CN106132981B - 具有针对登革病毒的抗病毒特性的β-发夹肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在结构上受约束的合成肽，其已经就β‑发夹结构的形成而进行了优化。所述肽能够抑制或减弱登革病毒(DENV)感染。本发明还包括包含这些合成肽的药物组合物，其对于预防和/或治疗由DENV引起的感染来说是有用的。同样地，本发明提供了用于治疗由该病毒引起的感染的方法。

Description

具有针对登革病毒的抗病毒特性的β-发夹肽
发明领域
本发明涉及医学和药物工业，特别地涉及具有针对登革病毒 (DENV)的抗病毒特性的合成肽的设计和获得。设计所述肽的一级 结构以有效地形成β-发夹结构和模拟该病毒的包膜蛋白的结构域III (DIIIE)的功能性斑片。本发明还涉及包含这些合成肽的药物组合物， 其用于预防和/或治疗由DENV引起的感染。
现有技术
DENV是黄病毒科(Flaviviridae)的成员，所述黄病毒科由具有 正义单链核糖核酸(RNA)的有包膜病毒组成。黄病毒科由三个不同 的属构成：黄病毒属(Flavivirus)、丙型肝炎病毒属(Hepacivirus) 和瘟病毒属(Pestivirus)。黄病毒属包括超过70种已知的病毒，其 中许多在人或其他物种中引起重要的疾病。这些之中包括黄热病毒 (YFV)和DENV。感染人血清的黄病毒属病毒是通过节肢动物媒介 (例如蜱和蚊子)进行传播的，这使得这些疾病是非常难以根除的 (Monath,T.P.,F.X.Heinz.1996.Flaviviruses,第961–1034页.In:B. N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley(编者),Fields virology,第3版,vol.1.Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,Pa.)。
DENV是在热带地区大范围流行的，并且其近期的再度出现在这 些国家的公共卫生中具有越来越大的重要性。据估计每年的感染为大 约1亿例；并且25亿人生活在登革热流行的地区(Gubler,D.J.(1998). Clin.Microbiol.Rev.11,480-496；Monath,T.P.(1994)Proc.Natl.Acad. Sci USA 91,2395-2400)。在1990-1998年期间，向世界卫生组织报告 的登革出血热(DHF)的病例的平均数是514,139例/年，包括15,000 例死亡，虽然认为DHF的真实发病率还要高至几倍。然而，目前还 不存在有商购可得的疫苗，也没有针对DENV的特异性抗病毒治疗。
术语“DENV”是指由在遗传上和在抗原性上相关的四种病毒或 血清型(DENV1－DENV4)组成的病毒复合体。DENV通过蚊子， 主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)传播给人。感染引起存在变化的 临床表现：从无症状的和轻微的表现，例如无差别的发热疾病，直至更严重的表现，例如DHF和可能致命的登革热休克综合征(DSS)。 最严重的临床表现通常与由该病毒的两种不同血清型引起的连续感染 相关联(KouríGP等人,(1987)Trans Roy SocTrop Med Hyg,72: 821-823；Halstead,S.B(2003).Adv.Virus Res.60:421-67)。该现象已通过由抗体介导的增强作用这一理论进行了解释，该理论基于通过在 由靶细胞的Fc受体协助的病毒-抗体复合物进入细胞方面的增加而产 生的病毒感染性的提高(Halstead SB.(1988).Science,239:476-481)。
病毒复制循环的第一步在于病毒吸在宿主细胞的表面上。已证明 了DENV结合至可能构成与细胞的初始相互作用位点的葡糖胺聚糖。 还已证明了病毒结合至树突细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓捕性非 整联蛋白(DC-SIGN，Dendritic Cell-SpecificIntercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin)，虽然可能的是这些分子的作用 与在细胞表面上的病毒积累或者病毒在体内散布至次级感染位点处相 关。病毒向细胞中的生产性进入通过由受体介导的胞吞作用而发生。 在初始结合后，病毒与牵涉内化过程的具有高亲和力的受体和/或共同 受体相互作用。一旦定位于胞吞区室中，pH的降低就诱导由病毒融 合蛋白中的结构变化所介导的内体膜与病毒包膜膜的融合过程。该过 程导致衣壳卸放到细胞质中，其中RNA随后被释放。一旦在细胞质 中，RNA就通过其5’非翻译区(5’UTR)与核糖体相互作用，其中发 生它所编码的病毒基因组的唯一开放读码框的翻译。以该方式，合成 出前体病毒多蛋白，其在黄病毒属中包括三种结构蛋白即衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E)，以及非结构蛋白(NS1-5)。 该多蛋白通过病毒来源的和宿主细胞的蛋白酶来进行共翻译或翻译后 修饰，从而产生功能性的独个病毒蛋白质。与辅助因子相联合的病毒 RNA依赖性RNA聚合酶产生负义单链RNA拷贝，其反过来充当用 于合成正义单链基因组RNA的模板。参与复制的病毒蛋白质与看起 来与内质网相关的膜结构相联合。
在复制后，基因组RNA与核衣壳蛋白相联合，并且在粗面内质 网的膜中，或者在由病毒所诱导的膜结构中，产生包被有包含病毒蛋 白质的脂质病毒包膜的未成熟病毒粒子的向着内腔的芽体。通过胞吐 途径，包膜的蛋白质被糖基化和成熟化，从而最后产生成熟病毒粒子 向细胞外空间的释放。
DENV的基因组由长度为大约11kb的正义单链RNA组成 (Henchal,E.A.&Putnak,J.R.(1990).Clin.Microbiol.Rev.3, 376-396)。病毒基因组编码不间断的开放读码框(ORF)，其大小根 据每种病毒血清型(包括相同血清型的毒株)而变化(Yabar V.C.(2003).Rev.Perú.Med.Exp.Salud Publica 20,51-57)。关于结构蛋白的基因 位于朝向5’端，其中占据ORF的大约四分之一。在基因组的其余部 分中编码非结构蛋白(Lindenbach,B.D.&Rice,C.M.(1999).J.Virol. 73,4611-4621)。
DENV和其他黄病毒的蛋白E在与细胞受体的结合、膜的融合和 病毒粒子的装配中发挥着根本性的作用。因此，其特性是对于宿主范 围和毒力以及保护性免疫的诱导来说重要的决定因素(Modis,Y.等人, (2005).J.Virol.79,1223-1231)。
蛋白E具有53至54kDa的分子量，并且它是结构多肽中最保守 的。在血清型之间，相似性为60-70％。X射线晶体学(Modis,Y.,(2003). Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,6986-6991)和冷冻电子显微镜术 (Kuhn,R.J.等人,(2002).Cell 108,717-725)的研究揭示，与在其他黄 病毒中一样，DENV的蛋白E在成熟病毒粒子的表面上形成二聚体。
在病毒粒子中，暴露于稍微酸性的pH(低于6.5)诱导该蛋白质 的不可逆的构象变化，所述构象变化在于二聚体的解离和其重新结合 成三聚体。该构象变化对于病毒膜与内体膜的融合来说是必不可少的， 所述融合在病毒粒子通过由受体所介导的胞吞作用而内化到哺乳动物 细胞中之后发生(Modis,Y.等人,(2004).Nature 427,313-319)。
在蛋白E的每个单体的大约500个氨基酸残基中，80％构成N- 末端胞外结构域的一部分。其余构成跨膜区，其将蛋白E锚定在脂质 包膜中(Chambers,T.J.等人,(1990).Annu.Rev.Microbiol.44, 649-688)，并且其通过具有大约53个残基的茎区与N-末端胞外结构 域相连接(Modis,Y.等人,(2004).Nature 427,313-319)。使蛋白E的 可溶性片段成形的多肽链折叠为三个结构性结构域：β-片层类型折叠 的中心结构域(结构域I)、延长的二聚体化区域(结构域II)和其 结构与免疫球蛋白的折叠类型相似的第三区域(结构域III)(Modis, Y.等人,(2003).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,6986-6991)。
DIIIE是蛋白E的唯一的连续多肽。其位于朝向每个单体的末端 羧基端，在氨基酸294和392之间。DIIIE的结构与免疫球蛋白恒定 区的结构非常相似(Modis,Y.等人,(2005).J.Virol.79,1223-1231)。 DIIIE的三级结构包括在位于位置302和333处的两个Cys残基(其 在所有黄病毒中是严格保守的)之间建立的二硫桥。
DIIIE通过具有10个残基的、延伸的且柔韧的区域与结构域I相 连(Modis,Y.等人,(2004).Nature 427,313-319)，这允许DIIIE采取 相对于其余结构域而言的方向(Rey,F.A.等人,(1995).Nature 375, 291-298)。在二聚体至三聚体的转换期间，DIIIE是遭受最显著移位 的结构域，其中经历大约70°的旋转和其质量中心向着结构域II的 的移动。在DENV和其他黄病毒的DIIIE中，存在有大量的决定毒 力、细胞向性和病毒宿主范围的残基(Rey,F.A.等人,(1995).Nature 375,291-298)，以及构成逃避中和突变的那些残基(Modis,Y.等人, (2005).J.Virol.79,1223-1231)。
许多来自对于DENV的蛋白E和病毒粒子的结构进行的分析的数 据，以及许多实验证据暗示，DIIIE构成蛋白E与细胞受体的相互作 用区域的一部分。在所述结构特征之中，要强调作为病毒粒子的最突 出区域的结构域的定位，其在与受体位点的相互作用中赋予更高度的 可接近性(Mukhopadhyay,S.等人,(2005).Nat.Rev.Microbiol.3, 13-22)。另外，该结构域所具有的免疫球蛋白类型的特有结构暗示了 其在与细胞受体的相互作用中的可能作用，因为已在多种多样的细胞 粘附蛋白中发现了类似的结构。暗示了DIIIE与受体的可能结合的其 他结构特征为在该结构域中存在带正电荷的亲水性斑片。这些区域由残基284-310和386-411形成，其可能牵涉该结构域与硫酸肝素分子 的结合(Modis,Y.等人,(2005).J.Virol.79,1223-1231)。
用通过重组脱氧核糖核酸(DNA)技术获得的该相同血清型的 DIIIE分子来进行的研究证明，它们能够直接结合至C6/36和BHK21 细胞的表面并且阻断病毒感染(Hung,J.J.等人,(2004).J.Virol.78, 378-388)。
以前的研究已证明，DIIIE以30μΜ或更低的表观解离常数(KD) (取决于所述黄病毒)特异性地与宿主细胞结合(Halstead,S.B.等人, (2005).Vaccine 23,849-856)。另一方面，已知以最高效率阻断DENV 与宿主细胞的结合的单克隆抗体是识别DIIIE的那些单克隆抗体，这 间接地表明，该结构域构成蛋白E与细胞受体的相互作用区域的一部 分(Thullier,P.等人,(2001).J.Gen.Virol.82,1885-1892)。
DENV向宿主细胞中的进入依赖于这些颗粒与在细胞表面上的特 异性受体分子所建立的相互作用。在对DENV的受体进行的研究过程 中获得的证据表明，这些分子可以在不同的细胞类型之间以及对于不 同的病毒血清型而变化。从关于DENV的受体的研究中积累的许多结 果暗示，该病毒利用多分子复合物，其中某些分子起初级受体的作用， 从而将病毒颗粒集中在细胞表面上并促进随后与胞吞受体的相互作 用。
阻断病毒向细胞中的进入是一个令人感兴趣的抗病毒策略，因为 它代表了用于阻止感染开始的初级屏障。通过X射线晶体学和核磁共 振波谱法来进行的分析已提供了该属的三种结构蛋白的原子分辨率结 构：蛋白C、蛋白prM和蛋白E。这些研究已招致抑制病毒复制的备 选方法，其朝着阻断对于病毒的有效繁殖来说必需的结构转换。在蛋 白E与受体分子和中和抗体的相互作用的基础上，已从结构研究中涌 现出了数种特异性区域，作为用于针对DENV的抗病毒药物的合理设 计的靶标。
已提出被称为低密度脂蛋白受体相关蛋白(Low Density LipoproteinReceptor-Related Protein)(LRP1)的膜蛋白是DENV 的推定的胞吞受体，并且其是对于抗病毒药物的设计来说有吸引力的 靶标(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。LRP1是有效地介导多于 30种天然配体的胞吞作用的受体，并且还是次要群鼻病毒的受体。该 受体直接地和间接地(这由能够同时与病毒相结合并与受体相互作用 的载体分子来介导)与病毒的DIIIE相结合。蛋白质α2-巨球蛋白 (α2M)的情况就是如此，所述α2M结合DIIIE并且是LRP1的配体。
已显示，基于DIIIE的结构的β-发夹肽在体外和在体内抑制登革 病毒感染(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。这些肽由DIIIE的 FGβ-发夹序列的片段组成，其序列依赖于病毒血清型而变化。它们通 过在所选择的发夹片段的N-末端和C-末端处所添加的两个半胱氨酸 之间所形成的二硫桥而环化。该系列的具有最高抗病毒活性的肽为肽HDIII3CL(其序列相应于DENV3)，并且抑制由四种血清型引起的 病毒感染。
然而，所述系列的肽具有重大的缺点。首先，效力是非常低的， 在Vero细胞中的感染抑制测定试验之中所测定的HDIII3CL的50％ 抑制浓度(IC50)的值为15μΜ(对于DENV1)、20μΜ(对于DENV2 和DENV3)和40μΜ(对于DENV4)。这样的效力值使得在这些分 子的临床开发中成功是不可能的。所希望的效力值应当至少在亚μΜ 范围内，优选地在nM或更优范围内。
这些分子的另一个可以看到的缺点是，链间环的区域为抗病毒抗 体应答的免疫显性表位(Matsui K.等人,(2009)Virology 384(1): 16-20)。在公开文本Huerta G.V.等人,WO 2007/124698这一文献中证 明，中和抗体3H5识别包含链间环的肽。一部分抗结构域应答在血清 型之间具有交叉反应性。这样的由先前的感染所诱导的交叉反应性抗 体可以具有针对该肽的中和效应，结果造成为了抵消所述中和效应， 进一步需要增加治疗剂量。
根据先前所提及的要素，针对DENV的具有高效力(优选地在 nM范围内)的抗病毒药物的可得性是一个尚未解决的问题。本发明 正是针对该目标。
发明描述
本发明通过提供经由对以前鉴定出的肽的效力进行优化而产生的 抑制DENV的新型β-发夹肽而解决了前面所提及的问题。本发明的β- 发夹肽的特征在于，具有选自由下列各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID No.1至SEQ ID No.9，或者与所述序列类似的序列。
