POLIPEPTIDO QUIMÉRICO FIBRINA-FILAGRINA CITRULINADO CAPAZ DE DETECTAR LOS ANTICUERPOS GENERADOS EN LA ARTRITIS REUMATOIDE
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un polipéptido quimérico, capaz de detectar los anticuerpos generados en Ia artritis reumatoide, que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas: (i) una procedente de Ia cadena α o β de Ia fibrina y (ii) una segunda procedente de Ia filagrina. Además, Ia invención comprende una composición antigénica, un método y un kit para el diagnóstico y pronóstico de Ia artritis reumatoide, a partir de Ia detección de los auto-anticuerpos generados durante el curso de dicha enfermedad.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La artritis reumatoide (AR) es una de las enfermedades autoinmunes más comunes, con un origen desconocido y que afecta al 0.5-1 % de Ia población, destruyendo progresivamente las articulaciones, causándoles deformidad y pérdida de función, además de producir complicaciones sistémicas.
En esta enfermedad Ia terapia intensiva aplicada en estadios iniciales ofrece resultados muy positivos, siendo fundamental su diagnóstico prematuro. El criterio de clasificación para Ia AR según el Colegio
Americano de Reumatología (ACR) (Arnelt FC, et al. Arthritis Rheum.
1988; 31:315-24) está basado en parámetros puramente clínicos, aunque estos criterios no son útiles para el diagnóstico temprano de Ia AR (Saraux A, et al. Arthritis Rheum 2001; 44: 2485-91).
En Ia actualidad existen diferentes métodos serológicos que permiten el diagnóstico de Ia AR y Ia distinguen de otras patologías similares en fases tempranas de su evolución. En este sentido, se conocen una serie de anticuerpos específicos para Ia AR, tales como: el factor antiperinuclear (APF), anticuerpos antifilagrina (AFA) y los anticuerpos antiqueratina (AKA). Los epítopos reconocidos por estos anticuerpos (auto-anticuerpos anti-proteínas citrulinadas) son generados por modificaciones post- traduccionales que consisten en Ia deiminación de Ia arginina a citrulina por Ia enzima peptidilarginina deiminasa (Vossenaar ER, et al. Bioessays 2003; 25: 1106-18).
Una de las herramientas más específicas en el diagnóstico de Ia AR consiste en Ia detección de los auto-anticuerpos generados frente a péptidos o proteínas citrulinadas, constituyendo éstos uno de los marcadores serológicos más eficaces de esta patología que se conocen {Nijenhuis S, et al. Clin. Chim. Acta 2004; 350: 17-34). Incluso, los kits (ELISA) más efectivos y comercialmente más extendidos para el diagnóstico de Ia AR están basados en péptidos citrulinados (CCP-1 y CCP-2) derivados concretamente de Ia proteína filagrina (Nijenhuis S, et al. 2004).
Otras proteínas del tejido sinovial que pueden ser citrulinadas son las cadenas α y β de Ia fibrina y el antígeno Sa o vimentina citrulinada. Recientemente, Sebbag et al (Sebbag et al Eur. J. Clin. Immunol. 2006, 36: 2250-2263) identificó 18 péptidos derivados de Ia proteina fibrina, dos de los cuales, denominados como [Cit60>72>74] β-fibrina (60-74) y [Cit3842] α- fibrina (36-50) y localizados en el dominio globular de Ia proteína, eran capaces de reaccionar frente a todos los sueros positivos para auto- anticuerpos anti-proteínas citrulinadas. Estos resultados han sido corroborados por recientes estudios (Pérez, et al Chem. Biol. Drug Des. 2006, 68, 194-200; US 7,022,485), donde se ha analizado Ia reactividad de
péptidos derivados de Ia fibrina en el diagnóstico de AR, confirmándose así su utilidad para el desarrollo y mejora de Ia eficacia de los sistemas de diagnóstico actuales.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Existe un creciente interés por desarrollar tests o pruebas específicas que mejoren el diagnóstico de Ia AR así como su diferenciación temprana respecto a otras enfermedades reumáticas que afectan a las articulaciones y tejido conectivo, sobre todo en pacientes con un peor pronóstico o aquellos con un desarrollo más temprano de Ia enfermedad. La incorporación de estos tests en Ia práctica clínica podría permitir Ia identificación de aquellos pacientes que requieren terapias más intensivas desde el mismo momento del diagnóstico de Ia enfermedad, permitiendo así un mayor control de ésta y, consecuentemente evitar al máximo Ia destrucción articular y mejorar el pronóstico de Ia enfermedad.
Los autores de Ia presente invención, en su afán de mejorar los sistemas de diagnóstico de Ia AR que se emplean actualmente, han descubierto sorprendentemente una serie de péptidos citrulinados de las cadenas α y β de Ia fibrina con especial sensibilidad y especificidad frente a los auto- anticuerpos anti-proteínas citrulinadas, en adelante auto-anticuerpos, que se generan durante el desarrollo de Ia AR. Además, uno de estos péptidos citrulinados de Ia cadena α de Ia fibrina fue unido covalentemente a un péptido cíclico de Ia filagrina obteniéndose un polipéptido quimérico (fibrina-filagrina) que fue capaz de complementar o mejorar los resultados de sensibilidad y especificidad obtenidos con péptidos CCP-1 y CCP-2 (Inmunoscan RA).
Así, un primer aspecto de Ia invención está referido a un polipéptido quimérico, que comprende al menos dos subunidades peptídicas
citrulinadas y unidas covalentemente, capaz de interaccionar con anticuerpos auto-inmunes generados durante Ia AR, donde:
a. una subunidad (a) comprende al menos un 85% de homología, preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 93%, aún más preferentemente al menos un 95% y todavía más preferentemente al menos un 98%, con un fragmento de al menos 7 aminoácidos de cualquiera de las cadenas α y β de Ia fibrina, preferentemente de longitud entre 10 y18 aminoácidos, y b. una segunda subunidad (b) ciclada que comprende al menos un 85%, preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 93%, aún más preferentemente al menos un 95% y todavía más preferentemente al menos un 98%, de homología con un fragmento de al menos 7 aminoácidos de Ia proteina filagrina, preferentemente de longitud entre 10 y 18 aminoácidos.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención Ia subunidad b comprende al menos dos aminoácidos cisteína entre los cuales se forma un puente disulfuro para ciclar dicha subunidad. Preferentemente estas cisteínas provienen de una sustitución serina-cisteína.
En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención el fragmento de Ia filagrina a partir del cual se obtiene Ia subunidad b, es el comprendido entre las posiciones 306 y 324 de dicha proteína, y en una realización todavía más preferida Ia secuencia comprendida entre las posiciones 306 y 324 de Ia β-fibrina es Ia SEQ ID NO:7.
En una realización aun más preferida Ia subunidad (b) comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 1 (cfdcyc).
En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención el fragmento de fibrina a partir del cual se obtiene Ia subunidad a, es el fragmento que va de Ia posición 617 a 631 de Ia α-fibrina, o bien el comprendido entre las posiciones 43 y 62 de Ia β-fibrina. En una realización preferente Ia secuencia comprendida entre las posiciones 617 y 631 de Ia α-fibrina es Ia SEQ ID NO:8. En una realización aún más preferente Ia secuencia comprendida entre las posiciones 43-62 de Ia β- fibrina es Ia SEQ ID NO:9.
