CN101472606A

CN101472606A - 用于治疗黄病毒感染的方法、分子及用途

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Publication number: CN101472606A
Application number: CNA2007800224852A
Authority: CN
Inventors: V·韦尔塔加林多; G·奇内亚圣地亚哥; N·弗莱塔斯萨拉萨尔; A·M·马丁邓恩; M·萨里亚努涅斯; O·吉罗拉克鲁斯; P·G·托莱多马约拉; A·桑切斯普恩特; V·A·贝萨达佩雷斯; O·雷伊斯阿考斯塔; H·E·加雷佩雷斯; A·卡夫拉莱斯里科; A·姆萨池奥拉萨; G·R·帕德龙帕洛马雷斯; L·J·冈萨雷斯洛佩斯
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2007-04-26
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2027-04-26
Also published as: WO2007124698A2; RU2008146997A; MY150685A; US20110212105A1; EP2022506B1; CA2650591A1; WO2007124698A3; CA2650591C; CN101472606B; US8420311B2; AU2007246076A1; AU2007246076B2; EP2022506A2; AR060827A1; ES2645679T3; CU23632A1

Abstract

本发明涉及用于阻断细胞的登革病毒感染的方法，所述方法包括干扰病毒包膜蛋白与细胞受体的直接或借助于载体蛋白的相互作用，以及涉及相关用途，其中所述细胞受体是α2－巨球蛋白受体，其也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白或CD91，并且所述载体蛋白是人α2－巨球蛋白。

Description

用于治疗黄病毒感染的方法、分子及用途

发明领域

本发明涉及病毒学、生物技术和制药工业领域。具体地，本发明涉及用于调节或阻断登革病毒(DV)感染的方法，其基于阻断该病毒与其细胞受体的相互作用。登革病毒(DV)使用α2-巨球蛋白受体(A2MR)来用于其进入哺乳动物细胞内，并且它可以使用α2-巨球蛋白(A2M)作为用于促进其与这种受体的相互作用的载体蛋白。本发明确定了与人A2M的直接相互作用的存在，并且定义了参与这种相互作用的该病毒的E蛋白的区域。此外，本发明定义了衍生自E蛋白的肽，其干扰该病毒与其细胞受体A2MR的相互作用，并且抑制哺乳动物细胞被该病毒的感染。因此，这些分子构成了用于预防和治疗由DV感染引起的疾病的潜在药理学试剂。

现有技术

E1登革病毒(DV)属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus，FV)。存在遗传上相关但被识别为不同血清型的4类DV(DV1、DV2、DV3和DV4)(Henchal E.A.和Putnak J.R.1990 Thedengue viruses.Clin.Microbiol.Rev.3：376-396)。4种血清型之间的全基因组序列同源性的程度为约70％。由一种病毒血清型毒株引起的首次感染赋予针对由属于同种血清型的毒株引起的后继感染的长效免疫，但不针对属于其余血清型的毒株。由异种血清型引起的继发感染是常见的，并且与该疾病的严重得多的症状的出现相关(Halstead，S.B.Neutralization and antibody-dependentenhancement of dengue viruses.(2003)Adv.Virus Res.60：421-67.，421-467.Hammon WMc.(1960)Newhaemorragic fever inchildren in the Philippines and Thailand.Trans AssocPhysicians；73：140-155)。因此，当开发针对DV的疫苗时，必须保证它提供针对所有4种血清型的保护。然而，由于甚至在相同血清型的毒株之间所发现的抗原变异的程度，有时由一种毒株感染引起的抗体针对相同血清型的第二种毒株的感染也可能不具有保护性，因此使有效、安全且低成本的疫苗的开发变成主要挑战。因此，具有抗病毒活性的分子的使用代表了对于疫苗接种的有吸引力的治疗备选方案。

DV病毒粒子的复制循环从其进入宿主细胞开始。在哺乳动物宿主中，病毒粒子使用受体介导的胞吞作用机制进入细胞(HaseT.，Summers.PL.和EckelsK.H.(1989)Flavivirus entry into culturedmosquito cells and human peripheral blood monocytes.Arch Virol.104：129-143)。在内体中产生的pH下降触发了病毒粒子上不可逆的构象变化，这诱导其与内体膜的融合及其解装配(Mukhopadhyay S.，Kuhn R.J.和Rossmann M.G.(2005)A structural perspective of theflavivirus life cycle.Nat Rev Microbiol.3：13-22)。

如此释放到细胞质中的病毒基因组被翻译成单个多蛋白，其由病毒和细胞的蛋白酶进行伴翻译和翻译后加工。新病毒粒子的装配在内质网的表面上发生，其中结构蛋白和基因组RNA分子进入腔内并继续通过高尔基复合体。病毒粒子以在细胞内囊泡中的成熟病毒颗粒形式离开高尔基复合体，所述细胞内囊泡的内容物通过胞吐作用而释放到细胞外环境中(Mukhopadhyay S.，Kuhn R.J.和Rossmann M.G.(2005)A structural perspective of the flavivirus life cycle.Nat RevMicrobiol.3：13-22)。

DV进入宿主细胞依赖于其与细胞表面上的特异性受体分子的相互作用。已鉴定了许多表面分子，关于它们存在支持它们参与病毒粒子进入细胞的证据，它们因此被视为推定的病毒受体。在实验上，导致病毒感染的DV-细胞相互作用的初始步骤已分成：通过与表面分子相互作用的病毒吸附的第一阶段，这可以于4℃发生；以及另一个阶段，在这个过程中发生受体介导的胞吞作用，并且其需要于37℃温育细胞作为先决条件(Hung SL，Lee PL，Chen HW，Chen LK，Kao CL，King CC(1999)Analysis of the steps involved in Dengue virusentry into host cells Virology；257：156-67)。这些阶段涉及病毒包膜蛋白的不同区域和细胞表面的不同分子(Crill WD，RoehrigJT(2001)Monoclonal antibodies that bind to domain III ofdengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers ofvirus adsorption to Vero cells.J Virol.75：7769-73)。

在迄今为止已鉴定的对于这个过程而言重要的表面分子之中有蛋白聚糖(Chen Y.，Maguire T.，Hileman R.E.，Fromm J.R.，Esko J.D.，Linhardt R.J.和Marks R.M.(1997)Dengue virus infectivitydepends on envelope protein binding to target cell heparansulfate.Nat.Med.3：866-871)，其已被提出参与了病毒颗粒在细胞表面上的集中以便它们与其他特异性的高亲和力受体的后续相互作用(Halstead S.B.，Heinz F.X.，Barrett A.D.和Roehrig J.T.(2005)Dengue virus：molecular basis of cell entry andpathogenesis，25-27 June 2003，Vienna，Austria.Vaccine.23：849-856)。与CD14相关联的蛋白质也已被描述为巨噬细胞和单核细胞中的可能受体(Chen Y.C.，Wang S.Y.和King C.C.(1999)Bacteriallipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of primaryhuman monocytes/macrophages by blockade of virus entry via aCD14-dependent mechanism.J Virol.73：2650-2657)。暂时被提议为DV受体的其他分子是GRP78/Bip(Jindadamrongwech S.和SmithDR.(2004)Virus Overlay Protein Binding Assay(VOPBA)revealsserotype specific heterogeneity of dengue virus bindingproteins on HepG2 human liver cells.Intervirology.47：370-373；Reyes-Del Valle J.，Chavez-Salinas S.，Medina F.和DelAngel RM.(2005)Heat shock protein 90 and heat shock protein 70 arecomponents of dengue virus receptor complex in human cells.JVirol.279：4557-4567)和层粘连蛋白受体(Thepparit C.和SmithD.R.(2004)Serotype-specific entry of dengue virus into livercells：iden tification of the 37-kilodalton/67-kilodaltonhigh-affinity laminin receptor as a denguevirus serotype 1receptor.J Virol.278：12647-12656；Tio P.H.，JongW.W.和CardosaM.J.(2005)Two dimensional VOPBA reveals laminin receptor(LAMR1)interaction with dengue virus serotypes 1，2 and 3.Virol J.2：25)。

DC-SIGN蛋白在DV病毒粒子进入未成熟的树突细胞内的过程中起着非常重要的作用。然而，这种蛋白质看起来同样参与了病毒颗粒在细胞表面上的集中而不是其胞吞作用(Tassaneetrithp B.，BurgessT.H.，Granelli-Piperno A.，Trumpfheller C.，Finke J.，Sun W.，Eller M.A.，Pattanapanyasat K.，Sarasombath S.，Birx D.L.Steinman R.M.，Schlesinger S.和Marovich M.A.(2003)DC-SIGN(CD209)mediates Dengue Virus infection of human dendriticcells.J.Exp.Med.197：823-829；Navarro-Sanchez E.，AltmeyerR.，Amara A，Schwartz O，Fieschi F，Virelizier JL.，Arenzana-Seisdedos F.和Despres P.(2003)Dendritic-cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin isessential for the productive infection of human dendritic cellsby mosquito-cell-derived dengue viruses.EMBO Rep.4：723-728；Lozach PY，Burleigh L，Staropoli I，Navarro-Sanchez E，HarriagueJ，Virelizier JL，Rey FA，Despres P，Arenzana-Seisdedos F，Amara A(2005)Dendritic cell-specific intercellular adhesionmolecule 3-grabbing non-integrin(DC-SIGN)-mediatedenhancement of dengue virus infection is independent of DC-SIGNinternalization signals.J Biol Chem.280：23698-708)。

DV和其他FV的包膜蛋白(E)在与细胞受体结合、膜融合和病毒粒子装配中起着基础作用。因此，它构成了关于宿主范围和毒力以及关于保护性免疫的诱导的主要决定因素之一(Heinz F.X.(1986)Epitope mapping of flavivirus glycoproteins.Adv Virol.Res.31：103-168；Modis Y.，Ogata S.，Clements D.和Harrison S.C.(2005)Variable surface epitopes in the crystal structure ofdengue virus type 3 envelope glycoprotein.J Virol.79：1223-1231)。分子量为53-54kDa的这种蛋白质是DV结构多肽中最保守的，其在不同FV中在其氨基酸序列方面具有40％的同一性(Mukhopadhyay S.，Kuhn R.J.和Rossmann M.G.(2005)A structuralperspective of the flavivirus life cycle.Nat Rev Microbiol.3：13-22)。X射线晶体学(Modis Y.，Ogata S.，Clements D.和Harrison S.C.(2003)A ligand-binding pocket in the dengue virusenvelope glycoprotein.Proc Natl Acad Sci USA.100：6986-6991)和电子低温显微术研究(Kuhn R.J.，Zhang W.，Rossmann，M.G.，Pletnev S.V.，Corver J.，Lenches E.，Jones C.T.，MukhopadhyayS.，Chipman P.R.，Strauss E.G.，Baker T.S.和Strauss J.H.(2002)Structure of Dengue Virus：Implications for Fla vivirusOrganization，Maturation，and Fusion.Cell.108：717-725)已揭示出，以类似于其他FV的方式，DV的E蛋白在成熟病毒粒子表面上以二聚体形式存在。

E蛋白的N-末端胞外域由整个分子的大约500个氨基酸残基中的80％形成。其余残基构成跨膜区，其使该蛋白质锚定在位于病毒周围的脂质包膜上。在E蛋白的一级结构中存在12个严格保守的Cys残基，它们参与6个二硫桥的形成(Nowak T.和Wengler G.(1987)Analysisof the disulphides present in the membrane protein of the WestNile flaviviruses.Virology.156：127-137；Hahn Y.S.，DallerR.，Hunkapiller T.，Dalrymple J.M.，Strauss J.H.和Strauss E.G.(1988)Nucleotide sequence of Dengue 2 RNA and comparison ofthe encoded proteins with those of other flaviviruses.Virology.162：167-180)，所述二硫桥在这种分子的抗原表位的形成中起着非常重要的作用(Roehrig J.T.，Volpe K.E.，Squires J.，Hunt A.R.，Davis B.S.和Chang G.J.(2004)Contribution of disulfidebridging to epitope expression of the dengue type 2 virusenvelope glycoprotein.J Virol.78：2648-2652)。

形成E蛋白的可溶性胞外域的多肽链折叠成3个结构域：折叠片的中央结构域(结构域I)；延长的二聚化区域(结构域II)；和第三个、免疫球蛋白样区域(结构域III)(ReyF.A，HeinzF.X和MandlC.(1995)The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitisvirus at 2

resolution.Nature.375：291-298；Modis Y.，OgataS.，Clements D.和Harrison S.C.(2003)A ligand-binding pocketin the dengue virus envelope glycoprotein.Proc Natl Acad SciUSA.100：6986-6991)。

DV的E蛋白的结构域III

结构域III(DIII)在E蛋白中具有主要的功能重要性。逃避中和抗体的突变体，以及改变病毒表型的突变(例如减毒突变或决定毒力的突变)位于这个结构域的上表面和侧表面。DIII存在于每个E蛋白单体的C-末端区域上，且包含氨基酸294-392。这个结构域构成病毒粒子上的最突出区域，其中它暴露了其侧面并且位于5X和3X对称轴周围，所述对称轴的每一个具有60个DIII分子(Kuhn R.J.，ZhangW.，Rossmann，M.G.，Pletnev S.V.，Corver J.，Lenches E.，JonesC.T.，Mukhopadhyay S.，Chipman P.R.，Strauss E.G.，Baker T.S.和Strauss J.H.(2002)Structure of Dengue Virus：Implicationsfor Flavivirus Organization，Maturation，and Fusion.Cell.108：717-725)。

DIII的结构类似于免疫球蛋白的恒定区。它由具有2个反平行的β折叠的β桶形成，所述β折叠中的一个由A、B、C′、D和E链组成，和另一个由C、F和G链组成。DIII的三级结构在很大程度上取决于在所有FV中都是严格保守的2个Cys残基之间所形成的单个二硫桥的存在。这个桥的还原减少或消除了被对于DIII特异的中和抗体的结合。获自E蛋白和DV病毒粒子的结构分析以及直接实验的大量数据表明，DIII是E蛋白中与细胞受体相互作用的区域的一部分(Hung JJ，Hsieh MT，Young MJ，Kao CL，King CC，Chang W(2004)An externalloop region of doma in III of dengue virus type 2 envelope proteinis involved in serotype-specific binding to mosquito but notmammalian cells.J Virol.78：378-88；Crill WD，Roehrig JT(2001)Monoclonal antibodies that bind to doma in III of dengue virusE glycoprotein are the most efficient blockers of virusadsorption to Vero cells.J Virol.75：7769-73；Thullier P，Demangel C，Bedouelle H，Megret F，Jouan A，Deubel V，Mazie JC，Lafaye P(2001)Mapping of a dengue virus neutralizing epitopecritical for the infectivity of all serotypes：insight into theneutralization mechanism J Gen Virol.82(Pt 8)：1885-92)。