本发明的中心目标是设计抑制DENV感染的肽，其特征在于，展 示出高的(至少在亚μΜ范围内，优选地在nM或更优范围内)效力。 高的效力是对于取得足够低的治疗剂量来说必需的特性。目前在临床 中针对其他病理学状况进行使用的治疗性合成肽是高度强有力的，其 中具有在nM/亚nΜ范围内的效用值(IC50，50％有效浓度(EC50)， 等等)，并且也是高度特异性的，其中具有低的毒性。具有微小效力 的肽需要更高的治疗剂量，这可以具有重大的缺点。例如，高剂量的 使用由于非特异性相互作用而增加了副作用的可能性。而且，较大的 肽浓度可能与聚集问题相关联，在生产过程期间和在其体内施用期间， 所述聚集通过与血清蛋白质的非特异性相互作用而发生。高剂量增加 了免疫原性/抗原性问题的可能性。抗肽免疫应答的诱导，特别是抗肽 抗体的产生，可以中和所述肽的治疗活性，尤其是在第二次施用中或 者在足够长的治疗时间之后，从而导致需要进一步增加剂量。
相反地，低的有效剂量的使用具有经济上的优点，在生产成本方 面和在待由患者支付的价格方面。肽的合成技术比基于小分子的药物 的合成更昂贵。所有这些可能限制能够获得针对登革热的抗病毒药物 的患者或人员的数目，尤其是如果治疗剂量是高的话。
肽的效力首先取决于该肽与生物学上重要的靶受体结合的亲和 力。模拟蛋白质表面的功能性斑片的活性肽的设计是一个并不普通的 问题，这是由于球状蛋白质的功能性斑片通常是形貌学的 (topographic)(牵涉多肽链的多于一个区段)和构象的(在与受体的相互作用中采取非常确定的空间结构)。相反，通常具有10-20个 氨基酸的相应于蛋白质的短区段的肽在溶液中是柔韧的，并且不采取 非常确定的唯一结构。
特别地，其序列相应于折叠蛋白质的β-发夹结构的肽通常在溶液 中不是在结构上稳定的，其中平衡地共存在多种构象。一般地，所述 肽在溶液中的构象可以作为在两个状态之间的平衡来看待：折叠状态 (其三维结构与该蛋白质的天然结构相一致)和解折叠或变性状态(该 肽在溶液中所采取的多种非天然构象的全体)。当肽的发夹结构越稳 定(和与在蛋白质的天然折叠中所采取的结构越相像)时，与受体的 相互作用的亲和力就将会越大，这归因于更小的与肽-受体复合物的形 成过程相关联的构象熵的损失。
如果假设在溶液中肽采取杂乱的结构并且结合过程通过构象选择 机制而发生，那么肽与受体的结合过程的自由能变化可以表示为与肽 的折叠相关联的自由能变化和其与结合位点偶联(刚性的，在偶联已 经折叠的肽这一意义上来说)的能量之和。
因此，在这样的情况下，可以通过下列方式来实现在与结合过程 相关联的自由能差方面的增加：a)通过将原始序列的氨基酸置换为对 于肽在溶液中折叠的稳定性正面地作出贡献的其他氨基酸来对肽进行 修饰(尤其是当被置换的残基不直接参与与受体的接触表面时)，和 b)通过优化在肽与受体之间的分子间相互作用来增加偶联能。
对于肽HDIII3CL(SEQ ID No.10，表1)的序列进行的检查揭 示了数种能够关于发夹类型的折叠的稳定性进行改善的特征。例如： a)位于F和Gβ-链这些区段中的氨基酸Asn3和Asn16的存在，其具 有非常低的形成β-片层的倾向(图1E)；b)在所述链之间的具有六 个残基的长环；c)位于所述链间环中的两个甘氨酸Gly7和Gly9的存 在。氨基酸天冬酰胺是β-结构的差的形成者，具有对于β-链而言非常 低的固有倾向值和对于以正的扭转角为特征的主链的环和结构的偏爱 (Swindells MB等人,(1995).Nat Struct Biol.,2(7):596-603)。 HDIII3CL的环的大小以四个残基而大于两个残基的最佳值(Branden C.&ToozeJ.Introduction to protein structure.New York:Carland Publishing,1991)。此外，一般地，在蛋白质的环中插入残基导致与 与其闭合相关联的熵成本，所述熵成本随着插入的大小而增加(Chan, H.S.&Dill,K.A.(1988).J.Chem.Phys.90:492-509；Nagi AD&Regan L.(1997)Fold Des.,2(1):67-75)。另外，甘氨酸是在折叠过程中损失 最多构象熵的残基，因为它不具有与其余天然氨基酸相关联的对于主 链扭转角的限制。
导致本发明的β-发夹肽的更大的折叠稳定性的序列设计的基础在 于，引入对于可修饰位置具有高的结构倾向的残基(比在待形成β-发 夹类型的结构的原始序列中存在的残基更大的倾向)。待在β-发夹的 折叠中占据特定位置的残基类型的结构倾向可以通过所述残基类型在 存在于蛋白质结构数据库中的经由实验测定的结构的β-发夹的所述位置处的出现频率来估计。从数学上，计算所观察到的所述残基类型在 该特定位置处的出现频率与所预期的频率(根据该残基在数据库中的 相对丰度)之比的对数。
在本发明中被定义为“可修饰的”位置为：
a)该肽的β-发夹的第一条β-链的残基，其相应于DIIIE的结构 的F链的内面(未暴露于溶剂的残基)。这些残基占据在该肽的第一 条β-链和第二条β-链(相应于该结构域的G链的链)的主链的供者原 子和受者原子之间建立氢桥的位置(HB位置)；
b)链间环；
c)该肽的第二条β-链(相应于该结构域的G链)的HB位置， 除了相应于保持不变的DIIIE的残基TRP391(相应于DENV2的编 号)的位置外。对于其余的位置，允许用优选地具有疏水特征的残基 来进行改变；
d)最接近所述环的F链的非HB位置(NHB位置)；
e)第二条链(相应于G链)的第一个HB位置。除了具有高的结 构倾向的残基外，由于功能原因还允许Lys，因为该残基模拟在所述 四种血清型的DIIIE中在形貌学上保守的并且在与受体LRP1/α2M* (激活的α2M)的结合中可能重要的赖氨酸(Lys 385，相应于DENV2的编号)的作用。
在(a)点中所定义的本发明的可修饰残基为在DIIIE的结构中对于 溶剂来说不可接近的并因此不参与该结构域与在病毒感染中重要的受 体的相互作用界面的残基。因此，它们可以被置换为对于折叠的稳定 性来说更有利的残基。
链间环的残基(b)被认为是可修饰的，因为通过比较所述四种血清 型的序列，它是可变区，这表明并不需要该环的任何区段的严格保守 来保证与受体的相互作用。这得到了下述事实的支持：肽HDIII3CL 抑制该病毒的四种血清型的感染，并且受体α2M*/LPR1的阻断通常 引起不依赖于血清型的抗病毒效应。本发明的链间环的优选变体由β- 转角的两个中心残基组成，其中该转角的位置1和4与邻近的β-链的 末端的残基相一致。所述环的该变体对于折叠的稳定性来说是有利的， 短的连接环在β-发夹中是最常见的(Branden C.&Tooze J.New York: Carland Publishing,1991)，并且该链间环的大小的减小降低了与变性状态相关联的构型熵，其随着多肽链的大小增加而变得更大。
具有两个残基(本发明的环的优选的长度)的环的中心残基之一 可以作为DENV3的DIIIE的残基Lys385的模拟残基而担当功能性作 用。在本发明的某些肽中，在具有与DIIIE的FGβ-发夹相同的拓扑 学结构的肽中，在IIP型β-转角的情况下，所述功能性作用由位于该 环的第二个位置处的赖氨酸残基(占据该转角的第二个中心位置)来 执行。在另一种肽中，在该肽的拓扑学结构与DIIIE的FGβ-发夹的 拓扑学结构反向的情况下，所述功能性作用由位于该环的第一个位置 (IIP型β-转角的位置2)处的d-Lys残基(氨基酸赖氨酸的D-立体 异构体)来担当。
在(c)点下所定义的可修饰残基位于该发夹的与(a)点的那些相同 的面，并因此与这些是邻近的并且在主链的原子之间形成氢桥。在该 结构域的结构中的相应残基部分地暴露于溶剂，因为G链是β-片层的 边缘的链。等价于由残基Trp391(相应于DENV2的编号)所占据的 位置的β-发夹的位置在本发明中不是可修饰残基，因为该残基在 DENV的四种血清型中是严格保守的并因此可能是功能性的。在实施 例2(表2)中证明，该位置在肽HDIII3CL(和表1的肽HDIII3CL2) 的抗病毒活性中是必需的，因为将该残基置换成丙氨酸引起抗病毒效 应的丧失。在第二条链的第一个位置(作为(e)而提及的可修饰残基) 处，允许氨基酸赖氨酸，目的是可以构成DENV3的DIIIE的残基 Lys385的结构/功能的模拟物，所述残基Lys385是在该结构域与蛋白 质α2M*(其是推定的胞吞受体α2M*/LRP1的组分)的相互作用中必 需的阳离子残基。
作为(d)而提及的可修饰位置位于相应于该结构域的暴露表面的 那一面，虽然其在血清型之间不是严格保守的(图1E)。
为了设计经优化的序列，在每一个可修饰位置处，选取具有最高 的结构偏好参数值的残基。这些参数是从在具有已知结构的有着8个 残基的片段中每个氨基酸的观察频率开始来进行计算的，所述片段采 取具有由两个残基组成的中心环的β-发夹结构(所述片段的残基4和 5为β-转角的两个中心残基)。通过使用具有大于的分辨率的 非冗余蛋白质三维结构库来进行分析(WHAT IF的数据库；Vriend,G. (1990),J.Mol.Graph.8,52-6)。偏好参数被定义为在发夹的一个位置 处一种氨基酸类型的出现次数与根据在数据库中该残基的相对丰度而 预期的次数之比的对数。对于具有IP和IIP型β-转角的β-发夹，分开地计算所述参数。为了最后的选择，获得β-发夹的三维结构模型， 考虑侧链的最常见的旋转异构体和链间接触。
本发明还包括将非天然氨基酸引入到与所述氨基酸的化学结构和 立体化学特性在结构上相容的β-发夹的位置处。在采取正的主链扭转 角的发夹的位置处所引入的天然氨基酸的D-立体异构体的情况就是 如此。一个实例是d-Pro，其作为IIP型β-转角的第二个残基(等价 于本发明的由两个残基组成的链间环的第一个残基)是有利的。另一 个实例是氨基酸d-Lys，其也被引入在相应于IIP型β-转角的第二个 残基的位置处，但是在具有反向拓扑学结构的肽中。在该情况下，该 Lys不是在该位置处在结构上有利的氨基酸(考虑到偏好参数，其是 不利的，这反映了Lys对于采取位于拉氏图(Ramachandran plot) 的右下象限中的扭转角来说是不利的这一事实)，但是该残基的侧链 值得想望作为结构域III(DENV3)的残基Lys385的潜在模拟物。残 基d-Lys对于采取在IIP型β-转角的位置2处所要求的扭转角来说是 有利的。
在上面段落中所描述的可修饰残基的定义相应于其拓扑学结构与 DIIIE的FGβ-发夹相同(天然拓扑学结构)的β-发夹肽。然而，本 发明还揭示了具有反向拓扑学结构的肽。在这样的肽中，该序列的第 一条和第二条β-链在功能上/在结构上分别相应于DIIIE的G和F链。 在具有反向拓扑学结构的肽中占据NHB位置的残基相应于具有天然 拓扑学结构的肽的HB位置，反之亦然。
保持该结构域的FGβ-发夹的原始拓扑学结构的所设计出的肽在 NHB位置处包括二硫桥，其对于β-发夹结构的折叠的稳定性来说是有 利的。所添加的半胱氨酸的位置为：a)F链的第一个残基，和b)G链 的最后一个残基(图1E)。
数种本发明的肽具有较大的β-链的大小，如果与肽HDIII3CL进 行比较。所述链的残基数目的增加对于折叠的稳定性作出贡献，其中 包括两个额外的氢桥的添加(一个HB残基/链)。
增加肽与受体的相互作用的亲和力(和还有其抗病毒活性)的另 一种方式在于通过修饰对于相互作用能的贡献很少或为负的界面残基 来优化分子间相互作用。一般地，大分子之间(特别地，蛋白质之间) 的相互作用的特征在于，由有限数目的界面残基来支配。其余残基仅 具有有限的贡献。在本发明的肽的情况下，既不知道肽-受体相互作用 的结构细节，也不知道DIIIE与受体之间的相互作用的结构细节。尽 管如此，作为首次接近，可以假定相应于DIIIE的FG发夹的暴露残 基的残基可能是功能性的，任选地牵涉肽-受体界面。
在本发明的实施例2(表2)和实施例6中显示，肽HDIII3CL2 的残基Lys14(相应于DENV3的DIIIE的残基Lys388)被丙氨酸置 换消除了在Vero细胞中该肽的抗病毒活性，并且影响该肽与受体 LRP1的结合。通过用丙氨酸置换残基Trp17(相应于DIIIE的残基Trp391)，获得了相同的结果。因此，这两个残基在生物学活性中均 是必需的，非常可能位于界面中，并且对于相互作用作出实质性贡献。 因此，在本发明中它们不被置换。该肽的残基Cys1和Cys18被丙氨 酸双重置换还消除了肽HDIII3CL2的抗病毒活性，以及其与受体LRP1结合的能力，但是该效应归因于在该肽的β-发夹结构的稳定性 方面的作用，而不是所述半胱氨酸对于分子间相互作用的有利贡献。
本发明将β-发夹肽的可能功能性的表面的延伸揭示为用于增加其 效力的方式。在该情况下，向发夹结构添加四个残基，其中两个相应 于DIIIE的FGβ-发夹的暴露面的残基未包含在一系列与HDIII3CL 类似的肽中。所述添加在于每条β-链两个残基，其中NHB位置被相 应于(DENV3的)包膜蛋白的残基375(F链)和392(G链)的氨 基酸占据。DIIIE的残基375的特征在所述四种血清型之间是保守的， 并且它被氨基酸Glu和Asp占据。这两个残基对于在本发明的β-发夹 肽中的等价位置来说都是符合条件的，虽然优选的解决方案是Glu， 因为不利的采取延伸结构并形成β-链的倾向在Asp上更明显。对于等 价于该结构域的残基392的位置，优选地采取Phe和Tyr，其是DENV 的四种血清型的最具代表性的残基。发夹的延伸段的HB位置相应于 关于折叠的优化而言的可修饰残基。在这些位置处，采取具有形成β- 链类型的二级结构的倾向的、优选地疏水的残基。
与在实施例2中所确定的必需残基(相应于DIIIE的Lys388和 Trp391的残基)和相应于位置Glu/Asp392的残基不同，其余的外面 残基(NHB)被认为能够进行修饰，因为其位置在血清型之间是更加 可变的。本发明的优选的解决方案是在DENV的四种血清型的同源序 列中在相同位置处出现的残基。相应于DIIIE的位置377的残基的情 况就是如此，优选的解决方案为(DENV1和DENV4的)残基Tyr， 而非(DENV3的)Asn。与Asn一样，残基Tyr是极性的并且是氢桥 的供者/受者，但是暴露出更大的非极性表面，并且是在蛋白质-蛋白 质相互作用的位点处更频繁出现的氨基酸。此外，采取延伸结构和β- 链的倾向对于Tyr来说是更大的，其还可以具有有利的(π-阳离子) 与相应于DIIIE的Lys388的残基的相互作用并且对发夹的稳定性作 出贡献。
非必需的(但可能功能性的)位置通常可以通过使用组合方法(例 如，在噬菌体上表达的肽文库)来进行测定/挑选，其中可以使必需位 置和结构位置保持固定不动并且使其余的可能功能性的位置随机化。 最佳序列的选择通过结合测定试验来实现，其中选择表达有效地与受 体分子(例如LRP1和/或α2M*)相结合的肽序列的噬菌体。经优化 的序列的选择还可以通过合理设计方法来实现。
为了本发明的目的，本发明的β-发夹肽可以通过合成途径来获得， 或者如果序列仅包含天然氨基酸，那么可以通过重组DNA技术来获 得，单独地或作为融合蛋白。在使用重组DNA技术的情况下，表达 为融合蛋白可以提高表达水平以及所述肽对于蛋白水解的稳定性。可 以将所述肽通过蛋白酶特异性底物序列而连接至融合蛋白。因此，通 过用这些蛋白酶进行蛋白水解，能够释放出本发明的肽并随后将其进 行纯化。
在实施例1中显示了新型β-发夹肽(SEQ ID No.1－SEQ ID No. 9)的设计。这些肽的序列的基本结构由四个区段组成：两个β-链区 段(其与DIIIE的FGβ-发夹在结构上类似)，它们被一个β-转角分 隔开并且跟随有一个包含三个赖氨酸的C-末端阳离子延伸段。这些肽 的设计按照前面所讨论的结构/功能标准来进行，其目标是增加这些分 子的抗病毒活性效力以及其与细胞受体的结合。
