CN110078800A - 合成肽在制备防治肝炎病毒感染药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，提供了一种具有抑制丙型肝炎病毒感染活性的合成肽及其在制备预防或治疗丙型肝炎病毒感染药物中的用途，本发明的合成肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。通过实验证实，该合成肽能够抑制HCV对靶细胞的感染，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制，从而证实了本发明的合成肽具备有效阻断HCV对宿主细胞的感染能力。此外，通过细胞毒性实验，本发明各浓度的合成肽对细胞正常的生理功能不会产生任何影响，安全性高。因此，本发明为丙型肝炎的防止和治疗提供了新的思路，具备潜在的良好的临床应用价值。

Description

合成肽在制备防治肝炎病毒感染药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种具有抑制丙型肝炎病毒感染活性的合成肽、其在制备抗丙肝药物中的潜在医学应用以及以该合成肽为活性成分的药物。

背景技术

近年来，生物活性肽研究已成为全球医药研制的热点之一。它不仅具有来源广泛、安全性好、靶向专一和生物活性强等优点，而且具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓、抗氧化、降低胆固醇等多种生理功能，成为当前国际药品与保健品行业竞相追逐的研究对象，应用发展前景十分看好。

由于多数生物活性肽都是分离自各种动物、植物和微生物，其本身就属于动物生理活性调节因子，不易产生耐药，甚至有替代某些抗生素的趋势，且不会对环境造成污染，这也是研究者们发掘其药用、食用及保健作用的关键所在。此外，肽类物质的结构类型呈现多样化，具有强大的药物活性筛选潜力，可利用半合成、全合成等方法进行人工合成，并能保持其真实结构和活性功能。

当前，病毒性疾病已成为威胁人类健康和生命安全的重大威胁之一。虽然临床上已研发有多种抗病毒药物，但是大部分病毒感染仍然缺乏有效的治疗办法，无法治愈。近些年的相关研究表明，最早在先天免疫系统中发现的多肽还可通过抑制病毒入侵、病毒蛋白合成以及提高宿主免疫功能等方面来发挥抗病毒效应，从而为抗病毒药物的研发提供了新的来源，尤其是在针对病毒入侵环节的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)抑制肽成功应用于临床治疗之后，多肽药物更是成为抗病毒研究的焦点(Gómara MJ,Haro I.Updating the useofsynthetic peptides as inhibitors ofHIV-1entry.Current Medicinal Chemistry,2014,21(10):1188-1200)。

研究者们通过不同的方法，尝试建立多种寻找病毒抑制肽的方法，包括从病毒自身编码的结构蛋白氨基酸序列或从噬菌体展示文库中筛选(Castel G,Chtéoui M,Heyd B,Tordo N.Phage display ofcombinatorial peptide libraries：application toantiviral research.Molecules,2011,16(5):3499-3518；Skalickova S,Heger Z,Krejcova L,Pekarik V,Bastl K,Janda J,Kostolansky F,Vareckova E,Zitka O,AdamV,KizekR.Perspective ofUse ofAntiviral Peptides against InfluenzaVirus.Viruses,2015,7(10):5428-5442.)。比如，针对I类包膜病毒(如HIV-1、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和流感病毒等)入侵靶细胞的过程中形成六股螺旋结构这一特点，设计研制的肽类抗病毒药物可特异性地抑制该类病毒的感染，像源自HIV跨膜蛋白gp41七肽重复结构的C34或T20多肽可强烈抑制HIV感染；通过对噬菌体展示文库或随机肽库的反复筛选，也已获得了针对流感病毒、单纯疱疹病毒、汉坦病毒、肠道病毒71型、辛诺柏病毒等多种病毒的抑制肽。

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)属于黄病毒家族的肝炎病毒属，是引起丙型肝炎(以下简称丙肝)的病原体。HCV感染者中约80％会发展成慢性丙肝，其中约33％会逐渐发展成肝硬化、肝纤维化甚至肝癌。

