CZ294969B6 - Buňka použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů, plazmid pro transformaci této buňky, způsob produkce defektních rekombinantních adenovirů, takto získaný defektní rekombinantní adenovir a použití uvedené buňky pro produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV - Google Patents
Buňka použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů, plazmid pro transformaci této buňky, způsob produkce defektních rekombinantních adenovirů, takto získaný defektní rekombinantní adenovir a použití uvedené buňky pro produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV Download PDFInfo
- Publication number
- CZ294969B6 CZ294969B6 CZ19972306A CZ230697A CZ294969B6 CZ 294969 B6 CZ294969 B6 CZ 294969B6 CZ 19972306 A CZ19972306 A CZ 19972306A CZ 230697 A CZ230697 A CZ 230697A CZ 294969 B6 CZ294969 B6 CZ 294969B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- region
- cell
- adenovirus
- plasmid
- orf6
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/75—Fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Řešení se týká buňky pro produkci rekombinantních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4, obsahující ve formě vložené do svého genomu část oblasti E4 genomu adenoviru nesoucí čtecí rámec ORF6 pod kontrolou funkčního promotoru, přičemž tato část oblasti E4 neobsahuje funkční čtecí rámec ORF4, jakož i plazmidu pro transformaci této buňky. Vynález se dále týká způsobu produkce rekombinantních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4, při kterém se kultura uvedených buněk transformuje jedním nebo několika plazmidy přinášejícími různé oblasti genomu uvedeného defektního rekombinantního adenoviru, načež se izolují produkované viry, takto získaných defektních rekombinantních adenovirů a použití uvedených buněk pro produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV.ŕ
Description
Vynález se týká nových buněčných řad použitelných pro produkci defektních rekombinantních adenovirů. Vynález se zejména týká purifikovaných virálních preparátů produkovaných v těchto řadách, jakož i plazmidů umožňujících jejich konstrukci. Nové buněčné řady podle vynálezu umožňují transkomplementaci oblasti E4 a klonální produkci defektních rekombinantních adenovirů při dosažení zvýšených výtěžků, a to zejména v případě celku nebo části oblasti E4.
Dosavadní stav techniky
Adenoviry mají některé obzvláště výhodné vlastnosti pro použití ve funkci vektoru pro přenos genů v genové terapii. Z těchto vlastností lze zejména uvést, že mají dosti široké hostitelské spektrum, že jsou schopné infikovat kviescentní buňky, že se neintegrují do genomu infikované buňky a že nejsou implikovány až do dnešního dne ve vážnějších patologických stavech. Adenoviry byly takto použity pro přenos zainteresovaných genů do svalu (Ragot a kol., Nátuře 361 (1993) 647), játra (Jaffe a kol., Nátuře genetics 1 (1992) 372), nervového systému (Akli a kol., Nátuře genetics 3 (1993) 224), atd.
Adenoviry jsou viry s lineární dvouřetězcovou DNA o velikosti asi 36 kb. Jejich genom obsahuje zejména na každém konci obrácenou repetiční sekvenci (ITR), enkapsidační sekvenci (Psi), rané geny a pozdní geny (viz obr. 1). Základní rané geny jsou obsaženy v oblasti El, E2, E3 a E4. Z těchto genů jsou to zejména geny obsažené v oblasti El, které jsou nezbytné pro virální propagaci. Základní pozdní geny jsou obsaženy v oblasti LI až L5. Genom adenovirů Ad5 byl zcela sekvencován a je dostupný na bázi zjištěných údajů (viz zejména Genebank M73260). Stejně tak byly rovněž sekvencovány části nebo dokonce celky genomů ostatních adenovirů (Ad2, Ad7, Ad 12, atd.).
Za účelem použití adenovirů v genové terapii byly připraveny různé vektory odvozené od adenovir, ve kterých jsou inkorporovány různé geny (beta-gal, OTC, alfa-lAt, cytokiny, atd.). V každé z těchto konstrukcí byl adenovir modifikován způsobem, který ho činí neschopným replikace v infikované buňce. Takto jsou konstrukcemi popsanými v rámci dosavadního stavu techniky adenoviry s delecí oblasti El, která je podstatná pro replikaci viru a v jejíž úrovni jsou vloženy sekvence heterogelové DNA (Levrero a kol., Gene 101 (1991), 195; Gosh-Chodhury a kol., Gene 50 (1986) 161). Tyto adenoviry jsou produkovány v komplementační řadě (řada 293), do které byla integrována část genomu adenovirů. Přesněji specifikováno, řada 293 obsahuje levý konec (asi 11 až 12 %) genomu adenovirového sérotypu 5 (Ad5), obsahující levou obrácenou repetiční sekvenci ITR, enkapsidační oblast, oblast El zahrnující Ela, Elb, oblast kódující protein pIX a část oblasti kódující protein pIVa2. Tato řada je schopna transkomplementovat defektní adenoviry s defektem v oblasti El, tzn. adenoviry, které jsou zbaveny celku nebo části oblasti El, a produkovat virální základní materiál se zvýšeným titrem. Nicméně vektory deficitní v oblasti El (vektory ET, nazývané vektory první generace) mají některé nedostatky, které jsou nežádoucí při jejich použití. Zejména nemusí být vždy zcela defektní, pokud jde o replikaci in vivo, a to zejména z důvodu některých transkomplementámích buněčných funkcí. Takto byla prokázána transkomplementární buněčných funkcí. Takto byla prokázána transkomplementární aktivita oblasti El v buňkách embryonálního karcinomu F9 (Inperiale a kol., Mol. Cell. Biol. 4, 1984, 867-874). Aktivita stejného typu regulovaná interleukinem-6 byla rovněž prokázána (Spergel a kol., J. Virol. 66, 1992, 1021-1030). Dalšími nedostatky
-1 CZ 294969 B6 spojenými s těmito vektory jsou přítomnost četných virových genů schopných exprimování in vivo po přenosu genů a indukovat imunitní nebo/a zánětovou odezvu.
Za účelem eliminace těchto nedostatků bylo navrženo realizovat v genomu adenoviru další delece nebo modifikace. Takto byla do mutantu tsl25 zavedena přesná termosenzibilní mutace umožňující inaktivovat vazebný protein s DNA (DBP) s molekulovou hmotností 72 kDa (Van der Vliet et Sůssenbach, Virology 67, 1975, 415-426). Tyto vektory mohou být rovněž produkovány s vysokými titry v buňkách řady 293 při přípustné teplotě (32 °C). Nicméně tento typ vektoru vykazuje také určitý počet nedostatků, mezi které patří nadexprese in vivo oblasti E4, existence přesné mutace, která je jako taková náchylná k reverzi, riziko částečné aktivity při teplotě 37 °C a podobně.
Další způsob eliminace uvedených problémů spočívá v deleci jiné oblasti, která je důležitá pro replikaci nebo/a propagaci viru. V tomto ohledu se přihlašovatel zajímal zejména o oblast E4. Oblast E4 je ve skutečnosti implikovaná při regulaci exprese pozdních genů, v rámci stability pozdních jádrových RNA, při extinkci exprese proteinů hostitelské buňky a v rámci účinnosti replikace virové DNA. Adenovirové vektory, ve kterých byly deleci odstraněny oblasti El a E4 mají takto transkripční pozadí (transkripční šum) a velmi sníženou expresi virových genů (viz zejména patentová přihláška PCT/FR94/00851). Avšak konstrukce a průmyslové a terapeutické využití takových vektorů vyžaduje mít k dispozici účinný systém transkomplementace obou uvedených funkcí za účelem produkce virového základního materiálu.
Podstata vynálezu
Vynález přináší řešení tohoto problému. Vynález ve skutečnosti poskytuje buněčné řady umožňující transkomplementaci oblasti E4 a klonální produkci s dosažením vysokých titrů rekombinantních adenovirů defektních v uvedené oblasti. Buněčné řady podle vynálezu jsou výhodně schopné transkomplementovat obě funkce El a E4 a umožňují tak produkovat viry deficitní v těchto dvou funkcích. Vynález rovněž poskytuje plazmidy umožňující konstrukci uvedených buněčných řad, způsob přípravy defektních rekombinantních adenovirů a purifíkovaných virových základních materiálů. Přihlašovatel nyní zejména prokázal, že produkční řady schopné transkomplementovat účinně oblast E4 se získají zavedením pouze části oblasti E4. V případě, že je přítomna pouze redukovaná funkční jednotka oblasti E4 odpovídající čtecí fázi ORF6 nebo čtecím fázím ORF6 a ORF6/7, se získají buněčné řady mající obzvláště výhodné vlastnosti.
Předmětem vynálezu je buňka pro produkci rekombinantních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4, obsahující ve formě vložené do svého genomu část oblasti E4 genomu adenoviru nesoucí čtecí rámec ORF6 pod kontrolou funkčního promotoru, přičemž tato část oblasti E4 neobsahuje funkční čtecí rámec ORF4.
Část oblasti E4 buňky má výhodně délku menší než 2 kb.
Část oblasti E4 buňky výhodně obsahuje čtecí rámec ORF6 a ORF6/7.
Část oblasti E4 buňky výhodně pochází z genomu lidského adenoviru skupiny C.
Oblast E4 buňky výhodně pochází z genomu adenoviru Ad2 nebo Ad5.
Promotorem je výhodně indukovatelný promotor.
Promotor je výhodně zvolen z množiny zahrnující promotor MMTV a jeho deriváty.
Část oblasti E4 buňky výhodně obsahuje čtecí rámec ORF6 sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptoru, která je zodpovědná za rozpoznání svého specifického ligandů.
-2CZ 294969 B6
Doménou jádrového receptoru buňky je výhodně doména fixace hormonu receptoru ke glukokortikoidům (HBD-GCR).
V buňce je výhodně čtecí rámec ORF6 sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptoru zodpovědnou za rozpoznání svého specifického ligandů vložena pod kontrolu indukovatelného promotoru, který vykazuje odezvu vůči glukokortikoidům.
V buňce je výhodně indukovatelným promotorem promotor GRE5.
Buňka je výhodně odvozena z buňky, která transkomplementuje oblast El.
Buňka je výhodně odvozena z buněčné řady 293.
Buňka je výhodně odvozena z buněk KB, Hela, MDCK, Věro nebo gmDBPó.
Buňka je výhodně odvozena z primární buněčné kultury.
Buňka je výhodně použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů deficitních alespoň v oblasti E4 a obsahuje ve formě vložené do svého genomu fragment BglII odpovídající nukleotidům 34115-32490 genomu Ad5. Touto buňkou je výhodně buňka buněčné řady 293, výhodněji buňka buněčné řady 293 transformované plazmidem, ve kterém část oblasti E4 genomu adenovirů nese čtecí rámec ORF6 a ORF6/7.
Výhodně buňka obsahuje ve formě vložené ve svém genomu fragment BglII-PVUII odpovídající nukleotidům 34115-33126 genomu Ad5.
Buňka výhodně obsahuje ve formě vložené do svého genomu chimérický gen obsahující čtecí rámec ORF6 genomu adenovirů na jednom ze svých konců s vazebnou doménou hormonu receptoru ke glukokortikoidům.
Buňkou je vhodně buňka buněčné řady 293 transformované plazmidem, ve kterém část oblasti E4 genomu adenovirů nese čtecí rámec ORF6 genomu adenovirů sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptoru zodpovědnou za rozpoznání specifického ligandů.
Předmětem vynálezu je rovněž plazmid obsahující část oblasti E4 genomu adenovirů nesoucí čtecí rámec ORF6 pod kontrolou indukovatelného heterogenního promotoru, přičemž tato část oblasti E4 neobsahuje funkční čtecí rámec ORF4.
V plazmidu výhodně část oblasti E4 genomu adenovirů nese čtecí rámec ORF6 a ORF6/7.
V plazmidu výhodně část oblasti E4 genomu adenovirů nese čtecí rámec ORF6 genomu adenovirů sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptoru zodpovědnou za rozpoznání svého specifického ligandů.
Buňka může být výhodně použita pro produkci rekombinančních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4.
Předmětem vynálezu je dále způsob produkce rekombinantních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4, jehož podstata spočívá v tom, že se kultura výše definovaných buněk transformuje jedním nebo několika plazmidy přinášejícími různé oblasti genomu uvedeného detektivního rekombinantního adenovirů, načež se izolují produkované viry.
Výhodně se tento způsob použije pro produkci rekombinantních adenovirů defektních v oblastech El a E4.
-3 CZ 294969 B6
Předmětem vynálezu je rovněž defektní rekombinantní adenovirus deltaEl, ORF3', ORF6“ obsahující deleci celku nebo části oblasti El a nukleotidů 34801-34329 a 34115-33126 v oblasti E4.
Předmětem vynálezu je také defektní rekombinantní adenovirus deltaEl, deltaE4, ORF1+ obsahující deleci celku nebo části oblasti E4 a deleci oblasti E4 s výjimkou čtecího rámce ORF1.
Uvedený defektní rekombinantní adenovirus výhodně obsahuje deleci oblasti El a deleci fragmentu, jehož 5-konec je obsažen ve čtecím rámci ORF7 a jehož 3'-konec je situován ve čtecím rámci ORF2.
Uvedený defektní rekombinantní adenovirus obsahuje výhodně deleci v oblasti E4 pokrývající nukleotidy 33093 až 35053.
Předmětem vynálezu je dále defektní rekombinantní adenovirus deltaEl, deltaE4, ORF4+ obsahující deleci celku nebo části oblasti E4 s výjimkou čtecího rámce ORF4.
Uvedený defektní rekombinantní adenovirus výhodně obsahuje deleci v oblasti El, deleci fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen ve čtecím rámci ORF7 a jehož 3'-konec je situován ve čtecím rámci ORF6, a deleci fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen ve čtecím rámci ORF3 a jehož 3'-konec je situován ve čtecím rámci ORF1 nebo v promotorové oblasti E4.
Uvedený defektní rekombinantní adenovirus výhodně obsahuje deleci oblasti El, deleci pokrývající nukleotidy 33093(SmaI)-33695 a deleci pokrývající nukleotidy 34634-35355 (Smál).
Předmětem vynálezu je rovněž defektní rekombinantní adenovirus deltaEl, deltaE4 obsahující deleci celku nebo části oblasti El a deleci pokrývající celek oblasti E4, zvolenou z množiny zahrnující následující delece: nukleotidy 32720-35835, 33466-35355 a 33093-35355.
Předmětem vynálezu je konečně použití výše definovaných buněk při způsobu produkce rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV.
Předmětem vynálezu je výhodně použití uvedených buněk při způsobu produkce rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV, při kterém se do kultury buněk zavede plazmid AA nesoucí zainteresovanou nukleovou kyselinu lemovanou sekvencemi ITR od AAV, adenovir helper a funkce Rep a Cap od AAV a při kterém se následně izolují produkované viry.
V rámci uvedeného použití je výhodně kulturou buněk kultura buněk obsahující celou oblast E4.
V rámci uvedeného použití je výhodně kulturou buněk kultura buněk obsahující čtecí rámec ORF6 a případně čtecí rámec ORF6/7.
V rámci uvedeného použití je výhodně adenovirem helper lidský adenovir defektní v oblasti E4.
V rámci uvedeného použití je výhodně adenovirem helper lidský adenovir defektní v oblasti El aE4.
V rámci uvedeného použití je výhodně adenovirem helper defektní psí adenovir.
V rámci uvedeného použití je výhodně adenovirem helper adenovir zvolený z množiny zahrnující kmeny CAV2.
V rámci uvedeného použití jsou výhodně funkcemi Rep a Cap funkce zavedené kotransfekcí buněk plazmidem nesoucím oblasti Rep a Cap od AAV.
-4CZ 294969 B6
V rámci uvedeného použití jsou výhodně zavedenými plazmidy plazmidy transfekované v přítomnosti činidla zkompaktňujícího nukleové kyseliny a kationtového lipidu.
V rámci uvedeného použití se výhodně uvedené buňky použijí při způsobu produkce rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV, při kterém se do kultury buněk kontransfekuje v přítomnosti polykationtového lipidu a zkompaktňujícího činidla plazmid AAV nesoucí zainteresovanou nukleovou kyselinu lemovanou sekvencemi IRE od AAV a plazmid nesoucí oblasti Rep a Cap od AAV, při kterém se následně uvedená kultura buněk koinfíkuje adenovirem helper zvoleným z množiny zahrnující adenoviry lidského původu Ad2 nebo Ad5 defektní v oblastech El a E4 a adenoviry psího původu CAV2 a při kterém se následně produkované viry izolují.
Jak již bylo uvedeno výše, mají buněčné řady podle vynálezu obzvláště výhodné vlastnosti. Tyto buněčné řady především umožňují transkomplementaci funkcí El a E4. Avšak jsou obzvláště výhodně schopné indukovat tvorbu pláží virů nedostatečných ve svých funkcích, což je nezbytné pro klonování rekombinantních virů a potom pro jejich amplifikaci a jejich purifíkaci. V tomto ohledu přihlašovatel ve skutečnosti prokázal, že buněčné řady obsahující celek oblasti E4 nebo větší funkční jednotky, zahrnující například čtecí fázi ORFS4, jsou neschopné tvořit pláže virů nedostatečných v oblasti E4. Identifikace specifických funkčních jednotek oblasti E4 umožňuje realizaci velmi účinného transkomplementačního a produkčního systému virů defektních v oblastech El a E4. Další výhody buněčných řad podle vynálezu spočívají zejména v jejich způsobilosti amplifikace v kapalném prostředí takových virů deficitních v oblastech El a E4 a ve vysokých titrech, které tyto řady produkují, jakož i v nepřítomnosti kontaminujících replikačních virových částic.
Oblast E4 adenovirového genomu je tvořena 7 otevřenými čtecími fázemi, které se označují jako ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 a ORF6/7 (obr. 2 a 3). Jak již bylo uvedeno výše, jsou buňky podle vynálezu charakterizovány zejména přítomností pouze části této oblasti zahrnující čtecí fázi ORF6, která je případně sdružená se čtecí fází ORF6/7. Je obzvláště důležité, aby část oblasti E4 přítomná v buňkách podle vynálezu neobsahovala funkční čtecí fázi ORF4. Výhodně oblast E4 přítomná v buňkách podle vynálezu neobsahuje funkční čtecí fázi ORF1ORF4. Výhodně je oblast E4 přítomná v buňkách podle vynálezu zbavená delecí alespoň částí čtecích fází ORF1-ORF4. Tyto různé části oblasti E4 mohou být získány enzymatickými řezy nebo modifikovány metodami, které jsou v dané oblasti známé. V rámci výhodné formy provedení obsahují buněčné řady podle vynálezu vložený fragment obsahující alespoň 2 kb oblasti E4 genomu adenoviru obsahující celek čtecích fází ORF6 a případně ORF6/7. Jako výhodné příklady lze uvést skutečnosti, že čtecí fáze ORF6 může být izolována z oblasti E4 ve formě fragmentu BglII-PvuII odpovídajícího nukleotidům 34115-33126, zatímco čtecí fáze ORF6ORF6/7 mohou být izolovány z oblasti E4 ve formě fragmentu BglII—BglII odpovídajícího nukleotidům 34115-32490 genomu Ad5. V rámci specifické formy provedení vynálezu se čtecí fáze ORF6 sloučí v translační fázi s doménou jádrového receptoru, která je zodpovědná za rozpoznání jeho specifického ligandu. Výhodně je zvolena doména vázání hormonu (HBD: Hormone Binding Domain) receptoru ke glukokortikoidům (GCR: Hollenbert a kol., 1985, Nátuře, 318, 635-341), neboť umožňuje zadržet v cytoplazmické oblasti buňky fúzní protein v nepřítomnosti hormonu (T. Mattioni a kol., 1994, Methods in Cell Biology, Kápl 16, 335-352), díly stabilní interakci domény HBD (GCR) s cytoplazmovým proteinem hsp90 a ostatními kofektory (S.P. Bohem a kol., 1995, Science, 268, 1303-1304). Přítomnost hormonu vyvolává translokaci fúzního proteinu cytoplazmy v jádru, což umožňuje funkčnost aktivity ORF6 oblasti E4 v jádrové oblasti. Rovněž je možné, že přídavek hormonu vyvolává odmaskování funkčních domén aktivity ORF6 mechanismem transkonfekční změny hybridního proteinu.
V tomto ohledu spočívá obzvláště výhodné provedení způsobu podle vynálezu v tom, že buňka obsahuje ve formě vložené do svého genomu fragment BglII—BglII odpovídající nukleotidům 34115-32490 genomu Ad5. Tento fragment je přítomen zejména v plazmidu pORFóGen
-5 CZ 294969 B6 popsaném v příkladech a použitém pro konstrukci buněčné řady-klon//2. V rámci jiného obzvláště výhodného provedení vynálezu obsahuje buňka ve formě vložené ve svém genomu fragment BglII-PvuII odpovídající nukleotidům 34115-33126 genomu Ad5. V rámci jiného provedení vynálezu je alespoň oblast ORF6 kopulována s doménou HBD receptorů GCR a to buď na C-terminálním konci (fúze GCR-ORF6), nebo na N-terminálním konci (fúze ORF6GCR). V případě C-terminální fúze je sekvence viru kódující ORF6 a ORF7 výhodně vložena v translační fázi za sekvence specifikující doménu HBD receptorů GCR. V rámci této specifické formy provedení generuje exprese chimérického genu takto primární RNA, jejíž produkt translace je protein GCR-ORF6 (SEQ ID n°7). Alternativní svázání tohoto transkriptu zase generuje mediátorovou RNA, která kóduje fúzní protein GCR-ORF6/7 (viz příklad 1.5).
Část oblasti E4 přítomná v buňkách podle vynálezu může pocházet z adenovirů různých původů nebo sérotypů. Ve skutečnosti existují různé sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, avšak také mají srovnatelnou generickou organizaci. Zejména může oblast E4 přítomná v buňkách podle vynálezu pocházet z adenovirů lidského nebo zvířecího původu.
Pokud jde o adenoviry lidského původu, lze výhodně citovat adenoviry klasifikované ve skupině C. Ještě výhodněji se z různých sérotypů lidského adenovirů dává přednost v rámci vynálezu adenovirům typu 2 nebo (Ad2 nebo Ad5). Z různých adenovirů živočišného původu se dává přednost použití v rámci vynálezu adenovirům psího původu, a to zejména všem kmenům adenovirů CAV2/kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800) jsou příklady takových adenovirů). Další adenoviry zvířecího původu jsou uvedeny zejména v patentové přihlášce WO94/26914.
V rámci výhodného provedení vynálezu pochází část oblasti E4 z genomu lidského adenovirů skupiny C. Ještě výhodněji pochází uvedená část z genomu adenovirů Ad2 nebo Ad5.
