KR102325400B1 - 뎅기열 바이러스에 대한 항바이러스 속성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드 - Google Patents

뎅기열 바이러스에 대한 항바이러스 속성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드 Download PDF

Info

Publication number
KR102325400B1
KR102325400B1 KR1020167026665A KR20167026665A KR102325400B1 KR 102325400 B1 KR102325400 B1 KR 102325400B1 KR 1020167026665 A KR1020167026665 A KR 1020167026665A KR 20167026665 A KR20167026665 A KR 20167026665A KR 102325400 B1 KR102325400 B1 KR 102325400B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lys
peptide
asp
cys
glu
Prior art date
Application number
KR1020167026665A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160127097A (ko
Inventor
글래이 치네아 샌티아고
비비안 휴르타 갈린도
알레한드로 미구엘 마르틴 던
힐다 엘리사 개래이 페레즈
오스발도 레예스 아코스타
비비아나 파르콘 카마
다이안 푸포 고메즈
알렉시스 예로 디아즈
가브리엘 제우스 마르퀘즈 페레라
모니카 사리아 누네즈
오스매니 구이로라 크루즈
로시오 갈라테이스 수아레즈
카렌 알바레즈 페레즈
소니아 곤잘레스 블란코
마리엘라 바즈퀘즈 카스틸로
루이스 자비에르 곤잘레스 로페즈
Original Assignee
센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아 filed Critical 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Publication of KR20160127097A publication Critical patent/KR20160127097A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102325400B1 publication Critical patent/KR102325400B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 베타 헤어핀 구조의 형성에 최적화된, 구조적으로 제약된 합성 펩타이드를 개시한다. 상기 펩타이드는 뎅기열 바이러스(DENV) 감염을 억제하거나 약화시킬 수 있다. 본 발명은 또한 이 합성 펩타이드들을 함유하는 약학적 조성물을 개시하며, 이는 DENV-유발된 감염의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 유사하게, 본 발명은 이 바이러스에 의해 유발된 감염을 치료하는 방법을 개시한다.

Description

뎅기열 바이러스에 대한 항바이러스 속성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드{BETA-HAIRPIN PEPTIDES HAVING ANTI-VIRAL PROPERTIES AGAINST THE DENGUE VIRUS}
본 발명은 의료 산업 및 제약 산업, 특히 뎅기열 바이러스(dengue virus; DENV)에 대한 항바이러스 활성을 나타내는 합성 펩타이드의 디자인 및 획득에 관한 것이다. 이 펩타이드들의 1차 구조는 베타 헤어핀 구조의 효율적인 형성을 용이하게 하고 DENV의 외피 단백질의 도메인 III(DIIIE)의 기능성 패치를 모방하도록 디자인되었다. 본 발명은 또한 DENV 감염의 예방 및/또는 치료에 사용되는, 이 합성 펩타이드들을 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
DENV는 게놈이 포지티브 센스(positive-sense), 단일 가닥 리보핵산(RNA) 분자를 함유하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 구성된 플라비비리대(Flaviviridae) 과의 일원이다. 플라비비리대 과에는 세 가지 다른 속, 플라비바이러스(Flavivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus) 및 페스티바이러스(Pestivirus)가 있다. 플라비바이러스는 다수가 임상적으로 중요한 질환을 유발하는 70가지 이상의 공지된 바이러스, 예를 들어, 황열병 바이러스(Yellow Fever Virus; YFV) 및 뎅기열 바이러스(DENV)를 포함한다. 인간 질환을 유발하는 플라비바이러스 속의 바이러스는 보통 절지동물(진드기 및 모기) 매개의 바이러스이므로, 이러한 질환들을 근절하는 것은 매우 어렵다(Monath , T. P., F. X. Heinz. 1996. Flaviviruses , p. 961-1034. In: B. N. Fields, D. M. Knipe , P. M. Howley (ed.), Fields virology, 3rd ed., vol. 1. Lippincott -Raven Publishers, Philadelphia, Pa.).
전 세계 열대 지역에서의 DENV 감염은 유행병 수준이 되었고, 최근, DENV의 재출현은 피해 국가의 공중 위생 시스템에서 점점 더 어려운 도전이 되고 있다. 매년 약 1억 건의 DENV 감염이 발생하는 것으로 추정되며, DENV가 풍토병인 지역에 25억명의 사람이 살고 있다(Gubler , D.J . (1998). Clin . Microbiol . Rev. 11, 480-496; Monath , T.P . (1994) Proc . Natl . Acad . Sci USA 91, 2395-2400). 1990-1998년 동안, 매년 DENV 출혈열(DENV hemorrhagic fever; DHF)로 인한 평균 514,139건의 발생 사례 및 15,000건의 사망이 세계 보건 기구(WHO)에 보고되었지만, DHF의 실제 발생률은 몇 배 더 높을 것으로 추정된다. 현재, DENV에 대한 백신은 상업적으로 이용 가능하지 않으며, 이 바이러스에 대한 특이적 항바이러스 치료가 존재하지 않는다.
용어 DENV는 실제로, DENV1 내지 DENV4로 명명된, 항원과 관련하여 및 유전적으로 관련된 네 가지 바이러스 또는 혈청형으로 구성된 복합체를 말한다. DENV는 소수의 모기 종, 주로 숲모기(Aedes aegypti)의 물린 자국을 통해 인간에게 전염된다. 그 결과 발생한 감염의 임상적 징후는 무증상 질환 또는 가벼운 열이 나는 상태에서부터 극심한 DHF 및 잠재적으로 치명적인 뎅기 쇼크 증후군(Dengue shock syndrome; DSS)까지 다양할 수 있다. 가장 극심한 임상적 징후는 바이러스가 1차 감염의 혈청형과 다른 혈청형에 속하는 2차 감염과 관련되어 있다( Kouri GP et al. (1987) Trans Roy Soc Trop Med Hyg ; 72: 821 -823; Halstead , S.B (2003). Adv . Virus Res. 60:421-67). 이 관찰 결과는 항체-의존성 향상 이론을 통해 설명되었으며, 이 이론은 바이러스 감염성이 실제로는 감염성 바이러스에게 Fc 수용체를 통한 표적 세포로의 진입의 추가적인 포트를 제공하는 비-중화 바이러스-항체 복합체의 형성을 통해 향상될 수 있다고 진술한다( Halstead SB . (1988). Science; 239: 476 -481).
바이러스 복제 주기의 첫 번째 단계는 숙주 세포의 표면에서의 비리온의 결합이다. DENV 비리온은 감염성 바이러스와 표적 세포의 초기 상호작용을 중재하는 분자로서 제안된 세포 표면 글리코사미노글리칸에 결합하는 것으로 밝혀졌다. DENV가 결합하는 것으로 밝혀진 또 다른 분자는 DC-SIGN(수지상세포-특이적 세포 내 부착 분자-3-그래빙(grabbing) 비-인테그린) 및 a 수지상세포-특이적 C형 렉틴이다. 하지만, 두 분자 모두 수동적인 역할을 하는 것으로 추정되며, 바이러스를 세포 표면에 축적하거나 생체 내에서 제2 감염 부위로의 확산을 진정시킨다. 바이러스 진입은 추가적인 고친화도 수용체 또는 공수용체와의 차후 상호작용을 통한 수용체-중재 엔도시토시스(endocytosis)를 필요로 하며, 이는 감염성 비리온의 내재화를 초래한다. 후자가 식균작용 구획에 도달하면, 그 결과로 발생한 pH 하락은 바이러스 융합 단백질의 구조적 변화에 의해 중재 되는 바이러스 외피 및 엔도솜 막의 융합 과정을 촉발한다. 이 융합의 최종 결과는 바이러스 캡시드(capsid)의 세포질로의 방출에 이은 게놈 RNA의 방출이다. 이어서, 네이키드(naked) 세포질 바이러스 RNA는 5' 비번역 영역(5'UTR)을 통해 리보솜과 상호작용하고, 이 RNA가 함유하는 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)은 전구체 바이러스 다단백질로 번역된다. 플라비바이러스 속에서, 이 다단백질 전구체는 세 개의 구조 단백질(캡시드(C) 막(prM) 및 외피(E)) 및 바이러스 및 숙주 세포 프로테아제에 의한 동시- 및 후-번역 변형에 의해 얻어지는 다섯 개의 비-구조 단백질(NS1-5)을 함유한다. 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제는 단일 가닥 안티센스(antisense) RNA 카피를 생산하며, 이것은 이어서 포지티브 센스 단일 가닥 게놈 RNA의 합성을 위한 주형의 역할을 한다. RNA의 복제 과정에 수반된 바이러스 단백질은 물리적으로 막 구조에 회합되며, 이는 아마도 소포체(ER)와 관련되어 있을 것으로 밝혀졌다.
복제 후, DENV 게놈 RNA는 캡시드 단백질과 회합하고, 조면 ER의 막을 통해 또는 바이러스-유도된 막 구조에서, 생성된 캡시드는 이미 바이러스 단백질을 함유하는 지질 막 외피로 덮여있는 ER 루멘(lumen)으로 버딩(bud)한다. 이어서, 이 미숙한 비리온은 분비 경로에 들어가서, 결국 성숙한 비리온으로서 세포 외 공간으로 방출된다.
상기 언급된 바와 같이, DENV 게놈은 정확한 길이가 다른 바이러스 혈청형마다 다르고 심지어 같은 혈청형의 균주들마다 다른 ORF를 함유하는(Yabar V,C . (2003). Rev. Peru. Med . Exp . Salud Publica 20, 51-57) 대략 11 kb 길이의 단일 가닥 포지티브 센스 RNA 분자이다(Henchal,E.A . & Putnak,J.R . (1990). Clin . Microbiol. Rev. 3, 376-396). 이 ORF의 5' 근위의 4분의 1은 구조 단백질을 암호화하고, 나머지는 비-구조 폴리펩타이드를 암호화한다(Lindenbach,B.D . & Rice,C.M. (1999). J. Virol. 73, 4611-4621).
DENV 및 다른 모든 플라비바이러스의 단백질 E는 세포 수용체에의 성숙한 비리온의 결합, 바이러스 진입 중 막 융합 및 비리온 조립에 있어서 필수적인 역할을 한다. 따라서, 단백질 E는 많은 필수적인 바이러스 특성, 예를 들어, 숙주 범위, 병독성 및 보호 면역의 유도에 영향을 미친다(Modis,Y ., et al. (2005). J. Virol . 79, 1223-1231).
단백질 E는 53 내지 54　kDa의 범위의 분자량을 갖는다. 단백질 E는 모든 DENV 구조 폴리펩타이드의 가장 잘 보존된 것이며, 60-70%의 혈청형 간 유사성을 나타낸다. 다른 플라비바이러스에서와 마찬가지로, DENV에서 단백질 E가 성숙한 비리온의 표면에서 다이머를 형성한다는 것은 X선 결정학(Modis,Y ., (2003). Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A 100, 6986-6991), 뿐만 아니라 전자 냉동-현미경 연구 (Kuhn,R.J., et al. (2002). Cell 108, 717-725)를 통해 밝혀졌다.
DENV 비리온을 약산 pH(즉, 6.5보다 낮음)에 노출하는 것은 이 다이머들을 분리시키고 그 결과 생긴 모노머의 트라이머로의 재회합으로 이어지는 단백질 E에서의 비가역적 형태 변화를 유도한다. 이 형태 변화는 포유류 세포에서 수용체-중재 엔도시토시스에 의한 DENV 비리온의 내재화 후에 일어나는 바이러스 및 엔도솜 막의 융합에 필수적이다(Modis,Y., et al. (2004). Nature 427, 313-319).
각각의 단백질 E 모노머의 대략 500개의 아미노산 잔기 외에, 80%는 N-말단 엑토도메인의 일부를 형성하고 나머지는 단백질 E를 지질 외피에 고정시키는 막관통 도메인을 형성한다(Chambers,T.J ., et al. (1990). Annu . Rev. Microbiol . 44, 649-688). 이 막관통 도메인은 대략 53개의 잔기의 줄기를 통해 엑토도메인에 결합된다(Modis,Y., et al. (2004). Nature 427, 313-319). 단백질 E 엑토도메인은 차례차례 세 개의 별개의 구조적 도메인, 즉 중심 베타-시트 도메인(도메인 I), 길쭉한 다이머화 도메인(도메인 II) 및 면역글로불린-유사 폴드(fold)를 가진 세 번째 도메인(도메인 III, DIIIE)로 폴딩된다(Modis,Y ., et al. (2003). Proc . Natl . Acad. Sci . U. S. A 100, 6986-6991).
DIIIE는 폴리펩타이드 사슬의 연속적이고 중단되지 않은 세그먼트에 의해 형성된 유일한 단백질 E 도메인이다. DIIIE는, 잔기 294 및 392 사이에서, 단백질 E 엑토도메인의 C-말단 단부에서 발견된다. DIIIE의 구조는 면역글로불린 불변 영역의 구형 도메인과 매우 유사하다(Modis,Y ., et al. (2005). J. Virol . 79, 1223-1231). DIIIE의 3차 구조는 모든 플라비바이러스 중에서 엄중히 보존된 위치 302 및 333의 두 개의 Cys 잔기 사이에서 이황화 결합을 유도한다.
DIIIE는 DIIIE가 잔류 도메인에 관하여 다른 방향을 취하게 하는(Rey,F.A ., et al. (1995). Nature 375, 291-298) 연장되고 플렉시블(flexible)한 10-잔기 링커를 통해 도메인 I에 연결된다(Modis,Y ., et al. (2004). Nature 427, 313-319). 다이머에서 트라이머로의 전이 중에, DIIIE는 가장 극단적인 구조적 변화를 나타내는 도메인이며, 대략 70°회전하고, 질량 중심은 도메인 II을 향해 36 Å만큼 이동한다. DENV 및 다른 플라비바이러스에서, 병독성, 세포 굴성 및 바이러스 숙주 범위를 결정하는 잔기의 대부분이 DIIIE에 위치한다(Rey,F.A ., et al. (1995). Nature 375, 291-298). 유사하게, 많은 중화 반응은 이 도메인에 대한 돌연변이 지도를 방지한다(Modis,Y., et al. (2005). J. Virol. 79, 1223-1231).
단백질 E 및 DENV 비리온의 구조 분석 및 실험으로부터 얻어진 많은 증거가 있으며, 이 증거들은 DIIIE가 추정상 DENV 세포 수용체와 상호작용하는 단백질 E의 영역의 일부라는 사실을 지지한다. 이러한 것과 일치하는 이 도메인의 구조적 특성 중 하나는 DIIIE가 비리온 표면에서 가장 돌출된 도메인이므로, 수용체 부위와의 상호작용에 가장 잘 접근 가능하다는 사실이다(Mukhopadhyay,S ., et al. (2005). Nat. Rev. Microbiol . 3, 13-22). 또한, 이 도메인이 면역글로불린-유사 폴드를 취한다는 사실은, 유사한 도메인이 다양한 세포 부착 단백질에서 발견되는 것으로 공지되어 있으므로, 이 도메인은 추정상 DENV 세포 수용체에 관여할 수 있다고 제안한다. 하지만, 수용체 결합에서 가능한 수반과 일치하는 이 도메인의 또 다른 구조적 특징은, 음전하를 띈 헤파린 설페이트 분자로의 이 도메인의 결합에 참여할 수 있는, 잔기 284-310 및 386-411에 의해 형성된 양전하를 띈 친수성 표면 패치의 존재이다(Modis,Y., et al. (2005). J. Virol. 79, 1223-1231).
재조합 데옥시리보핵산(DNA) 기술을 통해 얻어진 DIIIE를 이용한 연구는 바이러스 감염을 차단할 수 있는 경우, DIIIE는 C6/36 및 BHK21 세포주의 표면에 직접적으로 결합한다는 것을 나타냈다(Hung,J.J ., et al. (2004). J. Virol . 78, 378-388).
선행 연구에 따르면, DIIIE는 30 μM 미만의 겉보기 해리 상수(KD)로 숙주 세포로의 특이적 결합을 나타내며, DIIIE가 얻어진 플라비바이러스 종에 의존적이라는 것이 입증되었다(Halstead,S.B ., et al. (2005). Vaccine 23, 849-856). 다른 한편으로는, 표적 세포로의 DENV의 결합을 가장 효과적으로 차단하는 단클론성 항체(mAb)는 에피토프가 DIIIE에 위치하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 단백질 E와 바이러스 세포 수용체의 상호작용에서 이 도메인의 수반에 대한 간접적인 증거를 제공한다(Thullier,P., et al. (2001). J. Gen. Virol . 82, 1885-1892.).
DENV의 숙주세포로의 진입은 세포 표면 상에서 특이적 수용체 분자와의 이전 상호작용에 의존적이다. 하지만, DENV-숙주 세포 상호작용의 연구 결과에 따르면, 바이러스 진입에 사용된 이 수용체는 세포 유형에 따라 다를 수 있으며 심지어 바이러스 혈청형에 따라 다를 수 있다. 기존의 데이터에 따르면, 몇몇 분자가 주요 수용체의 역할을 수행하는 경우, DENV 진입은 세포 표면 상에서 식균작용 수용체와의 차후 상호작용을 위해 비리온에 결합하고 농축하는 다중 분자 복합체와의 상호작용을 수반한다고 추정된다.
세포로의 바이러스 진입을 차단하는 것은, 바이러스 생활 주기의 제1 단계 자체를 표적화하고, 성공적인 경우, 바이러스 감염의 모든 다른 다운스트림 이벤트를 차단하기 때문에, 항바이러스성 치료를 개발하기 위한 매우 매력적인 전략이 된다. X선 결정학 및 핵 자기 공명 분광법(nuclear magnetic resonance spectroscopy)에 의한 분석은 원자 해상도로 플라비바이러스 속의 세 개의 구조 단백질(단백질 C, 단백질 prM 및 단백질 E)의 구조에 관련된 정보를 제공한다. 이 연구는 외피 단백질의 구조적 전이의 억제와 유사한 바이러스 복제 주기를 억제하기 위한 대안적 접근법을 제안하였다. 유사하게, 일부 구조 연구는, DENV에 대한 항바이러스 약물의 합리적 디자인을 위한 표적으로서 잠재적 결합 부위를 구성하는, 수용체 분자와 중화 항체와의 상호작용에 수반된 외피 단백질의 특이적 영역에 관련된 데이터를 제공하였다.
저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(LRP1)로 명명된 인간 막 단백질이 DENV 진입 중에 사용된 실제의 식균 작용 수용체라는 것이 앞서 제안되었다(Huerta V. et al, WO 2007/124698). 따라서, 30개가 넘는 천연 리간드의 엔도시토시스를 효율적으로 중재하고, 관련 없는 바이러스 종인 인간 리노바이러스(Rhinovirus)의 작은 군에 대한 수용체의 역할을 하는 것으로 밝혀진, LRP1은 항바이러스 약물의 디자인을 위한 매력적인 표적이 될 수 있다. LRP1은 직접적으로 또는 LRP1 및 바이러스와 동시에 상호작용하는 브리징(bridging) 분자를 통해 DIIIE에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 브리징 분자의 한 예는 인간 알파-2-마크로글로불린(α2M)이며, 이것은 DIIIE에 결합하고, 또한 LRP1 리간드이다.
DIIIE의 구조를 기반으로 하는 베타 헤어핀 펩타이드는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 DENV 감염을 억제하는데 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Huerta V. et al, WO 2007/124698). 정확한 서열이 유래된 바이러스 혈청에 의존적인 이 펩타이드는 DIIIE의 FG 베타 헤어핀의 일부를 포함하고, 선택된 헤어핀 단편의 N- 및 C-말단에서 부가된 시스테인 잔기 사이의 이황화 브리지(bridge)를 통해 고정된다. 이 펩타이드 시리즈 외에, 가장 높은 항바이러스 활성을 나타내는 일원은 펩타이드 HDIII3CL이며, 이것은 DENV3 DIIIE로부터 유래되긴 하지만, 모든 네 가지 DENV 혈청형에 대하여 억제 활성을 나타낸다.
하지만, 이 고정된 베타 헤어핀 펩타이드는 상대적으로 약한 효능과 같이 중요한 단점을 가지고 있다. 예를 들어, Vero 세포에서 감염 억제 검정을 통해 결정된 HDIII3CL의 50% 억제 농도(IC50)는 DENV1에 대하여 15　μM, DENV2 및 DENV3에 대하여 20 μM, 및 DENV4에 대하여 40　μM이다. 이 상대적으로 불량한 효능은 임상적 개발을 위한 이 분자의 직접적인 사용을 불가능하게 하는데, 양호한 약물은 적어도 서브마이크로몰 범위, 바람직하게는 나노몰 범위, 또는 그 이상의 효능을 가지고 있어야 하기 때문이다.
이 펩타이드 시리즈의 또 다른 단점은 루프의 가닥 간 부분이 중화, 면역우성 B-세포 에피토프를 함유한다는 것이다(Matsui K, et al. (2009) Virology 384(1):16-20). 예를 들어, 문서 Huerta V. et al, WO 2007/124698은 중화 mAb 3H5가 이 가닥 간 루프를 함유하는 펩타이드에 결합한다는 것을 개시한다. 항-DIIIE 항체 반응의 일부가 다른 혈청형 사이에서 교차반응성이기 때문에, 이전 감염에 의해 유도된 기존의 교차반응성 항-DIIIE 항체 반응이 이 펩타이드에 결합하여 효율적인 농도를 감소시키며, 이로 인해 낮은 효능에 의해 이미 요구된 것들보다 펩타이드의 더 높은 치료적 투약량을 필요로 할 가능성이 있다.
상기 제공된 사실은 바람직하게는 나노몰 범위의 IC50을 가진 고효능 항바이러스 약물을 아직은 이용할 수 없다는 것을 나타낸다. 본 발명은 이 충족되지 않은 요구를 정확히 해결한다.
본 발명은 앞서 확인된 펩타이드의 효능을 최적화하여 얻어지는 새로운 DENV-억제 베타 헤어핀 펩타이드를 제공함으로써 상기 언급된 문제를 해결한다. 본 발명의 베타 헤어핀 펩타이드는 서열 번호 1 내지 서열 번호 9에서 제공되는 아미노산 서열, 또는 이 서열들과 유사한 서열 중 하나를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 주 목적은 적어도 서브마이크로몰 범위, 바람직하게는 나노몰 범위 또는 그 이상에서 상대적 고효능으로 DENV 감염을 억제하는 펩타이드를 디자인하는 것이다. 고효능은 치료 용량을 가능한 한 많이 감소시키는데 필수적이다. 현재 다른 병리에 대하여 임상적으로 사용 중인 치료적 합성 펩타이드는, 효율성(IC50, 50% 유효 농도(EC50), 등)이 나노몰/서브나노몰 범위에 있고 특이성은 매우 높아서, 매우 낮은 독성을 나타내는, 전형적으로 매우 강력한 화합물이다. 저효능 펩타이드는 높은 치료 투약량을 필요로 하므로, 많은 단점을 야기한다. 그 중 하나는 약물의 고용량이 비-특이적 상호작용으로 인한 부작용을 야기할 가능성을 증가시킨다는 것이다. 다른 하나는 제조 및 제형 중에 또는 생체 내에서의 전달 중에 응집 문제를 일으킬 확률이 매우 증가한다는 것이다(예를 들어, 혈청 단백질과의 비-특이적 상호작용으로 인해). 또 다른 하나는 항-펩타이드 항체 반응의 유도가 치료적 활성을 중화시키는 경우, 특히 치료가 반복되거나 연장되고, 이로 인한 손실을 보충하기 위해 더 높은 용량이 필요하면, 고용량이 면역원성/항원성 문제를 일으킬 확률을 증가시킨다는 것이다.
그에 반해서, 낮은 유효량을 가진 고효능 펩타이드의 사용은 많은 경제적인 장점을 나타내며, 이는 더 낮은 제조 비용 및 환자에 의해 지불되어야 하는 더 낮은 가격에 기인한다. 펩타이드 합성 기술은 보통 작은 분자량 화합물에 기초한 약물 합성보다 훨씬 더 비싸고, 이러한 비용 고려사항은 궁극적으로, 특히 치료 용량이 큰 경우, 뎅기열에 대한 펩타이드 기반-항바이러스 약물을 이용하려는 환자 또는 사람의 수를 제약할 수 있다.
치료적 펩타이드의 효능을 결정하는 필수적인 인자들 중 하나는 그것의 표적과의 상호작용의 친화도이다. 하지만, 고친화도 단백질-단백질 상호작용에 수반된 기능적 표면 패치를 모방하는 활성 펩타이드를 디자인하는 일은 결코 쉬운 것이 아니다. 여기에서 필수적인 문제는 구상 단백질의 기능적 표면 패치가 보통 지형적이고(즉, 폴리펩타이드 사슬의 하나 이상의 연속적인 세그먼트를 수반함) 형태적이라는(즉, 상호작용이 일어나는데 참여하는 잔기의 명확한 공간 배열을 필요로 함) 것이다. 그에 반해서, 짧은 단백질 세그먼트로부터 유래된, 전형적으로 10-20 잔기 길이의 펩타이드는 용액에서 플렉시블하고 보통은 하나의 명확한 단일 형태를 취하지 않는다. 베타 헤어핀 펩타이드는, 예를 들어, 폴딩된 단백질에서 명확한 구조적 모티프(motif)로부터 유래되지만, 용액에서 구조적으로 안정하지 않으며 대신에 평형 상태에서는 다른 형태의 앙상블(ensemble)로서 존재한다.
