CN101213204B - 丙型肝炎病毒核酸疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了可以用作HCV核酸疫苗、疫苗组分或用于产生HCV疫苗的核酸构建体。所述的构建体包括：(1)编码含有基于第一种HCV毒株的NS3-4A区和基于第二种毒株的NS3-NS4A-NS4B-NS5A或NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区的嵌合HCV多肽的构建体；和(2)编码HCV多肽的基于黑猩猩的腺病毒载体。

Description

丙型肝炎病毒核酸疫苗
相关申请
本申请要求2005年6月17日提交的美国临时申请号60/691,523，和2005年7月15日提交的美国临时申请号60/699,514的优先权，将它们都引入本文作为参考。
发明背景
不承认本申请中引用的参考文献是所要求保护的本发明的现有技术。
约3％的世界人口感染丙型肝炎病毒(HCV)。(Wasley et al.，Semin.Liver Dis.20，1-16，2000.)接触HCV在少数病例中引起明显的急性病，而在多数情况下，该病毒建立慢性感染，导致肝脏炎症和缓慢发展为肝衰竭和肝硬化。(Iwarson，FEMS Microbiol.Rev.14，201-204，1994.)此外，流行病学调查表明HCV在肝细胞癌的发病机理中起重要作用(Kew，FEMS Microbiol.Rev.14，211-220，1994，Alter，Blood 85，1681-1695，1995.)。
在1992年实现HCV的常规血液筛查之前，通过不经意地接触受污染的血液、血液制品或者移植器官而导致多数感染。在进行HCV的血液筛查的那些区域，主要通过静脉内药物使用感染HCV。较不常见的传播方法包括围产期接触、血液透析和与感染HCV的人的性接触。(Alteret al.，N.Engl.J.Med.341(8)，556-562，1999，Alter，J.Hepatol.31 Suppl.88-91，1999，Wasley et al.，Semin.Liver.Dis.201，1-16，2000.)
HCV基因组由编码约3000个氨基酸的前体多蛋白的约9.5kb的单链RNA组成。(Choo et al.，Science 244，362-364，1989，Choo et al.，Science 244，359-362，1989，Takamizawa et al.，J.Virol.65，1105-1113，1991.)HCV多蛋白含有以下顺序的病毒蛋白质：C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。
例如，Cho et al.，Vaccine17：1136-1144，1999；Paliard et al.，国际公布号WO 01/30812；Coit et al.，国际公布号WO 01/38360；和Emini etal.，国际公布号WO 03/031588提及了HCV核酸序列的用途，所述核酸序列提供一种或多种HCV非结构抗原以产生CMI应答。
发明概述
本发明描述了核酸构建体，其可以用作HCV核酸疫苗、疫苗组分或者用于生产HCV疫苗。所述的构建体包括：(1)编码嵌合HCV多肽的构建体，所述多肽含有基于第一种HCV毒株的NS3-4A区和基于第二种毒株的NS3-NS4A-NS4B-NS5A或NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区；和
(2)编码HCV多肽的基于黑猩猩的腺病毒载体。
从而，本发明的第一方面描述了包含编码HCV嵌合多肽的核苷酸序列的核酸。所述多肽包含HCV NS3-4a区和HCV NS3-NS4A-NS4B-NS5A区，HCV NS3-4a区包含与第一种HCV毒株的HCV NS3-4a基本上相似的氨基酸序列，HCV NS3-NS4A-NS4B-NS5A区包含与第二种HCV毒株的HCV NS3-NS4A-NS4B-NS5A基本上相似的氨基酸序列，其中所述两个区中存在的NS3-4A序列具有不同的序列。第一个区位于第二个区的氨基或者羧基侧。
关于氨基酸序列，对“基本上相似的序列”的引用指出与参考序列至少约70％的同一性。与参考序列的百分比同一性(也称作百分比同一的)可如下确定：将所述多肽区与对应的参考区比较以得到相同氨基酸的最大数目并确定对应的区域中相同氨基酸的数目。将该数目除以参考区域中氨基酸总数然后乘以100并四舍五入到最接近的整数。例如，HCVNS3-4A，NS3-NS4A-NS4B-NS5A和NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B的区域可以是不同的HCV毒株中存在的相应的HCV区域。
第一个和第二个区域中存在的不同的NS3-4A序列通过一个或多个氨基酸差异来反映。每个氨基酸差异独立地为添加、替代或者缺失。
在优选实施方案中，核酸是能够在人细胞中表达编码的HCV多肽的表达载体。人细胞内的表达具有治疗应用，用以主动治疗HCV感染和预防性治疗HCV感染。
表达载体含有编码多肽以及用于正确转录和加工的调节元件的核苷酸序列。可以存在的调节元件包括与编码所述多肽的核苷酸序列天然结合的那些元件和不与所述核苷酸序列天然结合的外源调节元件。外源调节元件如外源启动子可以用于在特定宿主，如人细胞中表达。
优选的表达载体是具有一个或多个缺失区域的重组腺病毒基因组。重组腺病毒基因组可以含有与一种或多种腺病毒血清型基本上相似的不同区域。对缺失区域的引用表示缺失全部或者部分所述区域。
本发明的另一方面描述了重组腺病毒，其包含：
a)编码HCV多肽的表达盒，其中HCV多肽包含HCV NS3-NS4A-NS4B-NS5A；和
b)含有E1缺失、E3缺失和任选含有E4缺失的重组腺病毒基因组；条件是该腺病毒基因组编码如下至少一种：(i)具有与SEQ IDNO：3或9基本相似的氨基酸序列的尾丝区；(ii)具有与SEQ IDNO：5或11基本相似的氨基酸序列的六邻体区；和(iii)具有与SEQ ID NO：7基本相似的氨基酸序列的五邻体区。
所述表达盒位于E1或者E3缺失。如果表达盒的全部或者部位位于对应于E1或者E3缺失的区域的位置中，那么认为该表达盒位于E1或者E3缺失中。
对HCV多肽或者氨基酸序列的引用包括天然存在的HCV序列、天然存在的序列的衍生物，其基本上类似于天然存在的序列或者所指出的序列，和嵌合HCV多肽。嵌合HCV多肽包括如上本发明第一方面所述的那些。
本发明的另一方面描述了重组腺病毒颗粒。所述颗粒由本文描述的重组腺病毒基因组编码并且包装该基因组的拷贝。
本发明的另一方面描述了制备重组腺病毒颗粒的方法，其包括步骤：(a)使用E1补充细胞表达重组腺病毒基因组来产生颗粒；和(b)基本上纯化该颗粒。对基本上纯化该颗粒的引用表示除去产生所述颗粒的全部或者多数细胞和细胞碎片。
本发明的另一方面描述了药物组合物，其包含治疗有效量的编码HCV多肽的核酸和可药用载体。
本发明的另一方面描述了治疗患者的方法，其包括对患者施用治疗有效量的编码HCV多肽的核酸的步骤。
对“治疗”的引用包括治疗HCV感染的患者或者预防性治疗患者以减小主动HCV感染的可能性或者严重性。“患者”指能够被HCV感染的哺乳动物。患者可以被或不被HCV感染。患者的实例是人和黑猩猩。
对于HCV感染的患者，有效量足以实现一种或多种下面的效果：减小HCV复制的能力，减小HCV负荷，增加病毒清除，和增强一种或多种HCV特异性CMI应答。
对于不被HCV感染的患者，有效量足以实现下面的一种或多种：增加产生对HCV感染的HCV特异性CMI应答的一种或多种组分的能力，减小对HCV感染的易感性，和减小感染性病毒建立持久感染而发生慢性疾病的能力。
对开放式术语如“包含”的引用允许额外的成分或者步骤。有时短语如“一种或多种”与或者不与开放式术语一起使用以强调额外的成分或者步骤的可能性。
除非明确指出，对术语如“一个”或“一种”的引用不限于一个。例如，“一个细胞”不排除“多个细胞”。有时，使用诸如一个或多个的短语来强调可能存在多个。
从本文提供的额外描述，包括不同的实施例，本发明的其他特点和优点是显而易见的。所提供的实施例阐明可用于实施本发明的不同的组分和方法。实施例不限制所要求保护的发明。基于本公开，技术人员可以鉴定和使用可用于实施本发明的其他组分和方法。
附图简述
图1提供了SEQ ID NO：1的氨基酸序列。氨基酸1-686提供了NS3-NS4A区，其基于HCV 3a。氨基酸687-690提供了HCV 3a NS4B区的前4个氨基酸并且提供了HCV 3a NS3-NS4A区的切割连接点。氨基酸691-2675提供了基于HCV 1b的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区。NS3-NS4A区和NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B还含有初始甲硫氨酸的加入。
图2A-2C提供了SEQ ID NO：2的核酸序列。
核苷酸318-10182提供了表达盒，其含有：
HCMV启动子：nt318-905
Int A：nt1040-1865
Kozaq序列：nt1885-1890
HCV Met-NS3-NS4A(基于3a，优化的)：nt1891-3948
HCV NS4B的前4个氨基酸(基于3a)：nt 3949-3960
HCV Met-NS3-5B(基于1b，Bk毒株，优化的)：nt 3961-9915
TAAA终止子：nt 9916-9919
BGH：nt 9956-10179。
图3提供了met-NS3-5B序列(SEQ ID NO：16)。
图4A-4J提供了ChAd3尾丝(图4A，SEQ ID NO：3)，ChAd3六邻体(图4B，SEQ ID NO：5)，ChAd3五邻体(图4C，SEQ ID NO：7)，ChAd63尾丝(图4D，SEQ ID NO：9)，ChAd63六邻体(图4E，SEQ IDNO：11)的氨基酸序列；和ChAd3尾丝(图4F，SEQ ID NO：4)，ChAd3六邻体(图4G，SEQ ID NO：6)，ChAd3五邻体(图4H，SEQ ID NO：8)，ChAd63尾丝(图4I，SEQ ID NO：10)，和ChAd63六邻体(图4J，SEQ ID NO：12)的编码核酸。
图5A-5H提供了ChAd3ΔE1，3，4，Ad5 E4orf6，NSmut-35，890 bp(ChAd3NSmut，SEQ ID NO：13)的核酸序列。野生型基因组的缺失坐标为：E1缺失从nt 461到nt 3541(3080 bp)，E3缺失从nt 28644到nt32633(3989 bp)，E4缺失从nt 34634到nt 37349(2715bp)。不同的区域如下：
ChAd3左ITR+包装信号：nt1-460
HCMV启动子：nt 467-1257
Kozak共有序列：nt 1263-1268
HCV NS3-5B(BK毒株)：nt 1269-7223
TAA终止子：nt 7224-7226
BGH多聚A：nt 7234-7452
ChAd3骨架：nt 7468-35890
Ad5 E4orf6：nt 34601-35482。
图6A-6H提供了野生型ChAd3的核酸序列(SEQ ID NO：14)。
图7A-7H提供了野生型ChAd6的核酸序列(SEQ ID NO：15)。
图8提供了ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)和MRKAd6NSmut感染的HeLa细胞中HCV NS蛋白质表达的比较。
图9提供了ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)和MRKAd6NSmut诱导C57/B6小鼠中细胞介导的免疫的能力的比较。
图10A-10H提供了ChAd63ΔE1，3，4，Ad5 E4orf6，NSmut的核酸序列(SEQ ID NO：17)。野生型基因组的缺失坐标是：E1缺失从nt 455到nt3421(2967 bp)，E3缺失从nt 27207到nt31778(4582bp)，E4缺失从nt33825到nt36215(2390bp)。不同的区域如下：
ChAd63左ITR+包装信号：nt1-454
HCMV启动子：nt458-1248
Kozak共有序列：nt1254-1259
HCV NS3-5B(BK毒株)：nt1260-7214
TAA终止子：nt7215-7217
BGH多聚A：nt7227-7447
ChAd63主链：nt7458-34658
Ad5 E4orf6：nt33316-34197。
图11图解了通过IFN-γELISPOT测量的免疫应答的时间过程，表达为在任何给定时间点对不同的HCV NS肽库观察到的应答的和。
图12图解了pV1JnsNSOPTmut3a-1b的不同组分。
图13图解了编码嵌合HCV多肽的pV1JnsNSOPTmut 3a-1b表达盒的遗传结构。不同的核苷酸区域为：
-人CMV启动子：318-905；
-内含子A：1040-1865；
-Kozaq序列：1885-1894；
-HCV MetNS3-NS4A(基因型3a)：1891-3960；
-HCV MetNS3-NS5BOPTmut(基因型1b)：3961-9915；
-TAAA终止子：9916-9919；和
-BGH多聚A：9965-10182.