Jak již bylo uvedeno výše, je část oblasti E4 přítomná v buňkách podle vynálezu vložena pod kontrolu funkčního promotoru v uvedených buňkách. Výhodně se jedná o indukovatelný promotor umožňující kontrolovat hladiny nebo/a periody exprese uvedených genů. Obzvláště výhodně se jedná o promotor LTD od MMTV (Pharmacia), který je indukován dexamethasonem nebo o promotor regulovaný tetracyklinem (WO94/29442, WO94/04672). Samozřejmě mohou být použity i další promotory a zejména varianty LTR od MMTV nesoucí například heterologní regulační oblasti (zejména oblasti „enhancef‘).
V rámci specifického provedení vynálezu je exprese hybridních genů pod kontrolou regulovaných promotorů, aby se eliminovala konstitutivní akumulace fúzního proteinu v cytoplazmě nebo za účelem minimalizace „úniku“ do jádrové oblasti a určité cytotoxicity. V rámci ještě specifičtějšího provedení vynálezu je chimérický gen pod kontrolou indukovatelného promotoru, který vykazuje odezvu na glukokortikoidy jako například promotor GRE5 (S. Maděr a J. White, 1993, PNAS, 90, 5603-5607, viz příklad 1.5).
Buňky podle vynálezu mohou být připraveny z různých farmaceuticky použitelných buněk, tj. kultivovatelných za průmyslově přijatelných podmínek, které nemají povahu poznaného patogenu. Může se jednat o uložení buněčné řady nebo o primární kultury a zejména o buňky embryonální lidské sítnice. Jedná se výhodně o buňky lidského původu, které jsou infíkovatelné adenovirem. V tomto ohledu lze citovat buňky KB, Hela, 293, Věro, gmDBP6, atd.
Buňky řady KB pochází z lidského epidermálního karcinomu. Tyto buňky jsou dostupné v ATCC (ref. CCL17), stejně jako podmínky umožňující jejich kultivaci. Rada lidských buněk Hela pochází z karcinomu lidského epitelu. Tato řada je také dostupná v ATCC (ref. CCL2), jakož i podmínky umožňující kultivaci buněk této řady. Buňky řady 293 jsou buňkami z embryonální lidské ledviny (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Tato řada zejména obsahuje ve formě integrované ve svém genomu levou část genomu lidského adenovirů Ad5 (12 %). Buněčná řada
-6CZ 294969 B6 gmDBPó (Brough a kol., Virology 190 (1992)624) je tvořena buňkami Hela nesoucím gen E2 adenoviru pod kontrolou LTR od MMTV.
Rovněž se může jednat o buňky psího původu (BHK, MDCK, atd.). V tomto ohledu jsou výhodnými buňkami psí buňky řady MDCK. Podmínky kultivace buněk MDCK byly popsané zejména Macatney-em a kol., Science 44(1988)9.
Buněčné řady podle vynálezu mohou být konstruovány různými způsoby. Obecně se tyto buněčné řady připraví transformací buněčné kultury plazmidem nesoucím vybraný fragment oblasti E4 pod kontrolou funkčního promotoru. Transfekce buněk může být provedena libovolnou známou technikou a zejména v přítomnosti fosforečnanu vápenatého, elektroporací, atd.
V rámci specifické formy provedení vynálezu nese použitý plazmid rovněž značkovací gen umožňující identifikovat a selektovat transformované buňky. Může se zejména jednat o libovolný gen rezistence vůči antibiotiku (geneticin, hygromycin, atd.). Značkovací gen může být rovněž nesen oddělenou konstrukcí která je ko-transfekovaná plazmidem. Po transfekci a selekci na značkovací gen mohou být získané buňky selektované podle jejich kapacity transkomplementovat adenoviry zbavené oblasti E4. Za tím účelem mohou být použity různé mutantní adenoviry defektivní v různých částech oblasti E4, zejména například adenoviry Ad2dll808 (Weinberg a Ketner, J. Virol. 57(1986)833), Ad5dll004, dli007 nebo dll014 (Bridge a Ketner, J. Virol. 63 (1989)631), dllOll (Bridge a kol., Virology 193 (1993)794), jak to bude uvedeno v příkladech.
Výhodně jsou buňky podle vynálezu rovněž schopné transkompletovat oblast El. Tyto mohou být konstruovány, jak to již bylo uvedeno výše, z buněk, které již transkompletují oblast El (příklad: buňky 293), nebo sekvenční zavedením konstrukce přinášející oblast El a konstrukce přinášející oblast E4 podle vynálezu, například do retinoblastů lidského původu.
V rámci obzvláště výhodného provedení vynálezu jsou buňky podle vynálezu odvozeny od buněčné řady 293. V tomto ohledu byly obzvláště výhodné výsledky získány s buňkami řady 293 transformovanými plazmidem pORFóGen nebo plazmidem pGGO, který kóduje protein HBDORF6 a HBD-ORF6/7.
Vynález rovněž popisuje konstrukci plazmidů obsahujících část oblasti E4 genomu adenoviru nesoucí čtecí fázi ORF6 nebo ORF6 a ORF6/7 pod kontrolou indukovatelného promotoru (viz zejména plazmidy pORFóGen a pGGO). Tyto plazmidy mohou být použity přímo pro transfekci zvolené buněčné populace s potom selekcí pro identifikaci buněk, které stabilně získaly funkci E4.
Dalším předmětem vynálezu je použití výše popsaných buněk pro produkci rekombinantních adenovirů defektivních alespoň v oblasti E4. Vynález ve skutečnosti poskytuje obzvláště výhodný způsob produkce rekombinantních adenovirů defektivních alespoň v oblasti E4, při kterém se používají výše uvedené buňky. Při tomto způsobu se buněčné kultury, které byly popsány výše, transformují jedním nebo několika plazmidy přinášející různé oblasti genomu uvedeného defektního rekombinantního adenoviru, načež se izolují produkované viry. Tento způsob je obzvláště výhodný pro produkci adenovirů majících nefunkční oblasti El a E4. Jedná se zejména o vektory, ve kterých byly oblasti El a E4 inaktivované nebo učiněné nefunkčními úplnou nebo částečnou delecí. Takové modifikované mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, například pomocí technik genetického inženýrství nebo také pomocí mutagenních činidel. Genetická modifikace nebo genetické modifikace mohou být lokalizované do části kódující uvedenou oblast nebo mimo kódující oblast a například do oblastí zodpovědných za expresi nebo/a regulaci transkripce uvedených genů. Uvedená delece může být provedena digescí pomocí příslušných restrikčních enzymů a potom ligací technikami, které jsou klasicky používané v oblasti molekulární biologie.
-7CZ 294969 B6
V rámci obzvláště výhodného provedení vynálezu se způsob podle vynálezu používá pro produkci rekombinantních adenovirů, ve kterých oblast El je inaktivována delecí fragmentu PvuII-BglII sahajícího od nukleotidu 454 až k nukleotidu 3328 v sekvenci adenovirů Ad5. Tato sekvence je dostupná v literatuře a rovněž na bázi uložených údajů (viz zejména Genebank n°73260). Při jiném výhodném provedení vynálezu je oblast El inaktivována delecí fragment HifII-Sau3A sahajícího od nukleotidu 382 až k nukleotidu 3446. V rámci specifického provedení uvedený způsob umožňuje produkci vektoru zahrnujícího deleci celku nebo části oblasti E4. To může být realizováno vyříznutím fragmentu Maell-MscI odpovídajícího nukleotidům 35835 až 32720. Buněčné řady podle vynálezu jsou ve skutečnosti neschopné transkompletovat a amplifíkovat adenoviry nesoucí libovolný typ delece nebo inaktivace oblasti E4. V rámci jiného specifického provedení vynálezu je odstraněna delecí pouze funkční část oblasti E4. Tato část zahrnuje alespoň fáze ORF3 a ORF6. Jako příklad lze uvést, že tyto kódující fáze mohou být odstraněny delecí z genomu ve formě fragmentů PvuII-Alil a BglII-PvuII odpovídajících nukleotidům 34801-34329 resp. 34115-33126. V rámci vynálezu mohou být rovněž použit delece oblasti E4 viru Ad2 dl808 nebo virů Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllOll nebo Ad5 dll014. V tomto ohledu jsou buňky podle vynálezu obzvláště výhodné pro produkci viru obsahujícího inaktivní oblast El nebo deleci v oblasti E4 typu delece přítomné v genomu Ad5 dll014, tj. viru E4“ zachovávajícího si čtecí fázi ORF4.
Vynález tedy rovněž popisuje defektivní rekombinantní adenoviry, jejichž genom obsahuje deleci v oblasti El a deleci v oblasti E4. Zejména popisuje defektní rekombinantní adenoviry, jejichž genom zahrnuje deleci v oblasti El a deleci v oblasti E4 odpovídající alespoň čtecím fázím ORF3 a ORF6. Adenoviry podle vynálezu takto výhodně obsahují následující delece zasahující celek nebo část oblasti El a E4:
- adenovirus deltaEl, ORF3 , ORF6 : delece celku nebo části oblasti El a nukleotidů 34801-34329 a 34115-33126 oblasti E4.
- adenovirus deltaEl, deltaE4, ORF1+: delece celku nebo části oblasti El a oblasti E4 s výjimkou čtecí fáze ORF1. Tato delece v oblasti E4 pokrývá výhodně nukleotidy 33093 (Smál) až 35053 (AccIII). Získá se například z mutantu Ad5 dl 1004. Pro realizaci adenovirů deltaEl, deltaE4, ORF1+ podle vynálezu mohou být použity i další delece, a to na bázi informací uvedených v přihlášce vynálezu a nukleotidové sekvence SEQ ID n°4. Tato dvouřetězcová sekvence představuje pravou část adenovirálního genomu zahrnující oblasti E4 a pravou obrácenou repetiční sekvenci nukleotidu 32749 (1 na SEQ ID n°4) až nukleotidu 35935 (3186 na SEQ ID n°4). Jedná se o čistě ilustrativní sekvenci, přičemž mohou být rovněž použity i další publikované sekvence. Jednotlivé čtecí fáze oblasti E4 jsou označeny jako ORF7, ORF6, ORF4, ORF3, ORF2 a ORF1. Adenovir delta El, deltaE4, ORF1+ podle vynálezu výhodně zahrnuje deleci v oblasti El a deleci fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen ve čtecí fázi ORF7 a jehož 3'-konec je situován ve čtecí fázi ORF2. Ještě výhodněji se delece týká fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen mezi nukleotidy 32920 až 33190 genomu adenovirů a jehož 3'-konec je obsažen mezi nukleotidy 34710 až 35090 adenovirálního genomu. Tato delece odpovídá nukleotidům 170 až 440 (konec 5') a 1960 až 2340 (konec 3') na sekvenci SEQ IN n°4.
- adenovir deltaEl, deltaE4, ORF4+: delece celku nebo části oblasti El a oblast E4 s výjimkou čtecí fáze ORF4. Adenovir deltaEl, deltaE4, ORF4+ podle vynálezu výhodně zahrnuje deleci oblasti El, deleci fragmentu, jehož konec 5' je obsažen ve čtecí fázi ORF7 a jehož konec 3' je situován do čtecí fáze ORF6 (s výjimkou části přesahující čtecí fáze ORF4) a deleci fragmentu, jehož konec 5' je obsažen ve čtecí fázi ORF3 a jehož konec 3' je situován do čtecí fáze ORF1 nebo do promoční oblasti E4. Výhodněji tyto adenoviry podle vynálezu obsahují:
-8CZ 294969 B6
i) deleci celku nebo části oblasti El, ii) deleci fragmentu, jehož konec 5' je obsažen mezi nukleotidy 32920 až 33190 genomu adenoviru a jehož konec 3' je obsažen mezi nukleotidy 33200 až 34000 adenovirálnímu genomu a iii) deleci fragmentu, jehož konec 5' je obsažen mezi nukleotidy 34360 až 34700 genomu adenoviru a jehož konec 3' je obsažen mezi nukleotidy 35150 až 35530 adenovirálního genomu.
Odpovídajícími polohami delece ii) v sekvenci SEQ ID n°4 jsou 180 až 445 (konec 5' až 450 až 1250 (konec 3'. Odpovídajícími polohami delece iii) v sekvenci SEQ ID n°4 jsou 1610 až 1950 (konec 5') a 2410 až 2870 (konec 3').
Tyto delece oblasti E4 výhodně pokrývají nukleotidy 33093 (SmaI)-33695 (SspI)—35355 (Smál). Tyto delece mohou být získány například z mutantu Ad5 dl 1014.
- adenovirus deltaEl, deltaE4: delece celku nebo části oblasti El a nukleotidů 32720 až 35835 nebo 33466 až 35355 (tato delece může být získána například z mutantů Ad5 dl 1011). Tyto tři delece pokrývají celek oblasti E4.
Jak již bylo uvedeno výše, pokrývá delece v oblasti El výhodně celek nebo část oblastí El A aElB. Tato delece musí být dostatečná ktomu, aby učinila vir neschopný autonomní replikace v buňce. Část odstraněná deleci v oblasti El v adenovirech podle vynálezu výhodně pokrývá nukleotidy 545-3328 nebo 382-3446.
Výše uvedená polohy se vztahují k sekvenci divokého adenoviru Ad5, tak, jak byl publikován a zpřístupněn na základě charakteristických údajů. Ačkoliv mohou existovat mezi různými sérotypy adenovirů určité malé rozdíly, jsou uvedené polohy obecně použitelné při konstrukci rekombinantních adenovirů podle vynálezu z libovolného sérotypu, a to zejména adenovirů Ad2 aAd7.
Jinak mohou adenoviry podle vynálezu mít i další změny v úrovni jejich genomu. Takto mohou být zejména deleci odstraněny i další oblasti, a to za účelem zvýšení kapacity viru a snížení vedlejších účinků, které jsou spojeny s expresí virálních genů. Tak například může být deleci odstraněn celek nebo část oblasti E3 nebo IVa2. Pokud jde o uvedenou oblast E3, může být obzvláště výhodné zachovat část kódující protein gpl9K. Tento protein ve skutečnosti umožňuje zabránit tomu aby byl adenovirový vektor předmětem imunitní reakce, která by 1) omezovala jeho účinek a 2) mohla by vyvolat nežádoucí sekundární účinky. V rámci specifické formy provede vynálezu se deleci odstraní oblast E3 a sekvence kódující protein gpl9K se opětovně zavede pod kontrolou heterologního promotoru.
Rekombinantní adenoviry podle vynálezu mají vlastnosti, které jsou obzvláště žádoucí pro použití v genové terapii. V těchto vektorech dochází ve skutečnosti ke kombinaci vysoké míry infekčních vlastností, bezpečnostních faktorů (riziko imunitní nebo/a zánětové reakce je zde silně omezeno) a kapacity přenosu genů. Navíc buněčné řady podle vynálezu umožňují produkci základního virálního materiálu, který je zcela prost kontaminujících replikačních částic (RCA). Získané výsledky ukazují, že v rámci vynálezu dosáhne konstrukce a produkce adenovirů defektní v oblastech El a E4 a prostých kontaminujících replikačních částic. Zejména není při použití buněčných řad pole vynálezu možné, aby se při produkci virů deltaEl, deltaE4, ORF1+, deltaEl, deltaE4+ nebo deltaEl, delta E4 podle vynálezu vyskytovaly kontaminující replikační částice E4+, protože tyto viry neobsahují sekvence pokrývající z jedné i druhé strany oblast integrovanou do genomu buňky (obr. 3) a kromě toho jednoduchý homologní rekombinační fenomen mezi buněčnými a virálními oblastmi by generoval neživotný vir zbavený pravé
-9CZ 294969 B6 obrácené repetiční sekvence ITR. Další výhoda virů podle vynálezu spočívá v jejich zvýšené klonovací kapacitě, která umožňuje vložení transgenů se značnou velikostí (vyšší než 10 kb). To zejména umožňuje použití regulačních sekvencí transkripce, umožňující zlepšení účinnosti, regulace a doby exprese. To navíc umožňuje použít menší dávky viru a dosáhnout srovnatelného terapeutického účinku při velmi snížených sekundárních účincích.
Jak již to bylo uvedeno výše, tvoří adenoviry velmi účinné vektory pro přenos genů v genové a buněčné terapii. V rámci takového přenosu mohou být do jejich genomu vložena heterologní sekvence nukleové kyseliny, jejíž přenos nebo/a exprese v buňce, orgánu nebo v organismu jsou žádoucí. Tato sekvence může zahrnovat jeden nebo několik terapeutických genů, mezi které patří například gen, jehož transkripce a případně translace v cílové buňce generuje produkty mající terapeutický účinek. Jako příklady takových terapeutických produktů lze zejména uvést enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd. (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atd., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (WO94/25073), dystrofin nebo minidystrofin (WO93/06223), protinádorové supresní geny: p53, Rb, RaplS, DCC, k-rev, atd. (WO94/24297), geny kódující faktory implikované v rámci koagulace: faktory VII, VIII, IX, atd., sebevražedné geny: thymidin-kináza, cytosindesamináza, atd., nebo také celek nebo část přirozeného nebo umělého imunoglobulinu (Fab, ScFv, atd., WO94/29446), atd. Terapeutickým genem může být rovněž gen nebo antimediátorová sekvence, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na komplementární RNA buněčných RNAm blokovat takto jejich translaci na protein podle techniky popsané v patentovém dokumentu EP 140 308. Terapeutickým genem může být také gen kódující antigenový peptid, schopný generovat u člověka imunitní odezvu, a to v rámci realizace vakcíny. Zejména se může jednat o specifické antigenové peptidy viru Epsteina a Barové, viru HIV, viru hepatitidy B (EP 185 573), viru pseudovztekliny nebo také specifické nádorové antigeny (EP 259 212).
Obecně heterologní sekvence nukleové kyseliny rovněž obsahuje promoční oblast funkční transkripce v infikované buňce, jakož i oblast situace v poloze 3' zainteresovaného genu, které specifikují transkripční konec a místo polyadenylace. Soubor těchto prvku tvoří expresní kazetu. Pokud jde o uvedenou promoční oblast, může se jednat o promoční oblast, která je přirozeně zodpovědná za expresi uvažovaného genu v případě, že je tato oblast schopna plnit svou funkci v infikované buňce. Může se také jednat o oblasti různého původu (odpovědné za expresi ostatních proteinů, nebo dokonce syntetické oblasti). Zejména se může jednat o promoční sekvence eukaryontních nebo virových genů nebo o jakoukoliv promoční sekvenci nebo odvozenou sekvenci stimulující nebo potlačující transkripci genu specifickým nebo nespecifickým způsobem a indukovatelným nebo neindukovatelným způsobem. Pro ilustraci lze uvést, že se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována, nebo z genomu viru a zejména o promotoru genů E1A, MLP adenovirů, promotor CMV, LTR-RSV, atd. Z eukaryotních promotorů lze rovněž uvést ibikvitámí promotory (HPRT, vimentil, alfaaktin, tubulin, atd.) promotory intermediárních vláken (desmin, neurofilamenty, keratin, GFAP, atd.), promotory terapeutických genů (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atd.), specifické tkáňové promotory (puryvát-kináza, villin, promotor intestinálního vazebného proteinu mastných kyselin, promotor aktinu alfa buněk hladkého svalu, specifický promotor pro játra, Apo AI, Apo AII, lidský albumin atd.) nebo také promotory s odezvou na stimuly (receptor steroidních hormonů, receptor retinoové kyseliny, atd.). Navíc mohou být tyto expresní sekvence modifikované přidáním aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí nebo sekvencí umožňujících tkáňové specifickou nebo majoritní expresi. V případě, že vložená nukleová kyselina nezahrnuje expresní sekvence, potom může být vložena do genomu defektivního viru až za takovou sekvenci.
Jinak může heterologní sekvence nukleových kyselin rovněž zahrnovat ještě před terapeutickým genem signální sekvenci řídicí syntetizovaný terapeutický genem signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečních cest cílové buňky. Touto signální sekvencí může být
-10CZ 294969 B6 přirozená signální sekvence terapeutického produktu, i když se může také jednat o libovolnou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální sekvenci.
Expresní kazeta terapeutického genu, může být vložena do různých míst rekombinantního adenoviru technikami popsanými v rámci dosavadního stavu techniky. Může být především vložena v úrovni delece El. Může být rovněž vložena v úrovni oblasti E3, a to adicí nebo substitucí sekvencí. Může být rovněž lokalizována v oblasti delecí odstraněné oblasti E4.
Buňky podle vynálezu mohou být rovněž použity pro produkci rekombinantních adenopřídržných virů (AAV). Toto použití představuje další obzvláště výhodnou aplikaci buněk podle vynálezu. Tyto buňky ve skutečnosti umožňují získat zvýšené titry virů AAVr, které jsou zcela zbaveny kontaminujících replikačních virů. V tomto ohledu se vynález rovněž týká použití buněk obsahující ve formě vložené ve svém genomu celek nebo část oblasti E4 genomu adenoviru obsahující alespoň čtecí fázi ORF6 pro produkci rekombinantních AVV. Těmito buňkami jsou výhodně buňky, které byly definovány výše.
Adeno-přidružený vir je virem náležejícím do skupiny lidských parvofírů a majícím relativně malou velikost, který se integruje do genomu buněk, které má infikovat, stabilním a lokálně specifickým způsobem. Adeno-přidružené viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by indukovaly účinek na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Jinak se nezdá, že by adeno-přidružené viry byly implikovány v patologických stavech člověka. Genom adenopřidružených virů již byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje asi 4700 bází a obsahuje na každém konci obrácenou repetiční oblast (ITR) s asi 145 bázemi, sloužící jako počátek replikace viru. Zbytek genomu je rozdělen do dvou základních oblasti nesoucích enkapsidační funkce: levou část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný při virální replikace a expresi virálních genů a pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující proteiny virové kapsidy. Použití vektorů odvozených od adeno-přidružených virů pro přenos genů in vitro a in vivo již bylo popsáno v literatuře (zejména WO91/18088, WO93/09293, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). V rekombinantních adeno-přidružených virem jsou delecí odstraněny geny rep a cap a nahrazeny zainteresovaným genem.
Jedna z obtíží omezujících použití adeno-přidružených virů jako vektorů v rámci genové terapie je odvozena ze skutečnosti, že se adeno-přidružený vir účinně nereplikuje v buňkách koinfikovaných virem helper, jakým je například adenovir nebo herpesvir. Příprava defektních rekombinantních adeno-přidružených virů vyžaduje tedy přítomnost tří složek, které musí být kontransfekovány a ko-infikovány do produkční buňky: pomocí vir (například adenovir), plazmid obsahující zainteresovanou nukleovou sekvenci ohraničenou dvěma obrácenými repetičními oblastmi (ITR) adeno-přidruženého viru a plazmid nesoucí enkapsidační geny (geny rep a cap) adeno-přidruženého viru.
