JP2024505203A - Ａｃｅ２受容体エクトドメイン融合分子及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和し、且つＡＣＥ２酵素活性を提供することが可能なポリペプチド、並びにコロナウイルス感染（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する障害及び付随する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び主要臓器傷害を治療するためのこれらのポリペプチドの使用、並びにそのような分子の作製方法に関する。【選択図】 図１

Description

［発明の分野］
本発明は、ヒトＡＣＥ２受容体エクトドメイン融合分子及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、ヒトＩｇＧ１抗体フレームワークの構造的エレメントを含むヒトＡＣＥ２受容体触媒ドメインのタンパク質融合バリアント並びにコロナウイルス感染（ＣＯＶＩＤ－１９）及び付随する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の低減におけるその使用に関する。

［発明の背景］
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックは、前例のない重大性の全世界的な医療危機として続いている。可能性のあるワクチンの臨床試験が進行中であるが、広範囲の集団のワクチン接種の安全性及び有効性に関して、不確実性が存在する。ＣＯＶＩＤ－１９感染に対する生物学的治療剤は絶対的に不足しており、現行の戦略は患者転帰に対して若干の影響を有するのみである。これに関して、敗血性ショック、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び急性腎傷害（ＡＫＩ）をはじめとするＣＯＶＩＤ－１９の重症合併症のうちの多数が、特にレニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）内での宿主応答により、少なくとも部分的に媒介される［１～３］。重要なことに、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞侵入を媒介する形質膜タンパク質であるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と直接的に相互作用する［４～６］。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、ウイルス複製に必要な中心的ステップとしての宿主細胞への接着及び内在化のために、そのスパイクタンパク質を利用する。それ故、スパイクタンパク質は、有望な抗ＣＯＶＩＤ－１９生物学的治療剤、ワクチン及び診断薬の開発のための主要な分子標的となっている。その融合前状態にあるスパイクタンパク質三量体は、スパイクタンパク質の受容体結合性ドメイン（ＲＢＤ）が、宿主細胞上のＡＣＥ２受容体と直接的に相互作用することを可能にする。このパンデミックの発生から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヒト受容体ＡＣＥ２に関連して、スパイクタンパク質の構造及び機能について多くのことが学ばれてきた。この理解のうちの一部は、この疾患に対する生物学的治療剤を開発することを目的とする数種類のアプローチをもたらした。これらの多数のアプローチのうちで、ウイルス侵入を遮断するための２種類の主な方向性は、中和性モノクローナル抗体による、及びＡＣＥ２受容体デコイによるスパイクタンパク質に対する結合性を含む。まさにウイルス侵入遮断の観点から、抗体の主な不利益は、新たに出現するウイルス株に対する低下した有効性のリスクであるが［７］、ヒトＡＣＥ２に基づく受容体デコイは、原理上は、堅牢な汎特異性プロフィールを保有するはずである。

アンジオテンシン（Ａｎｇ）ＩＩは、炎症性作用及び凝固促進性作用を有する強力な血管収縮剤である。ＡＣＥ２は、Ａｎｇ－ＩＩを、Ａｎｇ－ＩＩに対する血管拡張性拮抗ペプチドであるＡｎｇ－（１－７）へと変換するモノカルボキシペプチダーゼである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、肺及び冠動脈微小血管血栓症及び凝固を増加させ（増加したＤ－ダイマー）、これが増加したＣＯＶＩＤ－１９死亡率と関連する［８、９］。呼吸器ウイルスＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１と同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＡＣＥ２に結合し且つＡＣＥ２を阻害し［４～６］、したがって、ＡＣＥ２は、ＣＯＶＩＤ－１９感染を有する患者における潜在的なバイオマーカー及び治療標的である。ＡＣＥ２は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、及びＳＡＲＳにおいて下方調節され、これにより増加したＡｎｇ－ＩＩレベル、及び悪化した肺傷害がもたらされる［１０、１１］。つまり、レニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）の局所的活性化は、ＣＯＶＩＤ－１９においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する肺、心臓及び他の臓器の傷害応答を媒介し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２において局所的な組織ＡＣＥ２活性を増加させるための戦略は、したがって、Ａｎｇ－ＩＩ（有害）を低減させ、且つＡｎｇ－（１－７）（保護的）を強化することにより、細胞傷害を軽減することができるであろう。それ故、このウイルスに対するＡＣＥ２に基づくデコイは、宿主細胞へのウイルス侵入を中和する可能性を有するだけでなく、二重の作用機序を介して、Ａｎｇ－ＩＩからＡｎｇ－（１－７）への酵素的変換をもたらし、それにより、保護的ＲＡＳ経路を復旧し、且つＡＲＤＳを軽減することに推移する。

数件の研究は、その酵素活性を保持するか又は保持しない、単独又はヒト抗体のＦｃ領域に融合されたヒトＡＣＥ２エクトドメインを用いることに焦点を当てた［１２～１５］。しかしながら、複数因子最適化を目的とする革新的な分子操作が、臨床効率及び大規模製造可能性を有するＡＣＥ２に基づく生物学的治療剤を開発するために必要である。Ａｎｇ－ＩＩ変換のＡＣＥ２酵素活性を提供しながら、より効果的なウイルス中和をもたらすＡＣＥ２に基づくデコイに対する必要性が残っている。

［発明の概要］
本発明は、改善されたＡＣＥ２に基づくデコイを提供する。本技術分野における他のアプローチとは異なり、本発明者らは、ヒト集団中に広範囲に存在するより一般的なＡＣＥ２受容体において通常はトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基が見出される９２位にイソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基を保有する、ヒトＡＣＥ２受容体の天然バリアントに注目してきた。本発明者らは、本発明の経過中に、本明細書中でｈＡＣＥ２Ｉ９２と称されるこの天然に存在するヒトバリアントの構造的及び機能的エレメントを利用することが、ＡＣＥ２に基づくデコイの数種類の特性を改善し、そのうちで上述の二重の作用機序に対して最も重要なのは、改善された触媒活性及び改善されたウイルス中和であることを発見した。複数の側面を有する分子設計の試みにおける出発点としてＡＣＥ２Ｉ９２を用いて、本発明者らは、ここで、（ａ）ウイルス感染の効率的な中和のためのスパイクタンパク質に対する強い結合アビディティ及び親和性、（ｂ）低減したＡＲＤＳのための高い酵素活性、並びに（ｃ）改善された生物学的製造可能性を保有し、一方で、（ｄ）抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を予防しながらウイルスクリアランスを可能にするための適切な薬物動態、並びに（ｅ）新たに出現するウイルス株及び将来のパンデミックに対する保護に対する構造的成分をもたらす、ポリペプチド構築物のクラスを提供する。

したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和し且つＡｎｇ－ＩＩをＡｎｇ－（１－７）へと変換することが可能なポリペプチド構築物であって、４つの領域を含み且つ一般式：
Ｒ１［ｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０］－Ｒ２－Ｒ３［ヒンジＳ^２２０，Ｘ^２２６，Ｘ^２２９］－Ｒ４［Ｃ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３］
を有し、
式中、ｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０と表されるＲ１は、残基Ｘ^２７、Ｘ^２６１及びＸ^３３０を含むヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）受容体触媒ドメイン残基１８～６１４の天然に存在するバリアントＩｌｅ９２（Ｉ９２）を含むＮ末端の第１領域であり、Ｘ^２７はＴｈｒ又はＴｙｒのいずれかである２７位のアミノ酸残基であり、Ｘ^２６１はＣｙｓ又はＳｅｒのいずれかである２６１位のアミノ酸残基であり、且つＸ^３３０はＡｓｎ又はＴｙｒのいずれかである３３０位のアミノ酸残基であり；Ｒ２は、柔軟性ペプチドスペーサーを含む第２領域であり；Ｒ３は、ヒトＩｇＧ１重鎖抗体のヒンジ領域を含む第３領域であり、前記ヒンジ領域は、残基Ｓ^２２０、Ｘ^２２６及びＸ^２２９を含み；ヒトＩｇＧ１ヒンジ２２０位のアミノ酸残基はＳｅｒであり、且つヒトＩｇＧ１ヒンジ２２６位及び２２９位のアミノ酸残基はＣｙｓ又はＳｅｒのいずれかであり；且つＲ４は、ポリペプチドのＣ末端の第４の領域であり、Ｒ４は、Ｃ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３と示されてこれを含み、且つヒトＩｇＧ１抗体重鎖の第２定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２）及び第３定常ドメイン（Ｃ_Ｈ３）を含み、ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ２ドメイン中の２７０位のアミノ酸残基はグリシンである、ポリペプチド構築物が提供される。

実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ２スペーサー領域は、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基を含む柔軟性ペプチドスペーサーを含む。

実施形態では、ポリペプチド構築物は、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する。

実施形態では、ポリペプチド構築物は、組み換えヒトＡＣＥ２の、触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）の少なくとも３０％及び比活性の少なくとも６０％を保持する。

実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び／又は配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７に対して少なくとも９０％同一であるいずれかの配列からなる群より選択される配列を含む。

実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ２は、配列番号８、配列番号９、及び／又は配列番号８、配列番号９に対して少なくとも９０％同一であるいずれかの配列からなる群より選択される配列を含む。

実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ３は、配列番号１１、配列番号１２、及び／又は配列番号１１、配列番号１２に対して少なくとも９０％同一であるいずれかの配列からなる群より選択される配列を含む。

実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ４は、配列番号１４を有する配列、又は配列番号１４に対して少なくとも９０％同一である配列を含む。

実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８に対して少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む。

実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、二量体ポリペプチドである。実施形態では、二量体ポリペプチドは、ジスルフィド架橋によりそれぞれのＲ３ヒンジ領域を介して、連結され得るか、又は二量体化し得る。

別の実施形態は、本明細書中に記載されるいずれかのポリペプチド構築物をコードする核酸分子である。本発明はまた、ポリペプチドを生成するための発現ベクターであって、本明細書中に記載されるいずれかのポリペプチド構築物をコードする核酸分子を含む、発現ベクターも提供する。実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、選択された発現宿主により分泌可能である形態にある。

別の実施形態は、本明細書中に記載されるポリペプチド構築物及び薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物である。

別の実施形態では、本明細書中に記載されるいずれかのポリペプチド構築物をコードする核酸分子、又は本発明のいずれかのポリペプチド構築物を生成するための発現ベクターを含むトランスジェニック細胞宿主が提供される。

別の実施形態では、トランスジェニック細胞宿主は、第１のポリペプチド構築物と同じ第２のポリペプチド構築物をコードする第２の核酸分子又は第２のベクターをさらに含む。

別の実施形態は、提供されるトランスジェニック細胞宿主を培養するステップ、及び本発明に従う二量体ポリペプチド構築物を、当該宿主の増殖により馴化された培地から回収するステップを含む、二量体ポリペプチドを生成するための方法である。

別の実施形態は、医学的状態、疾患又は障害の治療のための、本明細書中に記載されるポリペプチド構築物の使用である。実施形態では、医学的状態、疾患又は障害は、ＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス感染、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）並びに肺、心臓、腎臓、脳及び腸などの関連する主要臓器不全を含む。

本明細書中に記載される通り、本発明のポリペプチド構築物のクラスは、４つの領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４を含む（図１）。これらのポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和してＣＯＶＩＤ－１９を治療するために、並びにＡｎｇ－ＩＩをＡｎｇ－（１－７）へと変換してＡＲＤＳを治療するために有用である。本発明のポリペプチドは、一般式：
Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４
を有し、式中、Ｒ１はｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０を含み、Ｘ^２７はＴｈｒ又はＴｙｒであり、Ｘ^２６１はＣｙｓ又はＳｅｒであり、Ｘ^３３０はＡｓｎ又はＴｙｒであり；
Ｒ２は、スペーサー又はリンカーを含み；
Ｒ３は、ヒンジＳ^２２０，Ｘ^２２６，Ｘ^２２９を含み；Ｘ^２２６及びＸ^２２９はＣｙｓ又はＳｅｒであり；且つ
Ｒ４はＣ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３を含む。

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、一般式：
Ｒ１［ｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０］－Ｒ２［スペーサー］－Ｒ３［ヒンジＳ^２２０，Ｘ^２２６，Ｘ^２２９］－Ｒ４［Ｃ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３］
を有するポリペプチドを含む。

ｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２１６，Ｘ^３３０と表される領域Ｒ１は、ヒトアンジオテンシン変換酵素２の天然に存在するバリアントＩｌｅ９２（ｈＡＣＥ２Ｉ９２）を含む第１（Ｎ末端）領域である。生来型ＡＣＥ２酵素のＡＣＥ２コレクトリン（ネック）ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク三量体に対する結合性と不適合であったので、剛性コンホメーションでＡＣＥ２触媒ドメイン二量体をロックすることが決定され；したがって、ネック（コレクトリン）ドメインが除去され、それにより残基１８～６１４から構成される受容体触媒ドメインからなるＲ１領域が生成され、Ｘ^２７はＴｈｒ又はＴｙｒのいずれかである２７位のアミノ酸残基であり、Ｘ^２６１はＣｙｓ又はＳｅｒのいずれかである２６１位のアミノ酸残基であり、且つＸ^３３０はＡｓｎ又はＴｙｒのいずれかである３３０位のアミノ酸残基である。好ましい非限定的な実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ１領域は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７に対して実質的に同一である配列からなる群より選択される。

本明細書中でスペーサー又はリンカーとも表される領域Ｒ２は、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基からつくられる柔軟性のポリペプチドリンカーを含む本発明のポリペプチド構築物の第２領域である。好ましい非限定的な実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ２領域は、配列番号８、配列番号９、及び配列番号８、配列番号９に対して実質的に同一である配列からなる群より選択される。当技術分野の当業者により理解されるであろう通り、本発明のポリペプチド構築物は、本明細書中に具体的に記載されるＲ２領域に限定されず、前記リンカー又はスペーサーが本発明のポリペプチドの作動可能な機能を可能にする配列及び長さのものであることを条件として、いずれかの好適なスペーサー又はリンカー（本明細書中で相互に交換可能に用いられる）を含むことができる。

ヒンジＳ^２２０，Ｘ^２２６，Ｘ^２２９と表される領域Ｒ３は、２２０位のＳｅｒアミノ酸残基を保持するヒトＩｇＧ１重鎖抗体のヒンジ領域を含む第３領域であり、Ｘ^２２６，Ｘ^２２９はＣｙｓ又はＳｅｒのいずれかである２２６位及び２２９位のアミノ酸残基である。好ましい非限定的な実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ２領域は、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１１、配列番号１２に対して実質的に同一である配列からなる群より選択される。

Ｃ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３と表される領域Ｒ４は、ヒトＩｇＧ１抗体重鎖の第２定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２）及び第３定常ドメイン（Ｃ_Ｈ３）を含むポリペプチド構築物のＣ末端領域であり、Ｃ_Ｈ２ドメインは２７０位のＧｌｙアミノ酸残基を含む。好ましい非限定的な実施形態では、ポリペプチド構築物のＲ２領域は、配列番号１４の配列又は配列番号１４に対して実質的に同一であるいずれかの配列を有する。

好ましい非限定的な実施形態では、本発明のポリペプチド構築物は、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８、及び配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８に対して実質的に同一である配列からなる群より選択される。

これらの好ましい非限定的な実施形態において提供されるポリペプチド構築物は、ＣＨＯ細胞中での一時的トランスフェクションにより高収量で生成することができ、高純度までプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー及び分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製することができ、上昇した酵素活性を保有し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対して高親和性及びアビディティを伴って結合し、高力価を伴って偽型化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和し、且つ細胞及び動物モデルにおいて真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和する。本発明において記載されるポリペプチド構築物のクラスは、生存生物、例えば、疾患の動物モデルとしてのマウス、ハムスター及びサル、並びに臨床応用に関してヒトでのウイルス量を低減させるために有用であろう。つまり、これらの化合物は、ＳＡＲＳ及びＣＯＶＩＤ－１９並びにそれらの新たに出現するウイルス株をはじめとするコロナウイルス感染、並びにウイルス疾患に関連するＡＲＤＳ及び複数の臓器、例えば、肺、心臓、腎臓、脳及び腸の傷害を治療するための有用な生物学的治療剤を代表する。

さらに、これらの化合物のＡＣＥ２代替機能は、呼吸器合胞体ウイルス、鳥類Ｈ５Ｎ１インフルエンザなどの、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を生じるか、又は敗血症誘導型ＡＲＤＳ／サイトカインストームに起因する他のウイルス誘導型病理における追加の治療応用を提供する。最後に、追加の治療適応症は、心筋炎、血管周囲及び心筋線維症でのものなどの心機能障害、糖尿病性腎症、腎線維症並びにＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤを生じる肝機能障害などの非ウイルス性適応症を含む。