据估计，当前全球约1.8亿人感染HCV，年新增患者300～400万例，每年约35万人死于与丙肝相关的肝病，是全球重要的公共健康问题。尤其是我国，作为HCV感染的高发区，丙肝患者约一千万。由于HCV存在高度的变异性和复杂性，目前尚无预防或治疗丙肝的疫苗，因此，抗HCV治疗的研究更加备受关注。

目前，临床上针对HCV感染的治疗药物主要包括长效干扰素(pegylatedinterferon，Peg-IFN)联合利巴韦林(ribavirin，RBV)和直接抗病毒药物(direct-actingantiviral agents，DAAs)两大类。前者治疗毒副作用大且病毒应答率低，尤其是对于HCV I基因型(为我国主要流行基因型)患者应答率仅40-50％；DAAs药物主要针对的是HCV的NS3/4A蛋白酶、NS5A蛋白酶及NS5B多聚酶，自2011年美国食品药品管理局(FDA)批准以来，总体的临床治愈率约达90％，但随着DAAs使用人群的不断增加，该药存在的一些问题也逐渐开始暴露，比如，耐药变异，在HBV/HCV共感染患者中用药会刺激HBV复制(不幸的是，我国乙肝感染者甚多)，DAAs药物间存在相互作用，价格比较昂贵(故而我国绝大部分HCV患者仍然实行以Peg-IFN/RBV为主的治疗方案)，药物本身的不良反应也逐渐显现，包括肝损伤、肾损伤、皮肤损伤等，此外，全口服方案是否可以降低肝细胞癌的风险也需进一步明确等一系列问题。因此，对于我国HCV患者尤其是临床难治丙肝患者的预防和治疗，仍需要进一步深入研究，以便开发出新型且可行的治疗药物方案。

发明内容

本发明是为解决上述问题而进行的，从前期自行设计的随机肽库中筛选出一种能抑制HCV感染的生物活性肽。本发明的另一目的在于，提供该生物活性肽在制备预防或治疗丙型肝炎病毒感染药物中的用途，以及其作为抗丙型肝炎病毒感染药物活性组分的用途。

本发明的主要技术方案是：利用现有的网络资源和常用生物学软件，结合包膜病毒入侵与感染特点，尤其是位于病毒颗粒表面的包膜蛋白负责介导病毒与宿主细胞的黏附与结合以及随后的内吞、融合等步骤这一重要理论，自主设计出一套随机肽库；然后，以人肝癌细胞系(Huh7.5.1)作为HCV感染的靶细胞，以基于细胞培养HCV(HCVcc)系统为感染模型，以期筛选出能抑制HCV感染能力的生物活性肽。我们发现，合成肽QLP-98在HCV感染Huh7.5.1细胞中发挥着重要的抑制作用，它能下调病毒蛋白的表达，阻断病毒基因组RNA的复制，从而显著降低HCV的感染活性。

本发明的第一方面，提供了一种具有抑制丙型肝炎病毒感染活性的合成肽(编号为QLP-98)，该合成肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，具体如下：LSLTHPVLGWGSVQANAWRPEM。

该合成肽为包含22个氨基酸的肽段，主要靶向作用于位于HCV病毒颗粒表面的包膜蛋白与宿主细胞的互作环节。本发明涉及的抗HCV合成肽副作用小，活性高，合成、纯化工艺简单方便，生产成本不高。具有阻断HCV感染宿主细胞(Huh7.5.1细胞)，抑制病毒与宿主细胞的入侵以及在宿主细胞中复制增殖的作用。

发明人对前期自行设计的随机肽库进行病毒感染抑制实验筛选，结果发现该合成肽能够抑制HCV对靶细胞的感染(参见说明书附图1)，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制(参见实施例3和4)，证实本发明的合成肽可以有效阻断HCV对宿主细胞的感染能力。

因此，本发明的第二方面，特别提供了合成肽在制备预防或治疗丙型肝炎病毒感染药物中的用途。特别地，该用途指的是阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制的用途。