Hlavním nedostatkem tohoto systému je, že používá vir helper. Tento vir je obecně replikační a přítomen ve směsi s produkty adeno-přidružených virů AAVr. Základní virální materiál je takto potenciálně kontaminován virem helper, který činí takový základní materiál neslučitelný s terapeutickým použitím. Kromě toho, jsou titry získaných virů vzhledem k velkému počtu implikovaných složek dosti nízké, řádově asi 108.
Vynález umožňuje eliminovat tyto nedostatky. Vynález ve skutečnosti poskytuje účinný způsob produkce AAVr, umožňují získat základní virový materiál mající vysoký titr (vyšší než 1010) a nekontaminovaný replikačním virem.
Proreplikaci adeno-přidržovaného viru AAV je zapotřebí pěti genu adenoviru: E1A, E1B, E2A, VA a E4. Tyto geny musí být přítomné a musí se exprimovat v produkční buňce za účelem optimální produkce infekčních částic. V rámci vynálezu se používá hlavně produkční buněčná řada obsahující již ve svém genomu některé z těchto genů a zejména celek nebo část oblasti E4, výhodně kombinovanou s oblastí El. Cílem použití tohoto typu buněčné řady je to, aby bylo
-11 CZ 294969 B6 možné použít defektní adenovir helper, tj. neschopný generovat autonomním způsobem infekční částice. Takto bude základní (zásobní) materiál tvořený AAVr-produkty nekontaminován.
Ve skutečnosti mohou být funkce integrované v buněčné řadě odstraněny delecí z genomu adenoviru helper.
Toto je obzvláště výhodné pro použití adenoviru helper lidského původu. Takto je možné v buněčné řadě, jaká byla popsána výše, schopné transkomplementovat funkce El a E4 adenoviru použití adenovir helper lidského původu (například ad5 nebo ad2), který je defektní v uvedených funkcích. Takový adenovir helper nemůže být účinně použit v rámci způsobů spadajících do dosavadního stavu techniky, neboť by nepřítomnosti oblastí důležitých pro produkci AAVr, (El a E4) výrazným způsobem limitovala účinnost způsobu. Takový adenovir je zcela neschopný generovat autonomním způsobem infekční částice. V tomto ohledu je případná přítomnost v základním materiálu AAVr nemůže negativním způsobem ovlivnit farmaceutickou kvalitu tohoto preparátu.
To rovněž umožňuje účinnější použití adenoviru helper zvířecího, výhodně psího, původu.
Kromě vysoké kvality získaného základního zásobního virálního materiálu umožňuje vynález obzvláště výhodným způsobem získat obzvláště vysoké titry viru. To je další velmi pozoruhodný rys způsobu podle vynálezu. Takto titry produktů, které mohou být vyšší než 1011 virálních genomů v jednom ml jsou až 1000 krát vyšší než titry získané v rámci dosavadního stavu techniky. Tyto výsledky jsou zcela neočekávané a mají kapitální význam pro průmyslové aplikace. Obzvláště pozoruhodných výsledků se dosahuje v případě buněčných řad odvozených od buněčné řady 293, které exprimují ORF6, případně v kombinaci s ORF6/7 nebo celek oblasti E4 pod kontrolou promotoru MMTV (obsahují tedy oblasti El exprimovanou konstitutivně a oblast E4 nebo část oblasti E4 obsahující alespoň ORF6 exprimovanou podmínečně v přítomnosti dexamethasonu).
Dokonce i v nepřítomnosti viru helper jsou uvedené buněčné řady schopné replikovat vir AAV. Když se takto tyto buněčné řady infikují divokým AAV nebo když se tyto buněčné řady transfekují infekčním plazmidem pAV2 (Mac Lauglin, Gene, 23, 67-73, 1983), lze realizovat replikaci DNA viru AAV. Účinnost replikace je samozřejmě nižší než účinnost replikace dosažená v přítomnosti adenoviru helper, avšak i tak demonstruje pozoruhodné vlastnosti buněk podle vynálezu.
Obzvláště výhodná buněčná řada pro provedení způsobu podle vynálezu je reprezentována buněčnou řadou 293 zahrnující ve formě vložené do svého genomu fragment BglII-BglII odpovídající nukleotidům 34115 nebo 32490 genomu Ad5. Jedná se například o buňky řady 293 transformované plazmidy pORFóGen (viz příklady).
V případě, že se provede koinfekce buňky uvedeného typu adenovirem helper (například lidský s divokým fenotypem nebo s delecí odstraněnou oblastí El nebo s dvojitou delecí oblastí El a E4 nebo psí adenovir) a kontransfekce dvou plazmidů, a sice plazmidu-AAV nesoucího obrácené replikační sekvence ITR rámující zainteresovanou nukleovou kyselinu s plazmidu nesoucího funkce rep a cap, potom lze produkovat v přítomnosti částic dexamethasonu a ve vysokých titrech částice infekčního viru AAV. Jak je to uvedeno v příkladech jsou genomové titry, které se dosáhnou v případě, že se pracuje za použití malých množství buněk, rovné 1011 genomů/ml.
V případe, že se pracuje s většími počty buněk, potom mohou být dosaženy titry, které obsahují hodnot až 1012. Kromě toho, jestliže se jako vir helper použije psí adenovir, potom způsob podle vynálezu umožňuje získat základní materiály AAV s vysokými titry, a to bez kontaminace lidským Ad.
- 12 CZ 294969 B6
Dalším předmětem vynálezu je tedy způsob produkce rekombinantních AAV, jehož podstata spočívá vtom, že se do buněčné kultury obsahující v formě vložené do svého genomu část oblasti E4 genomu adenovirů obsahující alespoň čtecí fázi ORF6 zavede:
- plazmid AAV nesoucí zainteresovanou nukleovou kyselinu ohraničenou obrácenými replikačními sekvencemi adeno-přidruženého viru,
- adenovir helper a
- funkce Rep a Cap adeno-přidruženého viru, načež se izolují produkované viry.
V rámci specifické provedení vynálezu je produkční buňkou buňka obsahující celistvou oblast E4. Podle jiné formy provedení vynálezu, která je obzvláště výhodná, je produkční buňkou buňka obsahující část oblast E4 obsahující alespoň čtecí fázi ORF6 a případně čtecí fázi ORF6/7.
V rámci obzvláště výhodné formy provedení vynálezu se jedná o buňku, která byla definována výše pro produkci adenovirů. Zejména se výhodně jedná o buňku schopnou transkomplementovat funkce El a E4 adenovirů. Výhodný příklad představuje buňka řady 293 obsahující vloženou ve svém genomu celou oblast E4 nebo část oblasti E4 zahrnující alespoň čtecí fázi ORF6 a případně čtecí fázi ORF6/7. Jako příklad lze uvést buňky klon//2 (IGRP2) a klon//4 (IGRP4).
Jak již bylo uvedeno výše, může být adenovirem helper lidský adenovir s divokým fenotypem nebo s delecí oblasti El nebo s dvojitou delecí oblastí El a E4 anebo také psí adenovir. Výhoda způsobu podle vynálezu spočívá jednak ve zvýšených titrech AAVr a jednak v sekuritárním charakteru základního virového materiálu, který umožňuje produkovat. Takto je obzvláště výhodné použít defektní adenovit helper, tj. adenovir neschopný generovat autonomním způsobem infekční částice. Adenovirem helper je v rámci způsobu podle vynálezu výhodně lidský adenovir mající deleci v oblasti E4. Ještě výhodněji se jedná o lidský adenovir defektní v oblastech El a E4. V rámci jiné výhodné formy provedení vynálezu se jedná o psí adenovir, výhodně zvolený z množiny zahrnující kmeny CAV2.
V rámci způsobu podle vynálezu jsou funkce rep a cap adeno-přidruženého viru AAV výhodně přivedeny kotransfekcí buněk plazmidem nesoucím oblasti rep a cap viru AAV. Tyto oblasti mohou být pod kontrolou homologního promotoru P5 nebo pod kontrolou konstitutivního promotoru, jakým je LTR-RSV. Tyto funkce mohou být rovněž přivedeny přímo použitým virem helper. Ve skutečnosti je možné vložit do adenovirů helper kazetu obsahující oblasti rep a cap viru AAV.
Při způsobu podle vynálezu může být transfekce plazmidu nebo plazmidů (plazmide-AAV a případně plazmid-RepCap) provedena libovolnou známou technikou. Nicméně čím je lepší míra transfekce, tím lepších produkčních hladin může být dosaženo. V tomto ohledu přihlašovatel nyní vyvinul obzvláště účinnou metodu transfekce plazmidů do produkčních buněk. Tato metoda spočívá v použití polykationtového lipidu a zhušťující činidla nukleových kyselin. Jedna z výhod této metody spočívá navíc ve skutečnosti, že se nezdá, že by tato metoda zhoršovala morfologii nebo fyziologický stav buněk. Mohou být použity různé typy kationtových lipidů, mezi které patří například lipofektamin, transfektam, atd. Z činidel zhušťujících (zkompaktňujících) DNA lze uvést výhodně peptidy odvozené od jádrových proteinů, jakými jsou histony, nukleolin, atd.
Do produkčních buněk mohou být současně nebo odděleně zavedeny různé plazmidy a viry helper. V případě odděleného zavedení neovlivňuje pořadí, ve kterém se zavedou jednotlivé odlišné složky, míru dosaženého vysokého titru. Jak je to ilustrováno v příkladech, byly významné titry nicméně dosaženy v případě, kdy se do buněk nejdříve kotransfekují plazmidy a teprve potom se buňky infikují virem helper.
- 13 CZ 294969 B6
Jedna ze specifických forem vynálezu spočívá ve způsobu produkce rekombinantních AAV, jehož podstata spočívá vtom, že se do buněčné kultury transkomplementují funkce El a E4 adenoviru kontransfekuje v přítomnosti polykationtového lipidu a zkompaktňujícího činidla plazmid AAV nesoucí zainteresovanou nukleovou kyselinu ohraničenou obrácenými repetičními sekvencemi ITR adeno-přidruženého viru a plazmid nesoucí oblasti rep a cap adeno-přidruženého viru, načež se uvedená kultura koinfikuje adenovirem helper, zvoleným z množiny zahrnující adenoviry lidského původu Ad2 nebo Ad5 defektní v oblastech El a E4 a adenoviry psího původu, a potom se izolují produkované viry.
Tento způsob provedení umožňuje získat vysoké titry virů a základní virální materiál farmaceutické kvality.
Vynález se rovněž týká purifíkovaných virálních přípravků (adenoviry a AAV) získané způsobem podle vynálezu, jakož i každé farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo několik defektních adenovirů nebo AAV, připravených uvedeným způsobem. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány s ohledem na možnosti topického, perorálního, parenterálního, intranasálního, intravenózního, intramuskulámího, subkutánního, intraokulámího, transdermálního nebo jiného podání.
Výhodně farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje farmaceuticky přijatelná vehikula pro injikovatelnou formulaci. Může se zejména jednat o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, monohydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý, atd. nebo směsi takových solí) mající sterilní izotonický charakter nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku umožní vytvoření injikovatelných roztoků. Mohou být použity i další pomocné látky, jako například hydrogel. Tento hydrogel může být připraven z libovolného bio-kompatibilního a netoxického (homo- nebo hetero-)polymeru. Takové polymery jsou například popsány v patentové přihlášce WO93/08845. Některé z těchto polymerů, a to zejména polymery získané z ethylenoxidu nebo/a propylenoxidu jsou komerčně dostupné. Použité dávky viru pro injekci mohou být závislé na různých faktorech, mezi které zejména patří způsob podání, léčený patologický stav, gen určený k exprimování nebo také požadovaná délka léčení. Obecně jsou rekombinantní adenoviry podle vynálezu formulovány a podávány ve formě dávek mezi 104al014 pfu a výhodně mezi 106 a 1010 pfu, zatímco adeno-přidružené viry AAV jsou formulovány a podávány v dávkách mezi 106 a 1011 částic. Výraz pfu („plaque forming unit“) odpovídá infekční potenci roztoku adenoviru a stanoví se infekcí příslušné buněčné kultury měřením obecně po 15 dnech počtu pláží (plaků) infikovaných buněk. Techniky stanovení titru pfu virového roztoku jsou velmi dobře dokumentované v literatuře.
V závislosti na terapeutickém genu mohou být takto produkované viry použity pro léčení nebo prevenci četných patologických stavů, zahrnujících genetické choroby (dystrofíe, cystická fibróza, atd.), neurodegenerativní choroby (Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, ALS, atd), rakoviny, patologie spojené s poruchami koagulace nebo s dyslipoproteinemií, patologické stavy spojené s virovými infekcemi (hepatitida, AIDS, atd.), atd.
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen patentovými nároky.
- 14CZ 294969 B6
Přehled obrázků na výkresech
Na připojených výkresech
- obr. 1 znázorňuje genetickou organizaci adenoviru Ad5, přičemž úplná sekvence Ad5 je k dispozici na bázi získaných údajů a umožňuje tak odborníkovi selektovat nebo vytvořit libovolné restrikční místo a takto izololibovolnou oblast genomu,
- obr. 2 znázorňuje genetickou organizaci oblasti E4,
- obr. 3 znázorňuje genetickou organizaci oblasti E4 divokých adenovirů a defektní oblasti E4, přičemž rozsah delece je reprezentován tlustou plnou čarou,
- obr. 4A znázorňuje schematické zobrazení kazety MMTV LTR/(ORF6+ORF7), přičemž jsou lokalizovány oligo 1, 2 a 5 použité pro amplifikaci nebo RT-PCT a +1 znamená iniciační místo transkripce a AAA znamená polyadenylační místo,
- obr. 4B znázorňuje strukturu produktů získaných prostřednictvím RT-PCR, přičemž SD znamená místo 5' donoru vazby a SA znamená místo 3' akceptoru vazby,
- obr. 5 ilustruje analýzu produkce adenovirálního vlákna imunologickou detekcí pomocí polyklonálního séra proti vláknu (Boulanger a kol.), přičemž buněčné extrakty jsou připraveny po 72 hodinové virální infekci, kdy dexamethazon je přidán současně s virem (finální koncentrace 600 nM), a A odpovídá infekci virem dli014 (ΜΘΙ=10), B odpovídá infekci virem dllOOl (MOI=1), C odpovídá infekci virem dll004 (MOI=10 a wt odpovídá infekci virem Ad5 (MOI=10),
- obr. 6 znázorňuje induktibilitu E4 v buňkách klonu//2 a analýzu neinfikovaných buněčných extraktů (kontrola nižší než 0) nebo extraktů infikovaných virem dl 1007, a to 72 hodin po infekci, přičemž DM = dexamethazon (600 nM) a
- obr. 7 znázorňuje strategii klonální konstrukce virů deltaEl, deltaE4.
Příklady provedení vynálezu
Obecné techniky molekulární biologie
Metoda klasicky používané v molekulární biologii, jakými jsou preparativní extrakce plazmidové DNA, odstředění plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarózovém nebo akrylamidovém genu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo systémem fenoí-chloroform, precipitace DNA v prostředí soli ethanolem nebo isopropanolem transformace v Escherichia coli, atd., jsou velmi dobře známé v daném oboru a bohatě popsané v literatuře /Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. a kol. (ed.), „Current Protocols in Molekular Biology“, JohnWiley and Sons, New York, 1987/.
Plazmidy typu pBR322, pUC a fagy série M13 jsou komerčního původu (Bethesda Research Laboratories). Pro ligaci mohou být fragmenty DNA separovány podle jejich velikosti elektroforézou a agarózovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, sráženy ethanolem a potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligázy fagu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele. Plnění proeminentních konců 5' může být provedeno Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podle pokynů dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA-polymerázy fagu
- 15 CZ 294969 B6
T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5' se provádí šetrným působením nukleázy S1.
Mutageneze řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena pomocí metody vyvinuté Taylorem a kol. /Nucleic Acids Res. 13 (1985), 8749-8764/ za použití soupravy distribuované společností Amersham. Enzymatická aplifíkace DNA technikou nazvanou PCR /Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. a kol, Science 230 (1985 1350-1354; Mullis K.B. a Fallona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987)335-350/ může být provedena za použití činidla „DNA thermal cycler“ (Perkin Elmer Cetus) podle pokynů výrobce. Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sanger-em a kol. /Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467/ za použití soupravy distribuované společností Amersham.
Příklad 1
Konstrukce plazmidů nesoucích různé funkční jednotky oblasti E4 pod kontrolou promotoru
1.1. Konstrukce plazmidu pE4Gen
Plazmid pPY2 odpovídá klonování fragmentu Avr2-Sall (asi 1,3 kb zahrnující promotor MMTV) plazmidu pMSG (Pharmacia) mezi místy Xbal a Sall plazmidu pIC2OH připraveného z kontextu E. coli dam+. Plazmid pPY4 je odvozen od plazmidu pPY4 deleci fragmentu s 35 pb po řezu pomocí BamHl a Ggll a po ligaci. Plazmid pPY5 odpovídá plazmidu pIC20H, ve kterém byl fragment Taql-Bgl2 zahrnující oblast E4 adenoviru typu 5 situovanou mezi polohami 35576 (Taq 1) a 32490 (Bgl2) klonován mezi místa Clal a BamHl. Oblast E4 plazmidu pPY5 je tedy včleněna do fragmentu EcoRV-Sphl, který může být klonován po částečné dogesci mezi místa Smál a Sphl plazmidu pPY4, což generuje plazmid pPY6. Vložení fragmentu Xhol plazmidu pKIXX (Pharmacia), který nese gen udělující u buněk 293 rezistenci vůči geneticinu, do plazmidu pPY6 generuje plazmid pE4Gen. Tento plazmid nese tedy selektovatelný gen a celou oblast E4 adenoviru exprimovanou z promotoru MMTV. V tomto specifickém plazmidu oba tyto geny následují jeden za druhým a příslušné kódující sekvence jsou nesené jedním a týmž řetězcem DNA. V tomto plazmidu je hlavně donorové místo 5' pro splétání lokalizováno před čtecí fází ORF1 (k poloze 35548) a tedy zachováno pro zajištění přesného alternativního plétání, umožňující generovat různé expresní produkty všech fází kódujících oblast E4, a to způsobem, který je srovnatelný s alternativním splétáním pozorovaným v průběhu virálního cyklu.
1.2. Konstrukce plazmidu pORFóGen
Plazmid pPY13 odpovídá klonování fragmentu Bgl2-Xbal plazmidu pPY6 mezi odpovídající místa plazmidu pIC20H. Tento fragment s 1,6 kb zahrnuje takto sekvenci adenoviru typu 5 od polohy 34115 (Bgll) do polohy 32490 (Bgl2 následován místem Xbal pocházejícím zklonovacího multimísta plazmidu pIC20H). Plazmid pPY13 tedy obsahuje celek otevřených čtecích fází ORF6 a ORF7 adenoviru nyní včleněných do fragmentu Xhol-Sphl. Klonování tohoto fragmentu mezi místy Sall a Sphl plazmidu pPY4 generuje plazmid pPY15. Vložení fragmentu Xhol plazmidu pKIXX, který nese gen udělující u buněk 293 rezistenci vůči geneticinu, do plazmidu pPY15 generuje plazmid pORFóGen. Tento plazmid takto nese selektovatelná gen a otevřené čtecí fáze ORF6 a ORF7 oblasti E4 adenoviru exprimované z promotoru MMTV. V tomto plazmidu oba uvedené geny následují za sebou a příslušné kódující sekvence jsou neseny jedním a týmž vláknem DNA. Prvním iniciačním kodonem translace je kodon otevřené fáze ORF6 (poloha 34077 v genomu Ad5) a je oddělen od místa CAP promotoru MMTV 235 nukleotidy. V případě, že alternativní splétání je sekvenční a implikuje na prvním místě rozpoznání donorového místa 5', nebylo hlavní donorové místo 5' lokalizované před čtecí fází ORF1 (k poloze 35548) tedy včleněno do konstrukce plazmidu pORFóGen, aby byla později umožněna účinná exprese produktů čtecích fází ORF6 a ORF6/7 (obr. 4A).
- 16CZ 294969 B6
1.3. Konstrukce plazmidů pORF4Gen
Plazmid pPY14 odpovídá klonování fragmentu Bgl2-Xbal s 1,9 kb (získaného po částečné dogesci enzymem Bgl2) plazmidů pPY6 mezi odpovídajícími místy plazmidů pIC20H. Tento plazmid s 1,9 kb takto zahrnuje sekvenci adenovirů typu 5 od polohy 34387 (Bgl2) do polohy 32490 (Bgl2, následovaný místem Xbal pocházejícím zklonovacího multimísta plazmidů pIC20H). Plazmid pPY14 je tedy isogenní vůči plazmidů pPY13 s výjimkou, že navíc zahrnuje fragment Bgl2 odpovídající téměř celku otevřených čtecích fází ORF4. Tento plazmid tedy obsahuje celek otevřených čtecích fází ORF4, ORF6 a ORF7 adenovirů, nyní zahrnuté ve fragmentu Xho-Sphl. Klonování tohoto fragmentu mezi místy Sall a Sphl plazmidů pPY4 generuje plazmid pPY16. Vložená fragmentu Xhol plazmidů pKIXX, který nese gen udělující u buněk 293 rezistenci vůči geneticinu, do plazmidů pPY16 generuje plazmid pORF4Gen. Tento plazmid tedy nese selektovatelný gen a otevřené čtecí fáze ORF4, ORF6 a ORF7 oblasti E4 adenovirů exprimované z promotoru MMTV. V tomto specifickém plazmidů oba uvedené geny následují za sebou a příslušné kódující sekvence jsou neseny jedním a týmž vláknem DNA. Stejně jako v případě plazmidů pORF6Gen, nebylo hlavní donorové místo 5' lokalizované před čtecí fází ORF1 (k poloze 35548) včleněno do konstrukce plazmidů pORF4Gen za účelem pozdějšího umožnění účinné exprese produktů čtecích fází ORF4, ORF6 a ORF6/7.
1.4. Konstrukce plazmidů pJY 1 apJY2
V tomto příkladu se popisuje konstrukce plazmidů zahrnujícího funkční jednotku oblasti E4 (viz příklad 1.2.) pod kontrolou promotoru odvozeného od MMTV. Zejména je tento promotor derivátem MMTV obsahujícím 5 prvků odezvy na glukokortikoidy, tj. derivátem vysoce indukovatelným glukokortikoidy. Tento plazmid byl zkonstruován následujícím způsobem.