关于DIII的结构-功能关系的研究也已使用了合成肽。例如，包括DV2的DIII的G β链的肽386-397被3H5中和性单克隆抗体所识别，所述3H5中和性单克隆抗体已知干扰该病毒与细胞的结合并且抑制红细胞的血细胞凝集(Roehrig JT，Bolin RA，Kelly RG(1998)Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of thedengue 2 virus，Jamaica Virology.246：317-28)。但是，E蛋白的这个区域中的几个突变对于3H5的结合不是有害的(Hiramatsu K，Tadano M，Men R，Lai CJ(1996)Mutational analysis of aneutralization epitope on the dengue type 2 virus(DEN2)envelopeprotein：monoclonal antibody resistant DEN2/DEN4 chimerasexhibit reduced mouse neurovirulence.Virology.1996，224：437-45)，然而，残基E383、P384和G385的突变取消了这种结合。还已显示，相应于F-G环和G链的部分的肽380-389可以阻断DIII与蚊子细胞的相互作用，但是不阻断与哺乳动物细胞的相互作用(HungJJ，Hsieh MT，Young MJ，Kao CL，King CC，Chang W(2004)An externalloop region of domain III of dengue virus type 2 envelope proteinis involved in serotype-specific binding to mosquito but notmammalian cells.J Virol.78：378-88)。另一方面，相应于A β链的来自DV1的肽306-314被4E11中和抗体所识别(Thullier P，Demangel C，Bedouelle H，Megret F，Jouan A，Deubel V，Mazie JC，Lafaye P(2001)Mapping of a dengue virus neutralizing epitopecritical for the infectivity of all serotypes：insight into theneutralization mechanism J Gen Virol.82(Pt8)：1885-92)。当以高浓度(约500μM)进行使用时，这种肽能够抑制Vero细胞中的病毒感染。

α2-巨球蛋白(A2M)

人A2M属于α巨球蛋白家族，其成员共享这样的特征，即能够结合广泛范围的肽、蛋白质和颗粒，从而充当脊椎动物的血浆和组织中的体液防线。在脊椎动物和无脊椎动物的循环中，以及在鸟类和爬行动物的蛋白中存在人A2M同系物(Borth W.(1992)Alpha2-macroglobulin，a multifunctional binding protein withtargeting characteristics.6：3345-53)。

人A2M是由各180kDa的4个亚基形成的糖蛋白，从而形成720kDa的同四聚体。这种蛋白质在不同的细胞类型例如肺成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞、肝细胞和星形胶质细胞中合成。每个亚基存在5个反应位点：1)“诱饵”区，其由25个氨基酸的区域组成，该区域位于每个亚基中部，并且几乎可以被源自该生物或微生物的任何机制类别的蛋白酶所切割；2)在半胱氨酸和谷氨酰胺的侧链之间所形成的硫酯键，其可以通过高温，通过小亲核体例如伯胺、还原剂或水的存在进行切割；3)受体结合位点，其包含每个亚基的138个C-末端氨基酸，并且其仅在切割硫酯键后暴露；4)位于“诱饵”区前20个氨基酸处的转谷氨酰胺酶结合位点；和5)Zn²⁺-结合位点。

人A2M抑制参与广泛范围的生物学过程的大量蛋白水解酶，所述生物学过程例如为纤维蛋白溶解、凝固、消化、免疫应答和侵入性组织生长。蛋白酶对“诱饵”区的切割诱导A2M中的构象变化，这与硫酯键的水解紧密偶联，由此A2M使蛋白酶陷入其新构象内。这种过程的净结果是A2M阻止大底物接近蛋白酶的活性位点。这种构象变化还暴露出该四聚体的每个亚基中的受体结合区，并因此A2M-蛋白酶复合物通过受体介导的胞吞作用而从循环中被快速清除(Gonias SL，Balber AE，Hubbard WJ，Pizzo SV(1983)Ligand binding，conformational change and plasma elimination of human，mouseand rat alpha-macroglobulin proteinase inhibitors.Biochem J.1.209：99-105)。

除了其作为蛋白水解调节剂的作用外，由于其结合许多不同分子并在胞吞途径的不同阶段时释放这种负载物的能力，A2M还参与许多过程。已将A2M作为载体蛋白的功能与从胞吞途径到细胞质的转运、胞吞转运作用和涉及或不涉及抗原呈递机制的降解相关联(PizzoSalvatore V，Gron Hanne(2004)Immune response modulator alpha-2macroglobulin complex，US6403092)。

与A2M的化学相互作用的性质已发现是所负载的肽或蛋白质的最终细胞目的地的关键决定因素。可逆的相互作用允许这些负载物于在胞吞途径的早期阶段中与复合物解离后呈现出生物学作用，而不可逆结合的蛋白质或肽通常到达溶酶体区室，在那里它们被降解(Borth W.(1992)Alpha 2-macroglobulin，a multifunctional bindingprotein with targeting characteristics The FASEB journal 6：3345-53)。

α2-巨球蛋白受体

A2M受体(A2MR)也称为低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)或CD91，其已与众多极其重要的生理学作用相关联，例如脂质代谢、止血、溶酶体酶的激活和神经传递。

A2MR是由与跨膜85kDa β链非共价键合的细胞外500kDa α链形成的异二聚体。α链包含具有2、8、10和11个补体样的富含Cys的配体结合位点的4个聚簇(cluster)。在每个配体结合位点聚簇后存在由富含Cys的区域和YWTD结构域形成的EGF-样结构域。β链的胞质尾巴具有2个NPxY基序，其被参与信号传导和胞吞作用的衔接蛋白质所识别(Herz J，Strickland DK.(2001)LRP：a multifunctionalscavenger and signaling receptor.J Clin Invest.108：779-84)。

A2MR识别至少30种属于不同蛋白质家族的不同配体，所述蛋白质家族包括脂蛋白、蛋白酶、蛋白酶-抑制剂复合物、细胞外基质蛋白质、细菌毒素、病毒和几种细胞内蛋白质。旨在详述这些分子与A2MR的相互作用的特征的研究已揭示出，31个配体结合位点的存在提供了受体识别这样广泛多样的配体的能力，每个配体结合位点呈现了独特的相互作用表面。因此，与受体的高亲和力相互作用涉及与几种配体结合位点的同时结合。

人A2MR还识别来自其他物种的配体，其中具有与对于内源性配体所展示的那些类似的亲和常数。

发明详述

病毒与其细胞受体的相互作用是感染性的首要决定因素。获得阻断病毒-受体相互作用的化合物可以导致开发出有效的抗病毒药物。

在DV的情况下，已显示，在病毒血症和疾病的严重度之间存在高度相关性。因此，获得能够减少受感染患者中的病毒载量的有效抗病毒药物对于控制疾病的严重形式而言是非常有吸引力的策略。然而，基于阻断病毒-受体相互作用的DV抗病毒药物的开发由于缺乏对于介导病毒胞吞作用的受体的身份、相互作用的性质和用于识别的决定因素的了解而受到阻碍。

本发明基于下述发现：DV2毒株Jamaica的E蛋白的DIII(Seq.ID.1)可以与来自人血浆的A2M(Seq.ID.2)形成可逆结合的复合物，以及借助于抗受体抗体或竞争性配体来阻断A2MR受体(Seq.ID.3)可以抑制哺乳动物细胞的DV感染。前者暗示，在这种情形中，A2M作为从病毒到A2MR受体的载体蛋白，并从而充当了病毒通过由这种受体介导的胞吞作用而进入细胞的途径之一。

A2M及其受体A2MR遍及不同组织和生物地广泛分布，在其中已发现了这些蛋白质的同系物。这2种分子(A2M和A2MR)由祖先蛋白质家族进化而来。因为在每个家族成员之间存在高度的结构和氨基酸序列同源性，所以这些分子作为DV受体的活性可能存在于广泛多样的细胞类型和生物中。此外，考虑到LDL受体家族的不同成员的配体结合结构域之间的高度相似性，可以推断在DV和属于这个家族的其他受体之间存在相互作用。

例如，鼻病毒的次要家族的成员使用LDL受体家族的不同成员作为细胞受体；在这种情况下，它们是低密度脂蛋白受体、极低密度脂蛋白受体和LRP1(Hofer F，Gruenberger M，Kowalski H，Machat H，Huettinger M，Kuechler E，Blass D(1994)Members of the lowdensity lipoprotein receptor family mediate cell entry of aminor-group common cold virus.Proc Natl Acad Sci 1；91：1839-42)。已知与其受体相互作用的这个病毒家族的表面蛋白质能够以各种亲和力与灵长类和鼠类细胞的LDL受体家族的成员结合，并且已确定此类相互作用介导病毒进入这些细胞类型中。

在不同FV的E蛋白之间也存在高度的结构和序列同源性，因此其他FV可以使用A2MR或LDL受体家族的其他受体。黄病毒属包括超过70种病毒，其中许多是强力的人病原体。由黄病毒感染引起的疾病的特征在于发热症状，其可以具有出血表现、脑炎和肝并发症。除了DV的4种血清型外，对于人健康具有重要性的该属的其他令人注目的成员是黄热病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒和西尼罗河病毒。

基于上述发现，本发明的一个目的是基于干扰病毒与A2MR受体的相互作用来阻断细胞的DV感染的方法。备选地，可以通过干扰与人A2M的相互作用来调节DV感染。在这个情况下，干扰与所述受体或与A2M的相互作用意指减少或增加这种相互作用。相互作用的减少将在非常早的阶段时中止病毒感染，因为病毒将不进入细胞；另一方面，增加或增强这种相互作用将阻止在内体酸化开始时释放被胞吞的病毒，从而影响膜融合事件和病毒RNA的释放。这两种类型的干扰对于中和其他病毒的感染性是有效的。

可以通过与在这个事件中所牵涉的两个表面(E蛋白的相互作用表面或A2MR受体的相互作用表面)中的任一个表面相互作用的分子来干扰DV与细胞的结合。同样地，可以通过使用结合人A2M与病毒蛋白质的相互作用表面的分子来干扰DV与细胞的结合。

特别地，本发明显示了，称为受体相关蛋白(Receptor-AssociatedProtein)(其在下文中将称作RAP)的蛋白质(其构成了A2MR的天然配体之一)以及针对该受体的抗体能够抑制Vero细胞的DV感染。

因此，用于干扰DV与A2MR受体的相互作用的试剂可以由从天然来源纯化的或借助于重组DNA技术获得的受体配体组成；或者可以由该受体的经纯化的可溶性变体组成，所述变体包含其细胞外部分(位于在序列表中标识为Seq.ID.3的序列中的残基20-4419之间的区域)或仍能够与DV结合的衍生自这个部分的片段。优选地，此类片段将包含相应于这种受体的配体结合结构域之一的区段(位于在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的残基25-66、或70-110、或852-892、或893-933、或934-973、或974-1013、或1014-1053、或1060-1099、或1102-1142、或1143-1182、或2522-2563、或2564-2602、或2603-2641、或2642-2690、或2694-2732、或2733-2771、或2772-2814、或2816-2855、或2856-2899、或2902-2940、或3332-3371、或3372-3410、或3411-3450、或3451-3491、或3492-3533、或3534-3572、或3573-3611、或3612-3649、或3652-3692、或3693-3733、或3739-3778之间的区域)。干扰试剂也可以由为了这个目的而开发的合成配体组成。后者的例子将是基于由本发明所提供的信息并使用本领域已知的方法而开发的合成肽。

基于信息学的方法已成为用于药物设计的有力工具。这些方法具有能够评估大量化合物的优点，因此极大节省了时间和实验工作。这些方法的成功使用需要可获得关于参与待被影响的相互作用的蛋白质和配体的三维结构的数据。帮助定义任何反应性分子中的相互作用表面的任何实验数据在这个情形中也是非常宝贵的帮助。

考虑到基于分子对接的用于药物开发的计算技术方面的现有技术，本发明中所描述的关于A2M及其受体A2MR在DV进入细胞中的作用的发现提供了关于实际筛选抑制这种相互作用的化合物(其作为潜在的抗病毒药物)的实验的靶标，或导致其开发。E蛋白的胞外域和DV病毒粒子的三维结构是可获得的。此外，介导A2M与A2MR结合的结构域以及LDL受体家族成员的各种配体结合结构域的晶体学结构也是可获得的。另一方面，本发明还定义了参与DV与其细胞受体的相互作用的氨基酸，并且提供了关于这种相互作用的结构决定子的信息。

因此，用于获得可以干扰DV与A2MR受体相互作用的合成肽的序列和/或小分子的结构的一种方法可以是使用理论方法，其涉及使用一种或几种计算机建模方法，和DIII以及A2MR受体的任何配体结合结构域的三维结构模型。使用用于计算机建模的这些方法中的任何一种，并且基于关于DIII结构的空间坐标，可以建立形成反平行β发夹的多肽链的主链的模型，所述反平行β发夹包括有在2条链之间的连接链中的β转角。此外，可以如此建立所述多肽的侧链的模型，即使得这些链的化学身份及其构象导致能量上有利的原子接触。还可以用计算机来探究序列空间，和肽的构象空间，侧链的旋转异构体，以及使用模型的能量评估作为标准来选择最有利的侧链，这预示着对于肽-蛋白质相互作用具有更高的亲和力。

DIII与A2MR受体的一种和/或几种配体结合结构域的相互作用模型的坐标可以通过实验方法(使用X射线衍射和/或NMR技术)，或通过使用计算机建模来获得。

还可以使用分子对接的计算方法，以重现相应于FG β发夹(其来自不同黄病毒的E蛋白的DIII)的肽和A2MR受体的配体结合结构域之间的相互作用的原子细节。同样地，可以从分子结构数据库中选择出重现了这种相互作用的特征的那些化合物，其因此构成了用于阻断黄病毒感染的有希望的抑制剂。

其他干扰试剂可以通过使用抗体或抗体片段来获得，所述抗体或抗体片段是通过本领域可用的任何方法而选择出的，例如通过选择噬菌体展示抗体文库。在后面一种情况下，所述可以有益于获得针对参与DV-A2MR或DV-A2M相互作用的区域的特异性应答。在针对A2MR或A2M的相互作用的区域的应答的情况下，所述选择必须允许区分这种相互作用的干扰和这些分子的生理学功能性的干扰。

本发明的目的还是基于使用干扰A2MR受体的表达的试剂来阻断细胞的DV感染的方法。通过使用现有技术中可获得的方法来开发抗病毒药物，可以推导出，一个例子将是使用暂时减少或消除A2MR受体表达的短干扰RNA(siRNA)。

本发明的另一个实施方案是用于预防或治疗由DV感染引起的疾病的方法，其包括施用有效量的具有抗病毒活性的分子，所述分子干扰DV与细胞受体的相互作用，其中所述细胞受体是A2MR细胞受体。根据关于药物制剂的目前规章在可接受的条件下配制的、具有抗病毒活性的分子可以在感染前或在疾病的症状出现后(具有关于DV感染的确证性实验室诊断)以有效剂量进行施用。

可以在暴露于DV感染的高风险区域之前，作为预防性药物来使用具有针对DV的抗病毒活性的分子。DV感染的高风险区域是这样的地理区域，即其已知具有用于传播DV的载体即伊蚊(Aedes)，并且其中正在发生任何DV血清型的可检测的流行。

本发明的另一个实施方案是用于预防和/或治疗由DV引起的疾病的方法，其包括使用干扰病毒与人A2M的相互作用的试剂。

本发明还涉及用于预测特定的细胞类型对于DV感染的易感性的方法。这种预测可以通过测试编码A2MR受体的基因的存在来进行，其中术语“基因”包括参与该多肽链产生的DNA区段，以及在前和在后的区域以及在编码序列(外显子)之间的间插序列(内含子)。