图14显示了用嵌合质粒(pV1Jns-NSOPTmut 3a-1b)或用pV1Jns-NSOPTmut免疫的动物(CD1小鼠)中，反应于来自HCV 1b和3a的NS3蛋白质而分泌IFN-γ的细胞数目(表示为每一百万个脾细胞中形成斑点的细胞)。
发明详述
本发明包括编码HCV嵌合多肽的核酸，其提供基于不同的HCV毒株的HCV非结构蛋白，和黑猩猩腺病毒载体用于表达HCV多肽的用途。所述核酸的用途包括用作疫苗组分以向细胞中导入HCV多肽，其提供用于产生抗HCV的CMI应答的宽范围的抗原，和用作生产此类疫苗组分的中间体。
由于主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类表达的广泛的分布，适应性细胞免疫应答可以发挥识别身体各处HCV感染的细胞中的病毒抗原，诱导免疫学记忆，和保持免疫学记忆的功能。这些功能规因于抗原特异性CD4+T辅助(Th)和CD8+细胞毒性T细胞(CTL)。
当通过它们的特异T细胞受体激活时，HCV特异性Th细胞完成多种免疫调节功能，它们的多数由Th1和Th2细胞因子介导。HCV特异性Th细胞帮助B细胞的激活和分化和病毒特异性细胞毒性T细胞的诱导和刺激。Th细胞与CTL一起还可以分泌抑制多种病毒的复制和基因表达的IFN-γ和TNF-α。此外，主要的效应细胞Th细胞和CTL可以诱导病毒感染的细胞的细胞凋亡和裂解。
反应于专职抗原呈递细胞(pAPCs)加工的抗原而产生HCV特异性CTL。抗原可以在pAPCs中合成或者导入pAPCs。通过向细胞中导入编码抗原的表达盒，可以在pAPCs细胞中发生抗原合成。
核酸疫苗施用的优选途径是肌内途径。肌内施用似乎导致向体细胞和pAPCs中导入和表达核酸。在体细胞中产生的HCV抗原可以转移到pAPCs中用于在MHCI类分子背景中的呈递。(Donnelly et al.，Annu.Rev.Immunol.15：617-648，1997.)
pAPCs将较长的抗原加工成蛋白酶体复合体中较小的肽抗原。该抗原被易位到内质网/高尔基复合体分泌途径用于与MHC I类蛋白质结合。CD8+T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)和CD8细胞表面蛋白识别与I类MHC结合的抗原。
基于黑猩猩腺病毒作为用于导入HCV抗原的载体的用途提供了人腺病毒载体的备选方案。基于黑猩猩腺病毒的载体当与多种免疫策略结合使用时尤其有用，其中被治疗的患者已经产生了针对最初使用的腺病毒载体的免疫应答。重复暴露于相同类型的基于腺病毒的载体可以由于针对腺病毒蛋白质的免疫应答而导致降低的有效性。一些最初的暴露可以是腺病毒感染的结果，可能补充使用腺病毒治疗HCV之外的疾病。
基于本文提供的教导，可以产生足够强的免疫应答以在患者中实现有益效果。所提供的教导包括关于HCV序列选择、载体选择、载体产生、组合治疗和施用的信息。
I.嵌合序列
提供具有不同的NS3-4A序列的区域的HCV嵌合多肽可以用作疫苗组分来提供靶定不同HCV毒株的抗原。HCV的主要特征是它的基因组的异质性。(Pawlotsky，Clin.Liver Dis，7：45-66，2003，Simmonds，J.General.Virol，85：3173-3188，2004.)此外，通常的易错的依赖RNA的RNA聚合酶和缺少RNA病毒通常的校正活性以及宿主导致的突变，是造成宿主中的HCV循环作为称作准种的复杂病毒群体的原因。(Blight etal.，Science 290：1972-1974，2000.)
嵌合构建体的不同区域中存在的不同的NS3-4A序列通过一个或多个氨基酸差异反映。每个氨基酸差异独立地是添加、替代或缺失。在不同实施方案中，第一个和第二个区域的NS3-4A区域相差至少约5％，至少10％，至少15％，或者有至少1、5、10、15、20或25个氨基酸改变。除了NS3-4A序列外，NS3-4A区域可以含有额外的氨基酸，如氨基末端甲硫氨酸和/或导入的切割位点。
可以从100减去序列同一性，确定百分比差异。例如，85％序列同一性提供了15％的差异。
基于天然存在的HCV分离物的多种实例，可以容易地产生嵌合多肽中存在的第一个区域和第二个多肽区域。可以将HCV分离物分类成下面的六个主要基因型，其包含一个或多个亚型：HCV-1/(1a，1b，1c)、HCV-2/(2a，2b，2c)、HCV-3/(3a，3b，10a)、HCV-4/(4a)，HCV-5/(5a)和HCV-6/(6a，6b，7b，8b，9a，11a)。(Simmonds，J.Gen.Virol.，693-712，2001.)特定的HCV序列如HCV-BK、HCV-J、HCV-N和HCV-H已经保存在GenBank并在多种出版物中描述。(例如，Chamberlain et al.，J.Gen.Virol.，1341-1347，1997.)