En una realización todavía más preferida de este aspecto de Ia invención Ia subunidad (a) del polipéptido quimérico comprende Ia secuencia se seleccionada del grupo:
a. SEQ ID NO:2 (p18), b. SEQ ID NO:3 (p19), ó c. SEQ ID NO:4 (p22),
En una realización todavía más preferida de este aspecto de Ia invención Ia subunidad (a) del polipéptido quimérico comprende Ia secuencia SEQ ID NO:5 (p38).
En otra realización preferida de Ia invención el polipéptido quimérico comprende Ia SEQ ID NO:6 (p18-cfdcyc).
En una realización también preferida de Ia invención el polipéptido quimérico, según cualquiera de los aspectos anteriores de Ia invención, está marcado o conjugado con moléculas transportadoras.
En adelante estos polipéptidos quiméricos citrulinados serán denominados como "polipéptido quimérico de Ia invención". Dichos polipéptidos podrán
ser obtenidos por procedimientos sobradamente conocidos en el estado de Ia técnica, tales como Ia síntesis química de péptidos en fase sólida (ver material y métodos).
Un segundo aspecto de Ia invención se relaciona con péptidos citrulinados de las cadenas α y β de Ia fibrina donde dichos péptidos tienen cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo: p18, p19, p22 y p38 o secuencias análogas (péptidos análogos), donde dichos péptidos citrulinados y péptidos análogos son capaces de interaccionar con los auto anticuerpos específicos de Ia AR. En una realización preferida de Ia invención los péptidos se encuentran ciclados y en una realización Ia ciclación se lleva a cabo a partir de dos cisteínas, preferentemente provenientes de una sustitución serina-cisteína. En adelante estos péptidos citrulinados serán denominados como "péptidos de Ia invención"
Un tercer aspecto de Ia invención se relaciona con una composición antigénica para el análisis diagnóstico y/o pronóstico de Ia AR que comprende al menos uno de los péptidos de Ia invención, el polipéptido quimérico de Ia invención o combinaciones de los mismos. En adelante esta composición será denominada como "composición antigénica de Ia invención".
Un cuarto aspecto de Ia invención se relaciona con un método para Ia detección de auto-anticuerpos específicos de Ia AR en una muestra biológica que comprende:
a. Poner en contacto una muestra biológica con al menos uno de los compuestos siguientes: un péptido de Ia invención, un polipéptido quimérico de Ia invención, una composición antigénica de Ia invención. b. Detectar Ia interacción entre los auto-anticuerpos específicos
y los péptidos de Ia invención, el polipéptido quimérico o composición antigénica del paso (a), mediante cualquier metodología útil, como puede ser cualquiera de los numerosos y sobradamente conocidos métodos en el estado de Ia técnica (por ejemplo a través del marcado de los péptidos, o Ia medición de Ia densidad óptica de Ia muestra, etc.) o cualquier otro método.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, se pone en contacto con Ia muestra biológica más de un polipéptido quimérico de Ia invención. En otra realización de Ia invención, Ia muestra biológica se pone en contacto con uno o más de los polipéptidos quiméricos de Ia invención y el polipéptido CCP-2.
Un quinto aspecto de Ia invención se relaciona con un kit de diagnóstico y pronóstico de Ia AR que comprende al menos uno de los péptidos de Ia invención, el polipéptido quimérico de Ia invención ó Ia composición antigénica de Ia invención (antígenos), preferentemente dicho kit comprenderá los reactivos y tampones necesarios para permitir Ia formación del complejo anticuerpo-antígeno.
Definiciones:
El termino "péptido o polipéptido derivado" hace referencia a Io largo de Ia descripción a péptidos que se obtienen a partir de regiones o fragmentos de al menos 7 amino ácidos de Ia proteína filagrina o de las cadenas α y β de Ia fibrina. Estos péptidos derivados han podido sufrir modificaciones (ejemplo: delaciones, deiminaciones, etc), que hayan reducido su homología con Ia secuencia inicial de Ia proteina de Ia que derivan. Un ejemplo de estos péptidos son los grupos de péptidos conocidos como CCP-1 y CCP-2.
El término "péptidos CCP-1" hace referencia a Io largo de Ia descripción a péptidos cíclicos derivados de Ia filagrina.
El término "péptidos CCP-2" hace referencia a Io largo de Ia descripción a péptidos con un grado de sensibilidad y especificad para Ia detección de Ia
AR mayor que el alcanzado con los péptidos CCP-1. A Io largo de los ensayos, que se muestran en Ia descripción, los péptidos de Ia invención son comparados con los péptidos CCP-2 obtenidos a partir del kit comercial de Immunoscan (Immunoscan RA; Eurodiagnostica, distribuido por Diasorin, Madrid, España).
El término "péptidos o polipéptidos análogos" está referido a péptidos donde al menos uno de sus aminoácidos ha sido sustituido por otro de características similares según se indica a continuación:
- Neutros polares, hidrófilos o (polares): serina (Ser), treonina (Thr), cisteína (Cys), asparagina (Asn) y glutamina (GIn).
- Neutros no polares, apolares o hidrófobos: glicina (GIy), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (lie), metionina (Met), prolina (Pro), fenilalanina (Phe), triptófano (Trp) y tirosina (Tyr)
- Con carga negativa, o ácidos: ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (GIu).
- Con carga positiva, o básicos: lisina (Lys), arginina (Arg) e histidina (His).
El término "péptidos unidos covalentemente" hace referencia a péptidos entre los cuales media un enlace covalente y donde Ia unión puede darse con o sin espaciadores.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esta figura muestra un esquema de Ia estrategia de síntesis en fase sólida del péptido cíclico "cabeza-cola" (p38HT) procedente de Ia cadena β de Ia fibrina (fragmento 43-62). Reactivos y condiciones: (i) Fmoc-Asp-Odmab DCM, DIPCDI, 20min O0C; (ii) DMAP (4- Dimetilaminopiridina), DMF, 3h; (iii) Síntesis en fase sólida (SPPS); (iv) 20% piperidina/DMF; (v) 3% hidrazina/DMF; (vi) 20% H2O/DMF, 16 h; (vii) DMF, DCM, Metanol; (viii) 1% DIPEA/DMF; (ix) 1 % HOBt/DMF (x) PyBOP/DMF, DCM, 72h; (xi) 1% DIEA/DMF; (xii) DMF/MeOH; (xiii) TFA (ácido trifluoroacético)/EDTA/TIS (triijsopropilsileno)/H2O, 3h. Los grupos W, X y Z son grupos protectores empleados para dirigir Ia reacción de síntesis química de los péptidos.
Figura 2. Esta figura muestra un esquema de Ia estrategia de síntesis en fase sólida del péptido cíclico con puente disulfuro (p38SS). Reactivos y condiciones: (i) SPPS; (ii) 20% piperidina/DMF; (iii) TFA/EDT/TIS/H2O, 3h; (iv) l2/MeOH, 60min, l2/MeOH 90 min; (v) DCM. Los grupos W, X, y Z son grupos protectores empleados para dirigir Ia reacción de síntesis de los péptidos.
Figura 3. Esta figura muestra un esquema de Ia estrategia de síntesis en fase sólida del péptido p18-cfc1cyc. Reactivos y condiciones: a) (i) 20% piperidina/DMF; (ii) SPPS del péptido cfcicyc; (iii) SPPS, síntesis peptídica en fase sólida del péptido p18; (iv) 20% piperidina/DMF; (v) TFA/EDT/TIS/H2O; (vi) I2/Metanol, 60 min y H2O, 90 min; (vii) DCM
b) Reactivos y condiciones: (i) 20% piperidina/DMF; (ii) SPPS del péptido cfd ; (iii) I2/Metanol/DCM, 4h; (iv) DMF/Metanol; (v) SPPS de p18 (vi) 20% piperidina/DMF; (vii) TFA/TIS/H2O (90:5:5)
Figura 4. Esta figura muestra gráficas de reactividad, medida en densidades ópticas (DO492), de péptidos derivados de las cadenas α y β de Ia fibrina para una muestra de 33 sueros provenientes de pacientes con AR.