该方法包括使用长度为20-50个碱基对的多核苷酸，所述多核苷酸与编码A2MR受体的基因序列上所选择的靶区域杂交并在下文中将称为探针，所述杂交在允许检测与该探针具有80-95％序列同一性的杂交靶的条件下进行。用于达到更高严紧性(即，仅检测出与探针具有95％或更高序列同一性的区域)的操作程序是本领域众所周知的。用于杂交的探针可能能够确定该基因是否编码仍保留了DV受体的所有功能性的蛋白质。

本发明还包括已开发用于干扰DV与其受体的相互作用的分子的用途，所述用途为用于评估特定细胞类型对于DV感染的易感性。该方法涉及检测细胞表面上的A2MR蛋白。例如，该方法可能包括使用识别A2MR受体的抗体、或该受体的配体、或与该受体相互作用的合成肽，将它们与待测试的细胞一起温育，这之后借助于现有技术中的任何目前技术(例如荧光团辅助流式细胞术)来检测其与细胞表面的结合。在可以用于这个实施方案的配体中包括A2M和RAP。

本发明的另一个实施方案包括用于评估特定细胞类型对于DV感染的易感性的方法，其基于A2MR蛋白的检测。该方法涉及获得包含全部细胞蛋白质或亚细胞部分的制剂。将事先通过在丙烯酰胺凝胶中进行电泳而分开或未分开的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并借助于特异性识别这种分子的抗体来检测A2MR受体的存在，随后检测所结合的抗体。备选地，将包含经转移的蛋白质的硝酸纤维素膜在包含该受体的配体之一(例如A2M或RAP)的溶液中进行温育，并且随后检测所结合的配体。

本发明还涉及用于筛选和鉴定保护不受DV感染的化合物的方法，其包括测定所评估的化合物阻断DV与A2MR受体的相互作用的能力。基于这种原理的方法可以使用这样的制剂，所述制剂包含DV病毒粒子，或备选地包含DV的E蛋白的胞外域，或包含含有所述蛋白质的DIII的重组蛋白质。该方法涉及将A2MR受体连同包含DV和待评估其阻断能力的化合物的制剂一起进行温育，随后评估所结合的病毒的量，并将其与在受试化合物不存在下所结合的病毒的量进行比较。所述检测优选地通过下列方式来进行：使用结合或固定在固相上的受体，添加在溶液中的病毒粒子和所评估的化合物的混合物。

A2MR制剂可以由从天然来源纯化出的样品组成，其中A2MR受体优选地占样品的蛋白质总含量的至少75％。天然来源的一些例子是细胞/组织匀浆物、或来自细胞培养的培养物上清液、或人血浆。A2MR制剂还可以由包含受体的α链或其片段的重组蛋白质组成，其保留了作为DV受体的功能性。

本发明还包括用于筛选和鉴定可以保护不受DV感染的化合物的方法，其基于测定所评估的化合物阻断DV与人A2M的相互作用的能力。基于这种原理的方法可以备选地使用DV的E蛋白的胞外域、或包含所述分子的DIII的重组蛋白质。为了评估被筛选的化合物的活性，将所评估的物质与A2M进行温育，并且评估其干扰与DV、或E蛋白的胞外域、或E蛋白的DIII的相互作用的能力。

附图描述

图1.经纯化的DIIIE2J制剂的表征。(A)将45μg DIIIE2J加载到C4反相柱上。色谱法运行于37℃下进行，其中使用配备有2个泵和控制器的高效液相色谱系统。蛋白质的洗脱通过下列方式来达到：以0.8mL/分钟的流速施加在0.1％(v/v)三氟乙酸中的10-60％(v/v)乙腈线性梯度，并在226nm处进行检测。(B)通过15％ SDS-PAGE的分析。泳道1：分子量标准参照物。泳道2：12μg经纯化的DIIIE2J制剂，其在非还原性样品缓冲液中作1:1稀释。蛋白质条带根据由Heukeshoven，J.和Dernick，R.，(1985).Simplified method forsilver staining of proteins in polyacrylamide gels and themechanism of silver staining.Electrophoresis 6：103-112所描述的方法进行染色。

图2.通过质谱法来测定DIIIE2J的分子量和二硫桥的形成。(A)从经克隆的DNA区段预测的氨基酸序列。(B)从该蛋白质的氨基酸序列预期的平均质量，其中假定N-末端甲硫氨酸未被去除(Met¹)或被去除(Ala²)。RCM：从Ala²开始的并且在每个半胱氨酸残基中掺入了碘乙酰胺的蛋白质的预期的平均质量。(C)DIIIE2J的解卷积的(deconvoluted)质谱。天然的：从rp-HPLC收集的未修饰的蛋白质。+IAA：于25℃与碘乙酰胺温育30分钟的蛋白质。+DTT+IAA：于37℃与10mM DTT温育2小时，随后于25℃与碘乙酰胺温育30分钟的蛋白质。

图3.使用鼠类和人抗体的用于分析DIIIE2J的抗原性的斑点印迹法。所述行包括用于使硝酸纤维素膜敏化的不同制剂，而所述列代表了不同抗体制剂的排列。C⁺：通过蔗糖-丙酮法(Clarke D.H.和Casals J.(1958).Techniques for hemagglutination andhemagglutination inhibition with arthropod-borne viruses.Amer.J.Trop.Med.Hyg.7：561-573)从经颅内接种的OF1乳鼠的脑匀浆物中获得的血清型2病毒抗原的制备物。C^-：通过蔗糖-丙酮法加工的、来自未接种的OF1乳鼠的脑匀浆物。

图4.抗-DV2抗体对于与色谱凝胶共价固定的DIIIE2J的识别。将具有DIIIE2J作为配体的20微升亲和凝胶的等分试样与不同的抗体制剂于25℃温育30分钟。未结合的部分通过低速离心来去除，并且凝胶用PBS pH 7.4，0.1％ Tween-20充分洗涤。

图5.证明A2M和DIIIE2J的直接结合，其中这两种蛋白质处于溶液中。(A)在直接结合实验中使用的经纯化的人A2M的制剂的品质分析。在变性、非还原条件下的SDS-PAGE(10％)。泳道1：用考马斯蓝染色。泳道2：使用多克隆抗-人A2M制剂(Sigma，USA)的Western印迹法免疫鉴定。(B-F)：用于分离不同种类的凝胶过滤运行的色谱图谱。自始至终使用在NaHPO₄ 50mM pH 7.0，300mM NaCl缓冲液中平衡的Superdex 200HR 10/30柱。运行以0.4mL/分钟的流速进行，并在280nm处进行监控。将样品以200μL的体积进行加载。(A)100μg DIIIE2J。(B)70μg未激活的A2M。(C)于25℃与70μg未激活的A2M温育1小时的100μg DIIIE2J。(D)70μg A2M_MeNH₂。(E)于25℃与70μg A2M_MeNH₂温育1小时的100μg DIIIE2J。在每个色谱图中，箭头标示出了被收集用于随后的SDS-PAGE分析的级分。星号标示出了相应于洗脱1个总柱体积的时间。(G)：在从不同色谱运行中收集的级分之中存在的蛋白质种类的12.5％ SDS-PAGE分析。从每次运行中收集的样品用丙酮进行沉淀。将所述蛋白质沉淀物重悬浮于15μL样品缓冲液中并进行电泳。相应的色谱图的字母以及所加载的样品的描述在每个泳道的顶端处标示出。箭头标明了在凝胶中DIIIE2J条带的位置。

图6.通过Biacore测量的DIIIE2J和A2M的直接结合。在注射下列物质之时和之后获得的响应曲线：(B)针对DV血清型2的中和性单克隆抗体(3H5)和针对所有FV的中和性单克隆抗体(4G2)；(C)通过用DV1和DV2进行免疫接种而获得的多克隆小鼠抗体制剂，以及经过汇集未用病毒免疫接种的小鼠血清而获得的样品(免疫前血清)；和(D)A2M稀释物，以0.3μMol/L至3μMol/L的浓度。所述运行在PBS pH 7.4上于25℃进行。不同稀释度的A2M以5μL/分钟的流速加载20分钟。响应表示为共振单位(RU)，其对于不含固定的蛋白质的通道的非特异性结合(小于5％)进行了校正。

图7.A2M和RAPR13抑制DIIIE2J与Vero细胞的结合。将预固定的细胞与荧光素化的蛋白质一起进行温育，并且通过流式细胞术来测量由于荧光素化的配体与细胞的结合而产生的荧光强度。每个实验点代表了从最少20000个细胞收集的数据。(A)A2M和RAPR13与细胞的结合。所描绘的值相应于在该测定法中每个点的平均荧光强度的值减去用未处理的细胞而获得的值。(B)和(C)在非荧光素化的配体存在或不存在下，使细胞与荧光素化的DIIIE2J进行温育，其中在每种情况下使用所指明的摩尔比。从用荧光素化的DIIIE2J+所述蛋白质的混合物进行温育的细胞和用荧光素化的DIIIE2J进行温育的细胞之间的平均荧光强度之比计算出结合％。

图8.重组RAP对于Vero细胞的DV2毒株S16803感染的影响。将处于90％汇合的Vero单层与不同稀释度的RAPR13或BSA于37℃预温育1小时，随后添加感染复数为1的病毒制备物，并于37℃再次温育1小时。在去除未结合的病毒后，添加补充有非必需氨基酸、1％ FCS和1％ CMC的MEM培养基，并且使细胞于37℃温育5天。通过用萘酚蓝黑染色单层来显现裂解噬斑。所述测定法在24孔平板中进行，其中对于该测定法的每个点使用一式两份。

图9.A2MR受体(SEQ ID.3，在SwissProt数据库中的LRP1_人)的配体结合结构域的多重序列比对。该比对使用ClustalX应用软件(Higgins D.，Thompson J.，Gibson T.Thompson J.D.，HigginsD.G.，Gibson T.J.(1994).CLUSTAL W：improving the sensitivityof progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting，position-specific gap penalties and weight matrixchoice.Nucleic Acids Res.22：4673-4680)来进行。箭头标明了属于配体结合斑片(ligand binding patches)的残基。该图的较下部分显示了“保守程度/残基”的示意图。

图10.DV的E蛋白的DIII的三维结构模型。(A)DV1；(B)DV2；(C)DV3；和(D)DV4。在DIII表面上的带正电的斑片(patch)是带阴影的，并且以2种灰度色调显现：暗灰色，位于相应于由A、B、C′、D和E链所定义的β折叠的表面上的斑片；和亮灰色，位于相应于或邻近于FG β发夹的表面上的斑片(参见图10A)。

图11.基于FG β发夹，用于阻断DV感染的肽的设计。(A)DV2的DIII的三维结构的示意图。该示意图强调了二级结构元件。(B)4种DV血清型的E蛋白的DIII的三级结构模型的结构叠合。该模型以关于不同病毒血清型的变化的灰度色调来呈现。(C)和(D)分别为肽HDIII2CL和HDIII3CL的三维结构模型。

图12.(A)被设计为模拟DIII表面上的不同区域的肽的序列。残基编号相应于以登录号P07564可从Swiss-Prot数据库(http: //www.ebi.ac.uk/swissprot)获得的DV血清型2毒株Jamaica 1409的E蛋白的序列。带下划线的残基不存在于E蛋白中，而是在设计过程中引入的。半胱氨酸残基用于通过二硫桥来限制肽的结构可动性。(B)在Western印迹测定法中中和抗体3H5对于肽HDIII2Cs的识别。将50μg BSA-肽缀合物和20μg重组蛋白质PD5在12.5％ SDS-PAGE凝胶上进行电泳(在变性条件下)，并转移至硝酸纤维素膜。在封闭后，将膜与mAb 3H5的稀释物(30μg/mL)于25℃温育2小时。用抗小鼠IgG-过氧化物酶缀合物来检测结合的抗体，并且使用化学发光来使印迹显现。(C)用10μg所述蛋白质和所述肽的每种变体平行地使2片硝酸纤维素膜敏化。一片膜与浓度为30μg/mL的mAb 3H5进行温育，和第二片膜与来自用HDIII2Cs-KLH缀合物进行免疫的小鼠的血清混合物进行温育。结合的抗体的检测在与在Western印迹测定法中相同的条件下进行。RCM：还原的且脲基甲基化的蛋白质/肽。

图13.抗-HDIIIE2Cs血清对于该病毒的识别。(A)将用DV2感染的或未感染的Vero细胞的匀浆物在10％ SDS-PAGE上进行电泳，并转移至硝酸纤维素膜。在封闭后，使膜与下述抗体制剂进行温育：(A.A)30μg/mL的mAb 3H5，(A.B)1/100稀释的、来自用HDIIIE2Cs-KLH缀合物进行免疫的小鼠的免疫前血清，和(A.C)1/100稀释的、来自用5剂HDIIIE2Cs-KLH缀合物进行免疫的小鼠的血清。(B)使用来自用不同DIII肽进行免疫的小鼠的血清所进行的³⁵S_DV2的免疫沉淀。使用(在第5剂之后)来自用肽-KLH缀合物进行免疫的小鼠的血清混合物的1/100稀释物。泳道1.抗pepDIII-1血清；泳道2.抗HDIIIE2Cs血清；泳道3.抗pepDIII-2血清；泳道4.免疫沉淀缓冲液，不含样品；和泳道5.与DV2反应的人血清混合物。

图14.从用肽-KLH缀合物进行免疫的小鼠获得的血清对于PD5蛋白的识别。多孔平板用0.5μg/孔的来自不同变体的总蛋白质进行包被：未修饰的(unmod.)；还原的且脲基甲基化的(RCM)；和脲基甲基化的且没有事先还原其二硫桥(CM)。将1:100稀释的、来自每个组的血清混合物在PBS-TpH 7.4中于37℃温育2小时。在这两种测定法中，使用抗小鼠IgG-HRP缀合物(1:1000稀释的)来进行显色，其中使用H₂O₂/OPD作为过氧化物酶的底物。在20分钟后通过添加2.5Mol/L H₂SO₄来终止酶促反应，并且在492nm处测量吸光度。关于所述肽的序列以及它们所包含的DV的DIII区域的数据可以在图9和11中找到。

图15.DV的E蛋白的DIII区域的呈现，所述区域包括在所设计的肽中。所呈现的序列是相应于DV1的DIII(DIII_DV1)和DV2的DIII(DIII_DV2)的氨基酸299-318和359-397(DV2的序列编号)的那些序列。3H5pept是在文献中被报道为由mAb3H5所识别的表位的一部分的肽(Trirawatanapong T，Chandran B，Putnak R，Padmanabhan R(1992)Mapping of a region of dengue virus type-2glycoprotein required for binding by a neutralizing monoclonalantibody.Gene.116：139-50)。在原始序列中不存在但在设计过程中引入的另外氨基酸以灰色字体表示。2个半胱氨酸残基用于引入可以限制该肽的构象自由度的二硫桥。引入N-末端赖氨酸以用于允许该肽与载体蛋白的共价缀合，并且包括β-丙氨酸残基作为间隔物。在带阴影的框中所包括的是在文献中在先前研究中使用的线性肽的序列，DV2-1、DV1-1、DV2-2、DV2-3(Hung JJ，Hsieh MT，Young MJ，KaoCL，King CC，Chang W(2004)An external loop region of domainIII of dengue virus type 2 envelope protein is involved inserotype-specific binding to mosquito but not mammalian cells.J Virol.78：378-88)和P′1(Thullier P，Demangel C，BedouelleH，Megret F，Jouan A，Deubel V，Mazie JC，Lafaye P(2001)Mappingof a dengue virus neutralizing epitope critical for theinfectivity of all serotypes：insight into the neutralizationmechanism J Gen Virol.82(Pt8)：1885-92)。在DIII结构上由所述肽所跨越的区域的三维呈现(以黑色突出显示)在该图的底部。