本発明のこれら及び他の特徴が、ここで、添付の図面を参照して、例として説明される。

配列表中の配列番号を参照して、４つの領域Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４を含む本発明のポリペプチドのクラスの設計を示す模式図である。示されるアミノ酸位置の数字は、各領域の従来のナンバリングに対応し、全長ポリペプチド配列に沿った連続的ナンバリングには対応しない。 本発明のポリペプチドのクラスをもたらす、構造に基づくモジュール式設計の主な原理を示す図である。ＡＣＥ２コレクトリン（ネック）ドメインは、ＣｏＶ－２スパイク三量体に不適合な剛性コンホメーションでＡＣＥ２触媒ドメイン二量体をロックし；したがって、ネック（コレクトリン）ドメインは除去された。スペーサー及びヒンジ領域により提供される、導入された柔軟性は、ＣｏＶ－２スパイク三量体に対する強い結合性に対してＡＣＥ２触媒ドメイン二量体をアンロックする。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合性ドメイン（ＲＢＤ）（半透明の分子表面として示される）に対する改善された結合性に関して親和性成熟した、本発明のポリペプチドのＲ１領域（暗灰色リボンとして示される）の３Ｄレンダリングを表す図である。Ｔ９２Ｉ突然変異を担持するヒトＡＣＥ２触媒ドメインの天然バリアントは、ＡＤＡＰＴプラットフォームを用いて本研究で行われる構造に基づく親和性成熟予測に対する出発点を代表する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する改善された結合親和性に関して本発明で選択された突然変異は、ＡＣＥ２Ｉ９２天然バリアントの２７位及び３３０位でのＣＰＫモデルとしてレンダリングされる。ＡＤＡＰＴ計算に従う上位３０種類の結合親和性改善突然変異に関して、表１を参照されたい。 ＣＨＯ細胞における一時的トランスフェクションにより生成され、且つプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製されたポリペプチドバリアントの分析を表す図である。図４Ａは、非還元性条件及び還元性条件並びに異なる溶出バッファーの下での変性タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を提供する。 ＣＨＯ細胞における一時的トランスフェクションにより生成され、且つプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製されたポリペプチドバリアントの分析を表す図である。図４Ｂ及び図４Ｃは、それぞれ、クエン酸塩ｐＨ３．６バッファー及び酢酸塩ｐＨ３．７バッファーを用いてプロテインＡカラムから溶出された、選択されたバリアントについての溶出画分のＵＰＬＣ－ＳＥＣ分析を提供する。ＭＡＬＳ分析により決定された主要ピークの分子量が示される。 ＣＨＯ細胞における一時的トランスフェクションにより生成され、且つプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製されたポリペプチドバリアントの分析を表す図である。図４Ｂ及び図４Ｃは、それぞれ、クエン酸塩ｐＨ３．６バッファー及び酢酸塩ｐＨ３．７バッファーを用いてプロテインＡカラムから溶出された、選択されたバリアントについての溶出画分のＵＰＬＣ－ＳＥＣ分析を提供する。ＭＡＬＳ分析により決定された主要ピークの分子量が示される。 分取サイズ排除クロマトグラフィー後のポリペプチドバリアントの分析を表す図である。図５Ａは、非還元性条件及び還元性条件下での変性タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を提供する。追加のポリペプチドバリアントのセットについての純度レベルを、表２に列挙する。 分取サイズ排除クロマトグラフィー後のポリペプチドバリアントの分析を表す図である。図５Ｂは、ＭＡＬＳ分析により決定された主要ピークの分子量と共に、選択された精製バリアントのＵＰＬＣ－ＳＥＣ分析を提供する。追加のポリペプチドバリアントのセットについての純度レベルを、表２に列挙する。 分取サイズ排除クロマトグラフィー後のポリペプチドバリアントの分析を表す図である。図５Ｃは、選択された精製バリアントについての沈降速度分析用超遠心分離（ＡＵＣ）分析データを提供する。追加のポリペプチドバリアントのセットについての純度レベルを、表２に列挙する。 選択されたポリペプチドバリアントについての酵素活性データを表す図である。組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）エクトドメインが対照として用いられる。図６Ａは、触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）値を決定するために用いられる１００ｎｇ／ｍＬの固定された酵素濃度での基質濃度の関数として、蛍光原性基質に基づく無細胞アッセイを用いて決定される酵素活性を提供する。 選択されたポリペプチドバリアントについての酵素活性データを表す図である。組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）エクトドメインが対照として用いられる。図６Ｂは、蛍光原性基質に基づく無細胞アッセイを用いて決定される比活性値を決定するために用いられる酵素濃度の関数としての活性を提供する。追加の試験されたバリアントについての酵素活性データに関して、表４を参照されたい。 選択されたポリペプチドバリアントについての酵素活性データを表す図である。組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）エクトドメインが対照として用いられる。図６Ｃは、２５ｎＭ アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）との３０分間のインキュベーションに関する、１００ｎｇ／ｍＬでの本発明のポリペプチドバリアント又は対照酵素（ｒｈＡＣＥ２及びｒｈＡＣＥ）の、ＥＬＩＳＡによりアッセイされたＡｎｇ ＩＩからアンジオテンシン－（１－７）への加水分解により評価される酵素活性を示す。データは平均±ＳＥＭとして表し、＊Ｐ＜０．０１はｒｈＡＣＥに対する。Ｎ＝３～４実験。 選択されたポリペプチドバリアントについての酵素活性データを表す図である。組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）エクトドメインが対照として用いられる。図６Ｄは、２４時間にわたって０．６ｎＭの本発明のポリペプチドバリアント又は対照酵素（ｒｈＡＣＥ２及びｒｈＡＣＥ）を用いて処理されたマウス初代近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）の存在下での、３０分間での１１．２５μＭ Ｍｃａ－ＡＰＫ（Ｄｎｐ）蛍光原性基質を用いる酵素活性についてのＲＦＵとして表される蛍光読み出し値を提示する。データは平均±ＳＥＭとして表し、＊Ｐ＜０．０１はｒｈＡＣＥに対する。Ｎ＝３実験。 選択されたポリペプチドバリアントについての酵素活性データを表す図である。組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）エクトドメインが対照として用いられる。図６Ｅは、２４時間にわたって０．６ｎＭの本発明のポリペプチドバリアント又は対照酵素（ｒｈＡＣＥ２及びｒｈＡＣＥ）を用いて処理されたマウス初代近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）の存在下での、Ａｎｇ ＩＩ（５ｎＭ）からアンジオテンシン－（１－７）への加水分解（ＥＬＩＳＡ）により評価される酵素活性についてのＲＦＵとして表される蛍光読み出し値を提示する。データは平均±ＳＥＭとして表し、＊Ｐ＜０．０１はｒｈＡＣＥに対する。Ｎ＝３実験。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する本発明のポリペプチドバリアントの結合能の評価を表す図である。図７Ａは、解離速度（ｋ_ｏｆｆ）によりポリペプチド構築物をランク付けするために用いられる標準化されたＳＰＲセンサーグラムを提供する。ホモ二価バリアントを、固相化された武漢株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＲＢＤ上に流し、これはアビディティ効果に起因して結合解離定数の算出を妨げる。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する本発明のポリペプチドバリアントの結合能の評価を表す図である。図７Ｂは、固相化された武漢株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＲＢＤを用いる代理中和（ｓｎ）－ＥＬＩＳＡ結合競合データ及びストレプトアビジン－ポリＨＲＰによる結合したビオチン化ＡＣＥ２検出を提供する。ＩｇＧ抗体アイソタイプが陰性対照として用いられる。表５は、試験されたバリアントのＳＰＲに基づくｋ_ｏｆｆ解離速度及びｓｎＥＬＩＳＡ ＩＣ９０値を列挙する。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する本発明のポリペプチドバリアントの結合能の評価を表す図である。図７Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント武漢株及びＢ．１．３５１（ベータ）並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のスパイク－ＲＢＤからの本発明のポリペプチドの解離速度を示す。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する本発明のポリペプチドバリアントの結合能の評価を表す図である。図７Ｄ及び図７Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント武漢株、Ｂ．１．３５１（ベータ）及びＢ．１．１．５２９（オミクロン）のスパイクＲＢＤに結合する本発明の選択ポリペプチドの長い解離動態実験からのＳＰＲセンサーグラム、並びに対応するフィッティングされた見かけの動態及び平衡定数を提供する。データは、Ｎ＝３実験からの平均±ＳＥＭとして表される。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する本発明のポリペプチドバリアントの結合能の評価を表す図である。図７Ｄ及び図７Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント武漢株、Ｂ．１．３５１（ベータ）及びＢ．１．１．５２９（オミクロン）のスパイクＲＢＤに結合する本発明の選択ポリペプチドの長い解離動態実験からのＳＰＲセンサーグラム、並びに対応するフィッティングされた見かけの動態及び平衡定数を提供する。データは、Ｎ＝３実験からの平均±ＳＥＭとして表される。 生存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する代用品としての偽型化レンチウイルス粒子に基づく中和データを示す図である。ＡＣＥ２を発現する宿主細胞株への偽型ウイルス粒子の侵入を遮断する本発明のポリペプチド構築物の能力を測定した。偽型化レンチウイルス粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ルシフェラーゼレポーター及びウイルス様粒子をアセンブルするために必要とされるレンチウイルスタンパク質の最小セットを含む。ウイルス侵入の遮断は、ルシフェラーゼレポーターのシグナルの喪失により検出される。図８Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上でヒトＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２を共発現するアッセイ実装１を提供する。 生存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する代用品としての偽型化レンチウイルス粒子に基づく中和データを示す図である。ＡＣＥ２を発現する宿主細胞株への偽型ウイルス粒子の侵入を遮断する本発明のポリペプチド構築物の能力を測定した。偽型化レンチウイルス粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ルシフェラーゼレポーター及びウイルス様粒子をアセンブルするために必要とされるレンチウイルスタンパク質の最小セットを含む。ウイルス侵入の遮断は、ルシフェラーゼレポーターのシグナルの喪失により検出される。図８Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上でヒトＡＣＥ２を発現するアッセイ実装を提供する。試験されたバリアントのＩＣ５０値の列挙に関して、表６を参照されたい。 生存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する代用品としての偽型化レンチウイルス粒子に基づく中和データを示す図である。ＡＣＥ２を発現する宿主細胞株への偽型ウイルス粒子の侵入を遮断する本発明のポリペプチド構築物の能力を測定した。偽型化レンチウイルス粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ルシフェラーゼレポーター及びウイルス様粒子をアセンブルするために必要とされるレンチウイルスタンパク質の最小セットを含む。ウイルス侵入の遮断は、ルシフェラーゼレポーターのシグナルの喪失により検出される。図８Ｃは、武漢株、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）及びＢ．１．６１７．２（デルタ）をはじめとする関心が持たれる数種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来のスパイクタンパク質を用いて偽型化されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）により引き起こされる細胞感染を中和する本発明の選択ポリペプチドの能力を示す。関連するＩＣ５０値は、表６ａに列挙される。 本発明の選択ポリペプチドによるＶＥＲＯ－Ｅ６細胞の感染に関する生存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株ウイルスの中和を示す図である。中和性モノクローナル抗体を、陽性対照として用いた。関連するＩＣ５０値は、表７に列挙される。 高血圧マウスにおける静脈内投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ作用を表す図である。図１０Ａは、本発明の選択ポリペプチドの投与の３、６、２４、４８、及び７２時間後にテイルカフ法により測定した収縮期血圧に対する作用を示す。 高血圧マウスにおける静脈内投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ作用を表す図である。図１０Ｂは、蛍光原性基質Ｍｃａ－ＡＰＫ（Ｄｎｐ）を用いてアッセイされた、本発明の選択ポリペプチドの投与７２時間後（エンドポイント）での血漿及び様々な臓器中のＡＣＥ２活性を示す。 高血圧マウスにおける静脈内投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ作用を表す図である。図１０Ｃは、本発明の選択ポリペプチドの投与７２時間後（エンドポイント）での血漿及び様々な臓器中のヒトＡＣＥ２及びＩｇＧ－Ｆｃに対するＥＬＩＳＡ免疫ブロッティングを示す。 高血圧マウスにおける静脈内投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ作用を表す図である。図１０Ｄは、アルブミン尿に対する治療の作用を示す。ＡＣＲ：尿中アルブミン／クレアチニン比。データは平均±ＳＥＭとして表し、Ｐ＜０．０５、^＠：生理食塩液に対して、＊：Ａｎｇ ＩＩに対して、^＃：ｒｈＡＣＥ２に対して、^＆：Ａｎｇ ＩＩ＋Ｋに対して、^％：Ａｎｇ ＩＩ＋Ｍに対して。ｎ＝３～６／群。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢株）に感染したハムスターへの投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ治療効力を表す図である。図１１Ａ及び図１１Ｂは、組み合わせた予防的及び治療的投薬としての鼻内投与後（図１１Ａ）又は治療的投薬のみの後（図１１Ｂ）での体重変化を示す図である。雄性ハムスターに、８×１０^３ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢分離株を鼻内的に負荷した。データは平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。ｎ＝６～７／群。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢株）に感染したハムスターへの投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ治療効力を表す図である。図１１Ａ及び図１１Ｂは、組み合わせた予防的及び治療的投薬としての鼻内投与後（図１１Ａ）又は治療的投薬のみの後（図１１Ｂ）での体重変化を示す図である。雄性ハムスターに、８×１０^３ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢分離株を鼻内的に負荷した。データは平均＋／－ＳＥＭとしてプロットした。ｎ＝６～７／群。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢株）に感染したハムスターへの投与後の本発明の選択ポリペプチドのインビボ治療効力を表す図である。図１１Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇの本発明の選択ポリペプチドの組み合わせた予防的（－４時間）及び治療的（＋２４時間）投与の静脈内投与後の感染後３日目での肺組織中の生存ウイルス力価を示す。雌性ハムスターに、１０^４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢分離株を鼻内的に負荷した。ウイルス力価はプラークアッセイにより決定した。データは中央値＋／－ＳＥＭとしてプロットした。ｎ＝７／群。

本発明の追加の態様及び利点は、以下の説明に鑑みて明らかであろう。本発明の範囲内での様々な変更及び改変が当業者に明らかになるので、詳細な説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のためにのみ与えられる。

［発明の詳細な説明］
本発明は、以下の実施例においてさらに例示されるであろう。しかしながら、これらの実施例は、例示目的のみのためのものであり、いかなる様式でも本発明の範囲を限定するために用いられるべきではないことが理解されるべきである。

したがって、以下は、本開示の実施において当業者を補助するために提供される詳細な説明である。別途定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中の説明で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示を限定していると意図されない。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、図面及び他の参考文献は、それらの全体で参照により明示的に組み入れられる。

定義
本明細書中で用いる場合、以下の用語は、別途特定されない限り、下記でそれらに対して与えられる意味を有し得る。しかしながら、当業者により知られているか又は理解される他の意味もまた可能であり、且つ本開示の範囲内に入ることが理解されるべきである。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が制御するであろう。加えて、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定的であることは意図されない。

用語「約」は、本明細書中で用いる場合、当技術分野で通常の技能を有する人物により予期されるであろう実験誤差、測定誤差、及び変動を考慮するために用いることができる。例えば、「約」とは、参照される指示値のプラス若しくはマイナス１０％、又はプラス若しくはマイナス５％を意味することができる。

本明細書中で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに指示しない限り、複数形の参照を含む。

語句「及び／又は」は、本明細書中で用いる場合、そのようにして等位接続される要素、すなわち、一部の場合に接続的に存在し、且つ他の場合に離接的に存在する要素のうちの「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」を用いて列挙される複数の要素は、同じ形式で解釈され、すなわち、そのようにして等位接続される要素のうちの「１つ又は複数」であるべきである。具体的に特定されるそれらの要素に対して関連するか又は関連しないかにかかわらず、「及び／又は」条項により具体的に特定される要素以外の他の要素が、任意選択で存在し得る。

明細書及び特許請求の範囲において本明細書中で用いる場合、「又は」は、上記で定義される通りの「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を隔てる場合、「又は」又は「及び／又は」は包含的、すなわち、少なくとも１つの包含として解釈されるが、多数の要素又は要素のリストのうちの２つ以上、及び、任意選択で、追加の列挙されない項目も含むであろう。「のうちの１つのみ」若しくは「のうちの厳密に１つ」などの明らかに逆に示されるか又は特許請求の範囲で用いられる場合の唯一の用語「からなる」は、多数の要素又は要素のリストのうちの厳密に１つの要素の包含を意味するであろう。一般的に、用語「又は」は、本明細書中で用いる場合、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、又は「のうちの厳密に１つ」などの排他性の用語により先行される場合、排他的選択肢（すなわち、「一方又は他方であって両方ではない」）を示すものとのみ解釈されるであろう。