Figura 5. Esta figura muestra gráficas de reactividad, medida en densidades ópticas (DO492), del péptido derivado Ia cadena β de Ia fibrina p38 y los péptidos cíclicos p38HT y p38SS para una muestra de 110 sueros AR.
Figura 6. Análisis de curva ROC (A) y de Ia reactividad de los péptidos p22, p22sc y p22lc frente a auto-anticuerpos (B, C y D) para una cohorte de pacientes con AR o artritis psoriásica (PsA). A) La sensibilidad y Ia especificidad fue calculada para todos los potenciales valores de cut-off (línea de corte) y representada como curva ROC (n=111 pacientes AR positivos, n=82 pacientes PsA positivos). En las gráficas B, C y D se muestra Ia reactividad de p22, p22sc y p22lc frente a los anticuerpos de pacientes de AR y PsA (CONTROL), representada con los valores óptimos de "cuf-o/f' obtenidos del análisis con Ia curvas ROC de cada ensayo.
Figura 7. Análisis de curva ROC (A) y de reactividad frente a anticuerpos (B, C, D y E) del péptido lineal de Ia β-fibrina (p38), del péptido lineal de Ia α-fibrina (p22), del polipéptido quimérico p38-GGG-p22) y de Ia mezcla de p38 y p22 para una cohorte de pacientes con AR o PsA. A) La sensibilidad y Ia especificidad fue calculada para todos los potenciales valores de "cut-off" y representada como curva ROC (n=111 pacientes AR positivos, n=82 pacientes PsA positivos). En las gráficas B, C D y E se muestra Ia reactividad de p38, p22, p38-GGG-p22 y p38+p22 frente a los auto-anticuerpos de pacientes con AR o PsA (CONTROL), representada con los valores óptimos de "cut-off" obtenidos del análisis con Ia curvas ROC de cada ensayo.
Figura 8. Análisis de curva ROC y de Ia reactividad péptidos cíclicos derivados de Ia filagrina (cfdcyc) (Pérez, T. et al. J. Pept. Sci. (2006) 12 (4), 267-278.) y el polipéptido quimérico (p18-cfc1cyc) en una cohorte de pacientes con AR o PsA. A) La sensibilidad y Ia especificidad fue calculada para todos los potenciales valores de "cut-off" y representada como curva ROC (n=111 AR pacientes, n=82 PsA pacientes). B) En las gráficas B, C se muestra Ia reactividad de cfd y p18-cfc1cyc frente a los auto- anticuerpos de pacientes con AR o PsA (CONTROL), representada con los valores óptimos de "cut-off" obtenidos del análisis con Ia curvas ROC de cada ensayo.
Figura 9. Análisis de Ia correlación entre los títulos de anticuerpos anti- péptido p18-cfc1cyc y anti-CCP-2.
Figura 10. Curva ROC para Anti-CCP-2
Figura 11. Curva ROC para anti-quimérico fibrina/filagrina p-18
Figura 12. Curva ROC para anti-quimérico fibrina/filagrina p-19
Figura 13. Curva ROC para anti-quimérico fibrina/filagrina p-22
Figura 14. Evolución de los valores de Ia Proteína C reactiva (PCR) a Io largo del seguimiento entre pacientes CCP-2 (+) y (-) .
Figura 15. Evolución del índice de actividad DAS28 a Io largo del seguimiento entre pacientes CCP-2 (+) y (-).
Figura 16. Evolución de los valores de Ia Proteína C reactiva (PCR) a Io largo del seguimiento entre pacientes con antiquiméricos anti-p-18 (+) y (-).
Figura 17. Evolución del índice de actividad DAS28 a Io largo del seguimiento entre pacientes con antiquiméricos anti-p-18 (+) y (-).
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
A continuación se detallan los materiales y métodos que fueron empleados para el desarrollo de Ia presente invención, así como sus ejemplos de realización. Dichos ejemplos no limitan Ia invención, sino que su finalidad es ilustrarla, poniendo de manifiesto Ia sensibilidad y especificidad de los polipéptidos quiméricos y péptidos de Ia invención.
Material y métodos
Síntesis de péptidos
Las síntesis de los péptidos pertenecientes a las cadenas α y β de Ia proteína fibrina, con distinto grado de deiminación (Tabla 1a-b), fueron realizadas mediante un proceso de síntesis de péptidos en fase sólida empleando una resina Tentagel RAM (Rapp Polymere GmbH, Germany) (100 mg, 0.28 meq/g). La síntesis se realizó en un sintetizador semiautomático de péptidos (SAM, Multisyntech, Germany) y se obtuvieron las secuencias en forma de carboxamidas C-terminales. Se siguió una estrategia Fmoc/tBut y las reacciones de acoplamiento entre aminoácidos se realizaron por duplicado, empleando como agentes de condensación 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y N,N'-diisipropilcarbodiimida (DIPCDI), y concentraciones tres veces superiores a las anteriores. La etapa de desprotección del grupo protector Fmoc se realizó también por duplicado empleando piperidina (20%) en dimetilformamida (DMF) durante 10 minutos.
