CN117321196A

CN117321196A - Ace2-受体胞外域融合分子及其用途

Info

Publication number: CN117321196A
Application number: CN202280021537.9A
Authority: CN
Inventors: T·苏利; Y·杜罗切尔
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2023-12-29
Also published as: JP2024505203A; EP4284926A1; WO2022162533A1; KR20230136628A; CA3206022A1

Abstract

本发明总体上涉及能够中和SARS‑CoV‑2并提供ACE2酶活性的多肽，以及这些多肽用于治疗冠状病毒感染相关病症(COVID‑19)和伴随的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和主要器官损伤的用途，以及制造此类分子的方法。

Description

ACE2-受体胞外域融合分子及其用途

技术领域

本发明涉及人ACE2受体胞外域融合分子及其用途。更具体地，本发明涉及人ACE2受体催化结构域与人IgG1抗体框架的结构元件的蛋白质融合变体及其在减少冠状病毒感染(COVID-19)和伴随的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)中的用途。

背景技术

COVID-19大流行仍在继续，是一场前所未有严重的全球医疗保健危机。尽管潜在疫苗的临床试验正在进行中，但广泛人群疫苗接种的安全性和有效性仍存在不确定性。针对COVID-19感染的生物疗法非常缺乏，目前的策略对患者结局影响不大。在这方面，COVID-19的许多危重疾病并发症包括脓毒症休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和急性肾损伤(AKI)至少部分是由宿主反应介导的，特别是在肾素-血管紧张素系统(RAS)内[1-3]。重要的是，引起COVID-19的病毒SARS-CoV-2直接与血管紧张素转化酶2(ACE2)相互作用，血管紧张素转化酶2是介导其细胞进入的质膜蛋白[4-6]。

SARS-CoV-2病毒利用其刺突蛋白用于附着并内化到宿主细胞中作为病毒复制所需的关键步骤。因此，刺突蛋白已成为开发有前景的抗COVID-19生物治疗药物、疫苗和诊断剂的主要分子靶标。处于其预融合状态下的刺突蛋白三聚体允许其受体结合结构域(RBD)直接与宿主细胞上的ACE2受体相互作用。自从这场大流行出现以来，对刺突蛋白与其人受体ACE2相关的结构和功能有了很多了解。其中一些理解导致了旨在开发针对这种疾病的生物治疗药物的几种方法。在这些众多方法中，阻止病毒进入的两个主要方向包括用中和单克隆抗体和ACE2受体诱饵与刺突蛋白结合。从病毒进入阻断的角度严格来看，抗体的主要责任是针对新出现的病毒株的功效下降的风险[7]，而基于人ACE2的受体诱饵原则上应具有强大的泛特异性特征谱。

血管紧张素(Ang)II是一种具有抗炎和促凝血作用的有效的血管收缩剂。ACE2是一种单羧肽酶，其将Ang-II转化为Ang-(1-7)，Ang-(1-7)是一种针对Ang-II的血管舒张反调节肽。SARS-CoV-2感染增加肺和冠状动脉的微血管血栓和凝血(增加的D-二聚体)，这与增加的COVID-19死亡率有关[8,9]。对于呼吸道病毒H1N1和H5N1，SARS-CoV-2结合并抑制ACE2[4-6]，因此ACE2是COVID-19感染患者的潜在生物标志物和治疗靶点。ACE2在H1N1、H5N1、H7N9和SARS中下调，导致Ang-II水平升高，并加重肺损伤[10,11]。因此，肾素-血管紧张素系统(RAS)的局部激活可能介导COVID-19中对SARS-CoV-2的肺、心脏和其他器官损伤反应。因此，增加SARS-CoV-2中局部组织ACE2活性的策略可以通过减少Ang-II(有害的)和增强Ang-(1-7)(保护性)来减轻细胞损伤。因此，针对该病毒的基于ACE2的诱饵不仅具有中和病毒进入宿主细胞的潜力，而且通过双重作用机制提供Ang-II到Ang-(1-7)的酶促转化，从而转变为恢复保护性RAS途径，并减轻ARDS。

几项研究集中于使用单独的或与人抗体的Fc区融合的人ACE2胞外域，保留或不保留其酶活性[12-15]。然而，需要旨在多因素优化的创新分子工程改造来开发具有临床效率和大规模可生产性的基于ACE2的生物治疗药物。仍然需要基于ACE2的诱饵，其导致更有效的病毒中和，同时提供Ang-II转化的ACE2酶活性。

发明内容

本发明提供了改进的基于ACE2的诱饵。与本领域的其他方法不同，我们关注于人ACE2受体的天然变体，其在位置92处具有异亮氨酸(Ile)氨基酸残基，在人群中广泛存在的更常见的ACE2受体中，在位置92处通常存在苏氨酸(Thr)氨基酸残基。在本发明的过程中，我们发现，采用这种天然存在的人变体(本文称为hACE2I92)的结构和功能元件改善了基于ACE2的诱饵的几种特性，其中对于上述双重作用机制来说最关键的是改善的催化活性和改善的病毒中和。使用ACE2I92作为多方面分子设计工作的起点，我们现在提供了一类多肽构建体，其具有：(a)与刺突蛋白的强结合亲合力(avidity)和亲和力(affinity)以用于病毒感染的有效中和，(b)用于减少ARDS的高酶促活性和(c)改善的生物可制造性；同时提供用于以下的结构成分：(d)适当的药代动力学，以允许病毒清除，同时防止抗体依赖性增强(ADE)，以及(e)针对新出现的株系和未来的流行病提供保护。

因此，提供了能够中和SARS-CoV-2并将Ang-II转化为Ang-(1-7)的多肽构建体，其包含四个区域并具有通式：

R1[hACE2I⁹²(18-614),X²⁷,X²⁶¹,X³³⁰]-R2-R3[铰链S²²⁰,X²²⁶,X²²⁹]-R4[C_H2G²⁷⁰-C_H3]

并且其中：R1表示hACE2I⁹²(18-614),X²⁷,X²⁶¹,X³³⁰，是包含人血管紧张素转化酶2(hACE2)受体催化结构域残基18至614的天然存在的变体Ile92(I92)的N末端第一区域，其包含残基X²⁷、X²⁶¹和X³³⁰；其中X²⁷是位置27处的氨基酸残基，其是Thr或Tyr，X²⁶¹是位置261处的氨基酸残基，其是Cys或Ser，并且X³³⁰是位置330处的氨基酸残基，其是Asn或Tyr；R2是包含柔性肽间隔子的第二区域；R3是包含人IgG1重链抗体的铰链区的第三区域，其中所述铰链区包含残基S²²⁰、X²²⁶和X²²⁹；其中人IgG1铰链位置220处的氨基酸残基是Ser，并且其中人IgG1铰链位置226和229处的氨基酸残基是Cys或Ser；和R4是多肽的C末端的第四区域，其中R4表示为并包含C_H2G²⁷⁰-C_H3，并且包含人IgG1抗体重链的第二恒定结构域(C_H2)和第三恒定结构域(C_H3)，其中人IgG1 C_H2结构域中位置270处的氨基酸残基是甘氨酸。

在一个实施方案中，多肽构建体的R2间隔子区域包含含有Gly和Ser残基的柔性肽间隔子。

在一个实施方案中，多肽构建体以至少500ng/mL的IC50中和SARS-CoV-2。

在一个实施方案中，多肽构建体保留重组人ACE2的至少30％的催化效率(k_cat/K_M)和至少60％的比活性。

在一个实施方案中，多肽构建体的R1包含选自以下的序列：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和/或与其至少90％相同的任何序列。

在一个实施方案中，多肽构建体的R2包含选自以下的序列：SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9和/或与其至少90％相同的任何序列。

在一个实施方案中，多肽构建体的R3包含选自以下的序列：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12和/或与其至少90％相同的序列。

在一个实施方案中，多肽构建体的R4包含以下序列：具有SEQ ID NO：14的序列，或与其至少90％相同的序列。

在一个实施方案中，本发明的多肽构建体包含选自以下的序列：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和与其至少90％相同的序列。

在一个实施方案中，本发明的多肽构建体是二聚体多肽。在一个实施方案中，二聚体多肽可以通过各自的R3铰链区通过二硫桥连接或可以二聚化。

另一个实施方案是编码本文所述的任何多肽构建体的核酸分子。本发明还提供了用于产生多肽的表达载体，其中所述表达载体包含编码其中所述的任何多肽构建体的核酸分子。在一个实施方案中，编码本发明的多肽的核酸序列呈可由选择的表达宿主分泌的形式。

另一个实施方案是包含本文所述的多肽构建体和药学上可接受的承载体、稀释剂或赋形剂的组合物。

在另一个实施方案中，提供了转基因细胞宿主，其包含编码本文所述的任何多肽构建体的核酸分子，或用于产生本发明的任何多肽构建体的表达载体。

在另一个实施方案中，转基因细胞宿主还包含编码与第一多肽构建体相同的第二多肽构建体的第二核酸分子或第二载体。

另一个实施方案是用于产生二聚体多肽的方法，其包括培养所提供的转基因细胞宿主，和从通过该宿主的生长条件化的培养基中回收根据本发明的二聚体多肽构建体。

另一个实施方案是本文所述的多肽构建体用于治疗医学病况、疾病或病症的用途。在一个实施方案中，医学病况、疾病或病症包括冠状病毒感染例如COVID-19、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和相关的主要器官衰竭例如肺、心脏、肾、脑和肠衰竭。

如本文所述，本发明的多肽构建体类别包含四个区域R1、R2、R3和R4(图1)。这些多肽可用于中和SARS-CoV-2以治疗COVID-19，以及将Ang-II转化为Ang-(1-7)以治疗ARDS。本发明的多肽具有通式：

R1-R2-R3-R4

其中R1包含hACE2I⁹²(18-614),X²⁷,X²⁶¹,X³³⁰，其中X²⁷是Thr或Tyr，X²⁶¹是Cys或Ser，X³³⁰是Asn或Tyr；

R2包含间隔子或接头；

R3包括铰链S²²⁰,X²²⁶,X²²⁹；其中X²²⁶和X²²⁹是Cys或Ser；和

R4包含C_H2G²⁷⁰-C_H3。

在一个优选的实施方案中，多肽包含具有以下通式的多肽：

R1[hACE2I⁹²(18-614),X²⁷,X²⁶¹,X³³⁰]-R2[间隔子]-R3[铰链S²²⁰,X²²⁶,X²²⁹]-R4[C_H2G²⁷⁰-C_H3]

R1区域，表示为hACE2I⁹²(18-614),X²⁷,X²¹⁶,X³³⁰，是包含人血管紧张素转化酶2(hACE2I⁹²)的天然存在的变体Ile92的第一(N末端)区域。天然ACE2酶的ACE2 collectrin(颈部)结构域被确定为将ACE2催化结构域二聚体锁定在刚性构象中，而这与SARS-CoV-2刺突三聚体的结合不相容；因此，去除了颈部(collectrin)结构域，以生成由残基18至614组成的受体催化结构域所组成的R1区域，其中X²⁷是位置27处的氨基酸残基，其是Thr或Tyr，X²⁶¹是位置261处的氨基酸残基，其是Cys或Ser，X³³⁰是位置330处的氨基酸残基，其是Asn或Tyr。在优选的非限制性实施方案中，多肽构建体的R1区域选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和与其基本上相同的序列。

R2区域，在本文中也表示为间隔子或接头，是本发明的多肽构建体的第二区域，其包含由Gly和Ser残基组成的柔性多肽接头。在优选的非限制性实施方案中，多肽构建体的R2区域选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和与其基本上相同的序列。如本领域技术人员将理解的，本发明的多肽构建体不限于本文具体指出的R2区域，而是可以包含任何合适的间隔子或接头(本文中可互换使用)，条件是所述接头或间隔子具有允许本发明的多肽的可操作功能的序列和长度。

R3区域，表示铰链S²²⁰,X²²⁶,X²²⁹，是包含在位置220处具有Ser氨基酸残基的人IgG1重链抗体的铰链区的第三区域，并且其中X²²⁶,X²²⁹是在位置226和229处的氨基酸残基，它们是Cys或Ser。在优选的非限制性实施方案中，多肽构建体的R2区域选自SEQ ID NO：11、SEQID NO：12和与其基本上相同的序列。

