BR112016019672B1 - Peptídeos de grampo beta com propriedades antivirais contra o vírus da dengue, composição farmacêutica e seus usos - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEOS DE GRAMPO BETA COM PROPRIEDADES ANTIVIRUS CONTRA O VÍRUS DE DENGUE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a peptídeos sintéticos estruturalmente contidos que foram otimizados para formar uma estrutura de grampo beta. Os peptídeos podem inibir ou reduzir a infecção causada pelo vírus da dengue (DENV). A invenção também refere-se a composições farmacêuticas contendo esses peptídeos sintéticos, as ditas composições farmacêuticas sendo adequadas para prevenir e/ou tratar as infecções causadas por DENV. Ademais, a invenção fornece um método para tratar as infecções causadas por esse vírus.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se à medicina e à indústria farmacêutica, e, em particular, à concepção e obtenção de peptídeos sintéticos que exibem atividade antiviral contra o vírus da Dengue (DENV). A estrutura primária destes peptídeos foi concebida para facilitar a formação eficiente de uma estrutura de grampo beta e para imitar fragmentos funcionais de domínio III da proteína de envelope (DIIIE) de DENV. A invenção também refere-se a composições farmacêuticas contendo estes peptídeos sintéticos, utilizados para a prevenção e/ou tratamento de infecções por DENV.

Estado da técnica

[002] DENV é um membro da família Flaviviridae, composto de vírus envelopado cujo genoma contém uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) de fita simples de polaridade positiva. Existem três gêneros diferentes na família Flaviviridae: Flavivirus, Hepacivirus e Pestivirus. Flavivirus abrange mais de 70 vírus conhecidos, dos quais muitos causam doenças clinicamente importantes, tais como o vírus da febre amarela (YFV) e o Vírus da Dengue (DENV). Os vírus do gênero Flavivirus que causam doenças humanas são geralmente transmitidos por artrópodes (carrapatos e mosquitos), e, portanto, erradicar estas doenças é uma tarefa extremamente difícil (Monath, T.P., F. X. Heinz. 1996. Flavivírus, pág. 961 a 1034. Em: B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley (ed.), Fields virology, 3a ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, Pa).

[003] As infecções por DENV atingiram proporções pandêmicas em áreas tropicais do mundo, e seu recente ressurgimento tornou-se um desafio cada vez mais difícil para os sistemas de saúde pública dos países afetados. Aproximadamente 100 milhões de infecções por DENV são estimadas para ocorrer anualmente, e 2,5 bilhões de pessoas vivem em áreas onde é DENV endêmico (Gubler, D. J. (1998) Clin. Microbiol. Rev. 11, 480 a 496; Monath, T. P. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91, 2395 a 2400). Durante o período de 1990 a 1998, uma média de 514.139 casos e 15.000 mortes devido à febre hemorrágica por DENV (FHD) foram relatados a cada ano à Organização Mundial de Saúde (OMS), embora a incidência real de FHD seja estimada como sendo várias vezes maior. Não há vacinas comercialmente disponíveis contra DENV, e nenhum tratamento antiviral específico contra este vírus.

[004] O termo DENV na verdade refere-se a um complexo composto por quatro vírus ou sorotipos antigênicos e geneticamente relacionados, denominados DENV1 a DENV4. O DENV é transmitido aos seres humanos através da picada de uma espécie de mosquitos, principalmente o Aedes aegypti. As manifestações clínicas da infecção resultante podem variar de uma doença assintomática ou um estado febril leve para o FHD mais grave e síndrome de choque por dengue (DSS) potencialmente fatal. As manifestações clínicas mais graves estão associadas a infecções secundárias onde o vírus pertence a um sorotipo diferente daquele da infecção primária (Kourí G. P. e outros (1987) Trans Roy Soc Trop Med Hyg; 72: 821 a 823; Halstead, S. B. (2003). Adv Virus Res. 60: 421 a 467). Esta observação foi explicada através da teoria de potenciação (enhancement) dependente de anticorpos, que determina que a infectividade viral pode ser efetivamente melhorada através da formação de complexos de vírus- anticorpos não neutralizantes, que permitiriam ao vírus infeccioso uma porta adicional de entrada para as células alvo via receptores Fc (Halstead SB. (1988) Science, 239: 476 a 481).

[005] A primeira etapa do ciclo de replicação viral é a ligação de vírions à superfície de sua célula hospedeira. Foi demonstrado que os vírions de DENV se ligam a glicosaminoglicanos da superfície celular, e estes foram propostos como moléculas mediando uma interação inicial de vírus infeccioso com a célula alvo. Outra molécula que o DENV também foi demonstrado se ligando é DC-SIGN (ligante de molécula de adesão intercelular não integrina específica de célula dendrítica), uma lectina tipo C específica de célula dendrítica. No entanto, pensa-se que ambas as moléculas desempenham um papel passivo, acumulando vírus na superfície da célula ou propiciando sua disseminação in vivo para sítios secundários de infecção. Uma entrada de vírus produtiva requer endocitose mediada por receptor via interações subsequentes com receptores ou co-receptores de alta afinidade adicionais, resultando na internalização dos vírions infecciosos. Uma vez que o último atinge o compartimento endocítico, a consequente queda no pH desencadeia o processo de fusão do envelope viral e membrana endossomal, que é mediada por mudanças estruturais na proteína de fusão viral. O resultado final desta fusão é a liberação de capsídeos virais para o citoplasma, seguida pela liberação de seu RNA genômico. O RNA viral citoplasmático nu então interage através da sua região 5’ não traduzida (5’ UTR) com ribossomos, e o único quadro de leitura aberta (ORF) que ele contém é traduzido em uma poliproteína viral precursora. No gênero Flavivirus, esta poliproteína precursora contém três proteínas estruturais (de membrana (prM), de capsídeo (C) e de envelope (E)) e cinco proteínas não estruturais (NS1-5), que são obtidas por modificação co- e pós- traducional pelas proteases virais e das células hospedeiras. A RNA polimerase dependente de RNA viral produz cópias de RNA antissenso de fita simples, que então funcionam como modelos para a síntese de RNA genômico de fita simples de polaridade positiva. Foi demonstrado que as proteínas virais envolvidas no processo de replicação de seu RNA estão fisicamente associadas a estruturas de membrana, provavelmente relacionadas com o retículo endoplasmático (RE).

[006] Depois da replicação, o RNA genômico do DENV se associa com a proteína do capsídeo e, através da membrana do RE rugoso ou em estruturas de membrana induzidas por vírus, os capsídeos resultantes brotam no lúmen do RE, já cobertos com o envelope de membrana lipídica contendo proteínas virais. Estes vírions imaturos então entram na via secretória, e são eventualmente liberados para o espaço extracelular como vírions maduros.

[007] Como mencionado acima, o genoma do DENV é uma molécula de RNA de fita simples de polaridade positiva de aproximadamente 11 kb de comprimento (Henchal, E. A. & Putnak, J. R. (1990). Clin. Microbiol. Rev. 3, 376 a 396) que contém um ORF cujo comprimento exato varia entre os diferentes sorotipos virais e até mesmo entre cepas do mesmo sorotipo (Yabar V. C., (2003). Rev. Perú. Med. Exp. Salud Publica 20, 51 a 57). O quarto proximal 5’ desse ORF codifica para proteínas estruturais, e os restantes codificam para polipeptídeos não estruturais (Lindenbach, B. D. & Rice, C. M. (1999). J. Virol. 73, 4611 a 4621).

[008] A proteína E do DENV e todos os outros flavivírus desempenham um papel fundamental na ligação de vírions maduros a receptores celulares, a fusão da membrana durante a entrada viral e montagem do vírion. Portanto, ela influencia em uma série de características fundamentais do vírus, tais como a gama de hospedeiros, virulência e a indução de imunidade protetora (Modis, Y., e outros (2005). J. Virol. 79, 1223 a 1231).

[009] A proteína E tem um peso molecular na faixa de 53 a 54 kDa. Ela é a mais conservada de todos os polipeptídeos estruturais do DENV, exibindo uma similaridade entre sorotipos de 60 a 70%. Ela foi mostrada através de cristalografia de raios-X (Modis, Y., (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 6986 a 6991), bem como estudos de crio- microscopia eletrônica (Kuhn, R. J., e outros (2002). Cell 108, 717 a 725) que, em DENV, como em outros flavivírus, a proteína E forma dímeros na superfície de vírions maduros.

[0010] Expor vírions DENV a um pH ligeiramente ácido (isto é,menor do que 6,5) induz uma mudança conformacional irreversível na proteína E que dissocia estes dímeros e leva à reassociação dos monômeros resultantes em trímeros. Esta mudança conformacional é necessária para a fusão de membranas virais e endossomais que acontece após a internalização de vírions DENV por endocitose mediada por receptor em células de mamífero (Modis, Y., e outros (2004). Nature 427, 313 a 319).

[0011] Dos aproximadamente 500 resíduos de aminoácidos de cada monômero da proteína E, 80% fazem parte de seu ectodomínio N-terminal e o restante forma um domínio transmembrana que ancora a proteína E ao envelope lipídico (Chambers, T. J., e outros (1990). Annu. Rev. Microbiol. 44, 649 a 688). Este domínio transmembrana é ligado ao ectodomínio através de uma haste de aproximadamente 53 resíduos (Modis, Y., e outros, (2004). Nature 427, 313 a 319). O ectodomínio E, por sua vez, enovela-se em três domínios estruturais separados: um domínio de folha beta central (domínio I), um domínio de dimerização alongado (domínio II) e um terceiro domínio com um enovelamento semelhante à imunoglobulina, domínio III (DIIIE) (Modis, Y., e outros (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 6986 a 6991).

[0012] DIIIE é o único domínio de proteína E formado por um segmento ininterrupto contínuo de sua cadeia de polipeptídeo. DIIIE é encontrado na extremidade C-terminal do ectodomínio de proteína E, entre os resíduos 294 e 392. A sua estrutura é muito semelhante à dos domínios globulares de regiões constantes de imunoglobulina (Modis, Y., e outros (2005). J. Virol. 79, 1223 a 1231). A estrutura terciária de DIIIE inclui uma ligação dissulfeto entre dois resíduos Cys nas posições 302 e 333 que são estritamente conservados dentre todos os flavivírus.

[0013] DIIIE se conecta ao domínio I através de um ligante de 10 resíduos flexíveis estendido (Modis, Y., e outros (2004). Nature 427, 313 a 319) que permite ao DIIIE adotar diferentes orientações em relação aos domínios restantes (Rey, F. A., e outros (1995). Nature 375, 291 a 298). Durante a transição dímero-para-trímero, DIIIE é o domínio exibindo as mudanças estruturais mais drásticas, à medida que rotaciona aproximadamente 70° e o seu centro de massa se move 36 Â em direção ao domínio II. Em DENV e outros flavivírus, uma grande parte dos resíduos que determinam a virulência, tropismo celular e gama de hospedeiros virais está localizada em DIIIE (Rey, F. A., e outros (1995). Nature 375, 291 a 298). Da mesma forma, muitas mutações de escape neutralizantes mapeiam para este domínio (Modis, Y., e outros (2005). J. Virol. 79, 1223 a 1231).

[0014] Há muita evidência, obtida tanto a partir da análise da estrutura de proteínas E quanto de vírions DENV e a partir de trabalho experimental, apoiando a noção de que DIIIE faz parte da região de proteína E que interage com o receptor celular putativo de DENV. Algumas das características estruturais deste domínio consistentes com tal papel são o fato de que DIIIE é o domínio mais protuberante na superfície do vírion, e, portanto, o mais acessível para a interação com sítios de receptores (Mukhopadhyay, S., e outros (2005) Nat. Rev. Microbiol. 3, 13 a 22). Também, o próprio fato de que ele adota um enovelamento semelhante à imunoglobulina sugere que possa engajar no receptor celular putativo de DENV, como domínios semelhantes já são há muito tempo conhecidos como sendo encontrados em uma grande variedade de proteínas de adesão celular. Ainda outra característica estrutural deste domínio consistente com um possível envolvimento na ligação ao receptor é a presença de fragmentos superficiais hidrofílicos positivamente carregados, formados por resíduos 284 a 310 e 386 a 411, que podem participar na ligação deste domínio a moléculas de sulfato de heparina carregadas negativamente (Modis, Y., e outros (2005). J. Virol. 79, 1223 a 1231).

[0015] Estudos com DIIIE, obtidos através de tecnologia de ácido desoxirribonucleico (DNA) recombinante, mostraram que eles se ligam diretamente à superfície de células das linhagens C6/36 e BHK21, onde eles foram capazes de bloquear a infecção viral (Hung, J. J., e outros (2004). J. Virol. 78, 378 a 388).

[0016] Estudos anteriores demonstraram que DIIIE exibe ligação específica às células hospedeiras com uma constante de dissociação aparente (KD) de 30 μM ou menos, dependendo da espécie de flavivírus a partir da qual DIIIE é obtido (Halstead, S. B., e outros (2005). Vaccine 23, 849 a 856). Por outro lado, sabe-se que os anticorpos monoclonais (mAb) que bloqueiam de forma mais eficiente a ligação de DENV a suas células alvo são aqueles cujo epítopo está localizado em DIIIE, fornecendo evidência indireta para o envolvimento deste domínio na interação da proteína E com receptores celulares de vírus (Thullier, P., e outros (2001). J. Gen. Virol. 82, 1885 a 1892.).

[0017] A entrada do DENV em suas células hospedeiras depende da sua interação anterior com moléculas receptoras específicas na superfície celular. No entanto, de acordo com as evidências reunidas durante o estudo de interações DENV-células hospedeiras, o receptor exato que é usado para a entrada viral pode variar, dependendo do tipo de célula e até mesmo do sorotipo viral. Os dados existentes sugerem que a entrada do DENV envolve uma interação com um complexo multimolecular, onde algumas moléculas desempenham o papel de receptores primários, ligando e concentrando os vírions na superfície celular para a interação posterior com o receptor endocítico putativo.

[0018] Bloquear a entrada do vírus nas células é uma estratégia atraente para o desenvolvimento de um tratamento antiviral, uma vez que teria como alvo o primeiro estágio do ciclo de vida viral e, se bem- sucedido, bloquearia todos os outros eventos à jusante da infecção viral. A análise por cristalografia de raios-X e espectroscopia de ressonância magnética nuclear forneceu informação estrutural em resolução atômica nas três proteínas estruturais do gênero Flavivirus (proteína C, proteína prM e proteína E). Estes estudos sugeriram abordagens alternativas para inibir o ciclo de replicação viral, como a inibição de transições estruturais da proteína de envelope. Da mesma forma, alguns estudos estruturais forneceram dados relativos a regiões específicas da proteína de envelope envolvida na interação com as moléculas receptoras e anticorpos neutralizantes, que constituem potenciais sítios de ligação como alvos para a concepção racional de fármacos antivirais contra DENV.

[0019] Foi anteriormente proposto que uma proteína de membrane humana denominada proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1) é o receptor endocítico verdadeiro usado durante a entrada de DENV (Huerta V. e outros, WO 2007/124698). LRP1, por conseguinte, constituiria um alvo atraente para a concepção de fármacos antivirais, à medida que esta molécula media eficazmente a endocitose de mais de 30 ligantes naturais, e foi mostrado previamente atuando como um receptor para uma espécie viral não relacionada, o grupo menor de rinovírus humano. Foi demonstrado que LRP1 liga-se à DIIIE tanto diretamente quanto através de moléculas que fazem uma ponte e que interagem simultaneamente com LRP1 e o vírus. Um exemplo deste último caso é alfa-2- macroglobulina humana (α2M), que se liga à DIIIE e é também um ligante de LRP1.

[0020] Foi previamente demonstrado que os peptídeos de grampo beta com base na estrutura de DIIIE podem ser utilizados para inibir a infecção por DENV tanto in vitro quanto in vivo (Huerta V. e outros, WO 2007/124698). Estes peptídeos, cuja sequência exata depende do sorotipo viral a partir do qual eles são derivados, abrangem parte do grampo beta FG de DIIIE, e são grampeados através de uma ponte dissulfeto entre resíduos de cisteína anexados no N- e C-terminais do fragmento de grampo selecionado. Desta série de peptídeos, o membro que apresenta a maior atividade antiviral foi o peptídeo HDIII3CL que, embora derivado de DIIIE de DENV3, exibe atividade inibidora contra todos os quatro sorotipos de DENV.

[0021] Estes peptídeos de grampo beta grampeados, no entanto,têm desvantagens importantes, tais como uma potência relativamente baixa. Por exemplo, a concentração inibidora de 50% (IC50) de HDIII3CL, determinada através de ensaios de inibição de infecção em células Vero, é 15 μM para DENV1, 20 μM para DENV2 e DENV3, e 40 μM para DENV4. Esta potência relativamente baixa impede a utilização direta destas moléculas para o desenvolvimento clínico, à medida que bons fármacos precisam ter potências ao menos na faixa submicromolar, e de preferência na faixa nanomolar, ou melhor.

[0022] Outra desvantagem desta série de peptídeos é que a parte intercadeia da alça contém um epítopo de células B imunodominante neutralizante (K Matsui, e outros (2009) Virology 384 (1): 16 a 20). O documento de Huerta V. e outros, documento WO 2007/124698, por exemplo, demonstra que o mAb neutralizante 3H5 se liga aos peptídeos contendo esta alça intercadeia. Uma vez que parte da resposta do anticorpo anti-DIIIE é uma reação cruzada entre sorotipos diferentes, existe a possibilidade de que uma resposta de anticorpos anti-DIIIE de reação cruzada pré-existente, induzida por uma infecção anterior, possa ligar-se a este peptídeo e diminuir a sua concentração eficaz, o que exige doses terapêuticas ainda mais elevadas do peptídeo do que as já exigidas por sua baixa potência.

[0023] Os fatos apresentados acima demonstram que nenhum fármaco antiviral de alta potência contra DENV, com IC50 preferencialmente na faixa nanomolar, está ainda disponível. A presente invenção aborda exatamente esta necessidade não atendida. Descrição da Invenção

[0024] A presente invenção resolve o problema mencionado acima fornecendo novos peptídeos de grampo beta de inibição de DENV obtidos através da otimização da potência de peptídeos anteriormente identificados. Os peptídeos de grampo beta da presente invenção são caracterizados por terem uma das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 9, ou uma sequência análoga a estas sequências.

[0025] Um objetivo central da presente invenção é a concepção de peptídeos inibidores de infecção por DENV com uma potência relativamente alta, ao menos na faixa submicromolar, e preferencialmente na faixa nanomolar ou superior. Altas potências são necessárias para diminuir ao máximo a dose terapêutica. Os peptídeos sintéticos terapêuticos atualmente em uso clínico contra outras patologias são tipicamente compostos muito potentes, cuja eficácia (IC50, 50% de concentração eficaz (EC50), etc.) fica na faixa nanomolar/subnanomolar e cuja especificidade é muito alta, exibindo então toxicidade muito baixa. Um peptídeo de baixa potência exigiria altas doses terapêuticas, que traz várias desvantagens importantes. Uma delas é o fato de que altas doses aumentam a possibilidade de que o fármaco exibirá efeitos colaterais devido a interações não específicas. Outra, que a probabilidade de ter problemas de agregação, ou durante a fabricação e a formulação ou durante a sua entrega in vivo (por exemplo, devido a interações não específicas com proteínas do soro) aumenta significativamente. Ainda outra é o fato de que altas doses aumentam a probabilidade de ter problemas de imunogenicidade/antigenicidade, onde a indução de uma resposta de anticorpos anti-peptídeo neutraliza sua atividade terapêutica, especialmente se o tratamento é repetido ou prolongado no tempo, exigindo, assim, doses ainda mais altas para compensar esta perda.