Tabla 1a. Secuencias de los péptidos derivados de Ia α-fibrina
Nombre Péptido Secuencia p1 αfibM 85-202) SRALAREVDLKDYEDQQK
P2 [C¡r90]αfib(185-202) SRALAXEVDLKDYEDQQK p3 [Cit 186'19O]αf¡b(185-202) SXALAXEVDLKDYEDQQK p4 [Cit 186]αfib(185-202) SXALAREVDLKDYEDQQK
p5 αfib(208-225) IAKDLLPSRDRQHLPLIK p6 [Cit 218]αfib(208-225) IAKDLLPSRDXQHLPLIK
P7 [Cit 216'218]αfib(208-225) IAKDLLPSXDXQHLPLIK p8 [Cit 216]αfib(208-225) IAKDLLPSXDRQHLPLIK
p9 αfib(418-435) GNVSPGTRREYHTEKLVT p10 [Cit 426]αfib(418-435) GNVSPGTRXEYHTEKLVT p11 [Cit 425'426]αfib(418-435) GNVSPGTXXEYHTEKLVT p12 [Cit 425]αfib(418-435) GNVSPGTXREYHTEKLVT
p13 αfib(501-518) SGIGTLDGFRHRHPDEAA p14 [Citfei2]αfib(501-518) SGIGTLDGFRHXHPDEAA p15 [Cit 510]αfib(501-518) SGIGTLDGFXHRHPDEAA p16 [Cit510'512]αfib(501-518) SGIGTLDGFXHXHPDEAA
p17 αfib(617-631) HSTKRGHAKSRPVRG p18 [Cit fe3O]αf¡b(617-631) HSTKRGHAKSRPVXG p19 [Cit 627'63O]αf¡b(617-631) HSTKRGHAKSXPVXG p20 [Cit 627]αfib(617-631) HSTKRGHAKSXPVRG p21 [Cit 621]αfib(617-631) HSTKXGHAKSRPVRG p22 [Cit 621 '630]αf¡ b (617-631) HSTKXGHAKSRPVXG p23 [Cit 621'627]αfib(617-631) HSTKXGHAKSXPVRG p24 [Cit 621'627'630]αf¡b(617-631) HSTKXGHAKSXPVXG
Tabla 1 b. Secuencias de los péptidos derivados de Ia β -fibrina
Nombre Péptido Secuencia p25 βfib(40-57) FFSARGHRPLDKKREEAP p26 [C¡r3]βf¡b(40-57) FFSARGHRPLDKKXEEAP p27 [Cit 47]βfib(40-57) FFSARGHXPLDKKREEAP p28 [Cit 47'53]βfib(40-57) FFSARGHXPLDKKXEEAP p29 [Cit 44'47'á3]βfib(40-57) FFSAXGHXPLDKKXEEAP p30 [Cit 44'47]βfib(40-57) FFSAXGHXPLDKKREEAP p31 [Cit 44'53]βfib(40-57) FFSAXGHRPLDKKXEEAP p32 [Cit 44]βfib(40-57) FFSAXG H RPLDKKRE EAP p33 βfib(43-62) ARGHRPLDKKREEAPSLRPA p34 [Citfeo]βfib(43-62) ARGHRPLDKKREEAPSLXPA p35 [Cit 53]βfib(43-62) ARGHRPLDKKXEEAPSLRPA p36 [Cit 53é0]βfib(43-62) ARGHRPLDKKXEEAPSLXPA p37 [Cit 47'53'éo]βfib(43-62) ARGHXPLDKKXEEAPSLXPA p38 [Cit47'60]βfib(43-62) ARGHXPLDKKREEAPSLXPA p39 [Cit47'53]βfib(43-62) ARGHXPLDKKXEEAPSLRPA p40 [Cit 47]Bfib(43-62) ARGHXPLDKKREEAPSLRPA p41 [Cit 44'47'53Hβf¡b(43-62) AXGHXPLDKKXEEAPSLXPA p42 [Cit 44'47'53]βfib(43-62) AXGHXPLDKKXEEAPSLRPA p43 [Cit 44'47'60]βfib(43-62) AXGHXPLDKKREEAPSLXPA p44 [Cit 44'47]βfib(43-62) AXGHXPLDKKREEAPSLRPA p45 [Cit 44'53'éo]βfib(43-62) AXGHRPLDKKXEEAPSLXPA p46 [Cit 44]βfib(43-62) AXGHRPLDKKREEAPSLRPA p47 [Cit 44á3]βfib(43-62) AXGHRPLDKKXEEAPSLRPA p48 [Cit 44'60]βfib(43-62) AXGHRPLDKKREEAPSLXPA p49 βfib(72-89) RARPAKAAATQKKVERKA p50 [Cit πβfib(72-89) RARPAKAAATQKKVEXKA p51 [Cit 74]Bfib(72-89) RAXPAKAAATQKKVERKA p52 [Cit 74á7]Bfib(72-89) RAXPAKAAATQKKVEXKA p53 [Cit 72'74'á7]βfib(72-89) XAXPAKAAATQKKVEXKA p54 [Cit 72'74]βfib(72-89) XAXPAKAAATQKKVERKA p55 [Cit 72'87]βfib(72-89) XARPAKAAATQKKVEXKA p56 [Cit72]βfib(72-89) XARPAKAAATQKKVERKA p57 βfib(151-168) LKDLWQKRQKQVKDNENV p58 [Cit 158]βfib(151-168) LKDLWQKXQKQVKDNENV p59 βfib(365-383) ANKYQISVNKYRGTAGNAL p60 [Cit376]βfib(365-383) ANKYQISVNKYXGTAGNAL p61 βfib(365-390) ANKYQISVNKYRGTAGNALMDGASQL p62 [Cit376]βfib(365-390) ANKYQISVNKYXGTAGNALMDGASQL p63 βfib(367-396) KYQISVNKYRGTAGNALMDGASQLMGENRT p64 [Cit395]βfib(367-396) KYQISVNKYRGTAGNALMDGASQLMGENXT p65 [Cit 376]βfib(367-396) KYQISVNKYXGTAGNALMDGASQLMGENRT p66 [Cit 376'395]βfib(367-396) KYQISVNKYXGTAGNALMDGASQLMGENXT p67 βfib(373-390) NKYRGTAGNALMDGASQL p68 [Cit376]βfib(373-390) NKYXGTAGNALMDGASQL p69 βfib(373-390)* NKYRGTAGNALMDGASQL p70 [Cit376]βfib(373-390)* NKYXGTAGNALMDGASQL
P71 palm-βfibí373-390) palm-NKYRGTAGNALMDGASQL
P72 palm-[Cit376]βfib(373-390) palm-NKYXGTAGNALMDGASQL
Citrulina = X * acidic peptides
Los péptidos fueron desprotegidos y simultáneamente desanclados de Ia resina en una única etapa empleando una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA)/ triisopropilsilano (TIS)/H2O (95/2.5/2.5). Los péptidos se precipitaron con éter dietílico frío, se centrifugaron y liofilizaron en un 10% de ácido acético. Los péptidos así obtenidos se analizaron por HPLC analítica a 215 nm. Su identidad se confirmó por espectrometría de masas MALDI-TOF.
Ciclación de péptidos
Para obtener el peptido cíclico "cabeza-cola" p38HT cuya secuencia aparece indicada en Ia Tabla 2, se empleó una protección estándar de los aminoácidos. p38HT se obtuvo por síntesis manual en una resina Novasyn® TGA (Novabiochem Ltd., Switzerland) (0.25 mmol/g) en forma de ácido C-terminal, siguiendo el procedimiento indicado en Ia Figura 1. La resina se suministra comercialmente funcionalizada con ácido hidroximetilfenoxiacético (HMPA). La primera etapa consistió en Ia acilación de Ia resina con el anhídrido isómero del Fmoc-Asp-ODmab vía su cadena lateral. La síntesis del péptido se continuó empleando una estrategia estándar Fmoc/tBut. Tras completar Ia síntesis del peptido, se eliminó el grupo terminal Fmoc con un 20% de piperidina en DMF. La eliminación del grupo Dmab se realizó por tratamiento con un 3% de hidracina en DMF, seguido de tratamiento con un 20% de agua en DMF.
Tabla 2. Péptidos de β fibrina ciclados Nombre secuencia
p38HT |—ARGHXPLDKKREEAPSLXPA D—| p3SSS GFFCARGHXPLDKKREEAPCLXPA
La resina desprotegida se trató con un 1 % de DIPEA-DMF seguido de un
1% de HOBt-DMF. La reacción de macrociclación se realizó en Ia resina empleando 3 equivalentes de PyBOP a temperatura ambiente durante 72 horas. Finalmente se liberó el péptido de Ia resina por tratamiento ácido con una mezcla de TFA/1 ,2-etanoditiol (EDT)/TIS/H2O (95/2/1/2). La construcción cíclica se aisló por precipitación con éter dietílico frío, disolviéndose el residuo final en un 10% de ácido acético y siendo éste finalmente liofilizado. El crudo peptídico se purificó por HPLC en fase reversa y se identificó por espectrometría de masas electrospray (ES-MS).