R4区域，表示C_H2G²⁷⁰-C_H3，是包含人IgG1抗体重链的第二恒定结构域(C_H2)和第三恒定结构域(C_H3)的多肽构建体的C末端区域，其中C_H2结构域含有位置270处的Gly氨基酸残基。在优选的非限制性实施方案中，多肽构建体的R2区域具有SEQ ID NO：14的序列或与其基本上相同的任何序列。

在优选的非限制性实施方案中，本发明的多肽构建体选自SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：28、以及与其基本上相同的序列。

这些优选的非限制性实施方案中提供的多肽构建体可以通过瞬时转染在CHO细胞中以高产量产生，可以通过蛋白-A亲和层析和制备型尺寸排阻层析(SEC)纯化至高纯度，具有升高的酶活性，以高亲和力和亲合力与SARS-CoV-2的刺突蛋白结合，高效中和假型SARS-CoV-2，并在细胞和动物模型中中和真正的SARS-CoV-2病毒。本发明中描述的一类多肽构建体可用于减少活生物体(例如作为疾病动物模型的小鼠、仓鼠和猴子，以及用于临床应用的人)中的病毒载量。因此，这些化合物代表了有用的生物治疗剂，其用于治疗冠状病毒感染，包括SARS和COVID-19及其新出现的毒株，以及病毒疾病相关的ARDS和多个器官(例如肺、心脏、肾、脑和肠)的损伤。

此外，这些化合物的ACE2替代功能在导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的其他病毒诱导的病理学(例如呼吸道合胞病毒、禽H5N1流感或脓毒症诱导的ARDS/细胞因子风暴)中提供了额外的治疗应用。最后，其他治疗适应症包括非病毒适应症，例如如心肌炎、血管周围和心肌纤维化中的心功能障碍、糖尿病肾病、肾纤维化和导致NASH/NAFLD的肝功能障碍。

现在将参考附图通过示例的方式描述本发明的这些和其他特征。

附图简要说明

图1是显示本发明的包含四个区域R1、R2、R3和R4的一类多肽的设计的示意图，其中参考序列表中的SEQ ID NO。所示的氨基酸位置编号对应于每个区域的常规编号，而不是沿着全长多肽序列的顺序编号。

图2示出了导致本发明的多肽类别的基于结构的模块化设计的主要原理。ACE2collectrin(颈)结构域将ACE2催化结构域二聚体锁定在与CoV-2刺突三聚体不相容的刚性构象中；因此，颈部(collectrin)结构域被移除。间隔子和铰链区提供的引入的灵活性解锁了ACE2催化结构域二聚体，以便与CoV-2刺突三聚体热结合(avid binding)。

图3呈现了本发明的多肽的R1区域的3D渲染(显示为深灰色带)，其经过亲和力成熟以改善与SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)(显示为半透明分子表面)的结合。携带T92I突变的人ACE2催化结构域的天然变体代表了本研究中使用ADAPT平台进行的基于结构的亲和力成熟预测的起点。本发明中选择的用于提高与SARS-CoV-2刺突蛋白-RBD的结合亲和力的突变被呈现为ACE2I92天然变体的位置27和330处的CPK模型。关于根据ADAPT计算得出的前30个结合亲和力改善突变参见表1。

图4A、4B和4C呈现了通过CHO细胞中瞬时转染产生并通过蛋白-A亲和层析纯化的多肽变体的分析。图4A提供了变性蛋白质在非还原和还原条件以及不同洗脱缓冲液下的SDS-PAGE分析。图4B和图4C提供了分别使用柠檬酸盐pH3.6缓冲液和乙酸盐pH3.7缓冲液从蛋白-A柱洗脱的选定变体的洗脱级分的UPLC-SEC分析。显示了通过MALS分析确定的主峰的分子量。

图5A、5B和5C呈现了在制备型尺寸排阻层析之后对多肽变体的分析。图5A提供了在非还原和还原条件下变性蛋白质的SDS-PAGE分析。图5B提供了所选的纯化的变体的UPLC-SEC分析，其中主峰的分子量通过MALS分析确定。图5C提供了所选的纯化的变体的沉降速度分析超速离心(AUC)分析数据。表2列出了一组其他多肽变体的纯度水平。

图6A、6B、6C、6D和6E呈现了所选多肽变体的酶活性数据。重组人ACE2(rhACE2)胞外域用作对照。图6A提供了使用基于荧光底物的无细胞测定法测定的作为在100ng/mL的固定酶浓度下的底物浓度的函数的酶活性，用于测定催化效率(k_cat/K_M)值。图6B提供了作为酶浓度的函数的活性，用于确定使用基于荧光底物的无细胞测定法确定的比活性值。有关其他测试的变体的酶活性数据参见表4。图6C显示了通过ELISA测定的将血管紧张素II(AngII)水解成血管紧张素-(1-7)而评估的本发明的多肽变体或对照酶(rhACE2和rhACE)在100ng/ml下与25nM Ang II孵育30分钟的酶活性。数据表示为平均值±SEM，相对于rhACE*P<0.01。N＝3-4次实验。图6D呈现了在用0.6nM本发明的多肽变体或对照酶(rhACE2和rhACE)处理24小时的小鼠原代近端肾小管上皮细胞(PTEC)的存在下，与11.25μM Mca-APK(Dnp)荧光底物30分钟的酶活性的表示为RFU的荧光读数。数据表示为平均值±SEM，相对于rhACE*P<0.01。N＝3次实验。图6E呈现了在用0.6nM本发明的多肽变体或对照酶(rhACE2和rhACE)处理24小时的小鼠原代近端肾小管上皮细胞(PTEC)的存在下，通过将Ang II(5nM)水解为血管紧张素-(1-7)(ELISA)评估的酶活性的表示为RFU的荧光读数。数据表示为平均值±SEM，相对于rhACE*P<0.01。n＝3次实验。

图7A、7B、7C、7D和7E显示了本发明的多肽变体与SARS-CoV-2刺突蛋白-RBD的结合能力的评估。图7A提供了用于按解离速率(k_off)对多肽构建体进行排序的标准化SPR传感图。同源二价变体流过SARS-CoV-2的固定的刺突蛋白RBD，由于亲合力效应，这阻止了结合解离常数的计算。图7B提供了使用SARS-CoV-2的固定的刺突蛋白-RBD的替代中和(sn)-ELISA结合竞争数据和通过链霉亲和素-聚HRP检测结合的生物素化ACE2。IgG抗体同种型用作阴性对照。表5列出了基于SPR的k_off解离率和测试的变体的snELISA IC90值。图7C显示本发明的多肽从SARS-CoV-2和SARS-CoV-2变体B.1.351(Beta)以及SARS-CoV-1的刺突蛋白-RBD的解离速率。图7D和7E提供了来自与SARS-CoV-2、SARS-CoV-2变体B.1.351(Beta)和B.1.1.529(Omicron)的刺突蛋白-RBD结合的本发明的选择的多肽的长解离动力学实验的SPR传感图，以及相应的拟合表观动力学和平衡常数。数据表示为N＝3次实验的平均值±SD。

图8A、8B和8C显示了基于作为活SARS-CoV-2病毒替代品的假型慢病毒颗粒的中和数据。测量了本发明的多肽构建体阻断假病毒颗粒进入表达ACE2的宿主细胞系的能力。假型慢病毒颗粒包含组装病毒样颗粒所需的最小慢病毒蛋白集、SARS-CoV-2刺突蛋白和萤光素酶报告因子。通过萤光素酶报告因子信号的丢失来检测病毒进入的阻断。图8A提供了测定实施方式1，在HEK293T细胞上共表达人ACE2和TMPRSS2。图8B提供了在HEK293T细胞上表达人ACE2的测定实施方式。有关测试的变体的IC50值的列表参见表6。图8C显示了本发明的选择的多肽中和由用来自SARS-CoV-2和几种所关注的SARS-CoV-2变体(包括D614G、B.1.1.7(Alpha)、B.1.351(Beta)和B.1.617.2(Delta))的刺突蛋白假型化的病毒样颗粒(VLP)引起的细胞感染的能力。相关的IC50值列于表6a中。

图9显示了本发明选择的多肽对用于感染VERO-E6细胞的活SARS-CoV-2病毒的中和作用。使用中和单克隆抗体作为阳性对照。相关的IC50值列于表7中。

图10A、10B、10C和10D呈现了本发明选择的多肽在高血压小鼠中静脉内施用后的体内效果。图10A显示了在施用本发明的选择的多肽后3、6、24、48和72小时通过尾套法(tail-cuff method)测量的对收缩压的影响。图10B显示了使用荧光底物Mca-APK(Dnp)测定的本发明选择的多肽施用后72小时(终点)时血浆和各种器官中的ACE2活性。图10C显示了施用本发明的选择的多肽后72小时(终点)时血浆和各种器官中人ACE2和IgG-Fc的ELISA免疫印迹。图10D显示了治疗对白蛋白尿的影响。ACR：尿白蛋白与肌酐的比率。数据表示为平均值±SEM，P<0.05^@相对于盐水，*相对于Ang II，^#相对于rhACE2，^&相对于Ang II+K，^％相对于Ang II+M。n＝每组3至6。

图11A、11B和11C呈现了本发明的选择的多肽在施用于感染SARS-CoV-2的仓鼠后的体内治疗功效。图11A和11B显示了在作为组合的预防性和治疗性给药的鼻内施用(图11A)之后或在仅治疗性给药(图11B)之后的体重变化。雄性仓鼠用8x 10³PFU的SARS-CoV-2分离株经鼻攻击。数据绘制为平均值+/-SEM。n＝每组6至7。图11C显示了在10mg/kg的本发明的选择的多肽的组合的预防性(-4小时)和治疗性(+24小时)施用的静脉内施用后，感染后第3天肺组织中的活病毒滴度。雌性仓鼠用10⁴PFU的SARS-CoV-2分离株经鼻攻击。通过空斑测定确定病毒滴度。数据绘制为中值+/-SEM。n＝每组7。

鉴于以下描述，本发明的附加方面和优点将变得明显。详细的描述和实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是明显的。

发明详述

在下面的实施例中将进一步说明本发明。然而，应当理解，这些实施例仅用于说明性目的并且不应当用于以任何方式限制本发明的范围。

因此，下面提供详细描述以帮助本领域技术人员实践本公开内容。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案并且不旨在限制本公开内容。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、附图和其他参考文献均明确地通过引用整体并入。

定义

如本文所使用的，除非另有说明，以下术语可具有赋予它们的以下含义。然而，应当理解，本领域普通技术人员已知或理解的其他含义也是可能的，并且在本公开内容的范围内。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在限制。

本文使用的术语“约”可用于考虑本领域普通技术人员预期的实验误差、测量误差和变化。例如，“约”可以指所参考的指示值的正负10％、或者正负5％。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。

如本文所使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的元素的“任一个或两者”，即，在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式解释，即，如此连接的“一个或多个”元素。除了由“和/或”子句具体标识的元素之外，可以任选地存在其他元素，无论与具体标识的那些元素相关还是不相关。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应当被理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为是包含性的，即，包括多个元素或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地其他未列出的项目。只有明确表示相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在权利要求中使用时，“由......组成”将指包括多个元素或元素列表中的恰好一个元素。一般而言，当前面有排他性术语(例如“任一”、“之一”、“其中仅一个”或“其中恰好一个”)时，本文使用的术语“或”仅应解释为指示排他性替代方案(即“一个或另一个，但不是两者”)。

如本文所使用的，所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“包含(composed of)”等应理解为是开放式的，即意味着包括但不限于。只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭或半封闭过渡短语。

如本文所使用的，涉及一个或多个元素的列表的短语“至少一个”应理解为表示选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指的元素列表内具体标识的元素之外的元素可以任选地存在，无论与具体标识的那些元素相关还是不相关。

