcggtcg ccgcagcctc540

gggacagccg gccgcgcgcc gccaggctcg cggacgcggg accacgcgcc gccctccggg600

aggcccaagt ctcgacccag ccccgcgtgg cgctggggga gggggcgcct ccgccggaac660

gcgggtgggg gaggggaggg ggaaatgcgc tttgtctcga aatggggcaa ccgtcgccac720

agctccctac cccctcgagg gcagagcagt ccccccacta actaccgggc tggccgcgcg780

ccaggccagc cgcgaggcca ccgcccgacc ctccactcct tcccgcagct cccggcgcgg840

ggtccggcga gaaggggagg ggaggggagc ggagaaccgg gcccccggga cgcgtgtggc900

atctgaagca ccaccagcga gcgagagcta gagagaagga aagccaccga cttcaccgcc960

tccgagctgc tccgggtcgc gggtctgcag cgtctccggc cctccgcgcc tacagctcaa1020

gccacatccg aagggggagg gagccgggag ctgcgcgcgg ggccgccggg gggaggggtg1080

gcaccgccca cgccgggcgg ccacgaaggg cggggcagcg ggcgcgcgcg cggcgggggg1140

aggggccggc gccgcgcccg ctgggaattg gggccctagg gggagggcgg aggcgccgac1200

gaccgcggca cttaccgttc gcggcgtggc gcccggtggt ccccaagggg agggaagggg1260

gaggcggggc gaggacagtg accggagtct cctcagcggt ggcttttctg cttggcagcc1320

tcagcggctg gcgccaaaac cggactccgc ccacttcctc gcccgccggt gcgagggtgt1380

ggaatcctcc agacgctggg ggagggggag ttgggagctt aaaaactagt acccctttgg1440

gaccactttc agcagcgaac tctcctgtac accaggggtc agttccacag acgcgggcca1500

ggggtgggtc attgcggcgt gaacaataat ttgactagaa gttgattcgg gtgtttccgg1560

aaggggccga gtcaatccgc cgagttgggg cacggaaaac aaaaagggaa ggctactaag1620

atttttctgg cgggggttat cattggcgta actgcaggga ccacctcccg ggttgagggg1680

gctggatctc caggctgcgg attaagcccc tcccgtcggc gttaatttca aactgcgcga1740

cgtttctcac ctgccttcgc caaggcaggg gccgggaccc tattccaaga ggtagtaact1800

agcaggactc tagccttccg caattcattg agcgcattta cggaagtaac gtcgggtact1860

gtctctggcc gcaagggtgg gaggagtacg catttggcgt aaggtggggc gtagagcctt1920

cccgccattg gcggcggata gggcgtttac gcgacggcct gacgtagcgg aagacgcgtt1980

agtggggggg aaggttctag aaaagcggcg gcagcggctc tagcggcagt agcagcagcg2040

ccgggtcccg tgcggaggtg ctcctcgcag agttgtttct cgagcagcgg cagttctcac2100

tacagcgcca ggacgagtcc ggttcgtgtt cgtccgcgga gatcgatctc tctcatctcg2160

ctcggctgcg ggaaatcggg ctgaagcgac tgagtccgcg atggaggtaa cgggtttgaa2220

atcaatgagt tattgaaaag ggcatggcga ggccgttggc gcctcagtgg aagtcggcca2280

gccgcctccg tgggagagag gcaggaaatc ggaccaattc agtagcagtg gggcttaagg2340

tttatgaacg gggtcttgag cggaggcctg agcgtacaaa cagcttcccc accctcagcc2400

tcccggcgcc atttcccttc actgggggtg ggggatgggg agctttcaca tggcggacgc2460

tgccccgctg gggtgaaagt ggggcgcgga ggcgggaatt cttattccct ttctaaagca2520

cgctgcttcg ggggccacgg cgtctcctcg gcgagcgttt cggcgggcag caggtcctcg2580

tgagcgaggc tgcggagctt cccctccccc tctctcccgg gaaccgattt ggcggccgcc2640

attttcatgg ctcgccttcc tctcagcgtt ttccttataa ctcttttatt ttcttagtgt2700

gctttctcta tcaagaagta gaagtggtta actatttttt ttttcttctc gggctgtttt2760

catatcgttt cgaggtggat ttggagtgtt ttgtgagctt ggatctttag agtcctgcgc2820

acctcattaa aggcgctcag ccttcccctc gatgaaatgg cgccattgcg ttcggaagcc2880

acaccgaaga gcggggaggg ggggtgctcc gggtttgcgg gcccggtttc agagaagata2940

tcaccaccca gggcgtcggg ccgggttcaa tgcgagccgt aggacaaaga aaccatttta3000

tgtttttcct gtcttttttt tcctttgagt aacggtttta tctgggtctg cagtcagtaa3060

aacgacagat gaaccgcggc aaaataaaca taaattggaa gccatcggcc acgaggggca3120

gggacgaagg tggttttctg ggcgggggag ggatattcgc gtcagaatcc tttactgttc3180

ttaaggattc cgtttaagtt gtagagctga ctcattttaa gtaatgttgt tactgagaag3240

tttaaccctt acgggacaga tccatggacc tttatagatg attacgagga aagtgaaata3300

acgattttgt ccttagttat acttcgatta aaacatggct tcagaggctc cttcctgtaa3360

tgcgtatgga ttgatgtgca aaactgtttt gggcctgggc cgctctgtat ttgaactttg3420

ttacttttct cattttgttt gcaatcttgg ttgaacatta cattgataag cataaggtct3480

caagcgaagg gggtctacct ggttattttt ctttgaccct aagcacgttt ataaaataac3540

attgtttaaa atcgatagtg gacatcgggt aagtttggat aaattgtgag gtaagtaatg3600

agtttttgct ttttgttagt gatttgtaaa acttgttata aatgtacatt atccgtaatt3660

tcagtttaga gataacctat gtgctgacga caattaagaa taaaaactag ctgaaaaaat3720

gaaaataact atcgtgacaa gtaaccattt caaaagactg ctttgtgtct cataggagct3780

agtttgatca tttcagttaa ttttttcttt aatttttacg agtcatgaaa actacaggaa3840

aaaaaatctg aactgggttt taccactact ttttaggagt tgggagcatg cgaatggagg3900

gagagctccg tagaactggg atgagagcag caattaatgc tgcttgctag gaacaaaaaa3960

taattgattg aaaattacgt gtgacttttt agtttgcatt atgcgtttgt agcagttggt4020

cctggatatc actttctctc gtttgaggtt ttttaaccta gttaactttt aagacaggtt4080

tccttaacat tcataagtgc ccagaataca ggctttggct t4121

<210> 2

<211> 9288

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg aagcttatcg ataccggtgg cgcgccaatt240