Para obtener los péptidos cíclicos en forma de disulfuro, que se muestran en las Tablas 2 y 3 (p38SS, p18-sc, p19-sc, p22-sc, p18-lc, p19-lc and p22-lc), fue necesario sustituir dos residuos de serina de Ia secuencia peptídica original por dos residuos de cisteína protegidos como Cys(Acm). Los péptidos lineales correspondientes se sintetizaron en forma de carboxamidas C-terminales tal y como se ha descrito con anterioridad y finalmente se liberaron de Ia resina por tratamiento con TFA/EDT/H2O (95/2.5/2.5) y se precipitaron con éter dietílico frío. Finalmente se disolvieron en un 10% de ácido acético y se liofilizaron. La caracterización de los péptidos resultantes se realizó por MALDI-TOF y HPLC analítica. La ciclación se llevó a cabo disolviendo los péptidos en ácido acético y adicionando una solución de yodo en metanol, para obtener el enlace disulfuro. Tras 60 minutos de agitación, se adicionó agua para acelerar Ia liberación del grupo protector Acm. La solución resultante se agitó durante 90 minutos más y finalmente el yodo fue extraído con diclorometano. La fase acuosa se diluyó tres veces con agua y se liofilizó. Los crudos peptídicos se caracterizaron por HPLC analítica y finalmente fueron purificados por HPLC preparativa y caracterizados por ES-MS. En Ia Figura 2 se ilustra el procedimiento sintético seguido para Ia preparación de uno de los péptidos cíclicos con puentes disulfuro (p38SS).
Tabla 3. Péptidos α fibrina
Nombre secuencia p S 8-sc H T K R O H A K C R F1 V SC G p S&-r:>c H T K R G H A K C X P V X G p22-sc H ? T K X (3 H A K C R P V ÍC C-. p S S-Sc H T K R O H A K S R P V X G i H T C P* L
Γ p SQ-fe H T K R G H A K 3 X. P V X G I H T C F* L ft-22-ϊc H T K X G H A K 3 R F1 V >C G I H T C P L
se: ciclo pequeños ("small eyele"); c: ciclo largo ("large eyele")
Péptidos quiméricos
Para llevar a cabo Ia síntesis de los péptidos quiméricos lineales que contienen tres residuos de glicina entre los péptidos seleccionados de α- y β-fibrina (Tabla 4a), se siguió el procedimiento general anteriormente descrito.
Para llevar a cabo Ia síntesis del (poli)péptido quimérico α-fibrina-filagrina (p18-cfc1cyc) cuya secuencia primaria se indica en Ia Tabla 4b, se emplearon dos estrategias sintéticas diferentes. La primera (Figura 3a) consistió en Ia síntesis de Ia secuencia quimérica lineal en fase sólida y su posterior delación en solución, mediante Ia formación de un puente disulfuro. En Ia segunda estrategia (Figura 3b), Ia delación de Ia región correspondiente al péptido de Ia filagrina se realizó en fase sólida y posteriormente, sobre Ia peptidil resina con el péptido de filagrina ya ciclado, se completó Ia síntesis de Ia secuencia correspondiente a Ia α-
fibrina. El desanclaje y desprotección final del polipéptido quimérico se realizó preservando el enlace disulfuro ya formado.
Tabla 4. Polipéptidos quiméricos 4a)α-fibrina-β-fibrina 4b) α-fibrina-filagrina
Nombre secuencia
(a) P1^-GGG-P i 8 ARGHXPLDKKREEAPSLXPAGGGHSTKRGHAKSRPVXG
p38-GGG-p1 & ARGHXPLDKKREEAPSLXPAGGGHSTKRGHAKSXPV'XG
p3B-GGG-p22 ARGHXPL D KKR EEAPSLXP AGGGHST KXGHAKSRPVXG
p f 8-cfd cyc HSTKRGHAKSRPVXGHQCHGESTXGRSRGRCGRSGS
Muestras de suero
Las muestras de suero analizadas procedieron de pacientes del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico de Barcelona. Se trabajó con un total de 193 muestras de suero, de las cuales 111 correspondían a pacientes diagnosticados con AR, según los criterios revisados de Ia Asociación
Americana de Reumatología de 1987 (ahora Colegio Americano de
Reumatología). Las muestras fueron previamente testadas por ELISA con el kit con anticuerpos CCP-2 (Immunoscan RA; Eurodiagnostica, distribuido por Diasorin, Madrid, Spain) para conocer Ia presencia o
ausencia de anticuerpos anti-CCP-2. Los 82 sueros restantes se obtuvieron de pacientes diagnosticados de PsA no preseleccionados y se emplearon como control negativo.
Ensayos de ELISA
Las secuencias peptídicas se unieron covalentemente a placas de titulación de ELISA (Costar Corp., DNA-bind N-oxysuccinimide surface, Cambrigde, MA), como se ha descrito previamente (Pérez, T.; Gómez, et al. Lett. Peptide Sci. 2002, 9, 291-300).
Brevemente, se diluyeron los péptidos a una concentración de 10 mg/mL en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6) 0.05 M. Se adicionaron 100 μL de solución peptídica a cada pocilio de Ia placa de microtitulación y se incubó toda Ia noche a 40C. Cada placa contenía pocilios control que incluían todos los reactivos excepto Ia muestra de suero, para estimar el ruido de fondo, y pocilios que incluían todos los reactivos excepto el péptido, para evaluar así las reacciones no específicas del suero. En los controles, los pocilios se bloquearon con 2 mg BSA/pocillo. Tras Ia incubación, las placas se bloquearon con 2% de BSA en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6) 0.05 M durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sueros se diluyeron 200 veces en tampón RIA (1% BSA, 350 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 7.6, 1 % vol/vol Tritón X-100, 0.5% wt/vol Na-deoxicolato, 0.1 % SDS) suplementado con suero fetal bovino al 10%. Se adicionaron 100 μL/pocillo y se incubaron durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Tras realizar seis lavados con PBS/0.05% Tween- 20, se adicionaron 100 μL/pocillo de IgG anti-humana conjugada a peroxidasa, diluida 1 :1000 en tampón RIA. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas seis veces con PBS/0.05% Tween-20 y los anticuerpos unidos se detectaron con dihidrocloruro de o-
fenilenodiamina (OPD, Sigma Chemical Company) y 0.8 mL/mL de 30% de peróxido de hidrógeno. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo con 50 mL de H2SO4 2N y los valores de absorbancia obtenidos fueron medidos a una longitud de onda de 492 nm. Todos los sueros se testaron por duplicado. También se incluyeron sueros control para monitorizar las variaciones Ínter- e intra- ensayos.