本明細書中で用いる場合、「含む」、「はじめとする」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、「から構成される」などのすべての移行句は、オープンエンドであり、すなわち、含むが限定しないことを意味すると理解されるべきである。移行句「からなる」及び「本質的に～からなる」のみが、それぞれ、閉鎖的又は半閉鎖的移行句であろう。

本明細書中で用いる場合、１つ又は複数の要素のリストに関して、語句「少なくとも１つ」は、要素のリスト中の要素のうちのいずれか１つ又は複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されるそれぞれ及びすべての要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素のリスト中の要素のいずれかの組み合わせを除外しないことが理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定される要素に関連するか又は関連しないかにかかわらず、語句「少なくとも１つ」が参照する要素のリスト内に具体的に特定される要素以外の要素が任意選択で存在し得ることも許容する。

用語「配列同一性」とは、本明細書中で用いる場合、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列間の配列同一性のパーセンテージを意味する。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適比較の目的のためにアライメントされる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適アライメントのために、第１のアミノ酸又は核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、結果としてその位置では分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複する位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて遂行することもできる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの１つの非限定的な例は、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムへと組み込まれているアルゴリズムである［１６］。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を取得するために、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に対するＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を取得するために、例えば、スコア－５０、ワード長＝３に対するＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを用いて行うことができる。比較目的のためのギャップありアライメントを取得するために、ギャップありＢＬＡＳＴを、［１７］に記載される通りに利用することができる。或いは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップありＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）デフォルトパラメータを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズムである［１８］。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを用いることができる。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するか又は許容せずに、上記のものに類似の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性の算出において、典型的には、完全一致のみがカウントされる。

「実質的に同一である」配列は、１つ又は複数の保存的アミノ酸突然変異を含むことができる。参照配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸突然変異は、参照配列と比較して生理学的、化学的、物理化学的又は機能的特性での実質的な変化を伴わない変異体ペプチドを生じることができることが当技術分野で公知であり；そのような場合、参照配列及び変異体配列は、「実質的に同一である」ポリペプチドであると考えられるであろう。保存的アミノ酸置換は、類似の化学的特性（例えば、サイズ、電荷、又は極性）を有する別のアミノ酸残基からのアミノ酸残基への置換として、本明細書中で定義される。

非限定的な例では、保存的突然変異は、アミノ酸置換であり得る。そのような保存的アミノ酸置換は、同じ群の別のアミノ酸から、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸へと置換することができる。用語「塩基性アミノ酸」とは、生理的ｐＨで典型的には正に荷電する、７超の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸としては、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）が挙げられる。用語「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」とも称される）とは、生理的ｐＨでは非荷電であるが、２個の原子により共有される電子の対が原子のうちの一方により比較的近く保持される少なくとも１箇所の結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸としては、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が挙げられる。用語「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」とも称される）とは、［１９］の標準化コンセンサス疎水性スケールに従って、ゼロ超の疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸としては、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が挙げられる。「酸性アミノ酸」とは、生理的ｐＨで典型的には負に荷電する、７未満の側鎖ｐＫａ値を有する親水性アミノ酸を意味する。酸性アミノ酸としては、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が挙げられる。ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）は、７付近、タンパク質表面に位置するヒスチジン残基の場合にはより正確には６．４付近のそのｐＫａに起因して、特殊なイオン化ポテンシャルを有する極性アミノ酸である［２０］。このことは、「極性」であり、７．２～７．４の生理的ｐＨでは主に非荷電であり、且つ酸性環境（ｐＨ＜７）では主に正に荷電するヒスチジンアミノ酸残基を生じる。

本発明の実質的に同一である配列は、本明細書中に記載される配列に対して、アミノ酸レベル又はヌクレオチドレベルで、少なくとも８５％同一であり得；別の例では、実質的に同一である配列は、少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％同一であるか、又はそれらの間のいずれかのパーセンテージであり得る。重要なことには、実質的に同一である配列は、参照配列の活性及び特異性を保持する。非限定的な実施形態では、配列同一性での差異は、保存的アミノ酸突然変異（複数可）に起因し得る。非限定的な実施形態では、配列同一性での差異は、同義ヌクレオチド置換又は保存的アミノ酸突然変異（複数可）を生じさせるヌクレオチド置換に起因し得る。非限定的な例では、本発明は、配列番号２３に示されるポリペプチド構築物配列に対して少なくとも８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド構築物を目的とし得る。

本明細書中で用いる場合、用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合により連結された２個以上のアミノ酸の直鎖を意味する。用語「ペプチド」は、一般的には、２～４９個のアミノ酸を含むアミノ酸の短い鎖を意味するために用いられ、一方で、用語「ポリペプチド」は、一般的には、５０個以上のアミノ酸を含むアミノ酸の比較的長い鎖を意味するために用いられる。しかしながら、これらの用語は、相互に交換可能に用いることができる。用語「ポリペプチド構築物」とは、フォールディング及び／又はアセンブルして三次元構造を形成している１つ若しくは複数のペプチド又はポリペプチドを意味するために本明細書中で用いられるが、タンパク質及びポリペプチド構築物はまた、相互に交換可能に用いることもできる。タンパク質は、当業者に理解されるであろう通り、翻訳後修飾を含むことができる。例えば、タンパク質は、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、ニトロシル化、及び／又はメチル化されることができる。

本明細書中で用いる場合、用語「組み換えポリペプチド」とは、組み換え技術により生成されるポリペプチドを意味し、一般的には、発現されるタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが好適な発現ベクターへと挿入され、これが宿主細胞へと導入されて、組み換えポリペプチドの発現を可能にする。組み換えポリペプチドは、異なるタンパク質などの、２つ以上の供給源由来のアミノ酸配列を含むことができる。そのような組み換えポリペプチドは、融合ポリペプチドと称される場合がある。組み換えポリペプチドはまた、１つ又は複数の合成アミノ酸配列も含むことができる。

本明細書中で用いる場合、用語「スペーサー」又は「リンカー」とは、２つのポリペプチドを直接的且つ共有的に連結するペプチドを意味する。リンカーは、アミノ酸、又は２個以上のアミノ酸を含むペプチドであり得る。リンカーがアミノ酸又はペプチドである場合、リンカーのＮ末端がペプチド結合により第１のポリペプチドのＣ末端に共有的に連結されることができ、且つリンカーのＣ末端がペプチド結合により第２のポリペプチドのＮ末端に共有的に連結されることができる。典型的には、リンカーにより共有的に連結される２つのポリペプチドは、天然には連結されないポリペプチドであり、例えば、２つのポリペプチドは、異なる遺伝子により及び／若しくは異なる生物種によりコードされることができるか、又は単一ポリペプチド若しくはタンパク質の異なる部分若しくはドメインであり得る。非限定的な例では、リンカー又はスペーサーは、２０アミノ酸未満であり得る。

本明細書中で用いる場合、用語「抗原」とは、免疫応答を生起することが可能ないずれかの分子、部分又は実体を意味する。免疫応答は、細胞性及び／又は体液性免疫応答を含む。抗原は、一般的には、それに対して同種抗体が選択的に結合できる少なくとも１つのエピトープを含む、生物学的分子、通常はタンパク質、ペプチド、多糖、脂質又はコンジュゲートである。

「ウイルス表面抗原」は、ウイルスの表面上に見出すことができる、ポリペプチドなどの抗原である。ウイルス表面抗原は、三量体ウイルス表面抗原であり得る。三量体ウイルス表面抗原の例としては、限定するものではないが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス（ＣｏＶ）－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１スパイク、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－ＣｏＶスパイク、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＲＳＶＦタンパク質、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＡＢＶＧ）、及びヒトメタ肺炎ウイルス（ｈＭＰＶ）糖タンパク質が挙げられる。

本明細書中で用いる場合、用語「薬学的に許容できる担体」とは、無毒である担体を意味する。好適な薬学的に許容できる担体としては、例えば、水、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数が挙げられる。薬学的に許容できる担体は、保存寿命又は有効性を強化する、湿潤化剤若しくは乳化剤、保存料又は緩衝剤などの微量の補助物質をさらに含有することができる。

本明細書中で用いる場合、核酸分子又はポリペプチドなどの分子に関して、用語「断片」とは、分子の全長未満である分子の一部分を意味する。

本明細書中で用いる場合、用語「被験体」とは、ヒト又は非ヒト動物、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類、又は両生類を意味する。

本明細書中で用いる場合、用語ヒンジ断片、Ｃ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインとは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）［２１～２３］に従って規定及びナンバリングされる通りのヌクレオチド及びタンパク質配列を有する、ＩｇＧ抗体重鎖の対応する領域を意味する。ヒンジ断片、Ｃ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメインの好ましい非限定的な実施形態は、ヒト抗体、及び好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプ由来である。

２つ以上のステップ又は動作を含む本明細書中に記載される特定の方法では、方法のステップ及び動作の順序は、文脈がそうでないことを指示しない限り、方法のステップ又は動作が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。

当技術分野での課題に対処するために、本発明は、ヒト集団に広範囲に存在するより一般的なＡＣＥ２受容体において通常はトレオニン（Ｔｈｒ）アミノ酸残基が見出される９２位にイソロイシン（Ｉｌｅ）アミノ酸残基を保有する、改善されたＡＣＥ２に基づくヒトＡＣＥ２受容体のデコイバリアントを提供する。本発明は、複数の側面を有する分子設計の試みにおける出発点としてＡＣＥ２Ｉ９２を用い、このことは、ここで、（ａ）ウイルス感染の効率的な中和のためのスパイクタンパク質に対する強い結合アビディティ及び親和性、（ｂ）低減したＡＲＤＳのための高い酵素活性、並びに（ｃ）改善された生物学的製造可能性を保有し；その間に、（ｄ）抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）を予防しながらウイルスクリアランスを可能にするための適切な薬物動態、及び（ｅ）新たに出現するウイルス株及び将来のパンデミックに対する保護に対する構造的成分をもたらす、ポリペプチド構築物のクラスを提供する。

本発明は、一般式：
Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４
を有するポリペプチド構築物を提供し、
式中、Ｒ１はｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０を含み、Ｘ^２７はＴｈｒ又はＴｙｒであり、Ｘ^２６１はＣｙｓ又はＳｅｒであり、Ｘ^３３０はＡｓｎ又はＴｙｒであり；
Ｒ２は、スペーサー又はリンカーを含み；
Ｒ３は、ヒンジＳ^２２０，Ｘ^２２６，Ｘ^２２９を含み；Ｘ^２２６及びＸ^２２９はＣｙｓ又はＳｅｒであり；且つ
Ｒ４はＣ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３を含み、
４つの領域のそれぞれの構造的特徴及び設計された利点は、実施例１「ポリペプチド構築物の分子操作」と題される以下のセクションにおいて提示され且つ詳細に記載される。本発明の設計されたポリペプチド構築物の利点を実証する実験データは、実施例２～実施例７の下に以下のセクションにおいて提示される。本開示の非限定的な例示的な例は、配列番号１５～２９、より具体的には配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８に提供される。

実施例１．ポリペプチド構築物の分子操作
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクホモ三量体に対するアビディティの最適化のための構造に基づくモジュール式設計
図２は、本発明のポリペプチドのモジュール式設計において利用される構造ドメインを図示する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクホモ三量体の分子モデルは、ＰＤＢ ＩＤ ６ＶＳＢを有するクライオＥＭ構造から取得された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合性ドメイン（ＲＢＤ）との複合体中の触媒及びネック（コレクトリン）ドメインを含むヒトＡＣＥ２エクトドメイン（１８－７４０）ホモ二量体は、ＰＤＢ ＩＤ ６Ｍ１７を有するクライオＥＭ構造から取得された。ヒンジ、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片ホモ二量体は、ＰＤＢ ＩＤ １ＨＺＨを有するヒトＩｇＧ１ ｍＡｂの結晶構造から取得された。構造操作、可視化及びレンダリングは、ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）を用いて行った。

このモジュール式設計の最初のステップとして、本発明者らは、ネック（コレクトリン）ドメインが、非共有的二量体化ドメインとして機能し、且つ、本研究において本発明者らがスパイクタンパク質ホモ三量体の２つのＲＢＤドメインに対する同時結合性とは不適合であると決定した剛性の相互配向で、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）をロックすることを決定し、したがって、図２に示される通り、ネックドメインは除去された。次のステップは、柔軟なポリペプチドスペーサー（Ｒ２領域）、及びそれに続いて柔軟なヒトＩｇＧ１ヒンジ（Ｒ３領域）を介して、残余のヒトＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）を、ホモ二量体として非共有的にアセンブルするヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３断片（Ｒ４領域）へと連結することであった。この新規の構造に基づく設計戦略は、本発明のホモ二量体ポリペプチド構築物の文脈において、２つのＡＣＥ２触媒ドメインの増加した柔軟性及び相互独立性を提供する。全体的な目標は、同じウイルススパイクタンパク質ホモ三量体分子の２つのＲＢＤドメイン上の、並びにビリオン表面で互いに隣接する異なるスパイクタンパク質ホモ三量体に属する２つのＲＢＤドメインへの、本発明の設計されたホモ二量体ポリペプチド構築物の２つのＲ１領域の同時占有を促進及び改善することである。それ故、本発明のポリペプチド構築物の独自の設計プラットフォームを用いて、ＡＤＡＰＴ親和性成熟により決定される通りの（以下を参照されたい）、ウイルススパイクタンパク質に対する高い結合アビディティ及び親和性を付与する残基を選択した。コレクトリン（ネック）ドメインの欠失は非限定的であることが理解され、且つ図１及び図２に記載される設計構想において全長ｈＡＣＥ２（１８－７４０）エクトドメインを利用することは、当業者が理解するであろう自明な改変であり、本発明のポリペプチド構築物に関して酵素活性及びウイルス中和の顕著なレベルを保持することができる。

ポリペプチド構築物の４つの領域のうちのそれぞれにおける追加の配列最適化
本段落に記載される配列バリエーションを、図１に模式的に示す。最初に、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）では、天然に存在するヒト突然変異Ｔ９２Ｉ［２４～２６］が選択された。この自然突然変異は、Ｎ^９０ＸＴ^９２Ｎ－グリコシル化シークオン及びしたがってＡｓｎ９０のＮ－グリコシル化を除去することが予測される。本発明者らの設計においてこの部分的に脱グリコシル化された天然バリアントを利用することの第１の利点は、本発明のポリペプチド構築物の比較的低い分子量をもたらすことであり、このことは、組織浸透を改善し得る。さらに、本明細書中で初めて示されるであろう通り、ＡＣＥ２Ｉ９２部分的脱グリコシル化天然バリアントは、本発明のポリペプチド構築物に対して、増加した酵素活性及び増加したウイルス中和効力の両方に関して、改善された活性プロフィールを付与する。重要なことに、ヒトＡＣＥ２の９２位でのＩｌｅアミノ酸の自然発生は、Ａｓｎ９０での炭水化物構造の除去からもたらされる、タンパク質表面曝露に起因して生じ得る免疫原性の懸念を排除する。

ポリペプチド構築物ホモ二量体中の２つの独立したＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の柔軟性及び相互の動作の自由さに対する作用を評価するために、２種類の異なる長さのスペーサー（Ｒ２領域）を設計した；５残基スペーサーＳＧＧＧＧ、及び１５残基スペーサーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ。比較的短いスペーサーが、２つの独立したＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）が立体障害を伴わずにホモ二量体ポリペプチド構築物中に納まることを可能にすることを確実にするために、分子モデル上でＰｙＭＯＬにおいて幾何学的測定を行った。

ヒトＩｇＧ１ヒンジ（Ｒ３領域）もまた改変された。最初に、本発明者らは、抗体軽鎖に対するジスルフィド架橋に生来関与するヒンジ２２０位の対になっていないＣｙｓ残基を突然変異させ、それによりＣｙｓ２２０を介して望ましくない共有的多量体分子種を形成する可能性を低減することを目的として、Ｃｙｓ２２０は本発明者らの構築物中には存在せず、したがって、Ｓｅｒアミノ酸により置換された。さらに、ヒンジ２２６位及び２２９位での生来型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域中の残余の２つのＣｙｓ残基をＳｅｒ残基によって追加的に置換するバリアントを設計した。これらのＣｙｓ残基は、Ｆｃ断片ホモ二量体中で２本の重鎖間でのジスルフィド架橋を通常形成するので、これらのＣｙｓ残基もまた、Ｆｃ融合タンパク質の製造可能性に影響を及ぼす望ましくない共有的多量体分子種を生じ得る［２７、２８］。構造的特徴は、大規模製造可能性の間のサンプル不均一性を低減させるために模索された。Ｃｙｓ残基を欠くヒンジ突然変異型Ｒ３領域は、ホモ二量体バリアントをもたらすことが想起され、このバリアントは、主にＣ_Ｈ３ドメインホモ二量体化を介して、非共有的なポリペプチド鎖間相互作用によってのみ安定化され、したがって、ポリペプチド鎖間共有的ジスルフィド結合によっては安定化されない。同じ精神で、本発明の特定の実施形態はまた、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の２６１位での、Ｓｅｒ残基へと突然変異された、表面曝露される対になっていないＣｙｓ残基も含む。