[0026] Em contraste, o uso de peptídeos de alta potência com baixas doses eficazes apresenta um certo número de vantagens econômicas, decorrentes tanto dos custos de fabricação mais baixos quanto preços mais baixos a serem pagos pelos pacientes. A tecnologia de síntese de peptídeos é geralmente muito mais dispendiosa do que a síntese de fármacos à base de compostos de baixo peso molecular, e considerações de custo pode, em última análise, limitar o número de pacientes ou pessoas com acesso a fármacos antivirais à base de peptídeos contra a dengue, especialmente se as doses terapêuticas são grandes.

[0027] Um dos fatores fundamentais que determinam a potência de um peptídeo terapêutico é a afinidade de sua interação com o seu alvo. No entanto, a tarefa de conceber peptídeos ativos que imitam os fragmentos superficiais funcionais envolvidos em interações proteína- proteína de alta afinidade está longe do trivial. O problema fundamental aqui é que fragmentos superficiais funcionais em proteínas globulares são geralmente topográficos (isto é, envolvendo mais do que um segmento contínuo da cadeia polipeptídica) e conformacionais (isto é, que exigem um arranjo espacial bem definido dos resíduos participantes para a interação acontecer). Em contraste, os peptídeos derivados de segmentos proteicos curtos, tipicamente 10-20 resíduos de comprimento, são flexíveis em solução e normalmente não adotam uma única conformação bem definida. Os peptídeos de grampo beta, por exemplo, apesar de serem derivados de um motivo estrutural bem definido em uma proteína enovelada, não são estruturalmente estáveis em solução, existindo como um conjunto de diferentes conformações em equilíbrio.

[0028] O estado conformacional de um peptídeo em solução destinado a imitar uma conformação particular é geralmente analisado como um equilíbrio entre dois estados: estado enovelado (cuja estrutura tridimensional corresponde à estrutura da proteína nativa que é suposta para imitar) e o estado de desenovelado ou desnaturado (o conjunto de todas as conformações não nativas adotadas pelo peptídeo em solução). No caso de um peptídeo de grampo beta imitar a interação entre um grampo beta em uma proteína nativa e uma proteína alvo separada, quanto mais estável o grampo é, mais a sua estrutura será semelhante a do segmento correspondente na proteína nativa, e maior a afinidade da interação resultante devido a perdas menores em entropia conformacional mediante a formação do complexo peptídeo-receptor.

[0029] Em outras palavras: assumindo-se que um peptídeo em solução adota uma estrutura desordenada, e assumindo-se que o processo de ligação ao seu alvo prossegue através de um mecanismo de seleção conformacional, então a variação em energia livre do processo de ligação pode ser expressa como a soma da variação em energia livre associada ao enovelamento do peptídeo na conformação apropriada e a variação em energia livre associada à ligação do peptídeo já enovelado ao seu sítio de ancoragem no receptor. Nesse caso, a quantidade de energia livre liberada pelo processo de ligação, ou, em outras palavras, a estabilidade da interação, pode ser aumentada através da modificação da sequência do peptídeo, substituição de alguns resíduos da sequência original por outros resíduos que ou a) aumentam a estabilidade conformacional do peptídeo em solução (especialmente conveniente quando os resíduos selecionados não interagem diretamente com a superfície de contato no sítio do receptor) ou b) otimizam as interações intermoleculares entre o peptídeo e seu receptor, aumentando a queda em energia livre que acontece durante a etapa de ancoragem.

[0030] Uma análise da sequência do peptídeo HDIII3CL (SEQ ID NO: 10, Tabela 1) revela várias características que podem ser aproveitadas para melhorar a estabilidade do seu enovelamento de grampo beta. Estes são: a) a presença de resíduos de asparagina - tal como Asn3 e Asn16 - em fitas beta F e G. A asparagina é um pobre formador de folhas beta, com uma propensão intrínseca muito baixa de formação de folhas beta e uma tendência a aparecer em alças e estruturas centrais caracterizadas por ângulos de torção positivos (Swindells MB, e outros (1995) Nat Struct Biol.; 2 (7): 596 a 603); b) a presença de uma alça bastante grande - seis resíduos de alça a alça, muito maior (por quatro resíduos) do que o tamanho ideal de dois (Branden C. & Tooze J. Introduction to protein structure. Nova Iorque: Carland Publishing, 1991). O problema aqui é que a inserção de novos resíduos em alças da proteína tem um custo entrópico associado com fechamento da alça, que cresce com o tamanho da alça; e c) a presença de dois resíduos de glicina - Gly7 e Gly9 - na alça intercadeias. A glicina é o resíduo que sofre a maior perda de entropia conformacional durante o processo de enovelamento, uma vez que não está sujeita às restrições de ângulo de torção de estrutura associadas com os outros aminoácidos naturais.

[0031] A base das alterações de sequência apresentadas na presente invenção, que aumentam a estabilidade conformacional dos peptídeos de grampo beta descritos, é substituir resíduos existentes em posições modificáveis por resíduos com uma propensão estrutural mais alta para a formação de estruturas do tipo grampo beta. A propensão estrutural de um aminoácido particular para ocupar uma posição específica em um grampo beta pode ser estimada a partir da frequência de aparecimento do dito aminoácido nessa posição entre as estruturas de grampo beta determinadas experimentalmente a partir dos bancos de dados de estrutura da proteína. Matematicamente, calcula-se como o logaritmo do quociente entre as frequências observadas e esperadas de aparecimento, derivando estas últimas da abundância relativa do resíduo relevante no banco de dados.

[0032] As posições definidas como modificáveis na presente invenção são os seguintes:

[0033] a) As posições na primeira fita beta do peptídeo de grampo beta que correspondem aos resíduos da face interna da fita F na estrutura de DIIIE, isto é, os resíduos não expostos ao solvente na estrutura nativa. Estes resíduos ocupam posições (posições HB) onde as ligações hidrogênio entre os átomos doadores e aceptores nas estruturas da primeira e da segunda fita beta (correspondente à fita G na estrutura de DIIIE) do peptídeo são estabelecidas;

[0034] b) As posições correspondentes à alça intercadeias;

[0035] c) As posições HB na segunda fita beta do peptide (correspondente à fita G de DIIIE), exceto o do resíduo Trp391 de DIIIE (ordenadas DENV2), que permanecerá invariável. No resto destas posições "c", os resíduos com carácter hidrofóbico são permitidos e preferenciais.

[0036] d) As posições não-HB (NHB) da fita F mais próxima à alça;

[0037] e) Possíveis modificações para a primeira posição HB da segunda fita do peptídeo (correspondente à fita G em DIIIE) incluem, em adição aos resíduos com alta propensão estrutural, a sua substituição por um resíduo Lys que imitaria a função de uma lisina (Lys385, ordenadas DENV2) que é topograficamente conservado entre DIIIE de todos os quatro sorotipos e pode potencialmente ser engatado durante a ligação ao complexo LRP1/α2M* (α2M ativado).

[0038] Os resíduos modificáveis da presente invenção definidos no ponto a) não são acessíveis a solvente na estrutura de DIIIE, e, portanto, não fazem parte da interface de contato entre o domínio e o seu receptor ou quaisquer outros receptores relevantes durante o ciclo de vida viral. Eles podem, portanto, ser substituídos por resíduos aumentando a estabilidade de enovelamento do peptídeo.

[0039] Os resíduos da alça intercadeias definidos no ponto (b) são considerados modificáveis porque a sequência desta região varia entre sorotipos de DENV, indicando que a conservação estrita destes resíduos não é necessária para preservar a interação de DIIIE com o receptor de DENV putativo. Esta linha de raciocínio é apoiada pelo fato de que o peptídeo HDIII3CL inibe a infecção de todos os quatro sorotipos de DENV, e que, em geral, bloqueando o receptor α2M*/LPR1 tem um efeito antiviral independente do sorotipo. A variante da alça intercadeia preferencial pela presente invenção consiste dos dois resíduos centrais de uma volta beta onde as posições 1 e 4 da volta corresponderiam ao primeiro resíduo de conexão das fitas beta adjacentes, como tal, uma variante aumentaria a estabilidade conformacional do peptídeo. Em geral, os grampos beta naturais tendem a ter alças de conexão curtas (Branden C. & Tooze J. Nova Iorque: Carland Publishing, 1991), e uma redução no tamanho da alçada alça reduz concomitantemente a entropia conformacional do estado desnaturado, que aumenta com o tamanho da cadeia polipeptídica.

[0040] Um dos dois resíduos centrais da alçada alça de dois resíduos (tamanho preferencial para a alça intercadeias na presente invenção) pode ter um papel funcional imitando Lys385 de DIIIE a partir de DENV3. Em alguns dos peptídeos descritos na presente invenção, este papel funcional é executado por um resíduo de lisina na posição 2 da alça, no caso de voltas beta tipo IIP (este resíduo Lys ocuparia assim a posição central da volta), cuja topologia é idêntica à do grampo FG de DIIIE. Em outro dos peptídeos descritos na presente invenção, este papel funcional é preenchido por um resíduo D-Lys (um estereoisômero D de L-lisina) colocado na posição 1 da alça (posição 2 em voltas beta tipo IIP), embora neste caso, a topologia do peptídeo seja invertida em relação àquela do grampo beta FG em DIIIE.

[0041] Os resíduos modificáveis definidos no ponto (c) são orientados para a mesma face do grampo desses no ponto a), ao qual eles são então adjacentes, e com o qual eles formam ligações hidrogênio envolvendo átomos da estrutura. Os resíduos correspondentes na estrutura de DIIIE são parcialmente expostos a solvente, à medida que a fita G forma a borda da folha beta. A posição do peptídeo de grampo beta correspondente à de Trp391 (ordenadas DENV2) em DIIIE é definida como não modificável na presente invenção, à medida que este resíduo é estritamente conservado através de todos os sorotipos DENV e é, muito provavelmente, funcional. De fato, o Exemplo 2 (Tabela 2) demonstra que este resíduo é essencial para a atividade antiviral do peptídeo HDIII3CL (e a do peptídeo HDIII3CL2 também, ver Tabela 1), e é perdido mediante a sua substituição por um resíduo de alanina. Uma substituição de lisina também é permitida na primeira posição da segunda fita (resíduo modificável referido no ponto e)), à medida que tal substituição constituiria uma imitação estrutural/funcional do resíduo Lys385 de DIIIE de DENV3. Lys385 é um resíduo catiônico envolvido na interação de DIIIE com α2M*, uma das proteínas constituintes do complexo receptor endocítico α2M*/LRP1 putativo.

[0042] Embora as posições modificáveis referidas no ponto d) correspondam aos resíduos na superfície exposta ao solvente de DIIIE, estas ainda são definidas como modificáveis porque elas não são estritamente conservadas através dos sorotipos DENV (Figura 1E).

[0043] Uma vez que o conjunto de posições modificáveis no peptídeo HDIII3CL foi definido, a sua sequência foi otimizada selecionando, para cada posição modificável, o resíduo com o maior índice de propensão estrutural. Este parâmetro, conforme mencionado acima, é derivado da frequência observada de aparecimento de cada resíduo em fragmentos de 8 resíduos adotando uma estrutura de grampo beta com uma fita de 2 resíduos centrais (isto é, os resíduos 4 e 5 do fragmento corresponderiam aos resíduos de centrais de uma volta beta), extraídos de bancos de dados de estruturas de proteínas determinadas experimentalmente. O banco de dados utilizado neste caso foi um conjunto não redundante de estruturas de proteínas tridimensionais com uma resolução superior a 2,5 Â (banco de dados WHAT IF; Vriend, G. (1990), J. Mol. Graph 8, 52 a 56.). O índice de propensão estrutural foi definido como o logaritmo do quociente entre o número de ocorrências de um aminoácido particular em uma posição particular no grampo e o número esperado de ocorrências com base na abundância relativa do resíduo no banco de dados, e foi calculado separadamente para grampos beta contendo voltas beta tipo IP e tipo IIP. A seleção final exigiu modelos de construção das estruturas tridimensionais dos peptídeos de grampo beta propostos, levando em conta os rotâmeros da cadeia lateral mais comuns e os contatos intercadeias.

[0044] A presente invenção também descreve a introdução de aminoácidos não naturais nas posições do grampo beta que são estruturalmente compatíveis com a sua estrutura química e estereoquímica. Tal é o caso de D-estereoisômeros de aminoácidos naturais, introduzidos em posições que adotam ângulos de torção de estrutura positivos. D-Pro, por exemplo, é favorável como o segundo resíduo de voltas beta tipo IIP (equivalente ao primeiro resíduo de uma alça intercadeia de 2 resíduos na presente invenção). Outro exemplo é D-Lys, também introduzido na posição correspondente ao segundo resíduo de uma volta beta tipo IIP, mas em peptídeos com uma topologia reversa. Nestes casos, L-Lys não é estruturalmente favorecido para esta posição (o seu índice de propensão estrutural não é alto, o que reflete o fato de que Lys não é bom em adotar ângulos de torção localizados no quadrante inferior direito do gráfico de Ramachandran), o que é lamentável face ao fato de que um resíduo Lys nesta posição potencialmente imitaria Lys285 de DIIIE a partir de DENV3. A introdução de um resíduo D-Lys soluciona este dilema, à medida que pode facilmente adotar os ângulos de torção necessários para a posição 2 de voltas beta do tipo IIP.

[0045] A definição de resíduos modificáveis, como descrito nos parágrafos acima, corresponde a voltas de grampo beta cuja topologia é idêntica (topologia nativa) à de FG de grampo beta na estrutura de DIIIE. No entanto, a presente invenção também descreve peptídeos com a topologia inversa. Nestes peptídeos, a primeira e a segunda fita beta da sequência correspondem, funcional e estruturalmente, às fitas G e F de DIIIE, respectivamente, e os resíduos que ocupam as posições NHB correspondem às posições HB em peptídeos de topologia nativa (e vice-versa).

[0046] Os peptídeos concebidos aqui que mantêm a topologia nativa do grampo beta FG de DIIIE incluem uma ponte de dissulfeto em uma posição NHB, que aumenta a estabilidade conformacional de estruturas de grampo beta. As posições ocupadas por estes resíduos Cys são: a) o primeiro resíduo da fita F e b) o último resíduo da fita L (Figura 1E).

[0047] Vários dos peptídeos descritos na presente invenção exibem fitas beta mais longas do que aquelas do peptídeo HDIII3CL. Estas fitas mais longas aumentam a estabilidade conformacional do peptídeo, porque introduzem duas ligações hidrogênio adicionais (um resíduo HB por fita).

[0048] Além de estabilizar a sua conformação, a afinidade da interação dos peptídeos descritos com o seu alvo (e, portanto, a sua atividade antiviral) pode também ser aumentada através da otimização direta da dita interação. Isto pode ser feito modificando-se os resíduos de interface cuja contribuição para a energia da interação é insignificante ou, na verdade, negativa.

[0049] Em geral, concluiu-se que a energia da ligação proteína- proteína é dominada por interações de um pequeno conjunto de resíduos. Assim, a maioria dos resíduos de interface desempenha um papel relativamente limitado no processo de ligação. Embora nenhum dado estrutural esteja disponível sobre a interação entre os peptídeos descritos na presente invenção e o seu alvo, ou sobre a interação entre DIIIE e o seu receptor putativo, assume-se, como uma primeira aproximação, que cada resíduo exposto ao solvente do grampo FG de DIIIE está engajado e/ou desempenha um papel funcional na interface peptídeo-receptor.

[0050] Os Exemplos 2 (Tabela 2) e 6 da presente invenção demonstram que substituir Lys14 (correspondente a Lys388 em DENV3 DIIIE) ou Trp17 (correspondente a Trp391 em DIIIE) do peptídeo HDIII3CL2 por um resíduo de alanina suprime, em qualquer caso, a atividade antiviral deste peptídeo em células Vero e afeta a sua ligação ao receptor LRP1. Ambos os resíduos são, portanto, essenciais para a atividade biológica de HDIII3CL2 e estão muito provavelmente localizados na interface, tornando contribuições essenciais para a interação. Por isso, nenhum destes resíduos é substituído na presente invenção. Uma dupla substituição de resíduos Cys1 e Cys18 por alanina também suprime a atividade antiviral e a ligação a LRP1 de HDIIICL2, mas o efeito, neste caso, se pensa ser causado pela perda de estabilidade conformacional em solução do grampo beta ao invés da perda de interações intermoleculares favoráveis.

[0051] A presente invenção também descreve que estender a superfície potencialmente funcional de peptídeos de grampo beta constitui um meio adicional para aumentar a sua potência. Neste caso particular, quatro resíduos são adicionados à estrutura do grampo, dos quais dois correspondem à face exposta do grampo FG em DIIIE e não foram anteriormente incluídos na série HDIII3CL de peptídeos análogos. Especificamente, dois resíduos são adicionados a cada fita beta, onde as posições NHB são ocupadas pelos aminoácidos correspondendo aos resíduos 375 (fita F) e 392 (fita G) de DENV3 DIIIE. Embora em DIIIE a identidade da posição 375 não é estritamente conservada entre todos os quatro sorotipos, uma vez que ou Asp ou Glu é observado em diferentes isolados, esta é uma substituição conservativa. Portanto, ambos os aminoácidos são elegíveis para a posição equivalente dos peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção, embora Glu seja a solução preferencial devido à menor propensão de Asp ser parte de conformações estendidas, tais como folhas beta. No caso da posição do peptídeo equivalente ao resíduo 392 de DIIIE, os aminoácidos preferenciais são Phe ou Tyr, que são os resíduos mais frequentemente observados nesta posição entre os quatro sorotipos DENV. Os resíduos modificáveis destas porções estendidas do grampo então correspondem às posições HB, que seriam usadas para otimizar a estabilidade conformacional, incluindo preferencialmente aminoácidos hidrofóbicos com altas propensões de formação de folha beta.

[0052] Exceto os resíduos essenciais descritos no Exemplo 2 (os correspondentes a Lys388, Trp391 e Glu/Asp392 em DIIIE), todos os resíduos restantes da face externa (posições NHB) são considerados modificáveis na presente invenção, à medida que seus aminoácidos correspondentes em DIIIE exibem mais variabilidade através dos sorotipos de DENV.

[0053] Com relação ao tipo de resíduo selecionável para as posições modificáveis dos peptídeos de grampo beta da presente invenção, as soluções preferenciais são aqueles tipos de resíduos que aparecem nas posições correspondentes de sequências homólogas dos quatro sorotipos de DENV. Tal é o caso do resíduo correspondente à posição 377 em DIIIE, onde a solução preferencial é Tyr (aparecendo em DIIIE a partir de DENV1 e DENV4) ao invés de Asn (aparecendo em DIIIE a partir de DENV3). Embora tanto Tyr quanto Asn sejam polares e doadores/receptores de ligação hidrogênio, Tyr expõe uma superfície não polar maior e aparece mais frequentemente em interfaces de interação proteína-proteína, tem uma maior propensão para adotar estruturas estendidas e formando parte de fitas beta, e pode contribuir com uma interação mais favorável (cátion pi) com o resíduo correspondendo a Lys388 a partir de DIIIE, contribuindo assim para a estabilidade conformacional do grampo beta.