本文使用的术语“序列同一性”是指两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的序列同一性的百分比。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，将序列进行比对以实现最佳比较目的(例如，可以在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入间隙，以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同重叠位置的数量/位置总数×100％)。在一个实施方案中，两个序列具有相同的长度。两个序列之间同一性百分比的确定也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性示例是并入NBLAST和XBLAST程序中的算法[16]。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST核苷酸程序参数集(例如评分＝100，字长＝12)进行，以获得与本公开内容的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以使用XBLAST程序参数集(例如评分-50，字长＝3)进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用缺口BLAST，如[17]中所述。或者，PSI-BLAST可用于执行迭代搜索，检测分子之间的远距离关系。当利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网站)。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性示例是Myers和Miller的算法[18]。这种算法被合并到ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。两个序列之间的同一性百分比可以使用类似于上述技术的技术来确定，无论是否允许存在间隙。在计算同一性百分比时，通常只计算完全匹配。

“基本上相同”的序列可以包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域已知，参考序列的一个或多个保守氨基酸突变可以产生突变肽，与参考序列相比，其生理学、化学、物理化学或功能特性没有实质性变化；在这种情况下，参考序列和突变序列将被视为“基本上相同”的多肽。保守氨基酸取代在本文中定义为将一个氨基酸残基取代为另一个具有相似化学性质(例如大小、电荷或极性)的氨基酸残基。

在非限制性实例中，保守突变可以是氨基酸取代。这种保守氨基酸取代可以用碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸取代相同组中的另一个。术语“碱性氨基酸”是指侧链pKa值大于7的亲水性氨基酸，其通常在生理pH下带正电荷。碱性氨基酸包括精氨酸(Arg或R)和赖氨酸(Lys或K)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)是指具有在生理pH下不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但其具有其中两个原子共享的电子对被其中一个原子更紧密地结合的至少一个键。极性氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或Y)、天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)。术语“疏水性氨基酸”(也称为“非极性氨基酸”)意在包括根据[19]的标准化共有疏水性量表表现出大于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(Ile或I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)和甘氨酸(Gly或G)。“酸性氨基酸”是指侧链pKa值小于7的亲水性氨基酸，其在生理pH下通常带负电荷。酸性氨基酸包括谷氨酸(Glu或E)和天冬氨酸(Asp或D)。组氨酸(His或H)是一种极性氨基酸，其具有特殊的电离势，因为它的pKa为约7，和更准确地在组氨酸残基位于蛋白质表面的情况下为约6.4[20]。这导致组氨酸氨基酸残基呈“极性”，在7.2-7.4的生理pH下主要不带电荷，而在酸性环境(pH<7)中主要带正电荷。

本发明的基本上相同的序列可以是至少85％相同；在另一个实例中，基本上相同的序列可以在氨基酸水平或核苷酸水平上与本文描述的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同，或者其之间的任何百分比。重要的是，基本上相同的序列保留了参考序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于保守氨基酸突变。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于同义核苷酸取代或引起保守氨基酸突变的核苷酸取代。在非限制性实例中，本发明可以涉及包含与SEQ ID NO：23中所示的多肽构建体序列至少85％、90％或95％相同的氨基酸序列的多肽构建体。

如本文所用，术语“肽”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的线性链。术语“肽”通常用于指包含2至49个氨基酸的短链氨基酸，而术语“多肽”通常用于指包含50个或更多个氨基酸的较长氨基酸链。然而，这些术语可以互换使用。术语“多肽构建体”在本文中用于指已经折叠和/或组装以形成三维结构的一种或多种肽或多肽，尽管蛋白质和多肽构建体也可以互换使用。如本领域技术人员将理解的，蛋白质可以包括翻译后修饰。例如，蛋白质可以被糖基化、脂化、磷酸化、泛素化、乙酰化、亚硝基化和/或甲基化。

本文所用的术语“重组多肽”是指通过重组技术产生的多肽，其中通常将编码表达的蛋白质的DNA或RNA插入到合适的表达载体中，然后将其引入宿主细胞中以允许表达重组多肽。重组多肽可以包括来自两个或更多个来源(例如不同的蛋白质)的氨基酸序列。此类重组多肽可称为融合多肽。重组多肽还可以包括一种或多种合成的氨基酸序列。

如本文所用，术语“间隔子”或“接头”是指直接共价连接两个多肽的肽。接头可以是氨基酸或包含两个或更多个氨基酸的肽。如果接头是氨基酸或肽，则接头的N末端可以通过肽键共价连接至第一多肽的C末端，并且接头的C末端可以通过肽键共价连接至第二多肽的N末端。通常，通过接头共价连接的两个多肽是非天然连接的多肽，例如它们可以由不同基因和/或不同物种编码，或者它们可以是单个多肽或蛋白质的不同部分或结构域。在非限制性实例中，接头或间隔子可以少于20个氨基酸。

如本文所用，术语“抗原”是指能够引发免疫应答的任何分子、部分或实体。这包括细胞和/或体液免疫反应。抗原通常是一种生物分子，通常是蛋白质、肽、多糖、脂质或缀合物，其含有同源抗体可以选择性结合的至少一个表位。

“病毒表面抗原”是可以在病毒表面发现的抗原，例如多肽。病毒表面抗原可以是三聚体病毒表面抗原。三聚体病毒表面抗原的例子包括但不限于严重急性呼吸综合征(SARS)-冠状病毒(CoV)-2(SARS-CoV-2)刺突蛋白、SARS-CoV-1刺突蛋白、中东呼吸综合征(MERS)-冠状病毒刺突蛋白、流感血凝素(HA)、人免疫缺陷病毒(HIV)gp120、呼吸道合胞病毒(RSV)RSVF蛋白、狂犬病病毒糖蛋白(RABVG)和人偏肺病毒(hMPV)糖蛋白。

如本文所用，术语“药学上可接受的承载体”是指无毒的承载体。合适的药学上可接受的承载体包括例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合中的一种或多种。药学上可接受的承载体还可以含有少量的辅助物质，例如增强保质期或有效性的润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂。

如本文所用，术语“片段”在涉及分子例如核酸分子或多肽时是指小于分子全长的分子部分。

如本文所用，术语“受试者”是指人或非人动物，例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼或两栖动物。

如本文所用，“SARS-CoV-2”在没有任何额外谱系或变体名称的情况下提供时，用于指SARS-CoV-2的原始毒株。

如本文所用，术语铰链片段、C_H2结构域和C_H3结构域是指IgG抗体重链的相应区域，其具有根据ImMunoGeneTics(IMGT)数据库(http://www.imgt.org/)[21-23])定义和编号的核苷酸和蛋白质序列。铰链片段、C_H2结构域和C_H3结构域的优选非限制性实施方案来自人抗体，并且优选地来自人IgG1同种型。

还应当理解，在本文描述的包括多于一个步骤或动作的某些方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作被叙述的顺序，除非上下文另有说明。

为了解决本领域的问题，本发明提供了人ACE2受体的改进的基于ACE2的诱饵变体，其在第92位具有异亮氨酸(Ile)氨基酸残基，在人群中广泛存在的更常见的ACE2受体中，在位置92处通常存在苏氨酸(Thr)氨基酸残基。本发明使用ACE2I92作为多方面分子设计工作的起点，其现在提供一类多肽构建体，其具有：(a)与刺突蛋白的强结合亲合力(avidity)和亲和力(affinity)以用于病毒感染的有效中和，(b)用于减少ARDS的高酶促活性和(c)改善的生物可制造性；同时提供用于以下的结构成分：(d)适当的药代动力学，以允许病毒清除，同时防止抗体依赖性增强(ADE)，以及(e)针对新出现的株系和未来的流行病提供保护。

本发明提供具有以下通式的多肽构建体：

R1-R2-R3-R4

R2包含间隔子或接头；

R4包含C_H2G²⁷⁰-C_H3，

其中四个区域中每一个的结构特征和设计优点在下面标题为实施例1“多肽构建体的分子工程改造”的部分中详细介绍和描述。证明本发明设计的多肽构建体的优点的实验数据在以下部分的实施例2至实施例7中给出。本公开内容的非限制性说明性实例在SEQID NO:15-29中提供，并且更具体地在SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28中提供.

实施例

实施例1.多肽构建体的分子工程改造

用于优化与SARS-CoV-2刺突同源三聚体的亲合力的基于结构的模块化设计

图2示出了本发明多肽的模块设计中使用的结构域。SARS-CoV-2刺突同源三聚体的分子模型取自PDB ID 6VSB的冷冻电镜结构。与SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)复合的人ACE2胞外域(18-740)同源二聚体(包括催化域和颈部(collectrin)结构域)取自PDB ID6M17的冷冻电镜结构。包括铰链、C_H2和C_H3结构域的人IgG1 Fc片段同源二聚体取自具有PDBID 1HZH的人IgG1 mAb的晶体结构。结构操纵、可视化和渲染是使用PyMOL分子图形系统(Schroedinger,LLC)完成的。

作为这种模块化设计的第一步，我们确定颈部(collectrin)结构域充当非共价二聚化结构域，并将ACE2催化结构域(R1区域)锁定在刚性的相互方向上，在本研究中我们确定这与刺突蛋白同源三聚体的两个RBD结构域上的同时结合是不相容的，因此去除了颈部结构域，如图2所示。下一步是通过柔性多肽间隔子(R2区域)然后是柔性人IgG1铰链(R3区域)将剩余的人ACE2催化结构域(R1区域)连接至人IgG1 C_H2-C_H3片段(R4区域)，其非共价组装为同源二聚体。这种新颖的基于结构的设计策略在本发明的同源二聚体多肽构建体的背景下提供了两个ACE2催化结构域的增加的灵活性和相互独立性。总体目标是促进和改善本发明设计的同源二聚体多肽构建体的两个R1区域在同一病毒刺突蛋白同源三聚体分子的两个RBD结构域上以及与属于不同刺突蛋白同源三聚体的在病毒体表面上彼此相邻的两个RBD结构域的同时占据。因此，本发明的多肽构建体的独特设计平台用于选择赋予与病毒刺突蛋白高结合亲合力和亲和力的残基，如通过ADAPT亲和力成熟所测定的(见下文)。应当理解，collectrin(颈)结构域的删除是非限制性的，并且在图1和图2中描述的设计概念中采用全长hACE2(18-740)胞外结构域是本领域技术人员所认为的明显修改，其能够保留发明的多肽构建体的显著水平的酶活性和病毒中和作用。

多肽构建体的四个区域的每个区域中的额外序列优化

本段中描述的序列变异如图1所示。首先，在ACE2催化结构域(R1区域)中，选择了天然存在的人突变T92I[24-26]。预计这种天然突变消除N⁹⁰XT⁹²N-糖基化序列子，从而消除Asn90的N-糖基化。在我们的设计中使用这种部分去糖基化的天然变体的第一个好处是它导致本发明的多肽构建体的分子量较低，这可以改善组织渗透。此外，如本说明书中首次显示的，ACE2I92部分去糖基化的天然变体赋予本发明的多肽构建体在增加的酶活性和增加的病毒中和效力方面改善的活性特征谱。重要的是，人ACE2的位置92处天然存在的Ile氨基酸消除了由于去除Asn90处的碳水化合物结构而导致的蛋白质表面暴露所可能引起的免疫原性问题。

设计了两种不同长度的间隔子(R2区域)，以评价多肽构建体同源二聚体中两个独立的ACE2催化结构域(R1区域)对灵活性和相互自由度的影响；5-残基间隔子SGGGG，和15-残基间隔子SGGGGSGGGGSGGGG。在PyMOL中对分子模型进行几何测量，以确保较短的间隔子允许两个独立的ACE2催化结构域(R1区域)容纳在同源二聚体多肽构建体中，而没有空间位阻。

人IgG1铰链(R3区域)也被修饰。首先，我们突变了铰链位置220处未配对的Cys残基，该残基天然参与抗体轻链的二硫桥，这在我们的构建体中不存在，从而旨在减少通过Cys220形成不需要的共价多聚体物种的可能性，其因此被Ser氨基酸取代。此外，设计了变体，将天然人IgG1铰链区中铰链位置226和229处的剩余的两个Cys残基额外替换为Ser残基。虽然这些Cys残基通常在Fc片段同源二聚体中的两条重链之间形成二硫桥，但它们还可能导致不需要的共价多聚体种类，其影响Fc融合蛋白的可制造性[27,28]。寻求一种结构特征来减少大规模制造过程中的样品异质性。缺乏Cys残基的铰链突变的R3区域被认为导致同源二聚体变体，仅通过非共价多肽链间相互作用(主要通过C_H3结构域同源二聚化)来稳定，因此不能通过多肽链间共价二硫键来稳定。出于相同的意思，本发明的某些实施方案还包括在ACE2催化结构域(R1区域)的位置261处的暴露于表面的未配对Cys残基突变为Ser残基。