本发明的第三方面，提供了一种抗丙型肝炎病毒感染的药物组合物，该药物组合物以上述合成肽或其药学上可接受的盐为活性组分，还包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

该药物组合物可以为能够抑制或下调丙型肝炎病毒基因组RNA复制量的试剂，也可以是阻断病毒蛋白在靶细胞中表达的试剂。

在药物组合物形式上，本发明的药物组合物可以为按常规药剂学制备的注射剂。

本发明的第四方面，提供了一种抑制丙型肝炎病毒复制的方法，即通过将该病毒暴露于丙型肝炎病毒蛋白抑制量的合成肽、或其治疗上可接受的含上述肽的组合物中，或者通过给哺乳动物细胞使用病毒学上有效量的抗丙型肝炎的合成肽、或其治疗上可接受的含上述肽的组合物来实现。

本发明的有益保障及效果：

本发明提供了一种自行设计的合成肽，通过实验证实，该合成肽能够抑制HCV对靶细胞的感染，并且可以有效阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制，从而证实了本发明的合成肽具备有效阻断HCV对宿主细胞的感染能力。此外，通过细胞毒性实验，本发明各浓度的合成肽对细胞正常的生理功能不会产生任何影响，安全性高。因此，本发明为丙型肝炎的预防和治疗提供了新的思路，具备潜在的良好的临床应用价值。

附图说明

图1为免疫荧光法检测不同浓度的合成肽QLP-98对HCV感染的影响，其中A为不同浓度的合成肽处理后对病毒感染性抑制的荧光检测图(所用一抗为HCV患者阳性血清)；B为不同浓度的合成肽处理细胞后对病毒感染的抑制率图。未加病毒感染的细胞作为实验空白对照组(Mock)；以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的Huh7.5.1细胞组作为阴性对照组(DMSO)。与对照组相比，*，P<0.05；***，P<0.001。

图2为培养细胞中加入不同浓度的合成肽QLP-98的细胞毒性检测结果，以DMSO处理的Huh7.5.1细胞组作为实验对照组(CTRL)。

图3为Westernblot法检测加入80μM的合成肽QLP-98对HCV感染能力的影响，其中A为检测丙型肝炎病毒核心蛋白(core)表达图，B为对A图结果进行灰度扫描获得的半定量结果图，C为检测丙型肝炎病毒核心蛋白在细胞中表达的免疫荧光图(所用一抗为HCVcore单克隆抗体)。未加病毒感染的细胞作为实验空白对照组(Mock)；以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的Huh7.5.1细胞组作为阴性对照组(DMSO)。与对照组相比，***，P<0.001。

图4为荧光定量PCR(real-time PCR)法检测加入80μM的合成肽QLP-98对HCV复制能力的影响，结果显示为相对于实验对照组，各实验组中丙型肝炎病毒基因组RNA水平的相对变化检测图。以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的Huh7.5.1细胞组作为阴性对照组(DMSO)。与对照组相比，**，P<0.01。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如PCR方法，那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2^ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术操作人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明，具体实施方式文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：合成肽抑制HCV感染的有效浓度筛选实验

1.1 Huh7.5.1细胞的HCV病毒感染实验

正常的Huh7.5.1细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃，5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，且细胞培养液中添加2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、100μg/mL的链霉素和100U/mL的青霉素。

感染前一天，将Huh7.5.1细胞按3×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。次日，先将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种HCV，37℃感染5h，弃去病毒液，并用预温PBS润洗3次，换成新鲜培养基，37℃继续培养48h，免疫荧光法检测HCV感染阳性细胞。

1.2合成肽对HCV感染的抑制实验

基本方法同上。分别将5，10，20，40，80μM浓度的合成肽QLP-98(氨基酸序列为SEQID NO:1)加入上述接种的病毒液中，感染细胞5h后，弃去病毒液，换成新鲜培养液继续培养48h，免疫荧光法检测病毒感染情况。