특정 형태를 모방하도록 의도된 용액 중 펩타이드의 형태적 상태는 보통 두 가지 상태, 즉 폴딩된 상태(3차원 구조는 모방하는 것으로 추정되는 네이티브(native) 단백질 구조와 일치한다) 및 폴딩되지 않은 또는 변성된 상태(용액 중 펩타이드에 의해 취해진 모든 비-네이티브 형태의 앙상블) 사이에서 평형인 것으로 분석된다. 네이티브 단백질과 별개의 단백질 표적의 베타 헤어핀의 상호작용을 모방하는 베타 헤어핀 펩타이드의 경우에, 헤어핀이 더 안정할수록, 구조가 네이티브 단백질의 해당 세그먼트와 더 유사해지고, 펩타이드-수용체 복합체의 형성시 형태적 엔트로피(entropy)의 더 작은 손실로 인해 상호작용의 친화도가 더 높아진다.
다시 말해서, 용액 중 펩타이드가 무질서한 구조를 취하고, 표적으로의 결합 과정이 형태적 선택 메커니즘을 통해 진행된다고 가정하면, 결합 과정의 자유 에너지의 변화는 적절한 형태로의 펩타이드의 폴딩에 관련된 자유 에너지의 변화와 수용체 상의 도킹(docking) 부위로의 이미 폴딩된 펩타이드의 결합에 관련된 자유 에너지의 변화의 합으로 표현될 수 있다. 상기 경우에, 결합 과정에 의해 방출된 자유 에너지의 양, 다시 말해서, 상호작용의 안정성은 펩타이드의 서열을 변화시킴으로써 증가될 수 있으며, 이는 원래 서열의 일부 잔기를 a) 용액에서 펩타이드의 형태적 안정성을 향상시키거나(선택된 잔기가 수용체 부위에서 접촉 표면과 직접적으로 상호작용하지 않을 때 특히 편리함) 또는 b) 펩타이드 및 수용체 간의 분자 간 상호작용을 최적화시키는 다른 잔기로 대체하여, 도킹 단계 중에 일어나는 자유 에너지의 감소를 증가시키는 것이다.
펩타이드 HDIII3CL의 서열(서열 번호 10, 표 1)의 분석은 그것의 베타 헤어핀 폴드의 안정성을 개선하기 위해 이용될 수 있는 여러 특성을 나타낸다. 이러한 특성은 다음과 같다: a) 베타 가닥 F 및 G 상의 아스파라긴 잔기(예를 들어, Asn3 및 Asn16)의 존재(아스파라긴은 불량한 베타-시트 전자이며, 매우 낮은 고유한 베타 시트 성향(propensity) 및 양의 비틀림각을 특징으로 하는 루프 및 백본 구조에서 나타나는 성향(tendency)을 갖는다)(Swindells MB, et al. (1995). Nat Struct Biol.; 2(7):596-603); b) 상당히 큰 루프(가닥에서 가닥으로 두 개의 최적 크기 보다 훨씬 더 큰(네 개의 잔기 만큼) 여섯 개의 잔기)의 존재(Branden C. & Tooze J. Introduction to protein structure. New York: Carland Publishing, 1991)(여기에서 문제점은 단백질 루프로의 새로운 잔기의 삽입은 루프 크기에 따라 성장하는 루프 클로저(loop closure)와 관련하여 엔트로피적 비용을 야기한다는 것이다); 및 c) 가닥 간 루프에서의 두 개의 글리신 잔기(Gly7 및 Gly9)의 존재(글리신은 다른 천연 아미노산과 관련된 백본 비틀림각 제약의 대상이 아니기 때문에, 폴딩 과정 동안 가장 큰 형태적 엔트로피 손실을 겪는 잔기이다).
개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 형태적 안정성을 증가시키는, 본 발명에서 제공된 서열 변화는 변형 가능한 위치에서 기존의 잔기를 베타 헤어핀-타입 구조의 형성을 위한 고차 구조적 성향을 가진 잔기로 대체하는 것이다. 베타 헤어핀에서 특이적 위치를 점유하기 위한 특정 아미노산의 구조적 성향은 단백질 구조 데이터베이스의 실험에 의해 결정된 베타 헤어핀 구조 가운데 상기 위치에서의 상기 아미노산의 출현 빈도로부터 추정될 수 있다. 수학적으로, 이는 관찰 출현 빈도 및 예상 출현 빈도 간의 지수(quotient)의 로그로서 계산되며, 예상 출현 빈도는 데이터베이스에서 관련 잔기의 상대적 풍부함으로부터 얻어진다.
본 발명에서 변형 가능한 것으로 한정된 위치는 다음과 같다:
a) DIIIE의 구조에서 가닥 F의 내면의 잔기, 즉, 네이티브 구조에서 용매에 노출되지 않은 잔기에 해당하는 베타 헤어핀 펩타이드의 제1 베타 가닥의 위치(이 잔기들은 펩타이드의 제1 및 제2 베타 가닥(DIIIE의 구조에서 가닥 G에 해당함)의 백본에서 공여자 및 수령자 원자 사이에서 수소 결합이 확립된 위치(HB 위치)를 점유한다);
b) 가닥 간 루프에 해당하는 위치;
c) 변하지 않은 채로 유지되는, DIIIE의 잔기 Trp391의 것(DENV2 세로 좌표)을 제외한, 펩타이드의 제2 베타 가닥(DIIIE의 가닥 G에 해당함)에서의 HB 위치(이 "c" 위치들 중 나머지에서, 소수성 특징을 가진 잔기가 허용되고 선호된다);
d) 루프에 가장 가까운 가닥 F의 비-HB(NHB) 위치;
e) 펩타이드의 제2 가닥(DIIIE에서 가닥 G에 해당함)의 제1 HB 위치에 대한 가능한 변형은, 높은 구조적 성향을 가진 잔기 이외에, 네 개의 혈청형 모두의 DIIIE 중에서 지형적으로 보존된 리신(Lys385, DENV2 세로 좌표)의 역할을 모방하고 LRP1/α2M*(활성화된 α2M) 복합체로의 결합 중에 잠재적으로 관여할 수 있는 Lys 잔기에 의한 대체를 포함한다.
지점 a)에서 한정된 본 발명의 변형 가능한 잔기는 DIIIE의 구조에서 용매-접근 가능하지 않으므로, 바이러스 생활 주기 동안 도메인과 그것의 수용체 또는 어느 다른 적절한 수용체 사이의 접촉 계면의 일부는 아니다. 따라서, 그것들은 펩타이드의 폴딩 안정성을 증가시키는 잔기로 대체될 수 있다.
지점 b)에서 한정된 가닥 간 루프의 잔기는 이 영역의 서열이 DENV 혈청형 간에 차이가 있기 때문에 변형 가능한 것으로 간주되며, 이 잔기의 엄격한 보존이 DIIIE와 DENV 수용체의 상호작용을 보존하는데 필요하지는 않을 것으로 추정된다. 이 추론은 펩타이드 HDIII3CL이 네 개의 DENV 혈청형 모두의 감염을 억제하고, 일반적으로 α2M*/LPR1 수용체를 차단하는 것은 혈청형-독립적 항바이러스 효과를 갖는다는 사실에 의해 지지된다. 본 발명에서 바람직한 가닥 간 루프는 이러한 변이체가 펩타이드의 형태적 안정성을 증가시키기 때문에, 회전의 위치 1 및 4가 인접한 베타 가닥의 제1 연결 잔기에 해당하는 베타 회전의 두 개의 중심 잔기로 구성된다. 일반적으로, 천연 베타 헤어핀은 짧은 연결 루프를 가지는 경향이 있고(Branden C. & Tooze J. New York: Carland Publishing, 1991), 루프 크기의 감소는 부수적으로 폴리펩타이드 사슬의 크기에 따라 증가하는 변성된 상태의 형태적 엔트로피를 감소시킨다.
2-잔기 루프의 두 개의 중심 잔기 중 하나(본 발명에서 가닥 간 루프에 대하여 바람직한 크기)는 DENV3로부터 DIIIE의 Lys385를 모방함으로써 기능적인 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 개시된 펩타이드 중 일부에서는, 이 기능적 역할이 위상 기하학(topology)이 DIIIE의 FG 헤어핀과 동일한 IIP형 베타 회전의 경우에 루프의 위치 2에서 리신 잔기에 의해 수행된다(따라서 이 Lys 잔기는 회전의 중심 위치를 점유할 것이다). 본 발명에 의해 개시된 펩타이드의 또 다른 것에서는, 이 기능적 역할이 루프의 위치 1(IIP형 베타 회전에서 위치 2)에 배치된 D-Lys 잔기(L-리신의 D 입체 이성질체)에 의해 실현되지만, 이 경우에는, 펩타이드의 위상 기하학이 DIIIE에서 FG 베타 헤어핀의 것에 관하여 반대이다.
지점 c)에서 한정된 변형 가능한 잔기는 지점 a)와 같은 헤어핀의 면으로 배향되므로, 잔기들은 인접하게 되고, 백본 원자를 수반하는 수소 결합을 형성한다. DIIIE의 구조에서 해당 잔기는 부분적으로 용매-노출되는데, 이는 가닥 G가 베타 시트의 엣지(edge)를 형성하기 때문이다. DIIIE의 Trp391(DENV2 세로 좌표)에 해당하는 베타 헤어핀 펩타이드에서의 위치는 본 발명에서 비-변형인 것으로 한정되는데, 이는 잔기가 모든 DENV 혈청형에 걸쳐 엄중히 보존되고, 매우 기능적이기 때문이다. 실제로, 실시예 2(표 2)는 이 잔기가 펩타이드 HDIII3CL의 항바이러스 활성(및 펩타이드 HDIII3CL2의 항바이러스 활성, 표 1 참조)에 필수적이고, 알라닌 잔기에 의한 대체시 손실된다는 것을 입증한다. 리신 치환은 또한 제2 가닥(지점 e)에서 언급된 변형 가능한 잔기)의 제1 위치에서 허용되는데, 이는 이러한 치환이 DENV3의 DIIIE의 잔기 Lys385의 구조적/기능적 모방체를 구성하기 때문이다. Lys385는 DIIIE와 α2M*/LRP1 식균작용 수용체 복합체의 구성 단백질 중 하나인 α2M*의 상호작용에 수반된 양이온성 잔기이다.
지점 d)에서 언급된 변형 가능한 위치는 DIIIE의 용매-노출된 표면의 잔기에 해당하지만, 여전히 변형 가능한 것으로 한정되는데, 이는 DENV 혈청형에 걸쳐 엄중히 보존되지 않기 때문이다(도 1E).
펩타이드 HDIII3CL의 변형 가능한 위치의 세트가 한정되면, 서열은, 각각의 변형 가능한 위치에 대하여, 가장 높은 구조적 성향 지수를 가진 잔기를 선택함으로써 최적화된다. 이 파라미터는, 상기 언급된 바와 같이, 중심 2-잔기 루프(즉, 단편의 잔기 4 및 5는 베타 회전의 중심 잔기에 해당할 것이다)를 가진 베타 헤어핀 구조를 취하는 8-잔기 단편에서 각각의 잔기의 관찰된 출현 빈도로부터 유래되며, 이는 실험에 의해 결정된 단백질 구조의 데이터베이스로부터 취해진다. 이 경우에 사용된 데이터베이스는 2.5 Å보다 높은 해상도를 가진 3차원 단백질 구조의 비다중(non-redundant) 세트였다(WHAT IF database; Vriend , G. (1990), J.Mol.Graph. 8, 52-6). 구조적 성향 지수는 헤어핀의 특정 위치에서의 특정 아미노산의 발생 횟수 및 데이터베이스에서 잔기의 상대적 풍부함에 기초한 예상 발생 횟수 간의 지수의 로그로서 한정되었고, IP 및 IIP형 베타 회전을 함유하는 베타 헤어핀에 대하여 별도로 계산되었다. 최종 선택은 가장 일반적인 측쇄 로타머 및 가닥 간 접촉을 고려하여 제안된 베타 헤어핀 펩타이드의 3차원 구조의 빌딩 모델(building model)을 필요로 한다.
본 발명은 화학 구조 및 입체 화학 측면에서 구조적으로 호환 가능한 베타 헤어핀의 위치로의 비-천연 아미노산의 도입을 개시한다. 이러한 예로서, 양의 백본 비틀림각을 취하는 위치로 도입된 천연 아미노산의 D-입체 이성질체의 경우를 들 수 있다. D-Pro는, 예를 들어, IIP형 베타 회전의 제2 잔기(본 발명에서 2-잔기 가닥 간 루프의 제1 잔기와 동등함)로서 유리하다. 또 다른 예는 IIP형 베타 회전의 제2 잔기에 해당하는 위치로, 하지만 역 위상 기하학을 가진 펩타이드에서 도입된 D-Lys이다. 한편, L-Lys는 이 위치에 대하여 구조적으로 선호되지 않으며(구조적 성향 지수가 높지 않으며, 이는 Lys가 라마찬드란 플롯(Ramachandran plot)의 우측 하단 사분면에 위치한 비틀림각을 취하는데 우수하지 않다는 사실을 반영하는 것이다), 이는 Lys 잔기가 이 위치에서 DENV3로부터 DIIIE의 Lys285를 잠재적으로 모방한다는 사실에 비추어 유감스럽다. 이 난제는 D-Lys 잔기를 대신 도입함으로써 해결 할 수 있는데, 이는 D-Lys가 IIP형 베타 회전의 위치 2에 필요한 비틀림각을 쉽게 취할 수 있기 때문이다.
변형 가능한 잔기란 의미는, 상기 단락에서 기술된 바와 같이, 위상 기하학이 DIIIE의 구조에서 베타 헤어핀 FG의 것과 동일한 (네이티브 위상 기하학) 베타 헤어핀 회전에 해당한다. 하지만, 본 발명은 또한 역 위상 기하학을 가진 펩타이드를 개시한다. 이 펩타이드에서, 서열의 제1 및 제2 베타 가닥은 각각 기능적으로 및 구조적으로 DIIIE의 가닥 G 및 F에 해당하고, 잔기 점유 NHB 위치는 네이티브 위상 기하학 펩타이드에서 HB 위치에 해당한다(그 반대도 그러하다).
DIIIE의 FG 베타 헤어핀의 네이티브 위상 기하학을 유지하는 본원에서 디자인된 펩타이드는 NHB 위치에서 이황화 브릿지(bridge)를 포함하며, 이것은 베타 헤어핀 구조의 형태적 안정성을 증가시킨다. 이 Cys 잔기에 의해 점유된 위치는 a) 가닥 F의 제1 잔기 및 b) 가닥 G의 최종 잔기이다(도 1E).
본 발명에서 개시된 펩타이드의 다수는 펩타이드 HDIII3CL보다 더 긴 베타 가닥을 나타낸다. 이 더 긴 가닥은 펩타이드의 형태적 안정성을 증가시키는데, 이는 두 개의 추가적인 수소 결합이 도입되기 때문이다(가닥 당 하나의 HB 잔기).
형태적 안정화 이외에, 개시된 펩타이드와 표적의 상호작용의 친화도(및 이에 따른 그것의 항바이러스 활성)는 또한 상기 상호작용을 직접적으로 최적화함으로써 증가될 수 있다. 이것은 상호작용의 에너지론 측면에서 기여도가 무시해도 될 정도거나 실제로 부정적인 계면 잔기를 변형시킴으로써 실행될 수 있다.
일반적으로, 단백질-단백질 결합의 에너지론은 상당히 작은 세트의 잔기의 상호작용에 의해 지배된다. 따라서, 대부분의 계면 잔기는 결합 과정에서 상대적으로 제약된 역할을 한다. 구조적 데이터는 본 발명에서 개시된 펩타이드 및 표적 간의 상호작용에 대하여, 또는 DIIIE 및 수용체 간의 상호작용에 대하여 이용 가능하지 않지만, 최초 근사치로서는, DIIIE의 FG 헤어핀의 모든 용매-노출된 잔기는 펩타이드-수용체 계면에서 관여하고 및/또는 기능적 역할을 하는 것으로 추정된다.
본 발명의 실시예 2(표 2) 및 6은 알라닌 잔기에 의한 펩타이드 HDIII3CL2의 Lys14(DENV3 DIIIE에서 Lys388에 해당함) 또는 Trp17(DIIIE에서 Trp391에 해당함)의 대체는 어떠한 경우에도 Vero 세포에서 이 펩타이드의 항바이러스 활성을 폐지하고 LRP1 수용체로의 결합에 영향을 미친다는 것을 입증한다. 따라서, 두 잔기 모두 HDIII3CL2의 생물학적 활성에 필수적이고, 계면에 위치할 가능성이 매우 커서, 상호작용에 필수적인 기여를 한다. 그러므로 본 발명에서는 이 잔기들 중 아무 것도 치환하지 않는다. 알라닌에 의한 잔기 Cys1 및 Cys18의 이중 치환은 또한 항바이러스 활성 및 HDIIICL2의 LRP1로의 결합을 폐지하지만, 이 경우의 효과는 유리한 분자간 상호작용의 손실 대신에 베타 헤어핀의 용액에서의 형태적 안정성의 손실에 의해 야기되는 것으로 생각된다.
본 발명은 또한 효능을 증가시키기 위한 추가적인 수단으로 베타 헤어핀 펩타이드의 잠재적으로 기능적인 표면을 확장시키는 것을 개시한다. 이 특정한 경우에는, 네 개의 잔기가 헤어핀 구조에 첨가되며, 이들 중 두 개는 DIIIE에서 FG 헤어핀의 노출된 면에 해당하고, 이전에 유사체 펩타이드의 HDIII3CL 시리즈에 포함된 적이 없었다. 구체적으로, 두 개의 잔기가 각각의 베타 가닥에 첨가되며, NHB 위치는 DENV3 DIIIE의 잔기 375(F 가닥) 및 392(G 가닥)에 해당하는 아미노산에 의해 점유된다. DIIIE에서 위치 375의 동일성은 네 개의 혈청형 모두에 걸쳐 엄중히 보존되지는 않지만, Asp 또는 Glu가 다른 분리물에서 관찰되기 때문에, 이것은 보존적 치환이다. 따라서, 두 아미노산 모두 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 동등한 위치에 대한 자격이 있지만, 확장된 형태, 예를 들어, 베타 시트의 일부가 되는 Asp의 낮은 성향 때문에 Glu가 바람직한 용액이다. DIIIE의 잔기 392와 동등한 펩타이드 위치의 경우에, 바람직한 아미노산은 Phe 또는 Tyr이며, 이것들은 네 개의 DENV 혈청형 중에서 이 위치에서 가장 빈번하게 관찰되는 잔기이다. 헤어핀의 이 확장된 부분의 변형 가능한 잔기는 HB 위치에 해당하며, 이것은 바람직하게는 높은 베타 시트 형성 성향을 가진 소수성 아미노산을 포함함으로써 형태적 안정성을 최적화하는데 사용될 것이다.
실시예 2에서 개시된 필수적인 잔기(DIIIE에서 Lys388, Trp391 및 Glu/Asp392에 해당하는 것들)를 제외하고, 외면(NHB 위치)의 모든 잔류 잔기는 본 발명에서 변형 가능한 것으로 간주되는데, 이는 DIIIE에서 해당하는 아미노산이 DENV 혈청형에 걸쳐 더 많은 가변성을 나타내기 때문이다.
본 발명의 베타 헤어핀 펩타이드의 변형 가능한 위치에 대하여 선택 가능한 잔기 유형에 관하여, 바람직한 용액은 DENV의 네 개의 혈청형의 상동 서열의 해당하는 위치에서 나타나는 상기 잔기 유형이다. 이러한 것은 DIIIE에서 위치 377에 해당하는 잔기의 경우이며, 바람직한 용액은 Asn(DENV3의 DIIIE에서 나타남) 대신에 Tyr(DENV1 및 DENV4의 DIIIE에서 나타남)이다. Tyr 및 Asn 둘 다 극성이고 수소 결합 공여자/수령자이지만, Tyr은 더 큰 비극성 표면을 노출하고 단백질-단백질 상호작용 계면에서 더 빈번하게 나타나며, 확장된 구조를 취하고 베타 가닥의 일부를 형성하는 더 높은 성향을 가지며, DIIIE의 Lys388에 해당하는 잔기와의 더 바람직한(pi-양이온) 상호작용에 기여할 수 있고, 따라서 베타 헤어핀의 형태적 안정성에 기여한다.
비필수적이지만 잠재적으로 기능성인 위치는 보통 조합 방법, 예를 들어, 파지 펩타이드 라이브러리의 사용을 통해 확인될 수 있으며, 필수적/구조적 위치는 고정되었고 나머지 위치는 무작위로 추출되었다. 이 경우에, 라이브러리는 특이적 리간드, 예를 들어, LRP1 및/또는 α2M*으로의 고-결합 펩타이드를 발현하는 상기 파지를 선택하는 결합 검정의 사용을 통해 최적의 서열에 대하여 스크리닝된다. 최적의 서열은 또한 합리적인 디자인 방법론의 사용을 통해 얻어질 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서, 개시된 베타 헤어핀 펩타이드는 화학적으로, 또는 서열이 천연 아미노산만을 함유하면, 재조합 DNA 기술을 통해, 단독으로 또는 융합 단백질로서, 합성될 수 있다. 융합 단백질의 사용은, 재조합 DNA 기술이 적용 가능하면, 숙주 프로테아제에 대한 재조합 페타이드의 발현 수준 및 안정성을 증가시킬 수 있다. 펩타이드는 프로테아제 인식 부위를 통해 융합 파트너에 결합될 수 있으며, 이것은 동족 프로테아제의 처리에 의해 펩타이드를 방출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예 1은 9개의 베타 헤어핀 펩타이드(서열 번호　1 - 서열 번호 9)의 디자인을 개시한다. 기본적으로, 이 펩타이드의 구조는 네 개의 세그먼트로 구성된다: 베타 회전에 의해 분리되고 세 개의 리신 잔기를 함유하는 C-말단 양이온성 연장으로 이어지는, 두 개의 베타-가닥 세그먼트(DIIIE의 FG 헤어핀에 구조적으로 유사함). 이 펩타이드는 항바이러스 효능 및 세포 수용체로의 결합을 최적화하기 위해 상기 논의된 구조적/기능적 기준에 따라 디자인되었다.
본 발명의 목적을 위해, 펩타이드 서열은 PHB1-9 베타 헤어핀 펩타이드의 서열 중 적어도 하나에 대한 상기 펩타이드의 서열 동일성이 70%와 동일하거나 그 이상, 바람직하게는 80%인 경우 본원에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드(표 1의 펩타이드 PHB1-9, 서열 번호 1-9)와 유사한 것으로 간주된다. 상기 유사한 펩타이드의 서열은 다음으로부터 선택되는 하나 또는 여러 위치에서 서로 다르다: 1) 상기 기술된 변형 가능한 위치 a)-e), 여기에서 특정 잔기 또는 PHB1-9의 잔기는 또한 베타 헤어핀에서 상기 위치를 점유하기 위해 높은 구조적 성향을 나타내는 잔기로 치환된다; 2) 상기 기술된 잠재적으로 기능성인 위치, 이로 인해 PHB1-9에서 적절한 위치(들)는 특정 DENV 혈청형의 DIIIE의 FG 헤어핀의 잔기 또는 잔기들에 의해 대신 점유되며, 상기 잔기(들)는 PHB1-9 펩타이드의 베타 헤어핀에서 유사한 위치를 점유한다; 3) C-말단 리신 태그의 잔기에 해당하는 위치; 이 경우에, 태그는 두 개 또는 세 개, 바람직하게는 세 개의 리신 잔기를 포함할 수 있다; 및 4) 펩타이드 PHB1-4 및 PHB7-9의 이황화 결합을 형성하는 시스테인에 해당하는 위치, 여기에서 하나의 Cys 잔기는, 반대 Cys 잔기가 Lys로 대체되는 한, Asp/Glu로 대체될 수 있으며, 이로 인해 펩타이드는 상기 잔기의 측쇄 간의 아미드 결합의 형성을 통해 고정되며, 즉, 한 측면에는 Asp/Glu이고 다른 측면에는 Lys이다.
PHB1-9 펩타이드의 활성은 Vero 세포 상에서 플라크(plaque) 억제 검정으로 평가되었으며, 이 결과는 실시예 2에 제시한다. 결과는 모두 이 실험 모델에서 항 바이러스 활성을 나타냈으며, 이 중 여섯 개는 펩타이드 HDIII3CL보다 더 높은 수준으로 나타났다. 특히, 펩타이드 PHB4는 나노몰 범위에서 네 개의 DENV 혈청형 모두에 대하여 매우 강력한 항바이러스 효과를 나타냈으며, 매우 양호한 선별 지수(1290 내지 6450, 특이적 혈청형에 의존적)를 갖는다. 따라서, 이 펩타이드는 DENV에 대한 항바이러스 약물의 개발을 위한 훌륭한 후보 분자가 될 수 있으며, 이전에 보고된 항바이러스 약물 후보물질보다 더 양호한 효능을 갖는다.
따라서, 본 발명은 또한 서열 번호 1 내지 서열 번호 9에서 제공된 것들로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이것들의 유사한 서열을 가진 하나 이상의 베타 헤어핀 펩타이드, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제로 구성된 약학적 조성물을 개시한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학적 조성물을 포함하는 펩타이드는 초분자 응집체를 형성하고 있다. 펩타이드 PHB4(및, 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드)가 양친매성 베타 가닥의 구조를 취하도록 디자인된 분자이기 때문에, 그것은 펩타이드 농도 및 정확한 용매 조성에 따라 초분자 응집체를 형성할 수 있다.