优选地，第一个和第二个区域都在体内被HCV蛋白酶加工以提供对应于存在于HCV嵌合多肽中的各个蛋白质的蛋白质。各HCV蛋白质可以被细胞进一步加工。
在涉及第一个区域的不同实施方案中，所述区域为或者含有氨基酸序列，该氨基酸序列基本上类似于如下序列中存在的NS3-NS4A区：SEQID NO：1的氨基酸1-686；HCV 1a(检索号.M62321)；HCV 2a(检索号.D00944；HCV 3a(检索号：D28917)；HCV 4a(检索号：Y11604)；HCV 5a(检索号：Y13184)或HCV 6a(检索号：D84264)。
在涉及第二个区域的不同实施方案中，该区域为或者含有NS3-NS4A-NS4B-NS5A或NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B*序列，其基本上类似于如下序列中存在的对应的区域：SEQ ID NO：1的氨基酸686-2675、氨基酸691-2675或氨基酸692-2675；HCV 1a(检索号.M62321)；HCV 2a(检索号.D00944；HCV 3a(检索号：D28917)；HCV 4a(检索号：Y11604)；HCV 5a(检索号：Y13184)或HCV 6a(检索号：D84264)。对“NS5B*的引用指无活性的NS5B。
优选地，第二个区域含有与来自第一个区域的蛋白酶活性相容的氨基酸切割位点。可以基于已知的切割序列加入切割位点。
关于氨基酸序列对“基本上相似的序列”的引用指出与参考序列至少约70％的同一性。与参考序列的百分比同一性(也称作百分比同一的)可如下确定：将所述多肽区与对应的参考区比较以得到相同氨基酸的最大数目并确定对应的区域中相同氨基酸的数目。将该数目除以参考区域中氨基酸总数然后乘以100并四舍五入到最接近的整数。
在不同实施方案中，基本上相似的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性；或者相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变。每个改变独立地为插入、替代或者添加。
可以产生对天然存在的HCV序列的修饰以得到不同的基本上相似的序列。天然存在的氨基酸中的差异是由于不同的氨基酸侧链(R基团)。R基团影响氨基酸的不同的性质，如物理大小、电荷和疏水性。可以将氨基酸分成如下的不同组：中性且疏水的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸)；中性且极性的(甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；碱性的(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；和酸性的(天冬氨酸和谷氨酸)。
通常，在替代不同的氨基酸以保持活性中，优选交换具有相似性质的氨基酸。替代特定组中的不同氨基酸，如缬氨酸替代亮氨酸、精氨酸替代赖氨酸和天冬酰胺替代谷氨酰胺是不引起多肽三级结构的改变的良好候选者。
氨基酸修饰优选保持或者加入T细胞抗原区域。可以对天然存在的HCV多肽序列进行不同的修饰以产生能够引起宽范围的T细胞应答的多肽。影响多肽引起宽T细胞应答的能力的因素包括保留或者引入HCV特异性T细胞抗原区和在不同的HCV分离物中不同的T细胞抗原区的优势。
例如，通过经验性实验可以鉴定HCV T细胞抗原。鉴定T细胞抗原的一种方法涉及从较长的多肽产生一系列重叠的短肽，然后从来自受感染的患者的T细胞群体筛选阳性克隆。通过特定的肽活化/激发阳性克隆。诸如IFNγ-ELISPOT、IFNγ-细胞内染色和成批CTL测定法的技术可以用于测量肽活性。可以认为这样鉴定的肽代表各自病原体的T细胞表位。
HCV多肽自身加工和产生CMI应答的能力可以用本文描述的或者本领域公知的技术测定。(见例如，Emini et al.，国际公布号WO03/031588.)此类技术包括使用IFNγ-ELISPOT、IFNγ-细胞内染色和成批CTL测定法测量HCV特异性CMI应答。
可以在NS5B中进行小的修饰以通过靶定复制所必需的基序而产生无活性的聚合酶。NS5B活性关键的基序和可以做出以产生无活性的NS5B的修饰的实例由Lohmann et al.，Journal of Virology71：8416-8426，1997，Kolykhalov et al.，Journal of Virology 74：2046-2051，2000，和Emini et al.，国际公布号WO03/031588描述。
当对嵌合HCV产生修饰时，需要考虑的额外因素包括保持自身加工的能力和保持T细胞抗原。所述多肽自身加工的能力很大程度上由功能蛋白酶活性决定。通过考虑NS3蛋白酶、作为NS3的辅因子的NS4A和HCV多肽中存在的蛋白酶识别位点，可以得到保持蛋白酶活性的修饰。
II.嵌合NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B* 2
优选的嵌合HCV多肽是NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B* 2，其中下标1和2表示与不同的HCV毒株中的对应区域基本上相似的区域序列，“NS5B*”表示酶学上无活性的NS5B。NS31-NS4A1和NS32-NS4A2相差至少一个氨基酸。在不同的实施方案中，NS31-NS4A1和NS32-NS4A2相差至少约5％，至少约10％，至少约15％；或者有至少1、5、10、15、20或25个氨基酸改变。
优选地，NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2 *多肽为第一个和第二个区域提供了足够的体内蛋白酶活性以各自产生一种或多种各自的HCV肽。在优选实施方案中，所述多肽可以产生作为单个肽的NS31，NS4A1、NS32、NS4A2、NS4B2、NS5A2和NS5B2 *。
可以如上文第1部分中所述提供不同的NS31-NS4A1和NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2 *区域。在不同的实施方案中，NS31-NS4A1区域为或者含有与SEQ ID NO：1的氨基酸1-686，或氨基酸2-686基本上相似的序列；NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2 *为或者含有与SEQ IDNO：1的氨基酸687-2675、691-2675或692-2675基本上相似的序列；或者NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2 *作为整体与SEQ IDNO：1基本上相似。在不同的实施方案中，每个区域与SEQ ID NO：1中对应的区域至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％基本上相似；或者相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变。
III.基因表达盒
编码多肽的基因表达盒含有多肽表达所需的元件。对“多肽”的引用可以是嵌合多肽。
III.A.编码的多肽序列
本文描述的HCV多肽编码的序列可以用于不同的载体中。特定的实例包括如上文第I和II部分中描述的嵌合多肽序列，和HCV多肽序列Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B*，如与SEQ ID NO：16基本上相似的序列(见Emini et al.，国际公布号WO 03/031 588)。与SEQ ID NO：16基本上相似的序列例如可以与下文第V部分中描述的黑猩猩载体结合使用。
在不同实施方案中，SEQ ID NO：16基本上相似的序列与SEQ IDNO：16的序列同一性为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％；或者相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变。
III.B.编码的多肽序列
基因表达盒中存在的调节元件一般包括：(a)在转录上偶联到编码所述多肽的核苷酸序列的启动子，(b)功能上偶联到所述核苷酸序列的5’核糖体结合位点，(c)连接到所述核苷酸序列的3’末端的终止子，和(d)功能上偶联到所述核苷酸序列的3’多聚腺苷酸化信号。还可以存在可用于增强或调节基因表达或者多肽加工的额外的调节元件。
启动子是被RNA聚合酶识别并介导下游区域转录的遗传元件。优选的启动子是提供增强水平的转录的强启动子。强启动子的实例是立即早期人巨细胞病毒启动子(CMV)，和具有内含子A的CMV。(Chapmanet al，Nucl.Acids Res.19：3979-3986，1991.)启动子的其他实例包括天然存在的启动子，如EF1α启动子、鼠CMV启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，和SV40早期/晚期启动子和β-肌动蛋白启动子，和人工启动子，如合成的肌肉特异性启动子和嵌合的肌肉特异性/CMV启动子(Li et al.，Nat.Biotechnol.17：241-245，1999，Hagstrom et al.，Blood95：2536-2542，2000)。
核糖体结合位点位于起始密码子处或者附近。核糖体结合位点的实例包括CCACCAUGG、CCGCCAUGG和ACCAUGG，其中AUG是起始密码子(Kozak，Cell 44：283-292，1986.)。核糖体结合位点的另一实例由SEQ ID NO：18提供。
多聚腺苷酸化信号负责切割转录的RNA和向RNA加入多聚(A)尾。高等真核生物中的多聚腺苷酸化信号含有来自多聚腺苷酸化加入位点的约11-30个核苷酸的AAUAAA序列。AAUAAA序列参与信号传递RNA切割。(Lewin，Genes IV，Oxford University Press，NY，1990.)多聚(A)尾对于mRNA加工是重要的。
可以用作基因表达盒的部分的多聚腺苷酸化信号包括最小兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号和牛生长激素多聚腺苷酸化(BGH)信号。(Xuet al.，Gene 272：149-156，2001，Post et al，U.S.Patent No.5,122,458.)额外的实例包括合成的多聚腺苷酸化信号(SPA)和SV40多聚腺苷酸化信号。SPA序列由SEQ ID NO：19提供。
对“转录上偶联的”的引用表示启动子处于这样的位置，其使得结合在该启动子处的RNA聚合酶可以引起核苷酸序列的转录。转录上偶联不需要被转录的序列与启动子相邻。
对“功能上偶联的”的引用表示介导对核苷酸序列的作用的能力。功能上偶联不需要偶联的序列相互相邻。功能上偶联到核苷酸序列的3’多聚腺苷酸化信号促进所转录的RNA的切割和多聚腺苷酸化。功能上偶联到核苷酸序列的5’核糖体结合位点方便核糖体结合。
可用于增强或调节基因表达或者可能存在的多肽加工的额外的调节元件的实例包括增强子、前导序列和操纵子。增强子区增强转录。增强子区的实例包括CMV增强子和SV40增强子。(Hitt et al.，Methods inMolecular Genetics 7：13-30，1995，Xu，et al.，Gene 272：149-156，2001.)增强子区可以与启动子结合。
前导序列是多肽上的氨基酸区域，其将该多肽导向蛋白酶体。编码前导序列的核酸在结构基因的5’并且沿着该结构基因转录。前导序列的实例是tPA。
操纵子序列可以用于调节基因表达。例如，Tet操纵基因序列可以用于抑制基因表达。
IV.编码核酸序列
编码核酸序列提供了编码特定氨基酸序列的密码子。用特定氨基酸序列和遗传密码的已知的简并性开始，可以得到许多不同的编码核酸序列。因为几乎所有氨基酸都由核苷酸三联体或者“密码子”的不同组合编码，所以产生遗传密码的简并性。
特定密码子向特定氨基酸的翻译是本领域中公知的(见，例如，Lewin GENES IV，p.119，Oxford University Press，1990)。氨基酸由如下的密码子编码：
A＝Ala＝丙氨酸：密码子GCA，GCC，GCG，GCU
C＝Cys＝半胱氨酸：密码子UGC，UGU
D＝Asp＝天冬氨酸：密码子GAC，GAU
E＝Glu＝谷氨酸：密码子GAA，GAG
F＝Phe＝苯丙氨酸：密码子UUC，UUU
G＝Gly＝甘氨酸：密码子GGA，GGC，GGG，GGU
H＝His＝组氨酸：密码子CAC，CAU
I＝Ile＝异亮氨酸：密码子AUA，AUC，AUU
K＝Lys＝赖氨酸：密码子AAA，AAG
L＝Leu＝亮氨酸：密码子UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU
M＝Met＝甲硫氨酸：密码子AUG
N＝Asn＝天冬酰胺：密码子AAC，AAU
P＝Pro＝脯氨酸：密码子CCA，CCC，CCG，CCU
Q＝Gln＝谷氨酰胺：密码子CAA，CAG
R＝Arg＝精氨酸：密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU
S＝Ser＝丝氨酸：密码子AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU
T＝Thr＝苏氨酸：密码子ACA，ACC，ACG，ACU
V＝Val＝缬氨酸：密码子GUA，GUC，GUG，GUU
W＝Trp＝色氨酸：密码子UGG
Y＝Tyr＝酪氨酸：密码子UAC，UAU
SEQ ID NO：13的核苷酸1269-7223提供了NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B*序列的实例。与SEQ ID NO：13的核苷酸1269-7223基本上相似的序列可以用作疫苗组分的部分。(Emini et al.，国际公布号WO03/031588.)例如，此类基本上相似的序列可以用作基于ChA3或ChA63的腺病毒载体的部分。
关于核苷酸序列，对“基本上相似的序列”的引用表示与参考序列至少约70％的同一性。与参考序列的百分比同一性(也称作百分比同一的)可如下确定：将所述核苷酸区与对应的参考区比较以得到最大同一性并确定对应的区域中相同核苷酸的数目。将该数目除以参考区域中核苷酸总数然后乘以100并四舍五入到最接近的整数。
可以优化核酸序列以增强在宿主中的表达。将考虑的因素包括C：G含量、优选的密码子、抑制性二级结构的避免。这些因素可以以不同的方式组合以试图得到在特定宿主中具有增强的表达的核酸序列。(见，例如，Donnelly et al.，国际公布号WO97/47358.)