1.3免疫荧光染色检测HCV抗原表达

Huh7.5.1细胞感染病毒后继续培养，然后采用免疫荧光法检测病毒抗原的表达，具体步骤如下：

1)细胞固定：将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入100μL预冷甲醇，于-20℃条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。

2)透膜：固定后的细胞每孔加入100μl 0.1％TritonX-100，室温孵育15min，用预冷PBS洗涤细胞3次。

3)封闭：每孔加入100μL 3％BSA，于室温下孵育1h。

4)一抗孵育：每孔加入HCV患者阳性血清(1:100，3％BSA稀释)100μL，室温孵育1h，用预冷的PBS洗涤细胞3次。

5)二抗孵育：每孔加入AF488荧光标记抗人IgG(1:1000，3％BSA稀释)100μL，室温避光孵育1h，用预冷的PBS避光洗涤细胞2次。

6)标记细胞核：每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:5000，PBS稀释)，室温避光孵育15min，用预冷的PBS避光洗涤细胞3次。

7)荧光显微镜下检测、拍照并计算绿色AF488阳性细胞克隆数。

1.4实验结果

将上述浓度的合成肽加入HCV细胞感染系统中作为合成肽组，同时以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)，以DMSO处理的细胞组作为阴性对照组(DMSO)。感染后48h，通过细胞免疫荧光染色法检测各浓度合成肽对病毒感染的抑制情况。

结果如图1所示，加入合成肽组与CTRL组相比，体系中加入10、20、40或80μM的合成肽后均能明显抑制HCV病毒的感染能力；随着加入合成肽浓度的增加，抑制效果越显著，抑制效率可达到约13％-65％(*，P<0.05；***，P<0.001)。

实施例2：合成肽的细胞毒性实验

采用CCK-8方法检测加入合成肽对Huh7.5.1细胞增殖的影响，具体步骤如下：

收集处于对数生长期的Huh7.5.1细胞，以每孔约3×10⁴个的密度接种于96孔板。待细胞生长过夜后，加入实施例1中各浓度的合成肽，继续培养48小时，然后CCK-8法检测细胞增殖情况。具体检测方法为：弃去细胞中原有的培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，置于37℃培养箱继续培养3h，然后用多功能酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度值。实验独立重复3次，计算平均值和标准误。

实验结果如图2所示，各组不同浓度的合成肽加入细胞后，对细胞没有产生明显的细胞毒性(P＞0.05)，说明各浓度的合成肽对细胞正常的生理功能并未产生影响，可用于后续实验。

实施例3：合成肽抑制HCV蛋白表达的实验

3.1合成肽对HCV感染的抑制实验

感染前一天，将Huh7.5.1细胞按2×10⁵个/孔接种于24孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养过夜。次日，先将培养上清吸出，用预温PBS润洗2次，以MOI＝1的病毒量接种HCV，其中加入80μM的上述合成肽QLP-98，感染细胞5h后，弃去病毒液，换成新鲜培养液继续培养48h，蛋白免疫印迹法检测病毒蛋白的表达情况。

3.2蛋白免疫印迹法检测HCV Core蛋白的表达

3.2.1细胞样品的制备

各对照组与合成肽处理组细胞弃去培养液后，用预温的PBS洗2～3次，每孔加100μL蛋白裂解液，反复吹打细胞促其裂解，转移至Ep管中，加入25μL 5×Loading buffer，于100℃煮10min左右，以12000rpm离心2min，弃沉淀，取上清(含细胞的总蛋白)进行SDS－PAGE电泳。

3.2.2蛋白免疫印迹法(Western blot)检测

(1)溶液配制

30％Acr/Bis：29.2％Acr，0.8％Bis，过滤后于4℃保存；

4×分离胶缓冲液：36.3g Tris，10％SDS 4mL，加H₂O约180mL，用浓HCl调整pH至8.8，定容至200mL；

4×浓缩胶缓冲液：6.55g Tris，10％SDS 4mL，加H₂O约80mL，用浓HCl调整pH至6.8，定容至100mL；

电泳缓冲液：3.03g Tris，14.41g Gly，1g SDS，加H₂O溶解，定容至1000mL；

Loading buffer：1M Tris-HCl(pH6.8)1.2mL，10％SDS 4mL，巯基乙醇1mL，甘油2mL，溴酚蓝0.2mg，加H₂O至20mL；