为了本发明的目的，如果一个肽序列与至少一种选自PHB1-9的 肽的序列相似，从而相应的序列同一性百分比等于或大于70％，优选 地等于或大于80％，那么认为那个序列与PHB1-9β-发夹肽是类似的。 所述类似肽的序列在一个或数个选自下列的位置处不同：1)上面所描 述的可修饰位置a)-e)，在该情况下，PHB1-9的残基被置换为也具有 高的在β-发夹中占据所述位置的结构倾向的残基；2)上面所描述的可 能功能性的位置，在该情况下，PHB1-9的所述残基被置换为DENV 的一种血清型的DIIIE的FG发夹的残基，以便所述残基在肽PHB1-9 的β-发夹中占据类似的位置；3)相应于C-末端赖氨酸尾巴的残基的 位置，在该情况下，所述尾巴可以包含两个或三个赖氨酸，优选地三 个赖氨酸；和4)相应于形成肽PHB1-4和PHB7-9的二硫桥的半胱氨 酸的位置，在该情况下，所述半胱氨酸可以被置换为残基Asp/Glu或 Lys，以便该桥的配对半胱氨酸分别被置换为Lys或Asp/Glu，并且所 述肽通过在所述残基(一边为Asp/Glu，和另一边为Lys)的侧链之 间形成酰胺键而环化。
肽PHB1-9的活性通过在Vero细胞中的蚀斑形成抑制测定试验来 进行评价，并且显示在实施例2中。所有这些肽均显示出抗病毒活性， 它们中的六个在所采用的实验模型中比肽HDIII3CL更强有力。肽 PHB4具有针对该病毒的四种血清型的在nM范围内的强有力的抗病 毒活性，并且显示出非常有利的选择性指数(在1290和6450之间， 取决于血清型)。该肽是作为针对DENV的抗病毒药物的具有优异特 性的先导分子，并且展示出比以前所报道的抗病毒药物更大的效力。
因此，本发明的目标还为包含一种或多种β-发夹肽和至少一种药 学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述β-发夹肽具有选自由下列各 项组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNo.1－SEQ ID No.9，或者与所 述序列类似的序列。
在本发明的一个实施方案中，在所述药物组合物中，所述肽形成 超分子聚集体。由于肽PHB4(和一般地，本发明的β-发夹肽)是为 了采取两亲性β-发夹结构而设计的两亲分子，因而其能够依赖于浓度 和环境条件而形成超分子聚集体。
在实施例5中显示，该肽进行自装配并且形成纳米结构，其大小 和形态取决于实验条件，例如浓度、温度、溶剂、聚集时间、添加物 的存在等。该肽的抗病毒活性可以依据这些条件而改变。
在本发明的背景下，“超分子聚集体”是指由许多肽分子(优选 地，多于十个分子)形成的聚集体。
在实施例8中证明，在肽PHB4的盐水溶液中于确定的温育时间 添加蛋白质人白蛋白(或称为人血清白蛋白(HSA))导致获得在低 于nM/亚nM范围内的效力。该结果表明，在HSA存在下配制该肽是 可能的，并且肽聚集体与该蛋白质的推定的相互作用导致高度有活性 的复合物。这样的相互作用可能在该肽的药物代谢动力学特性方面是 非常有利的，因为HSA具有非常高的半寿期。此外，其可以提供针对 蛋白酶的保护作用，并且影响与血清成分的不希望的可能相互作用。 因此，在本发明的一个实施方案中，包含所公开的β-发夹肽的药物组 合物还包含HSA。
不依赖于HSA的存在，肽PHB4自装配成纳米颗粒是从药物代 谢动力学/药效动力学的观点来看有利的特性。由于其大小，纳米颗粒 可以展示出比单体肽(其常常被迅速清除和被代谢)更长的在血液中 的半寿期。单体肽易被宿主的蛋白酶降解，而纳米颗粒提供更大的针 对蛋白水解的保护作用。在纳米颗粒的背景下，多个与受体的结合位 点的呈现可以增加该受体对该肽的亲和力，并且对于该肽的抗病毒活 性效力作出有利贡献。
在实施例3和6中证明，本发明的β-发夹肽能够结合蛋白质α2M* 和受体LRP1(其是DENV的推定的胞吞受体的组分)，并且是用于 设计抗病毒药物的有吸引力的靶标，根据在Huerta G.V.等人的专利 申请公开文本WO 2007/124698中所报道的。
本发明的实质性要素是分析在nM范围内的β-发夹肽的生物学活 性。如在实施例3中所显示的，在nM/亚μM范围内，肽PHB2、PHB4、 PHB5、PHB8和PHB9抑制DENV1-牙买加毒株的重组DIIIE的生物 素化变体(“DIIIE1J-生物素化的”)与蛋白质α2M*的结合，并且 所述抑制能力明显高于由非生物素化的DIIIE(DIIIE1J)所展示的。 所述肽的抑制百分比为DIIIE1J的1.5至3倍。在该浓度范围内，由 肽HDIII3CL所显示出的抑制是非常低的，相比于DIIIE1J而言。在 实施例6中证明，本发明的β-发夹肽以高亲和力结合受体LRP1，其 中肽PHB4显示出最强有力的与受体的结合的那一个。该结果与PHB4 是关于抗病毒活性而言最强有力的肽这一事实相一致。
在实施例8中证明，所述β-发夹肽的抗病毒活性与其结合受体 LRP1和蛋白质α2M*的能力相关，这是抗病毒作用机制涉及抑制病毒 进入细胞的非常坚实的证据。这还支持了优化在本发明中所公开的β- 发夹肽的效力的策略。
本发明的β-发夹肽结合蛋白质α2M和受体LRP1的能力可以用 于设计用于控制由这些蛋白质介导的疾病的治疗性试剂。在本发明中 所显示的对于DENV感染的强有力的抑制是该可能性的一个例子。
所述病毒与推定的胞吞受体α2M*/LRP1的结合的抑制(蛋白E 的结合的抑制)是开发相对于在现有技术中所鉴定出的其他受体而言 更优的针对DENV的抗病毒试剂的一个策略。由其他作者所描述的受 体是粘附受体，其介导与质膜的结合，但其不介导胞吞作用过程。因 此，本发明的肽通过阻断进入过程的后面步骤而将会是有效的，而不 依赖于由DENV所使用的粘附受体。
考虑到这些发现，本发明还包括在本发明中所公开的β-发夹肽用 于制备药物的用途。在一个实施方案中，所述药物用于抑制或减弱 DENV感染。在另一个实施方案中，用本发明的β-发夹肽制备的药物 用于治疗由蛋白质α2M或蛋白质LRP1介导的疾病。
本发明的目标还在于提供用于在有此需要的受试者中抑制或减弱 DENV感染的方法，其特征在于，给所述个体施用一种或多种本发明 的β-发夹肽，或者包含至少一种这些肽的药物组合物。
附图简述
图1.抑制登革病毒的β-发夹肽的设计。A)对于具有8个残基和 IP型中心β-转角的β-发夹的每一个位置所计算出的20种天然氨基酸 的偏好参数的图。更大的偏好参数值相应于更深的灰色色调。对于在 用WHATIF选择出的样品中在β-发夹的特定位置处未观察到的氨基 酸，给其分配0.5的观察值并计算相应的偏好参数。B)对于具有8个 残基和IIP型中心β-转角的β-发夹的每一个位置所计算出的20种天 然氨基酸的偏好参数的图。着色方案和偏好参数的计算与在(A)中 的相同。C-D)“标识(logo)”类型的图，其显示了来自具有IP型 (C)和IIP型(D)中心β-转角的β-发夹的比对的共有序列，其中氨 基酸的字母的大小与在样品中所观察到的氨基酸频率(每个位置)和 按照所使用的数据库的氨基酸组成所预期的频率之间的比率成正比。 E)DENV的四种血清型的DIIIE的片段(相应于FGβ-发夹)与肽PHB4的序列比对。MP：在本发明中所定义的可修饰位置(a-e)，* 为相应于在功能上重要的残基Lys385的位置；SS：肽PHB4的“经 设计的”二级结构；RN：PHB4的序列的残基数目；SSDEN：DIIIE 的二级结构；RNDEN：病毒DENV2的蛋白E的序列的残基数目；链： 相应于该病毒的DIIIE的F和G链的β-链。
图2：抑制DENV的β-发夹肽的三维结构模型。A)β-发夹肽 HDIII3CL，显示了相应于发夹(没有阳离子延伸段)的区段并且突显 了一些重要的残基。在括号中出现了在DIIIE中等价的残基的编号。 B)肽PHB4。用大括号标示出了相对于HDIII3CL而言的β-链的延 伸段的残基。C)这两个肽的结构叠加。
图3.经生物素化的病毒DENV1的DIIIE(DIIIE1Jbiot)与蛋白 质α2M*的结合的抑制。在纵坐标轴上显示了在0.05-3μΜ的浓度范 围内的本发明的β-发夹肽的抑制百分比。包括了肽HDIII3CL和重组 DIIIE(DIIIE1J)的抑制活性。
图4.剂量-应答曲线，其相应于经生物素化的DIIIE (DIIIE1Jbiot，病毒DENV1的序列)与α2M*的结合的抑制。显示 了相应于β-发夹肽PHB5、肽HDIII3CL和重组DIIIE(DIIIE1J)的 抑制百分比。
图5.所示的β-发夹肽对于经生物素化的病毒DENV1的DIIIE (DIIIE1Jbiot)与蛋白质α2M*的结合的抑制，以及与抗病毒活性的 关系。在纵坐标轴上显示了相对于对于DIIIE1J所测定的抑制百分比 而言的结合抑制百分比。显示了相应于亚μM(50-200nM)浓度范围 的数据。
图6.质粒pET-DIII DENV1的示意图。
图7.在与蛋白质α2M的相互作用中必需的DIIIE的残基的作图。 在纵轴上显示了在每个丙氨酸突变体(相应于在横轴上的每个特定残 基)的IC50值与重组DIIIE(DIIIE1PRS)的IC50值之间的比例。 深色带阴影的椭球体指明了限定初级相互作用位点的残基。具有边缘 的浅色椭球体限定了次级相互作用位点。
图8.参与与蛋白质α2M*的相互作用的位点在DIIIE的三维结构 中的定位。显示了病毒DENV1的DIIIE的结构的两种视图，包括二 级结构的“棍”式详细图示和示意性图示(分别用箭状物和管状物来 强调β-片层和环)。鉴定了在相互作用中重要的残基。重要的残基集 聚在由带阴影的椭球体所呈现的两个位点(第一个位点(A)和第二 个位点(B))中。三维结构的图示用PyMol(The PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.2r3pre,LLC.)来制作。
图9.在磷酸缓冲盐水(PBS)存在下肽PHB4的聚集动力学。 A-B)在PBS中，10μΜ的肽PHB4的聚集动力学。纵坐标轴相应于 相对于在零时间处(在PBS中溶解的那一时刻处)该肽的散射而言的 散射光的强度。A：0至300分钟的聚集变化图。B：聚集的最初30 分钟。C-D)：在PBS中，5μΜ的肽PHB4的聚集动力学。C：早聚 集，0-40分钟。D：晚聚集，30-230分钟。
图10.通过透射电子显微镜术来进行的肽PHB4的聚集体的形态 研究。研究了在水中和在PBS中以2mg/ml的浓度的该肽的聚集。所 研究的条件为：刚刚在水中(A)和在PBS中(B)重悬浮的肽；在 水中(C)和在PBS中(D)重悬浮并于50℃加热一小时的肽；以及 在水中(E)和在PBS中(F)溶解、于50℃加热一小时并在环境温 度下温育两小时的肽。所述标尺条分别地在A、B、E和F中等于100 nm，和在C-D中等于200nm。
图11.在用于测定DENV的DIIIE与受体LRP1的直接相互作用 的测定试验中所使用的蛋白质。A)LRP1的结构域的构造的示意性图 示。MP：质膜。指明了相应于与配体结合的结构域簇的区域。B)嵌 合蛋白sLRP1-CIV的示意性图示，Fc：免疫球蛋白恒定区片段。C) 重组蛋白质DIIIE1-4的示意性图示。D)通过在变性条件下的聚丙烯 酰胺电泳(SDS-PAGE)对蛋白质DIIIE的最终制备物进行的分析： 1.DIIIE1(尤其是DIIIE1J)；2.DIIIE2；3.DIIIE3；和4.DIIIE4。 指明了相应于所使用的分子量标准参照物的14kDa那部分的条带的 位置。
图12.在ELISA型测定试验中DENV的DIIIE与LRP1的配体 结合结构域的相互作用。在每张图的上面部分中，指明了在平板孔的 包被中所使用的蛋白质。通过使用缀合至过氧化物酶的抗人免疫球蛋 白Fc的多克隆抗体制备物来进行蛋白质sLPR1-CII-IV的结合。
图13.sLRP1-CIV的表面的表征。A)通过施加α2M*和受体相关 蛋白(RAP，Receptor-Associated Protein)(两者都在100nM)而 获得的传感图(sensorgram)。显示了在两个沟道上获得的信号：Fc1， 具有经固定化的sLRP1-CIV；和Fc2，具有经固定化的HSArec。B) 从针对浓度的最大共振单位(RU)的数据开始来测定RAP与sLRP1 的相互作用的亲和力。实线表示与具有两个相互作用位点的模型的拟 合。所述拟合通过使用程序GraphPad Prism v5.03来进行。在Biacore X上进行测量。
图14.β-发夹肽与sLRP1-CIV的相互作用。A和B)通过施加浓 度为20μΜ的肽而获得的传感图；C)在160s的相互作用下获得的 RU；和(D)在270s的相互作用下获得的RU。
图15.在β-发夹肽与蛋白质LRP1(片段sLRP1-CIV)的结合和 β-发夹肽的体外抗病毒活性之间所观察到的关系。显示了在于Vero 细胞中针对DENV2所测定的抗病毒活性的效力值[log(IC50,uM)]与 在时间经过400s时所观察到的Biacore信号的量值(RUrem)之间的线性回归。该分析用与肽HDIII3CL共有相同的拓扑学结构(天然拓 扑学结构)的PHB系列的肽来进行。95％的置信带用虚线来显示。在 插入图中显示了不包括肽PHB4的相似的分析。
图16.在β-发夹肽与蛋白质α2M*的结合和β-发夹肽的体外抗病 毒活性之间所观察到的关系。显示了DIIIE与蛋白质α2M*的结合的 抑制值针对相应于在Vero细胞中病毒DENV2感染的抑制的IC50值 的线性回归。相对于在关于所述肽的等摩尔浓度下对于重组DIIIE (DIIIE1J)所测定的抑制百分比而言来表示与α2M*的结合的抑制百 分比。显示了平均值和标准偏差的值，其在亚μM和nM的所述肽的 浓度下测定：50、100、200和400nM。
图17.肽PHB4的温育温度对于其抗病毒活性的影响。抗病毒活 性的评价通过用DENV2(16803毒株)进行感染的Vero细胞的感染 后(p.i.)24小时的上清液的滴度测定来进行。对于上清液的滴度测定， 使用在Vero细胞上的裂解斑形成测定试验。IC50的估计用统计学程 序GraphPad Prism v5.3来进行。实线表示用“log10(浓度)vs应答” 曲线模型来进行的非线性回归拟合。
图18.实验设计流程，其用于评价聚集体的生长时间对于肽PHB4 的抗病毒活性效力的影响。
图19.肽PHB4的温育时间和温度对于抗病毒活性的影响。抗病 毒活性的评价通过用DENV2(16803毒株)进行感染的Vero细胞的 感染后24小时的上清液的滴度测定来进行。对于上清液的滴度测定， 使用在Vero细胞上的裂解斑形成测定试验。在没有肽存在的情况下 被感染的细胞的上清液的病毒滴度为4log10。A.在10℃下进行温育； B.在37℃下进行温育。
图20.实验设计流程，其用于评价在开始聚集体的生长过程时肽 PHB4的初始浓度对于抗病毒活性效力的影响。
图21.肽在水中的初始溶液的浓度对于抗病毒活性的影响。抗病 毒活性的评价通过用DENV2(16803毒株)进行感染的Vero细胞的 感染后24小时的上清液的滴度测定来进行。对于上清液的滴度测定， 使用在Vero细胞上的裂解斑形成测定试验。
图22.肽PHB与组氨酸尾巴的融合的设计。在上图中，将尾巴添 加在该肽的C-末端处。在下图中，尾巴位于N-末端处。
图23.具有组氨酸尾巴的融合肽的聚集体/纳米颗粒的示意性图 示，所述聚集体/纳米颗粒通过用金属离子的间隔物和络合物 EGTA(Me2)的间隔物进行交联来稳定化。
图24.单独的以及与Zn和与EGTA(Zn2)形成络合物的肽 H5PHB4和PHB4H5的抗病毒活性。
实施方式的详细描述/实施例
实施例1.抑制登革病毒感染的β-发夹肽的设计和合成
在本发明中所使用的β-发夹肽的序列的描述