图16.肽HDIII2CL和HDIII3CL与来自人外周血的白细胞表面的结合。将通过红细胞裂解而分离的细胞用PBS pH7.4、1％牛血清白蛋白(BSA)、0.01％ NaN₃、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂进行洗涤，并用在PBS pH 7.4中的1％低聚甲醛进行固定。在洗涤后，使细胞与肽稀释物于4℃在PBS pH7.4，1％ BSA中温育30分钟。采用流式细胞术并使用链霉抗生物素蛋白-FITC缀合物来检测肽的结合。细胞对照：固定的未用肽或缀合物处理的细胞。

图17.抑制DV1和DV2对于Vero细胞的感染。(A)具有处于大约90％汇合的单层的6孔平板与在MEM培养基中的肽稀释物于37℃温育30分钟。随后添加DV1毒株WestPac 74或DV2毒株S16803的稀释物以获得100个裂解噬斑/孔的平均值，并且将平板与病毒/肽混合物于37℃温育30分钟。在温育后，将细胞洗涤2次，添加补充有非必需氨基酸、1％胎牛血清、1％ CMC的MEM培养基，并最后于37℃在CO₂气氛下温育5天。(B)所述肽在100μMol/L时的抑制效应。NRpep：无关肽。关于肽3H5pept、pepDIII-1、HIII2CL和HIII3CL的序列以及它们在DV的DIII上所跨越的区域的数据可以从图11中获得。抑制百分比的计算在“材料和方法”中描述。(C)通过使用不同浓度的所述肽来抑制DV2感染。通过用萘酚蓝黑染色来显现病毒噬斑。细胞对照：未处理的细胞。病毒对照：与该病毒温育的细胞，但没有肽。对于这两种肽，在22-45μMol/L的浓度时获得50％的抑制。

图18.相应于涉及人和动物健康的FV的FGβ发夹的残基的多重序列比对。(YFV)黄热病毒、(WNV)西尼罗河病毒、(JAE)日本脑炎病毒、(TBE)蜱传脑炎病毒、(KUNJ)库京病毒(Kunjinvirus)、(POW)玻瓦散病毒、(LAN)兰加特病毒、(MVE)墨累山谷脑炎病毒和(SLE)圣·路易脑炎病毒。

图19.与所述肽的同时温育对于A2M和RAPR13与Vero细胞表面的结合的影响。在不同浓度的HIII2CL和3H5pept存在下，将荧光素化的A2M和RAP13蛋白与预固定的Vero细胞于4℃温育30分钟，以便达到所示的肽/蛋白质摩尔比。通过流式细胞术来检测结合的配体。

图20.与A2M的预温育对于Vero细胞的DV感染的影响。将病毒制备物与蛋白质在25℃预温育1小时(A和C)或预温育所示的时间(B)，所述蛋白质即激活的A2M(A2Mact)、未激活的A2M(A2M noact)和无关蛋白质(NR)。将所述蛋白质与病毒的混合物加入至处于90％汇合的Vero细胞的单层中，并于37℃温育1小时。对细胞单层进行洗涤以去除未结合的病毒。接下来，添加补充有非必需氨基酸、1％FBS、1％ CMC的MEM培养基，并且使细胞在CO₂培养箱中于37℃温育5天。为了显现病毒噬斑，使用萘酚蓝黑对Vero细胞进行染色。所述实验在24孔平板中进行。每个实验点一式两份地进行。

图21.在使用固定的A2M的亲和色谱法中纯化A2MR受体的色谱图谱(A)，和从所述色谱中洗脱出的级分的SDS-PAGE分析(B)。使用5-15％丙烯酰胺梯度凝胶。与不同色谱级分的预温育对于Vero细胞的DV2感染的影响(C)。病毒噬斑数目减少中和测定法如图20中所述进行。(D)在通过颅内接种神经适应性DV2而诱导的Balb/C小鼠脑炎模型中的保护测定法。

图22.在通过颅内接种神经适应性DV2而诱导的Balb/C小鼠脑炎模型中的保护测定法。PepNR GAGs结合性：由与糖胺聚糖结合的片段和与DV的E蛋白无关的序列形成的肽。

实施例

材料和方法

变性蛋白质电泳(SDS-PAGE)

根据由Laemmli描述的标准条件(Laemmli，U.K.，(1970).Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.Nature 227：680-685)来使用聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质样品在样品缓冲液(1％ SDS，0.3M Tris-HCl，pH 6.8)中进行稀释。对于在还原条件下的分析，遵循相同的操作程序，但向样品缓冲液中添加β-巯基乙醇至2mM的终浓度，并且使样品于95℃加热2分钟。以20mA在0.25M Tris-HCl，1.92M甘氨酸缓冲液(pH8.3)和1％ SDS中进行电泳运行。使用关于用考马斯蓝或银进行染色的标准方法。想要用于随后将通过质谱法进行分析的蛋白质的电泳分离的凝胶根据关于无戊二醛的银染色的操作程序进行染色，这与质谱法分析是相容的(Shevchenko，A.，Willm，M.，Vorm，O.y Mann，M.，(1996).Anal.Chem.68：850-858)。

Western印迹法

在通过电泳分离后，在水下转移池中将蛋白质从凝胶转移至0.45μm Hybond-ECL硝酸纤维素膜(Amer sham，UK)(TowbinH.，StaehelinT.和Golden J.(1979).Electroforetic transfer of protein frompolyacrylamide gel to nitrocellulose sheets：procedure and someapplications.Proc.Natl.Acad.Sci.76：4350-4354)。在转移后，用在PBS pH7.4，0.1％ Tween-20中的5％(w/v)脱脂乳通过于25℃在恒定摇动下温育1小时来对膜进行封闭。此后，将它们与在PBS pH7.4，0.1％ Tween-20，5％脱脂乳中稀释的相应抗体于4℃温育过夜。在用大量的PBS pH7.4，0.1％ Tween-20进行洗涤后，随后将膜与合适的过氧化物酶缀合物(取决于从中获得抗体的物种)于25℃温育1小时。在所有情况下，缀合物从Amersham(UK)或Sigma(USA)获得。用于显现具有反应性的条带的过氧化物酶底物在各自的图的说明中指出。

斑点印迹法

2片硝酸纤维素膜用等摩尔量的DIIIE2J和BSA于25℃敏化1小时。2片膜都包括DV血清型2的病毒抗原制备物及其相应的阴性对照，以作为抗体的抗病毒反应性的对照。膜在恒定摇动下于25℃在包含5％脱脂乳的PBS，0.1％ Tween-20中封闭1小时。与不同抗体制剂的温育在PBS，0.01％ Tween-20、5％脱脂乳中于25℃进行2小时。在温育结束时，膜用PBS，0.01％ Tween-20充分洗涤，并且在鼠类抗体的情况下与抗小鼠IgG-过氧化物酶缀合物(Amersham，UK)进行温育，或对于人来源的抗体而言与抗人IgG-过氧化物酶缀合物(Sigma，USA)进行温育，在两种情况下均于25℃温育1小时。在第二次充分洗涤膜后，采用ECL Western Blotting Analysis System(Amersham，UK)，用CP-G PLUS(AGFA，Belgium)胶片在FBX C810放射自显影箱(FisherBiotech，USA)中对膜进行显影。所述胶片在用于放射自显影胶片的自动处理机中进行显影(Hyperprocessor，Amersham，UK)。

在色谱凝胶中固定蛋白质

将10mg等分试样的纯化的蛋白质逆0.1Mol/L NaHCO₃ pH 8.3，0.5Mol/L NaCl进行透析。蛋白质与色谱凝胶的偶联通过与1mL经CNBr激活的Sepharose(Amersham，UK)于25℃温育2小时来达到。未偶联的蛋白质通过在500xg下离心5分钟而从凝胶中去除。通过比较反应之前和之后溶液的蛋白质浓度来评估偶联效率。在所有情况下，大约95％的蛋白质被固定。

测定蛋白质的浓度

使用基于双金鸡宁酸的试剂盒(Pierce，USA)，并根据制造商关于在96孔平板中实施测定法的说明，来进行用于测定蛋白质浓度的测定法。标准曲线用不同稀释度(0.025-2mg/mL)的牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，USA)来制备。

在cm5芯片上的共价固定

cm5芯片(Biacore，Sweden)用于DIIIE2J和LRP1蛋白的共价固定。于25℃，以5μL/分钟的流速，并使用HBS(Biacore，Sweden)作为运行缓冲液来施行所述固定。芯片的表面通过加载35μL 0.2Mol/L N-乙基-N’-(3-二乙基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05Mol/LN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来激活。此后，将溶解于10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的蛋白质加载到该系统中。在固定结束时，将35μL 1M乙醇胺(pH8)加载到该系统中，以便封闭任何剩余的、游离的、经活化的基团。在每种情况下，待用作阴性对照的通道仅接受用EDC:：NHS溶液的激活注射以及用乙醇胺的封闭，其中使用相同的流速和注射体积。结果使用BIAevaluation ver.4.1程序(Biacore，Sweden)来进行分析。

通过质谱法进行分析

用配备有Z-喷射电雾化电离源的、具有八角形几何形状的混合型质谱仪QTOF-2TM(Micromass，UK)来获得质谱。

用于获得和加工质谱的软件是MassLinx，ver.3.5(Waters，USA)。使用MaxEntropy ver.3.0(Micromass，UK)来对胰蛋白酶消化肽段混合物的ESI-MS谱进行解卷积。所使用的鉴定软件是MASCOT和SeqTag。

DV2，基因型Jamaica的E蛋白的DIII(DIIIE2J)的获得

通过重组DNA技术获得DV2的E蛋白的结构域III，其中在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达编码这种多肽的基因片段。为了这个目的，使用亚磷酰胺法(Beaucage SL，Caruthers MH，Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of keyintermediates for deoxypolynucleotide synthesis.，TetrahedronLetters，(1981)，22，1859)来合成具有序列CATATGGCCATGGACAAACTACAGCTC(SEQ ID.19)和CTCGAGGCCGATGGAACTTCCTTT(SEQ ID.20)的两种寡核苷酸，其在5’末端中分别携带有限制酶Nde I和Xho I的识别序列(在序列中以加下划线表示)。

使用这两种寡核苷酸，并使用包含DV2毒株Jamaica 1409的基因组的前2469个核苷酸的p30-VD2质粒(Deubel V，Kinney RM，TrentDW，Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of thestructural proteins of dengue type 2 virus，Jamaica genotype.Virology，(1986)，155，365)作为模板，通过PCR扩增出编码E蛋白的DIII的DNA片段(Saiki RK，Scharf S，Faloona F，MullisKB，Horn GT，Erlich HA，Arnheim N，Enzymatic amplification ofbeta-globin genomic sequences and restriction site analysis fordiagnosis of sickle cell anemia.Science(1985)，230，1350)。使用来自Amersham，UK的pMOSBlue平端克隆试剂盒(RPN 5110)，将该片段克隆到pMOSBlue载体中，然后通过来下列方式来进行纯化：根据制造商的说明书用酶Nde I和Xho I(Promega Bene lux，b.v.，The Netherlands)消化所得到的质粒，随后在具有低凝胶化温度的琼脂糖凝胶上进行电泳(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.；Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA)。然后，在由制造商指定的条件下，使用T4DNA连接酶(Promega Benelux，b.v.，The Netherlands)将该片段连接到经同样消化的pET22b+质粒(Novagen Inc.，USA)中。

根据Sambrook等人(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning：A laboratory manual.New York，USA：ColdSpring Harbor Laboratory Press；1989)，将获得的混合物转化到大肠杆菌菌株XL-1Blue(Bullock WO，Fernández JM，Short JM.XL-1Blue：A high efficiency plasmid transforming recAEscherichia coli K12 strain with beta-galactosida seselection.Biotechniques 1987；5：376-8)中，并且通过限制性分析来筛选在选择培养基中生长后获得的菌落中存在的所得到的质粒。几种重组质粒的序列通过自动化Sanger测序来进行验证，并且选择出其序列匹配预期序列的代表性分子并命名为pET-iDIIIE2_J(SEQID.21)。这种质粒在大肠杆菌中在T7启动子控制下编码DV血清型2毒株Jamaica1409的E蛋白的DIII的细胞内合成。命名为DIIIE2J(SEQ ID.22)的所获得的蛋白质在其C-末端上包含具有6个连续组氨酸的序列，其被引入作为用于促进该蛋白质通过固定化金属亲和层析(IMAC)(Sulkowski，E.(1985)Purification of proteins by IMAC.TrendsBiotechnol.3，1-7)进行纯化的标签。

为了纯化DIIIE2J，将pET-iDIIIE2_J质粒转化(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning：A laboratory manual.New York，USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press；1989)到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中(Studier，F.W.和B.A.Moffatt.“Useofb acteriophage T7 RNA polymerase to direct selectivehigh-level expression of cloned genes.″J.Mol.Biol.189.1(1986)：113-30)，并将彻底分开的菌落用于接种50mL补充有50μg/mL氨苄青霉素的Luria Bertani培养基(LBA)。培养物于30℃在350r.p.m.下生长12小时，然后用于以在620nm下0.05的起始光密度来接种1L LBA培养基，其随后于28℃生长8小时直至指数后期，并且通过添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来进行诱导。生长在相同条件下继续另外5小时。

经诱导的培养物于4℃在5000xg下离心30分钟，并且将所得到的生物量重悬浮于30mL PBS中，并在弗氏压碎器上以1500kg/cm²施行3个循环来进行破裂。在将匀浆物于4℃在10000xg下离心30分钟后，将包含以内含体形式的所述蛋白质的沉淀物溶解在30mLPBS，6M盐酸胍中，并且通过以100μg/mL的蛋白质终浓度在PBS/10mM咪唑中进行稀释来重折叠DIIIE2J。

使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen Benelux B.V.，The Netherlands)通过固定化金属亲和层析(Sulkowski，E.(1985)Purification ofproteins by IMAC.Trends Biotechnol.3，1-7)来纯化重折叠的DIIIE2J。在结合后，通过顺次用在PBS pH7.4，0.3Mol/L NaCl中的50、100和300mMol/L咪唑溶液作为缓冲液洗涤柱来洗脱蛋白质。如通过使用ImageJ ver.1.35d软件(Rasband W.，http://rsb.info.nih.gov/ij/)的光密度分析常规操作对于经考马斯蓝染色的在变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行数字图像分析所评估的，所获得的蛋白质具有等于或高于90％的纯度。