[0054] Posições não essenciais, mas potencialmente funcionais podem geralmente ser identificadas por meio de métodos combinatórios, tais como a utilização de bibliotecas de peptídeos em fagos em que as posições essenciais/estruturais foram fixadas e as posições restantes foram randomizadas. Neste caso, a biblioteca é rastreada quanto a sequências ótimas através da utilização de ensaios de ligação que selecionam aqueles fagos expressando peptídeos de alta ligação a um ligante específico, tal como LRP1 e/ou α2M*. As sequências ótimas podem também ser obtidas através do uso de metodologias de concepção racionais.

[0055] Para os propósitos da presente invenção, os peptídeos de grampo beta descritos podem ser sintetizados quimicamente ou, se a sua sequência contém apenas aminoácidos naturais, por meio de tecnologia de DNA recombinante, isoladamente ou como proteínas de fusão. A utilização de proteínas de fusão, se a tecnologia de DNA recombinante for aplicável, pode aumentar os níveis de expressão e a estabilidade do peptídeo recombinante contra proteases hospedeiras. O peptídeo pode ser ligado ao seu parceiro de fusão através de um sítio de reconhecimento de protease, que pode então ser utilizado para liberar o peptídeo por tratamento com a protease cognata.

[0056] O Exemplo 1 da presente invenção descreve a concepção dos nove peptídeos de grampo beta (SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 9). Basicamente, a sua estrutura consiste em quatro segmentos: dois segmentos de fita beta (estruturalmente análogos ao grampo FG de DIIIE), separados por uma volta beta e seguidos por uma extensão catiônica C-terminal contendo três resíduos de lisina. Estes peptídeos foram concebidos seguindo os critérios estruturais/funcionais discutidos acima para otimizar a sua potência antiviral e a sua ligação aos receptores celulares.

[0057] Para os propósitos da presente invenção, uma sequência de peptídeo é considerada como sendo análoga à dos peptídeos de grampo beta aqui descritos (peptídeos PHB1-9 da Tabela 1, SEQ ID NO: 1-9) se a identidade de sequência do dito peptídeo com ao menos uma das sequências dos peptídeos de grampo beta PHB1-9 é igual ou maior do que 70%, e de preferência 80%. As sequências dos ditos peptídeos análogos diferem uma da outra em uma ou várias posições, selecionados a partir de: 1) posições modificáveis a)-e) descritas acima, onde um resíduo particular ou resíduos em PHB1-9 é/são substituídos por resíduos que também exibem uma alta propensão estrutural para ocupar essa posição em grampos beta; 2) as posições potencialmente funcionais descritas acima, pelas quais a posição(ões) relevante(s) em PHB1-9 é/são ocupadas por um resíduo ou resíduos de grampo FG de DIIIE a partir de um sorotipo de DENV particular, onde o dito resíduos(s) ocupa uma posição análoga no grampo beta de peptídeos PHB1-9; 3) as posições correspondentes aos resíduos de marcador de lisina C-terminal; neste caso, o marcador pode compreender dois ou três resíduos de lisina, de preferência três; e 4) as posições correspondentes às cisteínas formando as ligações dissulfeto de peptídeos PHB1-4 e PHB7-9, onde um resíduo Cys pode ser substituído por Asp/Glu, contanto que o resíduo Cys oposto seja substituído por Lys, de tal modo que o peptídeo é grampeado através da formação de uma ligação amida entre as cadeias laterais dos ditos resíduos, que é Asp/Glu em um lado e Lys no outro.

[0058] A atividade dos peptídeos PHB1-9 foi avaliada em um ensaio de inibição de plaque em células Vero, cujos resultados são mostrados no Exemplo 2. Todos eles exibiram atividade antiviral neste modelo experimental, seis deles em níveis mais elevados do que o peptídeo HDIII3CL. O peptídeo PHB4, em particular, exibiu um efeito antiviral muito potente na faixa nanomolar contra todos os quatro sorotipos de DENV, com índices de seletividade muito bons (1290 a 6450, dependendo do sorotipo específico). Portanto, este peptídeo constitui uma excelente molécula líder para o desenvolvimento de fármacos antivirais contra DENV, com uma potência melhor do que os candidatos a fármacos antivirais anteriormente relatados.

[0059] A presente invenção, portanto, também descreve uma composição farmacêutica composta por um ou mais peptídeos de grampo beta com uma sequência de aminoácido selecionada a partir das apresentadas na SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 9, ou uma sequência análoga dessa, e ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0060] Em uma modalidade da presente invenção, os peptídeos compreendendo a dita composição farmacêutica estão formando agregados supramoleculares. Como o peptídeo PHB4 (e, de um modo geral, os peptídeos de grampo beta descritos na presença invenção) é uma molécula que é concebida para adotar a estrutura de uma fita beta anfifílica, ele pode formar agregados supramoleculares dependendo da concentração de peptídeo e da composição exata de solvente.

[0061] O Exemplo 5 mostra como o peptídeo se autoaglutina em nanoestruturas, cujo tamanho e forma dependem das condições experimentais, tais como a concentração de peptídeo, temperatura, solvente, idade da solução, presença de aditivos diferentes, etc. A atividade antiviral deste peptídeo pode mudar, dependendo destas condições.

[0062] No contexto da presente invenção, o termo ‘agregados supramoleculares’ destina-se a denominar agregados formados por várias moléculas de peptídeos, preferencialmente mais de 10.

[0063] O Exemplo 8 mostra como a adição de albumina de soro humano (HSA) em pontos de tempo específicos após o peptídeo PHB4 ser dissolvido em solução salina produz formulações com potências na faixa nanomolar/subnanomolar baixa. Este resultado indica que é possível formular o peptídeo na presença de HSA, e que a presença desta proteína leva à formação dos complexos peptídeo:HSA exibindo atividade antiviral muito alta. Esta é uma conclusão importante a partir de um ponto de vista farmacocinético se o peptídeo for desenvolvido em um composto antiviral, à medida que não somente é a meia-vida em soro de HSA muito longa, mas HSA pode proteger o peptídeo contra proteases séricas e interações indesejadas com outros constituintes do soro. Portanto, em uma modalidade da presente invenção, a composição farmacêutica constituída pelos peptídeos de grampo beta descritos também contém HSA.

[0064] Independentemente da presença de HSA, o fato de que o peptídeo PHB4 se autoaglutinar em nanopartículas é uma característica desejável a partir do ponto de vista farmacocinético e farmacodinâmico. Devido ao seu tamanho, as nanopartículas tendem a apresentar meias-vidas mais longas no soro do que os peptídeos monoméricos, que geralmente são compensados e metabolizados em um curto espaço de tempo. Além disso, os peptídeos monoméricos são muito susceptíveis ao ataque proteolítico pelas proteases hospedeiras, contra as quais a sua aglutinação em nanopartículas tende a fornecer alguma proteção. Além disso, as nanopartículas oferecem um contexto estrutural em que haveria múltiplos sítios de ligação de uma única entidade, que pode levar a efeitos de avidez devido à ligação multivalente e, assim, uma maior afinidade aparente para a interação peptídeo-receptor ou, em outras palavras, melhor potência antiviral.

[0065] Os Exemplos 3 e 6 demonstram que os peptídeos de grampo beta da presente invenção podem ligar-se às proteínas α2M* e LRP1, que são componentes do receptor endocítico putativo para DENV e, por conseguinte, constituiriam um alvo para o desenvolvimento de compostos antivirais, conforme relatado por Huerta H. e outros, WO 2007/124698.

[0066] Uma parte essencial da presente invenção é a análise da atividade biológica dos peptídeos de grampo beta descritos na faixa nanomolar. Como mostrado no Exemplo 3, os peptídeos PHB2, PHB4, PHB5, PHB8 e PHB9 inibem a ligação de uma variante biotinilada de DENV1 DIIIE recombinante (cepa Jamaica; DIIIE1Jbiot) à proteína α2M* na faixa nanomolar/submicromolar, e a dita capacidade inibidora é claramente maior do que a apresentada por DIIIE não biotinilado (DIIIE1J), uma vez que as suas percentagens de inibição são de 1,5 a 3 vezes maiores do que de DIIIE1J. Em contraste, a capacidade inibidora exibida por HDIII3CL nesta faixa de concentração é muito baixa, em comparação com DIIIE1J. O Exemplo 6 demonstra que os peptídeos de grampo beta da presente invenção ligam-se ao receptor LRP1 com alta avidez, e que o peptídeo PHB4 apresenta a maior avidez nesse aspecto. Este resultado é coerente com o fato de que PHB4 também foi o peptídeo mais potente em ensaios de atividade antiviral.

[0067] O Exemplo 8 demonstra que o efeito antiviral dos peptídeos de grampo beta correlaciona-se com a sua capacidade se se ligar ao receptor LRP1 e proteína α2M*, solidamente suportando a noção de que estes peptídeos exercem o seu efeito antiviral através da inibição da entrada de DENV para as suas células alvo. Este resultado também ressalta a racionalidade da estratégia descrita na presente invenção para otimizar a potência antiviral dos peptídeos de grampo beta.

[0068] A capacidade dos peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção para a proteína de ligação α2M* e o receptor LRP1 pode ser aproveitada para desenvolver agentes terapêuticos para o controle de doenças ou condições clínicas mediadas por estas proteínas. A sua potente inibição da infecção por DENV, tal como descrito na presente invenção, constitui um exemplo desta possibilidade.

[0069] Bloquear a ligação de DENV (em outras palavras, inibindo a ligação da proteína E) ao receptor endocítico α2M*/LRP1 putativo é uma melhor escolha para o desenvolvimento de fármacos antivirais contra esse vírus do que os outros receptores conhecidos no estado da técnica. Os receptores descritos por outros autores são receptores de adesão, isto é, eles mediam a ligação do vírus à membrana citoplasmática, mas não internalizam o vírus por endocitose. Como o estágio inibido pelos peptídeos descritos na presente invenção está situado à jusante do estágio de adesão inicial, os peptídeos seriam eficazes independentemente de qual receptor específico ou receptores o vírus usa para aderir à célula alvo.

[0070] Tendo em conta estas conclusões, a presente invenção também compreende a utilização dos peptídeos de grampo beta descritos para a fabricação de um fármaco. Em uma modalidade, o fármaco é utilizado para inibir ou atenuar uma infecção por DENV. Em outra modalidade, o fármaco fabricado com os peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção é empregado para o tratamento de condições clínicas mediadas por proteínas α2M* ou LRP1.

[0071] A presente invenção também fornece um método para inibir ou atenuar uma infecção por DENV em um paciente afetado, caracterizado pela administração ao dito paciente de um ou mais dos peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção, ou uma composição farmacêutica que compreende ao menos um destes peptídeos.

Breve Descrição das Figuras

[0072] A Figura 1 representa a concepção de peptídeos de grampo beta inibidores do vírus da dengue (DENV). A) Parâmetros de preferência para cada um dos 20 aminoácidos naturais, calculados para cada posição de um grampo de 8 resíduos com uma volta beta central tipo IP. Quanto maior o valor do parâmetro de preferência, mais escuro o tom de cinza. Se não há casos de um aminoácido específico aparecendo em uma posição particular em qualquer um dos grampos beta do banco de dados WHATIF, ao dito aminoácido é atribuído um valor observado de 0,5 nessa posição, e o parâmetro de preferência correspondente é então calculado. B) Parâmetros de preferência para cada um dos 20 aminoácidos naturais, calculados para cada posição de um grampo de 8 resíduos com uma volta beta central tipo IIP. O esquema de cor e o cálculo dos parâmetros de preferência são idênticos aos de (A). C-D) Representação em estilo Logo de sequências consenso derivadas de alinhar grampos beta com voltas beta centrais tipo IP (C) ou IIP (D). O tamanho da letra é proporcional à razão entre a frequência observada desse aminoácido nessa posição e a frequência esperada com base na composição de aminoácido do banco de dados. E) Alinhamento de sequência do fragmento DIIIE correspondente ao grampo FG em cada um dos quatro sorotipos de DENV e peptídeo PHB4. MP: posições modificáveis (a-e) definidas na presente invenção, * posição correspondente à do resíduo Lys385, que é funcionalmente relevante; SS: estrutura secundária ‘projetada’ para o peptídeo PHB4; RN: número de resíduo na sequência PHB4; SSDEN: estrutura secundária em DIIIE; RNDEN: número de resíduo na sequência da proteína E a partir de DENV2; fitas: fitas beta correspondentes às fitas F e G em DIIIE.

[0073] A Figura 2 representa os modelos estruturais tridimensionais para os peptídeos de grampo beta inibindo DENV. A) peptídeo de grampo beta HDIII3CL. O segmento mostrado corresponde ao grampo sem a extensão C-terminal catiônica, destacando alguns resíduos relevantes. As ordenadas de seus resíduos equivalentes em DIIIE são dadas entre parênteses. B) Peptídeo PHB4. O colchete delimita a porção da fita beta que foi estendida em relação a HDIII3CL. C) Sobreposição estrutural de ambos os peptídeos.

[0074] A Figura 3 representa a inibição da ligação de DIIIE biotinilado a partir de DENV1 (DIIIE1Jbiot) à proteína α2M*. O eixo das ordenadas mostra a porcentagem de inibição para os peptídeos de grampo beta descritos pela presente invenção na faixa de concentrações de peptídeo de 0,05-3 μM. As atividades inibidoras do peptídeo HDIII3CL e DIIIE1J recombinante também são mostradas.

[0075] A Figura 4 representa as curvas de dose-resposta para a inibição da ligação de DENV1 DIIIE biotinilado (DIIIE1Jbiot) para α2M*. O gráfico mostra as porcentagens de inibição correspondentes ao peptídeo de volta beta PHB5, peptídeo HDIII3CL e DIIIE1J recombinante.

[0076] A Figura 5 representa a inibição da ligação de DENV1 DIIIE biotinilado (DIIIE1Jbiot) para a proteína α2M* pelos peptídeos de grampo beta indicados, e a relação com a atividade antiviral. O eixo das ordenadas mostra a porcentagem de inibição de ligação em relação à inibição da ligação determinada para DIIIE1J. Os dados se mostraram corresponder à faixa de concentração de peptídeo submicromolar (50-200 nM).

[0077] A Figura 6 representa o diagrama do plasmídeo pET-DIII DENV1.

[0078] A Figura 7 representa o mapeamento de resíduos DIIIE essenciais para a sua interação com a proteína α2M. O eixo das ordenadas mostra a relação entre os valores de IC50 para cada mutação de substituição de alanina (correspondente a cada resíduo na abcissa) e o valor de IC50 para DIIIE recombinante (DIIIE1PRS). As elipsoides sombreadas em tons escuros marcam os resíduos do sítio de interação primária. As elipsoides sombreadas em tons claros definem o sítio de interação secundário.

[0079] A Figura 8 representa a localização dentro da estrutura tridimensional de DIIIE dos sítios envolvidos durante a sua interação com a proteína α2M*. Duas vistas da estrutura de DENV1 DIII são mostradas, incluindo uma representação detalhada e uma representação da estrutura secundária, onde as setas e cilindros representam folhas beta e alças, respectivamente. Os resíduos relevantes são marcados. Eles se aglomeram em dois sítios, representados por elipsoides sombreadas: um sítio primário (A) e um sítio secundário (B). A estrutura tridimensional foi renderizada usando PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Versão 1.2r3pre, Schrodinger, LLC.)

[0080] A Figura 9 representa a cinética de agregação para peptídeo PHB4 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A-B): Cinética de agregação para peptídeo PHB4 em 10 μM, em PBS. O eixo das ordenadas corresponde à intensidade de luz dispersa, em relação à intensidade da luz dispersa no tempo 0 (no momento em que o peptídeo é dissolvido em PBS). A: Perfil de agregação para o tempo 0 a 300 min. B: Primeiros 30 min do processo de agregação. C-D): Cinética de agregação de peptídeo PHB4 em 5 μM, em PBS. C: Agregação precoce, tempo de 0-40 min. D: Agregação tardia, tempo de 30-230 min.

[0081] A Figura 10 representa o estudo da morfologia de agregados de peptídeo PHB4 por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) em uma concentração de peptídeo de 2 mg/mL, em água e PBS. As condições experimentais foram: peptídeo estudado imediatamente após a dissolução em água (A) ou PBS (B); peptídeo estudado após a dissolução e aquecimento durante 1 hora a 50° C ou em água (C) ou em PBS (D); e o peptídeo estudado após a dissolução em água (E) ou em PBS (F), seguido de aquecimento durante 1 hora a 50° C e depois incubação em temperatura ambiente durante 2 horas. As barras em A, B, E e F têm um comprimento de 100 nm, e as barras em C-D têm um comprimento de 200 nm.

[0082] A Figura 11 representa as proteínas utilizadas nos ensaios para a interação direta de DIIIE com o receptor LRP1. A) Representação esquemática da arquitetura de domínio de LRP1. CM:Membrana citoplasmática. As regiões correspondentes aos grupos de ligação ao ligante são indicadas. B) Representação esquemática da proteína quimérica sLRP1-CIV. Fc: Região constante de imunoglobulina. C) Representação esquemática de proteínas recombinantes DIIIE1-4. D) Análise por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE) das preparações finais de DIIIE: 1. DIIIE1 (especificamente, DIIIE1J), 2. DIIIE2, 3. DIIIE3 e 4. DIIIE4. A posição correspondente ao marcador 14 kDa no padrão de peso molecular utilizado no experimento é indicada.

[0083] A Figura 12 representa a interação de DENV DIIIE com os aglomerados de ligação ao ligante de LRP1 em um ensaio ELISA. A proteína utilizada para revestir as cavidades das placas é indicada no topo de cada gráfico. A ligação de proteínas sLPR1-CII-IV foi detectada utilizando um anticorpo policlonal anti-Fc de IgG conjugada humana à peroxidase de rabanete.

[0084] A Figura 13 representa a caracterização da superfície de ligação de sLRP1-CIV para um ensaio Biacore. A) Sensorgramas obtidos a partir da aplicação de α2M * e da proteína associada ao receptor (RAP), ambas a 100 nM. Os sinais de ambos os canais são mostrados: Fc1, com sLRP1-CIV imobilizado e Fc2, com HSA recombinante imobilizado. B) Determinação da afinidade da interação de RAP com sLRP1 a partir de unidades de ressonância (RU) máximas contra dados de concentração. A linha contínua representa um ajuste a um modelo de dois sítios de interação, realizado utilizando GraphPad Prism v5.03. As medições foram realizadas em uma unidade Biacore X.

[0085] A Figura 14 representa o ensaio Biacore para a interação de peptídeos de grampo beta com sLRP1-CIV. A e B) Sensorgramas obtidos através da aplicação dos peptídeos em 20 μM; C) RU observada a 160 s, e (D) RU a 270 s.

[0086] A Figura 15 mostra a relação entre a ligação à proteína LRP1 (fragmento sLRP1-CIV) e a atividade antiviral in vitro de peptídeos de grampo beta. A regressão linear foi utilizada para ajustar os dados de potência in vitro [log (IC50, uM)] para a atividade antiviral contra DENV2 em células Vero e a magnitude dos sinais de Biacore em t = 400 s (RUrem) para peptídeos da série PHB com a mesma topologia do peptídeo HDIII3CL (topologia nativa). A banda de confiança de 95% é mostrada com linhas tracejadas. A inserção representa uma análise semelhante, mas excluindo o peptídeo PHB4.