设计了在表1中命名为PHB1-9的新型β-发夹肽(其相应于SEQ ID No.1-9)，这按照旨在相对于HDIII3CL(SEQ ID No.10)而言提 高这些分子的抗病毒活性效力(和与细胞受体的结合)的结构/功能标 准来进行。这些肽的序列的基本结构由四个区段组成：两个β-链区段 (其与该病毒的DIIIE的FGβ-发夹在结构上类似)，它们被一个β- 转角分隔开并且跟随有一个包含三个赖氨酸的C-末端阳离子延伸段。 定义了两种不同的拓扑学结构：肽PHB1-4和PHB7-9具有与DIIIE 的FGβ-发夹相同的拓扑学结构(多肽链的方向是相同的或天然的)， 和肽PHB5和PHB6具有相反的或反向的拓扑学结构。具有天然拓扑 学结构的肽的第一个β-链区段(在表1中的β1)在结构上相应于Fβ- 链，和β2区段相应于Gβ-链(图1E)。肽PHB1、PHB2和PHB7 的链长与肽HDIII3CL的相应链(有着六个残基的链)相一致，而肽 PHB3-4和PHB8-9具有有着八个残基的链，和PHB5-6具有有着七个 残基的链。链的较大的大小对于其结构稳定性作出有利贡献(Stanger, H.E.等人,(2001).Proc.Natl.Acad.Sci.USA98,12015–12020)。
肽PHB1、PHB2和PHB7的残基Cys1、Asn/Tyr3和Thr5相应 于DIIIE的FGβ-发夹的NHB暴露位置。对于位置3，在PHB1和PHB7 中选择残基Asn3，其等价于病毒DENV3的DIIIE的残基Asn377； 和对于肽PHB2，选择残基Tyr3，其等价于DENV1、DENV2和DENV4 的Tyr377。Tyr3是比Asn3更优选的，因为它在血清型之间更保守， 更好地形成β-链结构，并且占据Lys10的对角线位置，这促进Tyr3 和Lys10可以在其侧链之间建立π-阳离子类型的有利的相互作用(图2B)。在位置5处，选择残基Thr5，以代替DENV的DIIIE的序列 的Val/Ile379(图1E)。这是由于残基Thr是相对于Val/Ile而言保 守的氨基酸，是β-链结构的良好形成者，但是它是更亲水的(这对于 肽的更大的可溶性作出贡献)并且显示出更高的结构偏好参数值(图1E的具有八个残基的β-发夹的位置2)。这些肽的残基Cys14、Asn12 和Lys10在β-发夹的相同面上分别占据与Cys1、Tyr/Asn3和Thr5 相邻的位置，但是主链不在所述残基之间形成氢桥。残基Lys10和 Asn12在结构/功能上相应于残基Lys388(其是在DENV1-3中保守的) 和Asn390(其是在DENV2-3中保守的)。在位置13处选择残基Trp， 因为DIIIE的相应残基Trp391在所述四种血清型中是严格保守的。 Cys1和Cys14这两个半胱氨酸形成执行必需结构作用的二硫桥。这些 残基占据NHB位置，并且在该位置处的二硫桥对于β-发夹的稳定性是有利的(Santiveri C.M.等人,(2008).Chem.Eur.J.,14,488-499)。 在本发明的后面，通过实验证明了残基Lys10、Trp13以及半胱氨酸 Cys1和Cys14对于所述肽的抗病毒活性来说是必需的。与HDIII3CL 类似的肽(其中一个位置(Lys10→Ala或Trp17→Ala，HDIII3CL 的Trp17在结构上相应于PHB1、PHB2和PHB7的残基Trp10)或 两个位置(Cys1→Ser和Cys18→Ser，在HDIII3CL中Trp18在结 构上相应于PHB1、PHB2和PHB7的残基Trp13)被置换)在所检验 的浓度范围内不具有抗病毒效应。另外，在后面还证明了Tyr3优于 Asn3，其中考虑到肽PHB9比肽PHB8更有强有力，并且这些肽仅在 相应于DENV1-2和DENV4的DIIIE的Tyr375的位置处不同。
表1.β-发夹肽的设计
p，脯氨酸的D-立体异构体；k，赖氨酸的D-立体异构体；天然拓扑学结构，与DIIIE的FGβ-发夹的拓扑学结构相同；反向拓扑学结构，与DIIIE的FGβ-发夹的拓扑学结 构相反。
残基Val2、Trp/Val4、Glu/Arg/Ile6、Lys/Trp9、Val/Tyr11和 Trp13形成该发夹的对面，其中占据HB位置。位置2、4和6分别与 位置13、11和9相邻，并且在主链的原子之间通过氢桥形成连接。由 于在上面的段落中所阐明的原因，位置13仅被Trp占据。通过考虑 每个残基的偏好参数值来选择其余的位置(图1A和B)。在位置6 和9的情况下，选择偶对Glu6-Lys9(PHB1)和Arg6-Trp9(PHB2)， 它们是有利的，因为其分别可以建立盐桥和π-阳离子相互作用。Lys9 (PHB1和PHB7)可以作为DIIIE的Lys385的模拟物而发挥功能性 作用。该残基在DIIIE与蛋白质α2M*的相互作用中是必需的，如在 本发明的后面所证明的那样。
肽PHB1和PHB2被设计成在残基6和9之间形成IIP型β-转角。 这些肽的位置7被残基d-Pro(其是氨基酸脯氨酸的D-立体异构体) 占据。该氨基酸对于占据IIP型β-转角的第二个位置来说是有利的 (Pantoja-Uceda D.等人,(2006)Methods Mol Biol.,340:27-51)。肽 PHB1的残基Asp8因高的偏好参数值而被选择。PHB2的Lys8被选 择用于模拟DIIIE的残基Lys385。在肽PHB7的情况下，在残基6和 9之间设计了一个IP型β-转角。通过考虑偏好参数值而选择了残基 Asn7和Gly8(图1A和B)。该二肽是IP型β-转角中非常常见的序 列。
另外，肽PHB3和PHB4的β-发夹的序列分别包含肽PHB1和 PHB2的相应发夹的序列(表1)。在该情况下，前者的位置4-15等 价于后者的位置2-13，因此PHB3和PHB4的残基4-15的选择用在上 面对于肽PHB1和PHB2所描述的标准来进行。
类似地，PHB8和PHB9包含PHB7的序列，并且残基4-15以与 PHB7的残基2-13相同的方式来进行选择。PHB3、PHB4、PHB8和 PHB9的残基Glu3和Phe16被选择用于模拟DIIIE的残基Glu375(其 在DENV1和DENV3中是保守的，在DENV2和DENV4中为Asp) 和Phe392(其在DENV1、DENV2和DENV4中是保守的，在DENV3 中为Tyr)(图1E)。选择PHB3-4和PHB8-9的残基Ile2和Ile17， 因为这些残基具有高的形成β-链结构的倾向。残基Cys1和Cys18占 据NHB位置，并且被引入用于形成使β-发夹结构稳定的二硫桥(图1E和图2)。
肽PHB5和PHB6具有反向拓扑学结构。残基Phe1、Asn3、Lys5、 Thr12、Asn14和Glu16在结构上等价于肽PHB3的残基Phe16、Asn14、 Lys12、Thr7、Asn5和Glu3，但是占据通过氢桥连接的HB位置。残 基Trp4和Trp6与残基Trp11和Trp13相邻，占据NHB位置，并且 被设计用于形成对于β-发夹的稳定性来说非常有利的Trp拉链。残基 Trp2在结构上相应于DIIIE的残基Trp391，并且由于上面所阐明的 原因而被选择。残基Glu7和Lys10具有高的偏好参数值，并且可以 形成对于发夹的稳定性来说有利的盐桥。氨基酸Asn9也通过偏好参 数而被选择。选择PHB6的残基d-Pro8，因为它在IIPβ-转角的位置 2中是有利的。引入PHB5的d-Lys以用于模拟DIIIE的残基Lys385， 因为残基d-Lys对于占据IIP型β-转角的位置2来说是非常有利的， 相比于与立体异构体L-Lys而言。备选地，PHB5和PHB6的残基Lys10 也可以模拟DIIIE的残基Lys385。
所有的肽PHB1-9的C-末端延伸段都包含三肽LysLysLys，其被 引入用于提高肽的可溶性，因为受体LRP1是阴离子分子，其可以与 本发明的β-发夹肽的阳离子三肽建立有利的静电相互作用。在肽 PHB5和PHB6的情况下，所述阳离子三肽通过二肽GlyGly而与β- 发夹分隔开，以在这两个区段之间引入柔韧性并且阻断β2链的延伸的 β结构的延长。
图1C和1D是“标识”类型的图(J.Gorodkin等人,(1997).Comput. Appl.Biosci.,Vol.13,no.6:583-586；T.D.Schneider&R.M.Stephens. (1990).Nucleic AcidsResearch,Vol.18,No.20,第6097-6100页)，其 分别显示了来自具有IP和IIP型中心β-转角的有着八个残基的β-发 夹的比对的共有序列。这些图通过使用web服务器“ProteinSequence Logos using Relative Entropy”(http://www.cbs.dtu.dk/～gorodkin/appl/plogo.html)来获得。该呈现形式是在图1A和1B中所显示的偏好参 数矩阵的备选方式，在此相应于每个氨基酸的字母的喷泉大小与该残 基类型在每个位置处的“重要性”成正比，即更大的字母意味着该残 基在结构上是更有利的。
除了肽PHB1-9外，表1还显示了肽HDIII3CL(SEQ ID No.10) 和其数种类似物(在其中残基被变成丙氨酸)的序列，所述类似物被 引入是为了调查所述肽的数种位置在抗病毒活性中的作用。以该目的 而设计的肽为HDIII3CL2，其是与肽HDIII3CL类似的具有有着三个 赖氨酸的延伸区段的肽(SEQ ID No.11)；HDIII3CLW-，其是肽 HDIII3CL2的Trp17→Ala突变体(SEQ ID No.12)；HDIII3CLK-， 其是肽HDIII3CL2的Lys14→Ala突变体(SEQ IDNo.13)；和 HDIII3CLC-，其是肽HDIII3CL2的Cys1→Ala和Cys18→Ala双突 变体(SEQ IDNo.14)。
图2集合了β-发夹肽HDIII3CL(A)和PHB4(B)的三维结构 模型。在肽HDIII3CL的情况下(图2A)，显示了相应于发夹(没有 阳离子延伸段)的区段并且突显了一些重要的残基。在括号中出现了 在DIIIE中等价的残基的编号。在肽PHB4的情况下(图2B)，用大 括号标示出了相对于HDIII3CL而言的β-链的延伸段的残基。强调了 在本发明中所描述的肽的生物学活性中重要的侧链：1)位于相应于 DIIIE的残基Lys385的转角/环中的Lys，2)位于第二条β-链中且相 应于DIIIE的残基Lys388的Lys，3)位于第二条β-链中且相应于 DIIIE的残基Trp391的Trp，4)位于第一条β-链中且相应于DIIIE 的残基Tyr377的Tyr。图2C显示了这两个肽的结构叠加。
本发明的肽PHB1-9代表了可以从在发明详述部分中和在该实施 例中所阐明的一般原理出发而设计出的β-发夹肽的具体示例，而所述 设计旨在获得针对DENV的高度强有力的抗病毒肽。因此，本发明保 护与至少一种选自PHB1-9的肽的序列相似的β-发夹肽的序列，从而 相应的序列同一性百分比等于或大于70％，优选地等于或大于80％。 所述类似肽的序列在一个或数个选自下列的位置处不同：1)在发明详 述部分中所描述的可修饰位置a-e)，在该情况下，PHB1-9的残基被置 换为也具有高的在β-发夹中占据所述位置的结构倾向的残基；2)在发 明详述部分中所描述的可能功能性的位置，在该情况下，PHB1-9的 所述残基被置换为DENV的一种血清型的DIIIE的FG发夹的残基， 以便所述残基在肽PHB1-9的β-发夹中占据类似的位置；3)相应于 C-末端赖氨酸尾巴的残基的位置，在该情况下，所述尾巴包含两个或 三个赖氨酸，优选地三个赖氨酸；和4)相应于形成肽PHB1-4和 PHB7-9的二硫桥的半胱氨酸的位置，在该情况下，所述半胱氨酸可 以被置换成残基Asp/Glu或Lys，以便该桥的配对半胱氨酸分别被置 换为Lys或Asp/Glu，并且所述肽通过在所述残基(一边为Asp/Glu， 和另一边为Lys)的侧链之间形成酰胺键而环化。
一般地，与PHB1-9类似的β-发夹肽的序列可以以下述方式来进 行描述：
i.与PHB1和PHB2类似的肽为其序列具有相对于PHB1和PHB2 的序列而言的70％或更高(优选地，80％或更高)同一性的相似性的 肽，并且所述序列由下列组成，
位置1(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys， 那么其与位置14的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置14的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置2(“a”类可修饰的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或 Met
位置3(可能功能性的)：Tyr或Asn
位置4(“a”类可修饰的)：Trp或Val或Phe或Glu
位置5(“d”类可修饰的)：Thr或Val或Ile(后两者为在DENV 的序列中出现的残基)
位置6(“a”类可修饰的)：Arg或Ile或Val或Glu或Leu
位置7(“b”类可修饰的)：d-Pro
位置8(“b”类可修饰的)：Asp或Lys或Asn
位置9(“a”和“e”类可修饰的)：Trp或Lys或Met或Thr 或Gln
位置10(可能功能性的)：Lys
位置11(“a”类可修饰的)：Val或Met或His或Leu
位置12(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His
位置13(必需位置)：Trp
位置14(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是 Cys，那么其与位置1的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置1的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置15-17或15-16(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽 Lys-Lys；
ii.与PHB3和PHB4类似的肽为其序列具有相对于PHB3和 PHB4的序列而言的70％或更高(优选地，80％或更高)同一性的相 似性的肽，并且所述序列由下列组成，
位置1(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys， 那么其与位置18的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置18的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置2(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或 Met
位置3(可能功能性的)：Glu或Asp
位置4(“a”类可修饰的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或 Met
位置5(可能功能性的)：Tyr或Asn
位置6(“a”类可修饰的)：Trp或Val或Phe或Glu
位置7(“d”类可修饰的)：Thr或Val或Ile(后两者为在DENV 的序列中出现的残基)
位置8(“a”类可修饰的)：Arg或Ile或Val或Glu或Leu
位置9(“b”类可修饰的)：d-Pro
位置10(“b”类可修饰的)：Asp或Lys或Asn
位置11(“a”和“e”类可修饰的)：Trp或Lys或Met或Thr 或Gln
位置12(可能功能性的)：Lys
位置13(“a”类可修饰的)：Val或Met或His或Leu