最後に、Ｒ４領域からのヒトＣ_Ｈ２ドメインを、突然変異Ｄ２７０Ｇを含めるために選択し、この突然変異は、ＦｃγＲ受容体及びＣｑ補体複合体に対する結合性の低減を介して、免疫エフェクター機能を減弱させることができる。この改変は、ウイルス感染の抗体治療の特定の副作用、すなわち：（ｉ）特定のウイルス感染において病理を悪化させることが示されている抗体依存性感染増強（ＡＤＥ）作用［２９］、並びに（ｉｉ）ＣＯＶＩＤ－１９感染に起因する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に既に罹患している臓器及び組織の炎症増加［３０～３２］を低減させることを目的とする。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクＲＢＤに対するＡＤＡＰＴ親和性成熟
上記の配列改善及び改変に加えて、ヒトＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する親和性成熟により特定される残基の組み込みにより、さらに遺伝子操作した。親和性成熟に対する出発点は、ＰＤＢ ＩＤ ６Ｍ１７を有するクライオＥＭ構造から取得された［４］、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合性ドメイン（ＲＢＤ）に結合したｈＡＣＥ２の原子座標であった。１コピーのみのヒトＡＣＥ２触媒ドメイン残基２１～６１５及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ残基３３６～５１８が保持され、すべての他の原子は除去された。水素原子が複合体に付加され、Ｈ結合相互作用を最大化するために調整された。続いて、非結合相互作用に関する距離依存性静電的及び無限遠点カットオフを用いて、ＡＭＢＥＲ力場を用いるエネルギー最小化により、複合体の構造的改善を行った［３３、３４］。非水素原子は、骨格及び側鎖原子に関してそれぞれ、４０及び１０ｋｃａｌ／（ｍｏｌ・Ａ^２）の調和力定数を有して、それらの結晶学的位置に拘束された。続いて、ＡＤＡＰＴプラットフォームを、親和性成熟のために用いた［３５、３６］。突然変異時にスパイクＲＢＤに対する結合親和性に影響を及ぼし得る、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）内の５７箇所の位置で、単一点走査突然変異導入シミュレーションを行った。本発明者らは、構造を構築し、且つ親ｈＡＣＥ２構造のこれらの位置での１７種類の他の考えられる天然アミノ酸（Ｃｙｓ及びＰｒｏは除外した）への単一点突然変異のエネルギーを評価するために、ＡＤＡＰＴプロトコールを用いた。これらの３種類のプロトコールの特異的バージョンにわたるコンセンサスアプローチ［３７］を、ｈＡＣＥ２変異体を構築及びスコア付けするために適用した。結合親和性のスコア付けは、主に、３種類の成分エネルギー関数を用いて算出されるスコアについての平均Ｚスコアに基づいた。結合親和性予測に先立って、ＡＣＥ２触媒ドメインの正しいフォールディングを不安定化することが予測された突然変異は、さらなる評価から破棄した。

改善されたスパイクＲＢＤ結合親和性を有する最も考えられる単一点変異体の選択は、主に、ＡＤＡＰＴからの上位３０位のコンセンサスＺスコアにより導かれた（表１）。ＡＤＡＰＴの３種類のサンプリングプロトコールを用いて予測された分子相互作用の目視検査を用いて、抗体界面での最適未満の相補性（例えば、非極性環境での極性基の埋没）、共有的幾何形状での立体的過密及び歪曲（例えば、芳香環の平面性からの逸脱）、並びにラマチャンドランプロットの却下される領域中にそれらの主鎖ねじれ角を有する生来型Ｇｌｙ残基の置き換えを検出した。２つの位置、Ｔｈｒ２７及びＡｓｎ３３０が最終的に選択され、これらの位置では、芳香族置換が、高い確率を伴って、親ＡＣＥ２構造に対して結合親和性を改善することが予測された。それらの考えられる置換のうちで、本発明者らは、他の予測される置換Ｐｈｅ及びＴｒｐに対するその増加した溶解度を考慮して、Ｔｙｒを置換残基として選んだ（図３）。本発明のポリペプチド構築物では、Ｔ２７Ｙ及びＮ３３０Ｙ突然変異を、単独又は組み合わせてのいずれかで用い、好ましくは、先行するセクションに記載される配列バリエーションとも組み合わせた。

実施例２．ＣＨＯ細胞における設計されたポリペプチド構築物の生成
本発明の様々なポリペプチド構築物は、それらのＮ末端にヒトＡＣＥ２の生来型シグナル配列を含む。構築物に対するＤＮＡコード領域を合成的に（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）調製し、ｐＴＴ５哺乳動物発現プラスミドベクターのＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）及びＢａｍＨ１（３’末端）部位へとクローニングした［３８］。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の一時的トランスフェクションにより、融合タンパク質を生成した。簡潔には、プラスミドＤＮＡを、ＣＨＯ－５５Ｅ１細胞の０．５Ｌ又は１Ｌ培養物へとトランスフェクションした。トランスフェクションは、９８％超の生存率を有する１．８×１０^６～２．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で行った。細胞を、１．０Ｌ～２．８Ｌ振盪フラスコ中に分布させ、ＰＥＩ ＭＡＸ（商標）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を用いて、１ｍＬの生成物当たり１μｇの総ＤＮＡをトランスフェクションした。最終的なＤＮＡ：ＰＥＩ ＭＡＸ（商標）比率は、１：４（ｗ／ｗ）であった。細胞培養物を、加湿５％のＣＯ_２雰囲気中、３７℃で１１０ｒｐｍの撹拌速度において、軌道振盪プラットフォーム上で２４時間インキュベートした。２４時間後、培養物に、１％ｗ／ｖの最終濃度でのトリプトンＮ１及び０．５ｍＭ最終濃度でのバルプロ酸ナトリウム塩を供給し、３２℃へと６日間移した。細胞密度及び細胞生存率を、トリパンブルー色素排除法を用いて、Ｖｉ－ＣＥＬＬ自動化細胞計数システム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）による細胞サンプルの直接的計数により決定した。

ポリペプチド構築物は、１０４～３２８ｍｇ／Ｌの収量で生成され、大多数のバリアントについての典型的な収量は約３００ｍｇ／Ｌであった。このことは、本発明のポリペプチド構築物を、ＣＨＯ細胞での一時的トランスフェクションにより効率的に生成することができることを実証する。さらなる収量増加が、特定のバリアントの最良な発現を有するＣＨＯ細胞のプールの選択及び増殖により予期される。

実施例３．アフィニティクロマトグラフィーによるポリペプチド構築物の精製
細胞培養上清からの精製を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより行った。細胞培養上清を、ＤＰＢＳ中で平衡化した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へとロードした。約４５ｃｍ／ｈ（１．７ｍＬ／分）での結合性セットに対する線形流速を用いて上清をロードし、約２．９分間の滞留時間を得た。ＤＰＢＳを用いてカラムを洗浄し、０．１Ｍクエン酸塩バッファーｐＨ３．６又は０．１Ｍ酢酸塩バッファーｐＨ３．７を用いてタンパク質を溶出した。１０％（ｖ／ｖ）の１Ｍ ＨＥＰＥＳを用いて中和を行った。中和した溶出プールを、Ｚｅｂａスピンカラムを用いてバッファー交換し、滅菌ろ過した。クエン酸塩ｐＨ３．６溶出バッファーを用いて、ヒンジ（Ｒ３領域）の２２６位及び２２９位並びにＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の２６１位にシステインを担持するバリアントの試験されたサンプルは、変性非還元性条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ試験に従って、約５０％のホモ二量体を含有し、残りは高分子量（ＨＭＷ）分子種の凝集物質であり、ＨＭＷ分子種のうちの大部分は、還元性条件下では消失した（図４Ａ、左側）。不均一性のこのレベルは、高解像度ＢＥＨ－４５０カラム上での分析的ＵＰＬＣ－ＳＥＣにより確認された（図４Ｂ）。しかしながら、溶出バッファーとして酢酸塩ｐＨ３．７を用いることにより、調製物の均一性が改善された。ヒンジ２２６位及び２２９位の両方（ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ；配列番号２３）又はＡＣＥ２触媒ドメインの２６１位（ＡＣＥ２ｍ４－Ｃ２６１Ｓ－ＳＧ４－Ｆｃ；配列番号２２）のいずれかに突然変異されたシステインを有するバリアントに関して、図４Ａ（右側）において非還元性条件下での変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥデータから見て取れる通り、ＨＭＷ分子種は存在しない。予期される通り、ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）バリアントは、未変性ホモ二量体のヒンジ領域間での共有的ジスルフィドの非存在に起因して、変性非還元性条件下では単量体として現れる。さらに、図４Ｃに示されるＢＥＨ－４５０カラムでの分析的ＵＰＬＣ－ＳＥＣデータは、精製サンプルの改善された均一性の主な要因が溶出バッファーであり（クエン酸塩ｐＨ３．６溶出バッファーを用いて約５０％のホモ二量体対酢酸塩ｐＨ３．７溶出バッファーを用いて約７０％のホモ二量体）、システイン残基の突然変異ではないことを示唆する。このことは、両方の溶出バッファーを用いて試験されたバリアントＡＣＥ２－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１５）から明白であり、このバリアントは、ＨＭＷ分子種のサイズ及び量が、クエン酸塩ｐＨ３．６溶出バッファー（図４Ｂ）よりも酢酸塩ｐＨ３．７溶出バッファー（図４Ｃ）を用いて低減されることを示す。本発明者らは、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）中のＣ２６１をＳｅｒへと突然変異させることは、均一性をさらに改善せず（酢酸塩ｐＨ３．７溶出バッファーを用いて）、７２％のホモ二量体を含有することも観察した。しかしながら、新規の知見として、ヒンジ（Ｒ３領域）の２２６位及び２２９位での２個のＣｙｓが両方ともＳｅｒへと突然変異された場合、均一性が顕著に改善し、比較的小さなサイズの１２％のみのＨＭＷ分子種を伴って、８８％のホモ二量体を生じた（図４Ｃ）。さらに、ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）バリアントのこの精製サンプルのホモ二量体分子種に関してＭＡＬＳ－ＲＩ分析により決定されたＭＷは１９８ｋＤａであり、これは１９０ｋＤａの理論上のホモ二量体ＭＷと良好に合致し、差異はおそらくはグリコシル化に起因すると考えられる。すべてのこれらの結果は、酢酸塩ｐＨ３．７溶出バッファーを用いること並びにヒトＩｇＧ１ヒンジ２２６位及び２２９位のシステインを突然変異させることが、このクラスのポリペプチドに対するプロテインＡ精製による約９０％の合理的に高い均一性を実現するために重要であることを示す。

次に、すべてのプロテインＡ精製サンプルを、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分取ＳＥＣによりさらに精製した。選択されたピーク画分を、製造業者の説明書に従って、１５℃で１０ｋＤａのメンブレン分子量カットオフ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）（登録商標）６遠心濃縮器を用いる限外ろ過により濃縮した。プロセスの間、タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度及び各バリアントの計算上の比吸光係数を用いて、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）（商標）２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）でモニタリングした。変性された精製バリアントのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、非還元性条件及び還元性条件下の両方での、すべてのポリペプチド構築物に関する非常に純粋なホモ二量体を示す（図５Ａ）。ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）バリアントは、未変性ホモ二量体のヒンジ領域間での共有的ジスルフィドの非存在に起因して、変性非還元性条件下では単量体として現れる。続いて、高解像度ＢＥＨ－４５０カラムでの分析的ＵＰＬＣ－ＳＥＣにより高純度を確認し、代表的なクロマトグラムを図５Ｂに示し、すべてのバリアントに関するホモ二量体画分を表２に列挙する。ＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）及びＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）の両方が、ヒンジ（Ｒ３領域）のレベルでのポリペプチド鎖間ジスルフィド架橋が存在するか（前者のバリアントにおいて）又は存在しない（後者のバリアントにおいて）、これらのバリアント間での差異にかかわらず、両者ともホモ二量体を示す、ほぼ同一のＵＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラムを有することを注意することが重要である。図５Ｂ及び表２に示される通り、これらの分子種のホモ二量体に関して決定されたＭＷは、１９０ｋＤａの計算上のタンパク質ＭＷを有するグリコシル化タンパク質と密接に合致する。注記すべきことに、表２に示される通り、位置Ａｓｎ９０での炭水化物を欠損したヒトＡＣＥ２ Ｉｌｅ９２の天然バリアントに基づくバリアント（配列番号１９、２０、２１、２２及び２３）に関する決定されたＭＷは、Ａｓｎ９０でのグリコシル化を有するもの（配列番号１５、１７及び１８）よりも小さい。

分取ＳＥＣにより精製したサンプルを、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度での２８０ｎｍの吸光度をモニタリングしながら、ＡＮ－５０ ８穴ローターを用いてＢｅｃｋｍａｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｌａｂ ＸＬ－Ｉ上で行われる沈降速度分析的超遠心分離（ＳＶ－ＡＵＣ）により、さらに分析した。３ｍｍ経路長及びサファイアウインドウを有する２セクターチャコールエポンセンターピースを含むセルを用いた。タンパク質を４５０００ｒｐｍで遠心分離し、４分間毎にスキャンを行った。ＳＥＤＦＩＴソフトウェアを用いてｃ（ｓ）分布を取得し、ＧＵＳＳＩソフトウェアを用いて統合した。表２に一覧にされたＳＶ－ＡＵＣデータは、試験されたポリペプチド構築物の精製サンプルが、約８Ｓでの１つの主要ピークを有することを示し、このピークは８８～９７％のタンパク質ピーク面積を占め、ホモ二量体分子種に起因する。ＨＭＷ分子種の含有量は非常に低い。これらのサンプルの摩擦係数は１．８～２．１の範囲であり、これらのホモ二量体のアセンブリに関する非対称コンホメーションを暗示し、この摩擦係数は上記の遺伝子操作されたコンホメーション柔軟性と一貫している。図５Ｃは、ヒンジ（Ｒ３領域）中のポリペプチド鎖間共有的ジスルフィド結合の存在又は非存在においてのみ異なるバリアントのペア：ＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）対ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）に関して、類似する沈降係数分布を示す。

実施例４．ポリペプチド構築物の安定性特性決定
凍結融解サイクル
本発明のポリペプチド構築物の精製サンプルを、－８０℃での凍結及び３０分間の融解の３サイクルからなる凍結融解安定性ストレス試験に供した。ＢＥＨ－２００カラムでの分析的ＵＰＬＣ－ＳＥＣを用いて、凍結融解サイクルのそれぞれの前後でのサンプル不均一性を決定した。すべてのサンプルが、凍結融解ストレスに対して極めて強靭であった。３回目の凍結融解サイクル後に決定されたホモ二量体の画分を、表３に列挙する。ストレス前及び３回目の凍結融解サイクル後のサンプルはまた、ＳＰＲ（下記参照）を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ結合性に関しても試験した。凍結融解ストレス前後でのＳＰＲセンサーグラムを比較する類似性スコアを表３に記録し、非常に類似の結合性レベルを示す。考え合わせると、これらのデータは、本発明のポリペプチド構築物が、凍結融解ストレスに対して非常に強靭であり、且つ－８０℃で保存することができることを示す。

フォールディング安定性
本発明者らは、このクラスのポリペプチド構築物の様々な構造化ドメインの安定性に差異があるか否かを見出すことにも関心を持った。この目的のために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、本発明において例示されるポリペプチド構築物の温度遷移中点（Ｔ_ｍ）を決定した。ＤＳＣ実験は、ＶＰ－キャピラリーＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を用いて行った。サンプルを、０．４ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで、ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）（商標）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＤＰＢＳ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に希釈した。熱変性を、フィードバックモード／「低」に設定されたゲイン、８秒間のフィルタリング時間、３分間のプレスキャン時間を用いて、６０℃／ｈの速度で２０℃～１００℃まで温度を増加させることにより、７０ｐｓｉの窒素圧力下で行った。すべてのデータを、Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を用いて解析した。サーモグラムを、対応するバッファーブランクスキャンの減算により補正し、タンパク質モル濃度へと標準化した。Ｔ_ｍ値を、Ｔ_ｍに対する矩形ピークファインダーアルゴリズムによる自動化データ加工を用いて決定した。表３に列挙されるデータは、すべてのバリアントが、２つの共通の特徴を付与する概ね等しいエンタルピーの約５０℃及び約８２℃の両方での遷移を有することを示す。これらの化合物の２つの共通の構造化された特徴は、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）及びＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン（Ｒ４領域）である。抗体ＩｇＧ１ Ｆｃ断片のＣ_Ｈ３ドメインは、約８２℃の融解温度を有することが公知である。ＡＣＥ２触媒ドメインは、５０℃付近での遷移に相当する［３９］。表３からのＴ_ｍデータに基づく構造－安定性関係分析は、一部のバリアント中に存在するＮ３３０Ｙ突然変異が、約２℃までのＡＣＥ２触媒ドメインのＴ_ｍの低下の原因であることを示唆する。