最后，选择来自R4区域的人C_H2结构域以包含突变D270G，该突变可能通过减少与FcγR受体和Cq补体复合物的结合来减弱免疫效应子功能。这一修饰旨在减少抗体治疗病毒感染的某些副作用，即：(i)显示加剧某些病毒感染的病理的抗体依赖性增强(ADE)效应[29]，以及(ii)已因COVID-19感染而受到急性呼吸窘迫综合征(ARDS)影响的器官和组织的增加的炎症[30-32]。

针对SARS-CoV刺突蛋白RBD的ADAPT亲和力成熟

除了上述序列改进和修饰外，还通过掺入通过针对SARS-CoV-2刺突蛋白的亲和力成熟而鉴定的残基进一步工程改造了人ACE2催化结构域(R1区域)。亲和力成熟的起点是与SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)结合的hACE2的原子坐标，该坐标取自PDB ID6M17的冷冻电镜结构[4]。仅保留了人ACE2催化结构域残基21-615和SARS-CoV-2刺突蛋白RBD残基336-518的一个拷贝，并去除了所有其他原子。将氢原子添加到复合物中并进行调整以最大化氢键合相互作用。然后使用具有距离相关的电介质和用于非键合相互作用的无限距离截止的AMBER力场[33,34]通过能量最小化对复合物进行结构细化。非氢原子被限制在其晶体位置，其中主链和侧链原子的谐和力常数分别为40和10kcal/(mol.A²)。然后使用ADAPT平台进行亲和力成熟[35,36]。在ACE2催化结构域(R1区域)内的可能在突变时影响与刺突蛋白RBD的结合亲和力的57个位置处进行了单点扫描诱变模拟。我们使用ADAPT方案构建结构并评估亲本hACE2结构的这些位置上17个其他可能的天然氨基酸(排除Cys和Pro)的单点突变能量。针对这三个方案的特定版本[37]采用了共识方法来构建hACE2突变体和对hACE2突变体进行评分。结合亲和力的评分主要基于用三个分量能量函数计算的评分的平均Z评分。在结合亲和力预测之前，预测会破坏ACE2催化结构域正确折叠稳定性的突变被排除在进一步评估之外。

最有可能具有改善的刺突蛋白-RBD结合亲和力的单点突变体的选择主要以来自ADAPT的最佳30个共识Z评分为指导(表1)。使用ADAPT的三种采样方案预测的分子相互作用的目视检查用于检测抗体界面的次优互补性(例如，极性基团埋藏在非极性环境中)、共价几何结构中的空间过度拥挤和扭曲(例如，与芳香环平面性的偏差)以及其主链扭转角位于Ramachandran图的不允许区域中的天然甘氨酸残基的替代物。最终选择了两个位置：Thr27和Asn330，其中相对于亲本ACE2结构，预计芳香族取代具有提高结合亲和力的高可能性。在这些可能的取代中，我们选择Tyr作为取代残基，因为它相对于其他预测的替代物Phe和Trp具有更增加的溶解度(图3)。在本发明的多肽构建体中，T27Y和N330Y突变可以单独使用或组合使用，并且还优选与前一节中描述的序列变异组合使用。

表1.使用基于结构的亲和力成熟平台ADAPT预测改善与SARS-CoV-2刺突蛋白-RBD的结合的ACE2催化结构域的前30个突变的共识Z评分。大的负评分预测突变后结合亲和力的显著改善。

实施例2.在CHO细胞中产生设计的多肽构建体

本发明的各种多肽构建体在其N-末端包括人ACE2的天然信号序列。构建体的DNA编码区是合成制备的(GenScript)，并克隆到pTT5哺乳动物表达质粒载体的HindIII(5'端)和BamH1(3'端)位点中[38]。通过瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生融合蛋白。简而言之，将质粒DNA转染至CHO-55E1细胞0.5L或1L培养物中。以存活率大于98％的1.8×10⁶至2.0×10⁶个细胞/mL的细胞密度进行转染。将细胞分布在1.0L至2.8L摇瓶中，并使用PEIMAX^TM(Polysciences,Inc.,Warrington,PA)以每1mL产物1μg总DNA进行转染。最终DNA:PEIMAX^TM比率为1:4(w/w)。将细胞培养物在轨道式摇动平台上以110rpm的搅拌速率在37℃、湿润的5％CO₂气氛中孵育24小时。24小时后，向培养物添加终浓度为1％w/v的胰蛋白胨N1和终浓度为0.5mM的丙戊酸钠盐，并转移至32℃持续6天。通过使用Vi-CELL自动细胞计数系统(Beckman Coulter Life Sciences,Indianapolis,IN)使用台盼蓝染料排除法对细胞样品进行直接计数来确定细胞密度和细胞活力。

多肽构建体以104至328mg/L的产量产生，其中大多数变体的典型产量为约300mg/L。这证明本发明的多肽构建体可以通过CHO细胞中的瞬时转染有效地产生。通过选择和繁殖具有特定变体的最佳表达的CHO细胞库，预计产量进一步增加。

实施例3.通过亲和层析纯化多肽构建体

通过蛋白-A亲和层析对细胞培养物上清液进行纯化。将细胞培养物上清液加载到在DPBS中平衡的5mL HiTrap MabSelect^TM SuRe^TM柱(GE Healthcare Life Sciences)上。使用设定为约45cm/h(1.7mL/min)的结合线性流速加载上清液，以获得约2.9分钟的停留时间。用DPBS洗涤柱子并用0.1M柠檬酸盐缓冲液pH3.6或0.1M乙酸盐缓冲液pH3.7洗脱蛋白质。使用10％(v/v)1M HEPES进行中和。使用Zeba旋转柱对中和的洗脱池进行缓冲液交换并进行无菌过滤。使用柠檬酸盐pH3.6洗脱缓冲液，根据变性非还原条件下的SDS-PAGE测试，在铰链(R3区域)的位置226和229以及ACE2催化结构域(R1区域)的位置261处携带半胱氨酸的变体的测试样品包含约50％的同源二聚体，其余为高分子量(HMW)种类的聚集材料，其中大多数HMW种类在还原条件下消失(图4A，左)。这种异质性水平通过高分辨率BEH-450柱上的分析型UPLC-SEC得到了证实(图4B)。然而，使用pH3.7的醋酸盐作为洗脱缓冲液提高制剂的均质性。从图4A(右)中非还原条件下的变性SDS-PAGE数据可以看出，对于在铰链位置226和229处(ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc；SEQ ID NO:23)或在ACE2催化结构域的位置261处(ACE2m4-C261S-SG4-Fc；SEQ ID NO：22)具有突变的半胱氨酸的变体，不存在HMW种类。正如所预期的，由于天然同源二聚体的铰链区之间不存在共价二硫键，ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)变体在变性非还原条件下表现为单体。此外，图4C中所示的BEH-450柱上的分析型UPLC-SEC数据表明，提高纯化的样品的均质性的主要因素是洗脱缓冲液(使用柠檬酸盐pH3.6洗脱缓冲液的约50％同源二聚体相对于使用醋酸盐pH3.7洗脱缓冲液的约70％同源二聚体)和没有半胱氨酸残基突变。这从用两种洗脱缓冲液测试的变体ACE2-SG4-Fc(SEQ ID NO：15)中可以清楚地看出，其显示与柠檬酸盐pH3.6洗脱缓冲液(图4B)相比，醋酸盐pH3.7洗脱缓冲液(图4C)降低了HMW种类的大小和数量。我们还观察到，将ACE2催化结构域(R1区域)中的C261突变为Ser并不能进一步提高均质性(使用醋酸盐pH3.7洗脱缓冲液)，其含有72％的同源二聚体。然而，作为一项新颖的发现，当铰链(R3区域)的位置226和229处的两个Cys均突变为Ser时，均质性显著改善，生成88％的同源二聚体，其中只有12％的尺寸相对较小的HMW种类(图4C)。此外，通过MALS-RI分析测定的ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)变体的该纯化样品的同源二聚体种类的MW是198kDa，这与190kDa的理论同源二聚体MW非常一致，并考虑到该差异可能是由于糖基化造成的。所有这些结果表明，使用醋酸盐pH3.7洗脱缓冲液并突变人IgG1铰链位置226和229处的半胱氨酸对于通过蛋白-A纯化此类多肽获得约90％的合理高均质性非常重要。

接下来，所有蛋白-A纯化的样品均在Superose 6Increase柱(GE HealthcareLife Sciences)上通过制备型SEC进一步纯化。按照制造商的说明，使用膜截留分子量为10kDa的6离心浓缩器(GE Healthcare Life Sciences)在15℃下通过超滤浓缩选定的峰级分。在此过程中，使用NanoDrop^TM2000分光光度计(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)使用280nm处的吸光度和计算出的每个变体的比消光系数来监测蛋白质浓度。变性纯化的变体的SDS-PAGE分析表明，在非还原和还原条件下，所有多肽构建体均具有高纯度的同源二聚体(图5A)。由于天然同源二聚体的铰链区之间不存在共价二硫键，ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)变体在变性非还原条件下表现为单体。然后通过高分辨率BEH-450色谱柱上的分析型UPLC-SEC确认高纯度，所有变体的代表性色谱图如图5B所示，同源二聚体分数列于表2中。重要的是注意到ACE2m4-SG4-Fc(SEQ ID NO：21)和ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)具有几乎相同的UPLC-SEC色谱图，均指示同源二聚体，尽管这些变体之间存在差异，即在铰链(R3区域)水平上存在(在前一个变体中)或不存在(在后一个变体中)多肽链间二硫桥。如图5B和表2所示，这些种类的同源二聚体所测定的MW与具有计算的190kDa的蛋白质MW的糖基化蛋白质非常一致。值得注意的是，基于人ACE2 Ile92的天然变体(其在位置Asn90处缺乏碳水化合物)的变体(SEQ ID NO:19、20、21、22和23)的确定的MW小于在Asn90处具有糖基化的那些(SEQ ID NO:15、17和18)，如表2所示。

通过制备型SEC纯化的样品通过在配备AN-50 8孔转子的Beckman ProteomelabXL-I上进行沉降速度分析超速离心(SV-AUC)进行进一步分析，监测在PBS中1mg/mL的蛋白质浓度下280nm处的吸光度。使用具有3mm路径长度的2分区炭-epon中心件和蓝宝石窗口的室。蛋白质以45000rpm离心，每4分钟进行一次扫描。使用SEDFIT软件获得c(s)分布，并使用GUSSI软件进行积分。表2中列出的SV-AUC数据表明测试的多肽构建体的纯化样品在约8S处有一个主峰，其占蛋白质峰面积的88-97％并且归属于同源二聚体种类。HMW种类的含量非常低。这些样品的摩擦系数范围为1.8-2.1，这意味着这些同源二聚体组装体的不对称构象，这与前面描述的工程改造的构象灵活性一致。图5C显示了仅在铰链(R3区域)中存在或不存在多肽链间共价二硫键方面不同的变体对的类似沉降系数分布：ACE2m4-SG4-Fc(SEQID NO：21)相对于ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)。

表2.纯化的变体的均质性。

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实施例4.多肽构建体的稳定性表征

冻融循环

对本发明的多肽构建体的纯化样品进行冻融稳定性应激测试，其由-80℃下的冷冻和解冻30分钟的3个循环组成。BEH-200柱上的分析型UPLC-SEC用于确定每次冻融循环之前和之后的样品异质性。所有样品对冻融应激都具有极强的承受力。第3次冻融循环后测定的同源二聚体的分数列于表3。还使用SPR测试了应激前和第3次冻融循环后的样品的SARS-CoV-2刺突蛋白-RBD结合(参见下文)。表3记录了比较冻融应激前后SPR传感图的相似性评分，其指示非常相似的结合水平。总之，这些数据表明本发明的多肽构建体对于冻融应激非常有承受力并且可以在-80℃下储存。