人A2M的纯化

从380mL人血浆中纯化出人A2M，所述人血浆通过合并来自30至40岁的健康供体的血浆样品而获得。使血浆于4℃逆去离子水(频繁更换)透析72小时。不溶性物质通过在10000xg下离心30分钟来分离。使上清液逆PBS pH6进行透析，并加载到XK50/30柱(Amersham，UK)中，所述柱中填充有65mL Chelating Sepharose FastFlow(Amersham，UK)，其事先加载有Zn²⁺并用PBS pH6平衡。柱随后用PBS pH6进行洗涤直至洗出液在280nm处的吸光度减少至基线水平，并用10mMol/L乙酸钠缓冲液pH5，150mM NaCl洗脱下结合的蛋白质。使用具有300kDa的MWCO的膜通过超滤来浓缩洗脱下的蛋白质，然后以2mL/分钟的流速加载到填充有Superdex 200(Amersham，UK)并用PBS pH7.8平衡的凝胶过滤柱(26 x 51cm)中。载具有最高分子量的级分中蛋白质的存在通过Western印迹测定法来进行检查，其中使用多克隆抗人A2M抗体制剂(Sigma，USA)。通过与200mMol/L甲胺在50mMol/L磷酸钠，150mMol/L NaCl，pH7.4中进行温育来达到经纯化的A2M的激活。使获得的A2M_MeNH₂逆50mMol/L磷酸钠，0.5Mol/L NaCl pH7.8进行充分透析。

重组人LRPAP1(RAP)蛋白的获得

通过重组DNA技术来获得称为“LRPAP1”或在科学文献中更通常称为“RAP”的“与LRP1受体相关的人蛋白质”，其中在大肠杆菌中表达编码这种分子的基因片段。为了这个目的，使用由Chomczynsky和Sacchi所描述的方案(Chomczynski，P.；Sacchi，N.(1987)Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.AnalyticalBiochemistry 162(1)：156)，从人单核细胞细胞系THP-1(Tsuchiya，S.；Yamabe，M.；Yamaguchi，Y.；Kobayashi，Y.；Konno，T.；Tada，K.(1980)Establishment and characterization of a humanacute monocytic leukemia cell line(THP-1)，Int.J.Cancer 26(2)：171)中纯化出总RNA；并且使用随机六聚体，采用来自Perkin-Elmer(USA，N808-0143)的GeneAmp RNA PCR Core Kit将该RNA逆转录成cDNA。通过PCR从cDNA扩增出LRPAP1(RAP)蛋白的基因(Saiki，R.K.；Scharf，S.；Faloona，F.；Mullis，K.B.；Horn，G.T.；Erlich，H.A.；Arnheim，N.(1985)Enzymatic amplification ofbeta-globin genomic sequences and restriction site analysis fordiagnosis of sickle cell anemia.Science 230(4732)：1350)，其中使用GeneAmp RNA PCR Core Kit(Perkin-Elmer，USA，N808-0143)以及寡核苷酸CATATGTACTCGCGGGAGAAGAACCAG(SEQ ID.23)和CTCGAGTCAGAGTTCGTTGTGC(SEQ ID.24)，其在5′末端上分别携带有限制酶Nde I和Xho I的识别序列(在序列中以加下划线表示)，其事先通过亚磷酰胺化学(Beaucage SL，Caruthers MH，Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of keyintermediates for deoxypolynucleotide synthesis.，TetrahedronLetters，(1981)，22，1859)来合成。

使用pGEM-T Vector System 1 Kit(Promega Benelux b.v.，TheNetherlands，A3600)将扩增出的片段克隆到pGEM-T载体(PromegaBenelux b.v.，The Netherlands)中，然后通过来下列方式来进行纯化：在由制造商指定的条件下用Nde I和Xho I(Promega Benelux，b.v.，The Netherlands)进行消化，随后在具有低凝胶化温度的琼脂糖凝胶上进行电泳(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.；Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)，ColdSpring HarborLaboratory Press，New York，USA)。然后，在由制造商指定的条件下，使用T4DNA连接酶(Promega Benelux，b.v.，The Netherlands)将该片段连接到事先用Nde I和Xho I消化的pET28a+质粒(NovagenInc.，USA)中。根据Sambrook等人(Sambrook J，Fritsch EF，ManiatisT.Molecular cloning：A laboratory manual.New York，USA：ColdSpring Harbor Laboratory Press；1989)，将反应混合物转化到大肠杆菌菌株XL-1Blue(Bullock WO，Fernández JM，Short JM.XL-1Blue：A high efficiency plasmid transforming recAEscherichia coli K12 strain with beta-galactosidase selection.Biotechniques 1987；5：376-8)中，并且通过限制性分析来筛选来自在选择培养基中生长后获得的菌落的质粒。几种所得到的重组质粒的序列通过自动化Sanger测序来进行验证，并且选择出匹配预期序列的代表性克隆并命名为pET-RAP(SEQ.ID.25)。这种质粒在大肠杆菌中在T7启动子控制下编码人LRPAP1(RAP)蛋白的细胞内合成。命名为RAPR13(SEQ ID.26)的重组蛋白质在N-末端上包含具有6个连续组氨酸的标签，以用于该蛋白质的随后的通过固定化金属亲和层析(IMAC)(Sulkowski，E.(1985)Purification of proteins by IMAC.Trends Biotechnol.3，1-7)的纯化，所述标签通过凝血酶切割位点而与该蛋白质的其余部分相分开。

为了纯化RAPR13，将pET-RAP质粒转化(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning：A laboratory manual.New York，USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press；1989)到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中(Studier，F.W.和B.A.Moffatt.“Use ofbacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-levelexpression of cloned genes.″J.Mol.Biol.189.1(1986)：113-30)，并将彻底分开的菌落用于接种在1L锥形瓶中的补充有100μg/mL卡那霉素的50mL ZYM5052培养基的培养物(Studier，F.W(2005)Proteinproduction by auto-induction in high density shaking cultures.Protein Expression and Purification 41(1)：207)，随后将其在28℃和350r.p.m下温育16小时。将经诱导的培养物于4℃在5000xg下离心30分钟，并且将所得到的生物量重悬浮于30mL PBS中，并在弗氏压碎器上以1500kg/cm²施行3个循环来进行破裂。在将所得到的匀浆物于4℃在10000xg下离心30分钟后，使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen Benelux B.V.，TheNetherlands)通过固定化金属亲和层析(Sulkowski，E.(1985)Purification of proteins by IMAC.Trends Biotechnol.3，1-7)从上清液中纯化出蛋白质，其中使用在PBS/0.3M NaCl中10-300mM咪唑的线性梯度作为用于洗脱的运行缓冲液。如通过使用ImageJ ver.1.35d软件(RasbandW.，http://rsb.info.nih.gov/ij/)的光密度分析常规操作对于经考马斯蓝染色的变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行数字图像分析所评估的，所获得的蛋白质具有等于或高于90％的纯度。

肽合成

使用Fmoc/tBu策略(Barany，G.和Merrifield，R.B.J AmChemSoc.99(1977)7363-7365)，通过在Fmoc-AM-MBHA树脂上的固相合成来获得所述肽。通过用DIC/HOBt进行激活来偶联氨基酸，其中通过茚三酮测定法来监控偶联反应的完成(Kaiser，E.，Colescott，R.L.，Bossinger，C.D.，Cook，P.I.Anal Biochem.34(1970)595-598)。通过用TFA/EDT/H₂O/TIS(94％/2.5％/2.5％/1％)溶液进行处理来使经合成的肽与树脂分开，用乙醚进行沉淀，并冻干72小时。通过用DMSO进行氧化来达到经形成二硫桥的肽环化(Andreu，D.，Albericio，F.，Solé，N.A.，Munson，M.C.，Ferrer，M.和Barany，G.，Pennington，M.W.和Dunn，B.M.(Eds)，Peptide Synthesis Protocols，Methodsin Molecular Biology，Totowa，NJ，1994，pp.91-169)。在所有情况下，肽通过RP-HPLC进行纯化，并且将经收集的级分独立地通过分析型RP-HPLC进行分析。通过合并具有等于或高于99％的色谱纯度的级分而获得每种肽的最终制剂。所述肽的最终制剂的分子量通过ESI-MS质谱法来进行验证。

关于荧光素化的蛋白质与细胞表面的结合的测定法

通过来自健康供体的总血液样品的红细胞裂解来获得外周血单核细胞，所述血液样品通过静脉穿刺而收集在BD Vacutainer K₃ EDTA小瓶中。以2ml/100μl血液的比例向血液中加入裂解溶液(0.3Mol/L NH₄Cl，20mMol/L KHCO₃，20μMol/L Na₂EDTA)，然后将样品于25℃温育大约15分钟，其中以3分钟的间隔摇动样品。通过冷却至4℃来终止反应，并且通过在350xg下离心5分钟来将细胞与裂解溶液相分开。在去除上清液后，细胞用PBS pH7.4，1％牛血清白蛋白(BSA)，0.01％ NaN₃，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂进行洗涤。

在经培养的Vero细胞的情况下，无需使用蛋白酶，通过与PBS pH7.4，5mM EDTA于37℃温育10分钟，并轻轻敲击锥形瓶外部，来使它们与培养瓶的表面分开。

将如上所述经收集和洗涤的细胞在固定溶液(PBS pH 7.4，2％低聚甲醛、0.01 ％NaN₃，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂)中于4℃温育30分钟，然后通过于4℃在350xg下离心5分钟来去除固定溶液。所述测定法通过如此来进行：在总体积100μL的荧光素化的蛋白质的每种稀释物(在PBS pH 7.4，1％BSA，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂中进行稀释)中于4℃将1 x 10⁵细胞温育1小时。每个实验包括具有未处理的细胞的对照。在温育后，将细胞洗涤2次，并再次在固定溶液中温育。荧光强度在PAS III仪器(Partec，Germany)上通过流式细胞术来进行定量。关于每个实验点的值由关于最低限度20000个细胞的测量进行计算。

在Vero细胞中的病毒感染的抑制

让Vero细胞在24孔平板中生长至大约90％汇合，并用不含FCS的MEM培养基洗涤2次。随后，根据该测定法的目的，添加包含蛋白质或抗体的稀释物并于37℃温育1小时。在温育后，以0.1的感染复数添加病毒，随后于37℃继续温育1小时。在第二次温育结束时，通过洗涤来去除未结合的病毒，并将细胞在高密度培养基(补充有非必需氨基酸、1％FCS、1％羧甲基纤维素的MEM)中于37℃温育5天，以便促进裂解噬斑的出现。通过用在0.15Mol/L乙酸钠中的0.1％萘酚蓝黑进行染色来显现噬斑。在每次测定法中的每个实验点使用2次重复，并且进行3次独立的测定。抑制百分比根据下式来进行计算：

在通过颅内接种DV而诱导的Balb/C小鼠脑炎模型中的保护测定法

将12只成年Balb/C小鼠(20g的平均体重)的组进行麻醉，通过颅内注射致死剂量的DV2来进行接种，并且每天进行观察，共21天。肽与病毒的混合物以相同方式进行接种。所接种的样品的体积是20μL。

实施例1

用于分离结合DV的DIII的蛋白质的亲和基质的获得

为了制备具有DIII作为用于分离人血浆蛋白质(其作为DV的潜在受体)的配体的亲和基质，克隆包含DV2的E蛋白的残基Met₂₈₉-Gly₄₀₀(SEQ ID.No.22)的重组蛋白质DIIIE2J，并在大肠杆菌中表达。

在IMAC后，如通过蛋白质电泳所评估的，获得的制剂具有高纯度，而银染色仅揭示出不含可检测的污染物的主要条带(图1B)。为了排除在电泳期间可能与DIIIE2J共迁移的污染物的可能存在，通过反相色谱法(rp-HPLC)来分析该制剂。将80μg DIIIE2J的等分试样加载到C4反相柱(4.6 x 250mm)(J.T.Baker，USA)中。所获得的色谱图(图1A)仅具有单重峰，这证实了该制剂的高度同质性。

DIII具有大量由中和抗体所识别的地形表位(topographicalepitope)，并且在所有这些情况下，已显示，抗体识别在还原DIII的2个半胱氨酸之间的二硫桥后被取消(Roehrig JT，Bolin RA，KellyRG(1998)Monoclonal antibody mapping of the envelopeglycoprotein of the dengue 2 virus，Jamaica Virology 246：317-28)。为了验证蛋白质的分子量和证实二硫桥的存在，将通过rp-HPLC纯化的DIIIE2J的等分试样进一步通过质谱法进行分析。如可从图2中看出的，DIIIE2J制剂的主要种类具有13515.00Da的质量，如果通过大肠杆菌甲硫氨酰-氨肽酶(MAP)从该分子上去除N-末端Met，那么这与预期值相差1.32Da(图2B)。该结果证实，N-末端Met已通过MAP而从DIIIE2J制剂中均一地去除，但质量的差异并不能够证实二硫桥的存在或不存在。

为了进一步检查二硫桥的状态，将经rp-HPLC纯化的DIIIE2J的等分试样分成具有相同体积的2个级分。所述级分之一用二硫苏糖醇进行还原，这之后这2个级分都通过用碘乙酰胺进行处理而烷基化，随后进行ESI-MS分析。结果显示，烷化剂仅在事先用二硫苏糖醇处理的那个级分中掺入，这由增加的13631.0Da的质量而得到证明，该质量与关于还原的且脲基甲基化的种类的预期值仅相差1.2Da。仅经历烷基化无事先的还原的那个级分具有与未处理的蛋白质相同的质量(13515.00Da)，这证实了DIIIE2J的制剂不具有游离的巯基，以及该分子的2个Cys残基键合形成DIII的特征性二硫桥。

在斑点印迹测定法中进行该蛋白质的抗原表征。如可从图3中看出的，DIIIE2J被鼠类抗-DV血清强烈结合，这显示出显著的对于同种血清型的特异性(图3)。该蛋白质还被来自在不同流行病学背景下被病毒感染的人的血清所识别。这个结果证明，所述DIIIE2J制剂重现了在完整的病毒颗粒情况下存在的结构元件。

为了用作亲和色谱配体，重要的是确定固定的DIIIE2J是否能够重现在病毒表面的情形中它所参与的相互作用。为了这个目的，将DIIIE2J固定在Sepharose4B上，并且就与最初针对完整的病毒颗粒而产生的抗体的结合来进行测试。将20μL DIIIE2J亲和树脂的等分试样在结合缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％ Tween-20)中进行平衡，并与在结合缓冲液中稀释的抗体样品于25℃温育30分钟(在每个步骤中，通过在500xg下离心5分钟来去除添加的溶液)。用结合缓冲液充分洗涤树脂后，通过在20mM Gly pH 2.5中以及在SDS-PAGE(还原条件)样品缓冲液中顺次温育来洗脱经结合的抗体。在这个实验中获得的结果证明，固定的重组蛋白质能够特异性地结合通过用整个病毒粒子进行免疫接种而获得的抗体(图4)，这证实它模拟了暴露在病毒粒子上的DIII的相互作用表面，并因此它可以用作用于分离潜在的病毒受体的配体。