실시예 5는 이 펩타이드가 어떻게 나노구조로 자가-조립되는지를 나타내며, 이것의 크기 및 형태는 실험 조건, 예를 들어, 펩타이드 농도, 온도, 용매, 용액의 수명, 다른 첨가제의 존재 등에 의존적이다. 이 펩타이드의 항바이러스 활성은 이 조건들에 따라 변할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '초분자 응집체'는 여러 펩타이드 분자, 바람직하게는 10개 이상에 의해 형성된 응집체를 명명한다.
실시예 8은 펩타이드 PHB4가 식염수에 용해된 후 특정 시점에서의 인간 혈청 알부민(HSA)의 첨가가 어떻게 저 나노몰/서브나노몰 범위에서 효능을 가진 제형을 생산하는지를 제시한다. 이 결과는 HSA의 존재시 펩타이드를 제형화하는 것이 가능하고, 이 단백질의 존재는 매우 높은 항바이러스 활성을 나타내는 펩타이드:HSA 복합체의 형성으로 이어진다는 것을 나타낸다. 이것은 펩타이드가 항바이러스성 화합물로 발달한다는 약물동력학적 관점에서 중요한 발견인데, 이는 HSA의 혈청 반감기가 매우 길 뿐만 아니라, HSA가 혈청 프로테아제 및 다른 혈청 구성성분과의 원치않는 상호작용으로부터 펩타이드를 보호할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 개시된 베타 헤어핀 펩타이드로 구성된 약학적 조성물은 또한 HSA를 함유한다.
HSA의 존재에 상관 없이, 펩타이드 PHB4가 나노입자로 자가-조립된다는 사실은 약물동력학적 및 약동학적 관점에서 바람직한 특성이다. 그것들의 크기로 인해, 나노입자는 보통 매우 짧은 기간에 제거되고 대사작용되는 모노머 펩타이드보다 더 긴 혈청 반감기를 나타내는 경향이 있다. 또한, 모노머 펩타이드는 숙주 프로테아제에 의한 단백질 가수분해 공격에 매우 민감하며, 모노머 펩타이드의 나노입자로의 조립(assemblage)은 이것에 대하여 일정 부분 보호책이 될 수 있다. 또한, 나노입자는 단일 실체물(entity)에 다중 결합 부위가 있는 구조를 제안하며, 이는 다원자가 결합으로 인한 결합활성 효과를 야기하여, 펩타이드-수용체 상호작용에 대하여 더 높은 친화도, 다시 말해서, 더 나은 항바이러스 효능을 야기할 수 있다.
실시예 3 및 6은 D, Huerta H. et al, WO 2007/124698에 보고된 바와 같이, 본 발명의 베타 헤어핀 펩타이드가, ENV에 대한 식균작용 수용체의 구성요소이고, 따라서 항바이러스 화합물의 개발을 위한 표적이 되는, α2M* 및 LRP1 단백질에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명의 필수적인 부분은 개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 나노몰 범위에서의 생물학적 활성의 분석이다. 실시예 3에서 나타난 바와 같이, 펩타이드 PHB2, PHB4, PHB5, PHB8 및 PHB9는 나노몰/서브마이크로몰 범위에서 단백질 α2M*로의 재조합 DENV1 DIIIE(자메이카 균주(Jamaica strain), DIIIE1Jbiot)의 비오티닐화된 변이체의 결합을 억제하고, 상기 억제 능력은 비-비오티닐화된 DIIIE(DIIIE1J)에 의해 나타난 것보다 확실히 더 높은데, 그것들의 억제 퍼센트는 DIIIE1J보다 1.5 내지 3배 더 높다. 그에 반해서, 이 농도 범위에서 HDIII3CL에 의해 나타난 억제 능력은 DIIIE1J와 비교하여 매우 낮다. 실시예 6은 본 발명의 베타-헤어핀 펩타이드가 높은 결합력으로 수용체 LRP1에 결합하고, 이 점에서 펩타이드 PHB4가 가장 높은 결합력을 나타낸다는 것을 입증한다. 이 결과는 PHB4가 항바이러스 활성 검정에서 가장 강력한 펩타이드라는 사실과 일치한다.
실시예 8은 베타 헤어핀 펩타이드의 항바이러스 효과가 수용체 LRP1 및 단백질 α2M*에 결합하는 능력과 연관성이 있다는 것을 입증하며, 이는 이들 펩타이드가 표적세포로의 DENV의 진입을 억제함으로써 항바이러스 효과를 발휘한다는 개념을 확고하게 지지한다. 또한, 이 결과는 베타 헤어핀 펩타이드의 항바이러스 효능을 최적화하기 위해 본원에서 개시된 전략의 합리성을 지지한다.
단백질 α2M* 및 수용체 LRP1에 결합하는, 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 능력은 이 단백질들에 의해 중재되는 질환 또는 임상적 상태의 제어를 위한 치료제의 개발에 이용될 수 있다. 본 발명에서 개시된 바와 같이, DENV 감염에 대한 이들의 강력한 억제는 이러한 가능성의 한 예에 해당한다.
식균작용 수용체 α2M*/LRP1로의 DENV의 결합의 차단(다시 말해서, 단백질 E의 결합 억제)은 이 바이러스에 대한 항바이러스 약물을 개발하기 위해 업계에 공지된 다른 수용체보다 더 나은 선택이다. 다른 발명자들에 의해 기술된 수용체는 부착 수용체로서, 세포질 막으로의 바이러스의 결합을 중재하지만, 엔도시토시스에 의해 바이러스를 내재화하지 않는다. 본 발명에서 개시된 펩타이드에 의해 억제되는 단계는 초기 부착 단계의 다운스트림에서 이루어지기 때문에, 이 펩타이드는 표적 세포에 부착하기 위해서 바이러스들이 어떤 특이적 수용체 또는 수용체들을 사용하는지에 관계없이 효율적일 것이다.
이러한 발견을 고려해보면, 본 발명은 또한 약물의 제조를 위한 본 발명에서 기술된 베타 헤어핀 펩타이드의 용도를 포함한다. 한 구체예에서, 약물은 DENV에 의한 감염을 억제하거나 약화시키는데 사용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드로 제조된 약물은 단백질 α2M* 또는 LRP1에 의해 중재된 임상적 상태의 치료에 이용된다.
본 발명은 또한 환자의 DENV에 의한 감염을 억제하거나 약화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 환자에게 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드 중 하나 이상, 또는 이 펩타이드 중 적어도 하나를 포함하는 약학적 조성물를 투여하는 것을 특징으로 한다.
도 1. 뎅기열 바이러스(DENV)에 대한 베타 헤어핀 펩타이드 억제의 디자인. (A) IP형 중심 베타 회전을 가진 8-잔기 헤어핀의 각각의 위치에 대하여 계산된 20개의 천연 아미노산 각각에 대한 선호 파라미터. 선호 파라미터의 값이 더 높아질수록 회색 색조는 더 어두워진다. WHATIF 데이터베이스의 베타 헤어핀 중 어느 것에서도 특정 위치에서 나타나는 특이적 아미노산의 예가 없는 경우, 상기 아미노산은 상기 위치에서 0.5의 관찰치가 할당되고, 이어서 해당 선호 파라미터가 계산된다. (B) IIP형 중심 베타 회전을 가진 8-잔기 헤어핀의 각각의 위치에 대하여 계산된 20개의 천연 아미노산 각각에 대한 선호 파라미터. 선호 파라미터의 착색 계획 및 계산치는 (A)와 동일하다. (C)-(D) IP형 (C) 또는 IIP형 (D) 중심 베타 회전을 가진 정렬 베타 헤어핀으로부터 유래된 공통 서열의 Logo-스타일 표현. 문자 크기는 상기 위치에서 상기 아미노산의 관찰 빈도와 데이터베이스의 아미노산 조성물 기반의 예측 빈도의 비율에 비례한다. (E) 네 개의 DENV 혈청형 및 펩타이드 PHB4 각각의 헤어핀 FG에 해당하는 DIIIE 단편의 서열 정렬. MP: 본 발명에서 한정된 변형 가능한 위치(a-e), * 잔기 Lys385의 것에 해당하는 기능적으로 적절한 위치; SS: 펩타이드 PHB4에 대하여 디자인된 2차 구조; RN: PHB4 서열에서 잔기 수; SSDEN: DIIIE의 2차 구조; RNDEN: DENV2의 단백질 E의 서열에서 잔기의 수; 가닥: DIIIE의 가닥 F 및 G에 해당하는 베타 가닥.
도 2. DENV-억제 베타 헤어핀 펩타이드에 대한 3차원 구조 모델. (A) HDIII3CL 베타 헤어핀 펩타이드. 제시된 세그먼트는 양이온성 C-말단 연장 없는 헤어핀에 해당하며, 일부 적절한 잔기를 강조한다. DIIIE에서 그것들의 동등한 잔기의 세로 좌표는 괄호 안에서 제시된다. (B) 펩타이드 PHB4. 괄호는 HDIII3CL에 비해 연장된 베타 가닥의 일부 범위를 정한다. (C) 두 펩타이드의 구조적 중첩.
도 3. 단백질 α2M*로의 DENV1의 비오티닐화된 DIIIE(DIIIE1Jbiot)의 결합의 억제. 세로축은 0.05-3 μM 펩타이드 농도 범위에서 본 발명에 의해 개시된 베타 헤어핀 펩타이드에 대한 억제 퍼센트를 나타낸다. 펩타이드 HDIII3CL 및 재조합 DIIIE1J의 억제 활성이 또한 제시된다.
도 4. α2M*로의 비오티닐화된 DENV1 DIIIE(DIIIE1Jbiot)의 결합의 억제에 대한 용량-반응 곡선. 차트는 베타 회전 펩타이드 PHB5, 펩타이드 HDIII3CL 및 재조합 DIIIE1J에 해당하는 억제 퍼센트를 나타낸다.
도 5. 베타 헤어핀 펩타이드에 의한 단백질 α2M*로의 비오티닐화된 DENV1 DIIIE (DIIIE1Jbiot)의 결합의 억제 및 항바이러스 활성과의 관계. 세로축은 DIIIE1J에 대하여 결정된 결합 억제에 관하여 결합 억제 퍼센트를 나타낸다. 제시된 데이터는 서브마이크로몰(50-200 nM) 펩타이드 농도 범위에 해당한다.
도 6. 플라스미드 pET-DIII DENV1의 다이어그램.
도 7. α2M과의 상호작용에 필수적인 DIIIE 잔기의 맵핑(Mapping). 세로축은 각각의 알라닌 대체 돌연변이에 대한 IC50 값(가로 좌표에서 각각의 잔기에 해당함)과 재조합 DIIIE(DIIIE1PRS)에 대한 IC50 값의 비율을 나타낸다. 어두운 톤으로 셰이딩된(shaded) 타원형은 1차 상호작용 부위의 잔기를 표시한다. 밝은 톤으로 셰이딩된 타원형은 2차 상호작용 부위를 한정한다.
도 8. 단백질 α2M*과의 상호작용 중에 관여 부위의 DIIIE의 3차원 구조 내 위치. DENV1 DIII의 두 가지 구조가 제시되는데, 화살표 및 원기둥이 각각 베타 시트 및 루프를 나타내는 2차원 구조를 포함한다. 적절한 잔기가 라벨링되어 있다. 이 잔기는 두 개의 부위로 클러스터링되며(cluster), 셰이딩된 타원형으로 표현된다: 1차 결합 부위(A) 및 2차 결합 부위(B). 3차원 구조는 PyMOL(The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre , Schrodinger , LLC .)을 사용하여 만들어졌다.
도 9. 포스페이트-완충된 식염수(PBS) 중 펩타이드 PHB4에 대한 응집 동역학. (A)-(B): PBS 중 10　μM의 펩타이드 PHB4에 대한 응집 동역학. 세로축은 시점 0(펩타이드가 PBS로 용해되는 순간)에서 분산된 빛의 강도에 대한 일정 시점에서의 분산된 빛의 강도에 해당한다. (A): 0 내지 300분 동안의 응집 프로파일. (B): 응집 과정의 처음 30분. (C)-(D): PBS 중 5 μM의 펩타이드 PHB4의 응집 동역학. (C): 초기 응집, 0-40분. (D): 말기 응집, 30-230분.
도 10. 투과 전자 현미경 검사(TEM)에 의한, 물 및 PBS 중 2 mg/mL의 농도의 펩타이드 PHB4의 응집체의 형태학 연구. 실험 조건은 다음과 같다: 물(A) 또는 PBS(B)로의 용해 직후 연구된 펩타이드; 물(C) 또는 PBS(D)에서 50℃에서 1시간 동안 용해 및 가열 후 연구된 펩타이드; 및 물(E) 또는 PBS(F)에 용해에 이어서 50℃에서 1시간 동안 가열한 다음 실온에서 2시간 동안 배양 후 연구된 펩타이드. (A), (B), (E) 및 (F)의 막대는 100 nm의 길이를 갖고 있으며, (C)-(D)의 막대는 200 nm의 길이를 갖고 있다.
도 11. DIIIE와 LRP1 수용체의 직접적인 상호작용에 대한 검정에 사용된 단백질. (A) LRP1의 도메인 아키텍쳐(domain architecture)의 개략도. CM: 세포질 막. 리간드 결합 클러스터에 해당하는 영역이 표시된다. (B) 키메라 sLRP1-CIV 단백질의 개략도. Fc: 면역글로불린 불변 영역. (C) 재조합 DIIIE1-4 단백질의 개략도. (D) 최종 DIIIE 조제물의 변성 전기영동(SDS-PAGE)의 분석: 1. DIIIE1(구체적으로, DIIIE1J), 2. DIIIE2, 3. DIIIE3 및 4. DIIIE4. 실험에 사용된 분자량 래더(ladder)에서 14 kDa 마커에 해당하는 위치가 표시된다.
도 12. ELISA 검정에서 DENV DIIIE와 LRP1의 리간드 결합 클러스터의 상호작용. 플레이트의 웰을 코팅하는데 사용된 단백질은 각 차트의 상단에 표시된다. sLPR1-CII-IV 단백질의 결합은 홀스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)에 컨쥬게이션된 인간 IgG의 다클론성 항-Fc를 사용하여 검출되었다.
도 13. Biacore 검정을 위한 sLRP1-CIV 결합 표면의 특성화. (A) 100 nM의 α2M* 및 수용체-회합된 단백질(RAP)의 적용으로부터 얻어진 센서그램(sensorgram). 두 채널의 신호가 나타난다: Fc1은 고정된 sLRP1-CIV를 가지며 Fc2는 고정된 재조합 HSA를 갖는다. (B) 농도 데이터에 대한 최대 공명 유닛 (Resonance Unit; RU)으로부터 RAP와 sLRP1의 상호작용의 친화도의 결정. 실선은 두 개의 상호작용 부위 모델에 대한 적합성을 나타내며, GraphPad Prism v5.03를 사용하여 수행된다. 측정은 Biacore X 유닛 상에서 수행되었다.
도 14. 베타 헤어핀 펩타이드와 sLRP1-CIV의 상호작용에 대한 Biacore 검정. (A) 및 (B) 20 μM 펩타이드의 적용으로부터 얻어진 센서그램; (C) 160 s에서 관찰된 RU, 및 (D) 270 s에서의 RU.
도 15. 단백질 LRP1(sLRP1-CIV 단편)로의 결합 및 베타 헤어핀 펩타이드의 시험관 내 항바이러스 활성 간의 관계. 선형 회귀를 사용하여 Vero 세포의 DENV2에 대한 항바이러스 활성에 대한 시험관 내 효능 데이터[log(IC50, uM)] 및 펩타이드 HDIII3CL과 같은 위상 기하학(네이티브 위상 기하학)을 가진 PHB 시리즈의 펩타이드에 대한 t=400 s(RUrem)에서의 Biacore 신호 크기를 고정시켰다. 95% 신뢰 구간은 점선으로 나타난다. 삽도는 펩타이드 PHB4를 배제약 유사한 분석을 도시한다.
도 16. 단백질 α2M*로의 결합 및 베타 헤어핀 펩타이드의 시험관 내 항바이러스 활성 간의 관계. 선형 회귀를 사용하여 단백질 α2M*로의 DIIIE의 결합의 억제에 대한 데이터 및 DENV2에 의한 Vero 세포의 감염의 억제를 위한 IC50 값을 고정시켰다. α2M*로의 결합의 퍼센트 억제는 펩타이드에 사용된 것과 등몰량 농도의 재조합 DIIIE1J에 대하여 결정된 억제 퍼센트에 관하여 제시되었다. 얻어진 값은 평균 및 표준 편차에 해당하며, 서브마이크로몰 및 나노몰 펩타이드 농도(50, 100, 200 및 400 nM)에서 결정된다.
도 17. 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성에 대한 배양 온도의 영향. 항바이러스 활성은 Vero 세포 상에서 플라크 형성 검정을 사용하여 감염 후(p.i.) 24 h에 DENV2 균주 16803으로 감염된 Vero 세포의 상층액을 적정하여 평가되었다. IC50은 GraphPad Prism v5.03을 사용하여 추정된다. 실선은 log10(농도) 대 반응 곡선에 대한 비-선형 고정을 나타낸다.
도 18. 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성에 대한 응집 시간의 영향을 평가하기 위해 사용된 실험 디자인을 제시하는 도해.
도 19. 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성에 대한 배양 시간 및 온도의 영향. 항바이러스 활성은 Vero 세포 상에서 플라크 형성 검정을 사용하여 DENV2 균주 16803로 감염된 Vero 세포의 24 h p.i. 상층액을 적정하여 평가되었다. 미처리 대조군(펩타이드 처리 안함)에서 바이러스 역가는 4 log10이었다. (A) 10℃에서 배양; (B) 37℃에서 배양.
도 20. 응집 과정 중에 항바이러스 활성의 효능에 대한 펩타이드 PHB4의 초기 농도의 영향을 평가하는데 사용된 실험 디자인.
도 21. 항바이러스 활성에 대한 수중 펩타이드의 초기 농도의 영향. 항바이러스 활성은 Vero 세포 상에서 플라크 형성 검정을 사용하여 DENV2 균주 16803으로 감염된 Vero 세포의 24 h p.i. 상층액을 적정하여 평가되었다.
도 22. C-말단(상단) 또는 N-말단(하단) 히스티딘 태그로의 PHB의 융합의 디자인.
도 23. 금속 이온 및 EGTA(Me2) 스페이서와 교차결합하여 안정화된 히스티딘-태그된 펩타이드 응집체/나노입자를 나타내는 도해.
도 24. 단독으로 또는 Zn 및 EGTA(Zn2)와 복합체로 펩타이드 H5PHB4 및 PHB4H5의 항바이러스 활성.
실시예
실시예 1. 뎅기열 바이러스의 감염을 억제하는 베타 헤어핀 펩타이드의 디자인 및 합성
본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 서열의 설명
표 1에서 PHB1-9로 명명된, 서열 번호 1-9에서 나타난 총 9개의 베타 헤어핀 펩타이드는 HDIII3CL과 비교될 때 항바이러스 활성의 효능 및 세포 수용체로의 결합의 강도를 증가시키는 것을 목적으로 하는 구조적/기능적 기준에 따라, 펩타이드 HDIII3CL(서열 번호 10)에서 시작하여 디자인하였다. 이 펩타이드의 구조는 기본적으로 다음과 같은 네 개의 세그먼트로 구성된다: 베타 회전에 의해 분리되고 세 개의 리신 잔기로 구성된 양이온성 C-말단 연장으로 이어지는, 두 개의 베타 가닥 세그먼트(DIIIE의 FG 베타 헤어핀과 구조적으로 유사함). 다음과 같은 두 개의 다른 위상 기하학을 사용하였다: 폴리펩타이드 백본이 DIIIE의 FG 베타 헤어핀에서와 같은 방향으로 이어지는, 펩타이드 PHB1-4 및 PHB7-9에서 사용된 네이티브 위상 기하학, 및 펩타이드 PHB5 및 PHB6에서 사용된 역 위상 기하학. 네이티브 위상 기하학 펩타이드에서, 제1 베타 가닥 세그먼트(표 1에서 베타1)는 구조적으로 F 베타 가닥에 해당하고, 제2 베타 가닥 세그먼트(베타2)는 G 베타 가닥에 해당한다(도 1E). 펩타이드 PHB1, PHB2 및 PHB7의 가닥 길이는 펩타이드 HDIII3CL의 가닥 길이(6개의 잔기 가닥)와 동일하지만, 펩타이드 PHB5-6에서 7개의 잔기로, 펩타이드 PHB3-4 및 PHB8-9에서 8개의 잔기로 연장하였다. 더 긴 가닥은 펩타이드의 형태적 안정성을 증가시킨다(Stanger, H. E., et al. (2001). Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98, 12015-12020).
펩타이드 PHB1, PHB2 및 PHB7의 잔기 Cys1, Asn/Tyr3 및 Thr5는 DIIIE의 FG 베타 헤어핀에서 노출된 NHB 위치에 해당한다. DENV3 DIIIE의 잔기 Asn377와 동등한 Asn 잔기를 펩타이드 PHB1 및 PHB7의 위치 3(Asn3)에 대하여 선택하였고, DENV1, DENV2 및 DENV4의 DIIIE의 Tyr377과 동등한 Tyr 잔기를 펩타이드 PHB2의 위치 3(Tyr3)에 대하여 선택하였다. Tyr3가 Asn3보다 바람직한데, 이는 Tyr3이 DENV 혈청형에 걸쳐 더 많이 보존되고, 베타 시트 형성에 대하여 더 높은 성향을 가지며, Lys10에 대하여 대각선으로 정렬되어 해당 측쇄 간의 바람직한 pi-양이온 상호작용을 용이하게 하기 때문이다(도 2B). Thr 잔기를 DENV DIIIE 서열에서 관찰된 Val/Ile379 대신에 위치 5(Thr5)에 대하여 선택하였다(도 1E). 이러한 선택을 한 근거는 Thr이 양호한 베타 시트-형성 성향을 가진 Val/Ile에 관하여 보존적 치환인 것, 뿐만 아니라 다른 두 개의 대안보다 더 친수성이고(따라서 물에서 펩타이드 가용성에 긍정적으로 기여한다) 더 높은 구조적 선호 파라미터의 값을 나타낸다는 것이다(도 1E에서 8-잔기 베타 헤어핀의 위치 2). 이 펩타이드의 잔기 Cys14, Asn12 및 Lys10은 베타 헤어핀의 같은 면의 각각 Cys1, Tyr/Asn3 및 Thr 5에 인접한 위치를 차지하지만, 이 잔기들 사이에 백본 수소 결합은 없다. 잔기 Lys10 및 Asn12는, 구조적으로 및 기능적으로, 잔기 Lys388(DENV1-3에서 보존됨) 및 Asn390(DENV2-3에서 보존됨)에 해당한다. Trp 잔기를 위치 13에 대하여 선택하였는데, 이는 DIIIE의 동등한 잔기(Trp391)가 모든 DENV 혈청형에 걸쳐 엄중히 보존되기 때문이다. 시스테인 Cys1 및 Cys14는 필수적인 구조적 역할을 수행하는 이황하 결합을 형성한다. 그것들은 NHB 위치를 차지하고, 이 위치에서의 이황화 결합은 베타 헤어핀의 안정성에 호의적으로 기여한다(Santiveri C.M ., et al. (2008). Chem . Eur . J., 14, 488 - 499). 하기 본 발명에서, 잔기 Lys10, Trp13, Cys1 및 Cys14가 이 펩타이드의 항바이러스 활성에 필수적이라는 것이 실험에 의해 입증될 것이다. HDIII3CL과 유사한 펩타이드는, 치환이 한 위치(Lys14→Ala 또는 Trp17→Ala, HDIII3CL의 Lys14는 구조적으로 PHB1, PHB2 및 PHB7의 잔기 Lys10에 해당하고, HDIII3CL의 Trp17은 구조적으로 PHB1, PHB2 및 PHB7의 잔기 Trp13에 해당한다) 또는 두 위치(Cys1→Ser 및 Cys18→Ser, HDIII3CL의 Cys18은 구조적으로 PHB1, PHB2 및 PHB7의 잔기 Cys14에 해당한다)에서 일어나는 경우, 검정된 농도 범위에서 검출 가능한 항바이러스 효과를 나타내지 않았다. 또한, 하기 본 문서에서, 펩타이드 PHB9가 펩타이드 PHB8보다 더 높은 항바이러스 효능을 나타내기 때문에 Tyr3이 Asn3보다 더 나은 선택이라는 것이 실험에 의해 입증될 것이며, 이것들의 유일한 차이는 DENV1-2 및 DENV4의 DIIIE의 Tyr375에 해당하는 위치에서의 치환의 성질이다.