実施例５．ポリペプチド構築物の酵素活性
触媒効率
本発明のポリペプチド構築物の酵素活性を、以前に記載された通りに［４０］、蛍光原性基質Ｍｃａ－ＡＰＫ（Ｄｎｐ）（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、Ｃａｔ＃：ＡＳ－６０７５７）を用いてアッセイした。組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）を陽性対照として用い（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、Ｃａｔ＃：９３３－ＺＮ）、ブランクを陰性対照として用いた。アッセイバッファーは、５０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ６．８を含有した。バリアント及びｒｈＡＣＥ２対照を１００ｎｇ／ｍＬ濃度で試験し、基質濃度は１、２、４、６、８及び１６μＭであった。サンプルは、１０^－５Ｍ ＡＣＥ２阻害剤ＭＬＮ－４７６０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ＃：５３０６１６）を用いるか又は用いずに、三重反復でアッセイした。３２０ｎｍの励起を用いて４０５ｎｍの発光を検出するＦＬＵＯｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙ蛍光光度計（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ、ＵＳＡ）上で、６２秒間毎に３２分間までの読み出し値を用いて、反応を動力学的に追跡した。データは、Ｇｒａｆｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてフィッティング及びプロットした。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＭＬＮ－４７６０を有するサンプルに関して減算し、生成物形成の標準曲線に基づいて生成物の濃度単位（μＭ）へと変換した。触媒効率ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍの算出のために、経時的な生成物形成の線形相から決定される初期速度（Ｖ_０）を、基質濃度に対してプロットした。基質濃度プロットに対するＶ_０の線形相を用いて、６μＭ未満の基質濃度での基質濃度によりＶ_０を除算することにより、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ値を算出した。［本発明者らは、触媒効率アッセイに関する技術的データのうちの一部が、ケビンバーンス博士（Ｄｒ．Ｋｅｖｉｎ Ｂｕｒｎｓ）（ＯＨＲＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）の研究室により快く提供されたことに、深く感謝する］。

触媒効率ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍを、表４中のすべての試験されたポリペプチド構築物に関して列挙し、基質濃度プロットに対するＶ_０を、ｒｈＡＣＥ２陽性対照及び図６Ａ中の選択されたバリアントに関して示す。これらのデータから見て取れる通り、本発明のすべてのポリペプチド構築物が、本研究において決定される通りの２．６７×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１のｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍを有するｒｈＡＣＥ２と同じ桁（１０^５Ｍ^－１ｓ^－１）である、高い触媒効率を有する。このことは、実施例１に記載される通りの分子設計及び最適化の間に導入された構造変化が、触媒活性に対して大きな影響を有しないことを示す。さらに、酵素活性データの構造－活性関係分析は、本発明者らの新規構築物においてＡＣＥ２酵素活性を増加させる上でのＴ９２Ｉ自然突然変異の重要且つ予測されない役割を明らかにする。この作用は、９２位にＴｈｒを有するバリアントＡＣＥ２ｍ１－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１８）を、９２位にＩｌｅを有するＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）と比較することにより最高に強調され、これらのバリアント同士の間の唯一の差異はこの自然突然変異及び結果として生じるＡｓｎ９０で連結される炭水化物構造の喪失である。この知見に対するさらなる支持が、ＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）と全く同じＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）を有するバリアントＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）により提供される。ＡＣＥ２ｍ１－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１８）と比較してＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）及びＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）の高い触媒効率は、図６Ａ及び表４から直ちに明らかになる。

比活性
本発明者らはまた、ポリペプチド構築物の比活性も特性決定し、且つそれらをｒｈＡＣＥ２陽性対照の比活性と比較した。比活性は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ２）蛍光分析活性アッセイキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ、Ｃａｔ＃：Ｋ８９７－１００）を用いて決定した。本発明者らは、キット中に提供される酵素（濃度は開示されていない）を、上記の触媒効率研究において用いられた市販のｒｈＡＣＥ２により置き換えた。製造業者のプロトコールに従った。アッセイは、二重反復で９６ウェル形式において行った。すべてのポリペプチド構築物の濃度は、２倍連続希釈での１ｎＭ～０．０３１２５ｎＭの範囲であった。３２０ｎｍでの励起及び４２０ｎｍでの発光を用いて、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５機器（ＢｉｏＴｅｋ）上で、反応を動力学的に追跡した。比活性の算出のために、活性時間経過プロットの線形範囲中の２つの時点を、０．２５ｎＭ（時点２０及び２５分間）及び１ｎＭ（時点５及び１０分間）の酵素濃度で選択し、これらの濃度は、プロットの線形相に対応する（図４Ｂ）。各時点に関する二重反復値を平均し、ブランクデータに基づいてゼロへと標準化した。続いて、時点間でのＲＦＵの変化を、対応する時間範囲及び用いられた酵素の量により除算することにより、比活性（ｐｍｏｌ／分／ｍｇ）を算出した。表４に報告される最終的な比活性データは、各プレート上のｒｈＡＣＥ２対照の比活性に対して標準化された、２つの酵素濃度（０．２５ｎＭ及び１ｎＭ）でのデータ間の平均である。

本発明のポリペプチド構築物が、１０^６ｐｍｏｌ（生成物）／分／ｍｇ（酵素）（図６Ｂ及び表４）のオーダーでの高い比活性を有し、且つｒｈＡＣＥ２対照と比較して６８～８９％の範囲にあることが容易に明らかになる。先行するセクションに提示される触媒効率データと合致して、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の２７位及び３３０位での突然変異は、バリアントＡＣＥ２ｍ１－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１８）について見て取れる通り、酵素活性を若干減少させる。しかしながら、比活性は、ＡＣＥ２触媒ドメインの９０位でのＮ－連結炭水化物の除去を伴って、９２位でのＩｌｅへの天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｉｎｇ）突然変異の包含を付加することにより回復される：ＡＣＥ２ｍ１－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１８）に対してＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）及びＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）バリアントを比較されたい。

考え合わせると、本発明のポリペプチド構築物の触媒効率及び比活性データは、これらの化合物が、Ａｎｇ－ＩＩをＡｎｇ（１－７）へと効率的に変換することにより代替的レニン－アンジオテンシン系の保護的作用を回復させる上で有効であり、したがって、ＡＲＤＳの重症度を低減させるための治療剤として機能するであろうことを示唆する。

アンジオテンシンＩＩ加水分解活性
アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）とのインキュベーション、及びそれに続くアンジオテンシン－（１－７）の測定（ＢＭＡ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｃａｔ＃：Ｓ－１３３０）により、ＡＣＥ２酵素活性を直接的にも決定した。０．５μｇ／ｍＬでの本発明の選択ポリペプチド又は対照酵素（ｒｈＡＣＥ２、ｒｈＡＣＥ）を、１０^－５Ｍ ＭＬＮ－４７６０を含むか又は含まずに、２５ｎＭ Ａｎｇ ＩＩ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃：１１５８／５）を含有するアッセイバッファーに、室温で３０分間添加した。図６Ｃは、本発明のすべての試験されたポリペプチドのＡｎｇ ＩＩ加水分解活性が、陰性対照であるヒト組み換えＡＣＥ（ｒｈＡＣＥ）よりも有意に高く、且つ陽性対照である市販の組み換えヒトＡＣＥ２（ｒｈＡＣＥ２）と同等であることを示す。［本発明者らは、アンジオテンシンＩＩ加水分解活性に関する技術的データのうちの一部が、ケビンバーンス博士（ＯＨＲＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）の研究室により快く提供されたことに、深く感謝する］。

マウス近位尿細管上皮細胞の初代培養における酵素活性及び安定性
近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ（Ｓａｉｎｔ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から入手した１２～１６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性及び雌性マウスから単離した。単離は、以前に記載された通りに行った［４１］。各単離に関して、１頭の雄性マウス及び１頭の雌性マウス由来の腎臓を、冷却灌流溶液［１．５ ＣａＣｌ_２、５．０ Ｄ－グルコース、１．０ ＭｇＳＯ_４、２４ ＮａＨＣＯ_３、１０５ ＮａＣｌ、４．０ 乳酸ナトリウム、２．０ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５．０ ＫＣｌ、１．０ Ｌ－アラニン、１０ Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及び０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する（ｍＭ）］中に回収した。腎臓皮質を細切し、０．１％のコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃：Ｃ９２６２）及び０．０５％のダイズトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃：Ｔ６５２２）、ｐＨ７．２を添加した灌流溶液中で消化した。皮質消化物を２５０μｍ篩に通し、ペレット化し、（ｍＭ）５．０ Ｄ－グルコース、１０ ＨＥＰＥＳ、１．０ ＭｇＣｌ_２、１２０ ＮａＣｌ、４．８ ＫＣｌ、２５ ＮａＨＣＯ_３、１．０ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．０ Ｌ－アラニン、１．４ ＣａＣｌ_２、６０Ｕ／ｍＬペニシリン、及び６０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する４０％のＰｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃：Ｐ１６４４）溶液中に再懸濁した。消化した生成物を、１８，５００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、ＰＴ細胞を含有する４番目の層を吸引し、ペレット化し、培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２－Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃：３１６０００３４及び２１７０００７５）中に再懸濁した。細胞を２４ウェルプレート上に播種し、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）培地及び既知組成培地（５μｇ／ｍＬインスリントランスフェリンセレン酸ナトリウム、５０ｎＭヒドロコルチゾン、２ｎＭ ３，３’，５－トリヨード－Ｌ－チロニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ＃：Ｉ１８８４、Ｈ０８８８、Ｔ５５１６）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）中で２４時間培養した。２４時間後、細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び既知組成培地中で生育させた。６日目（約７０％のコンフルエンス）に、０．６ｎＭのｒｈＡＣＥ２、本発明のポリペプチド、ｒｈＡＣＥ（陰性対照）、又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、対照）を用いて、ＰＴＥＣを２４時間処理した。バリアントを用いた処理後、アンジオテンシンＩＩ又はＭｃａ－ＡＰＫ（Ｄｎｐ）を、５ｎＭ Ａｎｇ ＩＩ又は１１．２５μＭ Ｍｃａ－ＡＰＫ（Ｄｎｐ）の最終濃度まで、各ウェルに添加した。Ａｎｇ ＩＩを用いて処理されたＰＴＥＣに関して、培地を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｃａｔ＃：Ｓ－１３３０）によりアンジオテンシン－（１－７）についてアッセイした。蛍光基質と共にインキュベートされたＰＴＥＣを、各ウェルから１００μＬ取り出し、黒色９６ウェルプレートへと移し、ＡＣＥ２酵素活性に関して記載された通りに蛍光を測定した。

上記の通りにインビトロでＡＣＥ２－Ｆｃバリアントの活性及び安定性を試験するために、培養した初代マウス近位尿細管細胞を、本発明の選択ポリペプチド、酵素対照（ｒｈＡＣＥ２、ｒｈＡＣＥ）又はＰＢＳを用いて２４時間処理し、続いて、蛍光原性基質（図６Ｄ）又はＡｎｇ ＩＩ（図６Ｅ）のいずれかと共にインキュベートした。すべての試験された本発明のポリペプチドは、３７℃で２４時間後に活性のままであり、蛍光原性基質（図６Ｄ）又はＡｎｇ ＩＩ（図６Ｅ）のいずれかを用いるそれらの活性は、陰性対照（ｒｈＡＣＥ）よりも有意に高く、且つ陰性対照（ｒｈＡＣＥ２）のものと同等であった。［本発明者らは、初代細胞培養における酵素活性に関する技術的データのうちの一部が、ケビンバーンス博士（ＯＨＲＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）の研究室により快く提供されたことに、深く感謝する］。

実施例６．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対するポリペプチド構築物の結合性
ＳＰＲによるスパイクＲＢＤからの解離速度
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の受容体結合性ドメイン（ＲＢＤ）に対する本発明のポリペプチドの結合動力学を、ＰＢＳＴ ｐＨ７．４ランニングバッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び３．４ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中２５℃で、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験により行った。社内製造した［４２］ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＲＢＤ武漢株及びＢ．１．３１５バリアント並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓ－ＲＢＤを、２００ＲＵでＣＭ－５センサーチップ上にアミンカップリングを介して固相化した。単一サイクル動力学を、３倍連続希釈（３０、６０又は１２０ｎＭの最大公称濃度）で各ポリペプチド構築物バリアントを注入することにより決定し、バッファーブランクを、９００秒間の解離相を有して１２０秒間にわたって５０μＬ／分でブランク及びＳ－ＲＢＤ表面上に同時に注入した。３０μＬ／分の流速で１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を用いて、３０秒間にわたって再生を行った。データ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて行った。二重参照センサーグラムをベースラインにアライメントし、オフレートランク付けについて６０ｎＭ注入の終了時へと標準化した。オフレートｋ_ｏｆｆ（Ｍ^－１ｓ^－１）を、二重参照データの１：１フィットから決定し、表５に一覧にした。アビディティは、流されたポリペプチド構築物の二価特性に起因して生じ、固相化Ｓ－ＲＢＤの密度が、熱力学的平衡定数Ｋ_Ｄの決定を妨げた。

本発明の試験されたポリペプチド構築物について取得されたアライメントされた標準化センサーグラムを図７Ａに示し、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤからのこれらの化合物の解離速度のランク付けにおいて有用である。解離速度は、さらなる治療剤開発に対する最良の結合剤を選択する上での主な基準であると典型的には考えられる。ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の９２位での自然突然変異と併せた２７位及び３３０位でのＡＤＡＰＴ親和性変化は、顕著に低下した解離速度をもたらし、したがって、未最適化ＡＣＥ２触媒ドメインを有するバリアント：ＡＣＥ２－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１５）及びＡＣＥ２－ＳＧ４ｘ３－Ｆｃ（配列番号１７）と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ドメインとの増加した相互作用を反映することが、図７Ａから直ちに明らかになる。最も遅い解離速度は、３種類のＡＣＥ２ｍ４バリアント（配列番号２１、２２及び２３）について観察され、ＡＣＥ２ｍ１－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１８）及びＡＣＥ２ｍ３－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２０）バリアントが近接してそれに続き、その後がＡＣＥ２ｍ２－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１９）であり、ＡＣＥ２ｍ２－ＳＧ４－Ｆｃは比較的速いｋ_ｏｆｆを有し、このｋ_ｏｆｆは未最適化ＡＣＥ２バリアントに関するよりも未だにはるかに遅い。表５中の解離速度の構造－活性関係は、Ｔ２７Ｙ置換のものよりも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤに対する結合相互作用の改善に対して、Ｎ３３０Ｙ置換の大きな役割を指摘する。このシリーズのポリペプチド構築物において取得された最も遅い解離速度は、１０^－６ｓ^－１のオーダーであり、非常に緊密な結合性を示す。

ｓｎＥＬＩＳＡによるスパイクＲＢＤに対する結合性競合
独自且つ臨床的に関連のある代理中和（ｓｎ）ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ［４３］もまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する本発明のポリペプチド構築物の結合能のインビトロ試験のための追加の方法として用いた。本アッセイでは、スパイクＲＢＤをマルチウェルプレート上に固相化し、続いて、中和能に関して試験される対象のサンプルと共にインキュベートした。続いて、ビオチン化ｈＡＣＥ２を添加し、ストレプトアビジン－ポリＨＲＰにより検出した。ビオチン化ｈＡＣＥ２と抗原との相互作用を遮断するサンプルの能力は、シグナルの用量依存的減少により測定することができる。本発明者らは、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ ＨＢＸプレート上の１００ｎｇの固相化組み換えＲＢＤを用い、プレートを４℃で一晩インキュベートした（２μｇ／ｍＬ）。ウェルに添加されるすべての体積は５０μＬであった。プレートを、２００μＬ ＰＢＳ－Ｔを用いて３回洗浄し、２００μＬ ３％のＢＳＡ（ＢｉｏＳｈｏｐ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．、ＳＫＩ４００．１）を用いて、室温で１～１．５時間ブロッキングした。上記の通りの４ステップの洗浄後、患者血清又は血漿の２倍連続希釈系列（０．５～４μＬのサンプル）を１時間インキュベートした。上記の通りにウェルを洗浄し、５０ｎｇビオチン化組み換えヒトＡＣＥ２と共に１時間インキュベートした。上記の通りの洗浄後、４４ｎｇストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓ２４３８）と共にウェルをインキュベートした。得られたシグナルを、ＴＭＢを用いて発色させ、定量化した。シグナルの日間変動に起因して、すべてのＯＤ_４５０値を、各サンプルについてサンプルを添加しなかったウェルのＯＤ_４５０に対して標準化する。すべての値を、この比率空間中に表す。