实施例2

人A2M与DV2的E蛋白的DIII直接相互作用

在人血浆中细胞受体的可溶性片段的存在是广泛已知的。另一方面，还已知向培养基中添加血清对于培养的细胞被DV感染的效率具有显著影响(Nash DR，Halstead SB，Stenhouse AC，McCue C.(1971)Nonspecific Factors in Monkey Tissues and Serum CausingInhibition of Plaque Formation and Hemagglutination by DengueViruses.Infect Immun.3：193-199)。因此，为了筛选DV的潜在细胞受体，决定尝试从人血浆中分离对于E蛋白的DIII具有亲和力的蛋白质。从30-40岁的、没有可检测的针对该病毒的抗体的健康供体中获得的血浆样品通过于56℃温育1小时来灭活，并且通过离心(5000xg，10分钟)从溶液中去除沉淀的蛋白质。将上清液贮存于-80℃直至使用。

与DIII结合的蛋白质的分离通过亲和色谱法来进行。将4份如上所述进行加工的人血浆与1份100mM HEPES pH6，1.75M NaCl，25mM CaCl₂，5mM MgCl₂相混合，并以10cm/h的流速加载到填充有DIIIE2J亲和树脂的柱(1.5cm直径x1.2cm高度)中。将样品在这些条件下在柱上于25℃再循环另外4小时，然后用100个柱体积的20mMHEPES缓冲液(pH 6)，0.35M NaCl，5mM CaCl₂，1mM MgCl₂充分洗涤柱。另外，用20mM HEPES缓冲液pH6，0.5M NaCl，5mM CaCl₂，1mM MgC l₂洗涤柱。结合的蛋白质的洗脱通过下列方式来进行：将10mMGly pH 2.5加载到柱中，并用UV检测器监控洗出液在280nm处的吸光度。

为了鉴定在洗出液中存在的蛋白质种类，将100μL等分试样的经收集的级分用10％三氯乙酸进行沉淀，重悬浮于20μL样品缓冲液中，并经历SDS-PAGE。切出蛋白质条带，并用胰蛋白酶进行消化，随后进行洗脱的蛋白质的ESI-MS分析。

检查对于每个蛋白质条带所获得的质谱，并且使具有最高强度的信号片段化，以获得关于所述肽的序列信息。在所有情况下，经测序的肽相应于人血浆蛋白质的胰蛋白酶消化片段(表1)。

表1.在使用固定的DIIIE2J进行的亲和色谱法的洗出液中鉴定出的蛋白质的概括

1：基于通过ESI-MS分析获得的数据，通过MASCOT(Perkins DN，PappinDJ，Creasy DM，Cottrell JS(1999)Probability-based proteinidentification by searching sequence databases using massspectrometry data.Electrophoresis 20：3551-67)鉴定的蛋白质在Swiss-Prot数据库中的登录号。

除了参与与固定的配体直接地、特异性地相互作用的蛋白质之外，在亲和色谱法的洗出液中存在与这种结合无关的其他分子。白蛋白(Q645G4，表1)以及IgM和IgG免疫球蛋白(P04220和P01834，表1)是在使用具有不同特异性的配体进行的亲和色谱法实验期间洗脱出的常见污染物，这可能是由于其在人血浆中的高丰度，在人血浆中它们的存在浓度对于白蛋白可以为大约35mg/mL，对于IgG可以为12-15mg/mL和对于IgM可以为5mg/mL。免疫球蛋白的存在还可以通过在人血浆的某些抗体中存在与DIIIE2J的交叉反应性来解释，所述抗体实际上是对于其他抗原特异的。

在经鉴定的蛋白质的那组内存在A2M(P01023，表1；Seq.ID.2)被认为是特别令人感兴趣的。已知A2M充当其他分子的载体蛋白，这可以导致由其A2MR细胞受体(Seq.ID.3)介导的胞吞作用。此外，在色谱法洗出液中还存在这样的蛋白质，其可能不参与与固定的配体的直接相互作用，并且可能是与其他经鉴定的蛋白质所形成的三元复合物的一部分，所述其他经鉴定的蛋白质的确结合该配体(Gavin AC，Bosche M，Krause R，Grandi P，Marzioch M，Bauer A，Schultz J，Rick JM，Michon AM，Cruciat CM，Remor M，Hofert C，Schelder M，Brajenovic M，Ruffner H，Merino A，Klein K，Hudak M，DicksonD，Rudi T，Gnau V，Bauch A，Bastuck S，Huhse B，Leutwein C，Heurtier MA，Copley RR，Edelmann A，Querfurth E，Rybin V，DrewesG，Raida M，Bouwmeester T，Bork P，Seraphin B，Kuster B，NeubauerG，Superti-Furga G(2002)Functional organization of the yeastproteome by systematic analysis of protein complexes Nature.415：123-4)。

为了确定A2M的分离是否是由于与DIIIE2J的直接相互作用，在独立的实验中将100μg等分试样的在PBS pH7.4中的后面一种蛋白质与100μg未激活的或激活的(通过甲胺处理)人A2M进行温育。混合物中蛋白质的摩尔浓度如下：对于DIIIE2J为1.4 x 10^-4mol/L，和对于人A2M的2种变体为7 x 10^-7Mol/L。将反应体系于37℃温育1小时，然后以0.4mL/分钟的流速加载到事先用50mM NaHPO₄缓冲液(pH 7.0)/300mM NaCl平衡的10/30 Superdex 200HR凝胶过滤柱中(图5E和F)。在加载经混合的蛋白质之前，通过使用纯化的蛋白质实施色谱运行，对于DIIIE2J和A2M中的每一种分别建立洗脱图谱和保留时间(图5B-D)。在所有情况下，将从每次运行收集的级分用丙酮进行沉淀，并通过15％SDS-PAGE进行分析，使与每个级分的总体积的比率保持恒定(1/5)。图5G证明了DIIIE2J与A2M的2种变体之间复合物的形成，这通过高分子量级分中出现相应于DIIIE2J的条带而表现出来。这个结果构成了A2M和DV包膜蛋白的DIII之间的物理相互作用的第一个证据。

实施例3

通过Biacore来测定DIIIE2J和A2M之间的相互作用的亲和常数

为了估计DIIIE2J和人A2M之间的相互作用的强度，根据在“材料和方法”中所描述的操作程序，将1600RU的DIIIE2J共价固定在CM5芯片上(通道1，图6A)(Biacore，Sweden)。

在初步实验期间(图6B和C)，可以证实芯片表面上存在有固定的蛋白质，所述蛋白质暴露出在病毒颗粒的情形中也是暴露的其表面区域。这种证实通过测量经固定的分子与经过用DV进行免疫接种而获得的抗体制剂的特异性相互作用来达到。特别地，与3H5单克隆抗体的结合(图6C)证明了地形表位的正确暴露和形成，这依赖于DIII的2个半胱氨酸残基之间的二硫桥的存在。

通过加载浓度为0.3μMol/L-3μMol/L的A2M，可以确定这2种蛋白质之间的相互作用是可饱和的以及可逆的(图6D)。所获得的缔合和解离曲线使得能够计算出，该相互作用具有10^-7Mol/L的量级的表观Kd。这个值可能表示在整个病毒粒子的情况下存在具有高得多的亲合力的相互作用，其中DIII作为多重拷贝围绕对称轴排列，并因此其中有利于与寡聚蛋白质例如A2M的多点结合。该相互作用是可逆的这一事实证实了这样的可能性，即A2M可以充当用于DV进入其宿主细胞的载体蛋白。

实施例4

A2MR受体的天然配体抑制DIII与Vero细胞的结合和病毒感染

RAP是LRP1的天然分子伴侣。这种蛋白质控制LRP1的活性，这可能通过介导构象变化来实现，所述构象变化阻止这种受体的各种配体的结合和/或内在化(Herz J，Goldstein JL，Strickland DK，HoYK，Brown MS.(1991)39-kDa protein modulates binding of ligandsto low density lipoprotein receptor-related protein/alpha2-macroglobulin receptor J Biol Chem.266：21232-8)。因此，RAP构成了理想配体以用于获得关于LRP1参与哺乳动物细胞中DV的胞吞作用的证据。

Vero细胞系已广泛用于研究DV与其细胞受体的相互作用的性质。这些细胞对于4种病毒血清型的感染是高度易感的。它们构成了用于评估针对DV的抗病毒活性的特别有利的工具，因为它们可以在测量裂解噬斑形成的抑制的测定法中使用。

由于这种细胞系衍生自猴肾细胞(https://www.atcc.org/)，并且在测定法中使用的A2MR受体的配体是人来源的，因此初步和必需的步骤是确证RAPR13和A2M_MeNH₂蛋白质与Vero细胞的结合。为此，使这些蛋白质荧光素化，并且使用流式细胞术来测量其与Vero细胞表面的结合。这2种分子在这种细胞系中显示出浓度依赖性的和可饱和的结合行为(图7A)。

在这种初次实验后，通过下列方式来确定RAPR13是否能够抑制A2M-MeNH₂与Vero细胞的结合：使预固定的细胞与荧光素化的A2M_MeNH₂和RAPR13或人重组EGF(作为对照)的混合物于4℃温育30分钟，其中使用以100倍摩尔过量的未标记的蛋白质。获得的结果证明了对于在RAPR13存在下与A2M_MeNH₂进行温育的细胞而言出现荧光的减少，这与在重组人EGF存在下与A2M_MeNH₂进行温育的样品相反(图7B)。这些结果确证，A2M_MeNH₂和RAPR13均以特异性和功能性的方式与Vero细胞中的A2MR受体结合。

关于感染抑制的测定法在接种有处于大约90％汇合的Vero细胞单层的24孔平板上进行。调整病毒的稀释度以获得大约20个裂解噬斑/孔。当在添加病毒之前将细胞与RAPR13蛋白或与针对A2MR受体的多克隆抗体制剂进行预温育时，该测定法的结果显示出裂解噬斑数目的显著减少(表2)。当将细胞与BSA或与针对无关抗原的抗体制剂进行预温育时，没有显著的减少。

表2.通过A2MR受体的天然配体或通过抗-受体抗体来抑制Vero细胞的感染的测定法¹

1.结果表示3次独立测定的平均值。在该测定法中使用的病毒毒株是DV1的West Pac 74，DV2的S16803，DV3的CH53489和DV4的TVP360。蛋白质RAP13和BSA在该测定法中以100μg/mL的浓度使用。α-A2MR：通过用A2MR受体进行免疫接种而获得的抗体。α-NR：通过用无关蛋白质进行免疫接种而获得的抗体。这两种抗体制剂以1/100的稀释度进行使用。

类似地，借助于裂解噬斑减少测定法可以显示出，用RAPR13蛋白质对于DV2而获得的感染抑制依赖于在实验中使用的蛋白质浓度(图8)。这个结果构成了A2MR受体参与了介导DV进入其靶细胞中的强有力证据。

实施例5

结构上受约束的、地形的(topographical)合成肽的设计

尽管在FV与宿主细胞的结合中DIII所发挥的基本作用是广泛公认的，但不存在关于DIII-衍生的合成肽具有抑制DV感染的潜在活性(在nM或几μM范围内)的报道。几个原因解释了这种情况：1)用合成肽来模拟整个蛋白的结构决定子并不重要，因为参与蛋白质-蛋白质相互作用的表面斑片通常是地形的，其由在三维结构上紧密地定位但沿着蛋白质序列分开的残基组成；2)通常，这些相互作用斑片是相当大的，其面积从数百到几千

这个量级大于小肽的总表面；3)肽在溶液中具有柔韧的结构，这暗示在采用对于与其结合伙伴的相互作用而言生物学上相关的结构后，将会存在构象熵的相当大的丧失，并因此，肽-蛋白质复合物的亲和力将明显低于蛋白质-蛋白质复合物的亲和力；4)肽在溶液中可以采取相对稳定的构象，但这些构象可能不同于由肽在其天然蛋白质情形中所采用的构象；5)病毒与其蛋白质受体的结合可能涉及多点相互作用并因此将具有大亲合力，因为病毒表面具有多个对称的DIII拷贝。这对于关于该受体而言所述病毒和所述肽之间的竞争造成高的能量屏障。

在关于A2MR受体与其天然配体之间的相互作用的结构-功能关系的研究期间所获得的数据已显示了在A2MR配体表面上的碱性残基聚簇和/或Lys/Arg侧链所发挥的重要作用。这是A2M(SEQ ID.2)的Lys1370和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A的Lys57的情况，它们如果通过定点诱变而被改变，则导致配体与受体的结合的显著下降(Arandjelovic S，Hall BD，Gonias SL(2005)Mutation of lysine 1370 in full-length humanalpha2-macroglobulin blocksbinding to the low densitylipoprotein receptor-related protein-1.Arch Biochem Biophys.438：29-35，Wedekind JE，Trame CB，Dorywalska M，Koehl P，RaschkeTM，McKee M，FitzGerald D，Collier RJ，McKay DB.(2001)Refinedcrystallographic structure of Pseudomonas aeruginosa exotoxinA and its implications for the molecular mechanism of toxicityJ Mol Biol.314：823-37)。类似地，其他研究已表明了apoE蛋白的由残基136-150形成的碱性聚簇以及Arg172的重要(Raussens V，Slupsky CM，Ryan RO，Sykes BD(2002)NMR structure and dynamicsof a receptor-active apolipoprotein Epeptide.J Biol Chem.277：29172-80)。

另一方面，A2MR受体的配体结合结构域，和一般地，LDL受体家族的所有成员的配体结合结构域的特征在于，由于存在可以与相互作用配体上的碱性残基有利地相互作用的暴露的保守酸性残基，因而在配体结合表面上具有显著阴性的静电势。例如，VLDL受体片段和人鼻病毒2(属于鼻病毒的次要群)之间的复合物的晶体学结构显示了病毒衣壳的VP1蛋白的LYS224与该受体的残基ASP139和GLU137之间的紧密相互作用(Verdaguer N，Fita I，Reithmayer M，Moser R，BlaasD(2004)X-raystructure of a minor group human rhinovirus boundto a fragment of its cellular receptor protein.Nat Struct MolBiol.11：429-34)。另外，VP1的Lys224的脂肪族侧链与该受体结构域的Trp132相互作用，所述Trp132虽然在A2MR的所有配体结合结构域中不是严格保守的，但是它是这个位置上最常见的氨基酸(在31个结构域中的20个结构域中出现，而Leu在4个结构域中、Phe在3个结构域中、Arg在2个结构域中以及Lys和Ser各仅在1个结构域中出现)(图9)。表3显示了A2MR受体的配体结合斑片，其由在结构上等价于VLDL受体中的Trp132、ASP135、GLU137和ASP139的位置来定义。

表3.A2MR受体中的配体结合斑片¹

1.该表中的编号相应于人A2MR的序列(SEQ ID No.3)。结构域：在SwissProt数据库中人A2MR受体的配体结合结构域的名称。第一个残基和最后一个残基：该受体的不同配体结合结构域的第一个和最后一个残基的位置。长度(aa)：配体结合结构域的氨基酸总数目。P1-4：形成配体结合斑片的残基。

考虑到Lys/Arg残基，和一般地，静电电荷在与LDL受体家族的配体结合结构域的相互作用中的重要性，因而检查了在DV1-4的相应DIII三维结构模型的所暴露的上表面和侧表面中荷电残基的定位。