HCV编码核酸的优化也在Emini et al.，国际公布号WO03/031588中描述。WO 03/031588提供了编码NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B*的不同的优化序列的实例。
NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2 *的密码子优化的序列的实例由SEQ ID NO：2的核苷酸1891-9915提供。核苷酸1891-1893提供了NS31-NS4A1区的甲硫氨酸密码子。核苷酸3949-3960提供了NS32-NS4A2区，其前四个氨基酸基于HCV 3a，接着是甲硫氨酸。
在本发明的不同的实施方案中，NS31-NS4A1-NS32-NS4A2-NS4B2-NS5A2-NS5B2 *编码区与SEQ ID NO：2的核苷酸1891-9915或1894-9915基本上相似。在不同的实施方案中，该核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸1891-9915或1894-9915具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性；或者相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或1-50个核苷酸。
V.核酸载体
编码HCV多肽的核酸可以用作治疗载体或者用于产生治疗载体。用于产生治疗载体的载体包括穿梭载体和腺病毒基因组质粒。
治疗载体用于向细胞中导入并在其中表达HCV多肽。合适的载体可以递送核酸到靶细胞，而不引起不可接受的副作用。用编码HCV多肽的基因表达盒实现了细胞表达。
可以用于治疗应用的载体的实例包括第一代和第二代腺病毒载体、依赖辅助病毒的腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、α病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体，和质粒载体。(Hitt，et al.，Advances in Pharmacology 40：137-206，1997，Johnston et al.，美国专利号6,156,588，Johnston et al.，国际公布号WO 95/32733，Emini et al.，国际公布号WO 03/031588.)
VA.腺病毒载体
腺病毒载体使用重组腺病毒基因组在靶细胞中表达目的蛋白质或者多肽。野生型腺病毒具有双链线性基因组，在两端具有反向末端重复。在病毒复制期间，基因组包装在病毒壳体内部形成病毒体。病毒通过病毒附着接着内化进入它的靶细胞。(Hitt et al.，Advances inPharmacology 40：137-206，1997.)
腺病毒基因组提供了腺病毒复制和加工所需的不同的元件。腺病毒基因组的每个末端含有反向末端重复(ITR)，其是病毒复制必需的。该病毒还编码加工产生感染性病毒体所需的一些结构蛋白质必需的蛋白酶活性。
可以基于宿主细胞转导后病毒基因的表达顺序描述腺病毒基因组的结构。根据转录发生在DNA复制开始之前或之后，将病毒基因称作早期(E)或者晚期(L)基因。在转录早期，表达E1、E2、E3和E4基因，为宿主细胞的病毒复制做准备。通过缺失病毒基因组的必需的早期区域1(E1)，可以使得病毒成为复制缺陷的。(Brody et al，Ann.N.Y.Acad..Sci.，716：90-101，1994.)
在晚期，晚期基因的表达被打开，该基因编码病毒颗粒的结构组分。所有晚期基因都处于单个启动子的控制下，并且编码蛋白质，包括五邻体(L2)、六邻体(L3)、100kDa支架蛋白(L4)，和尾丝蛋白(L5)，其形成新的颗粒，腺病毒DNA可以包裹在所述颗粒中。最后，野生型腺病毒复制过程可以引起细胞裂解。
腺病毒载体可以基于不同的腺病毒血清型，如在人或者动物中发现的那些。动物腺病毒的实例包括牛、猪、黑猩猩、鼠、犬和鸟(CELO)。人腺病毒包括B、C、D或者E组血清型，如2(“Ad2”)、4(“Ad4”)、5(“Ad5”)、6(“Ad6”)、24(“Ad24”)、26(“Ad26”)、34(“Ad34”)和35(“Ad35”)型。腺病毒载体可以含有来自一种腺病毒或者来自两种或多种不同的腺病毒的区域。
在不同的实施方案中，腺病毒载体是基于Ad5、Ad6、ChAd3、ChAd63或其组合。Ad5由Chroboczek，et al.，J.Virology 186：280-285，1992描述。基于Ad5和Ad6的载体在Emini et al.，国际公布号WO03/031588中描述。ChAd3的全长核酸序列在图6A-6H中提供。ChAd63的全长核酸序列在图7A-7H中提供。
在本发明的一个实施方案中，腺病毒载体含有一种或多种表面暴露的黑猩猩ChAd3或ChAd63结构蛋白。表面暴露的蛋白包括尾丝、六邻体和五邻体。包括此类蛋白质的腺病毒载体与人腺病毒蛋白质相反，当患者以前接触人腺病毒时，较少可能受到免疫应答的影响。
在不同的实施方案中，重组腺病毒载体基因组编码如下至少一种：
a)尾丝区，其具有与SEQ ID NO：3或9基本上相似的氨基酸序列；
b)六邻体区，其具有与SEQ ID NO：5或11基本上相似的氨基酸序列；
c)五邻体区，其具有与SEQ ID NO：7基本上相似的氨基酸序列。
在额外不同的实施方案中，序列相似性为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％；或者序列相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸改变。
V.A.1第一代腺病毒载体
第一代腺病毒载体含有重组腺病毒基因组，其具有E1缺失、任选的E3缺失、任选的E4缺失和表达盒。缺失的程度和组合足够大以使得病毒不能复制和容纳编码目的产物的基因表达盒。通过E1缺失使得病毒不能复制。
从Ad5的约碱基对342开始直到约碱基对3523，或者其他腺病毒的对应区域，可以得到E1缺失。优选地，缺失的区域涉及除去从Ad5的约碱基对450到约碱基对3511，或者其他腺病毒的对应区域。从约碱基对341开始的较大的E1区域缺失除去了促进病毒包装的元件。
从Ad5的约碱基对27865到约碱基对30995，或者其他腺病毒的对应区域，可以得到E3缺失。优选地，缺失的区域涉及除去从Ad5的约碱基对28134到约碱基对30817，或者其他腺病毒的对应区域。
从ChAd3的约碱基对34634开始到约碱基对37349或者其他腺病毒的对应区域，可以得到E4缺失。E4缺失将应该保留天然的E4orf6，或者可以插入来自不同腺病毒的E4orf6。Bett et al.，国际公布号WO2004/018627阐明了异源E4 orf6的用途。
E1、E3和E4缺失的组合应该足够大以便含有基因表达盒的重组基因组的总的大小不超过野生型腺病毒基因组的约105％。例如，随着重组腺病毒Ad5基因组的大小增加到高于约105％，基因组变得不稳定。(Bett et al.，Journal of Virology 67：5911-5921，1993.)
优选地，含有基因表达盒的重组腺病毒基因组的大小为野生型腺病毒基因组大小的约85％到约105％。在不同的实施方案中，含有表达盒的重组腺病毒基因组的大小为野生型基因组大小的约100％到约105.2％，和约100％。
可以在具有E1和E3缺失的Ad5或Ad6基因组中插入约7,500kb。没有任何缺失的Ad5基因组为35,935个碱基对，Ad6基因组为35,759个碱基对。
ChAd3和ChAd63载体与Ad5相比具有更大的基因组大小和存在可以缺失的更大的E3区域，所以插入核酸的能力更大。ChAd3基因组为37,741个碱基对，ChAd63基因组为36,643个碱基对。
在携带E1、E3缺失和Ad5 E4 orf6对E4的替代的ChAd3和ChAd63腺病毒载体中可以插入约高达10,800bp。用Ad5 E4 orf6替代E4既是缺失又是替代，因为替代的Ad5 E4orf6小于所缺失的。这些载体的10,800bp的插入片段达到了野生型基因组大小的105％的极限。
通过提供反式E1基因产物可以进行第一代腺病毒载体的复制。可以反式提供E1产物，例如，通过使用用腺病毒E1区转化的细胞系。用腺病毒E1区转化的细胞和细胞系的实例是HEK 293细胞、911细胞、PERC.6TM细胞和转染的原代人aminocytes细胞。(Graham et al.，Journalof Virology 36：59-72，1977，Schiedner et al.，Human Gene Therapy11：2105-2116，2000，Fallaux et al.，Human Gene Therapy9：1909-1917，1998，Bout et al.，美国专利号6,033,908.)