[0087] A Figura 16 mostra a relação entre a ligação à proteína α2M* e a atividade antiviral in vitro de peptídeos de grampo beta. A regressão linear foi utilizada para ajustar os dados para a inibição da ligação de DIIIE à proteína α2M* e os valores de IC50 para a inibição da infecção de células Vero por DENV2. A porcentagem de inibição da ligação a α2M* é expressa em relação à porcentagem de inibição determinada para DIIIE1J recombinante em concentrações equimolares às utilizadas para os peptídeos. Os valores apresentados correspondem a médias e os desvios padrão, determinados em concentrações de peptídeos submicromolares e nanomolares (50, 100, 200 e 400 nm).

[0088] A Figura 17 mostra a influência da temperatura de incubação sobre a atividade antiviral de peptídeo PHB4. A atividade antiviral foi avaliada por titulação de 24 h pós-infecção (p.i.) dos sobrenadantes a partir de células Vero infectadas com DENV2 cepa 16803, utilizando um ensaio de formação de plaque em células Vero. Os IC50 foram estimados utilizando GraphPad Prism v5.03. A linha contínua representa um ajuste não linear para log10 (concentração) vs curva de resposta.

[0089] A Figura 18 mostra o esquema que descreve o modelo experimental utilizado para avaliar a influência do tempo de agregação sobre a atividade antiviral de peptídeo PHB4.

[0090] A Figura 19 mostra a influência do tempo de incubação e da temperatura sobre a atividade antiviral de peptídeo PHB4. A atividade antiviral foi avaliada por titulação de 24 h p.i. dos sobrenadantes a partir de células Vero infectadas com DENV2 cepa 16803, utilizando um ensaio de formação de plaque em células Vero. A titulação viral em controles não tratados (sem o tratamento com o peptídeo) foi de 4 log10. A. Incubação a 10°C; B. Incubação a 37°C.

[0091] A Figura 20 mostra o modelo experimental utilizado para avaliar a influência da concentração inicial de peptídeo PHB4 durante o processo de agregação na potência de sua atividade antiviral.

[0092] A Figura 21 mostra a influência da concentração inicial do peptídeo em água sobre a sua atividade antiviral. A atividade antiviral foi avaliada por titulação de 24 h p.i. dos sobrenadantes a partir de células Vero infectadas com DENV2 cepa 16803, utilizando um ensaio de formação de plaque em células Vero.

[0093] A Figura 22 mostra o modelo de fusão de PHB para um marcador de histidina C-terminal (parte superior) ou N-terminal (parte inferior).

[0094] A Figura 23 mostra o esquema representando agregados/nanopartículas de peptídeos marcados com histidina estabilizadas por reticulação com íons de metal e espaçadores EGTA (Me2).

[0095] A Figura 24 mostra a atividade antiviral dos peptídeos H5PHB4 e PHB4H5, independentes ou em complexo com Zn e EGTA (Zn2).

Exemplos Exemplo 1. Planejamento e síntese de peptídeos de grampo beta inibindo a infecção pelo vírus da Dengue Descrição das sequências dos peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção

[0096] Um total de nove peptídeos de grampo beta, denominados PHB1-9 na Tabela 1, cujas sequências são mostradas em SEQ ID NO: 1-9, foram concebidos iniciando a partir do peptídeo HDIII3CL (SEQ ID NO: 10), de acordo com critérios estruturais/funcionais que visam aumentar a potência da sua atividade antiviral e a força da sua ligação a receptores de células, quando comparado com HDIII3CL. A estrutura destes peptídeos, basicamente, consiste em quatro segmentos: dois segmentos de fita beta (estruturalmente análogos aos do grampo beta FG de DIIIE), separados por uma volta beta e seguidos por uma extensão C-terminal catiônica composta por três resíduos de lisina. Foram utilizadas duas topologias diferentes: a topologia nativa, usada em peptídeos PHB1-4 e PHB7-9, onde a estrutura do polipeptídeo corre na mesma direção do grampo beta FG de DIIIE, e a topologia reversa, utilizada em peptídeos PHB5 e pHB6. Em peptídeos de topologia nativa, o primeiro segmento de fita beta (Beta 1 na Tabela 1) corresponde estruturalmente à fita beta F, e o segundo segmento de fita beta (beta2) corresponde à fita beta G (Figura 1E). O comprimento da fita em peptídeos PHB1, PHB2 e PHB7 é idêntico ao do peptídeo HDIII3CL (filamentos de seis resíduos), mas foi estendido para sete resíduos nos peptídeos PHB5-6 e para oito nos peptídeos PHB3-4 e PHB8-9. As fitas mais longas aumentam a estabilidade conformacional dos peptídeos (Stanger, H. E., e outros (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 12015 a 12020).

[0097] Os resíduos Cys1, Asn/Tyr3 e Thr5 a partir de peptídeos PHB1, PHB2 e PHB7 correspondem às posições NHB expostas no grampo beta FG de DIIIE. Um resíduo Asn, equivalente ao resíduo Asn377 em DENV3 DIIIE, foi escolhido para a posição 3 (Asn3) de peptídeos PHB1 e PHB7, e um resíduo Tyr, equivalente a Tyr377 de DIIIE a partir de DENV1, DENV2 e DENV4, foi escolhido para a posição 3 (Tyr3) de peptídeo PHB2. Tyr3 é preferencial sobre Asn3, à medida que é mais conservado através dos sorotipos de DENV, tem uma maior propensão para a formação de folhas beta, e está disposto diagonalmente a Lys10, facilitando uma interação pi-cátion favorável entre as suas cadeias laterais correspondentes (Figura 2B). Um resíduo Thr foi escolhido para a posição 5 (Thr5) em vez de Val/Ile379 observado em sequências DENV DIIIE (Figura 1E). A lógica por trás dessa escolha não foi somente que Thr é uma substituição conservativa em relação a Val/Ile com uma boa propensão de formação de folhas beta, mas que é mais hidrofílica do que as outras duas alternativas (contribuindo assim positivamente para a solubilidade de peptídeo em água) e exibe valores mais altos do parâmetro de preferência estrutural (posição 2 do grampo beta de 8 resíduos na Figura 1E). Os resíduos Cys14, Asn12 e Lys10 nestes peptídeos ocupam posições adjacentes a Cys1, Tyr/Asn3 e Thr 5, respectivamente, na mesma face do grampo beta, mas não há ligações de hidrogênio de estrutura entre esses resíduos. Os resíduos Lys10 e Asn12 correspondem, estrutural e funcionalmente, aos resíduos Lys388 (conservados em DENV1-3) e Asn390 (conservados em DENV2-3). Um resíduo Trp foi escolhido para a posição 13, uma vez que o resíduo equivalente em DIIIE (Trp391) é estritamente conservado através de todos os sorotipos de DENV. As cisteínas Cys1 e Cys14 formam uma ligação dissulfeto que cumpre um papel estrutural essencial. Eles ocupam posições NHB, e uma ligação dissulfeto nessa posição contribui favoravelmente para a estabilidade de grampos beta (Santiveri C. M. e outros (2008). Chem. Eur. J., 14, 488 a 499). Posteriormente na invenção, demonstra-se experimentalmente que os resíduos Lys10, Trp13, Cys1 e Cys14 são essenciais para a atividade antiviral desses peptídeos. Os peptídeos similares a HDIII3CL, onde substituições ocorrem em uma posição (Lys14 -> Ala ou Trp17 -> Ala, Lys14 em HDIII3CL corresponde estruturalmente ao resíduo Lys10 de PHB1, PHB2 e PHB7; e Trp17 de HDIII3CL corresponde estruturalmente ao resíduo Trp13 de PHB1, PHB2 e PHB7) ou em duas posições (Cys1 -> Ser e Cys18 -> Ser, Cys18 de HDIII3CL corresponde estruturalmente ao resíduo Cys14 de PHB1, PHB2 e PHB7), não exibiu um efeito antiviral detectável na faixa de concentração de ensaio. Também posteriormente neste documento, demonstra-se experimentalmente que Tyr3 é uma melhor escolha do que Asn3, à medida que o peptídeo PHB9 exibe uma potência antiviral mais alta do que o peptídeo PHB8, cuja única diferença é a natureza da substituição na posição correspondente a Tyr375 de DIIIE a partir de DENV1-2 e DENV4.Tabela 1 - Modelo de peptídeos de grampo betap, D-stereoisômero de prolina; k, D-stereoisômero de lisina; topologia native: idêntica à topologia do grampo beta FG de DIIIE; topologia reversa, oposta à topologia do grampo beta FG de DIIIE.

[0098] Os resíduos Val2, Trp/Val4, Glu/Arg/Ile6, Lys/Trp9, Val/Tyr11 e Trp13 fazem parte da face oposta do grampo beta, ocupando posições HB. As posições 2, 4 e 6 são adjacentes às posições 13, 11 e 9, respectivamente, e formam ligações de hidrogênio de estrutura. A posição 13 é ocupada apenas por Trp, como explicado anteriormente, e as posições restantes são escolhidas de acordo com o valor do parâmetro de preferência para cada resíduo (Figura 1A e B). Os pares Glu6-Lys9 (PHB1) e Arg6-Trp9 (PHB2) foram selecionados para as posições 6 e 9, devido ao fato de que eles podem estabelecer interações de ponte sal e pi-cátion favoráveis, respectivamente. Lys9 (PHB1 e PHB7) pode funcionalmente imitar o papel de resíduo Lys385 de DIIIE, que é essencial para a interação com α2M*, como demonstrado posteriormente na invenção.

[0099] Os peptídeos PHB1 e PHB2 foram concebidos para que uma volta beta tipo IIP se forme entre os resíduos 6 e 9. A posição 7 nestes peptídeos é ocupada por um resíduo d-Pro (um D- estereoisêmero de prolina), que é um aminoácido favorável para a segunda posição de voltas beta ipo IIP (Pantoja-Uceda D, e outros (2006) Methods Mol Biol.; 340:. 27 a 51). Asp foi escolhido para a posição 8 no peptídeo PHB1 devido aos altos escores do parâmetro de preferência para esse aminoácido nessa posição. Em contraste, um resíduo Lys foi selecionado em vez de para a posição 8 no peptídeo PHB2, com a intenção de imitar Lys386 de DIIIE. Para o peptídeo PHB7, uma volta beta tipo IP foi introduzida entre as posições 6 e 9. A escolha de resíduo para as posições 7 e 8 (Asn7 e Gly8) foi impulsionada pelo valor do parâmetro de preferência (Figura 1A e B). Os dipeptídeos Asn-Gly são muito frequentes em voltas beta tipo IP.

[00100] A sequência do grampo beta de peptídeos PHB3 e PHB4 compreende a sequência de grampo correspondente nos peptídeos PHB1 e PHB2 respectivamente (Tabela 1). Neste caso, as posições 4- 15 no anterior são equivalentes às posições 2-13 neste último, e assim os resíduos escolhidos para as posições 4-15 de PHB3 e PHB4 utilizaram os mesmos critérios descritos acima para os peptídeos PHB1 e PHB2.

[00101] Da mesma forma, os peptídeos PHB8 e PHB9 compreendem a sequência de peptídeo PHB7, e os resíduos para as posições 4-15 foram escolhidos seguindo os mesmos critérios que para as posições 2-13 em PHB7. Os resíduos Glu3 e Phe16 em PHB3, PHB4, PHB8 e PHB9 foram escolhidos com o objetivo de imitar Glu375 (conservado em DENV1 e DENV3, Asp em DENV2 e DENV4) e Phe392 (conservado em DENV1, DENV2 y DENV4, Tyr em DENV3) de DIIIE (Figura 1E). Os resíduos IIe2 e Ile17 em PHB3-4 e PHB8-9 foram escolhidos devido à sua propensão para formar estruturas de fita beta. Cys1 e Cys18 ocupam posições NHB, e são introduzidos de modo a formar uma ligação dissulfeto que grampeia o peptídeo, estabilizando assim a estrutura de grampo beta (Figura 1E e Figura 2).

[00102] A topologia dos peptídeos PHB5 e pHB6 é reversa à da alça de grampo FG nativo em DIIIE. Nesse caso, os resíduos Phe1, Asn3, Lys5, Thr12, Asn14 e Glu16 são estruturalmente equivalentes a Phe16, Asn14, Lys12, Thr7, Asn5 e Glu3 em peptídeo PHB3, mas eles ocupam as posições HB interagindo em conjunto através de ligações de hidrogênio. Os resíduos Trp4 e Trp6, que são adjacentes aos resíduos Trp11 Trp13 e no grampo enovelado, ocupam posições NHB, e foram escolhidos de modo a formarem zíperes de Trp que aumentam a estabilidade conformacional do grampo beta. O resíduo Trp2 corresponde estruturalmente ao resíduo Trp391 de DIIIE, e foi escolhido devido às razões explicadas anteriormente. Os resíduos Lys10 e Glu7 foram escolhidos com base em escores altos para o parâmetro de preferência, e no fato de que eles podem formar uma ponte salina que forneceria mais estabilidade ao grampo. A escolha de Asn9 também foi baseada em um alto escore para o parâmetro de preferência. O resíduo d-Pro8 em PHB6 foi selecionado porque este é um aminoácido favorável para a posição 2 em voltas beta tipo IIP. O resíduo d-Lys introduzido em PHB5 (na posição 8) destina-se a imitar o resíduo Lys385 de DIIIE; em adição, d-Lys é mais favorável para a posição 2 de voltas beta tipo IIP do que o seu estereoisômero L. Alternativamente, Lys10 em PHB5 e PHB6 também podem imitar Lys385 de DIIIE.

[00103] As extensões C-terminais introduzidas em peptídeos PHB1- 9 consistem de um tripeptídeo Lys. O seu propósito é aumentar a solubilidade dos peptídeos de grampo beta descritos e conferir-lhes um caráter catiônico, o que favorece a sua interação através de forças eletrostáticas com o receptor LRP1, que é uma proteína aniônica. No caso de peptídeos PHB5 e PHB6, o tripeptídeo catiônico é unido ao grampo beta através de um espaçador de dipeptídeo diglicina, destinado a fornecer uma certa flexibilidade entre os dois segmentos e a bloquear o prolongamento da estrutura beta estendida da fita beta2.

[00104] As Figuras 1C e 1D são representações do tipo logo (J.Gorodkin, e outros (1997) Comput. Appl. Biosci, Vol 13, No 6: 583 a 586; T. D. Schneider & R. M. Stephens (1990). Nucleic Acids Research, Vol. 18, NO: 20, p. 6097 a 6100) da sequência consenso gerada através do alinhando de grampos beta do tipo IP e IIP de 8 resíduos de comprimento, respectivamente. Eles foram obtidos utilizando o servidor da rede "Protein Sequence Logos using Relative Entropy" em http://www.cbs.dtu.dk/~gorodkin/appl/plogo.html. Esta representação é uma alternativa para as matrizes de parâmetros de preferência mostradas nas Figuras 1A e 1B. O tamanho da letra representando que cada aminoácido é proporcional à "importância" desse aminoácido em cada posição; ou seja, as letras maiores implicam que o resíduo é estruturalmente mais favorável.

[00105] Em adição aos peptídeos PHB1-9, a Tabela 1 mostra a sequência de peptídeo HDIII3CL (SEQ ID NO: 10) e várias variantes dessa, tendo substituições de resíduos selecionados para um resíduo de alanina, que foram utilizadas para investigar a importância dos resíduos substituídos para a atividade antiviral deste peptídeo. Os peptídeos assim concebidos foram HDIII3CL2, onde o peptídeo HDIII3CL foi estendido C-terminalmente com 3 resíduos de lisina (SEQ ID NO: 11); HDIII3CLW-, um mutante Trp17->Ala de HDIII3CL2 (SEQ ID NO: 12); HDIII3CLK-, um mutante Lys14->Ala de HDIII3CL2 (SEQ ID NO: 13); e HDIII3CLC-, um mutante duplo Cys1->Ala e Cys18->Ala do peptídeo HDIII3CL2 (SEQ ID NO: 14).

[00106] A Figura 2 representa modelos tridimensionais da estrutura dos peptídeos de grampo beta HDIII3CL (A) e PHB4 (B). No caso do peptídeo HDIII3CL (Figura 2A), a figura mostra o segmento correspondente ao grampo (sem a extensão catiônica C-terminal) e destaca alguns resíduos importantes. Os números entre parênteses correspondem às ordenadas dos resíduos correspondentes em DIIIE. No caso do peptídeo PHB4 (Figura 2B), um parêntesis é usado para indicar onde a fita é estendida em relação a HDIII3CL, e as seguintes cadeias laterais, que são importantes para a atividade biológica dos peptídeos descritos na presente invenção, são destacadas: 1) Lys localizado na volta/alça, correspondendo a Lys385 de DIIIE, 2) Lys localizado no segunda fita beta, correspondendo a Lys388 de DIIIE, 3) Trp localizado no segunda fita beta, correspondendo a Trp391 de DIIIE, 4) Tyr localizado na primeira fita beta, correspondendo a Tyr377 de DIIIE. A Figura 2C representa uma sobreposição estrutural de ambos os peptídeos.

[00107] Os peptídeos PHB1-9, descritos pela presente invenção, representam exemplos específicos de peptídeos de grampo beta com atividade antiviral altamente potente contra DENV que podem ser concebidos, seguindo os princípios gerais expostos na seção Descrição e, neste Exemplo da presente invenção. O presente pedido, portanto, abrange qualquer peptídeo de grampo beta cuja sequência é análoga a ao menos um dos peptídeos do conjunto PHB1-9, de tal modo que a sua identidade de sequência é igual ou superior a 70%, e de preferência 80%. Tais peptídeos análogos suportariam diferenças em uma ou várias posições selecionadas dentre: 1) posições modificáveis a-e), descritas na seção Descrição da invenção; neste caso, o resíduo(s) em PHB1-9 seria substituído por resíduos que exibem também uma alta propensão estrutural para ocupar essa posição em grampos beta; 2) posições potencialmente funcionais, descritas na seção Descrição da invenção; neste caso, o resíduo(s) em PHB1-9 seria substituído por um resíduo a partir da posição equivalente do grampo beta FG de DIIIE a partir de um sorotipo de DENV específico; 3) posições correspondentes à extensão Lys C- terminal; neste caso, a extensão compreende dois ou três resíduos de lisina, de preferência três, e 4) posições correspondentes às cisteínas formando ligações dissulfeto de peptídeos PHB1-4 e PHB7-9; nestes casos um membro do par de Cys pode ser substituído por Asp/Glu ou Lys e o outro por Lis ou Asp/Glu, de tal modo que o peptídeo pode ser grampeado formando uma ligação amida entre as cadeias laterais destes resíduos, isto é, Asp/Glu em um lado e Lys no outro.

[00108] As sequências de peptídeos de grampo beta análogas aos peptídeos do conjunto PHB1-9 podem ser descritas, em termos gerais, como segue:

[00109] i. Peptídeos análogos a PHB1 e PHB2: estes são peptídeos que exibem uma identidade de sequência de 70% ou superior (preferencialmente de 80% ou superior), com PHB1 ou PHB2, onde a sua sequência consiste em,

[00110] Posição 1 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 14, se for Glu/Asp (Lys), então, sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys ( Glu/Asp) na posição 14.