位置14(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His
位置15(必需位置)：Trp
位置16(可能功能性的)：Phe或Tyr
位置17(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr 或Met
位置18(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是 Cys，那么其与位置1的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置1的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置19-21或19-20(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽 Lys-Lys；
iii.与PHB7类似的肽为其序列具有相对于PHB7的序列而言的 70％或更高(优选地，80％或更高)同一性的相似性的肽，并且所述 序列由下列组成，
位置1(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys， 那么其与位置14的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置14的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置2(“a”类可修饰的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或 Met
位置3(可能功能性的)：Tyr或Asn
位置4(“a”类可修饰的)：Val或Ile或Phe或Tyr或Leu
位置5(“d”类可修饰的)：Thr或Val或Ile(后两者为在DENV 的序列中出现的残基
位置6(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Tyr，His或Lys
位置7(“b”类可修饰的)：Asn或Asp
位置8(“b”类可修饰的)：Gly
位置9(“a”和“e”类可修饰的)：Lys或His或Arg或Val 或Tyr或Glu或Met
位置10(可能功能性的)：Lys
位置11(“a”类可修饰的)：Tyr或Val或Gln或Trp，Phe
位置12(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His
位置13(必需位置)：Trp
位置14(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是 Cys，那么其与位置1的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置1的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置15-17或15-16(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽 Lys-Lys；
iv.与PHB8和PHB9类似的肽为其序列具有相对于PHB8和 PHB9的序列而言的70％或更高(优选地，80％或更高)同一性的相 似性的肽，并且所述序列由下列组成，
位置1(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys， 那么其与位置18的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置18的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置2(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或 Met
位置3(可能功能性的)：Glu或Asp
位置4(“a”类可修饰的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或 Met
位置5(可能功能性的)：Tyr或Asn
位置6(“a”类可修饰的)：Val或Ile或Phe或Tyr或Leu
位置7(“d”类可修饰的)：Thr或Val或Ile(后两者为在DENV 的序列中出现的残基)
位置8(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Tyr或His或Lys
位置9(“b”类可修饰的)：Asn或Asp
位置10(“b”类可修饰的)：Gly
位置11(“a”和“e”类可修饰的)：Lys或His或Arg或Val 或Tyr或Glu或Met
位置12(可能功能性的)：Lys
位置13(“a”类可修饰的)：Tyr或Val或Gln或Trp，Phe
位置14(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His
位置15(必需位置)：Trp
位置16(可能功能性的)：Phe或Tyr
位置17(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr 或Met
位置18(结构的，环化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是 Cys，那么其与位置1的残基Cys形成二硫桥，如果是Glu/Asp(Lys)， 那么其侧链与位置1的Lys(Glu/Asp)的侧链形成酰胺键
位置19-21或19-20(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽 Lys-Lys；
v.与PHB5和PHB6类似的肽为其序列具有相对于PHB5和 PHB6的序列而言的70％或更高(优选地，80％或更高)同一性的相 似性的肽，并且所述序列由下列组成，
位置1(可能功能性的)：Phe或Tyr
位置2(必需位置)：Trp
位置3(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His
位置4(“a”类可修饰的)：Trp
位置5(可能功能性的)：Lys
位置6(“a”类可修饰的)：Trp
位置7(可能功能性的，“b”类可修饰的)：Glu或Val或Arg 或Ile或Asp
位置8(“b”类可修饰的)：d-Pro或d-Lys
位置9(“b”类可修饰的)：Asn或Asp或Lys
位置10(可能功能性的，“b”类可修饰的)：Lys或Met或Trp 或Gln或Thr
位置11(“a”类可修饰的)：Trp
位置12(“d”类可修饰的)：Thr或Val或Ile(后两者为在DENV 的序列中出现的残基
位置13(“a”类可修饰的)：Trp
位置14(可能功能性的)：Tyr或Asn
位置15(“a”类可修饰的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr 或Met
位置16(可能功能性的)：Glu或Asp
位置17-21或17-20(C-末端延伸段)：五肽Gly-Gly-Lys-Lys-Lys 或四肽Gly-Gly-Lys-Lys。
肽的合成
在表1中所列出的肽的合成通过使用Fmoc/tBu策略在 Fmoc-AM-MBHA树脂上以固相方式来进行(Barany,G.&Merrifield, R.B.(1977)J Am Chem Soc.99 7363-7365)。所述合成在具有多孔玻 璃料的10mL注射器中手工地进行，并且所有试剂和溶剂通过在真空 中过滤来去除。氨基酸通过使用用DIC/HOBt进行活化的方法来进行 偶联，并且通过使用茚三酮测定试验来验证偶联反应的完成(Kaiser,E. 等人,(1970)Anal Biochem.34:595-598)。通过用三氟乙酸 /EDT/H2O/TIS(94％/2.5％/2.5％/1％)的溶液进行处理来将肽与树脂分开，用醚进行沉淀，并冻干72小时。将肽通过经由用二甲亚砜 (DMSO)进行氧化而形成二硫桥来进行环化(Andreu,D.等人,(编者), Peptide Synthesis Protocols,Methods inMolecular Biology,Totowa,NJ, 1994,第91-169页)，并且在RP-C18柱上通过制备型RP-HPLC来 进行纯化。将收集的级分独立地在分析型RP-HPLC中进行分析，并 且通过合并具有大于99％纯度的级分来制得每种肽的最终制备物。肽 的最终制备物的分子量通过质谱法ESI-MS来进行验证。
在配备有Z-喷射电雾化电离源的、具有八角形几何形状的混合型 质谱仪QTOF-2TM(Micromass,UK)中获取质谱。所使用的质谱加 工和获取程序为MassLinx,3.5版(Waters,USA)。
实施例2.在Vero细胞中病毒感染的抑制
为了证明本发明的β-发夹合成肽在体外抑制DENV感染的能力， 将所述肽在Vero细胞中在蚀斑形成抑制测定试验中进行评价。
使Vero细胞在24-孔平板中生长，直至单层达到大约90％汇合。 用没有胎牛血清(FBS)的MEM培养基(极限必需培养基)洗涤单 层两次，添加肽的稀释物，并且典型地在37℃下温育1小时。接着， 以0.001的感染复数(m.o.i.)添加病毒(DENV血清型2，NIBSC编 码S16803)，并且在37℃下重新将细胞温育1小时。在用病毒进行的 温育结束时，重新洗涤细胞以去除未结合的病毒，并且在37℃下在高 密度培养基(补充有非必需氨基酸、1％FBS、1％羧甲基纤维素的 MEM)中温育5天，以有助于裂解斑的形成。对于染色，使用在0.15 M乙酸钠中的0.1％萘酚蓝黑。在每个实验中，以每个点两次重复来 进行检定，并且进行三次独立的测定。
β-发夹肽的毒性效应借助于MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2- 基)-2,5-二苯基四唑Invitrogen,USA)方法(Mosmann,T.(1983).J. Immunol.Methods 65,55-63)并经由通过使用Newbauer计数室的细 胞计数来进行测定。用200μL/孔的处于1×105个细胞/mL的Vero细 胞的细胞悬浮液接种96-孔平板(Costar,USA)。温育平板直至达到 大约90％汇合，典型地18-24小时。将细胞用DMEM培养基(Dulbecco 改良的Eagle培养基)洗涤2次，然后添加50μL/孔的待评价的肽和/ 或添加物的稀释物。作为毒性的阳性对照，使用溶解在PBS中的Triton X-100TM。将平板在37℃和5％CO2下温育2或24小时。对于细胞单 层，采用两种不同的毒性测定：
a)添加50μL/孔的在PBS中的2mg/ml的MTT溶液。将平板在 37℃和5％CO2下温育四小时。在平板中，撤去培养基，并添加100μL/ 孔的DMSO以溶解甲月朁沉淀物。最后，在平板阅读器(Sensident ScanTM,Merck,Alemania)中于540nm处测量光密度(OD)。
b)用200μL/孔的DMEM培养基进行洗涤，然后添加50μL/孔 的胰蛋白酶(Sigma,USA)。通过添加150μL/孔的补充有10％FBS 的DMEM培养基来使胰蛋白酶失活。然后，通过使用活体染料锥虫 蓝(Gibco,USA)来对细胞进行计数。通过使用统计学程序GraphPad Prismv5.3来分析数据。用“log10(浓度)vs应答”曲线模型来进行非 线性回归拟合。
表2显示了相应于在Vero细胞中β-发夹肽针对DENV2的抗病毒 活性的IC50值，以及其毒性和选择性指数。在该系统中所有肽都具 有抗病毒活性，其中肽PHB2、PHB3、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9 比肽HDIII3CL更强有力。在该体外系统中，肽PHB3、PHB5和PHB8 的活性仅稍微更优，而肽PHB1、PHB6和PHB7较不强有力。肽PHB4 具有在nM范围内的抗病毒活性，并且显示出4333的选择性指数，这 是非常有利的。该肽是作为针对DENV的抗病毒药物候选物的具有优 异特性的先导分子。
结果证明，肽HDIII3CL的链间环是可有可无的，因为在本发明 的β-发夹肽的序列中，已去除了具有六个残基的环。取而代之，引入 了具有两个中心残基的β-转角，其没有保持与DIIIE的环的原始序列 的(部分的序列)相似性。所述肽的该特征在其用于继发感染的情况 下是有利的，因为所述环是抗病毒抗体应答的免疫显性区域 (Sukupolvi-Petty S.等人,(2007).J Virol.,81(23):12816-26)。这些预 先存在的抗体可以中和基于FGβ-发夹的肽的抗病毒活性，并且在本 发明的肽中环的去除消除了可能的被这些抗体的识别。
所获得的结果还暗示了所述β-发夹肽的数个残基在抗病毒活性中 的有利作用。在链间β-转角的中心位置处赖氨酸(d-赖氨酸)的存在 的情况就是如此。肽PHB5比PHB6更强有力，并且它们之间的差异 仅在于转角的序列，即在PHB6中不包含赖氨酸(表1)。该观察结 果还支持这样的事实，即PHB2和PHB4比其对应物PHB1和PHB3 (其在环的中心位置处也不具有赖氨酸)更强有力。该赖氨酸在功能 上/在结构上模拟该病毒的DIIIE的残基Lys385。另一个有利的特征 是在等价于DIIIE的残基377(病毒DENV3的包膜蛋白的编号)的位置处酪氨酸残基的存在。包含残基Tyr5的肽PHB9的效力比PHB8 (其差异仅在于残基Asn5的存在)更高。该结论也与下述事实相一 致：PHB2(包含Tyr3)和PHB4(包含Tyr5)比其对应物肽PHB1 和PHB3(其在等价的位置处也包含天冬酰胺)更强有力。
结果显示，导致引入四个额外的氨基酸(两个/链)的β-发夹的延 伸对于所述肽的抗病毒活性来说是有利的。肽PHB4(与PHB2相比)、 PHB8和PHB9(与PHB7相比)的效力是更高的。肽PHB4是该系 列中最强有力的，并且是唯一的在其序列中包含所鉴定的三种有利特征的肽。因此，在该实施例中获得的实验数据以其整体方式支持了本 发明的β-发夹肽的设计的本质基础。
表2.β-发夹肽的效力、体外毒性和选择性指数
*，抗病毒活性(50％抑制活性)；NA，在小于或等于100μM的浓度下 不具有抗病毒活性；在1000μM下没有毒性；ND，未测定。
接着，测定了肽PHB4和HDIII3CL针对DENV的四种血清型的 抗病毒活性，以为了比较各自的IC50值。在Vero细胞中在蚀斑形成 抑制测定试验中对所述肽进行评价，对于所述四种血清型(DENV1， NIBSC编号West Pac 74；DENV2，NIBSC编号S16803；DENV3， NIBSC编号CH53489；DENV4，NIBSC编号TVP360)使用0.001 的感染复数。如在表3中所观察到的，肽PHB4针对所述四种血清型 是高度强有力的，其效力是肽HDIII3CL的4000至7500倍，取决于 血清型。PHB4抑制所述四种血清型这一观察结果与提议受体 α2M*/LRP1作为DENV的四种血清型的内吞受体相一致，并且与后 面给出的PHB4与这些蛋白质相结合的证据相一致。
表3.肽PHB4和HDIII3CL针对登革病毒的 四种血清型的抗病毒活性
实施例3.β-发夹肽抑制结构域III与α2M*的结合
人α2M的纯化和激活