ｓｎＥＬＩＳＡアッセイを用いて取得されたＩＣ９０値を表５に列挙し、用量応答曲線を図７Ｂに示す。ｓｎＥＬＩＳＡ ＩＣ９０値とＳＰＲ結合性実験からのｋ_ｏｆｆ解離速度との間には定量的な合致が見られる。それにより、ｓｎＥＬＩＳＡ実験は、本発明のポリペプチド構築物のＡＣＥ２触媒ドメインにおいて行った構造的最適化が、未最適化バリアントと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに対する結合特性を顕著に改善することをさらに確認する。図７Ｂから明らかである重要な側面は、これらの化合物が、比較的高い用量で非常に低いレベルまでアッセイ中での競合因子として用いられるビオチン化ＡＣＥ２に対する結合性を低減させることが可能であることである。このことは、これらの化合物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを完全に中和することが可能であり、且つ宿主細胞上のＡＣＥ２へのその結合を妨げることを強く示唆する。このことは、これらの化合物を、強力な抗ウイルス剤として用いることができることを示す。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶバリアントに対する結合性
元の武漢株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクＲＢＤからの解離速度を評価することに加えて、より多くの本発明のポリペプチドをまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の関心が持たれるＢ．１．３５１（ベータ）バリアントの固相化Ｓ－ＲＢＤ、並びに武漢株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からは系統発生的により遠い以前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＳ－ＲＢＤへと結合する能力に関しても評価した［４４］。図７Ｃに表示されるグラフに示される通り、本発明のすべての試験されたポリペプチドは、Ｂ．１．３５１（ベータ）バリアントのＳ－ＲＢＤからの解離速度を示し、これは元の武漢株ウイルスバリアントのＳ－ＲＢＤからのものと同様であった。特筆すべきことに、本アッセイでの本発明のポリペプチドＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、元の武漢株ウイルスのＳ－ＲＢＤからのものよりも、Ｂ．１．３５１（ベータ）バリアントのＳ－ＲＢＤからはさらにより遅い解離速度を有した。

選択バリアントに関して、速度定数及びアビディティを伴う見かけのＫ_Ｄのより正確な推定値を誘導するために、約５００ＲＵで精製スパイクＲＢＤを固相化し、３６００秒間の比較的長い解離相を有して１８０秒間にわたって５０μＬ／分でブランク及びＳ－ＲＢＤ表面上に３、３０及び３００ｎＭの各ポリペプチド構築物を注入することにより、反復測定を行った。図７Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株、Ｂ．１．３５１（ベータ）及びＢ．１．１．５２９（オミクロン）バリアントのＳ－ＲＢＳに対する本発明のポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）についてのＳＰＲセンサーグラムを示し、図７Ｅは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の武漢株、Ｂ．１．３５１（ベータ）及びＢ．１．１．５２９（オミクロン）バリアントのＳ－ＲＢＳに対する本発明のポリペプチドＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）についてのＳＰＲセンサーグラムを示す。ポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）は、Ｂ．１．１３５バリアントに対する見かけ上１０倍強い結合性を有して、これらの２種類の重要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのいずれかのＳ－ＲＢＤに対して、非常に遅い動的解離速度（１０^－６Ｍ^－１ｓ^－１付近のｋ_ｏｆｆ）及びピコモル濃度の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を伴って結合する。しかしながら、ＳＰＲ実験は、非常に低い解離速度に起因して、これらのタンパク質複合体に関する検出限界（Ｌ．Ｏ．Ｄ．）に達している。本発明者らは、Ｂ．１．１．５２９（オミクロン）スパイクタンパク質ＲＢＤバリアントに対するポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）のＳＰＲ結合性実験も行い、同じ挙動、すなわち、ＳＰＲ法のＬ．Ｏ．Ｄ．に達した極めて強い結合性を観察した。ポリペプチドＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、これらの重要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのうちのいずれかのＳ－ＲＢＤに対して、遅い動的解離速度（１０^－４Ｍ^－１ｓ^－１付近のｋ_ｏｆｆ）及びナノモル濃度の解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）を伴って結合する。結合性は、元の武漢株ウイルスよりも、Ｂ．１．１３５ウイルスバリアントに対して強かった（４倍）。本発明者らはまた、Ｂ．１．１．５２９（オミクロン）Ｓ ＲＢＤバリアントに対するポリペプチドＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）のＳＰＲ結合性実験も行い、同じ挙動、すなわち、元の武漢株ウイルススパイクタンパク質ＲＢＤに対して、約４倍改善された結合親和性を観察した。考え合わせると、これらのデータは、現在出回っているすべてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対して、及び非常に高い確率を有して、将来新たに生じ得る他の突然変異型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対して、効率的に結合する、本発明のポリペプチドの広範な汎特異性を明らかに実証する。

実施例７．ポリペプチド構築物によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型ウイルス中和
偽型化ＶＬＰアッセイ
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づくスパイク偽型ウイルス代理アッセイを用いて、宿主細胞表面に存在するヒトＡＣＥ２受容体に対するウイルススパイクタンパク質の結合性により媒介される宿主細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス侵入の阻害に関して、本発明のポリペプチド構築物を評価した。本アッセイは、生存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する代替物として偽型化レンチウイルス粒子を用い、ＡＣＥ２を発現する宿主細胞株へのＶＬＰの侵入を遮断する、対象となる化合物の能力を測定する［４５］。偽型化ＶＬＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ルシフェラーゼレポーター及びＶＬＰをアセンブルするために必要とされるレンチウイルスタンパク質の最小限のセットを含む。ウイルス侵入の遮断は、ルシフェラーゼレポーターのシグナルの喪失により検出される。方法１及び方法２と命名された２種類の若干異なる偽型化ＶＬＰアッセイ実装を用いて、本発明のポリペプチドを評価した。

方法１では、ブルーム（Ｂｌｏｏｍ）研究室により最初に開発されたアッセイ［４５］を、堅牢性及び再現性を増加させるために最適化した［４３］。主な変更は、以下のことであった：１）感染の効率を改善する、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＣＥ２とＴＭＰＲＳＳ２を共発現させること；２）第２世代レンチウイルスパッケージングシステム（より高いＶＬＰレベルを生じた）を用いること；３）生成されるＶＬＰの品質での一貫性を改善した、ＶＬＰ生成のために３３℃まで温度を低下させることを含む、ＶＬＰ生成条件を適応させること。ＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２コード配列に対するエントリーベクターを、それぞれ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１７４５２）及びｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｈｙｇｒｏ ＤＥＳＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１７４５４）へとクローニングした。得られたトランスファーベクターを用いて、第２世代ｐｓＰＡＸ２及びＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、８４５４）を介して、レンチウイルスを作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＭＯＩ＜１でＡＣＥ２レンチウイルスを用いて形質導入し、ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて選択し、安定集団を作製した。その後、これらの細胞を、ＴＭＰＲＳＳ２レンチウイルスを用いて形質導入し、同様にハイグロマイシン（２００μｇ／ｍＬ）を用いて選択した。ＶＬＰ生成のために、５００μＬ ＪｅｔＰｒｉｍｅバッファー中で８μＬ ＪｅｔＰｒｉｍｅ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－トランスフェクションＳＡ、１１４－０１）を用いて、１．３μｇ ｐｓＰＡＸ２、１．３μｇ ｐＨＡＧＥ－ＣＭＶ－Ｌｕｃ２－ＩＲＥＳ－ＺｓＧｒｅｅｎ－Ｗ（ＢＥＩ、ＮＲ－５２５１６；ルシフェラーゼ並びにそれに続くＩＲＥＳ及びＺｓＧｒｅｅｎを発現するための、ＣＭＶプロモーターを用いるレンチウイルス骨格プラスミド）、及び０．４μｇ ＨＤＭ－ＩＤＴＳｐｉｋｅ－ｆｉｘＫ（ＢＥＩ、ＮＲ－５２５１４；コドン最適化型Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクをＣＭＶプロモーターの下に発現した；ＧｅｎＢａｎｋ、ＮＣ＿０４５５１２）を含む２ｍＬ増殖培地（ＤＭＥＭ中、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン［Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ］）を含有する６ウェルプレート形式で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一時的に共トランスフェクションした。トランスフェクションの８時間後、５％の熱不活性化ＦＢＳ及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有する３ｍＬのＤＭＥＭにより培地を置き換え、細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２で１６時間インキュベートし；続いて、さらに２４時間、３３℃及び５％のＣＯ２に移した。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、室温で５分間、５００×ｇで回転させ、０．４５μｍフィルターを通してろ過し、－８０℃で凍結させた。ウイルス力価は、対照に対して１０００超の相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を生じるウイルス希釈（約１：１００ウイルスストック希釈）と共に、ＨＩ１０培地（１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）を用いて、ポリ－Ｌ－リジンコーティング（５～１０μｇ／ｍＬ）９６ウェルプレート上のウェル当たり１０，０００細胞で、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を用いて評価した。中和アッセイに関して、血清サンプルの２．５倍連続希釈を、３７℃で１時間、１：１比率で希釈ウイルスと共にインキュベートし、その後、プレートしたＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に移し、３７℃及び５％のＣＯ２でさらに４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞を溶解させ、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６２０）を２分間添加し、その後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器を用いて読み取った。５０％の阻害濃度又は希釈（ＩＣ５０又はＩＤ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、非線形回帰によって算出した（ｌｏｇ［阻害剤］対標準化応答－可変勾配）。

方法２も、同じ公開されたプロトコールに基づき［４５］、したがって、方法１と概念的には似通っており、とりわけ、（ｉ）ヒトＡＣＥ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株上でのＴＭＰＲＳＳ２の共発現なし、及び（ｉｉ）ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞の一時的トランスフェクションによる３７℃でのレンチウイルスＶＬＰ生成をはじめとする、少数の顕著な差異を有する。

本発明のポリペプチド構築物に関して両方の方法により取得されたＩＣ５０データを、表６に列挙し、一方で用量応答曲線を図８に示す。最初に、本発明者らは、ＩＣ５０値間での１．０の線形相関Ｒ^２及びｌｏｇ_１０（ＩＣ５０）値間での０．９９のＲ^２を有する、２種類の実装を用いて取得されたＩＣ５０値間での良好な相関に注目する。さらに、これらの偽型ウイルス中和データは、先行して記載され、且つ表５に列挙される通りの、ＳＰＲ結合性実験により取得されたスパイクＲＢＤからのスパイク解離速度とほぼ完全に相関し、ｋ_ｏｆｆ及びＩＣ５０の間ではＲ^２＝０．９９（いずれかの偽型ウイルス中和法）、並びにｌｏｇ_１０ｋ_ｏｆｆ及びｌｏｇ_１０ＩＣ５０の間では０．９６～０．９９のＲ^２値（いずれかの偽型ウイルス中和法）を伴う。これらの極めて高い相関は、データの堅牢性を示し、本発明のポリペプチド構築物の作用機序、すなわち、ウイルススパイクＲＢＤに対する結合性が宿主細胞へのウイルス侵入を妨げることを強く確認する。本発明者らはまた、２種類の方法を用いて取得されたＩＣ５０データ間に良好な相関が見られるが、絶対的ＩＣ５０は、方法２よりも方法１を用いて高い値に読み替えられることにも注目する。この作用は、異なる実装に、及び特に、方法１ではＡＣＥ２発現細胞上でのＴＭＰＲＳＳ２の共発現を含むが、方法２では含まないことに起因し得る。ＴＭＰＲＳＳ２の共発現は、ウイルス侵入及び感染を促進し、それ故、ＴＭＰＲＳＳ２を含まない方法２と比較して、方法１を用いて、化合物の比較的高用量でなぜ中和が起こるのかを説明する可能性がある。

達成された最良の偽型ウイルス中和レベルは、両方の方法を用いて優れており、ＡＣＥ２ｍ４バリアントのうちの一部（配列番号２１、２３）は、方法１を用いて約２５ｎｇ／ｍＬ及び方法２を用いて３ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０値に到達する（表６）。ポリペプチド分子操作相中に行われる配列及び構造最適化（実施例１を参照されたい）は、偽型ウイルス中和効力の顕著な改善をもたらすことが、直ちに明らかになる。つまり、ＩＣ５０でのこれらの改善は、方法１を用いて８～１００倍、及び方法２を用いて少なくとも８～少なくとも３００倍の範囲である。表６中のデータのより詳細な構造－活性関係分析はまた、先行するセクションに記載される通りの結合性データの分析（表５）と完全に合致する、興味深いパターンも明らかにする。これらのパターンのうち、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の天然ヒトバリアントＩｌｅ９２が、９２位にＴｈｒ残基及び結果としてＡｓｎ９０に連結する炭水化物構造を有するより一般的なヒトバリアントと比較して、中和効力の顕著な改善を与えるという驚くべき予期せぬ知見を強調することが重要である。このことは、Ｔｈｒ９２を含むバリアントＡＣＥ２ｍ１－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号１８）を、Ｉｌｅ９２を含むが、ＡＣＥ２触媒ドメイン（Ｒ１領域）の残りはこれらのバリアント間で同一であるバリアントＡＣＥ２ｍ４－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２１）及びＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）と比較する場合、表６及び図８中のデータから容易に明らかになる。ＩＣ５０での驚くべき４～５倍（用いる方法に応じて）の減少は、したがって、ヒトＡＣＥ２触媒ドメイン中の自然突然変異Ｔ９２Ｉに直接的に起因する。

様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを用いて偽型化されたＶＬＰの中和
元の武漢株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＳタンパク質を含む中和されたＶＬＰ偽型の能力は、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来のＳタンパク質を用いて偽型化されたＶＬＰの細胞侵入を遮断するそれらの能力に関して、本発明の選択ポリペプチドを試験することを本発明者らに促した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上でヒトＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２を共発現する方法１を、本アッセイのために利用した。偽型化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクレンチウイルス粒子を、以下の改変を伴って、ブルームの研究室により記載される［４５］プロトコール及び試薬に従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の様々なバリアントを発現するプラスミドを用いて作製した：（１）ＨＥＫ２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞［４６］を、３００ｍＬでのレンチウイルス粒子の大規模生成のために用いた；（２）トランスフェクション後ＨＥＫ２９３ＳＦ－３Ｆ６細胞を、収量の改善のために３３℃でインキュベートした；（３）感染の７２時間後にレンチウイルス粒子を回収し、スクロースクッション遠心分離による濃縮に供した。簡潔には、上清を２０％のスクロースクッション上に載せ、４℃、３７，０００×ｇで３時間回転させた。続いて、濃縮された偽型化ＶＬＰを含有するペレットを、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中に再懸濁し、アリコートに分けた。ＡＴＣＣ及びＮＩＨのＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓリポジトリ（ＮＲ－５５２９３）から取得されたヒトＡＣＥ２及びＴＭＰＲＳＳ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、力価決定を行った。以下のプラスミドを用いた。武漢株：プラスミド名＝「ｐＨＤＭ ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２」（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ：ＳＡＲＳ関連コロナウイルス２、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイク－偽型化レンチウイルスキット、ＮＲ－５２９４８）。Ｄ６１４Ｇ：プラスミド名＝「ｐＨＤＭ ＳＡＲＳ２－Ｓｐｉｋｅ－Ｄｅｌ２１－Ｄ６１４Ｇ」、ＨＤＭ＿ＳＡＲＳ２＿Ｓｐｉｋｅ＿ｄｅｌ２１＿Ｄ６１４Ｇは、ジェシーブルーム（Ｊｅｓｓｅ Ｂｌｏｏｍ）からの寄贈品であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃：１５８７６２；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１５８７６２；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１５８７６２）。Ｂ．１．１．７（アルファ）：プラスミド名＝「ｐＰＡＣＫ－ＳＰＩＫＥ Ｎ５０１Ｙ」、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２「Ｓ」偽型－Ｎ５０１Ｙ変異体－レンチベクターパッケージングミックス（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＳＢＩ、Ｃａｔ＃：ＣＶＤ１９－５６０Ａ－１；突然変異：Ｎ５０１Ｙ）。Ｂ．１．３５１（ベータ）：プラスミド名＝「ｐＰＡＣＫ－ＳＰＩＫＥ Ｂ．１．３５１」、ＲＢＤ突然変異レンチベクターパッケージングミックス（ＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃：ＣＶＤ１９－５８０Ａ－１；突然変異：Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ）。Ｂ．１．６１７．２（デルタ）：プラスミド名＝「ｐｃＤＮＡ３．３－ＳＡＲＳ２－Ｂ．１．６１７．２）ｐｃＤＮＡ３．３－ＳＡＲＳ２－Ｂ．１．６１７．２」は、デイビッドネマジー（Ｄａｖｉｄ Ｎｅｍａｚｅｅ）からの寄贈品であった（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃：１７２３２０；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１７２３２０；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１７２３２０）。