베타 헤어핀 펩타이드의 디자인
서열 번호 이름 [ 베타1 ] [회전] [ 베타2 ] 연장 위상 기하학 베타 회전 유형
1 PHB1 CVNWTE pD KKVNWC KKK 네이티브 IIP
2 PHB2 CVYWTR pK WKVNWC KKK 네이티브 IIP
3 PHB3 CIEVNWTE pD KKVNWFIC KKK 네이티브 IIP
4 PHB4 CIEVYWTR pK WKVNWFIC KKK 네이티브 IIP
5 PHB5 FWNWKWE kN KWTWNVE GGKKK 역 IIP
6 PHB6 FWNWKWE pN KWTWNVE GGKKK 역 IIP
7 PHB7 CVNVTI NG KKYNWC KKK 네이티브 IP
8 PHB8 CIEVNVTI NG KKYNWFIC KKK 네이티브 IP
9 PHB9 CIEVYVTI NG KKYNWFIC KKK 네이티브 IP
10 HDIII3CL CSNIVI GIGDKA LKINWC KK 네이티브 6 aa
11 HDIII3CL2 CSNIVI GIGDKA LKINWC KKK 네이티브 6 aa
12 HDIII3CLW - CSNIVI GIGDKA LKINAC KKK 네이티브 6 aa
13 HDIII3CLK - CSNIVI GIGDKA LAINWC KKK 네이티브 6 aa
14 HDIII3CLC - SSNIVI GIGDKA LKINWS KKK 네이티브 6 aa
p, 프롤린 D-입체 이성질체; k, 리신 D-입체 이성질체; 네이티브 위상 기하학: DIIIE의 FG 베타 헤어핀의 위상 기하학과 동일함; 역 위상 기하학: DIIIE의 FG 베타 헤어핀의 위상 기하학과 상반됨.
잔기 Val2, Trp/Val4, Glu/Arg/Ile6, Lys/Trp9, Val/Tyr11 및 Trp13은 헤어핀의 반대쪽 면의 일부를 형성하며, HB 위치를 차지한다. 위치 2, 4 및 6은 각각 위치 13, 11 및 9에 인접하고, 백본 수소 결합을 형성한다. 위치 13은 앞서 설명된 바와 같이 Trp에 의해서만 차지되고, 나머지 위치는 각각의 잔기에 대한 선호 파라미터의 값에 따라 선택된다(도 1A 및 1B). Glu6-Lys9(PHB1) 및 Arg6-Trp9(PHB2) 쌍을 각각 바람직한 염 브릿지 및 pi-양이온 상호작용을 확립할 수 있다는 사실로 인해 위치 6 및 9에 대하여 선택하였다. Lys9(PHB1 및 PHB7)는 DIIIE의 잔기 Lys385의 역할을 기능적으로 모방할 수 있는데, 이는 하기 본 발명에서 입증된 바와 같이α2M*과의 상호작용에 필수적이다.
펩타이드 PHB1 및 PHB2는 IIP형 베타 회전이 잔기 6 및 9 사이에서 형성하는 것으로 디자인되었다. 이 펩타이드의 위치 7은 IIP형 베타 회전의 제2 위치에 대하여 바람직한 아미노산인 d-Pro 잔기(프롤린의 D-입체 이성질체)에 의해 차지된다(Pantoja-Uceda D, et al. (2006) Methods Mol Biol .; 340:27-51). Asp를 펩타이드 PHB1의 위치 8에 대하여 선택하였는데, 이는 이 위치에서의 이 아미노산에 대한 선호 파라미터의 높은 스코어 때문이다. 그에 반해서, 펩타이드 PHB2의 위치 8에 대해서는 Lys 잔기를 선택하였으며, 이는 DIIIE의 Lys386을 모방하려는 의도를 갖는다. 펩타이드 PHB7에 대하여, IP형 베타 회전을 위치 6 및 9 사이에 도입하였다. 위치 7 및 8에 대한 잔기(Asn7 및 Gly8)의 선택은 선호 파라미터의 값에 의해 결정되었다(도 1A 및 B). Asn-Gly 디펩타이드는 IP형 베타 회전에서 매우 빈번하다.
펩타이드 PHB3 및 PHB4의 베타 헤어핀의 서열은 각각 펩타이드 PHB1 및 PHB2에서 해당하는 헤어핀의 서열을 포함한다(표 1). 이 경우에, PHB3 및 PHB4의 위치 4-15는 PHB1 및 PHB2의 위치 2-13과 동등하고, 따라서 PHB3 및 PHB4의 위치 4-15에 대하여 선택된 잔기는 상기 펩타이드 PHB1 및 PHB2에 대하여 기술된 같은 기준을 사용하였다.
유사하게, 펩타이드 PHB8 및 PHB9는 펩타이드 PHB7의 서열을 포함하고, 위치 4-15에 대한 잔기를 PHB7의 위치 2-13에 대한 것과 같은 기준에 따라 선택하였다. PHB3, PHB4, PHB8 및 PHB9의 잔기 Glu3 및 Phe16를 DIIIE로부터 Glu375(DENV1 및 DENV3에서 보존되고, DENV2 및 DENV4의 Asp) 및 Phe392(DENV1, DENV2, DENV4에서 보존되고, DENV3의 Tyr)를 모방할 목적으로 선택하였다(도 1E). PHB3-4 및 PHB8-9의 잔기 Ile2 및 Ile17을 베타 가닥 구조를 형성하려는 성향 때문에 선택하였다. Cys1 및 Cys18은 NHB 위치에 도입되어 펩타이드를 고정하는 이황화 결합을 형성하고, 따라서 베타 헤어핀 구조를 안정화시킨다(도 1E 및 도 2).
펩타이드 PHB5 및 PHB6의 위상 기하학은 DIIIE의 네이티브 FG 헤어핀 루프의 위상 기하학과 반대이다. 그것들의 경우에, 잔기 Phe1, Asn3, Lys5, Thr12, Asn14 및 Glu16은 펩타이드 PHB3의 Phe16, Asn14, Lys12, Thr7, Asn5 및 Glu3와 구조적으로 동등하지만, 수소 결합을 통해 함께 상호작용하는 HB 위치를 차지한다. 폴딩된 헤어핀의 잔기 Trp11 및 Trp13에 인접한 잔기 Trp4 및 Trp6은 NHB 위치를 차지하고, 베타 헤어핀의 형태적 안정성을 증가시키는 Trp 지퍼를 형성하도록 선택하였다. 잔기 Trp2는 구조적으로 DIIIE의 잔기 Trp391에 해당하고, 앞서 설명된 이유로 인해 선택하였다. 잔기 Glu7 및 Lys10을 선호 파라미터에 대한 높은 스코어 및 그것들이 헤어핀에게 추가의 안정성을 제공하는 염 브릿지를 형성할 수 있다는 사실에 기초하여 선택하였다. Asn9의 선택은 또한 선호 파라미터에 대한 높은 스코어에 기초하였다. PHB6의 잔기 d-Pro8을 선택하였는데, 이는 이 아미노산이 IIP형 베타 회전에서 위치 2에 대하여 바람직한 아미노산이기 때문이다. PHB5에 도입된(위치 8에) d-Lys 잔기는 DIIIE의 Lys385 잔기를 모방하는 것을 목적으로 하며, 또한, d-Lys는 L 입체 이성질체보다 IIP형 베타 회전의 위치 2에 대하여 더 바람직하다. 대안으로, PHB5 및 PHB6의 Lys10은 또한 DIIIE의 Lys385를 모방할 수 있다.
펩타이드 PHB1-9에 도입된 C-말단 연장은 Lys 트리펩타이드로 구성된다. 이러한 연장의 목적은 개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 가용성을 증가시키고, 양이온성 성질을 부여하여 정전력을 통해 음이온성 단백질인 수용체 LRP1와의 상호작용을 향상 시키는 것이다. 펩타이드 PHB5 및 PHB6의 경우에, 양이온성 트리펩타이드는, 두 세그먼트 사이에 일부 유연성을 제공하고 가닥 베타 2의 연장된 베타 구조의 확장을 차단하는, 디-글리신 디펩타이드 스페이서를 통해 베타 헤어핀에 결합된다.
도 1C 및 1D는 각각 8 잔기-길이 IP형 및 IIP형 베타 헤어핀을 정렬함으로써 발생한 공통 서열의 로고타입 표현이다(J. Gorodkin , et al. (1997). Comput . Appl. Biosci ., Vol. 13, no. 6: 583 -586; T. D. Schneider & R. M. Stephens. (1990). Nucleic Acids Research, Vol. 18, No 20, p. 6097-6100). 이는 http://www.cbs.dtu.dk/~gorodkin/appl/plogo.html의 "Protein Sequence Logos using Relative Entropy" 웹 서버를 사용하여 얻었다. 이 표현은 도 1A 및 1B에서 나타난 선호 파라미터 매트릭스에 대한 대안이다. 각각의 아미노산을 나타내는 문자의 크기는 각 위치에서의 아미노산의 "중요성"에 비례한다; 즉, 더 큰 문자는 잔기가 구조적으로 더 바람직하다는 것을 나타낸다.
펩타이드 PHB1-9에 더하여, 표 1은 펩타이드 HDIII3CL의 서열(서열 번호10) 및 이것들의 여러 변이체를 나타내며, 여기서 변이체의 선택된 잔기는 알라닌 잔기로 치환되는데, 이를 사용하여 이 펩타이드의 항바이러스 활성에 대한 치환된 잔기의 중요성을 조사하였다. 디자인된 펩타이드는 HDIII3CL2, C-말단으로 3개 리신 잔기가 연장(서열 번호 11); HDIII3CLW-, HDIII3CL2의 Trp17→Ala 돌연변이(서열 번호 12); HDIII3CLK-, HDIII3CL2의 Lys14→Ala 돌연변이(서열 번호 13); 및 HDIII3CLC-, 펩타이드 HDIII3CL2의 Cys1→Ala 및 Cys18→Ala 이중 돌연변이(서열 번호 14) 였다.
도 2는 베타 헤어핀 펩타이드 HDIII3CL(A) 및 PHB4(B)의 3차원 구조 모델을 도시한다. 펩타이드 HDIII3CL의 경우에(도 2A), 도면은 헤어핀에 해당하는 세그먼트(양이온성 C-말단 연장 없음)를 나타내고 몇몇 중요한 잔기를 강조한다. 괄호 안의 수는 DIIIE의 해당 잔기의 세로 좌표에 해당한다. 펩타이드 PHB4의 경우에(도 2B), 괄호는 가닥이 HDIII3CL에 관하여 연장되는 경우, 본 발명에서 개시된 펩타이드의 생물학적 활성에 중요한 하기 측쇄들을 강조해서 나타내기 위해 사용된다: 1) DIIIE의 Lys385에 해당하는 회전/루프에 위치한 LyS, 2) DIIIE의 Lys388에 해당하는 제2 베타 가닥에 위치한 LyS, 3) DIIIE의 Trp391에 해당하는 제2 베타 가닥에 위치한 Trp, 4) DIIIE의 Tyr377에 해당하는 제1 베타 가닥에 위치한 Tyr. 도 2C는 두 펩타이드의 구조적 중첩을 도시한다.
본 발명에 의해 개시된 펩타이드 PHB1-9는 설명 섹션에서 및 본 발명의 이 실시예에서 제시된 일반적인 원칙에 따라 디자인될 수 있는 DENV에 대한 매우 강력한 항바이러스 활성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드의 특이적 예를 나타낸다. 따라서, 본 출원은 서열 동일성이 70%와 같거나 그 이상, 바람직하게는 80%가 되도록, 서열이 PHB1-9 세트의 펩타이드 중 적어도 하나와 유사한 모든 베타 헤어핀 펩타이드를 커버한다. 이 유사한 펩타이드는 다음 중에서 선택된 하나 또는 여러 위치에서 차이점이 있다: 1) 본 발명의 설명 섹션에서 기술된 변형 가능한 위치 a-e); 이 경우에, PHB1-9의 잔기(들)는 베타 헤어핀에서 상기 위치를 차지하려는 높은 구조적 성향을 나타내는 잔기로 대체된다; 2) 본 발명의 설명 섹션에서 기술된 잠재적 기능적 위치; 이 경우에, PHB1-9의 잔기(들)는 특이적 DENV 혈청형의 DIIIE의 FG 베타 헤어핀의 동등한 위치의 잔기로 대체된다; 3) C-말단 Lys 연장에 해당하는 위치; 이 경우에, 연장은 두 개 또는 세 개, 바람직하게는 세 개의 리신 잔기를 포함한다, 및 4) 펩타이드 PHB1-4 및 PHB7-9의 이황화 결합을 형성하는 시스테인에 해당하는 위치; 이 경우에 Cys 쌍의 하나는 Asp/Glu 또는 Lys으로 대체되고 나머지 하나는 Lys 또는 Asp/Glu로 대체될 수 있으며, 이로 인해 펩타이드는 이 잔기들(즉, 한 측면에는 Asp/Glu, 다른 측면에는 Lys)의 측쇄 간의 아미드 결합을 형성함으로써 고정될 수 있다.
PHB1-9 세트의 펩타이드와 유사한 베타 헤어핀 펩타이드의 서열은 일반적으로 다음과 같이 기술될 수 있다:
i. PHB1 및 PHB2와 유사한 펩타이드: 이 펩타이드는 PHB1 또는 PHB2와 70% 또는 그 이상(바람직하게는 80% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 나타내는 펩타이드이며, 서열은 다음과 같다:
위치 1(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 14에서 Cys 잔기와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 14에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치 2(변형 가능한 "a"): Val 또는 Ile 또는 Trp 또는 Phe 또는 Tyr 또는 Met
위치 3(잠재적으로 기능적): Tyr 또는 Asn
위치 4(변형 가능한 "a"): Trp, Val, Phe 또는 Glu
위치 5(변형 가능한 "d"): Thr, Val 또는 Ile(Val 또는 Ile는 천연 DENV 서열에서 나타나는 잔기이다)
위치 6(변형 가능한 "a"): Arg, Ile, Val, Glu 또는 Leu
위치 7(변형 가능한 "b"): d-Pro
위치 8(변형 가능한 "b"): Asp, Lys 또는 Asn
위치 9(변형 가능한 "a" 및 "e"): Trp, Lys, Met, Thr 또는 Gln
위치 10(잠재적으로 기능적): Lys
위치 11(변형 가능한 "a"): Val, Met, His 또는 Leu
위치 12(잠재적으로 기능적): Asn, Asp, Ser 또는 His
위치 13(필수적인 위치): Trp
위치 14(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 1에서 Cys 잔기와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 1에서 Lys (Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치 15-17 또는 15-16(C-말단 연장): Lys-Lys-Lys 트리펩타이드 또는 Lys-Lys 디펩타이드.
ii. PHB3 및 PHB4와 유사한 펩타이드: 이 펩타이드는 펩타이드 PHB3 및 PHB4에 관하여 70% 또는 그 이상(바람직하게는 80% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 가진 펩타이드이며, 다음과 같이 구성된 서열을 갖는다:
위치1(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 18에서 잔기 Cys와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 18에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치2(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치3(잠재적으로 기능적): Glu 또는 Asp
위치4(변형 가능한 "a"): Val, Ile, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치5(잠재적으로 기능적): Tyr 또는 Asn
위치6(변형 가능한 "a"): Trp, Val, Phe 또는 Glu
위치7(변형 가능한 "d"): Thr, Val 또는 Ile(Val 또는 Ile는 천연 DENV 서열에서 나타나는 잔기이다)
위치8(변형 가능한 "a"): Arg, Ile, Val, Glu 또는 Leu
위치9(변형 가능한 "b"): d-Pro
위치10(변형 가능한 "b"): Asp, Lys 또는 Asn
위치11(변형 가능한 "a" 및 "e"): Trp, Lys, Met, Thr 또는 Gln
위치12(잠재적으로 기능적): Lys
위치13(변형 가능한 "a"): Val, Met, His 또는 Leu
위치14(잠재적으로 기능적): Asn, Asp, Ser 또는 His
위치15(필수적인 위치): Trp
위치16(잠재적으로 기능적): Phe 또는 Tyr
위치17(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치18(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 1에서 Cys 잔기와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 1에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치19 -21 또는 19-20(C-말단 연장): Lys-Lys-Lys 트리펩타이드 또는 Lys-Lys 디펩타이드.
iii. PHB7과 유사한 펩타이드: 이 펩타이드는 펩타이드 PHB7과 70% 또는 그 이상(바람직하게는 80% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 가진 펩타이드이며, 다음과 같이 구성된 서열을 갖는다:
위치 1(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 14에서 잔기 Cys와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 14에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치 2(변형 가능한 "a"): Val, Ile, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치 3(잠재적으로 기능적): Tyr 또는 Asn
위치 4(변형 가능한 "a"): Val, Ile, Phe, Tyr 또는 Leu
위치 5(변형 가능한 "d"): Thr, Val 또는 Ile(Val 또는 Ile는 천연 DENV 서열에서 나타나는 잔기이다)
위치 6(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Tyr, His 또는 Lys
위치 7(변형 가능한 "b"): Asn 또는 Asp
위치 8(변형 가능한 "b"): Gly
위치 9(변형 가능한 "a" 및 "e"): Lys, His, Arg, Val, Tyr, Glu 또는 Met
위치 10(잠재적으로 기능적): Lys
위치 11(변형 가능한 "a"): Tyr, Val, Gln, Trp 또는 Phe
위치 12(잠재적으로 기능적): Asn, Asp, Ser 또는 His
위치 13(필수적인 위치): Trp
위치 14(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 1에서 Cys 잔기와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 1에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치 15-17 또는 15-16(C-말단 연장): Lys-Lys-Lys 트리펩타이드 또는 Lys-Lys 디펩타이드.
iv. PHB8 및 PHB9와 유사한 펩타이드: 이 펩타이드는 펩타이드 PHB8 및 PHB9에 관하여 70% 또는 그 이상(바람직하게는 80% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 가진 펩타이드이며, 다음과 같이 구성된 서열을 갖는다:
위치 1(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 18에서 잔기 Cys와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 18에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치 2(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치 3(잠재적으로 기능적): Glu 또는 Asp
위치 4(변형 가능한 "a"): Val, Ile, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치 5(잠재적으로 기능적): Tyr 또는 Asn
위치 6(변형 가능한 "a"): Val, Ile, Phe, Tyr 또는 Leu
위치 7(변형 가능한 "d"): Thr, Val 또는 Ile(Val 또는 Ile는 천연 DENV 서열에서 나타나는 잔기이다)
위치 8(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Tyr, His 또는 Lys
위치 9(변형 가능한 "b"): Asn 또는 Asp
위치 10(변형 가능한 "b"): Gly
위치 11(변형 가능한 "a" 및 "e"): Lys, His, Arg, Val, Tyr, Glu 또는 Met
위치 12(잠재적으로 기능적): Lys
위치 13(변형 가능한 "a"): Tyr, Val, Gln, Trp 또는 Phe
위치 14(잠재적으로 기능적): Asn, Asp, Ser 또는 His
위치 15(필수적인 위치): Trp
위치 16(잠재적으로 기능적): Phe 또는 Tyr
위치 17(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치 18(구조적, 고리화): Cys, Lys, Asp 또는 Glu(Cys이면 위치 1에서 Cys 잔기와 이황화 결합을 형성하고, Glu/Asp(Lys)이면 그것의 측쇄는 위치 1에서 Lys(Glu/Asp) 측쇄와 아미드 결합을 형성한다)
위치 19-21 또는 19-20(C-말단 연장): Lys-Lys-Lys 트리펩타이드 또는 Lys-Lys 디펩타이드.
v. PHB5 및 PHB6과 유사한 펩타이드: 이 펩타이드는 펩타이드 PHB5 및 PHB6에 관하여 70% 또는 그 이상(바람직하게는 80% 또는 그 이상)의 서열 동일성을 가진 펩타이드이며, 다음과 같이 구성된 서열을 갖는다:
위치 1(잠재적으로 기능적): Phe 또는 Tyr
위치 12(필수적인 위치): Trp
위치 3(잠재적으로 기능적): Asn, Asp, Ser 또는 His
위치 4(변형 가능한 "a"): Trp
위치 5(잠재적으로 기능적): Lys
위치 6(변형 가능한 "a"): Trp
위치 7(잠재적으로 기능적, 변형 가능한 "b"): Glu, Val, Arg, Ile 또는 Asp
위치 8(변형 가능한 "b"): d-Pro 또는 d-Lys
위치 9(변형 가능한 "b"): Asn, Asp 또는 Lys
위치 10(잠재적으로 기능적, 변형 가능한 "b"): Lys, Met, Trp, Gln 또는 Thr
위치 11(변형 가능한 "a"): Trp
위치 12(변형 가능한 "d"): Thr, Val 또는 Ile(Val 또는 Ile는 천연 DENV 서열에서 나타나는 잔기이다)
위치 13(변형 가능한 "a"): Trp
위치 5(잠재적으로 기능적): Tyr 또는 Asn
위치 13(변형 가능한 "a"): Ile, Val, Trp, Phe, Tyr 또는 Met
위치 14(잠재적으로 기능적): Glu 또는 Asp
위치 15-19 또는 15-18(C-말단 연장): Gly-Gly-Lys-Lys-Lys 펜타펩타이드 또는 Gly-Gly-Lys-Lys 테트라펩타이드.
펩타이드 합성
표 1에서 나열된 펩타이드를 Fmoc/tBu 전략에 따라 Fmoc-AM-MBHA 레진 상에서 고체상 합성에 의해 얻었다(Barany , G. & Merrifield , R. B. (1977) J Am Chem Soc. 99 7363-7365). 모든 시약 및 용매가 통상적으로 진공 하에서 여과에 의해 편리하게 제거될 수 있도록, 과정을 다공성 프리터(fritter)가 장착된 10 mL 주사기 상에서 수동으로 수행하였다. 아미노산을 DIC/HOBt 활성화 방법을 사용하여 커플링하였고, 커플링 반응의 완료를 닌하이드린 테스트로 검증하였다(Kaiser, E., et al. (1970) Anal Biochem . 34 595-598). 합성된 펩타이드를 레진에 트리플루오로아세트산/EDT/H2O/TIS(94%/2.5%/2.5%/1%) 용액을 처리하여 방출시켰고, 에테르로 침전시켰고 72시간 동안 동결건조시킨 후, 그것들을 디메틸 설폭사이드(DMSO)로의 산화를 통해 이황화 결합을 형성하여 고정시켰다(Andreu , D., et al. ( Eds ), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa , NJ, 1994, pp. 91-169). 수득한 펩타이드를 RP-C18 컬럼에서 예비 RP-HPLC로 정제하였고, 수거된 분획을 분석적 RP-HPLC로 독립적으로 분석하였으며, 99% 이상의 순도의 분획을 모아서 최종 펩타이드 조제물을 얻었다. 질량 분석법(ESI-MS)을 사용하여 최종 조제물의 분자량을 검증하였다.
질량 스펙트럼을 Z-spray 전기분무 이온화 소스가 장착된 하이브리드 8각 형상 QTOF-2TM 질량 분석계(Micromass, UK)로 획득하였다. 소프트웨어 패키지 MassLynx, ver. 3.5(Waters, USA)를 스펙트럼 획득 및 가공에 사용하였다.
실시예 2. Vero 세포에서의 DENV 감염의 억제
본 감염에 의해 개시된 베타 헤어핀 펩타이드가 시험관 내에서 DENV 감염을 억제할 수 있다는 것을 입증하기 위해서, 상기 펩타이드를 Vero 세포를 사용하는 플라크 감소 검정으로 평가하였다.
세포를 단층이 대략 90% 밀집도에 도달할 때까지 24웰 플레이트에서 키운 후, 그것들을 소 태아 혈청(FBS)이 없는 MEM 배지로 두 번 세척하였다. 이어서, 펩타이드 희석액을 첨가하였고 세포-펩타이드 혼합물을 전형적으로 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 이어서, 0.001의 감염 다중도(multiplicity of infection; m.o.i.)로 DENV 혈청형 2 조제물(NIBSC 코드 S16803)을 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양하였고, 바이러스 접종물과의 배양 기간이 완료되면, 결합되지 않은 비리온을 제거하기 위해 다시 세척하였고 바이러스 플라크가 형성되게 하기 위해 고밀도 배지(비-필수 아미노산, 1% FBS, 1% 카복시메틸셀룰로스로 보충된 MEM)에서 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 그 이후, 세포를 0.15 M 아세트산 나트륨 중 0.1% Naphtol Blue Black로 염색하였다. 각 검정에서 실험 시점 당 두 개의 복제물을 사용하였고, 각 샘플에 대하여 세 번의 독립적인 결정을 수행하였다.
베타 헤어핀 펩타이드의 독성을 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, Invitrogen, USA) 검정으로, 및 챔버를 사용하는 수동적 세포 계수에 의해 평가하였다(Mosmann,T . (1983). J. Immunol . Methods 65, 55-63.). 96웰 플레이트(Costar, USA)에 1x105 세포/mL로 Vero 세포를 함유하는 200 μL/웰의 현탁액을 분주하였고 단층이 대략 90% 밀집도에 도달할 때까지, 전형적으로 18-24 h 동안 배양하였다. 세포를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지로 두 번 세척한 후, 50 μL/웰의 평가되는 펩타이드 또는 첨가제 희석액을 첨가하였고(PBS에 용해된 Triton X-100™을 양성 독성 대조군으로 사용하였다) 플레이트를 5% CO2 대기 하에 37℃에서 2 또는 24 h 동안 배양하였다. 이어서 다음과 같은 두 가지 다른 과정을 이용하여 독성을 측정하였다.
a) PBS 중 MTT의 2 mg/mL 용액을 첨가하였고(50 μL/웰), 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가로 4 h 동안 배양하였다. 이어서 배지를 제거하였고, 100 μL/웰의 DMSO를 첨가하여 포르마잔 침전물을 가용화시켰다. 마지막으로, 플레이트 리더(Sensident Scan™, Merck, Germany)를 사용하여 540 nm의 파장에서 상층액의 광학 농도(OD)를 측정하였다.
b) 플레이트를 200 μL/웰의 DMEM 배지로 세척하였고, 이어서 트립신 용액(Sigma, USA)을 50　μL/웰로 첨가하였다. 10% FBS가 보충된 150　μL/웰의 DMEM을 첨가하여 트립신을 비활성화시킨 후, Trypan Blue(Gibco, USA) 생체 염색을 사용하여 세포를 계수하였다. 데이터를 통계학 소프트웨어 패키지 Prism v5.3(GraphPad, USA)을 사용하여 가공하였고, 여기서 log10(농도) 대 반응 곡선에 적합하도록 하는 비-선형 회귀를 사용하였다.