Fragment BglII zAd5 (poloha 34115 až 32490) zahrnuje sekvence (ORF6+ORF7) oblasti E4. Tento fragment byl nejdříve klonován mezi místy BglII a BamHI plazmidů pIC20H (Mash a kol., Gene 32 (1984)481, což generuje plazmid pPY13, ve kterém je místo BglII situováno před ORF6 zachováno. Fragment BglII—Sall plazmidů pPY13 tedy zahrnuje celek sekvencí (ORF6+ORF7) oblasti E4 Ad5. Tento fragment byl klonován mezi místy BamHI a Sall plazmidů pIC20H, což generuje plazmid pPY45.
Fragment Xbal (asi 1 kb) plazmidů pGRE5-l (Maděr a White, PNAS 90 (1993)5603) odpovídá promotoru odvozenému od MMTV, vysoce indukovatelnému glukokortikoidy. Tento fragment byl izolován a klonován mezi místy Xbal plazmidů pIC20H izolovaného z kontextu dam-. Získaný plazmid byl označen jako pPY21. V tomto plazmidů je místo BglII pocházející z klonovacího multimísta plazmidů pIC20H lokalizováno bezprostředně před pěti prvky promotorů schopnými vázat jádrový receptor na glukokortikoidy. Fragment BglII-EcoRI plazmidů pPY21 obsahující promotor vysoce indukovatelný glukokortikoidy byl potom klonován mezi místy BglII a EcoRI plazmidů PIC20H, což generuje plazmid pPY26.
Klonování fragmentu EcoRI-SppH plazmidů pPY45 mezi odpovídajícími místy plazmidů pPY26 generuje plazmid pJYl, který obsahuje sekvence (ORF6+ORF7) adenovirů Ad5 pod kontrolou promotoru vysoce indukovatelného glukokortikoidy (kazeta pGRE5/(ORF6+ORF7)).
Rovněž byl konstruován derivát odvozený od pJYl a obsahující gen rezistence vůči geneticinu. Fragment Xhol-Sall plazmidů pMSCV obsahuje bakteriální gen udělující eukaryontním rezistenci vůči geneticinu (APH) a exprimovaný u těchto buněk ze silného a ubikvitárního promotoru (PGK). Tento fragment byl klonován do plazmidů pJYl a v místu sall. Získaný plazmid byl označen jako pJY2. Tento plazmid obsahuje expresní kazetu pGRE5/(ORF6+ORF7) a pGK/APG přepsané ve stejném směru.
- 17CZ 294969 B6
1.5. Konstrukce plazmidu pGGO
Sestava částí GCR (HBD) a ORF6+ORF7 oblasti E4 adenoviru Ad5 se realizuje po amplifikaci PCR za použití plazmidu pSG5HGR jako matrice a deoxyoligonukleotidů SEQ ID n°5.
5'-GGCCCGCCGCCACCATGGATATTGAACCTGAAGTGTTATATGCAGGA-3';
(místo Smál je vyznačeno kurzívou, konsenzní Kozáková iniciační sekvence je vyznačena tučným písmem kodon specifikující zbytek 539 od GCP je podržen) a SEQ ID n°6
5-CTCGAGAACGCCGGACGTAGTCTTTTGATGAAACAGAAG-3' (místo Xhol je vyznačeno kurzívou, místo Tthllll je vyznačeno tučným písmem a kodon specifikující zbytek 77 od GCR je podtržen). Oligonukleotid SEQ ID n°5 umožňuje tedy polohovat ATG specifikující iniciaci translace před doménou GCR sahající od aminokyselin 539 až 77 od GCR. Oligonukleotid SEQ ID n°6 umožňuje zase polohovat restrikční místo Tthl 1II za HBD. Amplifikační fragment PCR byl nejdříve klonován do komerčního plazmidu pCRII a vytřídění bílá-modrá umožnila selektovat klon, jehož identita byla ověřena sekvencováním (plazmid pCRII/GCR). Tento plazmid je tedy zdroj fragmentu Smal-Xhol, který nese doménu HBD od GCR postoupivšího amplifikaci PCR s oligo SEQ ID n°5 a SEQ ID n°6.
Plazmid pMEL3 představuje intermediární konstrukci, která obsahuje „polylinker“ EcoRI-Pstl plazmidu pSLl 180 vložený mezi místa EcoRI a Pstl derivátu plazmidu pIC20H, ve kterém místo Hind3 situované v bezprostřední blízkosti místa Nrul na „polylinkeru“ bylo ošetřeno Klenowovým fragmentem polymerázy I Escherichia coli a potom podrobeno ligaci na sobě samém, což transformuje místo Hind3 na místo Nhel. Plazmid pMEL3 obsahuje rovněž fragment BamHI odpovídající polyadenylačnímu signálu SV40 předběžně vloženému do místa Bgl2 „polylinkeru“ plazmidu pIC20H. Fragment Smal-Xhol plazmidu pCRII/GCR, který obsahuje doménu HBD od GCR byl vložen mezi odpovídající místa plazmidu pMEL3, což generuje plazmid pMEL3/GCR.
Po celkové digesci plazmidu pPY13 pomocí Hinc2 a částečně digesci pomocí SspI a potom ligaci plazmidu na sobě samém je generován plazmid pPY13 (deltaHinc2-SsPl), který obsahuje fragment Hind3 sasi 1,4 kb obsahující celek sekvence ORF6+ORF7 oblasti E4 adenoviru Ad5 zahrnující polyadenylační místo.
Plazmid pPY12 (delta Hinc2-Sspl) byl digerován pomocí Hind3 a jeho konce byly naplněny pomocí polymerázy Klenow. Tento plazmid byl potom digerován pomocí Xhol a sekvence ORF6+ORF7 (asi 1,4 kb) se klonují mezi místy Xhol a Nrul plazmidu pMEL3/GCR, což generuje plazmid pMEL3/GCR-Tthl 11I-(ORF6+ORF7).
Kopulace místa Ttllll zavedená pomocí oligonukleotidu SEQ ID n°6 s místem TtHlllI umístěným bezprostředně před translační ATG fáze ORF6 na sekvenci adenoviru Ad5 (poloha 34070) umožňuje realizovat translační kopulace mezi doménou HBD od GCR a proteinem ORF6. Plazmid pMEL3/GCR-Tthl 11I-(ORF6+ORF7) se potom digeruje pomocí Tthllll a potom podrobí ligaci na sobě samém, což generuje plazmid pMEL3/GCR-(ORF6+ORF7). Tato konstrukce byla sekvencována za účelem ověření translační kopulace byla sekvencována za účelem ověření translační kopulace mezi doménou HBD od GCR a fází ORF. Sekvence chimérického genu, která byla získána, je prezentovaná sekvencí SEQ ID n°7. Sekvence rezultujícího proteinu GCR-ORF6 je prezentovaná sekvencí SEQ ID n°8.
Ošetření plazmidu pPY26 prostřednictvím EcoRI a Klenowovým fragmentem polymerázy I Escherichia coli a potom pomocí Bgl2 generuje fragment zahrnující indukovatelný promotor GRE5, jehož klonování mezi místem Apal ošetřeným Klenowovým fragmentem a místem BamHI plazmidu pMEL3/GCR-(ORF6+ORF7) generuje plazmid pMEL3/GRE-(GCR
-18CZ 294969 B6
ORF6+ORF7). Tento plazmid je zdrojem fragmentu Bgl2-Nhell odpovídajícího expresní kazetě kódující fúzi GcR-(ORF6+ORF7) exprimované z promotoru GRE5, přičemž jeho klonování mezi místy Bgl23 a Xbal plazmidu pCI-Neo (Promega) generuje plazmid pGGO.
Příklad 2
Konstrukce buněčných řad
V tomto příkladu se popisuje konstrukce buněčných řad komplementovaných v oblastech El aE4 adenovirů podle vynálezu. Tyto buněčné řady umožňují konstrukci a propagaci rekombinantních adenovirů s delecemi uvedených oblastí, a to aniž by bylo nezbytné použít vir helper.
Buněčné řady podle vynálezu byly konstruovány kotransfekcí zvolených buněk v přítomnosti fosforečnanu vápenatého plazmidu popsanými v příkladu 1 a konstrukční kódující receptor glukokortikoidů (Hollenberg a kol., Nátuře, 318, (1985) 635-641). Přesněji specifikováno, buňky řady 293 v miskách o průměru 5 cm byly transfekovány 1 až 5 pg plazmidu E4 (pE4Gen, pORF6-Gen, pORF4Gen, PGGO nebo pJY2) a případně 5 pg expresního plazmidu lidského receptorů glukokortikoidů exprimovaného v raného promotoru viru SV40 (plazmid pSG5HGR) v přítomnosti fosforečnanu vápenatého a podle protokolu popsaného Graham-em a Van der Eb-em (Virology 52 (1973)456).
2.1. Selekce klonů rezistentních vůči geneticinu
Po transfekci buněk se tyto buňky promyjí, načež se přidá kultivační prostředí (MEM, Sigma) obohacené fetálním telecím sérem (finální obsah 7 %) a buňky se inkubují po dobu 20 hodin. Nazítří se buňky selektují v přítomnosti účinné koncentrace geneticinu 350 mg/1. Geneticin se vyměňuje každý třetí den a selektovatelné klony se objeví po asi 3 týdnech. Když jsou všechny netransfekované buňky mrtvé, přetrvávají pouze buňky, do kterých byl vložen gen rezistence vůči geneticinu a tyto buňky se rozdělí za účelem generování buněčných klonů. Když jsou buněčné klony natolik veliké, že jsou pozorovatelné pouhým okem, jsou převedeny do jamek kultivační 24-jamkové kultivační plotny. Každý klon se potom progresivně amplifikuje v přítomnosti geneticinu nejdříve v jamkách 12-jamkové a potom 6-jamkové kultivační plotny a posléze se amplifíkují v kultivačních miskách. Každý získaný buněčný klon se potom přechovává ve zmrazené formě v kapalném dusíku.
2.2. Selekce klonů schopných produkovat viry deficitní v oblasti E4
Adenoviry Ad2dl808 (Weinberg a Ketner, J. Virol. 57, (1986) 833), Ad5dll004, D11007 nebo dll014 (Bridge a Ketner, J. Virol. 63 (1989) 631), dllOll (Bridge a kol., Virology 193 (1993) 794) jsou delečními mutanty nesoucími výrazné delece v úrovni oblasti E4. Tyto mutanty jsou neschopné replikovat se v buňkách 293, ale mohou být produkovány v buňkách W162 (Wedinberg a Ketner, PNAS 80(1983)5883). Ve druhé etapě bylo 50 klonů rezistentních vůči geneticinu testováno na stanovení jejich schopnosti produkovat uvedené viry E4 a tudíž transkomplementovat oblast E4. Za účelem stanovení uvedené schopnosti transkomplementovat oblast E4 bylo rovněž vytříděno 60 klonů transfekovaných plazmidem pJY2 a rezistentních vůči genticinu.
Za tím účelem byl každý klon infikován v kapalném prostředí virem dl808 při infekční multiplicitě asi 0,1 PFU/buňka (virální titr byl získán na buněčné řadě W162). V případě klonů pJY2 byla infekce provedena při úrovni 0,5 pfu/buňka v prostředí obohaceném dexamethazonem (1 pM). Objevení se cytopatického účinku amplifíkovatelného následnou reinfekcí buněk získaných buněčným lyzátem je ukazatelem určité virální propagace viru dl808 buňkami uvažovaného klonu. Tato transkomplementace je potom demonstrována jak analýzou v úrovni virální replikace, tak i schopností buněk tvořit virální pláže (plaky) (jeden z možných protokolů je popsán Hitt
-19CZ 294969 B6 em M., Bett-em A. J., Prevec-em L. a Graham-em F.L., Construction and propagation of human adenovirus vectors“, Cell Biology, a Laboratory HandBook, sv. 1, J.E. Cellis (ed.), Academie Press lne. (San Diego, Ca, USA), str. 479-490) po infekci virem dl808.
Tato etapa umožnila prokázat existenci několika specifických klonů majících účinnou schopnost transkomplementovat oblast E4. První z nich, který byl označen jako klon//2, je výsledkem transfekce plazmidů pORF6Gen, zatímco druhý, který byl označen jako klon//4, byl izolován po tranfekci plazmidů pE4Gen. Stabilní klony schopné transkomplementovat oblast E4, které jsou současně vysoce indukovatelné glukortikoidy, byly rovněž získány po transfekci buněk 293 plazmidem pJY2. Jinak, další stabilní klony schopné účinně propagovat viry defektní v oblasti E4 a vysoce indukovatelné nesteroidní sloučeninou byly rovněž připraveny. Tyto klony byly získány ko-transfekcí buněk 293 plazmidem pJY2 a plazmidem exprimujícím umělý transaktivátor, tvořený transaktivační oblastí (VP16), oblastí, která váže DNA pocházející z receptorů glukokortikoidů, a částí zkrácenou v C-terminálu receptorů progesteronu, takže tento hybridní receptor je schopen transaktivovat promotor GRE5 v přítomnosti RU486 a nikoliv steroidy. Získané klony jsou skutečně schopné účinně propagovat E4-defektní viry v přítomnosti RU486.
Samotný plazmid pGGO nebo ekvimolekulámí kombinace plazmidů pGOO a pSG5HGR se transfekují do buněk permisivních pro adenovir typu 2 nebo 5 a stabilní klony se selektují v přítomnosti 400 mg/1 geneticinu. Tak například transfekce plazmidů pGGO do buněk 293 generuje klon IGRP18, který umožňuje propagaci virů podvojně defektních v oblastech El a E4 v přítomnosti dexamethasonu (1 μΜ), což neplatí v případě absence adice.
2.3. Schopnost propagovat adenoviry deficitní v oblasti El
Schopnost připravených buněčných řad komplementovat oblast El byla ověřena po infekci adenovirem Ad-RSVbetaGal. Tento adenovir první generace (deficidní pouze v oblasti El) obsahuje gen LacZ od E. coli pod kontrolou promotoru LTR viru RSV (Stratford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626). Buňky klonů //2 a //4 buňky získané za použití pJY2 byly infikované virem Ad-RSVbetaGal, přičemž u každého klonu byla pozorována virální propagace.
Tyto výsledky ukazují, že schopnost buněk transkomplementovat oblast El nebyla ovlivněna dodatečným zavedením distální části oblasti E4 (klon //2, buňky pJY2) nebo celé oblasti E4 (klon //4).
2.4. Analýza Southern a Northem blot a RT-PCR za účelem ověření integrace funkční jednotky E4 v genomu
Buňky klonů //2 a //4 byly analyzovány na Southern blok za účelem ověření exprese virálních proteinů. Analýza Southern blot (analýza genomové DNA hybridizující s radioaktivní sondou pocházející z adenovirální oblasti E4) byla provedena podle protokolu popsaného Maniatis-em a kol. Za tímto účelem se připraví genomová DNA buněk 293 a //2. 2 pg této DNA se použije jako matrice při reakci PCR provedené v přítomnosti polymerázy Taq, oligo 1 sekvence SEQ ID n°l (odpovídající nukleotidům 52 až 71 promotoru MMTV) a oligo 2 sekvence SEQ ID n°2 (odpovídající polohám 32932 až 32940 genomu adenovirů Ad5). Tyto oligo amplifikují fragment s 2617 páry bází plazmidů pORF6Gen. Amplifikace byla provedena za následujících podmínek: denaturace při teplotě 94 °C po dobu 5 minut, 30 amplifikačních stupňů denaturací při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, hybridizace při teplotě 60 °C po dobu 2 minut a extenze při teplotě 70 °C po dobu 3 minut, přičemž extenze při posledním cyklu je prodloužena na 10 minut. Amplifikační produkty se potom analyzují elektroforézou SDS za použití 1% agarózy a identifikují na Southern Bot a hybridizací se značenou sondou pokrývající oblast (ORF6+ORF7) adenovirů nebo oblast MMTV.
Analýza Nothern Blot a RT-PCR (analýza buněčných RNA klonů //2 a //4 hybridizujících s radiačně onačenou sondou pocházející z oblasti E4 adenovirů) byla provedena podle protokolu
-20CZ 294969 B6 popsaného Maniatis-em a kol., přičemž polyadenylované buněčné RNA byly připraveny podle protokolu popsaného R.E. Farrell-em Jr., „RNA isolation strategies“ v: RNA Methodologies, a Laboratory guide for Isolation adn Characterization, Academie Press lne. (San Diego, CA, USA), str. 46-92). Pro RT-PCR bylo 500 ng RNA polyA+ ošetřeno 0,5 jednotky DNAse I a potom podrobeno obrácené transkripci se zárodkem oligo(dT). Desetina takto získaného preparátu jednořetězcové DNAc byla použita jako matrice při reakci PCR provedené pomocí oligo 2 (SEQ ID n°2) a oligo 3 (SEQ ID n°3), což odpovídá nukleotidům 227 až 246 vzhledem k místu cap promotor MMTV (viz obr. 4). Tato oligo byly konstruovány pro amplifíkaci fragmentu s 1255 páry bází nespletené RNAm ORF6 a fragment s 545 páry bází spletené RNAm ORF6/7. Amplifikační produkty se analyzují na 1% agarózovém gelu SDS a identifikují na Southern Blot a hybridizací se značenou sondou (ORF6+ORF7).
Uvedené analýzy umožňují prokázat, že oba tyto klony mají svou funkční jednotku E4 integrovanou na bázi několika kopií v buňce. Kromě toho tyto studie prokázaly, že oba dva klony exprimují protein vlákna adenoviru po infekci s delečními mutanty Ad5dll004, Ad5dll014 (obr. 5). Tento protein je pozdním proteinem replikačního a infekčního cyklu adenoviru, jehož syntéza implikuje expresi E4. Přítomnost tohoto proteinu v buňkách infikovaných mutanty E4' potvrzuje, že tyto buňky exprimují dobře funkční aktivitu E4.
Analýza Southern Blot zejména ukazují, že klon //2 obsahuje kopii kazety MMTV(ORF6+ORF7) ve formě integrované ve svém genomu. Celistvost této kazety byla kromě toho prokázána amplifíkaci pomocí oligo 1 a oligo 2, která generuje očekávaný fragment s 2,6 kb, který může být specificky detekován radiačně značenou sondou odpovídající jednotce (ORF6+ORF7) nebo promotoru MMTV (obr. 4). Výskyt přesného alternativního splétání v buňkách podle vynálezu byl rovněž prokázán pomocí RT-PCR. Takto byly v neinfíkovaném klonu //2, který byl kultivován v přítomnosti dexamethazonu (indukční podmínky), specificky detekovány radiačně značenou sondou (ORF6+ORF7) dva hlavní signály. Nejdůležitější signály je fragment s asi 1,3 kg, přičemž tato velikost perfektně odpovídá nespletenému produktu odvozenému od ORF6/ORF7. Druhým signálem je fragment s asi 0,6 kb, což je velikost, která je v souladu s vyříznutím (v průběhu splétání) intronu se 712 nukleotidy generujícím mediátor ORF6/7. Tyto výsledky jasně ukazují, že v buňkách podle vynálezu dochází k přesnému alternativnímu splétání a že oba produkty ORF6 a ORF6/7 oblasti E4 jsou dobře exprimovány v buňkách.
Schopnost buněk podle vynálezu exprimovat funkční produkt oblasti ORF6 byla jinak prokázána imunodetekcí proteinu vlákna. Získané výsledky ukazují, že buňky 293 infikované adenovirem Ad5 dl 1007 neprodukují vlákna. Naopak vláknově-specifícký signál je detekován v buňkách podle vynálezu (zejména klon //2) po infekci uvedeným mutantem a nikoliv v ostatních neinfíkovaných buňkách. Přítomnost vlákna byla rovněž prokázána v buňkách podle vynálezu infikovaných mutanty dl808, dll004 (ORF1+), dllOll nebo dll014 (ORF4+) v přítomnosti dexamethazonu.
2.5. Tvorba pláží (plaků)
Tato analýza jasně demonstruje obzvláště výhodné vlastnosti buněčných řad podle vynálezu. Zatímco jsou oba klony (klon //2 a klon //4) schopné transkomplementovat oblast E4 a propagovat se srovnatelnou účinností mutanty Ad2dll808 nebo Ad5dll004, vykazují výrazný rozdíl pokud jde o tvorbu pláží virů po infekci mutanty Ad2dll808, Ad5dll004, Ad5dll007, Ad5dll011 nebo Ad5dll014.
Schopnost tvořit virální pláže je základní vlastností produkčních buněčných řad. Ve skutečnosti pouze pod touto podmínkou mohou být rekombinantní virové klony izolovány, implifíkovány a purifíkovány. Získané výsledky jasně ukazují, že tvorba virových pláží je vždy pozorována v případě klonu //2, zatímco v případě klonu //2 k tomu dochází pouze zřídka. Tyto výsledky
-21 CZ 294969 B6 prokazují jednoznačným způsobem vynikající vlastnosti buněčnou řad podle vynálezu, do kterých byla integrována pouze jedna specifická funkční jednotka oblasti E4.
2.6. Regulovaná exprese aktivity E4
Další výhodná vlastnost klonu //2 podle vynálezu spočívá v regulovaném a indukovatelném charakteru exprese aktivity E4. Získané výsledky takto ukazují, že tvorba virových pláží je pozorovatelná pouze v případě dexamethazonu. Stejně tak je v klonu //2 výrazně zvýšena exprese vláknového proteinu adenovirů po infekci mutantech Ad5dll007 za indukčních podmínek (obr. 6). Stejné výsledky byly získány v případě mutantů Ad5dl808, Ad5dll004, Ad5dl2011 a Ad5dll014. Naopak exprese aktivity E4 v klonu //4 je konstitutivní.
Veškeré tyto výsledky jasně demonstrují výhody buněčných řad podle vynálezu, ve kterých je integrována pouze specifická funkční jednotka oblasti E4. Tyto výhody spočívají zejména ve schopnosti tvořit virové pláže a v umožněné amplifikaci defektních virů v kapalném prostředí. Tyto výhody spočívají také v regulovaném charakteru exprese aktivity E4, a to na rozdíl od buněčných řad, ve kterých jsou přítomné větší funkční jednotky oblasti E4.
Příklad 3
Produkce virů defektních v oblasti El a E4
V tomto příkladu se popisuje použití buněčných řad podle vynálezu pro produkci rekombinantních virů deficitních v oblastech El a E4. Tyto adenoviry byly produkovány homologní rekombinací po ko-transfekci do buněk podle vynálezu dvou fragmentů DNA, z nichž jeden přináší levou část genomu rekombinantního viru (mající deleci v oblasti El) a druhý přináší pravou část genomu rekombinantního viru (mající deleci v oblasti E4).