偽型ウイルス中和アッセイを以前に記載されたプロトコール［４５］に従って行い、３８４ウェルプレートに適応させた。簡潔には、本発明の選択ポリペプチドを含有するサンプルの３倍連続希釈を、３７℃で１時間、１：１比率で希釈ウイルスと共にインキュベートし、その後、ＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に添加した。続いて、ウェル当たりの発光読み出し値により、感染性を測定した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６２０）をウェルに２分間添加し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器を用いて読み取った。５０％の阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、非線形回帰によって算出した（ｌｏｇ［阻害剤］対標準化応答－可変勾配）。

図８Ｃに示される通り、本発明において提供される試験されたポリペプチドは、すべての調査されたウイルスＳタンパク質バリアントを用いて偽型化されたＶＬＰに対する細胞感染の良好な遮断を与える。様々なウイルスバリアントについての関連するＩＣ５０値を、表６ａに列挙する（ｎＭ及びｎｇ／ｍＬ）。本発明の試験されたポリペプチドのそれぞれに関して、ウイルスバリアント間にわたってＩＣ５０値での小さな変動が見られることが直接的に明らかである。特筆すべきことに、試験された本発明の両方のポリペプチドは、元の武漢株ウイルスよりも強力に（２倍まで）、関心が持たれる主なバリアントであるＢ．１．６１７．２（デルタ）を中和することが明らかになる。考え合わせると、この偽型ウイルス中和データは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の現在のバリアント並びに将来新たに出現するバリアントにより引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９感染の軽減を目的とする堅牢なアプローチを与え得る、本発明のポリペプチドのクラスの汎特異性をさらに支持する。

実施例８．ポリペプチド構築物によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２真正ウイルス中和
生存複製性真正ウイルスによるヒトＶＥＲＯ－Ｅ６細胞の感染を中和する本発明のポリペプチドの能力もまた評価した。これは、マイクロ中和アッセイを用いて行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｃａｎａｄａ／ＯＮ／ＶＩＤＯ－０１／２０２０を、カナダ国立微生物学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、ＭＢ、Ｃａｎａｄａ）から取得し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞上で増殖させ、Ｖｅｒｏ細胞上で定量化した。全ウイルスゲノム配列決定を行い、元の分離株に対する正確な遺伝子同一性を確認した。第３継代ウイルスストックを用いた。中和活性は、マイクロ中和アッセイを用いて決定した。簡潔には、各ポリペプチドの１５μｇの１：５連続希釈を、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、及び０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した高グルコース培地であるＤＭＥＭ中で行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を、各抗体希釈に対して１：１比率において１２５プラーク形成単位（ＰＦＵ）で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、９６ウェルプレート中に播種したＶｅｒｏ Ｅ６細胞に、ウイルス／ポリペプチドミックスを用いて感染させ、感染後７２時間（ｈｐｉ）、加湿／５％のＣＯ_２インキュベーター中、３７℃でインキュベートした。続いて、細胞を１０％のホルムアルデヒド中で一晩固定し、ウイルス感染を、マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン＃１０３５１１１）を用いて検出し、ウサギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｎｃ．）を用いてカウンター染色した。比色分析発色を、ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリドペルオキシデート基質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて取得し、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダー上、４９０ｎｍで検出した。ＩＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを用いて、非線形回帰から決定した。

図９に示され且つ表７に列挙される通り、試験した選択ポリペプチドは、１～４ｎｇ／ｍＬ範囲でのＩＣ５０値を伴って生存ウイルスの複製を阻害し、陽性対照である抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２モノクローナル抗体ＲＥＧＮ１０９３３［４７］と比較して、１０倍超の改善された有効性を与えた。例えば、ポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）は、１ｎｇ／ｍＬ又は６ｐＭ付近の優れたＩＣ５０を伴って、インビトロ細胞培養において真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるヒトＶＥＲＯ－Ｅ６細胞の感染を阻害した。また、ポリペプチドＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、４ｎｇ／ｍＬ又は２２ｐＭ付近の良好なＩＣ５０を伴って、インビトロ細胞培養において真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるヒトＶＥＲＯ－Ｅ６細胞の感染を阻害した。比較すると、本アッセイでは、対照抗体ＲＥＧＮ１０９３３は、４３ｎｇ／ｍＬ又は２８７ｐＭのＩＣ５０を示した。考え合わせると、これらのデータは、結合親和性の改善のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤとのＡＣＥ２界面のＡＤＡＰＴによりガイドされる最適化が、細胞レベルでの顕著な機能的改善へと読み替えることができることを実証する。

実施例９．高血圧マウスでのインビボ評価
［本発明者らは、高血圧マウスでのインビボ評価に関する技術的データのうちの一部が、ケビンバーンス博士（ＯＨＲＩ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｔｔａｗａ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）の研究室により快く提供されたことに、深く感謝する］。

倫理的記述
動物に対して行われたすべての実験は、カナダ動物飼育協議会（ＣＣＡＣ；Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）の規則に従い、オタワ大学動物飼育委員会により承認された（プロトコール３５１４）。

介入の割り当て
マウスは、湿度及び温度が常にモニタリングされ、水及び食物への自由なアクセスを伴って、オタワ大学動物飼育施設で飼育された。ケージの割り当ては、シェルフ内で無作為に行った。実験群に対する割り当ては、オンライン無作為化ツール（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ）を用いて行った。

アンジオテンシンＩＩ点滴
１２～１４週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄性及び雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ（登録商標）、モデル１００４）の皮下埋め込みに供した。マウスに、ミニポンプ埋め込みの１時間前に、０．０１ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンを注入した。マウスを、最初に５％のイソフルランを用いて麻酔し、手術全体を通して２．５％のイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で維持した。動物を剃毛し、クロルヘキシジングルコン酸塩４％を含有する溶液を用いて皮膚を滅菌した。被膜下領域において脊椎に対して垂直に０．５ｃｍ幅で切開を行い、止血鉗子を用いて皮下ポケットを作製した。ミニポンプをポケット中に挿入し、２個の創傷縫合クリップを用いて切開部を閉じた。局所ブピバカインを切開部に塗布し、動物を、麻酔から回復するまで加熱回復領域に移した。マウスに手術後４時間でさらなるブプレノルフィン注入を投与し、１日２回、７２時間にわたってモニタリングした。アンジオテンシンＩＩを１０００ｎｇ／ｋｇ／分で３週間点滴し、対照マウスには、ミニポンプを介して生理食塩溶液を点滴した。

本発明のポリペプチドの静脈内投与
本発明の２種類のポリペプチドを、マウスに静脈内投与した：ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）及びＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）。２種類の分類のマウスを研究した：正常血圧及び高血圧。マウスを以下の群に割り当てた：ｉ）生理食塩液、ｉｉ）Ａｎｇ ＩＩ、ｉｉｉ）Ａｎｇ ＩＩ＋ｒｈＡＣＥ２、ｉｖ）Ａｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ、ｖ）Ａｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ。浸透圧ミニポンプ挿入から２．５週間後に、マウスにバリアントＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はｒｈＡＣＥ２（２．５ｍｇ／ｋｇ－ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃：７９２００８）の単回静脈内注入（尾静脈を介して）を投与した。対照マウスにはＰＢＳを投与した。本発明のポリペプチド又はｒｈＡＣＥ２の注入から７２時間後に安楽死を行い、血漿、腎臓、心臓、肺、肝臓、及び脾臓を分析のために回収した。

血圧測定
収縮期血圧（ＳＢＰ）を、以前に記載された通りに［４８］、テイルカフプレチスモグラフィー（ＢＰ－２０００；Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｅｘ、ＮＣ）により測定した。連続する５日間にわたってマウスに訓練を行い、ｍｏｃｋ測定値を取得した。ベースライン（３回測定）、浸透圧ミニポンプ埋め込みから２．５週間後（２～３回測定）、並びに本発明のポリペプチドの注入から３、６、２４、４８、及び７２時間後に、ＳＢＰを評価した。各マウスを、１時点当たり１０回のＳＢＰ読み取りに供し、平均ＳＢＰを、これらの読み出し値から算出した。

アンジオテンシンＩＩ点滴により誘導される高血圧を、浸透圧ミニポンプ埋め込みから２．５週間後でのＳＢＰの顕著な上昇により確認した。ｒｈＡＣＥ２は注入から最大６時間後までＳＢＰを一時的に低減させ、一方でＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）はＳＢＰに対して顕著な作用を有しなかった（図１０Ａ）。特筆すべきことに、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、最大２４時間にわたってＳＢＰを顕著に低減させ、この低下作用は、４８時間にわたって部分的に持続した（図１０Ａ）。

血漿及び組織ＡＣＥ２活性
ＡＣＥ２酵素活性を、エンドポイント（７２時間）で回収した血漿及び組織（腎臓、心臓、肺、肝臓、及び脾臓）において評価した。活性は、記載される通りに［４０］、ＡＣＥ２特異的阻害剤ＭＬＮ－４７６０を含めるか又は含めずに、Ａｎａｓｐｅｃからの蛍光原性基質Ｍｃａ－ＡＰＫ（Ｄｎｐ）を用いて決定した。血漿ＡＣＥ２活性は、５μＬの血漿中で決定した。組織ＡＣＥ２活性に関して、サンプルを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．０２５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃：Ｐ８３４０）を含有する５００μＬの溶解バッファー中でホモジナイズした。溶解物を、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して、残渣を除去した。上清を、－８０℃で保存した。タンパク質濃度を、ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃：５０００１１２）を用いて決定した。ＡＣＥ２存在量での差異に起因して、腎臓組織を１μｇ総タンパク質でアッセイし、蛍光原性基質と共に１時間インキュベートした。心臓、肺、肝臓、及び脾臓ＡＣＥ２活性を、１０μｇでアッセイし、蛍光原性基質（１１．２５μＭ）と共に１６時間インキュベートした。データは、平均±ＳＥＭとして提示される。統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ９．３．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍを用いて行った。群間での比較を、一元配置分散分析により行い、続いて、テューキー又はダネットの事後検定のいずれかを行った。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意であると考えた。

エンドポイント（本発明のポリペプチドの投与から７２時間後）でマウスから回収した血漿において、ＡＣＥ２活性を評価した。本アッセイでは、ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）はエンドポイントでの血漿中でほぼ不活性であったが、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）の活性は、すべての群と比較して有意に増加した（図１０Ｂ）。

組織ＡＣＥ２活性を、腎臓、心臓、肺、肝臓、及び脾臓の溶解物中で分析した（図１０Ｂ）。すべてのサンプルのうちで腎臓溶解物における活性での有意差はなかった。ＡＣＥ２活性は、Ａｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ群の心臓溶解物中で有意に増加した。ＡＣＥ２活性は、群Ａｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃの肝臓溶解物中で、有意に高かった。最後に、脾臓由来のサンプルを分析した場合、群間でのＡＣＥ２活性の差異はなかった（図８Ａ）。

免疫ブロッティング
組織溶解物を、上記の通りに取得した。溶解物の量は、以下の通りに、組織／サンプルタイプに応じて変化した：血漿１μＬ、腎臓２０μｇ、心臓及び肺３０μｇ、肝臓及び脾臓４０μｇ。溶解物を４×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーに添加し、勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（５～１５％）にロードし、電気泳動にかけた。タンパク質を、ゲルからニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃：１６２０１１２）へとトランスファーし、室温で１時間、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ－Ｔ）を含有するトリス緩衝生理食塩溶液（ｐＨ７．６）（ＴＢＳ－Ｔ）及び３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１時間ブロッキングした。メンブレンに、４℃で一晩、ヤギ抗ＡＣＥ２（１：１０００希釈、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃：ＡＦ９３３）によってプローブ付けし、続いて、１：５，０００ ＨＲＰ－ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃：７０５－０３５－１４７）と共にインキュベートした。ＩｇＧ Ｆｃに対するプローブ付けは、４℃で一晩、ＨＲＰ－ロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ １：１０，０００（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃：７０９－０３５－０９８）を用いて行った。化学発光を、メンブレンへのＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬の添加により誘導し（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃：ＣＡ９５０３８－５６４Ｌ）、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｑ定量的ウエスタンブロットイメージングシステム上で検出した。

ＡＣＥ２は、ｒｈＡＣＥ２及びＡｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）群の血漿中で免疫ブロッティングにより検出され、非常に低レベルで、Ａｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）群の血漿中で検出された（図１０Ｃ）。加えて、ＡＣＥ２は、数種類の群由来の多数の臓器組織からの溶解物中で検出された（図１０Ｃ）。大多数のサンプルにおいて、免疫ブロッティング検出（図１０Ｃ）は、測定されたＡＣＥ２活性と相関した（図１０Ｂ）。注記すべきことに、腎臓でのＡＣＥ２についての免疫ブロットは、実質的なレベルの内因性ＡＣＥ２（約１００ｋＤａ）を示し、より顕著でない高分子量バンド（２５０ｋＤａのすぐ下；本発明のＡＣＥ２－Ｆｃホモ二量体に対応する可能性がある）は、Ａｎｇ ＩＩ＋ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ群由来の溶解物においてのみ検出された。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγを用いてプローブ付けした場合、同じバンドが検出され、このことは、腎臓組織溶解物中のＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃの存在を示した。ＡＣＥ２及びＩｇＧ Ｆｃγについての免疫ブロットは、心臓溶解物中でのＡＣＥ２活性データと合致し、このことは、心臓組織でのＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃの顕著な保持を示す。肺溶解物もまた、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃの持続的な存在を実証した。さらに、内因性ＡＣＥ２に対するＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃの比率が上昇した。肝臓溶解物では、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃに対する高ＭＷバンドが、免疫ブロット上で再度検出された。脾臓由来の免疫ブロットにおいて、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃに対応する高ＭＷバンドについての強いシグナルが見られた。

アルブミン－クレアチニン比
スポット尿を、エンドポイント（７２時間）で回収した。尿サンプルを、製造業者の説明書に従って、１：２００～１：５００に希釈した。アルブミンは、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃：Ｅ９９－１３４）により測定した。クレアチニンは、Ｅｔｈｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｔ＃：１０１２）からの比色分析に基づくキットを用いて、尿中で定量化した。アルブミンの値をμｇ／ｄＬへと変換し、アルブミンのクレアチニンに対する比率を、アルブミンレベルをクレアチニンレベル（ｍｇ／ｄＬ）により除算することにより算出した。

アルブミンの尿中排出の増加は、腎臓損傷を示すことができる。エンドポイント（７２時間）で回収された尿を用いる分析は、アルブミン－クレアチニン比（ＡＣＲ）での顕著な変化がなかったことを示した。しかしながら、生理食塩液群と比較して、高血圧群では増加の明らかな傾向が見られた。ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）を用いて処置された高血圧マウスは、生理食塩液群と同等の、アルブミン排出に関する最低値を有した（図１０Ｄ）。

結論として、本発明の多数の新規ポリペプチドが、ｒｈＡＣＥ２と同等の性能を伴って持続的なインビトロＡＣＥ２活性を示したが、ポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）はインビボでは迅速に活性を失った。候補ポリペプチドＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、このモデルにおいてインビボで強化された性能を有し、ＳＢＰを一時的に低減させた。ｉ．ｖ．注入の７２時間後の様々な組織溶解物中でのＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）の持続する検出は、増加したＡＣＥ２活性及び長期的な血圧低下作用と共に、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）が、顕著な治療的潜在能力を有し得ることを示唆する。考え合わせると、血漿及び様々な組織でのＡＣＥ２酵素活性及び免疫ブロッティングは、矛盾せず、且つＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）を用いて観察されるＳＢＰ低下作用並びに低減したアルブミン尿（ａｌｂｕｍｉｎｕｒｅａ）を支持し、ＣＯＶＩＤ－１９により引き起こされる主要な臓器傷害に対する保護的薬剤としての本発明の選択ポリペプチドの治療効果を強く示唆する。