[00111] Posição 2 ("a" modificável): Val ou Ile ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00112] Posição 3 (potencialmente funcional): Tyr ou Asn

[00113] Posição 4 ("a" modificável): Trp ou Val ou Phe ou Glu

[00114] Posição 5 ("d" modificável): Thr ou Val ou Ile (Os dois últimos são os resíduos que aparecem em sequências DENV naturais)

[00115] Posição 6 ("a" modificável): Arg ou Ile ou Val ou Glu ou Leu

[00116] Posição 7 ("b" modificável): d-Pro

[00117] Posição 8 ("b" modificável): Asp ou Lys ou Asn

[00118] Posição 9 ("a" e "e" modificáveis): Trp ou Lys ou Met ou Thr ou Gln

[00119] Posição 10 (potencialmente funcional): Lys

[00120] Posição 11 ("a" modificável): Val ou Met ou Leu ou His

[00121] Posição 12 (potencialmente funcional): Asn ou Asp ou Ser ou His

[00122] Posição 13 (posição essencial): Trp

[00123] Posição 14 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 1, se for Glu/Asp (Lys), então sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys (Glu/Asp) na posição 1.

[00124] Posição 15-17 ou 15-16 (extensão C-terminal): tripeptídeo Lys-Lys-Lys ou dipeptídeo Lys-Lys.

[00125] ii. Peptídeos análogos a PHB3 e PHB4: Estes são peptídeos com uma identidade de sequência de 70% ou superior (preferencialmente de 80% ou superior) em relação aos peptídeos PHB3 e PHB4, onde os ditos peptídeos análogos têm uma sequência que consiste em:

[00126] Posição 1 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cis, então forma uma ponte dissulfeto com resíduo Cys na posição 18, se for Glu/Asp (Lys), então a sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys (Glu/Asp) na posição 18.

[00127] Posição 2 ("a" modificável): Ile ou Val ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00128] Posição 3 (potencialmente funcional): Glu ou Asp

[00129] Posição 4 ("a" modificável): Val ou Ile ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00130] Posição 5 (potencialmente funcional): Tyr ou Asn

[00131] Posição 6 ("a" modificável): Trp ou Val ou Phe ou Glu

[00132] Posição 7 ("d" modificável): Thr ou Val ou Ile (Os dois últimos são os resíduos que aparecem nas sequências DENV naturais)

[00133] Posição 8 ("a" modificável): Arg ou Ile ou Val ou Glu ou Leu

[00134] Posição 9 ("b" modificável): d-Pro

[00135] Posição 10 ("b" modificável): Asp ou Lys ou Asn

[00136] Posição 11 ("a" e "e" modificável): Trp ou Lys ou Met ou Thr ou Gln

[00137] Posição 12 (potencialmente funcional): Lys

[00138] Posição 13 ("a" modificável): Val ou Met ou Leu ou His

[00139] Posição 14 (potencialmente funcional): Asn ou Asp ou Ser ou His

[00140] Posição 15 (posição essencial): Trp

[00141] Posição 16 (potencialmente funcional): Phe ou Tyr

[00142] Posição 17 ("a" modificável): Ile ou Val ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00143] Posição 18 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 1, se for Glu/Asp (Lys), então a sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys ( Glu/Asp) na posição 1.

[00144] Posição 19-21 ou 19-20 (extensão C-terminal): tripeptídeo Lys-Lys-Lys ou dipeptídeo Lys- Lys.

[00145] iii. Peptídeos análogos a PHB7: Estes são peptídeos com uma identidade de sequência de 70% ou superior (preferencialmente 80% ou mais) com o peptídeo PHB7, onde os ditos peptídeos análogos têm uma sequência que consiste em,

[00146] Posição 1 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 14, se for Glu/Asp (Lys), então a sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys ( Glu/Asp) na posição 14.

[00147] Posição 2 ("a" modificável): Val ou Ile ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00148] Posição 3 (potencialmente funcional): Tyr ou Asn

[00149] Posição 4 ("a" modificável): Val ou Ile ou Phe ou Tyr ou Leu

[00150] Posição 5 ("d" modificável): Thr ou Val ou Ile (Os dois últimos são os resíduos que aparecem nas sequências DENV naturais)

[00151] Posição 6 ("a" modificável): Ile ou Val ou Tyr, His ou Lys

[00152] Posição 7 ("b" modificável): Asn ou Asp

[00153] Posição 8 ("b" modificável): Gly

[00154] Posição 9 ("a" e "e" modificável): Lys ou His ou Arg ou Val ou Glu ou Tyr ou Met

[00155] Posição 10 (potencialmente funcional): Lys

[00156] Posição 11 ("a" modificável): Tyr ou Val ou Gln ou Trp, Phe

[00157] Posição 12 (potencialmente funcional): Asn ou Asp ou Ser ou His

[00158] Posição 13 (posição Essencial): Trp

[00159] Posição 14 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 1, se for Glu/Asp (Lys), então sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys (Glu/Asp) na posição 1.

[00160] Posição 15-17 ou 15-16 (extensão C-terminal): tripeptídeo Lys-Lys-Lys ou dipeptídeo Lys-Lys

[00161] iv. Peptídeos análogos a PHB8 e PHB9: Estes são peptídeos com uma identidade de sequência de 70% ou superior (preferencialmente de 80% ou superior) em relação aos peptídeos PHB8 e PHB9, onde os ditos peptídeos análogos têm uma sequência que consiste em:

[00162] Posição 1 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 18, se for Glu/Asp (Lys), então a sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys (Glu/Asp) na posição 18.

[00163] Posição 2 ("a" modificável): Ile ou Val ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00164] Posição 3 (potencialmente funcional): Glu ou Asp

[00165] Posição 4 ("a" modificável): Val ou Ile ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00166] Posição 5 (potencialmente funcional): Tyr ou Asn

[00167] Posição 6 ("a" modificável): Val ou Ile ou Phe ou Tyr ou Leu

[00168] Posição 7 ("d" modificável): Thr ou Val ou Ile (Os dois últimos são os resíduos que aparecem nas sequências DENV naturais)

[00169] Posição 8 ("a" modificável): Ile ou Val ou Tyr ou His ou Lys

[00170] Posição 9 ("b" modificável): Asn ou Asp

[00171] Posição 10 ("b" modificável): Gly

[00172] Posição 11 ("a" e "e" modificável): Lys ou His ou Arg ou Val ou Glu ou Tyr ou Met

[00173] Posição 12 (potencialmente funcional): Lys

[00174] Posição 13 ("a" modificável): Tyr ou Val ou Gln ou Trp, Phe

[00175] Posição 14 (potencialmente funcional): Asn ou Asp ou Ser ou His

[00176] Posição 15 (posição essencial): Trp

[00177] Posição 16 (potencialmente funcional): Phe ou Tyr

[00178] Posição 17 ("a" modificável): Ile ou Val ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00179] Posição 18 (estrutural, ciclização): Cys ou Lys ou Asp ou Glu, se for Cys, então forma uma ponte dissulfeto com o resíduo Cys na posição 1, se for Glu/Asp (Lys), então a sua cadeia lateral forma uma ligação amida com a cadeia lateral Lys (Glu/Asp) na posição 1.

[00180] Posição 19-21 ou 19-20 (extensão C-terminal): tripeptídeo Lys-Lys-Lys ou dipeptídeo Lys-Lys

[00181] v. Peptídeos análogos a PHB5 e pHB6: Estes são peptídeos com uma identidade de sequência de 70% ou superior (preferencialmente de 80% ou superior) em relação a peptídeos PHB5 e pHB6, onde os ditos peptídeos análogos têm uma sequência que consiste em:

[00182] Posição 1 (potencialmente funcional): Phe ou Tyr

[00183] Posição 2 (posição essencial): Trp

[00184] Posição 3 (potencialmente funcional): Asn ou Asp ou Ser ou His

[00185] Posição 4 ("a" modificável): Trp

[00186] Posição 5 (potencialmente funcional): Lys

[00187] Posição 6 ("a" modificável): Trp

[00188] Posição 7 (potencialmente funcional, "b" modificável): Glu ou Vai ou Arg ou Ile ou Asp

[00189] Posição 8 ("b" modificável): d-Pro ou d-Lys

[00190] Posição 9 ("b" modificável): Asn ou Asp ou Lys

[00191] Posição 10 (potencialmente funcional, "b" modificável): Lys ou Met ou Trp ou Gln ou Thr

[00192] Posição 11 ("a" modificável): Trp

[00193] Posição 12 ("d" modificável): Thr ou Val ou Ile (Os dois últimos são os resíduos que aparecem nas sequências DENV naturais)

[00194] Posição 13 ("a" modificável): Trp

[00195] Posição 14 (potencialmente funcional): Tyr ou Asn

[00196] Posição 15 ("a" modificável): lIe ou Val ou Trp ou Phe ou Tyr ou Met

[00197] Posição 16 (potencialmente funcional): Glu ou Asp

[00198] Posição 17-21 ou 17-20 (extensão C-terminal): pentapeptídeo Gly-Gly-Lys-Lys-Lys ou tetrapeptídeo Gly-Gly-Lys-Lys Síntese de Peptídeos

[00199] Os peptídeos listados na Tabela 1 foram obtidos por síntese de fase sólida em resina Fmoc-AM-MBHA, seguida da estratégia Fmoc/tBu (Barany, G. & Merrifield, R. B. (1977) J Am Chem Soc. 99 7363 a 7365). O processo foi realizado manualmente, em seringas de 10 mL equipadas com um filtro poroso, de modo que todos os reagentes e solventes poderiam ser convenientemente removidos por filtração sob vácuo. Os aminoácidos foram acoplados usando o método de ativação com DIC/HOBt, e o término da reação de acoplamento foi verificado com o teste de ninidrina (Kaiser, E., e outros (1970) Anal Biochem. 34, 595 a 598). Os peptídeos sintetizados foram liberados por tratamento da resina com uma solução de ácido trifluoroacético/EDT/H2O/TIS (94%/2,5%/2,5%/1%), precipitados com éter e liofilizados durante 72 h, após o que foram grampeados por formação de uma ligação dissulfeto através da oxidação com dimetil sulfóxido (DMSO) (Andreu, D., e outros (Eds), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, 1994, pp. 91 a 169). Os peptídeos resultantes foram purificados por RP-HPLC preparativo em uma coluna RP-C18, as frações coletadas foram analisadas independentemente por RP-HPLC analítico, e a preparação de peptídeo final foi obtida por combinação das frações de pureza superior a 99%. A espectrometria de massas (ESI-MS) foi utilizada para verificar o peso molecular da preparação final.

[00200] Os espectros de massas foram adquiridos com um espectrômetro de massas QTOF-2TM de geometria octogonal híbrida (Micromass, UK) equipado com uma fonte de ionização por eletroaspersão Z-spray. O pacote de software MassLynx, ver. 3.5 (Waters, USA) foi utilizado para aquisição e processamento de espectros.

Exemplo 2. Inibição da infecção por DENV em células Vero

[00201] De modo a demonstrar que os peptídeos de grampo beta descritos pela presente invenção podem inibir a infecção por DENV in vitro, os ditos peptídeos foram avaliados em um ensaio de redução de plaque utilizando a célula Vero.

[00202] As células foram cultivadas em placas de 24 cavidades até que a monocamada alcançou aproximadamente 90% de confluência, após o que foram lavadas duas vezes com meio MEM sem soro fetal bovino (FBS). Em seguida, foram adicionadas diluições de peptídeos e as misturas células-peptídeos foram incubadas tipicamente durante 1 hora a 37°C, seguida pela adição de uma preparação de sorotipo de DENV 2 (código NIBSC S16803) em uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) de 0,001. As células foram então incubadas durante 1 hora a 37°C, e uma vez que o período de incubação com o inóculo viral concluído, foram novamente lavadas para remover os vírions não ligados e incubadas durante 5 dias a 37°C em meio de alta densidade (MEM suplementado com aminoácidos não essenciais, 1% de FBS, 1% de carboximetil celulose), de modo a permitir que se formem placas virais. Em seguida, as células foram coradas com 0,1% Naphtol Blue Back em acetato de sódio a 0,15 M. Duas réplicas por ponto experimental foram utilizadas em cada ensaio, e três determinações independentes foram realizadas para cada amostra.

[00203] A toxicidade dos peptídeos de grampo beta foi avaliada com o ensaio MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio, Invitrogen, USA) (Mosmann, T. (1983). J. Immunol. Methods 65, 55 a 63.), e pela contagem manual de células usando uma câmara de Neubauer. Placas com noventa e seis cavidades (Costar, USA) foram semeadas com 200 μL/cavidade de uma suspensão contendo células Vero a 1 x 105 células/mL e incubadas até que as monocamadas atingissem aproximadamente 90% de confluência, tipicamente durante 18 a 24 horas. Após a lavagem das células duas vezes com meio DMEM (Meio de Eagle modificado por Dulbecco), 50 μL/cavidade foram adicionados do peptídeo ou diluições de aditivo a serem avaliadas (Triton X-100™ dissolvido em PBS foi utilizado como controle de toxicidade positivo) e as placas foram incubadas a 37°C sob uma atmosfera de CO2 a 5% durante 2 ou 24 horas. Foram então empregados dois procedimentos diferentes para medir a toxicidade:

[00204] a) Uma solução de 2 mg/mL de MTT em PBS (50 μL/cavidade) e as placas foram incubadas durante mais 4 h a 37°C, CO2 a 5%. O meio foi então removido, e 100 μL/cavidade de DMSO foram então adicionados para solubilizar os precipitados de formazano. Finalmente, a densidade óptica (OD) dos sobrenadantes em um comprimento de onda de 540 nm foi medida utilizando um leitor de placas (Sensident Scan™, Merck, Alemanha).

[00205] b) As placas foram lavadas com 200 μL/cavidade de meio DMEM e, em seguida, uma solução de tripsina (Sigma, USA) foi adicionado a 50 μL/cavidade. Após a inativação da tripsina através da adição de 150 μL/cavidade de DMEM suplementado com 10% de FBS, as células foram contadas utilizando o corante vital Trypan Blue (Gibco, USA). Os dados foram processados utilizando o pacote de software estatístico Prism v5.3 (GraphPad, USA), usando regressão não linear para ajustá-los a uma curva de log10 (concentração) vs resposta.

[00206] A Tabela 2 mostra os valores de IC50 calculados correspondentes à atividade antiviral dos peptídeos de grampo beta contra DENV2 em células Vero, bem como a sua toxicidade e índice de seletividade. Todos os peptídeos analisados exibiram atividade antiviral detectável neste sistema. Os peptídeos PHB2, PHB3, PHB4, PHB5, PHB8 e PHB9 exibiram maior potência antiviral do que o peptídeo HDIII3CL, embora no caso de peptídeos PHB3, PHB5 e PHB8, a diferença fosse pequena. Neste sistema in vitro, os peptídeos PHB1, PHB6 e PHB7 foram realmente menos potentes do que o peptídeo HDIII3CL. O peptídeo PHB4 exibiu atividade antiviral na faixa nanomolar e um excelente índice de seletividade de 4333. Este peptídeo constitui, portanto, uma molécula líder com excelentes propriedades como um fármaco antiviral candidato contra DENV.

[00207] Os resultados também demonstraram que a alça intercadeias de seis resíduos do peptídeo HDIII3CL é completamente dispensável, à medida que foi deletado da sequência dos peptídeos de grampo beta descritos pela presente invenção e substituídos com uma volta beta com dois resíduos centrais, com nenhuma similaridade, completa ou parcial, com a sequência original da alça DIIIE, sem efeitos prejudiciais à atividade antiviral in vitro. Esta é uma característica desejável, se os peptídeos forem utilizados durante as infecções secundárias por DENV, porque esta alça é imunodominante durante a resposta de anticorpo humano contra DENV (Sukupolvi-S Petty, e outros (2007). J Virol.; 81 (23): 12816-26) e os anticorpos pré- existentes podem, por conseguinte, neutralizar a atividade antiviral dos peptídeos à base de grampo beta FG deveria não eliminar a alça.Assim, deletar a alça nos peptídeos descritos na presente invenção elimina essa possibilidade.

[00208] Os dados também apontam para várias características comuns entre os peptídeos de grampo beta mais potentes, que provavelmente desempenham um papel importante em aumentar a sua atividade antiviral. Uma delas, por exemplo, é a presença de uma lisina (ou d-lisina) em uma posição central sobre as voltas beta intercadeia. O peptídeo PHB5 é mais potente do que PHB6, e a sua única diferença é a ausência de um resíduo de lisina na volta beta do último (Tabela 1). Além disso, PHB2 e PHB4 são mais potentes do que suas contrapartes PHB1 e PHB3, e nem PHB1 nem PHB3 têm um resíduo de lisina nas posições centrais da alça (essa lisina é pensada para imitar funcionalmente o resíduo Lys386 de DIIIE). Outra característica distintiva dos peptídeos mais potentes é a presença de um resíduo de tirosina na posição equivalente à do resíduo 377 em DIIIE (ordenadas a partir da proteína E de DENV3). Por exemplo, o peptídeo PHB9 é mais potente do que PHB8, e a única diferença é que Tyr5 foi substituído por Asn5 neste último. Além disso, PHB2 (contendo Tyr3) e PHB4 (contendo Tyr5) são mais potentes do que suas contrapartes de peptídeos PHB1 e PHB3, onde estes resíduos de tirosina foram substituídos por resíduos de asparagina.

[00209] Finalmente, os dados confirmaram que estender as fitas beta através da adição de quatro (duas por fita) aminoácidos adicionais tinha um efeito favorável sobre a atividade antiviral dos peptídeos resultantes. A potência do peptídeo PHB4, por exemplo, foi maior do que a de PHB2, e a dos peptídeos PHB8 e PHB9 foi maior do que a de PHB7. O peptídeo PHB4 é o mais potente de toda a série, e é o único cuja sequência contém todas as três características distintivas dos peptídeos potentes identificados acima. Assim, os dados experimentais obtidos neste exemplo demonstram, tomados em conjunto, que os critérios seguidos para a concepção de peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção foram escolhidos criteriosamente.Tabela 2. Potência, toxicidade in vitro e índice de seletividade para peptídeos de grampo beta.*, Atividade antiviral (50% de atividade inibidora), NA, nenhuma atividade inibidora em concentrações menores ou iguais a 100 μM. *, não tóxico em 1000 μM. ND, não determinado

[00210] Em seguida, decidiu-se comparar a atividade antiviral dos peptídeos PHB4 e HDIII3CL contra todos os quatro sorotipos de DENV, com o objetivo de comparar seus respectivos valores de IC50. Esta comparação foi realizada com ensaios de redução de plaque em células Vero, acrescentando o inóculo viral para cada sorotipo (DENV1, código NIBSC West Pac 74, DENV2, NIBSC, código S16803; DENV3, NIBSC, código CH53489; DENV 4, NIBSC código TVP360) em um m.o.i de 0,001. Como pode ser observado na Tabela 3, o peptídeo PHB4 foi ativo contra os quatro sorotipos, e muito mais do que o peptídeo HDIII3CL (4000 a 7500 vezes mais potente, dependendo do sorotipo). O fato de que PHB4 exibiu atividade inibidora contra os quatro sorotipos é consistente com o papel proposto para o complexo α2M*/LRP1 como receptor endocítico para todos os sorotipos de DENV e com a evidência experimental que demonstra a ligação de peptídeo PHB4 a essas proteínas, como mostrado mais adiante neste pedido.Tabela 3. Atividade antiviral de peptídeos PHB4 e HDIII3CL contra os quatro sorotipos do vírus da dengue

Exemplo 3. Inibição da ligação de DIIIE a α2M* por peptídeos de grampo beta Purificação e ativação de α2M humano

[00211] α2M humano foi purificada a partir de 380 mL de plasma humano, obtido através do agrupamento de amostras de plasma de voluntários saudáveis de 30 a 40 anos de idade. O plasma foi dialisado contra água deionizada, com frequentes mudanças, durante 72h a 4°C. O material insolúvel foi removido do dialisado resultante por centrifugação a 10000 x g durante 30 min, e o sobrenadante foi equilibrado para PBS pH 6,0 através de diálise e, em seguida, carregado em uma coluna XK 50/30 (Amersham, UK) empacotada com 65 mL de Sefarose quelante Fast Flow (Amersham, UK), previamente carregada com Zn2+ e equilibrada com PBS pH 6,0. Após carregar a amostra, a coluna foi lavada com PBS pH 6,0 até a absorbância do eluente cair para linha de base, e as proteínas ligadas foram eluídas com acetato de sódio a 10 mM/cloreto de sódio a 150 mM de tampão pH 5,0. O eluato coletado foi concentrado por ultrafiltração, e em seguida carregado em uma coluna de filtração em gel Superdex 200 (Amersham, UK) equilibrada com PBS a pH 7,8. A presença de α2M na fração de peso molecular mais alto foi verificada por Western blotting com uma preparação de anticorpo policlonal α2M anti-humano (Sigma, USA).α2M purificado foi ativado incubando-o com metilamina a 200 mM em fosfato de sódio a 50 mM, cloreto de sódio a 150 mM, pH 7,4. A preparação α2M_MeNH2 (α2M*) resultante foi extensivamente dialisada contra fosfato de sódio a 50 mM/cloreto de sódio a 0,5 M a pH 7,8.