표 2는 Vero 세포에서의 DENV2에 대한 베타 헤어핀 펩타이드의 항바이러스 활성, 뿐만 아니라 독성 및 선별 지수에 해당하는 계산된 IC50 값을 나타낸다. 모든 분석된 펩타이드는 이 시스템에서 검출 가능한 항바이러스 활성을 나타냈다. 비록 펩타이드 PHB3, PHB5 및 PHB8의 경우에는 차이가 크지 않았지만, 펩타이드 PHB2, PHB3, PHB4, PHB5, PHB8 및 PHB9는 펩타이드 HDIII3CL보다 더 높은 항바이러스 효능을 나타냈다. 이 시험관 내 시스템에서, 펩타이드 PHB1, PHB6 및 PHB7은 실제로 펩타이드 HDIII3CL보다도 효능이 적었다. 펩타이드 PHB4는 나노몰 범위에서 항바이러스 활성 및 4333의 훌륭한 선별 지수를 나타냈다. 따라서, 이 펩타이드는 DENV에 대한 후보 항바이러스 약물로서 훌륭한 속성을 가진 후보 분자이다.
이 결과는 또한 본 발명에 의해 개시된 베타 헤어핀 펩타이드의 서열로부터 결실되고, 두 개의 중심 잔기를 가지고, DIIIE 루프의 원래의 서열과 완전히 또는 부분적으로 유사성이 없으며, 시험관 내에서 항바이러스 활성에 대하여 해로운 효과가 없는 베타 회전과 대체되었기 때문에 펩타이드 HDIII3CL의 6-잔기 가닥 간 루프가 완전히 불필요하다는 것을 입증하였다. 이것은 펩타이드가 2차 DENV 감염 중에 사용되는 경우 바람직한 특성인데, 이는 이 루프가 DENV에 대한 인간 항체 반응 중에 면역 우성이므로(Sukupolvi -Petty S, et al. (2007). J Virol .; 81(23):12816-26), 기존의 항체가 FG 베타 헤어핀-기반 펩타이드의 항바이러스 활성을 중화시킬 수도 있으므로 제거되어야 하기 때문이다. 따라서, 본 발명에서 개시된 펩타이드에서 루프를 결실시키는 것은 이러한 가능성을 제거한 것이다.
데이터는 또한 항바이러스 활성의 증가에 대하여 중요한 역할을 수행하는 가장 강력한 베타 헤어핀 펩타이드 중에서 여러 공통된 특징을 나타낸다. 예를 들어, 그것들 중 하나는 가닥 간 베타 회전 상의 중심 위치에서의 리신(또는 d-리신)의 존재이다. 펩타이드 PHB5는 PHB6보다 더 강력한데, 유일한 차이는 PHB6의 베타 회전 상에 리신 잔기의 부재이다(표 1). 또한, PHB2 및 PHB4는 PHB1 및 PHB3보다 더 강력하고, PHB1 및 PHB3는 둘 다 루프 중심 위치에 리신 잔기를 갖지 않는다(이 리신은 DIIIE의 Lys386 잔기를 기능적으로 모방하는 것으로 추정된다). 가장 강력한 펩타이드의 또 다른 독특한 특징은 DIIIE의 잔기 377과 동등한 위치(DENV3의 E 단백질의 세로 좌표)에서의 티로신 잔기의 존재이다. 예를 들어, 펩타이드 PHB9는 PHB8보다 더 강력한데, 유일한 차이는 PHB8에서는 Tyr5이 Asn5로 대체되었다는 것이다. 또한, PHB2(Tyr3을 함유함) 및 PHB4(Tyr5를 함유함)는 PHB1 및 PHB3보다 더 강력하며, PHB1 및 PHB3의 티로신 잔기는 아스파라긴 잔기로 대체되었다.
마지막으로, 데이터는 네 개의(가닥 당 두 개) 추가적인 아미노산의 첨가에 의한 베타 가닥의 연장이 펩타이드의 항바이러스 활성에 대하여 바람직한 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. 예를 들어, 펩타이드 PHB4의 효능은 PHB2의 효능보다 더 높았고, 펩타이드 PHB8 및 PHB9의 효능은 PHB7의 효능보다 더 높았다. 펩타이드 PHB4는 가장 강력한 전체 시리즈로서, 서열이 상기 확인된 강력한 펩타이드의 세 가지 독특한 특징을 모두 함유하는 유일한 펩타이드다. 따라서, 이 실시예에서 얻어진 실험 데이터는 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드를 디자인하기 위한 기준이 현명하게 선택되었다는 것을 입증하였다.
베타 헤어핀 펩타이드에 대한 효능, 시험관 내 독성 및 선별 지수
펩타이드 Vero 세포에서의 항바이러스 활성
IC 50 *, μM Ctox50 , μM SI
PHB1 75 >>1000‡ >>13
PHB2 12 85 7
PHB3 17 >>1000‡ >>59
PHB4 0.003 13 4333
PHB5 17 259 15
PHB6 33 411 12
PHB7 79 1911 24
PHB8 15 300 20
PHB9 7 216 31
HDIII3CL 20 1000 50
HDIII3CL2 20 1000 50
HDIII3CLW- NA ND ND
HDIII3CLK- NA ND ND
HDIII3CLC- NA ND ND
*, 항바이러스 활성(50% 억제 활성); NA, 100 μM보다 낮거나 이것과 같은 농도에서 검출 가능한 활성 없음; ‡, 1000 μM에서 비독성; ND, 미결정.
그 다음에, 각각의 IC50 값을 비교하여, 네 개의 DENV 혈청형 모두에 대한 펩타이드 PHB4 및 HDIII3CL의 항바이러스 활성을 비교하였다. 이 비교를 Vero 세포에서 플라크 감소 검정으로 수행하였으며, 0.001의 m.o.i.로 각 혈청형(DENV1, NIBSC 코드 West Pac 74; DENV2, NIBSC 코드 S16803; DENV3, NIBSC 코드 CH53489; DENV 4, NIBSC 코드 TVP360)에 바이러스 접종물을 첨가하였다. 표 3에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 펩타이드 PHB4는 네 개의 혈청형에 대하여 활성이었고, 펩타이드 HDIII3CL보다 훨씬 더 활성이었다(혈청형에 따라 4000 내지 7500배 더 강력함). PHB4가 네 개의 혈청형에 대한 활성 억제를 나타낸다는 사실은, 하기 본 출원에서 나타난 바와 같이, 모든 DENV 혈청형에 대한 식균작용 수용체로서 α2M*/LRP1 복합체의 제안된 역할 및 이 단백질들로의 펩타이드 PHB4의 결합을 입증하는 실험적 증거와 일치한다.
뎅기열 바이러스의 네 개의 혈청형에 대한 펩타이드 PHB4 및 HDIII3CL의 항바이러스 활성
펩타이드 항바이러스 활성 IC 50 , μM
DENV1에 대한 DENV2에 대한 DENV3에 대한 DENV4에 대한
PHB4 0.002 0.003 0.005 0.01
HDIII3CL 15 20 20 50
실시예 3. 베타 헤어핀 펩타이드에 의한, α2M * 로의 DIIIE의 결합의 억제
인간 α2M의 정제 및 활성화
인간 α2M을 380 mL의 인간 혈장으로부터 정제하였고, 건강한 30 내지 40살의 지원자로부터 혈장 샘플을 모아서 얻었다. 혈장을 4℃에서 72시간 동안 탈염수에 대하여, 자주 교환하면서, 투석하였다. 불용성 재료를 10,000 x g로 30분 동안 원심분리하여 수득한 투석물로부터 제거하였고, 상층액을 투석에 의해 PBS pH 6.0으로 평형화한 다음 이전에 Zn2 +가 로딩되고 PBS pH 6.0로 평형화된 Chelating Sepharose Fast Flow(Amersham, UK) 65 mL로 채워진 XK 50/30 컬럼(Amersham, UK)에 로딩하였다. 샘플을 로딩한 후, 컬럼을 용리액의 흡광도가 베이스라인으로 떨어질 때까지 PBS pH 6.0으로 세척하였고, 결합된 단백질을 10 mM 아세트산 나트륨/150 mM 염화 나트륨 pH 5.0 버퍼로 용출하였다. 수거된 용출액을 한외 여과로 농축한 다음 PBS pH 7.8로 평형화된 Superdex 200(Amersham, UK) 겔 여과 컬럼에 로딩하였다. 가장 높은 분자량 분획에서의 α2M의 존재를 항-인간 α2M 다클론성 항체 조제물(Sigma, USA)을 이용한 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 검증하였다.
정제된 α2M을 50 mM 인산 나트륨, 150 mM 염화 나트륨, pH 7.4 중 200 mM 메틸아민과 함께 배양하여 활성화시켰다. 수득한 α2M_MeNH2(α2M*) 조제물을 50 mM 인산 나트륨/0.5 M 염화 나트륨 pH 7.8에 대하여 광범위하게 투석하였다.
경쟁 검정
재조합 DIIIE1J와 α2M*의 상호작용을 억제하는 펩타이드 PHB1-9 및 HDIII3CL의 능력을 경쟁 ELISA 포맷을 사용하여 분석하였다. 플레이트를 정제된 α2M*로 코팅하였고 다른 농도의 테스트 펩타이드 및/또는 재조합 DIIIE1J의 존재시 이전에 정제되고 비오티닐화된 DIIIE1J(DIIIE1Jbiot)와 함께 배양하였으며, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 컨쥬게이트로 α2M*-결합된 DIIIE1Jbiot을 검출하였다. 재조합 DIIIE1J(서열 번호 19)를 얻기 위한 실험 과정의 상세한 설명은 하기 제공되지만, 분자는 필수적으로 DENV1, 균주 1636의 단백질 E의 잔기 289-400(서열 PIR:A32401에 따라 넘버링)으로 구성되며(Chu , M. C., et al. (1989). Journal of General Virology 70 (Pt 7), 1701-1712.), 이는 C-말단 6-히스티딘 태그로 이어지는 도메인 III에 해당한다.
저 마이크로몰 내지 서브마이크로몰/나노몰 범위의 펩타이드 농도에서, 베타 헤어핀 펩타이드 PHB5, PHB7, PHB8 및 PHB9는 α2M*로의 DIIIE1Jbiot의 결합을 부분적으로 억제하고(도 3), 억제 퍼센트는 펩타이드 농도에 따라 점증적으로 증가한다. 펩타이드 PHB5, PHB8 및 PHB9는 이 중 가장 강력한 억제자이며, 23 내지 50%의 범위의 억제 퍼센트를 나타내고, 이는 재조합 DIIIE1J와 유사하다. 분석된 농도 범위에서, 이 세 개의 펩타이드는 펩타이드 HDIII3CL보다 α2M*로의 DIIIE1Jbiot의 결합에 더 나은 억제자이다(농도에 따라 2 내지 12배).
이 검정에서 펩타이드 HDIII3CL에 의해 나타난 최대 억제 퍼센트는 단 18%였으며, 이는 심지어 PHB7, 즉 가장 효능이 적은 베타 헤어핀 펩타이드의 억제 퍼센트보다도 더 낮다. 이것은 DIIIE의 FG 헤어핀의 가닥 간 루프의 잔기가 단백질 α2M*과의 상호작용에 불필요하다는 것을 나타내며, 이는 펩타이드 PHB7에서의 원래의 6-잔기 길이 루프가 단 두 개의 중심 잔기를 가진 IP형 베타 회전으로 대체되었기 때문이다. 이 베타 회전의 서열은 원래의 루프와의 유사성(전체적으로 또는 부분적으로)을 가지고 있지 않으며, 그것의 잔기를 구조적 기준(높은 IPGUD 베타 회전 형성 성향, 베타 헤어핀 연결기)에 기초하여 선택하였다. 펩타이드 PHB7(또한 PHB8 및 PHB9)에 남아있는 원래의 HDIII3CL 루프의 유일한 잔기는 Lys11(HDIII3CL 넘버링)인데, 이것의 기능적 역할은 PHB7의 Lys9에 의해 모방되며, 이것은 유사한(구조적으로 준-동등한) 공간적 위치를 차지한다.
Lys9(이것은 HDIII3CL의 Lys11을 모방한다) 외에 HDIII3CL 잔기의 역할을 모방하는 다음과 같은 다른 PHB7 잔기가 있다: a) PHB7의 Asn3, Lys10 및 Asn12는 HDIII3CL의 잔기 Asn3, Lys14 및 Asn16(수소 결합을 형성하지 않는 베타 헤어핀 잔기)을 모방하며, 이것들의 측쇄는 DIIIE의 FG 헤어핀의 노출된 면으로 발사되고, 따라서 잠재적으로 기능적이다; b) PHB7의 Trp13은 HDIII3CL의 Trp17과 동등하고, 모든 플라비바이러스에 걸쳐 엄중히 보존되는 Trp 잔기에 해당한다; c) PHB7의 Cys1 및 Cys14는 HDIII3CL의 Cys1-Cy18에 의해 형성된 것과 동등한 이황화 브리지를 형성한다. PHB7이 이러한 잔기를 보유하고 사실상 HDIII3CL의 DENV 억제 활성을 능가한다는 사실은 PHH7의 디자인 중에 이러한 보유 특성이 본 발명에 의해 개시된 펩타이드의 기능적 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.
펩타이드 PHB8 및 PHB9는 펩타이드 PHB7보다 더 나은 억제자이다. 이것은 PHB8 및 PHB9에 네 개의 잔기(가닥 당 두 개)의 첨가가 바람직하게는 본 발명에 의해 개시된 펩타이드의 DENV 억제 활성에 기여한다는 것을 나타낸다.
도 4에서 관찰될 수 있는 바와 같이, PHB5 베타 헤어핀 펩타이드와 α2M* 간의 상호작용의 친화도는 DIIIE와 α2M* 간의 상호작용과 유사한데, 각각의 검정된 PHB5 농도에 대한 억제 퍼센트가 DIIIE1J에 의해 나타난 것보다 단지 조금 더 낮다. 이 결과는 위상 기하학이 네이티브 FG 베타 헤어핀에 관하여 반대이면서 여전히 DIIIE-α2M* 상호작용을 억제할 수 있는 베타 헤어핀 펩타이드를 사용하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 펩타이드 PHB7-9가 IP형 회전을 사용하는 반면에 PHB5가 IIP회전을 사용한다는 것을 고려하여, 펩타이드로 디자인된 베타 회전의 유형과 관련하여 유사한 결론을 도출 될 수 있다. 중요한 것은 상호작용에 필수적인 잔기와 구조적 동등성을 보존하는 것, 즉 구조적으로 다른 프레임워크로 제공되는 경우, 잔기는 유사한 공간적 방식으로 배열된다는 것이다. 또한, PHB5는 펩타이드 PHB8 및 PHB9의 형태를 안정화하는데 있어서 이황화 결합에 의해 행해지는 역할이 다른 구조적 모티프, 예를 들어, PHB5에서 사용된 Trp 지퍼에 의해 수행될 수 있다는 것을 입증한다.
본 발명의 필수적인 요소는 나노몰 범위에서 개시된 펩타이드의 생물학적 활성의 분석이다. 고효능 펩타이드는 더 낮은 치료적 투약량 및 더 낮은 비용을 사용될 수 있으며, 높은 투약량과 관련된 많은 문제, 예를 들어, 응집, 비-특이적 상호작용, 항원성 및 면역원성의 발생 가능성을 낮출 수 있다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 나노몰/서브마이크로몰 범위에서 펩타이드 PHB2, PHB4, PHB5, PHB8 및 PHB9는 여전히 DIIIE1J 그 자체보다 α2M*로의 비오티닐화된 DIIIE1J(DIIIE1Jbiot)의 결합에 대해 더 나은 억제자였다(1.5 내지 3배 더 나은 퍼센트 억제). 다른 한편으로는, 상기 농도 범위에서 펩타이드 HDIII3CL에 의해 나타난 억제는 DIIIE1J와 비교하여 매우 적다.
실시예 4. α2M * 로의 DIIIE의 결합에 필수적인 잔기의 매핑
DIIIE에 대한 알라닌 돌연변이( DIIIE1PRS )의 라이브러리의 제조
DENV1의 DIIIE의 어느 잔기가 많은 다른 리간드와 상기 분자의 상호작용에서 중요한 역할을 하는지 결정하기 위해서, 단일-잔기 돌연변이의 라이브러리를 제조하였으며, 분석되는 리간드로의 상기 돌연변이 변이체의 결합을 추후 연구하기 위해서 각 용매-노출된 잔기를 조직적으로 알라닌 잔기로 대체하였다('알라닌 스캐닝'으로 더 흔히 공지되어 있는 기술). 이 유형의 실험에서, 리간드로의 특정 변이체의 결합에 관련된 어떠한 변이체도 야생형 단백질과 상기 리간드의 상호작용에서 돌연변이된 잔기의 수반의 증거로서 해석된다.
이 라이브러리를 제조하기 위해서, 초기 분석을 DENV1, 균주 PRS 288690의 외피 단백질의 잔기 289 내지 395(GenBank에 따른 넘버링: AAN32775.1)로 제약하였다(Goncalvez,A.P., et al. (2002), Virology 303　(1), 110-119.). 본원에서 DENV1 균주 PRS 288690의 DIIIE(DIIIE1PRS)로 한정된 바이러스 다단백질의 단편에 해당하는 서열은 서열 번호 15에서 나타난다.
DIIIE1PRS에서 돌연변이되는 잔기의 선택
모든 잔기가 한 번에 하나씩 알라닌으로 대체되는 무작위 대입 접근(brute-force approach) 대신에, WHAT IF 버전 20050919-1718 소프트웨어 패키지(Vriend , G., (1990), J. Mol .Graph. 8, 52- 6)를 사용하여 추정된 상대적인 용매 접근성에 기초하여, 및 FoldX 버전 6.0(Schymkowitz , J., et al. (2005). Nucleic Acids Res. 33, W382-W388)에 의해 계산된 ΔΔG로 표현된 야생형 단백질에 관하여 모든 가능한 변이체의 안정성의 차이의 추정에 기초하여 사전 선택하였다. 두 가지 계산 모두 DIIIE1PRS(서열 번호 15의 잔기 1-105)의 상동성 모델을 기반으로 하며, 이 모델은 DENV3의 단백질 E의 결정학적 배위로부터 얻어지고(Modis , Y., et al. (2003). Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A 100, 6986-6991) 에너지 최소화 과정에 적용된다.
Ala로 돌연변이되는 잔기를 선택하는데 사용된 기준은 15%보다 더 높은 상대적 접근성 및 4 kcal/mol보다 더 낮은 ΔΔG이었다. 이 기준을 만족하는 79 위치 및 상기 언급된 파라미터에 대한 계산 결과는 표 4에 제시난다.
DIIIE1PRS의 알라닌 스캐닝을 위해 선택된 잔기
Res. aa %ACC ΔΔG1 kcal/mol ΔΔG2 kcal/mol Res. aa %ACC ΔΔG1 kcal/mol ΔΔG2 kcal/mol
289 MET 78.4 - - 343 LYS 72.2 3.4 3
290 ASP 85.6 2.4 2.4 344 GLY 31.4 4.7 4.3
291 LYS 88.2 2.5 2.4 345 VAL 60.8 3.2 2.2
292 LEU 70.4 2.3 2.2 346 THR 58.2 2.7 2.7
293 THR 82.8 2.8 2.8 347 GLN 55.3 2.6 2.9
294 LEU 70.6 2.3 2.1 348 ASN 51.4 3.1 3
295 LYS 76.6 3.4 3.3 350 ARG 69 4 3.7
296 GLY 26.7 3.6 2.2 351 LEU 21.1 5.4 5.5
297 MET 58.7 2.1 2.1 352 ILE 36.3 3.4 3.6
298 SER 91.1 2.5 2.3 353 THR 42.7 3.6 2.8
299 TYR 32.5 3.7 3.2 355 ASN 26 2.6 2.7
300 VAL 65.7 2.4 2 357 ILE 24.1 3.8 3.8
301 MET 57.8 2.2 2.4 359 TRH 66.6 2.5 2.6
303 THR 76.8 2.8 2.9 360 ASP 31.5 3.1 2.2
304 GLY 23.2 4.6 3.7 361 LYS 38.5 1.8 2.9
305 SER 18.5 3.2 3.1 362 GLU 65.3 2.2 2.2
307 LYS 51.3 3.9 3.7 363 LYS 61.1 3.3 3.1
308 LEU 31 5.3 5 364 PRO 34.9 4.2 4.3
309 GLU 32.1 2.2 2.6 365 VAL 15.4 4 4
310 LYS 67.9 3.2 3.1 366 ASN 55.8 2.7 2.8
311 GLU 79.1 2.8 2.6 368 GLU 26.9 3.1 3.2
312 VAL 19 3.8 4 370 GLU 29 3.2 3.1
314 GLU 42.2 1.7 1.5 372 PRO 25.1 5.5 5.2
315 THR 37.8 5.1 4.7 373 PHE 62.9 2.7 2.5
316 GLN 90.6 2.8 2.7 374 GLY 25 4.3 4
317 HIS 79.1 1.8 2.2 375 GLU 55.4 3.6 3.6
321 LEU 43.9 4.1 4 379 VAL 17.7 4 4
323 GLN 23.7 2.3 2.8 383 GLY 75.8 3.4 3.9
325 LYS 30 3.3 3.1 384 GLU 68.3 3 3
327 GLU 59.1 3.3 3.1 385 LYS 67.2 3.3 3
329 THR 84.2 2.2 2.6 387 LEU 22.8 3.6 3.7
330 ASP 29.5 0.5 2 388 LYS 60.6 3.4 3.5
332 PRO 40.5 3.9 3.8 389 LEU 23.1 4.7 5.6
334 LYS 15.1 1.8 1.7 390 SER 54.4 2.5 2.4
336 PRO 21.5 4.9 4.9 391 TRP 17.6 4.2 5
338 SER 28 2.3 2.3 392 PHE 63.8 3 3
340 GLN 17.6 2 2.2 394 LYS 61.8 2.7 2.7
342 GLU 61.8 1.8 1.1
ΔΔG: Ala 돌연변이 및 야생형 단백질 간의 폴딩 ΔG의 차이(1: 비-최소화된 모델, 2: 최소화된 모델); %AAC: 용매 접근성 퍼센트. 셰이딩된 잔기는 ΔΔG가 4 kcal/mol보다 더 높은 위치에 해당한다.
대장균(Escherichia coli)에서의 DIIIE1PRS 및 그것의 돌연변이된 변이체의 발현을 위한 재조합 플라스미드의 라이브러리의 제조
알라닌 스캔에 사용되는 DIIIE1PRS 잔기를 선택한 후, 대장균(E. coli)에서의 라이브러리의 각각의 Ala-돌연변이 변이체의 이종 기원 발현을 위해 재조합 플라스미드를 제조하였다. 이것을 Agarwal et al.(Agarwal KL , et al. (1970), Nature 227, 27- 34)의 방법을 사용하여, 및 포스포라미다이트 화학법을 통해 고체상에서 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 시작하여(Beaucage SL & Caruthers MH (1981). Tetrahedron Letters, 22, 1859), DENV1, 균주 PRS 288690의 단백질 E의 잔기 289-400(GenBank에 따르는 넘버링: AAN32775.1)을 암호화하는 이중 가닥 DNA 분자(Goncalvez,A.P., et al. (2002). Virology 303 (1), 110- 119)에 이어서, C-말단 6-히스티딘 태그; 재조합 DIIIE1PRS(rDIIIE1PRS, 서열 번호 17)로서 본원에서 한정된 재조합 단백질을 합성함으로써 달성하였다. 이 이중 가닥 DNA 분자(서열 번호 16)는 단편이 플라스미드 pET22b(Novagen Inc., USA)에 의해 제공된 시작 코돈과 같은 리딩 프레임(reading frame)에서 플라스미드 pET22b(Novagen Inc., USA)로 삽입될 수 있도록 디자인된, Nde I 및 Xho I 제약 효소에 대한 인식 부위를 함유한다. 이 이중 가닥 DNA 분자를 제조사에 의해 명시된 조건 하에 Nde I 및 Xho I 제약 효소로 분해시킨 후, 분해된 단편을 제조사에 의해 명시된 조건 하에 T4 DNA 리가제를 사용하여 이전에 같은 방식으로 분해된 플라스미드 pET22b(Novagen Inc., USA)에 결찰시켰다. 이렇게 얻어진 결찰 혼합물을 Sambrook et al.(Sambrook J, et al. Molecular cloning: A laboratory manual. New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989)에 의해 기술된 바와 같이 대장균의 XL-1Blue 균주에 형질전환하였고(Bullock WO, et al. (1987). Biotechniques ; 5:　376-8), 선택 배지에서 키워진 콜로니의 플라스미드를 스크리닝하였고, 정제하였고 시퀀싱하여 예상된 서열에 해당하는 플라스미드를 얻었다. 상기 플라스미드를 pET-DIII DENV1(서열 번호 18)으로 명명하였고, 도 6에서 다이어그램으로 표현된다.