表3.纯化的变体的稳定性。

折叠稳定性

我们也有兴趣探究此类别的多肽构建体的各种结构化结构域的稳定性是否存在差异。为此，使用差示扫描量热法(DSC)来确定本发明中示例的多肽构建体的热转变中点(T_m)。DSC实验使用VP-毛细管DSC系统(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)进行。将样品在HyClone^TMDulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS；GE Healthcare Life Sciences)中稀释至0.4mg/mL的最终浓度。通过以60℃/h的速率从20℃至100℃升高温度在70psi氮气压力下进行热变性，其中反馈模式/增益设置为“低”，滤波周期为8秒，预扫描时间为3分钟。所有数据均使用Origin 7.0软件(OriginLab Corporation，Northampton，MA)进行分析。通过减去相应的缓冲液空白扫描来校正热分析图并标准化至蛋白质摩尔浓度。T_m值是使用T_m的矩形峰值查找算法的自动数据处理来确定的。表3中列出的数据表明，所有变体在～50℃和～82℃下具有大约相等的焓的转变，这意味着两个共同的特征。这些化合物的两个共同结构化特征是ACE2催化结构域(R1区域)和C_H2-C_H3结构域(R4区域)。已知抗体IgG1 Fc片段的C_H3结构域具有约82℃的熔融温度。ACE2催化结构域解释了50℃左右的转变[39]。基于表3中T_m数据的结构-稳定性关系分析表明，某些变体中存在的N330Y突变导致ACE2催化结构域的T_m降低约2℃。

实施例5.多肽构建体的酶活性

催化效率

如前所述[40]，用荧光底物Mca-APK(Dnp)(AnaSpec，San Jose，CA，目录号：AS-60757)测定本发明的多肽构建体的酶活性。重组人ACE2(rhACE2)用作阳性对照(R&DSystems Inc.,Minneapolis,MN,目录号:933-ZN)，空白用作阴性对照。测定缓冲液含有50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、300mM NaCl、10μM ZnCl₂，pH至6.8。变体和rhACE2对照在100ng/mL浓度下进行测试，底物浓度为1、2、4、6、8和16μM。使用或不使用10^-5MACE2抑制剂MLN-4760(Calbiochem，目录号：530616)对样品进行三次重复测定。通过在FLUOstarGalaxy荧光计(BMG Labtechnologies,Durham,NC,USA)上每62秒读取一次持续长达32分钟来动态跟踪反应，检测405nm处的发射和在320nm处的激发。使用Grafit(Sigma-Aldrich)对数据进行拟合和绘图。相对荧光单位(RFU)减去具有MLN-4760的样品，并基于产物形成的标准曲线转换为产物的浓度单位(μM)。为了计算催化效率，k_cat/K_M，将从产物形成随时间推移的线性阶段确定的初始速度(V₀)针对底物浓度作图。使用V₀相对于底物浓度的图的线性阶段，通过将V₀除以底物浓度低于6μM时的底物浓度来计算k_cat/K_M值。[我们非常感谢KevinBurns博士实验室(OHRI,University of Ottawa,Ottawa,Canada)友情提供的一些与催化效率测定相关的技术数据]。

表4中列出了所有测试的多肽构建体的催化效率(k_cat/K_M)，图6A中显示了rhACE2阳性对照和所选变体的V₀相对于底物浓度的图。从这些数据可以看出，本发明的所有多肽构建体具有与rhACE2处于相同数量级(10⁵M^-1s^-1)的高催化效率，如本研究中测定的rhACE2具有2.67x10⁵ M^-1s^-1的k_cat/K_M。这表明如实施例1中所述在分子设计和优化过程中引入的结构改变对催化活性没有重大影响。此外，酶活性数据的结构-活性关系分析揭示了T92I天然突变在增加我们的新型构建体中ACE2酶活性方面的重要且不可预测的作用。通过比较在位置92处具有Thr的变体ACE2m1-SG4-Fc(SEQ ID NO：18)与在位置92处具有Ile的ACE2m4-SG4-Fc(SEQ ID NO：21)(这些变体之间的唯一区别是这种天然突变以及由此导致的Asn90处连接的碳水化合物结构的丧失)，可以最好地突显这种效果。变体ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)提供了对此发现的进一步支持，该变体具有与ACE2m4-SG4-Fc(SEQ IDNO：21)完全相同的ACE2催化结构域(R1区域)。ACE2m4-SG4-Fc(SEQ ID NO：21)和ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)相对于ACE2m1-SG4-Fc(SEQ ID NO：18)的更高催化效率从图6A和表4立即变得明显。

比活性

我们还表征了多肽构建体的比活性，并将其与rhACE2阳性对照的比活性进行比较。使用血管紧张素转化酶(ACE2)荧光活性测定试剂盒(BioVision,Milpitas，CA，目录号：K897-100)测定比活性。我们将试剂盒中提供的酶(浓度未公开)替换为上述催化效率研究中使用的商业rhACE2。遵循制造商方案。测定以96孔形式一式两份进行。所有多肽构建体的浓度范围为以2倍系列稀释的1nM至0.03125nM。在Cytation 5仪器(Bio Tek)上动态跟踪反应，在320nm处激发和在420nm处发射。为了计算比活性，在对应于绘图的线性阶段的0.25nM(时间点20和25分钟)和1nM(时间点5和10分钟)的酶浓度下选择活性时程图的线性范围内的两个时间点(图4B)。基于空白数据对每个时间点的重复值进行平均并标准化至零。然后通过将时间点之间的RFU变化除以相应的时间范围和所用酶的量来计算比活性(pmol/min/mg)。表4中报告的最终比活性数据是标准化至每个板上rhACE2对照的比活性的两种酶浓度(0.25nM和1nM)下的数据之间的平均值。

明显的是，本发明的多肽构建体具有大约10⁶pmol(产物)/min/mg(酶)的高比活性(图6B和表4)，并且相对于rhACE2对照在68-89％的范围内。与前一节中呈现的催化效率数据一致，ACE2催化结构域(R1区域)的位置27和330处的突变略微降低了酶活性，如变体ACE2m1-SG4-Fc(SEQ ID NO：18)所见的。然而，通过在位置92处添加天然存在的至Ile的突变，并去除ACE2催化结构域的位置90处的N连接的碳水化合物，可以恢复比活性-相对于ACE2m1-SG4-Fc(SEQ ID NO：18)比较ACE2m4-SG4-Fc(SEQ ID NO：21)和ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)变体。

总之，本发明的多肽构建体的催化效率和比活性数据表明这些化合物将通过将Ang-II有效地转化为Ang(1-7)而有效恢复替代肾素-血管紧张素系统的保护作用，从而作为减轻ARDS严重程度的治疗剂。

表4.使用体外无细胞荧光测定的酶活性表征。

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na：未评估。

血管紧张素II水解活性

还通过与血管紧张素II(Ang II)一起孵育，然后测量血管紧张素-(1-7)(BMAbiomedicals，目录号：S-1330)来直接测定ACE2酶活性。将0.5μg/mL的本发明的选择的多肽或对照酶(rhACE2、rhACE)在室温下添加到含有或不含10^-5M MLN-4760的含有25nM Ang II(R&D systems，目录号：1158/5)的测定缓冲液中持续30分钟。图6C显示所有测试的本发明的多肽的Ang II水解活性显著高于阴性对照、人重组ACE(rhACE)并且与阳性对照商业重组人ACE2(rhACE2)相当。[我们非常感谢Kevin Burns博士实验室(OHRI,University ofOttawa,Ottawa,Canada)友情提供的一些与血管紧张素II水解活性相关的技术数据]。

小鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养物中的酶活性和稳定性

近端肾小管上皮细胞(PTEC)分离自C57BL/6雄性和雌性小鼠，年龄为12-16周，购自Charles Rivers(Saint-Constant,Quebec,Canada)。如前所述进行分离[41]。对于每次分离，将1只雄性和1只雌性小鼠的肾脏收集在冷灌注溶液中[含有(以mM计)1.5CaCl₂、5.0D-葡萄糖、1.0MgSO₄、24NaHCO₃、105NaCl、4.0乳酸钠、2.0Na₂HPO₄、5.0KCl、1.0L-丙氨酸、10N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)和0.2％牛血清白蛋白(BSA)]。将肾皮质切碎并在加入0.1％胶原酶(Sigma-Aldrich，目录号：C9262)和0.05％大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich，目录号：T6522)的pH7.2的灌注液中消化。皮质消化物通过250μm筛，沉淀并重悬于含有(以mM计)5.0D-葡萄糖、10HEPES、1.0MgCl₂、120NaCl、4.8KCl、25NaHCO₃、1.0NaH₂PO₄、1.0L-丙氨酸、1.4CaCl₂、60U/mL青霉素和60μg/mL链霉素的40％Percoll(Sigma-Aldrich，目录号：P1644)溶液中。将消化产物以18,500x g离心30分钟。离心后，将含有PT细胞的第4层吸出、沉淀并重悬于培养基(DMEM/F12-Gibco，目录号：31600034和21700075)中。将细胞接种到24孔板中，并在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1:1)培养基和成分确定培养基(5μg/mL胰岛素转铁蛋白硒酸钠、50nM氢化可的松、2nM 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸(Sigma Aldrich目录号：I1884、H0888、T5516)、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)中培养24小时。24小时后，细胞在DMEM/F12和成分确定培养基中生长。第6天(约70％汇合度)，用0.6nM rhACE2、本发明的多肽、rhACE(阴性对照)或磷酸缓冲盐水(PBS，对照)处理PTEC 24小时。用变体处理后，将血管紧张素II或Mca-APK(Dnp)添加到每个孔中，终浓度为5nM AngII或11.25μM Mca-APK(Dnp)。对于用Ang II处理的PTEC，收集培养基并通过ELISA测定血管紧张素-(1-7)(BMA Biomedicals，目录号：S-1330)。从每个孔中取出100μL与荧光底物一起孵育的PTEC，转移至黑色96孔板，并按照针对ACE2酶活性所描述的测定荧光。

为了在体外测试ACE2-Fc变体的活性和稳定性，如上所述，用本发明的选择的多肽、酶对照(rhACE2、rhACE)或PBS处理培养的原代小鼠近端肾小管细胞24小时，然后与荧光底物(图6D)或Ang II(图6E)一起孵育。本发明的所有测试的多肽在37℃下24小时后仍保持活性，并且它们对荧光底物(图6D)或Ang II(图6E)的活性显著高于阴性对照(rhACE)并且与阴性对照(rhACE2)的活性相当。[我们非常感谢Kevin Burns博士实验室(OHRI,University of Ottawa,Ottawa,Canada)提供的一些与原代细胞培养物中酶活性相关的技术数据]。

实施例6.多肽构建体与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合

通过SPR测定的从刺突蛋白-RBD的解离速率

本发明的多肽与SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的结合动力学通过表面等离振子共振(SPR)实验在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上在25℃下在PBSTpH7.4运行缓冲液(含0.05％Tween 20和3.4mM EDTA的PBS)中进行。内部生产的[42]SARS-CoV-2S-RBD和SARS-CoV-2B.1.315变体S-RBD以及SARS-CoV-1S-RBD通过胺偶联以200RU固定在CM-5传感器芯片上。通过以3倍系列稀释液(30、60或120nM的最高名义浓度)注射每种多肽构建体变体来确定单循环动力学，并且将空白缓冲液以50μL/min同时注射到空白和S-RBD表面上，持续120s，解离阶段为900s。使用10mM甘氨酸pH1.5以30μL/min的流速进行再生30秒。使用Biacore T200评估软件进行数据分析。双参考传感图与基线对齐并标准化至60nM注射的结束以用于解离速率排名。解离速率k_off(M^-1s^-1)从双参考数据的1:1拟合确定并制成表5。由于流动的多肽构建体的二价性质和固定化的S-RBD的密度而产生的亲合力效应阻碍了热力学平衡常数K_D的测定。