gttactaaaa cagcttcaca tggcttaaaa taggggacca atgtcttttc caatctaagt300

cccatttata ataaagtcca tgttccattt ttaaaggaca atcctttcgg tttaaaacca360

ggcacgatta cccaaacaac tcacaacggt aaagcactgt gaatcttctc tgttctgcaa420

tcccaacttg gtttctgctc agaaaccctc cctctttcca atcggtaatt aaataacaaa480

aggaaaaaac ttaagatgct tcaaccccgt ttcgtgacac tttgaaaaaa gaatcacctc540

ttgcaaacac ccgctcccga cccccgccgc tgaagcccgg cgtccagagg cctaagcgcg600

ggtgcccgcc cccacccggg agcgcgggcc tcgtggtcag cgcatccgcg gggagaaaca660

aaggccgcgg cacgggggct caagggcact gcgccacacc gcacgcgcct acccccgcgc720

ggccacgtta actggcggtc gccgcagcct cgggacagcc ggccgcgcgc cgccaggctc780

gcggacgcgg gaccacgcgc cgccctccgg gaggcccaag tctcgaccca gccccgcgtg840

gcgctggggg agggggcgcc tccgccggaa cgcgggtggg ggaggggagg gggaaatgcg900

ctttgtctcg aaatggggca accgtcgcca cagctcccta ccccctcgag ggcagagcag960

tccccccact aactaccggg ctggccgcgc gccaggccag ccgcgaggcc accgcccgac1020

cctccactcc ttcccgcagc tcccggcgcg gggtccggcg agaaggggag gggaggggag1080

cggagaaccg ggcccccggg acgcgtgtgg catctgaagc accaccagcg agcgagagct1140

agagagaagg aaagccaccg acttcaccgc ctccgagctg ctccgggtcg cgggtctgca1200

gcgtctccgg ccctccgcgc ctacagctca agccacatcc gaagggggag ggagccggga1260

gctgcgcgcg gggccgccgg ggggaggggt ggcaccgccc acgccgggcg gccacgaagg1320

gcggggcagc gggcgcgcgc gcggcggggg gaggggccgg cgccgcgccc gctgggaatt1380

ggggccctag ggggagggcg gaggcgccga cgaccgcggc acttaccgtt cgcggcgtgg1440

cgcccggtgg tccccaaggg gagggaaggg ggaggcgggg cgaggacagt gaccggagtc1500

tcctcagcgg tggcttttct gcttggcagc ctcagcggct ggcgccaaaa ccggactccg1560

cccacttcct cgcccgccgg tgcgagggtg tggaatcctc cagacgctgg gggaggggga1620

gttgggagct taaaaactag tacccctttg ggaccacttt cagcagcgaa ctctcctgta1680

caccaggggt cagttccaca gacgcgggcc aggggtgggt cattgcggcg tgaacaataa1740

tttgactaga agttgattcg ggtgtttccg gaaggggccg agtcaatccg ccgagttggg1800

gcacggaaaa caaaaaggga aggctactaa gatttttctg gcgggggtta tcattggcgt1860

aactgcaggg accacctccc gggttgaggg ggctggatct ccaggctgcg gattaagccc1920

ctcccgtcgg cgttaatttc aaactgcgcg acgtttctca cctgccttcg ccaaggcagg1980

ggccgggacc ctattccaag aggtagtaac tagcaggact ctagccttcc gcaattcatt2040

gagcgcattt acggaagtaa cgtcgggtac tgtctctggc cgcaagggtg ggaggagtac2100

gcatttggcg taaggtgggg cgtagagcct tcccgccatt ggcggcggat agggcgttta2160

cgcgacggcc tgacgtagcg gaagacgcgt tagtgggggg gaaggttcta gaaaagcggc2220

ggcagcggct ctagcggcag tagcagcagc gccgggtccc gtgcggaggt gctcctcgca2280

gagttgtttc tcgagcagcg gcagttctca ctacagcgcc aggacgagtc cggttcgtgt2340

tcgtccgcgg agatcgatct ctctcatctc gctcggctgc gggaaatcgg gctgaagcga2400

ctgagtccgc gatggaggta acgggtttga aatcaatgag ttattgaaaa gggcatggcg2460

aggccgttgg cgcctcagtg gaagtcggcc agccgcctcc gtgggagaga ggcaggaaat2520

cggaccaatt cagtagcagt ggggcttaag gtttatgaac ggggtcttga gcggaggcct2580

gagcgtacaa acagcttccc caccctcagc ctcccggcgc catttccctt cactgggggt2640

gggggatggg gagctttcac atggcggacg ctgccccgct ggggtgaaag tggggcgcgg2700

aggcgggaat tcttattccc tttctaaagc acgctgcttc gggggccacg gcgtctcctc2760

ggcgagcgtt tcggcgggca gcaggtcctc gtgagcgagg ctgcggagct tcccctcccc2820

ctctctcccg ggaaccgatt tggcggccgc cattttcatg gctcgccttc ctctcagcgt2880

tttccttata actcttttat tttcttagtg tgctttctct atcaagaagt agaagtggtt2940

aactattttt tttttcttct cgggctgttt tcatatcgtt tcgaggtgga tttggagtgt3000

tttgtgagct tggatcttta gagtcctgcg cacctcatta aaggcgctca gccttcccct3060

cgatgaaatg gcgccattgc gttcggaagc cacaccgaag agcggggagg gggggtgctc3120

cgggtttgcg ggcccggttt cagagaagat atcaccaccc agggcgtcgg gccgggttca3180

atgcgagccg taggacaaag aaaccatttt atgtttttcc tgtctttttt ttcctttgag3240

taacggtttt atctgggtct gcagtcagta aaacgacaga tgaaccgcgg caaaataaac3300

ataaattgga agccatcggc cacgaggggc agggacgaag gtggttttct gggcggggga3360

gggatattcg cgtcagaatc ctttactgtt cttaaggatt ccgtttaagt tgtagagctg3420