DIII1PRS의 79개의 사전 선택된 Ala 돌연변이를 발현하기 위한 재조합 플라스미드의 구성을 pET-DIII DENV1에 대하여 상기 기술된 바와 같이 수행하였지만, 각각의 경우에 돌연변이되는 잔기에 해당하는 코돈이 알라닌 코돈에 해당하는 GCG 트리플렛(triplet)으로 대체되는 다른 이중 가닥 DNA 분자를 합성하였다. 각각의 변이체에서 암호화하는 아미노산으로 대체된 코돈은 표 5에 제시한다.
알라닌에 의해 대체된 잔기 및 DIIIE1PRS 돌연변이의 라이브러리의 각각의 변이체에서 GCG에 의해 대체된 해당 코돈
변이체 Ala에 의해 대체된 잔기(서열 번호 15) 코돈 서열 번호 16에서의 위치 변이체 Ala에 의해 대체된 잔기(서열 번호 15) 코돈 서열 번호 16에서의 위치
D290 D2 GAT 7-9 K343 K55 AAA 166-168
K291 K3 AAA 10-12 G344 G56 GGA 169-171
L292 L4 CTG 13-15 V345 V57 GTG 172-174
T293 T5 ACT 16-18 T346 T58 ACC 175-177
L294 L6 TTA 19-21 Q347 Q59 CAG 178-180
K295 K7 AAA 22-24 N348 N60 AAT 181-183
G296 G8 GGG 25-27 R350 R62 AGA 187-189
M297 M9 ATG 28-30 L351 L63 TTG 190-192
S298 S10 AGC 31-33 I352 I64 ATA 193-195
Y299 Y11 TAT 34-36 T353 T65 ACA 196-198
V300 V12 GTG 37-39 N355 N67 AAT 202-204
M301 M13 ATG 40-42 I357 I69 ATA 208-210
T303 T15 ACA 46-48 T359 T71 ACT 214-216
G304 G16 GGC 49-51 D360 D72 GAC 217-219
S305 S17 TCA 52-54 K361 K73 AAA 220-222
K307 K19 AAG 58-60 E362 E74 GAA 223-225
L308 L20 CTA 61-63 K363 K75 AAA 226-228
E309 E21 GAG 64-66 P364 P76 CCA 229-231
K310 K22 AAG 67-69 V365 V77 GTC 232-234
E311 E23 GAA 70-72 N366 N78 AAC 235-237
V312 V24 GTG 73-75 E368 E80 GAG 241-243
E314 E26 GAG 79-81 E370 E82 GAA 247-249
T315 T27 ACC 82-84 P372 P84 CCT 253-255
Q316 Q28 CAG 85-87 F373 F85 TTT 256-258
H317 H29 CAT 88-90 G374 G86 GGT 259-261
L321 L33 CTA 100-102 E375 E87 GAG 262-264
Q323 Q35 CAG 106-108 V379 V91 GTG 274-276
K325 K37 AAA 112-114 G383 G95 GGT 286-288
E327 E39 GAA 118-120 E384 E96 GAA 289-291
T329 T41 ACA 124-126 K385 K97 AAA 292-294
D330 D42 GAT 127-129 L387 L99 TTG 298-300
P332 P44 CCA 133-135 K388 K100 AAA 301-303
K334 K46 AAG 139-141 L389 L101 CTA 304-306
P336 P48 CCC 145-147 S390 S102 AGC 307-309
S338 S50 TCG 151-153 W391 W103 TGG 310-312
Q340 Q52 CAA 157-159 F392 F104 TTC 313-315
E342 E54 GAG 163-165 K394 K106 AAA 319-321
대장균으로의 DIIIE1PRS 돌연변이의 라이브러리의 플라스미드의 형질전환 및 얻어진 클론의 냉동보존
이 숙주에서 선택된 DIIIE1PRS 변이체를 발현하는 플라스미드를 함유하는 대장균 세포의 클론을 얻기 위해서, 대장균 균주 BL21(DE3)의 형질전환-컴피턴트 세포(competent cell)(Studier, F. W. & Moffatt , B. A. (1986) J. Mol . Biol . 189(1), 113-130)를 제조하였고 앨리쿼트로 나누었으며, 이것들 각각을 별도로 돌연변이 라이브러리의 플라스미드 중 하나의 20 ng로 형질전환하였으며, 이 경우 당업자에게 공지된 방법을 사용하였다(Sambrook , J., et al. Molecular cloning: A laboratory manual. 1989. New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 형질전환된 앨리쿼트를 100 μg/mL로 앰피실린을 함유한 LB-아가 플레이트에 별도로 평판 배양하였다. 박테리아 성장이 가능하도록 37℃에서 12시간 동안 배양 후, 각 플레이트로부터 웰-분리된 콜로니 하나를 각각 100 μg/mL로 앰피실린이 보충된 LB 브로스(broth) 5 mL를 함유하는 별개의 테스트 튜브에 접종하였고, 37℃에서 가시적인 탁도의 출현까지 교반하면서(200 rpm) 배양하였다. 이어서, 배양물을 25℃에서 3000 x g로 20분 동안 무균 상태로 원심분리하여, 각각 250 μL의 신선한 LB 브로스 + 250 μL 40 % (v/v) 글리세롤에 재현탁하였고, 차례로 100 μL 앨리쿼트로 나누어서 -70℃에서 저장하였다.
돌연변이 DIIIE1PRS 변이체의 정제
DIIIE1PRS 돌연변이 라이브러리의 변이체 각각을 발현하는 냉동 보존된 대장균 클론의 라이브러리를 제조한 후, 소규모 과정으로 상기 DIIIE1PRS 변이체를 정제하였다. 간략히 말하면, 각 변이체에 대하여, 해당 플라스미드를 함유하는 대장균 클론의 단일 냉동 보존된 앨리쿼트를 사용하여 1 L Erlenmeyer 플라스크에서 100 μg/mL로 앰피실린이 보충된 ZYM50502 배지 50 mL에 접종하였으며(Studier, F. W. (2005). Protein Expr . Purif . 41(1), 207-234), 이어서 이것을 37℃에서 12시간 동안 300 r.p.m으로 배양하였다. 그 이후, 배양물을 3000 x g로, 25℃에서 20분 동안 원심분리하였고, 상층액을 제거하였고, 수득한 바이오매스(biomass)를 용해시켜 6 M 구아니디늄 염산염(GuHCl)을 함유하는 AG 버퍼(PBX 1X, NaCl 0.3 mol/L, 이미다졸 20　mM) 19 mL에 재현탁하였으며, 적절한 프로브로 30분 동안 간략한 소니케이션(sonication)에 의해 균질액의 점성을 제거하였다. 3000 x g로, 25℃에서 45분 동안 원심분리에 의해 균질액을 정화시킨 후, 상층액을 0.3 mL의 Ni2 +-니트릴로트리아세트산-아가로스 레진(Ni-NTA 아가로스, Qiagen, Germany)과 함께 느린 회전 셰이커(rotary shaker)에서 25℃에서 1시간 동안 배양하였고, 수득한 슬러리를 빈 NAP-10 컬럼(GE Healthcare, USA)으로 중력-충전하였고, GuHCl의 감소하는 농도를 함유한 AG 버퍼(6 M 내지 1.2 M) 및, 마지막으로 버퍼 A(PBS 1X, NaCl 0.3 M, 이미다졸 20 mM)로 연속으로 세척하였다. 이어서, 단백질을 0.9 mL 버퍼 E(PBS 1X, NaCl 0.3 M, 이미다졸 300 mM)로 용출하였고, 용출액을 사전 포장된 PD-10 컬럼(Amersham, UK)을 사용하는 Sephadex G25 상에서 겔 여과에 의해 즉시 PBS 1X로 버퍼 교환하였다. 수득한 조제물의 총 단백질 농도를 바이신코닉산(BCA) 방법으로 결정하였고(Smith, P. K. (1985). Anal. Biochem . 150(1), 76-85), 순도를 환원성 조건 하에 SDS-PAGE로 평가하여(Laemmli , U. K. (1970). Nature 227(259), 680-685), 분해 생성물이 존재한다는 것을 확인하였다. 정제된 DIIIE1PRS 변이체의 라이브러리를 사용될 때까지 -20℃에서 저장하였다.
경쟁 검정
재조합 DIIIE와 α2M*의 상호작용을 억제하는 각각의 DIIIE1PRS 알라닌 돌연변이의 능력을 경쟁 ELISA 포맷을 사용하여 분석하였다. 플레이트를 정제된 α2M*로 코팅하였고 다양한 농도의 각각의 DIIIE1PRS 알라닌 돌연변이의 존재시 비오티닐화된 DIIIE1PRS(DIIIE1PRSbiot)와 함께 배양한 다음, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 컨쥬게이트로 α2M*-결합된 DIIIE1PRSbiot을 검출하였다. 광학 농도 대 농도 판독값을 용량-반응 곡선에 적합해서, 각 돌연변이, 뿐만 아니라 야생형 재조합 DIIIE1PRS의 IC50을 계산하는데 사용하였다.
도 7에서 관찰된 바와 같이, 도메인 III의 다섯 개의 잔기(Lys361, Glu262, Pro264, Val365 및 Lys385) 중 하나의 알라닌에 의한 대체는 모든 경우에 IC50의 증가(상호작용의 친화도의 감소)를 초래한다. 임계치로서 IC50의 2배 증가가 일어나면, 총 13개의 잔기의 알라닌에 대한 돌연변이는 상호작용에 영향을 미친다. 상기 언급된 5개의 잔기 외에, 이 13개의 군에서의 잔기는 Glu342, Thr34, Arg350, Lys363, Asn366, Pro372, Gly374 및 Glu375이다.
이 결과는 α2M*로의 DIIIE의 결합이 DIIIE에서 두 개의 독립적인 표면 패치를 수반한다는 것을 나타낸다(도 7 및 8): 그 중 하나는 상부 표면 상에 위치하고(N-말단이 발견된 경우) 또 다른 하나는 하부 표면 상에 위치한다(C-말단이 발견된 경우). 상단 패치는 상호작용에 가장 많이 기여하는 잔기를 함유하며, 이 잔기는 알라닌에 의한 대체가 친화도를 10배 이상 감소시키는 다섯 개의 군을 포함한다. 따라서, 이 패치는 DIIIE와 α2M* 간의 상호작용을 위한 1차 부위인 것으로 간주될 수 있다. 필수적인 잔기는 Lys361-Asn366의 연속적 선형 세그먼트 및 잔기 Lys385이다.
DIIIE의 하부 표면에 위치한(도 7 및 8) 상기 언급된 제2 패치는 잔기 Glu342, Thr346, Arg350, Pro372, Gly374 및 Glu375에 의해 형성된다. 알라닌에 의한 이 잔기들의 대체는 상단 패치의 잔기 상에서의 유사한 대체보다 친화도를 더 작게 감소시킨다. 따라서, 이 하단 패치는 2차 상호작용 부위인 것으로 간주될 수 있다.
α2M*과의 상호작용에 수반된 DIIIE의 표면 부위의 맵핑에서 얻어진 이 실험 결과는 본 발명의 베타 헤어핀 펩타이드를 디자인하는데 필요한 원칙을 입증한다. 예를 들어, DIIIE의 Lys385의 구조적/기능적 모방체를 구성하는 리신 잔기를 포함하도록 한 결과, 이 잔기가 개별적으로 상호작용에 가장 많이 기여하는 잔기임이 입증되었다(알라닌으로의 돌연변이는 22배 이상만큼 상호작용의 친화도를 감소시킨다). 이 잔기를 모방하는 펩타이드 잔기는 다음과 같다: PHB2의 Lys8, PHB5의 d-Lys8, PHB1, PHB6 및 PHB7의 Lys9, PHB4의 Lys10 및 PHB3, PHB8 및 PHB9의 Lys11. 또 다른 예에서, DIIIE와 α2M*의 상호작용을 가장 강력하게 억제하는 베타 헤어핀 펩타이드 중 네 개(PHB4, PHB5, PHB8 및 PHB9, 도 5, 실시예 3)는 DIIIE의 Glu375를 구조적으로/기능적으로 모방하는 잔기를 가지며, 이것은 이 실시예에서 결정된 2차 결합 부위의 가장 중요한 잔기이다. Glu375를 모방하는 베타 헤어핀 펩타이드의 잔기는 PHB3, PHB4, PHB8 및 PHB9의 Glu3, 및 PHB5 및 PHB6의 Glu16이다. 다시 말해서, α2M*로의 DIIIE의 결합을 가장 강력하게 억제하는 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드는 이 실시예에서 기술된 1차 및 2차 상호작용 부위의 가장 중요한 두 개의 잔기를 함유하는 것들이다.
실시예 5. 초분자 구조의 형성
펩타이드 PHB4의 응집 동역학
빛 산란을 사용하여 펩타이드 PHB4의 응집을 모니터링하였다. 측정을 Shimadzu™ RF-5301PC(Shimadzu, Japan) 분광 형광계 상에서 수행하였으며, 기구 제조사에 의해 제조된 소프트웨어로 데이터를 획득하였다. 입사광 빔(여기) 및 검출기(방출)의 파장을 320 nm으로 설정하였고, 5 nm의 애퍼쳐(aperture)를 사용하였다. 펩타이드에 의해 분산된 빛의 강도에서 펩타이드가 없는 용액에 의해 분산된 빛의 강도(블랭크(blank))를 빼서 펩타이드로 인한 빛의 산란을 계산하였다. PBS 중 펩타이드의 용해로 인한 빛 산란의 변화를 시간 경과 방식으로 데이터를 획득함으로써 연구하였고, 측정 빈도는 초 당 1 또는 2회이다. PBS 중 PHB4의 용액을 수중 펩타이드 용액의 일부와 PBS 2X 용액의 일부를 혼합하여 제조하였다.
이 실험에서 획득한 데이터는, PBS로 용해되면, 2분 보다 더 짧은 잠재기 이후, 펩타이드에 의해 분산된 빛의 강도가 처음 30-40분 동안 신속하게 증가한 다음, 300분까지 선형 비율로 천천히 계속해서 증가함을 나타냈다. 도 9는 5 및 10 μM의 펩타이드 농도에 대하여 시점 0에서의 분산된 빛에 대한 일정 시점에서의 분산된 빛의 비율
Figure 112016093379169-pct00001
의 행태를 도시한다. 두 농도에 대한 프로파일은 유사하지만, 5 μM에서 최대인
Figure 112016093379169-pct00002
는 10 μM에서보다 더 크며(11 대 7), 이는 더 낮은 펩타이드 농도에서 일어나는 응집이 원래의 평균 크기와 비교하여 더 큰 평균 크기의 응집체의 형성을 야기함을 제안한다. SigmaPlot 10.0(Systat Software Inc., USA)을 사용?颱臼? 차트를 제조하였다.
펩타이드 PHB4에 의해 형성된 초분자 구조의 형태에 대한 투과 전자 현미경에 의한 분석
펩타이드 PHB4에 의해 형성된 응집체의 형태를 분석하기 위해서, 펩타이드 용액은 상이한 실험에 적용되며, 실험 조건, 예를 들어, 온도, 배양 시간 및 전해질의 존재는 응집을 용이하게 하도록 조작된다(도 10). 이 특정 연구를 위하여, 두 개의 펩타이드 용액(2 mg/mL, 0.73 mM)을 제조하였으며, 이 중 하나는 물에서, 다른 하나는 PBS에서 제조하였다. 이어서 샘플을 각각의 용액으로부터 채취하였고, 그리드(grid) 상에 직접 고정하여 현미경 하에서 관찰하였다(T0 샘플). 나머지를 50℃에서 1시간 동안 배양한 다음 샘플을 채취하여 즉시 고정하였다(T1 샘플). 이어서 나머지를 추가로 2시간 동안 실온에서 배양한 다음, 고정하였다(T2 샘플).
도 10A에서 관찰된 바와 같이, 물에 용해될 때 펩타이드는 실온에서 5-20 nm의 직경을 가진 미립자를 형성한다. 50℃ 처리는 미립자와 함께 5-10 nm의 크기를 가진 원섬유/소섬유형 사상 구조의 출현을 유도한다(도 10E). 수중 소섬유의 형성을 위한 잠재기가 있는데, 이 소섬유는 열 처리 후에만 T2 샘플에서 검출된다. 소섬유 형성은 더 높은 이온 강도(PBS)에서 바람직한데, 이는 더 긴(5-20 nm) 사상 구조가 PBS에서 펩타이드가 용해된 직후 형성되어(도 10B), 50℃에서 1시간 동안 샘플을 가열한 후 계속해서 수치가 증가되기(도 10D 및 10F) 때문이다. 이 결과는 더 높은 온도 및 이온 강도가 펩타이드 PHB4의 응집에 바람직하다는 것을 입증한다.
또한, 이 연구는 펩타이드 PHB4가 형태가 배지 조성 및 온도에 의존적인 초분자 응집체를 형성한다는 것을 분명하게 나타낸다. 관찰된 소섬유 구조의 크기는 아밀로이드형 구조와 일치하며, 이것은 전형적으로 연장된 베타 시트의 형성을 통해 길쭉한 섬유로서 성장한다.
단백질 응집 과정의 결과는 단백질 분자 사이에서 척력 및 인력 간의 정확한 균형에 의존적이다(Juarez , J., et al. (2009) Biophysical Journal 96[6], 2353-2370). 단백질 용액에 전해질을 첨가하는 것은 상기 전해질에 의한 단백질 분자 간 정전하 척력의 실딩(shielding)으로 인해 종종 소섬유의 형성 속도를 증가시키며, 따라서 이것은 매력적인 분자 간 상호작용 및, 따라서 응집체의 형성에 대한 균형을 깨트리는 것으로 공지되어 있다(Juarez , J., et al. (2009) Biophysical Journal 96[6], 2353-2370; Sagis,L.M ., et al. (2004). Langmuir 20, 924-927). 분자 간 상호작용 과정의 동역학은 또한 온도에 의존적이며, 이것은 단백질 응집의 유도에 대한 근본적인 역할을 하는 것으로 오랫동안 공지되어 있었다.
실시예 6. 베타 헤어핀 펩타이드와 LRP1 수용체 단편의 상호작용 연구
DENV 감염은 DENV 비리온 및 LRP1으로 공지된 세포 수용체 간의 상호작용을 방해하는 분자에 의해 차단될 수 있다는 것이 공지되어 있다(Huerta H. et al, WO 2007/124698). LRP1은 85 kDa β 사슬에 비-공유 결합에 의해 회합된 대략 500 kDa α 사슬에 의해 형성된 필수적인 막 단백질이다(도 11A)(Anna P. Lillis , et al. (2008) Physiol Rev 88: 887 -918). 이 수용체의 세포 외 영역은 전체 α 및 β 사슬의 일부에 의해 형성되며, 이것은 막관통 세그먼트, 및 수용체 신호전달 및 엔도시토시스에 수반된 세포 내 단백질과 상호작용하는 두 개의 NPxY 모티프를 함유한다. LRP1은 30개 이상의 다른 리간드를 내재화할 수 있는 구성적 식균작용 수용체이고, 지질 대사, 지혈, 리소좀 효소의 활성화 및 신경 전달을 포함하는 많은 중요한 과정에 수반되는 것으로 밝혀졌다.
세포 외 LRP1 리간드와 상호작용하는 것은 LRP1의 α 사슬이다. 이 사슬은 LRP1이 속하는 저밀도 지질 단백질 수용체 과의 일원의 전형적인 도메인 아키텍쳐를 나타낸다. 구체적으로, LRP1의 α 사슬은 구조적으로 보체 캐스케이드의 단백질의 Cys-풍부 영역에 관련된 2(클러스터 I), 8(클러스터 II), 10(클러스터 III) 및 11(클러스터 IV) 리간드 결합 부위를 함유하는 네 개의 클러스터를 함유한다. 각각의 리간드 결합 부위의 클러스터 다음에는 Cys-풍부 영역에 의해 형성된 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인 및 YWTD 도메인이 있다.
LRP1의 리간드 결합 도메인이 DENV의 DIIIE와 상호작용하는지 결정하기 위해서, 도 11C에서 나타난 바와 같이, 재조합 DIIIE 단백질을 DENV1 균주 Jamaica/CV1636/1977(DIIIE1J)의 단백질 E의 잔기 289-399; DENV2 균주 Jamaica 1409(DIIIE2)의 단백질 E의 잔기 289-399; DENV3 균주 H-87(DIIIE3)의 단백질 E의 잔기 287-397 및 C-말단 헥사히스티딘 태그(서열 번호 19-22)에 융합된 DENV4 균주 Dominica 814669 (DIIIE4)의 단백질 E의 잔기 289-399로부터 제조하였다. 단백질 DIIIE1J 및 DIIIE2-DIIIE4를 대장균의 이종 기원 발현에 의해 얻었고 고정된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제하여, 90% 이상의 순도를 가진 조제물을 얻었으며, 이는 SDS-PAGE 분석에 의해 입증된 바와 같다(도 11D).
또한, 이 실험은 각각 sLRP1-CII(서열 번호 23), sLRP1-CIII(서열 번호 24) 및 sLRP1-CIV(서열 번호 25)로 명명된, 인간 IgG1 분자(R&D Systems, USA)의 불변 영역에 융합된 LRP1의 클러스터 II, III 또는 IV를 함유하는 세 개의 재조합 단백질을 사용하였다(도 11B).
DIII/LRP1 상호작용의 평가를 ELISA 검정으로 수행하였으며, 이 검정에서는 96-웰 플레이트를 10　μg/ml의 단백질 DIIIE1J 또는 DIIIE2-DIIIE4로 코팅한 다음 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였고 37℃에서 1시간 동안 20 mM HEPES pH 7.5/150 mM NaCl/1 mM CaCl2/0.05% Tween 20에서 10　μg/ml의 sLRP1 CII, sLRP1 CIII 또는 sLRP1 CIV와 함께 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 항-인간 IgG-퍼옥시다제 컨쥬게이트의 1:1000 희석액과 함께 배양하였고 o-페닐렌디아민/H2O2로 현상하였다. 얻어진 데이터는 네 개의 혈청형 모두의 DIIIE에 대하여 유사한 패턴의 상호작용을 나타냈는데, sLRP1-CIV는 가장 강력한 결합을 나타내고 다음으로 강력한 결합은 sLRP1-CII에서 나타났으며, sLRP1-CIII는 어떠한 DIIIE 분자에도 검출 가능한 결합을 나타내지 않았다(도 12).
베타 헤어핀 펩타이드와 LRP1 수용체의 가용성 단편의 상호작용을 Biacore X 유닛을 사용하여, 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR)에 의해 연구하였다. 이 기술에서, 연구되는 상호작용 파트너 중 하나를 칩의 표면 상에 고정하고, 다른 상호작용 파트너를 제어된 유속의 조건 하에, 상호작용 표면 상단의 측정 세포를 통해 흐르는 용액에 용해시킨다. 상호작용 파트너의 회합 및 해리를 공명 유닛(RU)로 측정하고 '센서그램'으로 공지된 차트에서 시간의 함수로서 플로팅하였다. 따라서, SPR은 실험자가 상호작용 파트너를 라벨링하지 않고도 상호작용에 대한 상세한 정보를 얻을 수 있게 한다.
이 예에서, CM5 칩(GE Healthcare, USA)의 한 채널을 사용하여 표면 상에 고밀도로 단백질 sLRP1-CIV를 고정하였고(표 6 참조) 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA, Sigma-Aldrich, USA)을 다른 채널 상에 고정하였다. 각 분자에 대하여 달성된 RU 밀도에 기초하고, 각각의 sLRP1-CIV 분자에 대한 11개의 잠재적인 상호작용 부위 및 각각의 HSA 분자에 대한 하나의 잠재적인 상호작용 부위가 있다고 가정하면, 두 채널의 표면은 표면적 유닛 당 결합 부위의 유사한 밀도(pmol/mm2)를 나타낼 것이다.
sLRP1 - CIV와의 상호작용을 평가하는데 사용된 CM5 칩에서의 결합 표면의 특성의 요약
채널 리간드 분자량( kDa ) 고정된 RU 결합 부위(pmol/mm 2 ) 칩 표면에서의 단백질 농도(mol/L)
Fc1 sLRP1-CIV 77 1,665 0.2 2.2 x10-4
Fc2 rHSA 67 10,108 0.2-0.1 1.5 x10-3
두 개의 공지된 LRP1 리간드인, α2M 및 수용체-회합 단백질(RAP)로 공지된 단백질을 사용하여 고정된 단백질의 반응성을 평가하였다. 두 분자 모두 LRP1 수용체의 클러스터 IV와 상호작용한다는 것이 입증되었다(Jaap G. Neels , et al. (1999). Journal of Biological Chemistry, 274, 44: 31305 -31311). 도 13은 이 검증 결과를 나타낸다. 관찰할 수 있는 바와 같이, α2M 또는 RAP의 로딩은 sLRP1-CIV 채널에서 검출된 신호(RU)를 증가시키지만, rHSA 채널에서 신호 강도의 증가시키지 못한다. 이 결과는 고정된 sLRP1-CIV가 두 리간드 모두와 특이적으로 상호작용한다는 것을 입증한다.