本发明的测试的多肽构建体获得的经对齐的标准化传感图显示在图7A中，并且可用于对这些化合物从SARS-CoV-2RBD的解离速率进行排序。解离速率通常被视为选择最佳结合剂以用于进一步治疗开发的主要标准。从图7A中可以立即看出，位置27和330处的ADAPT亲和力变化以及ACE2催化结构域(R1区域)的位置92处的天然突变导致解离率显著降低，从而反映出相对于具有未优化的ACE2催化结构域的变体(ACE2-SG4-Fc(SEQ ID NO：15)和ACE2-SG4x3-Fc(SEQ ID NO：17))增加的与SARS-CoV-2结构域的相互作用。对于三种ACE2m4变体(SEQ ID NO：21、22和23)观察到最慢的解离速率，紧随其后的是ACE2m1-SG4-Fc(SEQ ID NO：18)和ACE2m3-SG4-Fc(SEQ ID NO：20)变体，然后是ACE2m2-SG4-Fc(SEQ IDNO：19)，其具有更快的k_off，但仍然比未优化的ACE2变体慢得多。表5中解离速率的结构-活性关系指出N330Y取代在改善与SARS-CoV2 RBD的结合相互作用方面比T27Y取代发挥更大的作用。这一系列多肽构建体中获得的最慢解离速率为10^-6s^-1数量级，指示非常紧密的结合。

通过snELISA测定的刺突蛋白-RBD的结合竞争

还使用独特且临床相关的基于替代中和(sn)ELISA的测定法[43]作为本发明的多肽构建体与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合能力的体外测试的额外方法。在此测定中，刺突蛋白-RBD被固定在多孔板上，然后与针对中和电位进行测试的样品一起孵育。然后添加生物素化的hACE2，其中通过链霉亲和素-polyHRP进行检测。样品阻断生物素化hACE2和抗原的相互作用的能力可以通过信号的剂量依赖性下降来测量。我们使用在4℃下孵育过夜(2μg/mL)的96孔Immulon HBX板上的100ng固定化重组RBD。添加到孔中的所有体积均为50μL。用200μL PBS-T洗涤板3次，并用200μL 3％BSA(BioShop Canada Inc.，SKI400.1)在室温下封闭1-1.5小时。如上所述洗涤后，将患者血清或血浆(0.5-4μL样品)的4步、2倍连续稀释系列孵育1小时。如上所述洗涤孔，并与50ng生物素化重组人ACE2一起孵育1小时。如上所述洗涤后，将孔与44ng链霉亲和素-过氧化物酶聚合物(MilliporeSigma，S2438)一起孵育。使用TMB显色并量化所得信号。由于信号每天都有变化，所有OD₄₅₀值对于每个样品均标准化至未添加样品时孔的OD₄₅₀。所有值均在此比率空间中表示。

表5列出了使用snELISA测定获得的IC90值，剂量反应曲线如图7B所示。在snELISAIC90值与SPR结合实验的k_off解离速率之间存在定性一致性。snELISA实验由此进一步证实，相对于未优化的变体，在本发明的多肽构建体的ACE2催化结构域中进行的结构优化显著改善了与SARS-CoV-2刺突蛋白-RBD的结合特性。从图7B中明显的一个重要方面是，这些化合物能够将与在测定中用作竞争剂的在较高剂量下的生物素化ACE2的结合降低至非常低的水平。这强烈表明这些化合物能够完全中和SARS-CoV-2病毒并阻止其附着在宿主细胞上的ACE2上。这强烈表明这些化合物可以用作有效的抗病毒剂。

表5.与SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的结合。

与SARS-CoV变体的结合

除了评估从原始SARS-CoV-2的刺突蛋白-RBD的解离速率之外，还评估了本发明的大量多肽的与SARS-CoV-2的所关注的B.1.351(Beta)变体的固定化S-RBD以及早期SARS-CoV-1(其在系统发育上与SARS-CoV-2的距离更远[44])的S-RBD结合的能力。如图7C中所示，本发明的所有测试的多肽显示出与原始SARS-CoV-2病毒的S-RBD的解离速率相似的与B.1.351(Beta)变体的S-RBD的解离速率。值得注意的是，在该测定中，本发明的多肽ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)从B.1.351(Beta)变体的S-RBD的解离速率甚至比从原始SARS-CoV-2病毒的S-RBD的解离速率还要慢。

对于选定的变体，为了获得动力学常数的更精确的估计值和与亲合力的表观K_D，通过以约500RU固定纯化的刺突蛋白-RBD并以3、30和300nM在空白和S-RBD表面上以50μL/min注射每种多肽构建体持续180s(使用3600s的更长的解离阶段)来进行重复测量。图7D显示本发明的多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)针对SARS-CoV-2以及SARS-CoV-2的B.1.351(Beta)和B.1.1.529(Omicron)变体的S-RBS的SPR传感图，图7E显示了本发明的多肽ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)针对SARS-CoV-2以及SARS-CoV-2的B.1.351(Beta)和B.1.1.529(Omicron)变体的S-RBS的SPR传感图。多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)以非常慢的动力学解离速率(k_off为约10^-6M^-1s^-1)和皮摩尔的解离平衡常数(K_D)与这两个重要的SARS-CoV-2变体的任一者的S-RBD结合，与B.1.135变体的结合相比明显强10倍。然而，由于极低的解离速率，SPR实验已达到这些蛋白质复合物的检测限(L.O.D.)。我们还进行了多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)与B.1.1.529(Omicron)刺突蛋白RBD变体的SPR结合实验，并观察到相同的行为，即达到SPR方法的L.O.D.的极强的结合。多肽ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)以缓慢的动力学解离速率(k_off为约10^-4M^-1s^-1)和纳摩尔的解离平衡常数(K_D)与这些重要的SARS-CoV-2变体的任一者的S-RBD结合。与B.1.135病毒变体的结合比与原始SARS-CoV-2病毒的结合更强(4倍)。我们还进行了多肽ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)与B.1.1.529(Omicron)SRBD变体的SPR结合实验，并观察到相同的行为，即相对于原始SARS-CoV-2病毒刺突蛋白RBD约4倍改善的结合亲和力。总而言之，这些数据清楚地证明了本发明的多肽有效结合目前流通的所有SARS-CoV-2变体和以非常高的可能性结合可能在未来出现的其他突变的SARS-CoV-2变体的广阔的泛特异性。

实施例7.通过多肽构建体中和SARS-CoV-2假病毒

假型VLP测定

使用基于病毒样颗粒(VLP)的刺突假型病毒替代测定来评估本发明的多肽构建体对通过病毒刺突蛋白与存在于宿主细胞表面的人ACE2受体的结合介导的SARS-CoV-2病毒在宿主细胞中的进入的抑制。该测定使用假型慢病毒颗粒作为活SARS-CoV-2病毒的替代品，并测量感兴趣的化合物阻止VLP进入表达ACE2的宿主细胞系的能力[45]。假型VLP包含组装VLP所需的最小慢病毒蛋白集、SARS-CoV-2刺突蛋白和萤光素酶报告因子。通过萤光素酶报告因子信号的丢失来检测病毒进入的阻断。两种稍微不同的假型VLP测定实施方式(称为方法1和方法2)用于评价本发明的多肽。

在方法1中，对最初由Bloom实验室[45]开发的检测方法进行了优化，以提高稳健性和重现性[43]。主要变化是：1)在HEK293T细胞中共表达TMPRSS2和ACE2，其提高了感染效率；2)使用第二代慢病毒包装系统(产生更高的VLP水平)；3)调整VLP生产条件，包括将用于VLP生产的温度降至33℃，这提高了生产的VLP的质量的一致性。ACE2和TMPRSS2编码序列的进入载体被分别克隆到pLenti CMV Puro DEST(Addgene,17452)和pLenti CMV HygroDEST(Addgene，17454)中。所得转移载体用于通过第二代psPAX2和VSV-G(Addgene,8454)生成慢病毒。HEK293T细胞用ACE2慢病毒以MOI<1转导，并用嘌呤霉素(1μg/mL)选择以产生稳定的群体。随后用TMPRSS2慢病毒转导这些细胞，并以类似的方式用潮霉素(200μg/mL)选择。对于VLP生成，在含有2mL生长培养基(10％FBS、DMEM中的1％青霉素/链霉素[Pen/Strep])的6孔板格式中使用1.3μg psPAX2、1.3μg pHAGE-CMV-Luc2-IRES-ZsGreen-W(BEI，NR-52516；使用CMV启动子以表达萤光素酶然后是IRES和ZsGreen的慢病毒骨架质粒)和0.4μg HDM-IDTSpike-fixK(BEI,NR-52514；在CMV启动子下表达密码子优化的SARS-CoV-2刺突蛋白；GenBank,NC_045512)，使用在500μL JetPrime缓冲液中的8μL JetPrime(Polyplus-transfection SA,114-01)瞬时共转染HEK293T细胞。转染8h后，将培养基换成3mL含5％热灭活FBS和1％Pen/Strep的DMEM，在37℃和5％CO2下孵育细胞16h；然后将它们转移到33℃和5％CO2下持续另外24小时。转染后48小时，收集上清液，在室温下以500xg离心5分钟，通过0.45μm过滤器过滤并冷冻于-80℃。使用HI10培养基(10％热灭活FBS、1％Pen/Strep)，使用在聚-L-赖氨酸包被(5-10μg/mL)的96孔板上的每孔10,000个细胞的HEK293T-ACE2/TMPRSS2细胞，以及导致相对于对照的>1000的相对萤光素酶单位(RLU)的病毒稀释液(约1:100病毒原液稀释液)，来评估病毒滴度。对于中和测定，将血清样品的2.5倍系列稀释液与稀释的病毒以1:1的比例在37℃下孵育1小时，然后转移至铺板的HEK293-ACE2/TMPRSS2细胞，并在37℃和5％CO2下孵育另外48小时。48小时后，裂解细胞，加入Bright-Glo萤光素酶试剂(Promega，E2620)2分钟，然后用PerkinElmer Envision仪器读数。使用GraphPadPrism 8(GraphPad Software Inc.)通过非线性回归(log[抑制剂]相对标准化响应-可变斜率)计算50％抑制浓度或稀释度(IC50或ID50)。

方法2也基于相同的已发布方案[45]，因此在概念上与方法1相似，但有一些显著差异，其中包括：(i)在表达人ACE2的HEK293T细胞系上没有TMPRSS2的共表达，和(ii)通过HEK293SF细胞的瞬时转染在37℃下产生慢病毒VLP。

使用用于本发明的多肽构建体的两种方法获得的IC50数据列于表6中，而剂量-响应曲线显示于图8中。首先，我们注意到用两种实施方式获得的IC50值之间的极好的相关性，其中IC50值之间的线性相关性R²为1.0，log₁₀(IC50)值之间的线性相关性R²为0.99。此外，这些假病毒中和数据与如前所述并列于表5的通过SPR结合实验获得的从刺突蛋白-RBD的刺突蛋白解离速率几乎完全相关，k_off和IC50(任一假病毒中和方法)之间的R²＝0.99，并且log₁₀k_off和log₁₀IC50(任一假病毒中和方法)之间的R²值为0.96-0.99。这些极高的相关性表明数据的稳健性并有力地证实了本发明的多肽构建体的作用机制，即与病毒刺突蛋白-RBD的结合阻止病毒进入宿主细胞。我们还注意到，虽然用两种方法获得的IC50数据之间存在极好的相关性，但相对于方法2，方法1的绝对IC50转换为更高的值。这种影响可能是由于不同的实施方式，特别是由于方法1中在表达ACE2的细胞上包括了TMPRSS2的共表达，而方法2没有这样做。TMPRSS2的共表达可能促进病毒进入和感染，因此解释了为什么方法1相对于不包括TMPRSS2的方法2在更高剂量的化合物下发生中和。

实现的最佳假病毒中和水平对于两种方法都是优异的，其中一些ACE2m4变体(SEQID NO:21,23)在方法1中达到约25ng/mL的IC50值，和在方法2中达到3ng/mL(表6)。明显的是，在多肽分子工程改造阶段(参见实施例1)进行的序列和结构优化导致假病毒中和效力的显著提高。因此，IC50范围的这些改善对于方法1为8至100倍，对于方法2为至少8倍至至少300倍。表6中数据的更详细的结构-活性关系分析也揭示了有趣的模式，这与上一节中描述的结合数据(表5)的分析完全一致。在这些模式中，重要的是突显令人惊讶和意想不到的发现，即相对于在位置92处具有Thr残基并因此具有在Asn90处附着的碳水化合物结构的更常见的人变体，ACE2催化结构域(R1区域)的天然人变体Ile92在中和效力方面提供了显著的改善。如果将包含Thr92的变体ACE2m1-SG4-Fc(SEQ ID NO：18)与包含Ile92的变体ACE2m4-SG4-Fc(SEQ ID NO：21)和ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)进行比较，这从表6和图8中的数据是很容易看出的，而ACE2催化结构域(R1区域)的其余部分在这些变体之间是相同的。因此，IC50中令人惊讶的4至5倍(取决于所使用的方法)降低可直接归因于人ACE2催化结构域中的天然突变T92I。