Los ensayos de ELISA llevados a cabo con el lipopéptido p66 o con las mezclas físicas de péptidos de fibrina, se realizaron tras Ia adsorción pasiva de las secuencias a Ia superficie sólida (Maxisorp, 96F Nunc,
Roskilde, Denmark), siguiendo Ia metodología ya descrita (Gomara, M. J. at al J Immunol Methods 2000, 234 (1-2), 23-34.). El péptido p65 se analizó empleando placas Covalink NH (Nunc, Roskilde, Denmark), que permiten Ia unión covalente de los péptidos a través de su región C- terminal. El procedimiento general fue el siguiente:
Se preparó una solución de péptido de 10 μg/mL en agua destilada que contenía sulfo-N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) a concentración 8 mM. Se adicionaron 100 μL de Ia solución de péptido/sulfo-NHS a cada pocilio. Asimismo se preparó una solución de un 2% de BSA/sulfo-NHS para adicionar al pocilio control. La reacción covalente se inició tras Ia adición de 50 μL de una solución 16 mM de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) a cada pocilio. Se incubaron las placas durante Ia noche a temperatura ambiente y se realizó el resto del ensayo ELISA siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para las placas Costar.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa estadístico SPSS versión 12.0. Para establecer Ia sensibilidad/especificidad de los diferentes tests
ELISA en las distintas patologías se realizó un estudio de curvas ROC. Para Ia comparación de proporciones se usó el test de ji cuadrado (Chi- square test) o el test de Fischer y para el análisis bivariante de las variables continuas el test de Ia t de Student o el de Wilcoxon-Mann- Whitney. Para las comparaciones múltiples, se utilizó el análisis de Ia varianza o el test de Kruskal-Wallis. Para Ia aplicación de las pruebas paramétricas se realizaron previamente contrastes de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y de homocedasticidad (tets de Levene).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1 : Identificación de epítopos de α-fibrina y β-fibrina
Con el objeto de detectar aquéllos péptidos de Ia proteina fibrina que fuesen más reactivos frente a sueros positivos para AR (en adelante sueros AR), se procedió a analizar Ia influencia del grado de deiminización mediante Ia síntesis de péptidos derivados de Ia fibrina con distinta relación arginina/citrulina. La identificación de las regiones de las cadenas α-fibrina y β-fibrina que serían empleadas en los ensayos fue llevada a cabo por predicciones de antigenicidad realizadas por ordenador. Se emplearon las escalas de hidrofilia de Hopp y Woods, de accesibilidad de Janin y de antigenicidad de Welling. Además se tuvo en cuenta qué regiones presentaban una mayor probabilidad de formar giros beta y que por tanto se deberían localizar en una zona más externa de Ia proteína, teniendo con ello una mayor facilidad para interaccionar con los anticuerpos. Los péptidos finalmente fueron sintetizados en fase sólida y caracterizados por su secuencia, HPLC y espectrometría de masas MALDI-Tof.
Estos péptidos fueron ensayados mediante inmunoensayo (ELISA) para determinar su capacidad de reconocer auto-anticuerpos presentes en sueros positivos para AR. Para identificar qué péptidos eran el mejor sustrato para los auto-anticuerpos todos los péptidos sintetizados fueron inicialmente ensayados con 33 sueros positivos para AR y con 40 sueros control. Tal y como se muestra en Ia Figura 4 se observó un considerable aumento de Ia sensibilidad para los péptidos p18, p19 y p22 derivados de Ia cadena α-fibrina, donde Ia arginina había sido sustituida en Ia posición
630. Aunque p24 también presenta una citrulina en esta posición específica, se trata de una versión totalmente citrulinada de Ia región 617-
631. De acuerdo con resultados anteriores de los inventores de Ia presente invención, una carga neta positiva podría ser un factor adicional que contribuyera a Ia reactividad del péptido. Según Ia experiencia de los inventores, un adecuado balance de residuos Arg/Cit en los péptidos puede favorecer una conformación con mayor capacidad de unión a los auto-anticuerpos, Io cual ha resultado favorable para mejorar su utilidad analítica, diagnóstica y pronostica.
El resto de péptidos correspondientes a Ia región 617-631 de Ia α-fibrina con una arginina sin modificar en Ia misma posición mostraron una reactividad menor. Para los péptidos derivados de Ia cadena de β-fibrina, de aquellos obtenidos a partir de Ia región definida entre las posiciones 43- 62, el p38 fue el que ofreció los mejores resultados de absorbancia (DO492), es decir una mayor unión a los auto-anticuerpos.
EJEMPLO 2: Ensayos de detección de auto-anticuerpos mediante péptidos ciclados
Péptidos ciclados de Ia β-fibrina.
A partir de Ia región 43-62 de Ia β-fibrina se procedió a Ia delación de péptidos derivados de dicha región para determinar si este tratamiento, Ia delación, conseguía aumentar su afinidad por los auto-anticuerpos. Así, se prepararon dos versiones de péptidos cíclicos a partir de Ia región 43-62 de Ia β-fibrina (Tabla 2). La primera de estas versiones, p38HT (del inglés "head to tail" o cabeza-cola), se correspondía con el péptido p38 ciclado, que fue obtenido en fase sólida mediante Ia formación de un enlace amida entre el extremo N-terminal del péptido y el grupo carboxilo de un residuo Asp introducido en el extremo C-terminal de Ia secuencia del péptido protegida por el grupo Odmab (del inglés - 4[N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxo- cyclohexylideno)-3-metylbutylamino)benzyloxy) (Figure 1 ). La segunda versión de los péptidos preparada, p38SS, fue obtenida mediante sustitución de dos residuos de serina por dos cisteínas en Ia región 43-62 de Ia β-fibrina y Ia ciclación fue llevada a cabo por oxidación en solución de yodo/metanol (Figura 2).
Las dos versiones de péptidos ciclados fue testada por ELISA con 110 sueros positivos para AR y 80 sueros control. Tal y como se muestra en Ia figura 5, Ia capacidad de los péptidos lineales para detectar auto- anticuerpos fue significativamente superada por los péptidos cíclicos (p<0.05), aunque entre p38HT y p38SS las diferencias no fueron significativas (p=162).
Péptidos ciclados de Ia α-fibrina.
Al igual que con Ia β-fibrina, se desarrollaron péptidos ciclados derivados de Ia α-fibrina, a partir de aquellos que habían ofrecido unos valores más elevados de antigenicidad, p18, p19 y p22. De este modo, se prepararon dos versiones cicladas de cada uno de los péptidos, una larga y otra corta, según se indica en Ia Tabla 3, y se ensayaron con 110 sueros positivos
para AR y 70 positivos para PsA. Los análisis de curva ROC mostraron unos valores de área bajo Ia curva (AUC) mayores para los péptidos cíclicos cortos (0.829, 0.745 y 0.703 para p18-sc, p19-sc y p22-sc respectivamente) en comparación con los largos (0.738, 0.703, 0.685 para p18-lc, p19-lc y p22-lc respectivamente). Como se muestra en Ia Figura 6 los valores más elevados de AUC y sensibilidad (p=0.008) fueron obtenidos para el péptido p22-sc, cuando el tamaño del anillo de delación era más pequeño.
Por otro lado, cabe destacar que los péptidos de fibrina empleados en los ensayos no dieron lugar a falsos positivos con muestras positivas para PsA, a diferencia de Io que sucede con otros métodos de detección de AR. Consecuentemente, y tal y como describen diversos autores (21 , 22), que afirman que los auto-anticuerpos detectados en el test anti-CCP son más frecuentes poblaciones afectadas por Ia PsA, los péptidos ciclados de Ia α- fibrina descritos en este apartado pueden ser de gran relevancia para mejorar los sistemas de detección de AR.
EJEMPLO 3: Ensayos de detección de auto-anticuerpos AR mediante péptidos quiméricos α-fibrina-β-fibrina y fibrina-filagrina.
A partir de los datos de especificidad y selectividad obtenidos para las diferentes regiones de los polipéptidos derivados de Ia α-fibrina y β-fibrina se procedió al diseño y síntesis en fase sólida de péptidos quiméricos (Tabla 4).
Los análisis ELISA mostraron que los polipéptidos quiméricos α-fibrina y β- fibrina analizados por curvas ROC ofrecían unos valores de AUC moderadamente más elevados que los correspondientes a péptidos monoméricos (Fig. 7). Sorprendentemente, cuando los mismos ensayos se realizaron con polipéptidos quiméricos fibrina-filagrina, donde el péptido de
filagrina se encontraba ciclado, los resultados de sensibilidad y especificidad fueron mejores.