SDS－PAGE浓缩胶(上层胶)：2.4mL水，1.0mL 4浓缩胶缓冲液，0.6ml 30％Acr/Bis，50μL 10％过硫酸铵溶液，10μL TEMED；

SDS－PAGE分离胶(12.5％下层胶)：4.2mL水，3.0mL 4分离胶缓冲液，4.8ml 30％Acr/Bis，100μL10％过硫酸铵溶液，10μL TEMED。

(2)SDS－PAGE蛋白电泳

1)聚丙烯酰胺凝胶的制备——按照产品说明书安装聚丙烯酰胺凝胶板，先加入2mL分离胶溶液，在胶面上加水覆盖，待胶凝固后倾去覆盖液，擦干后加入浓缩胶，插上合适尺寸梳子，待其凝固后进行电泳。

2)12.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳——将上述制备好的细胞样品和预染色的蛋白分子量Marker加入上样孔，80－100V/cm电压下电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底端，停止电泳，取出凝胶，切去浓缩胶。

(3)Western blot检测

将上述经12.5％SDS-PAGE进行总蛋白分离的下层凝胶，根据预染蛋白分子量Marker条带大小的指示，截取相应大小的目的条带，通过电转仪将蛋白转移到PVDF膜上。

用含5％脱脂牛奶的封闭液对膜上的非特异性结合位点进行封闭，然后与合适的一抗(抗-HCV Core的鼠源单抗和抗-GAPDH的兔源多抗，均为1:1000稀释)4℃轻摇孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜三遍后，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(羊抗鼠或抗兔IgG，均为1:1000稀释)室温作用孵育2小时后，用TBST缓冲液洗膜三遍，再利用HRP-ECL发光法进行底物显色，并拍照分析。

3.3免疫荧光法检测HCV Core抗原的表达

方法基本同1.3。主要区别在于，所用一抗为HCV Core的特异性鼠源单抗；二抗为AF488荧光标记抗鼠IgG。

3.4实验结果

将80μM的合成肽加入HCV细胞感染系统中，同时以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的细胞组作为阴性对照组(DMSO)。感染后48h通过Westernblot法检测该合成肽对病毒蛋白表达的影响。

结果如图3所示，与对照(CTRL和DMSO)组相比，感染体系中加入80μM的合成肽QLP-98后，丙型肝炎病毒核心蛋白core的表达显著降低(见图3A)，灰度扫描获得的蛋白半定量结果图和细胞中丙型肝炎病毒core蛋白的原位免疫荧光图也进一步确证了上述结果(***，P<0.001，见图3B和C)。

实施例4：合成肽抑制HCV基因组复制能力的实验

4.1合成肽对HCV复制的抑制实验

方法基本同3.1。感染前一天，接种Huh7.5.1细胞于24孔培养板。次日，以MOI＝1的病毒量接种HCV，其中加入80μM的合成肽QLP-98，感染5h后弃去病毒液，继续培养48h，荧光定量PCR法检测病毒基因组RNA复制情况。

4.2荧光定量PCR(real-time PCR)法检测HCV mRNA的复制

4.2.1抽提总RNA准备

购置无核酶的实验材料(如试管、tip头和Ep管)，或用已消毒的0.1％DEPC水浸泡实验材料两小时以上，然后用无菌去离子水冲洗干净，尽量不残留DEPC，再对待用材料进行高压灭菌，室温保存备用。

4.2.2抽提细胞中总RNA

利用Invitrogen公司的总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得细胞中的总RNA。方法如下：