Při bližší specifikaci lze uvést, že buňky 293E4 (klon //2 a klon //4) byly kotransfekovány 10 mg DNA viru Ad-RSVbeta-Gal (Stratford-Perricaudet a kol.) digerovaného pomocí Srfl nebo 5 mg DNA plazmidu, který slouží ke konstrukci tohoto viru, digerovaného pomocí Xmnl), a 10 mg DNA viru přinášejícího funkční deleci oblasti E4 (například Ad2dl808, Ad5dll004, Ad5dll007 nebo Ad5dll014) a digerovaného enzymem Clal. Po dosažení cytopatického účinku se viry purifikují alespoň dvěma po sobě jsoucími cykly rozdělení na pevném substrátu za účelem tvorby pláží na klonu 2. Pláže odpovídající infekci požadovaného viru (analýza DNA ukazuje v daném případě podvojnou deleci oblastí El a E4) se potom amplifikují po sobě následujícími infekčními cykly. Základní materiály se připraví purifikací na gradientu chloridu česného. Viru se potom konzervují při teplotě -80 °C klasickými technikami známými v daném oboru.
Kromě schopnosti klonu 2 tvořit virální pláže, umožňuje tento klon obzvláště účinnou propagaci v kapalném prostředí v případě viru Ad5dll014 (El+E4' ale ORF4+) nebo viru ET E4‘ konstruovaného z viru dl 1014.
Naopak klon 4 získaný po transfekci plazmidu pE4Gen není moc účinný při tvorbě pláží, neboť obtížně udržuje buněčnou konfluenci po dobu dostatečně dlouhou ktomu, aby byly pláže virální lyže snadno zjistitelné, (a to zvláště v případě, kdy požadovaný rekombinantní vir nekóduje beta-galaktosidázu).
Alternativní produkční metoda spočívá v klonální konstrukci virů podle vynálezu. Podle této metody jsou adenoviry deltaEldeltaE4 produkovány dvojnou homologní rekombinací in vivo po ko-transfekci 3 fragmentů, z nichž každý přináší část genomu viru.
-22CZ 294969 B6
Následující tři překrývající fragmenty odvozené od genomu AdRSVbetagal a Addll014 byla purifíkovány elektroelucí (obr. 7):
i) fragment I: tímto fragmentem je fragment Narl s 6,8 kb kódující betagel odpovídající levé části (deltaEl) genomu Adrsvbetagal. Jeho kontaminace neresekovaným (a tudíž replikačním) genomem AdRSVbetagel je silně nepravděpodobná, neboť úplná digesce pomocí Narl generuje tento fragment mezi 25 dalšími fragmenty, majícími od 26 nukleotidů až do 3,8 kb, ii) fragment II: tímto fragmentem je fragment Dral s 9,4 kb rovněž odvozený od genomu AdRSVbetagal a překrývající se s fragmentem I ve 1509 nukleotidech (viz obr. 7). Kontaminace tohoto fragmentu infekčním genomem je rovněž nemožná v případě, že tento fragment byl purifikován z 10 dalších fragmentů majících velikost mezi 494 nukleotidy a 4,8 kb, a to po celkové digesci pomocí Dral a AflII, iii) fragment III: tímto fragmentem je fragment Nsil s 21,3 kb odvozený od genomu Ad5 dlí 014. Překrývá se s fragmentem II ve 1652 nukleotidech (obr. 7). Tento fragment přináší pravou část genomu rekombinantního viru obsahující modifikovanou (deltaE4,ORF4+) oblast E4. Jeho kontaminace je ještě jednou tak nepravděpodobnější, poněvadž byl purifikován po úplné digesci pomocí Nsil generující 7 fragmentů s velikostí mezi 178 nukleotidy a 4 kb.
Purifikované fragmenty byly ko-transfekovány do buněk klonu //2 podle protokolu popsaného pro buňky 293 v přítomnosti 1 μΜ dexamethazonu v kultivačním prostředí (přidané vždy po čtyřech dnech v průběhu 3 týdnů). Po ukončení této kultivace byly buňky izolovány, 3 krát zmraženy a rozmraženy v lázni tvořené ledem a ethanolem a potom odstředěny po dobu 20 minut při 3000 g. Buněčný lyzát byl potom přidán k čerstvé kultuře buněk klonu //2 (rovněž označený jako IGRP2) v přítomnosti dexamethazonu (1 μΜ). Po 5 dnech byl pozorován cytopatický účinek dokazující produkci virů. Základní materiál tohoto rekombinantního viru AddeltaEl,deltaE4,ORR4+ byl získán po progresivní amplifikací směsi indukující cytopatický účinek ve 100 miskách o průměru 10 cm obsahujících buňky klonu //2 ve stadiu subkonfluence v přítomnosti 1 μΜ dexamethazonu. Po purifíkaci na gradientu chloridu česného a dialýza při teplotě 4 °C byl základní virový materiál titrován na monovrstvách buněk klonu //2 suplementovaných dexamethazonem (1 μΜ), a to před vybarvením in vitro pomocí X-Gal. V případě, že všechny plaky jsou pozitivní, může být titr vyjádřen v pfu/ml nebo počtem virálních plaků exprimujících betagal. Podle tohoto postupu byl připraven základní virový materiál s 1010 pfu. Potom byla kontrolována nepřítomnost RCA v tomto základním virovém materiálu restrikční analýzou a analýzou Southern. Za tímto účelem byla technikou podle Challberg-a (Virology 114 (1981)196) připravena virální DNA rekombinantu základního materiálu. 2 pg této DNA byly podrobeny restrikční analýze na 1% agarózovém gelu. Získané fragmenty byly převedeny na membránu Hybond-N (Amersham) a hybridizovány s radiačně značenou sondou odpovídající obráceným repetičním frekvencím adenoviru za účelem specifické detekce fragmentů lokalizovaných na konci virálního genomu.
Restrikční analýza pomocí enzymů Smál, AflII nebo Stul poskytla očekávané profily pro preparáty nekontaminované fragmenty ΕΓ nebo E4+, jak o tom svědčí relativní stechiometrie jednotlivých restrikčních fragmentů.
Analýza Southern po převodu na membrány ukazuje, že digesce pomocí Stul generuje pouze dva fragmenty hybridizující se sondou ITR: jeden z těchto fragmentů vykazuje mobilitu odpovídající mobilitě fragmentu s 1125 páry bází AdRSVbetagal kódujícího betagal, zatímco druhý migruje jako fragment Stul s 2673 páry bází Ad5dll014 nesoucí deleci oblasti E4. Prolongovaná expozice autoradiogramu neumožňuje pozorovat žádný dodatečný pás mající velikost odpovídající fragmentu ΕΓ (3158 párů bází) nebo E4+ (3980 párů bází). Stejně tak nebyl detekován fragment odpovídající velikostí (3267 párů bází) zavedení funkční jednotky E4 (ORF4+ORF7) do genomu rekombinantu, což dokazuje, že zde nedošlo ke dvojné rekombinací v průběhu produkce mezi
-23 CZ 294969 B6 virálním genomem a jednotkou E4 integrovanou do buňky. Tyto výsledky ukazují, že buňky podle vynálezu mohou být použity pro účinnou produkci šarží viru deltaEl,deltaE4 prostých RCA.
Příklad 4
Produkce rekombinantních adeno-přidružených virů (AAV)
V tomto příkladu se popisuje použití buněčných řad obsahujících celek nebo část oblasti E4 adenovirálního genomu pro produkci AAV. Tyto AAV byly produkovány ko-transfekcí do uvedených buněk plazmidu ITR-AAV a plazmidu Rep/Cal a konfekcí adenovirem helper.
Použité plazmidy a viry
- plazmid ITR-AAV, označený jako pMAlO: tento plazmid obsahuje zainteresovanou nukleovou kyselinu (expresní kazeta genu beta-gal E.coli tvořená promotorem LTR-RVS, genem LacZ, před kterým je situován signál jádrové lokalizace, a polyadenylačním místem viru SV40) lemovanou 2 ITR AAV. Plazmid pMAlO byl získán digescí plazmidu pXL2582 pomocí Spěl a opětovným uzavřením působením DNA-ligázy bakteriofágu T4. Toto působení umožňuje potlačit palindromické sekvence za levou ITR AAV. Plazmid pXL2582 byl získán ligací následujících fragmentů v místech EcoRI-KpnI plazmidu pXL2359 (popsán v přihlášce FR94 02445):
a) EcoRI-Xbal (obsahující levou ITR od AAV až k nukleotidu 155, místo Hinfl na publikované sekvenci AAV) plazmidu pXL2580 a
b) Xbal-KpnI plazmidu pXL2359 (obsahující expresní kazetu genu LacZ).
Plazmid pXL2580 byl získán z plazmidu pXL2359 následujícím způsobem: plazmid pXL2359 byl digerován pomocí EcoRI-Xbal a deponován na 1% agarózový gel, odkud yl purifikován fragment s 650 páry bází. Tento fragment byl redigerován pomocí Hindi a zpracován DNA-polymerázou bakteriofágu T4, opětovně resekován pomocí Pstl a potom deponován na 2% agarózový gel, odkud byl purifikován fragment s 200 páry bází. Tento fragment obsahující levou ITR od AAV až k nukleotidu 155 byl potom zaveden mezi místa Pstl-Smal plazmidu pBSKS+ (Stratagene).
- plazmid Rep/Cap: použitý plazmid, označený jako pdelta-Bal, byl popsán Lebkowski-m a kol. (Mol. Cel. Biol.8 (1988)3988). Tento plazmid obsahuje oblasti rep a cap od AAV pod kontrolou endogenního promotoru P5. Tento promotor P5 může být nahrazen jinými promotory, zejména konstitutivním promotorem LTR-RVS.
- použitým adenovirem helper je divoký adenovir Ad5. Je samozřejmé, že mohou být použity i další viry helper a zejména Ad5 defektní v oblasti 1 nebo/a E4 nebo psí adenovir. Zajímavost použití psího adenoviru spočívá v jeho schopnost podporovat replikaci AAV, i když jde o defektní vity u člověka. V důsledku toho jsou získané preparáty AAVr zcela prosté RCA a kontaminujícího lidského adenoviru.
Protokol
Produkce byla realizována transfekcí 20 misek o průměru 5 cm s buňkami klonu 112 (IGRP2) (hustota 3.106 buněk v každé misce), které byly 24 až 48 hodin předtím zaočkovány do kultivačního prostředí MEM suplementovaného 10 % fetálního hovězího séra. Do každé misky bylo kotransfekováno: 1 pg plazmidu pMAlO a 5 pg plazmidu pdeltaBal v přítomnosti 16 pg peptidu H+, 16,5 pl lipofektaminu (Gibco-BRl, Life Technology) a Optimem lipofektamin (Gibco
-24CZ 294969 B6
BRL, Life Technology) podle doporučení dodavatele. Po 4 až 16 hodinách kontaktu směsi s buňkami, byla transfekční směs odtažena a buňky byly infikovány po dobu jedné hodiny adenovirem helper při potenci 10 pfu vir/buňka ve finálním objemu 500 μΐ. Potom bylo přidáno prostředí MEM suplementované 10 % fetálního hovězího séra a 106 M dexamethasonu. Po pěti dnech byly buňky izolovány, vyjmuty pufrem tris-HCl 10 mM, PH 8 a podrobeny lyži 3 zmraženími a rozmraženími, načež byly zpracovány deoxycholátem sodným a tiypsinem v koncentracích 0,25 % resp. 1 % po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Produkované rekombinantní AAV byly potom purifikovány na gradientu chloridu česného o hustotě 1,4 v rotoru SW55.1 při 35 000 otáčkách za minutu po dobu 20 hodin.
Uvedené pokusy umožnily získat vysoké titry rekombinantních virů: 1011 genomů/ml. Uvedený způsob tedy umožňuje produkovat velmi vysoká množství rekombinantních AAV (způsoby popsané v rámci dosavadního stavu techniky vedly k 10- až 100- krát nižším titrům), majících vlastnosti vhodné pro terapeutické použití u člověka. Kromě toho je snadné použít desetkrát větší množství buněk a získat takto dále zvýšený titr virů.
Seznam sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID n°l:
charakteristika sekvence délka: 20 párů bází typ: nukleotid počet vláken: jediné konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc popis sekvence:
AAGCAGCCAA GGGGTTGTTT.
Informace o sekvenci SEQ ID n°2:
charakteristika sekvence: délka: 20 párů bází typ: nukleotid počet vláken: jediné konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc popis sekvence:
ACCCTAGTAT TCAACCTGCC.
Informace o sekvenci SEQ ID n°3:
charakteristika sekvence: délka: 20 párů bází typ: nukleotid počet vláken:jediné konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc popis sekvence:
-25CZ 294969 B6
ATCATCACAA
GAGCGGAACG.
Informace o sekvenci SEQ ID n°4:
charakteristika sekvence:
délka: 3189 párů bází typ: nukleotid počet vláken: dvě konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc io antimediátorová: ne popis sekvence:
-26CZ 294969 B6
| CATCCTCTTA | CACTTTTTCA | TACATTGCCC | AAGAATAAAG | AATCGTTTGT | GTTATGTTTC | 60 |
| AACGTGTTTA | TTTTTCAATT | GCAGAAAATT | TCAAGTCATT | TTTCATTCAG | TAGTATAGCC | 120 |
| CCACCACCAC | ATAGCTTATA | CAGATCACCG | TACCTTAATC | AAACTCACAG | AACCCTAGTA | 180 |
| TTCAACCTGC | CACCTCCCTC | CCAACACACA | GAGTACACAG | TCCTTTGTCC | CCGGCTGGCC | 240 |
| TTAAAAAGCA | TCATATCATG | GGTAACAGAC | ATATTCTTAG | GTGTTATATT | CCACACGGTT | 300 |
| TCCTGTCGAG | CCAAACGCTC | ATCAGTGATA | TTAATAAACT | CCCCGGGCAG | CTCACT7AAG | 3 63 |
| TTCATGTCGC | TGTCCAGCTG | CTGAGCCACA | GGCTGCTGTC | CAACTTGCGG | TTGCTTAACG | 420 |
| GGCGGCGAAG | GAGAAGTCCA | CGCCTACATG | GGGGTAGAGT | CATAATCGTG | CATCAGGATA | 480 |
| GGGČGGTGGT | GCTGCAGCAG | CGCGCGAATA | AACTGCTGCC | GCCGCCGC7C | CGTCCTGCAG | 54 0 |
| GAATACAACA | TGGCAGTGGT | CTCCTCAGCG | ATGATTCGCA | CCGCCCGCAG | CATAAGGCGC | 600 |
| CTTGTCCTCC | GGGCACAGCA | GCGCACCCTG | ATCTCACTTA | AATCAGCACA | GTAACTGCAG | 660 |
| CACAGCACCA | CAATATTGTT | CAAAATCCCA | CAGTGCAAGG | CGCTGTATCC | AAAGCTCATG | 720 |
| GCGGGGACCA | CAGAACCCAC | GTGGCCATCA | TACCACAAGC | GCAGGTAGA7 | TAAGTGGCGA | i - 0 |
| CCCCTCATAA | ACACGCTGGA | CATAAACATT | ACCTCTTTTG | GCATGTTGTA | ATTCACCACC | 940 |
| TCCCGGTACC | ATATAAACCT | CTGATTAAAC | ATGGCGCCAT | CCACCACCAT | CCTAAACCAG | SOC |
| CTGGCCAAAA | CCTGCCCGCC | GGCTATACAC | TGCAGGGAAC | CGGGACTGGA | ACAATGACAG | 960 |
| TGGAGAGCCC | AGGACTCGTA | ACCATGGATC | ATCATGCTCG | TCATGATATC | AATGTTGGCA | 1020 |
| CAACACAGGC | ACACGTGCAT | ACACTTCCTC | AGGATTACAA | GCTCCTCCCG | CGTTAGAACC | 1080 |
| ATATCCCAGG | GAACAACCCA | TTCCTGAATC | AGCGTAAATC | CCACAČTGCA | GGlj.—AGA'— _ . | 14 C |
| CGCACGTAAC | TCACGTTGTG | CATTGTCAAA | GTGTTACATT | CGGGCAGCAG | CGGATGATCC | 12'30 |
| TCCAGTATGG | TAGCGCGGGT | TTCTGTCTCA | AAAGGAGGTA | GACGATCCCT | ACTGTACGGA | .1Z £ c |
| GTGCGCCGAG | ACAACCGAGA | TCGTGTTGGT | CGTAGTGTCA | TGCCAAATGG | AACGCCGGAC | 1320 |
| GTAGTCATAT | TTCCTGAAGC | AAAACCAGGT | GCGGGCGTGA | CAAACAGATC | TGCGTCTCCG | 1380 |
| GTCTCGCCGC | TTAGATCGCT | CTGTGTAGTA | GTTGTAGTAT | ATCCACTCTC | TCAAAGCATC | 1440 |
| CAGGCGCCCC | CTGGCTTCGG | GTTCTATGTA | AACTCCTTCA | TGCGCCGCTG | CCCTGATAAC | 15 0 0 |
| ATCCACCACC | GCAGAATAAG | CCACACCCAG | CCAACCTACA | CATTCGTTCT | GCGAGTCACA | 1S ó 0 |
-27CZ 294969 B6
| CACGGGAGGA | GCGGGAAGAG | CTGGAAGAAC | CATGTTTTTT | TTTTTATTCC | AAAAGATTAT | 16 2 C |
| CCAAAACCTC | AAAATGAAGA | TCTATTAAGT | GAACGCGCTC | CCCTCCGGTG | GCGTGGTCAA | 1630 |
| ACTCTACAGC | CAAAGAACAG | ATAATGGCAT | TTGTAAGATG | TTGCACAATG | GCTTCCAAAA | 174C |
| GGCAAACGGC | CCTCACGTCC | AAGTGGACGT | AAAGGCTAAA | CCCTTCAGGG | TGAATCTCCT | 1800 |
| CTATAAACAT | TCCAGCACCT | TCAACCATGC | CCAAATAATT | CTCATCTCGC | CACCTTCTCA | 1360 |
| ATATATCTCT | AAGCAAATCC | CGAATATTAA | GTCCGGCCAT | TGTAAAAATC | TGCTCCAGAG | 1920 |
| CGCCCTCCAC | CTTCAGCCTC | AAGCAGCGAA | TCATGATTGC | AAAAATTCAG | GTTCCTCACA | 1980 |
| GACCTGTATA | AGATTCAAAA | GCGGAACATT | AACAAAAATA | CCGCGATCCC | GTAGGTCCCT | 2040 |
| TCGCAGGGCC | AGCTGAACAT | AATCGTGCAG | GTCTGCACGG | ACCAGCGCGG | CCACTTCCCC | 2100 |
| GCCAGGAACC | ATGACAAAAG | AACCCACACT | GATTATGACA | CGCATACTCG | GAGCTATGCT | 2160 |
| AACCAGCGTA | GCCCCGATGT | AAGCTTGTTG | CATGGGCGGC | GATATAAAAT | GCAAGGTGCT | 2220 |
| GCTCAAAAAA | TCAGGCAAAG | CCTCGCGCAA | AAAAGAAAGC | ACATCGTAGT | CATGCTCATG | 2230 |
| CAGATAAAGG | CAGGTAAGCT | CCGGAACCAC | CACAGAAAAA | GACACCATTT | TTCTCTCAAA | 2340 |
| CATGTCTGCG | GGTTTCTGCA | TAAACACAAA | ATAAAATAAC | AAAAAAACAT | TTAAACATTA | 2400 |
| GAAGCCTGTC | TTACAACAGG | AAAAACAACC | CTTATAAGCA | TAAGACGGAC | TACGGCCATG | 2460 |
| CCGGCGTGAC | CGTAAAAAAA | CTGGTCACCG | TGATTAAAAA | GCACCACCGA | CAGCTCCTCG | 2 520 |
| GTCATGTCCG | GAGTCATAAT | GTAAGACTCG | GTAAACACAT | CAGGTTGATT | CACATCGGTC | 2580 |
| AGTGCTAAAA | AGCGACCGAA | ATAGCCCGGG | GGAATACATA | CCCGCAGGCG | TAGAGACAAC | 2640 |
| ATTACAGCCC | CCATAGGAGG | TATAACAAAA | TTAATAGGAG | AGAAMACAC | ATAAACACCT | 2700 |
| GAAAAACCCT | CCTGCCTAGG | CAAAATAGCA | CCCTCCCGCT | CCAGAACAAC | ATACAGCGCT | 2760 |
| TCCACAGCGG | CAGCCATAAC | AGTCAGCCTT | ACCAGTAAAA | AAGAAAACCT | ATTAAAAAAA | 2820 |
| CACCACTCGA | CACGGGACCA | GCTCAATCAG | TCACAGTGTA | aaaaagggcc | AAGTGCAGAG | 2880 |
| CGAGTATATA | TAGGACTAAA | AAATGACGTA | ACGGTTAAAG | TCCACAAAAA | ACACCCAGAA | 294 0 |
| AACCGCACGC | GAACCTACGC | CCAGAAACGA | AAGCCAAAAA | ACCCACAACT | TCCTCAAATC | 3000 |
| GTCACTTCCG | TTTTCCCACG | TTACGTCACT | TCCCATTTTA | AGAAAACTAC | AATTCCCAAC | 3060 |
| ACATACAAGT | TACTCCGCCC | TAAAACCTAC | GTCACCCGCC | CCGTTCCCAC | GCCCCGCGCG | 3120 |
| ACGTCACAAA | CTCCACCCCC | TCATTATCAT | ATTGGCTTCA | ATCCAAAATA | AGGTATATTA | 3180 |
3139
TTGATGATG
Informace o sekvenci SEQ ID n°5:
charakteristika sekvence:
délka: 48 párů bází typ: nukleotid počet vláken: dvě konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc
-28CZ 294969 B6 hypotetická: ne antimediátorová: ne popis sekvence:
GGGCCCGCCG CCACCATGGA TATTGAACCT GAAGTGTTAT ATGCAGGA.