actcatttta agtaatgttg ttactgagaa gtttaaccct tacgggacag atccatggac3480

ctttatagat gattacgagg aaagtgaaat aacgattttg tccttagtta tacttcgatt3540

aaaacatggc ttcagaggct ccttcctgta atgcgtatgg attgatgtgc aaaactgttt3600

tgggcctggg ccgctctgta tttgaacttt gttacttttc tcattttgtt tgcaatcttg3660

gttgaacatt acattgataa gcataaggtc tcaagcgaag ggggtctacc tggttatttt3720

tctttgaccc taagcacgtt tataaaataa cattgtttaa aatcgatagt ggacatcggg3780

taagtttgga taaattgtga ggtaagtaat gagtttttgc tttttgttag tgatttgtaa3840

aacttgttat aaatgtacat tatccgtaat ttcagtttag agataaccta tgtgctgacg3900

acaattaaga ataaaaacta gctgaaaaaa tgaaaataac tatcgtgaca agtaaccatt3960

tcaaaagact gctttgtgtc tcataggagc tagtttgatc atttcagtta attttttctt4020

taatttttac gagtcatgaa aactacagga aaaaaaatct gaactgggtt ttaccactac4080

tttttaggag ttgggagcat gcgaatggag ggagagctcc gtagaactgg gatgagagca4140

gcaattaatg ctgcttgcta ggaacaaaaa ataattgatt gaaaattacg tgtgactttt4200

tagtttgcat tatgcgtttg tagcagttgg tcctggatat cactttctct cgtttgaggt4260

tttttaacct agttaacttt taagacaggt ttccttaaca ttcataagtg cccagaatac4320

aggctttggc tttcgcgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag4380

ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt4440

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac4500

gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg4560

ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag4620

tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat4680

gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat4740

ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt4800

tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga4860

ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg4920

gtgggaggtc tatataagca gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct4980

tatcgaaatt aatacgactc actataggga gacccaagct ggctagcgtt taaacttaag5040

cttggtaccg agctcggatc cactagtcca gtgtggtgga attctgcaga tatccagcac5100

agtggcggcc gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc5160

cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag5220

gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta5280

ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag5340

acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca5400

gctggggctc tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg5460

tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg5520

ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg5580

ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt5640

agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt5700

tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta5760

tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa5820

atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg5880

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta5940

gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat6000

gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac6060

tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga6120

ggccgaggcc gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg6180

cctaggcttt tgcaaaaagc tcccatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc6240

cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc6300

acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc6360

ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg6420

gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc6480

ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc6540

ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg agtctcgccc6600

gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag6660

cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag6720

cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc6780

atgacccgca agcccggtgc ctgattcgaa atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca6840

tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc6900

cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac6960

cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc7020

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta7080

tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag7140

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc7200

ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc7260

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa7320

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg7380

ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg7440

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag7500

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac7560

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga7620

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt7680

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc7740

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc7800

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta7860

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat7920

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca7980

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct8040

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg8100

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag8160

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc8220

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact8280

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt8340

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta8400

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta8460

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc8520

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat8580

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt8640

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg8700

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca8760

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta8820

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg8880

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact8940

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg9000

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt9060

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga9120

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc9180

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa9240

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc9288

Claims (10)

1.一种遍在染色质开放表达元件，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的遍在染色质开放表达元件在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的遍在染色质开放表达元件，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的遍在染色质开放表达元件；所述遍在染色质开放表达元件位于表达载体表达框的启动子上游。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pCDNA-3.1。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述的启动子为CMV。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述的遍在染色质开放表达元件位于pCDNA-3.1载体CMV启动子上游NruI位点。

8.如权利要求3至7任一项所述的重组表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以1F-5'- CTAAAACAGCTTCACATGGCTT -3' 和

1R-5'- gagcacctccgcacgggacccggcgctgctgctact -3'为引物，

扩增HNRPA2B1/CBX3基因的3045-5058位点片段，得序列1；

（2）以2F-5'- agcagcgccgggtcccgtgcggaggtgctcctcgcag -3'和

2R-5'-TCGCGAaagccaaagcctgtattctgggcacttatga-3'为引物

扩增 HNRPA2B1/CBX3基因的5046-7125位点片段，得序列2；

（3）以步骤（1）得到的序列1和步骤（2）得到的序列2为模板，以3F-5'-TCGCGAagcttatcgataccggtggcgcgccaattgttactaaaacagcttcacatggctta-3'和2R-5'-TCGCGAaagccaaagcctgtattctgggcacttatga-3'为引物将序列1和序列2搭桥PCR扩增；得序列3，即HNRPA2B1/CBX3遍在染色质开放表达元件；

（4）将序列3和pCDNA3.1载体分别通过NruI限制性内切酶酶切，通过凝胶电泳后切胶回收，分别得pCDNA3.1载体NruI酶切线性化产物和HNRPA2B1/CBX3序列NruI酶切产物；

（5）将载体，pCDNA3.1载体NruI酶切线性化产物和片段，HNRPA2B1/CBX3序列NruI酶切产物通过连接酶连接、培养、克隆，得重组表达载体。

9.细胞表达系统，其特征在于：包含如权利要求3至7任一项所述的重组表达载体。

10.如权利要求3至7任一项所述的重组表达载体在表达重组蛋白方面的应用。