从由合并30-40岁的健康人的血浆样品而得到的380mL人血浆 开始来纯化人α2M。将血浆在4℃下逆去离子水透析72小时，其中经 常更换。通过以10000x g离心30分钟来分离出不溶性物质。将上清 液逆PBS(pH 6.0)进行透析；并施加到XK 50/30柱(Amersham,UK)上，所述柱装有事先加载了Zn2+并用PBS(pH 6.0)进行平衡的65mL 的Chelating SepharoseFast Flow(Amersham,UK)。紧接着，将柱 用PBS(pH 6.0)进行洗涤，直至在280nm下洗出液的吸光度达到基 线。通过施加10mM乙酸钠、150mM氯化钠的缓冲液(pH 5.0)来 洗脱经结合的蛋白质。将所收集的蛋白质通过超滤进行浓缩。然后， 将样品施加到装有用PBS(pH 7.8)进行平衡的Superdex 200基质 (Amersham,UK)的凝胶过滤柱上。在具有最高分子量的级分中蛋 白质的存在通过Western印迹测定试验来进行确证，其中使用抗人 α2M的多克隆抗体制备物(Sigma,USA)。对于经纯化的α2M的激 活，将其与200mM甲胺一起在50mM磷酸钠、150mM氯化钠(pH 7.4)中进行温育。将α2M_MeNH2(α2M*)逆50mM磷酸钠、0.5M 氯化钠(pH7.8)进行彻底透析。
竞争性测定试验
肽PHB1-9和HDIII3CL抑制重组DIIIE(DIIIE1J)与蛋白质 α2M*的相互作用的能力通过竞争性ELISA测定试验来进行分析。将 平板用经纯化的α2M*级分进行包被，并且在数种浓度的肽和/或重组 DIIIE(DIIIE1J)存在下与“DIIIE1J-生物素化的”(经纯化的并事先经生物素化的DIIIE1J)一起进行温育。与α2M*结合的“DIIIE1J- 生物素化的”的检测通过使用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物来 进行。重组DIIIE(DIIIE1J)(SEQ IDNo.19)的获得在后面给出， 并且其组成为DENV1 1636毒株的病毒多蛋白的残基289-400(按照 序列PIR:A32401的编号)(Chu,M.C.等人,(1989).Journal of General Virology70(Pt 7),1701-1712)，随后为具有六个组氨酸的序列。
在低μM至亚μM/nM范围内的肽浓度下，β-发夹肽PHB5、PHB7、 PHB8和PHB9显示出对于“DIIIE1J-生物素化的”与蛋白质α2M* 的结合的部分抑制(图3)，并且观察到抑制百分比随肽浓度以单调 方式增加。肽PHB5、PHB8和PHB9是该组中最强有力的抑制剂， 并且达到23％-50％的抑制的值，这与由重组DIIIE所显示的相似。 在所分析的浓度范围内，这三种肽是比肽HDIII3CL更强有力的抑制 剂，它们具有高至2-12倍的抑制百分比，取决于所分析的浓度。
在该测定试验中，肽HDIII3CL达到仅18％的抑制的最大值，这 比最小的β-发夹肽(肽PHB7)的效力还低。该结果表明，如果考虑 与蛋白质α2M*的相互作用，DIIIE的FGβ-发夹的链间环的残基实际 上是可以摒弃的，因为在肽PHB7的设计中，具有6个原始残基的环 被替换成IP型β-转角(具有两个中心残基)。该转角的序列不与原 始的环序列相关(因部分相似性和/或同源性)，该肽的β-转角的残基 是由于基本上结构的原因(高的形成连接β-发夹的IP型转角的倾向) 而被引入的。从肽HDIII3CL的原始环中，在肽PHB7的序列中(和 在肽PHB8和9中)仅保留了赖氨酸11(HDIII3CL的序列)(在该 情况下，其由肽PHB7的赖氨酸9来代表)的功能性。在结构上，这 些赖氨酸占据相似的(在结构上准等价的)空间位置，并因此PHB7 的赖氨酸9在功能上模拟HDIII3CL的赖氨酸11。
除了赖氨酸9(HDIII3CL的Lys11的模拟物)外，PHB7的其他 残基也在结构上/在功能上模拟HDIII3CL的残基：a)Asn3、Lys10和 Asn12模拟HDIII3CL的残基Asn3、Lys14和Asn16(这些是在β-发 夹结构中不通过氢桥连接的残基)，其相应于DIIIE的FG发夹的暴 露面，并因此这些残基是可能功能性的；b)Trp13相应于HDIII3CL 的残基TRP17并且是在黄病毒中严格保守的残基；c)Cys1和Cys14 形成等价于由HDIII3CL的Cys1-Cy18所建立的二硫桥的二硫桥。 PHB7相对于HDIII3CL而言的抑制活性的增加有力地暗示了这些共 同的残基在本发明的肽的功能活性中的推定的作用。
肽PHB8和PHB9是比肽PHB7更强有力的抑制剂。这表明，在 PHB8和PHB9中添加四个残基(两个/发夹)对于本发明的β-发夹肽 的抑制活性作出了有利贡献。
如在图4中所观察到的，β-发夹肽PHB5抑制DIIIE与蛋白质 α2M*的结合，其中具有与由DIIIE-α2M*所显示出的相似的肽-α2M* 相互作用的表观亲和力，在每一种所检验的肽浓度下PHB5的抑制百 分比的值仅比由DIIIE1J所显示的稍低。这些结果表明，本发明的发夹肽的拓扑学结构可以进行修饰。这对于转角的类型也是有效的，其 在PHB5中为IIP型，而在PHB7-9中为IP型β-转角。重要的是在相 互作用中的必需残基的结构等价性，这些必需残基即使在结构上不同 的模型中也类似地进行布置。在PHB8和PHB9的折叠中二硫桥的稳 定化作用被在PHB5的设计中所引入的Trp“拉链”所代替。
本发明的的一个基本要素是在nM范围内的肽的生物学活性的分 析。肽的高效力可以导致更低的治疗剂量，其中具有在下列方面的随 之而来的优点：花费，以及和与高剂量相关联的聚集、非特异性相互 作用、抗原性和免疫原性问题有关的可能的不希望效应出现的可能性 的降低。如在图5中所显示的，在nM/亚μM范围内，肽PHB2、PHB4、 PHB5、PHB8和PHB9具有明显地高于重组DIIIE(DIIIE1J)的抑 制“DIIIE1J-生物素化的”与蛋白质α2M*的结合的活性，其中所观 察到的抑制百分比典型地高至1.5-3倍。在该浓度范围内，由肽HDIII3CL所显示的抑制相比于DIIIE1J而言是非常低的。
实施例4.在DIIIE与α2M*的结合中的必需残基的作图
DIIIE(DIIIE1PRS)的丙氨酸突变体文库的获得
为了能够测定DENV1的DIIIE的哪些残基在与不同配体的相互 作用中发挥重要作用，制备了其突变变体文库，其中每个暴露残基系 统性地被丙氨酸代替(一种以“丙氨酸扫描”更为人所知的技术)， 以便随后研究所述变体中的每一个与所研究的配体的结合。在该类型 的实验中，将关于特定突变体与所研究的配体的结合的任何改变解释 为该突变残基参与原始蛋白质与所述配体的相互作用的证据。
为了制备该文库，从DENV1PRS 288690毒株的包膜蛋白的残基 289至395(该编号按照蛋白质序列GenBank:AAN32775.1)出发 (Goncalvez,A.P.等人,(2002),Virology 303(1),110-119)。将相应于 病毒多蛋白的该片段(其在此被定义为病毒DENV1-PRS 288690毒株 的DIIIE(DIIIE1PRS))的序列鉴定为SEQ ID No.15。
在DENV1的DIII中待突变的残基的选择
决定基本上基于下列方面来进行待突变的残基的事先选择：残基 相对于溶剂而言的可接近性，其通过使用程序包WHAT IF 20050919-1718版(Vriend,G.,(1990),J.Mol.Graph.8,52-6)来估计； 和每个可能的变体相对于原始蛋白质而言在稳定性方面的差异的估 计，其表示为通过FoldX 6.0版(Schymkowitz,J.等人,(2005).Nucleic AcidsRes.33,W382-W388)而计算出的ΔΔG。这些计算基于 DIIIE1PRS(SEQ ID No.15的残基1-105)的同源性模型，其从DENV3 的蛋白E的晶体学坐标(Modis,Y.等人,(2003).Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 100,6986-6991)开始而获得，并且经历能量最小化过程。
最终所选用的选择标准是：高于15％的相对可接近性，和低于4 kcal/mol的ΔΔG。按照该标准而被选择用于突变为Ala的79个位置 以及关于所提及的参数的计算结果显示在表4中。
表4.被选择用于包括在DIIIE1PRS的Ala扫描中的残基
ΔΔG：Ala突变体相对于野生型而言的在稳定性方面的差异(1：没有最小 化的模型，2：经最小化的模型)；％AAC：对于溶剂的可接近性的％。带 阴影的残基相应于具有高于4kcal/mol的ΔΔG的位置。
用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达DIIIE1PRS及其突变变体的重组质粒 的获得
在选择了待被包括在丙氨酸扫描中的DIIIE1PRS的残基后，制备 重组质粒以用于其以及文库的变体中的每一个在大肠杆菌中的异源表 达。这通过下述方式来进行：通过Agarwal等人的方法(Agarwal KL 等人,(1970),Nature 227,27-34)并且从经由亚磷酰胺方法(Beaucage SL&Caruthers MH(1981).Tetrahedron Letters,22,1859)在固相上合 成的寡核苷酸开始，合成双链DNA分子，其编码DENV1PRS 288690 毒株的蛋白E的残基289-400(蛋白质序列GenBank:AAN32775.1) (Goncalvez,A.P.等人,(2002).Virology 303(1),110-119)，随后为具 有六个组氨酸的序列。在此，将所编码的蛋白质定义为重组DIIIE1PRS(rDIIIE1PRS，SEQ ID No.17)。所合成的双链DNA分子(SEQ ID No.16)包含对于限制酶NdeI和Xho I的切割位点，其被设计用于其 同相插入到质粒pET22b(Novagen Inc.,USA)中。在用限制酶Nde I 和Xho I于由制造商所明确说明的条件下消化该多核苷酸后，将其通 过使用T4DNA连接酶于由制造商所明确说明的条件下连接至事先以 相同方式进行消化的质粒pET22b(Novagen,Inc.)。将所获得的反应 混合物按照Sambrook等人(Sambrook J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual.New York,USA:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)转化到大肠杆菌XL-1Blue株(Bullock WO等人,(1987).Biotechniques,5:376-8)中，并且对在于选择培养基上获得的菌落中 所存在的质粒进行探查、纯化和测序，最终选择其序列相应于所期望 的序列(给予其名称pET-DIII DENV1(SEQ ID No.18))的质粒， 其呈现在图6中。
用于表达先前选择的DIIIE1PRS的79个突变变体的重组质粒的 构建以相同方式来进行，但在该情况下合成这样的双链DNA分子， 其中相应于待突变的残基的密码子序列被序列GCG(其相应于丙氨酸 的密码子)代替。在每个变体中被代替的密码子连同其所编码的氨基 酸一起显示在表5中。
表5.在DIIIE1PRS的突变体文库的每个变体中， 被丙氨酸代替的残基以及被GCG代替的相应密码子
将DIIIE1PRS的突变体文库的质粒转化到大肠杆菌中和将所获得的克隆冷冻保存
为了获得包含用于在大肠杆菌宿主中表达所选择的DIIIE1PRS 变体的质粒的大肠杆菌克隆，制备大肠杆菌BL21(DE3)株的感受态细 胞(Studier,F.W.&Moffatt,B.A.(1986)J.Mol.Biol.189(1),113-130) 并将其分成等分试样，将所述等分试样中的每一个分开地用20ng的 在所述突变体文库的质粒中的仅一种进行转化，其中使用常规方法(Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual.1989. New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。将经转化的 等分试样分开地接种在包含100μg/mL氨苄青霉素的LB-琼脂培养基 平板上。在于37℃下12小时的生长期后，从每一个板中选择良好隔 离的菌落，将其接种在处于试管中的5mL的补充有100μg/mL氨苄 青霉素的液体LB培养基中。将所得的培养物在搅拌下(200rpm)于 37℃进行温育直至出现可见的混浊，然后分开地在无菌条件下于25℃ 以3000x g离心20分钟，将每个重悬浮在250μL新鲜的LB+250μL 40％(v/v)甘油中，并又分成100μL的等分试样，将其贮存于-70℃。
DIIIE1PRS的突变变体的纯化
在获得了用于表达DIIIE1PRS的突变体文库中的每一种变体的 经冷冻保存的大肠杆菌克隆的集合之后，最后以小规模纯化所述变体 中的每一种。在每种情况下，这通过下述方式来进行：在具有50mL 的补充有100μg/mL氨苄青霉素的ZYM5052培养基(Studier,F.W. (2005).Protein Expr.Purif.41(1),207-234)的1L的锥形瓶中接种包 含相应质粒的大肠杆菌克隆的一个经冷冻保存的等分试样，将所得的 培养物在37℃和300r.p.m.下温育12小时。在所述时间段结束时，将 培养物于25℃以3000x g离心20分钟并弃去上清液，将所得的生物 质重悬浮在19mL的包含6M GuHCl的AG缓冲液(1X PBS，0.3 mol/L NaCl，20mM咪唑)中，并且通过在配备有U200-14探头的超 声发生器中以最大振幅和70％的功率进行超声处理30秒钟来消除匀 浆物的粘性。接着，将匀浆物通过于25℃以3000x g离心45分钟来 进行澄清，并将上清液与0.3mL的Ni2+-氨三乙酸-琼脂糖(Ni-NTA 琼脂糖,Qiagen,Germany)一起在25℃下在摆动的摇动器上温育1小 时。在该时间段后，将树脂通过重力装入空的NAP-10柱(GE Healthcare,USA)中，并通过重力顺次地用一系列具有在6M和1.2M 之间的逐渐降低的浓度的GuHCl的AG缓冲溶液和最后用A缓冲液 (1X PBS，0.3M NaCl，20mM咪唑)进行洗涤。接着，将柱在0.3mL 的E缓冲液(1X PBS，0.3M NaCl，300mM咪唑)中进行平衡，并 且用E缓冲液来洗脱蛋白质。通过凝胶过滤(Sephadex G-25)，将 洗出物缓冲液立即变换成1X PBS。所得的制备物的总蛋白质浓度通过 双金鸡宁酸方法(Smith,P.K.(1985).Anal.Biochem.150(1),76-85) 来进行测定，在这之后将10μL的每种制备物通过在还原条件下的 SDS-PAGE(Laemmli,U.K.(1970).Nature 227(259),680-685)来进行 分析以保证不存在降解。将经纯化的DIIIE1PRS的变体的集合贮存于 -20℃直至其使用。
竞争性测定试验
DIIIE1PRS的丙氨酸突变体抑制重组DIIIE与蛋白质α2M*的相 互作用的能力通过竞争性ELISA测定试验来进行分析。将平板用经纯 化的α2M*级分进行包被，并且在数种浓度的属于上面所描述的单突 变体文库的每个DIIIE1PRS的丙氨酸突变体存在下与“DIIIE1PRS- 生物素化的”一起进行温育。与α2M*结合的“DIIIE1PRS-生物素化 的”的检测通过使用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物来进行。将 光密度值拟合成剂量-应答曲线，并计算相应于每个突变体和重组蛋白 质DIIIE1PRS(天然序列)的IC50值。