用Ad5 E4 orf6顺式替代黑猩猩腺病毒天然E4区将促进在Ad5补充细胞系中增殖的不同血清型的黑猩猩腺病毒载体的生长和/或增加产量。293和PER.C6细胞中的Ad5E1序列不完全补充属于C组样黑猩猩腺病毒的人腺病毒外的血清型的复制。
应该将表达盒插入到重组腺病毒基因组中对应于缺失的E1区或者缺失的E3区的区域中。表达盒可以具有平行的或反平行的方向。在平行方向，所插入基因的转录方向与缺失的E1或E3基因为相同方向。在反平行方向，相反链作为转录模板并且转录方向为相反的方向。
在本发明的实施方案中，腺病毒载体含有E4缺失和序列的插入，该序列与SEQ ID NO：13的核苷酸34601-35482提供的Ad5 E4orf6序列基本上相似。在不同的实施方案中，序列同一性为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％；或者与SEQ ID NO：13的核苷酸34601-35482相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或1-50个核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，腺病毒载体骨架与SEQ ID NO：13的核苷酸1-460和7468-35890，或者与SEQ ID NO：17的核苷酸1-454和7458-34658有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的核苷酸序列同一性；或者与SEQ ID NO：13的核苷酸1-460和7468-35890，或者与SEQ ID NO：17的核苷酸1-454和7458-34658相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或1-50个核苷酸。
在另一实施方案中，含有表达盒的腺病毒载体与SEQ ID NO：13或17具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的核苷酸序列同一性；或者与SEQ ID NO：13或17相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或1-50个核苷酸。
V.A.2第二代腺病毒载体
第二代腺病毒载体含有比第一代载体更少的腺病毒基因组并且可以与补充细胞系和/或提供腺病毒蛋白质的辅助载体结合使用。第二代腺病毒载体一般在不同的参考文献如Russell，Journal of General Virology81：2573-2604，2000；Hitt et al.，1997，Human Ad vectors for Gene Transfer，Advances in Pharmacology，Vol.40 Academic Press，Catalucci et al.Journal of Virology 79：6400-6409，2005中描述。第二代腺病毒载体可以基于不同类型的腺病毒，包括人和黑猩猩腺病毒。
V.B.DNA质粒载体
DNA疫苗质粒载体含有基因表达盒以及促进复制和优选促进载体选择的元件。优选的元件提供了在非哺乳动物细胞中的复制和选择标记。治疗载体应该不含有提供在人细胞中复制或者整合到人核酸中的元件。
选择标记促进含有该标记的核酸的选择。优选的选择标记是赋予抗生素抗性的那些选择标记。抗生素选择基因的实例包括编码对氨苄青霉素、新霉素和卡那霉素抗性的核酸。
合适的DNA疫苗载体可以用含有细菌复制起点和选择标记的质粒开始。提供较高产率的细菌复制起点的实例包括ColE1质粒来源的细菌复制起点。(Donnelly et al.，Annu.Rev.Immunol.15：617-648，1997.)
细菌复制起点和选择标记的存在允许在细菌菌株如大肠杆菌(E.coli)中产生DNA载体。选择标记用于消除不含有该DNA载体的细菌。
SEQ ID NO：2提供了含有编码HCV多肽的表达盒的质粒载体的实例。在本发明的一个实施方案中，质粒载体与SEQ ID NO：2有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的核苷酸序列相似性；或者与SEQ ID NO：2相差0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或1-50个核苷酸。
VI.载体产生
使用重组核酸技术，如涉及使用限制酶、核酸连接和同源重组的技术，可以产生载体。重组核酸技术是本领域公知的。(Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-1998，和Sambrook etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manuaal，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989.)
中间载体用于得到治疗载体或者将表达盒或者其部分从一个载体转移到另一个载体。中间载体的实例包括腺病毒基因组质粒和穿梭载体。
在中间载体中有用的元件包括复制起点、选择标记、同源重组区，和方便的限制酶位点。方便的限制酶位点可以用于促进核酸序列的克隆或释放。
同源重组区提供了与另一核酸分子中的靶区域同源的核酸序列区。同源区在插入靶区域的核酸序列的侧翼。在不同实施方案中，同源区长为约150到600个核苷酸，或者长为约100到500个核苷酸。
本发明的一个实施方案描述了穿梭载体，其含有HCV多肽表达盒、选择标记、细菌复制起点、第一个腺病毒同源区和第二个腺病毒同源区，这些同源区靶定表达盒以插入或者替代E1区。第一个和第二个同源区在表达盒侧翼。第一个同源区含有与野生型腺病毒区的至少右端(3’端)的约碱基对4-450基本上同源的至少约100个碱基对。第二个同源区含有与Ad5的至少左端(5’端)的约碱基对3511-5792或者另一种腺病毒的对应区域基本上同源的至少约100个碱基对。
“基本上同源的”表示具有足够程度的同源性以与靶区域特异重组。在不同实施方案中，基本上同源的指至少85％、至少95％，或者100％序列同一性。
一种产生腺病毒载体的方法是通过产生含有表达盒的前腺病毒基因组质粒。前腺病毒质粒含有在所希望的补充细胞系中复制所需的所有腺病毒序列。然后用限制酶消化前腺病毒质粒以释放病毒的ITR’s并转染到补充细胞系用于病毒拯救。ITR’s必须从质粒序列释放以允许发生复制。腺病毒载体拯救导致产生含有所述表达盒的腺病毒载体。(见，例如，Emini et al.，国际公布号WO 03/031588.)
VI.A.腺病毒基因组质粒
腺病毒基因组质粒含有较长长度质粒(其可以是粘粒)内的腺病毒载体序列。较长长度质粒可以含有额外的元件，如促进在真核或者细菌细胞中生长和选择的那些元件，这取决于用于产生和保持质粒的方法。腺病毒基因组质粒优选具有插入E1或者E3缺失区的基因表达盒。
产生腺病毒基因组质粒的技术包括涉及使用穿梭载体和同源重组的那些技术，和涉及向腺病毒粘粒中插入基因表达盒的那些技术。(Hittet al.，Methods in Molecular Genetics 7：13-30，1995，Danthinne et al.，GeneTherapy 7：1707-1714，2000.)
本发明的一个实施方案描述了制备腺病毒的方法，其涉及用于产生腺病毒基因组质粒的同源重组步骤和腺病毒拯救步骤。同源重组步骤涉及使用含有侧翼为同源区的HCV多肽表达盒的穿梭载体。腺病毒同源重组区将表达盒靶定E1或者E3缺失的区域。
VI.B.腺病毒载体拯救
使用本领域中公知或者本文描述的技术，可以从重组的腺病毒基因组质粒拯救腺病毒载体。本领域中公知的用于腺病毒拯救的技术实例由Hitt et al.，Methods in Molecular Genetics 7：13-30，1995，和Danthinne etal.，Gene Therapy 7：1707-1714，2000提供。
拯救腺病毒载体的方法的实例涉及加强腺病毒复制。例如，通过在单独的质粒上提供腺病毒功能如E2蛋白(聚合酶，末端前蛋白和DNA结合蛋白)以及E4 orf6，可以进行加强腺病毒复制。(Emini et al.，国际公布号WO 03/031588.)
VII.HCV组合治疗
HCV核酸疫苗可以单独使用以治疗患者，可以与其他HCV治疗剂结合使用，并且可以与靶定其他类型疾病的治疗剂一起使用。额外的治疗剂包括治疗HCV和在HCV感染的人中具有高流行率的疾病的治疗剂。靶定其他类型疾病的治疗剂包括针对HIV和HBV的疫苗。
用于治疗HCV的额外的治疗剂包括疫苗和非疫苗治疗剂。(Zein，Expert Opin.Investig.Drugs10：1457-1469，2001.)额外的HCV疫苗的实例包括设计用来引起针对HCV核心、E1、E2或p7区的免疫应答的疫苗。疫苗组分的实例包括天然存在的HCV多肽、HCV模拟表位多肽或者编码此类多肽的核酸。
描述产生一般的模拟表位和描述不同的HCV模拟表位的参考文献在Felici et al.美国专利号5,994,083和Nicosia et al.，国际申请号WO99/60132中提供。HCV模拟表位可以与天然存在的HCV抗原融合。
当前批准的抗HCV剂是α干扰素和α干扰素与病毒唑组合。不同形式的α干扰素，如重组干扰素和聚乙二醇化的干扰素可以用于治疗HCV感染。(De Francesco et al.，Antiviral Research58：1-16，2003，Walkeret al.，Antiviral Chemistry&Chemotherapy 14：1-21，2003.)
多种不同的抗HCV剂处于不同阶段的临床开发中。正被开发的不同的抗HCV剂包括针对不同的HCV靶标的治疗剂。不同的HCV靶标的实例包括HCV聚合酶和HCV NS3-NS4A蛋白酶。(De Francesco et al.，Antiviral Research 58：1-16，2003，Walker et al.，Antiviral Chemistry&Chemotherapy 14：1-21，2003.)
VIII.药物施用
使用本文提供的教导以及本领域公知的技术，可以配制并对患者施用HCV疫苗。关于药物施用的一般教导在例如Modern Vaccinology，Ed.Kurstak，Plenum Med.Co.1994；Remington′s Pharmaceutical Sciences 18thEdition，Ed.Gennaro，Mack Publishing，1990；和Modern Pharmaceutics2nd Edition，Eds.Banker and Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990中提供，将它们都引入本文作为参考。
可以通过不同的途径施用HCV疫苗，如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、皮内、通过皮肤压迹，或者经鼻。优选的途径是肌内。
用不同的技术，如通过用或不用一次或多次电脉冲注射，可以进行肌内施用。电介导的转移可以通过刺激体液和细胞免疫应答帮助遗传免疫。
使用不同的技术，如用针头或者无针头的注射系统，可以进行疫苗注射。无针头注射系统的实例是喷射注射装置。(Donnelly et al.，国际公布号WO 99/52463.)