Ensaios de competição

[00212] A capacidade de peptídeos PHB1-9 e HDIII3CL de inibir a interação de DIIIE1J recombinante com α2M* foi analisada utilizando um formato de ELISA de competição. As placas foram revestidas com α2M* purificado e incubado com DIIIE1J biotinilado e previamente purificado (DIIIE1Jbiot) na presença de diferentes concentrações dos peptídeos de teste e/ou DIIIE1J recombinante, detectando DIIIE1Jbiot ligado a α2M* com um conjugado estreptavidina-peroxidase. Detalhes do procedimento experimental seguido para obter DIIIE1J recombinante (SEQ ID NO: 19) são apresentados posteriormente, mas essencialmente, a molécula consiste dos resíduos 289-400 (numeração de acordo com a sequência PIR: A32401) de proteína E de DENV1, cepa 1636 (Chu, M. C., e outros (1989). Journal of General Virology 70 (Pt 7), 1701 a 1712), correspondente ao domínio III seguido por um marcador de seis histidinas C-terminal.

[00213] Em concentrações de peptídeo na baixa faixa micromolar a submicromolar/ nanomolar, os peptídeos de grampo beta PHB5, PHB7, PHB8 e PHB9 parcialmente inibem a ligação de DIIIE1Jbiot a α2M* (Figura 3), e as percentagens de inibição aumentam monotonicamente com a concentração de peptídeo. Os peptídeos PHB5, PHB8 e PHB9 são os inibidores mais potentes deste grupo, apresentando porcentagens de inibição que variam de 23 a 50%, similar a DIIIE1J recombinante. Nas faixas de concentração analisadas, estes três peptídeos são melhores inibidores (2 a 12 vezes, dependendo da sua concentração exata) de ligação de DIIIE1Jbiot a α2M* do que o peptídeo HDIII3CL.

[00214] A porcentagem máxima de inibição exibida pelo peptídeo HDIII3CL nestes ensaios foi de apenas 18%; mais baixa do que a porcentagem de inibição de até PHB7, o menor peptídeo de grampo beta. Isto indica que, na prática, os resíduos na alça intercadeia do grampo FG de DIIIE são dispensáveis para a finalidade de interagir com a proteína α2M*, à medida que a alça de 6 resíduos de comprimento original foi substituído no peptídeo PHB7 por uma fita beta tipo IP com apenas dois resíduos centrais. A sequência desta volta beta não tem qualquer similaridade - total ou parcial - com a da alça original, seus resíduos foram escolhidos com base em critérios estruturais (propensão de formação de volta beta tipo IP, conectores de grampo beta). O único resíduo da alça HDIII3CL original que permanece ainda no peptídeo PHB7 (e PHB8 e PHB9 também) é Lys11 (numeração HDIII3CL), cujo papel funcional é imitado por Lys9 de PHB7, que ocupa uma posição espacial similar (estruturalmente quase equivalente).

[00215] Em adição a Lys9 (que imita Lys11 de HDIII3CL) há outros resíduos de PHB7 imitando o papel dos resíduos HDIII3CL: a) Asn3, Lys10 e Asn12 a partir de resíduos que imitam PHB7 Asn3, Lys14 e Asn16 de HDIII3CL (estes são os resíduos de grampo beta que não formam ligações hidrogênio), cujas cadeias laterais se projetam para a face exposta do grampo FG de DIIIE e são, portanto, potencialmente funcionais; b) Trp13 a partir de PHB7 é equivalente a Trp17 de HDIII3CL, e corresponde a um resíduo Trp que é estritamente conservado através de todos os flavivírus; c) Cys1 e Cys14 de PHB7 formam uma ponte dissulfeto equivalente à formada por Cys1-Cy18 de HDIII3CL. O fato de que PHB7 retém, e melhora, mediante a atividade inibidora DENV de HDIII3CL sugere que as características que foram retidas durante a concepção do primeiro desempenham um papel importante para a atividade funcional dos peptídeos descritos pela presente invenção.

[00216] Os peptídeos PHB8 e PHB9 são melhores inibidores do que o peptídeo PHB7. Isto indica que a adição de quatro resíduos (dois por filamento) para PHB8 e PHB9 contribui favoravelmente para a atividade inibidora DENV dos peptídeos descritos pela presente invenção.

[00217] Como pode ser observado na Figura 4, a afinidade aparente da interação entre o peptídeo de grampo beta PHB5 e α2M* é similar à da interação entre DIIIE e α2M*, à medida que as porcentagens de inibição para cada concentração de PHB5 ensaiada são apenas ligeiramente inferior às exibidas por DIIIE1J. Estes resultados demonstram que é possível usar um peptídeo de grampo beta cuja topologia é revertida em relação à do grampo beta FG nativo de DIIIE e ainda assim ser capaz de inibir a interação DIIIE-α2M*. Uma conclusão similar pode ser tirada do tipo de volta beta concebida para o peptídeo, tendo em conta que uma volta tipo IIP é usada em PHB5, enquanto os peptídeos PHB7-9 usam voltas tipo IP. O que é importante é preservar a equivalência estrutural dos resíduos, que são essenciais para a interação, isto é, que eles sejam dispostos de uma forma espacial análoga, mesmo quando apresentado dentro do contexto de um quadro estruturalmente diferente. Além disso, PHB5 demonstra que o papel desempenhado pela ligação dissulfeto em estabilizar a conformação dos peptídeos PHB8 e PHB9 pode ser assumido por outros motivos estruturais, tais como o zíper Trp usando em PHB5.

[00218] Um elemento essencial da presente invenção é a análise da atividade biológica dos peptídeos descritos na faixa nanomolar. Os peptídeos de alta potência permitem a utilização de doses terapêuticas mais baixas e as vantagens que resultam em termos de redução dos custos e menor probabilidade de aparecimento de um número de problemas associados a doses elevadas, tais como agregação, interações não específicas, antigenicidade e imunogenicidade. Como mostrado na Figura 5, na faixa nanomolar/submicromolar, os peptídeos PHB2, PHB4, PHB5, PHB8 e PHB9 foram ainda melhores inibidores da ligação de DIIIE1J biotinilado (DIIIE1Jbiot) a α2M* do que o próprio DIIIE1J (1,5 a 3 vezes melhor porcentagem de inibição). Por outro lado, na faixa de concentração, a inibição exibida pelo peptídeo HDIII3CL é muito baixa, em comparação com DIIIE1J.

Exemplo 4. Mapeamento de resíduos essenciais para a ligação de DIIIE a α2M* Preparação de uma biblioteca de mutantes de alanina para DIIIE (DIIIE1PRS)

[00219] De modo a determinar quais resíduos em DIIIE a partir de DENV1 desempenham um papel importante na interação da dita molécula com um número de diferentes ligantes, uma biblioteca de mutantes de um único resíduo foi preparada, onde cada resíduo exposto ao solvente foi sistematicamente substituído por um resíduo de alanina (uma técnica mais vulgarmente conhecida como ‘varrimento de alanina’), de modo a estudar posteriormente a ligação das ditas variantes mutantes aos ligantes a serem analisados. Neste tipo de experimentos, qualquer variação em relação à ligação de uma variante particular ao ligante é interpretada como evidência do envolvimento do resíduo mutado na interação da proteína de ocorrência natural com o dito ligante.

[00220] De modo a preparar esta biblioteca, a análise inicial foi circunscrita aos resíduos 289 a 395 (numeração de acordo com GenBank: AAN32775.1) da proteína de envelope de DENV1, cepa PRS 288690 (Gonçalvez, A. P., e outros (2002), Virology 303 (1), 110 a 119.). A sequência correspondente a este fragmento da poliproteína viral, como aqui definido DIIIE a partir de DENV1 cepa PRS 288690 (DIIIE1PRS), é mostrada na SEQ ID NO: 15.

Seleção de resíduos a serem mutados em DIIIE1PRS

[00221] Em vez de uma abordagem de força bruta, onde cada resíduo foi substituído por alanina por vez, decidiu-se fazer uma seleção prévia com base na acessibilidade do solvente relativo, como estimado usando o pacote de software WHAT IF versão 200509191718 (Vriend, G., (1990), J. Mol. Graph. 8, 52-6), e com base na estimativa da diferença na estabilidade de cada possível variante com relação à proteína de ocorrência natural, expressa como o ΔΔG calculado por FoldX versão 6.0 (Schymkowitz, J., e outros (2005). Nucleic Acids Res. 33, W382-W388). Ambos os cálculos basearam-se em modelos de homologia de DIIIE1PRS (resíduos 1-105 na SEQ ID NO: 15), obtidos a partir das coordenadas de cristalografia de proteína E a partir de DENV3 (Modis, Y., e outros (2003). Proc. Sci.USA 100, 6986 a 6991) e submetidos a um processo de minimização de energia.

[00222] O critério utilizado para selecionar resíduos a serem mutados para Ala foi uma acessibilidade relativa superior a 15% e um ΔΔG inferior a 4 kcal/mol. As 79 posições que satisfazem este critério e os resultados dos cálculos para os parâmetros mencionados acima são mostrados na Tabela 4.Tabela 4. Resíduos selecionados para a varredura de alanina de DIIIE1PRS.

[00223] ΔΔG: diferença no enovelamento ΔG entre o mutante Ala mutante e a proteína de ocorrência natural (1: modelos não minimizados, 2: modelo minimizado); %AAC: porcentagem de acessibilidade ao solvente. Os resíduos sombreados correspondem às posições onde ΔΔG foi maior do que 4 kcal/mol.

Preparação de uma biblioteca de plasmídeos recombinantes para a expressão de DIIIE1PRS e suas variantes mutadas em Escherichia coli

[00224] Depois de selecionar os resíduos de DIIIE1PRS a serem utilizados para a varredura de alanina, foram preparados os plasmídeos recombinantes para a expressão heteróloga de cada variante mutante Ala da biblioteca em E. coli. Isto foi conseguido por meio da síntese, usando o método de Agarwal e outros (Agarwal KL, e outros (1970), Nature 227, 27 a 34), e começando a partir de oligonucleotídeos sintetizados em fase sólida via química de fosforamidita (Beaucage SL e Caruthers MH (1981)., Tetrahedron Letters, 22, 1859), uma molécula de DNA de fita dupla que codifica para os resíduos 289 a 400 (numeração de acordo com GenBank: AAN32775.1) da proteína E de DENV1, cepa PRS 288690 (Gonçalvez, AP, e outros (2002) Virology 303 (1), 110 a 119), seguido de um marcador 6-histidina C-terminal; uma proteína recombinante aqui definida como DIIIE1PRS recombinante (rDIIIE1PRS, SEQ ID NO: 17). Esta molécula de DNA de fita dupla (SEQ ID NO: 16) contém sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição Nde I e Xho I, concebidos de modo que o fragmento pode ser inserido no plasmídeo pET22b (Novagen Inc., USA) no mesmo quadro de leitura do códon de início fornecido pelo dito plasmídeo. Depois de digerir esta molécula de DNA de fita dupla com as enzimas de restrição Nde I e Xho I sob condições especificadas pelo fabricante, o fragmento digerido foi ligado, usando T4 DNA ligase sob as condições especificadas pelo fabricante, ao plasmídeo pET22b (Novagen Inc. USA) previamente digerido do mesmo modo. A mistura de ligação assim obtida foi transformada na cepa XL-1Blue de E. coli (Bullock WO, e outros (1987) Biotechniques; 5: 376-8) como descrito por Sambrook e outros (Sambrook J., e outros. Molecular Cloning: A Laboratory Manual Nova Iorque, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989), e os plasmídeos a partir de colónias que cresceram em meio seletivo foram triados, purificados e sequenciados para se obter um plasmídeo cuja sequência correspondia à sequência esperada. O dito plasmídeo foi denominado pET-DIII DENV1 (SEQ ID NO: 18), e é representado esquematicamente na Figura 6.

[00225] A construção de plasmídeos recombinantes para expressar os 79 mutantes Ala previamente selecionados de DIII1PRS foi realizada como descrito acima para o pET-DIII DENV1, mas sintetizar em cada caso, uma molécula de DNA de fita dupla diferente na qual o códon correspondente ao resíduo a ser mutado foi substituído por um tripleto GCG, correspondendo a um códon de alanina. O códon que foi substituído em cada variante, em conjunto com o aminoácido para o qual ele foi codificado, é mostrado na Tabela 5.Tabela 5. Resíduo substituído por alanina e códon correspondente, substituído por GCG em cada variante da biblioteca de mutantes DIIIE1PRS.

Transformação dos plasmídeos da biblioteca de mutantes DIIIE1PRS em E. coli e a criopreservação dos clones obtidos

[00226] De modo a obter clones de células de E. coli contendo os plasmídeos para expressar neste hospedeiro as variantes DIIIE1PRS selecionadas, as células competentes transformadas da cepa de E. coli BL21 (DE3) (Studier, F. W. & Moffatt, B. A. (1986) J. Mol.Biol. 189 (1), 113 a 130) foram preparadas e divididas em alíquotas, cada uma das quais foi transformada separadamente com 20 ng de um dos plasmídeos da biblioteca mutante, usando métodos conhecidos dos versados na técnica (Sambrook , J., e outros. Molecular cloning: A laboratory Manual 1989. Nova Iorque, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press). As alíquotas transformadas foram semeadas separadamente em placas de LB-ágar contendo ampicilina a 100 μg/mL. Após a incubação durante 12 horas a 37°C para permitir o crescimento bacteriano, uma colônia isolado em uma cavidade a partir de cada placa foi inoculada em tubos de ensaio separados contendo 5 mL de caldo LB cada, suplementado com ampicilina a 100 μg/ml, e incubado a 37°C sob agitação (200 rpm) até o aparecimento de turbidez visível. As culturas foram então centrifugadas assepticamente a 3000 x g durante 20 min. a 25°C, cada um ressuspenso em 250 μl de caldo LB fresco + 250 μL de 40% (em volume) de glicerol, e por sua vez dividido em alíquotas de 100 μl que foram armazenadas a -70°C.

Purificação de variantes mutantes DIIIE1PRS

[00227] Depois de preparar uma biblioteca de clones de E. coli criopreservados expressando cada uma das variantes da biblioteca de mutante DIIIE1PRS, um processo em pequena escala foi usado para purificar as ditas variantes DIIIE1PRS. Em resumo, para cada variante, uma única alíquota criopreservada do clone de E. coli contendo o plasmídeo correspondente foi utilizada para inocular 50 mL de meio ZYM50502 (Studier, F. W. (2005). Protein Expr.Purif. 41 (1), 207 a 234) suplementado com ampicilina a 100 μg/mL em um frasco de Erlenmeyer de 1 L, que foi então incubado durante 12 horas a 37°C, 300 rpm. Posteriormente, a cultura foi centrifugada a 3000 x g, 25°C durante 20 min, o sobrenadante foi descartado, e a biomassa resultante foi lisada por ressuspensão em 19 mL de tampão AG (PBX 1X, NaCl 0,3 mol/L, imidazol a 20 mM) contendo 6 M de cloridrato de guanidina (GuHCl), eliminando a viscosidade do homogenato por breve sonicação para 30 com uma sonda apropriada. Após a clarificação do homogenato por centrifugação a 3000 x g, 25°C durante 45 min, o sobrenadante foi incubado durante 1 h a 25°C em um agitador de rotação lenta, com 0,3 mL de resina de agarose-ácido nitrilotriacético-Ni2+ (Ni-NTA agarose, Qiagen, Alemanha) e a pasta resultante foi empacotada por gravidade em uma coluna NAP-10 vazia (GE Healthcare, USA) e lavada consecutivamente com tampão AG contendo concentrações decrescentes de GuHCl (6 M a 1,2) e, finalmente, com tampão A (PBS 1X, NaCl 0,3 M, imidazol 20 mM). Em seguida, a proteína foi eluída com 0,9 mL de tampão E (PBS 1X, NaCl 0,3 M, imidazol 300 mM), e o eluato foi submetido imediatamente à troca de tampão para PBS 1X por filtração em gel em Sephadex G25 utilizando colunas PD-10 pré-empacotadas (Amersham, UK). A concentração de proteína total da preparação resultante foi determinada pelo método de ácido bicinconínico (BCA) (Smith, P. K. (1985). Anal. Biochem. 150 (1), 76 a 85), e a pureza foi avaliada por SDS-PAGE sob condições de redução (Laemmli, U. K. (1970). Nature 227 (259), 680 a 685), para assegurar que não há produtos de degradação presentes. A biblioteca de variantes DIIIE1PRS purificadas foi armazenada a -20°C até ser usada.

Ensaios de competição

[00228] A capacidade de cada mutante de alanina DIIIE1PRS para inibir a interação de DIIIE recombinante com α2M* foi analisada utilizando um formato de ELISA de competição. As placas foram revestidas com α2M* purificada e incubada com DIIIE1PRS biotinilado (DIIIE1PRSbiot) na presença de concentrações variadas de cada mutante de alanina DIIIE1PRS, então detectando DIIIE1PRSbiot ligado a α2M* com um conjugado de estreptavidina-peroxidase. Leituras de densidade óptica versus concentração foram ajustadas a uma curva de dose-resposta, utilizada para calcular o IC50 de cada mutante, bem como de DIIIE1PRS recombinantes de ocorrência natural.

[00229] Como observado na Figura 7, a substituição por alanina de qualquer um dos cinco resíduos (Lys361, Glu262, Pro264, Val365 e Lys385) do domínio III resulta em qualquer caso em um aumento de IC50 (diminuição da afinidade da interação) de mais uma ordem de magnitude. Tomando um aumento de 2 vezes no IC50 como um limite, as mutações para alanina de um total de 13 resíduos afetam a interação. Os resíduos deste grupo de 13, em adição aos cinco resíduos mencionados acima, são Glu342, Thr34, Arg350, Lys363, Asn366, Pro372, Gly374 e Glu375.

[00230] Estes resultados implicam que a ligação de DIIIE a α2M* envolve dois fragmentos superficiais independentes em DIIIE (Figuras 7 e 8): um localizado na sua superfície superior (onde o N-terminal é encontrado) e o outro na sua superfície inferior (uma voltada para o C- terminal). O fragmento superior contém os resíduos contribuindo mais para a interação, incluindo o grupo de cinco cuja substituição por alanina resulta em uma diminuição em afinidade de 10 vezes. Assim, este fragmento pode ser considerado um sítio primário para a interação entre DIIIE e α2M*. Seus resíduos essenciais são um segmento linear contíguo de Lys361-Asn366 e resíduo Lys385.