对于上述经不同处理的Huh7.5.1细胞，先吸弃旧的培养液，每孔加入1mL的TRIzol溶解细胞，反复吹打几次，待细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物转移至无核酶的Ep管。将细胞裂解样品在15～30℃条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。按每1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，盖紧管盖，用力摇晃15sec充分混匀，室温静置5min进行分层。于2～8℃12000rpm离心15min。将上层无色的水样层转移至一个新的无核酶的Ep管中。按每1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇沉淀RNA。颠倒混匀，室温静置10min，然后2～8℃12000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇洗涤RNA沉淀，2～8℃7500rpm离心5min，弃上清，空气干燥5-10min RNA沉淀，加入50μL不含RNA酶的无菌超纯水溶解RNA样品。整个过程须勤换手套，谨防RNA酶污染。

4.2.3逆转录制备cDNA

利用TaKaRa逆转录试剂盒获取对照组与实验组细胞的cDNA，具体步骤如下：

在PCR管中加入如下反应体系，

轻柔混匀，置于37℃反应15分钟，然后置于85℃加热5秒灭活逆转录酶。

4.2.4荧光定量PCR法检测

设计引物，检测HCV基因组复制水平。GAPDH作为检测用内参。引物序列如下：

HCV NCR-F：

CTTCACGCAGAAAGCGTCTA(SEQ ID NO:2)

HCV NCR-R：

CAAGCACCCTATCAGGCAGT(SEQ ID NO:3)

GAPDH-F：

TGGGCTACACTGAGCACCAG(SEQ ID NO:4)

GAPDH-R：

AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT(SEQ ID NO:5)

然后，利用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行检测，反应体系如下：

利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，设置程序为95℃预变性2min，进行40个PCR循环，95℃5sec，60℃30sec。

实验数据分析：PCR产物量的变化采用比较Ct值法来进行相对定量。该法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。

定义：ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内标

ΔΔCt＝(Ct_目的基因-Ct_内标)_已处理-(Ct_目的基因-Ct_内标)_未处理

RQ＝2^-ΔΔCt

利用Excel或Prism里的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。将合成肽处理组与DMSO对照组进行T检验分析比较。

4.3实验结果

将80μM的合成肽加入HCV细胞感染系统中，同时以不加合成肽的等量病毒感染的细胞组作为病毒感染阳性对照组(CTRL)；以DMSO处理的细胞组作为阴性对照组(DMSO)。感染后48h通过荧光定量PCR法检测该合成肽对病毒基因组RNA复制的影响。

结果如图4所示，与对照(CTRL和DMSO)组相比，感染体系中加入80μM的合成肽QLP-98后，丙型肝炎病毒基因组RNA复制水平显著降低(**，P<0.01)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 合成肽在制备防治肝炎病毒感染药物中的用途

<130> 权利要求书 说明书

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 1

Leu Ser Leu Thr His Pro Val Leu Gly Trp Gly Ser Val Gln Ala Asn

1 5 10 15

Ala Trp Arg Pro Glu Met

20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 2

cttcacgcag aaagcgtcta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 3

caagcaccct atcaggcagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 4

tgggctacac tgagcaccag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence )

<400> 5

aagtggtcgt tgagggcaat 20

Claims (7)

1.一种具有抑制丙型肝炎病毒感染活性的合成肽，其特征在于，该合成肽具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的合成肽在制备预防或治疗丙型肝炎病毒感染药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的合成肽在制备预防或治疗丙型肝炎病毒感染药物中的用途，其特征在于，所述用途为阻断病毒蛋白和基因组RNA在靶细胞中的表达与复制的用途。

4.一种抗丙型肝炎病毒感染的药物组合物，其特征在于，以权利要求1所述的合成肽或其药学上可接受的盐为活性组分，还包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

5.根据权利要求4所述的抗丙型肝炎病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为能够抑制或下调丙型肝炎病毒基因组RNA复制量的试剂。

6.根据权利要求4所述的抗丙型肝炎病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为阻断病毒蛋白在靶细胞中表达的试剂。

7.根据权利要求4所述的抗丙型肝炎病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为按常规药剂学制备的注射剂。