通过核酸注射后递送合适的电脉冲，可以进行电介导的转移或者基因电转移(GET)。(见Mathiesen，国际公布号WO 98/43702 and Eminiet al.国际公布号WO 03/031588.)
VIII.A.药物载体
可药用载体方便疫苗的保存和向受试者的施用。可药用载体的实例在本文描述。额外的可药用载体是本领域公知的。
可药用载体可以含有不同的组分，如缓冲剂、生理盐水或者磷酸缓冲盐水、蔗糖、盐或者聚山梨酸酯。可药用载体的实例是：2.5-10mM TRIS缓冲剂；25-100mM NaCl；2.5-10％蔗糖；0.01-2mM MgCl2；和0.001％-0.01％吐温80(植物来源的)。载体的特定实例含有5mM TRIS，75mM NaCl，5％蔗糖，1mM MgCl2，0.005％吐温80，pH8.0。
VIII.B.给药方案
考虑具体疫苗和诸如患者的年龄、体重、性别和医学状况；施用途径；所希望的效果和给药次数的因素，可以确定合适的给药方案。特定疫苗的功效取决于不同因素，如特定疫苗产生多肽的能力，所述多肽在细胞中被表达和加工并且在MHC I和I类复合体背景下被呈递。
施用于患者的HCV多肽编码核酸可以是不同类型的载体如腺病毒载体和DNA质粒疫苗的部分。在涉及施用DNA质粒的不同实施方案中，对患者施用约0.1到10mg质粒，和对患者施用约1到5mg质粒。在涉及施用病毒载体、优选腺病毒载体的不同实施方案中，对患者施用约105到1011个病毒颗粒，和对患者施用约107到1010个病毒颗粒。
病毒载体疫苗和DNA质粒疫苗可以单独施用，或者可以是激发和加强施用方案的部分。混合方式的激发和加强接种涉及用DNA疫苗激发和用病毒载体疫苗加强，或者用病毒载体疫苗激发并用DNA载体加强。
可以使用多次激发，例如约2-4次或更多次。激发和加强之间的时间长度可以通常从约4个月到1年变动，但是可以使用其他时间范围。在人具有现有的抗腺病毒免疫应答的情况下，优选使用用DNA疫苗激发的方案。
在本发明的一个实施方案中，用DNA疫苗进行直接初次接种到肌肉组织中。初次接种后，用腺病毒载体或者DNA疫苗进行加强。
物质如白介素-12、GM-CSF、B7-1、B7-2、IP10和Mig-1可以共同施用以加强免疫应答。所述物质可以作为蛋白质或者通过使用核酸载体共同施用。
VIII.C.异源激发-加强
异源激发-加强是混合的方式，其涉及使用一种类型的病毒载体进行激发和另一种类型的病毒载体用于加强。异源激发-加强可以涉及相关的载体，如基于不同腺病毒血清型的载体和关系更远的病毒，如来自不同动和痘病毒的腺病毒。使用痘病毒和腺病毒载体保护小鼠免受疟疾由Gilbert et al.，Vaccine 20：1039-1045，2002说明。表达HCV多肽的黑猩猩腺病毒载体提供了可以用于异源激发加强的载体。
激发和加强之间的时间长度通常从约四个月到一年变动，但是可以使用其他时间过程。最小的时间过程应该足够允许免疫静止。在一个实施方案中，该静止为至少6个月。激发可以涉及用一种类型的载体多次激发，如2-4次激发。
痘病毒载体中存在的表达盒应该含有目的痘病毒或者另一痘病毒成员天然的或者衍生的启动子。用于构建和使用不同类型的基于痘病毒的载体是本领域中公知的，所述载体包括基于痘苗病毒、经修饰的痘苗病毒、鸟痘病毒、浣熊痘病毒、修饰的痘苗病毒Ankara、金丝雀痘病毒(如ALVAC)、禽痘病毒、牛痘病毒和NYVAC的载体。(Moss，CurrentTopics in Microbiology and Immunology158：25-38，1982；Earl et al.，InCurrent Protocols in Molecular Biology，Ausubel et al.eds.，New York：Greene Publishing Associates&Wiley Interscience；1991：16.16.1-16.16.7；Child et al.，Virology 174(2)：625-9，1990；Tartaglia et al.，Virology188：217-232，1992；U.S.Patent Nos.，4,603,112，4,722,848，4,769,330，5,110,587，5,174,993，5,185,146，5,266,313，5,505,941，5,863,542，和5,942,235.)
VIII.D.佐剂
可以用佐剂配制HCV疫苗。佐剂是帮助免疫原产生免疫应答的物质。佐剂可以通过不同的机理发挥功能，如增加生物或者免疫半寿期、提供免疫调节剂，或者诱导产生免疫调节细胞因子。不同的佐剂可以组合使用。
可以用佐剂配制HCV疫苗。佐剂的实例是明矾、AlPO4、铝胶(alhydrogel)、脂类-A和其衍生物或者变体。弗氏不完全佐剂、中性脂质体、含有疫苗和细胞因子的脂质体、非离子嵌段共聚物、趋化因子和免疫调节剂。
含有聚氧乙烯(POE)和聚氧丙烯(POP)的非离子嵌段聚合物，如POE-POP-POE嵌段共聚物可以用作佐剂。(Newman et al.，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15：89-142，1998.)使用非离子嵌段共聚物组合阴离子表面活性剂，可以增强核酸的免疫应答。
不同类型的化合物可以用作免疫调节剂，如细胞因子、激素、脂类衍生物和小分子。免疫调节剂的实例包括抗-CTLA-4、抗-CD137、抗-CD40、抗-CD28、抗-CD4、抗CD25、抗PD1、抗-PD-L1、抗-PD-L2、FOXP3-阻断剂、Flt-3配体、咪喹莫特、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、沙格司亭、Toll样受体(TLR)-7激动剂，和TLR-9激动剂。
佐剂制剂的特定实例是含有CRL-1005(CytRx ResearchLaboratories)、DNA和苯扎氯铵(BAK)的佐剂制剂。可以如Emini et al.，国际公布号WO 03/031588中所述制备CRL-1005制剂。
VIIIE.疫苗保存
使用不同类型的缓冲剂可以保存疫苗。例如，可以使用如Emini etal.，国际公布号WO 03/031588中描述的缓冲剂A105。
通过除去或者螯合微量金属离子可以增强DNA的保存。诸如琥珀酸或者苹果酸的试剂和螯合剂可以用于增强DNA疫苗稳定性。非还原性自由基清除剂，如乙醇或者甘油的引入也可以用于防止DNA质粒受到自由基产生的破坏。此外，可以控制制剂中的缓冲剂类型、pH、盐浓度、曝光量、以及用于准备小瓶的消毒过程的类型，以优化DNA疫苗的稳定性。
IX.实施例
在下文提供实施例用于进一步阐明本发明的不同特征。这些实施例还阐明用于实施本发明的方法。这些实施例不限制要求保护的发明。
实施例1：ChAd63和ChAd3基因组序列的注解
用ChAd63和ChAd3对用“人腺病毒C”组(HAdV-C；分类学编号：129951)的所有蛋白质序列建立的本地数据库进行blast程序。通过检索特定的分类学编号，从NCBI服务器下载蛋白质序列。使用blastx程序进行blast检索。在比对中显示的序列数目设置为1000并且关闭滤器。然后用MSPcrunch分析Blast结果，MSPcrunch是用于大规模序列相似性分析的BLAST增强工具。
通过查看ATG和STOP密码子的位置和必要时查看剪接位点的位置，手工验证两个基因组序列上的每个所得CDS注解。用blastp将所有产物对以前建立的腺病毒蛋白质数据库检索以验证通过同源性对此类产物的预测。根据MSPcrunch结果和手工修正用VNTI注解ChAd63和ChAd3的普通的基因组序列。在表1和2中提供了ChAd3和ChAd63的基因产物。
表1ChAd3基因产物
CDS 产物  CDS边界(NCBI形式) 链
CDS1  E1A25.5K  589..991，1243..1544 正向的
CDS2  E1A30.8K  589..1129，1243..1544 正向的
CDS3  E1B22K  1716..2279 正向的
CDS4  E1B57K  2021..3544 正向的
CDS5  IX  3640..4104 正向的
CDS6  IVa2  4163..5499，5778..5790 互补的
CDS7  Pol  5269..8865，14228..14236 互补的
CDS8  pTP  8664..10667，14228..14236 互补的
CDS9  48K产物  11120..12379 正向的
CDS10  pIIIa  12403..14181 正向的
CDS11  III  14273..16054 正向的
CDS12  pVII  16069..16665 正向的
CDS13  V  16738..17853 正向的
CDS14  pX  17878..18123 正向的
CDS15  pVI  18219..18974 正向的
CDS16  外显子  19086..21968 正向的
表1ChAd3基因产物
CDS  产物  CDS边界(NCBI形式) 链
CDS17  蛋白酶  21998..22627 正向的
CDS18  DBP  22743..24395 互补的
CDS19  92K产物  24445..26940 正向的
CDS20  22K产物  26630..27229 正向的
CDS21  33K产物  26630..26966，27169..27551 正向的
CDS22  pVIII  27626..28309 正向的
CDS23  E312K  28310..28627 正向的
CDS24  E3CR1-α0  29125..29325 正向的
CDS25  E3gp18K  29328..29819 正向的
CDS26  E333K  29848..30738 正向的
CDS27  E3A11K  31293..31589 正向的
CDS28  E3RIDα  31601..31873 正向的
CDS29  E3RIDβ  31876..32274 正向的
CDS30  E315K  32267..32653 正向的
CDS31  U外显子  32684..32848 互补的
CDS32  尾丝  32859..34490 正向的
CDS33  E4ORF6/7  34698..34973，35685..35858 互补的
CDS34  E4ORF6  34974..35858 互补的
CDS35  E4ORF4  35758..36123 互补的