表6.SARS-CoV-2刺突蛋白假型病毒的中和作用。

用各种SARS-CoV-2变体假型化的VLP的中和

用来自最初的SARS-CoV-2的S蛋白中和VLP假型的能力促使我们测试本发明的选定多肽阻断用来自其他SARS-CoV-2变体的S蛋白假型化的VLP进入细胞的能力。该测定采用在HEK293T细胞上共表达人ACE2和TMPRSS2的方法1。根据Bloom实验室描述的方案和试剂[45]，使用表达SARS-CoV-2刺突蛋白的各种变体的质粒生产假型SARS-CoV-2刺突蛋白慢病毒颗粒，并进行以下修改：(1)HEK293SF-3F6细胞[46]用于以300mL大规模生产慢病毒颗粒；(2)转染后的HEK293SF-3F6细胞在33℃下孵育以提高产量；(3)感染后72小时收获慢病毒颗粒并通过蔗糖垫层离心浓缩。简而言之，将上清液置于20％蔗糖垫层上，并在4℃下以37,000×g离心3小时。然后，将含有浓缩的假型VLP的沉淀重悬于含有10％FBS的DMEM中并等分。使用过表达人ACE2和TMPRSS2的HEK293T细胞进行滴定，该细胞获自ATCC和NIH的BEI资源库(NR-55293)。使用以下质粒。SARS-CoV-2：质粒名称＝“pHDM SARS-Cov-2”(BEIResources，NIAID，NIH：SARS相关冠状病毒2，刺突蛋白假型慢病毒试剂盒，NR-52948)。D614G：质粒名称＝“pHDM SARS2-Spike-Del21-D614G”，HDM_SARS2_Spike_del21_D614G是来自Jesse Bloom的礼物(Addgene质粒#：158762；http://n2t.net/addgene:158762；RRID：Addgene_158762)。B.1.1.7(Alpha)：质粒名称＝“pPACK-SPIKE N501Y”，SARS-CoV-2“S”假型-N501Y突变体-慢病毒载体包装混合物(SBI System Biosciences SBI，目录号：CVD19-560A-1；突变：N501Y)。B.1.351(Beta)：质粒名称＝“pPACK-SPIKE B.1.351”，RBD突变慢病毒载体包装混合物(SBI System Biosciences，目录号：CVD19-580A-1；突变：K417N、E484K和N501Y)。B.1.617.2(Delta)：质粒名称＝“pcDNA3.3-SARS2-B.1.617.2)pcDNA3.3-SARS2-B.1.617.2”是来自David Nemazee的礼物(Addgene质粒#：172320；http://n2t.net/ addgene:172320；RRID:Addgene_172320)。

假病毒中和测定根据先前描述的方案进行[45]，并适用于384孔板。简而言之，将含有本发明选择的多肽的样品的3倍系列稀释液与稀释的病毒以1:1的比例在37℃下孵育1小时，然后添加到HEK293-ACE2/TMPRSS2细胞中。然后通过每孔的发光读数测量感染性。将Bright-Glo萤光素酶试剂(Promega，E2620)添加到孔中2分钟，然后用PerkinElmerEnvision仪器读数。使用GraphPad Prism8(GraphPad Software Inc.)通过非线性回归(log[抑制剂]相对标准化响应-可变斜率)计算50％抑制浓度(IC50)。

如图8C中所示，本发明提供的测试的多肽提供了针对用所有研究的病毒S蛋白变体假型化的VLP的细胞感染的优异阻断。表6a列出了各种病毒变体的相关IC50值(单位为nM和ng/mL)。直接明显的是，对于本发明的每种测试的多肽，不同病毒变体的IC50值存在微小差异。值得注意的是，相对于原始SARS-CoV-2病毒，所测试的本发明的两种多肽似乎更有效地(2倍)中和B.1.617.2(Delta)变体(一种受关注的主要变体)。总而言之，该假病毒中和数据进一步支持本发明的多肽类别的泛特异性，其可以提供一种稳健的方法来减轻由当前以及未来出现的SARS-CoV-2变体引起的COVID-19感染。

表6a.用来自所关注的SARS-CoV-2变体的刺突蛋白假型化的VLP的中和。

na：未评估

实施例8.通过多肽构建体中和SARS-CoV-2真实病毒

还评估了本发明的多肽中和活复制真实病毒对人VERO-E6细胞的感染的能力。这是通过微量中和测定完成的。SARS-CoV-2分离株Canada/ON/VIDO-01/2020获自国家微生物实验室(Winnipeg,MB,Canada)，在Vero E6细胞上繁殖并在Vero细胞上进行定量。进行全病毒基因组测序以确认与原始分离株的精确遗传同一性。使用第3代病毒储液。中和活性通过微量中和测定来确定。简而言之，在补充有1mM丙酮酸钠、1mM非必需氨基酸、100U/mL青霉素-链霉素和0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM高葡萄糖培养基中进行15μg每种多肽的1:5系列稀释。以1:1的比例向每种抗体稀释液中添加125个噬斑形成单位(PFU)的SARS-CoV-2，并在37℃下孵育1小时。孵育后，用病毒/多肽混合物感染接种在96孔板中的Vero E6细胞，并在湿润/5％CO₂培养箱中于37℃下孵育72小时的感染后时间(hpi)。然后将细胞在10％甲醛中固定过夜，用小鼠抗SARS-CoV-2核衣壳抗体(R&D Systems，克隆#1035111)检测病毒感染，并用兔抗小鼠IgG-HRP(Rockland Inc.)复染。使用邻苯二胺二盐酸盐过氧化物底物(Sigma-Aldrich)进行比色显色，并在Biotek Synergy H1酶标仪上于490nm处进行检测。使用GraphPad Prism 9软件通过非线性回归确定IC50。

如图9和表7中所示，测试的选择的多肽以在1-4ng/mL范围内的IC50值抑制活病毒的复制，并且相对于阳性对照抗SARS-CoV-2单克隆抗体REGN10933[47]提供了超过10倍改善的功效。例如，多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)在体外细胞培养物中抑制真正的SARS-CoV-2病毒对人VERO-E6细胞的感染，具有约1ng/mL或6pM的优异IC50。此外，多肽ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)在体外细胞培养物中抑制真正的SARS-CoV-2病毒对人VERO-E6细胞的感染，具有约4ng/mL或22pM的良好IC50。相比之下，在此测定中，对照抗体REGN10933显示43ng/mL或287pM的IC50。总而言之，这些数据表明，ADAPT引导的用于提高结合亲和力的ACE2与SARS-CoV-2刺突蛋白RBD交互的优化可以转化为细胞水平上的显著功能改善。

表7.SARS-CoV-2真实活病毒的中和。

实施例9.高血压小鼠中的体内评估

[我们非常感谢Kevin Burns博士实验室(OHRI,University of Ottawa,Ottawa,Canada)提供的一些与高血压小鼠体内评估相关的技术数据]。

伦理声明

所有在动物上进行的实验均获得Ottawa大学动物护理委员会(协议3514)的批准，并遵循加拿大动物护理委员会(CCAC)的规定。

干预措施的分配

小鼠被安置在Ottawa大学动物护理设施内，持续监测湿度和温度，并可以自由获取饮水和食物。笼子的分配是在架子内随机进行的。使用在线随机化工具(randomizer.org)对实验组进行分配。

血管紧张素II输注

对12-14周龄的C57BL/6雄性和雌性C57BL/6小鼠进行渗透微型泵(型号1004)的皮下植入。在微型泵植入前1小时给小鼠注射0.01mg/kg丁丙诺啡。小鼠最初用5％异氟烷麻醉，并在整个手术过程中保持在2.5％异氟烷下。将动物剃毛并用含有4％葡萄糖酸氯己定的溶液消毒皮肤。在被膜下区域垂直于脊柱切开0.5cm宽的切口，并使用止血钳制作皮下袋。将微型泵插入口袋中并使用2个缝合伤口夹闭合切口。将布比卡因局部施加在切口上，并将动物转移到加热的恢复区，直到它们从麻醉中恢复。手术后4小时，小鼠再次注射丁丙诺啡，并监测72小时，每天两次。血管紧张素II以1000ng/kg/min输注3周，对照小鼠通过微型泵输注盐水溶液。

本发明的多肽的静脉内施用

将本发明的两种多肽静脉内施用至小鼠：ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)和ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)。研究了两类小鼠：血压正常和高血压。将小鼠分为以下组：i)生理盐水，ii)Ang II，iii)Ang II+rhACE2，iv)Ang II+ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc，v)Ang II+ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc。小鼠在插入渗透微型泵后2.5周接受单次静脉注射(通过尾静脉)的ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(10mg/kg)、ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(10mg/kg)或rhACE2(2.5mg/kg-BioLegend，目录号：792008)变体。对照小鼠接受PBS。注射本发明的多肽或rhACE2后72小时进行安乐死，并收集血浆、肾、心脏、肺、肝和脾用于分析。

血压测量

如前所述[48]，通过尾套体积描记法(BP-2000；Vistech Systems，Apex，NC)测量收缩压(SBP)。小鼠接受连续5天的训练并进行模拟测量。在基线(3次测量)、渗透微型泵植入后2.5周(2-3次测量)以及注射本发明的多肽后3、6、24、48和72小时评估SBP。每个时间点对每只小鼠进行10个SBP读数，并根据这些读数计算平均SBP。

通过植入渗透微型泵后2.5周SBP的显著升高证实了血管紧张素II输注诱发的高血压。rhACE2在注射后短暂地降低SBP长达6小时，而ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)对SBP没有显著影响(图10A)。值得注意的是，ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)显著降低SBP长达24小时，并且这种降低效果部分持续48小时(图10A)。

血浆和组织ACE2活性

在终点(72小时)收集的血浆和组织(肾、心脏、肺、肝和脾)中评估ACE2酶活性。如所述的[40]，使用来自Anaspec的荧光底物Mca-APK(Dnp)在有或没有ACE2特异性抑制剂MLN-4760的情况下测定活性。血浆ACE2活性在5μL血浆中测定。对于组织ACE2活性，将样品在500μL含有pH7.4的50mM HEPES、150mM NaCl、0.5％Triton X-100、0.025mM ZnCl₂和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，目录号：P8340)的裂解缓冲液中匀浆。将裂解物在4℃下以12,000xg离心10分钟以去除碎片。上清液保存于-80℃。使用DC蛋白测定试剂盒(Bio-RadLaboratories，目录号：5000112)测定蛋白浓度。由于ACE2丰度的差异，肾组织以1μg总蛋白进行测定，并与荧光底物一起孵育1小时。心脏、肺、肝和脾ACE2活性以10μg进行测定，并与荧光底物(11.25μM)一起孵育16小时。数据以平均值±SEM表示。使用用于Windows的Prism9.3.0,GraphPad Software,San Diego,California USA,www.graphpad.com进行统计分析。通过单向ANOVA进行组间比较，然后进行Tukey或Dunnett后检验。P<0.05被认为有统计学意义。

在终点(施用本发明的多肽后72小时)从小鼠收集的血浆中评估ACE2活性。在此测定中，ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)在终点时在血浆中实际上无活性，而ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)的活性与所有组相比显著增加(图10B)。

对肾、心脏、肺、肝和脾的裂解物中的组织ACE2活性进行了分析(图10B)。所有样品中肾裂解物的活性没有显著差异。Ang II+ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc组的心脏裂解物中ACE2活性显著增加。Ang II+ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc组的肝裂解物中ACE2活性显著较高。最后，当分析来自脾的样品时，各组之间的ACE2活性没有差异(图8A)。