对于这种分析，使用DV2和DV3的E蛋白的结构(在蛋白质数据库中的条目为1oan和1uzg)作为模板，以用于构建DV1和DV4的E蛋白的3D结构模型，其中使用MODELLER程序(A.Sali，T.L.Blundell.(1993)Comparative protein modelling by satisfaction ofspatial restraints.J.Mol.Biol.234：779-815)。如可从图10中看出的，存在相应于在4种血清型中保守的赖氨酸侧链的4个表面斑片。除了由DV1、2和4的Lys310(在DV3中为Lys308)所定义的斑片外，其余斑片在它们在一级结构中的定位水平上不是严格保守的，而是在它们在蛋白质表面上的地形位置方面是严格保守的。这可能是由于在该蛋白质的3D结构中在邻近位置处的相关突变的出现，以及由于赖氨酸侧链的柔韧性。这些斑片中的2个位于暴露的表面上，相应于由链A、B、C′、D和E所限定的β折叠(图11A)，而其余斑片位于侧/上表面中，相应于或邻近于FG β发夹。

DIII表面上的4个保守赖氨酸斑片中的至少一个，和特别地，位于FG β发夹的暴露表面上或与FG β发夹的暴露表面邻近的2个斑片，与表3中定义的A2MR受体的配体结合斑片有利地相互作用。

为了设计可以抑制FV感染的基于DIII的肽，选择Ser376-Trp391区段(DV2的残基编号)作为出发点。这个区段包含FG β发夹，其将的总面积暴露于溶剂，并且是在成熟病毒粒子结构的情形中仍暴露的结构域的上/侧表面的一部分。已报道，这个区域中的几个突变影响阻断病毒与细胞相互作用的中和抗体的结合，或影响病毒表型。这个区段的主链的结构在可得的DV2和DV3的E蛋白晶体学结构之间是保守的(图11B)。这个结构保守还包括F-G环，其具有在残基Glu383-Gln386(根据SEQID1的残基编号)之间的II型β转角。FG区段主链的结构保守也可应用于DV1和DV4，因为考虑到相应序列之间的相似性程度，加上这些病毒的E蛋白的3D模型之间的结构相似性，其分别通过基于DV2和DV3坐标的同源性建模而获得(图11B)。

图11(C和D)显示了基于DV2和DV3的FG发夹而设计的合成肽HDIII2CL和HDIII3CL的一级结构和3D模型。

所述合成肽包括2个半胱氨酸，一个在N-末端处和另一个在C-末端处。如由这些肽的三维结构模型所表明的，这些残基可以形成在结构上与β发夹结构相容的二硫桥(图11C和D)。在这些模型中，半胱氨酸的α碳相隔5.7

这是二硫桥的通常距离。经由二硫桥的环化通过减少其主链的构象熵来促成该肽的发夹结构的稳定化。

该设计允许在该肽的F和G链的主链之间形成6个氢键，从而进一步增加了它的稳定性(图C和D)。残基4和6(链F)以及残基13、15和17(链G)是疏水性的，并且朝向发夹的相同面，这保证了它们之间有利的疏水性相互作用。F β链的残基4-6在β碳上分叉，并且特征在于对于采取β/延伸结构的高倾向。

肽HDIII3CL(SEQ ID.7)包括残基Lys11和Lys14，相应于DIII的2个赖氨酸斑片，其构成了用于与A2MR的配体结合结构域的有利相互作用的推定位点。肽HDIII2CL(SEQ ID.5)仅具有由Lys14形成的1个斑片；而HDIII1CL(DV1，SEQ ID.6)具有2个斑片，和HDIII4CL(DV4，SEQ ID.8)没有。

此外，设计了环肽HDIII2Cs(Seq.ID.4)和pepDIII-1，分别相应于DV2的E蛋白的序列Ile379-Lys388和Gly381-Gln386(图12A)。这2种肽包括在N-和C-末端处的半胱氨酸以用于经由二硫桥的其环化，所述二硫桥在结构上与天然蛋白质的3D结构相容。肽HDIII2Cs类似于肽HDIII2CL，但仅包括F和Gβ链的一部分。另一方面，肽pepDIII-1仅包括F-G环。

实施例6

肽HDIII2Cs重现了DV2的DIII的地形表位

为了评估mAb3H5对于肽HDIII2Cs的识别，制备肽-BSA缀合物并通过用这种抗体的Western印迹法进行分析(图12B)。重组蛋白质PD5用作这种测定法的阳性对照。这种蛋白质由DV2的E蛋白的DIII(残基286-426)形成，所述DIII与脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的硫辛酰胺脱氢酶(P64k)的C-末端融合。PD5已作为疫苗候选物进行了评估，并且能够引起保护性免疫应答，如通过在小鼠和猴的感染模型中的病毒攻击所评估的(Hermida L.，RodriguezR.，Lazo L.，Silva R.，Zulueta A.，Chinea G.，Lopez C.，GuzmánM.G.和Guillen G.(2004)Adengue-2 Envelope fragment insertedwithin the structure of the P64k meningococcal protein carrierenables a functional immune response against the virus in mice.J Virol Methods.115：41-49)，这证明这种蛋白质展示出该病毒的这个区域的关键表位。

单克隆抗体3H5通过用DV2制剂进行免疫接种来获得(Gentry MK，Henchal EA，McCown JM，Brandt WE，Dalrymple JM.(1982)Identification of distinct antigenic determinants on dengue-2virus using monoclonal antibodies Am J Trop Med Hyg.31(Pt1)：548-55)，并且以血清型-特异的方式识别在DIII上的表位(依赖于二硫桥的存在)。这种抗体有效地中和血清型2的病毒。公开的数据表明，在这种mAb的中和活性和其抑制病毒与其细胞受体结合的能力之间存在高度相关性(He RT，Innis BL，Nisalak A，UsawattanakulW，Wang S，Kalayanarooj S，Anderson R(1995)Antibodies thatblock virus attachment to Vero cells areamajor componentofthe human neu tralizing antibody response againstdengue virustype 2 J Med.Virol.45：451-61)。这种抗体对于肽HDIII2Cs的特异性识别证明，该肽重现了具有极大功能重要性的DIII表面的地形表位。

用于表征地形肽的工具之一是抗-肽血清的获得和表征。为了收集支持下述假设的另外证据：所设计的肽重现了该病毒中E蛋白的等价区域的抗原特征，使用HDIII2Cs-KLH缀合物作为免疫原而开始免疫接种方案。该方案包括给10只BalbC小鼠皮下施用5剂HDIII2Cs-KLH缀合物。经免疫接种的动物的血清的抗-肽滴度(1/2700)通过使用间接ELISA测定法来进行测定，其中用HDIII2Cs包被平板并比较免疫血清的反应性与其免疫前对照的反应性。

为了评估肽HDIII2Cs是否能够引起构象依赖性抗体应答，施行斑点印迹测定法，其中将2片硝酸纤维素膜用PD5蛋白和肽HDIII2Cs(未修饰的或者还原的且脲甲基化的)进行敏化(图12C)。该测定法证明，在其二硫桥丧失后，关于血清对于PD5和该肽的识别的信号强度均减少。该测定法还证明，该肽被mAb3H5所识别，并且这种信号在该肽的还原和脲甲基化后丧失。

最后，在Western印迹测定法中评估了抗-肽血清对于通过感染Vero细胞而获得的病毒的识别，及其免疫沉淀³⁵S_DV2的能力。在Western印迹中，抗-HDIII2Cs血清识别在与由mAb3H5所识别的条带相同位置上的条带，相应于E蛋白的分子量(图13A)。在与免疫前血清进行温育的膜上不存在信号，这证明经由抗-肽应答所介导的识别是特异性的。最后，抗-HDIII2Cs血清能够免疫沉淀DV2的E蛋白(图13B)。

获得的结果证明，HDIII2Cs肽模拟了DV2的E蛋白的DIII的二硫桥依赖性表位，以及通过二硫桥而施加给该肽的构象限制对于在用这种抗原免疫接种后获得的抗体应答具有显著影响。因此，肽的环化对于正确模拟这种表位的结构是必需的。

实施例7

肽HDIII2CL是比肽HDIII2Cs更佳的表位结构模拟物

开始免疫接种方案，以便确定肽HDIII2CL是否能够引起比肽HDIII2Cs更佳的应答，基于在病毒颗粒上的这种抗原区域的构象特征来进行评估。所述免疫接种方案还包括肽HDIII2Cs和pepDIII-1(图12A)。与先前方案相类似地，这个实验使用肽-KLH缀合物作为抗原，并且遵循实施例6中描述的相同的按剂量给药和免疫接种途径。

所得到的抗-肽血清在间接ELISA测定法中进行测试，其中以3种变体形式用PD5和P64k包被平板：未修饰的、脲甲基化的、和还原的/脲甲基化的。抗-HDIII2Cs和抗-HDIII2CL血清以构象依赖性方式识别PD5蛋白，如由与还原的且脲甲基化的变体相比较而言当使用未修饰的蛋白质时具有更高的反应性所证明的(图14)。然而，二硫桥丧失对于该蛋白质被抗-HDIII2CL血清的识别的影响高于抗-HDIII2Cs血清，并且更好地再现了对于通过用病毒制剂免疫接种小鼠而获得的抗-DV2血清所看到的效应(图14)。这个结果显示，导致获得肽HDIII2CL的再设计达到了在病毒情形中在DIII的这个区域中存在的构象的更佳呈现。

实施例8

相应于FG转角的地形肽展示出针对DV的4种血清型的广谱抑制

用肽HIII2CL和HIII3CL来施行测定法(图11C、10D和15)，以便估计它们模拟DIII与细胞表面分子的相互作用的能力。该测定法使用生物素化的肽，以便促进有助于借助于链霉抗生物素蛋白-FITC缀合物在流式细胞术实验中来检测它们。图16描述了直方图，其显示了在与不同稀释度的肽HIII2CL和HIII3CL以及无关肽(0.3-0.02mg/ml)进行温育后，细胞中荧光的行为。结果显示，这两种肽都以浓度依赖性方式结合细胞表面(图16)，这暗示了该相互作用是特异性的。由肽HIII3CL所产生的直方图中的移动显著大于由HIII2CL所产生的那种。这个结果表明，肽HIII3CL建立具有更高亲和力的相互作用，这与下列事实相一致：在这种分子中存在对于与A2MR受体相互作用而言可能重要的2个赖氨酸残基(Lys11和Lys14，图10C和11D)，而在肽HIII2CL中它们之一不存在(Lys11，图10B和11C)。

DIII具有E蛋白的暴露表面的最可变区域之一。事实上，这个结构域的抗原特征之一是，针对这个区域所获得的抗体主要是血清型特异性的(Roehrig JT，Bolin RA，Kelly RG(1998)Monoclonal antibodymapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus，Jamaica Virology 246：317-28)。然而，在用不同DV血清型的抑制测定法期间，所述肽展示出广谱抑制活性，其有效抑制同种以及异种血清型的毒株的感染(表3)。实际上，在测定浓度(0.1mg/ml)下，除了关于DV3的肽HIII4CL外，在其余测定点处均观察到高于50％的抑制。

表3.所设计的肽对于DV的4种血清型的抑制

所显示的结果相应于在Vero细胞上施行的病毒噬斑数目减少测定法。肽以0.1mg/ml的浓度使用。所述符号表示与其中在未用所述肽进行事先处理的情况下将细胞与病毒进行温育的对照相比较，在所述实验条件下病毒噬斑数目减少的程度。(+)50％或更高的减少，(+/-)噬斑数目的10-50％的减少，(-)噬斑数目的小于10％的减少。

图17呈现了另外的结果，其证实了所述肽针对同种和异种血清型的强有力的抑制活性。肽HDIII2CL达到了针对其同种血清型(DV2)病毒的60％的感染抑制，和针对DV1的80％的感染抑制(图17B)。此外，肽HDIII3CL以与肽HDIII2CL相同或比其更高的效能抑制DV2感染(图17C)。在这两种测定法(图17B和C)中，肽HDIII2CL和HDIII3CL具有比其余所测试的肽(3H5pept、NR3pep和pepDIII-1)明显更佳的效应。

基于在不同FV的E蛋白之间的结构相似性，设计了相应于对于动物和人健康重要的其他FV的相同DIII区域的肽(图18)：黄热病毒(Seq.ID.10)、西尼罗河病毒(Seq.ID.11)、日本脑炎病毒(Seq.ID.12)、蜱传脑炎病毒(Seq.ID.13)、库京病毒(Seq.ID.14)、玻瓦散病毒(Seq.ID.15)、兰加特病毒(Seq.ID.16)、墨累山谷脑炎病毒(Seq.ID.17)和圣·路易脑炎病毒(Seq.ID.18)。

实施例9

肽HDIII2CL改变A2MR和RAPR13与A2MR受体的相互作用

为了获得与A2MR受体的相互作用的直接证据，研究了所设计的肽之一对于A2MR的天然配体与Vero细胞的结合的影响。该测定法用荧光素化的A2M和RAPR13来进行，其中测量在浓度增加的肽HDIII2CL存在下它们与Vero细胞的结合。与细胞结合的蛋白质的量通过流式细胞术来估计，其中使用重组人EGF(rhEGF)作为该实验的阴性对照，因为已知Vero细胞在其表面上表达EGF受体(Copp J，WileyS，WardMW，vander Geer P(2005)Hypertonic shock inhibits growth factorreceptor signaling，induces caspase-3 activation，and causesreversible fragmentation of the mitochondrial network.Am JPhysiol Cell Physiol.288：C403-15)。

图19显示了肽HDIII2CL的存在如何增加与表面结合的A2M和RAPR13的量，然而，其对于rhEGF的结合没有影响。用作该测定法的对照的肽3H5pept的存在不产生在与表面结合的RAPR13的量方面的变化。这些结果表明，肽HDIII2CL对于A2M和RAPR13与其细胞受体的相互作用的影响对于这些分子而言是特异性的。然而，观察到的效应是配体与细胞的结合增加而不是减少这一事实暗示，所述肽不结合与这些分子相同的在该受体上的位点。在那种情况下，观察到的效应可以归因于由所述肽的结合所触发的构象变化，这种构象变化有利于A2M或RAPR13的结合。通过由不同配体的结合所介导的别构效应来调节配体的相互作用是可能的，其中考虑到呈递出这种受体的多个配体结合结构域的结构(Herz J，Strickland DK.(2001)LRP：amultifunctional scavenger and signaling receptor.J Clin Invest.108：779-84)。事实上，这种相同机制被用于解释RAP对于A2MR配体的结合和/或内在化的抑制，所述A2MR配体实际上结合与在A2MR结构中由RAP所占据的那些结构域明显远离的A2MR结构域。

实施例10

激活的A2M对于DV感染的抑制由与病毒的溶液中相互作用所介导

为了获得DV与A2M的相互作用的进一步证据，在Vero细胞感染抑制测定法中使用该蛋白质的2种变体，即激活的和未激活的。将病毒制剂与激活的A2M的溶液进行温育，所述激活的A2M的浓度高于由这种蛋白质变体所达到的生理学浓度。将等摩尔浓度的未激活的A2M和无关蛋白质的溶液用作阴性对照。