CDS36  E4ORF3  36139..36486 互补的
CDS37  E4ORF2  36483..36875 互补的
CDS38  E4ORF1  36928..37314 互补的
表2ChAd63基因产物
CDS  产物  CDS边界(GenBank形式) 链
CDS1  E1A24.6K  576..1050，1229..1437 正向的
CDS2  E1A28.3K  576..1143，1229..1437 正向的
CDS3  E1B22.6K  1601..2179 正向的
CDS4  E1B9.9K  1906..2186，3322..3340 正向的
CDS5  E1B18.4K  1906..2216，3204..3420 正向的
CDS6  E1B55.7K  1906..3420 正向的
CDS7  IX  3505..3933 正向的
CDS8  IVa2  3993..5326，5605..5617 互补的
CDS9  Pol  5096..8455 互补的
CDS10  21.1K产物  7877..8461 正向的
CDS11  pTP72.5K  8458..10347 互补的
CDS12  44.3K产物  10845..12020 正向的
CDS13  65.5K产物  12044..13810 正向的
CDS14  pIII  13889..15511 正向的
CDS15  pVII  15515..16099 正向的
CDS16  pV  16144..17181 正向的
CDS17  8.5K产物  17204..17437 正向的
CDS18  pVI  17509..18237 正向的
CDS19  外显子  18329..21154 正向的
CDS20  23.6K产物  21179..21802 正向的
CDS21  E2A  21882..23417 互补的
CDS22  88.5K产物  23443..25842 正向的
CDS23  24.9K产物  25556..25886，26056..26399 正向的
CDS24  pVIII  26471..27154 正向的
CDS25  E312.1K  27155..27475 正向的
CDS26  E323K  27429..27503，27692..28055 正向的
CDS27  E319.6K  28037..28570 正向的
表2ChAd63基因产物
CDS 产物  CDS边界(GenBank形式) 链
CDS28  E322.3K  29332..29946 正向的
CDS29  E332.5K  29961..30857 正向的
CDS30  E326.7K  28600..29319 正向的
CDS31  E310.5K  30865..31140 正向的
CDS32  E316.4K  31146..31577 正向的
CDS33  E315.2K  31570..31977 正向的
CDS34  Fiber  32254..33531 正向的
CDS35  E415.7K  33638..33889，34621..34791 互补的
CDS36  E434.9K  33886..34791 互补的
CDS37  E413.9K  34697..35062 互补的
CDS38  E413.6K  35072..35425 互补的
CDS39  E414.6K  35422..35811 互补的
CDS40  E413.8K  35851..36225 互补的
实施例2：ChAd3载体构建
ChAd3ΔE1，E3，E4，E4Ad5orf6载体的构建包括下面的步骤：
I.C亚组穿梭载体的构建
将ChAd3病毒基因组完全测序(SEQ ID NO：14)并将信息用于构建穿梭载体以促进通过整个基因组的同源重组克隆。简言之，用于克隆C亚组黑猩猩腺病毒3的穿梭载体(在本文中称作pChAd3EGFP)如下构建：将含有pIX编码区的ChAd3 DNA片段(nt3542-4105)通过PCR用引物SEQ ID NOs：20和21扩增，用SgfI-AscI消化，然后克隆到pARSCV32-3中并用SgfI-AscI消化，产生pARS-ChAd3D。将ChAd3右端(nt37320-37441)通过PCR用引物SEQ ID NOs：22和23扩增，用XbaI和Bam HI消化，然后连接到用XbaI和BamHI限制性酶切的pARS-ChAd3D中，产生pARS-ChAd3RD。将ChAd3病毒DNA左端(nt1-460)通过PCR用SEQ ID NOs：24和25的引物扩增，用EcoRI和SgfI消化，然后将克隆的pARS-ChAd3RD用EcoRI和SgfI消化，产生pARS-ChAd3RLD。还将病毒DNA盒设计成含有位于两个ITR’s末端的限制酶位点(PmeI)，从而该消化将从质粒DNA释放病毒DNA。
II.ΔE1ChAd3载体的构建
通过在大肠杆菌菌株BJ5183中同源重组构建ChAd3载体。用ChAd3纯化的病毒DNA和用BstEII和Bst1107I消化的pChAd3EGFP穿梭载体共转化BJ5183细胞。存在于线性化的pChAd3EGFP和病毒基因组DNA末端中的pIX基因、右ITR DNA序列之间的同源重组允许它插入到质粒载体中，同时缺失E1区，其被EGFP表达盒替代。如Emini etal.，国际公布号WO 03/031588中所述，构建基于人巨细胞病毒(HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(Bgh polyA)的HCV NS区表达盒并将其在大肠杆菌菌株BJ5183中利用HCMV和Bgh多聚A DNA序列之间的同源性，通过同源重组插入到ChAd3ΔE1EGFP载体中。
III.E3区缺失
为了诱导ChAd3载体骨架中完整E3区的缺失，通过PCR扩增E3基因侧翼的两个DNA区域，得到两种DNA片段。486bp片段跨越nt28159到nt28644(pVIII基因的3’，E3区上游)和474bpDNA片段，其含有尾丝基因的3’末端(bp32633到bp33106，E3区下游)。将EcoRI限制性位点引入第一种DNA片段的3’末端和第二种片段的5’末端。用EcoRI消化两种PCR片段并通过体外连接结合。然后用pVIII正向寡核苷酸和尾丝反向寡核苷酸进一步扩增所得的DNA片段(988bp)。
将含有连接在一起的E3区的3’和5’DNA侧翼区的988bp DNA片段与用HpaI线性化的pChAd3ΔE1/EGFP(在ChAd3野生型中E3区内32384bp处切割)通过共转化BJ5183细胞而进行重组，从而引入E3缺失。最终的重组产物是pChAd3ΔE1，E3/EGFP前腺病毒质粒。
IV.缺失E4区和插入Ad5 E4orf6
为了用Ad5 E4orf6替代ChAd3 E4区，将Ad5 E4orf6导入穿梭质粒中，该质粒含有来自ChAd3基因组的右端的最后393bp(bp37349到bp37741)。随后，将来自尾丝3’末端并且包括E4多聚A的144bp的DNA片段(从ChAd3map的bp34491到bp34634)导入下游Ad5E4orf6，产生质粒pARSChAd3Ad5E4orf6-2。
最后，将来自pARSChAd3Ad5E4orf6-2的在边界含有尾丝3’末端/E4多聚A和ChAd3右端的DNA片段通过共转化大肠杆菌菌株BJ5183而通过同源重组导入用PacI限制酶(PacI位点，ChAd3 wt的nt36924)线性化的pChAd3ΔE1，E3/EGFP中，从而产生pChAd3ΔE1，3，4 Ad5orf6EGFP。
按照该策略，将整个ChAd3 E4编码区缺失并用推定的E4 TATA信号下游62bp的克隆的Ad5E4orf6基因替代，该基因处于ChAd3 E4启动子控制下。
实施例3：ChAd63载体构建
如下构建类似于ChAd3ΔE1，E3，E4，E4Ad5orf6载体的ChAd63载体。
I.E亚组穿梭载体的构建
将ChAd63病毒基因组完全测序并将信息用于构建穿梭载体以方便通过完整基因组的同源重组来克隆。简言之，如下述构建用于克隆E亚组黑猩猩腺病毒63的穿梭载体(下文中称作pARSChAd63_EGFP)。
将ChAd63右端(nt 36216-36643)用SEQ ID NOs：26和27的引物通过PCR扩增，用XbaI和BamHI消化然后连接到用XbaI和BamHI限制性酶切的pARSChAd3-RLD中，产生pARS-ChAd63R。将含有pIX编码区的ChAd63 DNA片段(nt3422-3814)用SEQ ID NOs：28和29的引物通过PCR扩增，用SgfI-AscI消化，然后克隆到用SgfI-AscI消化的pARS-ChAd63R中，产生pARS-ChAd63RD。将ChAd63病毒DNA左端(nt1-455)用SEQ ID NOs：30和31的引物通过PCR扩增，用EcoRI和EcoRV消化，然后克隆到用EcoRI和EcoRV消化的pARS-ChAd63RD中，从而产生pARS-ChAd63RLD。使用SEQ ID NOs：32和33的引物通过PCR扩增HCMV-EGFP-bgh多聚A盒，用EcoRV消化，然后克隆到用EcoRV消化的pARS-ChAd63RLD中，产生pARS-ChAd63RLD-EGFP。还将病毒DNA盒设计成含有位于两个ITR的末端的限制酶位点(PmeI)，使得该消化将从质粒DNA释放病毒DNA。
II.构建ΔE1 ChAd63载体
通过在大肠杆菌菌株BJ5183中通过同源重组构建ChAd63载体。用ChAd63纯化的病毒DNA和用AscI消化的pARS-ChAd63RLD-EGFP共转化BJ5183细胞。存在于线性化的pARS-ChAd63RLD-EGFP和病毒基因组DNA末端的pIX基因、右ITR DNA序列之间的同源重组允许它插入在质粒载体中，同时缺失E1区，其被EGFP表达盒替代。
III.E3区缺失和ChAd63NSmut载体构建
为了缺失ChAd63载体骨架中的完整E3区，通过PCR扩增E3基因侧翼的两个DNA区，得到两种DNA片段。567bp片段跨越nt26665到nt27207(pVIII基因的3’，E3区上游)，563bp DNA片段含有尾丝基因的3’末端(bp31788到bp32326，E3区下游)。将PacI限制性位点导入第一种DNA片段的3’末端和第二种片段的5’末端。用PacI消化两种PCR片段并通过体外连接结合。所得的DNA片段(1112bp)用pVIII正向和尾丝反向寡核苷酸进一步扩增。