[00231] O segundo fragmento mencionado acima, localizado na superfície inferior de DIIIE (Figuras 7 e 8) é formado por resíduos Glu342, Thr346, Arg350, Pro372, Gly374 e Glu375. Substituir qualquer um destes resíduos por alanina produz uma diminuição menor na afinidade do que substituições similares em resíduos do fragmento superior; portanto, este fragmento inferior pode ser considerado um sítio de interação secundário.

[00232] Os resultados obtidos neste experimento abordaram mapear os sítios na superfície de DIIIE envolvido em sua interação com α2M* demonstram a solidez dos princípios seguidos para a concepção de peptídeos de grampo beta da presente invenção. Por exemplo, houve o cuidado de incluir resíduos de lisina que constituíam imitações estruturais/funcionais de Lys385 de DIIIE, e verifica-se que este é o resíduo contribuindo individualmente mais para a interação (sua mutação para alanina reduz a afinidade da interação em mais 22 vezes). Os resíduos de peptídeos que imitam este resíduo são: Lys8 em PHB2 e d-Lys8 em PHB5, Lys9 em PHB1, pHB6 e PHB7, Lys10 em PHB4 e Lys11 em PHB3, PHB8 e PHB9. Em outro exemplo, quatro dos peptídeos de grampo beta que mais potentemente inibem a interação de DIIIE com α2M* (PHB4, PHB5, PHB8 e PHB9, Figura 5, Exemplo 3) têm um resíduo que estruturalmente/funcionalmente imita Glu375 de DIIIE, que é o resíduo mais importante do sítio de ligação secundário determinado neste Exemplo. Os resíduos nos peptídeos de grampo beta que imitam Glu375 são Glu3 em PHB3, PHB4, PHB8 e PHB9, e Glu16 em PHB5 e pHB6. Em outras palavras, os peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção que inibem mais potencialmente a ligação de DIIIE para α2M* são aqueles que contêm, ao mesmo tempo, os dois resíduos mais importantes dos sítios de interação primário e secundário descritos neste Exemplo.

Exemplo 5. Formação de estruturas supramoleculares Cinética de agregação de peptídeo PHB4

[00233] A dispersão de luz foi usada para monitorar a agregação de peptídeo PHB4. As medições foram realizadas em um espectrofluorímetro Shimadzu RF-5301PC™ (Shimadzu, Japão), a aquisição de dados com o software fornecido pelo fabricante do instrumento. Os comprimentos de onda do feixe de luz incidente (excitação) e o detector (emissão) foram ajustados para 320 nm, utilizando-se aberturas de excitação e de emissão de 5 nm. A dispersão de luz devido ao peptídeo foi calculada subtraindo-se, a partir da intensidade da luz dispersa pelo peptídeo, a intensidade da luz dispersa por uma solução sem peptídeo (em branco). Variações na dispersão de luz devido à dissolução do peptídeo em PBS foram estudadas através da aquisição de dados no modo de curso de tempo, com uma frequência de medição de 1 ou 2 por segundo. As soluções de PHB4 em PBS foram preparadas pela mistura de uma parte de uma solução do peptídeo em água com uma parte de uma solução de PBS 2X.

[00234] Os dados adquiridos neste experimento revelaram que uma vez dissolvido em PBS, e depois de um período de latência menor do que 2 minutos, a intensidade da luz dispersa pelo peptídeo aumenta rapidamente durante os primeiros 30-40 min e, em seguida, continua a aumentar lentamente a uma taxa linear até 300 min, quando a medição terminou. A Figura 9 descreve o comportamento da razão da luz dispersa relativa à luz dispersa no tempo zeropara concentrações de peptídeo de 5 e 10 μM. Os perfis para ambas as concentrações são similares, embora o  máximo em 5 μM é maior (11 versus 7) do que em 10 μM, sugerindo que a agregação que ocorre em menores concentrações de peptídeo leva à formação de agregados de um tamanho médio maior em comparação com o tamanho médio original. Os gráficos foram preparados com SigmaPlot 10.0 (Systat Software Inc., USA).

Análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão da morfologia das estruturas supramoleculares formadas pelo peptídeo PHB4

[00235] De modo a analisar a morfologia dos agregados formados pelo PHB4 peptídeo, as soluções de peptídeos foram submetidas a diferentes tratamentos experimentais onde as condições tais como temperatura, tempo de incubação e a presença de eletrólitos, foram manipuladas para facilitar a agregação (Figura 10). Para este estudo particular, foram preparadas duas soluções de peptídeo (2 mg/ml, 0,73 mM), uma em água e a outra em PBS. A amostra foi então retirada de cada um, diretamente fixada em grades e observada sob o microscópio (amostras T0). O restante foi incubado durante 1 hora a 50°C e, em seguida, as amostras foram retiradas e fixadas imediatamente (amostras T1). O restante foi então incubado durante mais 2 horas em temperatura ambiente, e, em seguida, fixado (amostras T2).

[00236] Como observado na Figura 10A, quando dissolvido em água, o peptídeo forma particulados com um diâmetro de 5 a 20 nm em temperatura ambiente. Juntamente com os particulados, o tratamento a 50° C induz o aparecimento de estruturas filamentosas do tipo protofibrila/fibrila com um tamanho de 5 a 10 nm (Figura 10E). Há um período de latência para a formação de fibrilas em água, à medida que são detectadas na amostra T2 somente após o tratamento térmico. A formação de fibrilas é favorecida em forças iônicas mais elevadas (PBS), uma vez que estruturas filamentosas mais longas (520 nm) são formadas imediatamente após a dissolução do peptídeo em PBS (Figura 10B), que continuam a aumentar em número após o aquecimento da amostra durante 1 hora a 50°C (Figura 10D e 10F). Estes resultados demonstram que o aumento de temperatura e da força iônica favorece a agregação de peptídeo PHB4.

[00237] Além disso, o estudo indica claramente que o peptídeo PHB4 forma agregados supramoleculares cuja morfologia depende da composição do meio exata e da temperatura. As dimensões das estruturas fibrilares observadas são consistentes com as estruturas de tipo amiloide, que normalmente crescem como fibras alongadas através da formação de folhas beta estendidas.

[00238] O resultado dos processos de agregação de proteínas depende do equilíbrio exato entre a repulsão e atração entre as moléculas de proteína (Juárez, J., e outros (2009) Biophysical Journal 96 [6], 2353 a 2370). Sabe-se que a adição de eletrólitos a soluções de proteína frequentemente aumenta a taxa de formação de fibrilas, devido à blindagem de repulsões eletrostáticas entre as moléculas de proteína pelos ditos eletrólitos, que assim aponta o equilíbrio em direção a interações intermoleculares e, portanto, a formação de agregados (Juárez, J., e outros (2009) Biophysical Journal 96 [6], 2353 a 2370; Sagis, L. M., e outros (2004) Langmuir, 20, 924 a 927). A cinética do processo de interação intermolecular também é favorecida pela temperatura, que tem sido conhecida por desempenhar um papel fundamental na indução de agregação de proteínas.

Exemplo 6. Estudo da interação de peptídeos de grampo beta com um fragmento do receptor LRP1

[00239] Sabe-se que a infecção por DENV pode ser bloqueada por moléculas que interferem com a interação entre os vírions de DENV e o receptor de células conhecido como LRP1 (Huerta H. e outros, WO 2007/124698). LRP1 é uma proteína integral de membrana (Figura 11A) formada por uma cadeia α aproximadamente 500 kDa associada de forma não covalente a uma cadeia β de 85 kDa (Anna P. Lillis, e outros (2008) Physiol Rev 88: 887 a 918). A região extracelular deste receptor é formada pela cadeia α inteira e por parte da cadeia β, que contém um segmento transmembrana e dois motivos NPxY para interagir com proteínas intracelulares envolvidas na sinalização do receptor e endocitose. LRP1 é um receptor endocítico constitutivo que é capaz de internalizar mais de 30 diferentes ligantes, e revelou estar envolvido em um certo número de processos importantes, incluindo o metabolismo de lipídeos, hemostasia, a ativação de enzimas lisossômicas e neurotransmissão.

[00240] É a cadeia α de LRP1 que interage com ligantes LRP1 extracelulares. Esta cadeia exibe a arquitetura de domínio típico dos membros da família de receptores de lipoproteína de baixa densidade, à qual o LRP1 pertence. Especificamente, a cadeia α de LRP1 contém quatro grupos contendo 2 (grupo I), 8 (grupo II), 10 (grupo III) e 11 (grupo IV) sítios de ligação ao ligante estruturalmente relacionados com as regiões ricas em Cys de proteínas da cascata complementar. Depois de cada grupo de sítios de ligação ao ligante, há um domínio similar ao fator de crescimento epidérmico (EGF), formado por regiões ricas em Cys e domínios YWTD.

[00241] A fim de determinar se os domínios de ligação ao ligante de LRP1 interagem com DIIIE a partir de DENV, as proteínas DIIIE recombinantes foram preparadas a partir dos resíduos 289-399 da proteína E a partir de DENV1 cepa Jamaica/CV1636/1977 (DIIIE1J); resíduos 289-399 da proteína E de DENV2 cepa Jamaica 1409 (DIIIE2); os resíduos 287-397 da proteína E de DENV3 cepa H-87 (DIIIE3) e os resíduos 289-399 da proteína E de DENV4 cepa Dominica 814669 (DIIIE4), fusionados a um marcador de hexa- histidina C-terminal (SEQ ID NO: 19-22), como mostrado na Figura 11C. As proteínas DIIIE1J e DIIIE2- DIIIE4 foram obtidas por expressão heteróloga em E. coli e purificadas por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC), obtendo-se preparações com uma pureza superior a 90%, como evidenciado por análise de SDS-PAGE (Figura 11D).

[00242] Além disso, o experimento utilizou três proteínas recombinantes contendo grupos II, III ou IV de LRP1, denominados sLRP1-CII (SEQ ID NO: 23), sLRP1-CHI (SEQ ID NO: 24) e sLRP1- CIV (SEQ ID No: 25), respectivamente, fusionados à região constante de uma molécula de IgG1 humana (R & D Systems, USA) (Figura 11B).

[00243] A avaliação de interações DIII/LRP1 foi realizada com um ensaio ELISA, no qual placas de 96 cavidades foram revestidas com proteínas DIIIE1J ou DIIIE2-DIIIE4 em 10 μg/mL, em seguida, bloqueadas com albumina de soro bovino (BSA) e incubadas durante 1 hora a 37°C, ou com sLRP1 CII, sLRP1 CIII ou sLRP1 CIV a 10 μg/mL em 20 mM de HEPES pH 7,5/150 mM NaCl /1 mM de CaCl2/ Tween 20 a 0,05%. Após a lavagem, as placas foram então incubadas durante 1 hora a 37°C com uma diluição 1:1000 de um conjugado IgG- peroxidase anti-humano e desenvolvidas com o-fenilenodiamina/H2O2. Os dados obtidos revelaram um padrão semelhante de interações para DIIIE a partir de todos os quatro sorotipos, onde sLRP1-CIV exibiu a mais forte ligação seguida de sLRP1-CII enquanto sLRP1-CIII não mostrou ligação detectável a qualquer molécula de DIIIE (Figura 12).

[00244] A interação dos peptídeos de grampo beta com fragmentos solúveis do receptor de LRP1 foi estudada pela Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR), utilizando uma unidade Biacore X. Nesta técnica, um dos parceiros de interação a ser estudado é imobilizado na superfície de um chip, e o outro parceiro de interação é dissolvido em uma solução que corre através da célula de medição no topo da superfície de interação, sob condições de fluxo controlado. A associação e a dissociação de parceiros interagindo são medidas em unidades de ressonância (RU) e representadas graficamente, como uma função do tempo, em gráficos conhecidos como ‘sensorgramas’. SPR, portanto, permite que o experimentador obtenha informação detalhada sobre a interação sem ter que marcar qualquer parceiro de interação.

[00245] Neste exemplo, um canal de um chip CM5 (GE Healthcare, USA) foi utilizado para imobilizar a proteína sLRP1-CIV em sua superfície em uma densidade elevada (ver Tabela 6) e albumina de soro humano recombinante (rHSA, Sigma-Aldrich, USA) foi imobilizada no outro canal. Com base na densidade RU alcançada para cada molécula, e assumindo que há 11 potenciais sítios de interação para cada molécula sLRP1-CIV e um potencial sítio de interação para cada molécula de HSA, as superfícies em ambos os canais exibem assim uma densidade similar de sítios de ligação por unidade de área de superfície (pmol/mm2).Tabela 6. Resumo das características das superfícies de ligação no chip CM5 utilizadas para avaliar as interações com sLRP1-CIV

[00246] A reatividade da proteína imobilizada foi avaliada utilizando dois ligantes de LRP1conhecidos; ou seja, α2M e a proteína conhecida como proteína associada ao receptor (RAP). Foi previamente demonstrado que ambas as moléculas interagem com o grupo IV do receptor LRP1 (Jaap G. Neels, e outros (1999) Journal of Biological Chemistry, 274, 44: 31305 a 31311). A Figura 13 mostra os resultados dessa verificação. Como pode ser observado, o carregamento ou de α2M ou de RAP aumenta o sinal detectado (RU) no canal sLRP1-CIV, mas falha em produzir um aumento na intensidade do sinal no canal rHSA. Este resultado demonstra que o sLRP1-CIV imobilizado é capaz de estabelecer uma interação específica com ligantes.

[00247] Embora se tenha decidido imobilizar sLRP1-CIV em alta densidade, porque estas condições tornam mais fácil a detecção de quaisquer potenciais interações com os compostos cujo peso molecular é menor do que a das proteínas médias (tal como os peptídeos deste experimento que são destinados a serem estudados), deve ser ressaltado que em superfícies de alta densidade, limitações de transferência de massa e a possibilidade de ligação multivalente dificultam a determinação precisa de constantes cinéticas. Por isso, e de modo a caracterizar com mais detalhes a superfície de ligação sLRP1-CIV, diferentes diluições RAP (0,6-20 mM) foram carregadas, e RU foi registrado em condições de equilíbrio de interação (250 s, ver a Figura 13B). O comportamento exibido pela curva de RU máximo resultante versus concentração se encaixa bem em um modelo de sítio duplo, onde há uma interação de alta afinidade com um Kd de 4,2 nM e uma interação de baixa afinidade com um Kd de 1,1 μM. Estes dados são consistentes com outros resultados obtidos em diferentes estudos que analisam a ligação de RAP a LRP1, que indicam que RAP estabelece uma interação multipontos com os grupos II e IV de LRP1 com uma afinidade em 6-18 nm e que a perda de multivalência nesta interação leva a constantes de afinidade na faixa micromolar. Assim, neste experimento, a presença de uma interação cuja afinidade está na faixa micromolar pode ser explicado pela alta densidade de sLRP1- CIV imobilizado na superfície do chip, o que facilita a perda de interações multivalentes com altas concentrações de RAP. Os dados também indicam que sLRP1-CIV imobilizado reproduz fielmente as características previamente relatadas da interação LRP1-RAP.

[00248] A ligação dos peptídeos de grampo beta a sLRP1-CIV foi estudada através do carregamento de 20 μM em diluições em tampão de corrida das diferentes variantes de peptídeos no chip sLRP1-CIV caracterizado acima. A alta resistência dos sinais resultantes é consistente com a ligação do agregado, ao invés de formas monoméricas dos peptídeos. Portanto, as variações observadas entre os diferentes peptídeos podem refletir ou as diferenças na afinidade de interações de peptídeos unitárias ou diferenças em números de agregação e/ou geometrias que levam a variações no número de unidades de peptídeos capazes de engajar simultaneamente em moléculas sLRP1-CIV imobilizadas de uma maneira multivalente.

[00249] No caso de peptídeos da família HDIII3CL (peptídeos 10-14 na Tabela 1), a variante HDIII3CL2 exibe a ligação mais forte. Também há ligação específica detectável no caso de variantes HDIII3CLW e HDIII3CLK, embora a força da interação seja muito menor, o que sugere que a substituição de resíduos Trp17 e Lys14 tem um efeito prejudicial sobre a ligação a sLRP1-CIV. Há uma interação, no máximo, marginal, no caso da variante HDIII3CLC, indicando que a substituição de resíduos C1 e C18 (em outras palavras, a eliminação da ponte dissulfeto) afeta drasticamente a força da interação do peptídeo com sLRP1-CIV. Este resultado é consistente com os dados anteriores sobre a potência da atividade antiviral exibida pelos peptídeos, HDIII3CLC, HDIII3CLW e HDIII3CLK, cuja ligação a sLRP1-CIV é diminuída em relação a HDIII3CL, não exibiu atividade antiviral in vitro contra DENV2 em células Vero (ver Tabela 2). Por outro lado, a ligação mais forte a sLRP1-CIV exibida por HDIII3CL2 não se traduz em uma atividade antiviral mais potente em comparação com HDIII3CL (ver Tabela 2), indicando que a ligação ao receptor por si só é necessária, mas não suficiente para a atividade antiviral. Uma possível explicação para essa conclusão é que há uma fração de HDIII3CL2 que se liga a sítios em sLRP1-CIV que não desempenham um papel relevante na interação vírus-receptor e/ou que é uma ligação com uma afinidade muito baixa; uma suposição razoável tendo em conta a arquitetura multidomínios de receptor LRP1 e seus agrupamentos. A diferença entre os peptídeos HDIII3CL2 e HDIII3CL é que o primeiro tem uma lisina C-terminal adicional e tem, por conseguinte, um carácter catiônico mais forte, o que pode facilitar interações eletrostáticas adicionais com o receptor LRP1 carregado negativamente. Além disso, deve salientar-se que Lys21 não faz parte do grampo, que é a região topológica que imita o fragmento funcional em DIIIE descrito anteriormente (Huerta V. e outros, documento WO 2007/124698) e nesta invenção.

[00250] O mesmo procedimento foi seguido para avaliar a interação dos peptídeos de grampo beta PHB1, PHB2, PHB3, PHB4, PHB5, PHB8 e PHB9 com a superfície de sLRP1-CIV. Como mostrado nas Figuras 14B e 14D, o peptídeo PHB4, que em ensaios anteriores foi o peptídeo antiviral mais potente desta série, também exibiu a ligação mais forte por SPR a sLRP1-CIV. Os peptídeos PHB2, PHB4 e PHB9 também exibiram ligação máxima acima do peptídeo HDIII3CL (Figuras 14A e 14C), em correspondência com a sua atividade antiviral in vitro. Uma comparação da ligação dos peptídeos do mesmo tamanho e tipo de volta beta (PHB1-2, PHB3-4 e PHB8-9) mostra que os peptídeos PHB2, PHB4 e PHB9 são ligantes melhores do que suas contrapartes (PHB1, PHB3 e PHB8), em paralelo com o seu comportamento nos ensaios de atividade antiviral (ver Exemplo 2).

Exemplo 7. A correlação entre a atividade antiviral dos peptídeos de grampo beta e sua ligação ao receptor LRP1 e proteína α2M*

[00251] O receptor LRP1 foi anteriormente proposto como o receptor endocítico putativo para DENV, e um papel ‘ponte’ ou ‘transportador’ foi atribuído às proteínas α2M* (um ligante de LRP1) no processo de entrada de vírus nas células (Huerta V. e outros, WO 2007/124698).