Para Ia elaboración de este último ensayo se elaboraron dos péptidos: cfdcyc, perteneciente al grupo de los péptidos conocidos como CCP-1 (15), y p18-cfc1cyc, resultante de Ia unión covalente del primero con p18. La relación entre Ia sensibilidad y especificidad de ambos péptidos se presenta en Ia Figura 8. La sensibilidad del ELISA con p18-cfc1cyc fue del 82%, significativamente más elevada que Ia alcanzada por el ELISA con cfdcyc (65,8%; p=0.002). La especificidad fue muy elevada en ambos casos (93%). Esta elevada sensibilidad sin pérdida de especificidad es bastante relevante teniendo en cuenta que el grupo empleado como control consistía en pacientes afectados por PsA, una enfermedad inflamatoria con un cuadro clínico que puede simular Ia AR. Por otro lado, Ia frecuencia de auto-anticuerpos contra el polipéptido p18-cfc1cyc (6%) en Ia población control (PsA) es similar a Ia descrita por otros autores que emplean el test comercial basado en CCP-2, habiéndose reportado una prevalencia de un 5.6-7.8%
EJEMPLO 4: Ensayos de detección de auto-anticuerpos AR polipéptidos quiméricos mediante mezclas de péptidos.
Con el objetivo de mejorar los métodos de detección de AR basados en péptidos derivados de Ia fibrina, se prepararon diferentes mezclas de los mismos.
Se empleó un panel de 23 muestras de suero para las que el test comercial basado en CCP-2 había ofrecido resultados negativos y se estudió su reactividad frente a diversas mezclas de péptidos escogidos de entre los que habían resultado antigénicamente más relevantes (Tabla 5). Estas mezclas de péptidos fueron únicamente capaces de detectar 4 de
las 23 muestras AR positivas. Sin embargo, el polipéptido quimérico p18- cfdcyc fue capaz de detectar auto-anticuerpos AR en 8 sueros, alcanzándose por Io tanto una reactividad del 33% frente a unos máximos del 21 % y 17% obtenidos con el resto de métodos ensayados. Estos resultados demuestran que los péptidos quiméricos fibrina-filagrina son capaces de mejorar Ia sensibilidad de los métodos de detección de AR.
Tabla 5:
Muestra de suero p38* p18cfc1cyc** α-fib+β-fib+ cfdcyc
1 →-
2 - - -
3 - -
4 * 5
6
7 - -
8 _ -i-
9 _ -S-
IO -*- +
1 1 _ _
12 - -
13 _ _ _
14 _ _ _
35 _ _ _
¡6 _ _ _
17 _ _ -
18 _ _ -
19 ->- _
20 - -t- -
21 _ _ _
22 _ _
23 - - -
(4/23) 17% (8/23) 34.8% (4/23) 17%
* p38: péptido derivado de Ia β-fibrina
** p18cfc1cyc: polipéptido quimérico α-fibrina-β-fibrina
Es importante mencionar que los polipéptidos quiméricos fibrina-filagrina y, más concretamente, el polipéptido p18-cfc1cyc, han sido capaces de ofrecer resultados de sensibilidad superiores a los de cfdcyc e incluso de detectar sueros positivos para AR allí donde el test CCP-2 comercial
ofrecía falsos negativos. De hecho, más del 46% de los sueros negativos para el test CCP-2 reaccionó con p18-cfc1cyc y/o p38, indicando que los péptidos derivados de fibrina y los polipéptidos quiméricos fibrina-filagrina pueden permitir el desarrollo de tests de detección de auto-anticuerpos de AR con mejores resultados que los tests anteriores a Ia presente invención.
Durante Ia realización de estos ensayos se comprobó incluso Ia existencia de una correlación entre p18-cfc1cyc y CCP-2, tal y como se muestra en Ia Figura 9 (r=0.86, p<0.001 ). Estos resultados refuerzan Ia utilidad de los péptidos fibrina-filagrina para robustecer los métodos diagnósticos y pronósticos de Ia AR.
EJEMPLO 5: Sensibilidad y especificidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CCP2 y antipéptidos citrulinados quiméricos (fibrina/filagrina) (antiquiméricos fb/f (fibrina/filagrina))
Para llevar a cabo este análisis se determinaron los valores de los autoanticuerpos anti-CCP2 y anti-quiméricos fb/f (p18, p19, p22) por Ia técnica de ELISA. Para ello, se emplearon pacientes con artritis reumatoide (AR) (criterios de Ia ACR, 1987) (n = 322) y controles del banco de sangre del Hospital Clínico (n = 307) de cara a evaluar su sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo y negativo para el diagnóstico de AR. Para ello se efectuó un análisis de curvas ROC que demuestra con una especificidad del 98%, los siguientes valores de línea de corte o cutoff para los diferentes antígenos:
Anti-CCP2: 29 Ul/I Anti-quimérico fb/f - p18: 0.241 Anti-quimérico fb/f - p19: 0.229
Anti-quimérico fb/f - p22: 0.280
A continuación se detallan las curvas ROC para el diagnóstico de AR entre las poblaciones con AR (n = 322) y población control del banco de sangre (n= 307).
Tabla 6: Curva ROC para anti CCP2
Ver fig. 10
Tabla 7: Curva ROC para antiquimérico fb/f-p18
Ver fig. 11
Tabla 8: Curva ROC para antiquimérico fb/f-p19
Ver fig. 12
Tabla 9: Curva ROC para antiquimérico fb/f-p22
Ver fig. 13
Con este ensayo, se vuelve a demostrar que en el suero de pacientes con AR existen anticuerpos que reaccionan contra péptidos citrulinados quiméricos fibrina/filagrina, reforzando Ia idea de que los epítopos de Ia cadena alfa de Ia fibrina humana, presente en Ia sinovial reumatoide podrían constituirse en los principales antígenos que desencadenen Ia respuesta inmunológica con Ia formación de estos auto-anticuerpos, en pacientes con AR.
En el análisis de sensibilidad/especificidad de estos anticuerpos, se ha demostrado que tienen una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de AR. De hecho, empleando una población de 322 pacientes con AR y 307 controles (banco de sangre) y manteniendo una especificidad del 98%, Ia sensibilidad de los tres péptidos quiméricos fibrina/filagrina (fb/f) (p18, p19, p22) ha sido del 72%, 78% y 71 % respectivamente, una sensibilidad pareja a Ia observada con los anti-CCP- 2 comerciales (74%). De forma interesante, y aunque Ia correlación entre los diferentes anticuerpos es muy estrecha, hay un porcentaje notable de discrepancias entre ellos (entre 13-15% de sueros discordantes), Io que manifiesta que Ia determinación de más de un anticuerpo incrementa Ia sensibilidad (hasta un 81 %) sin prácticamente perder especificidad (96- 97%).
De hecho, se observa un número relativamente importante de pacientes con valores no concordantes. El 13.9% de los pacientes tienen discrepancias en Ia positividad del anticuerpo CCP-2 y el antiquimérico fb/f p-18.