如在图7中所观察到的，结构域III的五个残基(Lys361、Glu262、 Pro264、Val365和Lys385)通过丙氨酸来进行的突变引起超过一个 数量级的IC50值的增加(亲和力的降低)。考虑到在IC50值降低方 面的两倍的阈值，全部13个残基以该量值影响相互作用。除了已经提 及的五个残基外，在该组中还包括残基Glu342、Thr34、Arg350、 Lys363、Asn366、Pro372、Gly374和Glu375。
DIIIE与蛋白质α2M*的结合牵涉该结构域的表面的两个独立的 斑片(图7和8)，其中一个位于上表面(N-末端所位于之处)和另 一个位于下表面(该结构域的C-末端)。上表面的斑片包含对相互作 用贡献最大的残基，包括其通过丙氨酸进行的突变引起在亲和力方面 的超过10倍降低的五个残基。因此，可以认为所述斑片为在病毒的 DIIIE与蛋白质α2M*之间的相互作用的初级位点。该斑片通过线性区 段Lys361-Asn366和通过残基Lys385(作为必需残基)来成形。
位于该结构域的下表面的第二个斑片(图7和8)由残基Glu342、 Thr346、Arg350、Pro372、Gly374和Glu375来限定。由于这些残基 被丙氨酸置换而引起的亲和力的降低相比于上部斑片而言是较低的， 因此其可以被认为是次级相互作用位点。
在DIIIE与蛋白质α2M*的相互作用位点的作图中所获得的结果 有力地支持了本发明的β-发夹肽的设计的基础。所述肽具有在结构上 /在功能上模拟DIIIE的残基Lys385(其是单个地对相互作用贡献最 大的氨基酸)的赖氨酸残基(超过22倍的在亲和力方面的降低，当突 变为丙氨酸时)。所述肽的模拟该残基的残基为：PHB2的Lys8和 PHB5的d-Lys8，PHB1、PHB6和PHB7的Lys9，PHB4的Lys10， 以及PHB3、PHB8和PHB9的Lys11。
当考虑与蛋白质α2M*的相互作用时最强有力的五种发夹肽(图 5，实施例3)中的四种(PHB4、PHB5、PHB8和PHB9)具有在结 构上/在功能上模拟DIIIE的残基Glu375的残基。该残基是在该实施 例4中所确定的次级结合位点的最重要的残基。所述β-发夹肽的模拟所述残基Glu375的残基为：PHB3、PHB4、PHB8和PHB9的Glu3； 以及PHB5和PHB6的Glu16。因此，本发明的抑制与α2M*的结合 的最强有力的肽同时具有模拟在该实施例中所描述的初级和次级斑片 的最重要残基的残基。
实施例5.超分子结构的形成
肽PHB4的聚集动力学
使用光散射来监测肽PHB4的聚集。光散射的测量在分光荧光计 ShimadzuTM RF-5301 PC(Shimadzu,Japan)中进行。通过使用由该 仪器的制造公司所提供的程序来获取数据。将入射(激发)和散射(发 射)光束的波长调整至320nm，其中具有5nm的激发和发射孔径。 肽的散射通过从由肽溶液所散射的光的强度中减去由没有肽的溶液 (空白)所散射的光的强度值来计算。由于其溶解在PBS中而产生的 肽的散射的变化通过以时间过程方式(采用一次或两次测量/秒这样的 频率)实施测量来进行研究。肽在PBS中的溶液从肽在水中的溶液开 始通过在2X PBS中进行1:2稀释来制备。
一旦溶解在PBS中且在少于2分钟的潜伏时间后，由肽所散射的 光的强度在最初30-40分钟期间迅速增长，然后继续以线性动力学缓 慢地增加直至300分钟(最大研究时间)。图9显示了对于10μΜ和 5μΜ的肽浓度所获得的相对于在零时间处的分散值而言的散射光强 度的变化图。肽的行为在两种浓度下是相似的，尽管在5μΜ下所 观察到的的最大值大于在10μΜ下所观察到的(11对7)，这暗 示在较低的肽浓度下发生的聚集最终导致形成具有相对于原始平均大 小而言更大的平均大小的聚集体。所述图用SigmaPlot 10.0(Systat Software Inc.)来绘制。
通过透射电子显微镜术来研究肽PHB4的超分子结构的形态
为了鉴定由肽PHB4所形成的聚集体的形态，使其经历不同的与 聚集过程相关联的实验条件：温度、温育时间和电解质的存在(图10)。 为了该研究，制备以2mg/ml(0.73mM)的浓度的该肽在水和PBS 中的样品。将这些中的一个部分直接固定在方格网中并在显微镜下进 行观察(样品T0)。将每个样品的第二个部分在50℃下温育1小时 并随后立即固定(样品T1)，而将第三个部分在热处理后在环境温度 下维持额外两个小时的时间(样品T2)。
如在图10A中所观察到的，在水中的肽在环境温度下形成直径为 5-20nm的颗粒。在这些颗粒的基础之上，在50℃下的处理诱导了5-10 nm的初原纤维/原纤维类型的丝状结构的形成(图10E)。在水中原 纤维的形成需要潜伏时间，因为在热处理后仅在样品T2中检测到它 们。纤维的形成机制在离子强度存在下(PBS)是非常有利的，其中 紧接在将肽重悬浮在PBS中后观察到存在有直径为5-20nm的丝状结 构(图10B)。在将样品于50℃加热一小时后纤维变得更多(图10D和10F)。上面的结果证明，肽PHB4的聚集是一个由温度和由离子强度(PBS)的存在促进的过程。
该研究清楚地表明，肽PHB4形成超分子聚集体，其形态取决于 环境条件和温度。纤维状结构的尺寸与淀粉状蛋白类型的结构的形成 相一致，其特征在于通过延伸的β-片层的形成而伸长的纤维的增长。
蛋白质的聚集过程由蛋白质分子之间的排斥相互作用和吸引相互 作用之间的平衡来控制(Juárez,J.等人,(2009)Biophysical Journal 96[6],2353-2370)。已知向蛋白质溶液中添加电解质使得原纤维形成 速度的增加成为可能，这是屏蔽了蛋白质分子之间静电排斥的结果， 其中促进使得聚集体的形成成为可能的分子间相互作用(Juárez,J.等人,(2009)Biophysical Journal 96[6],2353-2370；Sagis,L.M.等人, (2004).Langmuir20,924-927)。同时，分子间相互作用过程的动力学 随温度的增长而得到促进，其是在蛋白质聚集体的诱导中的基本因素。 实施例6.β-发夹肽与受体LRP1的片段的相互作用的研究
已知使用干扰DENV与称为LRP1的受体的相互作用的分子阻断 对于细胞的感染(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。
LRP1是一种膜内在蛋白质(图11A)，其由非共价地缔合的大 约500kDa的α链和85kDa的β链形成(Anna P.Lillis等人,(2008) Physiol Rev 88:887-918)。胞外区由α链和β链的片段构成。β链还 包含一个跨膜区段和两个NPxY序列，所述NPxY序列用作与牵涉信号传导和胞吞作用的蛋白质偶联的位点。LRP1是可以内化多于30种 不同配体的组成性胞吞受体，并且与许多具有至关重要的重要性的功 能(例如，脂质代谢、止血、溶酶体酶的激活和神经传递)相关。
LRP1的α链介导与LRP1的胞外配体的相互作用。该链具有 LRP1所划归的低密度脂蛋白受体家族的成员蛋白质的典型的结构性 结构域构造。特别地，LRP1包含四个集群，其分别具有2个(簇I)、 8个(簇II)、10个(簇III)和11个(簇IV)与补体蛋白质的富含 半胱氨酸的区域这样类型的配体结合的位点。在每一个配体结合位点 集群之后接着的是与表皮生长因子具有相似性的结构域(其由富含半 胱氨酸的区域来成形)和YWTD结构域。
为了评价LRP1的配体结合结构域与DENV的DIIIE的直接相互 作用，使用包含与6His尾巴相融合的下列残基的重组蛋白质(SEQ ID No.19-22)：相应于病毒毒株“牙买加/CV1636/1977”的DENV1的 残基289-399(DIIIE1J)；DENV2“牙买加1409”毒株的残基289-399(DIIIE2)；DENV3H-87毒株的残基287-397(DIIIE3)；和DENV4 “多米尼加814669”毒株的残基289-399(DIIIE4)，如在图11C中 所呈现的。蛋白质DIIIE1J和DIIIE2-DIIIE4通过在大肠杆菌中的异 源表达来获得，并且通过具有金属螯合物的亲和层析来进行纯化，从 而获得具有大于90％纯度的制备物，如在SDS-PAGE分析中所证明 的那样(图11D)。还使用三种重组蛋白质，其包含与IgG1类型人 免疫球蛋白的恒定区(R&D Systems,USA)相融合的LRP1的簇II、 III和IV(分别命名为sLRP1-CII(SEQ ID No.23)、sLRP1-CIII(SEQ ID No.24)和sLRP1-CIV(SEQ ID No.25))(图11B)。
相互作用的评价通过ELISA类型的测定试验来进行，其中将96- 孔平板用10μg/ml的蛋白质DIIIE1J和DIIIE2-DIIIE4进行包被，用 牛血清白蛋白(BSA)进行封闭，并在37℃下与在20mM Hepes缓冲 液(pH 7.0)、150mM NaCl、1mM CaCl2、0.05％Tween 20中的浓 度为10μg/ml的sLRP1CII、sLRP1CIII和sLRP1CIV一起温育1 小时。在洗涤之后，将平板在37℃下与抗人IgG-过氧化物酶缀合物的 1:1000稀释物一起温育1小时，并使用底物邻苯二胺/H2O2来进行揭 示。所获得的结果显示了所述四种血清型的DIIIE的相似的相互作用 模式，其中用蛋白质sLRP1-CIV和sLRP1-CII获得了较大的反应性 (sLRP1-CIV>sLRP1-CII)，而用蛋白质sLRP1-CIII则未检测到反 应性(图12)。
为了研究所述肽与所述受体的可溶性片段的相互作用，使用 Biacore X设备，其采用称为表面等离子体共振的光学原理用于检测。 为了使用该技术，将待研究的分子之一固定化在构成测量室的面之一 的芯片表面上。另一分子以溶液形式进行使用，并在受控流条件下流 过测量室。相互作用物的缔合和解离以RU来进行测量，并且按照时 间在称为传感图的图中可视化。以该方式还可能的是，无需对分子进 行标记就能获得关于相互作用的详细信息。
为了进行测量，将蛋白质sLRP1-CIV以高密度条件(参见表6) 固定化在CM5芯片(General Electric Healthcare,USA)的沟道中。 在同一芯片的另一沟道中固定化重组HSA(HSArec)(Sigma-Aldrich, USA)。从对于所述蛋白质之一所达到的RU密度出发，并考虑到每 一个sLRP1-CIV分子中11个潜在的相互作用位点和每一个HSA分子 中一个位点的存在，获得了关于这两种蛋白质的相似的每单位表面的 结合位点密度(pmol/mm2)。
表6.用于评价与sLRP1-CIV的相互作用的 CM5芯片的表面的特征的概括
为了评价经固定化的蛋白质的反应性，使用两种已知的LRP1的 配体：α2M，和称为受体相关蛋白(RAP，Receptor associated protein) 的蛋白质。以前已证明，这两种蛋白质与受体LRP1的簇IV相互作 用(Jaap G.Neels等人,(1999).Journal of BiologicalChemistry,274,44: 31305-31311)。在图13中，正如可以看出的，α2M和RAP的施加 仅在相应于sLRP1-CIV的沟道中引起信号(RU)的增加，而在相应 于HSArec的沟道中未观察到任何信号增加。该结果证明，经固定化 的蛋白质sLRP1-CIV能够建立与这两种配体的特异性相互作用。
以高密度进行的固定化应当有助于具有比蛋白质小的大小的分子 (例如可以是肽)的特异性相互作用的检测。然而，在该条件下，质 量传递限制现象和建立与多于一个的配体分子的多价结合的可能性使 得测定相互作用的动力学常数变得困难。为了更详细地表征 sLRP1-CIV的表面的反应性，施加不同稀释度(0.6-20μΜ)的蛋白 质RAP，并在相互作用平衡条件下记录RU(250秒，参见图13B)。 通过将对于不同稀释度而达到的最大RU针对浓度进行绘图而获得曲 线显示了与双位点相互作用模型拟合的行为，其表明存在KD为4.2nM的高亲和力相互作用和KD为1.1μΜ的低亲和力相互作用。该行 为与在关于RAP与受体LRP1的相互作用的不同研究中所获得的结果 (其表明RAP可以以在6-18nM范围内的亲和力建立与LRP1的簇 II和IV的多点相互作用)相一致。然而，还从某些在多价结合中发 生的相互作用的丧失开始而获得了在μM范围内的亲和力值。因此， 在该工作中所使用的sLRP1-CIV表面上的亲和力处于μM级别的相互 作用的获得可以从在芯片表面上的高蛋白质密度(其有助于在较大的 RAP浓度下影响多价结合)来进行解释。这些结果还指明，经固定化 的蛋白质sLRP1-CIV复制了对于LRP1与RAP已经描述了的相互作 用的特征。
对于sLRP1-CIV的同一表面，以20μΜ的浓度施加在运行缓冲 液中进行稀释的肽的不同变体。在所获得的结果中，对于不同的肽变 体看出不同的相互作用水平。在所述肽的情况下，所获得的信号的量 值与其聚集形式的结合相一致。因此，所获得的信号可以是在肽与受 体中的相互作用位点之间的相互作用的内在亲和力或者单一相互作用 的强度方面的增加的结果，以及是由于被掺入到聚集结构中并具有与 受体的不同相互作用位点建立相互作用的能力的肽单元的数量的增加 而引起的亲和力提高的结果。
在HDIII3CL家族的肽(表1的肽10-14)的情况下，对于变体 HDIII3CL2获得了最高的结合水平。在变体HDIII3CLW和 HDIII3CLK的情况下，还获得了证明这些肽具有一定水平的与经固定 化的蛋白质结合的曲线。然而，这两种变体的信号比对于肽HDIII3CL 所获得的信号小，这表明残基W17和K14的独个置换导致更小的与 sLRP1-CIV的结合。对于变体HDIII3CLC所获得的信号表明，通过 残基C1和C18的置换(和二硫桥的随后消除)对于相互作用所产生 的影响仅允许该肽与sLRP1-CIV的边缘相互作用。该结果与由所述肽 所显示的抗病毒活性效力相一致；相对于HDIII3CL而言显示出与受 体的结合降低的HDIII3CLC、HDIII3CLW和HDIII3CLK在Vero 细胞中不具有针对DENV2的抗病毒活性(参见表2)。相反，对于 HDIII3CL2所观察到的与受体的结合的增加未表现在相对于 HDIII3CL而言的抗病毒活性的增加中(参见表2)。该结果表明，与 受体的结合本身是必需的，但对于抗病毒活性来说不是足够的。一种 可能的解释是，肽HDIII3CL2的一部分与在病毒-受体相互作用中不 重要的和/或以非常低的亲和力进行结合的该受体的位点相结合。考虑 到受体LRP1和/或其簇是多结构域的，这样的情形是合理的。肽 HDIII3CL2和HDIII3CL之间的差异是：前者具有一个额外的C-末 端赖氨酸。因此，所述肽是更加阳离子的，并且可能具有额外的与阴 离子性质的受体LRP1的静电类型的相互作用。此外，所述赖氨酸21 不构成发夹的一部分，所述发夹是模拟在本发明中和以前(Huerta G.V. 等人,WO 2007/124698)所描述的DIIIE的功能性斑片的拓扑学区域。
以相同的方式评价了β-发夹肽PHB1、PHB2、PHB3、PHB4、 PHB5、PHB8和PHB9与sLRP1-CIV的表面的相互作用。如在图14B和14D中所显示的，对于肽PHB4获得了显著更高的结合水平，所述 肽PHB4还是在抗病毒活性测定试验中最有活性的。肽PHB2、PHB4 和PHB9也显示了比对于肽HDIII3CL所观察到的更高的最大结合(图14A和14C)，这与它们的更高的抗病毒活性相符。此外，在具有相 同大小和β-转角类型的肽PHB1-2、PHB3-4和PHB8-9之间所观察到 的最大结合的比较显示，肽PHB2、PHB4和PHB9是比其对应物 PHB1、PHB3和PHB8更好的结合剂，与对于抗病毒活性(在实施例 2中所研究的)所观察到的相似地。