Informace o sekvenci SEQ ID n°6:
charakteristika sekvence:
délka: 39 párů bází typ: nukleotid počet vláken: dvě konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc popis sekvence:
CTCGAGAACG CCGGACGTAG TCTTTTGATG AAACAGAAG
Informace o sekvenci SEQ ID n°7:
charakteristika sekvence: délka: 1884 párů bází typ: nukleotid počet vláken: dvě konfigurace: lineární typ molekuly: DNAc hypotetická: ne antimediátorová: ne popis sekvence:
| ATGGATATTG | AACCTGAAGT | GTTATATGCA | GGATATGATA | GCTCTGTTCC | AGACTCAACT | 60 |
| TGGAGGATCA | TGACTACGCT | CAACATGTTA | GGAGGGCGGC | AAGTGATTGC | AGCAGTGAAA | 12 0 |
| TGGGCAAAGG | CAATACCAGG | TTTCAGGAAC | TTACACCTGG | ATGACCAAAT | GACCCTACTG | 1Θ0 |
| CAGTACTCCT | GGATGTTTCT | TATGGCATTT | GCTCTGGGGT | GGAGATCATA | TAGACAATCA | 240 |
| AGTGCAAACC | TGCTGTGTTT | TGCTCCTGAT | CTGATTATTA | ATGAGCAGAG | AATGACTCTA | 300 |
| CCCTGCATGT | ACGACCAATG | TAAACACATG | CTGTATGTTT | CCTCTGAGTT | ACACAGGCTT | 360 |
| CAGGTATCTT | ATGAAGAGTA | TCTCTGTATG | AAAACCTTAC | TGCTTCTCTC | TTCAGTTCCT | 420 |
-29CZ 294969 B6
| AAGGACGGTC | TGAAGAGCCA | AGAGCTATTT | GATGAAATTA | GAATGACCTA | CATCAAAGAG | 480 |
| C T AG GAAAAG | CCATTGTCAA | GAGGGAAGGA | AACTCCAGCC | AGAACTGGCA | GCGGTTTTAT | 540 |
| CAACTGACAA | AACTCTTGGA | TTCTATGCAT | GAAGTGGTTG | AAAATCTCCT | TAACTATTGC | 600 |
| TTCCAAACAT | TTTTGGATAA | GACCATGAGT | ATTGAATTCC | CCGAGATGTT | AGCTGAAATC | 660 |
| ATCACCAATC | AGATACCAAA | ATATTCAAAT | GGAAATATCA | AAAAACTTCT | GTTTCATCAA | 720 |
| AAGACTACGT | CCGGCGTTCC | ATTTGGCATG | ACACTACGAC | CAACACGATC | TCGGTTGTCT | 780 |
| CGGCGCACTC | CGTACAGTAG | GGATCGTCTA | CCTCCTTTTG | AGACAGAAAC | CCGCGCTACC | 840 |
| ATACTGGAGG | ATCATCCGCT | GCTGCCCGAA | TGTAACACTT | TGACAATGCA | CAACGTGAGT | 900 |
| TACGTGCGAG | GTCTTCCCTG | CAGTGTGGGA | TTTACGCTGA | TTCAGGAATG | GGTTGTTCCC | 960 |
| TGGGATATGG | TTCTAACGCG | GGAGGAGCTT | GTAATCCTGA | GGAAGTGTAT | GCACGTGTGC | 1020 |
| CTGTGTTGTG | CCAACATTGA | TATCATGACG | AGCATGATGA | TCCATGGTTA | CGAGTCCTGG | 1080 |
| GCTCTCCACT | GTCATTGTTC | CAGTCCCGGT | TCCCTGCAGT | GTATAGCCGG | CGGGCAGGTT | 1140 |
| TTGGCCAGCT | GGTTTAGGAT | GGTGGTGGAT | GGCGCCATGT | TTAATCAGAG | GTTTATATGG | 1200 |
| TACCGGGAGG | TGGTGAATTA | CAACATGCCA | AAAGAGGTAA | TGTTTATGTC | CAGCGTGTTT | 1260 |
| ATGAGGGGTC | GCCACTTAAT | CTACCTGCGC | TTGTGGTATG | ATGGCCACGT | GGGTTCTGTG | 1320 |
| GTCCCCGCCA | TGAGCTTTGG | ATACAGCGCC | TTGCACTGTG | GGATTTTGAA | CAATATTGTG | 1380 |
| GTGCTGTGCT | GCAGTTACTG | TGCTGATTTA | AGTGAGATCA | GGGTGCGCTG | CTGTGCCCGG | 1440 |
| AGGACAAGGC | GCCTTATGCT | GCGGGCGGTG | CGAATCATCG | CTGAGGAGAC | CACTGCCATG | 1500 |
| TTGTATTCCT | GCAGGACGGA | GCGGCGGCGG | CAGCAGTTTA | TTCGCGCGCT | GCTGCAGCAC | 1560 |
| CACCGCCCTA | TCCTGATGCA | CGATTATGAC | TCTACCCCCA | TGTAGGCGTG | GACTTCTCCT | 1620 |
| TCGCCGCCCG | TTAAGCAACC | GCAAGTTGGA | CAGCAGCCTG | TGGCTCAGCA | GCTGGACAGC | 1Ó30 |
| GACATGAACT | TAAGTGAGCT | GCCCGGGGAG | ΤΤΤΑΤΤΑΑΤΆ | TCACTGATGA | GCGTTTGGCT | 1740 |
| CGACAGGAAA | CCGTGTGGAA | TATAACACCT | AAGAATATGT | CTGTTACCCA | TGATATGATG | 1800 |
| CTTTTTAAGG | CCAGCCGGGG | AGAAAGGACT | GTGTACTCTG | TGTGTTGGGA | GGGAGGTGGC | 1860 |
| AGGTTGAATA | CTAGGGTTCT | GTGA | 1884 |
Informace o sekvenci SEQ ID n°8:
charakteristika sekvence:
délka: 534 aminokyselin typ: aminokyselina počet vláken: jediné konfigurace: lineární typ molekuly: protein popis sekvence:
-30CZ 294969 B6
| Met 1 | Asp | Ile | Glu | Pro 5 | Glu Val | Leu Tyr | Ala 10 | Gly | Tyr | Asp | Ser | Ser 15 | Val | ||
| Pro | Asp | Ser | Thr | Trp | Arg | Ile | Met | Thr | Thr | Leu | Asn | Met | Leu | Gly | Gly |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Arg | Gin | Val | Ile | Ala | Ala | Val | Lys | Trp | Ala | Lys | Ala | Ile | Pro | Gly | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Arg | Asn | Leu | His | Leu | Asp | Asp | Gin | Met | Thr | Leu | Leu | Gin | Tyr | Ser | Trp |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Met | Phe | Leu | Met | Ala | Phe | Ala | Leu | Gly | Trp | Arg | Ser | Tyr | Arg | Gin | Ser |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ser | Ala | Asn | Leu | Leu | Cys | Phe | Ala | Pro | Asp | Leu | Ile | Ile | Asn | Glu | Gin |
| 95 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Arg | Met | Thr | Leu | Pro | Cys | Met | Tyr Asp | Gin | Cys | Lys | His | Met | Leu | Tyr | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Val | Ser | Ser | Glu | Leu | His | Arg | Leu | Gin | Val | Ser | Tyr | Glu | Glu | Tyr | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Cys | Met | Lys | Thr | Leu | Leu | Leu | Leu | Ser | Ser | Val | Pro | Lys | Asp | Gly | Leu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Gin | G1 u | Leu | Phe | Asp | Glu | Ile | Arg | Met | Thr | Tyr | I le | Lys | Glu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Leu | Gly | Lys | Ala | Ile | Val | Lys | Arg | Glu | Gly | Asn | Ser | Ser | Gin | Asn | Trp |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gin | Arg | Phe | Tyr | Gin | Leu | Thr | Lys | Leu | Leu | Asp | Ser | Met | His | Glu | Val |
| 190 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Val | Glu | Asn | Leu | Leu | Asn | Tyr | Cys | Phe | Gin | Thr | Phe | Leu | Asp | Lys | Thr |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Met | Ser | Ile | Glu | Phe | Pro | Glu | Met | Leu | Ala | Glu | Ile | Ile | Thr | Asn | Gin |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Ile | Pro | Lys | Tyr | Ser | Asn | Gly | Asn | Ile | Lys | Lys | Leu | Leu | Phe | His | Gin |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Lys | Thr | Thr | Ser | Gly | Val | Pro | Phe | Gly | Met | Thr | Leu | Arg | Pro | Thr | Arg |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Ser | Arg | Leu | Ser | Arg | Arg | Thr | Pro | Tyr | Ser | Arg | Asp | Arg | Leu | Pro | Pro |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Phe | Glu | Thr | Glu | Thr | Arg | Ala | Thr | Ile | Leu | Glu | Asp | His | Pro | Leu | Leu |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Pro | Glu | Cys | Asn | Thr | Leu | Thr | Met | His | Asn | Val | Ser | Tyr | Val | Arg | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Leu | Pro | Cys | Ser | Val | Gly | Phe | Thr | Leu | Ile | Gin | Glu | Trp | Val | Val | Pro |
| 305 | 310 | 315 | 320 |
-31 CZ 294969 B6
| Trp Asp Met Val | Leu Thr Arg | Glu Glu | Leu 330 Ile | Val Asp | Ile Ile | Leu Met | Arg Thr 350 | Lys 335 Ser | Cys Met | ||||||
| 325 | Cys | ||||||||||||||
| Met | His Val | Cys 340 | Leu | Cys | Ala | Asn 345 | |||||||||
| Met | Ile | His | Gly | Tyr | Glu | Ser | Trp | Ala | Leu | His | Cys | His | Cys | Ser | Ser |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Pro | Gly | Ser | Leu | Gin | Cys | Ile | Ala | Gly | Gly | Gin | Val | Leu | Ala | Ser | Trp |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Phe | Arg | Met | Val | Val | Asp | Gly | Ala | Met | Phe | Asn | Gin | Arg | Phe | Ile | Trp |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Tyr | Arg | Glu | Val | Val | Asn | Tyr | Asn | Met | Pro | Lys | Glu | Val | Met | Phe | Met |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Val | Phe | Met | Arg | Gly Arg | His | Leu | Ile | Tyr | Leu | Arg | Leu | Trp | |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Tyr | Asp | Gly | His | Val | Gly | Ser | Val | Val | Pro | Ala | Met | Ser | Phe | Gly | Tyr |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Ser | Ala | Leu | His | Cys | Gly | Ile | Leu | Asn | Asn | Ile | Val | Val | Leu | Cys | Cys |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Ser | Tyr | Cys | Ala | Asp | Leu | Ser | Glu | Ile | Arg | Val | Arg | Cys | Cys | Ala | Arg |
| 465 | 470 | 475 | 4Θ0 | ||||||||||||
| Arg | Thr | Arg | Arg | Leu | Met | Leu | Arg | Ala | Val | Arg | Ile | Ile | Ala | Glu | Glu |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Thr | Thr | Ala | Met | Leu | Tyr | Ser | Cys | Arg | Thr | Glu | Arg | Arg | Arg | Gin | Gin |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Phe | Ile | Arg | Ala | Leu | Leu | Gin | His | His | Arg | Pro | Ile | Leu | Met | His | Asp |
| 515 | 520 | 525 |
Tyr Asp Ser Thr Pro Met 530
-32CZ 294969 B6
Claims (47)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Buňka použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4, obsahující ve formě vložené do svého genomu část oblasti E4 genomu adenoviru nesoucí čtecí rámec ORF6 pod kontrolou funkčního promotoru, přičemž tato část oblasti E4 neobsahuje funkční čtecí rámec ORF4.
- 2. Buňka podle nároku 1, ve které část oblasti E4 má délku menší než 2 kb.
- 3. Buňka podle nároku 1 nebo 2, ve které část oblasti E4 obsahuje čtecí rámec ORF6 a ORF6/7.
- 4. Buňka podle některého z předcházejících nároků, ve které část oblasti E4 pochází z genomu lidského adenoviru skupiny C.
- 5. Buňka podle nároku 4, ve které oblast E4 pochází z genomu adenoviru Ad2 nebo Ad5.
- 6. Buňka podle některého z předcházejících nároků, ve které promotor je indukovatelný promotorem.
- 7. Buňka podle nároku 6, ve které promotor je zvolen z množiny zahrnující promotor MMTV a jeho deriváty.
- 8. Buňka podle některého z nároků 1 až 6, ve které část oblasti E4 obsahuje čtecí rámec ORF6 sloučený vtranslační fázi s doménou jádrového receptoru, která je zodpovědná za rozpoznání svého specifického ligandu.
- 9. Buňka podle nároku 8, ve které doménou jádrového receptoru je doména fixace hormonu receptoru ke glukokortikoidům (HBD-GCR).
- 10. Buňka podle nároku 9, ve které čtecí rámec ORF6 sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptoru zodpovědnou za rozpoznání svého specifického ligandu je vložena pod kontrolu indukovatelného promotoru, který vykazuje odezvu vůči glukokortikoidům.
- 11. Buňka podle nároku 10, ve které indukovatelným promotorem je promotor GRE5.
- 12. Buňka podle některého z předcházejících nároků, která je odvozena z buňky, která transkomplementuje oblast El.
- 13. Buňka podle nároku 12, která je odvozena z buněčné řady 293.
- 14. Buňka podle některého z nároků 1 až 11, která je odvozena z buněk KB, Hela, MDCK, Věro nebo gmDBPó.
- 15. Buňka podle některého z nároků 1 až 11, která je odvozena z primární buněčné kultury.
- 16. Buňka podle nároku 1 nebo 2, která obsahuje ve formě vložené do svého genomu fragment BglII—Bgl 1II odpovídající nukleotidům 34115-32490 genomu Ad5.
- 17. Buňka podle nároku 16, kterou je buňka buněčné řady 293.-33CZ 294969 B6
- 18. Buňka podle nároku 16 nebo 17, kterou je buňka buněčné řady 293 transformované plazmidem podle nároku 23.
- 19. Buňka podle nároku 1 nebo 2, která obsahuje ve formě vložené ve svém genomu fragment BgllII-PvuII odpovídající nukleotidům 34115-33126 genomu Ad5.
- 20. Buňka podle nároku 1 nebo 2, která obsahuje ve formě vložené do svého genomu chimérický gen obsahující čtecí rámec ORF6 genomu adenoviru sloučený na jednom ze svých konců s vazebnou doménou hormonu receptorů ke glukokortikoidům.
- 21. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kterou je buňka buněčné řady 293 transformované plazmidem, ve kterém část oblasti E4 genomu adenoviru nese čtecí rámec ORF6 genomu adenoviru sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptorů zodpovědnou za rozpoznání svého specifického ligandů.
- 22. Plazmid obsahující část oblasti E4 genomu adenoviru nesoucí čtecí rámec ORF6 pod kontrolou indukovatelného heterogenního promotoru, přičemž tato část oblasti E4 neobsahuje funkční čtecí rámec ORF4.
- 23. Plazmid podle nároku 22, ve kterém část oblasti E4 genomu adenoviru nese čtecí rámec ORF6 a ORF6/7.
- 24. Plazmid podle nároku 22, ve kterém část oblasti E4 genomu adenoviru nese čtecí rámec ORF6 genomu adenoviru sloučený v translační fázi s doménou jádrového receptorů zodpovědnou za rozpoznání svého specifického ligandů.
- 25. Použití buňky podle některého z nároků 1 až 21 pro produkci rekombinantních adenovirů defektních alespoň v oblasti E4.
- 26. Způsob produkce rekombinantních adenovirů defektivních alespoň v oblasti E4, v y z n a č e n ý t í m , že se kultura buněk podle některého z nároků 1 až 21 transformuje jedním nebo několika plazmidy přinášejícími různé oblasti genomu uvedeného defektního rekombinantního adenoviru, načež se izolují produkované viry.
- 27. Způsob podle nároku 26 pro produkci rekombinantních adenovirů defektivních v oblastech El aE4.
- 28. Způsob podle nároku 26 nebo 27, vyznačený tím, že kulturou buněk je kultura buněk podle některého z nároků 16 až 21.
- 29. Defektní rekombinantní adenovirus deltaEl,ORF3“,ORF6~; obsahující deleci celku nebo části oblasti El a nukleotidů 34801-34329 a 34115-33126 v oblasti E4.
- 30. Defektní rekombinantní adenovirus deltaEl,deltaE4,ORFl+ obsahující deleci celu nebo části oblasti E4 a deleci oblasti E4 s výjimkou čtecího rámce ORF1.
- 31. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 30, který obsahuje deleci oblasti El a deleci fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen ve čtecím rámci ORF7 a jehož 3'-konec je situován ve čtecím rámci ORF2.
- 32. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 31, který obsahuje deleci v oblasti E4 pokrývající nukleotidy 33093 až 35053.
- 33. Defektní rekombinantní adenovirus deltaEl,deltaE4,ORF4+ obsahující deleci celku nebo části oblasti El a deleci oblasti E4 s výjimkou čtecího rámci ORF4.-34CZ 294969 B6
- 34. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 33, který obsahuje deleci v oblasti El, deleci fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen ve čtecím rámci ORF7 a jehož 3'-konec je situován ve čtecím rámci ORF6, a deleci fragmentu, jehož 5'-konec je obsažen ve čtecím rámci ORF3 a jehož 3'-konec je situován ve čtecím rámci ORF1 nebo v promotorové oblasti E4.
- 35. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 34, který obsahuje deleci oblasti El, deleci pokrývající nukleotidy 33093 (SmaI)-33695 a deleci pokrývající nukleotidy 34634-35355 (Smál).
- 36. Defektní rekombinantní adenovirus deltaEl,deltaE4 obsahující deleci celku nebo části oblasti El a deleci pokrývající celek oblasti E4, zvolenou z množiny zahrnující následující delece: nukleotidy 32720-35835, 33466-35355 a 33093-35355.
- 37. Použití buňky podle některého z nároků 1 až 21 při způsobu produkce rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV.
- 38. Použití buňky podle některého z nároků 1 až 21 při způsobu produkce rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV, při kterém se do kultury buněk zavede plazmid AAV nesoucí zainteresovanou nukleovou kyselinu lemovanou sekvencemi ITR od AAV, adenovir helper a funkce Rep a Cap od AAV a při kterém se následně izolují produkované viry.
- 39. Použití podle nároku 38, při kterém je kulturou buněk kultura buněk obsahující celou oblast E4.
- 40. Použití podle nároku 38, při kterém je kulturou buněk kultura buněk obsahující čtecí rámec ORF6 a případně čtecí rámec ORF6/7.
- 41. Použití podle nároku 38, při kterém je adenovirem helper lidský adenovir defektní v oblasti E4.
- 42. Použití podle nároku 38, při kterém je adenovirem helper lidský adenovir defektní v oblasti El aE4.
- 43. Použití podle nárok 38, při kterém je adenovirem helper defektní psí adenovir.
- 44. Použití podle nároku 43, při kterém je adenovirem helper adenovir zvolený z množiny zahrnující kmeny CAV2.
- 45. Použití podle nároku 38, při kterém jsou funkcemi Rep a Cap funkce zavedené kotransfekcí buněk plazmidem nesoucím oblasti Rep a Cap od AAV.
- 46. Použití podle nároku 38, při kterém jsou zavedenými plazmidy plazmidy transfekované v přítomnosti činidla zkompaktňujícího nukleové kyseliny a kationtového lipidu.