含有连接在一起的E3区侧翼的3’和5’DNA的1112bp DNA片段与用HpaI线性化的pChAd63ΔE1/EGFP(在ChAd63野生型中E3区内的30168bp处切割)通过共转化BJ5183细胞而进行重组，从而引入E3缺失。最终的重组产物是pChAd63ΔE1，E3/EGFP前腺病毒质粒。
如Emini et al.，国际公布号WO 03/031588中所述，构建基于人巨细胞病毒(HCMV)启动子和牛生长激素多聚腺苷酸化信号(Bgh多聚A)的HCV NS表达盒，并通过在大肠杆菌菌株BJ5183中利用HCMV和Bgh多聚A DNA序列之间的同源性，通过同源重组插入到pChAd63ΔE1，E3/EGFP载体中，从而产生ChAd63NSmut。
IV.缺失E4区和插入Ad5E4orf6
为了用Ad5 E4orf6替代ChAd63 E4区，将Ad5 E4orf6导入pARS-ChAd63RLD-EGFP中来源于ChAd63基因组右端的428bp(bp36216到bp36643)的下游。随后，将来自尾丝3’末端并且包括E4多聚A的200bpDNA片段(从ChAd63图的bp33624到bp33823)导入下游Ad5E4orf6中，产生质粒pARSChAd63Ad5E4orf6-2。最后，将来自pARSChAd63Ad5E4orf6-2的、在边界含有尾丝3’末端/E4多聚A和ChAd63左端的DNA片段通过共转化大肠杆菌菌株BJ5183，通过同源重组导入用PmeI限制酶消化(从质粒DNA释放病毒DNA)的pChAd63ΔE1，E3/EGFP中，从而产生pChAd63ΔE1，3，4 Ad5orf6 EGFP。
按照该策略，缺失了整个ChAd63 E4编码区并用推定的E4 TATA信号下游131bp的克隆的Ad5E4orf6基因替代，该基因处于ChAd63 E4启动子控制下。
实施例4：ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)表达
使用Catalucci et al.，Journal of Virology79：6400-6409，2005中描述的技术对ChAd3NSmut测试HCV蛋白质表达。用ChAd3NSmut和MRKAd6NSmut感染HeLa细胞。Emini et al.，国际公布号WO 03/031588描述了MRKAd6NSmut。通过抗-NS5A单克隆抗体用免疫印迹分析细胞提取物。如图8中所示，ChAd3 NSmut类似于基于人Ad6的载体(MRKAd6NSmut)表达HCV蛋白质。
实施例5：ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)稳定性
使用Catalucci et al.，Journal of Virology 79：6400-6409，2000描述的技术检查ChAd3NSmut的遗传稳定性。对从5个独立的克隆(在第10代)克隆提取的病毒DNA进行限制酶分析。引入Pre ChAd3 NSmut质粒作为阳性对照。ChAd3NSmut在PerC.6细胞中的传代是遗传上稳定的。
实施例6：小鼠中ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)和ChAd63NSmut (SEQ ID NO：17)诱导的CMI
用Emini et al.，国际公布号WO 03/031588中描述的技术在C57/B6小鼠中测定ChAd3NSmut和ChAd63NSmut诱导细胞介导的免疫的能力。图9提供了ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)、ChAd63NSmut(SEQ IDNO：17)和MRKAd6NSmut在C57/B6小鼠中诱导细胞介导的免疫的能力的比较。图9显示了注射后3周进行的IFN-γ ELIspot实验(用H2Kb限制的肽，在NS3蛋白酶中作图)  (数据以平均值显示；N＝5)。通过ChAd3NSmut以108和109的剂量在小鼠中引起了CMI，并且ChAd63NSmut与MRKAd6NSmut相当。
实施例7：猕猴中ChAd3NSmut和ChAd63NSmut诱导的CMI
使用Emini et al.，国际公布号WO 03/031588和Cirillo et al.国际公布号WO 2005/071093中描述的技术，通过免疫猕猴，在非人灵长类动物中证实了ChAd3NSmut(SEQ ID NO：13)和ChAd63NSmut(SEQ IDNO：17)诱导CMI的能力。在用异源激发/加强方案免疫的一组三只猴中评估载体，所述方案基于顺序注射三种不同的非交叉反应性载体。这三只动物通过在第0和4周用1010vp/猴的剂量两次注射ChAd3NSmut进行激发，接着在第22周注射MRKAd6NSmut和在第42周注射ChAd63NSmut。通过IFN-γ ELISPOT测量的免疫应答的时间过程在图11中报告，表示为在任何给定时间点对不同的HCV NS肽库观察到的应答的总和。结果表明通过ChAd3NS注射在所有动物中得到了有效的激发并且通过MRKAd6NSmut和ChAd63NSmut施用可以强烈加强CMI。
实施例8：构建编码嵌合HCV多肽(SEQ ID NO：1)的质粒DNA
通过在BJ5183大肠杆菌菌株中同源重组得到了在本文中称作pV1JnsNSOPTmut 3a-1b的质粒，该质粒编码含有基于HCV 3a的NS3-4A区和基于HCV 1b的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区的嵌合HCV多肽(图12和13)。
合成产生了质粒，其编码来自HCV 3a的完全密码子优化的NS3-4a，其具有最佳的翻译起始(Kozak)序列和与成熟NS3序列的第一个氨基酸融合的甲硫氨酸起始密码子。NS3-4a编码序列侧翼是两个重组区，用于插入在pV1JnsNSOPTmut接受质粒中(Emini et al.，国际公布号WO03/031588)，该接受质粒与内含子A序列和NS3(HCV 1b)编码序列的开始处同源。在新的NS3-4a序列的两端引入HindIII限制酶位点用于插入片段从亲本质粒的切除。
通过HpaI独特位点消化使pV1JnsOPTmut质粒线性化。将线性化的pV1JnsOPTmut质粒和HindIII消化的NS3-4a(3a)插入片段共转染在BJ5183细菌菌株中，产生pV1JnsNSOPTmut 3a-1b。图13中显示的所得pV1JnsNSOPTmut 3a-1b的遗传结构通过限制酶和DNA序列分析证实。
实施例9：编码嵌合HCV多肽的质粒DNA在小鼠中诱导CMI
在小鼠中测试编码嵌合HCV多肽的质粒DNA诱导对不同的HCV基因型的细胞介导的免疫的能力。该嵌合多肽(SEQ ID NO：1)含有基于HCV 3a的NS3-4A区和基于HCV 1b的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区(pV1Jns-NSOPTmut 3a-1b)。
用50μgDNA肌内注射三种不同品系的小鼠(两种近交系：Balb/c，C57B1/6和一种远交系：CD1)接着进行电脉冲。每只动物接受两剂嵌合质粒(pV1Jns-NSOPTmut 3a-1b)或者pV1Jns-NSOPTmut质粒(Emini et al.，国际公布号WO 03/031588)，其编码基于HCV 1b的NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B区。使用Emini et al.，国际公布号WO 03/031588中描述的技术测量对来自HCV 1b和3a的病毒蛋白质特异的CMI。图14显示了在CD1小鼠(远交品系)中，反应于来自HCV 1b和3a的NS3蛋白质而分泌IFN-γ的T细胞的数目(表示为每1百万个脾细胞中形成斑点的细胞)。用两种质粒得到了类似的对1bNS3蛋白质的特异T细胞应答，而嵌合构建体诱导了对3a NS3蛋白质的更高的应答(通过斯氏T检验，p＝O.04)。使用两种构建体，在两种近交系小鼠(Balb/c和C57B1/6)中反应于来自HCV 1b和3a的NS3蛋白质而诱导的CMI是相似的。
其他实施方案在下面的权利要求中。尽管已经显示和描述了一些实施方案，但是可以做出多种修改而不背离本发明的精神和范围。
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Claims (9)

1.重组腺病毒载体，其包含：
a)编码HCV多肽的表达盒，其中所述HCV多肽包含HCVNS3-NS4A-NS4B-NS5A；和
b)含有E1缺失、E3缺失和任选的E4缺失的腺病毒基因组，条件是所述基因组编码下面的至少一种：
i)具有SEQ ID NO：3或9的氨基酸序列的尾丝区；
ii)具有SEQ ID NO：5或11的氨基酸序列的六邻体区；和
iii)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的五邻体区，
其中所述表达盒位于E1或E3缺失，其中所述腺病毒载体不受抗人腺病毒的免疫应答的影响。
2.权利要求1的载体，其中
所述HCV多肽包含HCV NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B并且在体内产生足够的活性以自身加工而产生NS5B蛋白质，并且所述NS5B蛋白质是酶学上无活性的；和
所述腺病毒基因组含有E4缺失和SEQ ID NO：13的核苷酸34601-35482的Ad5 E4orf6序列的插入。
3.权利要求2的载体，其中所述载体由SEQ ID NO：13或17的核酸序列组成。
4.包含权利要求2的重组腺病毒基因组的重组腺病毒颗粒，其中所述颗粒由所述重组腺病毒基因组编码。
5.包含权利要求3的重组腺病毒基因组的重组腺病毒颗粒，其中所述颗粒由所述重组腺病毒基因组编码。
6.制备重组腺病毒颗粒的方法，其包括步骤：
a)使用E1补充细胞表达权利要求2的重组腺病毒基因组产生所述颗粒；和
b)纯化所述颗粒。
7.制备重组腺病毒颗粒的方法，其包括步骤：
a)使用E1补充细胞表达权利要求3的重组腺病毒基因组产生所述颗粒；和
b)纯化所述颗粒。
8.药物制剂，其包含治疗有效量的权利要求1-3任一项的重组腺病 毒载体和可药用载体。
9.治疗有效量的权利要求1-3任一项的重组腺病毒载体在制备用于治疗患者的药物中的用途。 
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