实施例7.β-发夹肽的抗病毒活性与其结合受体LRP1和蛋白质α2M* 的能力之间的相关性
以前已提出了作为DENV的推定的胞吞受体的受体LRP1，和在 病毒进入细胞的过程中具有可能的载体蛋白作用的蛋白质α2M* (Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。
在实施例6中证明了，本发明的β-发夹肽能够与受体LRP1的片 段相结合。在本实施例中，探察在实施例2中所观察到的抗病毒活性 是否与所述肽与受体LRP1结合的能力定量地相关。如在图15中所观 察到的，在Vero细胞中的抗病毒活性的IC50值的对数(-pIC50)显 示出与在运行400s时所观察到的Biacore信号(RUrem)的线性关系。 在该情况下，显示了共有相同的拓扑学结构的PHB肽(按照表1)。 肽PHB4显示出比其余肽高得多的在抗病毒活性方面的效力，但还观 察到超越了其余肽的行为的该肽与受体的结合。即使抽出相应于PHB4的数据，线性也得到保留(图15中的插入图)，线性回归系数 R2为0.99(在考虑PHB4的情况下)，和0.97(如果没有PHB4)。 插入图的数据的分析预测，如果保持关于PHB4的线性行为，那么在 Biacore中所观察到的与受体结合的值与在nM范围内的高的抗病毒 活性效力相符。这样的所期望的效力与在实施例2中通过实验而观察 到的相一致。
该系列的具有相似拓扑学结构的肽的抗病毒活性的pIC50数据显 示出与RUrem值的在统计学上显著的相关性，r(皮尔逊)＝-0.9957 和P<0.0001。在从数据中排除肽PHB4的情况下，相似地获得r(皮 尔逊)＝-0.9868，P＝0.0018。用程序GraphPad Prism v5.03来实现 相关性分析、线性回归和图。
这些结果与通过影响在病毒与受体LRP1之间的相互作用(其导 致病毒向细胞中的生产性进入的抑制)而介导的PHB肽的抗病毒作用 机制相一致。
在考虑到PHB肽在亚μM/nM范围内抑制DIIIE与蛋白质α2M* 结合的能力的情况下，进行相似的分析。如在实施例3中所显示的， 在所述浓度范围内，所述肽部分地抑制“DIIIE1J-生物素化的”与蛋 白质α2M*的结合，其中肽PHB2、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9明 显地优于重组DIIIE(DIIIE1J)，并且所述肽显示出典型地高至该结 构域的1.5至3倍的抑制百分比。PHB肽的抑制能力(相对于重组 DIIIE的抑制能力而言)与在Vero细胞中抑制DENV2感染的能力相 关，正如在图16中所观察到的。在IC50值和与α2M*的结合的抑制 百分比(相对于重组DIIIE的抑制而言来表示)之间的斯皮尔曼 (Spearman)相关系数为Rs＝-0.9762，P＝0.0004。该结果暗示，本 发明的β-发夹肽可能在病毒进入细胞的过程中干扰蛋白质α2M*的作 用。
实施例8.改变聚集作用的试剂对于肽PHB4的抗病毒活性的影响
在不同的改变聚集作用的因素存在下，在有助于形成聚集体的条 件下进行处理后评价肽PHB4的抗病毒活性，以便评价其对于由 DENV2(S16803毒株)引起的Huh 7.5细胞感染的抑制活性的影响。 Huh 7.5细胞系源自人肝细胞瘤。选择该细胞系是鉴于这些细胞对于 DENV2感染是高度敏感的，并且是从在人中感染的发病机制的观点来 看重要的系统(Lin YL等人,(2000)J Med Virol.,60(4):425-31)。
从在实施例5中所获得的结果(其证明了肽PHB4在水至具有更 大离子强度的介质中溶解的步骤改变聚集结构的大小和形态)开始， 采用一般性的实验设计，其中以肽在水中的溶液为出发点，并进行在 (i)MEM培养基或(ii)PBS中的稀释，在待评价的不同条件下。这两种溶液分别包含6.8g/L和8.0g/L的NaCl，并且调整至pH 7.4。
在病毒产量测定试验中评价抗病毒活性。为此，将Huh 7.5细胞 的单层(80-90％汇合)用没有补充物的DMEM培养基(DMEM s/FBS) 洗涤两次，并且在不同的肽PHB4制备物存在或不存在下在37℃和5％ CO2下以0.01的m.o.i感染2小时。通过用DMEM s/FBS进行洗涤来 除去病毒接种物，并添加200μL/孔的补充有2％FBS的DMEM培养 基。在感染后24小时收集被感染的细胞的上清液，并且通过经由裂解 斑形成测定试验(Morens D.M.等人,(1985).N.J.Clin.Microbiology, 22:250-254)对上清液进行滴度测定来测定病毒产量。
已知温度是影响自装配成超分子结构的肽的聚集过程的动力学的 一个因素(SabatéR.等人,(2012).Biomacromolecules,13(2):474-83)。 在第一系列的测定试验中，以20μΜ的肽在水中的溶液为出发点，并 制备在MEM中的在10-0.01μΜ范围内的稀释物，将其在10℃下和 在37℃下平行地温育2小时。作为对照，使用肽在MEM培养基中的 相同的稀释物，其在用于该测定试验中之前不进行温育。
结果显示，溶解在MEM培养基中的肽能够以依赖于浓度的行为 和0.16μΜ的IC50值抑制病毒感染，其中在10μΜ的浓度下达到感 染的完全抑制(图17，表7)。然而，在10℃下在DMEM培养基中 肽的预温育引起效力的增加，达到0.037μΜ的IC50值；而在37℃下， 具有直至0.89μΜ的值的IC50的增加。这些结果表明，在这两种温 度下进行的肽的温育正改变肽的聚合，其中使得其作为抗病毒试剂的 效力变化了总共24倍。
表7.在10℃和37℃下进行温育的肽PHB4的IC50值
通过使用统计学程序GraphPad Prism v5.3，经由非线性拟合来测定在每种 实验条件下IC50的调整。*在括号中指明了所述拟合的回归系数(R2) 的值。
为了调查聚集体的生长时间对于抗病毒活性效力的影响，设计了 一个实验(图18)，其中以不同的时间区间将肽在PBS中进行温育， 随后在相同体积的在DMEM中的80mg/ml HSA之中进行稀释，以便 检测聚集。HSA是强有力的改变聚集作用的试剂。证明了，HSA可以抑制淀粉状蛋白的β-肽的原纤维的初始形成和生长(Reyes A.等人, (2009)Journal ofBiological Engineering,3:5)。在10℃下和在37℃ 下平行地进行与HSA的温育(图18)。为了评价抗病毒活性，制备 在DMEM中的HSA(以40mg/ml)之中的肽的稀释物。
如在图19中所观察到的，在该测定试验中所使用的条件下，获得 了倒U形的剂量-应答行为，这表明在抑制活性中存在最佳的肽浓度范 围。已在大量的生物系统的活性中获得了该类型的应答。解释该类型 行为的机制在每个系统中是不同的，虽然共同要素是在所牵涉的分子 之间存在多价相互作用。
所述结果证明，肽的抑制活性对于在PBS中的温育时间(用于形 成具有更大效力的聚集体)敏感，在该情况下效力是指达到将该测定 试验的感染对照的病毒产量减少50％的最小肽浓度。另外，在10℃下 与HSA的温育导致形成具有较小效力的变体，相比于通过在37℃下 进行温育所获得的结果而言。该事实确证，应当存在肽(或肽的在生 长中的聚集体形式)与HSA之间的相互作用，其改变聚集现象的演化 并允许形成具有高效力的变体，从而以1nM-10pM的肽浓度达到感 染的完全抑制，如通过在PBS中温育45-60分钟以及在37℃下与HSA 温育而获得的那样。
肽的初始浓度是另一个参数，已观察到其可以显著地影响聚集过 程的动力学和结果。为了获得关于该参数对于肽PHB4的抗病毒活性 的影响的证据，进行在图20中示意性地描绘的测定试验，其中以在水 中的在100μΜ-2μΜ范围内的不同稀释物为起点，将其在2X MEM 培养基中进行1:1v/v稀释，并在25℃下温育2小时。在该温育结束 时，制备肽在DMEM s/FBS培养基中的稀释物，其立即被用于抗病毒 活性的测定试验中。
在该实验的结果中，观察到肽PHB4的抗病毒活性对于该肽在水 中溶解的初始浓度的依赖性，在将其添加至具有更大离子强度的溶液 中以引发聚集体生长之前(图21)。结果还显示了在剂量-应答行为 方面的变化，其确证了向着不同聚集结构的演化，这取决于肽在水中 溶解的初始条件。最强有力的形式再次显示出以倒U形式的剂量-应答 曲线，并且是对于肽处于在该测定试验中所评价的在水中的最大初始 稀释度这样的条件而获得的。
总之，所获得的结果证明，肽PHB4可以实现具有在nM-亚nM 浓度范围内的效力的聚集形式，这取决于所采用的聚集体形成条件。 重要的是强调，在这些实验中所使用的抗病毒活性测定试验代表了用 于所评价的分子的最严苛测定试验的变化形式之一，因为所述分子仅 在感染的初始阶段中存在，然后通过对细胞的洗涤而被撤去。在该实 验方案中所获得的对感染的抑制与病毒感染细胞的早期阶段(例如， 与细胞表面的结合、内化和膜融合)的抑制相一致。
实施例9.在病毒感染动物模型中的保护作用
为了评价肽PHB4的体内抗病毒活性并将其与肽HDIII3CL进行 比较，将具有12只成年Balb/C小鼠(20g的平均体重)的组通过吸 入乙醚来进行麻醉，并通过用相应于10倍半数致死剂量的病毒制备物 实施颅内注射来进行接种。经麻醉的动物迅速恢复，并在处理后5分 钟就看起来是警醒的。观察动物21天。将肽与病毒一起共接种。接种 物的最终体积在所有情况下均为20μL。通过使用Kaplan-Meier对数 秩检验来评价结果。
表8显示了在用DENV的四种血清型进行的实验中所获得的结 果。在所检验的剂量下，肽PHB4实现了小鼠的完全保护，其比肽 HDIII3CL更强有力。在DENV2的情况下，保护试验进行三次。
表8.在体内测定试验中获得的结果的概括
统计学显著性：***，P<0.005；**，P<0.01；*，P<0.05。ND，未测定。 a：未发现对于所使用的DENV3的毒株来说致死的剂量，因此该评价通过 发病率来进行，考虑了下列征候的存在：毛发竖起、驼背、身体衰弱和下 身瘫痪，以及这些症状的以天表示的持续时间。
实施例10.用于形成金属纳米颗粒的与“组氨酸尾巴”序列相融合的 肽PHB4
如前面所指出的，通过使用合成方法或通过重组DNA技术，可 以单独地或者与蛋白质/肽相融合地来获得本发明的β-发夹肽。如在实 施例5中所证明的，所述β-发夹肽可以聚集，采用不同类型的四级结 构，这取决于肽的浓度，溶剂的性质，以及实验条件，例如温度、pH、 离子强度、超声处理、添加物的存在、与蛋白质(例如HSA)的非共 价结合等。超分子结构也影响肽的抗病毒活性(实施例8)。纳米颗 粒的形成可以导致肽的效力的相当大的增加，其由更大的肽与受体的 结合亲和力来介导。所述肽纳米颗粒可以通过数个肽单体与受体的数 个配体结合结构域的结合而实现与受体的多点结合。纳米颗粒还可以 同时结合多于一个的存在于细胞膜上的受体链。类似地，纳米颗粒的 形成可以对药物代谢动力学特性作出有利贡献，其中增加在血液中的 半寿期、对于蛋白水解的抗性等。
由本发明的PHB肽形成的纳米颗粒可以通过下述方式而额外地 稳定化：将所述肽融合至能够支持以两个或更多个基团“A”/一个基 团“E”的化学计量的与“间隔物”分子或原子(E)的非共价相互作 用的“受者”基团(A)。这种类型的设计允许通过间隔物“E”来进行的两个或更多个PHB肽的缔合。在本发明的一个实施方案中，已通 过合成方式将具有五个组氨酸的“尾巴”的序列与肽PHB4相融合(图 22)。组氨酸尾巴可以作为用于多价金属离子(Zn(II)、Cu(II)、Cu(II)、 Cs，等等)的基团“A”发挥作用。在该情况下，氨基酸组氨酸的侧 链的咪唑基团与金属离子建立配位键，以直至“3-4个咪唑基团/1个 金属离子”的化学计量比。这表明，在足够的金属浓度下，结合至尾 巴的离子可以作为基团E起作用并使肽的二聚化稳定化。
在图23中，示意性地显示了，金属离子可以直接地但也能通过与 辅助螯合剂基团的配位而间接地介导具有可用的咪唑基团的肽的交 织，所述辅助螯合剂基团例如为四阴离子化合物EGTA即乙二醇-双 (2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸和EDTA即2-({2-[双(羧甲基)氨基] 乙基}(羧甲基)氨基)乙酸。在这些情况下，金属离子形成具有“2个金 属原子/1个二氨基四羧酸”的化学计量的EGTA(Me)2和EDTA(Me)2 类型的络合物。在这些络合物中存在的金属离子仍然可以与额外的咪 唑基团进行配位，从而所述络合物可以用作使肽和其聚合体的交织稳 定化的基团“E”(图23)。
图22显示了本发明的两种类型的融合分子：在一种类型中组氨酸 尾巴通过酰胺键而与肽PHB4的C-末端相结合(PHB4H5)，和在另 一种类型中所述尾巴位于N-末端(H5PHB4)。按照先前在实施例1 中所描述的过程来合成和纯化这两种融合肽。
接着，在10mM MES缓冲液(pH 6.8-7.5)中在2mM ZnCl2(其 提供金属离子)或2mM络合物EGTA(Zn2)存在下制备200μM的这 两种肽的储液。络合物EGTA(Zn2)事先通过在8mMZnCl2存在下制 备4mM EGTA的溶液来获得。
单独的以及以与Zn和与EGTA(Zn2)的络合物形式的肽PHB4H5 和H5PHB4的制备物通过在Vero细胞中的针对DEN2病毒(M2C毒 株)的抗病毒活性测定试验来进行评价。将细胞在每种肽制备物存在 下于37℃温育1小时，然后，以0.001的moi添加病毒。在两个小时 后，添加一层高密度培养基，并且于37℃在5％CO2的气氛中温育3 天。作为阴性对照，取在具有相应浓度的ZnCl2和EGTA(Zn2)溶液存 在下进行温育的细胞。通过使用针对病毒包膜的单克隆抗体，采用免 疫焦点(inmunofocus)技术来检测病毒蚀斑。按照下述表达式来计算 抑制百分比：
I＝100-100×NP肽/NP阴性对照
其中I为抑制百分比，和NP为考虑了重复的病毒蚀斑数目的平均值。
如在图24中所观察到的，在20μΜ下，融合肽(单独的，没有 金属添加物)以高的百分比(将近100％)抑制病毒感染；然而，在4 和0.16μΜ下，抗病毒活性消失。相反，肽与间隔物EGTA(Zn2)的络 合物保持了在50-70％的抑制范围内的抗病毒活性。肽H5PHB4的络 合物在0.16μΜ下显示出33％的抑制。
所获得的结果显示，从将肽PHB4与组氨酸尾巴相融合而得到的 肽是更强有力的，当与间隔物试剂(特别是与间隔物EGTA(Zn2))形 成络合物时。

Claims (6)

1.β-发夹肽，其特征在于，所述β-发夹肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.9中任一项。
2.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含一种或多种权利要求1的肽，和至少一种药学上可接受的赋形剂。
3.根据权利要求2的药物组合物，其包含人白蛋白。
4.根据权利要求2的药物组合物，其中所述肽形成超分子聚集体。
5.权利要求1的肽用于制备药物的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述药物用于抑制或减弱登革病毒(DENV)感染、由蛋白质α2-巨球蛋白(α2M)介导的疾病或者由蛋白质LRP1介导的疾病。
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