- 47. Použití buňky podle některého z nároků 1 až 21 při způsobu produkce rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV, při kterém se do kultury buněk kotransfekuje v přítomnosti polykationtového lipidu a zkompaktňujícího činidla plazmid AAV nesoucí zainteresovanou nukleovou kyselinu lemovanou sekvencemi IRE od AAV a plazmid nesoucí oblasti Rep a Cap od AAV, při kterém se následně uvedená kultura buněk koinfíkuje adenovirem helper zvoleným z množiny zahrnující adenoviry lidského původu Ad2 nebo Ad5 defektní v oblastech El a E4 a adenoviry psího původu CAV2 a při kterém se následně produkované viry izolují.7 výkresů
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9500747A FR2729674B1 (fr) | 1995-01-20 | 1995-01-20 | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| FR9506532A FR2741891B1 (fr) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| FR9510541A FR2738575B1 (fr) | 1995-09-08 | 1995-09-08 | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
| PCT/FR1996/000088 WO1996022378A1 (fr) | 1995-01-20 | 1996-01-19 | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ230697A3 CZ230697A3 (en) | 1997-10-15 |
| CZ294969B6 true CZ294969B6 (cs) | 2005-04-13 |
Family
ID=27253011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19972306A CZ294969B6 (cs) | 1995-01-20 | 1996-01-19 | Buňka použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů, plazmid pro transformaci této buňky, způsob produkce defektních rekombinantních adenovirů, takto získaný defektní rekombinantní adenovir a použití uvedené buňky pro produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6127175A (cs) |
| EP (1) | EP0805868A1 (cs) |
| JP (1) | JPH11504502A (cs) |
| KR (1) | KR100510822B1 (cs) |
| AU (1) | AU717253B2 (cs) |
| BR (1) | BR9606971A (cs) |
| CA (1) | CA2210168A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ294969B6 (cs) |
| FI (1) | FI973055A (cs) |
| HU (1) | HU222191B1 (cs) |
| IL (1) | IL116816A (cs) |
| MX (1) | MX9704552A (cs) |
| NO (1) | NO320382B1 (cs) |
| SK (1) | SK99097A3 (cs) |
| WO (1) | WO1996022378A1 (cs) |
Families Citing this family (327)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08511423A (ja) * | 1993-06-10 | 1996-12-03 | ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド | 血友病治療のためのアデノウイルスベクター |
| JP3816518B2 (ja) * | 1994-06-10 | 2006-08-30 | ジェンベク、インコーポレイティッド | 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系 |
| US5756283A (en) * | 1995-06-05 | 1998-05-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy |
| US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| US6004797A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-21 | Avigen, Inc. | Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production |
| US6730662B1 (en) | 1996-07-05 | 2004-05-04 | Mcgill University | Adenovirus E4 proteins for inducing cell death |
| WO1998001563A2 (en) * | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Branton Philip E | Adenovirus e4 proteins for inducing cell death |
| US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| NZ508399A (en) * | 1996-09-25 | 2003-06-30 | Novartis Ag | Packaging cell lines for use in facilitating the development of high capacity adenoviral vectors |
| US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| US6544769B1 (en) | 1996-12-13 | 2003-04-08 | Schering Corporation | Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
| US6168944B1 (en) | 1997-01-31 | 2001-01-02 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| US6146891A (en) * | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| JP2000509614A (ja) * | 1997-03-04 | 2000-08-02 | バクスター インターナショナル インコーポレイテッド | アデノウイルスｅ１−相補性細胞系 |
| CN1177934C (zh) | 1997-04-28 | 2004-12-01 | 阿文蒂斯药物股份有限公司 | 腺病毒介导的肿瘤内投送血管生成拮抗剂用于肿瘤的治疗 |
| JP4812914B2 (ja) | 1997-06-23 | 2011-11-09 | ユニバーシティ オブ サスカチュワン | ウシアデノウイルスタイプ３ゲノム |
| PT1049767E (pt) | 1998-01-08 | 2005-10-31 | Agronomique Inst Nat Rech | Coelho transgenico que expressa uma lipoproteina (a) humana funcional |
| CA2319212A1 (en) * | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Genzyme Corporation | Methods for purified aav vector production |
| FR2777570A1 (fr) * | 1998-04-17 | 1999-10-22 | Transgene Sa | Mutant ayant une activite phosphoribosyl transferase |
| US6225456B1 (en) | 1998-05-07 | 2001-05-01 | University Technololy Corporation | Ras suppressor SUR-5 |
| US6506889B1 (en) | 1998-05-19 | 2003-01-14 | University Technology Corporation | Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods |
| GB9811171D0 (en) * | 1998-05-22 | 1998-07-22 | Royal Free Hosp School Med | Viral vector |
| GB9811172D0 (en) * | 1998-05-22 | 1998-07-22 | Royal Free Hosp School Med | Virus production |
| JP2002528128A (ja) | 1998-11-02 | 2002-09-03 | ユニバーシティ オブ サスカチュワン | 組換えアデノウイルスベクターの増殖のためのアデノウイルス必須機能を発現するウシ細胞 |
| US6441156B1 (en) * | 1998-12-30 | 2002-08-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Calcium channel compositions and methods of use thereof |
| US7960540B2 (en) | 1999-04-08 | 2011-06-14 | Advanced Cancer Therapeutics, Llc | Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin |
| DK1181304T3 (da) | 1999-04-08 | 2008-02-11 | Antisoma Res Ltd | Antiproliferativ virkning af G-rige oligonucleotider samt fremgangsmåde til anvendelse af dem til binding af nucleolin |
| US8114850B2 (en) | 1999-04-08 | 2012-02-14 | Advanced Cancer Therapeutics, Llc | Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| IL151987A0 (en) | 2000-03-31 | 2003-04-10 | Aventis Pharma Inc | Nuclear factor kb inducing factor |
| GB0018307D0 (en) | 2000-07-26 | 2000-09-13 | Aventis Pharm Prod Inc | Polypeptides |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| DE10066104A1 (de) * | 2000-09-08 | 2003-01-09 | Medigene Ag | Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung |
| IL155726A0 (en) | 2000-12-28 | 2003-11-23 | Wyeth Corp | Recombinant protective protein from streptococcus pneumoniae |
| AUPR518501A0 (en) | 2001-05-22 | 2001-06-14 | Unisearch Limited | Yin yang-1 |
| US6677156B2 (en) * | 2001-07-23 | 2004-01-13 | Genvec, Inc. | Non-adenoviral gene product-based complementing cells for adenoviral vectors |
| US6682929B2 (en) | 2001-07-23 | 2004-01-27 | Genvec, Inc. | Adenovector complementing cells |
| US20030129203A1 (en) * | 2001-08-27 | 2003-07-10 | Nautilus Biotech S.A. | Mutant recombinant adeno-associated viruses |
| US7647184B2 (en) * | 2001-08-27 | 2010-01-12 | Hanall Pharmaceuticals, Co. Ltd | High throughput directed evolution by rational mutagenesis |
| US20040253210A1 (en) * | 2001-08-30 | 2004-12-16 | Marjorie Robert-Guroff | Adenovirus type7 vectors |
| US20040023910A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-02-05 | Zhiming Zhang | Use of cyr61 in the treatment and diagnosis of human uterine leiomyomas |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| US20030224404A1 (en) * | 2002-02-25 | 2003-12-04 | Manuel Vega | High throughput directed evolution of nucleic acids by rational mutagenesis |
| PL208588B1 (pl) | 2002-04-25 | 2011-05-31 | Crucell Holland Bv | Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa |
| EP1504125B1 (en) | 2002-05-15 | 2008-10-29 | Integragen | Human obesity susceptibility gene and uses thereof |
| NZ571508A (en) | 2002-05-24 | 2010-05-28 | Schering Corp | Neutralizing human anti-IGFR antibody |
| EP1539937A4 (en) * | 2002-08-22 | 2006-07-26 | Merck & Co Inc | METHODS OF PROPAGATION OF ADENOVIRUS AND VIRUS SO OBTAINED |
| US20050202438A1 (en) * | 2002-09-09 | 2005-09-15 | Rene Gantier | Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| US20060020396A1 (en) * | 2002-09-09 | 2006-01-26 | Rene Gantier | Rational directed protein evolution using two-dimensional rational mutagenesis scanning |
| CA2519680A1 (en) | 2003-03-28 | 2004-11-18 | The Scripps Research Institute | Adenovirus particles with enhanced infectivity of dendritic cells and particles with decreased infectivity of hepatocytes |
| US7485291B2 (en) * | 2003-06-03 | 2009-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Compositions and methods for generating multiple polypeptides from a single vector using a virus derived peptide cleavage site, and uses thereof |
| EP1636360A4 (en) * | 2003-06-03 | 2006-11-08 | Cell Genesys Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED EXPRESSION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES FROM A SINGLE VECTOR USING A PEPTIDE CLEAVAGE SITE |
| US7186699B2 (en) * | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
| ES2391975T3 (es) * | 2003-07-25 | 2012-12-03 | Genvec, Inc. | Vacunas a base de vector adenovírico |
| AU2004267247B2 (en) | 2003-08-22 | 2010-02-18 | Integragen | Human autism susceptibility gene and uses thereof |
| ATE458500T1 (de) | 2003-11-14 | 2010-03-15 | Genvec Inc | Pharmazeutische verbindung zur behandlung von lokal fortgeschrittenem primär inoperablen pankreaskarzinom (lapc). |
| EP1697534B1 (en) | 2003-12-01 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| CN107723298A (zh) | 2004-01-23 | 2018-02-23 | Msd意大利有限公司 | 黑猩猩腺病毒疫苗载运体 |
| US7432057B2 (en) | 2004-01-30 | 2008-10-07 | Michigan State University | Genetic test for PSE-susceptible turkeys |
| JP2007532656A (ja) | 2004-04-12 | 2007-11-15 | アメリカ合衆国 | アデノウイルスベクターを用いて免疫応答を誘導するための方法 |
| EP1761650B1 (en) | 2004-07-01 | 2009-03-04 | Integragen | Human autism susceptibility gene encoding prkcb1 and uses thereof |
| US7604798B2 (en) | 2004-07-15 | 2009-10-20 | Northwestern University | Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei |
| ATE527281T1 (de) | 2004-07-16 | 2011-10-15 | Us Gov Health & Human Serv | Impfstoffe gegen aids umfassend cmv/r nucleinsäurekonstrukte |
| EP1784493A2 (en) * | 2004-09-01 | 2007-05-16 | The Government of the United States of America as Represented by The Department of Health and Human Services | Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation |
| US20060057127A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Pocheng Liu | Cytokine-expressing cellular vaccines for treatment of prostate cancer |
| EP1863937B1 (en) | 2005-03-24 | 2010-09-22 | Integragen | Human autism susceptibility gene encoding a transmembrane protein and uses thereof |
| US20060234347A1 (en) * | 2005-04-13 | 2006-10-19 | Harding Thomas C | Targeting multiple angiogenic pathways for cancer therapy using soluble tyrosine kinase receptors |
| ES2564823T3 (es) | 2005-05-27 | 2016-03-29 | Ospedale San Raffaele S.R.L. | Vector génico que comprende miARN |
| EP2468881A3 (en) * | 2005-07-21 | 2012-08-15 | Abbott Laboratories | Multiple gene expression including sorf contructs and methods with polyproteins, pro-proteins, and proteolysis |
| US8450055B2 (en) * | 2005-08-31 | 2013-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Malaria antigen screening method |
| WO2007027860A2 (en) * | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| US9651543B2 (en) | 2005-08-31 | 2017-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Malaria antigen screening method |
| EP1951297A2 (en) | 2005-11-10 | 2008-08-06 | GenVec, Inc. | Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine |
| EP1835036A1 (en) | 2006-03-16 | 2007-09-19 | Exonhit Therapeutics SA | Methods and compositions for the detection and treatment of cancers |
| US20100143302A1 (en) * | 2006-03-16 | 2010-06-10 | Crucell Holland B.V. | Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof |
| JP2010507365A (ja) | 2006-10-19 | 2010-03-11 | メルク アンド カンパニー インコーポレイテッド | 抗ＩＬ−１３Ｒα１抗体およびその使用 |
| ES2658239T3 (es) | 2006-10-19 | 2018-03-08 | Csl Limited | Antagonistas de anticuerpos de alta afinidad del receptor alfa 1 de interleucina-13 |
| AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
| WO2008086386A2 (en) * | 2007-01-09 | 2008-07-17 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| EP2027868A1 (en) | 2007-08-24 | 2009-02-25 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Use of SCO-Spondin peptides for inhibiting or preventing neuronal apoptosis mediated by cell death receptor ligands |
| DK3153526T3 (da) | 2008-01-31 | 2020-12-14 | Inst Nat Sante Rech Med | Antistoffer mod human cd39 og anvendelse deraf til inhibering af aktivitet af t-regulatoriske celler |
| EP2355847A1 (en) | 2008-10-07 | 2011-08-17 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Neutralizing antibodies and fragments thereof directed against platelet factor-4 variant 1 (pf4v1) |
| CA2741691C (en) | 2008-11-05 | 2019-11-26 | Ingrid Lea Dodge | Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (bhs) disease |
| EP2199387A1 (en) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Serine protease derivatives and uses for the prevention and/or the treatment of blood coagulation disorders |
| EP2358874B1 (en) | 2008-12-19 | 2017-03-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Serine protease derivatives and uses in the prevention or the treatment of blood coagulation disorders |
| DK2382474T3 (en) | 2009-01-20 | 2015-04-07 | Transgene Sa | SOLUBLE ICAM-1 as a biomarker FOR PREDICTION OF THERAPEUTIC RESPONSE |
| WO2010096561A1 (en) | 2009-02-18 | 2010-08-26 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof |
| WO2010106051A1 (en) | 2009-03-17 | 2010-09-23 | Universite De La Mediterranee | Btla antibodies and uses thereof |
| EP2411815B1 (en) | 2009-03-24 | 2015-11-11 | Transgene SA | Biomarker for monitoring patients |
| BRPI1010512A2 (pt) | 2009-04-17 | 2016-03-15 | Transgène S A | "método ex vivo para avaliar a eficácia de um tratamento envolvendo a administração de uma composição imunogênica a um paciente, e, uso de níveis de linfócitos t ativados (cd3 + cd69+) como um biomarcador" |
| EP2427205A2 (en) | 2009-05-04 | 2012-03-14 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Par2 agonists for use in the treatment or prevention of influenza virus type a infections |
| ES2615881T3 (es) | 2009-05-07 | 2017-06-08 | Stallergenes | Uso de inmunoglobulinas igg1 y/o de ligandos del receptor cd32 para el tratamiento de enfermedades y manifestaciones inflamatorias por vía mucosa. |
| US9050276B2 (en) | 2009-06-16 | 2015-06-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Autism-associated biomarkers and uses thereof |
| AU2010270313B2 (en) | 2009-07-10 | 2014-05-22 | Transgene Sa | Biomarker for selecting patients and related methods |
| US20120219583A1 (en) | 2009-10-16 | 2012-08-30 | Los Alamos National Security, Llc | Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins |
| WO2011048443A1 (en) | 2009-10-20 | 2011-04-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Neuronal exocytosis inhibiting peptides derived from c subunit of v-atpase and cosmetic and pharmaceutical compositions containing said peptides |
| JP2013509188A (ja) * | 2009-10-30 | 2013-03-14 | アボット・ラボラトリーズ | Ｓｏｒｆ構築物および複数の遺伝子発現 |
| WO2011057254A2 (en) | 2009-11-09 | 2011-05-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Simian adenoviral vector-based vaccines |
| AU2010314842A1 (en) | 2009-11-09 | 2012-05-31 | Genvec, Inc. | Methods of propagating monkey adenoviral vectors |
| WO2011080322A1 (en) | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of prognosing the outcome of acquired hemophilia and of treatment of hemophilia |
| EP2524226A1 (en) | 2010-01-13 | 2012-11-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Promyelocytic leukemia protein as a redox sensor |
| KR20110103119A (ko) * | 2010-03-12 | 2011-09-20 | 국립암센터 | 신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러스 및 그의 제조 방법 |
| US9682133B2 (en) | 2010-03-17 | 2017-06-20 | Cornell University | Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse |
| US9255136B2 (en) | 2010-04-08 | 2016-02-09 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Inhibiting peptides derived from TREM-like transcript 1 (TLT-1) and uses thereof |
| EP2575853B1 (en) | 2010-05-25 | 2016-08-24 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods and pharmaceutical composition for the treatment of a feeding disorder with early-onset in a patient |
| EP2590669B1 (en) | 2010-07-09 | 2016-08-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Treatment of a disease associated with retinal degenerative disorder |
| US9040671B2 (en) | 2010-07-23 | 2015-05-26 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Methods for cancer management targeting Co-029 |
| WO2012021730A2 (en) | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Genvec, Inc. | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| EP3831406B1 (en) | 2010-08-23 | 2024-06-05 | Wyeth LLC | Stable formulations of neisseria meningitidis rlp2086 antigens |
| AU2011300409B2 (en) | 2010-09-10 | 2015-03-26 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of Neisseria meningitidis ORF2086 antigens |
| ES2566495T3 (es) | 2010-10-15 | 2016-04-13 | Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale | Vector de expresión para colesterol 24-hidrolasa en terapia de la enfermedad de Huntington |
| WO2012080769A1 (en) | 2010-12-15 | 2012-06-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-cd277 antibodies and uses thereof |
| WO2012083297A2 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors with modified hexon regions |
| WO2012088041A1 (en) | 2010-12-20 | 2012-06-28 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based dengue fever vaccine |
| DK2654789T3 (en) | 2010-12-22 | 2018-09-03 | Orega Biotech | ANTIBODIES AGAINST HUMAN CD39 AND USE THEREOF |
| US9598499B2 (en) | 2010-12-30 | 2017-03-21 | Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) | Antigen binding formats for use in therapeutic treatments or diagnostic assays |
| WO2012101125A1 (en) | 2011-01-24 | 2012-08-02 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Specific antibodies against human cxcl4 and uses thereof |
| WO2012120131A1 (en) | 2011-03-09 | 2012-09-13 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for generating cell microparticles |
| WO2012120129A1 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases |
| EP3147297B1 (en) | 2011-03-31 | 2018-12-12 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies directed against icos and uses thereof |
| NO2707391T3 (cs) | 2011-05-13 | 2018-04-07 | ||
| EP2710040B1 (en) | 2011-05-19 | 2017-07-12 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-human-her3 antibodies and uses thereof |
| WO2012162428A1 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Prime-boost vaccination for viral infection |
| US9051562B2 (en) | 2011-06-15 | 2015-06-09 | Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) | Polypeptides isolated from brevibacterium aurantiacum and their use for the treatment of cancer |
| CA2839508A1 (en) | 2011-06-22 | 2012-12-27 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Anti-axl antibodies and uses thereof |
| US9409988B2 (en) | 2011-06-22 | 2016-08-09 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Anti-Axl antibodies and uses thereof |
| EP2543679A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for the treatment and prevention of thrombosis |
| EP2543677A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for the treatment and prevention of thrombosis |
| EP2543678A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for the treatment and prevention of thrombosis |
| FR2979346B1 (fr) | 2011-08-23 | 2013-09-27 | Univ Joseph Fourier | Nanocorps anti-vcam-1 |
| WO2013041901A1 (en) | 2011-09-20 | 2013-03-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for preparing single domain antibody microarrays |
| JP6757120B2 (ja) | 2011-10-05 | 2020-09-16 | ジェンヴェック エルエルシー | アーフェンアデノウイルス（ゴリラ）又はアデノウイルスベクター、及び使用方法 |
| US9580476B2 (en) | 2011-10-05 | 2017-02-28 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (RSV) vaccine |
| JP6757121B2 (ja) | 2011-10-05 | 2020-09-16 | ジェンヴェック エルエルシー | シミアン（ゴリラ）アデノウイルス又はアデノウイルスベクター、及び使用方法 |
| EP2764012B1 (en) | 2011-10-05 | 2022-02-23 | GenVec, Inc. | Adenoviral vectors and methods of use |
| WO2013116591A1 (en) | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccine |
| SG10201609345QA (en) | 2012-02-07 | 2017-01-27 | Global Bio Therapeutics Inc | Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| MX351993B (es) | 2012-03-09 | 2017-11-03 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas. |
| US10039777B2 (en) | 2012-03-20 | 2018-08-07 | Neuro-Lm Sas | Methods and pharmaceutical compositions of the treatment of autistic syndrome disorders |
| WO2013174835A1 (en) | 2012-05-22 | 2013-11-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for screening a candidate compound for its pharmacology on a nuclear receptor |
| EP2855678B1 (en) | 2012-05-25 | 2017-08-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for selecting binders by phage display and masked selection |
| EP2855511B1 (en) | 2012-05-29 | 2019-07-24 | GenVec, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
| EP2855669B1 (en) | 2012-05-29 | 2018-10-10 | GenVec, Inc. | Modified serotype 28 adenoviral vectors |
| WO2014001368A1 (en) | 2012-06-25 | 2014-01-03 | Orega Biotech | Il-17 antagonist antibodies |
| EP2692732A1 (en) | 2012-08-03 | 2014-02-05 | Stallergenes S.A. | Novel allergen from ragweed pollen and uses thereof |
| US9695247B2 (en) | 2012-09-03 | 2017-07-04 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Antibodies directed against ICOS for treating graft-versus-host disease |
| JP6307080B2 (ja) | 2012-09-07 | 2018-04-04 | インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル） | 骨髄細胞に発現する誘発性受容体１（ｔｒｅｍ−１）ｔｒｅｍ様転写産物１（ｔｌｔ−１）に由来する阻害ペプチドおよびその使用 |
| EP2895191B1 (en) | 2012-09-14 | 2019-06-05 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Brachyury protein, adenoviral vectors encoding brachyury protein, and their use |
| KR101522341B1 (ko) * | 2012-10-02 | 2015-05-21 | 국립암센터 | 신규한 조건부-복제 가능 아데노바이러스 및 그의 제조 방법 |
| EP2906590B1 (en) | 2012-10-12 | 2018-05-30 | University of Leicester | Csn5 polypeptides and uses thereof for screening therapeutic agents |
| EP2733153A1 (en) | 2012-11-15 | 2014-05-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the preparation of immunoconjugates and uses thereof |
| KR102194748B1 (ko) | 2012-11-20 | 2020-12-23 | 사노피 | 항-ceacam5 항체 및 이의 용도 |
| EP2749289A1 (en) | 2012-12-26 | 2014-07-02 | Institut National De La Recherche Agronomique (INRA) | Anti-inflammatory peptides |
| US11013783B2 (en) | 2012-12-26 | 2021-05-25 | Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement | Anti-inflammatory peptides and methods for treating inflammatory diseases |
| EA201591219A1 (ru) | 2012-12-27 | 2015-12-30 | Санофи | Антитела против lamp1 и конъюгаты антитела и лекарственного средства, а также их применение |
| WO2014107739A1 (en) | 2013-01-07 | 2014-07-10 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Antibodies against pcsk9 |
| US9066966B2 (en) | 2013-02-01 | 2015-06-30 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cardiomyopathy due to friedreich ataxia |
| CA2903716C (en) | 2013-03-08 | 2019-04-09 | Pfizer Inc. | Immunogenic fusion polypeptides |
| US10981961B2 (en) | 2013-03-11 | 2021-04-20 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Delivery of card protein as therapy for occular inflammation |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| KR101606910B1 (ko) | 2013-03-29 | 2016-04-04 | 충북보건과학대학교 산학협력단 | 아데노바이러스 벡터 생산용 ａ５４９ 기반 세포주 |
| WO2014207173A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Interleukin 15 (il-15) antagonists and uses thereof for the treatment of autoimmune diseases and inflammatory diseases |
| EP2824176A1 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-14 | Siamed'xpress | Methods for producing sialylated therapeutic proteins |
| ES2733911T3 (es) | 2013-08-08 | 2019-12-03 | Global Bio Therapeutics Inc | Dispositivo de sujeción para procedimientos minimamente invasivos |
| MX369534B (es) | 2013-09-08 | 2019-11-11 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos. |
| US10159227B2 (en) | 2013-11-05 | 2018-12-25 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Alzheimer's disease animal model |
| CN105849125B (zh) | 2013-11-07 | 2020-05-15 | 国家医疗保健研究所 | 神经调节蛋白变构抗her3抗体 |
| DK3097113T3 (en) | 2014-01-20 | 2019-04-23 | Sanofi Sa | HOW TO UNKNOWN CYTOCHROM P450 POLYPEPTIDE WITH INCREASED ENZYMATIC ACTIVITY |
| EP3107939B1 (en) | 2014-02-19 | 2020-06-17 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Delivery of nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species |
| WO2015158851A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for the prevention or the treatment of bleeding episodes |
| FR3020063A1 (fr) | 2014-04-16 | 2015-10-23 | Gamamabs Pharma | Anticorps humain anti-her4 |
| EP3131922B1 (en) | 2014-04-17 | 2020-05-13 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Polypeptides and uses thereof for reducing cd95-mediated cell motility |
| FR3021970B1 (fr) | 2014-06-06 | 2018-01-26 | Universite Sciences Technologies Lille | Anticorps dirige contre la galectine 9 et inhibiteur de l'activite suppressive des lymphocytes t regulateurs |
| EP2974735A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-20 | Institut National De La Recherche Agronomique (INRA) | Anti-inflammatory properties of a surface protein of propionibacterium freudenreichii |