이 조건들이 분자량이 평균 단백질의 분자량보다 낮은 화합물(예를 들어, 이 실험이 연구하도록 의도된 펩타이드)과의 어떠한 잠재적인 상호작용을 더 쉽게 검출할 수 있게 하기 때문에 고밀도에서 sLRP1-CIV를 고정하는 것으로 결정되었지만, 고밀도 표면에서는 물질 전달 제약 및 다원자가 결합의 가능성으로 인해 동역학 상수를 정확히 결정하기가 어렵다는 것을 고려해야만 한다. 따라서, sLRP1-CIV 결합 표면을 더 상세히 특성화하기 위해서, 상이한 농도의 RAP 희석액(0.6-20 μM)을 로딩하고, RU를 상호작용 평형의 조건 하에 등록하였다(250초, 도 13B 참조). 그 결과 생성된 최대 RU 대 농도 곡선에 의해 나타난 행태는 4.2 nM의 Kd로의 고친화도 상호작용 및 1.1 μM의 Kd로의 저친화도 상호작용이 있는 이중 부위 모델의 것에 잘 부합한다. 이 데이터들은 LRP1로의 RAP의 결합을 분석하는 다른 연구에서 얻어진 다른 결과와 일치하며, 이는 RAP가 6-18 nM의 친화도로 LRP1의 클러스터 II 및 IV와의 다지점 상호작용을 확립하고, 이 상호작용에서의 다원자가의 손실이 마이크로몰 범위에서 일정한 친화도를 야기한다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 실험에서, 친화도가 마이크로몰 범위인 상호작용은 칩 표면에서 고밀도로 고정된 sLRP1-CIV에 의해 설명될 수 있으며, 이는 높은 RAP 농도에서의 다원자가 상호작용의 손실을 용이하게 한다. 데이터는 또한 고정된 sLRP1-CIV가 LRP1-RAP 상호작용의 이전에 보고된 특성을 충실하게 재현한다는 것을 나타낸다.
sLRP1-CIV로의 베타 헤어핀 펩타이드의 결합을 다른 펩타이드 변이체의 러닝 버퍼 중 20 μM 희석액을 상기 특성화된 sLRP1-CIV 칩으로 로딩하여 연구하였다. 그 결과 생성된 신호의 높은 강도는 모노머 형태의 펩타이드 보다는 응집된 형태의 펩타이드의 결합과 일치한다. 따라서, 다른 펩타이드 사이에서 관찰된 변화는 일원적 펩타이드 상호작용의 친화도의 차이 또는 응집 수의 차이를 반영할 수 있으며, 다원자가 방식으로 고정된 sLRP1-CIV 분자에 동시에 관여할 수 있는 펩타이드 유닛의 수의 변화로 이어지는 기하학을 반영할 수 있다.
HDIII3CL 과의 펩타이드(표 1의 펩타이드 10-14)의 경우에, 변이체 HDIII3CL2는 가장 강력한 결합을 나타낸다. 또한, 변이체 HDIII3CLW 및 HDIII3CLK의 경우에는 검출 가능한 특이적 결합이 있지만, 상호작용의 강도는 이보다 훨씬 더 낮으며, 잔기 Trp17 및 Lys14의 대체가 sLRP1-CIV로의 결합에 대하여 반대 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 변이체 HDIII3CLC의 경우에는 아주 미미한 상호작용이 있으며, 잔기 C1 및 C18의 대체(다시 말해서, 이황화 브리지의 제거)가 펩타이드와 sLRP1-CIV의 상호작용의 강도에 극적으로 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이 결과는 펩타이드에 의해 나타난 항바이러스 활성의 효능에 대한 이전의 데이터와 일치하는데, HDIII3CL에 비해 sLRP1-CIV로의 결합이 감소된 HDIII3CLC, HDIII3CLW 및 HDIII3CLK는 Vero 세포에서 DENV2에 대한 시험관 내 항바이러스 활성을 나타내지 않는다(표 2 참조). 다른 한편으로는, HDIII3CL과 비교하여 HDIII3CL2에 의해 나타난 sLRP1-CIV로의 더 강력한 결합은 더 강력한 항바이러스 활성으로 바뀌지 않으며(표 2 참조), 이는 수용체 결합 그 자체가 필요하지만 그것으로 항바이러스 활성에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. 이 발견에 대한 하나의 가능한 설명은 바이러스-수용체 상호작용에서 적절한 역할을 하지 않는 sLRP1-CIV의 부위에 결합하고, 및/또는 매우 낮은 친화도로 결합하고 있는 HDIII3CL2의 분획이 있다는 것이다; 이는 수용체 LRP1 및 그것의 클러스터의 다중 도메인 아키텍쳐를 설명하는 합리적인 중첩에 해당한다. 펩타이드 HDIII3CL2 및 HDIII3CL 간의 차이는 HDIII3CL2가 추가적인 C-말단 리신을 갖고, 따라서 더 강력한 양이온성 특징을 가지며, 이것은 음전하를 띈 LRP1 수용체와의 추가적인 정전하 상호작용을 용이하게 할 수 있다. 이에 더하여, Lys21는 이전에 및 본 발명에서 기술된 DIIIE의 기능성 패치를 모방하는 위상 기하학적 영역인 헤어핀의 일부를 형성하지 않는다는 것을 주목해야 한다(Huerta V. et al, WO 2007/124698).
베타 헤어핀 펩타이드 PHB1, PHB2, PHB3, PHB4, PHB5, PHB8 및 PHB9와 sLRP1-CIV 표면의 상호작용을 평가하기 위해 같은 과정이 뒤따른다. 도 14B 및 14D에서 나타난 바와 같이, 이전 검정에서 이 시리즈 중 가장 강력한 항바이러스 펩타이드인 펩타이드 PHB4는 또한 SPR에 의한 sLRP1-CIV로의 가장 강력한 결합을 나타냈다. 또한, 펩타이드 PHB2, PHB4 및 PHB9는, 시험관 내 항바이러스 활성에 부합하는, 펩타이드 HDIII3CL 이상의 최대 결합을 나타냈다(도 14A 및 14C). 같은 크기 및 베타 회전 유형의 펩타이드(PHB1-2, PHB3-4 및 PHB8-9)의 최대 결합의 비교는 펩타이드 PHB2, PHB4 및 PHB9가 그것들의 대응물(PHB1, PHB3 및 PHB8)보다 더 나은 바인더인 것을 나타내며, 항바이러스 활성 검정에서 그것들의 행태와 유사하다(실시예 2 참조).
실시예 7. 베타 헤어핀 펩타이드의 항바이러스 활성 및 수용체 LRP1 및 단백질 α2M * 로의 그것들의 결합 간의 상관관계
수용체 LRP1은 DENV에 대한 식균작용 수용체로 제안되었고, 세포로의 바이러스 진입 과정에서의 '브리징' 또는 '담체' 역할은 단백질 α2M*(LRP1 리간드)에 할당되었다(Huerta V. et al, WO 2007/124698).
실시예 6은 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드가 수용체 LRP1의 단편에 결합할 수 있다는 것을 입증하였다. 본 실시예는 실시예 2에서 관찰된 항바이러스 활성이 수용체 LRP1에 결합하는 이 펩타이드의 능력과 상관관계가 있는지를 검사한다. 도 15에서 관찰될 수 있는 바와 같이, Vero 세포에서 펩타이드의 항바이러스 활성의 IC50 값(-pIC50)의 로그는 400 s의 실행 길이로 관찰된 Biocore 신호의 값에 대한 선형 의존성(RUrem)을 나타낸다. 이 경우에, 표 1에 따라 같은 위상 기하학을 공유하는 유일한 PHB 펩타이드가 나타난다. 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성의 효능이 나머지보다 훨씬 더 높을 뿐만 아니라, 펩타이드 PHB4는 LRP1 결합에 관하여 다른 것들을 훨씬 능가한다. 상기 관찰된 관계의 선형성은 PHB4 데이터가 제외됨에도 불구하고 일정하게 유지되는데(도 15의 삽도), 선형 회귀 계수(R2)는 PHB4 데이터가 있으면 0.99이고, 없으면 0.97이다. 삽도 데이터를 분석에 따르면, PBH4에 대한 선형 종속성이 유지되어야 하면, Biacore 결합 값은 나노몰 범위에서 항바이러스 효능에 해당한다는 것이 예측될 수 있으며, 이는 실시예 2에서 실험에 의해 확인된 효능과 일치한다.
일반적인 위상 기하학을 가진 펩타이드의 항바이러스 활성에 대한 pIC50 데이터는 RUrem 값과의 통계적으로 유의한 상관관계를 나타낸다(r(Pearson) = - 0.9957 및 P < 0.0001). 펩타이드 PHB4 데이터가 제외되면, 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)는 유사하게 유지된다(r(Pearson) = - 0.9868, P = 0.0018). 상관관계, 선형 회귀 및 차트의 분석을 Prism v5.03(GraphPad Software Inc., USA)로 수행하였다.
이 결과들은 PHB 펩타이드가 비리온 및 LRP1 수용체 간의 상호작용을 방해하는 항바이러스 작용 메커니즘과 일치하며, 이는 세포로의 생산적 바이러스 진입의 억제를 야기한다.
서브마이크로몰/나노몰 범위에서 단백질 α2M*로의 DIIIE의 결합을 억제하는 PHB 펩타이드의 능력에 관하여 유사한 분석을 수행하였다. 실시예 3에서 나타난 바와 같이, 상기 농도 범위에서 펩타이드는 α2M*로의 비오티닐화된 DIIIE1J(DIIIE1Jbiot)의 결합을 부분적으로 억제하였으며, 펩타이드 PHB2, PHB4, PHB5, PHB8 및 PHB9는 DIIIE1J 단독 보다 더 나은(1.5 내지 3배) 억제 퍼센트를 나타낸다. 이 경우에, 펩타이드의 억제 능력은 또한 Vero 세포에서 DENV2에 대한 항바이러스 활성과 상관관계가 있으며(α2M*로의 DIIIE1Jbiot 결합을 억제하는 재조합 DIIIE1J의 능력에 관하여), 이는 도 16에서 나타난 바와 같다. IC50 값 및 α2M* 억제 퍼센트 간의 스피어맨 상관 계수(Spearman's correlation coefficient)(재조합 DIIIE1J의 억제 퍼센트에 관하여) Rs = -0.9762, P=0.0004이고; 이는 본 발명에서 개시된 베타 헤어핀 펩타이드가 세포로의 바이러스의 진입 중에 단백질 α2M*에 의해 수행되는 역할을 방해할 수 있다는 것을 제안하는 결과이다.
실시예 8. 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성에 대한, 응집에 영향을 미치는 약제의 효과
응집을 용이하게 하는 처리 후 또는 응집을 조절하는 다른 약제의 존재시 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성을 평가하였으며, 이는 DENV2 균주 S16803로 Huh7.5 세포의 감염에 대한 이 펩타이드의 억제 활성에 대한 효과를 검사할 목적을 갖는다. Huh7.5, 인간 간종양-유래된 세포주를 선택하였는데, 이는 이 세포주가 DENV2에 관대할 뿐만 아니라, DENV 발병의 관점의 실험 시스템으로서 적절하기 때문이다(Lin YL, et al. (2000) J Med Virol.; 60(4):425-31).
이온 강도의 변화가 펩티드 응집체의 크기 및 형태에 변화를 야기한다는 증거를 제시한 실시예 5에서 나타난 결과에 기초하여, 수중 PHB4의 농축된 용액으로부터 시작하여, 이 펩타이드를 (i) MEM 배지 또는 (ii) PBS(각각 6.8 g/L 및 8.0 g/L의 NaCl을 함유하며, pH를 7.4로 조절)에 용해시켜서 상이한 조건에서 평가하는 실험을 디자인 하였다.
항바이러스 활성을 바이러스 수율 검정에서 평가하였는데, 이 검정에서는 80-90% 밀집도 Huh7.5 단층을 보충되지 않은 DMEM으로 두 번 세척한 다음 다른 펩타이드 조제물의 존재시 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 0.01의 m.o.i로 감염시킨 후, 바이러스 접종물을 보충되지 않은 DMEM으로 세척하여 제거하였고, 세포를 2% FBS가 보충된 DMEM에서 키웠다. 세포 상층액을 24 h p.i. 수거하였고, 바이러스 수율을 플라크 형성 검정에서 상층액을 적정하여 결정하였다(Morens D. M., et al. (1985). N. J. Clin. Microbiology; 22: 250-254).
온도가 응집, 즉 초분자 구조로의 펩타이드 자가 조립에 큰 영향을 미친다는 것은 잘 공지되어 있다(Sabate R, et al. (2012). Biomacromolecules ; 13(2):474-83). 따라서, 제1 검정을 설정하였으며, 이 검정에서는 수중 20 μM PHB4의 용액으로부터 시작하여, 10-0.01 μM 농도 범위에 있는 MEM으로 희석액 제조하였고, 이어서 이것을 10℃ 및 37℃에서 2시간 동안 동시에 배양한 다음 바이러스 억제 검정에 사용하였다. 비-배양된 펩타이드 희석액(즉, 바이러스 억제 검정 직전에 제조됨)을 대조군으로서 사용하였다.
결과는 MEM 배지에 용해된 비-배양된 펩타이드가 용량-의존적 방식으로 바이러스 감염을 억제하였으며, IC50은 0.16 μM이고 IC100은 10 μM이라는 것을 나타낸다(도 17, 표 7). 10℃의 MEM에서의 사전 배양의 경우 IC50이 0.037 μM로 하락하였으므로 효능이 상당히 증가한 반면, 37℃에서의 배양의 경우 IC50이 0.89 μM으로 증가하였으므로 반대 효과를 나타냈다. 결과는 온도가 펩타이드 응집의 과정에서 결정적인 역할을 한다는 것을 나타내는데, 즉 이 실험에서 24배 더 큰 효능의 변화를 야기한다.
10℃ 또는 37℃에서 배양된 펩타이드 PHB4에 대한 IC 50
첨가제 처리
배양 안 함 2 hrs, 10℃ 2 hrs, 37℃
- 0.16(0.83*) 0.037(0.60) 0.89(0.87)
각 실험 조건에 대한 IC50 을 데이터의 비-선형 적합도로부터 결정하였으며, 이는 Prism v5.03을 사용하여 수행하였다. *괄호 안의 수는 적합도에 대한 회귀 계수(R2)의 값이다.
펩타이드 PHB4의 항바이러스 효능에 대한 응집 시간의 영향을 결정하기 위해서 제 2 실험을 디자인하였다(도 18). 이 실험에서, 펩타이드를 다른 간격으로 PBS에서 배양한 다음, 수득한 혼합물의 항바이러스 활성을 평가하기 전에 응집 과정을 중단시킬 목적으로 DMEM 중 80　mg/mL HSA의 단일 부피로 희석하였다(HSA는 초기 핵 형성 및 아밀로이드 β 펩타이드 소섬유의 성장 둘 다를 억제하는 것으로 입증된 강력한 응집 모듈레이터이다, Reyes A., et al. (2009) Journal of Biological Engineering, 3:5 참조). HSA와의 배양을 10℃ 또는 37℃에서 동시에 수행하였고(도 18), 항바이러스 활성을 평가하기 위한 이 펩타이드 샘플의 추가 희석을 DMEM 중 40 mg/mL HSA 용액에서 수행하였다.
도 19에서 나타난 바와 같이, 검정의 조건 하에서 펩타이드의 항바이러스 활성 값은 종 모양 용량-반응 곡선을 형성하였는데, 이는 활성 억제를 위한 펩타이드 농도의 최적 범위를 나타낸다. 이러한 유형의 반응은 많은 다른 생물학적 시스템의 활성에서 흔히 볼 수 있으며, 비록 이 행태를 설명할 수 있는 단일 작용 메커니즘은 없지만, 모든 경우에 공통 요소는 분자들 간 다원자가 상호작용이 존재한다는 것이다.
이 결과는 펩타이드의 활성 억제가 효능이 더 높은 응집체의 형성을 위한 PBS 중 배양 기간의 길이에 민감하다는 것을 입증하며, 이 경우에, 효능은 검정을 위한 감염 대조군의 50% 바이러스 수율만큼 감소하는 가장 낮은 펩타이드 농도로서 이해된다. 다른 한편으로는, 10℃에서 HSA와의 배양은 37℃에서 배양에 의해 얻어진 결과와 비교하여 더 낮은 효능 변이체의 형성을 야기한다. 이것은 펩타이드, 즉 여전히 성장하고 있는 응집체와 HSA의 상호작용이 있는 경우, PBS에서 45-60분 동안 배양 후 37℃에서 HSA와의 배양에 의해 얻어진 것과 같이 응집 과정이 변화되어 고효능 변이체의 형성을 야기하여, 이 검정 포맷에서 1 nM-10 pM 만큼 낮은 펩타이드 농도로 DENV에 의한 감염을 억제할 수 있음을 확인한다.
펩타이드의 시작 농도는 유의한 방식으로 응집 과정의 동역학 및 최종 결과에 영향을 미칠 수 있는 또 다른 파라미터이다. 이 파라미터가 펩타이드 PHB4의 항바이러스 활성에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해서, 검정을 설정하였으며(도 20에 제시) 이 검정에서는 100 μM 내지 2 μM의 범위의 농도에서 수중 펩타이드 용액을 단일 부피 MEM 2X로 희석하였고 25℃에서 2 h 동안 배양한 후, 보충되지 않은 DMEM 배지에서의 희석액을 제조하였고 항바이러스 활성에 대하여 검정하였다.
이 결과는 펩타이드를 응집체 성장 과정을 촉발하기 위해 더 높은 이온 강도의 용액에 첨가 전의 수중 펩타이드 PHB4의 초기 농도와 항바이러스 활성 간의 상관관계가 있다는 것을 입증한다(도 21). 또한, 데이터는 용량-반응 행태의 변화를 입증하며, 이는 수중 펩타이드 용해의 초기 조건에 따라 상이한 응집체 구조로의 발전을 확인한다. 가장 강력한 형태는 다시 종 모양 용량-반응 곡선을 형성하며, 펩타이드가 이 검정에서 평가된 가장 높은 수중 초기 희석액에서 발견되는 조건에 대하여 얻어진다.
요약하면, 이 결과는 펩타이드 PHB4가 응집 조건에 따라 나노몰/서브나노몰 범위에서 항바이러스 효능을 가진 응집된 형태로 조립될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실험에서 사용된 항바이러스 활성 검정은 평가되는 분자가 감염의 초기 단계에만 존재하며 세포 단층의 차후 세척 중에 제거되기 때문에 이 목적을 위한 가장 엄중한 테스트 중 하나라는 것이 강조되어야 한다. 따라서, 항바이러스 활성이 이 실험 설정으로 검출 가능하다는 사실은 세포로의 바이러스 진입의 초기 단계 중 하나를 억제하는 펩타이드 PHB4에 대한 작용의 메커니즘과 일치한다; 초기 단계는 세포 표면에의 결합, 내재화 또는 막 융합이다.
실시예 9. 동물 모델에서의 바이러스 감염의 보호
펩타이드 PHB4의 생체 내 항바이러스 활성을 평가하고 펩타이드 HDIII3CL과 비교하기 위한 실험을 설정하였다. 이 목적을 위해서, 12 마리의 성체 Balb/c 마우스(20 g 평균 체중)의 군을 에테르 흡입에 의해 마취시켰고 이 모델의 중간 치사량의 10배 및 평가되는 펩타이드를 함유하는 20 μL의 바이러스 조제물을 두개 내로 접종하였다. 동물은 신속하게 회복하여 처치 후 5분에 이미 기민한 것으로 나타났고, 그 후 21일 동안 모니터링하였다. 데이터를 카플란-마이어 로그 순위 테스트(Kaplan-Meier logarithmic rank test)를 사용하여 평가하였다.
표 8은 네 개의 DENV 혈청형으로 수행된 실험 결과를 함유한다. 검정된 용량에서, 펩타이드 PHB4는 마우스에 대한 전체 보호를 제공하고, 따라서 펩타이드 HDIII3CL보다 더 강력하다. DENV2 균주의 경우에, 실험을 세 번 반복하였다.
생체 내 보호 검정의 결과 요약
펩타이드 용량 보호 ( % )
DENV1 DENV2 DENV3 a DENV4
PHB4 30 mg 100*** 100 *** 100 *** 100***
HDIII3CL 30 mg 50* 42** ND 17***
통계적 유의성: ***, P < 0.005; **, P< 0.01; * P<0.05; ND, 미결정
a: 이 검정에서 사용된 DENV3 균주에 대한 치사량이 결정될 수 없었다. 따라서, 대신에 사망률을 평가하였으며, 다음과 같은 증상의 출현에 대하여 마우스를 모니터링하였으며: 뻗친 털, 사지 마비, 및 구부러진 자세, 이러한 증상을 나타내는 마우스를 안락사시켰다. 뻗친 털, 구부러진 자세, 탈진, 및 하지 마비.
실시예 10. 금속 기반 나노입자로의 조립을 위한 폴리히스티딘 태그에의 펩타이드 PHB4의 융합
본 발명자들은 본 발명에 의해 개시된 베타 헤어핀 펩타이드가 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여, 단독으로 또는 다른 단백질/펩타이드에 융합된 채로 생산될 수 있다는 것을 앞에서 언급하였다. 또한, 실시예 5에서는 본 발명에 의해 개시된 베타 헤어핀 펩타이드가 펩타이드의 시작 농도, 용매 유형 및 실험 조건, 예를 들어, 온도, pH, 이온 강도, 소니케이션, 첨가제의 존재, HSA와 같은 단백질에의 비-공유 결합 등에 따라 상이한 4차원 구조로 응집될 수 있고 이를 취할 수 있음을 입증하였다. 이 초분자 구조의 형성은 아마도 펩타이드-기반 나노입자와 그것들의 수용체의 상호작용의 결합력이 다원자가 결합 때문에 훨씬 더 크다는 사실(수용체에서 여러 리간드 결합 도메인을 갖거나 또는 세포 표면 상에서 하나 이상의 수용체를 가진 같은 나노입자에서 여러 모노머의 동시 상호작용)로 인해 베타 헤어핀 펩타이드의 항바이러스 활성을 크게 증가시킨다(실시예 8 참조). 이에 더하여, 나노 입자의 형성은 혈청 반감기를 증가시키고, 혈청 프로테아제에게 저항성을 부여함으로써 펩타이드의 약물동력학적 속성에 긍정적으로 기여할 수 있다.
본 발명에 의해 개시된 베타 헤어핀 펩타이드가 형성하는 것으로 밝혀진 나노입자는 '스페이서'(E) 분자 또는 원자에 비-공유 결합에 의해 결합할 수 있는 상기 펩타이드 '수령자'(A) 군을 융합함으로써 더 안정화될 수 있으며, 각각의 'E' 군에 대하여 둘 이상의 'A' 군의 화학량론을 갖는다. 이러한 디자인은 둘 이상의 PHB 펩타이드와 단일 'E' 스페이서의 회합을 가능하게 할 것이다. 본 발명의 한 구체예에서, 화학적 합성을 통해 펩타이드 PHB4에 다섯 개의 히스티딘 잔기로 구성된 태그를 부착하였다(도 22). 다중-히스티딘 태그는 다원자가 금속 이온, 예를 들어, Zn(II), Cu(II), Cu(II), Cs 등에 대하여 'A' 군의 기능을 수행할 수 있다. 이 경우에, 히스티딘 잔기의 측쇄를 구성하는 이미다졸 기의 원자는 금속 이온 당 최대 네 개의 이미다졸 기의 화학량론으로 금속 이온으로의 배위 결합을 확립한다. 따라서, 특정 농도에서, 다중히스티딘-결합된 금속 이온은 'E' 군의 역할을 하고 펩타이드 다이머화를 촉진할 수 있다.
도 23은 보조 킬레이트화 기, 예를 들어, 테트라아니온 화합물 EGTA(에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산) 및 EDTA(2-({2-[비스(카복시메틸)아미노]에틸}(카복시메틸)아미노)아세트산)로의 배위 수단에 의해서, 금속 이온이 어떻게 이용 가능한 이미다졸 기를 가지고 있는 상이한 펩타이드를 직간접적으로 결합하는데 사용될 수 있는지를 도시한다. 이 경우에, 금속 이온은 디아민테트라카복실산의 분자 당 두 개의 금속 이온의 화학량론을 가진 EGTA(Me)2 및 EDTA(Me)2 복합체를 형성하며, 추가적인 이미다졸 기와 배위 결합을 형성할 수 있고, 이로 인해 펩타이드 및 그것들의 응집체의 교차 결합을 안정화할 수 있는 'E' 군의 역할을 한다(도 23).
도 22는 본 발명에 의해 개시된 융합 분자 중 둘을 도시한다; 이 중 하나는 다중-히스티딘 태그가 C-말단 아미드 결합을 통해 펩타이드 PHB4에 결합되고(PHB4H5) 다른 하나는 태그가 유사한 방식으로 펩타이드에 N-말단으로 부착된다(P5PHB4). 두 융합 펩타이드를 앞서 실시예 1에서 기술된 과정에 따라 합성하고 정제하였고, 4 mM EGTA의 용액에 8 mM의 최종 농도로 ZnCl2를 첨가하여 얻은 2 mM ZnCl2(금속 이온을 제공) 또는 2 mM EGTA(Zn2) 복합체를 함유하는 10 mM MES pH 6.8-7.5 버퍼 중 각각의 펩타이드의 200 μM 용액을 제조하는데 사용하였다.