[00252] O exemplo anterior (Exemplo 6) demonstrou que os peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção podem ligar-se a um fragmento de receptor LRP1. O presente exemplo, por sua vez, examina a atividade antiviral observada no Exemplo 2 correlaciona-se quantitativamente com a capacidade destes peptídeos de se ligarem ao receptor LRP1. Como pode ser observado na Figura 15, o logaritmo dos valores de IC50 (-pIC50) da atividade antiviral dos peptídeos em células Vero exibe uma dependência linear sobre o valor dos sinais de Biacore observados com comprimentos de 400 s (RUrem). Neste caso, apenas os peptídeos de PHB que partilham a mesma topologia, de acordo com a Tabela 1, são mostrados. Não somente a potência da atividade antiviral do peptídeo PHB4 é muito maior do que o resto, mas o peptídeo PHB4 supera consideravelmente os outros em termos de ligação a LRP1. A linearidade da relação observada acima permanece constante mesmo se os dados PHB4 são excluídos (inserção na Figura 15), à medida que o coeficiente de regressão linear (R2) é de 0,99 com os dados PHB4 e 0,97 sem eles. Analisando os dados de inserção, uma predição que pode ser feita, a dependência linear deveria ser mantida para PHB4, os valores de ligação de Biacore corresponderiam a uma potência antiviral na faixa nanomolar, que é consistente com a potência experimentalmente determinada no Exemplo 2.

[00253] Os dados de pIC50 para a atividade antiviral de peptídeos com uma topologia comum exibem uma correlação estatisticamente significativa com os valores RUrem (r(Pearson) = - 0,9957 e P <0,0001). Se os dados de peptídeo PHB4 são excluídos, os valores do coeficiente de correlação de Pearson permanecem similares (r(Pearson) = - 0,9868, P = 0,0018). As análises de correlação, regressão linear e os gráficos foram preparados com Prisma v5.03 (GraphPad Software Inc., USA).

[00254] Estes resultados são consistentes com um mecanismo de ação antiviral onde os peptídeos PHB perturbam a interação entre os vírions e o receptor de LRP1, levando à inibição da entrada do vírus produtiva nas células.

[00255] Uma análise similar foi efetuada em relação à capacidade de peptídeos PHB de inibir a ligação de DIIIE à proteína α2M* na faixa submicromolar/nanomolar. Como mostrado no Exemplo 3, nessa faixa de concentração, os peptídeos inibiram parcialmente a ligação de DIIIE1J biotinilado (DIIIE1Jbiot) a α2M*, com peptídeos PHB2, PHB4,PHB5, PHB8 e PHB9 exibindo melhores porcentagens de inibição (1,5 a 3 vezes) do que DIIIE1J independentemente. Neste caso, a capacidade inibidora dos peptídeos (em relação à capacidade de DIIIE1J recombinante de inibir a ligação de DIIIE1Jbiot a α2M*) também se correlaciona com a sua atividade antiviral contra DENV2 em células Vero, como mostrado na Figura 16. O coeficiente de correlação de Spearman entre os valores de IC50 e a porcentagem de inibição de α2M* (em relação à porcentagem de inibição de DIIIE1J recombinante) é Rs = -0,9762, P = 0,0004; um resultado que sugere que os peptídeos de grampo beta descritos na presente invenção podem interferir no papel desempenhado pela proteína α2M* durante a entrada do vírus nas células.

Exemplo 8. Efeito de agentes que afetam a agregação da atividade antiviral do peptídeo PHB4

[00256] A atividade antiviral do peptídeo PHB4 foi avaliada após tratamentos que facilitam a sua agregação ou na presença de diferentes agentes que modulam a agregação, com o objetivo de examinar o seu efeito sobre a atividade inibidora deste peptídeo para a infecção de células Huh7.5 com DENV2 cepa S16803. Huh7.5, uma linhagem de células derivadas de hepatoma humano, foi selecionada não somente porque é permissiva para DENV2, mas por causa de sua relevância como um sistema experimental a partir do ponto de vista da patogênese de DENV (Lin YL, e outros (2000) J Med Virol.; 60 (4): 425 a 431).

[00257] Com base nos resultados apresentados no Exemplo 5, o que prova que as alterações na força iônica resulta em alterações no tamanho e na morfologia de agregados de peptídeos, um experimento foi concebido no qual, começando a partir de uma solução concentrada de PHB4 em água, o peptídeo foi dissolvido ou em (i) meio MEM ou em (ii) PBS (contendo respectivamente 6,8 g/L e 8,0 g/L de NaCl, e com o pH ajustado para 7,4) e submetido a diferentes condições a serem avaliadas.

[00258] A atividade antiviral foi avaliada em ensaios de rendimento de vírus, em que 80-90% de monocamadas confluentes Huh7.5 foram lavadas duas vezes com DMEM não suplementado e, em seguida, infectadas a um m.o.i de 0,01 durante 2 h a 37°C e CO2 a 5%, na presença das diferentes preparações de peptídeos, após o que o inóculo viral foi removido por lavagem com DMEM não suplementado, e as células foram cultivadas em DMEM suplementado com FBS a 2%. Os sobrenadantes celulares foram coletados em 24 h p.i., e os rendimentos de vírus foram determinados por titulação do sobrenadante em um ensaio de formação de plaque (Morens D. M., e outros (1985) N. J. Clin. Microbiologia; 22: 250 a 254).

[00259] Sabe-se que a temperatura influencia significativamente a agregação, ou auto-aglutinação de peptídeos em estruturas supramoleculares (Sabaté R, e outrros (2012) Biomacromolecules; 13 (2): 474 a 483). Por conseguinte, uma primeira série de ensaios foi definida acima em que, a partir de uma solução a 20 μM do peptídeo em água, diluições foram preparadas em MEM abrangendo a faixa de concentrações de 10 a 0,01 μM, que foram então incubadas em paralelo de 10°C e 37°C durante 2 horas e em seguida utilizadas em um ensaio de inibição viral. Diluições de peptídeos não incubados (isto é, preparadas imediatamente antes do ensaio de inibição viral) foram utilizadas como controles.

[00260] Os resultados mostram que o peptídeo não incubado, dissolvido em meio MEM, infecção viral inibida de uma forma dose- dependente, com um IC50 de 0,16 μM e um IC100 de 10 μM (Figura 17, Tabela 7). No entanto, a pré-incubação do peptídeo em MEM a 10° C produziu um aumento acentuado na potência, à medida que IC50 caiu para 0,037 μM, enquanto a incubação a 37° C produziu o efeito oposto, à medida que seu IC50 aumentou para 0,89 μM. Os resultados indicam que a temperatura tem um papel decisivo no processo de agregação de peptídeos, como neste experimento preliminar, produziram variações na potência de no máximo 24 vezes.Tabela 7. IC50 para peptídeo PHB4 incubado a 10°C ou 37°C.IC50 para cada condição experimental foi determinado a partir de ajustes não lineares dos dados, executados usando Prisma v5.03. *O número em parênteses é o valor do coeficiente de regressão para o ajuste (R2).

[00261] Um segundo experimento foi concebido para determinar a influência do tempo de agregação na potência antiviral do peptídeo PHB4 (Figura 18). Neste experimento, o peptídeo foi incubado em PBS durante intervalos diferentes, e, em seguida, diluído em um volume de 80 mg/mL de HSA em DMEM com a finalidade de parar o processo de agregação (HSA é um potente modulador de agregação que revelou inibir tanto a nucleação inicial quanto o crescimento de fibrilas de peptídeos β amiloide, ver Reyes A., e outros (2009) Journal of Biological Engineering, 3:5) antes de avaliar a atividade antiviral da mistura resultante. Esta incubação com HSA foi realizada em paralelo ou em 10°C ou em 37°C (Figura 18), e as diluições adicionais dessas amostras de peptídeos para avaliar sua atividade antiviral foram realizadas em soluções de 40 mg/mL de HSA em DMEM.

[00262] Como mostrado na Figura 19, sob as condições do ensaio, os valores de atividade antiviral do peptídeo produziram uma curva de dose-resposta em forma de sino que indica a existência de uma faixa ótima de concentrações de peptídeo para a sua atividade inibidora. Este tipo de resposta é geralmente visto na atividade de muitos sistemas biológicos diferentes, e embora não haja um único mecanismo de ação subjacente a este comportamento, um elemento comum em todos os casos é a existência de interações multivalentes entre as moléculas.

[00263] Os resultados evidenciam que a atividade inibidora do peptídeo é sensível à duração do período de incubação em PBS para a formação de agregados de maior potência, onde a potência é entendida, neste caso, como a menor concentração de peptídeo que diminui em 50% o rendimento viral do controle de infecção para o ensaio. Por outro lado, a incubação com HSA a 10°C leva à formação de variantes de menor potência, em comparação com os resultados obtidos por incubação a 37°C. Isto confirma que existe provavelmente uma interação entre o peptídeo, ou agregados ainda crescentes dos mesmos, com HSA, onde o curso do processo de agregação é alterado, levando à formação de variantes de alta potência, tais como as obtidas por incubação durante 45 a 60 min. Em PBS e, em seguida, a incubação com HSA a 37°C, que pode produzir a inibição total da infecção por DENV neste formato de ensaio em concentrações de peptídeo de no mínimo 1 nM-10 pM.

[00264] A concentração de partida do peptídeo é outro parâmetro que pode influenciar a cinética e os resultados finais do processo de agregação de forma significativa. A fim de dissecar como este parâmetro influencia na atividade antiviral do peptídeo PHB4, um ensaio foi configurado (representado esquematicamente na Figura 20) no qual as soluções do peptídeo em água em concentrações que variam de 100 μM a 2 μM foram diluídas com um volume de MEM 2x e incubadas durante 2 h a 25°C, após o qual as diluições em meio DMEM não suplementado foram preparadas e ensaiadas quanto à atividade antiviral.

[00265] Os resultados demonstram que existe uma relação entre a atividade antiviral e a concentração inicial de peptídeo PHB4 em água antes da sua adição a uma solução de força iônica mais elevada para desencadear o processo de crescimento de agregados (Figura 21). Além disso, os dados também evidenciam uma mudança no comportamento de dose-resposta, confirmando uma evolução em direção a estruturas de agregados que são diferentes, dependendo das condições iniciais da dissolução do peptídeo em água. As formas mais potentes mostram novamente uma curva de dose-resposta em forma de sino, e são obtidas para uma condição em que o peptídeo foi encontrado na maior diluição inicial em água avaliada neste ensaio.

[00266] Ao todo, os resultados evidenciam que o peptídeo PHB4 pode se agrupar em formas agregadas com uma potência antiviral na faixa nanomolar/subnanomolar, dependendo das condições de agregação. Dever-se-ia salientar que o ensaio de atividade antiviral utilizado nestes experimentos é um dos testes mais rigorosos para este propósito, à medida que a molécula sob avaliação está presente apenas durante o estágio inicial da infecção e é posteriormente removida durante as subsequentes lavagens da monocamada de células. Portanto, o fato de que a atividade antiviral foi detectável com esta configuração experimental é consistente com um mecanismo de ação para o peptídeo PHB4 pelo fato de que inibe um dos estágios precoces da entrada viral na célula; ou seja, ligação à superfície da célula, internalização ou fusão de membrana.

Exemplo 9. Proteção em um modelo animal de infecção viral

[00267] Um experimento foi conduzido para avaliar a atividade antiviral in vivo do peptídeo PHB4 e compará-la à do peptídeo HDIII3CL. Para este fim, grupos de 12 camundongos Balb/c adultos (20 g de peso corporal médio) foram anestesiados por inalação de éter e inoculados por via intracraniana com 20 μl de preparações virais contendo 10 vezes a dose letal média desse modelo e do peptídeo a ser avaliado. Os animais se recuperaram rapidamente e já pareceram alertas cinco minutos após o tratamento, e depois foram monitorados durante 21 dias. Os dados foram avaliados utilizando o teste de classificação logarítmica Kaplan-Meier.

[00268] A Tabela 8 contém os resultados dos experimentos realizados com os quatro sorotipos de DENV. Na dose ensaiada, o peptídeo PHB4 oferece proteção total aos camundongos, e por isso é mais potente que o peptídeo HDIII3CL. No caso da cepa DENV2, o experimento foi repetido três vezes.Tabela 8. Sumário dos resultados dos ensaios de proteção in vivoSignificância estatística: ***, P < 0,005; **, P< 0,01, * P<0,05. ND, não determinado a: A dose letal para a cepa DENV3 usada nesse ensaio poderia não ser determinada. Então, a morbidez foi avaliada ao invés monitorando os camundongos quanto ao aparecimento dos seguintes sintomas: pele arrepiada, paralisia de membros, e postura curvada, e os camundongos que mostram estes sinais foram sacrificados. Pele arrepiada, postura arqueada, prostração, e paralisia dos membros traseiros; e para a sua duração em dias.

[00269] Exemplo 10. Fusão de peptídeo PHB4 a marcadores de poli-histidina para montagem em nanopartículas à base de metal

[00270] Salientou-se anteriormente que os peptídeos de grampo beta descritos pela presente invenção podem ser produzidos, utilizando síntese química ou tecnologia de DNA recombinante, isoladamente ou fusionado à outra proteína/peptídeos. Além disso, foi demonstrado no Exemplo 5 que os peptídeos de grampo beta descritos pela presente invenção podem se agregar e adotar diferentes estruturas quaternárias, dependendo da concentração de peptídeo de partida, tipo de solvente e as condições experimentais, tais como temperatura, pH, força iônica, sonicação, presença de aditivos, ligação não covalente a proteínas tais como HSA, etc. A formação destas estruturas supramoleculares aumenta consideravelmente a atividade antiviral do peptídeo de grampo beta (ver Exemplo 8), provavelmente devido ao fato de que a avidez das interações de nanopartículas à base de peptídeo com o seu receptor putativo é muito maior devido à ligação multivalente (interação simultânea de vários monômeros na mesma nanopartícula com vários domínios de ligação ao ligante no receptor, ou com mais do que um receptor na superfície da célula). Além disso, a formação de nanopartículas pode contribuir positivamente para as propriedades farmacocinéticas do peptídeo, aumentando a sua meia vida em soro, conferindo resistência a proteases de soro, etc.

[00271] As nanopartículas que os peptídeos de grampo beta descritos pela presente invenção têm mostrado formar podem ser ainda mais estabilizadas fusionando os ditos peptídeos a grupos ‘aceptores’ (A), que se podem ligar-se de forma não covalente a moléculas ou átomos ‘espaçadores’ (e), com uma estequiometria de dois ou mais grupos ‘A’ para cada grupo ‘E’. Tal modelo permitiria a associação de dois ou mais peptídeos PHB com um único espaçador ‘E’. Em uma modalidade da presente invenção, anexou-se assim, via a síntese química, um marcador que consiste em cinco resíduos de histidina ao peptídeo PHB4 (Figura 22). Os marcadores de poli- histidina podem funcionar como grupos ‘A’ de íons metálicos polivalentes, tais como Zn (II), Cu (II), Cu (II), Cs, etc. Neste caso, o grupo de átomos de imidazol que constitui a cadeia lateral do resíduo de histidina estabelece ligações coordenadas ao íon de metal com uma estequiometria de até quatro grupos de imidazol por íon de metal. Em certas concentrações, por conseguinte, os íons de metal ligados à poli-histidina podem atuar como grupos E e promover a dimerização do peptídeo.

[00272] A Figura 23 representa esquematicamente como os íons de metal podem ser usados para ligar em conjunto, ou direta ou indiretamente, peptídeos diferentes contendo grupos imidazol disponíveis, por meio de coordenação de grupos quelantes auxiliares, tais como os compostos tetra-aniônicos de EGTA (etileno glicol-bis (2- aminoetiléter) -N,N,N’,N’-tetra-acético) e EDTA (ácido 2 - ({2- [bis (carboximetil) amino] etil} (carboximetil) amino) acético). Nestes casos, os íons de metal formam complexos EGTA(Me)2 e EDTA(Me)2 com uma estequiometria de dois átomos de metal por molécula de ácido diaminotetracarboxílico, em que os ditos íons de metal podem ainda formar ligações coordenadas com grupos imidazol adicionais, agindo assim como grupos ‘E’ que podem estabilizar a reticulação dos peptídeos e seus agregados (Figura 23).

[00273] A Figura 22 representa duas das moléculas de fusão descritas pela presente invenção; uma na qual o marcador de poli- histidina está associado ao peptídeo PHB4 através de uma ligação amida C-terminal (PHB4H5) e outra em que o marcador é acrescentado no N-terminal ao peptídeo de uma forma similar (H5PHB4). Ambos os peptídeos de fusão foram sintetizados e purificados seguindo os procedimentos anteriormente descritos no Exemplo 1, e utilizados para preparar soluções de 200 μM de cada peptídeo em 10 mM MES pH 6,8-7,5 contendo ou 2 mM ZnCl2 (que fornece o íon de metal) ou 2 mM de um complexo EGTA (Zn2), previamente obtido através da adição de ZnCl2 em uma concentração final de 8 mM a uma solução de 4 mM EGTA.

[00274] Estas preparações de peptídeos (PHB4H5 e H5PHB4, ou isoladamente ou em complexos, ou com Zn ou EGTA (Zn2)) foram então testadas quanto à atividade antiviral contra DENV2 (cepa M2C) em células Vero. Resumidamente, as células foram incubadas durante 1 h a 37° C na presença das preparações de peptídeos, e, em seguida, o inóculo viral foi adicionado em um m.o.i. de 0,001. Duas horas mais tarde, adicionou-se uma camada de meio de alta densidade e as placas foram incubadas durante 3 dias a 37° C, CO2 a 5%. As células incubadas apenas com soluções de ZnCl2 e EGTA(Zn2) nas concentrações correspondentes antes do desafio viral foram utilizadas como controles negativos. As placas virais foram detectadas utilizando uma técnica immunofoci com um anticorpo monoclonal específico para o envelope viral, e as porcentagens de inibição foram calculadas com a seguinte expressão:

[00275] Onde I representa a porcentagem de inibição e NP o número de placas virais, na média através das réplicas.

[00276] Como pode ser observado na Figura 24, embora os peptídeos de fusão (isoladamente, sem aditivos metálicos) sejam altamente inibidores em uma concentração de 20 μM (porcentagens de inibição próximas de 100%), a atividade antiviral desaparece em concentrações de peptídeos ou de 4 ou de 0,16 μM. Nessas concentrações, no entanto, os complexos dos peptídeos com o espaçador EGTA(Zn2) exibem ainda atividade antiviral na gama de 5070% de inibição. O peptídeo H5PHB4 apresenta uma porcentagem de inibição de 33% em 0,16 μM.

[00277] Estes resultados demonstram que as fusões do peptídeo PHB4 a marcadores de poli-histidina exibem atividade antiviral mais potente quando complexados com agentes espaçadores, particularmente ao espaçador EGTA(Zn2).

Claims (7)

1. Peptídeo de grampo beta exibindo atividade antiviral contra o vírus da Dengue, caracterizado pelo fato de que apresenta uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 9.

2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais peptídeos, como definidos na reivindicação 1, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a dita composição contém albumina de soro humano.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que os ditos peptídeos estão formando agregados supramoleculares.

5. Uso de peptídeos, como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento é para tratar infecções pelo vírus da Dengue (DENV).

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento para o tratamento de infecções pelo DENV compreende a administração de um ou mais dos peptídeos como definidos na reivindicação 1, ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos peptídeos como definidos na reivindicação 1.