| US10400015B2 (en) | 2014-09-04 | 2019-09-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use |
| US10398774B2 (en) | 2014-12-09 | 2019-09-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Human monoclonal antibodies against AXL |
| US10420834B2 (en) | 2014-12-24 | 2019-09-24 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant metapneumovirus F proteins and their use |
| WO2016118642A1 (en) | 2015-01-20 | 2016-07-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Recombinant human/bovine parainfluenza virus 3 (b/hpiv3) expressing a chimeric rsv/bpiv3 f protein and uses thereof |
| AU2016210068B2 (en) | 2015-01-23 | 2021-10-28 | Sanofi | Anti-CD3 antibodies, anti-CD123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to CD3 and/or CD123 |
| RU2723045C2 (ru) | 2015-02-19 | 2020-06-08 | Пфайзер Инк. | Композиции neisseria meningitidis и способы их получения |
| EP3261665A1 (en) | 2015-02-24 | 2018-01-03 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use |
| WO2016135041A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis |
| EP3273999A1 (en) | 2015-03-23 | 2018-01-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and pharmaceutical composition for the treatment and the prevention of neurological phenotype associated with friedreich ataxia |
| EP3091033A1 (en) | 2015-05-06 | 2016-11-09 | Gamamabs Pharma | Anti-human-her3 antibodies and uses thereof |
| US20180125947A1 (en) | 2015-05-20 | 2018-05-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Treatment of retinal detachment |
| JP6770533B2 (ja) | 2015-05-22 | 2020-10-14 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | Ｃａｔｈ−Ｄの触媒活性と、そのＬＲＰ１レセプターへの結合との両方を阻害するヒトモノクローナル抗体フラグメント |
| JP2018525029A (ja) | 2015-07-07 | 2018-09-06 | インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル） | ミオシン１８ａに対する特異性を有する抗体およびその使用 |
| WO2017024000A1 (en) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use |
| WO2017029391A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | New method for treating cancer |
| EP3350205A1 (en) | 2015-09-16 | 2018-07-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Specific interleukin-15 (il-15) antagonist polypeptide and uses thereof for the treatment of inflammatory and auto-immune diseases |
| DK3353196T3 (da) | 2015-09-22 | 2023-02-20 | Inst Nat Sante Rech Med | Polypeptider, der er i stand til at inhibere bindingen mellem leptin og neuropilin-1 |
| WO2017050955A1 (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Agents capable of inhibiting the binding between leptin and vegf165 |
| EP3352800B1 (en) | 2015-09-24 | 2022-01-05 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Methods and compositions for reducing metastases |
| JP7219452B2 (ja) | 2016-01-19 | 2023-02-08 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 遺伝子治療ベクターおよび医薬組成物 |
| WO2017139392A1 (en) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use |
| RU2018133708A (ru) | 2016-02-26 | 2020-03-26 | Инсерм (Энститю Насьональ Де Ля Сантэ Э Де Ля Решерш Медикаль) | Антитела, обладающие специфичностью к btla, и их использование |
| US10808011B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-10-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use |
| CN114907483A (zh) | 2016-03-22 | 2022-08-16 | 国家医疗保健研究所 | 人源化抗claudin-1抗体及其用途 |
| ES2938833T3 (es) | 2016-03-28 | 2023-04-17 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc | Métodos de inactivación térmica de adenovirus |
| WO2018013705A1 (en) * | 2016-07-12 | 2018-01-18 | Dimension Therapeutics | Use of glucocorticoid analogs to enhance recombinant adeno-associated virus yield |
| TWI790206B (zh) | 2016-07-18 | 2023-01-21 | 法商賽諾菲公司 | 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白 |
| WO2018020000A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies targeting tumor associated macrophages and uses thereof |
| CN109937050A (zh) | 2016-09-14 | 2019-06-25 | 鲁汶大学 | 修饰的vsv-g及其疫苗 |
| UY37405A (es) | 2016-09-20 | 2018-03-23 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vectores de adenovirus canino |
| BR112019005418A2 (pt) | 2016-09-20 | 2019-10-01 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | novos promotores |
| KR102566066B1 (ko) | 2016-09-20 | 2023-08-16 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 신규한 돼지 인플루엔자 백신 |
| US10619169B2 (en) | 2016-09-20 | 2020-04-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | EHV insertion site ORF70 |
| CA3038968A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Genvec, Inc. | Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells |
| WO2018067582A2 (en) | 2016-10-03 | 2018-04-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Hiv-1 env fusion peptide immunogens and their use |
| EP3526321A4 (en) | 2016-10-14 | 2020-05-13 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | USE OF TONIFYING AGENTS TO IMPROVE THE YIELD OF RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUS |
| US11286295B2 (en) | 2016-10-20 | 2022-03-29 | Sanofi | Anti-CHIKV monoclonal antibodies directed against the E2 structural protein |
| EP3532095A1 (en) | 2016-10-25 | 2019-09-04 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Prefusion coronavirus spike proteins and their use |
| CN110121508A (zh) | 2016-10-25 | 2019-08-13 | 法国国家健康和医学研究院 | 与cd160跨膜同种型结合的单克隆抗体 |
| FR3058143B1 (fr) | 2016-10-27 | 2021-03-12 | Univ Grenoble Alpes | Nanocorps anti-tau |
| US11116852B2 (en) | 2016-11-09 | 2021-09-14 | Precigen, Inc. | Frataxin expression constructs |
| WO2018109220A2 (en) | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Institute For Research In Biomedicine | Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof |
| ES2944358T3 (es) | 2017-01-30 | 2023-06-20 | Brainvectis | Vector de expresión para la colesterol 24-hidrolasa en terapia de ataxias espinocerebelosas de repetición de poliglutamina |
| JP7010961B2 (ja) | 2017-01-31 | 2022-02-10 | ファイザー・インク | 髄膜炎菌組成物およびその方法 |
| CN110392697A (zh) | 2017-03-02 | 2019-10-29 | 国家医疗保健研究所 | 对nectin-4具有特异性的抗体及其用途 |
| EP3596124A1 (en) | 2017-03-16 | 2020-01-22 | Innate Pharma | Compositions and methods for treating cancer |
| EP3601581A4 (en) | 2017-03-22 | 2021-05-19 | Ultragenyx Pharmaceutical Inc. | CELL CULTURE METHODS USING HDAC INHIBITORS OR REP PROTEINS |
| US11235056B2 (en) | 2017-03-24 | 2022-02-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Glycan-masked engineered outer domains of HIV-1 gp120 and their use |
| WO2018178051A1 (en) | 2017-03-28 | 2018-10-04 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Scgb1a1 polymorphism for the prediction and therapy or prevention of primary graft dysfunction |
| EP3388072A1 (en) | 2017-04-10 | 2018-10-17 | Universität Leipzig | Ubiquinone-independent cytoplasmic dihydroorotate dehydrogenase for use as medicament |
| CN110914414A (zh) | 2017-06-14 | 2020-03-24 | 德累斯顿工业大学 | 利用设计dna重组酶遗传改变基因组的方法与手段 |
| WO2019020480A1 (en) | 2017-07-24 | 2019-01-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | ANTIBODIES AND PEPTIDES FOR TREATING HCMV RELATED DISEASES |
| WO2019038420A1 (en) | 2017-08-25 | 2019-02-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF OSTEOCLAST DISEASES |
| CN111511760B (zh) | 2017-09-21 | 2023-10-03 | 感应检查疗法公司 | 对btn2具有特异性的抗体及其用途 |
| AU2018352236A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-04-23 | The Curators Of The University Of Missouri | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
| US11136356B2 (en) | 2017-10-16 | 2021-10-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use |
| US20200237799A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-07-30 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als) |
| CN112135622A (zh) | 2018-03-06 | 2020-12-25 | 普莱西根股份有限公司 | 乙型肝炎疫苗及其用途 |
| MX2020012107A (es) | 2018-06-18 | 2021-01-29 | Innate Pharma | Composiciones y procedimientos para el tratamiento del cancer. |
| EP3818161A1 (en) | 2018-07-02 | 2021-05-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord |
| WO2020010035A1 (en) | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Cannula system |
| US20210340188A1 (en) | 2018-10-22 | 2021-11-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion |
| CN112955169A (zh) | 2018-10-29 | 2021-06-11 | 法国国家卫生及研究医学协会 | 用于肌萎缩性侧索硬化疗法中的胆固醇24-水解酶的表达载体 |
| WO2020148207A1 (en) | 2019-01-14 | 2020-07-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Human monoclonal antibodies binding to hla-a2 |
| JP2022517029A (ja) | 2019-01-15 | 2022-03-03 | アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） | 変異したインターロイキン－３４（ｉｌ－３４）ポリペプチドおよび治療におけるその使用 |
| BR112021018611A2 (pt) | 2019-03-20 | 2021-11-23 | Imcheck Therapeutics Sas | Anticorpos tendo especificidade para btn2 e usos dos mesmos |
| US20220154153A1 (en) | 2019-03-22 | 2022-05-19 | Université de Paris | New inhibitors of lrrk2/pp1 interaction |
| US20220177558A1 (en) | 2019-03-25 | 2022-06-09 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Treatment of taupathy disorders by targeting new tau species |
| JP2022538733A (ja) | 2019-05-20 | 2022-09-06 | インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル） | 新規抗ｃｄ２５抗体 |
| WO2020234363A2 (en) | 2019-05-21 | 2020-11-26 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Expression vector for cholesterol 24-hydrolase in therapy of rett syndrome |
| WO2020254619A1 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti- protease nexin-1 conformational single domain antibodies and uses thereof |
| WO2021005223A1 (en) | 2019-07-10 | 2021-01-14 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the treatment of epilepsy |
| EP3999540A1 (en) | 2019-07-16 | 2022-05-25 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Antibodies having specificity for cd38 and uses thereof |
| WO2021009299A1 (en) | 2019-07-17 | 2021-01-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process |
| US20210032370A1 (en) | 2019-08-02 | 2021-02-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Recruiting agent further binding an mhc molecule |
| DE102019121007A1 (de) | 2019-08-02 | 2021-02-04 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Antigenbindende Proteine, die spezifisch an MAGE-A binden |
| US20220281967A1 (en) | 2019-08-02 | 2022-09-08 | Orega Biotech | Novel il-17b antibodies |
| WO2021028837A1 (en) | 2019-08-13 | 2021-02-18 | Waters Technologies Corporation | Affinity resins and sample preparation devices based on cartilaginous fish ignar derived binding domains |
| WO2021043723A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and compositions for treating pax6- deficiency related disease |
| EP4025604A1 (en) | 2019-09-04 | 2022-07-13 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Antibodies specific for il20-rb and uses thereof for the treatment of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease |
| WO2021048171A1 (en) | 2019-09-10 | 2021-03-18 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method to improve phagocytosis |
| CA3154655A1 (en) | 2019-09-24 | 2021-04-01 | Universite Catholique De Louvain | Modified vesicular stomatitis virus glycoprotein and uses thereof for the treatment of brain tumors |
| EP4034560A1 (en) | 2019-09-27 | 2022-08-03 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-müllerian inhibiting substance antibodies and uses thereof |
| WO2021058729A1 (en) | 2019-09-27 | 2021-04-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-müllerian inhibiting substance type i receptor antibodies and uses thereof |
| CN114761546A (zh) | 2019-10-08 | 2022-07-15 | 波士顿学院董事会 | 含有多个不同非天然氨基酸的蛋白质以及制备和使用此类蛋白质的方法 |
| EP3812008A1 (en) | 2019-10-23 | 2021-04-28 | Gamamabs Pharma | Amh-competitive antagonist antibody |
| CN110656090B (zh) * | 2019-10-28 | 2023-06-30 | 嘉兴安宇生物科技有限公司 | 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用 |
| CN110714027A (zh) * | 2019-10-28 | 2020-01-21 | 嘉铭(固安)生物科技有限公司 | 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用 |
| WO2021099394A1 (en) | 2019-11-19 | 2021-05-27 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer |
| JP2023502712A (ja) | 2019-11-21 | 2023-01-25 | インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） | 抗ｐｄ－１／ｉｌ－１５免疫サイトカインによる新しいｐｄ－１標的免疫療法 |
| WO2021116119A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies having specificity to her4 and uses thereof |
| JP2023525423A (ja) | 2020-01-15 | 2023-06-16 | イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー | Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質 |
| KR20220144377A (ko) | 2020-01-30 | 2022-10-26 | 우모자 바이오파마 인코포레이티드 | 이중특이적 형질도입 촉진제 |
| WO2021163365A1 (en) | 2020-02-11 | 2021-08-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Sars-cov-2 vaccine |
| WO2021175954A1 (en) | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Imcheck Therapeutics Sas | Antibodies having specificity for btnl8 and uses thereof |
| US11213482B1 (en) | 2020-03-05 | 2022-01-04 | University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat | SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system |
| CN115484978A (zh) | 2020-03-05 | 2022-12-16 | 尼奥克斯医疗有限公司 | 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物 |
| US11773391B2 (en) | 2020-04-01 | 2023-10-03 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19 |
| CN116096407A (zh) | 2020-04-29 | 2023-05-09 | 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) | 重组人偏肺病毒f蛋白及其用途 |
| US20230181753A1 (en) | 2020-05-12 | 2023-06-15 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | New method to treat cutaneous t-cell lymphomas and tfh derived lymphomas |
| WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
| JP2023532726A (ja) | 2020-06-29 | 2023-07-31 | インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル） | 抗プロテインｓシングルドメイン抗体及びそれを含むポリペプチド |
| KR20230043869A (ko) | 2020-08-07 | 2023-03-31 | 스페이스크래프트 세븐, 엘엘씨 | Aav 벡터를 사용한 플라코필린-2(pkp2) 유전자 요법 |
| WO2022035860A2 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use |
| IL301004A (en) | 2020-09-04 | 2023-04-01 | Merck Patent Gmbh | Antibodies against CEACAM5 and conjugates and uses thereof |
| EP4244253A1 (en) | 2020-11-12 | 2023-09-20 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes |
| WO2022136508A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Chlamydia vaccine based on targeting momp vs4 antigen to antigen presenting cells |
| WO2022152698A1 (en) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of npdk-d to evaluate cancer prognosis |
| WO2022159575A1 (en) | 2021-01-20 | 2022-07-28 | Bioentre Llc | Ctla4-binding proteins and methods of treating cancer |
| AU2022212952A1 (en) | 2021-01-27 | 2023-08-10 | Umoja Biopharma, Inc. | Lentivirus for generating cells expressing anti-cd19 chimeric antigen receptor |
| WO2022162177A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Chlamydia trachomatis antigenic polypeptides and uses thereof for vaccine purposes |
| WO2022184805A1 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-09 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein |
| WO2022200469A1 (en) | 2021-03-24 | 2022-09-29 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | A dominant negative protein of rad51 for treating cancer |
| EP4322937A1 (en) | 2021-04-14 | 2024-02-21 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | New method to improve the anti-tumoral activity of macrophages |
| EP4322938A1 (en) | 2021-04-14 | 2024-02-21 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | New method to improve nk cells cytotoxicity |
| WO2022232648A1 (en) | 2021-04-29 | 2022-11-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use |
| EP4329786A1 (en) | 2021-04-30 | 2024-03-06 | KaliVir Immunotherapeutics, Inc. | Oncolytic viruses for modified mhc expression |
| TW202309071A (zh) | 2021-05-05 | 2023-03-01 | 德商英麥提克生物技術股份有限公司 | 特異性結合ｐｒａｍｅ之抗原結合蛋白 |
| JP2024517377A (ja) | 2021-05-13 | 2024-04-22 | ウニベルシダージ ド アルガルヴェ | 神経変性疾患に用いるための単離または人工ヌクレオチド |
| KR20240038028A (ko) | 2021-07-27 | 2024-03-22 | 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 | Ct45에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 |
| WO2023012165A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Universite De Montpellier | Compositions and methods for treating cmt1a or cmt1e diseases with rnai molecules targeting pmp22 |
| CA3228275A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-09 | Genoveffa Franchini | Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection |
| EP4130038A1 (en) | 2021-08-03 | 2023-02-08 | Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement | Anti-il-2 antibody, complex comprising it, and uses thereof |
| WO2023017494A1 (en) | 2021-08-13 | 2023-02-16 | Triovance Holding Llc | A skin substitute composition and methods of producing and using the same |
| WO2023069987A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | University Of Rochester | Rejuvenation treatment of age-related white matter loss cross reference to related application |
| WO2023081633A1 (en) | 2021-11-02 | 2023-05-11 | University Of Rochester | Tcf7l2 mediated remyelination in the brain |
| US20230183713A1 (en) | 2021-11-15 | 2023-06-15 | Technische Universität Dresden | Site-specific recombinases for efficient and specific genome editing |
| WO2023088968A1 (en) | 2021-11-17 | 2023-05-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Universal sarbecovirus vaccines |
| WO2023091696A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. | Adenovirus delivery system for cancer treatment |
| WO2023099578A1 (en) | 2021-12-01 | 2023-06-08 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Neutralizing anti-cd95l monoclonal antibodies |
| EP4209508A1 (en) | 2022-01-11 | 2023-07-12 | Centre national de la recherche scientifique | Nanobodies for the deneddylating enzyme nedp1 |
| WO2023150563A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Cornell University | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment and the prevention of cardiomyopathy associated with friedreich ataxia |
| WO2023156437A1 (en) | 2022-02-16 | 2023-08-24 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-robo4 human monoclonal antibodies and uses thereof for the treatment of cancer |
| WO2023161412A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-08-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies for preventing the cleavage of cd95l by metalloproteases |
| WO2023170239A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Merck Patent Gmbh | Methods and tools for conjugation to antibodies |
| WO2023170296A1 (en) | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Nucleic acid system to specifically reprogram b and t cells and uses thereof |
| WO2023192835A1 (en) | 2022-03-27 | 2023-10-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use |
| WO2023196898A1 (en) | 2022-04-07 | 2023-10-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Beta globin mimetic peptides and their use |
| WO2023217904A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Syncitin-1 fusion proteins and uses thereof for cargo delivery into target cells |
| WO2023240287A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Bioentre Llc | Combinations of ctla4 binding proteins and methods of treating cancer |
| WO2024011237A1 (en) | 2022-07-08 | 2024-01-11 | Cornell University | Methods and pharmaceutical compositions for the treatment and the prevention of alzheimers disease |
| WO2024017990A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods and compositions for treating chronic pain disorders |
| WO2024052503A1 (en) | 2022-09-08 | 2024-03-14 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Antibodies having specificity to ltbp2 and uses thereof |
| WO2024056668A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | New anti-itgb8 antibodies and its uses thereof |
| WO2024061930A1 (en) | 2022-09-22 | 2024-03-28 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | New method to treat and diagnose peripheral t-cell lymphoma (ptcl) |
| WO2024074571A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Dc-targeting vaccine against nipah virus infection |
| WO2024079317A1 (en) | 2022-10-14 | 2024-04-18 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Methods and pharmaceutical composition for the treatment of alpha-synucleinopathies |
| PT118269A (pt) | 2022-10-20 | 2024-04-22 | Univ Aveiro | Pkmyt1 for use in regenerative medicine |
| WO2024091824A1 (en) | 2022-10-26 | 2024-05-02 | Ada Forsyth Institute, Inc. | Differentiation and reprogramming of chondrocyte |
| WO2024097992A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Umoja Biopharma, Inc. | Particles displaying adhesion-molecule fusions |
| WO2024098028A2 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Umoja Biopharma, Inc. | Lentiviral particles displaying fusion molecules and uses thereof |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU680459B2 (en) * | 1992-12-03 | 1997-07-31 | Genzyme Corporation | Gene therapy for cystic fibrosis |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| FR2707664B1 (fr) * | 1993-07-13 | 1995-09-29 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| KR100356615B1 (ko) * | 1993-07-13 | 2003-04-03 | 아방티 파르마 소시에테 아노님 | 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용 |
| US6686200B1 (en) * | 1993-08-31 | 2004-02-03 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus |
| FR2716682B1 (fr) * | 1994-01-28 | 1996-04-26 | Centre Nat Rech Scient | Procédé de préparation de virus adéno-associés (AAV) recombinants et utilisations. |
| FR2716893B1 (fr) * | 1994-03-03 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique. |
-
1996
- 1996-01-18 IL IL11681696A patent/IL116816A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-01-19 AU AU45443/96A patent/AU717253B2/en not_active Ceased
- 1996-01-19 HU HU9702404A patent/HU222191B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-01-19 EP EP96901417A patent/EP0805868A1/fr not_active Withdrawn
- 1996-01-19 KR KR1019970704903A patent/KR100510822B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-01-19 MX MX9704552A patent/MX9704552A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-01-19 BR BR9606971A patent/BR9606971A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-01-19 SK SK990-97A patent/SK99097A3/sk unknown
- 1996-01-19 JP JP8522091A patent/JPH11504502A/ja active Pending
- 1996-01-19 CZ CZ19972306A patent/CZ294969B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-01-19 WO PCT/FR1996/000088 patent/WO1996022378A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1996-01-19 US US08/875,223 patent/US6127175A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-01-19 CA CA002210168A patent/CA2210168A1/fr not_active Abandoned
-
1997
- 1997-07-18 NO NO19973332A patent/NO320382B1/no unknown
- 1997-07-18 FI FI973055A patent/FI973055A/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11504502A (ja) | 1999-04-27 |
| WO1996022378A1 (fr) | 1996-07-25 |
| AU4544396A (en) | 1996-08-07 |
| NO320382B1 (no) | 2005-11-28 |
| IL116816A (en) | 2003-05-29 |
| NO973332L (no) | 1997-07-18 |
| MX9704552A (es) | 1997-10-31 |
| KR100510822B1 (ko) | 2005-12-19 |
| AU717253B2 (en) | 2000-03-23 |
| NO973332D0 (no) | 1997-07-18 |
| FI973055A0 (fi) | 1997-07-18 |
| SK99097A3 (en) | 1998-02-04 |
| HU222191B1 (hu) | 2003-05-28 |
| HUP9702404A3 (en) | 1999-10-28 |
| IL116816A0 (en) | 1996-05-14 |
| BR9606971A (pt) | 1997-11-04 |
| CZ230697A3 (en) | 1997-10-15 |
| KR19980701512A (ko) | 1998-05-15 |
| EP0805868A1 (fr) | 1997-11-12 |
| FI973055A (fi) | 1997-07-18 |
| HUP9702404A2 (hu) | 1998-04-28 |
| US6127175A (en) | 2000-10-03 |
| CA2210168A1 (fr) | 1996-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ294969B6 (cs) | Buňka použitelná pro produkci rekombinantních adenovirů, plazmid pro transformaci této buňky, způsob produkce defektních rekombinantních adenovirů, takto získaný defektní rekombinantní adenovir a použití uvedené buňky pro produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů AAV | |
| RU2219241C2 (ru) | Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты) | |
| US5789390A (en) | Method for preparing recombinant adeno-associated viruses (AAV), and uses thereof | |
| JP3821846B2 (ja) | 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物 | |
| US5856152A (en) | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor | |
| JP3565859B2 (ja) | 改良されたアデノウイルスおよびその使用法 | |
| US6387368B1 (en) | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof | |
| JP2002507897A (ja) | 遺伝子治療で用いるべきヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム | |
| WO2001023597A9 (en) | Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus | |
| JP2001526900A (ja) | 標的細胞の染色体ｄｎａへの外来遺伝子情報の組み込みに有用な、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスのキメラ組換えウイルス | |
| US6200798B1 (en) | Defective recombinant adenoviruses with inactivated IVa2 gene | |
| MXPA97001766A (en) | Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv | |
| CA2321215C (en) | Hybrid adenovirus-aav virus and method of use thereof | |
| AU725843B2 (en) | Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20070119 |