免疫印迹

如上所述获得组织裂解物。裂解物的量取决于组织/样品类型而变化，如下：血浆1μl，肾20μg，心脏和肺30μg，肝和脾40μg。将裂解物添加到4xLaemmli样品缓冲液中，加载到梯度SDS-PAGE凝胶(5-15％)中，然后进行电泳。将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad Laboratories，目录号：1620112)，并在含有0.1％Tween20(TBS-T)和3％牛血清白蛋白(BSA)的Tris缓冲盐水(pH7.6)溶液中封闭1小时，在室温下进行1小时。将膜用山羊抗ACE2(1:1000稀释，R&D Systems，目录号：AF933)在4℃下探测过夜，然后与1:5,000HRP-驴抗山羊IgG(Jackson ImmunoResearch，目录号：705-035-147)一起孵育。使用HRP-驴抗人IgG Fcγ1:10,000(Jackson ImmunoResearch，目录号：709-035-098)在4℃下过夜进行针对IgGFc的探测。通过向膜添加Amersham ECL蛋白质印迹检测试剂(GE Healthcare，目录号：CA95038-564L)诱导化学发光，并在Alpha Innotech FluorChem Q定量蛋白质印迹成像系统上进行检测。

通过免疫印迹在rhACE2和Ang II+ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)组的血浆中检测到ACE2，并且在Ang II+ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)组的血浆中检测到非常低的水平(图10C)。此外，在来自几个组的许多器官组织的裂解物中检测到ACE2(图10C)。在大多数样品中，免疫印迹检测(图10C)与测得的ACE2活性(图10B)相关。值得注意的是，肾脏中ACE2的免疫印迹显示出显著水平的内源性ACE2(约100kDa)，并且仅在来自Ang II+ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc组的裂解物中检测到不太明显的高分子量带(紧接着低于250kDa；其可能对应于本发明的ACE2-Fc同源二聚体)。当用抗人IgG Fcγ探测时，检测到相同的条带，指示肾组织裂解物中ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc的存在。ACE2和IgG Fcγ的免疫印迹与心脏裂解物中的ACE2活性数据一致，表明ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc在心脏组织中相当多的保留。肺裂解物还证明ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc的持续存在。此外，ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc与内源性ACE2的比率升高。在肝脏裂解物中，在免疫印迹上再次检测到ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc的高MW条带。来自脾脏的免疫印迹上存在与ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc相对应的高MW条带的强烈信号。

白蛋白与肌酐的比率

在终点(72小时)收集随机尿(Spot urine)。按照制造商的说明，将尿液样品稀释1:200至1:500。白蛋白通过ELISA(Beth Laboratories Inc.，目录号：E99-134)测量。使用Ethos Bioscience的基于比色的试剂盒(目录号：1012)对尿液中的肌酐进行定量。将白蛋白的值转换为μg/dL，并且白蛋白与肌酐的比率通过白蛋白水平除以肌酐水平(mg/dL)计算。

白蛋白的尿排泄量的增加可能表明肾脏受损。使用终点(72小时)收集的尿液进行的分析表明，白蛋白与肌酐的比率(ACR)没有显著变化。然而，与盐水组相比，高血压组有明显的增加趋势。与盐水组相比，用ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)治疗的高血压小鼠具有最低的白蛋白排泄值(图10D)。

总之，尽管本发明的许多新多肽显示出持续的体外ACE2活性，具有与rhACE2相当的性能，但多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)在体内迅速丧失活性。候选多肽ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)在该模型中具有增强的体内性能，暂时减少SBP。静脉注射后72小时，在各种组织裂解物中持续检测到ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQID NO：28)，连同增加的ACE2活性和延长的血压降低作用，表明ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)可能具有显著的治疗潜力。总而言之，血浆和各种组织中的ACE2酶活性和免疫印迹是一致的，并且支持使用ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)观察到的SBP降低作用以及减少的白蛋白尿，并强烈表明本发明的选择的多肽作为针对由COVID-19引起的主要器官损伤的保护剂的治疗作用。

实施例10.SARS-CoV-2感染的仓鼠的体内评估

鼻内施用

鉴于在高血压小鼠的体内模型中观察到的本发明的一些多肽在血浆中的不稳定性，首先采用鼻内施用途径用于使用仓鼠模型来体内测试从COVID-19的恢复情况[49]。雄性叙利亚金仓鼠(81-90g)获自Charles River Laboratories(Saint-Constant,QC,Canada)。根据加拿大动物护理委员会的指南，动物饲养在加拿大国家研究委员会(NRC)的动物设施中。本研究中对动物进行的所有程序均符合NRC人健康治疗动物护理委员会在动物使用协议2020.06中审查和批准的法规和指南。使用8x 10³PFU的SARS-CoV-2分离株Canada/ON/VIDO-01/2020对雄性仓鼠进行鼻内攻击。测试了两种给药方案。在组合的预防性和治疗性给药中，在病毒攻击前4小时对动物鼻内施用本发明的多肽，并且在病毒攻击后24小时重复给药。在仅治疗性给药中，在病毒攻击后6小时向动物鼻内施用本发明的多肽，并且以24小时的间隔施用重复剂量。所有鼻内施用均以150μL的固定总体积进行，在左侧和右侧鼻孔之间交替进行，直至每个鼻孔接收总共75μL的测试品溶液。对照组动物仅接受PBS媒介物。测定每日体重。数据以平均值±SEM表示。n＝每组6至7只动物。

图11A显示了组合的预防性和治疗性施用后各组的体重变化。本发明测试的两种多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)和ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)相对于对照组(仅媒介物)对治疗组有显著影响，如减少的体重减轻所示。对于这两种测试品，恢复实际上在攻击后第3天导致体重增加。此外，在两个测试剂量下，即4mg/kg的高剂量(施用两次)和1mg/kg的低剂量(施用两次)，使用ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc多肽构建体获得了类似的恢复。这些结果证明了用本发明的多肽(包括但不限于ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23))通过非全身性施用途径治疗COVID-19的可行性。

仅治疗性施用后各组的体重变化显示于图11B中。本发明测试的两种多肽ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：23)和ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)相对于对照组(仅媒介物)对治疗组有显著影响，如减少的体重减轻所示。即使在比ACE2m4-hinge2CS-SG4-Fc多肽构建体更少的施用次数下，ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc多肽构建体也导致更显著的恢复(分别为5次相对3次的1mg/kg的治疗性施用)。此外，在使用ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc治疗在攻击后第2天和使用ACE2m4-hinge2CS-SG4治疗在攻击后第4天，恢复实际上导致了体重增加。这些结果证明进一步支持本发明的多肽作为用于从SARS-CoV-2病毒感染和COVID-19恢复的治疗剂的预期用途。

静脉内施用

由于ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)在血浆和器官组织(包括肺和其他器官)中表现出优异的稳定性(图10)，因此还通过体内全身施用途径用于在体内在COVID-19仓鼠模型[49]中对其进行了评估。雌性金色叙利亚仓鼠81-90克(Charles RiverLabs)经鼻内感染10⁴PFU的SARS-CoV-2活病毒。在病毒攻击时，将PBS溶液中的本发明的选择的多肽以10mg/Kg的剂量在眼后静脉中施用。病毒攻击后24小时以相同剂量进行重复施用。对照组动物仅接受PBS。每组由7只动物组成。攻击后3天对动物实施安乐死，并通过噬斑测定确定肺组织的病毒载量。攻击后3天对动物实施安乐死，并通过培养的VERO-E6细胞的感染使用噬斑测定来确定肺组织中的病毒载量，如前所述[50]。

如图11C所示，静脉内施用ACE2I92-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：28)减少了雌性仓鼠中的SARS-CoV-2感染，如通过噬斑测定确定的活病毒的中值水平相对于PBS对照组中的中值水平减少几乎一个数量级所证实的。重要的是，从图11C所示的数据可以明显看出，本发明的多肽的ACE2胞外域区域中的T92I突变是实现病毒滴度降低的关键。这通过与掺入亲本未突变的人ACE2胞外域的ACE2-hinge2CS-SG4-Fc(SEQ ID NO：27)多肽(其相对于PBS对照中的中位病毒滴度不会导致病毒滴度的中位降低，而相反似乎有相反的效果)的比较来证明。该数据基于人ACE2的T92I天然存在的突变作为必要的关键元件强调了本发明的多肽融合物的独特结构，其具有针对COVID-19感染和相关的主要器官损伤的令人惊讶和意想不到的功效特征。

序列表

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如果显示了，则信号肽是斜体、加下划线的，并且在最终蛋白产品中不是必需的。

参考资料

以下参考资料各自的内容在此通过引用整体并入本文。

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Claims

1.一种多肽构建体，其能够中和SARS-CoV-2并将Ang-II转化为Ang-(1-7)，所述多肽构建体包含四个区域并具有以下通式：

并且其中：

R1，表示hACE2I⁹²(18-614),X²⁷,X²⁶¹,X³³⁰，是包含人血管紧张素转化酶2(hACE2)受体催化结构域残基18至614的天然存在的变体Ile92(I92)的N末端第一区域，其包含残基X²⁷、X²⁶¹和X³³⁰；其中X²⁷是位置27处的氨基酸残基，其是Thr或Tyr，X²⁶¹是位置261处的氨基酸残基，其是Cys或Ser，并且X³³⁰是位置330处的氨基酸残基，其是Asn或Tyr；

R2是包含柔性肽间隔子的第二区域；

R3是包含人IgG1重链抗体的铰链区的第三区域，其中所述铰链区包含残基S²²⁰、X²²⁶和X²²⁹；其中人IgG1铰链位置220处的氨基酸残基是Ser，并且其中人IgG1铰链位置226和229处的氨基酸残基是Cys或Ser；和

R4是多肽的C末端的第四区域，其中R4表示为并包含C_H2G²⁷⁰-C_H3，并且包含人IgG1抗体重链的第二恒定结构域(C_H2)和第三恒定结构域(C_H3)，其中人IgG1 C_H2结构域中位置270处的氨基酸残基是甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中所述R2间隔子区域包含含有Gly和Ser残基的柔性肽间隔子。

3.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体以低于2500ng/mL(12.5nM)的浓度的IC50中和由SARS-CoV-2刺突蛋白变体介导的细胞感染。

4.根据权利要求1至3所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体以至少500ng/mL(2.5nM)的IC50中和SARS-CoV-2。

5.根据权利要求1至4所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体保留重组人ACE2的至少30％的催化效率(k_cat/K_M)和至少60％的酶活性。

6.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中R1包含选自以下的序列：SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和与其至少90％相同的序列。

7.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中R2包含选自以下的序列：SEQ ID NO：8、SEQID NO：9和与其至少90％相同的序列。

8.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中R3包含选自以下的序列：SEQ ID NO：11、SEQID NO：12和与其至少90％相同的序列。

9.根据权利要求1所述的多肽构建体，其中R4包含以下序列：具有SEQ ID NO：14的序列，或与其至少90％相同的序列。

10.根据权利要求1所述的多肽构建体，其包含选自以下的序列：SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：28和与其至少90％相同的序列。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的多肽构建体，其中所述构建体是二聚体多肽。

12.根据权利要求11所述的多肽构建体，其中所述二聚体多肽可以经由各自的R3铰链区通过二硫桥连接或二聚化。

13.一种核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项的多肽构建体。

14.一种载体，其包含权利要求12的核酸分子。

15.一种核酸序列，其编码权利要求1至12中任一项的多肽，所述多肽呈可由选择的表达宿主分泌的形式。

16.一种组合物，其包含权利要求1至12中任一项的多肽构建体和药学上可接受的承载体、稀释剂或赋形剂。

17.一种转基因细胞宿主，其包含权利要求13的核酸分子或权利要求14的载体。

18.根据权利要求15所述的转基因细胞宿主，进一步包含编码与第一多肽构建体相同的第二多肽构建体的第二核酸分子或第二载体。

19.一种产生二聚体多肽的方法，包括培养权利要求16的宿主，和从通过该宿主的生长条件化的培养基中回收根据权利要求10所述的二聚体多肽构建体。

20.根据权利要求1至12中任一项所述的多肽构建体用于治疗医学病况、疾病或病症的用途。

21.根据权利要求20所述的用途，其中所述医学病况、疾病或病症包括冠状病毒感染例如COVID-19、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和相关的主要器官衰竭例如肺、心脏、肾、脑和肠衰竭。