Tabla 10
Cuando se efectúa el análisis entre anti-CCP-2 y los anticuerpos contra péptidos quiméricos fb/f p-19 y p-22, se observan también discrepancias del 13.3% y del 15.3% respectivamente. Incluso entre los tres anticuerpos quiméricos fb/f, el nivel de discrepancias es también de 13.9%. con un mayor número de sueros discrepantes positivos por anticuerpos quiméricos fb/f, tal como se ilustra en Ia Tabla 11 :
EJEMPLO 6: Sensibilidad/Especificidad de los anticuerpos frente a péptidos citrulinados (CCP-2 y quiméricos fb/f) en diferentes patologías
Posteriormente y utilizando los puntos de corte calculados para definir Ia positividad a través de las curvas ROC entre pacientes con AR y el grupo control del banco de sangre, se han estudiado sueros de pacientes de tres patologías diferentes:
1. Lupus eritematoso sistémico (LES): n = 119
2. Artritis psoriásica: (PsA): n = 133
3. Hepatitis crónica por virus de Ia hepatitis C (HCVC): n = 84
La sensibilidad o positividad de los diferentes anticuerpos es muy baja en las tres patologías, Io que de acuerdo con Ia Tabla 12, demuestra Ia especificidad de los cuatro anticuerpos utilizados y su valor en el diagnóstico de Ia AR. En dicha tabla se muestran los datos referentes a Ia especificidad de los anticuerpos anti-CCP-2 y anti-quiméricos fb/f p18
Tabla 12
Tal y como se puede comprobar en Ia tabla, Ia especificidad es muy alta (97-98%), tanto con los anti-CCP-2 como en los quiméricos en las patologías artritis psoriásica y hepatitis crónica por virus C, con muy pocos casos falsos positivos.
Por tanto, en este estudio de especificidad de los diferentes auto- anticuerpos en otras patologías donde se observan fenómenos autoinmunitarios (Lupus eritematoso sistémico, hepatitis crónica por virus C) o que tienen un cuadro clínico similar a Ia AR (artritis psoriásica), queda claramente comprobado que los anticuerpos anti-quiméricos fb/f son sumamente específicos.
EJEMPLO 7: SIGNIFICADO PRONÓSTICO
El objetivo de este análisis era analizar el valor pronóstico de los anticuerpos citrulinados derivados de dominios de fibrina humana en Ia AR y compararlo con los que se determinan en Ia práctica clínica con el kit comercial de segunda generación (CCP2, Eurodiagnostica). Tal y como ya se ha visto a Io largo de Ia presente invención, los péptidos que han demostrado un mejor balance sensibilidad/especificidad son los quiméricos fb/f p18, p19 y p22; es por esto que son éstos los que se han empleado para el estudio sobre su significación pronostica.
Para efectuar el presente análisis se han estudiado 118 pacientes con AR de más de dos años de evolución y que después de iniciar un protocolo terapéutico con fármacos antirreumáticos, han estado en seguimiento durante dos años. Se ha tomado como medida de desenlace principal el grado de destrucción articular (progresión radiológica) al final de los dos años de seguimiento. Se ha podido comprobar que diferentes variables clínicas, biológicas e inmunogenéticas han estado asociadas a una mayor destrucción articular, entre ellas Ia presencia de anticuerpos específicos frente a péptidos citrulinados cíclicos. Especialmente en el caso de los anticuerpos anti-CCP-2 y el antiquimérico fb/f p18, se ha asociado de manera más clara su presencia en el momento basal a una mayor lesión radiológica a los dos años de seguimiento.
No obstante, es muy importante resaltar que aquellos pacientes anti CCP- 2 negativos pero positivos para los antiquiméricos, mostraban un grado de destrucción articular similar a los antiCCP positivos, demostrando que estos anticuerpos pueden dar información pronostica adicional.
A continuación se aportan los datos obtenidos para llegar a las conclusiones ya comentadas. En primer lugar se aportan las diferentes
características de los pacientes analizados:
Mujeres (%) 82.2
Edad (años), ± S. D. 53.8 ±15 Duración enfermedad (meses), X ± S. D. 10 ± 6.7
Dolor EAV (mm), X ± S.D 50.6 ± 21
VGPaciente (mm), X±S.D. 57.6 ±15.8
VGMedio (mm), X ± S.D. 55.7 ±14
NAD28, X±S.D. 9.8 ± 5.5 NAI28, X±S.D. 8.1 ± 4.2
DAS 28, X±S.D. 5.7 ±0.9
DAS28>5.1 (%) 75.4 mHAQ, X±S.D. 0.9 ± 0.5
VSG (mm/h), X±S.D. 39.7 ± 24.4 CRP (mm/dL), X±S.D. 2.8 ± 2.3
Hemoglobina (mg/dL), X ± S.D. 12.7 ± 1.4
Factor reumatoide positivo (>25U) 73.7
Anti-CCP-2 positivo (>50 U) (%) 69.7
Epitopo reumatoide (%) 72.5 Epitopo reumatoide homocigoto (%) 19.3
HLA-DRB1-04(%) 44.5
En cuanto a Ia detección de anticuerpos específicos frente a péptidos citrulinados sintéticos quiméricos en este ensayo (antiquiméricos fb/f) (ELISA), los resultados fueron los siguientes:
Tabla 13
En Ia Tabla 14 se pueden observar los valores del daño radiológico (basal y a los dos años) en función de Ia presencia o ausencia de los diferentes auto-anticuerpos específicos frente a los péptidos citrulinados.
*:p=0.006; **p=0.022. Delta: valor de Ia diferencia entre Larsen final y basal.
Tal y como ya se ha mencionado para valorar Ia capacidad pronostica de las diferentes variables a Ia hora de predecir Ia destrucción articular, se catalogó Ia presencia de progresión de Ia destrucción, cuando al final del seguimiento (24 meses) hubo un incremento en el valor de Larsen superior o igual a 4 puntos (entre el mes 0 y el mes 24). Siguiendo este criterio, 39 de los 118 pacientes (33%) presentaron progresión de Ia destrucción articular y 79 (67%) no.
Por otro lado, el análisis bivariante de los tres anticuerpos contra péptidos citrulinados quiméricos (antiquiméricos fb/f) dio lugar a los resultados que se exponen en Ia Tabla 15.
Tabla 15
Anti péptidos quiméricos No progresión progresión valor de p
Antiquimérico fb/f-p18+ 65.7% 85.3% 0.037
Antiquimérico fb/f-p19+ 70.8% 84.8% 0.126
Antiquimérico fb/f-p22+ 69.2% 81.8% 0.182
Estos resultados demuestran que Ia proporción de pacientes con anticuerpos contra péptidos citrulinados quiméricos fibrina/filagrina es más elevada en pacientes con progresión radiológica que en pacientes que no Ia presentan. Es más, si atendemos a los resultados ya expuestos en el ejemplo 5 cuando se analizan los datos de progresión radiológica entre pacientes antiCCP-2 positivos y negativos (con antiquiméricos fb/f positivos o negativos), se observa cómo el comportamiento del grupo CCP-2-/quimérico+ es similar al grupo CCP-2+ (es decir, con mayor progresión radiológica) y no al grupo CCP-2- Esto indica que Ia presencia de estos anticuerpos quiméricos determinan una mayor progresión radiológica, también en pacientes antiCCP-2 negativos. De ahí, Ia importancia en el diagnóstico y en el pronóstico de Ia enfermedad de Ia utilización de los péptidos quiméricos de Ia presente invención.
Por tanto, se puede comprobar a raíz de estos datos, como los anticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos, especialmente los anticuerpos anti CCP-2 y el antiquimérico fb/f p18, están asociados a una mayor
destrucción articular y como su presencia en el momento basal va asociada a una mayor lesión radiológica a los dos años de seguimiento.
EJEMPLO 8: Análisis de Ia asociación entre anticuerpos contra péptidos citrulinados y genotipo HLADRB.
En Ia Tabla 16 se puede observar Ia frecuencia de los diferentes alelos DRB04 y DRB03, así como del epítopo reumatoide en pacientes con anticuerpos específicos frente a péptidos citrulinados.
Tabla 16
En Ia tabla 16 se demuestra Ia asociación entre DRB04 y los anticuerpos antiCCP-2 y antiquimérico fb/f p18.