在图20A中观察到，将病毒与浓度增加的激活的A2M进行预温育以剂量依赖性方式阻断了病毒感染。非常有趣的结果是：在Vero细胞中抑制50％病毒感染的激活的A2M的浓度与对于激活的A2M与DIIIE2J蛋白的相互作用所测定的亲和常数(kD 10^-7mol/L，参见实施例3和图6D)相一致。这个结果暗示，在这个实验中，感染的抑制是由激活的A2M与病毒的相互作用介导的，而不是由于竞争结合细胞表面上的A2MR。激活的A2M还抑制Vero细胞的DV血清型1和3感染(图20C)。

为了证实感染的抑制是由于病毒与激活的A2M的溶液中相互作用，在与细胞进行温育之前将该蛋白质的2种变体与病毒制剂温育增加的时间间隔。图20B中的结果显示，抑制效应依赖于温育时间，这与由该蛋白质与病毒颗粒的直接相互作用所介导的抑制相一致。有趣的是，对于长于30分钟的温育时间，未激活的A2M使病毒感染增加高达50％。这个结果暗示，在温育期间产生的少量的激活的A2M能够增加感染效率。事实上，这种情况更好地反映了什么才是关于病毒与A2M在体内的相互作用的实际生理学情况，其中由于A2MR在清除A2M-蛋白酶复合物方面的高效率，激活的A2M以痕量进行循环(LiY，LuW，Marzolo MP，Bu G(2001)Differential functions of members ofthe low density lipoprotein receptor family suggested by theirdistinct endocytosis rates.J Biol Chem.276：18000-18006；Verges M，Bensadoun A，Herz J，Belcher JD，Havel RJ(2004)Endocytosis of hepatic lipase and lipoprotein lipase into ratliver hepa tocytes in vivo is mediated by the low densitylipoprotein receptor-related protein.J Biol Chem.279：9030-9036)。

实施例11

纯化的A2MR抑制DV对Vero细胞的感染

还研究了可溶性A2MR是否能够抑制DV感染。为此，从健康供体的人血浆中纯化出该受体的α链，其中这种蛋白质已知以3.7-10.8μg/mL的浓度进行循环(Quinn KA，Grimsley PG，Dai YP，Tapner M，Chesterman CN，Owensby DA(1997)Soluble low density lipoproteinreceptor-related protein(LRP)circulates in human plasma.JBiol Chem.272：23946-23951)。300mL冷冻人血浆的样品通过离子交换色谱法进行预分级，其中使用填充有DE-52(Whatman，UK)并用Tris 50mM，60mM NaCl，1mM EDTA pH6平衡的柱。所述级分通过浓度增加的NaCl的阶式梯度(step gradient)来进行洗脱，并且通过用生物素化的配体(即MeNH₂_A2M和RAPR13)的配体印迹分析就A2MR的存在来进行测试。使用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物来检测生物素化的配体的结合。

将包含受体的级分逆缓冲液Tris 50mM，120mM NaCl pH7.4，1mM CaCl₂，0.05％ Tween 20进行透析，并加载到含固定的MeNH₂_A2M的柱中，所述MeNH₂_A2M是由LDLR家族成员中的A2MR唯一地识别的配体。在洗脱受体之前，柱用仅包含0.5M NaCl的平衡缓冲液进行充分洗涤。关于A2MR的特异性洗脱，使用缓冲液Tris 50mM，0.5M NaClpH6，10mM EDTA，0.05％ Tween 20(图21A)。将来自亲和色谱法的不同级分逆PBS pH7.4，1mM CaCl₂进行透析，并通过经0.2μM进行过滤来灭菌。

SDS-PAGE分析显示出在2个级分(即用0.5M NaCl洗脱的级分，和相应于用于A2MR洗脱的特异性条件的级分)中的区别性的蛋白质条带模式。后一个级分显示出迁移至与A2MR的α链的分子量(400-500kDa)相一致的位置处的单个蛋白质条带(图21B)。

在DV2-噬斑减少中和测定法中在Vero细胞中评估这些亲和色谱法级分。为此，将包含100个感染性病毒颗粒的病毒制剂与不同级分以25μg/mL的蛋白质浓度于25℃预温育1小时。接下来，将病毒加入至Vero细胞单层中，并允许感染于37℃发生45分钟。此后去除病毒/蛋白质混合物，用新鲜培养基洗涤细胞，并且最后将细胞在高密度培养基中于37℃温育5天。

这个测定法的结果显示，使用相应于用于该受体的特异性洗脱的条件的级分有效地中和DV2感染(图21C)。这个级分还在由致死剂量的DV2的颅内感染所诱导的小鼠脑炎模型中展示出显著的保护效应(图21D)。事实上，该保护水平类似于通过将病毒与有效的中和性mAb 4G2(25μg/mL)进行预温育所获得的保护水平。

实施例12

肽HDIII3CL在小鼠模型中保护小鼠免于登革脑炎

将登革脑炎的小鼠模型用于研究肽HDIII3CL保护不受DV2感染的潜能。12只小鼠的组用与15μg和1.5μg肽HDIII3CL相组合的致死剂量的DV2进行接种。作为阴性对照，使用这样的肽，所述肽的组成为：具有已知的糖胺聚糖结合活性的14个氨基酸的片段，随后为与DV包膜蛋白无关的序列的16个氨基酸的片段。阴性对照肽以与肽HDIII3CL的最高剂量等摩尔的量进行使用。另一个组用相同的病毒制剂(但与25μg/mL的mAb 4G2进行预温育)进行接种以作为保护的阳性对照。

如在图22中可以观察到的，对于用最高剂量的肽进行接种的而言，肽HDIII3CL能够保护56％的小鼠。相应于1.5μg肽/动物的组显示出与肝素结合肽相似的保护水平，与用单独的病毒进行接种的组没有统计学上显著的差异，如通过Kaplan-Meier统计(时序检验)所评估的。

连同这种肽在体内模型中能够抑制DV感染的这一证据一起，肽HDIII3CL针对用DV2的致死攻击的保护作用也证实了该肽保护不受DV异种血清型感染的能力。

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<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>495

<212>PRT

<213>登革病毒2型

<400>1

<210>2

<211>1474

<212>PRT

<213>智人

<400>2

<210>3

<211>5144

<212>PRT

<213>智人

<400>3

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>登革病毒2型

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(12)

<223>半胱氨酸1和12之间的键

<400>4

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>登革病毒2型

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>5

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>登革病毒1型

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>6

<210>7

<211>18

<212>PRT

<213>登革病毒3型

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>7

<210>8

<211>18

<212>PRT

<213>登革病毒4型

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>8

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>登革病毒2型

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>9

<210>10

<211>18

<212>PRT

<213>黄热病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>10

<210>11

<211>18

<212>PRT

<213>西尼罗河病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>11

<210>12

<211>18

<212>PRT

<213>日本脑炎病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>12

<210>13

<211>14

<212>PRT

<213>蜱传脑炎病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(14)

<223>半胱氨酸1和14之间的键

<400>13

<210>14

<211>18

<212>PRT

<213>库京病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>14

<210>15

<211>14

<212>PRT

<213>玻瓦散病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(14)

<223>半胱氨酸1和14之间的键

<400>15

<210>16

<211>14

<212>PRT

<213>兰加特病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(14)

<223>半胱氨酸1和14之间的键

<400>16

<210>17

<211>18

<212>PRT

<213>墨累山谷脑炎病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>17

<210>18

<211>18

<212>PRT

<213>圣·路易脑炎病毒

<220>

<221>DISULFID

<222>(1)..(18)

<223>半胱氨酸1和18之间的键

<400>18

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含限制酶Nde I的识别位点

<400>19

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含限制酶Xho I的识别位点

<400>20

<210>21

<211>5706

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒，其在T7启动子控制下

编码DV血清型2毒株Jamaica 1409的E蛋白的结构域III的合成

<400>21

<210>22

<211>121

<212>PRT

<213>登革病毒2型

<400>22

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含限制酶Nde I的识别位点

<400>23

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：包含限制酶Xho I的识别位点

<400>24

<210>25

<211>6267

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：质粒，其在T7启动子控制下编码人来源的

RAPR13蛋白的合成

<400>25

<210>26

<211>344

<212>PRT

<213>智人

<400>26

Claims

1.用于阻断黄病毒感染的方法，其包括干扰病毒包膜蛋白与在序列表中标识为Seq.ID.3的α2-巨球蛋白受体，或与在序列表中标识为Seq.ID.2的α2-巨球蛋白的相互作用。

2.根据权利要求1的方法，其中所述黄病毒是登革病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒、西尼罗河病毒、库京病毒、玻瓦散病毒、兰加特病毒或圣·路易脑炎病毒。

3.根据权利要求1和2的方法，其中所述病毒蛋白质的序列与在序列表中标识为Seq.ID.1的序列具有至少60％的同源性。

4.根据权利要求1和2的方法，其中用于所述病毒的受体的序列的片段为下列片段之一：位于在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的氨基酸残基25-66、或70-110、或852-892、或893-933、或934-973、或974-1013、或1014-1053、或1060-1099、或1102-1142、或1143-1182、或2522-2563、或2564-2602、或2603-2641、或2642-2690、或2694-2732、或2733-2771、或2772-2814、或2816-2855、或2856-2899、或2902-2940、或3332-3371、或3372-3410、或3411-3450、或3451-3491、或3492-3533、或3534-3572、或3573-3611、或3612-3649、或3652-3692、或3693-3733、或3739-3778之间的片段。

5.根据权利要求4的方法，其中用于所述病毒的受体的序列的片段与下列片段中的任一个具有至少60％的同源性：位于在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的氨基酸残基25-66、或70-110、或852-892、或893-933、或934-973、或974-1013、或1014-1053、或1060-1099、或1102-1142、或1143-1182、或2522-2563、或2564-2602、或2603-2641、或2642-2690、或2694-2732、或2733-2771、或2772-2814、或2816-2855、或2856-2899、或2902-2940、或3332-3371、或3372-3410、或3411-3450、或3451-3491、或3492-3533、或3534-3572、或3573-3611、或3612-3649、或3652-3692、或3693-3733、或3739-3778之间的片段。

6.根据权利要求1和2的方法，其中用于所述病毒的载体蛋白的序列与在序列表中标识为Seq.ID.2的序列具有至少60％的同源性。

7.根据权利要求1和2的方法，其中干扰病毒包膜蛋白与在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的相互作用的试剂是抗体，或所述受体的竞争性配体，或在序列表中标识为Seq.ID.26的序列。

8.根据权利要求1和2的方法，其中干扰病毒包膜蛋白与在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的相互作用的试剂通过化学合成，或通过重组DNA技术，或从天然来源获得。

9.根据权利要求1和2的方法，其中干扰所述病毒与所述受体的相互作用的试剂是在序列表中标识为Seq.ID.4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的肽中的任何肽。

10.根据权利要求1和2的方法，其中干扰病毒相互作用的试剂是权利要求9中所描述的肽中任一种肽的化学修饰形式。

11.根据权利要求10的方法，其中所述肽具有由下式描述的化学结构：Nt-C1-F2-F3-F4-F5-F6-T7-T8-T9-T10-T11-T12-G13-G14-G15-G16-G17-C18-Ct，其中，

Nt：是任选的N-末端延伸，与末端氨基共价键合的化学基团，乙酰化，甲基化，肽，聚乙二醇，酰化；

C1：半胱氨酸(与C18处的另一个半胱氨酸形成二硫桥)，通过酰胺键与在位置C18处的谷氨酸/天冬氨酸(赖氨酸)的侧链共价连接的赖氨酸(谷氨酸/天冬氨酸)；

F2：丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸；

F3：酪氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸；

F4：异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸；

F5：缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸；

F6：异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸；

T7：甘氨酸；

T8：缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸；

T9：甘氨酸、谷氨酸；

T10：谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、脯氨酸；

T11：赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺；

T12：谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸；

T13：异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸；

T14：赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、苏氨酸；

T15：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、组氨酸；

T16：天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺；

T17：色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸；

C18：半胱氨酸(与C1处的另一个半胱氨酸形成二硫桥)，通过酰胺键与在位置C1处的谷氨酸/天冬氨酸(赖氨酸)的侧链共价连接的赖氨酸(谷氨酸/天冬氨酸)；

Ct：是任选的C-末端延伸，与末端羰基共价键合的化学基团，乙酰化，甲基化，肽，聚乙二醇，酰化。

12.根据权利要求1和2的方法，其中阻断感染的试剂干扰在序列表中标识为Seq.ID.1的序列与一个或多个被定义为在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的配体结合斑片的残基的相互作用。

13.根据权利要求1和2的方法，其中根据权利要求6、7、8、9、10和11的干扰病毒相互作用的试剂是药物组合物的有效成分。

14.根据权利要求1和2的方法，其中所述病毒与所述受体的相互作用的所述干扰包括阻断在序列表中标识为Seq.ID.3的蛋白质的表达。

15.根据权利要求12的方法，其中起干扰作用的试剂是干扰RNA的片段。

16.根据权利要求7、8、9、10、11和12的干扰病毒相互作用的试剂的用途，所述用途为用于确定细胞和/或生物对于登革病毒感染的易感性。

17.根据权利要求1和2的方法，其中干扰所述病毒与所述受体的相互作用的试剂通过下列方式获得：

a)将在序列表中标识为Seq.ID.3的病毒受体与包含在序列表中标识为Seq.ID.1的病毒包膜蛋白和阻断性化合物的制剂一起进行温育；

b)定量与所述受体结合的所述病毒包膜蛋白；

c)与在所述阻断性化合物不存在下与所述受体结合的病毒包膜蛋白的量进行比较。

18.根据权利要求1和2的方法，其中干扰所述病毒与所述受体的相互作用的试剂通过下列方式获得：

a)在反平行β发夹类型的结构的构象中使用具有根据权利要求9和10的序列的肽的三维结构模型的原子坐标，所述反平行β发夹包括在β链之间的连接环中的β转角；

b)使用在序列表中标识为Seq.ID.3的序列的配体结合结构域之一的三维结构模型的原子坐标，其已经过实验得到了确定或通过计算方法进行了建模；

c)分子对接的计算程序，其允许重现在18a中描述的结构与在18b中描述的结构的相互作用的原子细节；

d)将18c的计算对接程序用于从分子结构数据库中选择重现了在18c中描述的相互作用的特征的那些化合物作为病毒感染的阻断剂。

19.根据权利要求1和2的方法，其中干扰所述病毒包膜蛋白与在序列表中标识为Seq.ID.2的序列的相互作用的试剂是抗体、或α2-巨球蛋白的配体、或肽。

20.根据权利要求1和2的方法，其中干扰所述病毒包膜蛋白与在序列表中标识为Seq.ID.2的序列的相互作用的试剂通过化学合成，或通过重组DNA技术，或从天然来源获得。

21.根据权利要求1和2的方法，其中根据权利要求17和16的干扰病毒相互作用的试剂是药物组合物的有效成分。

22.根据权利要求17和18的干扰病毒相互作用的试剂的用途，所述用途为用于确定生物对于登革病毒感染的易感性。

23.根据权利要求9的肽，其在序列表中被标识为Seq.ID.4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18，其中所述肽是干扰所述病毒与所述细胞受体的相互作用的试剂。

24.根据权利要求23的肽，其中所述肽是干扰所述病毒与在序列表中标识为Seq.ID.3的细胞受体的相互作用的试剂。

25.根据权利要求23和24的肽，其中所述肽是具有抗病毒性质的药物组合物的有效成分。