Vero 세포에서 DENV2(균주 M2C)에 대한 이 펩타이드 조제물(PHB4H5 및 H5PHB4, 단독으로 또는 Zn 또는 EGTA(Zn2)와의 복합체로)의 항바이러스 활성에 대하여 검정하였다. 요약하면, 세포를 펩타이드 조제물의 존재시 37℃에서 1 h 동안 배양한 다음, 바이러스 접종물을 0.001의 m.o.i로 첨가하였다. 두 시간 후, 고밀도 배지의 층을 첨가하였고 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 배양하였다. 바이러스 접종 전에 해당하는 농도로 단지 ZnCl2 및 EGTA(Zn2)의 용액과 함께 배양된 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 바이러스 플라크를 바이러스 외피에 특이적인 단클론성 항체를 이용한 면역포시(immunofoci) 기술을 사용하여 검출하였고, 억제 퍼센트를 다음 식으로 계산하였다:
I = 100 - 100 x NP펩타이드/NP음성 대조군
여기서, I는 억제 퍼센트이며, NP는 반복하여 평균 낸 바이러스 플라크의 수이다.
도 24에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 융합 펩타이드(단독, 금속 첨가제 없음)는 20 μM의 농도에서 높은 억제성을 나타내지만(100%에 가까운 억제 퍼센트), 항바이러스 활성은 4 또는 0.16 μM의 펩타이드 농도에서 사라진다. 하지만, 이 농도에서도, 펩타이드와 EGTA(Zn2) 스페이서의 복합체는 50-70% 억제 퍼센트의 항바이러스 활성을 나타낸다. 펩타이드 H5PHB4는 0.16 μM에서 33%의 억제 퍼센트를 나타낸다.
이 결과는 다중-히스티딘 태그로의 펩타이드 PHB4의 융합이 스페이서 약제, 특히 EGTA(Zn2) 스페이서와 복합체를 형성할 때 더 강력한 항바이러스 활성을 나타낸다는 것을 입증한다.
<110> CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA <120> BETA HAIRPIN PEPTIDES WITH ANTIVIRAL PROPERTIES AGAINST DENGUE VIRUS <150> CU 2014-0026 <151> 2014-03-03 <160> 25 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> stereoisomer D-Proline <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> AMIDATION at C-terminus <220> <221> DISULFID <222> (1)..(14) <400> 1 Cys Val Asn Trp Thr Glu Pro Asp Lys Lys Val Asn Trp Cys Lys Lys 1 5 10 15 Lys <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(14) <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> stereoisomer D-Proline <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 2 Cys Val Tyr Trp Thr Arg Pro Lys Trp Lys Val Asn Trp Cys Lys Lys 1 5 10 15 Lys <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> stereoisomer D-Proline <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 3 Cys Ile Glu Val Asn Trp Thr Glu Pro Asp Lys Lys Val Asn Trp Phe 1 5 10 15 Ile Cys Lys Lys Lys 20 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> stereoisomer D-Proline <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 4 Cys Ile Glu Val Tyr Trp Thr Arg Pro Lys Trp Lys Val Asn Trp Phe 1 5 10 15 Ile Cys Lys Lys Lys 20 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> stereoisomer D-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 5 Phe Trp Asn Trp Lys Trp Glu Lys Asn Lys Trp Thr Trp Asn Val Glu 1 5 10 15 Gly Gly Lys Lys Lys 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> stereoisomer D-Lys <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 6 Phe Trp Asn Trp Lys Trp Glu Pro Asn Lys Trp Thr Trp Asn Val Glu 1 5 10 15 Gly Gly Lys Lys Lys 20 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(14) <220> <221> MOD_RES <222> (17) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 7 Cys Val Asn Val Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Asn Trp Cys Lys Lys 1 5 10 15 Lys <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 8 Cys Ile Glu Val Asn Val Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Asn Trp Phe 1 5 10 15 Ile Cys Lys Lys Lys 20 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 9 Cys Ile Glu Val Tyr Val Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Asn Trp Phe 1 5 10 15 Ile Cys Lys Lys Lys 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 10 Cys Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn 1 5 10 15 Trp Cys Lys Lys 20 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 11 Cys Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn 1 5 10 15 Trp Cys Lys Lys Lys 20 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 12 Cys Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn 1 5 10 15 Ala Cys Lys Lys Lys 20 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> DISULFID <222> (1)..(18) <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 13 Cys Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Ala Ile Asn 1 5 10 15 Trp Cys Lys Lys Lys 20 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Beta hairpin peptide, rational design <220> <221> MOD_RES <222> (21) <223> AMIDATION at C-terminus <400> 14 Ser Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn 1 5 10 15 Trp Ser Lys Lys Lys 20 <210> 15 <211> 106 <212> PRT <213> Dengue virus type 1 <220> <221> DISULFID <222> (14)..(45) <400> 15 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 20 25 30 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 35 40 45 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 50 55 60 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 65 70 75 80 Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu 85 90 95 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys 100 105 <210> 16 <211> 342 <212> DNA <213> Dengue virus type 1 <400> 16 catatggata aactgacttt aaaagggatg agctatgtga tgtgcacagg ctcatttaag 60 ctagagaagg aagtggctga gacccagcat ggaactgttc tagtgcaggt taaatacgaa 120 ggaacagatg cgccatgcaa gatccccttt tcgacccaag atgagaaagg agtgacccag 180 aatgggagat tgataacagc caatcccata gttactgaca aagaaaaacc agtcaacatt 240 gagacagaac caccttttgg tgagagctac atcgtggtag gggcaggtga aaaagctttg 300 aaactaagct ggttcaagaa aggaagcagc atagggctcg ag 342 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: rDIII DENV1, <220> <221> SITE <222> (114)..(119) <223> histidine-tag <400> 17 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 20 25 30 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 35 40 45 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 50 55 60 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 65 70 75 80 Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu 85 90 95 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Val 100 105 110 Asp His His His His His His 115 <210> 18 <211> 5700 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: plasmid pET-DIII DEN1 coding for rDIII DENV1; DNA, double stranded, circular <400> 18 catatggata aactgacttt aaaagggatg agctatgtga tgtgcacagg ctcatttaag 60 ctagagaagg aagtggctga gacccagcat ggaactgttc tagtgcaggt taaatacgaa 120 ggaacagatg cgccatgcaa gatccccttt tcgacccaag atgagaaagg agtgacccag 180 aatgggagat tgataacagc caatcccata gttactgaca aagaaaaacc agtcaacatt 240 gagacagaac caccttttgg tgagagctac atcgtggtag gggcaggtga aaaagctttg 300 aaactaagct ggttcaagaa aggaagcagc atagggctcg agcaccacca ccaccaccac 360 tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag 420 caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa 480 ggaggaacta tatccggatt ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg 540 cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc 600 ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa 660 atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac 720 ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt 780 tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca 840 accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt 900 taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta 960 caatttcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 1020 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 1080 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 1140 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 1200 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 1260 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 1320 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 1380 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 1440 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 1500 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 1560 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 1620 agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 1680 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 1740 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 1800 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 1860 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 1920 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 1980 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 2040 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 2100 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 2160 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 2220 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 2280 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 2340 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 2400 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 2460 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 2520 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 2580 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 2640 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 2700 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 2760 ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 2820 ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 2880 tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 2940 tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 3000 ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca 3060 acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 3120 gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 3180 aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt 3240 tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag 3300 cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga 3360 tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt 3420 actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg 3480 atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat 3540 gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg 3600 cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat 3660 gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc 3720 ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac 3780 aggagcacga tcatgcgcac ccgtggggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg 3840 ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg 3900 aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa 3960 atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata 4020 agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct 4080 ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg 4140 ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 4200 ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac 4260 cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa 4320 gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg 4380 gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatat ccgcaccaac 4440 gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac 4500 cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga 4560 catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata 4620 tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag 4680 cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc 4740 atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg 4800 aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat 4860 gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac 4920 gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt 4980 aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat 5040 cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc 5100 cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac 5160 cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac 5220 tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg 5280 aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct 5340 gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg 5400 gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca 5460 cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt 5520 cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc 5580 cggcgtagag gatcgagatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt 5640 gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 5700 5700 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: recombinant protein containing domain III of the envelope protein from virus Dengue type 1 <220> <221> SIMILAR <222> (114)..(119) <223> histidine-tag <400> 19 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 1 5 10 15 Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 20 25 30 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 35 40 45 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 50 55 60 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 65 70 75 80 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 85 90 95 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Leu 100 105 110 Glu His His His His His His 115 <210> 20 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: recombinant protein containing domain III of the envelope protein from virus Dengue type 2 <220> <221> SITE <222> (114)..(119) <223> histidine-tag <400> 20 Met Asp Lys Leu Thr Leu Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ser Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val 20 25 30 Leu Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro 35 40 45 Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile 50 55 60 Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu 65 70 75 80 Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu 85 90 95 Lys Ala Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Leu 100 105 110 Glu His His His His His His 115 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: recombinant protein containing domain III of the envelope protein from virus Dengue type 3 <220> <221> SITE <222> (114)..(119) <223> histidine-tag <400> 21 Met Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Thr Asn 1 5 10 15 Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 20 25 30 Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Val Pro Cys Lys Ile Pro 35 40 45 Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile 50 55 60 Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu 65 70 75 80 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp 85 90 95 Asn Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Leu 100 105 110 Glu His His His His His His 115 <210> 22 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: recombinant protein containing domain III of the envelope protein from virus Dengue type 4 <220> <221> SITE <222> (114)..(119) <223> histidine-tag <400> 22 Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly 1 5 10 15 Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr 20 25 30 Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro 35 40 45 Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile 50 55 60 Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu 65 70 75 80 Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn 85 90 95 Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Leu 100 105 110 Glu His His His His His His 115 <210> 23 <211> 617 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Arg Pro Pro Ile Phe Glu Ile Arg Met Tyr Asp Ala Gln Gln Gln Gln 1 5 10 15 Val Gly Thr Asn Lys Cys Arg Val Asn Asn Gly Gly Cys Ser Ser Leu 20 25 30 Cys Leu Ala Thr Pro Gly Ser Arg Gln Cys Ala Cys Ala Glu Asp Gln 35 40 45 Val Leu Asp Ala Asp Gly Val Thr Cys Leu Ala Asn Pro Ser Tyr Val 50 55 60 Pro Pro Pro Gln Cys Gln Pro Gly Glu Phe Ala Cys Ala Asn Ser Arg 65 70 75 80 Cys Ile Gln Glu Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Leu Asp 85 90 95 Asn Ser Asp Glu Ala Pro Ala Leu Cys His Gln His Thr Cys Pro Ser 100 105 110 Asp Arg Phe Lys Cys Glu Asn Asn Arg Cys Ile Pro Asn Arg Trp Leu 115 120 125 Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly Asn Ser Glu Asp Glu Ser Asn Ala 130 135 140 Thr Cys Ser Ala Arg Thr Cys Pro Pro Asn Gln Phe Ser Cys Ala Ser 145 150 155 160 Gly Arg Cys Ile Pro Ile Ser Trp Thr Cys Asp Leu Asp Asp Asp Cys 165 170 175 Gly Asp Arg Ser Asp Glu Ser Ala Ser Cys Ala Tyr Pro Thr Cys Phe 180 185 190 Pro Leu Thr Gln Phe Thr Cys Asn Asn Gly Arg Cys Ile Asn Ile Asn 195 200 205 Trp Arg Cys Asp Asn Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Ala 210 215 220 Gly Cys Ser His Ser Cys Ser Ser Thr Gln Phe Lys Cys Asn Ser Gly 225 230 235 240 Arg Cys Ile Pro Glu His Trp Thr Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Gly 245 250 255 Asp Tyr Ser Asp Glu Thr His Ala Asn Cys Thr Asn Gln Ala Thr Arg 260 265 270 Pro Pro Gly Gly Cys His Thr Asp Glu Phe Gln Cys Arg Leu Asp Gly 275 280 285 Leu Cys Ile Pro Leu Arg Trp Arg Cys Asp Gly Asp Thr Asp Cys Met 290 295 300 Asp Ser Ser Asp Glu Lys Ser Cys Glu Gly Val Thr His Val Cys Asp 305 310 315 320 Pro Ser Val Lys Phe Gly Cys Lys Asp Ser Ala Arg Cys Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Trp Val Cys Asp Gly Asp Asn Asp Cys Glu Asp Asn Ser Asp Glu 340 345 350 Glu Asn Cys Glu Ser Leu Ala Cys Arg Pro Pro Ser His Pro Cys Ala 355 360 365 Asn Asn Thr Ser Val Cys Leu Pro Pro Asp Lys Leu Ile Glu Gly Arg 370 375 380 Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 385 390 395 400 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 405 410 415 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 420 425 430 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 435 440 445 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 450 455 460 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 465 470 475 480 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 485 490 495 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 500 505 510 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 515 520 525 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 530 535 540 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 545 550 555 560 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 565 570 575 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 580 585 590 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 595 600 605 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 610 615 <210> 24 <211> 656 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Ser Ser Cys Arg Ala Gln Asp Glu Phe Glu Cys Ala Asn Gly Glu Cys 1 5 10 15 Ile Asn Phe Ser Leu Thr Cys Asp Gly Val Pro His Cys Lys Asp Lys 20 25 30 Ser Asp Glu Lys Pro Ser Tyr Cys Asn Ser Arg Arg Cys Lys Lys Thr 35 40 45 Phe Arg Gln Cys Ser Asn Gly Arg Cys Val Ser Asn Met Leu Trp Cys 50 55 60 Asn Gly Ala Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Ile Pro Cys Asn 65 70 75 80 Lys Thr Ala Cys Gly Val Gly Glu Phe Arg Cys Arg Asp Gly Thr Cys 85 90 95 Ile Gly Asn Ser Ser Arg Cys Asn Gln Phe Val Asp Cys Glu Asp Ala 100 105 110 Ser Asp Glu Met Asn Cys Ser Ala Thr Asp Cys Ser Ser Tyr Phe Arg 115 120 125 Leu Gly Val Lys Gly Val Leu Phe Gln Pro Cys Glu Arg Thr Ser Leu 130 135 140 Cys Tyr Ala Pro Ser Trp Val Cys Asp Gly Ala Asn Asp Cys Gly Asp 145 150 155 160 Tyr Ser Asp Glu Arg Asp Cys Pro Gly Val Lys Arg Pro Arg Cys Pro 165 170 175 Leu Asn Tyr Phe Ala Cys Pro Ser Gly Arg Cys Ile Pro Ser Trp Thr 180 185 190 Cys Asp Lys Glu Asp Asp Cys Glu His Gly Glu Asp Glu Thr His Cys 195 200 205 Asn Lys Phe Cys Ser Glu Ala Gln Phe Glu Cys Gln Asn His Arg Cys 210 215 220 Ile Ser Lys Gln Trp Leu Cys Asp Gly Ser Asp Asp Cys Gly Asp Gly 225 230 235 240 Ser Asp Glu Ala Ala His Cys Glu Gly Lys Thr Cys Gly Pro Ser Ser 245 250 255 Phe Ser Cys Pro Gly Thr His Val Cys Val Pro Glu Arg Trp Leu Cys 260 265 270 Asp Gly Asp Lys Asp Cys Ala Asp Gly Ala Asp Glu Ser Ile Ala Ala 275 280 285 Gly Cys Leu Tyr Asn Ser Thr Cys Asp Asp Arg Glu Phe Met Cys Gln 290 295 300 Asn Arg Gln Cys Ile Pro Lys His Phe Val Cys Asp His Asp Arg Asp 305 310 315 320 Cys Ala Asp Gly Ser Asp Glu Ser Pro Glu Cys Glu Tyr Pro Thr Cys 325 330 335 Gly Pro Ser Glu Phe Arg Cys Ala Asn Gly Arg Cys Leu Ser Ser Arg 340 345 350 Gln Trp Glu Cys Asp Gly Glu Asn Asp Cys His Asp Gln Ser Asp Glu 355 360 365 Ala Pro Lys Asn Pro His Cys Thr Ser Gln Glu His Lys Cys Asn Ala 370 375 380 Ser Ser Gln Phe Leu Cys Ser Ser Gly Arg Cys Val Ala Glu Ala Leu 385 390 395 400 Leu Cys Asn Gly Gln Asp Asp Cys Gly Asp Ser Ser Asp Glu Arg Gly 405 410 415 Cys His Ile Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 420 425 430 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 435 440 445 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 450 455 460 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 465 470 475 480 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 485 490 495 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 500 505 510 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 515 520 525 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 530 535 540 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 545 550 555 560 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 565 570 575 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 580 585 590 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 595 600 605 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 610 615 620 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 625 630 635 640 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 645 650 655 <210> 25 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Ser Asn Cys Thr Ala Ser Gln Phe Val Cys Lys Asn Asp Lys Cys Ile 1 5 10 15 Pro Phe Trp Trp Lys Cys Asp Thr Glu Asp Asp Cys Gly Asp His Ser 20 25 30 Asp Glu Pro Pro Asp Cys Pro Glu Phe Lys Cys Arg Pro Gly Gln Phe 35 40 45 Gln Cys Ser Thr Gly Ile Cys Thr Asn Pro Ala Phe Ile Cys Asp Gly 50 55 60 Asp Asn Asp Cys Gln Asp Asn Ser Asp Glu Ala Asn Cys Asp Ile His 65 70 75 80 Val Cys Leu Pro Ser Gln Phe Lys Cys Thr Asn Thr Asn Arg Cys Ile 85 90 95 Pro Gly Ile Phe Arg Cys Asn Gly Gln Asp Asn Cys Gly Asp Gly Glu 100 105 110 Asp Glu Arg Asp Cys Pro Glu Val Thr Cys Ala Pro Asn Gln Phe Gln 115 120 125 Cys Ser Ile Thr Lys Arg Cys Ile Pro Arg Val Trp Val Cys Asp Arg 130 135 140 Asp Asn Asp Cys Val Asp Gly Ser Asp Glu Pro Ala Asn Cys Thr Gln 145 150 155 160 Met Thr Cys Gly Val Asp Glu Phe Arg Cys Lys Asp Ser Gly Arg Cys 165 170 175 Ile Pro Ala Arg Trp Lys Cys Asp Gly Glu Asp Asp Cys Gly Asp Gly 180 185 190 Ser Asp Glu Pro Lys Glu Glu Cys Asp Glu Arg Thr Cys Glu Pro Tyr 195 200 205 Gln Phe Arg Cys Lys Asn Asn Arg Cys Val Pro Gly Arg Trp Gln Cys 210 215 220 Asp Tyr Asp Asn Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Glu Ser Cys Thr 225 230 235 240 Pro Arg Pro Cys Ser Glu Ser Glu Phe Ser Cys Ala Asn Gly Arg Cys 245 250 255 Ile Ala Gly Arg Trp Lys Cys Asp Gly Asp His Asp Cys Ala Asp Gly 260 265 270 Ser Asp Glu Lys Asp Cys Thr Pro Arg Cys Asp Met Asp Gln Phe Gln 275 280 285 Cys Lys Ser Gly His Cys Ile Pro Leu Arg Trp Arg Cys Asp Ala Asp 290 295 300 Ala Asp Cys Met Asp Gly Ser Asp Glu Glu Ala Cys Gly Thr Gly Val 305 310 315 320 Arg Thr Cys Pro Leu Asp Glu Phe Gln Cys Asn Asn Thr Leu Cys Lys 325 330 335 Pro Leu Ala Trp Lys Cys Asp Gly Glu Asp Asp Cys Gly Asp Asn Ser 340 345 350 Asp Glu Asn Pro Glu Glu Cys Ala Arg Phe Val Cys Pro Pro Asn Arg 355 360 365 Pro Phe Arg Cys Lys Asn Asp Arg Val Cys Leu Trp Ile Gly Arg Gln 370 375 380 Cys Asp Gly Thr Asp Asn Cys Gly Asp Gly Thr Asp Glu Glu Asp Cys 385 390 395 400 Glu Pro Pro Thr Ala His Thr Thr His Cys Lys Asp Lys Lys Glu Phe 405 410 415 Leu Cys Arg Asn Gln Arg Cys Leu Ser Ser Ser Leu Arg Cys Asn Met 420 425 430 Phe Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Glu Asp Cys Ser Ile Asp 435 440 445 Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 450 455 460 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 465 470 475 480 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 485 490 495 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 500 505 510 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 515 520 525 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 530 535 540 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 545 550 555 560 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 565 570 575 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 580 585 590 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 595 600 605 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 610 615 620 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 625 630 635 640 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 645 650 655 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 660 665 670 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 675 680 685

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 9로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 베타 헤어핀 펩타이드.
  2. 제1항으로부터 선택되는 하나 이상의 펩타이드 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제로 구성되는 것을 특징으로 하는, 뎅기열 바이러스(DENV) 감염으로 인한 질환의 억제 또는 약화용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 인간 혈청 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 조성물의 펩타이드는 초분자 응집체를 형성하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
KR1020167026665A 2014-03-03 2015-02-26 뎅기열 바이러스에 대한 항바이러스 속성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드 KR102325400B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2014-0026 2014-03-03
CUP2014000026A CU20140026A7 (es) 2014-03-03 2014-03-03 Péptidos horquilla beta con propiedades antivirales contra el virus dengue
PCT/CU2015/000002 WO2015131858A2 (es) 2014-03-03 2015-02-26 Péptidos horquilla beta con propiedades antivirales contra el virus dengue

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160127097A KR20160127097A (ko) 2016-11-02
KR102325400B1 true KR102325400B1 (ko) 2021-11-12

Family

ID=53008223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167026665A KR102325400B1 (ko) 2014-03-03 2015-02-26 뎅기열 바이러스에 대한 항바이러스 속성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9896482B2 (ko)
EP (1) EP3115056B1 (ko)
JP (1) JP6854644B2 (ko)
KR (1) KR102325400B1 (ko)
CN (1) CN106132981B (ko)
AR (1) AR099563A1 (ko)
AU (1) AU2015226580B2 (ko)
CA (1) CA2940078C (ko)
CU (1) CU20140026A7 (ko)
ES (1) ES2733648T3 (ko)
MX (1) MX363745B (ko)
MY (1) MY181033A (ko)
PH (1) PH12016501715B1 (ko)
WO (1) WO2015131858A2 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017189988A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Araim Pharmaceuticals, Inc. Tissue protective peptides for preventing and treating diseases and disorders associated with tissue damage

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110212105A1 (en) * 2006-04-28 2011-09-01 Vivian Huerta Galindo Method to block the infection by flaviviruses, molecules and uses

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU23586A1 (es) * 2005-11-22 2010-10-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus
CU23630A1 (es) * 2006-10-30 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Moléculas peptídicas quiméricas con propiedades antivirales contra los virus de la familia flaviviridae
CU20080028A6 (es) * 2008-02-29 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos químicos obtenidos in silico para la preparación de composiciones farmacéuticas para atenuar o inhibir la infección por virus dengue y otros flavivirus

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110212105A1 (en) * 2006-04-28 2011-09-01 Vivian Huerta Galindo Method to block the infection by flaviviruses, molecules and uses

Also Published As

Publication number Publication date
ES2733648T3 (es) 2019-12-02
MX363745B (es) 2019-04-01
CA2940078C (en) 2020-11-17
WO2015131858A2 (es) 2015-09-11
MY181033A (en) 2020-12-16
CN106132981A (zh) 2016-11-16
MX2016011420A (es) 2016-11-16
US20170152290A1 (en) 2017-06-01
JP6854644B2 (ja) 2021-04-07
CA2940078A1 (en) 2015-09-11
PH12016501715A1 (en) 2016-12-19
KR20160127097A (ko) 2016-11-02
JP2017509619A (ja) 2017-04-06
BR112016019672A2 (pt) 2017-10-24
AU2015226580A1 (en) 2016-09-15
EP3115056B1 (en) 2019-04-03
AR099563A1 (es) 2016-08-03
AU2015226580B2 (en) 2018-11-08
PH12016501715B1 (en) 2016-12-19
EP3115056A2 (en) 2017-01-11
WO2015131858A3 (es) 2015-10-29
US9896482B2 (en) 2018-02-20
CN106132981B (zh) 2019-11-12
CU20140026A7 (es) 2015-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2020508049A (ja) 操作されたトランスフェリン受容体結合ポリペプチド
KR20220123294A (ko) 폴리펩티드, 이의 제조방법 및 용도
US8741310B2 (en) Fusion-intermediate state of HIV-1 gp41 targeted by broadly neutralizing antibodies
JP2015521592A (ja) 安定化されたｇｐ１２０
JP2020508053A (ja) 操作されたポリペプチド
KR102325400B1 (ko) 뎅기열 바이러스에 대한 항바이러스 속성을 가진 베타 헤어핀 펩타이드
US9079950B2 (en) Modified Hepatitis C virus proteins
TWI450724B (zh) 新的融合蛋白質及其用於製備抗ｃ型肝炎疫苗的用途
US20210403514A1 (en) Compositions and methods for treatment of bone associated diseases
EP3612550A1 (en) Modified cytomegalovirus proteins and stabilized complexes
WO2013027217A1 (en) Zymoxins and methods of using the same
Kajiwara et al. Bioorganic synthesis of a recombinant HIV-1 fusion inhibitor, SC35EK, with an N-terminal pyroglutamate capping group
Castilho et al. Heterologous expression, characterization and structural studies of a hydrophobic peptide from the HIV-1 p24 protein
KR102259974B1 (ko) 재조합 항원을 이용하여 목적 항원 특이적인 항체를 제조하는 방법
EP4347622A1 (en) Reconstitution and uses of flavivirus epitopes
Mishra Structural basis of antibody-mediated immunity against Crimean-Congo hemorrhagic fever virus glycoproteins
BR112016019672B1 (pt) Peptídeos de grampo beta com propriedades antivirais contra o vírus da dengue, composição farmacêutica e seus usos
US10675346B2 (en) Antigenic polypeptides comprising pre-hairpin intermediate conformations of HIV-1 GP41
CN116761624A (zh) 稳定的冠状病毒蛋白及其疫苗组合物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right