実施例１０．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターにおけるインビボ評価
鼻内投与
高血圧マウスのインビボモデルにおいて観察された血漿中での本発明の一部のポリペプチドの不安定性を考慮して、鼻内投与経路を、ハムスターモデルを用いるＣＯＶＩＤ－１９からの回復をインビボで試験するために最初に採用した［４９］。雄性シリアゴールデンハムスター（８１～９０ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｉｎｔ－Ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＱＣ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。動物を、カナダ動物飼育協議会のガイドラインに従って、カナダ国立研究機構（ＮＲＣ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａ）の動物施設で維持した。本研究において動物に対して行ったすべての手順は、ＮＲＣヒト健康治療剤動物飼育委員会（ＮＲＣ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による動物使用プロトコール２０２０．０６において審査及び承認された規則及びガイドラインに従った。雄性ハムスターに、８×１０^３ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｃａｎａｄａ／ＯＮ／ＶＩＤＯ－０１／２０２０を鼻内負荷した。２種類の投薬レジメンを試験した。組み合わせた予防的及び治療的投薬において、動物に、ウイルス負荷の４時間前に本発明のポリペプチドを鼻内投与し、ウイルス負荷の２４時間後にも反復用量を投与した。治療的投薬のみでは、動物に、ウイルス負荷の６時間後に本発明のポリペプチドを鼻内投与し、反復用量を、２４時間間隔で投与した。すべての鼻内投与は、合計７５μＬの試験物品溶液が各鼻孔に投与されるまで、左及び右鼻孔の間で交互に、１５０μＬの固定合計体積を用いて行った。対照群の動物には、ＰＢＳビヒクルのみを投与した。毎日の体重を測定した。データは平均±ＳＥＭとして提示した。ｎ＝６～７動物／群。

組み合わせた予防的及び治療的投与後の様々な群に対する体重変化を、図１１Ａに示す。試験された本発明の両方のポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）及びＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、低減された体重減少により示される通り、対照群（ビヒクルのみ）と比較して、処置群に対する顕著な影響を有した。両方の試験された物品に関して、回復は、負荷３日間後での体重増加を実際にはもたらした。さらに、ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃポリペプチド構築物による同様の回復が、４ｍｇ／ｋｇの高用量（２回投与された）並びに１ｍｇ／ｋｇの低用量（２回投与された）の試験された２種類の用量で達成された。これらの結果は、非全身性投与経路を介して、限定するものではないが、ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）をはじめとする本発明のポリペプチドを用いてＣＯＶＩＤ－１９を治療することの実行可能性を実証する。

治療的投与のみの後の様々な群に対する体重変化を、図１１Ｂに示す。試験された本発明の両方のポリペプチドＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２３）及びＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は、低減された体重減少により示される通り、対照群（ビヒクルのみ）と比較して、処置群に対する顕著な影響を有した。ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃポリペプチド構築物は、ＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃポリペプチド構築物よりも少数回の投与でさえも、より著しい回復をもたらした（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇの３回対５回の治療的投与）。さらに、回復は、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ処置を用いて負荷後２日目後、及びＡＣＥ２ｍ４－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４処置を用いて負荷後４日目後での体重増加を実際にはもたらした。これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染及びＣＯＶＩＤ－１９からの回復のための治療剤としてのこれらの発明のポリペプチドの意図される使用に対するさらなる支持を実証する。

静脈内投与
ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）は血漿並びに肺及び他の臓器をはじめとする臓器組織中での優れた安定性を示したので（図１０）、ＣＯＶＩＤ－１９ハムスターモデル［４９］でのインビボに対する全身性投与経路を用いても評価した。雌性シリアゴールデンハムスター８１～９０ｇ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）に、１０^４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生存ウイルスを鼻内的に感染させた。ＰＢＳ溶液中の本発明の選択ポリペプチドを、ウイルス負荷の時点で、１０ｍｇ／Ｋｇの用量で後眼窩静脈（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｖｅｉｎ）に投与した。同じ用量を用いる反復投与を、ウイルス負荷の２４時間後に行った。動物の対照群には、ＰＢＳのみを投与した。各群は、７頭の動物からなった。負荷の３日間後に動物を安楽死させ、プラークアッセイにより肺組織に関してウイルス量を決定した。負荷の３日間後に動物を安楽死させ、以前に記載される通りに［５０］、培養ＶＥＲＯ－Ｅ６細胞の感染によるプラークアッセイを用いて、肺組織中のウイルス量を決定した。

図１１Ｃに示される通り、ＡＣＥ２Ｉ９２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２８）のｉ．ｖ．投与は、プラークアッセイにより決定される生存ウイルスの中央値レベルが、ＰＢＳ対照群の中央値レベルと比較して、ほぼ１桁分低減したことから明らかである通り、雌性ハムスターでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を低減させた。重要なことに、本発明のポリペプチドのＡＣＥ２エクトドメイン領域中のＴ９２Ｉ突然変異が、ウイルス力価の低減を達成するために重要であることが、図１１Ｃに示されるデータから明らかである。このことは、ＰＢＳ対照群での中央値ウイルス力価と比較してウイルス力価の中央値低減をもたらさず、且つ対照的に全く逆の作用を有するようである、親非突全変異型ヒトＡＣＥ２エクトドメインを組み込むＡＣＥ２－ｈｉｎｇｅ２ＣＳ－ＳＧ４－Ｆｃ（配列番号２７）ポリペプチドとの比較から分かる。このデータは、ＣＯＶＩＤ－１９感染及び付随する主要臓器傷害に対する驚くべき予期せぬ有効性プロフィールを有する欠かせない重要な要素としての、ヒトＡＣＥ２の天然に存在するＴ９２Ｉ突然変異に基づく、本発明のポリペプチド融合体の固有構造を強調する。

配列表

参考文献：
以下の参考文献のそれぞれの内容は、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる。
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［２３］ Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ Ｖ， Ｄｕｒｏｕｘ Ｐ， Ｊａｂａｄｏ－Ｍｉｃｈａｌｏｕｄ Ｊ， Ｆｏｌｃｈ Ｇ， Ａｏｕｉｎｔｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ＩＭＧＴ（Ｒ）， ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｒ） ２５ ｙｅａｒｓ ｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１５；４３：Ｄ４１３－２２．
［２４］ Ｌｉｐｐｉ Ｇ， Ｌａｖｉｅ ＣＪ， Ｈｅｎｒｙ ＢＭ， Ｓａｎｃｈｉｓ－Ｇｏｍａｒ Ｆ． Ｄｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２ （ＡＣＥ２） ｇｅｎｅ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）？ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ． ２０２０；５８：１４１５－２２．
［２５］ Ｓｏｒｏｋｉｎａ Ｍ， Ｊ ＭＣＴ， Ｂａｒｒｅｒａ－Ｖｉｌａｒｍａｕ Ｓ， Ｐａｓｃｈｋｅ Ｒ， Ｐａｐａｓｏｔｉｒｉｏｕ Ｉ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ． Ｓｃｉ Ｄａｔａ． ２０２０；７：３０９．
［２６］ Ｓｔａｗｉｓｋｉ ＥＷ， Ｄｉｗａｎｊｉ Ｄ， Ｓｕｒｙａｍｏｈａｎ Ｋ， Ｇｕｐｔａ Ｒ， Ｆｅｌｌｏｕｓｅ ＦＡ， Ｓａｔｈｉｒａｐｏｎｇｓａｓｕｔｉ ＪＦ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ＡＣＥ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ． ｂｉｏＲｘｉｖ． ２０２０：２０２０．０４．０７．０２４７５２．
［２７］ Ｖａｎｉｏｔｉｓ Ｇ， Ｍｏｆｆｅｔｔ Ｓ， Ｓｕｌｅａ Ｔ， Ｗａｎｇ Ｎ， Ｅｌａｈｉ ＳＭ， Ｌｅｓｓａｒｄ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ＩＧＦ－ＴＲＡＰ ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１８；８：１７３６１．
［２８］ Ｓｔｒａｎｄ Ｊ， Ｈｕａｎｇ ＣＴ， Ｘｕ Ｊ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． ２０１３；１０２：４４１－５３．
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［３１］ Ｒａｇａｂ Ｄ， Ｓａｌａｈ Ｅｌｄｉｎ Ｈ， Ｔａｅｉｍａｈ Ｍ， Ｋｈａｔｔａｂ Ｒ， Ｓａｌｅｍ Ｒ． Ｔｈｅ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｔｏｒｍ； Ｗｈａｔ Ｗｅ Ｋｎｏｗ Ｓｏ Ｆａｒ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０２０；１１：１４４６．
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［３７］ Ｓｕｌｅａ Ｔ， Ｖｉｖｃｈａｒｕｋ Ｖ， Ｃｏｒｂｅｉｌ ＣＲ， Ｄｅｐｒｅｚ Ｃ， Ｐｕｒｉｓｉｍａ ＥＯ． Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｏｌｖａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒａｎｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ． Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｍｏｄｅｌ． ２０１６；５６：１２９２－３０３．
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［４２］ Ｃｏｌｗｉｌｌ Ｋ， Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｙ， Ｓｔｕｉｂｌｅ Ｍ， Ｇｅｒｖａｉｓ Ｃ， Ａｒｎｏｌｄ Ｃ， Ｒａｔｈｏｄ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ａ “Ｍａｄｅ－ｉｎ－Ｃａｎａｄａ” ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． ｍｅｄＲｘｉｖ． ２０２１：２０２１．１０．２５．２１２６５４７６．
［４３］ Ａｂｅ ＫＴ， Ｌｉ Ｚ， Ｓａｍｓｏｎ Ｒ， Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ－Ｔｅｈｒａｎｉ Ｐ， Ｖａｌｃｏｕｒｔ ＥＪ， Ｗｏｏｄ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２． ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ． ２０２０；５．
［４４］ Ｓｔａｒｒ ＴＮ， Ｇｒｅａｎｅｙ ＡＪ， Ｈｉｌｔｏｎ ＳＫ， Ｅｌｌｉｓ Ｄ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＫＨＤ， Ｄｉｎｇｅｎｓ ＡＳ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｅｐ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ｏｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ＡＣＥ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ． Ｃｅｌｌ． ２０２０；１８２：１２９５－３１０ ｅ２０．
［４５］ Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＫＨＤ， Ｅｇｕｉａ Ｒ， Ｄｉｎｇｅｎｓ ＡＳ， Ｌｏｅｓ ＡＮ， Ｍａｌｏｎｅ ＫＤ， Ｗｏｌｆ ＣＲ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ． Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０２０；１２．
［４６］ Ｃｏｔｅ Ｊ， Ｇａｒｎｉｅｒ Ａ， Ｍａｓｓｉｅ Ｂ， Ｋａｍｅｎ Ａ． Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ２９３ＳＦ－３Ｆ６ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． １９９８；５９：５６７－７５．
［４７］ Ｂａｕｍ Ａ， Ａｊｉｔｈｄｏｓｓ Ｄ， Ｃｏｐｉｎ Ｒ， Ｚｈｏｕ Ａ， Ｌａｎｚａ Ｋ， Ｎｅｇｒｏｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ． ＲＥＧＮ－ＣＯＶ２ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ａｎｄ ｈａｍｓｔｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０２０；３７０：１１１０－５．
［４８］ Ｃａｌｌｅｒａ ＧＥ， Ａｎｔｕｎｅｓ ＴＴ， Ｃｏｒｒｅａ ＪＷ， Ｍｏｏｒｍａｎ Ｄ， Ｇｕｔｓｏｌ Ａ， Ｈｅ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ ａｔ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ ｄｏｓｅｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ－ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＣＥ２／ＡＴ２Ｒ／Ｍａｓ ａｘｉｓ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１６；３６．
［４９］ Ｉｍａｉ Ｍ， Ｉｗａｔｓｕｋｉ－Ｈｏｒｉｍｏｔｏ Ｋ， Ｈａｔｔａ Ｍ， Ｌｏｅｂｅｒ Ｓ， Ｈａｌｆｍａｎｎ ＰＪ， Ｎａｋａｊｉｍａ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒｓ ａｓ ａ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０２０；１１７：１６５８７－９５．
［５０］ Ａｋａｃｈｅ Ｂ， Ｒｅｎｎｅｒ ＴＭ， Ｔｒａｎ Ａ， Ｄｅｓｃｈａｔｅｌｅｔｓ Ｌ， Ｄｕｄａｎｉ Ｒ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＢＡ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅｓｉｓｔｉｎ－ｔｒｉｍｅｒｉｚｅｄ ｓｐｉｋｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＳｍＴ１ ａｎｄ ＳＬＡ ａｒｃｈａｅｏｓｏｍｅ ａｄｊｕｖａｎｔ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０２１；１１：２１８４９．

Claims (21)

1. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和し且つＡｎｇ－ＩＩをＡｎｇ－（１－７）へと変換することが可能なポリペプチド構築物であって、４つの領域を含み、且つ一般式：
   Ｒ１［ｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０］－Ｒ２－Ｒ３［ヒンジＳ^２２０，Ｘ^２２６，Ｘ^２２９］－Ｒ４［Ｃ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３］
   を有し、
   式中、ｈＡＣＥ２Ｉ^９２（１８－６１４），Ｘ^２７，Ｘ^２６１，Ｘ^３３０と表されるＲ１は、残基Ｘ^２７、Ｘ^２６１及びＸ^３３０を含む、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ｈＡＣＥ２）受容体触媒ドメイン残基１８～６１４の天然に存在するバリアントＩｌｅ９２（Ｉ９２）を含むＮ末端の第１領域であり；Ｘ^２７はＴｈｒ又はＴｙｒのいずれかである２７位のアミノ酸残基であり、Ｘ^２６１はＣｙｓ又はＳｅｒのいずれかである２６１位のアミノ酸残基であり、且つＸ^３３０はＡｓｎ又はＴｙｒのいずれかである３３０位のアミノ酸残基であり；
   Ｒ２は、柔軟性ペプチドスペーサーを含む第２領域であり；
   Ｒ３は、ヒトＩｇＧ１重鎖抗体のヒンジ領域を含む第３領域であり、前記ヒンジ領域は、残基Ｓ^２２０、Ｘ^２２６及びＸ^２２９を含み；ヒトＩｇＧ１ヒンジ２２０位のアミノ酸残基はＳｅｒであり、且つ、ヒトＩｇＧ１ヒンジ２２６位及び２２９位のアミノ酸残基はＣｙｓ又はＳｅｒのいずれかであり；且つ
   Ｒ４は、ポリペプチドのＣ末端の第４の領域であり、Ｒ４は、Ｃ_Ｈ２Ｇ^２７０－Ｃ_Ｈ３と示されてこれを含み、且つヒトＩｇＧ１抗体重鎖の第２定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２）及び第３定常ドメイン（Ｃ_Ｈ３）を含み、ヒトＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ２ドメイン中の２７０位のアミノ酸残基はグリシンである、
   ポリペプチド構築物。
2. 前記Ｒ２スペーサー領域が、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基を含む柔軟性ペプチドスペーサーを含む、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
3. ２５００ｎｇ／ｍＬ（１２．５ｎＭ）の濃度未満のＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質バリアントにより媒介される細胞感染を中和する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
4. 少なくとも５００ｎｇ／ｍＬ（２．５ｎＭ）のＩＣ５０で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
5. 組み換えヒトＡＣＥ２の、触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）の少なくとも３０％及び酵素活性の少なくとも６０％を保持する、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
6. Ｒ１が、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及びそれらに対して少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
7. Ｒ２が、配列番号８、配列番号９、及びそれらに対して少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
8. Ｒ３が、配列番号１１、配列番号１２、及びそれらに対して少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
9. Ｒ４が、配列番号１４を有する配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
10. 配列番号１６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２８、及びそれらに対して少なくとも９０％同一である配列からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
11. 二量体ポリペプチドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
12. 前記二量体ポリペプチドが、ジスルフィド架橋によりそれぞれのＲ３ヒンジ領域を介して、連結され得るか、又は二量体化し得る、請求項１１に記載のポリペプチド構築物。
13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードする核酸分子。
14. 請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
15. 選択された発現宿主により分泌可能である形態の請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
16. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物及び薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物。
17. 請求項１３に記載の核酸分子又は請求項１４に記載のベクターを含む、トランスジェニック細胞宿主。
18. 第１のポリペプチド構築物と同じ第２のポリペプチド構築物をコードする第２の核酸分子又は第２のベクターをさらに含む、請求項１５に記載のトランスジェニック細胞宿主。
19. 請求項１６に記載の宿主を培養するステップ、及び請求項１０に記載の二量体ポリペプチド構築物を、当該宿主の増殖により馴化された培地から回収するステップを含む、二量体ポリペプチドを生成するための方法。
20. 医学的状態、疾患又は障害の治療のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物の使用。
21. 前記医学的状態、疾患又は障害が、ＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルス感染、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）並びに肺、心臓、腎臓、脳及び腸などの関連する主要臓器不全を含む、請求項２０に記載の使用。

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